CN111630174A - 遗传修饰植物的再生 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及植物育种领域，特别是涉及从细胞和其它组织产生植物。更特别地，本发明提供了用于改善植物再生的方法和工具，特别是从转化的或遗传修饰的植物细胞中再生。

Description

遗传修饰植物的再生
本发明涉及植物育种和生物技术领域，并且特别涉及从细胞和其他组织产生植物。更特别地，本发明提供了用于改善植物再生，特别是从转化的或遗传修饰的植物细胞中再生的方法和工具。
在植物育种中，为了产生用于特定目的所需基因型和表型，从人类文明的开始临近就已经实践了植物物种的操作过程。随着基因工程的发展，这个农业领域在过去的几十年中已经有了显著的变化。已经开发了多种植物遗传工程方法。转化方法的选择取决于许多变量，主要是待转化的植物物种、实验目的和必要设备的可用性。绝大多数植物转化技术需要使用具有高再生能力的外植体作为起始材料。此外，基因编辑构成了一种新的分子生物学方法，通过该方法可以将特定的修饰如插入、缺失或点突变或其组合引入植物基因组中。为此，需要特异性分子仪器，其首先具有核酸酶活性，但最重要的是可以以足够的特异性引导至待修饰的靶序列，以编程和进行特异性和定点诱变。在过去的几年中，在植物生物技术中，特异性基因组编辑已经发展为常规育种和转基因策略的替代。然而，由于植物的经编辑起始材料的有限再生能力，目前可用的工具，例如大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFNs)、"转录激活剂样效应物核酸酶"(TALEN)或CRISPR系统仅在有限程度上用于植物生物技术中。
多种细胞具有发育为胚胎的潜力，包括单倍体配子体细胞，例如花粉和胚囊的细胞(参见Forster,B.P.,等人(2007)Trends Plant Sci.12:368-375and Seguí-Simarro,J.M.(2010)Bot.Rev.76:377-404)，以及衍生自植物的所有三个基本组织层的体细胞(Gaj,M.D.(2004)Plant Growth Regul.43:27-47或Rose,R.,等人(2010)“Developmentalbiology of somatic embryogenesis”in:Plant Developmental Biology-Biotechnological Perspectives,Pua E-C和Davey MR,编著(Berlin Heidelberg:Springer),pp.3-26)。
再生成植物的能力通常限于某些植物物种中的特定基因型，并且在转化和遗传修饰的植物细胞和其它前体组织中减弱。即使转化和遗传修饰植物细胞的步骤是成功的，这也不一定意味着实际上可以从修饰的细胞获得期望的植物。据推测，植物细胞和其它前体组织为了实现遗传修饰而经受的处理影响植物发育和再生。因此，本发明的目的是提高先前已知的用于产生转基因和遗传修饰植物的方法的功效，并支持从修饰的植物细胞和其它植物前体再生植物。
在本发明中，令人惊奇地发现拟南芥属基因GRF5(GROWTH-REGULATING FACTOR 5，生长调节因子5)在促进植物再生中具有作用，这并未针对这种基因或其GRF基因家族的对应物而被报道过。
在van der Knaap等人(2000；“A novel gibberellin-induced gene from riceand its potential regulatory role in stem growth”,Plant physiology,122(3),695-704.)中，作者鉴定并表征了GRF基因家族在稻中的第一个成员(OsGRF1)这是居间分生组织中赤霉酸诱导的基因。拟南芥属中的过表达导致茎生长受损、雌性不育和雄性育性降低。赤霉酸的应用不能恢复转化植物的茎伸长缺陷，表明OsGRF1能参与GA诱导的茎伸长。2003Kim等人(“The AtGRF family of putative transcription factors is involvedin leaf and cotyledon growth in Arabidopsis”,The Plant Journal,36(1),94-104.)中已经表征了拟南芥属GRF家族，并确定了这些基因主要在活跃生长的组织中表达。对过表达AtGRF1和AtGRF2的无效突变体和转基因植物的分析表明GRF家族的一些成员参与了叶和子叶生长过程中细胞扩增的调节。此外，过表达的植物显示延迟的抽苔时间，揭示了开花中的推定作用。在确定协调发育叶中细胞增殖的分子机制的研究中，Rodriguez等发现miR396拮抗其靶标GRF转录因子在拟南芥属中的表达模式((2010),“Control of cellproliferation in Arabidopsis thaliana by microRNA miR396”,Development,137(1),103-112.)。因此，miR396和GRF之间的平衡控制叶中细胞的最终数目。此外，作者显示靶向miR396的GRF可调节茎顶端分生组织的大小。
2005年，Horiguchi et al.(“The transcription factor AtGRF5and thetranscription coactivator AN3regulate cell proliferation in leaf primordia ofArabidopsis thaliana”,The Plant Journal,43(1),68-78.)首次表征了AtGRF5及其相互作用配偶体ANGUSTIFOLIA3(AN3)。敲除突变体atgrf5和an3由于细胞数目减少而产生狭窄的叶，而在AtGRF5和AN3过表达株系中叶原基中的细胞增殖增强。Kuijt等人((2014),的细胞增殖增强。)“The transcription factor AtGRF5and the transcription coactivatorAN3regulate cell proliferation in leaf primordia of Arabidopsis thaliana”,显示GRF家族在网络中作用为参与者控制KNOTTED1-LIKE HOMEBOX(KNOX)基因的表达，其参与枝条芽顶端分生组织的细胞分化限制。AtGRF4、AtGRF5和AtGRF6能够结合KNOX基因的启动子，抑制其表达。过表达AtGRF4、AtGRF5或AtGRF6的拟南芥幼苗在芽顶端分生组织中表现出发育异常。在Vercruyssen等人((2015),n。过表达组织的细gulating factor 5stimulatesArabidopsis chloroplast division,photosynthesis,and leaf longevity”,Plantphysiology,pp-114.)的最近研究中，过量表达GRF5的拟南芥属叶显示了每个细胞更高的叶绿体数目、增加的叶绿素含量和延迟的叶衰老。
总之，众所周知拟南芥属基因AtGRF5和其它GRF基因在叶片形态发生和茎发育中起作用。此外，据报道GRF基因在开花、种子和根发育中起作用，以控制胁迫条件下的植物生长和调节植物寿命。然而，在他们的研究过程中，本发明的发明人惊奇地发现了该基因家族的另一和新的功能。GRF5能够提供加强植物再生的积极作用，因此允许更有效地回收转基因植物。本发明允许改善来自不同组织或细胞(例如小孢子)的再生，可以克服对植物再生的不顺应性，特别是基因型依赖性，通过例如目的基因和GRF5的共表达改善转基因植物的恢复，通过例如基因组编辑组分和GRF5的瞬时共表达改善基因组工程化植物的恢复，以及缩短产生转基因株系和恢复的时间。因此，本发明的第一方面是GRF5多肽用于改善植物再生能力的用途。
下文任何对本发明方法中有用的多肽或蛋白质的提及均指本文定义的GRF5多肽或GRF5蛋白。下文任何对本发明方法中有用的核酸或多核苷酸(除了被转化的目的核苷酸序列或任选用作修饰植物基因组的修复模板的核酸分子)的提及，被认为是指能够编码此类GRF5多肽或GRF5蛋白的核酸或多核苷酸。在一个实施方案中，任何提及可用于本发明方法的多肽/蛋白质或核酸/多核苷酸应理解为指可用于本发明方法、构建体、表达盒、植物细胞、植物、种子、可收获部分和产物的蛋白质或核酸。待引入植物细胞或植物(并因此可用于实施本发明方法)的包括mRNA的核酸/多核苷酸是编码现在将描述的多肽/蛋白质类型的任何核酸/多核苷酸，下文也称为"GRF5核酸"、"GRF5多核苷酸"、"GRF5基因"或"GRF5mRNA"等。
本文定义的"GRF5多肽"或"GRF5蛋白"指任何转录因子，当用Interprosacan软件(www.ebi.ac.uk/Interpro)分析时，优选14-3-3样蛋白GF14υ，更优选其包含PFAM结构域PF08880(也称为QLQ结构域)和PFAM结构域PF08879(也称为WRC结构域)，甚至更优选包含发现在GRF5多肽N末端或其附近至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％覆盖度匹配的PFAM结构域PF08880，以及发现与位于GRF5多肽的PFAM结构域PF08880的C末端至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％覆盖度匹配的PFAM结构域PF08879，即匹配PF08879的氨基酸区段按翻译方向位于匹配PF08880的氨基酸区段后。优选地，至少一个匹配具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的覆盖度。
在一个实施方案中，两个匹配氨基酸区段均位于GRF5多肽的N-末端一半，优选地，匹配PFAM结构域PF08880的氨基酸区段位于GRF5多肽的N-末端四分之一。优选地，PFAM结构域PF08880与GRF5多肽的氨基酸残基匹配，所述匹配始于GRF5多肽的残基5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25，优选地始于残基9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21，且PFAM结构域PF08879与GRF5多肽的氨基酸残基匹配，所述匹配始于GRF5多肽的残基68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99，优选地始于残基72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94或95。优选地，匹配PFAM结构域PF08880的氨基酸区段的起始氨基酸残基与匹配PFAM结构域PF08879的氨基酸区段的起始氨基酸残基之间的距离是在GRF5多肽中的60至82个氨基酸，更优选地60至75个氨基酸，更优选61至75个氨基酸，甚至更优选在GRF5多肽中62-73个氨基酸。
在又一个实施方案中，本文使用的GRF5多肽包含指示物基序：[D]-[PL]-[E]-[P]-[G]-[R]-[C]-[R]-[R]-[T]-[D]-[G]-[K]-[K]-[W]-[R]-[C]-[SA]-[RK]-[ED]-[A]-[YH]-[P]-[D]-[S]-[K]-[Y]-[C]-[E]-[KR]-[H]-[M]-[H]-[R]-[G]-[RK]-[N]-[R]，其中GRF5多肽与指示物基序相比显示最多三个错配，即在各GRF5多肽和指示物基序之间的序列比对中最多可出现三个错配，优选与指示物基序相比至多两个错配，即在各GRF5多肽和指示物基序之间的序列比对中最多可出现二个错配，更优选地与指示物基序相比至多一个错配，即在各GRF5多肽和指示物基序之间的序列比对中最多可出现仅一个错配，并且更优选地与指示物基序相比没有错配。在特别优选的实施方案中，错配或单一错配之一位于指示物基序的位置2，更优选地，错配是[A]而不是[P]。错配是指根据指示物基序的某一位置上的氨基酸被不同的氨基酸取代，或者通过插入至少一个额外的氨基酸而缺失或移位。方括号内的指示物基序的字母表示氨基酸残基(单字母代码)，基序代表本发明任何GRF5多肽中存在的从N-末端到C-末端方向的氨基酸残基顺序。如果在一个方括号内有两个字母，则它们表示可选。该基序已经从来自16个不同植物物种(包括单子叶和双子叶植物)的GRF5多肽序列的全面比较中推导出来，并允许将GRF5多肽与GRF蛋白质家族的其它成员如GRF1区分开(参见图5A)。图5B显示了通过序列比对/比较进行的示例性基序分析，用于确定错配的数目。优选地，基序位于GRF5多肽的N-末端一半，更优选地基序位于GRF5多肽的N-末端一半，并含有与PFAM结构域PF08879匹配的氨基酸区段亚区，即基序与PFAM结构域PF08879匹配的氨基酸区段具有连续重叠。优选地，指示物基序由SEQ ID NO:41至SEQ ID NO:104或SEQ ID NO:113至SEQ ID NO:176的任何氨基酸序列组成。相应地，GRF5多肽优选包含由氨基酸序列SEQ IDNO:41至SEQ ID NO:104或SEQ ID NO:113至SEQ ID NO:176中的任何组成的一个连续基序。
