CN111278849A - 用于改善植物的转化效率的方法和用于转化植物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于改善植物的转化效率的方法。根据本发明的方法包括使用编码以SEQ ID NO:2或4所示的氨基酸序列的核酸，或编码包含与以SEQ ID NO:2或4所示的氨基酸序列具有至少85％同一性且具有改善植物的转化效率的功能的氨基酸序列的多肽的核酸。

Description

用于改善植物的转化效率的方法和用于转化植物的方法

发明领域

本发明涉及用于改善植物的转化效率的方法和用于转化植物的方法。

本发明还涉及核酸构建体。本发明的核酸构建体可以用于改善植物的转化效率的方法或用于转化植物的方法中。

本发明进一步涉及经转化的植物。

本发明进一步涉及小麦TaWox5基因在改善单子叶植物，特别是小麦、玉米和稻的转化效率中的应用。

发明背景

自1983年植物转基因技术成功以来，使用遗传工程方法改善植物的发展非常迅速。2016年，世界上共有28个国家种植了转基因作物，面积为1.797亿公顷，比1996年增长了约100倍，约有1800万农民受益于转基因作物的种植。转基因作物的种植不仅增加了产率，增加了收入，而且还减少了农药的使用，保护了环境和生物多样性，并改善了农产品的质量。然而，目前在世界范围内商业化种植的转基因作物仅限于昆虫抗性玉米和棉花、除草剂抗性的大豆和油菜、抗病毒木瓜等，并且没有小麦和其他主要谷类作物。相反，全球转基因小麦的研究和工业化显然处于落后状态。除了安全性、产业政策、人们的理解和转基因品种的遗传功能的局限性之外，低效率的遗传转化技术是限制转基因小麦研究与开发的主要环节(Harwood,(2012)J.Exp.Bot.Mar；63(5):1791-8.)。为了培育具有抗病性、抗旱性、耐盐性、高质量和有效营养物吸收的转基因小麦，有必要鉴定大量候选基因的功能。因为靶基因表达受插入位点和插入拷贝数以及外源基因插入到内源基因的遗传和功能等因素的影响，所以有必要获得一定数量的转基因植物以鉴定每个候选基因的功能。此外，随着小麦基因组测序工作的完成，将克隆大量基因并进行功能研究。因此，由于转基因小麦研究和发展以及小麦功能基因组学研究需要大量的转基因植物，迫切需要改善小麦的转化效率，扩大转化规模，建立高效、安全、大规模的转基因技术系统，并且促进转基因小麦的产业化和小麦功能基因组学研究进程。

在主要作物中，小麦是难以遗传转化的农作物(Harwood,2012)。基因转化效率低，并且重复性差。遗传工程育种的过程显然落后于大豆、玉米、棉花和稻等农作物的。已知日本烟草公司近年来已显著提高了小麦的遗传转化效率，并且澳大利亚可以使用此技术将小麦的转化效率改善约40％(Richardson et al.,(2014)Plant Cell Tiss.Organ.Cult.；64(1):1-19.)。但是该技术仅对Fielder、Westonia和少数基因型有效，大多数小麦品种的转化效率仍然很低，甚至无法转化。该单位于2014年引进此技术。通过对该技术的消化、吸收和改良，小麦基因型Fielder和CB037的转化效率也达到了40％，并成功转化15种商业品种，如Zhoumai 18、Yangmai 16和Ji 5264。但是，除Kenong199的转化效率达到20％外，其他品种的转化效率均不高，其中Jimai 22的转化效率仅为2.7％，Zhongmai 895的转化效率仅为3.6％，Aikang 58和Jing 411可能无法成功转换。鉴于转基因小麦的工业化前景，育种者需要使用大面积推广的小麦品种作为转化受体，因此，商品小麦品种的转化是最大的限制因素。

WUSCHEL基因(WUS基因)是同源域转录因子，其改善或抑制其他基因的表达。已知它们大多数沿着胚的顶点-基底轴不对称表达。已经在各种植物中发现了具有WUS同源盒的多个基因，并且此类基因称为WOX。

认为WUS/WOX在早期发育中在维持枝条干细胞中起重要作用。已在许多植物中发现WUS/WOX，包括拟南芥属(Arabidopsis)、矮牵牛属(petunia)、玉米和稻。

文献Graaff et al.(Genome Biology,2009,10,248)是WOX家族的综述。文献中列出了WOX家族的14个成员，即WOX1至WOX14。在WOX家族成员中，WOX5最初在稻中鉴定，并认为与早期发育中的侧根形成和枝条形成有关。它在维持干细胞中起着重要作用。由于细胞的分化特别阻止了分生组织(根冠，茎尖)的进一步延长，因此此类部位的细胞分化得到维持，受到分化抑制(干细胞的维持)以允许进一步的生长，并且认为负责维持的基因是WUX。

已经提出了WUS/WOX促进体细胞胚发生中愈伤组织形成的可能性(例如Ikeuchiet al.,The Plant Cell,2013,25,3159-3173)。然而，据报道，仅WUS/WOX的过表达导致负面现象，甚至愈伤组织死亡，缺乏再分化或异常形态，无法发展为正常个体(PlantJournal,30(3),2000)。因此，已经实施以下措施，例如诱导型启动子中WUS/WOX基因表达的控制，与要表达的期望核酸不同的核酸(如BBM(Baby Boomer))的导入，或当WUS/WOX基因变得不必要时除去它。

除了上述小麦之外，例如，大豆、菜豆、红辣椒等也难以培养，并且认为是所谓的“难以培养”的物种。而且，即使在一种物种中，也有一些品种(例如，玉米的B73)与一般研究品种(例如，对于玉米的A188)相比更难以培养。没有获得用于有效地转化植物，特别是被认为是“难以培养”的植物或变种以获得经转化的植物的有效方法，并且期望开发此类方法。

引用列表

专利文献

PTL 1:JP 2010-166924 A

PTL 2:WO2007/148819

非专利文献

NPL 1:Harwood,(2012)J.Exp.Bot.Mar；63(5):1791-8

NPL 2:Richardson et al.,(2014)Plant Cell Tiss.Organ.Cult 119,647–659

NPL 3:Graaff et al.,(2009)Genome Biology 10,248

NPL 4:Ikeuchi et al.,(2013)The Plant Cell 25,3159-3173

NPL 5:Plant Journal 30(3)2000

NPL 6:Xu et al.,(1996)Plant Mol.Biol.30:387

NPL 7:Ohshima et al,.(1990)Plant Cell 2:95

NPL 8:Aguan et al.,(1993)Mol.Gen.Genet.240:1

NPL 9:Van Breusegem et al.,(1994)Planta 193:57

NPL 10:Nundy et al.,(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1406

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NPL 12:Walker et al.,(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:6624

NPL 13:Shinozaki,K.and Yamaguchi-Shinozaki,K.,(2000)Curr.Opin.PlantBiol.3,217-223

NPL 14:Gupta et al.,(2012)Plant Cell Rep.31:839-850

NPL 15:Xu et al.,(1995)Plant Mol Biol 27:237-248

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NPL 18:Wang et.al.,(2017)Plant biotechnology journal 15:614-623

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NPL 20:Ishida,et al.,(2015)In Agrobacterium Protocols:Volume1.Methods in Molecular Biology,vol.1223(Wang,K.,ed),pp.189-198.New York:Springer Science+Business Media

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NPL 22:Barcelo and Lazzeri,(1995)Plant Gene Transfer and ExpressionProtocols pp 113-123

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NPL 24:Ishida et al.,(2007)NATURE PROTOCOLS,Vol.2,No.7,1614-1621

发明概述

技术问题

本发明的目的是提供用于改善植物的转化效率的有效方法和用于转化植物的方法。

问题的解决方案

本发明包括以下非限制性实施方案。

[实施方案1]

用于改善植物的转化效率的方法，其包括在所述植物中过表达

1)编码以SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的核酸或编码包含与以SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列并且具有改善植物的转化效率的功能的多肽的核酸；或

2)编码以SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的核酸或编码包含与以SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列并且具有改善植物的转化效率的功能的多肽的核酸。

[实施方案2]

根据实施方案1的方法，其包括在所述植物中过表达编码包含与以SEQ ID NO:2或4所示的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列并且具有改善植物的转化效率的功能的多肽的核酸。

[实施方案3]

3.根据实施方案1或2的方法，其中所述植物是单子叶植物。

[实施方案4]

4.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中所述植物选自玉米、小麦、大麦、稻、高粱和黑麦。

[实施方案5]

5.根据权利要求1至4中任一项的方法，其中植物的转化效率的改善包括以下一项或多项：

a)所述植物的愈伤组织形成的效率的改善；

b)所述植物的再分化速率的改善；和

c)基因转移效率的改善。

[实施方案6]

核酸构建体，其包含：

1)编码以SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的核酸或编码包含与以SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列并且具有改善植物的转化效率的功能的多肽的核酸；或

2)编码以SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的核酸或编码包含与以SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列并且具有改善植物的转化效率的功能的多肽的核酸；

和

用于在所述植物中产生核酸的启动子。

[实施方案7]

根据实施方案6的核酸构建体，其中所述启动子是组成型启动子、诱导型启动子或位点特异性启动子。

[实施方案8]

一种转化植物的方法，其包括对植物导入根据权利要求6或7的核酸构建体和要在所述植物中表达的期望核酸。

[实施方案9]

9.根据实施方案8的转化方法，其中瞬时表达根据权利要求6或7的核酸构建体或要在所述植物中产生的期望核酸。

[实施方案10]

通过根据实施方案9或10的转化方法获得的经转化的植物。

[实施方案11]

核酸构建体，其包含：

1)编码以SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的核酸或编码包含与以SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列并且具有改善植物的转化效率的功能的多肽的核酸；或

2)编码以SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的核酸或编码包含与以SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列并且具有改善植物的转化效率的功能的多肽的核酸；

用于在所述植物中产生核酸的启动子；

和

要在所述植物中产生的期望核酸。

[实施方案12]

实施方案11的核酸构建体，其中直接或通过接头连接

1)编码以SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的核酸或编码包含与以SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列并且具有改善植物的转化效率的功能的多肽的核酸；或

2)编码以SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的核酸或编码包含与以SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列并且具有改善植物的转化效率的功能的多肽的核酸；

和

要在所述植物中产生的期望核酸。

[实施方案13]

根据实施方案12的核酸构建体，其中所述要在所述植物中产生的期望核酸与所述核酸1)或2)的3’连接。

[实施方案14]

一种转化植物的方法，其包括将根据实施方案11至13中任一项的核酸构建体导入植物中。

[实施方案15]

实施方案14的转化方法，其中瞬时表达根据实施方案11至13中任一项的核酸构建体。

[实施方案16]

通过根据实施方案14或15的转化方法获得的经转化的植物。

在其他方面，本发明还包括以下实施方案。

[实施方案17]

TaWox5蛋白或其编码基因、或含有所述基因的表达盒、或含有所述基因的重组载体、或含有所述基因的重组细菌在改善核酸分子对靶植物的转化效率中的应用。

[实施方案18]

TaWox5蛋白、或其编码基因、或含有所述基因的表达盒在促进核酸分子导入靶植物中的应用。

[实施方案19]

根据实施方案17或18的应用，其中所述TaWox5蛋白源自小麦；

TaWox5蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

[实施方案20]

根据实施方案17至19中任一项的应用，其中，

TaWox5蛋白的编码基因是如以下1)至3)中任一项的DNA分子：

1)具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列的11825-12573中的DNA分子；

2)与1)所示的DNA分子具有大于95％、98％或99％的同源性的DNA分子；

3)在严格条件下与1)定义的DNA序列杂交并编码相同功能多肽的DNA分子。

[实施方案21]

21.根据实施方案17至20中任一项的应用，其中，

所述植物是小麦。

[实施方案22]

22.根据实施方案17至21中任一项的应用，其中，

所述核酸分子是质粒；

或所述核酸分子是质粒，并且所述质粒是pDE003。

[实施方案23]

用于改善核酸分子对靶植物的转化效率的方法，其包括以下步骤：将含有TaWox5蛋白的编码基因和所述核酸分子的表达盒转移到所述靶植物中，以改善所述核酸分子对所述靶植物的转化效率。

[实施方案24]

根据实施方案23的方法，其中，

所述TaWox5基因源自小麦；

所述TaWox5蛋白的编码基因是如以下1)至3)中任一项所描述的DNA分子：

1)具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列的11825-12573中的DNA分子；

2)与1)所示的DNA分子具有大于95％、98％或99％的同源性的DNA分子；

3)在严格条件下与1)定义的DNA序列杂交并编码相同功能多肽的DNA分子；

包含所述基因的表达盒是如以下a)至c)中任一项的DNA分子：

1)具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列的9812-12837中的DNA分子；

2)与1)所示的DNA分子具有大于95％、98％或99％的同源性的DNA分子；

3)在严格条件下与1)定义的DNA序列杂交并编码相同功能多肽的DNA分子。

[实施方案25]

