CN108997484B - 小麦TaWox5基因在提高小麦转化效率中的应用 - Google Patents

小麦TaWox5基因在提高小麦转化效率中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108997484B
CN108997484B CN201710422896.6A CN201710422896A CN108997484B CN 108997484 B CN108997484 B CN 108997484B CN 201710422896 A CN201710422896 A CN 201710422896A CN 108997484 B CN108997484 B CN 108997484B
Authority
CN
China
Prior art keywords
wheat
tawox5
gene
sequence
transformation efficiency
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201710422896.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108997484A (zh
Inventor
王轲
叶兴国
刘会云
王坤杨
杜丽璞
王静
林志珊
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Original Assignee
Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to CN201710422896.6A priority Critical patent/CN108997484B/zh
Application filed by Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences filed Critical Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority to BR112019025744A priority patent/BR112019025744A8/pt
Priority to CA3064981A priority patent/CA3064981A1/en
Priority to EP18813480.3A priority patent/EP3619225A4/en
Priority to PCT/CN2018/090239 priority patent/WO2018224001A1/en
Priority to CN201880037775.2A priority patent/CN111278849B/zh
Priority to US16/617,930 priority patent/US11447784B2/en
Priority to AU2018280528A priority patent/AU2018280528B2/en
Publication of CN108997484A publication Critical patent/CN108997484A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108997484B publication Critical patent/CN108997484B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/005—Methods for micropropagation; Vegetative plant propagation using cell or tissue culture techniques
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/008—Methods for regeneration to complete plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8206—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated
    • C12N15/8207—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated by mechanical means, e.g. microinjection, particle bombardment, silicon whiskers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8214—Plastid transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells

Abstract

本发明公开了小麦TaWox5基因在提高小麦转化效率中的应用。本发明提供了TaWox5基因或含有所述基因的重组载体、表达盒或重组菌在提高核酸分子转化目的植物转化效率中的应用，还提供了TaWox5基因或含有所述基因的重组载体、表达盒或重组菌在促进核酸分子转化目的植物中的应用。本发明克隆了小麦TaWOX5基因，将该基因导入不同小麦中的结果发现，该基因可以大幅提高小麦转化效率。不仅提高了Fielder等易转化小麦品种的转化效率，还大大提高了难转化小麦品种如济麦22，矮抗58及京411等的转化效率，解决了小麦转化基因型限制的问题。

Description

小麦TaWox5基因在提高小麦转化效率中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及小麦TaWox5基因在提高小麦转化效率中的应用。
背景技术
自1983年植物转基因技术取得成功以来，利用遗传工程途径改良植物的发展速度很快。2016年全球共有28个国家种植了转基因作物，面积达到了1.797亿公顷，比1996年增加了约100倍，约1800万农民从种植转基因作物中受益。转基因作物的种植不但提高了产量，增加了收入，而且减少了杀虫剂使用，保护了环境和生物多样性，提高了农产品品质。但是，目前全球商业化种植的转基因作物仅限于抗虫玉米和棉花，抗除草剂大豆和油菜，抗病毒病木瓜等，还没有小麦等主要禾谷类粮食作物。相比之下，全球转基因小麦研究和产业化明显处于落后状态。除了转基因品种安全性、产业政策、人们认识、基因功能等因素的限制外，低效率的遗传转化技术是限制转基因小麦研发的主要环节(Harwood，2012)。为了培育抗病、耐旱、耐盐、优质、营养吸收高效的转基因小麦，需要对大量候选基因进行功能鉴定。由于目标基因表达受到插入位点和插入拷贝数等因素的影响，以及外源基因插入对内源基因遗传和功能的影响等，鉴定每一个候选基因的功能都需要获得一定数量的转基因植株。另外，随着小麦基因组测序工作的完成，大量基因将被克隆和进行功能研究。所以，转基因小麦研发和小麦功能基因组学研究需要获得大量转基因植株，迫切需要提高小麦转化效率，扩大转化规模，建立高效、安全、规模化转基因技术体系，推进转基因小麦产业化和小麦功能基因组学研究进程。
在主要农作物中，小麦属于遗传转化比较困难的作物(Harwood，2012)，遗传转化效率较低，重复性较差，基因工程育种进程明显落后于大豆、玉米、棉花、水稻等农作物。知道近几年日本烟草公司将小麦的遗传转化效率大幅提升，澳大利亚利用该技术小麦转化效率可以达到40％左右(Richardson et al，2014)。但是该技术仅仅针对Fielder及Westonia等少数基因型有效果，多数小麦品种转化效率仍然较低甚至不能转化。本单位于2014年引进了该技术，通过对该技术的消化吸收与改进，小麦基因型Fielder和CB037的转化效率也达到40％，并成功转化了周麦18，杨麦16，冀5264等15个商业化品种。但是除了科农199的转化效率达到20％以外，其它品种转化效率不高，其中济麦22只有2.7％，中麦895仅3.6％，矮抗58及京411没有转化成功。考虑到转基因小麦的产业化前景，育种家需要用大面积推广的小麦品种作为转化受体，因此，商业化小麦品种的转化是最大的限制因素。
发明内容
本发明的一个目的是提供TaWox5蛋白或其编码基因或含有所述基因的表达盒或含有所述基因的重组载体或含有所述基因的重组菌的用途。
本发明提供的TaWox5蛋白或其编码基因或含有所述基因的表达盒或含有所述基因的重组载体或含有所述基因的重组菌在提高核酸分子导入目的植物转化效率中的应用。
本发明还提供了TaWox5蛋白或其编码基因或含有所述基因的表达盒或含有所述基因的重组载体或含有所述基因的重组菌在促进核酸分子导入目的植物中的应用。
上述应用中，所述TaWox5蛋白源自小麦。
或所述TaWox5蛋白的氨基酸序列为序列2。
上述应用中，所述TaWox5蛋白的编码基因为如下1)-3)中任一所述的DNA分子:
1)核苷酸序列为序列1第11821-12573位的DNA分子；
2)与1)所示的DNA分子同源性大于95％、98％或99％的DNA分子；(麻烦把英文字体改一致，一般全用times new man)
3)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能多肽的DNA分子。
