CN116249780A - 单子叶植物叶外植体的快速转化 - Google Patents

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Abstract

提供了用于转化单子叶植物叶外植体的方法。

Description

单子叶植物叶外植体的快速转化
技术领域
本公开涉及植物分子生物学领域，包括植物的遗传操作。更特别地，本公开涉及单子叶植物叶外植体的转化。
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年9月30日提交的美国临时专利申请号63/085588的优先权，该申请特此通过引用以其全文并入本文中。
以电子方式递交的序列表的引用
该序列表的官方副本经由EFS-Web作为ASCII格式的序列表以电子方式提交，文件名为20210927_8418-WO-PCT_ST25，创建于2021年9月27日，且具有4,465,021字节大小，并与本说明书同时提交。包含在该ASCII格式的文件中的序列表是本说明书的一部分并且通过引用以其全文并入本文。
背景技术
近年来，植物基因工程的性能有了极大的扩展。当前的转化技术提供了产生商业上可行的转基因植物的机会，从而能够创造含有期望性状的新植物品种。植物基因工程的一个限制是适于转化的植物组织外植体的可用性，因为许多植物组织外植体难以转化和再生。因此，需要允许更广泛范围的可转化和可再生植物外植体组织的植物转化方法。
发明内容
本公开包括使用单子叶植物叶外植体用于产生含有异源多核苷酸的转基因植物的方法和组合物，以及使用单子叶植物叶外植体用于产生经基因编辑植物的方法和组合物。在另一方面，本公开提供了通过本文公开的方法产生的植物的种子。
在一个方面，一种产生含有异源多核苷酸的转基因单子叶植物的方法，该方法包括使单子叶植物叶外植体与异源多核苷酸表达盒和形态发生基因表达盒接触，其中该形态发生基因表达盒包含编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列和编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽或WUS/WOX和BBM或ODP2多肽的功能同源物的核苷酸序列，其中该编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列和该编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽或WUS/WOX和BBM或ODP2多肽的功能同源物的核苷酸序列的组合表达在强度和持续时间上足够，使得该单子叶植物叶外植体在该接触的约八周或更短时间内、或约6周或更短时间内、或约4周或更短时间内、或约十天至约十四天内形成含有该异源多核苷酸表达盒的可再生植物结构；以及从含有异源多核苷酸表达盒的可再生植物结构再生转基因单子叶植物。在一个方面，单子叶植物叶外植体是单倍体单子叶植物叶外植体。在一个方面，异源多核苷酸表达盒和形态发生基因表达盒通过由根瘤菌(Rhizobia)细菌物种转化或粒子轰击的方法引入。在一个方面，其中异源多核苷酸表达盒和形态发生基因表达盒通过电穿孔、PEG转染或RNP(核糖核蛋白)递送的方法引入。在一个方面，编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列和编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽或WUS/WOX和BBM或ODP2多肽的功能同源物的核苷酸序列的组合表达大于形态发生基因表达盒的表达，该形态发生基因表达盒包含可操作地连接到具有SEQ ID NO：290的农杆菌属(Agrobacterium)-NOS启动子的编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列，和可操作地连接到具有SEQ ID NO：339的泛素(UBI)启动子的编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列。在一个方面，单子叶植物叶外植体来源于幼苗而不是直接衍生自胚或种子或未经修饰的胚组织。在一个方面，单子叶植物叶外植体衍生自约8-20天龄、约12-18天龄、约10-20天龄、约14-16天龄、约16-18天龄或约14-18天龄的幼苗。在一个方面，编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列选自WUS、WUS1、WUS2、WUS3、WOX2A、WOX4、WOX5A和WOX9，并且其中编码Babyboom(BBM)多肽的核苷酸序列选自BBM、BBM1、BBM2、BBM3、BMN2和BMN3，或者胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽是ODP2。在一个方面，异源多核苷酸表达盒包含选自由以下组成的组的异源多核苷酸：赋予营养增强的异源多核苷酸、赋予改进的油含量的异源多核苷酸、赋予改进的蛋白质含量的异源多核苷酸、赋予改进的代谢物含量的异源多核苷酸、赋予增加的产量的异源多核苷酸、赋予非生物胁迫耐受性的异源多核苷酸、赋予耐旱性的异源多核苷酸、赋予耐寒性的异源多核苷酸、赋予除草剂耐受性的异源多核苷酸、赋予有害生物抗性的异源多核苷酸、赋予病原体抗性的异源多核苷酸、赋予昆虫抗性的异源多核苷酸、赋予氮利用效率(NUE)的异源多核苷酸、赋予疾病抗性的异源多核苷酸、赋予增加的生物量的异源多核苷酸、赋予改变代谢途径的能力的异源多核苷酸、以及前述的组合。在一个方面，叶外植体选自由以下组成的组：叶、根生叶、茎生叶、互生叶、对生叶、十字型对出叶、对生重叠叶、轮生叶、有柄叶、无柄叶、近无柄叶、有托叶、无托叶、单叶、复叶、叶原基、叶鞘、叶基、叶的紧邻其与叶柄或茎的附着点的一部分、芽，包括但不限于侧芽、以及前述的组合。在一个方面，单子叶植物选自由以下组成的组：柳枝稷(Panicum virgatum)(柳枝稷草)、双色高粱(Sorghumbicolor)(高粱、苏丹草)、巨芒(Miscanthus giganteus)(芒草)、甘蔗属物种(Saccharumsp.)(能源甘蔗)、玉蜀黍(Zea mays)(玉米)、普通小麦(Triticum aestivum)(小麦)、水稻(Oryza sativa)(稻)、御谷(Pennisetum glaucum)(珍珠粟)、黍属物种(Panicum spp.)、高粱属物种(Sorghum spp.)、芒属物种(Miscanthus spp.)、甘蔗属物种(Saccharum spp.)、和斑茅属物种(Erianthus spp.)。在一个方面，单子叶植物选自禾本科。在一个方面，单子叶植物选自禾本科亚科，该禾本科亚科选自虎尾草亚科(Chloridoideae)、黍亚科(Panicoideae)、稻亚科(Oryzoideae)、和早熟禾亚科(Pooideae)。在一个方面，选自禾本科亚科虎尾草亚科的单子叶植物是埃塞俄比亚画眉草(Eragrostis tef.)。在一个方面，选自禾本科亚科黍亚科的单子叶植物选自玉蜀黍、双色高粱、御谷、和柳枝稷。在一个方面，选自禾本科亚科稻亚科的单子叶植物是水稻。在一个方面，选自禾本科亚科早熟禾亚科的单子叶植物选自大麦(Hordeum vulgare)、黑麦(Secale cereal)、和普通小麦。在一个方面，功能性WUS/WOX多肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、或212；或其中功能性WUS/WOX多肽由选自以下的核苷酸序列编码：SEQ ID NO：143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、或211，并且其中Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：214、216、219、221、223、225、227、229、或231；或其中Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽由选自以下的核苷酸序列编码：SEQ ID NO：213、215、217、218、220、222、224、226、228、230、或232。在一个方面，形态发生基因表达盒进一步包含选自以下的多核苷酸：ZM-MIR-Corngrass1核苷酸、ZM-GRF5核苷酸、ZM-GRF4核苷酸、ZM-GIF1核苷酸、ZM-GRF4～GIF1核苷酸、ZM-STEMIN1核苷酸、ZM-REV核苷酸、ZM-ESR1核苷酸、ZM-LAS核苷酸、ZM-CUC1核苷酸、ZM-CUC2核苷酸、ZM-CUC3核苷酸、ZM-RLD1核苷酸、ZM-KN1核苷酸、ZM-CYCD2核苷酸、ZM-GPCNAC-1核苷酸、ZM-MIR156B核苷酸、ZM-LEC1核苷酸、AT-RKD4核苷酸、AT-LEC2核苷酸、AT-RAP2.6L核苷酸、ZM-MIR-SPS1核苷酸、ZM-MIR-MAX1核苷酸、或ZM-MIR-MAX4核苷酸。在一个方面，形态发生基因表达盒进一步包含编码位点特异性重组酶的多核苷酸序列，该位点特异性重组酶选自由以下组成的组：FLP、FLPe、KD、Cre、SSV1、λInt、phi C31 Int、HK022、R、B2、B3、Gin、Tn1721、CinH、ParA、Tn5053、Bxb1、TP907-1或U153，其中该位点特异性重组酶可操作地连接到组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子、或受发育调控的启动子。在一个方面，切除形态发生基因表达盒以提供含有异源多核苷酸的转基因单子叶植物。在一个方面，远离形态发生基因表达盒育种。在一个方面，转基因植物包含异源多核苷酸。在一个方面，转基因种子包含异源多核苷酸。
在一个方面，一种衍生自转基因单子叶植物叶外植体的可再生植物结构，该单子叶植物叶外植体包含异源多核苷酸表达盒和形态发生基因表达盒，其中该形态发生基因表达盒包含编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列和编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽或WUS/WOX和BBM或ODP2多肽的功能同源物的核苷酸序列，其中该编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列和该编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽或WUS/WOX和BBM或ODP2多肽的功能同源物的核苷酸序列的组合表达在强度和持续时间上足够，使得该单子叶植物叶外植体在该单子叶植物叶外植体接收该异源多核苷酸表达盒和该形态发生基因表达盒的约八周或更短时间内、或约6周或更短时间内、或约4周或更短时间内、或约十天至约十四天内形成含有异源多核苷酸表达盒的可再生植物结构。在一个方面，单子叶植物叶外植体是单倍体单子叶植物叶外植体。在一个方面，编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列选自WUS、WUS1、WUS2、WUS3、WOX2A、WOX4、WOX5A和WOX9，并且其中编码Babyboom(BBM)多肽的核苷酸序列选自BBM、BBM1、BBM2、BBM3、BMN2和BMN3，或者胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽是ODP2。在一个方面，异源多核苷酸表达盒和形态发生基因表达盒通过由根瘤菌细菌物种转化或粒子轰击的方法引入。在一个方面，异源多核苷酸表达盒和形态发生基因表达盒通过电穿孔、PEG转染、或RNP(核糖核蛋白)递送的方法引入。在一个方面，异源多核苷酸表达盒包含选自由以下组成的组的异源多核苷酸：赋予营养增强的异源多核苷酸、赋予改进的油含量的异源多核苷酸、赋予改进的蛋白质含量的异源多核苷酸、赋予改进的代谢物含量的异源多核苷酸、赋予增加的产量的异源多核苷酸、赋予非生物胁迫耐受性的异源多核苷酸、赋予耐旱性的异源多核苷酸、赋予耐寒性的异源多核苷酸、赋予除草剂耐受性的异源多核苷酸、赋予有害生物抗性的异源多核苷酸、赋予病原体抗性的异源多核苷酸、赋予昆虫抗性的异源多核苷酸、赋予氮利用效率(NUE)的异源多核苷酸、赋予疾病抗性的异源多核苷酸、赋予增加的生物量的异源多核苷酸、赋予改变代谢途径的能力的异源多核苷酸、以及前述的组合。在一个方面，叶外植体选自由以下组成的组：叶、根生叶、茎生叶、互生叶、对生叶、十字型对出叶、对生重叠叶、轮生叶、有柄叶、无柄叶、近无柄叶、有托叶、无托叶、单叶、复叶、叶原基、叶鞘、叶基、叶的紧邻其与叶柄或茎的附着点的一部分、芽，包括但不限于侧芽、以及前述的组合。在一个方面，单子叶植物选自由以下组成的组：柳枝稷(柳枝稷草)、双色高粱(高粱、苏丹草)、巨芒(芒草)、甘蔗属物种(能源甘蔗)、玉蜀黍(玉米)、普通小麦(小麦)、水稻(稻)、御谷(珍珠粟)、黍属物种、高粱属物种、芒属物种、甘蔗属物种、和斑茅属物种。在一个方面，单子叶植物选自禾本科。在一个方面，单子叶植物选自禾本科亚科，该禾本科亚科选自虎尾草亚科、黍亚科、稻亚科、和早熟禾亚科。在一个方面，选自禾本科亚科虎尾草亚科的单子叶植物是埃塞俄比亚画眉草。在一个方面，来自禾本科亚科黍亚科的单子叶植物选自玉蜀黍、双色高粱、御谷、和柳枝稷。在一个方面，来自禾本科亚科稻亚科的单子叶植物是水稻。在一个方面，来自禾本科亚科早熟禾亚科的单子叶植物选自大麦、黑麦、和普通小麦。在一个方面，功能性WUS/WOX多肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQ IDNO：144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、或212；或其中功能性WUS/WOX多肽由选自以下的核苷酸序列编码：SEQ ID NO：143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、或211，并且其中Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：214、216、219、221、223、225、227、229、或231；或其中Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽由选自以下的核苷酸序列编码：SEQ ID NO：213、215、217、218、220、222、224、226、228、230、或232。在一个方面，形态发生基因表达盒进一步包含选自以下的多核苷酸：ZM-MIR-Corngrass1核苷酸、ZM-GRF5核苷酸、ZM-GRF4核苷酸、ZM-GIF1核苷酸、ZM-GRF4～GIFl核苷酸、ZM-STEMIN1核苷酸、ZM-REV核苷酸、ZM-ESR1核苷酸、ZM-LAS核苷酸、ZM-CUC1核苷酸、ZM-CUC2核苷酸、ZM-CUC3核苷酸、ZM-RLD1核苷酸、ZM-KN1核苷酸、ZM-CYCD2核苷酸、ZM-GPCNAC-1核苷酸、ZM-MIR156B核苷酸、ZM-LECl核苷酸、AT-RKD4核苷酸、AT-LEC2核苷酸、AT-RAP2.6L核苷酸、ZM-MIR-SPS1核苷酸、ZM-MIR-MAX1核苷酸、或ZM-MIR-MAX4核苷酸。在一个方面，形态发生基因表达盒进一步包含编码位点特异性重组酶的多核苷酸序列，该位点特异性重组酶选自由以下组成的组：FLP、FLPe、KD、Cre、SSVl、λInt、phi C31 Int、HK022、R、B2、B3、Gin、Tn1721、CinH、ParA、Tn5053、Bxb1、TP907-1或U153，其中该位点特异性重组酶可操作地连接到组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子、或受发育调控的启动子。在一个方面，切除形态发生基因表达盒以提供含有异源多核苷酸的转基因单子叶植物。在一个方面，可育转基因单子叶植物从可再生植物结构产生。在一个方面，可育转基因单子叶植物不包含形态发生基因表达盒。在一个方面，多个单子叶植物种子从转基因单子叶植物产生。
在一个方面，一种产生含有异源多核苷酸的转基因单子叶植物的方法，该方法包括使单子叶植物叶外植体与异源多核苷酸表达盒和形态发生基因表达盒接触，其中形态发生基因表达盒包含编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列和编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽或WUS/WOX和BBM或ODP2多肽的功能同源物的核苷酸序列，其中编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列和编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列的组合表达大于形态发生基因表达盒的组合表达，该形态发生基因表达盒包含可操作地连接到具有SEQ ID NO：290的农杆菌属-NOS启动子的编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列，和可操作地连接到具有SEQ ID NO：339的泛素(UBI)启动子的编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列；选择含有该异源多核苷酸表达盒的单子叶植物叶外植体，其中该单子叶植物叶外植体在该接触的约八周或更短时间内、或约6周或更短时间内、或约4周或更短时间内、或约十天至约十四天内形成含有该异源多核苷酸表达盒的可再生植物结构；以及从含有异源多核苷酸表达盒的可再生植物结构再生转基因单子叶植物。在一个方面，单子叶植物叶外植体是单倍体单子叶植物叶外植体。在一个方面，编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列选自WUS、WUS1、WUS2、WUS3、WOX2A、WOX4、WOX5A和WOX9，并且其中编码Babyboom(BBM)多肽的核苷酸序列选自BBM、BBM1、BBM2、BBM3、BMN2和BMN3，或者胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽是ODP2。在一个方面，异源多核苷酸表达盒和形态发生基因表达盒通过由根瘤菌细菌物种转化或粒子轰击的方法引入。在一个方面，异源多核苷酸表达盒和形态发生基因表达盒通过电穿孔、PEG转染、或RNP(核糖核蛋白)递送的方法引入。在一个方面，异源多核苷酸表达盒包含选自由以下组成的组的异源多核苷酸：赋予营养增强的异源多核苷酸、赋予改进的油含量的异源多核苷酸、赋予改进的蛋白质含量的异源多核苷酸、赋予改进的代谢物含量的异源多核苷酸、赋予增加的产量的异源多核苷酸、赋予非生物胁迫耐受性的异源多核苷酸、赋予耐旱性的异源多核苷酸、赋予耐寒性的异源多核苷酸、赋予除草剂耐受性的异源多核苷酸、赋予有害生物抗性的异源多核苷酸、赋予病原体抗性的异源多核苷酸、赋予昆虫抗性的异源多核苷酸、赋予氮利用效率(NUE)的异源多核苷酸、赋予疾病抗性的异源多核苷酸、赋予增加的生物量的异源多核苷酸、赋予改变代谢途径的能力的异源多核苷酸、以及前述的组合。在一个方面，叶外植体选自由以下组成的组：叶、根生叶、茎生叶、互生叶、对生叶、十字型对出叶、对生重叠叶、轮生叶、有柄叶、无柄叶、近无柄叶、有托叶、无托叶、单叶、复叶、叶原基、叶鞘、叶基、叶的紧邻其与叶柄或茎的附着点的一部分、芽，包括但不限于侧芽、以及前述的组合。在一个方面，单子叶植物选自由以下组成的组：柳枝稷(柳枝稷草)、双色高粱(高粱、苏丹草)、巨芒(芒草)、甘蔗属物种(能源甘蔗)、玉蜀黍(玉米)、普通小麦(小麦)、水稻(稻)、御谷(珍珠粟)、黍属物种、高粱属物种、芒属物种、甘蔗属物种、和斑茅属物种。在一个方面，单子叶植物选自禾本科。在一个方面，单子叶植物选自禾本科亚科，该禾本科亚科选自虎尾草亚科、黍亚科、稻亚科、和早熟禾亚科。在一个方面，选自禾本科亚科虎尾草亚科的单子叶植物是埃塞俄比亚画眉草。在一个方面，来自禾本科亚科黍亚科的单子叶植物选自玉蜀黍、双色高粱、御谷、和柳枝稷。在一个方面，来自禾本科亚科稻亚科的单子叶植物是水稻。在一个方面，来自禾本科亚科早熟禾亚科的单子叶植物选自大麦、黑麦、和普通小麦。在一个方面，功能性WUS/WOX多肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、或212；或其中功能性WUS/WOX多肽由选自以下的核苷酸序列编码：SEQ ID NO：143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、或211，并且其中Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：214、216、219、221、223、225、227、229、或231；或其中Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽由选自以下的核苷酸序列编码：SEQ ID NO：213、215、217、218、220、222、224、226、228、230、或232。在一个方面，形态发生基因表达盒进一步包含选自以下的多核苷酸：ZM-MIR-Corngrassl核苷酸、ZM-GRF5核苷酸、ZM-GRF4核苷酸、ZM-GIF1核苷酸、ZM-GRF4～GIF1核苷酸、ZM-STEMIN1核苷酸、ZM-REV核苷酸、ZM-ESR1核苷酸、ZM-LAS核苷酸、ZM-CUC1核苷酸、ZM-CUC2核苷酸、ZM-CUC3核苷酸、ZM-RLD1核苷酸、ZM-KN1核苷酸、ZM-CYCD2核苷酸、ZM-GPCNAC-1核苷酸、ZM-MIR156B核苷酸、ZM-LEC1核苷酸、AT-RKD4核苷酸、AT-LEC2核苷酸、AT-RAP2.6L核苷酸、ZM-MIR-SPS1核苷酸、ZM-MIR-MAX1核苷酸、或ZM-MIR-MAX4核苷酸。在一个方面，形态发生基因表达盒进一步包含编码位点特异性重组酶的多核苷酸序列，该位点特异性重组酶选自由以下组成的组：FLP、FLPe、KD、Cre、SSV1、λInt、phi C31 Int、HK022、R、B2、B3、Gin、Tn1721、CinH、ParA、Tn5053、Bxb1、TP907-1、或U153，其中该位点特异性重组酶可操作地连接到组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子、或受发育调控的启动子。在一个方面，切除形态发生基因表达盒以提供含有异源多核苷酸的转基因单子叶植物。在一个方面，远离形态发生基因表达盒育种。在一个方面，由该方法产生的转基因植物包含异源多核苷酸。在一个方面，转基因植物的种子包含异源多核苷酸。
在一个方面，一种产生含有异源多核苷酸的转基因玉蜀黍植物的方法，该方法包括使玉蜀黍叶外植体与异源多核苷酸表达盒和形态发生基因表达盒接触，其中该形态发生基因表达盒包含编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列和编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽或WUS/WOX和BBM或ODP2多肽的功能同源物的核苷酸序列，其中编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列和编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽或WUS/WOX和BBM或ODP2多肽的功能同源物的核苷酸序列的组合表达在强度和持续时间上足够，使得该玉蜀黍叶外植体在该接触的约八周或更短时间内、或约6周或更短时间内、或约4周或更短时间内、或约十天至约十四天内形成含有异源多核苷酸表达盒的可再生植物结构；以及从含有异源多核苷酸表达盒的可再生植物结构再生转基因玉蜀黍植物。在一个方面，玉蜀黍叶外植体是单倍体玉蜀黍叶外植体。在一个方面，异源多核苷酸表达盒和形态发生基因表达盒通过由根瘤菌细菌物种转化或粒子轰击的方法引入。在一个方面，异源多核苷酸表达盒和形态发生基因表达盒通过电穿孔、PEG转染、或RNP(核糖核蛋白)递送的方法引入。在一个方面，编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列和编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽或WUS/WOX和BBM或ODP2多肽的功能同源物的核苷酸序列的组合表达大于形态发生基因表达盒的表达，该形态发生基因表达盒包含可操作地连接到具有SEQ ID NO：290的农杆菌属-NOS启动子的编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列，和可操作地连接到具有SEQ ID NO：339的泛素(UBI)启动子的编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列。在一个方面，玉蜀黍叶外植体衍生自幼苗而不是直接衍生自胚或种子或未经修饰的胚组织。在一个方面，玉蜀黍叶外植体衍生自约8-20天龄、约12-18天龄、约10-20天龄、约14-16天龄、约16-18天龄或约14-18天龄的幼苗。在一个方面，编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列选自WUS、WUS1、WUS2、WUS3、WOX2A、WOX4、WOX5A和WOX9，并且其中编码Babyboom(BBM)多肽的核苷酸序列选自BBM、BBM1、BBM2、BBM3、BMN2和BMN3，或者胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽是ODP2。在一个方面，异源多核苷酸表达盒包含选自由以下组成的组的异源多核苷酸：赋予营养增强的异源多核苷酸、赋予改进的油含量的异源多核苷酸、赋予改进的蛋白质含量的异源多核苷酸、赋予改进的代谢物含量的异源多核苷酸、赋予增加的产量的异源多核苷酸、赋予非生物胁迫耐受性的异源多核苷酸、赋予耐旱性的异源多核苷酸、赋予耐寒性的异源多核苷酸、赋予除草剂耐受性的异源多核苷酸、赋予有害生物抗性的异源多核苷酸、赋予病原体抗性的异源多核苷酸、赋予昆虫抗性的异源多核苷酸、赋予氮利用效率(NUE)的异源多核苷酸、赋予疾病抗性的异源多核苷酸、赋予增加的生物量的异源多核苷酸、赋予改变代谢途径的能力的异源多核苷酸、以及前述的组合。在一个方面，叶外植体选自由以下组成的组：叶、根生叶、茎生叶、互生叶、对生叶、十字型对出叶、对生重叠叶、轮生叶、有柄叶、无柄叶、近无柄叶、有托叶、无托叶、单叶、复叶、叶原基、叶鞘、叶基、叶的紧邻其与叶柄或茎的附着点的一部分、芽，包括但不限于侧芽、以及前述的组合。在一个方面，功能性WUS/WOX多肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、或212；或其中功能性WUS/WOX多肽由选自以下的核苷酸序列编码：SEQ ID NO：143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、或211，并且其中Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：214、216、219、221、223、225、227、229、或231；或其中Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽由选自以下的核苷酸序列编码：SEQ IDNO：213、215、217、218、220、222、224、226、228、230、或232。在一个方面，形态发生基因表达盒进一步包含选自以下的多核苷酸：ZM-MIR-Corngrass1核苷酸、ZM-GRF5核苷酸、ZM-GRF4核苷酸、ZM-GIF1核苷酸、ZM-GRF4～GIF1核苷酸、ZM-STEMIN1核苷酸、ZM-REV核苷酸、ZM-ESR1核苷酸、ZM-LAS核苷酸、ZM-CUC1核苷酸、ZM-CUC2核苷酸、ZM-CUC3核苷酸、ZM-RLD1核苷酸、ZM-KN1核苷酸、ZM-CYCD2核苷酸、ZM-GPCNAC-1核苷酸、ZM-MIR156B核苷酸、ZM-LEC1核苷酸、AT-RKD4核苷酸、AT-LEC2核苷酸、AT-RAP2.6L核苷酸、ZM-MIR-SPS1核苷酸、ZM-MIR-MAX1核苷酸、或ZM-MIR-MAX4核苷酸。在一个方面，形态发生基因表达盒进一步包含编码位点特异性重组酶的多核苷酸序列，该位点特异性重组酶选自由以下组成的组：FLP、FLPe、KD、Cre、SSV1、λInt、phi C31 Int、HK022、R、B2、B3、Gin、Tn1721、CinH、ParA、Tn5053、Bxb1、TP907-1或U153，其中该位点特异性重组酶可操作地连接到组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子、或受发育调控的启动子。在一个方面，切除形态发生基因表达盒以提供含有异源多核苷酸的转基因玉蜀黍植物。在一个方面，远离形态发生基因表达盒育种。在一个方面，由该方法产生的转基因植物包含异源多核苷酸。在一个方面，转基因植物的种子包含异源多核苷酸。
在一个方面，一种衍生自转基因玉蜀黍叶外植体的可再生植物结构，该玉蜀黍叶外植体包含异源多核苷酸表达盒和形态发生基因表达盒，其中该形态发生基因表达盒包含编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列和编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽或WUS/WOX和BBM或ODP2多肽的功能同源物的核苷酸序列，其中编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列和编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽或WUS/WOX和BBM或ODP2多肽的功能同源物的核苷酸序列的组合表达在强度和持续时间上足够，使得该玉蜀黍叶外植体在该玉蜀黍叶外植体接收该异源多核苷酸表达盒和该形态发生基因表达盒的约八周或更短时间内、或约6周或更短时间内、或约4周或更短时间内、或约十天至约十四天内形成含有异源多核苷酸表达盒的可再生植物结构。在一个方面，玉蜀黍叶外植体是单倍体玉蜀黍叶外植体。在一个方面，编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列选自WUS、WUS1、WUS2、WUS3、WOX2A、WOX4、WOX5A和WOX9，并且其中编码Babyboom(BBM)多肽的核苷酸序列选自BBM、BBM1、BBM2、BBM3、BMN2和BMN3，或者胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽是ODP2。在一个方面，异源多核苷酸表达盒和形态发生基因表达盒通过由根瘤菌细菌物种转化或粒子轰击的方法引入。在一个方面，异源多核苷酸表达盒和形态发生基因表达盒通过电穿孔、PEG转染、或RNP(核糖核蛋白)递送的方法引入。在一个方面，异源多核苷酸表达盒包含选自由以下组成的组的异源多核苷酸：赋予营养增强的异源多核苷酸、赋予改进的油含量的异源多核苷酸、赋予改进的蛋白质含量的异源多核苷酸、赋予改进的代谢物含量的异源多核苷酸、赋予增加的产量的异源多核苷酸、赋予非生物胁迫耐受性的异源多核苷酸、赋予耐旱性的异源多核苷酸、赋予耐寒性的异源多核苷酸、赋予除草剂耐受性的异源多核苷酸、赋予有害生物抗性的异源多核苷酸、赋予病原体抗性的异源多核苷酸、赋予昆虫抗性的异源多核苷酸、赋予氮利用效率(NUE)的异源多核苷酸、赋予疾病抗性的异源多核苷酸、赋予增加的生物量的异源多核苷酸、赋予改变代谢途径的能力的异源多核苷酸、以及前述的组合。在一个方面，叶外植体选自由以下组成的组：叶、根生叶、茎生叶、互生叶、对生叶、十字型对出叶、对生重叠叶、轮生叶、有柄叶、无柄叶、近无柄叶、有托叶、无托叶、单叶、复叶、叶原基、叶鞘、叶基、叶的紧邻其与叶柄或茎的附着点的一部分、芽，包括但不限于侧芽、以及前述的组合。在一个方面，功能性WUS/WOX多肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、或212；或其中功能性WUS/WOX多肽由选自以下的核苷酸序列编码：SEQ ID NO：143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、或211，并且其中Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：214、216、219、221、223、225、227、229、或231；或其中Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽由选自以下的核苷酸序列编码：SEQ IDNO：213、215、217、218、220、222、224、226、228、230、或232。在一个方面，形态发生基因表达盒进一步包含选自以下的多核苷酸：ZM-MIR-Corngrass1核苷酸、ZM-GRF5核苷酸、ZM-GRF4核苷酸、ZM-GIF1核苷酸、ZM-GRF4～GIF1核苷酸、ZM-STEMIN1核苷酸、ZM-REV核苷酸、ZM-ESR1核苷酸、ZM-LAS核苷酸、ZM-CUC1核苷酸、ZM-CUC2核苷酸、ZM-CUC3核苷酸、ZM-RLD1核苷酸、ZM-KN1核苷酸、ZM-CYCD2核苷酸、ZM-GPCNAC-1核苷酸、ZM-MIR156B核苷酸、ZM-LEC1核苷酸、AT-RKD4核苷酸、AT-LEC2核苷酸、AT-RAP2.6L核苷酸、ZM-MIR-SPS1核苷酸、ZM-MIR-MAX1核苷酸、或ZM-MIR-MAX4核苷酸。在一个方面，形态发生基因表达盒进一步包含编码位点特异性重组酶的多核苷酸序列，该位点特异性重组酶选自由以下组成的组：FLP、FLPe、KD、Cre、SSV1、λInt、phi C31 Int、HK022、R、B2、B3、Gin、Tn1721、CinH、ParA、Tn5053、Bxb1、TP907-1或U153，其中该位点特异性重组酶可操作地连接到组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子、或受发育调控的启动子。在一个方面，切除形态发生基因表达盒以提供含有异源多核苷酸的转基因玉蜀黍植物。在一个方面，提供了从可再生植物结构产生的可育转基因玉蜀黍植物。在一个方面，玉蜀黍植物不包含形态发生基因表达盒。在一个方面，提供了从转基因玉蜀黍植物产生的多个玉蜀黍种子。
在一个方面，一种产生含有异源多核苷酸的转基因玉蜀黍植物的方法，该方法包括使玉蜀黍叶外植体与异源多核苷酸表达盒和形态发生基因表达盒接触，其中该形态发生基因表达盒包含编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列和编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽或WUS/WOX和BBM或ODP2多肽的功能同源物的核苷酸序列，其中编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列和编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列的组合表达大于形态发生基因表达盒的组合表达，该形态发生基因表达盒包含可操作地连接到具有SEQ ID NO：290的农杆菌属-NOS启动子的编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列，和可操作地连接到具有SEQ ID NO：339的泛素(UBI)启动子的编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列；选择含有异源多核苷酸表达盒的玉蜀黍叶外植体，其中该玉蜀黍叶外植体在该接触的约八周或更短时间内、或约6周或更短时间内、或约4周或更短时间内、或约十天至约十四天内形成含有该异源多核苷酸表达盒的可再生植物结构；以及从含有异源多核苷酸表达盒的可再生植物结构再生转基因玉蜀黍植物。在一个方面，玉蜀黍叶外植体是单倍体玉蜀黍叶外植体。在一个方面，编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列选自WUS、WUS1、WUS2、WUS3、WOX2A、WOX4、WOX5A和WOX9，并且其中编码Babyboom(BBM)多肽的核苷酸序列选自BBM、BBM1、BBM2、BBM3、BMN2和BMN3，或者胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽是ODP2。在一个方面，异源多核苷酸表达盒和形态发生基因表达盒通过由根瘤菌细菌物种转化或粒子轰击的方法引入。在一个方面，异源多核苷酸表达盒和形态发生基因表达盒通过电穿孔、PEG转染、或RNP(核糖核蛋白)递送的方法引入。在一个方面，异源多核苷酸表达盒包含选自由以下组成的组的异源多核苷酸：赋予营养增强的异源多核苷酸、赋予改进的油含量的异源多核苷酸、赋予改进的蛋白质含量的异源多核苷酸、赋予改进的代谢物含量的异源多核苷酸、赋予增加的产量的异源多核苷酸、赋予非生物胁迫耐受性的异源多核苷酸、赋予耐旱性的异源多核苷酸、赋予耐寒性的异源多核苷酸、赋予除草剂耐受性的异源多核苷酸、赋予有害生物抗性的异源多核苷酸、赋予病原体抗性的异源多核苷酸、赋予昆虫抗性的异源多核苷酸、赋予氮利用效率(NUE)的异源多核苷酸、赋予疾病抗性的异源多核苷酸、赋予增加的生物量的异源多核苷酸、赋予改变代谢途径的能力的异源多核苷酸、以及前述的组合。在一个方面，叶外植体选自由以下组成的组：叶、根生叶、茎生叶、互生叶、对生叶、十字型对出叶、对生重叠叶、轮生叶、有柄叶、无柄叶、近无柄叶、有托叶、无托叶、单叶、复叶、叶原基、叶鞘、叶基、叶的紧邻其与叶柄或茎的附着点的一部分、芽，包括但不限于侧芽、以及前述的组合。在一个方面，功能性WUS/WOX多肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、或212；或其中功能性WUS/WOX多肽由选自以下的核苷酸序列编码：SEQ ID NO：143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、1 71、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、或211，并且其中Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：214、216、219、221、223、225、227、229、或231；或其中Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽由选自以下的核苷酸序列编码：SEQ ID NO：213、215、217、218、220、222、224、226、228、230、或232。在一个方面，形态发生基因表达盒进一步包含选自以下的多核苷酸：ZM-MIR-Corngrass1核苷酸、ZM-GRF5核苷酸、ZM-GRF4核苷酸、ZM-GIF1核苷酸、ZM-GRF4～GIF1核苷酸、ZM-STEMIN1核苷酸、ZM-REV核苷酸、ZM-ESR1核苷酸、ZM-LAS核苷酸、ZM-CUC1核苷酸、ZM-CUC2核苷酸、ZM-CUC3核苷酸、ZM-RLD1核苷酸、ZM-KN1核苷酸、ZM-CYCD2核苷酸、ZM-GPCNAC-1核苷酸、ZM-MIR156B核苷酸、ZM-LEC1核苷酸、AT-RKD4核苷酸、AT-LEC2核苷酸、AT-RAP2.6L核苷酸、ZM-MIR-SPS1核苷酸、ZM-MIR-MAX1核苷酸、或ZM-MIR-MAX4核苷酸。在一个方面，形态发生基因表达盒进一步包含编码位点特异性重组酶的多核苷酸序列，该位点特异性重组酶选自由以下组成的组：FLP、FLPe、KD、Cre、SSV1、λInt、phi C31 Int、HK022、R、B2、B3、Gin、Tn1721、CinH、ParA、Tn5053、Bxb1、TP907-1或U153，其中该位点特异性重组酶可操作地连接到组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子、或受发育调控的启动子。在一个方面，切除形态发生基因表达盒以提供含有异源多核苷酸的转基因玉蜀黍植物。在一个方面，远离形态发生基因表达盒育种。在一个方面，由该方法产生的转基因植物包含异源多核苷酸。在一个方面，转基因植物的种子包含异源多核苷酸。