25.根据实施方案23或24的方法，其中，

所述植物是小麦；

或所述核酸分子是质粒；

或所述核酸分子是质粒，并且所述质粒是pDE003。

[实施方案26]

根据实施方案25的方法，其中，

通过pDE003-TaWox5载体将含有所述TaWox5蛋白的编码基因和所述核酸分子的表达盒转移到所述靶植物中；所述pDE003-TaWox5载体的核苷酸序列是SEQ ID NO.1。

发明的有益效果

在本发明中，植物的转化效率(愈伤组织形成/再分化效率)仅通过如下改善：过表达作为WOX5相关基因的核酸1)或2)，而未进行除了感兴趣基因外的另一种基因(例如BBM基因)的表达、表达的控制或消除或除去所述WOX5相关基因。特别是在小麦中，成功地对包括难以培养的品种在内的良种品种进行了愈伤组织的形成和再分化。此外，在玉米中，也首次成功地进行了难以培养的品种(B73)的愈伤组织形成，并且再分化也已经变得可能。已知B73是最难以获得愈伤组织形成和再分化的品种之一。根据本发明，可以转化B73。因此，预期根据本发明，其他难以培养的植物和难以培养的品种也可类似地转化。

此外，成功地获得了表达由核酸1)或2)编码的蛋白质和感兴趣蛋白质的嵌合蛋白的转化植物。

通过上述改善核酸分子对靶植物的转化效率的方法，将TaWox5和其他核酸分子混合并导入靶植物中时的转化效率高于当仅将其他核酸分子导入靶植物中时的转化效率。

根据本发明，克隆了小麦TaWox5基因，并将该基因导入不同小麦中的结果显示了该基因可以大大改善小麦的转化效率。因此，不仅改善了Fielder等易转化小麦品种的转化效率，而且大大改善了Jimai 22、Aikang 58和Jing411等难转化小麦品种的转化效率，并且解决了小麦转化中基因型限制的问题。

附图简述

图1是pDE001载体的示意图。

图2是pDE003载体的示意图。

图3是pDE003-TaWox5载体的示意图。

图4是Bar基因的PCR检测结果。

图5是pCUB载体的示意图。

发明详述

1.用于改善植物的转化效率的方法

一方面，本发明涉及用于改善植物的转化效率的方法。

不受限制，用于改善植物的转化效率的方法包括在植物中过表达：

1)编码以SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的核酸或编码包含与以SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列并且具有改善植物的转化效率的功能的多肽的核酸；或

2)编码以SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的核酸或编码包含与以SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列并且具有改善植物的转化效率的功能的多肽的核酸。

(1)核酸

根据本发明的核酸是

1)编码以SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的核酸或编码包含与以SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列并且具有改善植物的转化效率的功能的多肽的核酸；或

2)编码以SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的核酸或编码包含与以SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列并且具有改善植物的转化效率的功能的多肽的核酸。

以SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列是由源自本发明中发现的小麦的WOX5相关基因(TaWox5基因)编码的氨基酸序列。源自小麦的WOX相关基因(TaWox5基因)具有以SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列。以SEQID NO:2所示的氨基酸序列由以SEQ ID NO:11(cDNA序列)所示的核酸序列编码，其对应于以SEQ ID NO:1(基因组DNA序列)所示的核酸序列的核苷酸11825至12573。

以SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列是由源自稻的WOX5相关基因(osTaWox5基因)编码的氨基酸序列。源自稻的WOX5相关基因具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列。SEQID NO:4的氨基酸序列由对应于以SEQ ID NO:3所示的核酸序列(基因组DNA序列)的以SEQ ID NO:12所示的核酸序列(cDNA序列)编码。

核酸1)是编码以SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的核酸或编码包含与以SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列并且具有改善植物的转化效率的功能的多肽的核酸。核酸2)是编码以SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的核酸或编码包含与以SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列并且具有改善植物的转化效率的功能的多肽的核酸。

由核酸1)或核酸2)编码的氨基酸序列包括以SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的变体，更具体地，与以SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列具有至少85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％同一性的氨基酸序列。一方面，由根据本发明的核酸1)或核酸2)编码的氨基酸序列包括与以SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。

如本文所用，两个氨基酸序列之间的同一性％可以通过目视检查和数学计算来确定。此外，可以使用计算机程序确定同一性％。此类计算机程序的示例包括BLAST和ClustalW。特别地，通过BLAST程序进行同一性搜索的条件(参数)如记载于Altschul etal.(Nucl.Acids.Res.,25,p.3389-3402,1997)，并可从NCBI和日本DNA数据库(DDBJ)的网站上公开获得(BLAST manual,Altschul et al.NCB/NLM/NIH Bethesda,MD 20894；Altschul et al.)。此外，可以使用诸如遗传信息处理软件GENETYX Ver.7(GENETYX)、DNASIS Pro(Hitachi Software Engineering Co.,Ltd.)或Vector NTI(Infomax)等程序来确定同一性％。

核酸1)或核酸2)可以是以SEQ ID NO:11所示的核苷酸核酸序列，或者是以SEQ IDNO:12所示的核酸序列的变体。

具体地，核酸可以是例如通过“缺失、取代、插入或添加1个或多个核苷酸”从以SEQID NO:11所示的核酸序列或以SEQ ID NO:12所示的核酸序列修饰的核酸序列。

如本文所用，就核酸序列而言的“缺失、取代、插入或添加1个或几个核苷酸”是指与靶核酸序列相比缺失1个或几个核苷酸或用其他核苷酸取代，插入其他核苷酸和/或添加其它核苷酸的核酸序列。“几个核苷酸”是指但不限于600或更少，300或更少，150或更少，100或更少，50或更少，30或更少，20或更少，15或更少，12或更少，10或更少，8或更少，6或更少，4或更少，3或更少的核苷酸。或者，术语“几个核苷酸”是指占核酸序列全长的30％，优选25％，20％，15％，10％，5％，3％，2％或1％的核苷酸。优选的是通过上述核苷酸的缺失、取代、插入或添加，在编码氨基酸的序列中不发生移码。

或者，核酸1)或核酸2)包含以SEQ ID NO:1所示的核酸序列的核苷酸11825至12573或与SEQ ID NO 3所示的核酸序列具有至少85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％同一性的核酸序列或由这些中任何核酸序列组成。一方面，根据本发明的核酸1)或核酸2)包含与以SEQ ID NO:11所示的核酸序列或以SEQ ID NO:12所示的核酸序列具有至少95％同一性的核酸序列。

如本文所用，两个氨基酸序列之间的同一性％可以通过视觉检查和数学计算来确定。此外，可以使用计算机程序确定同一性的％。此类序列比较计算机程序的实例包括BLASTN程序(Altschul et al.(1990),J.Mol.Biol.,215:403-10)，版本2.2.7或WU-BLAST2.0算法，可从美国国家医学图书馆的网站获得：https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi。可以使用因特网站点http://blast.wustl.edu中描述的WU-BLAST 2.0标准默认参数设置。

或者，核酸1)或核酸2)可以是在严格条件下与以SEQ ID NO:11所示的核酸序列或以SEQ ID NO:12所示的核酸序列杂交的核酸。或者，核酸1)或核酸2)可以是在严格条件下与同以SEQ ID NO:11所示的核酸序列或以SEQ ID NO:12所示的核酸序列互补的核酸杂交的核酸。

如本文所用，术语“在严格条件下”是指在中等或高度严格条件下的杂交。具体地，普通技术人员可以例如基于DNA的长度容易地确定中等严格条件。Sambrook et al,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版,第6-7章,Cold Spring HarborLaboratory Press,2001中阐述了基本条件。优选地，中等严格条件的实例包括1xSSC至6xSSC和42℃至55℃的杂交条件，更优选1xSSC至3xSSC和45℃至50℃的条件，最优选2xSSC和50℃的条件。若杂交溶液含有例如约50％的甲酰胺，则将使用比上述温度低5至15℃的温度。洗涤条件的实例包括在40℃至60℃的0.5xSSC至6xSSC。

在杂交和洗涤中，通常可以添加0.05％至0.2％，优选约0.1％的SDS。本领域技术人员可以例如基于DNA的长度容易地确定高度严格的条件。通常，高度严格(高严格)条件包括在比中等严格条件的那些高的温度和/或低的盐浓度杂交和/或洗涤。条件的实例包括0.1xSSC至2xSSC和55℃至65℃的杂交条件，更优选0.1xSSC至1xSSC和60℃至65℃的条件，最优选条件分别是0.2xSSC和63℃。洗涤条件的实例包括0.2xSSC至2xSSC和50℃至68℃的条件，更优选0.2xSSC和60至65℃的条件。

核酸1)和核酸2)编码具有改善植物转化效率的功能的多肽。核酸1)和核酸2)是WOX5相关基因。一方面，核酸1)和核酸2)维持WOX5相关基因具有的功能(包括由WOX5相关基因编码的蛋白质的功能)。由WOX5相关基因编码的功能的一个实例是干细胞的维持。

SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4的氨基酸序列之间的同一性是79％。以SEQ ID NO:11所示的核酸序列与以SEQ ID NO:12所示的核酸序列的同一性为84％。

(2)植物

在本发明中，要改善转化效率的植物的种类没有特别限制。

植物可以是双子叶植物或单子叶植物，并且它优选是单子叶植物。进一步优选地，它是禾本科(Poaceae)的植物，更优选地，它是玉米、小麦、大麦、稻、高粱、黑麦等，并且最优选地，它是玉米、小麦或稻。

根据本发明的方法可以用于特别但不限于认为是“难以培养”的植物或品种。术语“难以培养”是指难以培养，更具体地例如，难以培养从植物体分离的细胞，难以通过诸如去分化等处理形成愈伤组织或难以使愈伤组织再分化成植物体。

通常，单子叶植物比双子叶植物更难以培养，但是“难以培养”植物的实例包括大豆、菜豆和红辣椒。术语“难以培养的品种”是指比相同物种的普通研究品种(例如玉米的A188)难以培养的品种。其实例包括玉米B73或源自B73的良种玉米品种；良种小麦品种(例如TAM)；除Golden Promise和Igri以外的大麦品种；和除296B、C401、SA281、P898012、Pioneer 8505和Tx430以外的高粱品种。

(3)过表达

在本发明中，在植物中过表达基因。

术语“过表达(核酸)”(在本文中，也简称为“表达”)是指人工表达在自然条件下不表达的核酸或以比自然条件下表达的量多的量人工表达核酸。

过表达核酸的手段没有特别限制。可以使用允许在植物(包括任何形式，例如卵、花粉(sperm)、种子、细胞、未成熟胚、成熟胚、愈伤组织和成年植物)中过表达核酸的任何已知手段。在将外源基因整合到载体中之后，可以通过基因转移技术将基因导入植物中，所述基因转移技术例如但不限于土壤杆菌介导的基因转移。此外，存在于植物中的基因可以使用诸如基因组编辑等技术过表达。

用于引入外源核酸的基因转移方法没有特别限制，并且其实例包括已知方法，例如土壤杆菌介导的基因转移、聚乙二醇(PEG)方法、晶须法、显微注射、玻璃珠法、颗粒轰击和电穿孔。

用于过表达植物中存在的基因的基因组编辑技术没有特别限制。其实例包括CRISPR-Cas方法、TALLEN方法、锌指介导的诱变、冷却(chilling)、同源重组、寡核苷酸特异性诱变、大核酸酶介导的诱变及其组合。方法的实例包括但不限于用于编辑内源基因的启动子以过表达该基因的方法和用于编辑内源基因的部分以将其改变为根据本发明的基因序列的方法。

一方面，过表达不仅包括上述核酸的组成性过表达，而且还包括瞬时或位点特异性过表达。

(4)转化效率

根据本发明的方法改善植物的转化效率。术语“改善转化效率”通常是指以下一种或多种：a)植物的愈伤组织形成效率的改善；b)植物的再分化速率的改善；和c)基因转移效率的改善。“改善转化效率”优选是愈伤组织形成效率的改善和/或再分化速率的改善，并且进一步优选愈伤组织形成效率的改善。

术语“改善”指但不限于与当不过表达上述核酸时的情况相比将植物的愈伤组织形成效率、植物的再分化速率或基因转移效率改善例如1.5倍或更多倍，2倍或更多倍，3倍或更多倍，4倍或更多倍，或5倍或更多倍。或者，它是指在没有上述核酸的过表达的情况下不可能时，使植物的愈伤组织形成、植物的再分化或基因转移成为可能。