用于本发明方法的来自各种植物物种的GRF5多肽的实例在下文进一步描述。在表1中，显示了PFAM结构域PF08880和PFAM结构域PF08879的位置以及在任何所显示的GRF5序列中的单个覆盖。
表1：来自16个不同植物物种的GRF5多肽中的结构域分析
Figure BDA0002568640120000051
Figure BDA0002568640120000061
根据一个方面，本发明提供了一种转化植物细胞的方法，包括以下步骤
(a1)将以下引入植物细胞
(i)至少一种目的核苷酸序列；以及
(ii)包含编码GRF5多肽的多核苷酸的表达盒、编码GRF5多肽的mRNA或GRF5多肽，其中(i)和(ii)可平行或以任何顺序相继引入，或
(a2)将至少一种目的核苷酸序列引入植物细胞；和在所述植物细胞中平行或顺序诱导编码GRF5多肽的内源基因的增强的表达水平；以及
(b)任选地在一定条件下培养(a1)或(a2)的植物细胞或源自(a1)或(a2)的植物细胞的植物细胞，在所述条件中在所述植物细胞中，GRF5多肽由所述表达盒表达，GRF5多肽由所引入的mRNA翻译，GRF5多肽由所述内源基因增强/增加表达，或GRF5多肽存在，优选与野生型植物细胞或其中包含编码GRF5多肽的多核苷酸的表达盒、编码GRF5多肽的mRNA或GRF5多肽未根据步骤(a1)引入或其中编码GRF5多肽的内源基因的增强表达水平未根据步骤(a2)诱导的植物细胞中的量相比，所述植物细胞中的量增加。
根据本发明的方法产生了修饰或转化的植物细胞，由于GRF5的存在或GRF5的存在的量增加，所述植物细胞具有改善的再生能力。然而，优选在修饰的植物细胞中，GRF5的存在或GRF5以提高的量存在是瞬时的。
植物细胞的转化是指将核酸分子以引起稳定整合到植物细胞基因组中或在植物细胞中瞬时出现的方式引入植物细胞中，导致核酸序列的表达，其例如与特定组织或某些发育阶段等组成性、暂时性或特异性相关。单子叶和双子叶植物细胞的转化和再生现在是常规的，并且最合适的转化技术的选择将由实践者确定。方法的选择将随待转化的植物类型或基因型而变化；本领域技术人员将认识到特定方法对于给定植物类型或基因型的适用性。合适的方法可以包括但不限于：植物原生质体的电穿孔；脂质体介导的转化；聚乙二醇(PEG)介导的转化；使用病毒的转化；微量注射植物细胞；植物细胞的微弹轰击；真空浸渗；和农杆菌介导的转化。
引入至少一个目的核苷酸序列的步骤(a1)(i)或(a2)可使用本领域公知的任何合适的方法进行。有许多方法可用于将目的核酸转移到植物细胞中。示例性的载体介导的方法是农杆菌介导的转化，例如Lindsay&Gallois,1990,Journal of Experimental Botany,and Kischenko等人,2005,Cell Biology International(用于甜菜),by Ishida等人,2007,(“Agrobacterium-mediated transformation of maize.”Nature protocols,2(7),1614-1621)(用于玉米)，或通过来自Japan Tobacco公司的PureWheat Technology(用于小麦)。其它合适的技术包括粒子轰击和电穿孔。
本发明的目的核苷酸序列可以是DNA或RNA序列，例如mRNA、siRNA、miRNA等。更特别地，目的核苷酸序列编码至少一种表型性状。优选地，由DNA或RNA赋予的表型性状可以选自对生物胁迫的抗性/耐受性，包括病原体抗性/耐受性，其中病原体可以是病毒、细菌、真菌或动物病原体，对非生物胁迫的抗性/耐受性，包括冷却抗性/耐受性、干旱胁迫抗性/耐受性、渗透抗性/耐受性、热胁迫抗性/耐受性、寒冷或霜冻胁迫抗性/耐受性、氧化胁迫抗性/耐受性、重金属胁迫抗性/耐受性、盐胁迫或水浸抗性/耐受性、倒伏抗性/耐受性、落粒抗性/耐受性、或对一种或多种除草剂如草甘膦、草铵膦(glufosinate)、2,4-D、麦草畏、ALS抑制剂等的抗性/耐受性。至少一种目的表型性状还可以选自对另外的目的农学性状的修饰，包括产量增加、开花时间修饰、种子颜色修饰、胚乳组成修饰、营养含量修饰或目的途径的代谢工程改造。
在本发明的上下文中，GRF5可作为包含编码GRF5多肽的多核苷酸的表达盒、作为编码GRF5多肽的mRNA(也包括前mRNA或前体mRNA)或作为GRF5多肽引入。用于引入核酸分子的示例性技术如上所述。或者，可以通过激活编码GRF5多肽的内源基因的表达在植物细胞中提供GRF5。这将导致内源GRF5基因的表达水平提高，即导致植物细胞中GRF5多肽的存在或出现量提高。内源基因表达的激活可通过修饰编码GRF5多肽的内源基因启动子的活性或结构来实现。例如，增强子元件可通过基因编辑引入启动子；或者调节启动子的增强子元件可进一步增强，或者调节启动子的沉默子元件可通过例如靶向诱变/修饰而弱化；或者修饰可以通过基因编辑工具如CRISPR系统(Hilton等人(2015).Epigenome editing by aCRISPR-Cas9-based acetyltransferase activates genes from promoters andenhancers.Nature biotechnology,33(5),510-517)引入增强子相关的表观基因组中；或基于例如TALE激活剂或dCas9激活剂的合成转录因子可以引入细胞，其中它们能够结合启动子上或附近的靶向识别位点并激活GRF5基因的转录(Cheng等人(2013).Multiplexedactivation of endogenous genes by CRISPR-on,an RNA-guided transcriptionalactivator system.Cell research,23(10),1163.)；或者植物细胞中通过转录后抑制来调节GRF5基因表达的微RNA(miRNA)的量可通过例如敲除(无效突变体)或敲低来降低，以增加植物细胞中翻译的GRF5多肽的量，例如Rodriguez等人2010(上文)在拟南芥属中鉴定了拮抗GRF5表达的微RNA miR396，其因此代表影响植物细胞中GRF5多肽的量的合适靶标。
根据植物物种以及细胞类型，需要不同水平的基因或表达激活，以便在再生发生时在植物细胞中具有足够量的GRF5多肽。本领域技术人员可以利用各种技术来测量内源或引入基因的实际表达水平，例如qPCR、RT-PCR、Northern印迹或微阵列。引入甜菜(Betavulgaris)植物的AtGRF5基因表达水平的测量示于图4。这些方法允许本领域技术人员通过常规工作调节GRF5基因的表达水平，这实现了从多种组织或体细胞和生殖细胞(例如小孢子)的再生能力的改善。在一个优选实施方案中，在植物细胞中，编码GRF5多肽的内源基因的表达水平增加至少2倍、3倍或5倍，优选10倍、25倍或50倍，更优选100倍、200倍或500倍。
如上文进一步描述的，通过应用一种或多种激活剂或其前体，可以在植物细胞中诱导内源基因的增强的表达水平。这些可以应用于培养植物细胞的培养基，然后被植物细胞主动或被动吸收。此外，一种或多种激活剂或其前体可以通过显微注射、电穿孔或生物射弹轰击直接引入植物细胞。除了上述合成转录激活剂，本领域已知许多其它激活剂可用于增加内源基因的表达水平，特别是内源GRF5基因的表达水平：近年来，化学植物遗传学和化学植物生物学的技术领域出现，其中用小分子处理生物系统以特异性地扰乱细胞功能。小分子在商业上用作不同系统中的药物、除草剂和杀真菌剂，但近年来，它们也越来越多地用作遗传调节的工具。例如，化学遗传学涉及通过化合物文库的筛选发现各种细胞功能的小分子效应物(Dejonghe&Russinova(2017).Plant Chemical Genetics:From Phenotype-Based Screens to Synthetic Biology.Plant Physiology,pp-01805；Kawasumi,M.,&Nghiem,P.(2007).Chemical genetics:elucidating biological systems with small-molecule compounds.Journal of Investigative Dermatology,127(7),1577-1584.)。适于激活靶基因如GRF5表达的这种小分子效应物可通过按照不同策略的化学筛选来鉴定(Dejonghe&Russinova，2017)。可以获得全面的化合物文库，其允许简单筛选无数小分子和鉴定可用于激活基因如GRF5的基因表达的效应物。如上所述，另一种提高内源基因如GRF5表达水平的方法是应用所谓的合成转录激活剂。它们通常通过识别结构域和至少一个激活结构域的融合来设计。识别结构域可以来源于已知系统，如锌指、TAL效应子或CRISPR；对于激活，例如将单纯疱疹病毒衍生的VP-16或VP-64激活结构域与识别结构域融合可以引起转录增加。较弱的活化域如人NF-κB的AD增加了基因活化的多种选择。此外，如内源启动子上所示，激活剂的组合可用于引入协同效应(Moore等人(2014).“Transcription activator-like effectors:a toolkit for synthetic biology.”ACS synthetic biology,3(10),708-716.；US 2002/0046419A1；Lowder等人(2017).“Multiplexed transcriptionalactivation or repression in plants using CRISPR-dCas9-based systems.”PlantGene Regulatory Networks:Methods and Protocols,167-184.)。合成转录激活剂可以被递送到植物细胞或也作为前体，即作为编码这种人工或合成转录激活剂或其结构域的DNA或RNA分子或作为转录激活剂的失活形式被引入植物细胞，所述转录激活剂的失活形式随后在细胞中或在细胞的特定区室中被激活。最后，通过上游负调节因子(即miR396)的失活或通过产生对这样的负调节因子有抗性的GRF基因的突变形式，也可以实现GRF基因表达的增强。
优选地，本发明的GRF5多肽包含选自SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、106、108、110、112或209的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、106、108、110、112或209具有至少70％同一性的氨基酸序列，优选与SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、106、108、110、112或209具有至少80％、至少85％、至少90％、更优选至少95％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列，且优选包含本文所述的指示物基序，特别优选由SEQ ID NO:41至SEQID NO:104或SEQ ID NO:113至SEQ ID NO:176的任何氨基酸序列组成的指示物基序。例如由内源基因编码的GRF5多肽可包含选自SEQ ID NO:2(拟南芥(Arabidopsis thaliana)),SEQ ID NO:4(甜菜),SEQ ID NO:6(玉蜀黍(Zea mays)),SEQ ID NO:8(普通小麦(Triticumaestivum)),SEQ ID NO:10(欧洲油菜(Brassica napus)),SEQ ID NO:12(芫菁(Brassicarapa)),SEQ ID NO:14(甘蓝(Brassica oleracea)),SEQ ID NO:16(萝卜(Raphanussativus)),SEQ ID NO:18(两色蜀黍(Sorghum bicolor)),SEQ ID NO:20(葵花(Helianthus annuus)),SEQ ID NO:22(马铃薯(Solanum tuberosum)),SEQ ID NO:24(大麦(Hordeum vulgare)),SEQ ID NO:26(黑麦(Secale cereal)),SEQ ID NO:28(大豆(Glycine max)),SEQ ID NO:30(陆地棉(Gossypium hirsutum)),SEQ ID NO:32(稻(Oryzasativa)),SEQ ID NO:106(大豆),SEQ ID NO:108(欧洲油菜),SEQ ID NO:110(葵花),SEQID NO:112(玉蜀黍)或SEQ ID NO:209(Zea mays)的氨基酸序列。