上述应用中，所述植物为小麦；
或所述核酸分子为质粒；
或所述核酸分子为质粒，所述质粒为pDE003。
本发明另一个目的是提供一种提高核酸分子导入目的植物的转化效率的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：将含有TaWox5蛋白编码基因的表达盒和核酸分子转入目的植物中，实现提高核酸分子导入目的植物的转化效率。
含有TaWox5蛋白编码基因的表达盒和核酸分子可以通过一个载体也可以通过不同载体转入目的植物中。
上述方法中，所述TaWox5基因源自小麦；
所述TaWox5蛋白的编码基因为如下1)-3)中任一所述的DNA分子:
1)核苷酸序列为序列1第11821-12573位的DNA分子；
2)与1)所示的DNA分子同源性大于95％、98％或99％的DNA分子；
3)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能多肽的DNA分子；
所述含有所述基因的表达盒为如下a)-c)中任一所述的DNA分子:
a)核苷酸序列为序列1第9812-12837位的DNA分子；
b)与1)所示的DNA分子同源性大于95％、98％或99％的DNA分子；
c)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能多肽的DNA分子。
上述方法中，所述植物为小麦；
或所述核酸分子为质粒；
或所述核酸分子为质粒，所述质粒为pDE003。
上述方法中，所述含有TaWox5蛋白编码基因的表达盒和核酸分子是通过pDE003-TaWOX5载体转入目的植物中；所述pDE003-TaWOX5载体的核苷酸序列为序列1。
本发明第3个目的是提供如下物质。
本发明提供的物质，为TaWox5蛋白或其编码基因或含有所述基因的表达盒或含有所述基因的重组载体或重组菌。
上述提高核酸分子导入目的植物转化效率的方法为将TaWOX5和其它核酸分子混合导入目的植物转化效率高于将其它核酸分子单独导入目的植物转化效率。
本发明克隆了小麦TaWOX5基因，将该基因导入不同小麦中的结果发现，该基因可以大幅提高小麦转化效率。不仅提高了Fielder等易转化小麦品种的转化效率，还大大提高了难转化小麦品种如济麦22，矮抗58及京411等的转化效率，解决了小麦转化基因型限制的问题。
附图说明
图1为pDE001载体示意图。
图2为pDE003载体示意图。
图3为pDE003-TaWOX5载体示意图。
图4为Bar基因的PCR检测结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中所举的质粒、菌株只用于对本发明作进一步详细说明，并不对本发明的实质内容加以限制。凡未注明具体试验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
试验例中所举的质粒、菌株来源如下：
克隆载体pMD-18T：为Takara公司市售产品；
植物表达载体pDE001和pDE003：为拜尔迪公司市售产品；
大肠杆菌TOP10：为北京市全式金公司市售产品；大肠杆菌PRK2013和根癌农杆菌C58C1由本实验室保存。
科农199、轮选987、济麦22、矮抗58、杨麦16、京411、Fielder、CB037、西农979均记载在如下文献中：Wang et.al 2017Generation of marker-free transgenic hexaploidwheat via an Agrobacterium-mediated co-transformation strategy in commercialChinese wheat varieties Plant biotechnology journal 15:614-623；王荣成,张睿.肥料运筹对强筋小麦西农979群体及产量效应.西北农业学报,2012,21(6):63-66。
实施例1、小麦TaWOX5基因克隆及其在小麦转基因中的应用
一、小麦TaWOX5基因克隆
设计引物(F：GTGTCAATGGAGGCGCTGAGCG；R：GTGTCAATGGAGGCGCTGAGCG)。
提取小麦品系CB037的基因组DNA作为模板，用上述引物F和R进行AS-PCR扩增，得到约760bp片段。
将上述PCR产物连接在pMD-18T载体上，得到pMD-18T-TaWOX5，送去测序。
测序结果，该PCR产物具有序列表中序列1所示的核苷酸，命名为TaWOX5基因，该基因长度为749bp，含有1个116bp的内含子，编码210个氨基酸，该基因编码的蛋白的氨基酸序列为序列2，该蛋白命名为TaWOX5。
也可以人工合成序列1，将其连接在pMD-18T载体上，得到pMD-18T-TaWOX5。
二、小麦TaWOX5基因在小麦转基因中的应用
1、植物转化载体pDE003-TaWOX5的构建
将上述引物F和R分别加上SmaI和KpnI，利用高保真酶KOD以pMD-18T-TaWOX5为模板进行PCR扩增，然后利用KpnI和SmaI对PCR产物和pDE001载体(图1)进行酶切，得到773bp的PCR扩增产物和4535bp的pDE001载体骨架，最后将两者进行连接得到中间的植物表达载体pDE001-TaWOX5。然后利用HindIII分别对pDE001-TaWOX5和pDE003(图2)进行酶切，得到3033bp的TaWOX5酶切产物和10170bp的pDE003载体骨架，最后将两者的酶切产物进行连接得到最终的植物表达载体pDE003-TaWOX5(图3)。
pDE003-TaWOX5载体的核苷酸序列为序列1，该载体为将序列1第9812-12837所示的DNA分子(含有TaWOX5基因的表达盒)插入pDE003载体的HindIII酶切位点间得到的载体。
其中，序列1第7832-9817位为UBI启动子，第7257-7808位为Bar基因，第6989-7242位为Nos终止子,9818-11815位为UBI启动子，第11821-12573位为TaWOX5基因，第12586-12837位为Nos终止子。
将植物表达载体pDE003-TaWOX5转入大肠杆菌Top10中，得到含pDE003-TaWOX5的大肠杆菌Top10菌株。
2、重组质粒pDE003-TaWOX5转入农杆菌C58C1
1)将宿主菌农杆菌C58C1(Wang et.al 2017Generation of marker-freetransgenic hexaploid wheat via an Agrobacterium-mediated co-transformationstrategy in commercial Chinese wheat varieties Plant biotechnology journal15:614-623)菌株在4ml含Rif、Gen的LB培养基的试管中，180rpm,28℃培养40h，得到农杆菌C58C1菌液；
含pDE003-TaWOX5的大肠杆菌Top10菌株及辅助菌PRK2013(wang et.Al2017Generation of marker-free transgenic hexaploid wheat via anAgrobacterium-mediated co-transformation strategy in commercial Chinese wheatvarieties Plant biotechnology journal 15:614-623)在4ml含Kan的LB培养基的试管中，225rpm,37℃培养16h，得到含pDE003-TaWOX5的大肠杆菌Top10菌液和PRK2013菌液；
2)将农杆菌C58C1菌液、含pDE003-TaWOX5的大肠杆菌Top10菌液和PRK2013菌液各100μl加入1.5ml离心管中，混匀；用只有农杆菌C58C1菌液和辅助菌PRK2013菌液各100μl加入1.5ml离心管中作对照；4000rpm,离心3min收集菌体；
3)弃上清，并用移液枪将剩余的上清液吸干，加入50μl不含抗生素的LB培养基，重悬浮菌体；
4)用移液枪将菌体加入不含抗生素的LB固体培养基上，注意不要晃动平板，使菌体成团，待平板晾干后，用封口膜封好，28℃培养24h；
5)用接种针将从菌团上接取少量菌体，在含Rif、Gen、Kan的LB固体培养基上划线，每个平板划一个目的菌和一个对照，28℃培养48h。
6)从三亲杂交的平板上挑取单克隆，PCR验证阳性农杆菌菌株。
PCR验证的引物为引物F和R，结果得到700bp的为阳性农杆菌菌株。
阳性农杆菌菌株为将重组质粒pDE003-TaWOX5转入农杆菌C58C1得到的重组菌，命名为含pDE003-TaWOX5的农杆菌C58C1。
采用同样的方法将空载体pDE003转入农杆菌C58C1得到的重组菌，命名为含pDE003的农杆菌C58C1。
3、农杆菌介导法转化小麦
详细步骤和方法参考Wang et al.,2016和Ishida et al.,2015，具体如下：
1)在侵染前4d，将含pDE003-TaWOX5的农杆菌C58C1和含pDE003的农杆菌C58C1分别接种于含Gent 50mg L-1、Spec 50mg L-1、Rif 50mg L-1的YEP固体培养基上，28℃黑暗条件下复苏培养3d。挑取单菌落于10ml含有Gent 50mg L-1、Spec50mg L-1、Rif 50mg L-1的YEP液体培养基中，200rpm、28℃黑暗条件下过夜震荡培养.