例如，在下文所述的实施例中，仅通过小麦中上述核酸的过表达来改善愈伤组织形成的效率和再分化的效率两者。此外，玉米的愈伤组织形成是可能的，这在本发明之前是不可能的。

2.核酸构建体(实施方案A)

一方面，本发明涉及核酸构建体(实施方案A)。

核酸构建体(实施方案A)包括但不限于：

1)编码以SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的核酸或编码包含与以SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列并且具有改善植物的转化效率的功能的多肽的核酸；或

2)编码以SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的核酸或编码包含与以SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列并且具有改善植物的转化效率的功能的多肽的核酸；

和

用于在所述植物中产生核酸的启动子。

核酸1)或2)如以上“1.用于改善植物的转化效率的方法”中所述。

(1)启动子

本发明的核酸构建体包括用于在靶植物中表达核酸的启动子。

启动子没有特别限制，只要启动子可以在靶植物细胞中实现感兴趣核酸的转录。在一个实施方案中，启动子是组成型启动子、诱导型启动子或位点特异性启动子。

启动子的实例包括花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)、各种泛素启动子、各种肌动蛋白启动子、烟草PR1a基因启动子、胭脂碱合酶基因启动子、油菜贮藏蛋白(napin)基因启动子、油质蛋白基因启动子等。

在一个实施方案中，可使用诱导型启动子。诱导型启动子的实例包括已知其表达受外部因素诱导的启动子，诸如丝状真菌、细菌或病毒的感染或侵入；低温、高温、干燥或紫外线照射；施加特定的化学物质，例如激素，如生长素和油菜素固醇类(brassinosteroid)；和其他外部因素。启动子的更具体实例包括稻几丁质酶基因的启动子(Xu et al.1996Plant Mol.Biol.30:387)和烟草PR蛋白基因的启动子(Ohshima et al.1990 Plant Cell2:95)，其表达是由丝状真菌、细菌或病毒的感染或侵入诱导的；稻“lip19”基因的启动子(Aguan et al.1993 Mol.Gen.Genet.240:1)，其表达是由低温诱导的；稻“hsp80”基因和“hsp72”基因的启动子(Van Breusegem et al.1994 Planta 193:57)，其表达是由高温诱导的；拟南芥(Aarabidopsis thaliana)“rab16”基因的启动子(Nundy et al.1990Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1406)，其表达是由干燥诱导的；欧芹查尔酮合酶基因的启动子(Schulze-Lefert et al.1989 EMBO J.8:651)，其表达是由紫外线照射诱导的；玉米醇脱氢酶基因的启动子(Walker et al.1987 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:6624)，其表达是由厌氧条件诱导的；以及通过盐胁迫诱导表达的启动子(Shinozaki,K.and Yamaguchi-Shinozaki,K.,Curr.Opin.Plant Biol.3,217-223(2000))。此外，由四环素诱导的四环素诱导系统，其使用大肠杆菌转座子Tn10中存在的四环素抗性操纵子(tet操纵子)；LexA的氨基酸序列(氨基酸1-87)，由雌二醇诱导的大肠杆菌SOS调节子的阻遏物；来自单纯疱疹病毒(HSV)的VP16(氨基酸序列)的转录活性位点(氨基酸残基403-479)；通过融合人雌激素受体的调节区(氨基酸残基282-595)制备的合成转录激活物XVE(氨基酸序列)；和转录诱导系统，其中多个SOS盒(5’-TACTGTATATATATACAGTA-3’)(最初LexA结合的操纵基因)作为XVE结合的顺式序列排列在CaMV 35S最小启动子的TATA盒的上游。

也可以使用位点特异性启动子。位点特异性启动子的实例包括用于表达核酸的叶特异性启动子(例如，水稻psb0基因启动子(JP-A-2010-166924))、用于表达核酸的茎特异性启动子(例如拟南芥FA6启动子(Gupta et al.2012 Plant Cell Rep 31:839-850)、用于表达核酸的根特异性启动子(例如RCc3启动子(Xu et al.1995 Plant Mol Biol 27:237-248)和主要在根、茎和叶的营养器官中表达的启动子(例如，拟南芥AS启动子)。

在本发明的一个实施方案中，仅通过过表达核酸，可以形成难以形成愈伤组织的靶植物的愈伤组织，并改善转化效率。非限制地，在一个实施方案中，启动子不是诱导型启动子，而是组成型启动子。

(2)载体

1)或2)的核酸和用于在靶植物中表达核酸的启动子可以与任何载体连接。“载体”是用于扩增、维持和引入基因重组技术中要使用的重组核酸的核酸分子。含有核酸和用于在靶植物中表达核酸的启动子的载体在整体上可以称为核酸构建体或载体。注意，载体可以是线性或环形的，并且优选地是环形的。

可用的重组载体可用于以常规方式连接核酸和用于在靶植物中表达核酸的启动子。本发明中使用的载体没有特别限制，只要其可用于在靶植物细胞中实现本发明的目标效果。例如，可以使用pBI系列的载体、pBluescript系列的载体和pUC系列的载体。pBI系列载体的实例包括pBI121、pBI101、pBI101.2、pBI101.3和pBI221。优选二元载体，例如pBI系列载体，因为它们可以通过土壤杆菌将感兴趣核酸导入靶植物中。pBluescript系列载体的实例包括pBluescript SK(+)、pBluescript SK(-)、pBluescript II KS(+)、pBluescriptII KS(-)，pBluescript II SK(+)和pBluescript II SK(-)。pUC系列载体的实例包括pUC19和pUC119。优选pBluescript系列和pUC系列载体，因为它们可以将核酸直接导入靶植物中。此外，优选地，也可以使用诸如pGreen系列(www.pgreen.ac.uk)、pCAMBIA系列(www.cambia.org)和pLC系列(WO2007/148819)等二元载体，以及诸如pSB11(Komari etal,1996,Plant J,10:165-174)和pSB200(Komori et al,2004,Plant J,37:315-325)载体等超二元载体。另外，也可以优选使用通过组合这些部分制备的载体。

本发明的载体可以进一步包含转化体鉴定标志物。作为标志物，例如可以使用药物选择标志物基因。药物选择标志物基因没有特别限制，并且可以使用任何已知的基因。药物选择标志物基因的具体实例包括庆大霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、壮观霉素抗性基因、四环素抗性基因、潮霉素抗性基因和许多其他药物选择标志物基因。此外，可以使用对除草剂膦丝菌素等具有抗性的膦丝菌素乙酰转移酶基因(bar)。此外，可以使用用荧光材料标记的标志物基因，例如DsRed2(TaKaRa-Bio)和GFP。

本发明的载体可以进一步包含转录终止子序列等。转录终止子序列没有特别限制，只要其具有作为转录终止位点的功能，并且可以是任何已知的转录终止子序列。转录终止子序列取决于使用的启动子是可选择的，并且其实例包括花椰菜花叶病毒35S的转录终止区域(CaMV35S终止子)和胭脂碱合酶基因的转录终止区域(Nos终止子)。在上述重组表达载体中，通过将转录终止子序列排列在适当的位置，可以在将载体导入靶植物细胞中之后防止诸如合成长得不必要的转录物等现象的发生。

此外，重组表达载体可以进一步包含其他核酸区段。其他核酸区段没有特别限制，并且其实例包括转化体选择标志物、增强子和用于增强翻译效率的核苷酸序列。此外，上述重组表达载体可以进一步包含T-DNA区域。T-DNA区域，特别是当使用土壤杆菌将重组表达载体导入靶植物中时，可以增强基因转移效率。注意，每个重组表达载体的T-DNA数目没有确定，并且它可以根据目的选择。

用于增强翻译效率的核苷酸序列的实例包括来自烟草花叶病毒的omega序列。通过将omega序列排列在启动子的非翻译区(5’UTR)中，可以增强融合基因的翻译效率。

此外，增强子的实例包括包含CaMV35S启动子内的上游侧序列的增强子区域。因此，根据目的，上述重组表达载体可以包括各种核酸区段。

本发明的核酸构建体(实施方案A)可以用于改善靶植物的转化效率的方法和/或本发明的靶植物的转化方法中。本发明包括核酸构建体在用于改善靶植物中转化效率的方法中的用途以及核酸构建体在转化方法中的用途。

3.转化方法(实施方案A)

在一个实施方案中，本发明包括靶植物的转化方法(实施方案A)。

靶植物的转化方法(实施方案A)包括将核酸构建体(实施方案A)和要在靶植物中表达的期望核酸导入靶植物中。

“要在靶植物中表达的期望核酸”(感兴趣基因：GOI)是要导入靶植物细胞中的具有任何序列的核酸，没并且有特别限制。它可以是编码氨基酸序列(结构基因)的核酸序列或者可以是非结构基因。感兴趣的核酸序列可以与期望的启动子和终止子连接。例如，它可以是一组能够通过在靶植物中过表达和启动子获得期望性状(表型)的基因，并且可以像RNAi一样，是能够通过抑制植物内源基因获得期望性状的核酸序列。此外，它可以是用于进行基因组编辑的核酸序列，如编码Cas蛋白的基因和引导序列。

核酸的长度没有特别限制，但优选为适合于与核酸构建体(实施方案A)一起导入靶植物细胞中并表达的长度。非限制地，长度是100kbp或更小，优选为50kbp或更小，更优选为30kbp、10kbp或更小和1kbp或更小。

用于将核酸构建体(实施方案A)和在靶植物中表达的期望核酸导入靶植物中的手段没有特别限制。非限制地，手段可以包括将外源基因掺入载体等中，然后通过基因转移方法，例如土壤杆菌法将基因导入靶植物中。或者，用于将核酸构建体(实施方案A)和要在靶植物中表达的期望核酸导入靶植物中的手段可以包括如下实施方案，其中通过使用基因组编辑等技术编辑靶植物中存在的基因并且表达。

导入顺序没有限制，只要在转化靶植物的过程中的特定点时已经导入了核酸构建体(实施方案A)和要在靶植物中表达的期望核酸。可以同时导入(共转化)核酸构建体和要在靶植物中表达的期望核酸，或者可以先产生通过导入核酸构建体获得的经转化的植物，然后将要在靶植物中表达的期望核酸导入产生的经转化的植物中，或者反之亦然。

核酸构建体和要在靶植物中表达的期望核酸可以存在于不同的载体中，或者可以存在于一种载体中。当两者存在于一个载体中时，它们可以在相同启动子的控制下，或者可以在不同启动子的控制下。核酸构建体和要在靶植物中表达的期望核酸可以在在线性片段上保持的情况下导入靶植物中，然后表达。

共转化是同时转化两个或更多个独立的外源遗传物质。共转化方法的实例包括用于在单个基因转移期间将各自具有多个T-DNA的多个二元载体导入靶植物的方法(多载体方法)，用于在单个基因转移期间将具有两个或更多个T-DNA的一个二元载体导入的方法(单载体，多T-DNA方法)，用于在单个基因转移期间导入仅具有一个T-DNA的一个二元载体，然后通过使用两个或更多个右边界序列排列构成两个或更多个基因的一个T-DNA的方法(一个载体，两个边界方法：Yau and Stewart,2013)；和用于在单个基因转移期间导入仅具有一个T-DNA，具有两个或更多个启动子、要在靶植物中表达的期望核酸和终止子的T-DNA的一个二元载体的方法(一个载体，一个T-DNA的方法)。在本发明中，可以优选地进行任何这些手段。

用于导入核酸构建体和要在靶植物中表达的期望核酸的载体的类型没有特别限制。可以使用“2.核酸构建体(实施方案A)”中所述的任何载体。在多载体方法的情况下，可以以任何组合使用载体。

此外，可以瞬时表达或稳定表达核酸构建体和/或要在靶植物中表达的期望核酸。在一个实施方案中，非限制地，瞬时表达核酸构建体或要在靶植物中表达的期望核酸。

4.经转化的植物(实施方案A)

在一个实施方案中，本发明涉及经转化的植物(实施方案A)。

本发明的经转化的植物(实施方案A)是通过本发明的转化方法(实施方案A)获得的经转化的植物。特别地，本发明第一次使得能够提供所谓的“难培养”植物或变种中的经转化的植物。在本发明的经转化的植物中，核酸组成性、瞬时或位点特异性过表达。

5.核酸构建体(实施方案B)

在一个实施方案中，本发明涉及核酸构建体(实施方案B)。

核酸构建体(实施方案B)包括但不限于：

1)编码以SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的核酸或编码包含与以SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列并且具有改善靶植物中的转化效率的功能的多肽的核酸；或

2)编码以SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的核酸或编码包含与以SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列并且具有改善靶植物中的转化效率的功能的多肽的核酸；