在一个方面，一种产生经基因组编辑的玉蜀黍植物的方法，该方法包括使玉蜀黍叶外植体与形态发生基因表达盒接触，其中该形态发生基因表达盒包含编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列和编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽或WUS/WOX和BBM或ODP2多肽的功能同源物的核苷酸序列，其中编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列和编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽或WUS/WOX和BBM或ODP2多肽的功能同源物的核苷酸序列的组合表达大于形态发生基因表达盒的表达，该形态发生基因表达盒包含可操作地连接到具有SEQ ID NO：290的农杆菌属-NOS启动子的编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列，和可操作地连接到具有SEQ ID NO：339的泛素(UBI)启动子的编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列；提供编码位点特异性多肽或位点特异性核酸酶的多核苷酸；选择含有基因组编辑的玉蜀黍叶外植体，其中该玉蜀黍叶外植体在该接触的约八周或更短时间内、或约6周或更短时间内、或约4周或更短时间内、或约十天至约十四天内形成含有该基因组编辑的可再生植物结构；以及从含有基因组编辑的可再生植物结构再生经基因组编辑的植物。在一个方面，玉蜀黍叶外植体是单倍体玉蜀黍叶外植体。在一个方面，编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列选自WUS、WUS1、WUS2、WUS3、WOX2A、WOX4、WOX5A和WOX9，并且其中编码Babyboom(BBM)多肽的核苷酸序列选自BBM、BBM1、BBM2、BBM3、BMN2和BMN3，或者胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽是ODP2。在一个方面，位点特异性多肽或位点特异性核酸酶选自由以下组成的组：锌指核酸酶、大范围核酸酶、转座酶、TALEN、和CRISPR-Cas核酸酶。在一个方面，CRISPR-Cas核酸酶是Cas9、Cpfl、或Cas12f1核酸酶并且进一步包括提供指导RNA。在一个方面，位点特异性多肽或位点特异性核酸酶实现插入、缺失、或取代突变。在一个方面，指导RNA和CRISPR-Cas核酸酶是核糖核蛋白复合物。在一个方面，叶外植体选自由以下组成的组：叶、根生叶、茎生叶、互生叶、对生叶、十字型对出叶、对生重叠叶、轮生叶、有柄叶、无柄叶、近无柄叶、有托叶、无托叶、单叶、复叶、叶原基、叶鞘、叶基、叶的紧邻其与叶柄或茎的附着点的一部分、芽，包括但不限于侧芽、以及前述的组合。在一个方面，功能性WUS/WOX多肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、或212；或其中功能性WUS/WOX多肽由选自以下的核苷酸序列编码：SEQ ID NO：143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、或211，并且其中Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：214、216、219、221、223、225、227、229、或231；或其中Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽由选自以下的核苷酸序列编码：SEQ ID NO：213、215、217、218、220、222、224、226、228、230、或232。在一个方面，形态发生基因表达盒进一步包含选自以下的多核苷酸：ZM-MIR-Corngrass1核苷酸、ZM-GRF5核苷酸、ZM-GRF4核苷酸、ZM-GIF1核苷酸、ZM-GRF4～GIF1核苷酸、ZM-STEMIN1核苷酸、ZM-REV核苷酸、ZM-ESR1核苷酸、ZM-LAS核苷酸、ZM-CUC1核苷酸、ZM-CUC2核苷酸、ZM-CUC3核苷酸、ZM-RLD1核苷酸、ZM-KN1核苷酸、ZM-CYCD2核苷酸、ZM-GPCNAC-1核苷酸、ZM-MIR156B核苷酸、ZM-LEC1核苷酸、AT-RKD4核苷酸、AT-LEC2核苷酸、AT-RAP2.6L核苷酸、ZM-CUC3核苷酸、ZM-MIR-SPSl核苷酸、ZM-MIR-MAX1核苷酸、或ZM-MIR-MAX4核苷酸。在一个方面，形态发生基因表达盒进一步包含编码位点特异性重组酶的多核苷酸序列，该位点特异性重组酶选自由以下组成的组：FLP、FLPe、KD、Cre、SSVl、λInt、phi C31 Int、HK022、R、B2、B3、Gin、Tn1721、CinH、ParA、Tn5053、Bxb1、TP907-1或U153，其中该位点特异性重组酶可操作地连接到组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子、或受发育调控的启动子。在一个方面，切除形态发生基因表达盒以提供经基因组编辑的植物。在一个方面，远离形态发生基因表达盒育种以提供含有基因组编辑的经基因组编辑的植物。在一个方面，提供了由该方法产生的经基因组编辑的植物。在一个方面，经基因组编辑的植物的种子包含基因组编辑。
在一个方面，一种产生经基因组编辑的单子叶植物的方法，该方法包括使单子叶植物叶外植体与形态发生基因表达盒接触，其中该形态发生基因表达盒包含编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列和编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列，其中编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列和编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列的组合表达大于形态发生基因表达盒的表达，该形态发生基因表达盒包含可操作地连接到具有SEQ ID NO：290的AT-NOS启动子的编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列，和可操作地连接到具有SEQ ID NO：339的泛素(UBI)启动子的编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列，和提供编码位点特异性多肽或位点特异性核酸酶的多核苷酸；选择含有基因组编辑的单子叶植物叶外植体，其中该单子叶植物叶外植体在该接触的约八周或更短时间内、或约6周或更短时间内、或约4周或更短时间内、或约十天至约十四天内形成含有该基因组编辑的可再生植物结构；以及从含有基因组编辑的可再生植物结构再生经基因组编辑的植物。在一个方面，单子叶植物叶外植体是单倍体单子叶植物叶外植体。在另一个方面，其中编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列选自WUS、WUS1、WUS2、WUS3、WOX2A、WOX4、WOX5A和WOX9，并且其中编码Babyboom(BBM)多肽的核苷酸序列选自BBM、BBM1、BBM2、BBM3、BMN2、和BMN3，或者胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽是ODP2。在一个方面，位点特异性多肽或位点特异性核酸酶选自由以下组成的组：锌指核酸酶、大范围核酸酶、TALEN和CRISPR-Cas核酸酶。在进一步的方面，CRISPR-Cas核酸酶是Cas9或Cpfl核酸酶并且进一步包括提供指导RNA。在一个方面，位点特异性多肽或位点特异性核酸酶实现插入、缺失、或取代突变。在一个方面，指导RNA和CRISPR-Cas核酸酶是核糖核蛋白复合物。在一个方面，可用于本公开的方法的叶外植体选自由由以下组成的组：叶、根生叶、茎生叶、互生叶、对生叶、十字型对出叶、对生重叠叶、轮生叶、有柄叶、无柄叶、近无柄叶、有托叶、无托叶、单叶、复叶、叶原基、叶鞘、叶基、叶的紧邻其与叶柄或茎的附着点的一部分、芽(包括但不限于侧芽)、以及前述的组合。在一个方面，可用于本公开的方法的单子叶植物选自由以下组成的组：柳枝稷(柳枝稷草)、双色高粱(高粱、苏丹草)、巨芒(芒草)、甘蔗属物种(能源甘蔗)、玉蜀黍(玉米)、普通小麦(小麦)、水稻(稻)、御谷(珍珠粟)、黍属物种、高粱属物种、芒属物种、甘蔗属物种、和斑茅属物种。在一个方面，可用于本公开的方法的单子叶植物选自禾本科。在一个方面，其中单子叶植物来自禾本科，单子叶植物选自禾本科亚科，该禾本科亚科选自虎尾草亚科、黍亚科、稻亚科、和早熟禾亚科。在一个方面，其中单子叶植物来自禾本科亚科虎尾草亚科，该单子叶植物是埃塞俄比亚画眉草。在一个方面，其中单子叶植物来自禾本科亚科黍亚科，该单子叶植物选自玉蜀黍、双色高粱、御谷、和柳枝稷。在一个方面，其中单子叶植物来自禾本科亚科稻亚科，该单子叶植物是水稻。在一个方面，其中单子叶植物来自禾本科亚科早熟禾亚科，该单子叶植物选自大麦、黑麦、和普通小麦。在一个方面，其中功能性WUS/WOX多肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、或212；或其中功能性WUS/WOX多肽由选自以下的核苷酸序列编码：SEQ ID NO：143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、1 89、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、或211，并且其中Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：214、216、219、221、223、225、227、229、或231；或其中Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽由选自以下的核苷酸序列编码：SEQ IDNO：213、215、217、218、220、222、224、226、228、230、或232。在一个方面，形态发生基因表达盒进一步包含选自以下的多核苷酸：ZM-MIR-Corngrass1核苷酸、ZM-GRF5核苷酸、ZM-GRF4核苷酸、ZM-GIF1核苷酸、ZM-GRF4～GIF1核苷酸、ZM-STEMIN1核苷酸、ZM-REV核苷酸、ZM-ESR1核苷酸、ZM-LAS核苷酸、ZM-CUC3核苷酸、ZM-MIR-SPS1核苷酸、ZM-MIR-MAX1核苷酸、或ZM-MIR-MAX4核苷酸。在进一步的方面，形态发生基因表达盒进一步包含编码位点特异性重组酶的多核苷酸序列，该位点特异性重组酶选自由以下组成的组：FLP、FLPe、KD、Cre、SSV1、λInt、phi C31Int、HK022、R、B2、B3、Gin、Tn1721、CinH、ParA、Tn5053、Bxb1、TP907-1、或U153，其中该位点特异性重组酶可操作地连接到组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子、或受发育调控的启动子。在一个方面，切除形态发生基因表达盒被以提供经基因组编辑的植物。在一个方面，远离形态发生基因表达盒育种以提供含有基因组编辑的经基因组编辑的植物。在一个方面，提供了由本文所公开的方法产生的经基因组编辑的植物，其中该植物包含基因组编辑。在一个方面，提供了由本文所公开的方法产生的经基因组编辑的植物的种子，其中该种子包含基因组编辑。
具体实施方式
将在下文中更全面地描述本文的公开内容，其中示出了一些但不是所有的可能的方面。实际上，公开内容能以许多不同的形式体现，并且不应被解释为局限于本文所阐述的方面；而是提供这些方面，使得本公开能满足适用的法律要求。
所公开的方法所涉及的领域中的技术人员将考虑到，本文所公开的许多修改和其他方面具有以下描述中呈现的传授的益处。因此，应当理解，这些公开内容不限于所公开的特定方面，并且修改和其他方面旨在包括在所附权利要求的范围内。尽管本文中采用了特定术语，但这些术语仅在一般性和描述性意义上使用而并非用于限制目的。
也应当了解本文所用的术语仅是为了描述特定方面而不旨在进行限制。如在说明书和权利要求中所使用的，术语“包含”可以包括“由......组成”的方面。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与所公开的组合物和方法所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。在本说明书和下面的权利要求中，将参考本文中所定义的若干术语。
如本文所用，“接触(contacting、contact、contacted)”、“与......进行接触(comes in contact with)”或“与......接触(in contact with)”意指“直接接触”或“间接接触”。例如，将细胞置于细胞可以与表达盒、核苷酸、肽、RNP(核糖核蛋白)或本文公开的其他物质进行接触的条件下。允许此类表达盒、核苷酸、肽或其他物质存在于细胞存活的环境(例如，培养基或在细胞中表达或邻近细胞中表达)中并且可以在细胞上起作用。例如，包含选择剂的培养基可以与细胞直接接触，或者包含选择剂的培养基可以由滤纸、植物组织或其他细胞与细胞分离，因此选择剂通过滤纸、植物组织或其他细胞转移到细胞。可以由T-DNA转移、粒子轰击、电穿孔、PEG转染、或RNP(核糖核蛋白)递送使本文所公开的表达盒、核苷酸、肽和其他物质与细胞接触。
如本文所用，体细胞胚是通过与合子胚的发育相似的发育阶段(包括球形和过渡阶段胚的形成、胚轴、和盾片的形成以及脂质和淀粉的积累)进行的多细胞结构。衍生自合子胚的单个体细胞胚萌发以产生单个非嵌合植物，其可能最初衍生自单个细胞。
如本文所用，“胚性愈伤组织”或“愈伤组织”是未分化或部分未分化细胞的脆性或非脆性混合物，其包聚增殖的初级和次级体细胞胚，该初级或次级体细胞胚能够再生为成熟可育植物。
如本文所用，“萌发”是可再生结构的生长，以形成苗，然后继续生长以产生植物。
如本文所用，“转基因植物”是含有转基因的成熟可育植物。
本公开的方法可用于转化叶外植体。如本文所用，“叶外植体”包括但不限于根生叶、茎生叶、互生叶、对生叶、十字型对出叶、对生重叠叶、轮生叶、有柄叶、无柄叶、近无柄叶、有托叶、无托叶、单叶、或复叶。叶外植体包括芽(包括但不限于侧芽)、叶原基、叶鞘、叶基、或叶的紧邻其与叶柄或茎的附着点的一部分。此类营养器官及其复合组织可用于用编码农艺学重要性状的核苷酸序列转化。
如本文所用，“叶”是从植物茎突出的扁平横向结构，包括扁平叶和植物茎之间的支撑秆，但不包括位于叶柄和茎连接处的腋生分生组织，包括但不限于根生叶、茎生叶、互生叶、对生叶、十字型对出叶、对生重叠叶、轮生叶、有柄叶、无柄叶、近无柄叶、有托叶、无托叶、单叶、或复叶。
如本文所用，“同源物”是旁系同源物(例如，同一物种基因组内的家族成员)或直系同源物(来自另一植物物种的相应基因)。更一般地，由从共同的祖先DNA序列遗传而与第二个基因相关的基因被称为同源物。术语同源物适用于因物种形成事件而分离的基因之间的关系(直系同源物)或在同一物种内因遗传复制事件而分离的基因之间的关系(旁系同源物)。
如本文所用，术语“形态发生基因”是指基因，该基因当异位表达时刺激可产生植物的体细胞衍生结构的形成。更精确地，形态发生基因的异位表达或突变或沉默或表达减少刺激了可以产生植物的体细胞胚或器官发生结构(比如芽分生组织或腋生分生组织)的从头形成或刺激了植物再生。这种刺激的从头形成发生在形态发生基因在其中被表达或沉默或抑制的细胞中，或者发生在相邻细胞中。形态发生基因可以是调节其他基因表达的转录因子，或者是影响植物组织中激素水平的基因，两者都可以刺激形态发生改变。可以将形态发生基因稳定地掺入植物的基因组中或可以瞬时表达。在一个方面，控制形态发生基因的表达。可以在转录或转录后控制表达。受控表达也可以是特定时期内形态发生基因的脉冲表达。替代地，形态发生基因可以仅在某些转化细胞中表达而在其他细胞中不表达。可以通过下文公开的多种方法来控制形态发生基因的表达。可用于本公开的方法的形态发生基因可获自或衍生自任何植物物种。
如本文所用，术语“形态发生因子”意指形态发生基因和/或由形态发生基因表达的蛋白质。
形态发生基因涉及植物代谢、器官发育、干细胞发育、细胞生长刺激、器官发生、再生、体细胞胚发生起始、加速体细胞胚成熟、顶端分生组织的起始和/或发育、芽分生组织或腋生分生组织的起始和/或发育、芽的起始和/或发育、或它们的组合，比如WUS/WOX基因(WUS、WUS1、WUS2、WUS3、WOX2A、WOX4、WOX5或WOX9)，参见美国专利7,348,468和7,256,322以及美国专利申请公开20170121722和20070271628：Laux等人(1996)Development[发育]122：87-96；和Mayer等人(1998)Cell[细胞]95：805-815；van der Graaff等人，2009，Genome Biology[基因组生物学]10：248；Dolzblasz等人，2016，Mol.Plant[分子植物]19：1028-39可用于本公开的方法。预期WUS/WOX的调节可调节植物和/或植物组织表型，包括植物代谢、器官发育、干细胞发育、细胞生长刺激、器官发生、再生、体细胞胚发生的起始、体细胞胚成熟的加速、顶端分生组织的起始和/或发育、芽分生组织的起始和/或发育、芽的起始和/或发育、或其组合。拟南芥(Arabidopsis)WUS的表达可以在营养组织中诱导干细胞，其可以分化为体细胞胚(Zuo，等人(2002)Plant J[植物杂志]30：349-359)。在这方面也有意义的是MYB118基因(参见美国专利7，148，402)、MYB115基因(参见Wang等人(2008)CellResearch[细胞研究]224-235)、BABYBOOM基因(BBM；参见Boutilier等人(2002)Plant Cell[植物细胞]14：1737-1749)、CLAVATA基因(参见例如美国专利7,179,963)、芽再生增强子1(ESR1)基因(参见Banno等人(2001)，The Plant Cell[植物细胞]，卷13：2609-2618)、Corngrass1(Cg1)基因(参见Chuck等人(2007)Nature Genetics[自然基因]，卷39(4)：544-549)、杯状子叶(CUC)基因(参见Hibara等人(2006)The Plant Cell[植物细胞]，卷18：2946-2957)、REVOLUTA(REV)基因(参见Otsuga等人(2001)The Plant Journal[植物杂志]25(2)：223-236)、更多腋生生长1(MAX1)基因(参见Stirnberg等人(2002)Development[发育]129：1131-1141)、SUPERSHOOT(SPS)基因(参见Tanikanjana，等人(2001)Genes&Development[基因和发育]15：1577-1588)、横向抑制因子(LAS)基因(参见Greb等人(2003)Genes&Development[基因和发育]17：1175-1187)、更多腋生生长4(MAX4)基因(参见Sorefan等人(2003)Genes&Development[基因和发育]17：1469-1474)、干细胞诱导因子1(STEMIN1)基因(参见Ishikawa等人(2019)Nature Plants[自然植物]5：681-690)、生长调节因子4(GRF4)基因和/或GRF相互作用因子1(GIF1)基因(参见Debernardi等人bioRxiv2020.08.23.263905；doi：https：//doi.org/10.1101/2020.08.23.263905)、和生长调节因子5(GRF5)基因(参见Kong等人bioRxiv 2020.08.23.263947；doi：https：//doi.org/10.1101/2020.08.23.263947)。
功能性WUS/WOX多肽的形态发生多核苷酸序列和氨基酸序列可用于所公开的方法。如本文所定义，“功能性WUS/WOX核苷酸”是编码含有同源盒DNA结合结构域、WUS盒和EAR阻遏物结构域的蛋白质的任何多核苷酸(Ikeda等人，2009Plant Cell[植物细胞]21：3493-3505)。如Rodriguez等人，2016PNAS www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.1607673113所证明的，去除留在同源盒DNA结合结构域，WUS盒和EAR阻遏子结构域后面的二聚化序列产生功能性WUS/WOX多肽。Wuschel蛋白(以下称为WUS)在含有多能干细胞池的顶端分生组织的起始和维持中起关键作用(Endrizzi，等人，(1996)Plant Journal[植物杂志]10：967-979；Laux，等人，(1996)Development[发育]122：87-96；以及Mayer，等人，(1998)Cell[细胞]95：805-815)。WUS基因的拟南芥植物突变体含有被错误指定并且似乎经历分化的干细胞。WUS编码一种可能作为转录调节剂的新型同源结构域蛋白(Mayer，等人，(1998)Cell[细胞]95：805-815)。拟南芥芽分生组织的干细胞群体被认为通过促进器官起始的CLAVATA(CLV)基因与干细胞特性所需的WUS基因之间的调节环来维持，其中CLV基因在转录水平上阻遏WUS，并且WUS表达足以诱导分生组织细胞特性和干细胞标志物CLV3的表达(Brand，等人，(2000)Science[科学]289：617-619；Schoof，等人，(2000)Cell[细胞]100：635-644)。WUS在拟南芥中的组成型表达已显示可导致叶片的不定芽增殖(原位)(Laux，T.，Talk Presented atthe XVI International Botanical Congress Meeting[在第十六届国际植物大会上发表的演讲]，1999年8月1-7日，密苏里州圣路易斯(St.Louis，Mo.))。
在一个方面，可用于本公开的方法的功能性WUS/WOX多肽是WUS、WUS1、WUS2、WUS3、WOX2A、WOX4、WOX5、WOX5A或WOX9多肽(参见，美国专利7，348，468和7，256，322以及美国专利申请公开号2017/0121722和2007/0271628，将其通过引用以其全文并入本文以及van derGraaff等人，2009，Genome Biology[基因组生物学]10：248)。可用于本公开的方法的功能性WUS/WOX多肽可获自或衍生自任何植物，包括但不限于单子叶植物、双子叶植物、被子植物和裸子植物。可用于本公开的方法的其他功能性WUS/WOX序列列于表2。
可用于本公开的其他形态发生基因包括但不限于LEC1(将其通过引用以其全文并入本文的美国专利6,825,397，Lotan等人，1998，Cell[细胞]93：1195-1205)、LEC2(Stone等人，2008，PNAS 105：3151-3156；Belide等人，2013，Plant Cell Tiss.Organ Cult[植物细胞组织器官培养]113：543-553)、KN1/STM(Sinha等人，1993.Genes Dev[基因发育]7：787-795)、来自农杆菌属的IPT基因(Ebinuma and Komamine，2001，In vitro Cell.Dev Biol-Plant[体外细胞发育生物学-植物]37：103-113)、MONOPTEROS-DELTA(Ckurshumova等人，2014，New Phytol.[新植物学]204：556-566)、农杆菌属AV-6b基因(Wabiko和Minemura1996，Plant Physiol.[植物生理学1112：939-951)、农杆菌属IAA--h和IAA-m基因的组合(Endo等人，2002，Plant Cell Rep.[植物细胞报告]，20：923-928)、拟南芥SERK基因(Hecht等人，2001，Plant Physiol.[植物生理学]127：803-816)、拟南芥AGL15基因(Harding等人，2003，Plant Physiol.[植物生理学]133：653-663)、FUSCA基因(Castle和Meinke，PlantCell[植物细胞]6：25-41)和PICKLE基因(Ogas等人，1999，PNAS 96：13839-13844)。
如本文所用，术语“转录因子”意指通过与启动子的DNA序列结合以及上调或下调表达来控制特定基因的转录速率的蛋白质。转录因子(也是形态发生基因)的实例包括AP2/EREBP家族的成员(包括BBM(ODP2)、多血(plethora)和aintegumenta亚家族、CAAT-盒结合蛋白(比如LEC1和HAP3)以及MYB的成员、bHLH、NAC、MADS、bZIP和WRKY家族。
胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽以及相关多肽如Babyboom(BBM)蛋白家族蛋白的形态发生多核苷酸序列和氨基酸序列可用于本公开的方法。在一个方面，包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是ODP2、BBM2、BMN2或BMN3多肽，参见美国专利申请公开号2017/0121722，将其通过引用以其全文并入本文。可用于本公开的方法的ODP2多肽包含两个预测的APETALA2(AP2)结构域，并且是AP2蛋白家族(PFAM登录号PF00847)的成员。推定转录因子的AP2家族已显示出调节广泛的发育过程，并且家族成员的特征是存在AP2DNA结合结构域。预测该保守核心形成结合DNA的两亲性α螺旋。AP2结构域首先在APETALA2中鉴定，APETALA2是拟南芥蛋白，调节分生组织身份、花器官规格、种皮发育和花同源基因表达。现在已经在多种蛋白质中发现了AP2结构域。
可用于本公开的方法的ODP2多肽与AP2家族内的几种多肽具有同源性，例如参见通过引用以其全文并入本文的US 8420893的图1，提供了玉蜀黍和水稻ODP2多肽与具有两个AP2结构域的其他八个蛋白质的比对。在图1中还提供了在US 8420893的比对中出现的所有蛋白质的共有序列。可用于本公开方法的包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽可获自或衍生自本文该的任何植物。在一个方面，可用于本公开方法的包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是ODP2多肽。在一个方面，可用于本公开方法的包含两个AP2-DNA结合结构域的多肽是BBM2多肽。可用于本公开的方法的ODP2多肽和BBM2多肽可获自或衍生自任何植物，包括但不限于单子叶植物、双子叶植物、被子植物和裸子植物。可用于本公开的方法的另外的胚珠发育蛋白2(ODP2)序列和Babyboom(BBM)(BBM、BBM1、BBM2、BBM3、BMN2和BMN3)序列列于表2。
如本文所用，术语“表达盒”意指由编码和非编码序列组成的载体DNA的独特组分，该编码和非编码序列包括在转化/转染细胞中控制表达的5′和3′调节序列。
如本文所用，术语“编码序列”意指由编码蛋白质的氨基酸的起始密码子和终止密码子界定的DNA序列部分。
如本文所用，术语“非编码序列”意指进行转录以产生信使RNA但不编码蛋白质的氨基酸的DNA序列部分，例如5’非翻译区，内含子和3’非翻译区。非编码序列也可以指RNA分子，例如微RNA、干扰RNA或RNA发夹，其当表达时可以下调内源基因或其他转基因的表达。
如本文所用，术语“调节序列”意指能够增加或减少基因表达的核酸分子区段。调节序列包括启动子、终止子、增强子元件、沉默元件、5’UTR和3’UTR(非翻译区)。
如本文所用，术语“UBI”或“UBI1”或“URI PRO”或“URI1 PRO”或“ZM-UBI PRO”或“ZM-UBI1 PRO”或“ZM-UBI1 PRO Complete”(SEQ ID NO：339)由UBI1ZM PRO序列(SEQ IDNO：333)和UBI1ZM 5UTR(SEQ ID NO：334)以及UBIlZM INTRON1(SEQ ID NO：335)构成。
如本文所用，术语“3xENH”(SEQ ID NO：340)由FMV ENH(SEQ ID NO：336)和PCSVENH(SEQ ID NO：337)以及MMV ENH(SEQ ID NO：338)构成。
如本文所用，术语“转移盒”意指T-DNA，其包含侧翼为右边界和左边界的一个或多个表达盒。
如本文所用，“T-DNA”意指插入宿主植物细胞的基因组中的Ti质粒的一部分。
如本文所用，术语“可选择标记”意指当在转化/转染细胞中表达时赋予对选择剂如抗生素、除草剂和对未转化/未转染细胞有毒的其他化合物的抗性的转基因。
如本文所用，术语“EAR”意指乙烯响应元件结合因子相关的两亲性阻遏基序，其具有作为转录因子内转录阻遏信号的一般共有序列。在DNA结合蛋白(例如转录因子、dCAS9或LEXA(作为实例))上添加EAR型阻遏子元件，赋予融合蛋白转录阻遏功能(Kagale，S.，和Rozwadowski，K.2010.Plant Signaling and Behavior[植物信号与行为]5：691-694)。
在一个方面，本公开的方法包括使单子叶植物叶外植体与重组表达盒或构建体接触，该重组表达盒或构建体包含编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列，或编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列，或编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列与编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列的组合，以产生包含异源多核苷酸的转基因单子叶植物。
在一个方面，编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列，或编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列，或编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列与编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列的组合可以被位点特异性重组酶靶向切除。因此，编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列，或编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列，或编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列与编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列的组合的表达可以在转化后的期望时间由切除控制。应当理解，当位点特异性重组酶用于控制编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列，或编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列，或编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列与编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列的组合的表达时，表达构建体包含在待切除的多核苷酸序列侧翼的适当位点特异性切除位点，例如，如果使用Cre重组酶，则是Cre lox位点。位点特异性重组酶不一定共位于包含编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列，或编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列，或编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列与编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列的组合的表达构建体上。然而，在一个方面，形态发生基因表达盒进一步包含编码位点特异性重组酶的核苷酸序列。
用于控制编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列，或编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列，或编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列与编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列的组合的表达的位点特异性重组酶可以选自多种合适的位点特异性重组酶。例如，在各个方面中，位点特异性重组酶是FLP、FLPe、KD、Cre、SSV1、λInt、phi C31 Int、HK022、R、B2(Nern等人，(2011)PNAS[美国国家科学院院刊]第108卷，第34期第14198-14203页)、B3(Nern等人，(2011)PNAS[美国国家科学院院刊]第108卷，第34期第14198-14203页)、Gin、Tn1721、CinH、ParA、Tn5053、Bxb1、TP907-1或U153。位点特异性重组酶可以是去稳定的融合多肽。去稳定的融合多肽可以是TETR(G17A)-CRE或ESR(G17A)-CRE。
在一个方面，编码位点特异性重组酶的核苷酸序列可操作地连接到组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子或受发育调控的启动子。合适的组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子和发育调控启动子包括UBI，LLDAV，EVCV，DMMV，BSV(AY)PRO，CYMV PRO FL，UBIZM PRO，SI-UB3 PRO，SB-UBI PRO(ALT1)，USB1ZM PRO，ZM-GOS2 PRO，ZM-H1B PRO(1.2KB)，IN2-2，NOS，35S的-135版本，ZM-ADF PRO(ALT2)，AXIG1，DR5，XVE，GLB1，OLE，LTP2(Kalla等人，1994.Plant J.[植物杂志]6：849-860和US 5525716，通过引用以其全文并入本文)，HSP17.7，HSP26，HSP18A，AT-HSP811，AT-HSP811L，GM-HSP173B，四环素、胺苯磺隆或氯磺隆激活的启动子，PLTP，PLTP1，PLTP2，PLTP3，SDR，LGL，LEA-14A或LEA-D34(美国专利申请公开20170121722和20180371480，通过引用以其全文并入本文)。
在一个方面，可操作地连接到位点特异性重组酶的化学诱导型启动子是XVE(Zuo等人(2002)The Plant Journal[植物杂志]30(3)：349-359)。化学诱导型启动子可以被四环素阻遏物(TETR)、胺苯磺隆阻遏物(ESR)或氯磺隆阻遏物(CR)阻遏，并且在添加四环素相关配体或磺酰脲配体后会发生去阻遏作用。阻遏物可以是TETR，四环素相关的配体是强力霉素或脱水四环素。(Gatz，C.，Frohberg，C.和Wendenburg，R.(1992)Stringentrepression and homoaeneous de-repression by tetracycline of a modified CaMV35S promoter in intact transgenic tobacco plants[在完整转基因烟草植物中，四环素对修饰的CaMV 35S启动子的严格阻遏和均质去阻遏]，Plant J.[植物杂志]2，397-404)。可替代地，阻遏物可以是ESR，并且磺酰脲配体是胺苯磺隆、氯磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆、氯嘧磺隆、烟嘧磺隆、氟嘧磺隆、苯磺隆、磺酰磺隆、三氟啶磺隆、甲酰胺磺隆、碘甲磺隆，氟磺隆、噻吩磺隆、砜嘧磺隆、甲基二磺隆或氯吡嘧磺隆(US 20110287936通过引用以其全文并入本文)。用于诱导型表达的可替代方法是使用在其中编码的糖皮质激素阻遏物(Ouwerkerk等人(2001)Planta[植物]213：370-378)融合到编码的目的基因(例如形态发生蛋白，比如WUS2或ODP2蛋白)的糖皮质激素系统。
在一个方面，当形态发生基因表达盒或构建体包含位点特异性重组酶切除位点时，编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列，或编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列，或编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列与编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列的组合可以可操作地连接到生长素诱导型启动子、受发育调控的启动子、组织特异性启动子或组成型启动子。在这种情况下有用的示例性生长素诱导型启动子、受发育调控的启动子、组织特异性启动子和组成型启动子包括UBI，LLDAV，EVCV，DMMV，BSV(AY)PRO，CYMV PRO FL，UBIZM PRO，SI-UB3 PRO，SB-UBI PRO(ALT1)，USB1ZM PRO，ZM-GOS2 PRO，ZM-H1B PRO(1.2KB)，IN2-2，NOS，-135形式的35S，ZM-ADF PRO(ALT2)，AXIG1(US 6，838，593通过引用以其全文并入本文)，DR5，XVE，GLB1，OLE，LTP2，HSP17.7，HSP26，HSP18A，AT-HSP811(Takahashi，T，等人，(1992)Plant Physiol.[植物生理学]99(2)：383-390)，AT-HSP811L(Takahashi，T，等人，(1992)Plant Physiol.[植物生理学]99(2)：383-390)，GM-HSP173B(
Figure BDA0004153398210000341
F.，等人(1984)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]3(11)：2491-2497)，四环素、胺苯磺隆或氯磺隆激活的启动子，PLTP，PLTP1，PLTP2，PLTP3，SDR，LGL，LEA-14A，LEA-D34(美国专利申请公开20170121722和20180371480，通过引用以其全文并入本文)以及本文公开的任何启动子。
当使用形态发生基因盒和性状基因盒(异源多核苷酸)来产生转基因植物时，希望具有在共转化的植物中将形态发生基因基因座与性状基因(异源多核苷酸)基因座分离的能力，以提供仅含有性状基因(异源多核苷酸)的转基因植物。这可以使用根癌农杆菌属两T-DNA二元系统来实现，其中通用主题具有两个变型(参见Miller等人，2002)。例如，在最初的两T-DNA载体中，用于形态发生基因和除草剂选择(即HRA)的表达盒包含在第一T-DNA中，并且性状基因表达盒(异源多核苷酸)包含在第二T-DNA中，其中两个T-DNA都存在于单个二元载体上。当用含有两T-DNA质粒的农杆菌属转化植物细胞时，高百分比的转化的细胞含有两个T-DNA，该两个T-DNA已经整合到不同基因组位置(例如，在不同染色体上)。在第二方法中，例如，将两个农杆菌属菌株(每个菌株均含有两个T-DNA(形态发生基因T-DNA或性状基因(异源多核苷酸)T-DNA)之一)按比例混合在一起，并将混合物用于转化。使用这种混合农杆菌属方法转化后，高频率观察到恢复的转基因事件同时包含两个T-DNA，通常位于不同的基因组位置。对于两种共转化方法，观察到在大部分产生的转基因事件中，这两个T-DNA基因座独立地分离，并且可以很容易地鉴定出子代T1植物，其中T-DNA基因座彼此分离，从而导致子代种子的恢复，该子代种子含有无形态发生基因/除草剂基因的性状基因(异源多核苷酸)。参见Miller等人Transgenic Res[转基因研究]11(4)：381-96。
除了电穿孔、PEG转染或RNP(核糖核蛋白)递送外，本文提供的方法还依赖于使用细菌介导的和/或生物射弹介导的基因转移来产生具有掺入的目标核苷酸序列的可再生植物细胞。可用在本公开的方法中的细菌株包括但不限于卸甲(disarmed)农杆菌属、苍白杆菌属细菌或根瘤菌科(Rhizobiaceae)细菌。可用于本方法的卸甲农杆菌属(Agrobacteria)包括但不限于AGL-1、EHA105、GV3101、LBA4404、LBA4404 THY-(参见US 8,334,429，其通过引用以其全文并入本文)和LBA4404 TD THY-(其中两个拷贝移除的Tn904转座子已从LBA4404 THY-中移除)(参见2020年3月26日提交的PCT/US 20/24993，其要求2019年3月28日提交的美国临时专利申请号62/825054的权益，所有这些农杆菌属特此通过引用以其全文并入本文)。农杆菌属菌株LBA4404 TD THY-是保藏于ATCC的根癌农杆菌属(A.tumefaciens)LBA4404 THY-菌株，指定的登录号为PTA-10531，其中功能性Tn904转座子不存在或Tn904转座子的两个拷贝都已被删除。可用于本发明方法的苍白杆菌属细菌菌株包括但不限于美国专利公开号US 20180216123中公开的那些，其通过引用以其全文并入本文。可用于本发明方法的根瘤菌科细菌株包括但不限于美国专利号US 9,365,859中公开的那些，其通过引用以其全文并入本文。
还呈现了具有该表达盒的植物，该表达盒被稳定地掺入到该植物、该植物的种子的基因组中，其中该种子包含该表达盒。进一步呈现的是植物，其中异源多核苷酸或目的多核苷酸的基因或基因产物赋予营养增强、产量增加、非生物胁迫耐受性、耐旱性、耐寒性、除草剂耐受性、有害生物抗性、病原体抗性、昆虫抗性、氮利用效率(NUE)、疾病抗性或改变代谢途径的能力。还呈现了一种植物，其中异源多核苷酸或目的多核苷酸的表达改变了该植物的表型。
本公开涵盖分离的或基本上纯化的核酸组合物。“分离的”或“纯化的”核酸分子或其生物活性部分当通过重组技术产生时不含其他细胞物质或培养基，或者当化学合成时基本上不含化学前体或其他化学物质。“分离的”核酸基本上不含在衍生出该核酸的生物体的基因组DNA中天然地位于该核酸侧翼的序列(即位于该核酸的5′和3′端的序列)(包括蛋白质编码序列)。例如，在多个方面中，分离的核酸分子可含有少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，这些核苷酸序列在衍生该核酸的细胞的基因组DNA中天然地位于该核酸分子的侧翼。