2)室温下3,500rpm离心10min收集农杆菌菌体，倒掉上清，用MS重悬液(1/10MS基本培养基(北京西美杰科技有限公司，货号：M519，glucose 10g L-1)重悬，得到含pDE003-TaWOX5的农杆菌C58C1重悬液和含pDE003的农杆菌C58C1重悬液。
3)选择适宜大小的不同品种小麦幼胚(大约开花后14天左右)等分为2份，分别与含pDE003-TaWOX5的农杆菌C58C1重悬液和含pDE003的农杆菌C58C1重悬液混合进行侵染，然后平铺于AS基本共培养基上(1/10MS基本培养基，glucose 10g L-1，agarose 8g L-1)，25℃培养3d。
4)将共培养后的幼胚转移至恢复培养基WLS-RES(MS基本培养基，2,4-D 0.5mg L-1,picloram 2.2mg L-1,Cb 400mg L-1、Cef 100mg L-1)黑暗下培养5d。
5)将恢复培养后的幼胚转移至第一次筛选培养基WLS-P5(MS基本培养基，2,4-D0.5mg L-1,picloram 2.2mg L-1,PPT 5mg L-1、Cb 400mg L-1、Cef 100mg L-1)黑暗下培养14d。
6)然后再将愈伤转移至第一次筛选培养基WLS-P10(MS基本培养基，2,4-D 0.5mgL-1,picloram 2.2mg L-1,PPT 10mg L-1、Cb 400mg L-1)黑暗下培养21d。
7)将上述愈伤转移至分化培养基LSZ-P5(MS基本培养基、PPT 5mg L-1)，光下培养2周。
8)将小麦绿芽分离出来放置生根培养基MSF-P5(MS培养基，PPT 5mg L-1、IBA0.5mgL-1),培养21d。
9)待根长好的幼苗移栽到土中，得到转pDE003-TaWOX5苗和转pDE003苗。
4、阳性苗鉴定
1)、PCR方法
利用Bar(pDE003载体上含有Bar基因)引物(F:ACCATCGTCAACCACTACATCG；R:GCTGCCAGAAACCACGTCATG)对转pDE003-TaWOX5苗进行PCR扩增。
结果如图4所示，M：5000bp DNA marker；CK为普通小麦Fielder；1-15：转pDE003-TaWOX5苗，可以看出，得到429bp片段为阳性转pDE003-TaWOX5苗。
对转pDE003苗进行PCR扩增，结果得到429bp片段为阳性转pDE003苗。
上述结果表明，转基因苗均为阳性。
2)、转化效率统计分析
转化效率＝(阳性苗/幼胚数)*％
结果如表1所示，与转空载体pDE003相比，转pDE003-TaWOX5载体可以使同一品种的小麦转化效率有大幅度提升，如：Fielder对照转化效率为45.3％，而转TaWOX5载体的转化效率高达154％；科农199对照转化效率为22.7％，转TaWOX5载体转化效率提高到近70％；以前转化率较低的品种济麦22、轮选987、杨麦16等，转TaWOX5载体的转化效率都提高到20％以上；此外，以前不能转化的品种矮抗58、京411及西农979，转TaWOX5载体的转化效率都可以达到10％以上。
由此可见，TaWOX5可以大大提高小麦的转化效率，解决小麦转化的基因型问题。
表1对照载体和TaWOX5载体转化效率比较
Figure BDA0001315456270000071
序列表
<110>中国农业科学院作物科学研究所
<120> 小麦TaWox5基因在提高小麦转化效率中的应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 13202
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221>misc_feature
<221>（6734）…(6982）
<223>n=a或g或c或t
<400> 1
agtactttga tccaacccct ccgctgctat agtgcagtcg gcttctgacg ttcagtgcag 60
ccgtcttctg aaaacgacat gtcgcacaag tcctaagtta cgcgacaggc tgccgccctg 120
cccttttcct ggcgttttct tgtcgcgtgt tttagtcgca taaagtagaa tacttgcgac 180
tagaaccgga gacattacgc catgaacaag agcgccgccg ctggcctgct gggctatgcc 240
cgcgtcagca ccgacgacca ggacttgacc aaccaacggg ccgaactgca cgcggccggc 300
tgcaccaagc tgttttccga gaagatcacc ggcaccaggc gcgaccgccc ggagctggcc 360
aggatgcttg accacctacg ccctggcgac gttgtgacag tgaccaggct agaccgcctg 420
gcccgcagca cccgcgacct actggacatt gccgagcgca tccaggaggc cggcgcgggc 480
ctgcgtagcc tggcagagcc gtgggccgac accaccacgc cggccggccg catggtgttg 540
accgtgttcg ccggcattgc cgagttcgag cgttccctaa tcatcgaccg cacccggagc 600
gggcgcgagg ccgccaaggc ccgaggcgtg aagtttggcc cccgccctac cctcaccccg 660
gcacagatcg cgcacgcccg cgagctgatc gaccaggaag gccgcaccgt gaaagaggcg 720
gctgcactgc ttggcgtgca tcgctcgacc ctgtaccgcg cacttgagcg cagcgaggaa 780
gtgacgccca ccgaggccag gcggcgcggt gccttccgtg aggacgcatt gaccgaggcc 840
gacgccctgg cggccgccga gaatgaacgc caagaggaac aagcatgaaa ccgcaccagg 900
acggccagga cgaaccgttt ttcattaccg aagagatcga ggcggagatg atcgcggccg 960
ggtacgtgtt cgagccgccc gcgcacgtct caaccgtgcg gctgcatgaa atcctggccg 1020
gtttgtctga tgccaagctg gcggcctggc cggccagctt ggccgctgaa gaaaccgagc 1080
gccgccgtct aaaaaggtga tgtgtatttg agtaaaacag cttgcgtcat gcggtcgctg 1140
cgtatatgat gcgatgagta aataaacaaa tacgcaaggg gaacgcatga aggttatcgc 1200
tgtacttaac cagaaaggcg ggtcaggcaa gacgaccatc gcaacccatc tagcccgcgc 1260
cctgcaactc gccggggccg atgttctgtt agtcgattcc gatccccagg gcagtgcccg 1320
cgattgggcg gccgtgcggg aagatcaacc gctaaccgtt gtcggcatcg accgcccgac 1380
gattgaccgc gacgtgaagg ccatcggccg gcgcgacttc gtagtgatcg acggagcgcc 1440
ccaggcggcg gacttggctg tgtccgcgat caaggcagcc gacttcgtgc tgattccggt 1500
gcagccaagc ccttacgaca tatgggccac cgccgacctg gtggagctgg ttaagcagcg 1560
cattgaggtc acggatggaa ggctacaagc ggcctttgtc gtgtcgcggg cgatcaaagg 1620
cacgcgcatc ggcggtgagg ttgccgaggc gctggccggg tacgagctgc ccattcttga 1680
gtcccgtatc acgcagcgcg tgagctaccc aggcactgcc gccgccggca caaccgttct 1740
tgaatcagaa cccgagggcg acgctgcccg cgaggtccag gcgctggccg ctgaaattaa 1800
atcaaaactc atttgagtta atgaggtaaa gagaaaatga gcaaaagcac aaacacgcta 1860
agtgccggcc gtccgagcgc acgcagcagc aaggctgcaa cgttggccag cctggcagac 1920
acgccagcca tgaagcgggt caactttcag ttgccggcgg aggatcacac caagctgaag 1980
atgtacgcgg tacgccaagg caagaccatt accgagctgc tatctgaata catcgcgcag 2040
ctaccagagt aaatgagcaa atgaataaat gagtagatga attttagcgg ctaaaggagg 2100
cggcatggaa aatcaagaac aaccaggcac cgacgccgtg gaatgcccca tgtgtggagg 2160
aacgggcggt tggccaggcg taagcggctg ggttgtctgc cggccctgca atggcactgg 2220
aacccccaag cccgaggaat cggcgtgacg gtcgcaaacc atccggcccg gtacaaatcg 2280
gcgcggcgct gggtgatgac ctggtggaga agttgaaggc cgcgcaggcc gcccagcggc 2340