用于在靶植物中表达核酸的启动子；和

要在靶植物中表达的期望核酸。

1)或2)的核酸如“1.用于改善靶植物中的转化效率的方法”中所述。用于在靶植物中表达核酸的启动子如上文“2.核酸构建体(实施方案A)”中所述。要在靶植物中表达的期望核酸如上文“3.转化方法(实施方案A)”中所述。

1)或2)的核酸和用于在靶植物中表达该核酸的启动子可以与任何载体连接。“载体”如上文“2.核酸构建体(实施方案A)”中所述。

通过在靶植物中表达核酸构建体(实施方案B)，获得由1)或2)的核酸编码的蛋白质和由期望核酸编码的蛋白质构成的融合蛋白，即嵌合蛋白。嵌合蛋白的制备方法没有特别限定，并且可以使用任何已知的遗传工程技术来表达嵌合蛋白。

非限制地，在一个实施方案中，1)或2)的核酸和要在靶植物中表达的期望核酸直接或通过接头连接。在一个实施方案中，将要在靶植物中表达的期望核酸与1)或2)的核酸的3’侧连接。

在通过在靶植物中表达核酸构建体(实施方案B)可获得的嵌合蛋白中，由1)或2)的核酸编码的蛋白质和由期望核酸编码的蛋白质可以直接或通过接头键合。接头没有特别限制，并且可以是氨基酸接头。在一个实施方案中，氨基酸接头的长度为但不限于1个氨基酸残基或更多，2个氨基酸残基或更多，3个氨基酸残基或更多，4个氨基酸残基或更多，5个氨基酸残基或更多，8个氨基酸残基或更多，10个氨基酸残基或更多，12个氨基酸残基或更多。在一个实施方案中，氨基酸接头的长度为但不限于50个氨基酸残基或更少，40个氨基酸残基或更少，30个氨基酸残基或更少，25个氨基酸残基或更少，20个氨基酸残基或更少，15个氨基酸残基或更少，12个氨基酸残基或更少。在一个实施方案中，非限制地，氨基酸接头的长度是1-50个氨基酸残基，优选5-25个氨基酸残基。优选的是，接头不影响由1)或2)的核酸编码的蛋白质和由期望核酸编码的蛋白质的功能，并且中性氨基酸如甘氨酸、丝氨酸或丙氨酸是优选的。

在嵌合蛋白质中，由1)或2)的核酸编码的蛋白质可以与由期望核酸编码的蛋白质的N端侧或C端侧键合。优选地，由1)或2)的核酸编码的蛋白质在由期望核酸编码的蛋白质的N端侧。在实施例5中，当由1)或2)的核酸编码的蛋白质在N端侧时，获得了更高的转化效率。

本发明的核酸构建体(实施方案B)可以用于改善靶植物中的转化效率的方法和/或本发明的靶植物的转化方法中。本发明包括核酸构建体在用于改善靶植物中转化效率的方法中的用途以及核酸构建体在转化方法中的用途。

6.转化方法(实施方案B)

在一个实施方案中，本发明包括靶植物的转化方法(实施方案B)。

本发明的转化方法(实施方案B)包括将核酸构建体(实施方案B)导入靶植物中。

核酸构建体(实施方案B)如“5.核酸构建体(实施方案B)”中所述。用于在靶植物中导入核酸构建体(实施方案B)的手段没有特别限制，并且如“3.转化方法(实施方案A)”中所述。通过在靶植物中进行靶植物的转化方法(实施方案B)，在靶植物中表达由1)或2)的核酸编码的蛋白质和由期望核酸编码的蛋白质构成的融合蛋白，即嵌合蛋白。

非限制性地，在一个实施方案中，瞬时表达核酸构建体(实施方案B)。

7.经转化的植物(实施方案B)

在一个实施方案中，本发明涉及经转化的植物(实施方案B)。

本发明的经转化的植物(实施方案B)是通过本发明的转化方法(实施方案B)获得的转化植物。特别地，本发明第一次使得能够提供所谓的“难培养”植物或变种中的经转化的植物。在本发明的经转化的植物中(实施方案B)，组成性，瞬时或位点特异性过表达由1)或2)的核酸编码的蛋白质和由期望核酸编码的蛋白质的嵌合蛋白。

实施例

在下文中，将参考实施例详细描述本发明，但是本发明不限于这些实施例。基于本文的描述，本领域技术人员可以容易地对本发明进行修改和/或改变，并且那些修改和/或改变的发明也包括在本发明的技术范围内。

除非另有说明，否则以下实施例中使用的实验方法为常规方法。

除非另有说明，否则以下实施例中使用的材料，试剂等是市售的。

在下面的实施例中说明的质粒和菌株是为了进一步阐述本发明的目的，而不是意图限制本发明的实质内容。在未指明具体测试条件的情况下，它们是本领域技术人员公知的常规条件，例如Sambrook等人,于分子克隆：实验手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)描述的，或制造商建议的。

实施例1

本实施例中说明的质粒和菌株源自以下各项：

克隆载体pMD-18T是Takara的市售产品。

植物表达载体pDE001和pDE003是Biodee的市售产品。

大肠杆菌TOP 10是北京TransGen Biotech的市售产品；大肠杆菌PRK2013和根癌土壤杆菌C58C1由本实验室保存。

Kenong 199、Lunxuan 987、Jimai 22、Aikang 58、Yangmai 16、Jing 411、Fielder、CB037和Xinong 979都记录在以下文献中：Wang et.al.,2017Generation ofmarker-free transgenic hexaploid wheat via an Agrobacterium-mediated co-transformation strategy in commercial Chinese wheat varieties Plantbiotechnology journal 15:614-623；Rongcheng Wang,Rui Zhang,Effect ofFertilizer Application on Yield and Population of Strong Gluten Wheat Xinong979,Acta Agriculturae Boreali-occidentalis Sinica,2012,21(6):63-66。

本实施例描述了小麦TaWox5基因克隆及其在小麦转基因中的应用。

I.小麦TaWox5基因克隆

设计引物(F:GTGTCAATGGAGGCGCTGAGCG；R:GTGTCAATGGAGGCGCTGAGCG))(SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:6)

提取小麦菌株CB037的基因组DNA作为模板，并使用上述引物F和R进行AS-PCR扩增以获得约760bp的片段。

将PCR产物连接至pMD-18T载体以获得pMD-18T-TaWox5，并送去测序。

测序结果是该PCR产物具有序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸，称为TaWox5基因。该基因长度为749bp，含有116bp内含子，并且编码210个氨基酸。该基因编码的蛋白质的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，称为TaWox5。

SEQ ID NO:1也可以人工合成并连接到pMD-18T载体以获得pMD-18T-TaWox5。

II.小麦TaWox5基因在小麦转基因中的应用

1.植物转化载体pDE003-TaWox5的构建

引物Wox5SmaF:AAACCCGGGATGGAGGCGCTGAGCGG和Wox5KpnR:AAAGGTACCTTAGACCAGATACCGAT(SEQ ID No:7和8)，用高保真酶KOD以pMD-18T-TaWox5为模板进行PCR扩增。然后，用KpnI和SmaI对PCR产物和pDE001载体(图1)进行酶消化，以获得773bp PCR扩增产物和4535bp pDE001载体主链。最后，将773bp PCR扩增产物和4535bppDE001载体主链连接起来，以获得中间植物表达载体pDE001-TaWox5。然后将pDE001-TaWox5和pDE003(图2)用HindIII进行酶消化，以获得3033bp TaWox5酶消化的产物和10170bp pDE003载体主链。最后，将两种经酶消化的产物连接以获得最终的植物表达载体pDE003-TaWox5(图3)。

pDE003-TaWox5载体的核苷酸序列是SEQ ID NO:1，其是通过将SEQ ID NO:1中9812-12837所示的DNA分子(含有TaWox5基因的表达盒)插入pDE003载体的HindIII酶消化位点中获得的载体。

在SEQ ID NO:1中，7832-9817位点是UBI启动子，7257-7808位点是Bar基因，6989-7242位点是Nos终止子，9818-11815位点是UBI启动子，11825-12573个位点是TaWox5基因，而12586-12837位点是Nos终止子。

将植物表达载体pDE003-TaWox5转移至大肠杆菌Top 10中，以获得含有pDE003-TaWox5的大肠杆菌Top 10菌株。

2.将重组质粒pDE003-TaWox5转移至土壤杆菌C58C1中

1)在4ml含有Rif，Gen LB培养基的试管中在28℃以180rpm培养宿主土壤杆菌C58C1菌株(Wang et.al.,2017 Generation of marker-free transgenic hexaploidwheat via an Agrobacterium-mediated co-transformation strategy in commercialChinese wheat varieties Plant biotechnology journal 15:614-623)达40h，以得到土壤杆菌C58C1细菌溶液。

在4ml含有Kan LB培养基的试管中以225rpm在37℃培养含有pDE003-TaWox5的大肠杆菌Top 10菌株和辅助细菌PRK2013(Wang et.al.,2017Generation of marker-freetransgenic hexaploid wheat via an Agrobacterium-mediated co-transformationstrategy in commercial Chinese wheat varieties Plant biotechnology journal15:614-623)达16h，以获得含有pDE003-TaWox5的大肠杆菌Top 10细菌溶液和PRK2013细菌溶液。

2)将100μl土壤杆菌C58C1细菌溶液，含有pDE003-TaWox5的大肠杆菌Top 10细菌溶液和PRK2013细菌溶液分别添加至1.5ml离心管中并均匀混合；仅将100μl土壤杆菌C58C1细菌溶液和辅助细菌PRK2013溶液分别添加到1.5ml离心管中作为对照，并以4000rpm离心3分钟以收集菌体。

3)弃去上清液，用移液管将剩余的上清液吸起，并添加50μl不含抗生素的LB培养基，并将菌体重新悬浮。

4)将菌体添加到不含抗生素的LB固体培养基。注意不要摇动平板，以使菌体集簇，然后将平板晾干后用密封膜密封，并在28℃下培养24小时。

5)用接种针从细菌簇中提取少量的菌体，在含有Rif、Gen、Kan的LB固体培养基上划线，并在28℃下培养48小时，在每个平板上划线一种靶细菌和一种对照。

6)从三元杂交板中挑选单个克隆，并通过PCR鉴定阳性土壤杆菌菌株。

用于PCR鉴定的引物是引物F和R，并且因此获得了700bp的阳性土壤杆菌菌株。

阳性土壤杆菌菌株是通过将重组质粒pDE003-TaWox5转移到土壤杆菌C58C1中得到的重组细菌，称为含有pDE003-TaWox5的土壤杆菌C58C1。

通过相同的方法将空载体pDE003转移到土壤杆菌C58C1中，以得到含有pDE003的重组细菌，称为土壤杆菌C58C1。

3.土壤杆菌介导的小麦转化

详细的步骤和方法参见Wang et al.,2016和Ishida et al.,2015，具体如下。

1)在感染前4天，将含有pDE003-TaWox5的土壤杆菌C58C1和含有pDE003的土壤杆菌C58C1分别接种到含有Gent 50mg L^-1、Spec 50mg L^-1和Rif 50mg L^-1的YEP固体培养基中，并且在黑暗中于28℃复苏3天。挑出单菌落，将其添加到10ml含有Gent 50mg L^-1、Spec50mg L^-1和Rif 50mg L^-1的YEP液体培养基中，摇动并在28℃于黑暗中以200rpm培养过夜。

2)通过在室温以3500rpm离心10分钟来收集土壤杆菌菌体。弃去上清液。用MS重悬液(1/10MS基础培养基(Beijing Ximeijie Technology Co.,Ltd.,Item No.M519，葡萄糖10g L^-1)重悬土壤杆菌菌体，以获得含有pDE003-TaWox5的土壤杆菌C58C1重悬液和含有pDE003的土壤杆菌C58C1重悬液。

3)选择大小合适的小麦未成熟胚(开花后约14天)的不同品种，并均等分成两份，将它们与含有pDE003-TaWox5的土壤杆菌C58C1重悬液和含有pDE003的土壤杆菌C58C1重悬液混合并感染，然后在25℃的AS基础共培养基(1/10MS基础培养基，葡萄糖10g L^-1，琼脂糖8g L^-1)上铺3天。

4)将共培养的未成熟胚转移至恢复培养基WLS-RES(MS基础培养基，2,4-D 0.5mgL^-1、毒莠定2.2mg L^-1、Cb 400mg L^-1、Cef 100mg L^-1)在黑暗中放置5天。

5)将进行恢复培养的未成熟胚转移到第一筛选培养基WLS-P5(MS基础培养基、2,4-D 0.5mg L^-1、毒莠定2.2mg L^-1、PPT 5mg L^-1、Cb 400mg L^-1、Cef 100mg L^-1)在黑暗中放置14天。