如本文所使用的，术语“片段”是指核酸序列的一部分。用于本公开的方法中的序列的片段保留了核酸序列的生物活性。可替代地，可用作杂交探针的核苷酸序列的片段可以不必保留生物活性。本文公开的核苷酸序列的片段可以在至少约20、25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1025、1050、1075、1100、1125、1150、1175、1200、1225、1250、1275、1300、1325、1350、1375、1400、1425、1450、1475、1500、1525、1550、1575、1600、1625、1650、1675、1700、1725、1750、1775、1800、1825、1850、1875或1900个核苷酸，且最多主题序列的全长范围内。核苷酸序列的生物活性部分可通过分离序列的一部分并评估该部分的活性来制备。
还涵盖了用于本公开方法的核苷酸序列的片段和变体以及由此编码的蛋白质。如本文所用，术语“片段”是指核苷酸序列的一部分，由此编码的蛋白质或氨基酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可以编码保留天然蛋白的生物活性的蛋白质片段。可替代地，作为杂交探针的核苷酸序列的片段通常不编码保留生物活性的片段蛋白质。因此，核苷酸序列的片段范围可以是从至少约20个核苷酸、约50个核苷酸、约100个核苷酸、至高至编码用于本公开方法的蛋白质的全长核苷酸序列。
如本文所用，术语“变体”是指与本文所公开的启动子序列具有实质相似性的序列。变体包含在天然多核苷酸中的一个或多个内部位点处的一个或多个核苷酸的缺失和/或添加，和/或在天然多核苷酸中的一个或多个位点处的一个或多个核苷酸的取代。如本文所使用的，“天然”核苷酸序列包括自然存在的核苷酸序列。就核苷酸序列来说，可使用本领域熟知的分子生物学技术来鉴定自然存在的变体，诸如像用本文概述的聚合酶链反应(PCR)和杂交技术来鉴定。
核苷酸序列变体还包括人工合成的核苷酸序列，比如那些采用定点诱变技术产生的核苷酸序列。通常，文中公开的核苷酸序列的变体将与该核苷酸序列具有至少40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、至95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，如通过本文别处描述的序列比对程序使用默认参数所确定的。还涵盖本文公开的核苷酸序列的生物活性变体。生物活性可以通过使用技术来测量，这些技术是例如RNA印迹分析、从转录融合体获得的报道基因活性测量，等。参见例如Sambrook，等人，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册](第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社]，Cold SpringHarbor[冷泉港]，N.Y.[纽约])，下文称为“Sambrook”，通过引用以其全文并入本文。可替代地，可以测量在可操作地连接到核苷酸片段或变体的启动子的控制下产生的报告基因例如绿色荧光蛋白(GFP)或黄色荧光蛋白(YFP)等的水平。参见例如Matz等人(1999)NatureBiotechnology[自然生物技术]17：969-973；美国专利号6,072,050，通过引用以其全文并入本文；Nagai，等人，(2002)Nature Biotechnology[自然生物技术]20(1)：87-90。核苷酸序列变体还涵盖衍生自诱变和重组发生程序(如DNA改组)的序列。通过这种程序，可以操纵一个或多个不同的核苷酸序列以产生新的核苷酸序列。以此方式，由相关序列多核苷酸的群体产生重组多核苷酸文库，该相关序列多核苷酸包含具有基本序列同一性并且能够在体外或体内同源重组的序列区域。这种DNA改组的策略在本领域中是已知的。参见，例如，Stemmer，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]91：10747-10751；Stemmer(1994)Nature[自然]370：389 391；Crameri，等人(1997)Nature Biotech.[自然生物技术]15：436-438；Moore，等人(1997)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]272：336-347；Zhang，等人，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]94：4504-4509；Crameri，等人，(1998)Nature[自然]391：288-291和美国专利号5,605,793和5,837,458，所述文献通过引用以其全文并入本文。
用于诱变和核苷酸序列改变的方法是本领域熟知的。参见，例如，Kunkel，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]82：488-492；Kunkel，等人，(1987)Methods in Enzymol.[酶学方法]154：367-382；美国专利号4,873,192；Walker和Gaastra，编辑(1983)Techniques in Molecular Biology[分子生物学技术](麦克米伦出版公司，纽约)及其中引用的参考文献，所述文献通过引用以其全文并入本文。关于不影响目的蛋白的生物活性的适当的氨基酸取代的指导可以发现于Dayhoff等人，(1978)Atlas of ProteinSequence and Structure[蛋白序列和结构图谱](Natl.Biomed.Res.Found.[国家生物医学研究基金会]，Washington，D.C.[华盛顿特区])的模型中，将其通过引用并入本文。保守取代，如将一个氨基酸与具有相似特性的另一个氨基酸交换，会是最佳的。
本公开的核苷酸序列可用于分离来自其他生物(特别是其他植物，更特别是其他单子叶植物或双子叶植物)的相应序列。以这种方式，可以使用如PCR、杂交等方法来鉴定此类序列(基于其与本文所示序列的序列同源性)。本公开涵盖了基于与本文所示的完整序列或者与完整序列的片段的序列同一性而分离的序列。
在PCR方法中，可以设计寡核苷酸引物用于PCR反应，以从由任何目的植物提取的cDNA或基因组DNA扩增相应的DNA序列。用于设计PCR引物与PCR克隆的方法是本领域普遍已知的并公开于Sambrook(同上)中。还参见，Innis，等人编辑(1990)PCR Protocols：A Guideto Methods and Applications[PCR方案：方法与应用指南](Academic Press[学术出版社]，纽约)；Innis和Gelfand编辑(1995)PCR Strategies[PCR策略](Academic Press[学术出版社]，纽约)；以及Innis和Gelfand编辑(1999)PCR Methods Manual[PCR方法手册](Academic Press[学术出版社]，纽约)，其通过引用以其全文并入本文。已知的PCR方法包括但不限于：使用成对引物、巢式引物、单特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等的方法。
在杂交技术中，利用已知核苷酸序列的全部或部分作为探针，该探针选择性杂交来自所选生物体的一群克隆基因组DNA片段或cDNA片段(即基因组或cDNA文库)中存在的其他相应核苷酸序列。这些杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段、或其他寡核苷酸，并且可以用可检测基团如32P或任何其他可检测标记进行标记。因此，例如，可通过基于本公开的序列标记合成的寡核苷酸来制得用于杂交的探针。用于制备杂交用探针和用于构建基因组文库的方法是本领域普遍已知的并且公开于Sambrook(同上)中。
一般而言，具有活性并且与本文所公开的序列杂交的序列将与所公开的序列有至少40％至50％的同源性，约60％、70％、80％、85％、90％、95％至98％或更高的同源性。即，序列的序列相似性可以在一定范围内，共享至少约40％至50％、约60％至70％以及约80％、85％、90％、95％至98％的序列相似性。
用于比较的序列的比对方法是本领域熟知的。因此，任意两个序列之间的百分序列同一性的测定能够用一种数学算法进行。这种数学算法的非限制性实例是Myers和Miller(1988)CABIOS4：11-17的算法；Smith，等人，(1981)Adv.Appl.Math.[高等应用数学]2∶482的算法；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48：443-453的算法；Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.[美国科学院院报]85：2444-2448的算法；Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]872：264的算法，根据Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]90：5873-5877进行了修改，通过引用以其全文并入本文。这些数学算法的计算机实现是本领域公知的，并可用于序列比较以确定序列同一性。
如本文使用的，在两个核酸或多肽序列的上下文中的“序列同一性”或“同一性”是指，当在指定比较窗口上对齐最大对应性时，两个序列中的相同残基。当使用关于蛋白质的序列同一性百分比时，认识到不相同的残基位置通常相差保守氨基酸取代，其中氨基酸残基被具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其他氨基酸残基取代，并且因此不改变分子的功能性质。当序列在保守取代方面不同时，可以向上调节序列同一性百分比，以校正该取代的保守性质。相差这些保守取代的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。用于进行此调节的方法是本领域技术人员所熟知的。典型地，这涉及作为部分而不是完全错配对保守取代打分，从而提高百分比序列同一性。因此，例如，当相同的氨基酸得分为1，并且非保守取代的得分为零时，保守取代的得分在零和1之间。计算保守取代的评分，例如，如在程序PC/GENE(易达利遗传学公司(Intelligenetics)，山景城，加利福尼亚州)中实现的。
如本文使用的，“序列同一性百分比”意指通过在比较窗口上比较两个最佳比对序列所确定的值，其中与参比序列(其不包含添加或缺失)相比，该比较窗中的多核苷酸序列部分可以包含添加或缺失(即空位)，以进行这两个序列的最佳比对。通过以下方式计算该百分比：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中的位置的总数目，然后将该结果乘以100以产生序列同一性百分比。
术语多核苷酸序列的“实质同一性”意指，使用比对程序使用标准参数与参比序列比较时，多核苷酸包含具有至少70％序列同一性、优选至少80％、更优选至少90％、和最优选至少95％序列同一性的序列。本领域技术人员将认识到，可以适当地调整这些值以通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框定位等来确定由两个核苷酸序列编码的蛋白质的相应同一性。用于这些目的的氨基酸序列的实质同一性通常意指至少60％、70％、80％、90％和至少95％的序列同一性。
核苷酸序列实质相同的另一个指示是两个分子在严格条件下是否彼此杂交。通常，严格条件被选择为在定义的离子强度和pH下比指定序列的Tm低约5℃。然而，严格条件涵盖比Tm低约1℃至约20℃范围的温度，这取决于如本文其他部分确定的所需的严格程度。如果在严格条件下彼此不杂交的核酸编码的多肽实质上相同的，则这些核酸仍然是实质上相同的。例如，当使用遗传编码允许的最大密码子简并性产生一个拷贝的核酸时，这可能发生。两个核酸序列实质上相同的一个指征是，第一个核酸编码的多肽与第二个核酸编码的多肽具有免疫交叉反应性。
本文所公开的方法、序列和基因可用于植物的基因工程，例如，用于产生转化的或转基因的植物，来表达目的表型。如本文使用的，术语“经转化的植物”和“转基因植物”是指在其基因组内包含异源多核苷酸的植物。通常，异源多核苷酸稳定整合于转基因或转化的植物基因组内，这样使得多核苷酸得以传递至连续世代。异源多核苷酸可以单独地或作为重组DNA构建体的部分整合进基因组中。应当理解的是，如本文所用，术语“转基因的”包括其基因型已经通过异源核酸的存在而改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括最初如此改变的那些转基因以及通过有性杂交或无性繁殖从初始转基因产生的那些。
通过以下来产生转基因“事件”：用包含核酸表达盒的异源DNA构建体转化植物细胞，该核酸表达盒包含目的基因；再生由所转移的基因插入该植物的基因组中所产生的植物群体；并且选择表征为插入特定基因组位置的植物。事件在表型上表征为插入的基因的表达。在遗传水平上，事件是植物遗传组成的一部分。术语“事件”也指转化体和另一个植物之间有性杂交所产生的子代，其中该子代包含异源DNA。
术语“植物”是指整株植物、植物器官(例如叶、茎、根等)、植物组织、植物细胞、植物部分、种子、繁殖体、胚及其子代。植物细胞可以是分化的或未分化的(例如愈伤组织、未分化的愈伤组织、未成熟和成熟的胚、未成熟的合子胚、未成熟的子叶、胚轴、悬浮培养细胞、原生质体、叶、叶细胞、根细胞、韧皮部细胞和花粉)。植物细胞包括但不限于来自以下的细胞：种子、悬浮培养物、外植体、未成熟胚、胚、合子胚、体细胞胚、胚发生愈伤组织、分生组织、体细胞分生组织、分生组织区域、器官发生性愈伤组织、愈伤组织、原生质体、衍生自成熟的穗衍生种子的胚、叶、叶基、来自成熟植物的叶、叶尖、未成熟花序、穗、未成熟穗、长须、子叶、未成熟子叶、胚轴、来自叶的细胞、来自茎的细胞、来自根的细胞、来自芽的细胞、根、芽、配子体、孢子体、花粉、小孢子、多细胞结构(MCS)、可再生植物结构(RPS)和胚样结构。
植物部分包括分化和未分化的组织，包括但不限于以下：根、茎、枝、叶、花粉、种子、肿瘤组织以及各种形式的细胞和培养物(例如，单细胞、原生质体、胚和愈伤组织)。植物组织可以是在植物中或在植物器官、组织或细胞培养物中。
谷物旨在意指由商业种植者出于栽培或繁殖物种之外的目的所生产的成熟种子。再生的植物的子代、变体和突变体也包括在本公开的范围内，其条件是这些子代、变体和突变体包含引入的多核苷酸。
本公开还包括通过本文所公开的任何方法获得的植物。本公开还包括来自通过本文所公开的任何方法获得的植物的种子。
在进一步的方面，所公开的方法中使用的叶外植体可以衍生自任何植物，包括被子植物纲的高等植物。单子叶植物纲亚纲的植物是合适的。合适的物种可来自葱科、六出花科、石蒜科、槟榔科、凤梨科、秋水仙科、薯蓣科、黑药花科、芭蕉科和禾本科。
可衍生所公开的方法中使用的叶外植体的合适物种包括以下属的成员：葱属、六出花属、凤梨属、须芒草属、芦竹属、秋水仙属、狗牙根属、薯蓣属、油棕属、斑茅属、羊茅属、雪花莲属、大麦属、黑麦草属、芒属、芭蕉属、稻属、黍属、狼尾草属、虉草属、梯牧草属、早熟禾属、甘蔗属、黑麦属、高粱属、大米草属、小黑麦属、小麦属、北美穗草属、藜芦属、和玉米属。
在一个另外的方面，在所公开的方法中使用的叶外植体可以衍生自对于农业、园艺、用于产生液体燃料分子和其他化学品的生物质和/或林业重要或有意义的植物。非限制性实例包括例如柳枝稷(柳枝稷草)、双色高粱(高粱、苏丹草)、巨芒(芒草)、甘蔗属物种(能源甘蔗)、玉蜀黍(玉米)、普通小麦(小麦)、水稻(稻)、御谷(珍珠粟)、黍属物种、高粱属物种、芒属物种、甘蔗属物种、斑茅属物种、须芒草(Andropogon gerardii)(大须芒草)、矮象草(Pennisetum purpureum)(象草)、虉草(Phalaris arundinacea)(虉草)、狗牙根(Cynodon dactylon)(百慕大草)、高羊茅(Festuca arundinacea)(牛尾草)、草原索草(Spartina pectinata)(草原索草)、芦竹(Arundo donax)(巨型芦苇)、黑麦(裸麦)、小黑麦属物种(Triticosecale spp.)(小麦属-小麦X黑麦)、竹子、油棕(Elaeis guineensis)(棕榈树)、大蕉(Musa paradisiaca)(香蕉)、菠萝(Ananas comosus)(凤梨)、洋葱(Alliumcepa，onion)、秋水仙(Colchicum autumnale)、加州藜芦(Veratrum califomica)、薯蓣属物种(Dioscorea spp.)、雪花莲(Galanthus wornorii)、六出花属物种(Alstroemeriaspp.)、北美穗草(Uniola paniculata)(燕麦)、翦股颖(bentgrass)(剪股颖属物种(Agrostis spp.))、大麦(薏米)、草地早熟禾(Poa pratensis)(早熟禾)、黑麦草属物种(Lolium spp.)(黑麦草)、和梯牧草(Phleum pratense，timothy)。感兴趣的是为能源产生而种植的植物，即所谓的能源作物，比如基于纤维素的能源作物，如柳枝稷(柳枝稷草)、双色高粱(高粱、苏丹草)、巨芒(芒草)、甘蔗属物种(能源甘蔗)、须芒草(大须芒草)、矮象草(象草)、虉草、狗牙根(百慕大草)、高羊茅(牛尾草)、草原索草、芦竹、黑麦(裸麦)、小黑麦属物种(小麦属-小麦X黑麦)和竹子；和基于淀粉的能源作物，如玉蜀黍(玉米)；和基于蔗糖的能源作物，如甘蔗属物种(甘蔗)；以及生产生物柴油的能源作物，如油棕(棕榈树)。
在进一步的方面，在所公开的方法中使用的叶外植体可以衍生自在表1中列出的单子叶植物科以及代表性属和/或种中发现的任何植物。
表1.
Figure BDA0004153398210000451
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Figure BDA0004153398210000461
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Figure BDA0004153398210000471
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Figure BDA0004153398210000481
Figure BDA0004153398210000491
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在再进一步的方面，来自禾本科的叶外植体(包括来自虎尾草亚科、扁芒草亚科、Micrairoideae、芦竹亚科、黍亚科、三芒草亚科、稻亚科、竹亚科、早熟禾亚科、Puelioideae、Pharoideae、和Anomochlooideae的叶外植体)可用于本公开的方法。禾本科(历史上也被称为颖花科)是一个被认为是草的单子叶开花植物大科。它包括谷类植物、竹类植物和天然草地的草类以及在草坪和牧场栽培的物种。可用于本公开的方法的禾本科内的物种的实例包括但不限于竹子(毛竹(Phyllostachys edulis))、薏米(大麦)、翦股颖(剪股颖属物种)、匍匐翦股颖(Agrostis stolonifera)、早熟禾(草地早熟禾)、牛尾草(羊茅属物种)、狗尾草(青狗尾草)、虉草(Phalaris arundinacea)、羊草(大黍(Megathyrsusmaximus))、人面竹(Phyllostachys aurea)、象草(芦竹(Arundo donax))、沙漠草(Stipagrostis plumosa)、小盼草(Chasmanthium latifolium)、管芒(芒草(Miscanthussinensis))、谷子(粟)、龙爪稷(Eleusine coracana)、细柄黍(Panicum sumatrance)、鸭乸草(Paspalum scrobiculatum)、稗子(湖南稗子(Echinochloa frumentacea))和黍(Panicum miliaceum)、鸭茅(Dactylis glomerata)、柳枝稷草(柳枝稷)、珍珠粟(御谷)、紫色短柄草(二穗短柄草(Brachypodium distachyon))、稻(水稻)；均是粳稻和籼稻品种)、裸麦(黑麦)、黑麦草、高粱(双色高粱)、圣僧草(Stenotaphrum secundatum)、甘蔗、画眉草(埃塞俄比亚画眉草)、福尼奥小米(Digitaria exilis)、梯牧草、小黑麦(小黑麦属物种)、普通小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(Triticum durum)、二粒小麦(Triticum dicoccum)、一粒小麦(Triticum monococcum)、斯卑尔脱小麦(Triticum spelta)、山羊草(山羊草属物种(Aegilops spp))、冰草(Agropyron cristatum)、燕麦、玉米(玉蜀黍)、墨西哥类蜀黍(Zea mays spp.mexicana或spp.parviglumis)和多年生大刍草(Zea diploperennis)。
在特定方面，可用于本公开的方法的叶外植体包括但不限于以下的叶外植体：竹子(毛竹(Phyllostachys edulis))、薏米(大麦)、翦股颖(剪股颖属物种)、匍匐翦股颖、早熟禾(草地早熟禾)、牛尾草(羊茅属物种)、狗尾草(青狗尾草)、虉草、羊草(大黍(Megathyrsus maximus))、人面竹(Phyllostachys aurea)、象草(芦竹(Arundo donax))、沙漠草(Stipagrostis plumosa)、小盼草(Chasmanthium latifolium)、管芒(芒草(Miscanthus sinensis))、谷子(粟)、龙爪稷(Eleusine coracana)、细柄黍(Panicumsumatrance)、鸭乸草(Paspalum scrobiculatum)、稗子(湖南稗子(Echinochloafrumentacea))和黍(Panicum miliaceum)、鸭茅(Dactylis glomerata)、柳枝稷草(柳枝稷)、珍珠粟(御谷)、紫色短柄草(二穗短柄草)、稻(水稻)；均是粳稻和籼稻品种)、裸麦(黑麦)、黑麦草(Lolium perenne)、高粱(双色高粱)、圣僧草(Stenotaphrum secundatum)、甘蔗(Saccharum officinarum)、画眉草(埃塞俄比亚画眉草)、福尼奥小米(Digitariaexilis)、梯牧草)、小黑麦(小黑麦属物种)、普通小麦、硬粒小麦、二粒小麦、一粒小麦、斯卑尔脱小麦、山羊草(山羊草属物种)、冰草、燕麦、玉米(玉蜀黍)、墨西哥类蜀黍mexicana或spp.parviglumis)和多年生大刍草。
目的异源编码序列、异源多核苷酸和多核苷酸可用于本公开的方法中以用于改变植物的表型。表型的各种变化是所关注的，包括修饰基因在植物中的表达，改变植物对病原体或昆虫的防御机制，提高植物对除草剂的耐受性，改变植物发育以响应环境胁迫，调控植物对盐、温度(热和寒冷)、干旱等的应答。这些结果可通过表达包含适当基因产物的目的异源核苷酸序列来获得。在特定方面中，目的异源核苷酸序列是在植物或植物部分中表达水平提升的植物内源序列。可以通过提供改变的一个或多个内源基因产物(特别是激素、受体、信号分子、酶、转运蛋白或辅因子)的表达或通过影响植物中的营养摄取来获得结果。这些改变导致转化的植物的表型的变化。
用于本公开的方法的目的异源多核苷酸或核苷酸序列的一般类别包括，例如涉及信息的那些基因(比如锌指)，涉及通讯的那些基因(比如激酶)，以及涉及管家的那些基因(比如热休克蛋白)。转基因(目的异源多核苷酸或核苷酸序列)的更具体的类别例如包括编码农艺学、昆虫抗性、疾病抗性、除草剂抗性、环境胁迫抗性(对寒冷、盐、干旱等的耐受性改变)和谷物特征的重要性状的基因。仍另外的转基因种类包括从植物和其他真核生物以及原核生物诱导外源性产物(如酶、辅因子及激素)的表达的基因。应认识到，任何目的基因或多核苷酸都可以使用本文所公开的方法可操作地连接到启动子并在植物中表达。
许多农艺性状可以影响“产率”，这些农艺性状包括但不限于植物高度、豆荚数目、植物上的豆荚位置、节间数目、豆荚粉碎的发生率、颗粒尺寸、生节和固氮作用的效率、养分同化的效率、对生物和非生物应力的抗性、碳同化、植物结构、对倒伏的抗性、种子萌芽百分比、幼苗活力以及幼体性状。可以影响产率的其他性状包括：萌发效率(包括在胁迫条件下的萌发)、生长速率(包括在胁迫条件下的生长速率)、穗数目、每个穗的种子数目、种子大小、种子的组成(淀粉、油、蛋白质)以及种子填充的特征。还感兴趣的是转基因植物的产生，该转基因植物表现出可能或可能不赋予植物总产量增加的理想表型特性。这样的特性包括增强的植物形态学、植物生理学或从转基因植物收获的成熟种子的改良成分。
本公开的转基因植物的“增加的产率”可用许多方法证明并测量，包括容重、每株植物的种子数目、种子重量、每单位面积的种子数目(即每英亩的种子、或种子重量)、蒲式耳/英亩、吨/英亩、公斤/公顷。例如，玉蜀黍产量可测量为通常基于水分调整(例如15.5％的水分)来报告的每单位生产面积的去壳玉米粒的产量，例如以蒲式耳/英亩或公吨/公顷为单位。增加的产量可以是由于提高了关键生化化合物(如氮、磷和碳水化合物)的利用，或者是由于提高了对环境胁迫(如寒冷、炎热、干旱、盐、以及害虫或病原体攻击)的耐受性所致。作为植物生长调节剂改变表达或者细胞周期或光合作用途径改变的结果，性状增强重组DNA还可用于提供具有改善的生长和发育以及最终增加的产量的转基因植物。
如本文用于描述本公开的各方面的“增强的性状”包括改善或增强的水分利用效率或耐旱性、渗透胁迫耐受性、高盐度胁迫耐受性、热胁迫耐受性、增强的耐寒性(包括萌发耐寒性)、增加的产量、改良的种子质量、提高的氮利用效率、植物生长发育较早、植物生长发育迟缓、增强的种子蛋白质以及增强的种子油产生。
多个目的基因(目的异源多核苷酸或核苷酸序列)可以用于本公开的方法中并在植物中表达，例如昆虫抗性性状、除草剂抗性、真菌抗性、病毒抗性、胁迫耐受性、疾病抗性、雄性不育、茎秆强度等)或输出性状(例如，增加的产量、改性淀粉、改善的油特性、平衡的氨基酸、高赖氨酸或甲硫氨酸、增加的消化性、改善的纤维品质、抗旱性、营养增强等)。
此类基因(目的异源多核苷酸或核苷酸序列)包括例如苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)毒性蛋白基因，美国专利号5,366,892；5,747,450；5,736,514；5,723,756；5,593,881和Geiser，等人，(1986)Genn[基因]48：109，其公开内容通过引用以其全文并入本文。编码疾病抗性性状的基因(目的异源多核苷酸或核苷酸序列)也可用于本公开的方法，基因包括例如解毒基因，比如解毒伏马菌素的基因(美国专利号5,792,931)；无毒力(avr)和疾病抗性(R)基因(Jones，等人，(1994)Science[科学]266：789；Martin，等人，(1993)Science[科学]262：1432；和Mindrinos，等人，(1994)Cell[细胞]78：1089)，通过引用以其全文并入本文。
可以用于本公开的方法的除草剂抗性性状(目的异源多核苷酸或核苷酸序列)包括编码对具有抑制乙酰乳酸合酶(ALS)作用的除草剂(特别是磺酰脲类除草剂(例如含有导致这种抗性的突变(特别是S4和/或Hra突变)的乙酰乳酸合酶(ALS)基因))具有抗性的基因、编码对具有抑制谷氨酰胺合酶作用的除草剂(比如草丁瞵或basta)具有抗性的基因(例如bar基因)、编码对草甘膦具有抗性的基因(例如，EPSPS基因和GAT基因；例如，参见美国专利申请公开号2004/0082770和WO 03/092360，所述文献通过引用以其全文并入本文)或其他本领域已知的此类基因。bar基因编码对除草剂basast的抗性，nptII基因编码对抗生素卡那霉素和遗传霉素的抗性，并且ALS基因突变体编码对除草剂氯磺隆的抗性，任何和所有这些都可以可操作地连接到本公开的启动子并用于本公开的方法。
草甘膦抗性由突变型5-烯醇丙酮-3-磷酸酯合酶(EPSPS)和aroA基因(其可以可操作地连接到本公开的启动子并用于本公开的方法)赋予。参见，例如Shah，等人的美国专利号4,940,835，其公开了EPSPS形式的能赋予草甘磷抗性的核苷酸序列。授予Barry，等人，的美国专利号5,627,061也描述了编码EPSPS酶的基因，该基因可以可操作地连接到本公开的启动子并用于本公开的方法。还参见，美国专利号6,248,876 B1；6,040,497；5,804,425；5,633,435；5,145,783；4,971,908；5,312,910；5,188,642；4,940,835；5,866,775；6,225,114B1；6,130,366；5,310,667：4,535,060；4,769,061；5,633,448；5,510,471；Re.36,449；RE37,287E和5,491,288以及国际公开WO 97/04103；WO 97/04114；WO 00/66746；WO 01/66704；WO 00/66747和WO 00/66748，其通过引用以其全文并入本文。还对表达编码草甘磷氧化还原酶的基因的植物赋予草甘磷抗性，这在美国专利号5,776,760和5,463,175(其通过引用以其全文并入本文)中进行了更全面地描述。也可通过过量表达编码草甘磷N-乙酰转移酶的基因，来赋予植物草甘磷抗性。参见，例如美国专利申请序列号11/405,845和10/427,692，所述文献通过引用以其全文并入本文。
不育基因(目的异源多核苷酸或核苷酸序列)可用于本公开的方法中以提供物理去雄的替代方案。以这种方式使用的基因的实例包括美国专利号5,583,210(通过引用以其全文并入本文)中所描述的雄性组织优选基因和具有雄性不育表型的基因(如QM)。可以可操作地连接到启动子并用于本公开的方法的其他基因包括激酶和编码对雄或雌配子体发育有毒的化合物的那些。
还可以使用可以增加例如用于乙醇生产的淀粉或提供蛋白质表达的本公开的方法产生商业性状。转化植物的另一个重要的商业用途是生产聚合物和生物塑料，例如在美国专利号5,602,321(通过引用以其全文并入本文)中所述。基因(比如β酮硫解酶、PHB酶(聚羟基丁酸酯合酶)、及乙酰乙酰辅酶A还原酶可以可操作地连接到启动子并用于本公开的方法(参见Schubert，等人，(1988)J.Bacteriol.[细菌学杂志]170：5837-5847，其通过引用以其全文并入本文))促进聚羟基链烷酸酯(PHA)的表达。
许多性状基因(目的异源多核苷酸或核苷酸序列)是本领域已知的并且可以用于本文所公开的方法中。例如而非限制，赋予对昆虫或疾病的抗性的性状基因(异源多核苷酸)、赋予对除草剂的抗性的性状基因(异源多核苷酸)、赋予或促成改变的谷物特征的性状基因(异源多核苷酸)(比如改变的脂肪酸、改变的磷含量、改变的碳水化合物或碳水化合物组成、改变的抗氧化剂含量或组成、或改变的必需种子氨基酸含量或组成)是可以可操作地连接到启动子以在通过本文公开的方法转化的植物中表达的性状基因(异源多核苷酸)类型的实例。本领域已知的其他基因可包含在可用于本文公开的方法的表达盒中。非限制性实例包括产生用于位点特异性DNA整合的位点的基因、影响非生物胁迫抗性(包括但不限于开花、穗和种子发育、氮利用效率的提高、改变的氮响应性、抗旱性或耐旱性、抗寒性或耐寒性、以及抗盐性或耐盐性)和在胁迫下增加产量的基因、或影响植物生长和农学性状如产量、开花、植物生长和/或植物结构的其他基因和转录因子。
本公开的方法可用于转化具有为靶向基因的反义序列的异源核苷酸序列的植物。如本文所用，“反义方向”包括以反义链转录的方向可操作地连接到启动子的多核苷酸序列。反义链与内源转录产物充分互补，这样使得内源转录产物的翻译经常被抑制。“可操作地连接”是指两个或更多个核酸片段在单个核酸片段上的缔合，这样使得一个核酸片段的功能受到另一个的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达时，它与编码序列可操作地连接(即编码序列在启动子的转录控制下)。编码序列可以在正义或反义方向上可操作地连接到调控序列上。
术语“反义DNA核苷酸序列”是指与该核苷酸序列的5′至3′正常方向相反的方向的序列。当反义DNA序列被递送到植物细胞中时，其阻止了靶向的基因的DNA核苷酸序列的正常表达。反义核苷酸序列编码RNA转录物，该RNA转录物与通过靶向的基因的DNA核苷酸序列的转录产生的内源信使RNA(mRNA)互补并能够杂交。在这种情况下，抑制了由靶向的基因编码的天然蛋白的产生，以实现所需的表型应答。可以对该反义序列作出修饰，只要该序列与相应的mRNA杂交并干扰相应的mRNA的表达。在该方式中，可以使用与相应的反义序列具有70％、80％、85％序列同一性的反义构建体。此外，反义核苷酸的部分可以用来破坏该靶基因的表达。通常，可以使用至少50个核苷酸、100个核苷酸、200个核苷酸、或更多个核苷酸的序列。因此，本文公开的启动子序列可以可操作地连接到反义DNA序列，以降低或抑制植物中天然蛋白的表达。
“RNAi”是指用于降低基因表达的一系列相关技术(参见例如美国专利号6,506,559，通过引用以其全文并入本文)。由其他名称所指的较老技术现在据认为基于相同的机制，不过在文献中被赋予不同的名称。这些名称包括“反义抑制”，即产生能够抑制目标蛋白质的表达的反义RNA转录物，以及“共抑制”或“正义抑制”，指产生能够抑制相同的或者实质上相似的外来基因或者内源基因的表达的正义RNA转录物(美国专利号5，231，020，将其通过引用以其全文并入本文)。此类技术依赖于使用能导致积累这样的双链RNA的构建体，该双链RNA中的一条链与待沉默的靶基因互补。本公开的方法可用来表达将会产生RNA干扰的构建体(包括微RNA和小干扰RNA)。
如本文所用，术语“启动子”或“转录起始区”意为DNA调节区，其通常包含TATA盒或能够指导RNA聚合酶II在特定编码序列的适当的转录起始位点起始RNA合成的DNA序列。启动子可以另外地包含通常位于TATA盒上游或5′的其他识别序列或能够指导RNA聚合酶II起始RNA合成的DNA序列，称为上游启动子元件，其影响转录起始速率。认识到虽然已经鉴定了本文公开的启动子区域的核苷酸序列，在此处鉴定的特定启动子区域上游的5’非翻译区中分离和鉴定其他启动子在本领域的水平内。另外，可以提供嵌合启动子。这样的嵌合体包括与异源转录调节区的片段和/或变体融合的启动子序列的部分。因此，本文公开的启动子区域可包含上游启动子，例如负责编码序列的组织表达和时间表达的启动子，增强子，等。
如本文所用，术语“调控元件”也指DNA序列，该DNA序列通常但不总是在结构基因的编码序列上游(5’)，该DNA序列包括通过以下方式控制编码区表达的序列：提供对从特定位点开始转录所需的RNA聚合酶和/或其他因子的识别。提供对RNA聚合酶或其他转录因子的识别以确保在特定位点起始的调节元件的实例是启动子元件。启动子元件包括负责转录起始的核心启动子元件，以及修饰基因表达的其他调节元件。应理解，位于编码区序列的内含子内或编码区序列3′的核苷酸序列也可有助于调节目的编码区的表达。合适的内含子的实例包括但不限于玉蜀黍IVS6内含子或玉蜀黍肌动蛋白内含子。调节元件还可包括那些位于转录起始位点的下游(3′)、或转录的区域内、或两者处的元件。在本公开的上下文中，转录后调节元件可包括在转录起始之后有活性的元件，例如翻译和转录增强子、翻译和转录阻遏子以及mRNA稳定性决定子。
在本公开全文中使用的“异源核苷酸序列”、“目的异源多核苷酸”或“异源多核苷酸”是与启动子序列不是天然地一起存在的或是可操作地连接到启动子序列的序列。虽然这种核苷酸序列对启动子序列来说是异源的，但相对植物宿主，可以是同源的或天然的、或者异源的、或者外来的。同样，启动子序列对于植物宿主和/或目的多核苷酸可以是同源的或天然的或异源的或外来的。
应认识到，增强子可能提高转录水平。增强子是发挥作用以增加启动子区的表达的核苷酸序列。增强子是本领域已知的，包括SV40增强子区、35S增强子元件等。还知道一些增强子还可以改变正常的启动子表达模式，例如通过引起启动子组成型表达，当不具有增强子时同一启动子仅在一个特定组织或一些特定组织中表达。
启动子序列的修饰可以提供异源核苷酸序列的一系列表达。因此，可将这些调节元件序列修饰为弱启动子或强启动子。通常，“弱启动子”意指以低水平驱动编码序列的表达的启动子。“低水平”表达旨在意指以约1/10,000个转录物至约1/100,000个转录物至约1/500,000个转录物的水平表达。相反地，强启动子以高水平或以约1/10个转录物至约1/100个转录物至约1/1,000个转录物的水平驱动编码序列的表达。
本文公开的转化方法可用于任何植物的遗传操作，从而导致转化的植物的表型改变。表型改变可以通过T-DNA转移、粒子轰击、电穿孔、PEG转染或RNP(核糖核蛋白)递送来实现。
术语“可操作地连接的”，意指异源核苷酸序列的转录或翻译受启动子序列的影响。以此方式，可将启动子的核苷酸序列与目的异源核苷酸序列一同在表达盒中提供，以便在目的植物中，更特别地，在植物的生殖组织中表达。
在本公开的一个方面，表达盒包含转录起始区，该转录起始区包含可操作地连接到形态发生基因和/或异源核苷酸序列的启动子序列或其变体或其片段。这种表达盒可具有多个限制位点，用于使插入该核苷酸序列的过程受调节区的转录调节。表达盒可另外含有选择性标记基因以及3’终止区。
表达盒在转录的5′-3′方向上可包含转录起始区(即启动子或其变体或片段)、翻译起始区、目的异源核苷酸序列、翻译终止区，并且任选地包含在宿主生物中有功能的转录终止区。各个方面的调节区(即启动子、转录调节区和翻译终止区)和/或多核苷酸对于宿主细胞或彼此之间可以是天然的/类似的。可替代地，各个方面的调节区和/或多核苷酸对于宿主细胞或彼此之间可以是异源的。如本文所用，关于序列的“异源”是指该序列源于外来物种，或者，如果源于相同物种的话，则是通过蓄意人为干预从其在组合物和/或基因组基因座中的天然形式进行实质性修饰得到的序列。例如，可操作地连接到异源多核苷酸的启动子来自与从其衍生该多核苷酸的物种不同的物种，或者，如果来自相同/类似的物种，那么一方或双方基本上由它们的原来形式和/或基因组基因座修饰得到，或者该启动子不是被可操作地连接的多核苷酸的天然启动子。
终止区对于转录起始区可以是天然的，对于有效地连接的目的DNA序列可以是天然的，对于植物宿主可以是天然的，或者可能衍生自另一种来源(即，对于启动子、被表达的DNA序列、植物宿主或其任何组合来说为外源的或异源的)。方便的终止区可获自根癌农杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒，如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。还参见Guerineau，等人，(1991)Mol.Gen.Genet.[分子遗传学和普通遗传学]262：141-144；Proudfoot，(1991)Cell[细胞]64：671-674；Sanfacon，等人，(1991)Genes Dev.[基因与发育]5：141-149；Mogen，等人，(1990)Plant Cell[植物细胞]2：1261-1272；Munroe，等人，(1990)Gene[基因]91：151-158；Ballas，等人，(1989)Nucleic Acids Res.[核酸研究]17：7891-7903；以及Joshi，等人，(1987)Nucleic Acid Res.[核酸研究]15：9627-9639，通过引用以其全文并入本文。
可用于本公开的方法的表达盒还可含有针对基因、异源核苷酸序列、目的异源多核苷酸或要共转化入生物体的异源多核苷酸的至少一个另外的核苷酸序列。可替代地，该一个或多个另外的核苷酸序列可以在另一表达盒中提供。
在适当的情况下，可以对核苷酸序列进行优化以增加转化植物中的表达。也就是说，可使用植物偏好性密码子来合成这些核苷酸序列，从而改进表达。有关宿主偏好性使用的讨论，参见，例如Campbell和Gowri，(1990)Plant Physiol.[植物生理学]92：1-11，其通过引用以其全文并入本文，用于讨论宿主优选的密码子使用。本领域中可获得用于合成植物偏好性基因的方法。参见例如，美国专利号5,380,831，5,436,391以及Murray，等人，(1989)Nucleic Acids Res.[核酸研究]17：477-498，所述文献通过引用以其全文并入本文。
已知有另外的序列修饰能增强细胞宿主中的基因表达。这些包括消除以下序列：编码假聚腺苷酸化信号、外显子-内含子剪接位点信号、转座子样重复的序列，及可能不利于基因表达的其他经充分表征的序列。可以将异源核苷酸序列的G-C含量调整至通过参照宿主细胞中表达的已知基因而计算出的给定细胞宿主的平均水平。如果可能，修饰序列以避免出现预测的发夹二级mRNA结构。