aacgcatcga ggcagaagca cgccccggtg aatcgtggca agcggccgct gatcgaatcc 2400
gcaaagaatc ccggcaaccg ccggcagccg gtgcgccgtc gattaggaag ccgcccaagg 2460
gcgacgagca accagatttt ttcgttccga tgctctatga cgtgggcacc cgcgatagtc 2520
gcagcatcat ggacgtggcc gttttccgtc tgtcgaagcg tgaccgacga gctggcgagg 2580
tgatccgcta cgagcttcca gacgggcacg tagaggtttc cgcagggccg gccggcatgg 2640
ccagtgtgtg ggattacgac ctggtactga tggcggtttc ccatctaacc gaatccatga 2700
accgataccg ggaagggaag ggagacaagc ccggccgcgt gttccgtcca cacgttgcgg 2760
acgtactcaa gttctgccgg cgagccgatg gcggaaagca gaaagacgac ctggtagaaa 2820
cctgcattcg gttaaacacc acgcacgttg ccatgcagcg tacgaagaag gccaagaacg 2880
gccgcctggt gacggtatcc gagggtgaag ccttgattag ccgctacaag atcgtaaaga 2940
gcgaaaccgg gcggccggag tacatcgaga tcgagctagc tgattggatg taccgcgaga 3000
tcacagaagg caagaacccg gacgtgctga cggttcaccc cgattacttt ttgatcgatc 3060
ccggcatcgg ccgttttctc taccgcctgg cacgccgcgc cgcaggcaag gcagaagcca 3120
gatggttgtt caagacgatc tacgaacgca gtggcagcgc cggagagttc aagaagttct 3180
gtttcaccgt gcgcaagctg atcgggtcaa atgacctgcc ggagtacgat ttgaaggagg 3240
aggcggggca ggctggcccg atcctagtca tgcgctaccg caacctgatc gagggcgaag 3300
catccgccgg ttcctaatgt acggagcaga tgctagggca aattgcccta gcaggggaaa 3360
aaggtcgaaa aggtctcttt cctgtggata gcacgtacat tgggaaccca aagccgtaca 3420
ttgggaaccg gaacccgtac attgggaacc caaagccgta cattgggaac cggtcacaca 3480
tgtaagtgac tgatataaaa gagaaaaaag gcgatttttc cgcctaaaac tctttaaaac 3540
ttattaaaac tcttaaaacc cgcctggcct gtgcataact gtctggccag cgcacagccg 3600
aagagctgca aaaagcgcct acccttcggt cgctgcgctc cctacgcccc gccgcttcgc 3660
gtcggcctat cgcggccgct ggccgctcaa aaatggctgg cctacggcca ggcaatctac 3720
cagggcgcgg acaagccgcg ccgtcgccac tcgaccgccg gcgcccacat caaggcaccc 3780
tgcctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct cccggagacg 3840
gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg 3900
ggtgttggcg ggtgtcgggg cgcagccatg acccagtcac gtagcgatag cggagtgtat 3960
actggcttaa ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat atgcggtgtg 4020
aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag gcgctcttcc gcttcctcgc 4080
tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg 4140
cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag 4200
gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc 4260
gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag 4320
gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga 4380
ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc 4440
atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg 4500
tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt 4560
ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca 4620
gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca 4680
ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag 4740
ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca 4800
agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg 4860
ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg catgatatat 4920
ctcccaattt gtgtagggct tattatgcac gcttaaaaat aataaaagca gacttgacct 4980
gatagtttgg ctgtgagcaa ttatgtgctt agtgcatcta atcgcttgag ttaacgccgg 5040
cgaagcggcg tcggcttgaa cgaatttcta gctagacatt atttgccgac taccttggtg 5100
atctcgcctt tcacgtagtg gacaaattct tccaactgat ctgcgcgcga ggccaagcga 5160
tcttcttctt gtccaagata agcctgtcta gcttcaagta tgacgggctg atactgggcc 5220
ggcaggcgct ccattgccca gtcggcagcg acatccttcg gcgcgatttt gccggttact 5280
gcgctgtacc aaatgcggga caacgtaagc actacatttc gctcatcgcc agcccagtcg 5340
ggcggcgagt tccatagcgt taaggtttca tttagcgcct caaatagatc ctgttcagga 5400
accggatcaa agagttcctc cgccgctgga cctaccaagg caacgctatg ttctcttgct 5460
tttgtcagca agatagccag atcaatgtcg atcgtggctg gctcgaagat acctgcaaga 5520
atgtcattgc gctgccattc tccaaattgc agttcgcgct tagctggata acgccacgga 5580
atgatgtcgt cgtgcacaac aatggtgact tctacagcgc ggagaatctc gctctctcca 5640
ggggaagccg aagtttccaa aaggtcgttg atcaaagctc gccgcgttgt ttcatcaagc 5700
cttacggtca ccgtaaccag caaatcaata tcactgtgtg gcttcaggcc gccatccact 5760
gcggagccgt acaaatgtac ggccagcaac gtcggttcga gatggcgctc gatgacgcca 5820
actacctctg atagttgagt cgatacttcg gcgatcaccg cttcccccat gatgtttaac 5880
tttgttttag ggcgactgcc ctgctgcgta acatcgttgc tgctccataa catcaaacat 5940
cgacccacgg cgtaacgcgc ttgctgcttg gatgcccgag gcatagactg taccccaaaa 6000
aaacatgtca taacaagaag ccatgaaaac cgccactgcg ccgttaccac cgctgcgttc 6060
ggtcaaggtt ctggaccagt tgcgtgacgg cagttacgct acttgcatta cagcttacga 6120