6)然后，将愈伤组织转移至第一筛选培养基WLS-P10(MS基础培养基、2,4-D 0.5mgL^-1、毒莠定2.2mg L^-1、PPT 10mg L^-1、Cb 400mg L^-1)并在黑暗中培养21天。

7)将愈伤组织转移至分化培养基LSZ-P5(MS培养基，PPT 5mg L^-1)，并在光照下培养2周。

8)分离出小麦的嫩芽(green shoot)并置于生根培养基MSF-P5(MS培养基、PPT5mg L^-1、IBA 0.5mg L^-1)中，并且培养21天。

9)将具有生长良好的根部的幼苗移植到土壤以获得转pDE003-TaWox5幼苗和转pDE003幼苗。

4.鉴定阳性幼苗

1)PCR方法

使用Bar(包含Bar基因的pDE003载体)引物(F:ACCATCGTCAACCACTACATCG；R:GCTGCCAGAAACCACGTCATG)(SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10)对转pDE003-TaWox5幼苗进行PCR扩增。

结果显示在图4中，其中M：5000bp DNA标志物。CK：普通小麦Fielder；1-15：转pDE003-TaWox5幼苗，并且可以看到429bp片段是阳性转pDE003-TaWox5幼苗。

对pDE003幼苗进行PCR扩增，结果429bp片段为阳性转pDE003幼苗。

以上结果指示所有转基因幼苗均为阳性。

2)对转化效率的统计分析

转化效率＝(阳性幼苗数目/未成熟胚数)*％

结果如表1中显示。与转空载体pDE003相比，转pDE003-TaWox5载体可以大大改善相同品种小麦的转化效率，例如Fielder对照的转化效率为45.3％，而转TaWox5的转化效率高达154％；Kenong 199的转化效率为22.7％，而转TaWox5的转化效率改善到约70％；具有较低转化效率的品种诸如Jimai 22、Lunxuan 987和Yangmai 16的转TaWox5载体的转化效率分别改善到20％以上；另外，以前无法转化的品种，诸如Aikang 58、Jing 411和Xinong979的转TaWox5载体的转化效率可分别达到10％以上。

可以看出，TaWox5可以大大改善小麦的转化效率，并且解决小麦转化的基因型问题。

表1对照载体和TaWox5载体的转化效率的比较

实施例2

在本实施例中检查TaWox5和GUS基因作为GOI的过表达是否导致在小麦中使用轰击法进行转化的转化效率的增加。

首先，如下从小麦(品种：Fielder)的未成熟胚制备愈伤组织。小麦(品种：Fielder)愈伤组织根据Ke Wang,et al.(Ke Wang,Huiyun Liu,Lipu Du and Xingguo Ye(2017)Plant Biotechnology Journal 15,pp.614-623)和Ishida,et al.(Ishida,Y.,Tsunashima,M.,Hiei,Y.and Komari,Y.(2015)Wheat(Triticum aestivum L.)transformation using immature embryos.In Agrobacterium Protocols:Volume1.Methods in Molecular Biology,vol.1223(Wang,K.,ed),pp.189-198.New York:Springer Science+Business Media.)的方法制备，在立体显微镜下从未成熟种子中分离出未成熟胚。将胚转移到不含头孢噻肟和羧苄西林的WLS-Res培养基中。2天后，用解剖刀和镊子从未成熟的胚上切下胚轴，并在不含头孢噻肟和羧苄西林的WLS-Res培养基上放置5天。将组织转移到愈伤组织诱导培养基(WLS-P5)上并培养2周。

如下所述制备含有TaWox5和GUS基因作为GOI的质粒。首先，将含有GUS的质粒制备为带有GUS和bar的pAH006(Yin Gui-xiang et al.,(2014)Journal of Plant GeneticResources,DOI:10.13430/j.cnki.jpgr.2014.06.022三个方便实用的植物表达载体构建与验证)。实施例1中制备的pDE003-TaWox5也用于该实验。

通过基因枪将pAH006和pDE003-TaWox5以及pAH006作为阴性对照转移到小麦(Fielder)愈伤组织中，然后在没有头孢噻肟和羧苄西林的WLS-Res培养基上再放置5天。根据Barcelo和Lazzeri(Plant Gene Transfer and Expression Protocols(1995)pp 113-123,Transformation of Cereals by Microprojectile Bombardment of ImmatureInflorescence and Scutellum Tissues)，使用颗粒枪方法进行基因诱导。重新分化载体得到诱导的愈伤组织以获得经转化的植物(转pAH006+pDE003-TaWox5和转pAH006作为对照)，然后根据实施例1进行对转化效率的统计分析。

结果，转pAH006+pDE003-TaWox5的转化效率为9.55％，其远高于对照的转化效率4.04％。另外，转化体正常生长并且对其形态没有负面影响。

实施例3

在本实施例中，研究了TaWox5和GUS基因作为GOI的过表达是否导致在小麦中使用成熟胚进行转化的转化效率的增加。

首先，如下从小麦(品种：Fielder)的成熟胚制备愈伤组织。将成熟小麦(品种：Verry和CB037)的谷物用70％乙醇灭菌10分钟，浸入25％漂白剂中25分钟，然后在25℃的黑暗中于无菌水中浸泡过夜，然后用无菌水冲洗3次。将稍发芽的种子再次用25％漂白剂灭菌15分钟，然后用无菌水冲洗3次。

用锋利的刀通过来回5-6次轻轻且完全将置于无菌滤纸上的种子上的成熟胚刮成薄的小块(厚度约0.1mm和直径约0.5mm)，然后将刮擦组织在愈伤组织诱导培养基上轻柔接种一周。

阳性土壤杆菌菌株是通过将重组质粒pDE003-TaWox5或空的pDE003转移到土壤杆菌C58C1中获得的重组细菌。将带有pDE003-TaWox5或空pDE003的土壤杆菌C58C1感染愈伤组织，然后再分化以获得根据实施例1的经转化的植物。根据实施例1进行对经转化的植物中转化效率的统计分析。

结果显示于表2。尽管使用空载体pDE003没有获得转化体，但是使用pDE003-TaWox5获得了一些转化体，并且转化效率分别为1.19％和1.81％。该结果显示了TaWox5基因可以大大改善Verry和CB037两个品种中成熟胚的转化效率。

表2

所有培养基和其他步骤根据Medveckáand.Harwood(2015)(MedveckáE.andHarwood W.A.(2015)Wheat(Triticum aestivum L.)transformation using matureembryos.In Agrobacterium Protocols:Volume 1.Methods in Molecular Biology,vol.1223(Wang,K.,ed),pp.199-209.New York:Springer Science+Business Media.)进行。

在没有导入CB1(gDNA)的比较例中，根本没有发生转化。但是，在共导入CB1之后，转化变得可能。

实施例4

在本实施例中，通过土壤杆菌法将TaWox5和来自稻的TaWox5同源物osTaWox5导入玉米(品种A188和B73)中。导入的基因为以下基因：在实施例1中获得的小麦TaWox5的gDNA，根据关于TaWox5(TaWox5cDNA)(SEQ ID NO:11)、来自稻的TaWox5同源物osTaWox5的gDNA(osTaWox5gDNA)(SEQ ID NO:3)和osTaWox5的cDNA(osTaWox5cDNA)(SEQ ID NO:12)的核苷酸序列的信息合成的cDNA。在本实施例中，通过用具有一个T-DNA区域的一个载体转化来导入实施例1中获得的TaWox5，并且使用用一种具有两个T-DNA区域的一种载体，两个T-DNA的方法导入其他基因。

(1)载体的构建

通过使用pLC41(LC215698.1)为模板，进行PCR反应，以替换pLC41的10667-52的限制酶AflII和PspOMI位点(pLC41AflII-PspOMI)。

接着，通过使用pLC41AflII-PspOMI为模板以从RB上游约330bp至LB下游约520bp扩增RB-AflII-PspOMI-LB，并且还通过使用pLC41为模板从KorB至oriT扩增pLC41KorB-tooriT进行PCR反应。在RB-AflII-PspOMI-LB的PCR反应中，使用由编码RB的约330bp上游部分的序列组成的5'端磷酸化引物(pLC41 330bp-RB F+P)和由编码LB的约520bp下游部分的序列组成的5'端磷酸化引物(pLC41 LB-520bp R+P)。在针对pLC41 GUS-HPT KorB to oriT的PCR反应中，使用由编码下游方向的间隔oriT-IncC的序列组成的引物pLC41 oriT-IncC F和由编码上游方向的间隔oriT-IncC的序列组成的引物pLC41 oriT-IncC R。结果，获得来自RB-AflII-PspOMI-LB片段的1100bp的PCR产物和来自pLC41KorB to oriT片段的约10000bp的PCR产物。

连接RB-AflII-PspOMI-LB片段和pLC41KorB to oriT片段，以产生pLC41 cotraAflII-PspOMI。含有osTaWox5gDNA、osTaWox5cDNA、TaWox5gDNA或TaWox5cDNA的片段均使用表3中所述的引物合成，并插入遍在蛋白启动子-遍在蛋白内含子和Nos终止子之间。在pLC41 cotra AflII-PspOMI的第一个T-DNA中，从RB侧插入玉米遍在蛋白启动子-遍在蛋白内含子-每个TaWox5-Nos终止子表达盒和35s启动子-GUS-Nos终止子表达盒。在第二个T-DNA中，插入了35S启动子-Bar-35S终止子表达盒。

表3

(SEQ ID NOs:13-16)如此制备的pLC41-osTaWox5cDNA-GUS-bar、pLC41-osTaWox5gDNA-GUS-bar、pLC41-TaWox5cDNA-GUS-bar和pLC41-TaWox5gDNA-GUS-bar、和实施例1中以具有TaWox5的gDNA的载体制备的pDE003-TaWox5，以及还有在T-DNA上具有花椰菜花叶病毒35s启动子-himacatalase内含子-GUS-Nos终止子和玉米遍在蛋白启动子-遍在蛋白内含子-bar-Nos终止子的对照载体(pLC41-GUS-bar)进行测试。将这些载体中的每种导入具有pVGW9的根癌土壤杆菌LBA4404菌株中。

(2)玉米1的转化

将由pDE003-TaWox5、pLC41-TaWox5cDNA-GUS-bar、pLC41-TaWox5gDNA-GUS-bar或pLC41-GUS-bar和pVGW9引入的LBA4404菌株接种到玉米的未成熟胚(品种：B73)中。接种和共培养按照Ishida et al.,(2007)NATURE PROTOCOLS,Vol.2,No.7,1614-1621的方法进行。

在共培养的第5天(接种后第7天)，计数在盾片表面上形成紧密愈伤组织的未成熟胚的数量。结果显示在表4中。在用对照pLC41-GUS-bar接种的未成熟胚中，根本看不到形成紧密愈伤组织的未成熟胚。相反，在用含有TaWox5基因的载体转化的未成熟胚中，以12％至86.2％的效率观察到形成紧密愈伤组织的未成熟胚。这些愈伤组织通过继续培养而增殖。通过在再生培养中转移并培养此类愈伤组织，从增殖的愈伤组织获得再生植物。已经证实这些再生的植物可以生根并且可以通过转移到盆中的土壤中在温室中生长。

表4

(3)玉米2的转化

将由pLC41-osTaWox5cDNA-GUS-bar、pLC41-osTaWox5gDNA-GUS-bar、pLC41-TaWox5cDNA-GUS-bar或pLC41-GUS-bar和pVGW9导入的LBA4404菌株接种到玉米的未成熟胚(品种：B73)中。接种和共培养根据Ishida et al.,NATURE PROTOCOLS,2007,Vol.2,No.7,1614-1621的方法进行的。

在共培养的第5天(接种后第7天)，计数在盾片表面上形成紧密愈伤组织的未成熟胚的数目。结果显示在表5中。在用对照pLC41-GUS-bar接种的未成熟胚中，根本看不到形成紧密愈伤组织的未成熟胚。相反，在用包含各种TaWox5基因的载体转化的未成熟胚中，以32.1％至85.2％的效率观察到形成紧密愈伤组织的未成熟胚。

表5

(4)玉米3的转化

将通过pLC41-osTaWox5cDNA-GUS-bar或pLC41-TaWox5cDNA-GUS-bar和pVGW9导入的LBA4404菌株接种到玉米(品种：A188)的未成熟胚中。接种和共培养，选择和再分化根据Ishida et al.,NATURE PROTOCOLS,2007,Vol.2,No.7,1614-1621的方法进行。

切下再分化的植物叶的部分，并检查GUS基因的表达。GUS基因表达的检查根据Ishida et al.,NATURE PROTOCOLS,2007,Vol.2,No.7,1614-1621的方法进行。在从用任一种载体接种的未成熟胚获得的再分化植物的叶中，发现两片叶均为蓝色染色。因此，证实了可以在不排除TaWox5基因的情况下从用各种TaWox5转化的未成熟胚中获得再分化植物。

如上所述，在本发明的方法中，观察到玉米B73品种中的愈伤组织形成和再生，所述玉米B73品种称为“难以培养的”品种。此外，在玉米品种A188中，改善了愈伤组织效率，并且即使在不除去TaWox5基因的情况下再分化也是成功的。当使用来自小麦的WOX5相关基因和来自稻的WOX5相关基因时，观察到相似的效果。此外，观察到使用gDNA和cDNA也是有效的。

实施例5

在本实施例中，在小麦中表达TaWox5蛋白和GFP蛋白的嵌合蛋白：3'-TaWox5-GFP-5'和3'-GFP-TaWox5-5'。在这两种情况下，TaWox5和GFP均通过由10个Gly残基组成的接头组合。表6显示了该实施例中使用的引物的所有序列数据。

表6

(SEQ ID NO:17-24)为了构建带有嵌合蛋白的载体，首先，分别使用引物GFPbamFinf4和GFPbamRinf4、Wox5bamFinf3和Wox5bamRinf3获得含有具有BamH1位点和10个Gly的接头的GFP基因的片段和含有具有BamH1位点和10个Gly的接头的TaWox5基因的片段。然后用BamHI消化GFP片段、TaWox5片段和pCUB载体(如图5所示)，然后在含有GUS的片段和经消化的pCUB之间进行连接，以获得pCUB-10Gly-GFP和pCUB-10Gly-TaWox5。

(1)构建用于表达5’-TaWox5-(10Gly)-GFP-3’的载体；

使用Wox5Finf4和Wox5Rinf4作为引物扩增含有TaWox5基因的无终止密码子的片段。将此类片段和通过BamHI消化的pCUB-10Gly-GFP连接，以通过同源重组获得pCUB-TaWox5-10Gly-GFP。

(2)构建用于表达5’-GFP-(10Gly)-TaWox5-3’的载体；

使用GFPFinf3和GFPRinf3为引物，扩增含有GFP基因的无终止密码子的片段。将此类片段和通过BamHI消化的pCUB-10Gly-TaWox5连接，以通过同源重组获得pCUB-GFP-10Gly-TaWox5。

将这些载体pCUB-GFP-10Gly-TaWox5、pCUB-TaWox5-10Gly-GFP和空的pCUB导入小麦(品种：Jimai22)的未成熟胚中，然后再分化以获得转化体，并对转化效率进行统计分析。根据实施例1进行植物转化的程序和统计分析。结果，pCUB-TaWox5-10Gly-GFP的转化效率为39.6％，尽管pCUB-GFP-10Gly-TaWox5和空pCUB的转化效率为0％，未获得转化体。

序列表

序列表

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 用于改善植物的转化效率的方法和用于转化植物的方法

<130> FA0392-18046

<150> CN201710422896.6

<151> 2017-06-07

<160> 24

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 13202

<212> DNA

<213> 小麦

<220>

<221> misc_feature

<222> (6734)..(6982)

<223> n是a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (8720)..(8720)

<223> n是a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (8802)..(8802)

<223> n是a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (10827)..(10827)

<223> n是a、c、g或t

<220>

<221> misc_feature

<222> (10909)..(10909)

<223> n是a、c、g或t

<400> 1

agtactttga tccaacccct ccgctgctat agtgcagtcg gcttctgacg ttcagtgcag 60

ccgtcttctg aaaacgacat gtcgcacaag tcctaagtta cgcgacaggc tgccgccctg 120

cccttttcct ggcgttttct tgtcgcgtgt tttagtcgca taaagtagaa tacttgcgac 180

tagaaccgga gacattacgc catgaacaag agcgccgccg ctggcctgct gggctatgcc 240

cgcgtcagca ccgacgacca ggacttgacc aaccaacggg ccgaactgca cgcggccggc 300

tgcaccaagc tgttttccga gaagatcacc ggcaccaggc gcgaccgccc ggagctggcc 360

aggatgcttg accacctacg ccctggcgac gttgtgacag tgaccaggct agaccgcctg 420

gcccgcagca cccgcgacct actggacatt gccgagcgca tccaggaggc cggcgcgggc 480

ctgcgtagcc tggcagagcc gtgggccgac accaccacgc cggccggccg catggtgttg 540

accgtgttcg ccggcattgc cgagttcgag cgttccctaa tcatcgaccg cacccggagc 600

gggcgcgagg ccgccaaggc ccgaggcgtg aagtttggcc cccgccctac cctcaccccg 660

gcacagatcg cgcacgcccg cgagctgatc gaccaggaag gccgcaccgt gaaagaggcg 720

gctgcactgc ttggcgtgca tcgctcgacc ctgtaccgcg cacttgagcg cagcgaggaa 780

gtgacgccca ccgaggccag gcggcgcggt gccttccgtg aggacgcatt gaccgaggcc 840

gacgccctgg cggccgccga gaatgaacgc caagaggaac aagcatgaaa ccgcaccagg 900

acggccagga cgaaccgttt ttcattaccg aagagatcga ggcggagatg atcgcggccg 960

ggtacgtgtt cgagccgccc gcgcacgtct caaccgtgcg gctgcatgaa atcctggccg 1020

gtttgtctga tgccaagctg gcggcctggc cggccagctt ggccgctgaa gaaaccgagc 1080

gccgccgtct aaaaaggtga tgtgtatttg agtaaaacag cttgcgtcat gcggtcgctg 1140

cgtatatgat gcgatgagta aataaacaaa tacgcaaggg gaacgcatga aggttatcgc 1200

tgtacttaac cagaaaggcg ggtcaggcaa gacgaccatc gcaacccatc tagcccgcgc 1260

cctgcaactc gccggggccg atgttctgtt agtcgattcc gatccccagg gcagtgcccg 1320

cgattgggcg gccgtgcggg aagatcaacc gctaaccgtt gtcggcatcg accgcccgac 1380

gattgaccgc gacgtgaagg ccatcggccg gcgcgacttc gtagtgatcg acggagcgcc 1440

ccaggcggcg gacttggctg tgtccgcgat caaggcagcc gacttcgtgc tgattccggt 1500

gcagccaagc ccttacgaca tatgggccac cgccgacctg gtggagctgg ttaagcagcg 1560

cattgaggtc acggatggaa ggctacaagc ggcctttgtc gtgtcgcggg cgatcaaagg 1620

cacgcgcatc ggcggtgagg ttgccgaggc gctggccggg tacgagctgc ccattcttga 1680

gtcccgtatc acgcagcgcg tgagctaccc aggcactgcc gccgccggca caaccgttct 1740

tgaatcagaa cccgagggcg acgctgcccg cgaggtccag gcgctggccg ctgaaattaa 1800

atcaaaactc atttgagtta atgaggtaaa gagaaaatga gcaaaagcac aaacacgcta 1860

agtgccggcc gtccgagcgc acgcagcagc aaggctgcaa cgttggccag cctggcagac 1920

acgccagcca tgaagcgggt caactttcag ttgccggcgg aggatcacac caagctgaag 1980

atgtacgcgg tacgccaagg caagaccatt accgagctgc tatctgaata catcgcgcag 2040

ctaccagagt aaatgagcaa atgaataaat gagtagatga attttagcgg ctaaaggagg 2100

cggcatggaa aatcaagaac aaccaggcac cgacgccgtg gaatgcccca tgtgtggagg 2160

aacgggcggt tggccaggcg taagcggctg ggttgtctgc cggccctgca atggcactgg 2220

aacccccaag cccgaggaat cggcgtgacg gtcgcaaacc atccggcccg gtacaaatcg 2280

gcgcggcgct gggtgatgac ctggtggaga agttgaaggc cgcgcaggcc gcccagcggc 2340

aacgcatcga ggcagaagca cgccccggtg aatcgtggca agcggccgct gatcgaatcc 2400

gcaaagaatc ccggcaaccg ccggcagccg gtgcgccgtc gattaggaag ccgcccaagg 2460

gcgacgagca accagatttt ttcgttccga tgctctatga cgtgggcacc cgcgatagtc 2520

gcagcatcat ggacgtggcc gttttccgtc tgtcgaagcg tgaccgacga gctggcgagg 2580

tgatccgcta cgagcttcca gacgggcacg tagaggtttc cgcagggccg gccggcatgg 2640

ccagtgtgtg ggattacgac ctggtactga tggcggtttc ccatctaacc gaatccatga 2700

accgataccg ggaagggaag ggagacaagc ccggccgcgt gttccgtcca cacgttgcgg 2760

acgtactcaa gttctgccgg cgagccgatg gcggaaagca gaaagacgac ctggtagaaa 2820

cctgcattcg gttaaacacc acgcacgttg ccatgcagcg tacgaagaag gccaagaacg 2880

gccgcctggt gacggtatcc gagggtgaag ccttgattag ccgctacaag atcgtaaaga 2940

gcgaaaccgg gcggccggag tacatcgaga tcgagctagc tgattggatg taccgcgaga 3000

tcacagaagg caagaacccg gacgtgctga cggttcaccc cgattacttt ttgatcgatc 3060

ccggcatcgg ccgttttctc taccgcctgg cacgccgcgc cgcaggcaag gcagaagcca 3120

gatggttgtt caagacgatc tacgaacgca gtggcagcgc cggagagttc aagaagttct 3180

gtttcaccgt gcgcaagctg atcgggtcaa atgacctgcc ggagtacgat ttgaaggagg 3240

aggcggggca ggctggcccg atcctagtca tgcgctaccg caacctgatc gagggcgaag 3300

catccgccgg ttcctaatgt acggagcaga tgctagggca aattgcccta gcaggggaaa 3360

aaggtcgaaa aggtctcttt cctgtggata gcacgtacat tgggaaccca aagccgtaca 3420

ttgggaaccg gaacccgtac attgggaacc caaagccgta cattgggaac cggtcacaca 3480

tgtaagtgac tgatataaaa gagaaaaaag gcgatttttc cgcctaaaac tctttaaaac 3540

ttattaaaac tcttaaaacc cgcctggcct gtgcataact gtctggccag cgcacagccg 3600

aagagctgca aaaagcgcct acccttcggt cgctgcgctc cctacgcccc gccgcttcgc 3660

gtcggcctat cgcggccgct ggccgctcaa aaatggctgg cctacggcca ggcaatctac 3720

cagggcgcgg acaagccgcg ccgtcgccac tcgaccgccg gcgcccacat caaggcaccc 3780

tgcctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct cccggagacg 3840

gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg 3900

ggtgttggcg ggtgtcgggg cgcagccatg acccagtcac gtagcgatag cggagtgtat 3960

actggcttaa ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat atgcggtgtg 4020

aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag gcgctcttcc gcttcctcgc 4080

tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg 4140

cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag 4200

gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc 4260

gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag 4320

gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga 4380

ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc 4440

atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg 4500

tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt 4560

ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca 4620

gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca 4680

ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag 4740

ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca 4800

agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg 4860

ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg catgatatat 4920

ctcccaattt gtgtagggct tattatgcac gcttaaaaat aataaaagca gacttgacct 4980

gatagtttgg ctgtgagcaa ttatgtgctt agtgcatcta atcgcttgag ttaacgccgg 5040

cgaagcggcg tcggcttgaa cgaatttcta gctagacatt atttgccgac taccttggtg 5100

atctcgcctt tcacgtagtg gacaaattct tccaactgat ctgcgcgcga ggccaagcga 5160

tcttcttctt gtccaagata agcctgtcta gcttcaagta tgacgggctg atactgggcc 5220

ggcaggcgct ccattgccca gtcggcagcg acatccttcg gcgcgatttt gccggttact 5280

gcgctgtacc aaatgcggga caacgtaagc actacatttc gctcatcgcc agcccagtcg 5340

ggcggcgagt tccatagcgt taaggtttca tttagcgcct caaatagatc ctgttcagga 5400

accggatcaa agagttcctc cgccgctgga cctaccaagg caacgctatg ttctcttgct 5460

tttgtcagca agatagccag atcaatgtcg atcgtggctg gctcgaagat acctgcaaga 5520

atgtcattgc gctgccattc tccaaattgc agttcgcgct tagctggata acgccacgga 5580

atgatgtcgt cgtgcacaac aatggtgact tctacagcgc ggagaatctc gctctctcca 5640

ggggaagccg aagtttccaa aaggtcgttg atcaaagctc gccgcgttgt ttcatcaagc 5700

cttacggtca ccgtaaccag caaatcaata tcactgtgtg gcttcaggcc gccatccact 5760

gcggagccgt acaaatgtac ggccagcaac gtcggttcga gatggcgctc gatgacgcca 5820

actacctctg atagttgagt cgatacttcg gcgatcaccg cttcccccat gatgtttaac 5880

tttgttttag ggcgactgcc ctgctgcgta acatcgttgc tgctccataa catcaaacat 5940

cgacccacgg cgtaacgcgc ttgctgcttg gatgcccgag gcatagactg taccccaaaa 6000

aaacatgtca taacaagaag ccatgaaaac cgccactgcg ccgttaccac cgctgcgttc 6060

ggtcaaggtt ctggaccagt tgcgtgacgg cagttacgct acttgcatta cagcttacga 6120

accgaacgag gcttatgtcc actgggttcg tgcccgaatt gatcacaggc agcaacgctc 6180

tgtcatcgtt acaatcaaca tgctaccctc cgcgagatca tccgtgtttc aaacccggca 6240

gcttagttgc cgttcttccg aatagcatcg gtaacatgag caaagtctgc cgccttacaa 6300

cggctctccc gctgacgccg tcccggactg atgggctgcc tgtatcgagt ggtgattttg 6360

tgccgagctg ccggtcgggg agctgttggc tggctggtgg caggatatat tgtggtgtaa 6420

acaaattgac gcttagacaa cttaataaca cattgcggac gtttttaatg tactgaatta 6480

acgccgaatt gctctagcca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt 6540

aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta 6600

atgtgagtta gctcactcat taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta 6660

tgttgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt 6720

acgaattcga gctnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 6780

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 6840

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 6900

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 6960

nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nngagctccg atctagtaac atagatgaca ccgcgcgcga 7020

taatttatcc tagtttgcgc gctatatttt gttttctatc gcgtattaaa tgtataattg 7080

cgggactcta atcataaaaa cccatctcat aaataacgtc atgcattaca tgttaattat 7140

tacatgctta acgtaattca acagaaatta tatgataatc atcgcaagac cggcaacagg 7200

attcaatctt aagaaacttt attgccaaat gtttgaacga tctgcaggtc gacggatcag 7260

atctcggtga cgggcaggac cggacggggc ggtaccggca ggctgaagtc cagctgccag 7320

aaacccacgt catgccagtt cccgtgcttg aagccggccg cccgcagcat gccgcggggg 7380

gcatatccga gcgcctcgtg catgcgcacg ctcgggtcgt tgggcagccc gatgacagcg 7440

accacgctct tgaagccctg tgcctccagg gacttcagca ggtgggtgta gagcgtggag 7500

cccagtcccg tccgctggtg gcggggggag acgtacacgg tcgactcggc cgtccagtcg 7560

taggcgttgc gtgccttcca ggggcccgcg taggcgatgc cggcgacctc gccgtccacc 7620

tcggcgacga gccagggata gcgctcccgc agacggacga ggtcgtccgt ccactcctgc 7680

ggttcctgcg gctcggtacg gaagttgacc gtgcttgtct cgatgtagtg gttgacgatg 7740

gtgcagaccg ccggcatgtc cgcctcggtg gcacggcgga tgtcggccgg gcgtcgttct 7800

gggctcatgg atcctctaga gtcgacctgc agaagtaaca ccaaacaaca gggtgagcat 7860

cgacaaaaga aacagtacca agcaaataaa tagcgtatga aggcagggct aaaaaaatcc 7920

acatatagct gctgcatatg ccatcatcca agtatatcaa gatcaaaata attataaaac 7980

atacttgttt attataatag ataggtactc aaggttagag catatgaata gatgctgcat 8040

atgccatcat gtatatgcat cagtaaaacc cacatcaaca tgtataccta tcctagatcg 8100

atatttccat ccatcttaaa ctcgtaacta tgaagatgta tgacacacac atacagttcc 8160

aaaattaata aatacaccag gtagtttgaa acagtattct actccgatct agaacgaatg 8220

aacgaccgcc caaccacacc acatcatcac aaccaagcga acaaaaagca tctctgtata 8280

tgcatcagta aaacccgcat caacatgtat acctatccta gatcgatatt tccatccatc 8340

atcttcaatt cgtaactatg aatatgtatg gcacacacat acagatccaa aattaataaa 8400

tccaccaggt agtttgaaac agaattaatt ctactccgat ctagaacgac cgcccaacca 8460

gaccacatca tcacaaccaa gacaaaaaaa agcatgaaaa gatgacccga caaacaagtg 8520

cacggcatat attgaaataa aggaaaaggg caaaccaaac cctatgcaac gaaacaaaaa 8580

aaatcatgaa atcgatcccg tctgcggaac ggctagagcc atcccaggat tccccaaaga 8640

gaaacactgg caagttagca atcagaacgt gtctgacgta caggtcgcat ccgtgtacga 8700

acgctagcag cacggatctn acacaaacac ggatctaaca caaacatgaa cagaagtaga 8760

ctaccgggcc ctaacatgga ccgaacgcga tctagagagt anagaggggg gggggggagg 8820

acgagcggcg taccttgaag cggaggtgcc gacgggtgga tttgggggag atctggtttg 8880

tgtgtgtgtg cgctccgaac aacacgaggt tggggaaaga gggtgtggag ggggtgtcta 8940

tttattacgg cgggcgagga agggaaagcg aaggagcggt gggaaaggaa tcccccgtag 9000

ctgccggtgc cgtgagagga ggaggaggcc gcctgccgtg ccggctcacg tctgccgctc 9060

cgccacgcaa tttctggatg ccgacagcgg agcaagtcca acggtggagc ggaactctcg 9120

agaggggtcc agaggcagcg acagagatgc cgtgccgtct gcttcgcttg gcccgacgcg 9180

acgctgctgg ttcgctggtt ggtgtccgtt agactcgtcg acggcgttta acaggctggc 9240

attatctact cgaaacaaga aaaatgtttc cttagttttt ttaatttctt aaagggtatt 9300

tgtttaattt ttagtcactt tattttattc tattttatat ctaaattatt aaataaaaaa 9360

actaaaatag agttttagtt ttcttaattt agaggctaaa atagaataaa atagatgtac 9420

taaaaaaatt agtctataaa aaccattaac cctaaaccct aaatggatgt actaataaaa 9480

tggatgaagt attatatagg tgaagctatt tgcaaaaaaa aaggagaaca catgcacact 9540

aaaaagataa aactgtagag tcctgttgtc aaaatactca attgtccttt agaccatgtc 9600

taactgttca tttatatgat tctctaaaac actgatatta ttgtagtact atagattata 9660

ttattcgtag agtaaagttt aaatatatgt ataaagatag ataaactgca cttcaaacaa 9720

gtgtgacaaa aaaaatatgt ggtaattttt tataacttag acatgcaatg ctcattatct 9780

ctagagaggg gcacgaccgg gtcacgctgc aaagctttgc agcgtgaccc ggtcgtgccc 9840

ctctctagag ataatgagca ttgcatgtct aagttataaa aaattaccac atattttttt 9900

tgtcacactt gtttgaagtg cagtttatct atctttatac atatatttaa actttactct 9960

acgaataata taatctatag tactacaata atatcagtgt tttagagaat catataaatg 10020

aacagttaga catggtctaa aggacaattg agtattttga caacaggact ctacagtttt 10080

atctttttag tgtgcatgtg ttctcctttt tttttgcaaa tagcttcacc tatataatac 10140

ttcatccatt ttattagtac atccatttag ggtttagggt taatggtttt tatagactaa 10200

tttttttagt acatctattt tattctattt tagcctctaa attaagaaaa ctaaaactct 10260

attttagttt ttttatttaa taatttagat ataaaataga ataaaataaa gtgactaaaa 10320

attaaacaaa taccctttaa gaaattaaaa aaactaagga aacatttttc ttgtttcgag 10380

tagataatgc cagcctgtta aacgccgtcg acgagtctaa cggacaccaa ccagcgaacc 10440

agcagcgtcg cgtcgggcca agcgaagcag acggcacggc atctctgtcg ctgcctctgg 10500

acccctctcg agagttccgc tccaccgttg gacttgctcc gctgtcggca tccagaaatt 10560

gcgtggcgga gcggcagacg tgagccggca cggcaggcgg cctcctcctc ctctcacggc 10620

accggcagct acgggggatt cctttcccac cgctccttcg ctttcccttc ctcgcccgcc 10680

gtaataaata gacaccccct ccacaccctc tttccccaac ctcgtgttgt tcggagcgca 10740

cacacacaca aaccagatct cccccaaatc cacccgtcgg cacctccgct tcaaggtacg 10800

ccgctcgtcc tccccccccc ccctctntac tctctagatc gcgttcggtc catgttaggg 10860

cccggtagtc tacttctgtt catgtttgtg ttagatccgt gtttgtgtna gatccgtgct 10920

gctagcgttc gtacacggat gcgacctgta cgtcagacac gttctgattg ctaacttgcc 10980

agtgtttctc tttggggaat cctgggatgg ctctagccgt tccgcagacg ggatcgattt 11040

catgattttt tttgtttcgt tgcatagggt ttggtttgcc cttttccttt atttcaatat 11100

atgccgtgca cttgtttgtc gggtcatctt ttcatgcttt tttttgtctt ggttgtgatg 11160

atgtggtctg gttgggcggt cgttctagat cggagtagaa ttaattctgt ttcaaactac 11220

ctggtggatt tattaatttt ggatctgtat gtgtgtgcca tacatattca tagttacgaa 11280

ttgaagatga tggatggaaa tatcgatcta ggataggtat acatgttgat gcgggtttta 11340

ctgatgcata tacagagatg ctttttgttc gcttggttgt gatgatgtgg tgtggttggg 11400

cggtcgttca ttcgttctag atcggagtag aatactgttt caaactacct ggtgtattta 11460

ttaattttgg aactgtatgt gtgtgtcata catcttcata gttacgagtt taagatggat 11520

ggaaatatcg atctaggata ggtatacatg ttgatgtggg ttttactgat gcatatacat 11580

gatggcatat gcagcatcta ttcatatgct ctaaccttga gtacctatct attataataa 11640

acaagtatgt tttataatta ttttgatctt gatatacttg gatgatggca tatgcagcag 11700

ctatatgtgg atttttttag ccctgccttc atacgctatt tatttgcttg gtactgtttc 11760

ttttgtcgat gctcaccctg ttgtttggtg ttacttctgc aggtcgactc tagaggatcc 11820

cgggatggag gcgctgagcg ggcgggtggg agtgaagtgc gggcggtgga acccgacggc 11880

ggagcaggtg aaggtgctga cggagctgtt ccgggcgggg ctgcggacgc cgagcaccga 11940

gcagatccag cggatctcca cccacctcag cgccttcggc aaggtggaga gcaagaacgt 12000

cttctactgg ttccagaacc acaaggcccg cgagcgccac caccacaaga agcgccgccg 12060

cgtcgcatcc tgctcccccg acagcagcag caacgatgaa gagaccggcc gtgccgccgc 12120

cgccgagccc gccgacctcg tgctccagcc tcccgagagc aagcgggagg ccggaggcta 12180

caaccaccac ccccggatca tgacatgtaa gttagcagta gcacccatgt cgttgttcat 12240

acgtagagct tggtttgttc ctaatggaac agtatcctta gatcatcggc ccggtgctga 12300

tccatttggt gcgtgcatgc aggctatgtg agggaggtgg cggagcagga agaggcgacg 12360

acgtgggagc ggccgacgag ggaagtggag acgctggagc tgttcccgct caaagcagcc 12420

tgctacgacc tggagctgga ggcggacagg ttcagccggt atgtgaggag cggcgagcaa 12480

cagtgcaggg agatctcctt cttcgacgtg gccaccggac gggatccgcc gctggagctc 12540

aggctctgca gcttcgatcg gtatctggtc taaggtaccg agctgatcgt tcaaacattt 12600

ggcaataaag tttcttaaga ttgaatcctg ttgccggtct tgcgatgatt atcatataat 12660

ttctgttgaa ttacgttaag catgtaataa ttaacatgta atgcatgacg ttatttatga 12720

gatgggtttt tatgattaga gtcccgcaat tatacattta atacgcgata gaaaacaaaa 12780

tatagcgcgc aaactaggat aaattatcgc gcgcggtgtc atctatgtta ctagatcgaa 12840

ttcaagcttg gcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac 12900

ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata gcgaagaggc 12960

ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatgag cttgagcttg 13020

gatcagattg tcgtttcccg ccttcagttt aaactatcag tgtttgacag gatatattgg 13080

cgggtaaacc taagagaaaa gagcgtttat tagaataacg gatatttaaa agggcgtgaa 13140

aaggtttatc cgttcgtcca tttgtatgtg catgccaacc acagggttcc cctcgggatc 13200

aa 13202

<210> 2

<211> 210

<212> PRT

<213> 小麦

<400> 2

Met Glu Ala Leu Ser Gly Arg Val Gly Val Lys Cys Gly Arg Trp Asn

1 5 10 15

Pro Thr Ala Glu Gln Val Lys Val Leu Thr Glu Leu Phe Arg Ala Gly

20 25 30

Leu Arg Thr Pro Ser Thr Glu Gln Ile Gln Arg Ile Ser Thr His Leu

35 40 45

Ser Ala Phe Gly Lys Val Glu Ser Lys Asn Val Phe Tyr Trp Phe Gln

50 55 60

Asn His Lys Ala Arg Glu Arg His His His Lys Lys Arg Arg Arg Val

65 70 75 80

Ala Ser Cys Ser Pro Asp Ser Ser Ser Asn Asp Glu Glu Thr Gly Arg

85 90 95

Ala Ala Ala Ala Glu Pro Ala Asp Leu Val Leu Gln Pro Pro Glu Ser

100 105 110