表达盒可以另外包含5′前导序列。此类前导序列可以起到增强翻译的作用。翻译前导序列在本领域是已知的，并且包括但不限于：小核糖核酸病毒前导序列，例如EMCV前导序列(脑心肌炎5′非编码区)(Elroy-Stein，等人，(1989)Proc.Nat.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]，86：6126-6130)；马铃薯Y病毒组前导序列，例如TEV前导序列(烟草蚀纹病毒)(Allison，等人，(1986)Virology[病毒学]154：9-20)：MDMV前导序列(玉蜀黍矮花叶病毒)；人类免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak，等人，(1991)Nature[自然]353：90-94)；来自首蓿花叶病毒的外壳蛋白mRNA的非翻译前导序列(AMV RNA 4)(Jobling，等人，(1987)Nature[自然]325：622-625)；烟草花叶病毒前导序列(TMV)(Gallie，等人，(1989)Molecular Biology of RNA[RNA的分子生物学]，第237-256页)和玉蜀黍褪绿斑驳病毒(chlorotic mottle viruS)前导序列(MCMV)(Lommel，等人，(1991)Virology[病毒学]81：382-385)，通过引用以其全文并入本文。还参见，Della-Cioppa，等人，(1987)PlantPhysiology[植物生理学]84：965-968，将该文献通过引用以其全文并入本文。也可采用已知用来增强mRNA稳定性的方法，例如内含子，比如玉蜀黍泛素内含子(Christensen和Quail，(1996)Transgenic Res.[转基因研究]5：213-218；Christensen，等人，(1992)PlantMolecular Biology[植物分子生物学]18：675-689)或者玉蜀黍AdhI内含子(Kyozuka，等人，(1991)Mol.Gen.Genet.[分子遗传学和普通遗传学]228：40-48；Kyozuka，等人，(1990)Maydica[美迪卡杂志]35：353-357)等，所述文献通过引用以其全文并入本文。
可用于本公开的方法的DNA表达盒或构建体还可根据需要包含其他增强子(翻译或转录增强子)。这些增强子区域是本领域技术人员众所周知的，并且可以包括ATG起始密码子和相邻序列。起始密码子必须与编码序列的阅读框同相，以确保翻译整个序列。翻译控制信号和起始密码子可以来自天然和合成的多种来源。可以从转录起始区的来源或从结构基因提供翻译起始区。该序列也可以衍生自被选择以表达该基因的调控元件，并且可以被特异性修饰以增加mRNA的翻译。应认识到，为提高转录水平，可将增强子与多个方面的启动子区域结合使用。增强子是本领域已知的，包括SV40增强子区、35S增强子元件等。
在制备表达盒时，可以操作各种DNA片段，以提供处于适当取向以及合适时，处于适当阅读框中的DNA序列。为此，可采用衔接子(adapter)或接头以连接DNA片段，或可以涉及其他操作以提供方便的限制性位点、去除多余的DNA、去除限制性位点等。出于这个目的，可以涉及体外诱变、引物修复、限制性酶切(restriction)、退火、再取代(例如转换和颠换)。
报道基因或选择性标记基因也可以包括在可用于本公开的方法的表达盒中。本领域已知的合适的报告物的实例可以在以下中找到：例如，Jefferson，等人，(1991)PlantMolecular Biology Manual[植物分子生物学年刊]，编辑Gelvin，等人，(Kluwer AcademicPublishers[鲁维尔学术出版社])，第1-33页；DeWet，等人，(1987)Mol.Cell.Biol.[分子细胞生物学]7：725-737；Goff，等人，(1990)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]9：2517-2522；Kain，等人，(1995)Bio Techniques[生物技术]19：650-655和Chiu，等人，(1996)Current Biology[当前生物学]6：325-330，通过引用以其全文并入本文。
用于选择转化细胞或者组织的可选择标记基因可以包括赋予抗生素抗性或除草剂抗性的基因。合适的选择性标记基因的实例包括但不限于编码对如下的耐受性的基因：氯霉素(Herrera Estrella，等人，(1983)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]2：987-992)；氨甲蝶呤(Herrera Estrella，等人，(1983)Nature[自然]303：209-213；Meijer，等人，(1991)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]16：807-820)；潮霉素(Waldron，等人，(1985)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]5：103-108和Zhijian，等人，(1995)Plant Science[植物科学]108：219-227)；链霉素(Jones，等人，(1987)Mol.Gen.Genet.[分子遗传学和普通遗传学]210：86-91)；壮观霉素(Bretagne-Sagnard，等人，(1996)Transgenic Res.[转基因研究]5：131-137)；博莱霉素(Hille，等人，(1990)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]7：171-176)；磺酰胺类(Guerineau，等人，(1990)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]15：127-36)；溴草腈(Stalker，等人，(1988)Science[科学]242：419-423)；草甘膦(Shaw，等人，(1986)Science[科学]233：478-481以及美国专利申请序列号10/004,357和10/427,692)；草丁膦(DeBlock，等人，(1987)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]6：2513-2518)，通过引用以其全文并入本文。
可以在恢复转基因事件中发挥作用的其他基因将包括但不限于例如以下实例：GUS(β-葡糖醛酸酶；Jefferson，(1987)Plant Mol.Biol.Rep.[植物分子生物学报告]5：387)、GFP(绿色荧光蛋白；Chalfie，等人，(1994)Science[科学]263：802)、萤光素酶(Riggs，等人，(1987)Nucleic Acids Res.[核酸研究]15(19)：8115和Luehrsen，等人，(1992)Methods Enzymol.[酶学方法]216：397-414)以及编码花色素产生的玉米基因(Ludwig，等人，(1990)Science[科学]247：449)，通过引用以其全文并入本文。
如本文所用，“载体”是指用于将核苷酸构建体(例如表达盒或构建体)引入宿主细胞的DNA分子，比如质粒、粘粒或细菌噬菌体。克隆载体典型地含有一个或少量限制性内切核酸酶识别位点，可以以可确定的方式在该位点插入外来DNA序列而不会丧失该载体的基本生物学功能，以及插入适用于鉴定和选择克隆载体转化的细胞的标记基因。标记基因通常包括提供四环素抗性、潮霉素抗性或氨苄青霉素抗性的基因。
本公开的方法涉及将多肽或者多核苷酸引入到植物中。如本文使用，“引入”意指以这样一种方式将多核苷酸或多肽提供于植物中以致于该序列得以进入该植物的细胞内部。本公开的方法不取决于将序列引入植物中的特定方法，只要多核苷酸或多肽进入植物的至少一个细胞的内部即可。将多核苷酸或多肽引入植物的方法是本领域已知的，该方法包括但不限于稳定转化法、瞬时转化法和病毒介导法。
“稳定转化”是其中引入到植物中的核苷酸构建体整合到植物的基因组中并能由其子代继承的转化。“瞬时转化”意指将多核苷酸引入该植物中并且不整合到该植物的基因组中，或者将多肽引入植物中。
转化方案以及将核苷酸序列引入植物中的方案，可根据要靶向转化的植物或者植物细胞的类型(即单子叶植物或者双子叶植物)而变化。将核苷酸序列引入到植物细胞中并随后插入到植物基因组中的合适方法包括显微注射(Crossway，等人，(1986)Biotechniques[生物技术]4：320-334)、电穿孔(Riggs，等人，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]83：5602-5606)、农杆菌属介导的转化(Townsend，等人，美国专利号5,563,055和Zhao，等人，美国专利号5,981,840)、直接基因转移(Paszkowski，等人，(1984)EMBO J[欧洲分子生物学学会杂志]3：2717-2722)以及弹道粒子加速(参见例如，美国专利号4,945,050；5,879,918；5,886,244；5,932,782；Tomes，等人，(1995)在Plant Cell，Tissue，and Organ Culture：Fundamental Methods[植物细胞、组织和器官培养：基本方法]，编辑Gamborg和Phillips(Springer-Verlag，Berlin[柏林施普林格出版社])；McCabe，等人，(1988)Biotechnology[分子技术学]6：923-926)和Lecl转化(WO00/28058)。还参见，Weissinger，等人，(1988)Ann.Rev.Genet.[遗传学年鉴]22：421-477；Sanford，等人，(1987)Particulate Science and Technology[微粒科学与技术]5：27-37(洋葱)；Christou，等人，(1988)Plant Physiol.[植物生理学]87：671-674(大豆)；McCabe，等人，(1988)Bio/Technology[生物/技术]6：923-926(大豆)；Finer和McMullen，(1991)InVitro Cell Dev.Biol.[体外细胞生物学和发育生物学]27P：175-182(大豆)；Singh，等人，(1998)Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]96：319-324(大豆)；Datta，等人，(1990)Biotechnology[生物技术]8：736-740(水稻)；Klein，等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]85：4305-4309(玉米)；Klein，等人，(1988)Biotechnology[生物技术]6：559-563(玉米)；美国专利号5,240,855；5,322,783和5,324,646；Klein，等人，(1988)Plant Physiol.[植物生理学]91：440-444(玉蜀黍)；Fromm，等人，(1990)Biotechnology[生物技术]8：833-839(玉蜀黍)；Hooykaas-Van Slogteren，等人，(1984)Nature[自然](伦敦)311：763-764；美国专利号5,736,369(谷类)；Bytebier，等人，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]84：5345-5349(百合科(Liliaceae))；De Wet，等人，(1985)The Experimental Manipulation of Ovule Tissues[胚珠组织的实验操作]，编辑Chapman，等人(Longman[朗文出版社]，纽约)，第197-209页(花粉)；Kaeppler，等人，(1990)Plant Cell Reports[植物细胞报告]9：415-418和Kaeppler，等人，(1992)Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]84：560-566(晶须介导的转化)；D′Halluin，等人，(1992)Plant Cell[植物细胞]4：1495-1505(电穿孔)；Li，等人，(1993)Plant Cell Reports[植物细胞报告]12：250-255以及Christou和Ford，(1995)Annals ofBotany[植物学年报]75：407-413(稻)；Ishida，等人，(1996)Nature Biotechnology[自然生物技术]14：745-750(经由根癌农杆菌属(Agrobacterium tumefaciens)的玉米)，所有这些通过引用以其全文并入本文。在US 2017/0121722中也发现了用于禾成熟胚快速植物转化的方法和组合物，通过引用以其全文并入本文。在US 2019/0078106中发现了可用于植物转化的载体，通过引用以其全文并入本文。
在特定方面中，可以使用各种瞬时转化方法将DNA表达盒或构建体提供给植物。这类瞬时转化方法包括但不限于病毒载体系统，和以阻止DNA后续释放的方式沉淀多核苷酸。因此，可以从粒子结合的DNA进行转录，但其被释放以整合至基因组的频率大大降低了。此类方法包括使用包被有聚乙烯亚胺(PEI；西格玛公司(Sigma)#P3143)的粒子。
在其他方面中，可以通过使植物与病毒或病毒核酸接触而将多核苷酸引入植物中。通常，此类方法涉及将核苷酸构建体掺入病毒DNA或RNA分子内。涉及病毒DNA或RNA分子、用于将多核苷酸引入植物中并表达其中所编码的蛋白质的方法是本领域已知的。参见例如，美国专利号5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367、5,316,931和Porta，等人，(1996)Molecular Biotechnology[分子生物技术]5：209-221，所述文献通过引用以其全文并入本文。
可依据常规方式将已转化的细胞培育成植株。参见，例如，McCormick，等人，(1986)Plant Cell Reports[植物细胞报道]5：81-84，通过引用以其全文并入本文。然后可以培育这些植株，并用相同的经转化的株系或者不同的株系进行授粉，并鉴定出具有所希望的表型特征的表达的所得子代。可以培育两代或两代以上以确保希望的表型特征的表达稳定保持并且遗传，然后收获种子以确保希望的表型特征已经实现表达。以此方式，本公开提供了基因组中稳定掺入了核苷酸构建体(例如表达盒)的转化种子(也被称为“转基因种子”)。
有各种各样的方法用于从植物组织再生植物。特定的再生方法将取决于起始植物组织和待再生的特定植物种类。来自单一植物原生质体转化体或来自各种转化外植体的植物再生、发育和栽培是本领域众所周知的(Weissbach和Weissbach，(1988)，在Methods forPlant Molecular Biology[植物分子生物学方法]，(编辑)，Academic Press，Inc.[学术出版社]，San Diego，Calif.[加利福尼亚州圣地亚哥]中，通过引用以其全文并入本文)。这种再生和生长过程通常包括如下步骤：选择经转化的细胞，通过胚性发育的通常阶段、通过生根苗阶段培养那些个体化细胞。以同样的方式再生转基因胚和种子。然后将所得的转基因生根芽苗种植在合适的植物生长培养基(如土壤)中。优选地，再生植物自花授粉以提供纯合的转基因植物。或者，将得自再生植物的花粉与农艺学上重要的品系的产生种子的植物进行杂交。相反地，将来自这些重要品系的植物的花粉用于给再生植物授粉。使用本领域技术人员熟知的方法培养含有所希望的多核苷酸的这些方面的转基因植物。
用于在植物基因组的特定位置靶向插入多核苷酸的方法是本领域已知的。利用位点特异性重组系统实现多核苷酸在所需的基因组位置处的插入。参见，例如，US 9,222,098B2、US 7,223,601 B2、US 7,179,599 B2和US 6,911,575 B1，所有这些均通过引用以其全文并入本文。简而言之，侧翼为两个不相同重组位点的目标多核苷酸可包含在T-DNA转移盒中。将T-DNA转移盒引入植物中，该植物已经将靶位点稳定地掺入其基因组中，该靶位点侧翼为与转移盒的位点相对应的两个不相同的重组位点。T-DNA转移的替代选择包括但不限于粒子轰击、电穿孔、PEG转染或RNP(核糖核蛋白)递送。提供适当的重组酶，并将转移盒整合到靶位点。由此，目的多核苷酸被整合在植物基因组中的特定染色体位置处。
在一个方面，所公开的方法可用于以提高的效率和速度将多核苷酸引入叶外植体中，多核苷酸可用于靶向特定位点以在植物基因组中进行修饰。可以用所公开的方法引入的位点特异性修饰包括使用用于引入位点特异性修饰的任何方法产生的修饰，该方法包括但不限于通过使用基因修复寡核苷酸(例如美国公开2013/0019349)，或通过使用双链断裂技术，如TALEN、大范围核酸酶、锌指核酸酶、CRISPR-Cas等。例如，所公开的方法可以用于将CRISPR-Cas系统引入植物细胞或植物中，以用于以下目的：对植物或植物细胞的基因组中的靶序列进行基因组修饰，选择植物，缺失碱基或序列，基因编辑，以及将目的多核苷酸插入植物或植物细胞的基因组中。因此，所公开的方法可以与CRISPR-Cas系统一起使用以提供用于修饰或改变植物、植物细胞或种子的基因组内的靶向位点和目的核苷酸的有效系统。该Cas内切核酸酶基因是植物优化的Cas9内切核酸酶，其中植物优化的Cas9内切核酸酶能够结合植物基因组的基因组靶序列并在其中产生双链断裂。
Cas内切核酸酶在指导核苷酸的指导下识别并任选地将特定靶位点处的双链断裂引入细胞的基因组中。CRISPR-Cas系统提供了用于修饰植物、植物细胞或种子的基因组内的靶位点的有效系统。还提供了采用指导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统的方法和组合物，以提供用于修饰细胞基因组内的靶位点和用于编辑细胞基因组内的核苷酸序列的有效系统。一旦鉴定了基因组靶位点，就可以采用多种方法进一步修饰靶位点，使得它们含有多种目的多核苷酸。所公开的组合物和方法可用于引入用于编辑细胞基因组中的核苷酸序列的CRISPR-Cas系统。待编辑的核苷酸序列(目的核苷酸序列)可以位于由Cas内切核酸酶识别的靶位点之内或之外。
CRISPR基因座(规律间隔成簇短回文重复序列)(叉称SPIDR-间隔区散在同向重复序列)构成最近描述的DNA基因座的家族。CRISPR基因座由部分回文的短而高度保守的DNA重复序列(通常为24至40bp，重复从1至140次，也称为CRISPR重复序列)组成。重复序列(通常具有物种特异性)由恒定长度的可变序列(通常为20至58，依赖于CRISPR基因座(WO2007/025097，2007年3月1日公开))间隔。
Cas基因包括通常与侧翼CRISPR基因座偶合、相关或相近或相邻的基因。术语“Cas基因”和“CRISPR相关的(Cas)基因”在本文中可互换地使用。
在另一方面，Cas内切核酸酶基因可操作地连接到Cas密码子区域上游的SV40核靶向信号和Cas密码子区域下游的二分型VirD2核定位信号(Tinland等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]89：7442-6)。
关于Cas内切核酸酶，术语“功能片段”、“功能上等效的片段”和“功能等效片段”在本文中可互换使用。这些术语意指Cas内切核酸酶序列的一部分或子序列，其中产生双链断裂的能力被保留。
关于Cas内切核酸酶，术语“功能变体”、“功能上等效的变体”和“功能等效变体”在本文中可互换使用。这些术语意指Cas内切核酸酶的变体，其中产生双链断裂的能力被保留。这些片段和变体可以经由例如定点诱变和合成构建等方法来获得。
在一个方面，Cas内切核酸酶基因是可以识别N(12-30)NGG型的任何基因组序列并且原则上是可以靶向的植物密码子优化的酿脓链球菌Cas9基因。
内切核酸酶是切割多核苷酸链内的磷酸二酯键的酶，并且包括在特定位点切割DNA而不损害碱基的限制性内切核酸酶。限制性内切核酸酶包括I型、II型、III型、和IV型内切核酸酶，这些限制性内切核酸酶进一步包括亚型。在I型和III型系统中，甲基化酶和限制性酶活性二者均包含在单复合物中。内切核酸酶还包括大范围核酸酶，也称为归巢内切核酸酶(HE酶)，该酶相似于限制性内切核酸酶，在特定识别位点处结合并且切割，然而对于大范围核酸酶，这些识别位点通常更长，约18bp或更长(于2012年3月22日提交的专利申请PCT/US 12/30061)。基于保守序列基序，大范围核酸酶已被分为四个家族。这些基序参与金属离子的配位和磷酸二酯键的水解。大范围核酸酶的显著之处在于它们的长识别位点，并且还在于耐受其DNA底物中的一些序列多态性。对于大范围核酸酶的命名约定相似于对其他限制性内切核酸酶的约定。大范围核酸酶还分别表征为针对由独立的ORF、内含子、和内含肽编码的酶的前缀F-、I-、或PI-。重组方法的一个步骤涉及在识别位点处或在该识别位点附近的多核苷酸切割。该切割活性可用于产生双链断裂。对于位点特异性重组酶和它们的识别位点的综述，参见Sauer(1994)Curr Op Biotechnol[生物技术新见]5：521-7；以及Sadowski(1993)FASEB[美国实验生物学学会联合会杂志]7：760-7。在一些实例中，重组酶来自整合酶(Integrase)或解离酶(Resolvase)家族。TAL效应物核酸酶是一类新的序列特异性核酸酶，其可以被用于在植物或其他生物的基因组中特异性靶序列处造成双链断裂。(Miller，等人(2011)Nature Biotechnology[自然生物技术]29：143-148)。锌指核酸酶(ZFN)是由锌指DNA结合结构域和双链-断裂-诱导剂结构域组成的工程化双链断裂诱导剂。识别位点特异性由锌指结构域赋予，该锌指结构域典型地包含两个、三个、或四个锌指，例如具有C2H2结构，然而其他锌指结构是已知的并且已经被工程化。锌指结构域适于设计特异性结合所选择的多核苷酸识别序列的多肽。ZFN包括连接至非特异性内切核酸酶结构域(例如来自Ms型内切核酸酶，例如Fokl的核酸酶结构域)的工程化DNA结合锌指结构域。另外的功能性可以融合到锌指结合结构域中，这些另外的功能性包括转录激活物结构域、转录阻遏子结构域、和甲基化酶。在一些实例中，核酸酶结构域的二聚化是切割活性所需的。每个锌指在靶DNA中识别三个连续的碱基对。例如，3指结构域识别9个连续核苷酸的序列，由于该核酸酶的二聚化需要，因此两组锌指三联体用于结合18个核苷酸的识别序列。
本文所用的“Dead-CAS9”(dCAS9)用于提供转录阻遏子结构域。dCAS9已发生突变，因此无法再切割DNA。dCAS9在被gRNA引导至序列时仍然可以结合，也可以与阻遏子元件融合。如本文所述，融合至阻遏子元件的dCAS9缩写为dCAS9-REP，其中阻遏子元件(REP)可以是已在植物中表征的任何已知阻遏子基序。表达的指导RNA(gRNA)与dCAS9-REP蛋白结合，并靶向dCAS9-REP融合蛋白与启动子(T-DNA内的启动子)内特定的预定核苷酸序列的结合。例如，如果使用ZM-UBIPRO：：dCAS9-REP：：PINIITERM盒和U6-POLPRO：：gRNA：：U6 TERM盒将其表达在边界外，且gRNA被设计成指导dCAS9-REP蛋白以结合T-DNA内表达盒SB-UBI PRO：：moPAT：：PINIITERM中的SB-UBI启动子，任何整合了边界外序列的事件会是双丙氨膦敏感性的。仅整合T-DNA的转基因事件将表达moPAT，并且对双丙氨磷具有抗性。使用与阻遏子融合的dCAS9蛋白(与TETR或ESR相反)的优点是能够将这些阻遏子靶向T-DNA内的任何启动子。TETR和ESR仅限于同源操纵子结合序列。可替代地，可以使用与阻遏子结构域融合的合成的锌指核酸酶代替gRNA和dCAS9-REP(Urritia等人，2003，Genome Biol.[基因组生物学14：231)，如上所述。
来自细菌的II型CRISPR/Cas系统采用crRNA和tracrRNA将Cas内切核酸酶指导至其DNA靶。该crRNA(CRISPR RNA)包含与双链DNA靶的一条链互补，并且与tracrRNA(反式激活CRISPR RNA)碱基配对形成RNA双链体的区域，该RNA双链体引导Cas内切核酸酶切割DNA靶。如本文所用，术语“指导核苷酸”涉及两个RNA分子-包含可变靶向结构域的crRNA(CRISPR RNA)和tracrRNA的合成性融合。在一个方面，该指导核苷酸包含12至30个核苷酸序列的可变靶向结构域和可以与Cas内切核酸酶相互作用的RNA片段。
如本文所用，术语“指导多核苷酸”涉及可以与Cas内切核酸酶形成复合物的多核苷酸序列，并且使得Cas内切核酸酶能够识别并任选地切割DNA靶位点。指导多核苷酸可以是单分子或双分子。指导多核苷酸序列可以是RNA序列、DNA序列或其组合(RNA-DNA组合序列)。任选地，指导多核苷酸可以包含至少一种核苷酸、磷酸二酯键或连接修饰，例如但不限于锁核酸(LNA)、5-甲基dC、2，6-二氨基嘌呤、2′-氟代A、2′-氟代U、2′-O-甲基RNA、硫代磷酸酯键、与胆固醇分子的连接、与聚乙二醇分子的连接、与间隔子18(六乙二醇链)分子的连接、或导致环化的5′至3′共价连接。仅包含核糖核酸的指导多核苷酸也被称为“指导核苷酸”。
指导多核苷酸、VT结构域和/或CER结构域的核苷酸序列修饰可以选自但不限于由以下各项组成的组：5′帽、3′聚腺苷酸尾、核糖开关序列、稳定性控制序列、形成dsRNA双链体的序列、将指导多核苷酸靶向亚细胞位置的修饰或序列、提供跟踪的修饰或序列、提供蛋白质结合位点的修饰或序列、锁核酸(LNA)、5-甲基dC核苷酸、2,6-二氨基嘌呤核苷酸、2′-氟代A核苷酸、2′-氟代U核苷酸、2′-O-甲基RNA核苷酸、硫代磷酸酯键、与胆固醇分子的连接、与聚乙二醇分子的连接、与间隔子18分子的连接、5′至3′共价连接、或其任何组合。这些修饰可以产生至少一个另外的有益特征，其中该另外的有益特征选自由以下组成的组：修改的或调节的稳定性、亚细胞靶向、跟踪、荧光标记、用于蛋白质或蛋白质复合物的结合位点、对互补靶序列的修改的结合亲和力、修改的细胞降解抗性和增加的细胞通透性。
在一个方面，该指导核苷酸和Cas内切核酸酶能够形成复合物，该复合物使得Cas内切核酸酶能够在DNA靶位点引入双链断裂。
在本公开的方法的一个方面，可变靶结构域是12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸长度。
在本公开的方法的一个方面，指导核苷酸包含II型CRISPR/Cas系统中的可以与II型Cas内切核酸酶形成复合物的cRNA(或cRNA片段)和tracrRNA(或tracrRNA片段)，其中该指导核苷酸/Cas内切核酸酶复合物可以将Cas内切核酸酶指导至植物基因组靶位点，使得Cas内切核酸酶能够将双链断裂引入基因组靶位点。可以使用本领域已知的任何方法(例如但不限于粒子轰击或局部应用)将指导核苷酸直接引入植物或植物细胞。
在一个方面，可以通过引入包含相应指导DNA序列的重组DNA分子间接引入指导核苷酸，该指导DNA序列可操作地连接到能够在植物细胞中转录指导核苷酸的植物特异性启动子。术语“相应的指导DNA”包括与RNA分子相同但用“T”代替RNA分子的每个“U”的DNA分子。
在一个方面，经由粒子轰击或使用所公开的用于重组DNA构建体的农杆菌属转化的方法和组合物来引入该指导核苷酸，该重组DNA构建体包含可操作地连接到植物U6聚合酶III启动子的相应指导DNA。
在一个方面，指导RNA/Cas9内切核酸酶复合物的RNA是包含双链体crRNA-tracrRNA的双链体化的RNA。使用指导核苷酸对比双链体crRNA-tracrRNA的一个优点是，为了表达融合的指导核苷酸，仅需要制造一个表达盒。
术语“靶位点”、“靶序列”、“靶DNA”、“靶基因座”、“基因组靶位点”、“基因组靶序列”、以及“基因组靶基因座”在本文中可互换地使用，并且意指植物细胞的基因组(包括叶绿体DNA和线粒体DNA)中的多核苷酸序列，在该多核苷酸序列处通过Cas内切核酸酶在植物细胞基因组中诱导双链断裂。靶位点可以是植物基因组中的内源性位点，或者可替代地，靶位点可以与植物异源，从而不是基因组中天然存在的，或者与其在自然界中存在的地方相比，靶位点可以发现于异源基因组位置中。
如本文所用，术语“内源性靶序列”和“天然靶序列”在本文中可互换地使用，从而意指对于植物的基因组是内源的或天然的靶序列，并且是在植物的基因组中靶序列的内源或天然位置处。在一个方面，该靶位点可以相似于由双链断裂诱导剂，比如LIG3-4内切核酸酶(美国专利公开2009/01 331 52A1(2009年5月21日公开))或MS26++大范围核酸酶(2012年6月19日提交的美国专利申请13/526912)特异性识别和/或结合的DNA识别位点或靶位点。
“人工靶位点”或“人工靶序列”在本文中可互换地使用，并且意指已经引入植物基因组中的靶序列。此类人工靶序列可以在序列上与植物的基因组中的内源性或天然靶序列相同，但是位于植物的基因组中的不同位置(即，非内源性的或非天然的位置)处。
“改变的靶位点”、“改变的靶序列”、“修饰的靶位点”和“修饰的靶序列”在本文中可互换地使用，并且是指如本文公开的靶序列：该靶序列当与未改变的靶序列相比时包含至少一种改变。此类“改变”包括，例如：(i)至少一个核苷酸的替代、(ii)至少一个核苷酸的缺失、(iii)至少一个核苷酸的插入、或(iv)(i)-(iii)的任何组合。
在一个方面，所公开的方法可用于向植物中引入用于植物中靶基因的基因抑制的多核苷酸。对于植物基因工程的几个方面来说，降低特定基因的活性(也称为基因沉默或基因抑制)是所希望的。许多基因沉默技术是本领域技术人员众所周知的，包括但不限于反义技术。
在一个方面，所公开的方法可用于将用于将核苷酸序列靶向整合到植物中的多核苷酸引入植物中。例如，所公开的方法可以用于引入T-DNA表达盒以转化包含靶位点的植物，该转移盒包含不相同重组位点侧翼的目的核苷酸序列。在一个方面，靶位点包含至少一组与T-DNA表达盒上的那些相对应的不相同的重组位点。重组位点侧翼的核苷酸序列的交换通过重组酶进行。因此，所公开的方法可以用于引入T-DNA表达盒以靶向整合核苷酸序列，其中该T-DNA表达盒的侧翼为由重组酶识别的不相同重组位点，该重组酶识别并实现不相同重组位点处的重组。因此，所公开的方法和组合物可以用于提高含有不相同重组位点的植物的发育效率和发育速度。
因此，所公开的方法可以进一步包括用于将外源核苷酸定向、靶向整合到转化植物中的方法。在一个方面，所公开的方法在基因靶向系统中使用新的重组位点，该基因靶向系统有利于将希望的基因和核苷酸序列定向靶向到先前引入到靶植物基因组中的相应重组位点。
在一个方面，将侧翼有两个不相同重组位点的核苷酸序列引入到衍生自靶生物体基因组的外植体的一个或多个细胞中，从而建立用于插入目的核苷酸序列的靶位点。一旦建立了稳定的植物或培养组织，将侧翼有与侧翼靶位点的那些重组位点相对应的重组位点的第二构建体或目的核苷酸序列，在重组酶蛋白存在下引入稳定转化的植物或组织中。该过程导致靶位点和T-DNA表达盒的不相同重组位点之间的核苷酸序列的交换。
应认识到，以这种方式制备的转化植物可以包含多个靶位点；即多组不相同的重组位点。以这种方式，转化植物中的靶位点的多个操作是可获得的。转化植物中的靶位点是指已经插入到转化植物基因组中的并包含不相同重组位点的DNA序列。
用于所公开的方法中的重组位点的实例是已知的。在大多数天然存在的酿酒酵母菌株中发现的两微米质粒编码位点特异性重组酶，其促进两个反向重复之间的DNA的倒位。这种倒位在质粒拷贝数扩增中起着核心作用。
名为FLP蛋白的蛋白质催化位点特异性重组事件。最小重组位点(FRT)已被定义并且包含围绕不对称8-bp间隔子的两个反向的13个碱基对(bp)的重复序列。FLP蛋白切割该重复序列和间隔子连接处的位点，并经由3′磷酸共价连接至DNA。位点特异性重组酶(如FLP)在特定靶序列处切割和再次连接DNA，这导致两个相同位点之间的精确限定的重组。为了起作用，系统需要重组位点和重组酶。不需要辅助因子。因此，整个系统可以插入到植物细胞中并在其中起作用。已显示酵母FLP\FRT位点特异性重组系统在植物中起作用。迄今为止，该系统已被用于切除不需要的DNA。参见Lyznik等人(1993)Nucleic Acids Res.[核酸研究]21：969-975。相比之下，本公开利用不相同的FRT用于植物基因组中核苷酸序列的交换、靶向、排列、插入和表达的控制。
在一个方面，需要转化的、含有整合到其基因组中的靶位点的目的生物体，如来自植物的外植体。靶位点的特征在于侧翼有不相同的重组位点。另外需要靶向盒，其含有侧翼有与包含在转化生物体的靶位点中的那些位点相对应的不相同重组位点的核苷酸序列。需要识别不相同重组位点并催化位点特异性重组的重组酶。
应认识到，重组酶可以通过本领域已知的任何方式提供。即，通过瞬时表达或通过提供重组酶或重组酶蛋白质的信使RNA(mRNA)，可以在生物体或植物细胞中通过用能够在生物体中表达重组酶的表达盒转化生物体而提供。
“不相同重组位点”意指侧翼重组位点在序列上不相同并且不会重组，或在位点之间的重组将是最小化的。即，一个侧翼重组位点可以是FRT位点，而第二个重组位点可以是突变的FRT位点。本公开的方法中使用的不相同重组位点阻止或大大抑制两个侧翼重组位点之间的重组和其中所含的核苷酸序列的切除。因此，应认识到，可以在本公开中使用任何合适的不相同重组位点，包括FRT和突变FRT位点、FRT和lox位点、lox和突变lox位点、以及本领域已知的其他重组位点。
通过合适的不相同重组位点暗示，在活性重组酶存在下，两个不相同重组位点之间的序列切除(如果有的话)以显著低于核苷酸序列重组介导的交换靶向排列到植物基因组中的效率存在。因此，用于本公开的合适的不相同位点包括那些位点之间的重组效率低的位点；例如，其中效率小于约30％至约50％，优选小于约10％至约30％，更优选小于约5％至约10％。
如上所指出，靶向盒中的重组位点对应于转化植物的靶位点中的重组位点。即，如果转化植物的靶位点含有FRT和突变FRT的侧翼的不相同重组位点，则靶向盒将含有相同的FRT和突变FRT不相同的重组位点。
此外还应认识到，用于所公开的方法中的重组酶将取决于转化植物的靶位点中的和靶向盒中的重组位点。即，如果使用FRT位点，则需要FLP重组酶。以相同的方式，在使用lox位点的情况下，需要Cre重组酶。如果不相同重组位点包含FRT和lox位点两者，则植物细胞中将需要FLP和Cre重组酶两者。
该FLP重组酶是催化位点特异性反应的蛋白质，该蛋白质参与在DNA复制期间扩增酿酒酵母的两微米质粒的拷贝数。FLP蛋白质已被克隆并表达。参见例如，Cox(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]80：4223-4227。用于本公开的FLP重组酶可以是衍生自酵母属的酶。可能优选的是使用植物优选密码子合成重组酶，用于在目的植物中最佳表达。参见例如，1997年11月18日提交的、标题为“Novel Nucleic AcidSequence Encoding FLP Recombinase[编码FLP重组酶的新颖核酸序列]”的美国申请系列号08/972,258，通过引用并入本文。
该噬菌体重组酶Cre催化在两个lox位点之间的位点特异性重组。该Cre重组酶是本领域已知的。参见例如Guo等人(1997)Nature[自然]389：40-46；Abremski等人，(1984)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]259：1509-1514；Chen等人(1996)Somat.Cell Mol.Genet.[体细胞与分子遗传学]22：477-488；以及Shaikh等人(1977)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]272：5695-5702。将其全部通过引用并入本文。这样的Cre序列也可以使用植物优选密码子来合成。
在适当的情况下，可以对待插入植物基因组的核苷酸序列进行优化以增加转化植物中的表达。在本公开中使用哺乳动物、酵母或细菌基因的情况下，可以使用植物优选密码子来合成它们以改善表达。应认识到，为了在单子叶植物中表达，也可以使用单子叶植物优选密码子合成双子叶植物基因。本领域中可获得用于合成植物优选基因的方法。参见例如，美国专利号5,380,831、5,436,391，以及Murray等人(1989)Nucleic Acids Res.[核酸研究]17：477-498，这些文献通过引用并入文中。可以从目的植物中表达的蛋白质中更频繁使用的密码子确定植物优选密码子。应认识到，可以构建单子叶植物或双子叶植物优选序列以及特定植物物种的植物优选序列。参见例如，EPA 0359472；EPA 0385962；WO 91/16432：Perlak等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院报]88：3324-3328；以及Murray等人(1989)Nucleic Acids Res.[核酸研究]17：477-498。美国专利号5,380,831；美国专利号5,436,391；等，这些文献通过引用并入本文中。进一步认识到，该基因序列的所有或任何部分可以是优化的或合成的。即，还可以使用完全优化的或部分优化的序列。
已知另外的序列修饰增强细胞宿主中的基因表达并可用于本公开中。这些包括：消除编码假的聚腺苷酸化信号和外显子-内含子剪接位点信号的序列、转座子样重复序列、及可能不利于基因表达的其他经充分表征的序列。可以将序列的G-C含量调整至通过参照宿主细胞中表达的已知基因而计算出的给定细胞宿主的平均水平。如果可能，修饰序列以避免出现预测的发夹二级RNA结构。
本公开还包括新的FLP重组靶位点(FRT)。FRT已被鉴定为包含由八(8)个碱基间隔子隔开的两个13个碱基对重复序列的最小序列。只要这两个13碱基的重复序列被八个核苷酸分开，间隔区中的核苷酸就可以被核苷酸组合代替。似乎间隔区的实际核苷酸序列不是关键的；然而，对于本公开的实践，间隔区域中核苷酸的某些取代可能比其他取代更好地起作用。在链交换期间，八个碱基对间隔子参与DNA-DNA配对。该区域的不对称性决定了重组事件中位点对齐的方向，这将随后导致倒位或切除。如上所示，大部分间隔子可以被突变而不丧失功能。参见例如，Schlake和Bode(1994)Biochemistry[生物化学]33：12746-12751，通过引用并入本文。
新的FRT突变位点可用于实践所公开的方法。这样的突变位点可以通过基于PCR的诱变来构建。尽管突变FRT位点是已知的(参见WO 1999/025821的SEQ ID No 2、3、4和5)，但认识到其他突变FRT位点可用于实践本公开。本公开不限于使用特定的FRT或重组位点，而是可使用不相同的重组位点或FRT位点以将核苷酸序列在植物基因组中靶向插入和表达。因此，可以基于本公开构建和使用其他突变FRT位点。
如上所讨论的，在重组酶存在下，含有具有不相同重组位点的靶位点的基因组DNA与含有具有相应不相同重组位点的T-DNA表达盒的载体一起导致重组。将位于侧翼重组位点之间的T-DNA表达盒的核苷酸序列与位于侧翼重组位点之间的靶位点的核苷酸序列进行交换。以此方式，目的核苷酸序列可以精确地并入宿主的基因组中。
认识到可以实行本公开的许多变化。例如，可以构建具有多个不相同重组位点的靶位点。因此，多个基因或核苷酸序列可以在植物基因组中的精确位置处堆叠或排序。同样地，一旦已经在基因组内建立了靶位点，可以通过将此类位点并入T-DNA表达盒的核苷酸序列内并将位点转移至靶序列来引入另外的重组位点。因此，一旦已经建立了靶位点，就可能随后通过重组来添加位点或改变位点。
另一种变化包括提供与生物体中的靶位点可操作地连接的启动子或转录起始区。优选地，该启动子将位于第一个重组位点的5′。通过用包含编码区的T-DNA表达盒转化生物体，在T-DNA表达盒整合到靶位点时将发生编码区的表达。这方面提供了通过提供可选择标记序列作为编码序列来选择转化细胞(特别是植物细胞)的方法。
本系统的其他优点包括通过利用如上所讨论的T-DNA表达盒并且用简单的整合模式选择生物体来降低转基因或转移的DNA在生物体中整合的复杂性的能力。以相同的方式，可以通过比较几个转化事件来鉴定基因组内的优选位点。基因组内的优选位点包括不破坏必需序列的表达并提供转基因序列的充分表达的位点。
所公开的方法还提供了在基因组内的一个位置组合多个表达盒的方法。可以在基因组内的靶位点处添加或删除重组位点。
本领域已知的用于将该系统的三种组分放在一起的任何方式都可以用于本公开中。例如，植物可以稳定地转化以在其基因组中具有靶位点。重组酶可以瞬时表达或提供。可替代地，能够表达重组酶的核苷酸序列可以稳定地整合至植物的基因组中。在相应的靶位点和重组酶存在下，将侧翼有相应的不相同重组位点的T-DNA转移盒插入到转化植物的基因组中。
可替代地，可以通过将转化植物进行有性杂交而将该系统的各组分放在一起。在这个方面，含有整合到其基因组中的靶位点的转化植物(亲本一)可以与已经用含有侧翼不相同重组位点(其对应于植物一中的重组位点)的T-DNA表达盒遗传转化的第二植物(亲本二)进行有性杂交。植物一或植物二在其基因组内含有表达重组酶的核苷酸序列。重组酶可以在组成型或诱导型启动子的控制之下。以此方式，可以控制重组酶的表达和重组位点处的后续活性。
所公开的方法可用于将转移的核苷酸序列靶向整合到特定的染色体位点。该核苷酸序列可以编码任何目的核苷酸序列。特定的目的基因包括为宿主细胞和/或生物体提供容易分析的功能特征的那些，如标记基因、以及改变受体细胞表型的其他基因等。因此，影响植物生长、高度、对疾病和昆虫的易感性、营养价值等的基因可用于本公开中。核苷酸序列还可以编码“反义”序列以关闭或修饰基因表达。
应认识到，核苷酸序列可以用于功能性表达单元或T-DNA表达盒中。功能性表达单元或T-DNA表达盒意指具有功能性启动子的目的核苷酸序列，并且在大多数情况下是终止区。在本公开的实践中有各种方式来获得功能表达单元。在本公开的一个方面中，将目的核酸作为功能表达单元转移或插入到基因组中。
可替代地，可将核苷酸序列插入到基因组内启动子区的3′的位点中。在后一种情况下，将编码序列插入到启动子区3′使得在整合时实现功能表达单元。T-DNA表达盒将包含可操作地连接到编码目的肽的核酸的转录起始区或启动子。这类表达盒被提供有用于将一个或多个目的基因的插入的多个限制性位点，以使该基因位于调节区的转录调节之下。
以下实例是通过说明的方式但不是通过限制的方式来提供的。
实例
本公开的多个方面在以下实例中被进一步定义，其中除非另有说明，否则份数和百分数以重量计，并且度数以摄氏度计。尽管这些实例说明了本公开的多个方面，但仅是通过说明的方式给出的。从以上的讨论和这些实例中，本领域的技术人员能够确定本公开的多个方面的本质特性，并且在不脱离本公开的精神和范围的情况下，可进行它们的各种变化和修改以使其适应各种用途和条件。因此，从上述说明书来看，除了本文所示出和描述的那些之外，各种修改对于本领域技术人员来说将是清楚的。此类修改也当视为落入所附权利要求的范围内。
实例1：序列
表2中呈现了可用于本公开的方法的序列。
表2.