accgaacgag gcttatgtcc actgggttcg tgcccgaatt gatcacaggc agcaacgctc 6180
tgtcatcgtt acaatcaaca tgctaccctc cgcgagatca tccgtgtttc aaacccggca 6240
gcttagttgc cgttcttccg aatagcatcg gtaacatgag caaagtctgc cgccttacaa 6300
cggctctccc gctgacgccg tcccggactg atgggctgcc tgtatcgagt ggtgattttg 6360
tgccgagctg ccggtcgggg agctgttggc tggctggtgg caggatatat tgtggtgtaa 6420
acaaattgac gcttagacaa cttaataaca cattgcggac gtttttaatg tactgaatta 6480
acgccgaatt gctctagcca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt 6540
aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta 6600
atgtgagtta gctcactcat taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta 6660
tgttgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt 6720
acgaattcga gctnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 6780
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 6840
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 6900
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 6960
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nngagctccg atctagtaac atagatgaca ccgcgcgcga 7020
taatttatcc tagtttgcgc gctatatttt gttttctatc gcgtattaaa tgtataattg 7080
cgggactcta atcataaaaa cccatctcat aaataacgtc atgcattaca tgttaattat 7140
tacatgctta acgtaattca acagaaatta tatgataatc atcgcaagac cggcaacagg 7200
attcaatctt aagaaacttt attgccaaat gtttgaacga tctgcaggtc gacggatcag 7260
atctcggtga cgggcaggac cggacggggc ggtaccggca ggctgaagtc cagctgccag 7320
aaacccacgt catgccagtt cccgtgcttg aagccggccg cccgcagcat gccgcggggg 7380
gcatatccga gcgcctcgtg catgcgcacg ctcgggtcgt tgggcagccc gatgacagcg 7440
accacgctct tgaagccctg tgcctccagg gacttcagca ggtgggtgta gagcgtggag 7500
cccagtcccg tccgctggtg gcggggggag acgtacacgg tcgactcggc cgtccagtcg 7560
taggcgttgc gtgccttcca ggggcccgcg taggcgatgc cggcgacctc gccgtccacc 7620
tcggcgacga gccagggata gcgctcccgc agacggacga ggtcgtccgt ccactcctgc 7680
ggttcctgcg gctcggtacg gaagttgacc gtgcttgtct cgatgtagtg gttgacgatg 7740
gtgcagaccg ccggcatgtc cgcctcggtg gcacggcgga tgtcggccgg gcgtcgttct 7800
gggctcatgg atcctctaga gtcgacctgc agaagtaaca ccaaacaaca gggtgagcat 7860
cgacaaaaga aacagtacca agcaaataaa tagcgtatga aggcagggct aaaaaaatcc 7920
acatatagct gctgcatatg ccatcatcca agtatatcaa gatcaaaata attataaaac 7980
atacttgttt attataatag ataggtactc aaggttagag catatgaata gatgctgcat 8040
atgccatcat gtatatgcat cagtaaaacc cacatcaaca tgtataccta tcctagatcg 8100
atatttccat ccatcttaaa ctcgtaacta tgaagatgta tgacacacac atacagttcc 8160
aaaattaata aatacaccag gtagtttgaa acagtattct actccgatct agaacgaatg 8220
aacgaccgcc caaccacacc acatcatcac aaccaagcga acaaaaagca tctctgtata 8280
tgcatcagta aaacccgcat caacatgtat acctatccta gatcgatatt tccatccatc 8340
atcttcaatt cgtaactatg aatatgtatg gcacacacat acagatccaa aattaataaa 8400
tccaccaggt agtttgaaac agaattaatt ctactccgat ctagaacgac cgcccaacca 8460
gaccacatca tcacaaccaa gacaaaaaaa agcatgaaaa gatgacccga caaacaagtg 8520
cacggcatat attgaaataa aggaaaaggg caaaccaaac cctatgcaac gaaacaaaaa 8580
aaatcatgaa atcgatcccg tctgcggaac ggctagagcc atcccaggat tccccaaaga 8640
gaaacactgg caagttagca atcagaacgt gtctgacgta caggtcgcat ccgtgtacga 8700
acgctagcag cacggatctn acacaaacac ggatctaaca caaacatgaa cagaagtaga 8760
ctaccgggcc ctaacatgga ccgaacgcga tctagagagt anagaggggg gggggggagg 8820
acgagcggcg taccttgaag cggaggtgcc gacgggtgga tttgggggag atctggtttg 8880
tgtgtgtgtg cgctccgaac aacacgaggt tggggaaaga gggtgtggag ggggtgtcta 8940
tttattacgg cgggcgagga agggaaagcg aaggagcggt gggaaaggaa tcccccgtag 9000
ctgccggtgc cgtgagagga ggaggaggcc gcctgccgtg ccggctcacg tctgccgctc 9060
cgccacgcaa tttctggatg ccgacagcgg agcaagtcca acggtggagc ggaactctcg 9120
agaggggtcc agaggcagcg acagagatgc cgtgccgtct gcttcgcttg gcccgacgcg 9180
acgctgctgg ttcgctggtt ggtgtccgtt agactcgtcg acggcgttta acaggctggc 9240
attatctact cgaaacaaga aaaatgtttc cttagttttt ttaatttctt aaagggtatt 9300
tgtttaattt ttagtcactt tattttattc tattttatat ctaaattatt aaataaaaaa 9360
actaaaatag agttttagtt ttcttaattt agaggctaaa atagaataaa atagatgtac 9420
taaaaaaatt agtctataaa aaccattaac cctaaaccct aaatggatgt actaataaaa 9480
tggatgaagt attatatagg tgaagctatt tgcaaaaaaa aaggagaaca catgcacact 9540
aaaaagataa aactgtagag tcctgttgtc aaaatactca attgtccttt agaccatgtc 9600
taactgttca tttatatgat tctctaaaac actgatatta ttgtagtact atagattata 9660
ttattcgtag agtaaagttt aaatatatgt ataaagatag ataaactgca cttcaaacaa 9720
gtgtgacaaa aaaaatatgt ggtaattttt tataacttag acatgcaatg ctcattatct 9780
ctagagaggg gcacgaccgg gtcacgctgc aaagctttgc agcgtgaccc ggtcgtgccc 9840