编码本发明GRF5多肽的外源(异源)或内源多核苷酸包含
(i)包含SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、105、107、109、111、207、208或210的核苷酸序列；
(ii)包含与包含SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、105、107、109、111、207、208或210的核苷酸序列至少70％、优选至少80％、至少85％、至少90％、更优选至少95％、至少98％或至少99％同一的序列的核苷酸序列；
(iii)编码如上定义的GRF5多肽的核苷酸序列或在遗传密码简并性范围内编码由(i)和/或(ii)编码的多肽的核苷酸序，；
(iv)与(i)、(ii)或(iii)的核苷酸序列互补的核苷酸序列；和/或
(v)在严格条件下与(iv)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
编码GRF5多肽的多核苷酸，特别是编码GRF5多肽的多核苷酸，可包含选自以下序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:1(拟南芥)；SEQ ID NO:3(甜菜)、SEQ ID NO:5(玉蜀黍)、SEQID NO:7(普通小麦)、SEQ ID NO:9(欧洲油菜)、SEQ ID NO:11(芜青)、SEQ ID NO:13(甘蓝)、SEQ ID NO:15(萝卜)、SEQ ID NO:17(两色蜀黍)、SEQ ID NO:19(葵花)、SEQ ID NO:21(马铃薯)、SEQ ID NO:23(大麦)、SEQ ID NO:25(黑麦)、SEQ ID NO:27(大豆)、SEQ ID NO:29(陆地棉)、SEQ ID NO:31(稻)、SEQ ID NO:105(大豆)、SEQ ID NO:107(欧洲油菜)、SEQID NO:109(葵花)、SEQ ID NO:111(玉蜀黍)、SEQ ID NO:207(合成的)、SEQ ID NO:208(合成的)或合成的NO：210(合成的)。
为了本发明的目的，两个相关核苷酸或氨基酸序列的"序列同一性"，以百分比表示，是指两个最佳比对序列中具有相同残基的位置数(x100)除以所比较的位置数。缺口，即在比对中残基存在于一个序列中而不存在于另一个序列中的位置，被认为是具有不相同残基的位置。通过Needleman和Wunsch算法(Needleman和Wunsch1970)进行两个序列的比对。上述计算机辅助序列比对可以方便地使用标准软件程序进行，例如欧洲分子生物学开放软件套装软件(EMBOSS)中实施的程序NEEDLE，例如6.3.1.2版(Trends in Genetics 16(6),276(2000))，其缺省参数例如蛋白质矩阵＝EBLOSUM62，gapopen＝10.0和gapextend＝0.5。
术语"严格条件"或"在严格条件下杂交"是指彼此具有足够互补性的核苷酸序列通常保持杂交的条件。这些严格条件是本领域技术人员已知的，并且描述于例如CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，NY(1989)6.3.1-6.3.6中。技术人员知道如何根据例如Sambrook等人,Molecular Cloning,Cold Spring HarbourLaboratory,1989确定所需的杂交条件。术语"杂交条件"在这方面不仅指核酸实际凝聚过程中的主要实际条件，而且指随后洗涤步骤中的主要条件。严格杂交条件的实例是这样的条件，在该条件下，主要仅那些具有至少80％，优选至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列同一性的核酸分子进行杂交。严格杂交条件是，例如：4×SSC在65℃下洗涤，随后在0.1×SSC在65℃下洗涤约1小时。如本文所用的术语"严格杂交条件"也可以指：在68℃下，在0.25M磷酸钠，pH7.2，7％SDS，1mM EDTA和1％BSA中杂交16小时，随后在68℃下用2×SSC和0.1％SDS洗涤两次，优选地，杂交在严格条件下进行。
表述"可操作地连接"是指嵌合基因的所述元件以其功能被协调并允许编码序列表达的方式彼此连接，即它们是功能性连接的。例如，当启动子能够确保另一核苷酸序列的转录和最终表达时，启动子与所述另一核苷酸序列功能性连接。如果两个蛋白编码核苷酸序列以可以形成第一和第二蛋白或多肽的融合蛋白的方式连接，则它们彼此功能性或可操作性连接。
当基因导致表达产物的形成时，该基因被认为是表达的。表达产物表示由编码这种产物的核酸、DNA或RNA，例如本文所述的第二核酸的转录和任选的翻译产生的中间产物或终产物。在转录过程中，受调节区，特别是启动子控制的DNA序列被转录成RNA分子。RNA分子可以自身形成表达产物，或者当其能够被翻译成肽或蛋白质时，其可以是中间产物。当作为基因表达的终产物的RNA能够例如与另一种核酸或蛋白质相互作用时，该基因被认为编码作为表达产物的RNA分子。RNA表达产物的实例包括抑制性RNA，例如有义RNA(共抑制)、反义RNA、核酶、miRNA或siRNA、mRNA、rRNA和tRNA。当基因表达的终产物是蛋白质或肽时，该基因被认为编码作为表达产物的蛋白质。
本文所用的核酸(分子)或核苷酸(序列)或多核苷酸是指DNA和RNA。DNA还包括cDNA和基因组DNA。核酸分子可以是单链或双链的，并且可以化学合成或通过体外或甚至体内生物表达产生。
很明显，当RNA分子的核苷酸序列通过参照相应DNA分子的核苷酸序列来定义时，核苷酸序列中的胸腺嘧啶(T)应该被尿嘧啶(U)替代。从本申请的上下文中将清楚是否涉及RNA分子还是DNA分子。
如本文所用，"包括"等应被解释为指定所提及的所述特征、整数、步骤或组分的存在，但不排除一个或多个特征、整数、步骤或组件或其群组的存在或添加。因此，例如，包含核苷酸或氨基酸序列的核酸或蛋白质可以包含比实际引用的更多的核苷酸或氨基酸，即，被嵌入更大的核酸或蛋白质中。包含功能或结构上定义的DNA区的嵌合基因可以包含另外的DNA区等。
通过GRF5，可提供具有改善的再生能力的植物细胞或其它植物前体组织。这对于基因修饰的植物细胞，特别是具有编辑的基因组的植物细胞特别有用。
根据本发明的优选实施方案，在植物细胞瞬时转化中，进行引入至少一个目的核苷酸序列和GRF5的步骤(a1)或引入至少一个目的核苷酸序列并诱导编码GRF5的内源基因的增强的表达水平的步骤(a2)。就本发明而言，"瞬时转化"是指插入序列未(稳定地)整合到植物细胞的基因组中。在另一个实施方案中，实现稳定的转化，其中将本文公开的转化方法的步骤(a1)和(a2)中的目的核苷酸序列和/或本文公开的修饰基因组的方法的步骤(a1)中的编码GRF5多肽的多核苷酸插入植物细胞的基因组中。根据本发明特别优选的实施方案，将编码GRF5的核苷酸序列瞬时转化入细胞，同时将目的核苷酸序列稳定转化入细胞基因组。
修饰植物细胞的基因组可以通过双链DNA断裂(DSB)诱导酶来完成，所述酶优选识别所述细胞基因组中的预定位点。
因此，本发明的另一个实施方案是修饰植物细胞基因组的方法，包括以下步骤
(a1)将如下引入植物细胞，包含编码GRF5多肽的多核苷酸的表达盒、编码GRF5多肽的mRNA(包括前mRNA)或GRF5多肽；或
(a2)在植物细胞中诱导编码GRF5多肽的内源基因的增强的表达水平；以及
(b)在一定条件下培养(a1)或(a2)的植物细胞或源自(a1)或(a2)的植物细胞的植物细胞，在所述条件中在所述植物细胞中，GRF5多肽由所述表达盒表达，GRF5多肽由所引入的mRNA翻译，GRF5多肽由所述内源基因增强/增加表达，或GRF5多肽存在，优选与野生型植物细胞或其中包含编码GRF5多肽的多核苷酸的表达盒、编码GRF5多肽的mRNA或GRF5多肽未根据步骤(a1)引入或其中编码GRF5多肽的内源基因的增强表达水平未根据步骤(a2)诱导的植物细胞中的量相比，所述植物细胞中的量增加；
(c)通过双链DNA断裂(DSB)诱导酶和任选地通过修复核酸分子修饰(b)的植物细胞的基因组，所述诱导酶，所述酶优选地识别所述细胞的基因组中的预定位点，
其中在所述预定位点的所述基因组的修饰选自
i.至少一个核苷酸的置换；
ii.至少一个核苷酸的缺失；
iii.至少一个核苷酸的插入；或
iv.i-iii的任何组合；以及
其中步骤(c)与步骤(a1)/(a2)和/或(b)同时进行，在步骤(a1)/(a2)之前进行，在步骤(a1)/(a2)或(b)之间进行或在步骤(b)之后进行。
如本文所用，"双链DNA断裂诱导酶"或"DSBI酶"是能够在特定核苷酸序列，称为"识别位点"处诱导双链DNA断裂的酶。双链DNA断裂(DSB)诱导酶可以例如选自大范围核酸酶、TAL效应物核酸酶、锌指核酸酶、CRISPR系统如CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1、CRISPR/CasX、CRISPR/CasY、CRISPR/Csm1或CRISPR/MAD7。稀有切割的内切核酸酶是DSBI酶，其具有优选约14至70个连续核苷酸的识别位点，因此具有非常低的切割频率，甚至在较大的基因组如大多数植物基因组中。归巢内切核酸酶，也称为大范围核酸酶，构成了这类稀有切割内切核酸酶的家族。它们可以由内含子、独立基因或间插序列编码，并呈现明显的结构和功能特性，这些特性使它们区别于更经典的限制性酶，通常区别于细菌限制修饰II型系统。它们的识别位点具有一般的不对称性，这与大多数限制酶识别位点的特征性二分体对称性形成对比。已经表明，由内含子或内含肽编码的几种归巢内切核酸酶促进它们各自的遗传元件归巢至等位无内含子或无内含肽位点。通过在无内含子或无内含子的等位基因中产生位点特异性双链断裂，这些核酸酶产生重组末端，其参与基因转化过程，该过程复制编码序列并导致在DNA水平插入内含子或间插序列。WO03/004659(17-20页)的表I中提供了其它罕见切割性大范围核酸酶及其各自的识别位点的列表(引入本文作为参考)。
此外，可用于设计基本上识别任何所选靶核苷酸序列的定制的罕见切割核酸内切酶的方法。简言之，嵌合限制酶可用设计用于识别特异性核苷酸序列的锌指结构域与来自天然限制酶如Fokl的非特异性DNA切割结构域之间的杂合体制备。这些方法已经描述在例如WO03/080809、WO94/18313或WO95/09233和Isalan等(2001)中。一种快速的、普遍适用的工程化锌指的方法，通过靶向HIV-1启动子来说明。Nature biotechnology,19(7),656；Liu等人(1997)。设计用于在复杂基因组内独特寻址的聚乙酰基锌指蛋白。Proceedings ofthe National Academy of Sciences,94(11),5525-5530.)。
定制设计的内切核酸酶的另一个实例包括TALE核酸酶(TALEN)，其基于来自黄单胞菌属的与核酸酶(例如FokI或其变体)的催化结构域融合的转录激活子样效应物(TALE)。这些TALE的DNA结合特异性由串联排列的34/35个氨基酸重复单元的重复可变二残基(RVD)定义，使得一个RVD特异性识别靶DNA中的一个核苷酸。可以装配重复单元以基本上识别任何靶序列，并与核酸酶的催化结构域融合以产生序列特异性内切核酸酶Boch等人(2009).Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type IIIeffectors.Science,326(5959),1509-1512；Moscou&Bogdanove(2009).A simple ciphergoverns DNA recognition by TAL effectors.Science,326(5959),1501-1501；和WO2010/079430,WO 2011/072246,WO 2011/154393,WO2011/146121,WO 2012/001527,WO2012/093833,WO 2012/104729,WO 2012/138927,WO2012/138939)。WO2012/138927还描述了具有各种催化结构域的单体(紧密)TALEN和TALE及其组合。
最近，已经描述了一种新型的可定制的内切核酸酶系统；所谓的CRISPR/Cas系统。在其天然环境中的CRISPR系统描述了一种分子复合物，该分子复合物包括至少一个小的且单独的非编码RNA与Cas核酸酶或另一种CRISPR核酸酶(如Cpf1核酸酶(Zetsche等人,，，Cpf1Is a Single RNA-Guides Endonuclease of a Class 2CRISPR-Cas System″,Cell,163,pp.1-13,10月2015))的组合，该复合物可以产生特定的DNA双链断裂。目前，CRISPR系统被分为2类，包括五种类型的CRISPR系统，II型系统，例如使用Cas9作为效应物，和V型系统，使用Cpf1作为效应物分子(Makarova等人,Nature Rev.Microbiol.,2015)。在人工CRISPR系统中，合成的非编码RNA和CRISPR核酸酶和/或任选地经修饰以充当切口酶或缺乏任何核酸酶功能的经修饰的CRISPR核酸酶可以与至少一种组合crRNA和/或tracrRNA的功能的合成的或人工的引导RNA或gRNA组合使用(Makarova等人，2015，同上)。在天然系统中由CRISPR/Cas介导的免疫应答需要CRISPR-RNA(crRNA)，其中控制CRISPR核酸酶的特异性激活的该指导RNA的成熟在迄今为止已表征的各种CRISPR系统之间显著变化。首先，入侵DNA，也称为间隔区，整合在CRISPR基因座近端的两个相邻重复区之间。II型CRISPR系统编码Cas9核酸酶作为干扰步骤的关键酶，该系统含有crRNA以及反式激活RNA(tracrRNA)作为指导基序。这些杂交并形成双链(ds)RNA区，其被RNAseIII识别并可被切割以形成成熟的crRNA。然后这些依次与Cas分子结合以便将核酸酶特异性地引导至靶核酸区域。重组gRNA分子可以包含可变DNA识别区和Cas相互作用区，并且因此可以独立于特定靶核酸和所需Cas核酸酶而被特异性设计。作为进一步的安全机制，PAM(原间隔区邻近基序)必须存在于靶核酸区域中；这些是直接从Cas9/RNA复合物识别的DNA继续的DNA序列。化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9的PAM序列已被描述为″NGG″或″NAG″(标准IUPAC核苷酸编码)(Jinek等人,″A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptivebacterial immunity″,Science 2012,337:816-821)。金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的Cas9的PAM序列是″NNGRRT″或″NNGRR(N)″。进一步的变体CRISPR/Cas9系统是已知的。因此，脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)Cas9在PAM序列NNNNGATT处切割。嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)Cas9在PAM序列NNAGAAW处切割。最近，已经描述了弯曲杆菌属(Campylobacter)CRISPR系统的进一步PAM基序NNNNRYAC(WO2016/021973A1)。对于Cpf1核酸酶，已经描述了没有tracrRNA的Cpf1-crRNA复合物有效识别和切割靶DNA，其通过短的富含T的PAM进行，这与通常由Cas9系统识别的富含G的PAM相反(Zetsche等，同上)。此外，通过使用修饰的CRISPR多肽，可以获得特异性单链断裂。Cas切口酶与各种重组gRNA的组合使用也可以通过双DNA切口诱导高度特异性的DNA双链断裂。此外，通过使用两种gRNA，可以优化DNA结合的特异性，从而优化DNA切割。同时，其他CRISPR效应物，如最初针对细菌描述的CasX和CasY效应物是可用的，并且代表其他效应物，其可用于基因组工程目的(Burstein等人,“New CRISPR-Cas systems from uncultivatedmicrobes”,Nature,2017,542,237-241)。
DSBI酶的切割位点涉及DNA上诱导双链DNA断裂的精确位置。切割位点可以包含在DSBI酶的识别位点中(或不包含在DSBI酶的识别位点中)(与DSBI酶的识别位点重叠)，因此可以说DSBI酶的切割位点位于其识别位点处或附近。DSBI酶的识别位点，有时也称为结合位点，是由DSBI酶(特异性地)识别并决定其结合特异性的核苷酸序列。例如，TALEN或ZNF单体具有分别由其RVD重复或ZF重复决定的识别位点，而其切割位点由其核酸酶结构域(例如FokI)决定，并且通常位于识别位点之外。在二聚体TALEN或ZFN的情况下，切割位点位于各自单体的两个识别/结合位点之间，发生切割的该间插DNA区域称为间隔区。
本领域技术人员能够选择识别某一识别位点并在预选/预定位点或其附近的切割位点诱导DSB的DSBI酶，或者对这种DSBI酶进行工程化。或者，可以使用任何常规转化方法或通过与基因组中具有DSBI酶识别位点的生物杂交将DSBI酶识别位点引入到靶基因组中，然后可以将任何所需的DNA引入到DSBI酶的切割位点处或其附近。
在该实施方案的特别优选的方面，将修复核酸分子另外引入植物细胞中。如本文所用，"修复核酸分子"是单链或双链DNA分子或RNA分子，其用作模板用于在切割位点附近或切割位点处的预选位点处修饰基因组DNA。如本文所用，"用作修饰基因组DNA的模板"是指修复核酸分子通过侧翼区域和预选位点侧翼的靶基因组中相应同源区域之间的同源重组，任选地与修复核酸分子两个末端之一处的非同源末端连接(NHEJ)组合(例如，在仅存在一个侧翼区域的情况下)，在预选位点处拷贝或整合。通过同源重组的整合将允许修复核酸分子与靶基因组精确连接直至核苷酸水平，而NHEJ可能在修复核酸分子与基因组DNA之间的连接处导致小的插入/缺失。
如本文所用，"基因组的修饰"是指基因组已经改变了至少一个核苷酸。这可以通过置换至少一个核苷酸和/或缺失至少一个核苷酸和/或插入至少一个核苷酸来进行，只要与修饰前的预选基因组靶位点的核苷酸序列相比，它导致至少一个核苷酸的总变化，从而允许鉴定修饰，例如通过技术人员熟知的例如测序或PCR分析等的技术。
如本文所用，"预选位点"、"预确定位点"或"预定位点"表示基因组(例如核基因组或叶绿体基因组)中的特定核苷酸序列，在该位置上期望插入、置换和/或缺失一个或多个核苷酸。这可以是例如内源基因座或在先前引入的外源DNA或转基因中的或与其连接的特定核苷酸序列。预选位点可以是特定的核苷酸位置，在该位置(之后)其意图进行一个或多个核苷酸的插入。预选位点还可以包含待交换(置换)或缺失的一个或多个核苷酸的序列。
如本申请上下文中所用，术语"约"是指所述值的+/-10％，优选所述值的+/-5％。例如，约100个核苷酸(nt)应理解为90至110nt之间的值，优选95至105之间的值。
如本文所用，"侧翼区"是修复核酸分子的区域，其具有与预选位点侧翼(即上游或下游)的DNA区的核苷酸序列同源的核苷酸序列。很明显，应当选择侧翼区域的长度和序列同一性百分比，以便能够在所述侧翼区域和它们在预选位点上游或下游的相应DNA区域之间进行同源重组。侧翼于预选位点的与修复核酸分子的侧翼DNA区具有同源性的DNA区也称为基因组DNA中的同源区。
为了具有足够的重组同源性，修复核酸分子的侧翼DNA区域的长度可以变化，并且长度应至少为约10nt，约15nt，约20nt，约25nt，约30nt，约40nt或约50nt。然而，侧翼区域可以尽实际可能的长(例如，高达约100-150kb，例如完整的细菌人工染色体(BAC)。优选地，侧翼区域将是约50nt至约2000nt，例如约100nt，200nt，500nt或1000nt，此外，目标DNA侧翼的区域不必与同源区域(预选位点侧翼的DNA区域)相同，并且可以具有约80％至约100％的序列同一性，优选与预选区域侧翼的DNA区域具有约95％至约100％的序列同一性，侧翼区域越长，对同源性的要求越不严格；此外，在不改变相邻DNA序列的DNA序列的情况下实现在预选位点的靶DNA序列的交换，侧翼DNA序列应优选与在预选位点侧翼的上游和下游DNA区域相同。
如本文所用，"上游"表示核酸分子上更靠近所述核酸分子5'端的位置。同样，术语"下游"是指核酸分子上更靠近所述核酸分子3'末端的位置。为了避免疑惑，核酸分子及其序列通常以其5'至3'方向(从左到右)表示。
为了靶向预选位点的序列修饰，必须选择侧翼区，使得上游侧翼区的3'端和/或下游侧翼区的5'端与预定位点的末端对齐。这样，上游侧翼区的3'端决定了预定位点的5'端，而下游侧翼区的5'端决定了预定位点的3'端。
如本文所用，所述预选位点位于所述切割(和/或识别)位点之外或远离所述切割(和/或识别)位点，是指意图进行基因组修饰的位点(预选位点)不包含DSBI酶的切割位点和/或识别位点，即预选位点不与切割(和/或识别)位点重叠。因此，在这方面，之外/远离是指切割(和/或识别)位点的上游或下游。
已经根据本发明的方法转化或基因编辑的并且可能具有修饰的基因组的修饰的植物细胞可以再生为完整(能育)植物。由于在植物细胞中存在额外的GRF5，它们再生的能力显着改善。因此，在本发明的一个优选方面，植物细胞的转化或植物细胞基因组的修饰分别在再生植物的步骤之后。因此，本发明提供了一种产生转基因植物的方法，包括
(a)如上所述转化植物细胞，和
(b)从(a)的植物细胞或从(a)的植物细胞衍生的植物细胞再生包含至少一种植物细胞的植物，所述植物细胞包含作为转基因的所述至少一种目的核苷酸序列。
此外，本发明还提供了产生遗传修饰植物的方法，包括
(a)如上文所述修饰植物细胞的基因组，和
(b)从(a)的植物细胞或从衍生自(a)的植物细胞再生在至少一个细胞中包含所述基因组修饰或所述经修饰的植物细胞的植物。
再生技术依赖于对组织培养生长培养基中某些植物激素的操作，有时依赖于可与所需目的核苷酸序列一起引入的杀生物剂和/或除草剂标记物。Evans等人,ProtoplastsIsolation and Culture,Handbook of Plant Cell Culture,pp.124-176,MacMillilanPublishing Company,New York,1983和Binding,Regeneration of Plants,PlantProtoplasts,pp.21-73,CRC Press,Boca Raton,1985中描述了从培养的原生质体再生植物。再生也可以从植物愈伤组织、外植体、原生质体、未成熟或成熟胚、胚组织、分生组织、器官或其部分获得。这种再生技术一般描述于Klee(1987)Ann.Rev.of Plant Phys.38:467486。为了从转基因组织如未成熟胚获得完整植物，可以在受控的环境条件下在一系列含有营养物和激素的培养基中培养它们，这是一种称为组织培养的方法。一旦产生完整植株并产生种子，就开始评价后代。
根据本发明，不仅可以改善转化的或遗传修饰的植物细胞的再生能力，而且可以改善其它类型的具有差再生能力的敏感细胞的再生能力。特别地，通过GRF5可以改善从前体如未成熟雄性配子体或小孢子产生单倍体植物胚。
因此，本发明的另一方面是产生单倍体植物胚的方法，包括步骤
(a1)将如下引入未成熟雄配子体或小孢子中：包含编码GRF5多肽的多核苷酸的表达盒、编码GRF5多肽的mRNA或GRF5多肽的mRNA；或
(a2)在未成熟雄配子体或小孢子中诱导编码GRF5多肽的内源基因的增强的表达水平；以及
(b)在一定条件下培养(a)的未成熟雄配子体或小孢子，其中在未成熟雄配子体或小孢子中，GRF5多肽从表达盒表达，GRF5多肽从引入的mRNA翻译，GRF5多肽从内源基因增强表达，或GRF5多肽存在，优选与野生型植物细胞或其中包含编码GRF5多肽的多核苷酸的表达盒、编码GRF5多肽的mRNA或GRF5多肽未根据步骤(a1)引入或其中编码GRF5多肽的内源基因的增强表达水平未根据步骤(a2)诱导的植物细胞中的量相比，所述植物细胞中的量增加；以及
(c)选择来源于步骤(b)的未成熟雄性配子体或小孢子的单倍体植物胚。
本发明还包括产生单倍体幼苗的方法，其包括将单倍体植物材料暴露于包含编码GRF5多肽的多核苷酸的表达盒、编码GRF5多肽的mRNA或GRF5多肽以产生单倍体胚，然后将单倍体胚转化(即萌发)为幼苗。因此，本发明包括一种制备单倍体植物的方法，包括培养按照上述方法产生的幼苗。本发明还提供了产生双单倍体植物的方法，包括在GRF5存在下培养单倍体植物材料一段时间，刺激或允许自发染色体加倍，和使双单倍体植物材料生长成幼苗、小植株或植物。在某些实施方案中，单倍体胚胎发生和染色体加倍可以基本上同时发生。在其它实施方案中，在单倍体胚胎发生和染色体加倍之间可能存在时间延迟。如果单倍体幼苗、植物或小植株的生长不涉及自发染色体加倍事件，则可以使用化学染色体加倍剂，例如秋水仙素。许多方法涉及使植物细胞与秋水仙素、抗微管剂或抗微管除草剂如拿草特(pronamide)、一氧化二氮或任何有丝分裂抑制剂接触。结果是纯合的加倍单倍体细胞。当使用秋水仙素时，培养基中的浓度通常可以是0.01％-0.2％。秋水仙素浓度的范围可以是约400-600mg/L。
当小孢子暴露于GRF5多肽时，则可形成愈伤组织，其可经历器官发生以形成胚。因此，本发明包括产生单倍体植物愈伤组织的方法，包括将未成熟雄性配子体或小孢子暴露于GRF5多肽，或将包含编码GRF5多肽的多核苷酸的表达盒、编码GRF5多肽的mRNA或GRF5多肽引入其中。
在培养步骤中，未成熟雄性配子体或小孢子优选暴露于GRF5一段时间，所述时间足以诱导单倍体胚形成。所需的时间阶段可取决于所涉及的植物的种类，并且这些都是本领域普通技术人员容易确定的。GRF5暴露的优选范围为约1至约20小时；更优选约2-约20小时。
在本发明的某些方面，在引入包含编码GRF5多肽的多核苷酸的表达盒、编码GRF5多肽的mRNA或GRF5多肽之前，对单倍体植物材料施加物理胁迫。物理胁迫可以是例如温度、黑暗、光或电离辐射、饥饿或渗透胁迫中的任何一种。光可以是全光谱日光，或者是选自可见、红外或UV光谱的一个或多个频率。胁迫可以是连续的或间断的(周期性的)；随时间的推移是规则的或随机的。
本发明适用于任何植物物种，无论是单子叶植物还是双子叶植物。优选地，可进行本发明的方法和用途的植物是选自以下属的植物：大麦属(Hordeum)、蜀黍属(Sorghum)、甘蔗属(Saccharum)、玉蜀黍属(Zea)、狗尾草属(Setaria)、稻属(Oryza)、小麦属(Triticum)、黑麦属(Secale)、黑小麦属(Triticale)、苹果属(Malus、)、短柄菜属(Brachypodium)、Aegilops、胡萝卜属(Daucus)、甜菜属(Beta)、桉树属(Eucalyptus)、烟草属(Nicotiana)、茄属(Solanum)、咖啡属(Coffea)、葡萄属(Vitis)、Erythrante、Genlisea、香瓜属(Cucumis)、Marus、拟南芥属(Arabidopsis)、Crucihimalaya、Cardamine、独行菜属(Lepidium)、Capsella、Olmarabidopsis、Arabis、芸苔属(Brassica)、Eruca、萝卜属(Raphanus)、柑橘属(Citrus)、麻风树属(Jatropha)、杨属(Populus)、苜蓿属(Medicago)、鹰嘴豆属(Cicer)、Cajanus、菜豆属(Phaseolus)、大豆属(Glycine)、棉属(Gossypium)、黄芪属(Astragalus)、莲属(Lotus)、Torenia、葱属(Allium)或向日葵属(Helianthus)。更优选的，植物选自大麦、Hordeum bulbusom、两色蜀黍、Saccharum officinarium、玉蜀黍物种(Zea spp.)(包括玉蜀黍)、谷子(Setaria italic)、Oryza minuta、稻、Oryzaaustraliensis、Oryza alta、普通小麦、硬粒小麦(Triticum durum)、黑麦、黑小麦(Triticale)、Malus domestica、Brachypodium distachyon、海滨大麦(Hordeummarinum)、Aegilops tauschii、Daucus glochidiatus、甜菜属物种(包括甜菜)、小胡萝卜(Daucus pusillus)、Daucus muricatus、野胡萝卜(Daucus carota)、Eucalyptusgrandis、Nicotiana sylvestris、Nicotiana tomentosiformis、烟草(Nicotianatabacum)、Nicotiana benthamiana、Solanum lycopersicum、马铃薯(Solanumtuberosum)、Coffea canephora、葡萄(Vitis vinifera)、Erythrante guttata、Genliseaaurea、Cucumis sativus、Marus notabilis、Arabidopsis arenosa、Arabidopsis lyrata、拟南芥、Crucihimalaya himalaica、Crucihimalaya wallichii、Cardamine nexuosa、Lepidium virginicum、Capsella bursa pastoris、Olmarabidopsis pumila、Arabishirsute、欧洲油菜、甘蓝、芫菁、萝卜、Brassica juncacea、黑芥(Brassica nigra)、Erucavesicaria subsp.sativa、甜橙(Citrus sinensis)、Jatropha curcas、Populustrichocarpa、Medicago truncatula、Cicer yamashitae、Cicer bijugum、鹰嘴豆(Cicerarietinum)、Cicer reticulatum、Cicer judaicum、Cajanus cajanifolius、Cajanusscarabaeoides、菜豆(Phaseolus vulgaris)、大豆、棉属物种(Gossypium sp.)、紫云英(Astragalus sinicus)、Lotus japonicas、Torenia fournieri、洋葱(Allium cepa)、葱(Allium fistulosum)、Allium sativum、葵花、菊芋(Helianthus tuberosus)和/或Alliumtuberosum。特别优选的是甜菜、玉蜀黍、普通小麦、大麦、黑麦、葵花、马铃薯、两色蜀黍、芜菁、欧洲油菜、Brassica juncacea、甘蓝、萝卜、稻、大豆、和/或棉属物种(Gossypium sp)。
本发明的合适植物细胞尤其是愈伤组织，优选脆性愈伤组织，分生组织，再生组织(例如小孢子)或胚组织以及原生质体的细胞。
植物的部分可以附着于完整的整体植物或与完整的整体植物分离。植物的这些部分包括但不限于植物的器官、组织和细胞，优选种子。
本发明的主题还是通过上述方法获得的或可通过上述方法获得的植物。因此，本发明的一个实施方案是通过上述转化植物细胞并从所述细胞再生植物的方法获得的或可获得转基因植物，以及其后代或部分，其中所述后代或部分包含至少一种作为转基因的目的核苷酸序列。本发明的另一个实施方案是通过修饰植物细胞基因组并从所述细胞再生植物的上述方法获得的或可获得的遗传修饰植物以及其后代或部分，其中所述后代或部分包含通过上述修饰方法引入的基因组中的修饰。
本发明的进一步主题是源自上述转基因植物或遗传修饰植物的植物细胞或种子。这种植物细胞优选包含瞬时或稳定整合的编码GRF5多肽的多核苷酸和双链DNA断裂(DSB)诱导酶，其优选识别所述细胞基因组中的预定位点，和任选地包含修复核酸分子。编码GRF5多肽的多核苷酸优选可操作地连接到合适的调节序列，以使植物细胞能够表达GRF5多肽。调节序列意指例如"启动子"，其是指通常在其编码序列上游(5')的核苷酸序列，其通过提供对RNA聚合酶和正确转录所需的其它因子的识别来控制编码序列的表达。"组成型启动子"是指在几乎所有组织中和在所有时间指导基因表达的启动子。组成型启动子的实例包括CaMV35S启动子、双CaMV35S启动子(70S启动子)、胭脂碱合酶(nos)启动子、BdEF1启动子或遍在蛋白启动子如PcUbi4或ZmUbi1。"调节启动子"是指非组成型地、而是以时间和/或空间调节方式指导基因表达的启动子，包括组织特异性和诱导型启动子。它包括天然和合成序列以及可以是合成和天然序列的组合的序列。不同的启动子可以指导基因在不同组织或细胞类型中、或在不同发育阶段、或响应于不同环境条件的表达。用于植物细胞的各种类型的新启动子正被持续地发现，并且是本领域技术人员公知的。"组织特异性启动子"指不在所有植物细胞中表达，而仅在特定器官(如叶或种子)、特定组织(如胚或子叶)或特定细胞类型(如叶实质或种子储存细胞)中的一种或多种细胞类型中表达的调节启动子。这些启动子还包括在发育种子或果实中果实成熟期间、在完全分化的叶中或在衰老开始时被时间调节(例如在早期或晚期胚胎发生中)的启动子。"诱导型启动子"是指那些受调节的启动子，其可以在一种或多种细胞类型中通过外部刺激(例如化学、光、激素、胁迫或病原体)而开启。诱导型启动子的实例是可由蜕皮激素、地塞米松、乙醇诱导的启动子。这些启动子是本领域公知的(例如Samalova等人(2005).pOp6/LhGR:a stringently regulated andhighly responsive dexamethasone-inducible gene expression system fortobacco.The Plant Journal,41(6),919-935；Gatz&Lenk(1998).Promoters thatrespond to chemical inducers.Trends in Plant Science,3(9),352-358.)。
本发明的另一个主题是通过本发明的方法获得的或可获得的单倍体植物胚。
本发明的另一个主题是植物细胞，其包含瞬时或稳定整合的编码GRF5多肽的多核苷酸，和优选识别所述细胞基因组中预定位点的双链DNA断裂(DSB)诱导酶，和任选的修复核酸分子，其中优选编码GRF5多肽的多核苷酸与合适的调节序列可操作连接，以使植物细胞能够表达GRF5多肽。当进行上述修饰植物细胞基因组的方法时，可以获得这样的植物细胞。
本发明的另一方面是编码GRF5多肽的多核苷酸、编码GRF5多肽的mRNA、GRF5多肽或编码GRF5多肽的内源基因的表达激活蛋白在植物细胞的转化方法中，优选在上述转化方法中，在修饰植物细胞基因组的方法中，优选在上述修饰基因组的方法中，在产生植物或单倍体植物胚的方法中，优选在上述产生植物或单倍体植物胚的方法中，或在植物再生的方法中，优选在上述植物再生的方法中的用途。
除非在实施例中另有说明，所有重组DNA技术都按照如下所述的标准技术进行：Sambrook等人(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition,ColdSpring Harbor Laboratory Press,NY and in Volumes 1and 2of Ausubel等人(1994)Current Protocols in Molecular Biology,Current Protocols,USA。植物分子工作的标准材料和方法描述于Plant Molecular Biology Labfax(1993)，R.D.D.Cray,BIOSScientific Publications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications,UK联合发行。其他标准分子生物学技术的参考文献包括Sambrook和Russell(2001)MolecularCloning:A Laboratory Manual,Third Edition,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,NY,Volumes I and II of Brown(1998)Molecular Biology LabFax,SecondEdition,Academic Press(UK)。聚合酶链式反应的标准磁疗和方法见于Dieffenbach和Dveksler(1995)PCR Primer:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,以及McPherson等人(2000)PCR-Basics:From Background to Bench,FirstEdition,Springer Verlag,Germany.。
本文所提及或引用的所有专利、专利申请和出版物或公开内容(包括因特网上的出版物)均全文以引用方式并入。
将参考以下附图和本文所述的实施例进一步描述本发明。然而，应当理解，本发明并不限于这些实施例。
附图
图1：在每个选择步骤中发育的芽的总数(S1-S4)。从用对照构建体pZFN-tdT-nptII或用pZFN-nptII-GRF5进行的5个独立转化实验获得的数据(比较表3)。
图2：在对照实验(A)和用pZFN-nptII-GRF5进行的实验(B)上，在选择步骤3开始时(S3)芽再生14个独立转化的愈伤组织。箭头指示发育中的芽。按照2.1的方法进行实验。
图3：用pZFN-nptII-GRF5(A)和对照质粒pABM70S-TurboYFP(B)轰击后10天，甜菜愈伤组织中的芽再生。用pUbi4-tDT质粒共轰击愈伤组织，以通过红色荧光控制瞬时表达水平。按照方法2.2进行实验。显示了三个独立轰击的愈伤组织。
图4：十一个独立的甜菜转基因事件中GRF5的表达水平。
图5：A：来自16个不同植物物种的GRF5多肽序列的序列比较和GRF5特异性指示物基序(SEQ ID NO:177)的推导；如所示的GRF5多肽序列的部分序列列在SEQ ID NO:178-206；B：通过对来自16个不同植物物种的完整蛋白质序列进行序列比对/比较进行基序分析，允许多至10个错配。"起始"和"终止"列表示GRF5多肽序列片段对应于指示物基序的起始和终止位置；"错配"列显示各个GRF5多肽和指示物基序之间的错配数目；如所示的GRF5多肽序列的部分序列列在SEQ ID NO:178-184和SEQ ID NO:186-206。AtGRF1_AT2G22840.1(SEQ ID NO:33)；AtGRF2_AT4G37740.1(SEQ ID NO:34)；AtGRF3_AT2G36400.1(SEQ ID NO:35)；AtGRF4_AT3G52910.1(SEQ ID NO:36)；AtGRF6_AT2G06200.1(SEQ ID NO:37)；AtGRF7_AT5G53660.1(SEQ ID NO:38)；AtGRF8_AT4G24150.1(SEQ ID NO:39)；AtGRF9_AT2G45480.1(SEQ ID NO:40)。
图6：用如下获得的糖用甜菜中的转化频率：对照构建提70S::tdT，过表达AtGRF5(cDNA-SEQ ID NO:1；氨基酸序列-SEQ ID NO:2)，和甜菜GRF5直系同源物BvGRF5(合成DNA-SEQ ID NO:207；氨基酸序列-SEQ ID NO:4)的构建体。
图7：通过使用过表达td番茄(tDT)(对照)和AtGRF5(cDNA-SEQ ID NO:1；氨基酸序列-SEQ ID NO:2)的构建体，在转化实验中获得的每接种甜菜愈伤组织的转基因芽数目。
图8：从用对照构建体70S-tDT(对照)和过表达AtGRF5的构建体(70S-GRF5)的转化实验获得的每个甜菜愈伤组织的转基因芽平均数。使用两种顽拗基因型(recalcitrantgenotype)A和B。基因型A的不顺应再生枝条水平非常高，而基因型B显示比A更温和的不顺应。
图9：在甜菜中过表达AtGRF5的转基因株系的愈伤组织再生实验。通过使用Kischenko等人2005(也参见实施例1)所述的愈伤组织诱导培养基和芽再生培养基，对愈伤组织形成频率(A)和芽再生频率(B)进行评分。测定了总共5个过表达AtGRF5的独立事件(AtGRF5-36，AtGRF5-41，AtGRF5-14，AtGRF5-94，AtGRF5-50)。作为对照，使用非转基因甜菜芽(WT1和WT2)和过表达tDT报道蛋白的转基因芽(tDT-事件)。通过qRT-PCR测定从用于测定(C)的GRF5转基因事件分离的样品中AtGRF5的表达水平。
图10：或者用对照构建体70S::tDT的序列，或用过表达AtGRF5(cDNA-SEQ ID NO:1；氨基酸序列-SEQ ID NO:2)，两个GRF5玉米直向同源物[ZmGRF5版本A(合成DNA-SEQ IDNO:208；氨基酸序列-SEQ ID NO:209)和ZmGRF5版本B(合成DNA-SEQ ID NO:210；氨基酸序列-SEQ ID NO:112)的构建体的玉米中的转化频率。转化效率计算为转基因事件的数目除以接种的不成熟胚的数目。
图11：转化21天后大豆外植体上芽发育和芽的DsRed荧光。DsRed对照、AtGRF5和GmGRF5外植体的代表性图片显示(A)在初生节的芽发育和(B)芽的DsRed荧光。DsRed图片是多个图片的合成，并且出于定向目的而被定位在临近的位置。
图12：选择后16至22天，'良好'芽生长的形成持续迅速增加。在两个时间点评分外植体的百分比，以突出针对用三种构建体转化的外植体选择时芽的快速产生。
图13：在用和不用GRF5变体转化的大豆外植体上形成芽。显示了三种处理(构建体)的从一次重复的顶视图和侧视图中获得的图片。在用AtGRF5(中图)和GmGRF5(下图)相对于DsRed对照(上图)转化的外植体中，芽生长更明显。
图14：盒须图显示在选择时第16和22天，用AtGRF5或GmGRF5转化的外植体中转基因芽再生的显著增加。
图15：转化21天后，卡诺拉油菜外植体上芽发育和芽的DsRed荧光。来自DsRed对照、AtGRF5和BnGRF5的外植体的代表性图片显示(A)下胚轴节段的愈伤组织发育和(B)外植体上的DsRed荧光。
图16：在用AtGRF5、BnGRF5和DsRed对照转化的五个欧洲油菜实验中表达DsRed的外植体的百分比在盒须图中描述。与对照构建体相比，AtGRF5和BnGRF5中表达DsRed的外植体百分比显著更高，平均值增加了接近3倍。
图17：用对照构建体70S-tDT和70S-AtGRF5共转化甜菜愈伤组织。共转化实验中愈伤组织的接种是用各自含有每个构建体的农杆菌菌株的1:1混合物分别进行的。
实施例
甜菜试验
二元质粒的制备：
二元载体pZFN-nptII-GRF5通过以下标准克隆方法产生。在该载体的T-DNA中，将编码GRF5(At3g13960)的cDNA克隆在双CaMV35S启动子和胭脂碱合酶(NOS)终止子之间，以确保GRF5蛋白的高异位表达水平。T-DNA还含有赋予对一系列氨基糖苷抗生素(例如卡那霉素或巴龙霉素)的抗性的新霉素磷酸转移酶II(nptII)基因，并用于选择转基因植物细胞和组织。NOS启动子和pAG7终止子位于nptII基因的侧翼。二元载体的骨架含有分别用于在大肠杆菌(Escherichia coli)和根癌农杆菌(Agrobacternum tumefaciens)中复制质粒的colE1和pVS1起点；和为细菌选择赋予链霉素/壮观霉素抗性的aadA基因。通过标准方法将pZFN-nptII-GRF5质粒转化到AGL-1农杆菌菌株中。
微繁殖芽的转化：
通过不同的方法转化甜菜的芽：
a)农杆菌介导的转化基于Kischenko等，2005Cell Biology International：
1.基因型S706的微繁殖的芽用作起始材料。在补充了30g/l蔗糖和0.25mg/l苄基腺嘌呤(BAP)的MS盐中增殖芽。
2.为了诱导脆弱愈伤组织，将叶外植体在30℃左右在包括15g/l蔗糖和2mg/lBAP的MS盐中孵育几周。
3.收获易碎愈伤组织。
4.使含有载体pZFN-nptII-GRF5的农杆菌AGL-1在补充了适当抗生素的合适培养基中生长。
5.用农杆菌悬液接种愈伤组织。愈伤组织和农杆菌的共培养在含有440mg/lCaCl2×2H2O、170mg/l KH2PO4、1900mg/l KNO3、370mg/l MgSO4、1650mg/l NH4NO3、2mg/lBAP、40μg/l乙酰丁香酮、20g/l蔗糖和2g/l葡萄糖的培养基中进行至少2天。
6.将愈伤组织继代培养至补充了30g/l蔗糖、1mg/l GA3、1mg/l TDZ和500mg/l特美汀的MS盐，并在黑暗中孵育用于培养1周。
7.为了选择转基因细胞，将愈伤组织转移至补充了100mg/l巴龙霉素的步骤6的培养基中，并在光照下温育数周。
8.选择转基因愈伤组织并在相同的培养基和条件下传代培养若干次。
9.分离再生芽并在MS盐中繁殖，MS盐包括30g/l蔗糖、0.25mg/l BAP和100mg/l卡那霉素。
10.将绿色的芽转移到补充了30g/l蔗糖、0.1mg/l BAP、250mg/l特美汀和200mg/l巴龙霉素的MS盐中以完成选择阶段，并在该培养基中定期扩增数次。
11.从绿色生长的芽中分离叶外植体，用于DNA提取和PCR分析，以便证实推定的转基因株系。
12.将选择的芽在补充了0.5mg/l IBA、100mg/l头孢噻肟和10mg/l PPT的MS盐中生根，并转移到温室中进行种子生产。
b)甜菜愈伤组织的粒子轰击
1.如先前在2.1的方法中所述产生易碎愈伤组织。
2.渗透处理进行若干小时。
3.按照PDS-1000/He使用手册中的标准方法制备金颗粒并对其进行DNA包被。质粒pZFN-nptII-GRF5和pUbi4-tDT(含有红色荧光报道分子)与金颗粒共沉淀。作为对照，用pUbi4tDT和pABM70STurboYFP(含有黄色荧光报道分子)包被金颗粒。
4.用PDS-1000/He装置(Bio-Rad)轰击愈伤组织，每次发射使用30ng包被有500ngDNA的金颗粒。
5.为了评价GRF5瞬时表达对芽再生频率的影响，将轰击的愈伤组织在补充了30g/l蔗糖、1mg/l GA3和1mg/l噻苯隆的MS盐中在光照条件下孵育用于培养2周。通过使用标准双目镜对芽数进行评分。
结果：
用构建体pZFN-nptII-GRF5对来自甜菜微繁殖芽的愈伤组织进行根癌农杆菌介导的转化，在选择步骤结束时显著增加了再生芽的数目(表2)。作为对照，使用了含有红色荧光报道分子的构建体pZFN-tdT-nptII(对照)。五个独立实验显示平均转化频率从5.0％增加到33.9％。此外，通过PCR证实的转基因事件的数目平均从每个转化实验的4.8个事件增加到25.4个事件。
表2.通过a)的转化方法用对照构建体或用pZFN-nptII-GRF5进行的5个独立实验的转化频率。还显示了选择阶段结束时的芽总数和通过PCR证实的转基因事件总数。粗体表示发育中的芽、转基因事件和转化频率的平均数。
Figure BDA0002568640120000261
在愈伤组织转化实验中，也已经确定了每个单独选择步骤的芽再生。在每个选择步骤中再生芽的定量显示，在甜菜愈伤组织中GRF5的过量表达加速芽器官发生(表3，图1和2)。在另一个愈伤组织转化实验中，已经确定了两种顽拗甜菜基因型的芽再生(图8)：用构建体pZFN-tdT-nptII(对照)转化，对于基因型A没有转基因芽，对于基因型B每个愈伤组织平均仅产生0.3个芽。在70S启动子下使用AtGRF5过表达，转基因芽的平均数量对于基因型A从0增加到1.67个转基因芽，对于基因型B从每个愈伤组织的0.3增加到4.82个芽。这令人印象深刻地证明了AtGRF5的潜力，并开辟了使用标准转化方法以基因型独立的方式工作的可能性。
进一步的实验证明，通过使用用于在甜菜愈伤组织中过表达AtGRF5的构建体，每个接种的愈伤组织的转基因事件的数目可以增加9倍(图9)。作为对照，使用了含有红色荧光报道分子的构建体pZFN-tdT-nptII(对照)。GRF基因以及报道基因处于组成型70S启动子(来自花椰菜花叶病毒的双重增强的组成型35S启动子)的控制之下。
已经在十一个随机选择的独立的甜菜转基因事件中测定了GRF5的表达水平。用结合NOS终止子的3'-UTR的引物进行表达分析。在所有分析的转基因事件中，检测到高水平的GRF5表达(见图4)。