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实例2：培养基组成
实例中引用了各种培养基以用于转化和细胞培养。这些培养基的组成在下表3-14中提供。
表3.
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aMS维生素原液：0.1g/l烟酸、0.1g/l盐酸吡哆醇、0.02g/l盐酸硫胺素、0.4g/l甘氨酸。
表4.
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表5.
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表6.
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表7.
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表8.
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表9.
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表10.
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表11.
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表12.
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表13.
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表14.
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实例3：粒子轰击
粒子轰击的标准方案(Finer和McMullen，1991，In Vitro Cell Dev.Biol.-Plant[体外细胞发育生物学-植物]27：175-182)可以与本公开的方法一起使用。
A.Cas9介导的供体模板的粒子介导递送经由同源依赖性修复(HDR)进行整合
每次粒子轰击通常使用四种质粒：1)供体质粒(50ng/μl)，其含有侧翼为CRISPR/Cas9介导的同源依赖性SDN3的同源臂(基因组序列)的供体盒，2)含有表达盒UBI PRO：：Cas9：：pinII加表达盒ZM-U6PRO：：gRNA：：U6 TERM的质粒(50ng/μl)，3)含有表达盒3xENH：：UBI PRO：：ODP2的质粒(10ng/μl)，和4)含有表达盒NOS：：WUS2：：IN2TERM的质粒(5ng/ul)。为了将DNA附着到0.6μm金粒子上，将四种质粒混合，方法是在低结合微量离心管(索伦森生物科学公司(Sorenson Bioscience)39640T)中将10μl每种质粒添加在一起，总共40μl。向该悬浮液中添加50μl 0.6μm金粒子(30μg/μl)和1.0μl Transit 20/20(目录号MIR5404，米鲁斯生物有限责任公司(Mirus Bio LLC))，并将该悬浮液置于旋转振荡器上10分钟。将悬浮液以10,000RPM(约9400x g)离心，弃去上清液。将金粒子重悬于120μl的100％乙醇中，在低功率下短暂超声处理，并且将10μl移液到每个载片上。然后将载片风干以蒸发掉所有剩余的乙醇。使用PDF-1000/HE粒子递送装置，使用600PSI破裂片在27英寸Hg处执行粒子轰击。
在该实验中使用了转基因Pioneer Stiff-Stalk近交系PHH5E。基于AM-CYANl的种子特异性表达选择半合子种子，并将其使用80％乙醇表面灭菌3分钟，随后在50％漂白剂+0.1％Tween-20的溶液中孵育，同时用搅拌棒搅拌20分钟。然后将无菌种子在无菌双蒸馏水中冲洗3次。将表面灭菌的种子在13158F固体培养基上在(120μE m-2s-1)光照下使用18小时光周期于25℃萌发。
可替代地，氯气或氧化剂可用于种子灭菌。氯气可以使用多种化合物(或试剂)(包括漂白粉、次氯酸钙、次氯酸钠、工业漂白剂、家用漂白剂、二氧化氯一氯胺、二氯胺和三氯胺)生成。可用于该方法的氧化剂包括但不限于臭氧、过氧化氢、次氯酸、次溴酸、二氧化氯和二氧化乙烯。
14天后，将幼苗中胚轴正上方的3cm段(含有茎顶端分生组织区域正上方的叶轮(leaf-whorl)组织)切除。使用解剖刀将3cm段纵向一分为二。然后将叶组织的外层(胚芽鞘)丢弃。对于衍生自每个幼苗的叶段/组织，将叶分离并平放在含有以下两种培养基之一的培养板的中间直径2cm内；i)在轰击前，在含有12％蔗糖的培养基13224中持续3-4小时(10个板，每个含有来自10个幼苗之一的段/组织)，和ii)在轰击前，在含有12％蔗糖+0.1mg/l胺苯磺隆的培养基13224C中持续2-3小时(10个板，每个含有来自10个幼苗之一的段/组织)。
DNA官能化金粒子的制备如下进行。将质粒PHP71193和PHP71788的储备溶液(100ng/ul)用无菌水稀释至50ng/ul。将PHP21875和PHP40828的储备溶液(100ng/ul)用无菌水稀释至25ng/ul。使用无菌、低结合Eppendorf管。将稀释的质粒PHP71788(50ng/ul)、PHP71193(50ng/ul)、PHP21875(25ng/ul)和PHP40828(25ng/ul)各十ul添加到无菌、低结合Eppendorf管(质粒的最终比率分别为50∶50∶25∶25)中。然后将该DNA混合物添加到含有50ul的0.6uM金粒子的无菌低结合Eppendorf管中(储备溶液浓度为10mg/ml)，并轻轻搅拌以混合悬浮液中的DNA和金粒子。添加1ul的Transit 20/20，并再次轻轻搅拌管。然后在室温下将管置于125RPM旋转振荡器上10分钟。然后将管在微量离心机中以10,000RPM离心。弃去上清液，添加120ul的95％EtOH，然后将管在低设置下短暂超声处理以重悬粒子，然后将10ul的DNK/金粒子/EtOH悬浮液移液到载片的中心。将载片暴露在层流罩中低处的无菌空气中大约10分钟以蒸发EtOH。然后将带有干燥金粒子/DNA的载片用于粒子轰击。对于粒子轰击，使用PDS-1000/He粒子递送系统(伯乐公司(Bio-rad)，美国加利福尼亚州赫拉克勒斯市)，带有425psi爆破片和位于载体支架下方的两个架子上的含有靶段/组织的培养皿，并且真空度为大约27mg Hg。
当通过添加胺苯磺隆诱导Wus2和Odp2的表达时，叶段/组织中的体细胞胚发生受到刺激。使用这种诱导型Wus2/Odp2种质作为新实验的起点，然后将幼苗来源的叶段/组织用作粒子轰击的靶外植体。如上所述，在一个处理中，叶段/组织在粒子轰击前在含有12％蔗糖的培养基上孵育(以质壁分离叶细胞)，并且在第二个处理中，叶段在粒子递送之前被暴露于含有12％蔗糖加0.1mg/l胺苯磺隆的培养基(提供更早的暴露于诱导处理以开始Wus2/Odp2表达的刺激)。为了进一步增强形态发生(除了诱导型表达提供的)，将含有组成型Wus2和ODP2表达盒的质粒与Cas9和gRNA以及模板DNA(侧翼是基因组序列的NPTII表达盒)共同递送。DNA递送后，经由同源依赖性重组(HDR)成功的NPTII编码序列整合允许使用诱导配体(0.1mg/l胺苯磺隆)和G418两者进行选择来再生HDR事件。由于高水平的Wus2和Bbm表达(来自预整合的60850-T-DNA的诱导型表达加上由PHP21875和PHP40828提供的组成型)，使用NPTII和G418的选择效率降低，导致逃逸(野生型)植物恢复。因此，在较低水平的G418选择剂(150mg/l或200mg/l)下，当来自9株幼苗的叶段/组织用作每次处理的起始外植体时，恢复了46株和34株含有NPTII基因的T0植物，但没有观察到含有完美HDR整合的植物。相比之下，当9株幼苗再次用于质粒的粒子递送，随后由于更高的G418(250mg/l)而增加选择压力时，选择变得更加严格，并且从总共38株再生和分析的T0植物中恢复了三个完美的HDR整合事件。
因此，使用Wus2和Odp2表达盒的这种组合来刺激生长，同时也递送SDN3供体DNA、Cas9表达盒和指导RNA表达盒，导致有效的同源依赖性靶向整合。因此，从对仅衍生自34个起始幼苗的叶段的粒子轰击中恢复了三个完美的HDR事件。
比较起来，当以类似方式转化野生型玉蜀黍Stiff-Stalk近交系PHH5G，但不使用Wus2和Odp2时，转基因事件没有恢复。因此，将质粒PHP71193和PHP71788粒子递送到幼苗衍生的叶段/组织(不含Wus2或Odp2)中无法产生转基因或经编辑的T0植物。
B.位点特异性整合
使用Pioneer近交系PH184C(在US8445763中公开，通过引用以其全文并入本文)，其在1号染色体中含有由UBI PRO：FRT1：NPTII：：PINII TERM+FRT87构成的预整合位点特异性整合(SSI)靶位点(Chrom-1靶位点)。轰击前，从先锋近交系PH184C的穗中分离出10-12个DAP(授粉后的天数)未成熟胚，并置于605J培养基和16％蔗糖中3小时，以使盾片细胞质壁分离。可替代地，将前2cm-3cm的幼苗衍生的叶轮组织纵向一分为二，并切成大约0.5mm-3.0mm的叶段，并将这些叶段在粒子轰击之前在605J培养基加16％蔗糖上进行质壁分离三小时。
每次粒子轰击通常使用四种质粒：
1)供体质粒(100ng/μl)，其含有用于重组酶介导的盒交换的FRT侧翼的供体盒，例如，含有FRT1：PMI：：PINII TERM：：CZ19B1TERM+UBI1ZM PRO：：UBI1ZM 5UTR：：UBI1ZMINTRON1：：DS-RED2：：PINIITERM+FRT6的质粒(PHP8418-0004)；
2)含有表达盒UBI1ZM PRO：：UBI1ZM 5UTR：：UBI1ZM INTRON1：：FLPm：：PINII TERM的质粒(2.5ng/μl)(PHP5096)；
3)含有表达盒ZM-PLTP PRO：：ZM-ODP2：：OS-T28 TERM+FMV&PCSV增强子的质粒(10ng/μl)(PHP89030)；以及
4)含有表达盒ZM-PLTP PRO：：ZM-WUS2：：IN2-1TERM+PSW1+GZ-W64A TERM+FL2TERM的质粒(5ng/ul)(PHP89179)。
为了将DNA附着到0.6μm金颗粒上，将四种质粒混合在一起，方法是在低结合微量离心管(Sorenson Bioscience 39640T)中将10μl每种质粒加在一起，总共40μl。向该悬浮液中添加50μl0.6μm金粒子(30μg/μl)和1.0μl Transit 20/20(目录号MIR5404，Mirus BioLLC)，并将该悬浮液置于旋转振荡器上10分钟。将悬浮液以10,000RPM(约9400x g)离心，弃去上清液。将金颗粒再悬浮在120μl100％乙醇中，在低功率下短暂超声处理，将10μl移液到每个载体盘上。然后将载体盘风干以除去所有残留的乙醇。使用Biolistics PDF-1000，在28英寸汞柱下使用200PSI破裂盘执行粒子轰击。粒子轰击后，在改良后以包含12.5g/l甘露糖和5g/l麦芽糖且不含蔗糖的605J培养基上选择未成熟胚或叶段。选择10-12周后，再生小植株并使用qPCR分析。预计PLTP：：ODP2(PHP89030)和PLTP：：WUS2(PHP89179)连同SSI组件(供体DNA(PHP8418-0004)+UBI：：FLP(PHP5096))的共递送将产生供体片段位点特异性整合到Chrom-1靶位点中的高频率(即，相对于轰击的未成熟胚的数量的4％-7％的比率)。
实例4：农杆菌属介导的玉米转化
A.农杆菌属母板的制备。
将带有二元供体载体的根癌农杆菌属从-80℃冷冻等分试样划线到固体12R培养基上，并在黑暗中在28℃培养2-3天，以制备母板。
B.在固体培养基上生长农杆菌属。
从母板上挑出单菌落或多菌落的农杆菌属，并将其划线到含有810K培养基的第二平板上，并在黑暗中于28℃孵育过夜。
将农杆菌属感染培养基(700A；5ml)和100mM 3′-5′-二甲氧基-4′-羟基苯乙酮(乙酰丁香酮；5μL)添加到通风橱中的14mL锥形管中。将来自第二平板的约3个满环的农杆菌属悬浮于管中，然后将管涡旋以形成均匀的悬浮液。将悬浮液(1ml)转移到分光光度计管中，并将悬浮液的光密度(550nm)调节至约0.35-1.0的读数。农杆菌属浓度为约0.5至2.0×109cfu/mL。将最终的农杆菌属悬浮液等分到2mL微量离心管中，每个管含有约1mL悬浮液。然后尽快使用悬浮液。
C.在液体培养基中生长农杆菌属。
可替代地，可以通过在液体培养基中生长来制备农杆菌属用于转化。感染前一天，使125ml烧瓶制有30ml 557A培养基(10.5g/l磷酸氢二钾，4.5g/l无水磷酸二氢钾，1g/l硫酸铵，0.5g/l脱水柠檬酸钠，10g/l蔗糖，1mM硫酸镁)和30μL壮观霉素(50mg/mL)和30μL乙酰丁香酮(20mg/mL)。将来自第二平板的半环农杆菌属悬浮于烧瓶中，并置于设定为200rpm的轨道振荡器上，并在28℃孵育过夜。将农杆菌属培养物以5000rpm离心10min。去除上清液并添加含乙酰丁香酮溶液的农杆菌属感染培养基(700A)。将细菌通过涡旋重悬，并将农杆菌属悬浮液的光密度(550nm)调节至约0.35至2.0的读数。
D.玉蜀黍转化。
将玉蜀黍种子在20％(v/v)漂白剂(5.25％次氯酸钠)加1滴吐温20中表面灭菌15min至20min，然后在无菌水中洗涤3次，萌发并允许生长为幼苗约14天，然后如上所述制备以产生叶段/片段。将叶段置于含有200μM乙酰丁香酮溶液+0.02％
Figure BDA0004153398210001471
表面活性剂(Plant Health Technologies[植物健康技术公司]，P.O.Box 70013[邮政信箱70013]，Boise[博伊西]，ID 83707-0113)的农杆菌属感染培养基(700A)中。吸出农杆菌属感染培养基，并且将1ml农杆菌属悬浮液加入叶段中并允许静置20min。将农杆菌属的悬浮液和叶段倒入无菌金属筛中并弃去液体。使用抹刀将收集在金属筛上的叶段转移到一叠3张无菌Whatman#2滤纸上，用于吸去多余的含有农杆菌属的液体，然后再次使用抹刀将叶段转移到放在共培养培养基上的滤纸上。将平板在黑暗中于21℃孵育1-3天进行共培养。
然后将支撑叶段的滤纸转移到静置培养基(605T培养基)中而不进行选择。七天后，将支撑叶段的滤纸转移到选择培养基中，持续三周。选择后，使用镊子将健康生长的体细胞胚转移到成熟培养基上，在黑暗中持续两周，此时将成熟板全部(仍然含有成熟的体细胞胚)转移到光照下，持续另外一周。在光照下一周后，将再生的小植株转移到生根培养基。生根后，小植株准备好移植到温室中。
实例5：玉蜀黍叶段的转化
农杆菌属介导的玉蜀黍叶段转化后WUS2和ODP2的组成型表达导致胚性愈伤组织和/或快速形成的体细胞胚产生，该胚性愈伤组织和/或体细胞胚再生为健康、可育的T0植物。
使用实例4中所描述的用于农杆菌属介导的玉蜀黍转化的一般方案，其中进行下文描述的修改以使用叶片段/组织作为靶外植体。
A.体外种子萌发以产生幼苗靶段/组织
通过在使用磁力搅拌棒搅拌下浸入一系列溶液中对成熟种子进行表面灭菌；首先浸入80％乙醇溶液中3分钟，倒出乙醇溶液并替换为含0.1％吐温20的30％Clorox漂白剂溶液20分钟，倒出Clorox漂白剂溶液，并在高压灭菌的无菌水中漂洗成熟种子(三次5分钟漂洗)。在最后的无菌水漂洗之后，将灭菌的种子转移到固体90O培养基上。体外发芽和幼苗生长在26℃进行，其中光周期为16h光照/8h黑暗。从每株12天至18天龄的幼苗中取下中胚轴上方最初2.5cm至3cm的叶轮用于进一步加工以进行转化。
可替代地，可以通过暴露于氯气对种子进行灭菌。氯气可以使用多种化合物(或试剂)(包括漂白粉、次氯酸钙、次氯酸钠、工业漂白剂、家用漂白剂、二氧化氯一氯胺、二氯胺和三氯胺)生成。此外，氧化剂可用于种子灭菌。可用于本文公开的方法中的氧化剂包括但不限于臭氧、过氧化氢、次氯酸、次溴酸、二氧化氯和二氧化乙烯。
B.农杆菌属制备
将根癌农杆菌属菌株LBA4404 TD THY-携带辅助质粒PHP71539(SEQ ID NO：4)(pVIR9，参见US20190078106A1，通过引用以其全文并入本文)和含有具有可选择标记(ZM-ALS(HRA))和可筛选标记(ZS-GREEN1)的WUS2/ODP2 T-DNA的二元供体载体PHP96037或含有可选择标记和/或可筛选标记T-DNA(缺少WUS2/ODP2)的二元供体对照载体从-80℃冷冻等分试样中划到固体12V培养基上，并于28℃在黑暗中培养2天以制作主板。工作板通过以下制备：通过将来自12V生长主板的4-5个菌落划入新鲜的810K培养基，在用于农杆菌属感染之前在黑暗中于28℃孵育过夜。可用于本公开的方法的附加辅助质粒(PHP70298、RV005393和RV007497(含有来自发根农杆菌属(A.rhizogenes)的vir基因))列于表2中。
将添加有20μL乙酰丁香酮和20μL先前稀释10倍的表面活性剂(Break Thru S233，Evonik Industries GmbH[赢创工业有限公司]，Goldschmidtstraβe100，45127Essen，Germany[黄金路100号，埃森45127，德国])的农杆菌属感染培养基(700J培养基，10m1)加入到通风橱中的50mL锥形管中。从工作板上收集大约5个满环的农杆菌属，转移到50ml试管中的感染培养基，然后涡旋直至均匀悬浮。将悬浮液(1ml)转移到分光光度计管中，并将悬浮液的光密度(550nm)调节至0.6的读数。将最终的农杆菌属悬浮液等分到含有0.4μm可渗透培养插入物(Falcon，部件号分别为353046和353090)的Corning六孔板中，其中每个孔含有约8mL的农杆菌属悬浮液。
如前所述对玉蜀黍近交系PH85E的种子进行表面灭菌，然后使其于28℃在低光照下在固体90B培养基(1/2强度MS盐加20g/l蔗糖和50mg/l苯菌灵)上萌发。用消毒剪刀从每株12-18天龄体外萌发的幼苗上取下叶基段(中胚轴上方约2.5cm至3.0cm的部分)。将这些叶段放入150mm x15mm Petri培养皿中。使用镊子夹住绿色上端的各叶轮部分，并使用无菌#10手术刀片将该部分纵向平分为2个纵向的一半。除去外叶，并且然后将轮生的内叶横切(切块)成更小的部分(大小约为1mm至3mm，优选大小为2.5mm至3.0mm)。收集小叶部分并直接转移到含有农杆菌属悬浮液的可渗透培养插入物中，并在室温(25℃)下孵育15分钟的感染期。
感染后，将含有农杆菌属感染的叶段的培养插入物从8孔板中取出并放置在高压灭菌的干燥滤纸上以吸走并去除任何残留的农杆菌属溶液。然后将感染的叶段转移到于710N固体共培养培养基上静置的新鲜滤纸(VWR 7.5CM)上。使用镊子将叶段均匀分散在710N板上并确保它们具有足够的生长空间。将感染的叶段/组织在黑暗中于21℃孵育2-3天。
共培养2-3天后，将支撑叶段/组织的纸张从710N培养基中取出并转移到605B培养基上用于4周的静置培养。每2周对叶段/组织进行传代培养。在静置培养基(605B)上进行4周的培养后，将板放入受控温度/湿度培养箱(45℃/70％RH)中用于2小时热处理。将板从培养箱中取出并在室温(25℃)下1小时至2小时，直到板冷却。根据玉蜀黍近交系，应用单次两小时热处理或连续两天两次2小时热处理来刺激干旱诱导型RAB17启动子并诱导CRE介导的WUS2、ODP2和CRE重组酶切除。
热处理和在室温下温度平衡后，将含新发育体细胞胚的叶段转移到无滤纸的13329B成熟培养基上，于28℃在黑暗中培养2周，并且然后移入26℃光照室，持续另外一周。将现在支撑小芽的叶段转移到404J生根培养基上，持续另外2周至3周，直到发育出形成良好的根，此时小植株准备好转移到温室中。
转化效率(转化频率)计算为在百分比基础上，每一种用于叶片段/段制备的起始幼苗产生的独立转基因T0植物的数量。例如，使用50株幼苗并且幼苗被分成5组(实验中的五种不同处理)，10株幼苗/处理(或实验重复，如表15所示)。对于一组内的每株幼苗，切下中胚轴上方包裹叶组织的3cm圆柱体，并将每个圆柱体纵向一分为二。然后这些长度的一分为二叶组织用手术刀手动切片或放入食品加工机内的液体中并进行脉冲处理，这两种方法都产生了平均长度在0.5mm与3.0mm之间的叶片段/段。用于每株起始幼苗的转化的最终叶段(片段)的数量可能会有所不同，这取决于幼苗叶的大小和宽度，从一批到另一批略有不同的物理切割过程等。还应该注意的是，基于这个程序，将来自各处理(或重复)内10株幼苗的每个定群的叶片段/片段合并用于农杆菌属介导的转化。
通过阳性PCR分析鉴定的独立转基因T0事件被制表成从单个叶段/片段产生的分子独特的T0植物，这阻止了将克隆事件(例如相同的转基因整合模式)计数为单独的事件。一旦确定了给定处理的分子地表征转基因事件的最终数量，就将转基因T0植物(独立事件)的最终数量相加并除以该重复的起始幼苗数量(在实例5中为10)，并将结果乘以100以提供百分比。因此，对于表15中的实验重复5，从10株起始幼苗产生了30株T0植物，转化频率(表15中的T0％)为(30/10)X 100＝300％。
来自五个实验的结果显示在表15中，其中每个实验使用10株起始幼苗(总共50株)来产生起始叶段用于农杆菌属感染，恢复的转基因T0植物的数量范围为从18(实验1)至51(实验4)，导致平均转化频率为360％+/-112(标准偏差(SD))。这与在T-DNA中仅含有可选择标记基因和/或可筛选标记基因(荧光蛋白基因)的实验相反，在该实验中没有观察到培养应答并且没有产生T0植物。
除了高转化频率外，高百分比的恢复的T0植物是T-DNA(含可选择标记和/或可筛选标记)的单拷贝(SC)，没有检测到来自农杆菌属的污染序列。此类SC/无农杆菌属事件(T0植物)的范围为从23％至37％，平均值为31.4％(+/-5.2％SD)。通过将高质量转基因T0植物(T-DNA的SC，无污染农杆菌属主干序列)的数量与这些实验中使用的起始幼苗数量进行比较，提供了总体效率的清晰量度，平均频率为114％(+/-44％SD)。这种使用WUS2/ODP2的方法避免了在温室中生长成熟玉蜀黍植物90-120天以产生用于转化的未成熟胚外植体的需要，并提供了来自实验室中从萌发种子生成的叶外植体的转基因事件。
表15.
Figure BDA0004153398210001521
＊相对于T0植物的总数，具有单拷贝T-DNA且无质粒序列的T0植物的频率
＊＊相对于幼苗的起始数量，具有单拷贝T-DNA且无质粒序列的T0植物的频率
实例6：高粱叶段的转化
农杆菌属介导的高粱叶段转化后WUS2和ODP2的组成型表达导致胚性愈伤组织和/或快速形成的体细胞胚的产生，这些胚性愈伤组织和/或快速形成的体细胞胚再生为健康、可育的T0植物。
高粱的农杆菌属菌株、构建体、幼苗的生长、用于转化的叶材料的制备、农杆菌属感染、共培养、静置培养、成熟和生根均与实例5中用于玉蜀黍开发的方法相同。此处的目的是确定该方法在没有任何高粱特异性优化的情况下如何可转移。
来自使用WUS2/ODP2 T-DNA的四项实验以及在其中对照T-DNA仅含有可选择标记和荧光标记(HRA+ZS-GREEN)的一项实验的结果显示在表16中。各实验还含有两种静置培养基之间的比较，两种静置培养基为不含额外硫酸铜或BAP的13266P(605B培养基加50mg/l美罗培南)和培养基13265L(13266P培养基加100uM硫酸铜和0.5mg/l BAP)。
如对于玉蜀黍所证明的，在T-DNA(PHP96037)中含WUS2和ODP2表达盒的高粱处理也导致高转化频率，根据每株起始幼苗恢复的转基因T0植物数量计算，13266P和13265L的平均值(+/-SD)分别为36.5％(+/-4.1％)和35.5％(+/-9.6％)，两种培养基组分之间没有显著差异(p＝0.05)。相反，包含可选择标记和/或可筛选标记且在T-DNA中没有WUS2/ODP2的对照处理没有产生转基因事件。两种培养基在用PHP96037转化时获得高质量T0高粱植物(没有农杆菌属主干的单拷贝(SC/NA％))的平均频率在36％与38％之间。
与玉蜀黍一样，这种方法避免了在温室中生长成熟高粱植物90-120天以产生用于转化的未成熟胚外植体的需要，并提供了来自实验室中从萌发种子生成的叶外植体的转基因事件。
表16.
Figure BDA0004153398210001531
实例7：启动子、额外辅助子、切除组分、
和可选择标记的组合
在农杆菌属介导的叶段转化后使用多种启动子、额外辅助子、切除组分和可选择标记的组合来表达WUS2和ODP2，导致胚性愈伤组织和/或快速形成的体细胞胚的产生，该胚性愈伤组织和/或体细胞胚再生为健康、可育的T0植物。
A.组成型启动子组合
如下所示，启动子、附加辅助、切除组分和可选择标记的众多组合导致玉蜀黍中成功加速的叶转化。
如实例5中所述，使用农杆菌属菌株LBA4404 TD THY-转化玉蜀黍幼苗衍生的叶段。T-DNA递送根据UBI-ZS-GREEN的瞬时表达进行评估，UBI-ZS-GREEN存在于所有测试的T-DNA变体中。转化后十四天至二十一天，根据生长速率和段/组织的形态两者评估生长应答(评定量表参见表17)。叶转化测定评分(转化(TXN)应答(Resp.)测定分数或测定分数)基于形态(早期体细胞胚形成与胚性愈伤组织的产生)和生长速率，其中增加的数值分数表明更快的生长，以及从完全愈伤组织生长(即，分数为1)到快速产生无愈伤组织的单一功能体细胞胚(即4)的伴随进展，如表17所示。
表17.
Figure BDA0004153398210001541
表18显示了在农杆菌属介导的玉蜀黍叶段转化后的生长应答，其中T-DNA来自含有启动子、额外辅助子、切除组分和可选择标记的不同构建体组合的质粒。
在测试的各种构建体中，29种构建体导致为“2”的测定分数，而23种构建体导致在开始农杆菌属感染后的14-21天内早期体细胞胚的快速产生(测定分数为3或4)。这些结果证明，用于叶转化的WUS2和ODP2的各种启动子、额外辅助子、切除组分和可选择标记的组合产生了愈伤组织生长应答和/或快速胚应答，并导致增加的转化效率(叶段应答百分比)。然而，23种质粒的子集导致快速体细胞胚形成，并大大缩短了转化过程的持续时间。这表现为缩短的培养时间。测定分数为二(2)的构建体通常在农杆菌属感染后约6-8周内产生准备好用于成熟阶段(芽的胚再生在这里开始)的胚性愈伤组织，而对于测定分数为三(3)和四(4)的构建体，此持续时间分别进一步缩短至5-7周和4-6周。这与Lowe等人(2016，Plant Cell[植物细胞]28：1998-2015)发表的用于叶段转化的方法进行了比较，在该方法中，培养持续时间为在体细胞胚成熟开始前的10-12周之间。
与Lowe等人，构建体PHP35648和本文测试的其他在体细胞胚成熟前需要10-12周产生缓慢生长愈伤组织应答的构建体相比，本文测试的许多其他构建体导致更短的时间范围(8周或更短)以达到体细胞胚成熟阶段。导致更短的时间范围(8周或更短)以达到体细胞胚成熟阶段的构建体包括含有驱动WUS和ODP2的各种启动子和额外辅助子、切除组分和可选择标记组合的组合，如表18中所示。
表18.
Figure BDA0004153398210001551
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Figure BDA0004153398210001561
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Figure BDA0004153398210001571
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Figure BDA0004153398210001581
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Figure BDA0004153398210001591
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Figure BDA0004153398210001601
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Figure BDA0004153398210001611
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Figure BDA0004153398210001621
＊HSP17启动子上游(5′)的单一Cross-Talk Blocker序列
＊＊两个Cross-Talk Blocker序列，一个在上游并且一个在下游，在HSP17：：CRE表达盒的侧翼
＊＊*CRE介导的Cas9和gRNA切除
B.WUS/BBM表达盒的配置
执行以下比较：
i)PHP35648：UBI：：CYAN+RAB17：：CRE+NOS：：WUS2+UBI：：ODP2
来自玉蜀黍的泛素(UBI)启动子是强组成型启动子，而衍生自农杆菌属的胭脂碱合酶(NOS)启动子是与UBI相比在玉蜀黍中驱动约20％水平的表达的组成型启动子。然而，与已去除强上游表达盒的T-DNA相比，NOS：：WUS上游的强表达盒(比如UBI：：CYAN和RAB17：：CRE)有可能下调WUS表达。
用农杆菌属菌株LBA4404 TD THY-和含具有表达WUS2和ODP2的UBI：：CYAN+RAB17：：CRE+NOS：：WUS2+UBI：：ODP2的含有T-DNA的质粒(PHP35648)的玉蜀黍幼苗衍生的叶段的转化导致愈伤组织的缓慢起始和生长，随着时间的推移，愈伤组织的胚性变得越来越大。使用此构建体，在实现RAB17：：CRE介导的切除以及随后的体细胞胚成熟和T0植物再生之前，需要10-12周的愈伤组织生长(测定分数＝1)。
ii)PHP81858：NOS：：WUS2+UBI：：ODP2+RAB17：：CRE
当使用农杆菌属菌株LBA4404 TD THY-和PHP81858(在其中不存在上游强表达盒)转化玉蜀黍幼苗衍生的叶段时，NOS：：WUS2+UBI：：ODP2的组合导致中等的胚性愈伤组织生长速率，其中更高百分比的叶段产生阳性应答。使用此构建体，在RAB17：：CRE介导的切除以及随后的体细胞胚成熟和T0植物再生之前需要6-8周的愈伤组织生长(测定分数＝2)。
iii)PHP95385：ACTIN：：WUS+UBI：：ODP2+HSP：：CRE
当使用农杆菌属菌株LBA4404 TD THY-和含有ACTIN PRO：：WUS2+UBI PRO：：ODP2+HSP17 PRO：：CRE的PHP95385转化玉蜀黍幼苗衍生的叶段时，导致适中胚性愈伤组织生长速率，其中更高百分比的叶段产生阳性应答。使用此构建体，在CRE介导的切除以及随后的体细胞胚成熟和T0植物再生之前需要6-8周的愈伤组织生长(测定分数＝2)。
iv)PHP81856：AXIG1：：WUS2+PLTP：：ODP2+RAB17：：CRE
与组成型启动子NOS和UBI相比，玉蜀黍AXIG1启动子由培养基中生长素的存在诱导，并且约通常是玉蜀黍UBI启动子强度的约20％(在我们标准浓度2，4-D的存在下)。PLTP启动子相对于UBI似乎是强的，但PLTP启动子的表达不像UBI启动子那样为组成型。当PHP81856(AXIG1：：WUS2+PLTP：：ODP2)用于农杆菌属介导的转化时，在未成熟胚和叶段中观察到相似水平的瞬时ZS-GREEN表达，表明T-DNA递送以相同程度发生在两个外植体中。然而，来自这两种外植体随后的生长应答是不同的。在未成熟胚中，AXIG1：：WUS2+PLTP：：ODP2的表达导致快速体细胞胚形成。相反，当AXIG1：：WUS2+PLTP：：ODP2用于叶段时，没有发生转基因(绿色荧光)愈伤组织或体细胞胚的生长，并且没有T0植物被恢复，因为WUS2和ODP2的表达没有持续足够长的持续时间(测定分数＝0)。
v)PHP96037：NOS：：WUS2+3xENH：：UBI：：ODP2
当使用农杆菌属菌株LBA4404 TD THY-和含有NOS：：WUS2+3xENH：：UBI PRO：：UBI：：ODP2+HSP17 PRO：：CRE的PHP96037转化玉蜀黍幼苗衍生的叶段时，体细胞胚快速形成，直接自叶段出现而没有中间愈伤组织阶段。在农杆菌属感染后10-14天之间观察到直接体细胞胚形成。因此，由PHP96037提供的WUS2和ODP2表达的强度和更长的持续时间足以刺激快速体细胞胚形成。使用此构建体，在CRE介导的切除以及随后的体细胞胚成熟和T0植物再生之前仅需要4-6周的愈伤组织生长(测定分数＝4)。
C.测试驱动WUS2和/或ODP2表达的新启动子
实验结果(比如表18中总结的那些)清楚地证明，驱动ODP2表达的强组成型启动子，比如玉蜀黍UBI1ZM PRO(或UBI1ZM PRO的增强版本)连同各种额外辅助子、切除组分和可选择标记有效刺激快速体细胞胚形成和T0植物再生，而一系列组成型启动子(比如GOS2或NOS(强度都约为UBI1ZM的15％-20％)直至UBI PRO本身，并且包括ACTIN PRO、8xDR5-35SPRO和FT-MEM1-NOS PRO)在用于驱动WUS2表达时连同各种额外辅助子、切除组分和可选择标记有效刺激快速体细胞胚形成和T0植物再生。鉴定新的启动子候选物以连同各种额外辅助子、切除组分和可选择标记结合使用，从而导致表18和19中所示的列表。
为了测试这些潜在的启动子候选物，构建了具有以下配置的T-DNA：
配置1)RB+PRO-1：：WUS1+3xENH：：UBI1ZM：：ODP2+UBI：：ZS-GREEN+UBI：：NPTII+LB；
配置2)RB+NOS：：WUS1+3xENH：：PRO-2：：ODP2+UBI：：ZS-GREEN+UBI：：NPTII+LB；以及
配置3)RB+NOS：：WUS1+PRO-2：：ODP2+UBI：：ZS-GREEN+UBI：：NPTII+LB。
基于本文的实验观察，表19中的启动子在用于上述配置1中的“PRO-1”位置以驱动WUS2表达时，预计会产生阳性结果(测定分数为“2-4”)。表19中用单星号指示的启动子在配置2中替代PRO-2时预计会产生快速胚性生长(分数为2-4)，并且双星号指示的启动子预计会在配置2或3中产生快速胚形成。同样，表20中列出的六个新启动子在配置2和3(驱动ODP2的表达)中替换时，预计性能等于或优于UBI1ZM。
表19.
Figure BDA0004153398210001651
Figure BDA0004153398210001661
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＊正在进行WUS(配置1)和/或ODP2(配置2)测试的启动子
＊＊正在进行在如上配置2和3中的ODP2测试的启动子。
表20.
Figure BDA0004153398210001662
实例8：跨禾本科物种和变种的叶转化
将来自禾本科内不同物种的种子在无菌条件下进行表面灭菌和萌发。使用开发用于玉蜀黍的方案，收获来自禾本科内产生的各种幼苗的叶组织，并将其手动切成2-3mm的段或在食品加工机中制备，如上所述。含有PHP71539(pVIR9)和含具有组分NOS：：WUS2+3xENH：：UBI PRO：：ODP2+UBI：：ZS-GREEN+HRA的T-DNA的质粒两者的农杆菌属菌株LBA4404TD THY-用于转化。方案中的所有步骤和用于这些实验的所有培养基配方均与描述用于玉蜀黍的那些相同，并且所用质粒(PHP54733、PHP81858、PHP93739和PHP96037；分别为SEQ IDNO：93、8、23和66)含有玉蜀黍启动子和玉蜀黍WUS2/ODP2基因。
对于所有测试的物种，幼苗衍生的叶段(无论是手动制备还是搅拌机制备)都成功地用于恢复体细胞胚和再生T0植物，该植物被证实含有用于转化的质粒的相应T-DNA。使用这种叶转化方法成功转化的物种在下表21中以粗体显示，并且包括玉米、高粱、珍珠粟、稻、柳枝稷草、薏米、裸麦、小麦和画眉草。这些物种跨越禾本科内的四个亚科(虎尾草亚科、黍亚科、稻亚科、和早熟禾亚科)，这些亚科几乎跨越禾本科(Poaceae)的整个系统发生广度。这些不同的谷类作物(其中一些通常被视为抵抗或难以使用常规方法进行转化的)容易通过叶转化进行转化，此外，该方法还在两种历史上很难转化的墨西哥类蜀黍品种(Zea maysssp Mexicana)和(Zea mays ssp parviglumis)中产生了体细胞胚并再生了T0植物。当叶段用PHP96037进行农杆菌属感染并在前面的实例里如上所述进行传代培养时，Zea maysssp Mexicana和Zea mays ssp parviglumis均产生了多个转基因植物，其中47株和8株(分别地)T0植物被证实含有具有组分RB+LOXP+NOS：：WUS2+3xENH：：UBIODP2+INS+HSP PRO：：CRE+INS+LOXP+ZS-GREEN+HRA+LB的T-DNA。
表21.