ctctctagag ataatgagca ttgcatgtct aagttataaa aaattaccac atattttttt 9900
tgtcacactt gtttgaagtg cagtttatct atctttatac atatatttaa actttactct 9960
acgaataata taatctatag tactacaata atatcagtgt tttagagaat catataaatg 10020
aacagttaga catggtctaa aggacaattg agtattttga caacaggact ctacagtttt 10080
atctttttag tgtgcatgtg ttctcctttt tttttgcaaa tagcttcacc tatataatac 10140
ttcatccatt ttattagtac atccatttag ggtttagggt taatggtttt tatagactaa 10200
tttttttagt acatctattt tattctattt tagcctctaa attaagaaaa ctaaaactct 10260
attttagttt ttttatttaa taatttagat ataaaataga ataaaataaa gtgactaaaa 10320
attaaacaaa taccctttaa gaaattaaaa aaactaagga aacatttttc ttgtttcgag 10380
tagataatgc cagcctgtta aacgccgtcg acgagtctaa cggacaccaa ccagcgaacc 10440
agcagcgtcg cgtcgggcca agcgaagcag acggcacggc atctctgtcg ctgcctctgg 10500
acccctctcg agagttccgc tccaccgttg gacttgctcc gctgtcggca tccagaaatt 10560
gcgtggcgga gcggcagacg tgagccggca cggcaggcgg cctcctcctc ctctcacggc 10620
accggcagct acgggggatt cctttcccac cgctccttcg ctttcccttc ctcgcccgcc 10680
gtaataaata gacaccccct ccacaccctc tttccccaac ctcgtgttgt tcggagcgca 10740
cacacacaca aaccagatct cccccaaatc cacccgtcgg cacctccgct tcaaggtacg 10800
ccgctcgtcc tccccccccc ccctctntac tctctagatc gcgttcggtc catgttaggg 10860
cccggtagtc tacttctgtt catgtttgtg ttagatccgt gtttgtgtna gatccgtgct 10920
gctagcgttc gtacacggat gcgacctgta cgtcagacac gttctgattg ctaacttgcc 10980
agtgtttctc tttggggaat cctgggatgg ctctagccgt tccgcagacg ggatcgattt 11040
catgattttt tttgtttcgt tgcatagggt ttggtttgcc cttttccttt atttcaatat 11100
atgccgtgca cttgtttgtc gggtcatctt ttcatgcttt tttttgtctt ggttgtgatg 11160
atgtggtctg gttgggcggt cgttctagat cggagtagaa ttaattctgt ttcaaactac 11220
ctggtggatt tattaatttt ggatctgtat gtgtgtgcca tacatattca tagttacgaa 11280
ttgaagatga tggatggaaa tatcgatcta ggataggtat acatgttgat gcgggtttta 11340
ctgatgcata tacagagatg ctttttgttc gcttggttgt gatgatgtgg tgtggttggg 11400
cggtcgttca ttcgttctag atcggagtag aatactgttt caaactacct ggtgtattta 11460
ttaattttgg aactgtatgt gtgtgtcata catcttcata gttacgagtt taagatggat 11520
ggaaatatcg atctaggata ggtatacatg ttgatgtggg ttttactgat gcatatacat 11580
gatggcatat gcagcatcta ttcatatgct ctaaccttga gtacctatct attataataa 11640
acaagtatgt tttataatta ttttgatctt gatatacttg gatgatggca tatgcagcag 11700
ctatatgtgg atttttttag ccctgccttc atacgctatt tatttgcttg gtactgtttc 11760
ttttgtcgat gctcaccctg ttgtttggtg ttacttctgc aggtcgactc tagaggatcc 11820
cgggatggag gcgctgagcg ggcgggtggg agtgaagtgc gggcggtgga acccgacggc 11880
ggagcaggtg aaggtgctga cggagctgtt ccgggcgggg ctgcggacgc cgagcaccga 11940
gcagatccag cggatctcca cccacctcag cgccttcggc aaggtggaga gcaagaacgt 12000
cttctactgg ttccagaacc acaaggcccg cgagcgccac caccacaaga agcgccgccg 12060
cgtcgcatcc tgctcccccg acagcagcag caacgatgaa gagaccggcc gtgccgccgc 12120
cgccgagccc gccgacctcg tgctccagcc tcccgagagc aagcgggagg ccggaggcta 12180
caaccaccac ccccggatca tgacatgtaa gttagcagta gcacccatgt cgttgttcat 12240
acgtagagct tggtttgttc ctaatggaac agtatcctta gatcatcggc ccggtgctga 12300
tccatttggt gcgtgcatgc aggctatgtg agggaggtgg cggagcagga agaggcgacg 12360
acgtgggagc ggccgacgag ggaagtggag acgctggagc tgttcccgct caaagcagcc 12420
tgctacgacc tggagctgga ggcggacagg ttcagccggt atgtgaggag cggcgagcaa 12480
cagtgcaggg agatctcctt cttcgacgtg gccaccggac gggatccgcc gctggagctc 12540
aggctctgca gcttcgatcg gtatctggtc taaggtaccg agctgatcgt tcaaacattt 12600
ggcaataaag tttcttaaga ttgaatcctg ttgccggtct tgcgatgatt atcatataat 12660
ttctgttgaa ttacgttaag catgtaataa ttaacatgta atgcatgacg ttatttatga 12720
gatgggtttt tatgattaga gtcccgcaat tatacattta atacgcgata gaaaacaaaa 12780
tatagcgcgc aaactaggat aaattatcgc gcgcggtgtc atctatgtta ctagatcgaa 12840
ttcaagcttg gcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac 12900
ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc 12960
ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatgag cttgagcttg 13020
gatcagattg tcgtttcccg ccttcagttt aaactatcag tgtttgacag gatatattgg 13080
cgggtaaacc taagagaaaa gagcgtttat tagaataacg gatatttaaa agggcgtgaa 13140
aaggtttatc cgttcgtcca tttgtatgtg catgccaacc acagggttcc cctcgggatc 13200
aa 13202
<210> 2
<211> 210
<212> PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400> 2
Met Glu Ala Leu Ser Gly Arg Val Gly Val Lys Cys Gly Arg Trp Asn
1 5 10 15
Pro Thr Ala Glu Gln Val Lys Val Leu Thr Glu Leu Phe Arg Ala Gly
20 25 30
Leu Arg Thr Pro Ser Thr Glu Gln Ile Gln Arg Ile Ser Thr His Leu
35 40 45