Lys Arg Glu Ala Gly Gly Tyr Asn His His Pro Arg Ile Met Thr Cys

115 120 125

Tyr Val Arg Glu Val Ala Glu Gln Glu Glu Ala Thr Thr Trp Glu Arg

130 135 140

Pro Thr Arg Glu Val Glu Thr Leu Glu Leu Phe Pro Leu Lys Ala Ala

145 150 155 160

Cys Tyr Asp Leu Glu Leu Glu Ala Asp Arg Phe Ser Arg Tyr Val Arg

165 170 175

Ser Gly Glu Gln Gln Cys Arg Glu Ile Ser Phe Phe Asp Val Ala Thr

180 185 190

Gly Arg Asp Pro Pro Leu Glu Leu Arg Leu Cys Ser Phe Asp Arg Tyr

195 200 205

Leu Val

210

<210> 3

<211> 712

<212> DNA

<213> 稻

<400> 3

atggaggctc ttagcgggcg agtgggggtg aagtgtgggc ggtggaaccc gacggcggag 60

caggtgaagg tcctgacgga gctgttccga gcggggttgc ggacgccgag cacggagcag 120

atccagcgca tctccactca cctcagcgca ttcggcaagg tggagagcaa gaacgtcttc 180

tactggttcc agaaccacaa ggcccgcgag cgccaccacc acaagaagcg ccgccgcggc 240

gcctcctccc ccgacagcgg cagcaacgat gacgatggcc gcgccgcagc ccacgagggc 300

gacgccgacc tcgtcctgca gcctcctgag agcaagcggg aggccagaag ctacggccat 360

catcaccggc tcatgacatg taagcataca tactttgatt aattatttcg cctatataca 420

tgcatacgta cgcatgaata cccatgatcg aatagctgat caagttgctg ttcgatccgc 480

gcttgcaggc tacgtgaggg atgtggtgga gacggaagcg atgtgggagc ggccgacgag 540

ggaggtggaa acgctggagc tgttcccact caagtcgtat gacctcgagg tggacaaggt 600

ccggtatgtg aggggcggcg gtggcgagca gtgcagggag atctcgttct tcgacgtcgc 660

tgccggccgg gatccgccgc tggagctcag gctttgcagc ttcggcctct ag 712

<210> 4

<211> 200

<212> PRT

<213> 稻

<400> 4

Met Glu Ala Leu Ser Gly Arg Val Gly Val Lys Cys Gly Arg Trp Asn

1 5 10 15

Pro Thr Ala Glu Gln Val Lys Val Leu Thr Glu Leu Phe Arg Ala Gly

20 25 30

Leu Arg Thr Pro Ser Thr Glu Gln Ile Gln Arg Ile Ser Thr His Leu

35 40 45

Ser Ala Phe Gly Lys Val Glu Ser Lys Asn Val Phe Tyr Trp Phe Gln

50 55 60

Asn His Lys Ala Arg Glu Arg His His His Lys Lys Arg Arg Arg Gly

65 70 75 80

Ala Ser Ser Pro Asp Ser Gly Ser Asn Asp Asp Asp Gly Arg Ala Ala

85 90 95

Ala His Glu Gly Asp Ala Asp Leu Val Leu Gln Pro Pro Glu Ser Lys

100 105 110

Arg Glu Ala Arg Ser Tyr Gly His His His Arg Leu Met Thr Cys Tyr

115 120 125

Val Arg Asp Val Val Glu Thr Glu Ala Met Trp Glu Arg Pro Thr Arg

130 135 140

Glu Val Glu Thr Leu Glu Leu Phe Pro Leu Lys Ser Tyr Asp Leu Glu

145 150 155 160

Val Asp Lys Val Arg Tyr Val Arg Gly Gly Gly Gly Glu Gln Cys Arg

165 170 175

Glu Ile Ser Phe Phe Asp Val Ala Ala Gly Arg Asp Pro Pro Leu Glu

180 185 190

Leu Arg Leu Cys Ser Phe Gly Leu

195 200

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于小麦TAWOX5基因克隆的正向引物

<400> 5

gtgtcaatgg aggcgctgag cg 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于小麦TAWOX5基因克隆的反向引物

<400> 6

gtgtcaatgg aggcgctgag cg 22

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Wox5SmaF引物

<400> 7

aaacccggga tggaggcgct gagcgg 26

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Wox5KpnR引物

<400> 8

aaaggtacct tagaccagat accgat 26

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 正向Bar引物

<400> 9

accatcgtca accactacat cg 22

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 反向Bar引物

<400> 10

gctgccagaa accacgtcat g 21

<210> 11

<211> 633

<212> DNA

<213> 小麦

<400> 11

atggaggcgc tgagcgggcg ggtgggagtg aagtgcgggc ggtggaaccc gacggcggag 60

caggtgaagg tgctgacgga gctgttccgg gcggggctgc ggacgccgag caccgagcag 120

atccagcgga tctccaccca cctcagcgcc ttcggcaagg tggagagcaa gaacgtcttc 180

tactggttcc agaaccacaa ggcccgcgag cgccaccacc acaagaagcg ccgccgcgtc 240

gcatcctgct cccccgacag cagcagcaac gatgaagaga ccggccgtgc cgccgccgcc 300

gagcccgccg acctcgtgct ccagcctccc gagagcaagc gggaggccgg aggctacaac 360

caccaccccc ggatcatgac atgctatgtg agggaggtgg cggagcagga agaggcgacg 420

acgtgggagc ggccgacgag ggaagtggag acgctggagc tgttcccgct caaagcagcc 480

tgctacgacc tggagctgga ggcggacagg ttcagccggt atgtgaggag cggcgagcaa 540

cagtgcaggg agatctcctt cttcgacgtg gccaccggac gggatccgcc gctggagctc 600

aggctctgca gcttcgatcg gtatctggtc taa 633

<210> 12

<211> 603

<212> DNA

<213> 稻

<400> 12

atggaggctc ttagcgggcg agtgggggtg aagtgtgggc ggtggaaccc gacggcggag 60

caggtgaagg tcctgacgga gctgttccga gcggggttgc ggacgccgag cacggagcag 120

atccagcgca tctccactca cctcagcgca ttcggcaagg tggagagcaa gaacgtcttc 180

tactggttcc agaaccacaa ggcccgcgag cgccaccacc acaagaagcg ccgccgcggc 240

gcctcctccc ccgacagcgg cagcaacgat gacgatggcc gcgccgcagc ccacgagggc 300

gacgccgacc tcgtcctgca gcctcctgag agcaagcggg aggccagaag ctacggccat 360

catcaccggc tcatgacatg ctacgtgagg gatgtggtgg agacggaagc gatgtgggag 420

cggccgacga gggaggtgga aacgctggag ctgttcccac tcaagtcgta tgacctcgag 480

gtggacaagg tccggtatgt gaggggcggc ggtggcgagc agtgcaggga gatctcgttc 540

ttcgacgtcg ctgccggccg ggatccgccg ctggagctca ggctttgcag cttcggcctc 600

tag 603

<210> 13

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TaWox5-FW引物

<400> 13

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggcta tggaggcgct gagcgggcgg 50

<210> 14

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TaWox5-RV引物

<400> 14

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt tagaccagat accgatcgaa 50

<210> 15

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> osTaWox5-FW引物

<400> 15

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc tagaggccga agctgcaaag cc 52

<210> 16

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> osTaWox5-RV引物

<400> 16

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc tagaggccga agctgcaaag cc 52

<210> 17

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GFPbamFinf4引物

<400> 17

caggtcgact ctagaggaat ggtgagcaag ggcgag 36

<210> 18

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GFPbamRinf4引物

<400> 18

ttcgagctcg gtacccgggg atccaccacc gccacctccg ccaccgcctc cagatctgta 60

cagctcg 67

<210> 19

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Wox5bamFinf3引物

<400> 19

caggtcgact ctagaggaat ggaggcgctg agcgg 35

<210> 20

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Wox5bamRinf3引物

<400> 20

ttcgagctcg gtacccgggg atccaccacc gccacctccg ccaccgcctc cgaccagata 60

ccgat 65

<210> 21

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Wox5Finf4引物

<400> 21

gcggaggtgg cggtggtgga atggaggcgc tgagcgg 37

<210> 22

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Wox5Rinf4引物

<400> 22

ttcgagctcg gtacccgggg attagaccag ataccgat 38

<210> 23

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GFPFinf3引物

<400> 23

gcggaggtgg cggtggtgga atggtgagca agggcgag 38

<210> 24

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GFPRinf3引物

<400> 24

ttcgagctcg gtacccgggg attaagatct gtacagctcg 40

Claims (16)

1.用于改善植物的转化效率的方法，其包括在所述植物中过表达

1)编码以SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的核酸或编码包含与以SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列并且具有改善植物的转化效率的功能的多肽的核酸；或

2)编码以SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的核酸或编码包含与以SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列并且具有改善植物的转化效率的功能的多肽的核酸。

2.根据权利要求1的方法，其包括在所述植物中过表达编码包含与以SEQ ID NO:2或4所示的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列并且具有改善植物的转化效率的功能的多肽的核酸。

3.根据权利要求1或2的方法，其中所述植物是单子叶植物。

4.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中所述植物选自玉米、小麦、大麦、稻、高粱和黑麦。

5.根据权利要求1至4中任一项的方法，其中植物的转化效率的改善包括以下一项或多项：

a)所述植物的愈伤组织形成的效率的改善；

b)所述植物的再分化速率的改善；和

c)基因转移效率的改善。

6.核酸构建体，其包含：

1)编码以SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的核酸或编码包含与以SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列并且具有改善植物的转化效率的功能的多肽的核酸；或

2)编码以SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的核酸或编码包含与以SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列并且具有改善植物的转化效率的功能的多肽的核酸；

和

用于在所述植物中产生核酸的启动子。

7.根据权利要求6的核酸构建体，其中所述启动子是组成型启动子、诱导型启动子或位点特异性启动子。

8.用于转化植物的方法，其包括对植物导入根据权利要求6或7的核酸构建体和要在所述植物中表达的期望核酸。

9.根据权利要求8的转化方法，其中瞬时表达根据权利要求6或7的核酸构建体或要在所述植物中产生的期望核酸。

10.通过根据权利要求9或10的转化方法获得的经转化的植物。

11.核酸构建体，其包含：

1)编码以SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的核酸或编码包含与以SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列并且具有改善植物的转化效率的功能的多肽的核酸；或

2)编码以SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的核酸或编码包含与以SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列并且具有改善植物的转化效率的功能的多肽的核酸；

用于在所述植物中产生核酸的启动子；

和

要在所述植物中产生的期望核酸。

12.根据权利要求11的核酸构建体，其中直接或通过接头连接

1)编码以SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的核酸或编码包含与以SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列并且具有改善植物的转化效率的功能的多肽的核酸；或

2)编码以SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的核酸或编码包含与以SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列并且具有改善植物的转化效率的功能的多肽的核酸；

和

要在所述植物中产生的期望核酸。

13.根据权利要求12的核酸构建体，其中所述要在所述植物中产生的期望核酸与所述核酸1)或2)的3’连接。

14.用于转化植物的方法，其包括将根据权利要求11至13中任一项的核酸构建体导入植物中。

15.根据权利要求14的转化方法，其中瞬时表达根据权利要求11至13中任一项的核酸构建体。

16.通过根据权利要求14或15的转化方法获得的经转化的植物。

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