Figure BDA0004153398210001671
Figure BDA0004153398210001681
这10个物种(物种跨越禾本科内的四个亚科并且涵盖了在所述科内系统发生多样性的广度)在使用我们未修改的玉蜀黍方案时的转化令人惊讶和出乎意料。此外，预计i)筛选其他亚科的成员，比如竹子(竹亚科)将取得类似的成功，和ii)进一步优化(例如使用启动子的同源直系同源物，给定物种的WUS2和ODP2和使用物种优化的培养基配方)将对转化效率和可转化物种的广度提供进一步的改善。
实例9：用ZM-ODP2同源物转化玉蜀黍叶段
构建含有以下T-DNA的质粒：RB+NOS：：WUS1+3xENH：：UBI1 ZM：：“BBM”+UBI：：ZS-GREEN+UBI：：NPTII+LB，其中“BBM”代表待测Zm-ODP2(玉蜀黍BBM)同源物。
当含PHP71539(SEQ ID NO：4)和含有上述T-DNA(RB+NOS：：WUS1+3xENH：：UBI1ZM：：“BBM”+UBI：：ZS-GREEN+UBI：：NPTII+LB)的第二个质粒的农杆菌属菌株LBA4404 TD THY-用于转化玉蜀黍近交系PH85E叶段时，预计当“BBM”基因为以下之一时：ZM-ODP2(ALT1)；ZM-BBM2；ZM-BBM2(ALT1)；SB-BBM；SB-BBM2；MS-BBM；MS-BBM1；OS-ODP2(MOD2)；OS-BBM2；BD-BBM；BD-BBM2；SI-BBM；SI-BBM2；SV-BBM；SV-BBM2；TA-BBM-6A；或MA-BBML，将刺激快速体细胞胚形成和T0植物生成。对于上述基因命名，ZM＝玉蜀黍，SB＝双色高粱，MS＝芒草，OS＝水稻，BD＝二穗短柄草，SI＝粟，SV＝青狗尾草，TA+普通小麦，并且MA＝小果野蕉(Mucaacuminata)。
实例10：用ZM-WUS2同源物转化玉米叶段
构建含有以下T-DNA的质粒：RB+NOS：：“WUS”+3xENH：：UBIlZM：：ODP2+UBI：：ZS-GREEN+UBI：：NPTII+LB，其中“WUS”代表待测的Zm-WUS(玉蜀黍WUS)同源物。
当含PHP71539(SEQ ID NO：4)和含有上述T-DNA(RB+NOS：：“WUS”+3xENH：：UBI1ZM：：ODP2+UBI：：ZS-GREEN+UBI：：NPTII+LB)的第二个质粒的农杆菌属菌株LBA4404 TDTHY-用于转化玉蜀黍近交系PH85E叶段时，预计当“WUS”基因(WUS/WOX家族成员)为以下之一时：ZM-WUS1；ZM-WUS2；ZM-WOX2A；ZM-WOX5A；ZM-WOX4；ZM-WOXB；ZM-WOX9；SB-WUS；OS-WUS；SI-WUS；SV-WUS；PV-WUS；PH-WUS；MS-WUS；BD-WUS；或TA-WUS，将刺激快速体细胞胚形成和T0植物生成。对于上述基因命名，ZM＝玉蜀黍，SB＝双色高粱，MS＝芒草，OS＝水稻，BD＝二穗短柄草，SI＝粟，SV＝青狗尾草，TA+普通小麦，PV＝Panicum viridis，PH＝Panicum halii，并且MA＝小果野蕉(Muca acuminata)。
实例11：驱动WUS2或ODP2的启动子的增强子组合构建含有以下T-DNA的质粒：RB+NOS：：WUS2+“ENH”：：UBI1ZM：：ODP2+UBI：：ZS-GREEN+UBI：：NPTII+LB，其中“ENH”代表待测病毒增强子的1x、2x或3x组合。
当含PHP71539(SEQ ID NO：4)和含有上述T-DNA(RB+NOS：：WUS2+“ENH”：：UBI1ZM：：ODP2+UBI：：ZS-GREEN+UBI：：NPTII+LB)的第二个质粒的农杆菌属菌株LBA4404 TD THY-用于转化玉蜀黍近交系PH85E叶段时，预计将刺激快速体细胞胚形成和T0植物生成，对于其中“ENH”是病毒增强子的1x、2x或3x组合的质粒，其中组合的病毒增强子元件选自紫茉莉花叶病毒增强子(MMV ENH)，FMV增强子元件来自玄参花叶病毒，PCSV增强子来自花生退绿条纹花椰菜病毒启动子，BSV(AY)增强子元件来自香蕉条纹病毒Acuminata云南株，CYMV增强子来自柑橘黄色花叶病毒启动子，并且CaMV35S增强子来自花椰菜花叶病毒启动子。当这些单一增强子、由两个或三个(分别地)相同增强子构成的二聚或三聚增强子，或不同增强子的双重或三重组合位于用于WUS2或ODP2的启动子的上游时，预计将刺激转化频率、体细胞胚的快速形成和总体生长速度，其中一个、两个或三个连续的增强子提供越来越大的增强。
实例12：农杆菌属感染期间使用的不同表面活性剂
在农杆菌属感染玉蜀黍近交系HC69的叶外植体期间添加稀释的表面活性剂增加了T-DNA递送、可筛选标记，比如荧光蛋白的瞬时表达以及转基因T0植物的最终恢复。在这些实验中，比较了以下不同的表面活性剂：Silwet-L-77(LEHLE Seed Company[LEHLE种子公司]，目录号VIS-01)；Break Thru S233(赢创公司，产品编号99982498，批号H219624078)；和Surface(Alligare[阿盖尔公司]，Opelika，AL[亚利桑那州奥佩利卡市])。
使用含PHP71539(SEQ ID NO：4)以及以下两者中的任一种的农杆菌属菌株LBA4404 TD THY-转化玉蜀黍近交系HC69：
a)含有RB+NOS PRO：：WUS2+3xENH：：UBI1ZM PRO：：ODP2+SB-UBI PRO：：ZS-GREEN+HRA的PHP93933(参见表22)：或者
b)含有RB+NOS PRO：：WUS2+3xENH：：UBI1ZM PRO：：ODP2+HSP17.7PRO：：CRE+SB-UBIPRO：：ZS-GREEN+LB的PHP96942(参见表23)。
表22.
Figure BDA0004153398210001711
＊计为在农杆菌属感染后14-21天之间评分的多细胞体细胞胚
表23.
Figure BDA0004153398210001712
＊计为在CRE介导的切除、成熟和生根后再生T0小植株5018
虽然表21和22中显示的结果之间的数量级不同，但所有表面活性剂处理在测试的浓度下都非常有效并产生许多转基因事件。
实例13：在玉蜀黍近交系HC69的幼苗衍生的叶段/组织中的农杆菌属介导的位点特异性整合(SSI)
玉蜀黍近交系HC69基因组中的预整合靶位点(靶基因座)用于位点特异性整合，如美国专利号6,187,994、6,262,341、6,330,545、6,331,661和8,586,361中所述，这些专利中的每个专利都通过引用以其全文并入本文。在该实例13中，使用了在HC69近交基因组内位于1号染色体上的靶位点45(分别为16507617bp和16509427bp的5′和3′侧翼位置)，并且该靶位点由整合组分loxP+UBI1ZM PRO：：UBI1ZM 5’UTR：：UBI1ZM INTRON1：：FRT1：：NPTII：：PINII TERM+FRT6构成，之前已经由Cas9介导的同源重组引入该组分以创建此SSI着陆区。将种子进行表面灭菌，在90B培养基上萌发，并从16天龄的幼苗制备叶段。两个农杆菌属菌株含有辅助质粒PHP71539(SEQ ID NO：4)，第一个菌株还含有PHP90842(含RB+FLP+FRT1+PMI+WUS+ODP2+CRE+LOXP+DsRED2+FRT6+LB的T-DNA)，并且第二个菌株还含有比例为8∶2的PHP93925(含RB+UBI：：WUS+3xENH：：UBI：：ODP2+SB-UBI：：ZS-GREEN+HRA+LB的T-DNA)。两种构建体的OD均为0.4。表面活性剂Break-ThruS 233通过将无菌ddH2O添加到10％浓度的原液中进行稀释，并且然后将10％Break-Thru S 223添加到农杆菌属悬浮液中以给出0.02％(V/v)的终浓度。
对叶组织进行以下加工：首先切下紧靠中胚轴上方的3cm轮生组织，并将其与100ml在700J培养基加乙酰丁香酮中的混合农杆菌属悬浮液一起放入食品加工机。施用1-2秒的短脉冲，直到叶片段/段的大小为约2-3mm，并且然后允许悬浮在感染培养基中的混合物(叶段和农杆菌属混合物)在搅拌机中静置15分钟。感染15分钟后，通过将叶段/组织倒入不锈钢筛中使其与液体分离，并且然后将叶段/组织转移到在60x25mm板内静置的玻璃滤纸支架上。允许在干燥滤纸上静置的叶组织/段静置几分钟，并且然后将滤纸(支撑叶段)转移到共培养培养基上。然后使用无菌接种环将组织/段均匀分布在过滤器上。在710N培养基上于21℃在黑暗中共培养2天，此时将叶段转移至静置培养基605B(使用镊子提起并转移整个过滤器)并于28℃在黑暗中培养14天。在静置期结束时，将过滤器移至选择培养基(605O＝去除蔗糖并添加15g/l甘露糖的605J培养基)上并于28℃在黑暗中孵育，其中每两周转移至新鲜的605O培养基。选择6周后，将带有过滤器和叶段/组织的板转移到45℃/70％RH培养箱中2小时，允许这种热休克处理以激活HSP17.7PRO：：CRE表达盒。热处理2小时后，将板转移回通风橱中并允许冷却至室温。然后使用镊子将段/组织从过滤器上挑下，并转移到成熟培养基(13329B)中，于28℃在黑暗中持续18天，并且然后将板移入设置于26℃的暗光培养室。然后选择健康的芽并转移到272M(272X，含10mg/l美罗培南)生根培养基中，于26℃光照下持续另外2-3周，然后转移到温室。
如表24所示，使用上述方法导致成功的位点特异性整合。从30株幼苗开始制备用于农杆菌属介导转化的靶组织，127个叶段通过产生体细胞胚应答。从该最初生长应答，44个胚性愈伤组织在G418选择上继续生长。从这个数量的愈伤组织中，7个再生为T0植物，其中4株植物通过分子分析证实了位点特异性整合，并且这4个事件中的一个事件在双重组产物的两端具有完美的重组连接。在表24中标记为RMCE的该事件也不含有T-DNA序列，包括没有FLP、WUS2、ODP2或农杆菌属主干的指示。
表24.
Figure BDA0004153398210001731
实例14：农杆菌属介导的叶转化和CAS9介导的脱失
使用两个构建体来测试用于CRE介导的切除的LOXP位点的位置和两种质粒的选择时机。第一个设计具有定位的LOXP位点，使得WUS2、ODP2、CRE和Cas9都被重组酶切除，与在PHP97933(RB+LOXP+NOS PRO：：WUS2+3xENH：UBI1 ZM PRO：：ODP2+INS+HSP 17.7PRO：：CRE+UBI1ZM PRO：：Cas9+ZM-U6 PRO：：gRNA+LOXP+UBI1ZM：：NPTII+UBI：：ZS-GREEN+LB)中一样。第二个T-DNA被设计，使得只有WUS2、ODP2和CRE被重组酶切除，如在PHP98784(RB+LOXP+NOSPRO：：WUS2+3xENH：UBI1ZM PRO：：ODP2+INS+HSP 17.7PRO：：CRE+INS+LOXP+UBI1ZM PRO：：Cas9+ZM-U6 PRO：：gRNA+UBI1ZM：：NPTII+UBI：：ZS-GREEN+LB)中一样。
农杆菌属制备、叶转化、静置、选择、成熟和生根如前面实例中所述进行，有以下细节；60个近交系PH85E的种子用于每个处理(总共4个处理)，其中120个幼苗衍生的叶段用PHP97933转化，并且120个幼苗衍生的叶段用PHP98784转化。农杆菌属感染和共培养后，将叶段转移到静置培养基605B上7天，并且然后将所有处理转移到选择培养基13266N(13266P加150mg/l G418)上3周。然后对来自所有四个处理的组织/段进行热处理(45℃，2小时)。热处理后，所有体细胞胚都经过成熟和生根步骤。
表25总结了转化频率和WAXY脱失(Cas9介导的缺失)频率。在成熟和生根之前减少选择时，PHP97933的转化频率为25％，并且继续选择时为15％，并且在这两种处理中仅观察到一个WAXY脱失。分子分析证实，内源性WAXY基因在其中已缺失的这一事件也经历了CRE介导的切除以去除WUS2、ODP2、CRE、Cas9和gRNA表达盒。
在成熟和生根之前减少选择时，PHP98784的转化频率为140％，并且继续选择时为95％，并且在这两种处理中，分别恢复了两个和一个WAXY脱失。所有三个脱失还含有来自PHP98784的整合T-DNA，CRE介导的切除从PHP98784中仅去除了WUS2、ODP2和CRE。应该指出的是，该方案中综合培养步骤的持续时间是：农杆菌属感染-30分钟；共培养-2天；静置培养-一周；选择培养-3周；成熟-2周；和生根-2-3周。此时将T0植物送入温室。这个从农杆菌属感染直到成熟阶段的时间段只有4周2天。这种用于靶向基因组修饰的农杆菌属介导的Cas9递送的展示代表了比由Lowe等人(2016，Plant Cell[植物细胞]28：1998-2015)在文献中报道的随机整合方法快得多的过程。
表25.
Figure BDA0004153398210001741
实例15：粒子枪递送入叶段后恢复的CAS9/CRISPR介导的基因组修饰
CAS9介导的玉蜀黍基因组切割用于将单密码子改变引入玉蜀黍ALS2基因。为了生成ALS2经编辑的等位基因，将794bp的同源物片段(修复模板)克隆到质粒载体中，并测试两个127nt单链DNA寡核苷酸作为修复模板，该寡核苷酸与天然序列相比含有若干核苷酸改变。794bp修复模板包括单个核苷酸改变，其将指导对应于氨基酸位置165处的脯氨酸改变成丝氨酸(P165S)的DNA序列编辑以及ALS-CR4靶位点和PAM序列内的三个另外的改变。修复模板内PAM序列的修饰将甲硫氨酸密码子(AUG)改变为天然存在于ALS1基因中的异亮氨酸(AUU)。使用玉米近交系HC69，来自每个处理的30株幼苗的叶段被两种寡核苷酸或单质粒修复模板(UBI PRO：UBI1ZM INTRON：CAS9：：PINII，POLIII PRO：：ALS-CR4 gRNA、UBI PRO：UBI1ZM INTRON：NPTII-ZS-GREEN：：PINII TERM，3xENH：UBI1ZM PRO：：ZM-ODP2：：PINIITERM和ACTIN PRO：：ZM-WUS2：：PINII TERM)轰击。粒子轰击后，将来自30株幼苗的叶段置于静置培养基上。7天的静置期后，将在滤纸支架上静置的叶段转移到含有150mg/l G418的选择培养基上21天以选择抗生素抗性体细胞胚，并且然后移到成熟培养基(具有选择压力)上2-3周，并且然后移到生根培养基上14-17天(直到根大到足以移植到土壤中)。此时，将在选择培养基上生长的200株(每次处理)随机选择的独立幼苗转移到无菌塑料容器中的新鲜G418培养基，该容器可容纳高度直到6”的植物。将剩余小植株(每次处理约800株)转移至含有100ppm氯磺隆的容器内的固体培养基上作为经编辑的ALS2基因的直接选择。两周后，对随机选择的小植株中的100株小植株和10株从氯磺隆选择存活下来的小植株取样用于分析。在以下12株小植株中检测到经编辑的ALS2等位基因：两个衍生自在G418上生长的随机选择的小植株，并使用794bp修复DNA模板生成，并且其余10株衍生自使用127nt单链寡核苷酸编辑的氯磺隆抗性小植株。对ALS1基因的分析仅揭示了证实ALS-CR4 gRNA的高特异性的野生型序列。
所有12株含有经编辑的ALS2等位基因的植物都被送到温室并取样用于额外的分子分析和后代测试。对ALS2等位基因的DNA序列分析证实存在P165S修饰以及与各自修复模板相关的其他核苷酸改变。分析两株T0植物的T1和T2后代以评估经编辑的ALS2等位基因的遗传性。通过测序分析了衍生自使用来自野生型HC69植物的花粉进行杂交的后代植物，并证明了在亲本植物中观察到的经编辑的等位基因的有性传播预期是1∶1分离比率(分别为57∶56和47∶49)。为了测试经编辑的ALS序列是否赋予除草剂抗性，将选择的具有经编辑的和野生型ALS2等位基因的四周龄的分开的T1植物用四种不同浓度的氯磺隆(50、100(1x)、200和400mg/升)进行喷雾。处理后三周，具有经编辑的等位基因的植物显示正常表型，而仅具有野生型等位基因的植物证明强烈的衰老迹象。此外，从衍生自用野生型HC69花粉授粉的植物的种子中分离出的胚在含有100ppm氯磺隆的培养基上萌发。萌发后十四天，具有经编辑的等位基因的植物显示出正常高度和发育良好的根系，而具有野生型等位基因的植物矮小且不发育根。
在上述实验中，如果ODP2和WUS2表达盒(在两个单独的质粒上)不包含在含有修复模板、Cas9、ALS-CR4 gRNA、和MoPAT-DsRED的质粒中，则在来自30株幼苗的叶段进行粒子轰击并在Pioneer近交系PHH5G中进行双丙氨膦选择后没有事件被恢复。相比之下，当将含有PLTP PRO：：ODP2：：PINII和AXIG1 PRO：：WUS2：：PINII TERM的质粒添加到用于金粒子制备和粒子轰击的质粒混合物中时，含有CAS/CRISPR介导的对ALS基因的基因编辑的事件容易被恢复。在对来自Pioneer近交系PHH5G的30株幼苗的叶段进行粒子轰击后，超过1000个双丙氨膦抗性小植株被恢复，并且其中大于15株被确定含有赋予对除草剂氯嘧磺隆抗性的基因组ALS2基因的编辑。
实例16：同源依赖性重组(HDR)
携带PHP71539(超毒力质粒)和PHP99721(T-DNA质粒)两者的农杆菌属菌株LBA4404 THY-TN-用于叶转化。PHP99721的T-DNA(SEQ ID NO：283)含有组分RB+LOXP+NOS：：WUS2：：IN2TERM+3xENH：：UBI1ZM PRO：：ODP2：：OS-T28 TERM+HSP17.7PRO：：MO-CRE：：PINIITERM+UBI1ZM PRO：：CAS9：：ZM-UBI TERM+ZM-U6 PRO：：gRNA-CHR1-53.66+ZM-ALS PRO：：HRA：：SB-UBI TERM+CHR1-53.66TARGET SITE+HOMOLOGY SEQ1+SI-UBI PRO：：NPTII：：SI-UBI TERM+HOMOLOGY SEQ2+CHR1-53.66TARGET SITE+SB-UBI PRO：：ZS-GREEN1：：OS-UBITERM+LB。
将玉蜀黍近交系PHH5E的种子表面灭菌并轻轻压入固体萌发培养基(90AE＝90O培养基+2mg/l嘧啶醇)，其中胚轴朝上，随后在光照(120μE m-2s-1)下于28℃使用18小时光周期持续14天进行萌发和幼苗生长。在幼苗用于转化的那天早上，允许一半的幼苗保留在28℃(对照处理)，而剩下的一半幼苗被转移到45℃、70％RH的培养箱中3小时(热处理)。然后将所有幼苗用于制备叶外植体用于如下所述的转化。
首先，将幼苗在中胚轴上方切割(从根部去除气生部分)并收获叶轮的前3cm，丢弃剩余的更成熟的叶组织。使用手术刀将3cm长的叶轮纵向一分为二，将两半放入在食品加工机中的100ml农杆菌属悬浮液中(OD＝0.5-0.6，在550nm下测量，其中细菌悬浮在培养基700J+200mM AS+0.02％
Figure BDA0004153398210001771
表面活性剂中)。叶组织以低速(10个脉冲)进行脉冲混合，直到叶段/片段的平均大小在长度/深度上约为0.5mm至3mm。使农杆菌属悬浮液中悬浮的段/组织在室温下在搅拌机碗中停留20分钟，每1-2分钟轻轻旋转一次，这构成了“农杆菌属感染”步骤。感染后，将悬浮液倒入无菌不锈钢筛网，从穿过的液体中捕获叶段/片段用于处理。然后将叶段从筛网转移到三层干燥的Whatman#2滤纸上，滤纸吸走多余的农杆菌属悬浮液(但未洗涤)，使得一层薄薄细菌停留在叶段/片的表面。将叶段/片再次转移到在固体共培养培养基(710N)上静置的单层Whatman滤纸上，并且然后于21℃在黑暗中培养24小时。共培养后，将带有支撑叶段/片的滤纸转移到静置培养基605B上，并于28℃在黑暗中培养一周，此时将滤纸再次转移到选择培养基13266N上，并于28℃在黑暗中培养3周。选择后，将选择板(置于半透明培养箱中，该培养箱通常放置12个板，6叠，每叠2个板)转移到45℃、70％相对湿度的培养箱中2小时，然后取出并将该箱放在25℃工作台上1.5小时以使温度重新平衡至室温。热处理(其激活HSP17.7PRO：：CRE表达用于从T-DNA切除WUS/BBM/CRE)后，将健康的体细胞胚从对向滤纸转移到新鲜的成熟培养基13329B上，并于28℃在黑暗中培养2周，然后将板转移到25℃光照(120μE m-2s-1，18小时光周期)中另外一周。然后将已开始产生芽的健康成熟体细胞胚转移到生根培养基404J上用于在光照下培养另外的203周。然后将小植株转移到温室中的土壤中。当再生的T0植物大到足以取样时，将叶组织打孔用于T-DNA和农杆菌属质粒主干序列的qPCR分析。两个HR连接的PCR分析以及从侧翼内源性1号染色体序列跨越整个序列(已经由同源依赖性修复(SDN3)进行整合)的长PCR分析用于确认靶向整合。
总共进行了9个重复实验，并且对于每个转化实验，使用15-30株幼苗作为每个实验的对照或“热预处理幼苗”处理。对于专门用于基因插入设计的基因编辑，使用了相同的构建体PHP99721。
在农杆菌属感染后3-4天，通过对ZS-GREEN在叶段中的瞬时表达进行评分来评估T-DNA递送的相对效率。分数范围从“0”(在给定处理中没有叶段/片段在其中表达ZS-GREEN)开始，在处理内大约25％、50％、75％或90％-100％的叶段/片分别显示ZS-GREEN表达时，分数为1、2、3、或4。因此，我们使用视觉标记的瞬时表达作为农杆菌属T-DNA递送效率的相对指示。使用此量表，对于所有9个实验，用于对照处理的T-DNA递送分数始终被评为“3”，而对于热处理，分数始终被评为“4”。基于这一观察可以得出结论：在叶分割和农杆菌属感染之前，在45℃、70％RH的培养箱中对幼苗进行热预处理3小时导致提高的T-DNA递送效率。
表25中总结的结果证明，使NOS：：WUS+3xENH：UBI：：ODP2+UBI：：CAS9的组合进行的农杆菌属介导的玉蜀黍幼苗转化在该实验的许多重复中导致高效的HDR频率。在产生T0植物后，收集叶样品用于PCR分析以鉴定具有NPTII基因的基因插入事件。从用于9个已完成转化实验的204株幼苗中，总共产生了1150株T0植物，这给出了563％的总T0转化频率(基于用于转化的幼苗数量)。从1150株T0植物中，使用跨越两个整合连接中的每一个整合连接的PCR和跨越整个整合基因座的长PCR反应确认了32个基因插入事件(均确认正确的相应插入大小)，这产生了2.8％的基因插入频率。对照和“热预处理幼苗”处理均观察到高效的HDR频率。热休克处理使T0群体中的T0转化频率和基因编辑(基因插入)频率加倍，因此热休克处理提高了基因编辑的整体过程效率(参见表25)。
表25.
Figure BDA0004153398210001791
Figure BDA0004153398210001801
实例17：用嘧啶醇的幼苗预处理改善转化
用于农杆菌属介导的玉蜀黍叶段/组织转化的方法遵循如实例4和5中所述。具体而言，将近交系PHH5E的种子表面灭菌并播种到不含嘧啶醇(0mg/l嘧啶醇＝对照培养基90O培养基)、2mg/l嘧啶醇(70AE培养基)或4mg/l嘧啶醇的萌发培养基上。所有重复实验和处理中使用的幼苗的萌发和生长期(在120μmol m-2s-1光照强度下，于28℃使用18小时光周期)为14天。将十四天的幼苗切开并在搅拌机中与携带PHP71539加PHP97334(分别为SEQ IDNO：4和77)的农杆菌属菌株LBA4404 THY-TN-一起加工，以产生用于转化的0.5mm至3mm叶段。如实例4中所述，通过感染、静置、选择、胚成熟和再生阶段培养叶段/片。
对于在三种不同培养基上使用三种单独的幼苗种植执行的该实验的三次重复(总结在表26中)，对照培养基产生了103％的平均转化频率，而在2mg/l或4mg/l嘧啶醇上生长的幼苗导致随后的分别为302％和246％的转化频率。所有三次处理都产生了T0植物，其中整合T-DNA的单拷贝比例相似，0mg/l、2mg/l和4mg/l预处理的范围分别为从57％、至52％、至62％。
表26.
Figure BDA0004153398210001802
Figure BDA0004153398210001811
＊Txn％＝转化频率(％)
＊＊由瞬时ZS-GREEN表达评估的相对T-DNA递送(0＝无至4＝几乎所有胚都表达)
＊＊SC＝整合T-DNA的单拷贝
在三种谷物粳稻(Oryza sativa var Kitaake)、画眉草(埃塞俄比亚画眉草)和珍珠粟(御谷(Pennisetum glaucum))上测试(使用培养基90O加1mg/l或2mg/l嘧啶醇)在种子萌发和幼苗生长期间的2％和1％的嘧啶醇预处理。对于粳稻(Oryza sativa varKitaake)、画眉草(埃塞俄比亚画眉草)和珍珠粟(御谷)中的每一者，在没有额外嘧啶醇的90O培养基上生长的幼苗导致非常细长的幼苗，由于中胚轴上方的叶轮区域稀薄生物量很少。当来自所有三个物种的种子在90O培养基加2mg/l嘧啶醇上萌发和生长时，14天后幼苗仅长到1-2em的高度，并且尽管叶轮区域较厚(由于叶较宽)，但是加工这些小幼苗以产生叶段随后进行转化更加困难。
相比之下，对于所有三种谷类作物，在90O加1mg/l嘧啶醇上的种子萌发和幼苗生长产生了中等生长速率，与对照(无嘧啶醇)相比，茎更粗并且叶更宽。这些轮段容易在食品加工机中加工以产生大小合适的叶段，表现出良好的农杆菌属介导的T-DNA递送(大量瞬时ZS-GREEN表达)，并产生最高数量的转基因T0小植株(与其他两个处理相比)。因此，与玉蜀黍和高粱(在其中，在幼苗生长期间2mg/l嘧啶醇预处理对叶转化是最佳的)相比，较低浓度的1mg/l嘧啶醇导致在粳稻、画眉草和珍珠粟中的最佳结果。
实例18：在农杆菌属感染之前将幼苗暴露于高温改善转化
用于农杆菌属介导的玉蜀黍叶段/组织转化的方法遵循如实例4和5中所述。具体而言，将Pioneer近交系PHH5E的种子表面灭菌并播种在含有2mg/l嘧啶醇的萌发培养基(培养基70AE)上，在120μmol m-2s-1光照强度下于28℃使用18小时光周期持续14天生长期。此时，将幼苗分为两个处理；1)于28℃保持附加的3小时，或2)于45℃孵育3小时，此时所有幼苗在农杆菌属悬浮液存在下进行机械加工，以产生悬浮的叶段/片用于转化。分离幼苗叶轮组织并机械加工以产生0.5mm至3mm的叶段用于如所述使用携带PHP71539加PHP97334(分别为SEQ ID NO：4和77)的农杆菌属菌株LBA4404THY-TN-进行转化。
如表27所示，对照处理导致260％(101％)的平均(+/-标准偏差)转化频率。相比之下，在加工用于转化的叶组织之前将幼苗于45℃预处理3小时，导致559％(85％)的转化频率。使用p＝0.05的置信区间，使用配对学生T检验，这些结果证明与保持在28℃的正常生长室温度的幼苗相比，热预处理产生了显著更高的转化频率。
表27.
Figure BDA0004153398210001821
在一组单独的四个实验中，使PHH5E幼苗于28℃生长两周，并且然后在加工叶组织用于使用PHP71539加PHP97334(分别为SEQ ID NO：4和77)进行的农杆菌属转化之前移入37℃生长室过夜。如表28所示，这些实验产生了315％(82％)的持续高转化频率，其中再生T0植物中的单拷贝频率为54％(8％)。这些结果证明，不同的高温预处理方案也产生了高转化频率。
表28.
Figure BDA0004153398210001831
实例19：农杆菌属感染之前进行生长素预处理改善转化
用于农杆菌属介导的玉蜀黍叶段/组织转化的方法遵循如实例4和5中所述。具体而言，将Pioneer近交系PHH5E的种子表面灭菌并播种在不含生长素的萌发培养基上14天。此时，将幼苗分为四个处理；1)保留在90O培养基(0mg/l 2，4-D＝对照)上，2)转移到90O培养基加3mg/l 2，4-D上，3)转移到90O培养基加10mg/l 2，4-D上，或4)转移到90O培养基加30mg/l 2，4-D mg/l上。将所有幼苗在120μmol m-2s-1光照强度下于28℃使用18小时光周期保持在这些培养基上24小时，此时将所有幼苗在农杆菌属悬浮液存在下机械加工以产生悬浮的叶段/片以用于转化。
分离幼苗叶轮组织并机械加工以产生0.5mm至3mm的叶段用于如所述使用携带PHP71539加PHP97334(分别为SEQ ID NO：4和77)的农杆菌属菌株LBA4404 THY-TN-进行转化。
表29显示在10mg/l 2，4-D上生长的幼苗导致改善的叶转化，如与对照处理相比增加的转化频率(Txn％)和单拷贝T-DNA整合频率所证明的。
表29.
Figure BDA0004153398210001841
＊转化频率＝(T0植物数量/幼苗数量)x100
＊＊无外来农杆菌属序列的单拷贝T-DNA整合
＊＊＊单拷贝频率＝(单拷贝T0植物数量/T0植物数量)x100
实例20：在农杆菌属感染之前使幼苗在增加光谱的光照下萌发和生长改善转化
用于农杆菌属介导的玉蜀黍叶段/组织转化的方法遵循如实例4和5中所述。具体而言，将Pioneer近交系PHH5E的种子表面灭菌并播种在不含生长素的发芽培养基上14天，在120μmol m-2s-1光照强度下于28℃使用18小时光周期生长。虽然光照强度在处理之间保持一致，但在荧光灯(Phillips高性能Alto II，#F32T8/植物)、Valoya LED灯(ValoyaNS12/C65#LE17051487)或RAZR LED灯(Fluence Bioengineering，Inc.[Fluence生物工程公司]#4009716)下生长幼苗的光的质量不同。当比较整个可见光谱的输出时，这些光源之间的差异显而易见。Phillips荧光灯在蓝色范围(400-500nm)中产生了其最宽的峰，其中在光谱的绿色、黄色和红色部分(500-700nm)中有许多尖锐的尖峰和中间的弱照明间隙。相比之下，Razor LED阵列大致在蓝色的中间(约560-570nm)产生了尖锐的峰，其中更宽的峰跨越光谱的绿色部分延伸到红色部分(约530-650nm)内，而Valoya大致在蓝色的中间(约560-570nm)产生了尖锐的峰，其中更宽的峰跨越光谱的绿色和黄色部分(约530-630nm)，在光谱的红色部分(约660-670nm)有肩峰。
将幼苗转移到37℃、50％相对湿度的培养箱中24小时进行机械加工。分离幼苗叶轮组织并机械加工以产生0.5mm至3mm的叶段用于如所述使用携带PHP71539加PHP97334(分别为SEQ ID NO：4和77)的农杆菌属菌株LBA4404 THY-TN-进行转化。
表30显示，相对于在荧光或Valoya LED照明下生长的那些，在不同光谱下生长幼苗导致改善的叶片转化，如在RAZR LED灯下通过增加的转化频率(Txn％)所证明的。
表30.
Figure BDA0004153398210001851
实例21：在充足的阳光下，土壤播种、温室生长的幼苗产生高转化频率
将盆栽土壤或其他合适的基质，比如蛭石在盆中消毒，并将近交系PHH5E的种子播种、萌发，并允许其在预先消毒的温室中生长。两周后收获幼苗并如实例4中所述进行转化。当与在较低光照水平(即80-120uMol m-2s-1)的生长室条件下生长的幼苗相比，在全强度阳光(约2400uMol m-2s-1)下生长的幼苗预计产生更高的转化频率。
遵循如实例4和5中所概述的农杆菌属介导的玉蜀黍叶段/组织转化方法。具体而言，将Pioneer近交系PHH5E的种子表面灭菌并播种在土壤中，并在温室条件下生长21天。由以下收获幼苗叶组织：在土壤水平切割，放入无菌通风橱中，喷洒70％乙醇，并且然后将外面的三片连续叶剥落并去除，在剥下每片叶之间喷洒，并用70％乙醇浸泡的纸巾擦拭。一旦去除外面的叶，就正常制备剩下的内叶轮。将表面灭菌轮生体的底部3cm取下，一分为二，并且然后在农杆菌属悬浮液存在下进行机械加工，以产生悬浮的0.5mm至3mm叶段用于如所述使用携带PHP71539加PHP97334(SEQ ID NO：4和77)的农杆菌属菌株LBA4404 THY-TN-进行转化。当与在生长室中人工照明下生长的幼苗相比时，预计温室中全光谱阳光下的幼苗健康状况最佳。此外，预计在温室中全光谱光照下生长的幼苗将产生表现出改善的T-DNA递送频率、改善的体细胞胚应答(更快的生长和更高的数量)和增加的T0植物产量，以及增加的单拷贝整合频率的叶段。
还预计此类额外处理(比如添加嘧啶醇、2，4-D以及过夜或3小时热处理)将具有累加效应，从而将转化频率推进到甚至更高的水平。
实例22：CORNGRASS1表达
Corngrass1(Cg1)表达改善转化频率并促进分生组织形成和芽形成以及T0植物再生。
使用携带含以下的T-DNA的诱导型农杆菌属菌株LBA4404 TD THY-：i)ZM-MIR156B(Corngrass1)(SEQ ID NO：123)表达盒，ii)热CRE盒，iii)HRA表达盒，和iv)ZS-GREEN表达盒。农杆菌属菌株用于转化从体外生长的不育玉蜀黍叶中切下的叶组织段。通过共培养、静置和成熟进行的农杆菌属方法、转化和培养基进展如上所述。将细菌培养物调整至0.6的OD550用于感染，并将8ml等分到6孔板上的筛杯中。将小叶基部直接放入农杆菌属悬浮液中，感染15分钟，并转移到在710N共培养培养基顶部静置的高压灭菌滤纸上于21℃在黑暗中2-3天。共培养后，将支撑叶段/组织的纸张转移到605B培养基，持续4周静置期，并且每2周进行传代培养。静置期后，将板置于设置于45℃和70％RH的培养箱中2小时，之后将叶段/组织转移到13329B成熟培养基上并于28℃在黑暗中培养2周。然后将成熟培养基上的段/组织移至设置于26℃的光照室1周。将带有小芽的组织/段转移到404J生根培养基上2-3周，直到发育出形成良好的根。预计用含有Corngrass1表达盒的T-DNA进行转化会导致增加的转化频率并再生多个绿色且健康的枝条。用Corngrass1表达盒对叶段/组织进行农杆菌属感染预计产生健康的可育植物，Corngrass1表达盒在其中被切除。
实例23：生长调节因子和融合的表达
玉蜀黍生长调节因子5(GRF5)基因、或玉蜀黍生长调节因子4(GRF4)基因、或玉蜀黍GRF相互作用因子1(ZM-GIF1)基因、或玉蜀黍生长调节因子4(ZM-GRF4)基因与玉蜀黍GRF相互作用因子1(ZM-GIF1)基因之间的融合(ZM-GRF4～GIF1)、或玉蜀黍生长调节因子5(ZM-GRF5)基因与玉蜀黍GRF相互作用因子1(ZM-GIF1)基因之间的融合(ZM-GRF5-GIF1)的表达改善了转基因芽的再生。
使用携带含以下的T-DNA的农杆菌属菌株LBA4404 TD THY-：i)玉蜀黍生长调节因子5(ZM-GRF5)(SEQ ID NO：115)表达盒、或玉蜀黍生长调节因子4(ZM-GRF4)(SEQ ID NO：117)表达盒、或玉蜀黍GRF相互作用因子1(ZM-GIFl)(SEQ ID NO：119)表达盒、或玉蜀黍生长调节因子4(ZM-GRF4)(SEQ ID NO：117)与玉蜀黍GRF相互作用因子1(SEQ ID NO：119)之间的融合(ZM-GRF4～GIF1)(SEQ ID NO：121)表达盒、或玉蜀黍生长调节因子5(ZM-GRF5)(SEQ ID NO：115)与玉蜀黍GRF相互作用因子1(SEQ ID NO：119)之间的融合(ZM-GRF5-GIF1)(SEQ ID NO：140)表达盒，ii)热诱导型CRE盒，iii)HRA表达盒，和iv)ZS-GREEN表达盒。农杆菌属菌株用于转化从体外生长的不育玉蜀黍叶中切下的组织段。通过共培养、静置和成熟进行的农杆菌属方法、转化和培养基进展如上所述。将细菌培养物调整至0.6的OD550用于感染，并将8ml等分到6孔板上的筛杯中。将小叶基部直接放入农杆菌属悬浮液中，感染15分钟，并转移到在710N共培养培养基顶部静置的高压灭菌滤纸上于21℃在黑暗中2-3天。共培养后，将支撑叶段/组织的纸张转移到605B培养基，持续4周静置期，并且每2周进行传代培养。静置期后，将板置于设置于45℃和70％RH的培养箱中2小时，之后将叶段/组织转移到13329B成熟培养基上并于28℃在黑暗中培养2周。然后将成熟培养基上的段/组织移至设置于26℃的光照室1周。将带有小芽的段/组织转移到404J生根培养基上2-3周，直到发育出形成良好的根。预期用含有GRF5表达盒、或GRF4表达盒、或GIF1表达盒、或GRF5-GIF1基因融合表达盒、或GRF4-GIF1基因融合表达盒的T-DNA进行转化导致增加的转化频率并再生多个绿色且健康的芽。用GRF5表达盒或GRF4表达盒、或GIF1表达盒、或GRF5-GIF1基因融合表达盒、或GRF4-GIF1基因融合表达盒对叶段/组织进行农杆菌属感染预计产生健康的可育植物，GRF5表达盒、或GRF4表达盒、或GIF1表达盒、或GRF5-GIF1基因融合表达盒、或GRF4-GIF1基因融合表达盒在其中被切除。
实例24：干细胞诱导因子1(STEMIN1)表达
玉蜀黍干细胞诱导因子1(STEMIN1)基因的表达改善转化频率并促进分生组织形成和芽形成。
使用携带含以下的T-DNA的农杆菌属菌株LBA4404 TD THY，：i)干细胞诱导因子1(ZM-STEMIN1)(SEQ ID NO：124)表达盒，ii)热诱导型CRE盒，iii)HRA表达盒，和iv)ZS-GREEN表达盒。农杆菌属菌株用于转化从体外生长的不育玉蜀黍叶中切下的组织段。通过共培养、静置和成熟进行的农杆菌属方法、转化和培养基进展如上所述。将细菌培养物调整至0.6的OD550用于感染，并将8ml等分到6孔板上的筛杯中。将小叶基部直接放入农杆菌属悬浮液中，感染15分钟，并转移到在710N共培养培养基顶部静置的高压灭菌滤纸上于21℃在黑暗中2-3天。共培养后，将支撑叶段/组织的纸张转移到605B培养基，持续4周静置期，并且每2周进行传代培养。静置期后，将板置于设置于45℃和70％RH的培养箱中2小时，之后将叶段/组织转移到13329B成熟培养基上并于28℃在黑暗中培养2周。然后将成熟培养基上的段/组织移至设置于26℃的光照室1周。将带有小芽的段/组织转移到404J生根培养基上2-3周，直到发育出形成良好的根。预计用含有STEMIN1表达盒的T-DNA进行转化导致增加的转化频率，并再生多个绿色且健康的芽。用STEMIN1表达盒对叶段/组织进行农杆菌属感染预计产生健康的可育植物，STEMIN1表达盒在其中被切除。
实例25：拟南芥REVOLUTA(AT-REV)的玉蜀黍直系同源物的表达
拟南芥REVOLUTA(AT-REV)基因的玉蜀黍直系同源物的表达改善转化频率并促进分生组织形成和芽形成。
使用携带含以下的T-DNA的农杆菌属菌株LBA4404 TD THY-：i)玉蜀黍REVOLUTA(ZM-REV)(SEQ ID NO：125)表达盒，ii)热诱导型CRE盒，iii)HRA表达盒，和iv)ZS-GREEN表达盒。农杆菌属菌株用于转化从体外生长的不育玉蜀黍叶中切下的组织段。通过共培养、静置和成熟进行的农杆菌属方法、转化和培养基进展如上所述。将细菌培养物调整至0.6的OD550用于感染，并将8ml等分到6孔板上的筛杯中。将小叶基部直接放入农杆菌属悬浮液中，感染15分钟，并转移到在710N共培养培养基顶部静置的高压灭菌滤纸上于21℃在黑暗中2-3天。共培养后，将支撑叶段/组织的纸张转移到605B培养基，持续4周静置期，并且每2周进行传代培养。静置期后，将板置于设置于45℃和70％RH的培养箱中2小时，之后将叶段/组织转移到13329B成熟培养基上并于28℃在黑暗中培养2周。然后将成熟培养基上的段/组织移至设置于26℃的光照室1周。将带有小芽的段/组织转移到404J生根培养基上2-3周，直到发育出形成良好的根。预计用含有ZM-REV表达盒的T-DNA进行转化导致增加的转化频率，并再生多个绿色且健康的芽。用ZM-REV表达盒对叶段/组织进行农杆菌属感染预计产生健康的可育植物，ZM-REV表达盒在其中被切除。
实例26：拟南芥芽再生增强子1(AT-ESR1)的玉蜀黍直系同源物的表达
拟南芥芽再生增强子1(AT-ESR1)基因的玉蜀黍直系同源物的表达改善转化频率并促进分生组织形成和芽形成。
使用携带含以下的T-DNA的农杆菌属菌株LBA4404 TD THY-：i)玉蜀黍芽再生增强子1(ZM-ESR1)(SEQ ID NO：126)表达盒，诱导型ii)热CRE盒，iii)HR表达盒，和iv)ZS-GREEN表达盒。农杆菌属菌株用于转化从体外生长的不育玉蜀黍叶中切下的组织段。通过共培养、静置和成熟进行的农杆菌属方法、转化和培养基进展如上所述。将细菌培养物调整至0.6的OD550用于感染，并将8ml等分到6孔板上的筛杯中。将小叶基部直接放入农杆菌属悬浮液中，感染15分钟，并转移到在710N共培养培养基顶部静置的高压灭菌滤纸上于21℃在黑暗中2-3天。共培养后，将支撑叶段/组织的纸张转移到605B培养基，持续4周静置期，并且每2周进行传代培养。静置期后，将板置于设置于45℃和70％RH的培养箱中2小时，之后将叶段/组织转移到13329B成熟培养基上并于28℃在黑暗中培养2周。然后将成熟培养基上的段/组织移至设置于26℃的光照室1周。将带有小芽的段/组织转移到404J生根培养基上2-3周，直到发育出形成良好的根。预计用含有ZM-ESR1表达盒的T-DNA进行转化导致增加的转化频率，并再生多个绿色且健康的芽。用ZM-ESR1表达盒对叶段/组织进行农杆菌属感染预计产生健康的可育植物，ZM-ESR1表达盒在其中被切除。
实例27：拟南芥横向抑制因子(AT-LAS)的玉蜀黍直系同源物的表达
拟南芥横向抑制因子(AT-LAS)基因的玉蜀黍直系同源物的表达改善转化频率并促进分生组织形成和芽形成。
使用携带含以下的T-DNA的诱导型农杆菌属菌株LBA4404 TD THY-：i)玉蜀黍横向抑制因子(ZM-LAS)(SEQ ID NO：127)表达盒，ii)热CRE盒，iii)HRA表达盒，和iv)ZS-GREEN表达盒。农杆菌属菌株用于转化从体外生长的不育玉蜀黍叶中切下的组织段。通过共培养、静置和成熟进行的农杆菌属方法、转化和培养基进展如上所述。将细菌培养物调整至0.6的OD550用于感染，并将8ml等分到6孔板上的筛杯中。将小叶基部直接放入农杆菌属悬浮液中，感染15分钟，并转移到在710N共培养培养基顶部静置的高压灭菌滤纸上于21℃在黑暗中2-3天。共培养后，将支撑叶段/组织的纸张转移到605B培养基，持续4周静置期，并且每2周进行传代培养。静置期后，将板置于设置于45℃和70％RH的培养箱中2小时，之后将叶段/组织转移到13329B成熟培养基上并于28℃在黑暗中培养2周。然后将成熟培养基上的段/组织移至设置于26℃的光照室1周。将带有小芽的段/组织转移到404J生根培养基上2-3周，直到发育出形成良好的根。预计用含有ZM-LAS表达盒的T-DNA进行转化导致增加的转化频率，并再生多个绿色且健康的芽。用ZM-LAS表达盒对叶段/组织进行农杆菌属感染预计产生健康的可育植物，ZM-LAS表达盒在其中被切除。
实例28：拟南芥杯状子叶(AT-CUC)的玉蜀黍直系同源物的表达
拟南芥杯状子叶(AT-CUC)基因的玉蜀黍直系同源物的表达改善转化频率并促进分生组织形成和芽形成。
使用携带含以下的T-DNA的农杆菌属菌株LBA4404 TD THY-：i)玉蜀黍杯状子叶3(ZM-CUC3)(SEQ ID NO：128)表达盒、或玉蜀黍杯状子叶1(ZM-CUC1)(SEQ ID：135)表达盒、或玉蜀黍杯状子叶2(ZM-CUC2)(SEQ ID：142)表达盒，ii)热诱导型CRE盒，iii)HRA表达盒，和iv)ZS-GREEN表达盒。农杆菌属菌株用于转化从体外生长的不育玉蜀黍叶中切下的组织段。通过共培养、静置和成熟进行的农杆菌属方法、转化和培养基进展如上所述。将细菌培养物调整至0.6的OD550用于感染，并将8ml等分到6孔板上的筛杯中。将小叶基部直接放入农杆菌属悬浮液中，感染15分钟，并转移到在710N共培养培养基顶部静置的高压灭菌滤纸上于21℃在黑暗中2-3天。共培养后，将支撑叶段/组织的纸张转移到605B培养基，持续4周静置期，并且每2周进行传代培养。静置期后，将板置于设置于45℃和70％RH的培养箱中2小时，之后将叶段/组织转移到13329B成熟培养基上并于28℃在黑暗中培养2周。然后将成熟培养基上的段/组织移至设置于26℃的光照室1周。将带有小芽的段/组织转移到404J生根培养基上2-3周，直到发育出形成良好的根。预计用含有ZM-CUC3表达盒、或ZM-CUC1表达盒、或ZM-CUC2表达盒的T-DNA进行转化导致增加的转化频率并再生多个绿色且健康的芽。用ZM-CUC3表达盒、或ZM-CUC1表达盒、或ZM-CUC2表达盒对叶段/组织进行农杆菌属感染预计产生健康的可育植物，ZM-CUC3表达盒、或ZM-CUC1表达盒、或ZM-CUC2表达盒在其中被切除。
实例29：拟南芥SUPERSHOOT1(AT-SPS1)的玉蜀黍直系同源物的下调
拟南芥Supershoot 1(AT-SPS1)基因的玉蜀黍直系同源物的下调改善转化频率并促进分生组织形成和芽形成。
使用携带含以下的T-DNA的农杆菌属菌株LBA4404 TD THY-：i)靶向玉蜀黍Supershoot 1基因(ZM-SPS1)(SEQ ID NO：129)的转录物的mRNA(ZM-MIR-SPS1)(SEQ IDNO：132)表达盒，ii)热诱导型CRE盒，iii)HRA表达盒，和iv)ZS-GREEN表达盒。农杆菌属菌株用于转化从体外生长的不育玉蜀黍叶中切下的组织段。通过共培养、静置和成熟进行的农杆菌属方法、转化和培养基进展如上所述。将细菌培养物调整至0.6的OD550用于感染，并将8ml等分到6孔板上的筛杯中。将小叶基部直接放入农杆菌属悬浮液中，感染15分钟，并转移到在710N共培养培养基顶部静置的高压灭菌滤纸上于21℃在黑暗中2-3天。共培养后，将支撑叶段/组织的纸张转移到605B培养基，持续4周静置期，并且每2周进行传代培养。静置期后，将板置于设置于45℃和70％RH的培养箱中2小时，之后将叶段/组织转移到13329B成熟培养基上并于28℃在黑暗中培养2周。然后将成熟培养基上的段/组织移至设置于26℃的光照室1周。将带有小芽的段/组织转移到404J生根培养基上2-3周，直到发育出形成良好的根。预计用含有ZM-MIR-SPS1表达盒的T-DNA进行转化导致增加的转化频率，并再生多个绿色且健康的芽。用ZM-MIR-SPS1表达盒对叶段/组织进行农杆菌属感染预计产生健康的可育植物，ZM-MIR-SPS1表达盒在其中被切除。
实例30：拟南芥拟南芥更多腋生生长1(AT-MAX1)的玉蜀黍直系同源物的下调
拟南芥更多腋生生长1(AT-MAX1)基因的玉蜀黍直系同源物的下调改善转化频率并促进分生组织形成和芽形成。
使用携带含以下的T-DNA的诱导型农杆菌属菌株LBA4404 TD THY-：i)靶向玉蜀黍更多腋生生长1基因(ZMMAX1)(SEQ ID NO：130)的转录物的mRNA(ZM-MIR-MAX1)(SEQ IDNO：133)表达盒，ii)热CRE盒，iii)HRA表达盒，和iv)ZS-GREEN表达盒。农杆菌属菌株用于转化从体外生长的不育玉蜀黍叶中切下的组织段。通过共培养、静置和成熟进行的农杆菌属方法、转化和培养基进展如上所述。将细菌培养物调整至0.6的OD550用于感染，并将8ml等分到6孔板上的筛杯中。将小叶基部直接放入农杆菌属悬浮液中，感染15分钟，并转移到在710N共培养培养基顶部静置的高压灭菌滤纸上于21℃在黑暗中2-3天。共培养后，将支撑叶段/组织的纸张转移到605B培养基，持续4周静置期，并且每2周进行传代培养。静置期后，将板置于设置于45℃和70％RH的培养箱中2小时，之后将叶段/组织转移到13329B成熟培养基上并于28℃在黑暗中培养2周。然后将成熟培养基上的段/组织移至设置于26℃的光照室1周。将带有小芽的段/组织转移到404J生根培养基上2-3周，直到发育出形成良好的根。预计用含有ZM-MIR-MAX1表达盒的T-DNA进行转化导致增加的转化频率，并再生多个绿色且健康的芽。用ZM-MIR-MAX1表达盒对叶段/组织进行农杆菌属感染预计产生健康的可育植物，ZM-MIR-MAX1表达盒在其中被切除。
实例31：拟南芥拟南芥更多腋生生长4(AT-MAX4)的玉蜀黍直系同源物的下调
拟南芥更多腋生生长4(AT-MAX4)基因的玉蜀黍直系同源物的下调改善转化频率并促进分生组织形成和芽形成。
使用携带含以下的T-DNA的诱导型农杆菌属菌株LBA4404 TD THY-：i)靶向玉蜀黍更多腋生生长4基因(ZMMAX4)(SEQ ID NO：131)的转录物的mRNA(ZM-MIR-MAX4)(SEQ IDNO：134)表达盒，ii)热CRE盒，iii)HRA表达盒，和iv)ZS-GREEN表达盒。农杆菌属菌株用于转化从体外生长的不育玉蜀黍叶中切下的组织段。通过共培养、静置和成熟进行的农杆菌属方法、转化和培养基进展如上所述。将细菌培养物调整至0.6的OD550用于感染，并将8ml等分到6孔板上的筛杯中。将小叶基部直接放入农杆菌属悬浮液中，感染15分钟，并转移到在710N共培养培养基顶部静置的高压灭菌滤纸上于21℃在黑暗中2-3天。共培养后，将支撑叶段/组织的纸张转移到605B培养基，持续4周静置期，并且每2周进行传代培养。静置期后，将板置于设置于45℃和70％RH的培养箱中2小时，之后将叶段/组织转移到13329B成熟培养基上并于28℃在黑暗中培养2周。然后将成熟培养基上的段/组织移至设置于26℃的光照室1周。将带有小芽的段/组织转移到404J生根培养基上2-3周，直到发育出形成良好的根。预计用含有ZM-MIR-MAX4表达盒的T-DNA进行转化导致增加的转化频率，并再生多个绿色且健康的芽。用ZM-MIR-MAX4表达盒对叶段/组织进行农杆菌属感染预计产生健康的可育植物，ZM-MIR-MAX4表达盒在其中被切除。
实例32：使用不同启动子、WUS、ODP2和BBM基因进行离子轰击的玉蜀黍的叶转化
如前所述对玉蜀黍叶外植体进行粒子轰击。用于WUS和ODP2(BBM)的单独质粒被一起轰击以递送表31中所述的测试组合。存在具有调节WUS和ODP2的不同启动子的质粒，以及具有来自不同单子叶植物物种的WUS和ODP2基因的质粒。此外，还存在具有来自不同植物物种的BBM2基因的质粒。在轰击后，将外植体置于静置培养基上10天，并对体细胞胚(SE)的形成进行评分。对SE应答相对于组合NOS：：WUS+3XENH-UBI：：ODP2所见的应答进行评分，该组合的应答设置为100％。应答从0至5排序如下。0：0-15％(无至非常低的SE应答)；1：15％-25％(低SE应答)；2：25％-50％(中等SE应答)；3：50％-80％(中等偏高的SE应答)；4：80％-100％(高SE应答)；5：＞100％(高产SE应答)。
表31.
Figure BDA0004153398210001951
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Figure BDA0004153398210001961
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Figure BDA0004153398210001971
上表31中总结的结果证明，驱动WUS2或BBM表达的多种启动子，以及多种WUS2和/或BBM同源物(和BBM2同源物)对于刺激玉蜀黍叶细胞中高于NOS：WUS+UBI：BBM组合所示水平的快速体细胞胚形成(任一分数均为3和以上)是有效的。应该注意的是，使用粒子轰击用于该测定提供了额外的生长应答刺激，这仅仅是因为粒子轰击的人工性质递送了各质粒的许多拷贝，人为地将生长应答升高到高于农杆菌属转化期间通常看到的生长应答(与粒子轰击递送的更高滴度相比，引入的T-DNA的拷贝数通常低。由于该测定中这种一致升高的表达，NOS：WUS+UBI：BBM组合产生了非常低水平的快速体细胞胚——在农杆菌属递送后未观察到的应答(通常没有快速体细胞胚)。尽管如此，表31中总结的测定证明许多组合刺激了高于NOS：WUS+UBI：BBM对照的水平的快速体细胞胚形成。
实例33：由含调节这些基因的不同启动子的质粒转化的叶段/组织中的WUS和ODP2的转录水平
如前述实例所述制备玉蜀黍叶外植体并通过含有表32中所列质粒的农杆菌属转化并置于静置培养基上。感染后7天对转化的叶外植体进行取样，并由定量逆转录PCR(qRT-PCR)分析WUS2和ODP2转录物的水平。将转录物水平标准化为来自非转化野生型组织的天然WUS2和ODP2转录物，以生成相对的WUS和ODP转录物水平。分析了用于每个构建体的五个重复。
表32.
Figure BDA0004153398210001981
＊显著不同于PHP97978中的WUS2水平
＊＊显著不同于PHP97978中的ODP2水平
表32中的数据报告为两种基因的平均相对转录物水平±STD(表达)。表达定义为由表达盒产生的单独WUS2或ODP2 mRNA转录物水平，该表达盒具有分别驱动转基因WUS2或ODP2编码序列表达的特异性启动子。组合表达定义为转基因细胞中用于WUS2和ODP2的表达(平均相对转录物水平±STD)。TXN应答测定分数如表17中所定义。导致愈伤组织应答的NOS：WUS2+UBI：ODP2基因组合具有1的测定分数。使用该构建体(PHP97978；SEQ ID NO：284)的WUS2和ODP2转录物水平产生胚性愈伤组织。对于PHP97334(SEQ ID NO：77；NOS：WUS2+3XENH-UBI：ODP2)，与NOS：WUS+UBI：ODP2相比，WUS2和ODP2转录物水平均显著增加(P＜0.05)，并导致早期体细胞胚形成而无需首先形成胚性愈伤组织(测定分数为4)。类似地，PHP96277(SEQ ID NO：67；ACTIN：WUS2+3XENH-UBI：ODP2)显示出显著更高的WUS2和ODP2转录物水平并且TXN应答测定分数为4，而PHP95385(SEQ ID NO：47；ACTIN：WUS2+UBI：ODP2)显示出与PHP97978相比显著更高的WUS2转录物水平但相似的ODP2转录物水平，并且具有3的测定分数(一些早期体细胞胚快速生长)。相比之下，PHP100011(SEQ ID NO：269；NOS：WUS2+3XENH-RPL1：ODP2)具有与PHP97978的ODP2相比显著较低的转录物水平，并且具有1的测定分数(无早期体细胞胚，仅胚性愈伤组织)，而PHP100057(SEQ ID NO：273；NOS：WUS2+3XENH-EF1A：ODP2)具有与PHP97978相似的WUS2和ODP2转录物水平，并且也具有1的测定分数(无早期体细胞胚，仅胚性愈伤组织)。
实例34：衍生自单倍体幼苗的叶段的转化生成具有单倍体和二倍体混合物的转基因事件
A.体外单倍体胚拯救以产生幼苗衍生的靶组织
单倍体胚如US 8,859,846 B2中所述生成，该专利通过引用以其全文并入本文，其中在该实例34中进行以下修改：使用近交系代替F1杂种作为花粉受体，并且用于胚拯救/萌发的培养基不含秋水仙碱或任何其他染色体加倍剂。通过流式细胞术辅助观察胚组织中的颜色表达来执行从二倍体胚中鉴定单倍体胚。发现单倍体诱导率在不同实验组间无显著差异，并且范围从17％至20％。
B.使用单倍体幼苗衍生的叶段进行转化
遵循如实例5中所述使用携带PHP71539加PHP97334(分别为SEQ ID NO：4和77)的农杆菌属菌株LBA4404 THY-TN-进行农杆菌属介导的玉蜀黍转化程序用于该实例34中的单倍体幼苗衍生的叶片段，这包括农杆菌属制备、单倍体叶段的接种、共培养、静置、选择和再生。整体转化效率因实验而异，平均为42％，范围从最高的100％至最低的12.5％。与二倍体成熟种子萌发的幼苗相比，转化的单倍体叶段萌发的幼苗生长较慢且较细，并且总体转化效率低于从来自二倍体幼苗的叶段的转化效率。来自同一组材料的幼苗质量一致。然而，实验单倍体-2材料的质量由于生长室内的光照条件变化而受到损害，并且那些光照条件变化反映在转化效率下降至(19％)，这大大低于(42％)的平均转化效率。实验单倍体-4由于意外延长的热休克处理而受到负面影响，以致于导致愈伤组织受损以及T0植物的恢复和再生差(8)。参见表34。
表34.
Figure BDA0004153398210002001
＊BBF＝无主干
如表35中所示，衍生自衍生自单倍体幼苗的单倍体叶段转化的转基因事件展示出高百分比的二倍体T0植物。具体而言，从总共122株再生的T0植物(表34)，对来自4个代表性实验(实验单倍体-1、单倍体-3、单倍体-5和单倍体-6)的102株T0植物进行取样以使用流式细胞术进行倍性确认。实验单倍体-2和实验单倍体-4由于如上所述实验异常而被排除在该分析之外。表35中显示的结果证明了从衍生自单倍体幼苗的单倍体叶段生成的转基因T0植物中的高自发加倍的频率。从转化的单倍体叶段再生的转基因T0植物的倍性已经经历了染色体加倍(没有暴露于化学加倍剂)，其中几乎一半的转基因T0植物是二倍体(平均48.1％，范围从34.8％到55.9％)。
表35.
Figure BDA0004153398210002011
实例35：使用氯气用于种子灭菌
将近交系PHH5E种子放置在密封室内的单层中，该密封室包括紧挨着室顶部内的旋塞阀下方的含有100ml家用漂白剂(8.25％(w/v)次氯酸钠)的储器。使用玻璃移液管以通过打开的阀门-1向反应容器缓慢加入3.5ml的12N HCL，并立即关闭阀门-1，这密封了含有种子的室。当两种溶液接触时，氯气从反应储器中释放出来。室保持关闭以允许灭菌以进行过夜(16hrs至18hrs)。然后打开两个阀门，在将排出的空气释放到化学流通风橱之前，打开阀门-2以允许氯气流出含有种子的室并进入含有150ml0.5M NaOH(其捕获氯气)的第二个洗涤室。打开含有种子的室中的另一个阀门-3允许新鲜空气流入腔室，从而允许氯气排出并由新鲜空气替代。以这种方式，在打开室以移除种子之前，将室用氯气吹扫1.5小时至2小时。
将气体灭菌的种子在90AE固体培养基上在(120μE m-2s-1)光照下使用18小时光周期于25℃萌发。在萌发培养基上14天后，评估萌发的种子的百分比和表现出微生物污染(真菌或细菌)的百分比。结果在表36中示出。我们的标准水性灭菌方法(如上所述)也在同一批种子上执行作为对照(在表36中标记为“稀释漂白剂”)。
表36.
Figure BDA0004153398210002021
如果在放置在本实验中使用的高蔗糖萌发培养基之前未灭菌，则用于该实验的这批PHH5E近交系种子通常会导致100％污染。如表36所示，氯气灭菌降低了40％至70％的污染率，并且萌发频率相对于对照处理(水性稀释漂白剂灭菌)在相似的范围内。注意到水性漂白灭菌方法是仔细优化参数(浓度、时间、温度等)的结果，因此预计气体灭菌方案中的参数的优化将产生类似的高效结果。
实例36：单独用ZM-ODP2转化玉蜀黍叶段
A.使用3xENH：UBI1ZM PRO
构建含有以下T-DNA的质粒：RB+LOXP+FMV ENH：：PSCV ENH：：MMV ENH：：UBI1ZMPRO：：ZM-ODP2+HSP17.7PRO：：CRE+LOXP+SB-UBI：：ZS-GREEN+SI-UBI：：NPTII+LB(PHV00001，SEQ ID NO：341)，其中3xENH：UBI1ZM PRO导致ZM-ODP2的表达水平显著高于当单独使用UBI1ZM PRO时的表达水平。
当使用含PHP71539(SEQ ID NO：4)和第二质粒PHV00001(SEQ ID NO：341)的农杆菌属菌株LBA4404 TD THY-来转化玉蜀黍近交系PH85E叶段时，预计强烈表达的ZM-ODP2将导致快速体细胞胚形成并且将刺激T0植物生成。
还预计使用其他病毒或植物增强子序列，或添加到ZM-UBI启动子的EME序列(比如WO 2018/183878中公开的那些，其通过引用以其全文并入本文)，或用其他强启动子替代ZM-UBI(例如来自其他物种的同源启动子)连同增强子或EME将产生类似的结果：高水平的ZM-ODP2表达、快速的体细胞胚形成和T0植物生成。
B.使用双组分反式激活体系
构建含有以下T-DNA的质粒：RB+LOXP+ZM-GOS2PRO：：SB-UBI INTRON1：：MO-LEXA：MO-CBF1A+6xREC：MIN35SPRO：OMEGA 5UTR：：ZM-ODP2+HSP17.7PRO：：CRE+LOXP+SB-UBI：：ZS-GREEN+SI-UBI：：NPTII+LB(PHV00003，SEQ ID NO：343)，其中双组分反式激活系统导致ZM-ODP2表达水平显著高于当使用UBI1ZM PRO：：ODP2时的表达水平。
当使用含PHP71539(SEQ ID NO：4)和第二质粒PHV0003(SEQ ID NO：343)的农杆菌属菌株LBA4404 TD THY-来转化玉蜀黍近交系PH85E叶段时，预计强表达的ZM-ODP2将导致快速体细胞胚形成并且将刺激T0植物生成。
还预计对双组分反式激活体系的组分进行修改(比如(但不限于)i)用更强的启动子，比如ZM-ACTIN PRO代替ZM-GOS2，ii)用新的激活结构域代替CBF1A，iii)改变融合到DNA结合结构域的激活结构域的数量，和iv)改变LEXA结合序列(REC)的数量)都可以用于进一步提高ZM-ODP2的表达。还预计用dCAS-α10代替LEXA并使用靶向内源性ZM-ODP2启动子序列的gRNA序列可以刺激ODP2活性，并且因此促进来自转化的叶细胞的快速体细胞胚。
实例37：单独用ZM-WUS2转化玉蜀黍叶段
A.使用3xENH：UBI1ZM PRO
构建含有以下T-DNA的质粒：RB+LOXP+FMV ENH：：PSCV ENH：：MMV ENH：：UBI1ZMPRO：：ZM-WUS2+HSP17.7PRO：：CRE+LOXP+SB-UBI：：ZS-GREEN+SI-UBI：：NPTII+LB(PHV00002，SEQ ID NO：342)，其中3xENH：UBI1ZM PRO导致ZM-WUS2的表达水平显著高于当使用UBI1ZMPRO：：WUS2时的表达水平。
当使用含PHP71539(SEQ ID NO：4)和第二质粒PHV00002(SEQ ID NO：342)的农杆菌属菌株LBA4404 TD THY-来转化玉蜀黍近交系PH85E叶段时，预计强表达的ZM-WUS2将导致刺激快速体细胞胚形成时，将刺激T0植物生成。
还预期使用其他病毒或植物增强子序列，或添加到ZM-UBI启动子的EME序列，或用其他强启动子替换ZM-UBI(例如来自其他物种的同源启动子)连同增强子或EME将产生相似的结果：高水平的ZM-WUS2表达、快速的体细胞胚形成和T0植物生成。
B.使用双组分反式激活体系
构建含有以下T-DNA的质粒：RB+LOXP+ZM-GOS2PRO：：SB-UBI INTRON1：：MO-LEXA：MO-CBF1A+6xREC：MIN35SPRO：OMEGA 5UTR：：ZM-WUS2+HSP17.7PRO：：CRE+LOXP+SB-UBI：：ZS-GREEN+SI-UBI：：NPTII+LB(PHV00004，SEQ ID NO：344)，其中双组分反式激活系统导致ZM-WUS2表达水平显著高于当使用UBI1ZM PRO：：WUS2时的表达水平。
当使用含PHP71539(SEQ ID NO：4)和第二质粒PHV0004(SEQ ID NO：344)的农杆菌属菌株LBA4404 TD THY-来转化玉蜀黍近交系PH85E叶段时，预计强表达的ZM-WUS2将导致快速体细胞胚形成并且将刺激T0植物生成。
还预计对双组分反式激活体系的组分进行修改(比如(但不限于)i)用更强的启动子比如ZM-ACTIN PRO代替ZM-GOS2，ii)用新的激活结构域代替CBF1A，iii)改变与DNA结合结构域融合的激活结构域的数量，和iv)改变LEXA结合序列(REC)的数量)都可以用来进一步提高ZM-WUS2的表达。还预计用dCAS-α10代替LEXA并使用靶向内源性ZM-WUS2启动子序列的gRNA序列可以刺激WUS2活性，并且因此促进来自转化叶细胞的快速体细胞胚。
还预计对双组分反式激活体系的组分进行修改(比如(但不限于)i)用更强的启动子比如ZM-ACTIN PRO代替ZM-GOS2，ii)用新的激活结构域代替CBF1A，iii)改变与DNA结合结构域融合的激活结构域的数量，和iv)改变LEXA结合序列(REC)的数量)都可以用来进一步提高ZM-WUS2的表达。还预计用dCAS-α10代替LEXA并使用靶向内源性ZM-WUS2启动子序列的gRNA序列可以刺激WUS2活性，并且因此促进来自转化叶细胞的快速体细胞胚。
如本文所使用的，单数形式“一种(a)”、“一种(an)”以及“该(the)”包括复数个指示物，除非上下文中另外明确指明。因此，例如，提及“细胞”包括多个这样的细胞，并且提及“蛋白质”包括本领域技术人员已知的一种或多种蛋白质及其等效物，等等。本文所用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义，除非另有明确说明。
本说明书中提到的所有专利、出版物和专利申请指示了本公开所属领域技术人员的水平。将所有专利、出版物和专利申请通过引用以其全文并入本文，其程度就像明确且个别指出通过引用将每一篇个别专利、出版物或专利申请以其全文并入一样。
虽然为了清楚理解的目的，已经通过说明和实例的方式对前述公开进行了详细描述，但是在所附权利要求的范围内可以实施某些改变和修改。

Claims (126)

1.一种产生含有异源多核苷酸的转基因单子叶植物的方法，所述方法包括：
使单子叶植物叶外植体与异源多核苷酸表达盒和形态发生基因表达盒接触，其中所述形态发生基因表达盒包含编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列和编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽或WUS/WOX和BBM或ODP2多肽的功能同源物的核苷酸序列，其中所述编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列和所述编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽或WUS/WOX和BBM或ODP2多肽的功能同源物的核苷酸序列的组合表达在强度和持续时间上足够，使得所述单子叶植物叶外植体在所述接触的约八周或更短时间内、或约6周或更短时间内、或约4周或更短时间内、或约十天至约十四天内形成含有所述异源多核苷酸表达盒的可再生植物结构；以及
从含有所述异源多核苷酸表达盒的所述可再生植物结构再生转基因单子叶植物。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述单子叶植物叶外植体是单倍体单子叶植物叶外植体。
3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述异源多核苷酸表达盒和所述形态发生基因表达盒通过由根瘤菌(Rhizobia)细菌物种转化或粒子轰击的方法引入。
4.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述异源多核苷酸表达盒和所述形态发生基因表达盒通过电穿孔、PEG转染、或RNP(核糖核蛋白)递送的方法引入。
5.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列和所述编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽或WUS/WOX和BBM或ODP2多肽的功能同源物的核苷酸序列的组合表达大于所述形态发生基因表达盒的表达，所述形态发生基因表达盒包含可操作地连接到具有SEQ ID NO：290的农杆菌属(Agrobacterium)-NOS启动子的编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列，和可操作地连接到具有SEQ ID NO：339的泛素(UBI)启动子的编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列。
6.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述单子叶植物叶外植体衍生自幼苗而不是直接衍生自胚或种子或未经修饰的胚组织。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述单子叶植物叶外植体衍生自约8-20天龄、约12-18天龄、约10-20天龄、约14-16天龄、约16-18天龄、或约14-18天龄的幼苗。
8.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中编码所述功能性WUS/WOX多肽的所述核苷酸序列选自WUS、WUS1、WUS2、WUS3、WOX2A、WOX4、WOX5A和WOX9，并且其中编码所述Babyboom(BBM)多肽的所述核苷酸序列选自BBM、BBM1、BBM2、BBM3、BMN2、和BMN3，或者所述胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽是ODP2。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述异源多核苷酸表达盒包含选自由以下组成的组的异源多核苷酸：
赋予营养增强的异源多核苷酸、赋予改进的油含量的异源多核苷酸、赋予改进的蛋白质含量的异源多核苷酸、赋予改进的代谢物含量的异源多核苷酸、赋予增加的产量的异源多核苷酸、赋予非生物胁迫耐受性的异源多核苷酸、赋予耐旱性的异源多核苷酸、赋予耐寒性的异源多核苷酸、赋予除草剂耐受性的异源多核苷酸、赋予有害生物抗性的异源多核苷酸、赋予病原体抗性的异源多核苷酸、赋予昆虫抗性的异源多核苷酸、赋予氮利用效率(NUE)的异源多核苷酸、赋予疾病抗性的异源多核苷酸、赋予增加的生物量的异源多核苷酸、赋予改变代谢途径的能力的异源多核苷酸、以及前述的组合。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述叶外植体选自由以下组成的组：叶、根生叶、茎生叶、互生叶、对生叶、十字型对出叶、对生重叠叶、轮生叶、有柄叶、无柄叶、近无柄叶、有托叶、无托叶、单叶、复叶、叶原基、叶鞘、叶基、叶的紧邻其与叶柄或茎的附着点的一部分、芽，包括但不限于侧芽、以及前述的组合。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述单子叶植物选自由以下组成的组：柳枝稷(Panicum virgatum)(柳枝稷草)、双色高粱(Sorghum bicolor)(高粱、苏丹草)、巨芒(Miscanthus giganteus)(芒草)、甘蔗属物种(Saccharum sp.)(能源甘蔗)、玉蜀黍(Zeamays)(玉米)、普通小麦(Triticum aestivum)(小麦)、水稻(Oryza sativa)(稻)、御谷(Pennisetum glaucum)(珍珠粟)、黍属物种(Panicum spp.)、高粱属物种(Sorghum spp.)、芒属物种(Miscanthus spp.)、甘蔗属物种(Saccharum spp.)、和斑茅属物种(Erianthusspp.)。
12.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述单子叶植物选自禾本科。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述单子叶植物选自禾本科亚科，所述禾本科亚科选自虎尾草亚科(Chloridoideae)、黍亚科(Panicoideae)、稻亚科(Oryzoideae)、和早熟禾亚科(Pooideae)。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述选自禾本科亚科虎尾草亚科的单子叶植物是埃塞俄比亚画眉草(Eragrostis tef.)。
15.如权利要求13所述的方法，其中所述选自禾本科亚科黍亚科的单子叶植物选自玉蜀黍、双色高粱、御谷、和柳枝稷。
16.如权利要求13所述的方法，其中所述选自禾本科亚科稻亚科的单子叶植物是水稻。
17.如权利要求13所述的方法，其中所述选自禾本科亚科早熟禾亚科的单子叶植物选自大麦(Hordeum vulgare)、黑麦(Secale cereal)、和普通小麦。
18.如权利要求1-5中任一项所述的方法，
其中所述功能性WUS/WOX多肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、或212；或其中所述功能性WUS/WOX多肽由选自以下的核苷酸序列编码：SEQ ID NO：143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、或211，并且
其中所述Babyboom(BBM)多肽或所述胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：214、216、219、221、223、225、227、229、或231；或其中所述Babyboom(BBM)多肽或所述胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽由选自以下的核苷酸序列编码：SEQ ID NO：213、215、217、218、220、222、224、226、228、230、或232。
19.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述形态发生基因表达盒进一步包含选自以下的多核苷酸：ZM-MIR-Corngrass1核苷酸、ZM-GRF5核苷酸、ZM-GRF4核苷酸、ZM-GIF1核苷酸、ZM-GRF4～GIF1核苷酸、ZM-STEMIN1核苷酸、ZM-REV核苷酸、ZM-ESR1核苷酸、ZM-LAS核苷酸、ZM-CUC1核苷酸、ZM-CUC2核苷酸、ZM-CUC3核苷酸、ZM-RLD1核苷酸、ZM-KN1核苷酸、ZM-CYCD2核苷酸、ZM-GPCNAC-1核苷酸、ZM-MIR156B核苷酸、ZM-LECl核苷酸、AT-RKD4核苷酸、AT-LEC2核苷酸、AT-RAP2.6L核苷酸、ZM-MIR-SPS1核苷酸、ZM-MIR-MAX1核苷酸、或ZM-MIR-MAX4核苷酸。
20.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述形态发生基因表达盒进一步包含编码位点特异性重组酶的多核苷酸序列，所述位点特异性重组酶选自由以下组成的组：FLP、FLPe、KD、Cre、SSV1、λInt、phiC31Int、HK022、R、B2、B3、Gin、Tn1721、CinH、ParA、Tn5053、Bxb1、TP907-1、或U153，其中所述位点特异性重组酶可操作地连接到组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子、或受发育调控的启动子。
21.如权利要求20所述的方法，所述方法进一步包括切除所述形态发生基因表达盒以提供所述含有异源多核苷酸的转基因单子叶植物。
22.如权利要求1或权利要求2所述的方法，所述方法进一步包括远离所述形态发生基因表达盒育种。
23.由如权利要求21或权利要求22所述的方法产生的转基因植物，其中所述植物包含所述异源多核苷酸。
24.一种如权利要求21或权利要求22所述的转基因植物的种子，其中所述种子包含所述异源多核苷酸。
25.一种衍生自转基因单子叶植物叶外植体的可再生植物结构，所述单子叶植物叶外植体包含异源多核苷酸表达盒和形态发生基因表达盒，其中所述形态发生基因表达盒包含编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列和编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽或WUS/WOX和BBM或ODP2多肽的功能同源物的核苷酸序列，其中所述编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列和所述编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽或WUS/WOX和BBM或ODP2多肽的功能同源物的核苷酸序列的组合表达在强度和持续时间上足够，使得所述单子叶植物叶外植体在所述单子叶植物叶外植体接收所述异源多核苷酸表达盒和所述形态发生基因表达盒的约八周或更短时间内、或约6周或更短时间内、或约4周或更短时间内、或约十天至约十四天内形成含有所述异源多核苷酸表达盒的可再生植物结构。
26.如权利要求25所述的可再生植物结构，其中所述单子叶植物叶外植体是单倍体单子叶植物叶外植体。
27.如权利要求25或权利要求26所述的可再生植物结构，其中编码所述功能性WUS/WOX多肽的所述核苷酸序列选自WUS、WUS1、WUS2、WUS3、WOX2A、WOX4、WOX5A和WOX9，并且其中编码所述Babyboom(BBM)多肽的所述核苷酸序列选自BBM、BBM1、BBM2、BBM3、BMN2、和BMN3，或者所述胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽是ODP2。
28.如权利要求25或权利要求26所述的可再生植物结构，其中所述异源多核苷酸表达盒和所述形态发生基因表达盒通过由根瘤菌细菌物种转化或粒子轰击的方法引入。
29.如权利要求25或权利要求26所述的可再生植物结构，其中所述异源多核苷酸表达盒和所述形态发生基因表达盒通过电穿孔、PEG转染、或RNP(核糖核蛋白)递送的方法引入。
30.如权利要求25-29中任一项所述的可再生植物结构，其中所述异源多核苷酸表达盒包含选自由以下组成的组的异源多核苷酸：
赋予营养增强的异源多核苷酸、赋予改进的油含量的异源多核苷酸、赋予改进的蛋白质含量的异源多核苷酸、赋予改进的代谢物含量的异源多核苷酸、赋予增加的产量的异源多核苷酸、赋予非生物胁迫耐受性的异源多核苷酸、赋予耐旱性的异源多核苷酸、赋予耐寒性的异源多核苷酸、赋予除草剂耐受性的异源多核苷酸、赋予有害生物抗性的异源多核苷酸、赋予病原体抗性的异源多核苷酸、赋予昆虫抗性的异源多核苷酸、赋予氮利用效率(NUE)的异源多核苷酸、赋予疾病抗性的异源多核苷酸、赋予增加的生物量的异源多核苷酸、赋予改变代谢途径的能力的异源多核苷酸、以及前述的组合。
31.如权利要求25-30中任一项所述的可再生植物结构，其中所述叶外植体选自由以下组成的组：叶、根生叶、茎生叶、互生叶、对生叶、十字型对出叶、对生重叠叶、轮生叶、有柄叶、无柄叶、近无柄叶、有托叶、无托叶、单叶、复叶、叶原基、叶鞘、叶基、叶的紧邻其与叶柄或茎的附着点的一部分、芽，包括但不限于侧芽、以及前述的组合。
32.如权利要求25-31中任一项所述的可再生植物结构，其中所述单子叶植物选自由以下组成的组：柳枝稷(柳枝稷草)、双色高粱(高粱、苏丹草)、巨芒(芒草)、甘蔗属物种(能源甘蔗)、玉蜀黍(玉米)、普通小麦(小麦)、水稻(稻)、御谷(珍珠粟)、黍属物种、高粱属物种、芒属物种、甘蔗属物种、和斑茅属物种。
33.如权利要求25-31中任一项所述的可再生植物结构，其中所述单子叶植物选自禾本科。
34.如权利要求33所述的可再生植物结构，其中所述单子叶植物选自禾本科亚科，所述禾本科亚科选自虎尾草亚科、黍亚科、稻亚科、和早熟禾亚科。
35.如权利要求34所述的可再生植物结构，其中所述选自禾本科亚科虎尾草亚科的单子叶植物是埃塞俄比亚画眉草。
36.如权利要求34所述的可再生植物结构，其中所述来自禾本科亚科黍亚科的单子叶植物选自玉蜀黍、双色高粱、御谷、和柳枝稷。
37.如权利要求34所述的可再生植物结构，其中所述来自禾本科亚科稻亚科的单子叶植物是水稻。
38.如权利要求34所述的可再生植物结构，其中所述来自禾本科亚科早熟禾亚科的单子叶植物选自大麦、黑麦、和普通小麦。
39.如权利要求25-27中任一项所述的可再生植物结构，
其中所述功能性WUS/WOX多肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、或212；或其中所述功能性WUS/WOX多肽由选自以下的核苷酸序列编码：SEQ ID NO：143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、1 93、195、197、199、201、203、205、207、209、或211，并且
其中所述Babyboom(BBM)多肽或所述胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：214、216、219、221、223、225、227、229、或231；或其中所述Babyboom(BBM)多肽或所述胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽由选自以下的核苷酸序列编码：SEQ ID NO：213、215、217、218、220、222、224、226、228、230、或232。
40.如权利要求25-27中任一项所述的可再生植物结构，其中所述形态发生基因表达盒进一步包含选自以下的多核苷酸：ZM-MIR-Corngrassl核苷酸、ZM-GRF5核苷酸、ZM-GRF4核苷酸、ZM-GIF1核苷酸、ZM-GRF4～GIF1核苷酸、ZM-STEMIN1核苷酸、ZM-REV核苷酸、ZM-ESR1核苷酸、ZM-LAS核苷酸、ZM-CUCl核苷酸、ZM-CUC2核苷酸、ZM-CUC3核苷酸、ZM-RLD1核苷酸、ZM-KN1核苷酸、ZM-CYCD2核苷酸、ZM-GPCNAC-1核苷酸、ZM-MIR156B核苷酸、ZM-LEC1核苷酸、AT-RKD4核苷酸、AT-LEC2核苷酸、AT-RAP2.6L核苷酸、ZM-MIR-SPS1核苷酸、ZM-MIR-MAX1核苷酸、或ZM-MIR-MAX4核苷酸。
41.如权利要求25或权利要求26所述的可再生植物结构，其中所述形态发生基因表达盒进一步包含编码位点特异性重组酶的多核苷酸序列，所述位点特异性重组酶选自由以下组成的组：FLP、FLPe、KD、Cre、SSV1、λInt、phi C31 Int、HK022、R、B2、B3、Gin、Tn1721、CinH、ParA、Tn5053、Bxb1、TP907-1、或U153，其中所述位点特异性重组酶可操作地连接到组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子、或受发育调控的启动子。
42.如权利要求41所述的方法，所述方法进一步包括切除所述形态发生基因表达盒以提供所述含有异源多核苷酸的转基因单子叶植物。
43.一种可育转基因单子叶植物，所述可育转基因单子叶植物从如权利要求25所述的可再生植物结构产生。
44.如权利要求43所述的可育转基因单子叶植物，其中所述单子叶植物不包含所述形态发生基因表达盒。
45.多个单子叶植物种子，所述多个单子叶植物种子从如权利要求43或权利要求44所述的转基因单子叶植物产生。
46.一种产生含有异源多核苷酸的转基因单子叶植物的方法，所述方法包括：
使单子叶植物叶外植体与异源多核苷酸表达盒和形态发生基因表达盒接触，其中所述形态发生基因表达盒包含编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列和编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽或WUS/WOX和BBM或ODP2多肽的功能同源物的核苷酸序列，其中所述编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列和所述编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列的组合表达大于所述形态发生基因表达盒的组合表达，所述形态发生基因表达盒包含所述可操作地连接到具有SEQ ID NO：290的农杆菌属-NOS启动子的编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列，和所述可操作地连接到具有SEQ ID NO：339的泛素(UBI)启动子的编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列；
选择含有所述异源多核苷酸表达盒的单子叶植物叶外植体，其中所述单子叶植物叶外植体在所述接触的约八周或更短时间内、或约6周或更短时间内、或约4周或更短时间内、或约十天至约十四天内形成含有所述异源多核苷酸表达盒的可再生植物结构；以及
从含有所述异源多核苷酸表达盒的所述可再生植物结构再生转基因单子叶植物。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述单子叶植物叶外植体是单倍体单子叶植物叶外植体。
48.如权利要求46或权利要求47所述的方法，其中编码所述功能性WUS/WOX多肽的所述核苷酸序列选自WUS、WUS1、WUS2、WUS3、WOX2A、WOX4、WOX5A和WOX9，并且其中编码所述Babyboom(BBM)多肽的所述核苷酸序列选自BBM、BBM1、BBM2、BBM3、BMN2、和BMN3，或者所述胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽是ODP2。
49.如权利要求46或权利要求47所述的方法，其中所述异源多核苷酸表达盒和所述形态发生基因表达盒通过由根瘤菌细菌物种转化或粒子轰击的方法引入。
50.如权利要求46或权利要求47所述的方法，其中所述异源多核苷酸表达盒和所述形态发生基因表达盒通过电穿孔、PEG转染、或RNP(核糖核蛋白)递送的方法引入。
51.如权利要求46-50中任一项所述的方法，其中所述异源多核苷酸表达盒包含选自由以下组成的组的异源多核苷酸：
赋予营养增强的异源多核苷酸、赋予改进的油含量的异源多核苷酸、赋予改进的蛋白质含量的异源多核苷酸、赋予改进的代谢物含量的异源多核苷酸、赋予增加的产量的异源多核苷酸、赋予非生物胁迫耐受性的异源多核苷酸、赋予耐旱性的异源多核苷酸、赋予耐寒性的异源多核苷酸、赋予除草剂耐受性的异源多核苷酸、赋予有害生物抗性的异源多核苷酸、赋予病原体抗性的异源多核苷酸、赋予昆虫抗性的异源多核苷酸、赋予氮利用效率(NUE)的异源多核苷酸、赋予疾病抗性的异源多核苷酸、赋予增加的生物量的异源多核苷酸、赋予改变代谢途径的能力的异源多核苷酸、以及前述的组合。
52.如权利要求46-51中任一项所述的方法，其中所述叶外植体选自由以下组成的组：叶、根生叶、茎生叶、互生叶、对生叶、十字型对出叶、对生重叠叶、轮生叶、有柄叶、无柄叶、近无柄叶、有托叶、无托叶、单叶、复叶、叶原基、叶鞘、叶基、叶的紧邻其与叶柄或茎的附着点的一部分、芽，包括但不限于侧芽、以及前述的组合。
53.如权利要求46-52中任一项所述的方法，其中所述单子叶植物选自由以下组成的组：柳枝稷(柳枝稷草)、双色高粱(高粱、苏丹草)、巨芒(芒草)、甘蔗属物种(能源甘蔗)、玉蜀黍(玉米)、普通小麦(小麦)、水稻(稻)、御谷(珍珠粟)、黍属物种、高粱属物种、芒属物种、甘蔗属物种、和斑茅属物种。
54.如权利要求46-52中任一项所述的方法，其中所述单子叶植物选自禾本科。
55.如权利要求54所述的方法，其中所述单子叶植物选自禾本科亚科，所述禾本科亚科选自虎尾草亚科、黍亚科、稻亚科、和早熟禾亚科。
56.如权利要求55所述的方法，其中所述选自禾本科亚科虎尾草亚科的单子叶植物是埃塞俄比亚画眉草。
57.如权利要求55所述的方法，其中所述来自禾本科亚科黍亚科的单子叶植物选自玉蜀黍、双色高粱、御谷、和柳枝稷。
58.如权利要求55所述的方法，其中所述来自禾本科亚科稻亚科的单子叶植物是水稻。
59.如权利要求55所述的方法，其中所述来自禾本科亚科早熟禾亚科的单子叶植物选自大麦、黑麦、和普通小麦。
60.如权利要求46-48中任一项所述的方法，
其中所述功能性WUS/WOX多肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、或212；或其中所述功能性WUS/WOX多肽由选自以下的核苷酸序列编码：SEQ ID NO：143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、1 69、1 71、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、或211，并且
其中所述Babyboom(BBM)多肽或所述胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：214、216、219、221、223、225、227、229、或231；或其中所述Babyboom(BBM)多肽或所述胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽由选自以下的核苷酸序列编码：SEQ ID NO：213、215、217、218、220、222、224、226、228、230、或232。
61.如权利要求46-48中任一项所述的方法，其中所述形态发生基因表达盒进一步包含选自以下的多核苷酸：ZM-MIR-Corngrass1核苷酸、ZM-GRF5核苷酸、ZM-GRF4核苷酸、ZM-GIF1核苷酸、ZM-GRF4～GIF1核苷酸、ZM-STEMIN1核苷酸、ZM-REV核苷酸、ZM-ESR1核苷酸、ZM-LAS核苷酸、ZM-CUC1核苷酸、ZM-CUC2核苷酸、ZM-CUC3核苷酸、ZM-RLD1核苷酸、ZM-KN1核苷酸、ZM-CYCD2核苷酸、ZM-GPCNAC-1核苷酸、ZM-MIR156B核苷酸、ZM-LEC1核苷酸、AT-RKD4核苷酸、AT-LEC2核苷酸、AT-RAP2.6L核苷酸、ZM-MIR-SPS1核苷酸、ZM-MIR-MAX1核苷酸、或ZM-MIR-MAX4核苷酸。
62.如权利要求46或权利要求47所述的方法，其中所述形态发生基因表达盒进一步包含编码位点特异性重组酶的多核苷酸序列，所述位点特异性重组酶选自由以下组成的组：FLP、FLPe、KD、Cre、SSV1、λInt、phi C31 Int、HK022、R、B2、B3、Gin、Tn1721、CinH、ParA、Tn5053、Bxb1、TP907-1、或U153，其中所述位点特异性重组酶可操作地连接到组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子、或受发育调控的启动子。
63.如权利要求62所述的方法，所述方法进一步包括切除所述形态发生基因表达盒以提供所述含有异源多核苷酸的转基因单子叶植物。
64.如权利要求46或权利要求47所述的方法，所述方法进一步包括远离所述形态发生基因表达盒育种。
65.由如权利要求63或权利要求64所述的方法产生的转基因植物，其中所述植物包含所述异源多核苷酸。
66.一种如权利要求63或权利要求64所述的转基因植物的种子，其中所述种子包含所述异源多核苷酸。
67.一种产生含有异源多核苷酸的转基因玉蜀黍植物的方法，所述方法包括：
使玉蜀黍叶外植体与异源多核苷酸表达盒和形态发生基因表达盒接触，其中所述形态发生基因表达盒包含编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列和编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽或WUS/WOX和BBM或ODP2多肽的功能同源物的核苷酸序列，其中所述编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列和所述编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽或WUS/WOX和BBM或ODP2多肽的功能同源物的核苷酸序列的组合表达在强度和持续时间上足够，使得所述玉蜀黍叶外植体在所述接触的约八周或更短时间内、或约6周或更短时间内、或约4周或更短时间内、或约十天至约十四天内形成含有所述异源多核苷酸表达盒的可再生植物结构；以及
从含有所述异源多核苷酸表达盒的所述可再生植物结构再生转基因玉蜀黍植物。
68.如权利要求67所述的方法，其中所述玉蜀黍叶外植体是单倍体玉蜀黍叶外植体。
69.如权利要求67或权利要求68所述的方法，其中所述异源多核苷酸表达盒和所述形态发生基因表达盒通过由根瘤菌细菌物种转化或粒子轰击的方法引入。
70.如权利要求67或权利要求68所述的方法，其中所述异源多核苷酸表达盒和所述形态发生基因表达盒通过电穿孔、PEG转染、或RNP(核糖核蛋白)递送的方法引入。
71.如权利要求67或权利要求68所述的方法，其中所述编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列和所述编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽或WUS/WOX和BBM或ODP2多肽的功能同源物的核苷酸序列的组合表达大于所述形态发生基因表达盒的表达，所述形态发生基因表达盒包含所述可操作地连接到具有SEQ ID NO：290的农杆菌属-NOS启动子的编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列，和所述可操作地连接到具有SEQ ID NO：339的泛素(UBI)启动子的编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列。
72.如权利要求67或权利要求68所述的方法，其中所述玉蜀黍叶外植体衍生自幼苗而不是直接衍生自胚或种子或未经修饰的胚组织。
73.如权利要求72所述的方法，其中所述玉蜀黍叶外植体衍生自约8-20天龄、约12-18天龄、约10-20天龄、约14-16天龄、约16-18天龄、或约14-18天龄的幼苗。
74.如权利要求67或权利要求68所述的方法，其中编码所述功能性WUS/WOX多肽的所述核苷酸序列选自WUS、WUS1、WUS2、WUS3、WOX2A、WOX4、WOX5A和WOX9，并且其中编码所述Babyboom(BBM)多肽的所述核苷酸序列选自BBM、BBM1、BBM2、BBM3、BMN2、和BMN3，或者所述胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽是ODP2。
75.如权利要求67-74中任一项所述的方法，其中所述异源多核苷酸表达盒包含选自由以下组成的组的异源多核苷酸：
赋予营养增强的异源多核苷酸、赋予改进的油含量的异源多核苷酸、赋予改进的蛋白质含量的异源多核苷酸、赋予改进的代谢物含量的异源多核苷酸、赋予增加的产量的异源多核苷酸、赋予非生物胁迫耐受性的异源多核苷酸、赋予耐旱性的异源多核苷酸、赋予耐寒性的异源多核苷酸、赋予除草剂耐受性的异源多核苷酸、赋予有害生物抗性的异源多核苷酸、赋予病原体抗性的异源多核苷酸、赋予昆虫抗性的异源多核苷酸、赋予氮利用效率(NUE)的异源多核苷酸、赋予疾病抗性的异源多核苷酸、赋予增加的生物量的异源多核苷酸、赋予改变代谢途径的能力的异源多核苷酸、以及前述的组合。
76.如权利要求67-75中任一项所述的方法，其中所述叶外植体选自由以下组成的组：叶、根生叶、茎生叶、互生叶、对生叶、十字型对出叶、对生重叠叶、轮生叶、有柄叶、无柄叶、近无柄叶、有托叶、无托叶、单叶、复叶、叶原基、叶鞘、叶基、叶的紧邻其与叶柄或茎的附着点的一部分、芽，包括但不限于侧芽、以及前述的组合。
77.如权利要求67-71中任一项所述的方法，
其中所述功能性WUS/WOX多肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、或212；或其中所述功能性WUS/WOX多肽由选自以下的核苷酸序列编码：SEQ ID NO：143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、或211，并且
其中所述Babyboom(BBM)多肽或所述胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：214、216、219、221、223、225、227、229、或231；或其中所述Babyboom(BBM)多肽或所述胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽由选自以下的核苷酸序列编码：SEQ ID NO：213、215、217、218、220、222、224、226、228、230、或232。
78.如权利要求67-71中任一项所述的方法，其中所述形态发生基因表达盒进一步包含选自以下的多核苷酸：ZM-MIR-Corngrass1核苷酸、ZM-GRF5核苷酸、ZM-GRF4核苷酸、ZM-GIF1核苷酸、ZM-GRF4～GIF1核苷酸、ZM-STEMIN1核苷酸、ZM-REV核苷酸、ZM-ESR1核苷酸、ZM-LAS核苷酸、ZM-CUC1核苷酸、ZM-CUC2核苷酸、ZM-CUC3核苷酸、ZM-RLD1核苷酸、ZM-KN1核苷酸、ZM-CYCD2核苷酸、ZM-GPCNAC-1核苷酸、ZM-MIR156B核苷酸、ZM-LEC1核苷酸、AT-RKD4核苷酸、AT-LEC2核苷酸、AT-RAP2.6L核苷酸、ZM-MIR-SPS1核苷酸、ZM-MIR-MAX1核苷酸、或ZM-MIR-MAX4核苷酸。
79.如权利要求67或权利要求68所述的方法，其中所述形态发生基因表达盒进一步包含编码位点特异性重组酶的多核苷酸序列，所述位点特异性重组酶选自由以下组成的组：FLP、FLPe、KD、Cre、SSV1、λInt、phiC31 Int、HK022、R、B2、B3、Gin、Tn1721、CinH、ParA、Tn5053、Bxb1、TP907-1、或U153，其中所述位点特异性重组酶可操作地连接到组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子、或受发育调控的启动子。
80.如权利要求79所述的方法，所述方法进一步包括切除所述形态发生基因表达盒以提供所述含有异源多核苷酸的转基因玉蜀黍植物。
81.如权利要求67或权利要求68所述的方法，所述方法进一步包括远离所述形态发生基因表达盒育种。
82.由如权利要求80或权利要求81所述的方法产生的转基因植物，其中所述植物包含所述异源多核苷酸。
83.一种如权利要求80或权利要求81所述的转基因植物的种子，其中所述种子包含所述异源多核苷酸。
84.一种衍生自转基因玉蜀黍叶外植体的可再生植物结构，所述玉蜀黍叶外植体包含异源多核苷酸表达盒和形态发生基因表达盒，其中所述形态发生基因表达盒包含编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列和编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽或WUS/WOX和BBM或ODP2多肽的功能同源物的核苷酸序列，其中所述编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列和所述编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽或WUS/WOX和BBM或ODP2多肽的功能同源物的核苷酸序列的组合表达在强度和持续时间上足够，使得所述玉蜀黍叶外植体在所述玉蜀黍叶外植体接收所述异源多核苷酸表达盒和所述形态发生基因表达盒的约八周或更短时间内、或约6周或更短时间内、或约4周或更短时间内、或约十天至约十四天内形成含有所述异源多核苷酸表达盒的可再生植物结构。
85.如权利要求84所述的可再生植物结构，其中所述玉蜀黍叶外植体是单倍体玉蜀黍叶外植体。
86.如权利要求84或权利要求85所述的可再生植物结构，其中编码所述功能性WUS/WOX多肽的所述核苷酸序列选自WUS、WUS1、WUS2、WUS3、WOX2A、WOX4、WOX5A和WOX9，并且其中编码所述Babyboom(BBM)多肽的所述核苷酸序列选自BBM、BBM1、BBM2、BBM3、BMN2、和BMN3，或者所述胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽是ODP2。
87.如权利要求84或权利要求85所述的可再生植物结构，其中所述异源多核苷酸表达盒和所述形态发生基因表达盒通过由根瘤菌细菌物种转化或粒子轰击的方法引入。
88.如权利要求84或权利要求85所述的可再生植物结构，其中所述异源多核苷酸表达盒和所述形态发生基因表达盒通过电穿孔、PEG转染、或RNP(核糖核蛋白)递送的方法引入。
89.如权利要求84-88中任一项所述的可再生植物结构，其中所述异源多核苷酸表达盒包含选自由以下组成的组的异源多核苷酸：
赋予营养增强的异源多核苷酸、赋予改进的油含量的异源多核苷酸、赋予改进的蛋白质含量的异源多核苷酸、赋予改进的代谢物含量的异源多核苷酸、赋予增加的产量的异源多核苷酸、赋予非生物胁迫耐受性的异源多核苷酸、赋予耐旱性的异源多核苷酸、赋予耐寒性的异源多核苷酸、赋予除草剂耐受性的异源多核苷酸、赋予有害生物抗性的异源多核苷酸、赋予病原体抗性的异源多核苷酸、赋予昆虫抗性的异源多核苷酸、赋予氮利用效率(NUE)的异源多核苷酸、赋予疾病抗性的异源多核苷酸、赋予增加的生物量的异源多核苷酸、赋予改变代谢途径的能力的异源多核苷酸、以及前述的组合。
90.如权利要求84-89中任一项所述的可再生植物结构，其中所述叶外植体选自由以下组成的组：叶、根生叶、茎生叶、互生叶、对生叶、十字型对出叶、对生重叠叶、轮生叶、有柄叶、无柄叶、近无柄叶、有托叶、无托叶、单叶、复叶、叶原基、叶鞘、叶基、叶的紧邻其与叶柄或茎的附着点的一部分、芽，包括但不限于侧芽、以及前述的组合。
91.如权利要求84-86中任一项所述的可再生植物结构，
其中所述功能性WUS/WOX多肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、或212；或其中所述功能性WUS/WOX多肽由选自以下的核苷酸序列编码：SEQ ID NO：143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、或211，并且
其中所述Babyboom(BBM)多肽或所述胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：214、216、219、221、223、225、227、229、或231；或其中所述Babyboom(BBM)多肽或所述胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽由选自以下的核苷酸序列编码：SEQ ID NO：213、215、217、218、220、222、224、226、228、230、或232。
92.如权利要求84-86中任一项所述的可再生植物结构，其中所述形态发生基因表达盒进一步包含选自以下的多核苷酸：ZM-MIR-Corngrass1核苷酸、ZM-GRF5核苷酸、ZM-GRF4核苷酸、ZM-GIF1核苷酸、ZM-GRF4～GIF1核苷酸、ZM-STEMIN1核苷酸、ZM-REV核苷酸、ZM-ESR1核苷酸、ZM-LAS核苷酸、ZM-CUC1核苷酸、ZM-CUC2核苷酸、ZM-CUC3核苷酸、ZM-RLD1核苷酸、ZM-KNl核苷酸、ZM-CYCD2核苷酸、ZM-GPCNAC-1核苷酸、ZM-MIR156B核苷酸、ZM-LEC1核苷酸、AT-RKD4核苷酸、AT-LEC2核苷酸、AT-RAP2.6L核苷酸、ZM-MIR-SPS1核苷酸、ZM-MIR-MAX1核苷酸、或ZM-MIR-MAX4核苷酸。
93.如权利要求84或权利要求85所述的可再生植物结构，其中所述形态发生基因表达盒进一步包含编码位点特异性重组酶的多核苷酸序列，所述位点特异性重组酶选自由以下组成的组：FLP、FLPe、KD、Cre、SSVl、λInt、phi C31 Int、HK022、R、B2、B3、Gin、Tn1721、CinH、ParA、Tn5053、Bxb1、TP907-1、或U153，其中所述位点特异性重组酶可操作地连接到组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子、或受发育调控的启动子。
94.如权利要求93所述的方法，所述方法进一步包括切除所述形态发生基因表达盒以提供所述含有异源多核苷酸的转基因玉蜀黍植物。
95.一种可育转基因玉蜀黍植物，所述可育转基因玉蜀黍植物从如权利要求84所述的可再生植物结构产生。
96.如权利要求95所述的可育转基因玉蜀黍植物，其中所述玉蜀黍植物不包含所述形态发生基因表达盒。
97.多个玉蜀黍种子，所述多个玉蜀黍种子从如权利要求95或权利要求96所述的转基因玉蜀黍植物产生。
98.一种产生含有异源多核苷酸的转基因玉蜀黍植物的方法，所述方法包括：
使玉蜀黍叶外植体与异源多核苷酸表达盒和形态发生基因表达盒接触，其中所述形态发生基因表达盒包含编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列和编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽或WUS/WOX和BBM或ODP2多肽的功能同源物的核苷酸序列，其中所述编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列和所述编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列的组合表达大于所述形态发生基因表达盒的组合表达，所述形态发生基因表达盒包含所述可操作地连接到具有SEQ ID NO：290的农杆菌属-NOS启动子的编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列，和所述可操作地连接到具有SEQ ID NO：339的泛素(UBI)启动子的编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列；
选择含有所述异源多核苷酸表达盒的玉蜀黍叶外植体，其中所述玉蜀黍叶外植体在所述接触的约八周或更短时间内、或约6周或更短时间内、或约4周或更短时间内、或约十天至约十四天内形成含有所述异源多核苷酸表达盒的可再生植物结构；以及
从含有所述异源多核苷酸表达盒的所述可再生植物结构再生转基因玉蜀黍植物。
99.如权利要求98所述的方法，其中所述玉蜀黍叶外植体是单倍体玉蜀黍叶外植体。
100.如权利要求98或权利要求99所述的方法，其中编码所述功能性WUS/WOX多肽的所述核苷酸序列选自WUS、WUS1、WUS2、WUS3、WOX2A、WOX4、WOX5A和WOX9，并且其中编码所述Babyboom(BBM)多肽的所述核苷酸序列选自BBM、BBM1、BBM2、BBM3、BMN2、和BMN3，或者所述胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽是ODP2。
101.如权利要求98或权利要求99所述的方法，其中所述异源多核苷酸表达盒和所述形态发生基因表达盒通过由根瘤菌细菌物种转化或粒子轰击的方法引入。
102.如权利要求98或权利要求99所述的方法，其中所述异源多核苷酸表达盒和所述形态发生基因表达盒通过电穿孔、PEG转染、或RNP(核糖核蛋白)递送的方法引入。
103.如权利要求98-102中任一项所述的方法，其中所述异源多核苷酸表达盒包含选自由以下组成的组的异源多核苷酸：
赋予营养增强的异源多核苷酸、赋予改进的油含量的异源多核苷酸、赋予改进的蛋白质含量的异源多核苷酸、赋予改进的代谢物含量的异源多核苷酸、赋予增加的产量的异源多核苷酸、赋予非生物胁迫耐受性的异源多核苷酸、赋予耐旱性的异源多核苷酸、赋予耐寒性的异源多核苷酸、赋予除草剂耐受性的异源多核苷酸、赋予有害生物抗性的异源多核苷酸、赋予病原体抗性的异源多核苷酸、赋予昆虫抗性的异源多核苷酸、赋予氮利用效率(NUE)的异源多核苷酸、赋予疾病抗性的异源多核苷酸、赋予增加的生物量的异源多核苷酸、赋予改变代谢途径的能力的异源多核苷酸、以及前述的组合。
104.如权利要求98-103中任一项所述的方法，其中所述叶外植体选自由以下组成的组：叶、根生叶、茎生叶、互生叶、对生叶、十字型对出叶、对生重叠叶、轮生叶、有柄叶、无柄叶、近无柄叶、有托叶、无托叶、单叶、复叶、叶原基、叶鞘、叶基、叶的紧邻其与叶柄或茎的附着点的一部分、芽，包括但不限于侧芽、以及前述的组合。
105.如权利要求98-100中任一项所述的方法，
其中所述功能性WUS/WOX多肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、或212；或其中所述功能性WUS/WOX多肽由选自以下的核苷酸序列编码：SEQ ID NO：143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、或211，并且
其中所述Babyboom(BBM)多肽或所述胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：214、216、219、221、223、225、227、229、或231；或其中所述Babyboom(BBM)多肽或所述胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽由选自以下的核苷酸序列编码：SEQ ID NO：213、215、217、218、220、222、224、226、228、230、或232。
106.如权利要求98-100中任一项所述的方法，其中所述形态发生基因表达盒进一步包含选自以下的多核苷酸：ZM-MIR-Corngrass1核苷酸、ZM-GRF5核苷酸、ZM-GRF4核苷酸、ZM-GIF1核苷酸、ZM-GRF4～GIF1核苷酸、ZM-STEMIN1核苷酸、ZM-REV核苷酸、ZM-ESR1核苷酸、ZM-LAS核苷酸、ZM-CUC1核苷酸、ZM-CUC2核苷酸、ZM-CUC3核苷酸、ZM-RLD1核苷酸、ZM-KN1核苷酸、ZM-CYCD2核苷酸、ZM-GPCNAC-1核苷酸、ZM-MIR156B核苷酸、ZM-LEC1核苷酸、AT-RKD4核苷酸、AT-LEC2核苷酸、AT-RAP2.6L核苷酸、ZM-MIR-SPS1核苷酸、ZM-MIR-MAX1核苷酸、或ZM-MIR-MAX4核苷酸。
107.如权利要求98或权利要求99所述的方法，其中所述形态发生基因表达盒进一步包含编码位点特异性重组酶的多核苷酸序列，所述位点特异性重组酶选自由以下组成的组：FLP、FLPe、KD、Cre、SSV1、λInt、phi C31 Int、HK022、R、B2、B3、Gin、Tn1721、CinH、ParA、Tn5053、Bxb1、TP907-1、或U153，其中所述位点特异性重组酶可操作地连接到组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子、或受发育调控的启动子。
108.如权利要求107所述的方法，所述方法进一步包括切除所述形态发生基因表达盒以提供所述含有异源多核苷酸的转基因玉蜀黍植物。
109.如权利要求98或权利要求99所述的方法，所述方法进一步包括远离所述形态发生基因表达盒育种。
110.由如权利要求108或权利要求109所述的方法产生的转基因植物，其中所述植物包含所述异源多核苷酸。
111.一种如权利要求108或权利要求109所述的转基因植物的种子，其中所述种子包含所述异源多核苷酸。
112.一种产生经基因组编辑的玉蜀黍植物的方法，所述方法包括：
使玉蜀黍叶外植体与形态发生基因表达盒接触，其中所述形态发生基因表达盒包含编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列和编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽或WUS/WOX和BBM或ODP2多肽的功能同源物的核苷酸序列，其中所述编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列和所述编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽或WUS/WOX和BBM或ODP2多肽的所述功能同源物的核苷酸序列的组合表达大于所述形态发生基因表达盒的表达，所述形态发生基因表达盒包含所述可操作地连接到具有SEQ ID NO：290的农杆菌属-NOS启动子的编码功能性WUS/WOX多肽的核苷酸序列，和所述可操作地连接到具有SEQID NO：339的泛素(UBI)启动子的编码Babyboom(BBM)多肽或胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽的核苷酸序列；
提供编码位点特异性多肽或位点特异性核酸酶的多核苷酸；
选择含有基因组编辑的玉蜀黍叶外植体，其中所述玉蜀黍叶外植体在所述接触的约八周或更短时间内、或约6周或更短时间内、或约4周或更短时间内、或约十天至约十四天内形成含有所述基因组编辑的可再生植物结构；以及
从含有所述基因组编辑的所述可再生植物结构再生经基因组编辑的植物。
113.如权利要求112所述的方法，其中所述玉蜀黍叶外植体是单倍体玉蜀黍叶外植体。
114.如权利要求112或113所述的方法，其中编码所述功能性WUS/WOX多肽的所述核苷酸序列选自WUS、WUS1、WUS2、WUS3、WOX2A、WOX4、WOX5A和WOX9，并且其中编码所述Babyboom(BBM)多肽的所述核苷酸序列选自BBM、BBM1、BBM2、BBM3、BMN2、和BMN3，或者所述胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽是ODP2。
115.如权利要求112或113所述的方法，其中所述位点特异性多肽或位点特异性核酸酶选自由以下组成的组：锌指核酸酶、大范围核酸酶、转座酶、TALEN和CRISPR-Cas核酸酶。
116.如权利要求115所述的方法，其中所述CRISPR-Cas核酸酶是Cas9、Cpf1或Cas12f1核酸酶并且进一步包括提供指导RNA。
117.如权利要求112、115或116中任一项所述的方法，其中所述位点特异性多肽或所述位点特异性核酸酶实现插入、缺失或取代突变。
118.如权利要求116所述的方法，其中所述指导RNA和CRISPR-Cas核酸酶是核糖核蛋白复合物。
119.如权利要求112-118中任一项所述的方法，其中所述叶外植体选自由以下组成的组：叶、根生叶、茎生叶、互生叶、对生叶、十字型对出叶、对生重叠叶、轮生叶、有柄叶、无柄叶、近无柄叶、有托叶、无托叶、单叶、复叶、叶原基、叶鞘、叶基、叶的紧邻其与叶柄或茎的附着点的一部分、芽，包括但不限于侧芽、以及前述的组合。
120.如权利要求112-114中任一项所述的方法，
其中所述功能性WUS/WOX多肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：144、146、148、150、152、154、156、158、160、162、164、166、168、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、或212；或其中所述功能性WUS/WOX多肽由选自以下的核苷酸序列编码：SEQ ID NO：143、145、147、149、151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、或211，并且
其中所述Babyboom(BBM)多肽或所述胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：214、216、219、221、223、225、227、229、或231；或其中所述Babyboom(BBM)多肽或所述胚珠发育蛋白2(ODP2)多肽由选自以下的核苷酸序列编码：SEQ ID NO：213、215、217、218、220、222、224、226、228、230、或232。
121.如权利要求112-114中任一项所述的方法，其中所述形态发生基因表达盒进一步包含选自以下的多核苷酸：ZM-MIR-Corngrass1核苷酸、ZM-GRF5核苷酸、ZM-GRF4核苷酸、ZM-GIF1核苷酸、ZM-GRF4～GIF1核苷酸、ZM-STEMIN1核苷酸、ZM-REV核苷酸、ZM-ESR1核苷酸、ZM-LAS核苷酸、ZM-CUC1核苷酸、ZM-CUC2核苷酸、ZM-CUC3核苷酸、ZM-RLD1核苷酸、ZM-KN1核苷酸、ZM-CYCD2核苷酸、ZM-GPCNAC-1核苷酸、ZM-MIR156B核苷酸、ZM-LEC1核苷酸、AT-RKD4核苷酸、AT-LEC2核苷酸、AT-RAP2.6L核苷酸、ZM-CUC3核苷酸、ZM-MIR-SPS1核苷酸、ZM-MIR-MAX1核苷酸、或ZM-MIR-MAX4核苷酸。
122.如权利要求112或113所述的方法，其中所述形态发生基因表达盒进一步包含编码位点特异性重组酶的多核苷酸序列，所述位点特异性重组酶选自由以下组成的组：FLP、FLPe、KD、Cre、SSV1、λInt、phi C31 Int、HK022、R、B2、B3、Gin、Tn1721、CinH、ParA、Tn5053、Bxb1、TP907-1、或U153，其中所述位点特异性重组酶可操作地连接到组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子、或受发育调控的启动子。
123.如权利要求122所述的方法，所述方法进一步包括切除所述形态发生基因表达盒以提供经基因组编辑的植物。
124.如权利要求112或113所述的方法，所述方法进一步包括远离所述形态发生基因表达盒育种以提供含有所述基因组编辑的所述经基因组编辑的植物。
125.一种经基因组编辑的植物，所述经基因组编辑的植物由如权利要求123或124所述的方法产生。
126.一种如权利要求123或124所述的经基因组编辑的植物的种子，其中所述种子包含所述基因组编辑。
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