Ser Ala Phe Gly Lys Val Glu Ser Lys Asn Val Phe Tyr Trp Phe Gln
50 55 60
Asn His Lys Ala Arg Glu Arg His His His Lys Lys Arg Arg Arg Val
65 70 75 80
Ala Ser Cys Ser Pro Asp Ser Ser Ser Asn Asp Glu Glu Thr Gly Arg
85 90 95
Ala Ala Ala Ala Glu Pro Ala Asp Leu Val Leu Gln Pro Pro Glu Ser
100 105 110
Lys Arg Glu Ala Gly Gly Tyr Asn His His Pro Arg Ile Met Thr Cys
115 120 125
Tyr Val Arg Glu Val Ala Glu Gln Glu Glu Ala Thr Thr Trp Glu Arg
130 135 140
Pro Thr Arg Glu Val Glu Thr Leu Glu Leu Phe Pro Leu Lys Ala Ala
145 150 155 160
Cys Tyr Asp Leu Glu Leu Glu Ala Asp Arg Phe Ser Arg Tyr Val Arg
165 170 175
Ser Gly Glu Gln Gln Cys Arg Glu Ile Ser Phe Phe Asp Val Ala Thr
180 185 190
Gly Arg Asp Pro Pro Leu Glu Leu Arg Leu Cys Ser Phe Asp Arg Tyr
195 200 205
Leu Val
210

Claims (8)

1.TaWox5蛋白或其编码基因或含有所述基因的表达盒或含有所述基因的重组载体或含有所述基因的重组菌在提高核酸分子导入小麦的转化效率中的应用；
所述TaWox5蛋白的氨基酸序列为序列2。
2.TaWox5蛋白或其编码基因或含有所述基因的表达盒在促进核酸分子导入小麦中的应用；
所述TaWox5蛋白的氨基酸序列为序列2。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：
所述TaWox5蛋白的编码基因为序列1第11821-12573位的DNA分子。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：
所述核酸分子为质粒，所述质粒为pDE003。
5.一种提高核酸分子导入小麦转化效率的方法，包括如下步骤：将含有TaWox5蛋白编码基因的表达盒和核酸分子转入小麦中，实现提高核酸分子导入小麦转化效率的目的；
所述TaWox5蛋白的氨基酸序列为序列2。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：
所述TaWox5蛋白的编码基因为序列1第11821-12573位的DNA分子；
所述含有所述基因的表达盒为核苷酸序列为序列1第9812-12837位的DNA分子。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：
所述核酸分子为质粒，所述质粒为pDE003。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：
所述含有TaWox5蛋白编码基因的表达盒和核酸分子是通过pDE003-TaWOX5载体转入小麦中；所述pDE003- TaWOX5载体的核苷酸序列为序列1。
CN201710422896.6A 2017-06-07 2017-06-07 小麦TaWox5基因在提高小麦转化效率中的应用 Active CN108997484B (zh)

Priority Applications (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710422896.6A CN108997484B (zh) 2017-06-07 2017-06-07 小麦TaWox5基因在提高小麦转化效率中的应用
CA3064981A CA3064981A1 (en) 2017-06-07 2018-06-07 Method for improving transformation efficiency of plant and method for transforming plant
EP18813480.3A EP3619225A4 (en) 2017-06-07 2018-06-07 PROCESS FOR IMPROVING THE EFFICIENCY OF TRANSFORMATION OF A PLANT AND PROCESS FOR TRANSFORMATION OF A PLANT
PCT/CN2018/090239 WO2018224001A1 (en) 2017-06-07 2018-06-07 Method for improving transformation efficiency of plant and method for transforming plant
BR112019025744A BR112019025744A8 (pt) 2017-06-07 2018-06-07 Método para aperfeiçoar a eficiência de transformação de planta e método para transformar planta
CN201880037775.2A CN111278849B (zh) 2017-06-07 2018-06-07 用于改善植物的转化效率的方法和用于转化植物的方法
US16/617,930 US11447784B2 (en) 2017-06-07 2018-06-07 Method for improving transformation efficiency of plant and method for transforming plant
AU2018280528A AU2018280528B2 (en) 2017-06-07 2018-06-07 Method for improving transformation efficiency of plant and method for transforming plant

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710422896.6A CN108997484B (zh) 2017-06-07 2017-06-07 小麦TaWox5基因在提高小麦转化效率中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108997484A CN108997484A (zh) 2018-12-14
CN108997484B true CN108997484B (zh) 2020-07-24

Family

ID=64566126

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710422896.6A Active CN108997484B (zh) 2017-06-07 2017-06-07 小麦TaWox5基因在提高小麦转化效率中的应用
CN201880037775.2A Active CN111278849B (zh) 2017-06-07 2018-06-07 用于改善植物的转化效率的方法和用于转化植物的方法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201880037775.2A Active CN111278849B (zh) 2017-06-07 2018-06-07 用于改善植物的转化效率的方法和用于转化植物的方法

Country Status (7)

Country Link
US (1) US11447784B2 (zh)
EP (1) EP3619225A4 (zh)
CN (2) CN108997484B (zh)
AU (1) AU2018280528B2 (zh)
BR (1) BR112019025744A8 (zh)
CA (1) CA3064981A1 (zh)
WO (1) WO2018224001A1 (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112521475B (zh) * 2020-12-25 2022-11-18 山东农业大学 小麦TaLAX1-A基因及其在提高小麦幼胚再生效率中的应用
EP4268583A1 (en) 2020-12-28 2023-11-01 Kaneka Corporation Method for producing transformed cells of corn or corn plant, nucleic acid construct, and method for introducing nucleic acid to cells or corn plant
CN112680539A (zh) * 2021-01-05 2021-04-20 中国农业科学院作物科学研究所 一种通过小麦TaMTL基因敲除突变体诱导的小麦单倍体植株筛选方法
WO2023118136A1 (en) 2021-12-22 2023-06-29 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Improved screening method for genome edited events
WO2023122640A1 (en) * 2021-12-22 2023-06-29 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Use of tawox for improving regeneration of plant cells