表3.在5个独立愈伤组织转化实验的每个选择步骤中再生芽的定量，所述实验用pZFN-tdT-nptII(Ctrl)或pZFN-nptII-GRF5(RB)进行。每个步骤中发育的芽的总数以粗体表示。
Figure BDA0002568640120000271
在愈伤组织再生的进一步实验中，已经分析了在甜菜中过表达AtGRF5的五个不同的转基因事件。作为对照，一方面使用两种非转基因甜菜系(WT1和WT2)，另一方面使用过表达tdT报道蛋白的转基因系。图9A显示对照系和转基因AtGRF5事件中平均愈伤组织形成频率几乎是相当的，在转基因事件中可能略有提高。图9B显示了转基因芽的平均数量。五个AtGRF5事件中的四个与两个对照相比显示芽形成的显著增加。从图9C明显看出，对芽形成的积极作用与转基因事件中AtGRF5的表达水平有关。
在用对照构建体的共转化实验中，70S-tDT和70S-AtGRF5已经稳定整合到甜菜愈伤组织细胞的基因组中。共转化实验中愈伤组织的接种是用含有每个构建体的农杆菌菌株的1:1混合物分别进行的。平均共转化频率为31.5％。如图17所示，在共转化中红色荧光(tDT阳性)事件的数目比在单一转化实验中高约8倍。
根据2.2的方法通过粒子轰击进行转化，显示GRF5的瞬时(过)表达甚至也导致转化频率显著增加。经轰击的愈伤组织显示出改善的再生能力。图3显示用构建体pZFN-nptII-GRF5生物射弹转化的愈伤组织与用对照构建体转化的愈伤组织相比，再生芽数增加。
在另外的愈伤组织转化实验中，还使用构建体pZFN-nptII-AtGRF5确定了甜菜中的转化频率，与相同但表达来自甜菜的GRF同源物(BvGRF5)的构建体进行了比较。作为对照，使用了含有红色荧光报道分子的构建体pZFN-tdT-nptII(对照)。GRF基因以及报道基因在组成型70S启动子的控制下。图6中所示的实验在早期选择阶段停止。这解释了为什么tDT构建体的转化效率是0％。实现了对于构建体AtGRF5，平均转化频率为70％，对于构建体BvGRF5，平均转化频率为32.5％。
2.稻实验
用于二元质粒的构建体：
通过标准克隆方法产生二元载体。在该载体的T-DNA中，将编码GRF5(At3g13960)的cDNA克隆在合适的启动子和终止子之间，以确保GRF5蛋白在稻中有足够的异位表达水平(＝单一构建体)。T-DNA还含有用于选择转基因植物细胞和组织的GFP基因。另外，产生了二元载体，其除了携带编码GRF5(At3g13960)的cDNA外还包括合适的启动子和终止子，确保GRF5蛋白在稻中足够的异位表达水平，以及在启动子和终止子(＝双(堆叠)构建体)控制下的另一目的基因。
种子灭菌播种：
野生型绿色种子在70％乙醇中孵育并摇动大约1分钟。除去乙醇后，用无菌mQ水洗涤种子一次。然后加入30ml6％次氯酸钠溶液，并将种子摇动40-60分钟。在除去次氯酸钠溶液后，用无菌mQ洗涤种子3-5次。
在完成灭菌(0-3小时)后，将种子在无菌滤纸上干燥，并放置在诱导培养基R001的表面上。在32℃下在连续光(3000lux)下进行6天的温育。
转化和共培养：
对于外植体制备，选择适于转化的野生型种子的膨胀胚(盾片衍生愈伤组织)，并转移到含有用掺入到植物细胞中的质粒转化的根癌农杆菌的液体感染培养基(R002)中1.5分钟，然后转移到共培养平板(R003)上。将平板在25℃黑暗中孵育3天。抗性组织的选择
选择：
共培养3天后，从种子上除去愈伤组织，用无菌mQ水洗涤几次，用含有250mg/l头孢噻肟的无菌mQ水洗涤一次，并转移到R004选择培养基中。在32℃下在连续光(3000lux)下进行温育2周。
微愈伤组织的分离和再生
通过无菌镊子将微愈伤组织转移到R005中，并在32℃的连续光(3000lux)下孵育1周。然后在暗室中检查用作选择标记的GFP。将GFP阳性的健康愈伤组织转移到R006上，并在32℃的连续光照(3000lux)下进一步孵育1周。为了连续再生，将愈伤组织转移到R007上，在32℃的连续光照(3000lux)下进行3周，在将小植株带到温室中之前，用无菌镊子将健康的小植株拔出，并在32℃的连续光照(3000lux)下转移到R008中进行2周。
表4.培养基R001至R008的组成。
Figure BDA0002568640120000291
Figure BDA0002568640120000301
Figure BDA0002568640120000311
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结果：
用含有GRF5的不同构建体对来源于稻不成熟胚的愈伤组织进行根癌农杆菌介导的转化，导致平均转化频率显著增加。作为对照或比较，使用28个随机选择的其它不含GRF5的构建体观察到的转化效率，显示平均转化效率为63％。对于'单'构建体，转化效率平均可以从63％提高到78％，对于'双'构建体，甚至可以从63％提高到84％(表5)。
表5.独立实验的转化频率，在稻中具有含GRF5的单构建体或具有与另一基因XY堆叠的GRF5。总共，测试了与来自拟南芥的GRF5堆叠中的12种不同基因("GRF5"，如SEQ IDNO:1中所示的核苷酸序列，SEQ ID NO:2的氨基酸序列)，其中重复3个实验两次(由Rep01和Rep02表示)。另外，单独和以堆叠的方式测试来自两色蜀黍的GRF5("GRF5-蜀黍"，核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示，氨基酸序列SEQ ID NO:18)。平均转化频率以粗体表示。
Figure BDA0002568640120000331
3.玉蜀黍实验
在二元质粒中使用的构建体:
通过标准克隆方法产生二元载体。在这些载体的T-DNA中，将a)编码AtGRF5的cDNA(SEQ ID NO:1)，b)编码ZmGRF5的合成DNA(版本A)(SEQ ID NO:208)，和c)编码ZmGRF5的合成DNA(版本B)SEQ ID NO:210)克隆在合适的启动子(例如BdEF1启动子)和终止子之间，以确保GRF5蛋白在玉米中足够的异位表达水平。作为对照，使用了含有在具有ZmUbi内含子的70S启动子控制下的tDT报道基因的构建体。
转化：
根癌农杆菌介导的转化通过使用不成熟胚的盾片转化单子叶植物的标准方法(例如WO95/06722)进行。
结果：
如图10所示，用含有来源于拟南芥的GRF的构建体进行根癌农杆菌介导的不成熟胚转化，导致平均转化频率显著增加，从8％增加到14％。与此相反，使用来源于不同玉蜀黍基因型的两种ZmGRF5版本增强了转化效率，强得多。对于ZmGRF5的版本A，效率从8％提高到52％，对于ZmGRF5的版本B，效率从8％提高到48％。
4.Glycine max(大豆)实验
大豆转化：
大豆转化使用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)进行，用于将T-DNA递送到位于栽培品种Jake的大豆幼苗的初级节点处的上胚轴腋生分生组织细胞中(根据OlhoftP.M.,Bernal L.M.,Grist L.B.,Hill D.S.,Mankin S.L.,Shen Y.,Kalogerakis M.,Wiley H.,Toren E.,Song H.-S.,Hillebrand H.,and Jones T.2007,A novelAgrobacterium rhizogenes-mediated transformation method soybean[Glycine max(L.)Merrill]using primary-node explants from seedlings,In VitroCell.Dev.Biol.-Plant 43:536-549；US 2014237688,WO 2006024509,WO 2005121345)。
二元质粒的产生：
通过以下标准克隆方法产生三个二元质粒。第一个二元质粒是用于实验的对照质粒(称为DsRed对照)和用于其它载体的基础载体。其在T-DNA中含有用于转基因植物细胞和组织的表型评分的DsRed基因和用于转基因细胞的优先选择的AtAHAS基因。两个基因都用合适的启动子和终止子克隆，所述启动子和终止子确保足够的异位表达以用于上述目的。第二个二元质粒含有具有编码AtGRF5(SEQ ID NO.2)的cDNA的基础载体，所述cDNA克隆在合适的启动子和终止子之间，确保GRF5蛋白在大豆中足够的异位表达水平。第三个二元质粒含有基础载体，其具有克隆在合适的启动子和终止子之间的编码GmGRF5(SEQ IDNO.106)的cDNA，确保GRF5蛋白在大豆中足够的异位表达水平。
种子灭菌和萌发：
将'Jake'栽培种的大豆种子在具有氯气的室中灭菌，所述氯气通过将3.5ml 12NHCl加入100ml漂白剂中而产生。灭菌后，将约65粒种子铺在PlantCons中的固体萌发培养基(1×B5盐和维生素，2％蔗糖，0.8％Noble琼脂(A5431Sigma-Aldrich)；pH5.8)上。幼苗在26℃光照(150μm-2s-2)中萌发7天，并用作转化的外植体材料。
农杆菌制备：
用下列载体之一转化发根农杆菌(WO2006024509)，所述载体包含：(1)pSUPER：DsRed和pPcUBI：AHAS选择标记作为对照，或对照载体加上(2)pPcUbi-AtGRF5或(3)pPcUBI-GmGRF5。使发根农杆菌生长并在Falcon试管中重悬于50ml液体接种培养基(1/10th B5盐(G768Phytotetech)、3％蔗糖、20mM MES、1X Gamborg维生素、200μM乙酰丁香酮、1.44μM赤霉酸、5.0μM激动素；pH5.4)中至OD600为1.5。然后将农杆菌悬浮液置于深培养皿中以接收制备的外植体。
外植体的制备与转化：
通过除去根和大部分下胚轴、一个子叶、子叶节处的腋生组织生长和包括所有预形成叶的初生节上方的上胚轴，从8日龄幼苗制备幼苗外植体。在制备外植体后，将大约45-50个外植体与农杆菌悬浮液在培养皿中孵育30分钟。然后将外植体置于培养皿中的湿滤纸上，所述滤纸含有共培养基(1/10th B5盐(G768Phytotech)、3％蔗糖、20mM MES、0.5％Noble琼脂(A5431
Figure BDA0002568640120000351
)、1X Gamborg维生素、200μM乙酰丁香酮、1.44μM赤霉酸、5.0μM激动素、4.1mM L-半胱氨酸、0.5mM二硫苏糖醇、0.5mM硫代硫酸钠；pH5.4)，并在室温下密封于容器中5天。
芽的发育和选择：
5天后，将外植体转移到选择培养基(1X B5盐和维生素(G398Phytotech)、3％蔗糖、3mM MES、1μM6-苄基-氨基嘌呤、5μM激动素、250mg/l特美汀STK、3μM灭草烟(imazapyr)、0.8％Noble琼脂(A5431Sigma-Aldrich)；pH5.6)，每个平板上五个，并在26℃培养。选择16天后，外植体在初生节腋生分生组织处具有显著生长，并首先对芽发育(再生)评分。在选择22天后(选择结束)，外植体从固体培养基中移出，并在(1)芽形成的质量和(2)在初生节处发育的芽上的DsRed荧光评分之前置于
Figure BDA0002568640120000352
生长培养基上。
实验设计和结果：
一个实验在四个研究者和三个构建体之间进行(表6)。用DsRed对照、AtGRF5和GmGRF5转化大豆初生节腋生分生组织。总共转化524个幼苗外植体，并在选择16天后(转化后21天)和选择22天后(转化后27天)评分。选择16天后，芽在初生节处快速生长，并且是小的、紧凑的芽盘和更大的、伸长的芽的组合(图11)。在靶组织(初生节)处的再生[(具有芽的外植体的数目)/总外植体*100]对于所有构建体为80-100％，并且在选择时在16天时固定。在16至22天之间，外植体上的芽继续快速生长。对于两个时间点，对外植体主观评分健康的、伸长的芽生长的存在，其形态("良好")预示着成功形成生根的转基因植物(图12)。用来自两个时间点的所有三种构建体转化的外植体上的"良好"芽形成增加，尤其是用AtGRF5和GmGRF5转化的外植体。在四次重复中，当与DsRed对照相比时，用GRF5的任一种形式转化的外植体倾向于具有更晚期的芽形成(更大的芽，更伸长)(图13)。
为了获得转化效率的早期测量，在选择的第16和22天对外植体进行评分，针对在初生节处是否存在DsRed发荧光的芽，这是由于转基因细胞表达DsRed蛋白。在两个时间点，DsRed表达在含有AtGRF5或GmGRF5的构建体中比DsRed对照明显更强；然而在选择时的16天更是如此(图11)。表征为具有"良好"芽形态的外植体通常具有有DsRed表达的芽(图11)。在两个时间点，与用DsRed对照转化的外植体相比，用AtGRF5或GmGRF5转化的外植体中具有表达DsRed的芽的外植体的百分比显著更高(α＝0.05)(表6；图14)。在用DsRed对照构建体转化的外植体中，在选择22天后，54.5％显示DsRed表达的芽，相较而言AtGRF5和GmGRF5分别为70.2％和74.6％(表6)。数据表明在转化后27天，用AtGRF5或GmGRF5转化的大豆外植体比未用GRF5形式转化的外植体在初生节再生的转基因芽明显更多。
表6.在选择时第16天和第22天，用AtGRF5或GmGRF5转化的外植体中转化的芽的再生显著增加。显示了再生和DsRed发荧光的芽的平均值和范围。显著不同(在α＝0.05)的构建体后跟有不同的字母；1＝[(在初生节处具有芽的外植体的数目/接种的外植体的总数{n})×100]；2＝[(在初生节具有DsRed芽的外植体的数目/接种的外植体的总数{n})×100]
Figure BDA0002568640120000361
5.欧洲油菜(卡诺拉油菜)实验
卡诺拉油菜转化：
使用发根农杆菌进行欧洲油菜转化，用于将T-DNA递送到基因型BNS3的欧洲油菜幼苗的下胚轴区段中。
种子灭菌和萌发：
通过将200-300粒种子置于50-mL Falcon管中的70％乙醇中2分钟，对种子进行表面灭菌。在轻轻摇动2分钟后，除去乙醇，加入40-50ml30％Clorox漂白剂和1滴Tween。将种子在偶尔混合下孵育10分钟。除去液体，然后用无菌水冲洗种子三次，之后将种子置于PlantCon盒中的萌发培养基(1/2×MS盐/维生素，10g l-1蔗糖，Phyto琼脂7g l-1；pH5.8)上。将这些盒置于23℃的黑暗中4至5天。
农杆菌制备：
用下列载体之一转化发根农杆菌：(1)pSUPER:DsRed和PcUBI:AHAS选择性标记作为对照，或对照载体加上(2)PcUbi-AtGRF5或(3)PcUBI-BnGRF5(SEQ ID NO.108)。使发根农杆菌生长至OD600为1.0，随后用液体感染培养基(1×MS盐/维生素，30g l-1蔗糖；pH5.8)稀释至0.1。然后将农杆菌悬浮液置于用于接收制备的下胚轴外植体的皿中。
外植体的制备与转化：
通过从萌发盒中取出并放置在用无农杆菌的感染培养基润湿的无菌滤纸上以保持幼苗肿胀，从四至五天黄化的幼苗制备下胚轴外植体。除去根、子叶和上胚轴后，制备长度为7-10mm的下胚轴节段。切割后，将外植体浸入农杆菌悬液中，印迹在干燥的无菌滤纸上，最后置于平板中共培养基(1x MS盐/维生素，30g l-1蔗糖，0.6g l-1MES，18g l-1甘露醇，7g l-1Phyto琼脂，1mg l-12,4-D，100mg l-1乙酰丁香酮，200mg l-1L-半胱氨酸，pH5.6)顶部的滤纸上。一旦铺上～50个外植体，用微孔胶带密封平板，在23℃光照下，16小时光照/8小时黑暗光周期培养3天。
愈伤组织发育和芽起始：
3天后，将所有外植体转移到恢复培养基(1×MS盐/维生素，30g l-1蔗糖，0.6g l- 1MES，18g l-1甘露醇，7g l-1Phyto琼脂，1mg l-12,4-D，300mg l-1特美汀；pH5.6)中，用微孔胶带密封，并在23℃培养7天。一周后将外植体转移到选择培养基#1(1×MS盐/维生素，30gl-1蔗糖，0.5g l-1MES，7g l-1Phyto琼脂，3mg l-1BAP，0.1mg l-1NAA，0.1mg l-1GA3，2.5mg l- 1AgNO3，100nM咪唑乙烟酸，300mg l-1特美汀；pH5.8)中，在23℃下在16h光/8h黑暗光周期下培养14天。选择两周后，将外植体转移到选择培养基2(1x MS盐/维生素，30g l-1蔗糖，0.5gl-1MES，7g l-1Phyto琼脂，0.5mg l-1BAP，0.1mg l-1GA3，2.5mg l-1AgNO3，100nM咪唑乙烟酸，300mg l-1特美汀；pH5.8)中。
实验设计和结果：
在3名研究者中进行五个随时间的实验，每个研究者最少一个重复(表卡诺拉油菜-1)。在实验1中，仅对于实验1用DsRed对照和BnGRF5构建体转化欧洲油菜下胚轴；在其它实验中，外植体用DsRed对照、AtGRF5和BnGRF5构建体转化。总共接种3,156个外植体，在16-22天后进行DsRed荧光评分。在这个时间点，外植体迅速地发育愈伤组织，尤其是在下胚轴的切断端。对于外植体，评分外植体上是否存在DsRed荧光，而不考虑单个外植体的大小、强度和频率。DsRed表达部分的频率是处理的转化效率的早期指标。
DsRed表达在含有AtGRF5或BnGRF5的构建体中比DsRed对照明显更强(图15)。与用DsRed对照转化的外植体相比，用AtGRF5或BnGRF5转化的外植体中具有DsRed表达芽的外植体的百分比显著更高(表7；图16)。在用DsRed对照构建体转化的外植体中，20.1％显示DsRed表达的芽，相较而言AtGRF5和GmGRF5分别为56.6％和58.5％。0数据表明在转化后21天，用AtGRF5或BnGRF5转化的欧洲油菜外植体比未用GRF5任一形式转化的外植体具有多3倍的转基因愈伤组织部分(统计学上显著，α＝0.05)。在处理(构建体)之间没有检测到研究者和实验之间的显著差异。
表7.在接种后21天，转化的愈伤组织在用AtGRF5或BnGRF5转化的外植体上显著增加。显示了再生和DsRed发荧光愈伤组织的平均值和范围。显著不同(在α＝0.05)的构建体后跟有不同的字母；1＝[(具有DsRed愈伤组织的外植体的数目/接种的外植体的总数{n})×100]。
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Claims (15)

1.一种转化植物细胞的方法，包括以下步骤
(a1)平行或顺序地将以下引入植物细胞
i.至少一种目的核苷酸序列；以及
ii.包含编码GRF5多肽的多核苷酸的表达盒、编码GRF5多肽的mRNA或GRF5多肽；或
(a2)将至少一种目的核苷酸序列引入植物细胞；以及
在所述植物细胞中平行或顺序诱导编码GRF5多肽的内源基因的增强的表达水平；以及
(b)任选地，在一定条件下培养(a1)或(a2)的植物细胞或衍生自(a1)或(a2)的植物细胞的植物细胞，在所述条件中在所述植物细胞中，GRF5多肽由表达盒表达，GRF5多肽由引入的mRNA翻译，GRF5多肽由内源基因增强表达，或存在GRF5多肽。
2.修饰植物细胞基因组的方法，包括步骤
(a1)将如下引入植物细胞：包含编码GRF5多肽的多核苷酸的表达盒、编码GRF5多肽的mRNA或GRF5多肽；或
(a2)在植物细胞中诱导编码GRF5多肽的内源基因的增强的表达水平；以及
(b)在一定条件下培养(a1)或(a2)的植物细胞或衍生自(a1)或(a2)的植物细胞的植物细胞，在所述条件中在所述植物细胞中，GRF5多肽由表达盒表达，GRF5多肽由引入的mRNA翻译，GRF5多肽由内源基因增强表达，或存在GRF5多肽；
(c)通过双链DNA断裂(DSB)诱导酶和任选地通过修复核酸分子修饰(b)的植物细胞的基因组，所述诱导酶，所述酶优选地识别所述细胞的基因组中的预定位点，
其中在所述预定位点的所述基因组的修饰选自
i.至少一个核苷酸的置换；
ii.至少一个核苷酸的缺失；
iii.至少一个核苷酸的插入；或
iv.i-iii的任何组合；以及
其中步骤(c)与步骤(a1)/(a2)和/或(b)同时进行，在步骤(a1)/(a2)之前进行，在步骤(a1)/(a2)和(b)之间进行或在步骤(b)之后进行。
3.一种产生转基因植物的方法，包括步骤
(a)根据权利要求1的方法转化植物细胞，和
(b)从(a)的植物细胞或从(a)的植物细胞衍生的植物细胞再生包含至少一个细胞的植物，所述细胞包含作为转基因的至少一个目的核苷酸序列。
4.一种产生遗传修饰植物的方法，包括步骤
(a)根据权利要求2的方法修饰植物细胞的基因组，和
(b)从(a)的植物细胞或从衍生自(a)的植物细胞再生在至少一个细胞中包含基因组修饰的植物。
5.产生单倍体植物胚的方法，包括步骤
(a1)将如下引入未成熟雄配子体或小孢子中：包含编码GRF5多肽的多核苷酸的表达盒、编码GRF5多肽的mRNA或GRF5多肽的mRNA；或
(a2)在未成熟雄配子体或小孢子中诱导编码GRF5多肽的内源基因的增强的表达水平；以及
(c)在一定条件下培养(a)的未成熟雄配子体或小孢子，其中在未成熟雄配子体或小孢子中，GRF5多肽从表达盒表达，GRF5多肽从引入的mRNA翻译，GRF5多肽从内源基因增强表达，或存在GRF5多肽；以及
(d)选择来源于步骤(b)的未成熟雄性配子体或小孢子的单倍体植物胚。
6.权利要求1至5任一项的方法，其中所述GRF5多肽包含PFAM结构域PF08880和PFAM结构域PF08879，优选地其中所述PFAM结构域PF08880发现在GRF5多肽的N-末端处或附近至少90％覆盖的匹配，且所述PFAM结构域PF08879发现在GRF5多肽中位于PFAM结构域PF08880的C-末端至少90％的匹配。
7.权利要求6的方法，其中两个匹配氨基酸区段均位于GRF5多肽的N-末端半部，优选地所述匹配PFAM结构域PF08880的氨基酸区段位于GRF5多肽的N-末端四分之一。
8.权利要求1-7任一项的方法，其中GRF5多肽包含基序[D]-[PL]-[E]-[P]-[G]-[R]-[C]-[R]-[R]-[T]-[D]-[G]-[K]-[K]-[W]-[R]-[C]-[SA]-[RK]-[ED]-[A]-[YH]-[P]-[D]-[S]-[K]-[Y]-[C]-[E]-[KR]-[H]-[M]-[H]-[R]-[G]-[RK]-[N]-[R](SEQ ID NO:177)且具有至多三个错配，其中所述基序优选由氨基酸序列SEQ ID NO:41至SEQ ID NO:104或SEQID NO:113至SEQ ID NO:176的任何组成，且其中优选地基序包含与PFAM结构域PF08879匹配的氨基酸区段的亚区域。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述GRF5多肽包含
(i)包含SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、106、108、110、112或209的氨基酸序列；或
(ii)一种氨基酸序列，其包含与(i)的氨基酸至少70％同一的序列。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述编码GRF5多肽的多核苷酸包括
(i)包含SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、105、107、109、111、207、208或210的核苷酸序列；
(ii)包含与(i)的核苷酸序列至少70％同一的序列的核苷酸序列；
(iii)在遗传密码简并性范围内编码由(i)或(ii)编码的多肽的核苷酸序列；
(iv)与(i)、(ii)或(iii)的核苷酸序列互补的核苷酸序列；或
(v)在严格条件下与(iv)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中将包含编码GRF5多肽的多核苷酸的表达盒引入植物细胞导致其稳定整合到所述植物细胞的基因组中，或其中将包含编码GRF5多肽的多核苷酸的表达盒、编码GRF5多肽的mRNA或GRF5多肽引入植物细胞中，或在植物细胞中诱导编码GRF5多肽的内源基因的表达水平增强导致GRF5多肽在所述植物细胞或其后代细胞中瞬时出现。
12.权利要求1至11任一项的方法，其中编码GRF5多肽的多核苷酸与适合于在植物细胞中表达GRF5多肽的至少一种调节序列可操作连接。
13.权利要求1至4的方法，其中步骤(a1)或(a2)的植物细胞是体细胞组织、愈伤组织、分生组织或胚组织的细胞，或原生质体。
14.通过权利要求3或4的方法获得的或能够获得的植物，或其后代植物。
15.权利要求14的植物的植物细胞或种子，其中所述植物细胞或种子包含至少一种作为转基因的目的核苷酸序列或包含基因组中的修饰。
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