CN114736912B (zh) * 2022-03-24 2023-05-26 华南农业大学 优化的玉米rZmG2基因及其在提高植物遗传转化效率中的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1536084A (zh) * 2003-04-09 2004-10-13 中国农业科学院作物育种栽培研究所 一种用农杆菌介导对小麦进行基因转化的方法
CN102533845A (zh) * 2011-12-31 2012-07-04 哈尔滨师范大学 一种农杆菌介导的小麦遗传转化方法
CN104263753A (zh) * 2014-10-24 2015-01-07 扬州大学 一种提高农杆菌介导法转化小麦的转化率的方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7256322B2 (en) 1999-10-01 2007-08-14 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Wuschel (WUS) Gene Homologs
EP1144637B1 (en) 1999-10-01 2007-05-23 E.I. Du Pont De Nemours And Company Wuschel (wus) gene homologs
US20140130203A1 (en) * 2000-04-19 2014-05-08 Thomas J. La Rosa Rice nucleic acid molecules and other molecules associated with plants and uses thereof for plant improvement
JP2005185101A (ja) 2002-05-30 2005-07-14 National Institute Of Agrobiological Sciences 植物の全長ｃＤＮＡおよびその利用
US8586824B2 (en) * 2006-02-13 2013-11-19 Temasek Life Sciences Laboratory Plant homeodomain protein-encoding genes and their uses
WO2008001414A1 (fr) 2006-06-23 2008-01-03 Japan Tobacco Inc. Vecteur cosmide destiné à transformer une plante et son procédé d'utilisation
CA2750007A1 (en) 2009-01-28 2010-08-05 Basf Plant Science Company Gmbh Plants having enhanced yield-related traits and a method for making the same
JP4919305B2 (ja) 2010-03-12 2012-04-18 独立行政法人農業生物資源研究所 葉特異的発現活性を有するプロモーター
CN103224563B (zh) * 2013-03-29 2014-09-03 中国农业科学院作物科学研究所 合成型转录因子VP64- Os01g63510的应用
CN104031936A (zh) * 2014-06-16 2014-09-10 中国热带农业科学院橡胶研究所 一种转AtWUS基因促进橡胶树侧芽发生的方法
WO2017074547A1 (en) 2015-10-30 2017-05-04 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for rapid plant transformation
CN106676128A (zh) * 2015-11-09 2017-05-17 中国科学院上海生命科学研究院 水稻OsWOX11蛋白及其编码基因的应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1536084A (zh) * 2003-04-09 2004-10-13 中国农业科学院作物育种栽培研究所 一种用农杆菌介导对小麦进行基因转化的方法
CN102533845A (zh) * 2011-12-31 2012-07-04 哈尔滨师范大学 一种农杆菌介导的小麦遗传转化方法
CN104263753A (zh) * 2014-10-24 2015-01-07 扬州大学 一种提高农杆菌介导法转化小麦的转化率的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
WOX转录因子家族研究进展;王俞程 等;《草业科学》;20150531;第32卷(第5期);第760-769页 *
小麦中几个与农杆菌转化与组织培养再生相关基因的克隆和功能分析;赵佩;《中国博士学位论文全文数据库 农业科技辑》;20160115;第五章 *
提高植物农杆菌转化效率辅助策略研究进展;叶兴国 等;《中国农业科学》;20121231;第45卷(第15期);第3007-3019页 *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2018280528B2 (en) 2022-08-25
US11447784B2 (en) 2022-09-20
CA3064981A1 (en) 2018-12-13
EP3619225A1 (en) 2020-03-11
BR112019025744A2 (pt) 2020-06-30
CN111278849A (zh) 2020-06-12
AU2018280528A1 (en) 2019-12-19
CN108997484A (zh) 2018-12-14
EP3619225A4 (en) 2020-12-30
CN111278849B (zh) 2022-11-15
WO2018224001A1 (en) 2018-12-13
AU2018280528A8 (en) 2020-08-13
US20200231977A1 (en) 2020-07-23
BR112019025744A8 (pt) 2022-10-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108997484B (zh) 小麦TaWox5基因在提高小麦转化效率中的应用
CN108486146B (zh) LbCpf1-RR突变体用于CRISPR/Cpf1系统在植物基因编辑中的应用
CN111534535B (zh) 一种构建麦角硫因生产菌的方法
CN106834338B (zh) 拟南芥基因rem16的表达载体及其在调控植株开花期中的应用
CN109576300B (zh) 玉米转化事件HiII-AtAAP1-1及其特异性鉴定方法与应用
CN111154764B (zh) 一种通过基因组编辑提高水稻抗病性的方法及其使用的sgRNA
CN114317598A (zh) 病毒诱导的基因沉默载体及其应用和柑橘病害防控的方法
CN108531502A (zh) 柑桔衰退病毒侵染性克隆的构建及接种方法
CN101709300B (zh) 水稻人工miRNA基因干涉载体快速构建方法
CN109456990B (zh) 一种利用基因组编辑技术提高叶绿体遗传转化效率的方法
CN108559759A (zh) 三元穿梭载体及利用其构建clbv侵染性克隆的方法
CN110669794B (zh) 以突变的筛选剂抗性基因为报告体系的c·t碱基替换的细胞富集技术及其应用
CN112553246A (zh) 一种基于CRISPR-SaCas9系统的高效基因组编辑载体及其应用
CN110938650B (zh) 一种mRNA可变剪切-荧光素酶报告系统及其应用
KR20230163460A (ko) 식물에서의 증가된 형질전환성 및 반수체 유도
CN110724689B (zh) Cas9介导的麻竹基因编辑载体和应用
KR102170566B1 (ko) 목적 유전자의 발현을 조기 종결하기 위한 벡터 및 이를 포함하는 균주
CN112980709B (zh) 一种工程菌株及其构建方法和应用
CN112980710B (zh) 一种工程菌株、其构建方法和应用
RU2715314C1 (ru) Генотерапевтический ДНК-вектор VTvaf17-Act1-Cas9 на основе генотерапевтического ДНК-вектора VTvaf17, несущий целевой ген Cas9, для гетерологичной экспрессии этого целевого гена в клетках растений при геномном редактировании растений, способ получения и применения генотерапевтического ДНК-вектора, штамм Escherichia coli SCS110-AF/VTvaf17-Act1-Cas9, несущий генотерапевтический ДНК-вектор, способ его получения, способ производства в промышленных масштабах генотерапевтического ДНК-вектора
CN109750059B (zh) 水稻β-淀粉酶BA2及其编码基因与应用
US20040158889A1 (en) Efficient system for RNA silencing
CN113621531B (zh) 一种酵母工程菌及其构建方法和应用
CN113106117A (zh) 一种获得已知tdna侧翼序列插入基因组位点的方法
CN114989284A (zh) SiPSY1蛋白质及其相关生物材料在调控谷子类胡萝卜素合成中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant