BR112020013605A2 - métodos para transformar uma célula vegetal, para modificar o genoma, para produzir uma planta transgênica, para produzir uma planta genéticamente modificada e para produzir um embrião vegetal haploide, planta e célula vegetal ou semente de planta - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se ao campo do melhoramento de plantas e, em particular, à geração de plantas a partir de células e outros tecidos. Mais particularmente, a invenção proporciona métodos e meios para melhorar a regeneração de plantas, especialmente a partir de células vegetais transformadas ou geneticamente modificadas.

Description

“MÉTODOS PARA TRANSFORMAR UMA CÉLULA VEGETAL, PARA MODIFICAR O GENOMA, PARA PRODUZIR UMA PLANTA TRANSGÊNICA, PARA PRODUZIR UMA PLANTA GENÉTICAMENTE MODIFICADA E PARA PRODUZIR UM EMBRIÃO VEGETAL HAPLOIDE, PLANTA E CÉLULA VEGETAL OU SEMENTE DE PLANTA”

[001] A presente invenção refere-se ao campo do melhoramento de plantas e biotecnologia e, particularmente, à geração de plantas a partir de células e outros tecidos. Mais particularmente, a invenção proporciona métodos e meios para melhorar a regeneração de plantas, especialmente a partir de células vegetais transformadas ou geneticamente modificadas.

[002] No melhoramento vegetal, o processo de manipulação de espécies de plantas tem sido uma prática desde quase o início da civilização humana, com o intuito de criar genótipos e fenótipos desejados para fins específicos. Com o desenvolvimento da engenharia genética, esse campo da agricultura mudou significativamente nas últimas décadas. Uma variedade de métodos de engenharia genética para plantas foi desenvolvida. A escolha do método de transformação depende de inúmeras variáveis, principalmente das espécies de plantas a serem transformadas, do objetivo do experimento e da disponibilidade de equipamento necessário. A grande maioria das técnicas de transformação de plantas requer o uso de explantes com alta capacidade de regeneração como material de partida. Além disso, a edição de genes constitui um novo método biológico molecular por meio do qual, modificações específicas como inserções, deleções ou mutações pontuais ou combinações das mesmas podem ser introduzidas no genoma de uma planta. Para isso, são necessários instrumentos moleculares específicos que primeiramente tenham atividade de nuclease, mas acima de tudo que possam ser guiados para a sequência alvo a ser modificada com especificidade suficiente para programar e realizar uma mutagênese sítio-específica e sítio-dirigida. Nos últimos anos na biotecnologia vegetal, a edição específica do genoma se tornou uma alternativa ao melhoramento convencional e às estratégias transgênicas. No entanto, ferramentas atualmente disponíveis, como meganucleases, nucleases de dedo de zinco (ZFNs), “nucleases efetoras do tipo ativador de transcrição” (TALENs) ou sistemas CRISPR são usadas apenas em biotecnologia vegetal em uma extensão limitada, devido às capacidades limitadas de regeneração do material de partida das plantas.

[003] Uma grande variedade de células tem o potencial de se desenvolver em embriões, incluindo células gametofíticas haploides, como as células dos sacos de pólen e embriões (consulte Forster, B.P., et al. (2007) Trends Plant Sci. 12: 368-375 e Seguí-Simarro, J.M. (2010) Bot. Rev. 76: 377- 404), bem como células somáticas derivadas das três camadas fundamentais de tecido vegetal (Gaj, M.D. (2004) Plant Growth Regul. 43: 27-47 ou Rose, R., et al. (2010) “Developmental biology of somatic embryogenesis” em: Plant Developmental Biology-Biotechnological Perspectives, Pua E-C e Davey MR, Eds. (Berlin Heidelberg: Springer), págs. 3-26).

[004] A capacidade de regenerar em plantas é frequentemente limitada a genótipos específicos em uma determinada espécie de planta e enfraquecida em células vegetais transformadas e geneticamente modificadas e em outros tecidos precursores. Mesmo que a etapa de transformação e modificação genética de uma célula vegetal seja bem-sucedida, isso não significa necessariamente que as plantas desejadas possam realmente ser obtidas a partir das células modificadas. Supõe-se que o tratamento ao qual as células vegetais e outros tecidos precursores são submetidos a fim de se obter uma modificação genética, afete o desenvolvimento e a regeneração das plantas. Assim, é um objetivo da presente invenção melhorar a eficácia de métodos previamente conhecidos para gerar plantas transgênicas e geneticamente modificadas e suportar a regeneração de plantas a partir de células vegetais modificadas e outros precursores vegetais.

[005] Na presente invenção, foi surpreendentemente descoberto que o gene GRF5 (fator 5 regulador do crescimento) de Arabidopsis tem um efeito no aumento da regeneração de plantas que nunca foi relatado para este gene ou seus homólogos da família de genes GRF.

[006] Em van der Knaap et al. (2000; “A novel gibberellin-induced gene from rice and its potential regulatory role in stem growth”, Plant physiology, 122 (3), 695-704) os autores identificaram e caracterizaram o primeiro membro da família de genes GRF em arroz (OsGRF1). Este era um gene induzido pelo ácido giberélico em meristemas intercalares. A superexpressão em Arabidopsis causou comprometimento do crescimento do caule, esterilidade feminina e redução da fertilidade masculina. A aplicação de ácido giberélico não conseguiu recuperar o defeito de alongamento do caule das plantas transformadas, sugerindo que o OsGRF1 poderia participar do alongamento do caule induzido pelo GA. Em 2003, Kim et al. (“The AtGRF family of putative transcription factors is involved in leaf and cotyledon growth in Arabidopsis”, The Plant Journal, 36 (1), 94-104) caracterizaram a família de genes GRF de Arabidopsis e determinaram que os genes são expressos principalmente nos tecidos em crescimento ativo. A análise de mutantes nulos e plantas transgênicas que superexpressam AtGRF1 e AtGRF2 indicou que alguns membros da família GRF estão envolvidos na regulação da expansão celular durante o crescimento de folhas e cotilédones. Além disso, as plantas superexpressoras apresentaram um tempo de fixação tardio, revelando um papel putativo na floração. Em um estudo para determinar os mecanismos moleculares que coordenam a proliferação celular no desenvolvimento de folhas, Rodriguez et al. descobriram que o miR396 antagoniza o padrão de expressão de seus alvos, os fatores de transcrição de GRF, em Arabidopsis ((2010), “Control of cell proliferation in Arabidopsis thaliana by microRNA miR396”, Development, 137 (1), 103-112). Assim, o equilíbrio entre miR396 e os GRFs controla o número final de células nas folhas. Além disso, os autores mostraram que miR396s que visam GRFs podem regular o tamanho do meristema apical do caule.

[007] Em 2005, Horiguchi et al. (“The transcription factor AtGRF5 and the transcription coactivator AN3 regulate cell proliferation in leaf primordia of Arabidopsis thaliana”, The Plant Journal, 43 (1), 68-78.) primeiro caracterizaram o AtGRF5 e seu parceiro interativo ANGUSTIFOLIA3 (AN3). Os mutantes por nocaute gênico atgrf5 e an3 desenvolveram folhas estreitas devido ao número de células diminuído, ao passo que a proliferação celular em primórdios foliares foi reforçada nas linhagens que superexpressavam AtGRF5 e AN3. Kuijt et al. ((2014), “Interaction between the GROWTH-REGULATING FACTOR and KNOTTED1-LIKE HOMEOBOX Families of Transcription Factors”, Plant physiology, 164 (4), 1952-1966) demonstraram que os membros da família GRF desempenham um papel na rede que controla a expressão dos genes KNOTTED1-LIKE HOMEBOX (KNOX), que estão envolvidos na restrição da diferenciação celular no meristema apical do caule. AtGRF4, AtGRF5 e AtGRF6 são capazes de se ligar ao promotor de um gene KNOX, reprimindo sua expressão. As mudas de Arabidopsis que superexpressam AtGRF4, AtGRF5 ou AtGRF6 mostram aberrações no desenvolvimento do meristema apical do caule. Em um estudo recente de Vercruyssen et al.

((2015), “Growth regulating factor 5 stimulates Arabidopsis chloroplast division, photosynthesis, and leaf longevity”, Plant physiology, pp. 114) as folhas de Arabidopsis que superexpressam GRF5 apresentaram maior número de cloroplasto por célula, aumento no teor de clorofila e senescência foliar retardada.

[008] Em resumo, é sabido que o gene AtGRF5 de Arabidopsis e outros genes GRF desempenham um papel importante na morfogênese foliar e desenvolvimento do caule. Além disso, foi relatado que os genes GRF têm função no desenvolvimento da floração, e desenvolvimento da semente e raiz, controlando o crescimento de plantas sob condições de estresse e regulando a longevidade da planta. Entretanto, durante os estudos, os inventores da presente invenção encontraram surpreendentemente outra e nova função dessa família de genes. O GRF5 é capaz de prover um efeito positivo no sentido de impulsionar a regeneração da planta e, portanto, permitindo uma recuperação mais eficiente de plantas transgênicas. A presente invenção permite melhorar a regeneração de diferentes tecidos ou células (por exemplo, microesporos), podendo superar resistência para a regeneração de plantas, em especial a dependência de genótipo, melhorar a recuperação da planta transgênica, por exemplo, pela coexpressão do gene de interesse e do gene GRF5, e de plantas modificadas no genoma, por exemplo, coexpressão transitória de componentes de edição do genoma e GRF5, além de encurtar o tempo para a produção e recuperação de linhagens transgênicas. Assim, um primeiro aspecto da presente invenção é o uso do polipeptídeo de GRF5 para melhorar a capacidade de regenerativa de uma planta.

[009] Qualquer referência a seguir a um polipeptídeo ou proteína útil nos métodos da presente invenção é utilizada para designar um polipeptídeo GRF5 ou proteína GRF5 conforme definido no presente. Qualquer referência a seguir a um ácido nucleico ou polinucleotídeo útil nos métodos da invenção (exceto a sequência nucleotídica de interesse que está sendo transformada ou a molécula de ácido nucleico opcionalmente usada como molde de reparo para modificar o genoma de uma planta) é entendida como um ácido núcleo ou polinucleotídeo capaz de codificar um polipeptídeo GRF5 ou proteína GRF5. Em um exemplo de realização, qualquer referência a um polipeptídeo/proteína ou ácido nucleico/polinucleotídeo útil nos métodos da invenção deve ser entendida como significando proteínas ou ácidos nucleicos úteis nos métodos, construções, cassetes de expressão, células vegetais, plantas, sementes, partes e colhíveis e produtos da invenção. O ácido nucleico/polinucleotídeo, incluindo mRNA(s) a ser(em) introduzido(s) em uma célula vegetal ou planta (e, portanto, útil na execução dos métodos da invenção) é qualquer ácido nucleico/polinucleotídeo que codifica o tipo de polipeptídeo/proteína que será agora descrito, doravante também denominado “ácido nucleico GRF5”, “polinucleotídeo GRF5”, “gene GRF5” ou “mRNA GRF5” ou similares.

[010] Um “polipeptídeo GRF5” ou “proteína GRF5”, conforme definido na presente invenção, refere-se a qualquer fator de transcrição, de preferência uma proteína GF14 semelhante a 14-3-3, mais preferencialmente compreendendo um domínio PFAM PF08880 (também conhecido como domínio QLQ) e um domínio PFAM PF08879 (também conhecido como domínio WRC) quando analisado com o software Interproscan (www.ebi.ac.uk/interpro), e ainda mais preferencialmente compreende um domínio PFAM PF08880 que encontra uma correspondência de pelo menos 90%, pelo menos 91%, em pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de cobertura na porção N-terminal ou próximo ao polipeptídeo GRF5 e o domínio PFAM PF08879 que encontra uma correspondência de pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos Cobertura de 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de cobertura na porção C-terminal do domínio PFAM PF08880 do polipeptídeo GRF5, ou seja, o trecho de aminoácido correspondente a PF08879 está localizado na direção da tradução atrás do trecho de aminoácidos correspondente ao PF08880. De preferência, pelo menos uma das correspondências tem uma cobertura de pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos

98%, pelo menos 99% ou 100%.

[011] Em um exemplo de realização, ambos os trechos de aminoácidos correspondentes estão localizados na metade N-terminal do polipeptídeo GRF5, preferencialmente o trecho de aminoácidos correspondendo ao domínio PFAM PF08880 está localizado no quarto N- terminal do polipeptídeo GRF5. De preferência, o domínio PFAM PF08880 corresponde aos resíduos de aminoácidos do polipeptídeo GRF5 a partir do resíduo 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 do polipeptídeo GRF5, de preferência do resíduo 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou 21, e o domínio PFAM PF08879 corresponde aos resíduos de aminoácidos do polipeptídeo GRF5 a partir dos resíduos 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99 do polipeptídeo GRF5, de preferência do resíduo 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 ou 95. De preferência, a distância entre o resíduo de aminoácido inicial do domínio PFAM correspondente ao trecho de aminoácido PF08880 e o resíduo de aminoácido inicial do domínio PFAM correspondente ao trecho de aminoácido PF08879 é de 60 a 82 aminoácidos dentro do polipeptídeo GRF5, mais preferencialmente de 60 a 75 aminoácidos, mais preferencialmente 61 a 75 aminoácidos, ainda mais preferencialmente de 62 a 73 aminoácidos dentro do polipeptídeo GRF5.

[012] Em um exemplo de realização adicional, o polipeptídeo GRF5, conforme utilizado na presente invenção, compreende o motivo indicador: [D]-[PL]-[E]-[P]-[G]-[R]-[C]-[R]-[R]-[T]-[D]-[G]-[K]-[K]-[W]-[R]-[C]-[SA]-[RK]-[ED]- [A]-[YH]-[P]-[D]-[S]-[K]-[Y]-[C]-[E]-[KR]-[H]-[M]-[H]-[R]-[G]-[RK]-[N]-[R], em que é permitido/tolerável que o polipeptídeo GRF5 exiba um número máximo de três posições não correspondentes no pareamento de sequência (mismatches) em comparação com o motivo indicador, ou seja, até três posições não correspondentes no pareamento de sequência (mismatches) podem aparecem em um alinhamento de sequência entre o respectivo polipeptídeo GRF5 e o motivo indicador, de preferência um número máximo de duas posições não correspondentes no pareamento de sequência (mismatches) em comparação com o motivo indicador, ou seja, até duas posições não correspondentes no pareamento de sequência (mismatches) podem aparecer em um alinhamento de sequência entre o respectivo polipeptídeo GRF5 e o motivo indicador, mais preferencialmente um número máximo de uma posição não correspondente no pareamento de sequência (mismatch) em comparação com o motivo indicador, ou seja, apenas uma posição não correspondente no pareamento de sequência (mismatch) pode aparecer em um alinhamento de sequência entre o respectivo polipeptídeo GRF5 e o motivo indicador e, mais preferencialmente, sem mismatch em comparação com o motivo indicador. Em um exemplo de realização particularmente preferido, uma das posições não correspondentes no pareamento da sequência (mismatches) ou o único mismatch está localizado na posição 2 do motivo indicador e mais preferencialmente o pareamento não correspondente (mismatch) é [A] em vez de [P]. Uma posição não correspondente no pareamento de sequência (mismatch) significa que o aminoácido em uma determinada posição, de acordo com o motivo indicador, é substituído por um aminoácido diferente ou é excluído ou alterado pela inserção de pelo menos um aminoácido adicional. As letras do motivo indicador entre colchetes indicam o resíduo de aminoácido (código de uma letra) e o motivo representa a ordem dos resíduos de aminoácidos na direção N-terminal para C- terminal, como presente em qualquer polipeptídeo GRF5 da presente invenção.

Se houver duas letras dentro de um colchete, elas representam alternativas. O motivo foi deduzido de uma comparação abrangente de sequências de polipeptídeos GRF5 derivadas de 16 espécies vegetais diferentes, incluindo plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas e permite distinguir polipeptídeos

GRF5 de outros membros da família de proteínas GRF como GRF1 (consulte a Figura 5A). A análise de motivos exemplares por alinhamento/comparação de sequência para a determinação do número de posições não correspondentes no pareamento de sequência (mismatches) é mostrada na Figura 5B.

Preferencialmente, o motivo está localizado na metade N-terminal do polipeptídeo GRF5, mais preferencialmente o motivo está localizado na metade N-terminal do polipeptídeo GRF5 e contém uma sub-região do trecho de aminoácidos correspondente ao domínio PFAM PF08879, ou seja, o motivo tem uma sobreposição sequencial com o trecho de aminoácidos correspondente ao domínio PFAM PF08879. Preferencialmente, o motivo indicador consiste em qualquer uma das sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 a SEQ ID NO: 104 ou SEQ ID NO: 113 a SEQ ID NO: 176. Correspondentemente, o polipeptídeo GRF5 compreende preferencialmente um motivo contíguo que consiste em qualquer uma das sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 a SEQ ID NO : 104 ou SEQ ID NO: 113 a SEQ ID NO: 176.

[013] Exemplos de polipeptídeos GRF5 de diversas espécies de plantas úteis nos métodos da presente invenção estão adicionalmente descritos abaixo. Na Tabela 1, são indicadas as localizações do domínio PFAM: PF08880 e do domínio PFAM: PF08879, bem como a cobertura individual em qualquer uma das sequências GRF5 apresentadas.

TABELA 1 ANÁLISES DE DOMÍNIO EM POLIPEPTÍDEOS GRF5 DERIVADOS DE 16 ESPÉCIES

VEGETAIS DIFERENTES Domíio pfam, a partir Domínio PFAM, até Compr. do domínio % do compr. do Domínio PFAM domínio pfam domínio pfam Descrição do [SEQ ID NO] Sequência Sequência a partir de (i) valor_e coberta Escore (hmm) pfam até de

Domíio pfam, a partir

Domínio PFAM, até Compr. do domínio

% do compr. do Domínio PFAM domínio pfam domínio pfam Descrição do [SEQ ID NO]

Sequência

Sequência a partir de (i) valor_e coberta Escore (hmm)

pfam até de 1,60E- 2 PF08879 WRC 43 72,5 1 41 82 124 95 20 7,80E- 2 PF08880 QLQ 35 57,4 1 35 16 50 100 16 1,10E- 4 PF08879 WRC 43 73 1 43 88 130 100 20 3,00E- 4 PF08880 QLQ 35 58,8 1 34 20 54 97 16 1,90E- 6 PF08879 WRC 43 72,3 1 43 91 133 100 20 7,00E- 6 PF08880 QLQ 35 51,2 1 33 19 53 94 14 2,00E- 8 PF08879 WRC 43 72,2 1 43 94 136 100 20 2,20E- 8 PF08880 QLQ 35 56 1 34 21 55 97 15 1,20E- 10 PF08879 WRC 43 72,9 1 41 82 124 95 20 3,30E- 10 PF08880 QLQ 35 58,6 1 35 16 50 100 16 1,80E- 12 PF08879 WRC 43 72,3 1 41 82 124 95 20 3,30E- 12 PF08880 QLQ 35 58,6 1 35 16 50 100 16 1,20E- 14 PF08879 WRC 43 72,9 1 41 82 124 95 20 3,30E- 14 PF08880 QLQ 35 58,6 1 35 16 50 100 16 1,20E- 16 PF08879 WRC 43 72,9 1 41 82 124 95 20 4,90E- 16 PF08880 QLQ 35 58,1 1 35 16 50 100 16 1,80E- 18 PF08879 WRC 43 72,3 1 43 90 132 100 20 6,90E- 18 PF08880 QLQ 35 51,2 1 33 18 52 94 14 2,50E- 20 PF08879 WRC 43 75,1 1 43 88 130 100 21 2,30E- 20 PF08880 QLQ 35 55,9 1 34 18 52 97 15 2,30E- 22 PF08879 WRC 43 72 1 43 72 114 100 20 22 PF08880 QLQ 35 8,50E- 57,3 1 35 10 44 100

Domíio pfam, a partir Domínio PFAM, até Compr. do domínio % do compr. do Domínio PFAM domínio pfam domínio pfam Descrição do [SEQ ID NO] Sequência Sequência a partir de (i) valor_e coberta Escore (hmm) pfam até de 16 1,10E- 24 PF08879 WRC 43 73 1 43 94 136 100 20 2,20E- 24 PF08880 QLQ 35 56 1 34 21 55 97 15 1,90E- 26 PF08879 WRC 43 72,2 1 43 94 136 100 20 2,20E- 26 PF08880 QLQ 35 56 1 34 21 55 97 15 2,80E- 28 PF08879 WRC 43 74,9 1 43 79 121 100 21 8,50E- 28 PF08880 QLQ 35 47,7 1 34 13 47 97 13 2,30E- 30 PF08879 WRC 43 75,2 1 43 75 117 100 21 2,50E- 30 PF08880 QLQ 35 55,8 2 34 9 43 94 15 1,90E- 32 PF08879 WRC 43 72,3 1 43 91 133 100 20 3,50E- 32 PF08880 QLQ 35 55,4 1 34 18 52 97 15 2,80E- 106 PF08879 WRC 43 74,9 1 43 79 121 100 21 8,50E- 106 PF08880 QLQ 35 47,7 1 34 13 47 97 13 1,20E- 108 PF08879 WRC 43 72,9 1 41 82 124 95 20 3,30E- 108 PF08880 QLQ 35 58,6 1 35 16 50 100 16 110 PF08879 WRC - - - 2 43 95 137 - 110 PF08880 QLQ - - - 1 37 13 49 - 112 PF08879 WRC - - - 1 43 90 131 - 112 PF08880 QLQ - - - 1 33 15 49 - 209 PF08879 WRC - - - 1 43 90 131 - 209 PF08880 QLQ - - - 1 33 15 49 -

[014] De acordo com um aspecto, a invenção provê um método para transformar uma célula vegetal compreendendo as etapas de; (a1) introdução em uma célula vegetal de;

(i) pelo menos uma sequência nucleotídica de interesse; e

(ii) um cassete de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo GRF5,

mRNA(s) que codifica(m) o polipeptídeo GRF5 ou um polipeptídeo GRF5, em que (i) e (ii) podem ser introduzidos de maneira paralela ou sequencial em qualquer ordem, ou

(a2) introdução em uma célula vegetal de pelo menos uma sequência nucleotídica de interesse; e induzir na referida célula vegetal de maneira paralela ou sequencial um intensificador do nível de expressão de um gene endógeno que codifica um polipeptídeo GRF5; e

(b) opcionalmente, cultivo a célula vegetal de (a1) ou (a2) ou uma célula vegetal derivada da célula vegetal de (a1) ou (a2)

em condições em que na célula vegetal o polipeptídeo GRF5 é expresso a partir do cassete de expressão, o polipeptídeo

GRF5 é traduzido a partir do(s) mRNA(s) introduzido(s), o(s)

polipeptídeo(s) GRF5 tem(têm) a expressão intensificada/aumentada a partir do gene endógeno, ou o(s)

polipeptídeo(s) GRF5 está(estão) presente(s),

preferivelmente em uma quantidade aumentada em comparação com o quantidade encontrada em células vegetais tipo selvagem ou uma célula vegetal na qual o cassete de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo GRF5, mRNA(s) que codifica(m) o polipeptídeo GRF5 ou possuindo o(s) polipeptídeo(s) GRF5 não foi introduzido de acordo com a etapa (a1) ou no qual o nível de expressão intensificado de um gene endógeno que codifica o polipeptídeo GRF5 não foi induzido de acordo com a etapa (a2).

[015] O método de acordo com a presente invenção produz uma célula vegetal modificada ou transformada possuindo uma melhor capacidade de regeneração devido à presença de GRF5 ou a presença de GRF5 em uma quantidade aumentada. É preferível, no entanto, que na célula vegetal modificada a presença de GRF5 ou a presença de GRF5 em uma quantidade aumentada seja transitória.

[016] A transformação de uma célula vegetal significa introduzir uma molécula de ácido nucleico em uma célula vegetal de maneira a causar integração estável no genoma da célula vegetal ou aparência transitória na célula vegetal, levando à expressão da sequência de ácido nucleico, por exemplo, constitutivamente, temporalmente ou especificamente relacionada com determinado(s) tecido(s) ou estágio(s) de desenvolvimento e etc. A transformação e a regeneração de células vegetais monocotiledôneas e dicotiledôneas são rotineiras, e a seleção da técnica de transformação mais apropriada será determinada pelo especialista. A escolha do método varia de acordo com o tipo de planta ou genótipo a ser transformado; os especialistas na técnica reconhecerão a adequação de métodos particulares para determinados tipos de plantas ou genótipos. Os métodos adequados podem incluir, mas não estão limitados a: eletroporação de protoplastos vegetais; transformação mediada por lipossomas; transformação mediada por polietileno glicol (PEG); transformação usando vírus; microinjeção de células vegetais; bombardeio de microprojéteis de células vegetais; infiltração a vácuo; e transformação mediada por Agrobacterium.

[017] A etapa (a1) (i) ou (a2) de introdução de pelo menos uma sequência de nucleotídeos de interesse pode ser realizada usando qualquer método adequado comumente conhecido no estado da técnica. Estão disponíveis vários métodos para transferir ácidos nucleicos de interesse para as células vegetais. Um método mediado por vetor exemplar é a transformação mediada por Agrobacterium, conforme descrito, por exemplo, por Lindsay & Gallois, 1990, Journal of Experimental Botany, e Kischenko et al., 2005, Cell Biology International for sugar, por Ishida et al., 2007, (“Agrobacterium- mediated transformation of maize” Nature protocols, 2 (7), 1614-1621) para milho, ou pela empresa PureWheat Technology da Japan Tobacco para trigo.

Outras técnicas adequadas incluem bombardeio de partículas e eletroporação.

[018] A sequência nucleotídica de interesse de acordo com a invenção pode ser uma sequência de DNA ou RNA, por exemplo, mRNA, siRNA, miRNA etc. De modo mais específico, a sequência nucleotídica de interesse codifica pelo menos uma característica fenotípica. De preferência, a característica fenotípica conferida pelo DNA ou RNA pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em resistência/tolerância ao estresse biótico, incluindo resistência/tolerância a patógenos, em que o patógeno pode ser um vírus, patógeno bacteriano, fúngico ou animal, resistência/tolerância ao estresse abiótico, incluindo resistência/tolerância ao resfriamento, resistência/tolerância ao estresse por seca, resistência/tolerância osmótica, resistência/tolerância ao estresse por calor, resistência/tolerância ao estresse causado por frio ou geada, resistência/tolerância ao estresse oxidativo, resistência/tolerância ao estresse por metais pesados, resistência/tolerância ao estresse por sal ou alagamento, resistência/tolerância ao acamamento, resistência/tolerância à quebra, resistência/tolerância contra um ou mais herbicidas como o glifosato, glufosinato, 2,4-D, dicamba, inibidores da ALS e etc. A pelo menos uma característica fenotípica de interesse também pode ser selecionada a partir do grupo que consiste na modificação de outra característica agronômica de interesse, incluindo aumento do rendimento, modificação do tempo de floração, modificação da cor das sementes,

modificação da composição do endosperma, modificação do teor nutricional ou engenharia metabólica de uma via de interesse.

[019] No contexto da presente invenção, o GRF5 pode ser introduzido como um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo GRF5, como mRNA que codifica um polipeptídeo GRF5 (incluindo também o mRNA pré-mRNA ou precursor) ou como um polipeptídeo GRF5. Técnicas exemplificativas para a introdução de uma molécula de ácido nucleico são descritas acima. Alternativamente, o GRF5 pode ser fornecido na célula vegetal, ativando a expressão do gene endógeno que codifica o polipeptídeo GRF5. Isto conduziria a um nível de expressão aumentada do gene GRF5 endógeno, ou seja, a presença ou a ocorrência do polipeptídeo GRF5 em uma quantidade aumentada na célula vegetal. A ativação da expressão do gene endógeno pode ser alcançada modificando a atividade ou estrutura do promotor do gene endógeno que codifica o polipeptídeo GRF5. Por exemplo, elementos intensificadores/ facilitadores (enhancers) podem ser introduzidos no promotor por meio da edição de genes; ou um elemento intensificador que regula o promotor pode ser ainda mais fortalecido ou um elemento silenciador que regula o promotor pode ser enfraquecido, por exemplo, pela mutagênese/modificação direcionada; ou podem ser introduzidas modificações no epigenoma relacionado aos intensificadores por meio de ferramentas de edição de genes, tal como sistemas CRISPR (Hilton et al. (2015). Epigenome editing by a CRISPR-Cas9-based acetyltransferase activates genes from promoters and enhancers. Nature biotechnology, 33(5), 510-517); ou fatores de transcrição sintéticos baseados, por exemplo, em ativadores TALE ou ativadores dCas9 podem ser introduzidos na célula onde eles são capazes de ligar a locais de reconhecimento direcionados no promotor ou próximo a ele e ativar a transcrição do gene GRF5 (Cheng et al. (2013). Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system. Cell research, 23 (10), 1163.); ou a quantidade de microRNA (miRNA) na célula vegetal que regula a expressão do gene GRF5 por inibição pós- transcricional pode ser reduzida por, por exemplo, por nocaute (ou knock out) (mutante nulo) ou silenciamento gênico (knock down), a fim de aumentar a quantidade de polipeptídeo GRF5 traduzido na célula vegetal - por exemplo Rodriguez et al. 2010 (supra) identificaram em Arabidopsis o microRNA miR396 que antagoniza a expressão de GRF5 e representa, portanto, um alvo adequado para afetar a quantidade de polipeptídeo GRF5 em uma célula vegetal.

[020] Dependendo da espécie vegetal, bem como do tipo de célula, são necessários diferentes níveis de ativação de gene ou expressão, a fim de ter uma quantidade adequada de polipeptídeo GRF5 presente na célula vegetal no momento em que ocorre a regeneração. Existem várias técnicas disponíveis para um técnico hábil no assunto, a fim de medir o nível de expressão eficaz de um gene endógeno ou um gene introduzido, por exemplo, qPCR, RT-PCR, Northern blot, ou análise de microarranjos (microarrays). A medição do nível de expressão do gene AtGRF5 introduzido em uma planta Beta vulgaris é mostrada na Figura 4. Esses métodos permitem que os especialistas na técnica por trabalho de rotina, ajustem o nível de expressão do gene GRF5 que afeta a capacidade de regeneração aprimorada de diversos tecidos ou células somáticas e reprodutivas (por exemplo, micrósporos). Em um exemplo de realização preferido, na célula vegetal, o nível de expressão de um gene endógeno que codifica um polipeptídeo GRF5 é aumentado pelo menos pelo fator 2, pelo fator 3 ou pelo fator 5, de preferência pelo fator 10, pelo fator de 25 ou fator de 50, mais preferido pelo fator de 100, pelo fator de 200 ou pelo fator de 500.

[021] Como descrito acima, a indução de um nível de expressão intensificado de um gene endógeno em uma célula vegetal pode ser realizada pela aplicação de um ou mais ativadores ou um precursor dos mesmos. Estes podem ser aplicados ao meio em que as células vegetais são cultivadas e são então ativamente ou passivamente absorvidos pela célula vegetal. Além disso, o um ou mais ativador ou precursor do mesmo pode ser introduzido diretamente na célula vegetal por microinjeção, eletroporação ou bombardeamento biolístico. Ao lado dos ativadores de transcrição sintéticos acima, vários outros ativadores que podem ser usados para aumentar o nível de expressão de um gene endógeno são conhecidos no estado da técnica, em particular o nível de expressão do gene GRF5 endógeno: nos últimos anos, os domínios técnicos da genética vegetal química e da biologia vegetal química emergiu onde os sistemas biológicos são tratados com pequenas moléculas para perturbar especificamente funções celulares. As pequenas moléculas são usadas comercialmente como drogas, herbicidas e fungicidas em diferentes sistemas, mas nos últimos anos elas são cada vez mais exploradas também como ferramentas para a regulação genética. Por exemplo, a genética química envolve a descoberta de efetores tipo pequenas moléculas de funções celulares variadas através de triagens de bibliotecas de compostos (Dejonghe & Russinova (2017). Plant Chemical Genetics: From Phenotype-Based Screens to Synthetic Biology. Plant Physiology, pp. 01805; Kawasumi, M., & Nghiem, P.

(2007). Chemical genetics: elucidating biological systems with small-molecule compounds. Journal of Investigative Dermatology, 127(7), 1577-1584). Tais efetores tipo moléculas pequenas, adequados para a ativação da expressão de um gene alvo como o GRF5, podem ser identificados por exames químicos seguindo diferentes estratégias (Dejonghe & Russinova, 2017). Estão disponíveis bibliotecas abrangentes de compostos que permitem a triagem simples de inúmeras moléculas pequenas e a identificação de efetores que podem ser usados para a ativação da expressão gênica de genes como o

GRF5. Como mencionado acima, outra abordagem para aumentar o nível de expressão de um gene endógeno como GRF5 é a aplicação dos chamados ativadores de transcrição sintética. Eles geralmente são projetados pela fusão de um domínio de reconhecimento e pelo menos um domínio ativador. O domínio de reconhecimento pode ser derivado de sistemas conhecidos como dedo de zinco, efetores TAL ou CRISPR; para a ativação, fusão, por exemplo, dos domínios de ativação VP-16 ou VP-64 derivados do vírus Herpes simplex a um domínio de reconhecimento, pode causar um aumento na transcrição. Os domínios de ativação mais fracos, como AD do NF-κB humano, aumentam a variedade de opções para a ativação gênica. Além disso, como mostrado nos promotores endógenos, combinações de ativadores podem ser usadas para introduzir efeitos sinérgicos (Moore et al. (2014). “Transcription activator-like effectors: a toolkit for synthetic biology” ACS synthetic biology, 3(10), 708-716.; US 2002/0046419 A1; Lowder et al. (2017). “Multiplexed transcriptional activation or repression in plants using CRISPR-dCas9-based systems” Plant Gene Regulatory Networks: Methods and Protocols, 167-184). O ativador de transcrição sintética pode ser entregue à célula vegetal ou introduzido na célula vegetal também como precursor, por exemplo, como molécula de DNA ou RNA que codifica tal ativador de transcrição artificial ou sintético ou um domínio do mesmo ou como uma forma inativa do ativador de transcrição que é ativado posteriormente na célula ou em um compartimento específico da célula.

Finalmente, o aumento da expressão de genes GRF também pode ser alcançado pela inativação de reguladores negativos a montante (isto é, miR396) ou pela criação de uma versão mutante do gene GRF que é resistente a esses reguladores negativos.

[022] Preferencialmente, o polipeptídeo GRF5 da presente invenção compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24,

26, 28, 30, 32, 106, 108, 110, 112 ou 209, ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos 70% de identidade com as SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 106, 108, 110, 112 ou 209, de preferência pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com as SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 30, 32, 106, 108, 110, 112 ou 209, e preferencialmente compreende um motivo indicador como descrito na presente invenção, de modo particularmente preferido, um motivo indicador consistindo em qualquer uma das sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 a SEQ ID NO: 104 ou SEQ ID NO: 113 a SEQ ID NO: 176.

O polipeptídeo GRF5, por exemplo, codificado por um gene endógeno, pode compreender uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas sequências de SEQ ID NO: 2 (Arabidopsis thaliana), SEQ ID NO: 4 (Beta vulgaris), SEQ ID NO: 6 (Zea mays), SEQ ID NO: 8 (Triticum aestivum), SEQ ID NO: 10 (Brassica napus), SEQ ID NO: 12 (Brassica rapa), SEQ ID NO: 14 (Brassica oleracea), SEQ ID NO: 16 (Raphanus sativus), SEQ ID NO: 18 (Sorghum bicolor), SEQ ID NO: 20 (Helianthus annuus), SEQ ID NO: 22 (Solanum tuberosum), SEQ ID NO: 24 (Hordeum vulgare), SEQ ID NO: 26 (Secale cereale), SEQ ID NO: 28 (Glycine max), SEQ ID NO: 30 (Gossypium hirsutum), SEQ ID NO: 32 (Oryza sativa), SEQ ID NO: 106 (Glycine max), SEQ ID NO: 108 (Brassica napus), SEQ ID NO: 110 (Helianthus annuus), SEQ ID NO: 112 (Zea mays) ou SEQ ID NO: 209 (Zea mays).

[023] Um polinucleotídeo exógeno (heterólogo) ou endógeno que codifica o polipeptídeo GRF5 da invenção compreende; (i) uma sequência nucleotídica compreendendo a SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 105, 107, 109, 111 207, 208 ou 210; (ii) uma sequência nucleotídica compreendendo uma sequência que é pelo menos 70%, preferencialmente pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica a uma sequência nucleotídica compreendendo a SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 105, 107, 109, 111, 207, 208 ou 210; (iii) uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo GRF5 como definido acima ou uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo codificado por (i) e/ou (ii) dentro do escopo da degenerescência do código genético; (iv) uma sequência nucleotídica complementar a uma sequência nucleotídica de (i), (ii) ou (iii); e/ou (v) uma sequência nucleotídica que hibridiza com uma sequência nucleotídica de (iv) sob condições estringentes.

[024] O polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo GRF5, particularmente o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo GRF5, pode compreender uma sequência nucleotídica selecionada a partir do grupo que consiste nas sequências de SEQ ID NO: 1 (Arabidopsis thaliana); SEQ ID NO: 3 (Beta vulgaris), SEQ ID NO: 5 (Zea mays), SEQ ID NO: 7 (Triticum aestivum), SEQ ID NO: 9 (Brassica napus), SEQ ID NO: 11 (Brassica rapa), SEQ ID NO: 13 (Brassica oleracea), SEQ ID NO: 15 (Raphanus sativus), SEQ ID NO: 17 (Sorghum bicolor), SEQ ID NO: 19 (Helianthus annuus), SEQ ID NO: 21 (Solanum tuberosum), SEQ ID NO: 23 (Hordeum vulgare), SEQ ID NO: 25 (Secale cereale), SEQ ID NO: 27 (Glycine max), SEQ ID NO: 29 (Gossypium hirsutum), SEQ ID NO: 31 (Oryza sativa), SEQ ID NO: 105 (Glycine max), SEQ ID NO: 107 (Brassica napus), SEQ ID NO: 109 (Helianthus annuus), SEQ ID NO: 111 (Zea mays), SEQ ID NO: 207 (sintético), SEQ ID NO: 208 (sintético) ou SEQ ID NO: 210 (sintético).

[025] Para os fins da presente invenção, a “identidade de sequência” de duas sequências relacionadas de nucleotídeos ou aminoácidos, expressa em porcentagem, refere-se ao número de posições nas duas sequências idealmente alinhadas que têm resíduos idênticos (x100) divididos pelo número de posições comparadas. Uma lacuna (ou gap), isto é, uma posição em um alinhamento onde um resíduo está presente em uma sequência, mas não na outra, é considerada como uma posição com resíduos não idênticos. O alinhamento das duas sequências é realizado pelo algoritmo de Needleman e Wunsch (Needleman e Wunsch 1970). O alinhamento de sequência assistido por computador acima, pode ser realizado convenientemente usando um software padrão, como o programa NEEDLE, conforme implementado no Pacote de Software Aberto da European Molecular Biology (EMBOSS), por exemplo, versão 6.3.1.2 (Trends in Genetics 16 (6), 276 (2000)), com seu parâmetro padrão, por exemplo, para matriz de proteínas = EBLOSUM62, gap open = 10.0 e gap extend = 0.5.

[026] Os termos “condições estringentes” ou “hibridização sob condições estringentes” se referem a condições sob as quais sequências nucleotídicas com complementaridade suficiente entre si geralmente permanecem hibridizadas. Estas condições estringentes são conhecidas pelos técnicos hábeis no assunto e estão descritas, por exemplo, em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nova Iorque (1989), 6.3.1-

6.3.6. O técnico no assunto sabe como determinar as condições de hibridização necessárias com base, por exemplo, em Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989. O termo “condições de hibridização”, a este respeito, refere-se não apenas às condições reais de hibridização prevalecentes durante a aglomeração dos ácidos nucleicos, como também às condições prevalecentes durante as etapas subsequentes de lavagem. Exemplos de condições estringentes de hibridização são condições em que principalmente apenas as moléculas de ácido nucleico que possuem pelo menos 80%, preferencialmente pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência sofrem hibridização. As condições de hibridização estringentes são, por exemplo: 4 × SSC a 65ºC e múltiplas lavagens subsequentes em 0,1 × SSC a 65ºC por aproximadamente 1 hora. O termo “condições de hibridização estringentes”, conforme usado na presente invenção, também pode significar: hibridização a 68ºC em fosfato de sódio 0,25 M, pH 7,2, SDS a 7%, 1 mM de EDTA e BSA a 1% por 16 horas e, subsequentemente, lavagem por duas vezes com SSC 2× e SDS a 0,1% a 68ºC. De preferência, a hibridização ocorre sob condições estringentes.

[027] A expressão “operacionalmente ligado” significa que os referidos elementos do gene quimérico estão ligados entre si de tal maneira que suas funções são coordenadas, permitindo a expressão da sequência codificante, ou seja, eles estão funcionalmente ligados. A título de exemplo, um promotor está funcionalmente ligado à outra sequência nucleotídica quando ele é capaz de garantir a transcrição e finalmente a expressão da referida sequência codificante. Duas proteínas que codificam sequências nucleotídicas são funcionalmente ou operacionalmente ligadas entre si se estiverem conectadas de tal maneira que uma proteína de fusão da primeira e da segunda proteína ou polipeptídeo possa ser formada.

[028] Diz-se que um gene é expresso quando ele leva à formação de um produto da expressão. Um produto da expressão denota um produto intermediário ou final resultante da transcrição e tradução opcional do ácido nucleico, DNA ou RNA, codificante de tal produto, por exemplo, o segundo ácido nucleico descrito no presente. Durante o processo de transcrição, uma sequência de DNA sob controle de regiões reguladoras, particularmente o promotor, é transcrita em uma molécula de RNA. Uma molécula de RNA pode ela própria formar um produto da expressão ou ser um produto intermediário quando é capaz de ser traduzida em um peptídeo ou proteína. Diz-se que um gene codifica uma molécula de RNA como produto da expressão quando o RNA como produto final da expressão do gene é, por exemplo, capaz de interagir com outro ácido nucleico ou proteína. Exemplos de produtos de expressão de RNA incluem RNA inibitório, como por exemplo, RNA senso (sense) (cossupressão), RNA antissenso (antisense), ribozimas, miRNA ou siRNA, mRNA, rRNA e tRNA. Diz-se que um gene codifica uma proteína como produto da expressão quando o produto final da expressão do gene é uma proteína ou peptídeo.

[029] Um ácido nucleico (molécula) ou nucleotídeo (sequência) ou polinucleotídeo, conforme utilizados na presente invenção, referem-se a DNA e RNA. O DNA também inclui cDNA e DNA genômico. Uma molécula de ácido nucleico pode ser de fita simples ou fita dupla e pode ser sintetizada quimicamente ou produzida por expressão biológica in vitro ou mesmo in vivo.

[030] É evidente que sempre que as sequências nucleotídicas das moléculas de RNA são definidas por referência à sequência nucleotídica das moléculas de DNA correspondentes, a timina (T) na sequência nucleotídica deve ser substituída pelo uracila (U). Se a referência é feita às moléculas de RNA ou DNA, ficará claro a partir do contexto do presente pedido.

[031] Conforme utilizado na presente invenção, “compreendendo” ou termos similares, deve ser interpretado como especificando a presença de recursos, números inteiros, etapas ou componentes declarados, conforme referido, mas não impede a presença ou adição de um ou mais recursos, números inteiros, etapas ou componentes, ou grupos dos mesmos. Assim, por exemplo, um ácido nucleico ou proteína compreendendo uma sequência de nucleotídeos ou aminoácidos, pode compreender mais nucleotídeos ou aminoácidos do que aqueles realmente citados, ou seja, o ácido nucleico ou proteína está incorporado em um ácido nucleico ou proteína maior. Um gene quimérico compreendendo uma região de DNA que é funcional ou estruturalmente definida pode compreender regiões adicionais de DNA etc.

[032] Por meio do GRF5, pode ser fornecida uma célula vegetal ou outro tecido vegetal precursor com uma capacidade aprimorada de regeneração. Isso é particularmente útil para células vegetais geneticamente modificadas, em particular células vegetais com um genoma editado.

[033] De acordo com um exemplo de realização preferido da invenção, a etapa (a1) de introduzir pelo menos uma sequência nucleotídica de interesse e GRF5 ou a etapa (a2) de introduzir pelo menos uma sequência nucleotídica de interesse e induzir um nível de expressão intensificado de um gene endógeno que codifica GRF5 proporciona a transformação transitória da célula vegetal. Nos termos da invenção, “transformação transitória” significa que a sequência inserida não está integrada (de forma estável) no genoma da célula vegetal. Em outro exemplo de realização, é efetuada uma transformação estável, em que a sequência nucleotídica de interesse na etapa (a1) e (a2) do método para transformação divulgada na presente invenção e/ou o polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo GRF5 na etapa (a1) do método de modificação do genoma divulgado na presente invenção é inserido no genoma da célula vegetal. De acordo com um exemplo de realização especialmente preferido da invenção, a sequência nucleotídica que codifica GRF5 é transformada transitoriamente na célula enquanto a sequência nucleotídica de interesse é transformada de maneira estável no genoma da célula.

[034] A modificação do genoma da célula vegetal pode ser realizada por meio de uma enzima indutora de quebra do DNA de fita dupla (DSB) que, de preferência, reconhece um sítio predeterminado no genoma da referida célula.

[035] Assim, outro exemplo de realização da presente invenção é um método para a modificação do genoma de uma célula vegetal compreendendo as etapas de;

(a1) introdução de um cassete de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo GRF5,

mRNA(s) que codifica(m) o polipeptídeo GRF5 (incluindo pré-mRNA(s)) ou polipeptídeo(s) GRF5 em uma célula vegetal; ou

(a2) indução de um nível de expressão intensificado de um gene endógeno que codifica um polipeptídeo GRF5 em uma célula vegetal; e

(b) cultivo da célula vegetal de (a1) ou (a2) ou uma célula vegetal derivada da célula vegetal de (a1) ou (a2) em condições nas quais na célula vegetal o polipeptídeo GRF5 é expresso a partir do cassete de expressão, o polipeptídeo

GRF5 é traduzido a partir do(s) mRNA(s) introduzido(s), o polipeptídeo GRF5 tem a expressão melhorada/intensificada a partir do gene endógeno, ou o(s) polipeptídeo(s)

está(estão) presente(s), preferivelmente em uma quantidade aumentada em comparação com o quantidade encontrada em células vegetais tipo selvagem ou uma célula vegetal na qual o cassete de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo GRF5,

mRNA(s) que codifica(m) o polipeptídeo GRF5 ou o(s)

polipeptídeo(s) GRF5 não foi(foram) introduzido(s) de acordo com a etapa (a1), ou no qual o nível de expressão intensificado de um gene endógeno que codifica o polipeptídeo GRF5 não foi induzido de acordo com a etapa

(a2); (c) modificação do genoma da célula vegetal de (b) por meio de uma enzima indutora de quebra do DNA de fita dupla (DSB) que reconhece preferencialmente um sítio predeterminado no genoma da referida célula e, opcionalmente, por meio de uma molécula de ácido nucleico de reparação, em que a modificação do referido genoma no referido sítio predeterminado é selecionada a partir de i. uma substituição de pelo menos um nucleotídeo; ii. uma deleção de pelo menos um nucleotídeo; iii. uma inserção de pelo menos um nucleotídeo; ou iv. qualquer combinação de i. - iii.; e em que a etapa (c) é conduzida simultaneamente à etapa (a1)/(a2) e/ou (b), antes da etapa (a1)/(a2), entre a etapa (a1)/(a2) ou (b) ou após a etapa (b).

[036] Conforme utilizado na presente invenção, uma “enzima indutora de quebra do DNA de fita dupla” ou “enzima DSBI” é uma enzima capaz de induzir a ruptura em um DNA de fita dupla em uma sequência nucleotídica particular, chamada de “sítio de reconhecimento”. A enzima indutora de quebra de DNA de fita dupla (DSB) pode, por exemplo, ser selecionada do grupo que consiste em meganuclease, nuclease efetora de TAL, nuclease dedo de zinco, sistemas CRISPR como CRISPR/Cas9, CRISPR/Cpf1, CRISPR/CasX, CRISPR/CasY, CRISPR/Csm1 ou CRISPR/MAD7. Endonucleases de clivagem rara são enzimas DSBI que possuem um sítio de reconhecimento de preferência de cerca de 14 a 70 nucleotídeos consecutivos e, portanto, têm uma frequência muito baixa de clivagem, mesmo em genomas maiores, como a maioria dos genomas vegetais. As endonucleases de homing, também chamadas de meganucleases,

constituem uma família dessas endonucleases de clivagem rara. Elas podem ser codificadas por íntrons, genes independentes ou sequências intervenientes, e apresentam propriedades estruturais e funcionais impressionantes que as diferenciam das enzimas de restrição mais clássicas, geralmente dos sistemas de modificação - restrição tipo II bacterianos. Os seus sítios de reconhecimento têm uma assimetria geral que contrasta com a simetria díade característica da maioria dos sítios de reconhecimento de enzimas de restrição. Demonstrou-se que várias endonucleases de homing codificadas por íntrons ou inteínas promovem o homing de seus respectivos elementos genéticos em sítios alélicos, sem íntrons ou sem inteína. Ao fazer uma quebra de fita dupla sítio- específica nos alelos sem íntrons ou sem inteína, essas nucleases criam extremidades recombinogênicas, que se envolvem em um processo de conversão de genes que duplica a sequência codificante e leva à inserção de um íntron ou uma sequência interveniente no nível do DNA. Uma lista de outras meganucleases de clivagem raras e seus respectivos sítios de reconhecimento é fornecida na Tabela I do documento WO 03/004659 (páginas 17 a 20) (incorporado ao presente por referência).

[037] Além disso, estão disponíveis métodos para projetar endonucleases de clivagem rara sob medida que reconhecem basicamente qualquer sequência nucleotídica alvo de escolha. Resumidamente, as enzimas de restrição quiméricas podem ser preparadas usando híbridos entre um domínio dedo de zinco projetado para reconhecer uma sequência nucleotídica específica e o domínio de clivagem de DNA não específico de uma enzima de restrição natural, como Fokl. Tais métodos foram descritos, por exemplo, no documento WO 03/080809, WO 94/18313 ou WO 95/09233 e em Isalan et al.

(2001). A rapid, generally applicable method to engineer zinc fingers illustrated by targeting the HIV-1 promoter. Nature biotechnology, 19(7), 656; Liu et al.

(1997). Design of polydactyl zinc-finger proteins for unique addressing within complex genomes. Proceedings of the National Academy of Sciences, 94(11), 5525-5530).

[038] Outro exemplo de endonucleases desenhadas por encomenda incluem as nucleases TALE (TALENs), que são baseadas em Nucleases Efetoras Semelhantes a Ativadores de Transcrição (TALEs) a partir da bactéria do gênero Xanthomonas fundido com o domínio catalítico de uma nuclease (por exemplo Fokl ou variante do mesmo). A especificidade de ligação ao DNA dessas TALEs é definida por di - resíduos variáveis repetitivos (RVDs) de unidades de repetição de 34/35 aminoácidos dispostas em tandem, de modo que um RVD reconhece especificamente um nucleotídeo no DNA alvo. As unidades de repetição podem ser montadas para reconhecer basicamente quaisquer sequências alvo e fundidas a um domínio catalítico de uma nuclease para criar endonucleases sequência-específicas (consulte, por exemplo, Boch et al. (2009). Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors. Science, 326(5959), 1509-1512; Moscou & Bogdanove (2009). A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors, 326 (5959), 1501-1501; e os documentos WO 20 10/079430, WO 20 11/072246, WO 2011/154393, WO 20 11/146121, WO 2012/001527, WO 2012/093833, WO 2012/104729, WO 2012/138927, WO 2012/138939). O documento WO 2012/138927 descreve ainda TALENs monoméricas (compactas) e TALEs com vários domínios catalíticos e combinações dos mesmos.

[039] Recentemente, um novo tipo de sistema de endonuclease personalizável foi descrito; o chamado sistema CRISPR/Cas. Um sistema CRISPR em seu ambiente natural descreve um complexo molecular que compreende pelo menos um RNA não codificante pequeno e individual em combinação com uma nuclease Cas ou outra nuclease CRISPR como uma nuclease Cpf1 (Zetsche et al., “Cpf1 Is a Single RNA-Guides Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System”, Cell, 163, pp. 1-13, outubro de 2015) que pode produzir uma quebra específica do DNA de fita dupla.

Atualmente, os sistemas

CRISPR são classificados em duas classes, compreendendo cinco tipos de sistemas CRISPR, o sistema tipo II, por exemplo, usando Cas9 como efetor e o sistema tipo V usando Cpf1 como molécula efetora (Makarova et al., Nature

Rev.

Microbiol. 2015). Em sistemas CRISPR artificiais, um RNA sintético não codificante e uma nuclease CRISPR e/ou opcionalmente uma nuclease

CRISPR modificada, modificada para atuar como nickase ou sem qualquer função de nuclease, podem ser usados em combinação com pelo menos um

RNA guia sintético ou artificial ou gRNA que combine a função de um crRNA e/ou um tracrRNA (Makarova et al., 2015, supra). A resposta imune mediada por CRISPR/Cas em sistemas naturais requer CRISPR-RNA (crRNA), em que a maturação desse RNA guia, que controla a ativação específica da nuclease

CRISPR, varia significativamente entre os vários sistemas CRISPR que foram caracterizados até agora.

Primeiramente, o DNA invasor, também conhecido como espaçador, é integrado entre duas regiões de repetição adjacentes na extremidade proximal do locus CRISPR.

Os sistemas CRISPR tipo II codificam uma nuclease Cas9 como enzima chave para a etapa de interferência, sistema que contém um crRNA e também um RNA trans-ativador (tracrRNA) como o motivo guia.

Estes hibridizam e formam regiões de RNA de fita dupla (ds) que são reconhecidas pela RNAseIII e podem ser clivadas para formar crRNAs maduros.

Estes, por sua vez, associam-se à molécula Cas, a fim de direcionar a nuclease especificamente para a região de ácido nucleico alvo.

As moléculas gRNA recombinantes podem compreender a região variável de reconhecimento de DNA e também a região de interação Cas e, portanto, podem ser projetadas especificamente, independentemente do ácido nucleico alvo específico e da nuclease Cas desejada.

Como mecanismo de segurança adicional, os PAMs (motivo adjacente ao protoespaçador) devem estar presentes na região de ácido nucleico alvo; estas são sequências de DNA que seguem diretamente do

DNA reconhecido pelo complexo Cas9/RNA. A sequência PAM para o Cas9 de Streptococcus pyogenes foi descrita como sendo “NGG” ou “NAG” (código padrão de nucleotídeo IUPAC) (Jinek et al., “A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity”, Science 2012, 337: 816- 821). A sequência PAM para Cas9 de Staphylococcus aureus é “NNGRRT” ou “NNGRR(N)”. São conhecidos outros sistemas CRISPR/Cas9 variantes. Assim, uma Cas9 de Neisseria meningitidis cliva no PAM a sequência NNNNGATT.

Um Cas9 de Streptococcus thermophilus cliva no PAM a sequência NNAGAAW. Recentemente, outro motivo PAM, NNNNRYAC, foi descrito para um sistema CRISPR de Campylobacter (WO 2016/021973 A1). Para nucleases Cpf1, foi descrito que o complexo Cpf1-crRNA, sem um tracrRNA, reconhece e cliva eficientemente o DNA alvo procedido por um PAM rico em T curto, em contraste com os PAMs ricos em G geralmente reconhecidos pelos sistemas Cas9 (Zetsche et al. supra). Além disso, utilizando polipeptídeos CRISPR modificados, podem ser obtidas quebras de fita simples específicas. O uso combinado de nickases Cas com vários gRNAs recombinantes também pode induzir cortes (nick) de DNA de fita dupla altamente específicos por meio de duplo corte de DNA. Além disso, usando dois gRNAs, a especificidade da ligação do DNA e, portanto, a clivagem do DNA podem ser otimizadas. Outros efetores CRISPR, como CasX e CasY, originalmente descritos para bactérias, estão disponíveis e representam outros efetores, que podem ser usados para fins de engenharia genômica (Burstein et al., “New CRISPR-Cas systems from uncultivated microbes”, Nature, 2017, 542, 237-241).

[040] O sítio de clivagem de uma enzima DSBI refere-se à localização exata no DNA onde a quebra de DNA de fita dupla é induzida. O sítio de clivagem pode ou não estar compreendido (sobreposto) ao sítio de reconhecimento da enzima DSBI e, portanto, é dito que o sítio de clivagem de uma enzima DSBI está localizado no sítio de reconhecimento ou próximo a ele.

O sítio de reconhecimento de uma enzima DSBI, também conhecido como sítio de ligação, é a sequência nucleotídica que é (especificamente) reconhecida pela enzima DSBI e determina sua especificidade de ligação. Por exemplo, um monômero TALEN ou ZNF possui um sítio de reconhecimento que é determinado por suas repetições RVD ou ZF, respectivamente, enquanto o sítio de clivagem é determinado pelo domínio da nuclease (por exemplo, FokI) e geralmente está localizado fora do sítio de reconhecimento. No caso de TALENs ou ZFNs diméricos, o sítio de clivagem está localizado entre os dois sítios de reconhecimento/ligação dos respectivos monômeros, essa região de DNA interveniente em que ocorre a clivagem é referida como região espaçadora.

[041] Um técnico hábil no assunto seria capaz de escolher uma enzima DSBI que reconhece um determinado sítio de reconhecimento e induzir uma DSB em um sítio de clivagem no sítio ou nas proximidades do sítio pré- selecionado/predeterminado ou projetar tal enzima DSBI. Alternativamente, um sítio de reconhecimento de enzima DSBI pode ser introduzido no genoma alvo usando qualquer método de transformação convencional ou cruzamento com um organismo que tenha um sítio de reconhecimento de enzima DSBI em seu genoma, e qualquer DNA desejado pode ser posteriormente introduzido no sítio ou nas proximidades do sítio de clivagem dessa enzima DSBI.

[042] Em um aspecto particularmente preferido deste exemplo de realização, uma molécula de ácido nucleico de reparação é adicionalmente introduzida na célula vegetal. Como usado aqui, uma “molécula de ácido nucleico de reparo” é uma molécula de DNA de fita simples ou dupla ou molécula de RNA que é usada como molde para modificação do DNA genômico no sítio pré-selecionado nas proximidades ou no sítio de clivagem. Conforme utilizado na presente invenção, “usar como molde para modificação do DNA genômico” significa que a molécula de ácido nucleico de reparo é copiada ou integrada no sítio pré-selecionado por recombinação homóloga entre a(s) região(ões) flanqueadoras e a(s) região(ões) de homologia correspondente(s) no genoma alvo que flanqueia o sítio pré-selecionado, opcionalmente em combinação com a junção de extremidades não homóloga (NHEJ) em uma das duas extremidades da molécula de ácido nucleico de reparo (por exemplo, no caso de haver apenas uma região flanqueadora). A integração por recombinação homóloga permitirá a junção precisa da molécula de ácido nucleico de reparo ao genoma alvo até o nível nucleotídico, enquanto a NHEJ pode resultar em pequenas inserções/deleções na junção entre a molécula de ácido nucleico de reparo e o DNA genômico.

[043] Conforme utilizado na presente invenção, “uma modificação do genoma”, significa que o genoma mudou em pelo menos um nucleotídeo. Isso pode ocorrer pela substituição de pelo menos um nucleotídeo e/ou pela deleção de pelo menos um nucleotídeo e/ou pela inserção de pelo menos um nucleotídeo, desde que resulte em uma alteração total de pelo menos um nucleotídeo em comparação com a sequência de nucleotídeos do sítio genômico alvo pré-selecionado antes da modificação, permitindo assim a identificação da modificação, por exemplo, por técnicas como sequenciamento ou análise PCR e similares, das quais o perito estará ciente.

[044] Conforme utilizado no presente pedido um “sítio pré- selecionado” ou “sítio predeterminado” ou “sítio predefinido” indica uma sequência nucleotídica específica no genoma (por exemplo, o genoma nuclear ou o genoma do cloroplasto) no local em que se deseja inserir, substituir e/ou excluir um ou mais nucleotídeos. Isso pode, por exemplo, ser um locus endógeno ou uma sequência nucleotídica específica ou ligada a um DNA ou transgene exógeno previamente introduzido. O sítio pré-selecionado pode ser uma posição nucleotídica específica na qual (após a qual) se pretende fazer uma inserção de um ou mais nucleotídeos. O sítio pré-selecionado também pode compreender uma sequência de um ou mais nucleotídeos que devem ser trocados (substituídos) ou excluídos.

[045] Conforme usado no contexto do presente pedido, o termo “aproximadamente” significa +/- 10% do valor recitado, preferencialmente +/- 5% do valor recitado. Por exemplo, cerca de 100 nucleotídeos (nt) devem ser entendidos como um valor entre 90 e 110 nt, de preferência entre 95 e 105.

[046] Como utilizado na presente invenção, uma “região flanqueadora” é uma região da molécula de ácido nucleico de reparo que possui uma sequência nucleotídica homóloga à sequência nucleotídica da região flanqueadora do DNA (ou seja, a montante ou a jusante) do sítio pré- selecionado. Será claro que o comprimento e porcentagem da identidade de sequência das regiões flanqueadoras deve ser escolhida de modo a permitir a recombinação homóloga entre as referidas regiões de flanqueamento e sua região de DNA correspondente a montante ou a jusante do sítio pré- selecionado. A região ou regiões de DNA que flanqueiam o sítio pré- selecionado tendo homologia com a região ou regiões de DNA flanqueadoras da molécula de ácido nucleico de reparo também são referidas como região ou regiões de homologia no DNA genômico.

[047] Para ter homologia suficiente para recombinação, as regiões de DNA flanqueadoras da molécula de ácido nucleico de reparo podem variar em comprimento e devem ter pelo menos cerca de 10 nt, cerca de 15 nt, cerca de 20 nt, cerca de 25 nt, cerca de 30 nt, cerca de 40 nt ou cerca de 50 nt de comprimento. No entanto, a região flanqueadora pode ser o maior tempo possível (por exemplo, até cerca de 100-150 kb, como cromossomos artificiais bacterianos completos (BACs)) De preferência, a região flanqueadora será de cerca de 50 a 2000 nt, por exemplo, cerca de 100nt, 200 nt, 500 nt, ou 1000 nt. Além disso, as regiões flanqueadoras do DNA de interesse não precisam ser idênticas às regiões de homologia (as regiões de DNA que flanqueiam o sítio pré-selecionado) e podem ter entre cerca de 80% e cerca de 100% de identidade de sequência, de preferência cerca de 95% a cerca de 100% de identidade de sequência com as regiões de DNA que flanqueiam o sítio pré- selecionado. Quanto maior a região flanqueadora, menos rigoroso será o requisito de homologia. Além disso, para conseguir a troca da sequência de DNA alvo no sítio pré-selecionado sem alterar a sequência de DNA das sequências de DNA adjacentes, as sequências de DNA flanqueadoras devem ser preferencialmente idênticas às regiões de DNA a montante e a jusante que flanqueiam o sítio pré-selecionado.

[048] Como usado aqui, “a montante” indica uma localização em uma molécula de ácido nucleico que está mais próxima da extremidade 5' da referida molécula de ácido nucleico. Da mesma forma, o termo “a jusante” refere-se a um sítio em uma molécula de ácido nucleico que está mais próximo da extremidade 3' da referida molécula de ácido nucleico. Para evitar dúvidas, as moléculas de ácido nucleico e suas sequências são tipicamente representadas na direção 5' para 3' (da esquerda para a direita).

[049] Para direcionar a modificação da sequência no sítio pré- selecionado, as regiões de flanqueamento devem ser escolhidas de modo que a extremidade 3' da região flanqueadora a montante e/ou a extremidade 5' da região flanqueadora a jusante se alinhem com as extremidades do sítio predefinido. Assim, a extremidade 3' da região flanqueadora a montante determina a extremidade 5' do sítio predefinido, enquanto a extremidade 5' da região flanqueadora a jusante determina a extremidade 3' do sítio predefinido.

[050] Conforme usado no presente documento, o referido site pré-selecionado estando localizado fora ou distante do sítio de clivagem (e/ou reconhecimento) significa que o sítio no qual se pretende fazer a modificação genômica (sítio pré-selecionado) não compreende o sítio de clivagem e/ou sítio de reconhecimento da enzima DSBI, ou seja, o sítio pré-selecionado não se sobrepõe ao sítio de clivagem (e/ou reconhecimento). “Fora/distante” a esse respeito significa, assim, a montante ou a jusante do sítio de clivagem (e/ou reconhecimento).

[051] A célula vegetal modificado que foi transformada ou gene editado de acordo com os métodos da presente invenção e, possivelmente, tem um genoma modificado pode ser regenerada em uma planta inteira (fértil).

Devido à presença do GRF5 adicional na célula vegetal, sua capacidade de regenerar é significativamente melhorada. Assim, em um aspecto preferido da invenção, a transformação de uma célula vegetal ou a modificação de um genoma de uma célula vegetal, respectivamente, é seguida por uma etapa de regeneração de uma planta. Consequentemente, a presente invenção provê um método para a produção de uma planta transgênica compreendendo; (a) transformar uma célula vegetal como descrito acima; e (b) regenerar a partir da célula vegetal de (a) ou de uma célula vegetal derivada da célula vegetal de (a) uma planta compreendendo pelo menos uma célula vegetal que compreende a pelo menos uma sequência nucleotídica de interesse como um transgene.

[052] Além disso, a presente invenção também fornece um método para produzir uma planta geneticamente modificada compreendendo; (a) modificar o genoma de uma célula vegetal conforme descrito acima; e (b) regenerar a partir da célula vegetal de (a) ou de uma célula vegetal derivada da célula vegetal de (a) uma planta compreendendo em pelo menos uma célula a modificação do genoma ou a célula vegetal modificada.

[053] As técnicas de regeneração dependem da manipulação de certos fito-hormônios em um meio de crescimento de cultura de tecidos,

dependendo ocasionalmente de um marcador biocida e/ou herbicida que pode ser introduzido juntamente com a(s) sequência(s) nucleotídica(s) desejada(s).

A regeneração de plantas a partir de cultura de protoplastos está descrita em Evans et al., Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, MacMillilan Publishing Company, New York, 1983; e Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton,

1985. A regeneração também pode ser obtida a partir de calo vegetal, explantes, protoplastos, embriões imaturos ou maduros, tecido embrionário, tecidos meristemáticos, órgãos, ou suas partes. Tais técnicas de regeneração são descritas de modo geral em Klee (1987) Ann. Rev. of Plant Phys. 38:

467486. Para obter plantas inteiras a partir de tecidos transgênicos, como embriões imaturos, elas podem ser cultivadas sob condições ambientais controladas em uma série de meios contendo nutrientes e hormônios, um processo conhecido como cultura de tecidos. Uma vez que plantas inteiras são geradas e produzem sementes, a avaliação da progênie é iniciada.

[054] De acordo com a presente invenção, não só é possível melhorar a capacidade de regeneração das células vegetais transformadas ou geneticamente modificadas, como também outros tipos de células sensíveis, com capacidades de regeneração pobres. Em particular, a produção de um embrião vegetal haploide a partir de precursores como um gametófito masculino imaturo ou um micrósporo pode ser melhorada por meio do GRF5.

[055] Assim, em outro aspecto, a presente invenção é um método de produção de um embrião vegetal haploide, compreendendo as etapas de: (a1) introdução de um cassete de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo GRF5, mRNA(s) que codifica(m) o polipeptídeo GRF5 ou polipeptídeo(s) GRF5 em um gametófito masculino imaturo ou micrósporo; ou (a2) indução de um nível de expressão intensificado de um gene endógeno que codifica um polipeptídeo GRF5 em um gametófito masculino imaturo ou micrósporo; e (b) cultivo do gametófito masculino imaturo ou micrósporo de (a) sob condições nas quais o polipeptídeo GRF5 no gametófito masculino imaturo ou micrósporo é expresso a partir do cassete de expressão, o polipeptídeo GRF5 é traduzido a partir do(s) mRNA(s) introduzido(s), o polipeptídeo GRF5 tem a expressão melhorada/intensificada a partir do gene endógeno, ou o(s) polipeptídeo(s) está(estão) presente(s) preferivelmente em uma quantidade aumentada em comparação com o quantidade encontrada em células vegetais tipo selvagem ou uma célula vegetal na qual o cassete de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo GRF5, mRNA(s) que codifica(m) o polipeptídeo GRF5, ou na qual o(s) polipeptídeo(s) GRF5 não foi(foram) introduzido(s) de acordo com a etapa (a1), ou no qual o nível de expressão intensificado de um gene endógeno que codifica o polipeptídeo GRF5 não foi induzido de acordo com a etapa (a2); e (c) seleção de um embrião vegetal haploide derivada do gametófito masculino imaturo ou do micrósporo da etapa (b).

[056] A invenção também inclui um método de produção de plântulas haploides compreendendo expor material vegetal haploide de uma cassete de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo GRF5, mRNA que codifica o polipeptídeo GRF5, ou polipeptídeo(s) GRF5 para produzir embriões haploides e, em seguida, a conversão (ou seja, germinação dos embriões haploides em mudas. A invenção inclui, portanto, um método de produção de plantas haploides que compreende o cultivo de uma muda produzida de acordo com o método mencionado acima. A invenção também provê um método para produzir uma planta haploide dupla que compreende cultivar material vegetal haploide na presença de GRF5 por um período, estimulando ou permitindo uma duplicação espontânea de cromossomos e cultivo do material vegetal haploide duplo em uma muda, plântula ou planta. Em alguns exemplos de realização, a embriogênese haploide e a duplicação de cromossomos podem ocorrer de maneira substancialmente simultânea. Em outros exemplos de realização, pode haver um atraso no tempo entre a embriogênese haploide e a duplicação cromossômica. Se o crescimento de mudas, plantas ou plântulas haploides não envolver um evento de duplicação espontânea de cromossomos, pode ser utilizado um agente químico de duplicação de cromossomos, por exemplo, a colquicina. Muitos procedimentos envolvem o contato de células vegetais com colquicina, agentes antimicrotúbulos ou herbicidas antimicrotúbulos, como pronamida, óxido nitroso ou qualquer inibidor mitótico. O resultado são células haploides duplamente homozigotas. Quando a colquicina é usada, a concentração no meio pode ser geralmente de 0,01% a 0,2%. O intervalo de concentração da colquicina pode ser de cerca de 400 - 600 mg/L.

[057] Quando um micrósporo é exposto ao(s) polipeptídeo(s) GRF5, um calo pode se formar e este pode sofrer organogênese para formar um embrião. A invenção, portanto, inclui um método de produção de calo vegetal haploide que compreende expor um gametófito masculino imaturo ou um micrósporos ao(s) polipeptídeo(s) GRF5 ou introduzir um cassete de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo GRF5, mRNA que codifica o polipeptídeo GRF5, ou polipeptídeo(s) GRF5.

[058] A exposição do gametófito masculino imaturo ou micrósporo ao GRF5 durante a etapa de cultivo é preferencialmente realizada por um período de tempo suficiente para induzir a formação de embriões haploides. O período de tempo necessário pode depender da espécie de planta em questão e tudo isso é facilmente determinável por um profissional versado na técnica. Um intervalo preferido de exposição ao GRF5 é de cerca de 1 a cerca de 20 horas; mais preferencialmente de cerca de 2 a cerca de 20 horas.

[059] Em certos aspectos da invenção, um estresse físico é aplicado ao material vegetal haploide antes da introdução do cassete de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo GRF5, mRNA que codifica o polipeptídeo GRF5, ou polipeptídeo(s) GRF5. O estresse físico pode ser qualquer tipo de estresse, por exemplo, temperatura, escuridão, luz ou radiação ionizante, privação ou estresse osmótico. A luz pode ser luz solar de espectro total ou uma ou mais frequências selecionadas a partir do espectro visível, infravermelho ou UV. O estresse pode ser contínuo ou interrompido (periódico); regular ou aleatório ao longo do tempo.

[060] A presente invenção é aplicável a qualquer espécie de planta, seja monocotiledônea ou dicotiledônea. De preferência, plantas que podem ser submetidas aos métodos e usos da presente invenção são plantas dos gêneros selecionados a partir do grupo que consiste em Hordeum, Sorghum, Saccharum, Zea, Setaria, Oryza, Triticum, Secale, Triticale, Malus, Brachypodium, Aegilops, Daucus, Beta, Eucalyptus, Nicotiana, Solanum, Coffea, Vitis, Erythrante, Genlisea, Cucumis, Marus, Arabidopsis, Crucihimalaya, Cardamine, Lepidium, Capsella, Olmarabidopsis, Arabis, Brassica, Eruca, Raphanus, Citrus, Jatropha, Populus, Medicago, Cicer, Cajanus, Phaseolus, Glycine, Gossypium, Astragalus, Lotus, Torenia, Allium, ou Helianthus. Mais preferencialmente, a planta é selecionada do grupo que consiste em Hordeum vulgare, Hordeum bulbusom, Sorghum bicolor,

Saccharum officinarium, Zea spp., including Zea mays, Setaria italica, Oryza minuta, Oryza sativa, Oryza australiensis, Oryza alta, Triticum aestivum, Triticum durum, Secale cereale, Triticale, Malus domestica, Brachypodium distachyon, Hordeum marinum, Aegilops tauschii, Daucus glochidiatus, Beta spp., including Beta vulgaris, Daucus pusillus, Daucus muricatus, Daucus carota, Eucalyptus grandis, Nicotiana sylvestris, Nicotiana tomentosiformis, Nicotiana tabacum, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum, Solanum tuberosum, Coffea canephora, Vitis vinifera, Erythrante guttata, Genlisea aurea, Cucumis sativus, Marus notabilis, Arabidopsis arenosa, Arabidopsis lyrata, Arabidopsis thaliana, Crucihimalaya himalaica, Crucihimalaya wallichii, Cardamine nexuosa, Lepidium virginicum, Capsella bursa pastoris, Olmarabidopsis pumila, Arabis hirsute, Brassica napus, Brassica oleracea, Brassica rapa, Raphanus sativus, Brassica juncacea, Brassica nigra, Eruca vesicaria subsp. sativa, Citrus sinensis, Jatropha curcas, Populus trichocarpa, Medicago truncatula, Cicer yamashitae, Cicer bijugum, Cicer arietinum, Cicer reticulatum, Cicer judaicum, Cajanus cajanifolius, Cajanus scarabaeoides, Phaseolus vulgaris, Glycine max, Gossypium sp., Astragalus sinicus, Lotus japonicas, Torenia fournieri, Allium cepa, Allium fistulosum, Allium sativum, Helianthus annuus, Helianthus tuberosus e/ou Allium tuberosum. São particularmente preferidas as plantas Beta vulgaris, Zea mays, Triticum aestivum, Hordeum vulgare, Secale cereale, Helianthus annuus, Solanum tuberosum, Sorghum bicolor, Brassica rapa, Brassica napus, Brassica juncacea, Brassica oleracea, Raphanus sativus, Oryza sativa, Glycine max,e/ou Gossypium sp.

[061] As células vegetais adequadas de acordo com a presente invenção são especialmente células de um tecido caloso, preferencialmente de um calo friável, de um tecido meristemático, de um tecido reprodutivo (por exemplo, micrósporos) ou de um tecido embrionário, bem como protoplastos.

[062] Uma parte ou partes de plantas podem ser anexadas ou separadas de uma planta inteira intacta. Tais partes de uma planta incluem, mas não estão limitadas a, órgãos, tecidos e células de uma planta e, de preferência, sementes.

[063] A matéria da presente invenção também são plantas que são obtidas ou que podem ser obtidas pelos métodos descritos acima.

Consequentemente, um exemplo de realização da invenção é uma planta transgênica obtida ou obtenível pelo método acima de transformar uma célula vegetal e regenerar uma planta a partir da referida célula, bem como a progênie ou partes da planta, em que a progênie ou parte da planta compreende pelo menos uma sequência nucleotídica de interesse como transgene. Outro exemplo de realização da invenção é uma planta geneticamente modificada obtida ou obtenível pelo método acima de modificar o genoma de uma célula vegetal e regenerar uma planta a partir da referida célula, bem como a progênie ou partes da planta, em que a progênie ou parte da planta compreende a modificação no genoma introduzido pelo método de modificação acima.

[064] Outra matéria da presente invenção é uma célula vegetal ou uma semente derivada da planta transgênica acima ou planta geneticamente modificada. Tal célula vegetal compreende preferencialmente um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo GRF5 integrado de maneira transitória ou estável e uma enzima indutora de quebra de DNA de fita dupla (DSB), que preferencialmente reconhece um sítio predeterminado no genoma da referida célula e, opcionalmente, uma molécula de ácido nucleico de reparo.

O polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo GRF5 é preferencialmente operacionalmente ligado a uma sequência reguladora adequada, de modo que a célula vegetal é capaz de expressar o polipeptídeo GRF5. Uma sequência reguladora significa, por exemplo, um “promotor” que se refere a uma sequência nucleotídica, geralmente a montante (5') de sua sequência codificante, que controla a expressão da sequência codificante, proporcionando o reconhecimento da RNA polimerase e de outros fatores necessários para a correta transcrição. Um “promotor constitutivo” refere-se a promotores que dirigem a expressão gênica em quase todos os tecidos e em todos os momentos. Exemplos de promotores constitutivos incluem o promotor CaMV 35S, duplo promotor 35S de CaMV (promotor 70S), promotor da nopalina- sintase (nos), promotor BdEF1, ou promotor de ubiquitina, tal como PcUBI4 ou ZmUbi1. “Promotor regulado” refere-se aos promotores que direcionam a expressão gênica de maneira não constitutiva, mas regulada de maneira temporal e/ou de maneira espacial, e inclui promotores tecido-específicos e indutíveis. Ele inclui sequências naturais e sintéticas, bem como sequências que podem ser uma combinação de sequências sintéticas e naturais.

Diferentes promotores podem direcionar a expressão de um gene em diferentes tecidos ou tipos celulares, ou em diferentes estágios de desenvolvimento, ou em resposta a diferentes condições ambientais. Novos promotores de vários tipos úteis em células vegetais estão sendo constantemente descobertos e são bem conhecidos pelos especialistas na técnica. Um “promotor tecido-específico” refere-se a promotores regulados que não são expressos em todas as células vegetais, mas apenas em um ou mais tipos de células em órgãos específicos (como folhas ou sementes), tecidos específicos (como embrião ou cotilédones), ou tipos celulares específicos (como células do parênquima folhar ou de armazenamento da semente). Estes incluem também promotores que são temporalmente regulados (como na embriogênese precoce ou tardia) durante o amadurecimento dos frutos em sementes ou frutos em desenvolvimento, em folhas totalmente diferenciadas, ou no início da senescência. “Promotor indutível” refere-se aos promotores regulados que pode ser ligado em um ou mais tipos celulares por um estímulo externo (tal como uma substância química, luz, hormônio, estresse ou patógeno). Exemplos de promotor indutível são promotores indutíveis são promotores indutíveis por ecdisona, dexametasona, etanol. Tais promotores são bem conhecidos no estado da técnica (por exemplo, Samalova et al.

(2005). pOp6/LhGR: a stringently regulated and highly responsive dexamethasone‐inducible gene expression system for tobacco. The Plant Journal, 41(6), 919-935; Gatz & Lenk (1998). Promoters that respond to chemical inducers. Trends in Plant Science, 3(9), 352-358.).

[065] Outra matéria da invenção é um embrião vegetal haploide obtido ou obtenível pelo método da invenção.

[066] Outra matéria da presente invenção é uma célula vegetal compreendendo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo GRF5 integrado de maneira transitória ou estável, e uma enzima indutora de quebra de DNA de fita dupla (DSB) que preferencialmente reconhece um sítio predeterminado no genoma da referida célula e, opcionalmente, uma molécula de ácido nucleico de reparo, em que preferencialmente o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo GRF5 está operacionalmente ligado a uma sequência reguladora adequada, de modo que a célula vegetal é capaz de expressar o polipeptídeo GRF5. Essa célula vegetal pode ser obtida ao realizar o método descrito acima para modificar o genoma de uma célula vegetal.

[067] Um aspecto adicional da presente invenção é o uso de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo GRF5, um mRNA que codifica um polipeptídeo GRF5, um polipeptídeo GRF5 ou um ativador da expressão de um gene endógeno que codifica um polipeptídeo GRF5 em um método de transformação de uma célula vegetal, preferencialmente no método de transformação descrito acima, em um método de modificação do genoma de uma célula vegetal, preferencialmente no método de modificação do genoma descrito acima, em um método para a produção de uma planta ou um embrião vegetal haploide, de preferência no método para a produção de uma planta ou um embrião vegetal haploide descrito acima, ou em um método para regeneração de uma planta, de preferência no método de regeneração de uma planta descrito acima.

[068] Salvo quando indicado de outra forma nos Exemplos, todas as técnicas de DNA recombinante são realizadas de acordo com protocolos padrão, tal como descrito em Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY e nos volumes 1 e 2 de Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA. Os materiais e métodos-padrão para o trabalho molecular em plantas estão descritos em Plant Molecular Biology Labfax (1993) R.D.D. Cray, publicado juntamente por BIOS Scientific Publications Ltd (Reino Unido) e Blackwell Scientific Publications (Reino Unido). Outras referências para técnicas padrão de biologia molecular incluem Sambrook e Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Terceira Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, Volumes I e II de Brown (1998) Molecular Biology LabFax, Segunda Edição, Academic Press (Reino Unido). Os materiais e métodos padrão para as reações em cadeia da polimerase também podem ser encontrados em Dieffenbach e Dveksler (1995), PCR Primer: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; e particularmente em McPherson et al. (2000), PCR - Basics: From background to bench, 1ª ed., Springer Verlag, Alemanha.

[069] Todas as patentes, pedidos de patente e publicações ou divulgações públicas (incluindo publicações na Internet) mencionadas ou citadas no presente pedido são integralmente incorporadas ao presente por referência.

[070] A invenção será adicionalmente descrita com referência às seguintes figuras e exemplos descritos. No entanto, deve-se compreender que a invenção não está limitada a tais Exemplos.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[071] Fig. 1: Número total de brotações em desenvolvimento em cada etapa de seleção (S1-S4). Dados obtidos a partir de 5 experimentos de transformação independentes realizados com a construção de controle pZFN- tdT-nptII ou com pZFN-nptII- GRF5 (compare a Tabela 3).

[072] Fig. 2: Regeneração de brotos no início da etapa de seleção 3 (S3) de 14 calos independentemente transformados em um experimento de controle (A) e um experimento realizado com pZFN-nptII- GRF5 (B). As setas indicam os brotos em desenvolvimento. Os experimentos foram realizados seguindo o método de 2.1.

[073] Fig. 3: Regeneração de brotos em calos de beterraba sacarina 10 dias após serem bombardeados com pZFN-nptII- GRF5 (A) e com plasmídeo controle pABM70S-TurboYFP (B). Os calos foram cobombardeados com plasmídeo pUbi4-tDT para controlar os níveis de expressão transitória por fluorescência vermelha. Os experimentos foram realizados seguindo o método

2.2. São mostrados três calos independentemente bombardeados.

[074] Fig. 4: Nível de expressão de GRF5 em onze eventos transgênicos independentes de beterraba sacarina.

[075] Fig. 5: A: Comparação de sequência das sequências de polipeptídeos de GRF5 derivadas de 16 espécies vegetais diferentes e dedução de um motivo indicador específico de GRF5 (SEQ ID NO: 177); sequências parciais das sequências de polipeptídeos de GRF5 como mostrado são apresentadas nas SEQ ID NOs: 178 - 206; B: análise de motivos por alinhamento/comparação de sequências de proteínas completas derivadas de 16 espécies de plantas diferentes, permitindo até 10 pareamentos discordantes (mismatches). As colunas “start” (início) e “stop” (parada) indicam a posição inicial e final do fragmento de sequência dos polipeptídeos GRF5 correspondentes ao motivo indicador; a coluna “discordâncias (mismatches)” mostra o número de pareamentos discordantes entre o respectivo polipeptídeo GRF5 e o motivo indicador; as sequências parciais das sequências de polipeptídeos GRF5, como mostrado, são apresentadas nas SEQ ID NOs: 178 - 184 e SEQ ID NOs: 186 - 206. AtGRF1_AT2G22840.1 (SEQ ID NO: 33); AtGRF2_AT4G37740.1 (SEQ ID NO: 34); AtGRF3_AT2G36400.1 (SEQ ID NO: 35); AtGRF4_AT3G52910.1 (SEQ ID NO: 36); AtGRF6_AT2G06200.1 (SEQ ID NO: 37); AtGRF7_AT5G53660.1 (SEQ ID NO: 38); AtGRF8_AT4G24150.1 (SEQ ID NO: 39); AtGRF9_AT2G45480.1 (SEQ ID NO: 40).

[076] Fig. 6: Frequência de transformação em beterraba sacarina obtida com a construção controle 70S::tdT, a construção de superexpressão de AtGRF5 (cDNA - SEQ ID NO: 1; sequência de aminoácidos - SEQ ID NO: 2) e o ortólogo de GRF5 da beterraba, BvGRF5 (DNA sintético - SEQ ID NO: 207; sequência de aminoácidos - SEQ ID NO: 4).

[077] Fig. 7: Diversas brotações transgênicas por calo de beterraba sacarina inoculados obtidos em experimentos de transformação usando construções para superexpressar tdTomato (tDT) (controle) e AtGRF5 (cDNA - SEQ ID NO: 1; sequência de aminoácidos - SEQ ID NO: 2).

[078] Fig. 8: Número médio de brotações transgênicas por calo de beterraba sacarina obtidas a partir de experimentos de transformação com a construção de controle 70S-tDT (controle) e a construção para superexpressão de AtGRF5 (70S-GRF5). Foram utilizados dois genótipos recalcitrantes A e B.

O nível de recalcitrância para brotos regenerados do genótipo A é muito alto, enquanto o genótipo B exibe uma recalcitrância mais suave que A.

[079] Fig. 9: Experimentos de regeneração de calo de linhagens transgênicas que superexpressam AtGRF5 em beterraba sacarina. A frequência de formação de calo (A) e a frequência de regeneração de brotos (B) foram pontuadas usando o meio de indução de calos e o meio de regeneração de brotos descrito em Kischenko et al., 2005 (consulte também o exemplo 1). Foram analisados um total de 5 eventos independentes que superexpressam o AtGRF5 (AtGRF5-36, AtGRF5-41, AtGRF5-14, AtGRF5-94, AtGRF5-50). Como controle, foram usadas brotações não transgênicas de beterraba sacarina (WT1 e WT2) e brotações transgênicas superexpressando a proteína repórter tDT (evento tDT). O nível de expressão de AtGRF5 foi determinado por qRT-PCR em amostras isoladas a partir dos eventos transgênicos GRF5 utilizados no ensaio (C).

[080] Fig. 10: A frequência de transformação no milho, com a construção controle 70S::tDT ou com construções para superexpressarem AtGRF5 (cDNA - SEQ ID NO: 1; sequência de aminoácidos - SEQ ID NO: 2), dois ortólogos de milho GRF5 [ZmGRF5 versão A (DNA sintético - SEQ ID NO: 208; sequência de aminoácidos - SEQ ID NO: 209) e ZmGRF5 versão B (DNA sintético - SEQ ID NO: 210; sequência de aminoácidos - SEQ ID NO: 112). A eficiência da transformação foi calculada como o número de eventos transgênicos dividido pelo número de embriões imaturos inoculados.

[081] Fig. 11: Desenvolvimento de brotos e fluorescência DsRed de brotos em explantes de soja 21 dias após a transformação. Imagens representativas de explantes controle DsRed, AtGRF5 e GmGRF5 mostrando (A) o desenvolvimento dos rebentos (brotos) no nó primário e (B) a fluorescência DsRed de brotos.+ As imagens DsRed são compostas de várias imagens e posicionadas na posição aproximada para fins de orientação.

[082] Fig. 12: Formação de “bom” crescimento de brotações continuou a aumentar rapidamente de 16 para 22 dias na seleção. A porcentagem de explantes foi pontuada em dois momentos para destacar a rápida produção de brotações na seleção de explantes transformados com as três construções.

[083] Fig. 13: Formação de brotos em explantes de soja transformados com e sem variantes de GRF5. As fotos tiradas da vista superior e lateral de uma repetição são mostradas para os três tratamentos (construções). O crescimento dos brotos é mais pronunciado nos explantes transformados com AtGRF5 (painel do meio) e GmGRF5 (painel abaixo) versus o controle DsRed (painel superior).

[084] Fig. 14: Gráfico de caixa e bigode visualizando o aumento significativo na regeneração de brotações transgênicas em explantes transformados com AtGRF5 ou GmGRF5 aos 16 e 22 dias na seleção.

[085] Fig. 15: Desenvolvimento de brotos e fluorescência DsRed de brotos em explantes de canola 21 dias após a transformação. Imagens representativas de explantes controle DsRed, AtGRF5 e BnGRF5 mostrando desenvolvimento de calo nos segmentos hipocótilos e (B) fluorescência DsRed nos explantes.

[086] Fig. 16: Porcentagem de explantes que expressam DsRed em cinco experimentos com Brassica napus transformados com o controle AtGRF5, BnGRF5 e DsRed são representados em um gráfico de caixa e bigode. A porcentagem de explantes que expressam DsRed é significativamente maior em AtGRF5 e BnGRF5 em comparação com as construções de controle, com um aumento de quase três vezes em média.

[087] Fig. 17: A cotransformação de calo de beterraba sacarina com o construção de controle 70S-tDT e 70S-AtGRF5. A inoculação de calo nos experimentos de cotransformação foi realizada com uma mistura 1:1 das cepas de Agrobacterium que possuíam cada construção individualmente.

EXEMPLOS

1. EXPERIMENTOS EM BETA VULGARIS

[088] Produção do plasmídeo binário:

[089] O vetor binário pZFN-nptII- GRF5 foi produzido pelo seguinte procedimentos de clonagem padrão. Dentro do T-DNA deste vetor, o cDNA que codifica GRF5 (At3g13960) foi clonado entre o promotor duplo CaMV 35S e o terminador da nopalina sintase (NOS) para garantir altos níveis de expressão ectópica da proteína GRF5. O T-DNA também contém o gene da neomicina fosfotransferase II (nptII) que confere resistência a uma variedade de antibióticos aminoglicosídeos, como a canamicina ou a paromomicina, e foi usado para a seleção de células e tecidos vegetais transgênicos. O promotor NOS e o terminador pAG7 flanqueiam o gene nptII. A cadeia principal do vetor binário contém as origens de colE1 e pVS1 para replicação plasmidial em Escherichia coli e Agrobacterium tumefaciens, respectivamente; e o gene aadA que confere resistência à estreptomicina/espectinomicina para seleção de bactérias. O plasmídeo pZFN-nptII-GRF5 foi transformado na cepa AGL-1 de Agrobacterium através de um procedimento padrão.

[090] Transformação de brotos micropropagados:

[091] Os brotos de beterraba sacarina foram transformados por diferentes métodos: a) Transformação mediada por Agrobacterium pel método baseado em Kischenko et al., 2005 Cell Biology International:

1. Brotos micropropagados do genótipo S706 foram utilizados como material de partida. Os brotos foram multiplicados em sais MS suplementados com 30 g/L de sacarose e 0,25 mg/L de benziladenina (BAP),

2. Para induzir calo friável, os explantes foliares foram incubados em sais MS, incluindo 15 g/L de sacarose e 2 mg/L de BAP a cerca de 30ºC por várias semanas,

3. Os calos friáveis foram colhidos,

4. O Agrobacterium AGL-1 que continha o vetor pZFN-nptII- GRF5 foi cultivado em meio adequado suplementado com os antibióticos apropriados,

5. Os calos foram inoculados com suspensão de Agrobacterium. A cocultura de tecido caloso e Agrobacterium foi feita em meio contendo 440 mg/L de CaCl2x2H2O, 170 mg/L de KH2PO4, 1,900 mg/L de KNO3, 370 mg/L de MgSO4, 1650 mg/L NH4NO3, 2 mg/L de BAP, 40 mg/L acetoseringona, 20 g/L de sacarose e 2 g/L de glicose, durante pelo menos 2 dias,

6. Os calos foram subcultivados em sais MS suplementados com 30 g/L de sacarose, 1 mg/L de GA3, 1 mg/L de TDZ e 500 mg/L de Timentina e incubados no escuro por cerca de 1 semana,

7. Para a seleção de células transgênicas, os calos foram transferidos para o meio da etapa 6 suplementado com 100 mg/L de paromomicina e incubados à luz por várias semanas,

8. Os calos transgênicos foram selecionados e subcultivados por várias vezes no mesmo meio e condições,

9. Os rebentos em regeneração foram isolados e propagados em sais MS, incluindo 30 g/L de sacarose, 0,25 mg/L de BAP e 100 mg/L de canamicina,

10. Os rebentos verdes foram transferidos para sais MS suplementados com 30 g/L de sacarose, 0,1 mg/L de BAP, 250 mg/L de Timentina e 200 mg/L de paromomicina para finalizar a fase de seleção e foram multiplicados regularmente por várias vezes neste meio,

11. Os explantes foliares foram isolados a partir dos brotos em crescimento verde para extração de DNA e análise por PCR, a fim de confirmar as supostas linhagens transgênicas,

12. Os brotos selecionados foram enraizados em sais MS suplementados com 0,5 mg/L de AIB, 100 mg/L de cefotaxima e 10 mg/L de PPT e transferidos para a estufa para produção de sementes; b) Bombardeamento de partículas em calo de beterraba sacarina

1. Calos friáveis foram produzidos como descrito anteriormente no método 2.1,

2. Foi realizado um tratamento osmótico por várias horas,

3. A preparação e o revestimento de DNA nas partículas de ouro foram realizados por procedimentos padrão, conforme descrito no manual de instruções PDS-1000/He.

Os plasmídeos pZFN-nptII-GRF5 e pUbi4-tDT (contendo um repórter fluorescente vermelho) foram coprecipitados com partículas de ouro. Como controle, as partículas de ouro foram revestidas com pUbi4tDT e pABM70STurboYFP (contendo um repórter fluorescente amarelo),

4. Os calos foram bombardeados com uma unidade PDS- 1000/He (Bio-Rad), usando 30 ng de partículas de ouro revestidas com 500 ng de DNA por injeção,

5. Para avaliar o efeito da expressão transitória do GRF5 na frequência de regeneração de brotos, os calos bombardeados foram incubados em sais MS suplementados com 30 g/L de sacarose, 1 mg/L de GA3 e 1 mg/L de Tidiazurom em condições de luz por cerca de 2 semanas. O número de brotos foi pontuado usando uma lupa binocular padrão.

RESULTADOS

[092] A transformação de calos derivados de brotos micropropagados de beterraba sacarina mediada por Agrobacterium tumefaciens com a construção pZFN-nptII-GRF5 aumenta significativamente o número de brotos regenerados no final da etapa de seleção (Tabela 2). Como controle, foi utilizada a construção pZFN-TdT-nptII (Controle) contendo um repórter fluorescente vermelho. Os cinco experimentos independentes mostram um aumento na média da frequência de transformação de 5,0% para 33,9%.

Além disso, o número de eventos transgênicos confirmados por PCR aumentou em média de 4,8 eventos para 25,4 eventos por experimento de transformação.

TABELA 2 FREQUÊNCIA DE TRANSFORMAÇÃO DE 5 EXPERIMENTOS INDEPENDENTES REALIZADOS PELO MÉTODO DE TRANSFORMAÇÃO (A), COM UMA CONSTRUÇÃO CONTROLE OU COM PZFN-NPTII - GRF5.

[093] O número total de brotos no final da fase de seleção e o número total de eventos transgênicos confirmados por PCR também são mostrados. No número médio de brotos em desenvolvimento, os eventos transgênicos e a frequência de transformação estão indicados em negrito. Nome do nº brotos ao final da nº linhagens transgênicas Frequência de Experimento seleção confirmadas transformação(%) Control_Rep01 9 3 5,5 Control_Rep02 8 5 8,5 Control_Rep03 11 5 3,3 Control_Rep04 9 4 3,1 Control_Rep05 13 7 4,7 Méd. Controle 10 4,8 5,0 GRF5_Rep01 108 23 11,5

Nome do nº brotos ao final da nº linhagens transgênicas Frequência de Experimento seleção confirmadas transformação(%) GRF5_Rep02 61 28 35,0 GRF5_Rep03 27 13 21,7 GRF5_Rep04 167 35 38,9 GRF5_Rep05 86 28 62,2 Méd. GRF5 89,8 25,4 33,9

[094] Nos experimentos de transformação de calo, a regeneração dos brotos foi determinada também para cada etapa de seleção individual. A quantificação dos brotos em regeneração em cada etapa de seleção mostra que a superexpressão do GRF5 nos calos da beterraba sacarina acelera a organogênese dos rebentos (Tabela 3, Figuras 1 e 2). Em outro experimento de transformação de calo, a regeneração de brotos foi determinada para dois genótipos recalcitrantes de beterraba sacarina (Figura 8): A transformação com o construção pZFN-tdT-nptII (controle) não resultou em brotamento transgênico para o genótipo A e apenas uma média de 0,3 brotações por calo para o genótipo B. Usando a superexpressão de AtGRF5 sob o promotor 70S, o número médio de brotações transgênicas aumentou de 0 para 1,67 brotos transgênicos para o genótipo A e de 0,3 para 4,82 brotos por calo para o genótipo B. Isso demonstra de maneira impressionante o potencial do AtGRF5 e abre a possibilidade de trabalhar de forma independente de genótipo com métodos de transformação padrão.

[095] Experimentos adicionais demonstraram que o número de eventos transgênicos por calo inoculado poderia ser aumentado por fator 9 ao utilizar uma construção para superexpressão de AtGRF5 em calos de Beta vulgaris (Figura 9). Como controle, foi utilizada a construção pZFN-TdT-nptII (Controle) contendo um repórter fluorescente vermelho. O gene GRF, bem como o gene repórter, estavam sob o controle do promotor constitutivo 70S (promotor constitutivo 35S intensificado duas vezes do vírus do mosaico da couve-flor).

[096] O nível de expressão do GRF5 foi determinado em onze eventos transgênicos independentes de beterraba sacarina aleatoriamente selecionados. A análise da expressão foi realizada com os iniciadores (primers) de ligação à 3'-UTR do terminador NOS. Em todos os eventos transgênicos analisados, um alto nível de expressão de GRF5 foi detectado (vide a figura 4).

TABELA 3.

QUANTIFICAÇÃO DE BROTAÇÕES REGENERATIVAS EM CADA ETAPA DE SELEÇÃO DE 5 EXPERIMENTOS INDEPENDENTES DE TRANSFORMAÇÃO DE CALO REALIZADOS COM PZFN-TDT-NPTII (CONTROLE) OU PZFN-NPTII- GRF5 (RB).

[097] O número total de brotos em desenvolvimento em cada etapa é indicado em negrito.

ETAPAS DE SELEÇÃO ID do experimento Gene superexpresso S1 S2 S3 S4 Ctrl-1 tdTomate 0 0 3 6 Ctrl-2 tdTomate 0 1 3 4 Ctrl-3 tdTomate 0 0 0 11 Ctrl-4 tdTomate 0 0 4 5 Ctrl-5 tdTomate 0 0 7 6 Controle-Total tdTomate 0 1 17 32 RB-1 GRF5 0 40 41 27 RB-2 GRF5 0 11 20 30 RB-3 GRF5 0 9 11 7 RB-4 GRF5 0 65 77 25 RB-5 GRF5 2 27 23 34 RB-Total GRF5 2 152 172 123

[098] Em um experimento adicional de regeneração de calo, cinco diferentes eventos transgênicos que superexpressam o AtGRF5 na beterraba sacarina foram analisados. Como controle, por um lado, duas linhagens de beterraba não transgênicas (WT1 e WT2) e, por outro lado, uma linhagem transgênica que superexpressa a proteína repórter tdT. A Figura 9A mostra que a frequência média de formação de calo nas linhagens de controle e os eventos transgênicos do AtGRF5 foram quase comparáveis, talvez um pouco melhorados nos eventos transgênicos. Na Figura 9B, é apresentado o número médio de brotos transgênicos. Quatro dos cinco eventos AtGRF5 mostram um aumento significativo na formação de brotos em comparação aos dois controles. A partir da Figura 9C, parece que o efeito positivo na formação de brotos está relacionado ao nível de expressão de AtGRF5 nos eventos transgênicos.

[099] Em experimentos de cotransformação com a construção de controle, 70S-tDT e o 70S-AtGRF5 foram integrados de maneira estável no genoma das células de calo de beterraba sacarina. A inoculação de calo nos experimentos de cotransformação foi realizada com uma mistura 1:1 das cepas de Agrobacterium que possuíam cada construção individualmente. A frequência média de cotransformação foi de 31,5%. Como mostrado na Figura 17, o número de eventos fluorescentes vermelhos (tDT positivo) é cerca de 8 vezes maior na cotransformação do que nos experimentos de transformação única.

[100] A transformação via bombardeio de partículas de acordo com o método de 2.2 mostrou que mesmo a (super)expressão transitória de GRF5 resulta em um aumento significativo da frequência de transformação. Os calos bombardeados mostram uma capacidade de regeneração aprimorada. A Figura 3 mostra que os calos biolisticamente transformados com a construção pZFN-nptII-GRF5 exibem um aumento do número de brotos em regeneração em comparação com calos com a construção controle.

[101] Em experimentos adicionais de transformação de calo, a frequência de transformação em beterraba sacarina também foi determinada usando a construção pZFN-nptII-AtGRF5 em comparação com a mesma construção, mas expressando o homólogo de GRF de Beta vulgaris (BvGRF5).

Como controle, foi utilizada a construção pZFN-TdT-nptII (Controle) contendo um repórter fluorescente vermelho. Os genes GRF, bem como o gene repórter, estavam sob o controle de um promotor constitutivo 70S. Os experimentos mostrados na Figura 6 foram interrompidos em uma fase de seleção precoce.

Isso explica por que a eficiência de transformação da construção tDT é de 0%.

Para a construção AtGRF5, a frequência média de transformação de 70% e para a construção BvGRF5, a frequência média de transformação de 32,5%, podem ser alcançadas.

2. EXPERIMENTOS EM ORYZA SATIVA

[102] Construções usadas no plasmídeo binário:

[103] Os vetores binários foram produzidos por procedimentos de clonagem convencionais. Dentro do T-DNA deste vetor, o cDNA que codifica GRF5 (At3g13960) foi clonado entre um promotor e um terminador adequados, garantindo níveis de expressão ectópica suficientes da proteína GRF5 em arroz (= construções únicas). O T-DNA também contém o gene GFP que foi usado para a seleção de células e tecidos vegetais transgênicos. Além disso, foram produzidos vetores binários que carregam ao lado do cDNA que codifica GRF5 (At3g13960), incluindo o promotor e o terminador adequados, garantindo níveis de expressão ectópica suficientes da proteína GRF5 no arroz, um gene adicional de interesse sob o controle de um promotor e terminador (= construções dupla (empilhadas)).

[104] Esterilização e semeadura de sementes:

[105] As sementes verdes tipo selvagem foram incubadas em etanol a 70% e submetidas à agitação por cerca de 1 minuto. Após a remoção do etanol, as sementes foram lavadas uma vez com água milliQ estéril. Em seguida, 30 mL de solução de hipoclorito de sódio a 6% foram adicionados e as sementes foram submetidas à agitação durante 40-60 minutos. Após a remoção da solução de hipoclorito de sódio, as sementes foram lavadas 3 a 5 vezes com mQ estéril.

[106] Após o término da esterilização (0 a 3 horas), as sementes foram secas em papel de filtro estéril e colocadas na superfície do meio de indução R001. A incubação ocorreu sob luz contínua (3000 lux) a 32ºC por 6 dias.

[107] Transformação e Cocultivo:

[108] Para a preparação do explante, embriões inchados (calos derivados de escutelo) das sementes do tipo selvagem adequados para transformação foram selecionados e transferidos para o meio de infecção líquido (R002) contendo Agrobacterium tumefaciens transformado com o plasmídeo que foi incorporado nas células vegetais por 1,5 minutos e depois para as placas de cocultivo (R003). As placas foram incubadas por 3 dias a 25ºC no escuro. Seleção de tecido resistente.

[109] Seleção

[110] Após 3 dias de cocultivo, os calos foram removidos das sementes, lavados várias vezes com água mQ estéril e uma vez com água mQ estéril contendo 250 mg/L de cefotaxima e foram transferidos para o meio de seleção R004. A incubação foi realizada sob luz contínua (3000 lux) a 32ºC por 2 semanas.

[111] Isolamento de microcalos & Regeneração

[112] Por meio de pinça estéril, os microcalos foram transferidos para o meio R005 e incubados sob luz contínua (3000 lux) a 32ºC por 1 semana. Posteriormente, o GFP usado como marcador de seleção foi verificado em câmara escura. Os calos positivos para GFP saudáveis foram transferidos para o meio R006 e posteriormente incubados sob luz contínua (3000 lux) a 32ºC por 1 semana. Para a regeneração contínua, os calos foram transferidos para o meio R007 por 3 semanas sob luz contínua (3000 lux) a 32ºC. Com uma pinça estéril, plântulas saudáveis foram retiradas e transferidas para R008 por 2 semanas sob luz contínua (3000 lux) a 32ºC antes que as plântulas fossem trazidas para a estufa.

TABELA 4 COMPOSIÇÃO DOS MEIOS R001 A R008. R001 - Meio de indução (sólido) Cód. do Concentração Ingredientes 1,00 L fornecedor/estoque Final Sais N6 Sigma - C1416 4,00 g Vitaminas N6 Duchefa - C0401 1x 1,00 mL L-Prolina Sigma -P5607 2878 mg/L 2,88 g Casaminoácidos BD - 223050 300 mg/L 0,30 g Sacarose Duchefa - S0809 30 g/L 30,00 g pH 5,80 Gelrite Duchefa - G1101,5 4 g/L 4,00 g 2,4-D (1mg/mL) Sigma - D7299 2 mg/L 2000,00 µL R002 - (líquido) Meio de infecção (esterilizado por filtro) Cód. do Concentração Ingredientes 1,00 l fornecedor/estoque Final Sais N6 Sigma - C1416 1x 4,00 g Vitaminas N6 Duchefa - C0401 1x 1,00 mL Casaminoácidos BD - 223050 300 mg/L 0,30 g Sacarose Duchefa - S0809 68,5 g/L 68,50 g VWR - D+-Glicose-Monohidratada 36,00 g MERC1,08342,1000 36 g/L pH 5,20 Acetoseringona (2M) Sigma Aldrich 2478-38-8 100 µM 66,00 µL Preparação de acetoseringona: 2M=392 mg em 1 mL de DMSO dus: 0,04 g em 100 µL de

DMSO R003 - (sólido) Meio de cocultivo Cód. do Concentração Ingredientes 1,00 l fornecedor/estoque Final Sais N6 Sigma - C1416 4,00 g Vitaminas N6 Duchefa - C0401 1x 1,00 mL Casaminoácidos BD - 223050 300 mg/L 0,30 g Sacarose Duchefa - S0809 30 g/L 30,00 g VWR - D+-Glicose-Monohidratada 10,00 g MERC1,08342,1000 10 g/L pH 5,20 Gelrite Duchefa - G1101,5 4 g/L 4,00 g

Acetoseringona (2M) Sigma Aldrich 2478-38-8 100 µM 66,00 µL 2,4-D (1mg/mL) Sigma - D7299 2 mg/L 2000,00 µL Preparação de acetoseringona: 2M=392 mg em 1 mL de DMSO dus: 0,04 g em 100 µL de

DMSO R004 - Meio de seleção (LBA nptII) Cód. do Concentração Ingredientes 1,00 l fornecedor/estoque Final Sais N6 Sigma - C1416 4,00 g Vitaminas N6 Duchefa - C0401 1x 1,00 mL L-Prolina Duchefa - P0717 2878 mg/L 2,88 g Casaminoácidos BD - 223050 300 mg/L 0,30 g Sacarose Duchefa - S0809 30 g/L 30,00 g pH 5,80 Agarose tipo 1 Sigma - A6013 7 g/L 7,00 g 2,4-D (1mg/mL) Sigma - D7299 2 mg/L 2000,00 µL Cefotaxima (200 mg/mL) Duchefa - C0111 100 mg/L 500,00 µL Vancomicina (100 mg/mL) Duchefa - V0155 100 mg/L 1000,00 µL Bissulfato de G418 (100 Sigma - G1279 35 mg/L 350,00 ul mg/mL) R005 - Meio de pré-regeneração Cód. do Concentração Ingredientes 1,00 l fornecedor/estoque Final Sais N6 Sigma - C1416 4,00 g Vitaminas N6 Duchefa - C0401 1x 1,00 mL L-Prolina Duchefa - P0717 500 mg/L 0,50 g Casaminoácidos BD - 223050 300 mg/L 0,30 g Sacarose Duchefa - S0809 30 g/L 30,00 g pH 5,80 Agarose tipo 1 Sigma - A6013 7 g/L 7,00 g Quinetina (1mg/mL) Sigma - K0753 2 mg/L 2000,00 µL NAA (1mg/mL) Duchefa - N0903 1 mg/L 1000,00 µL ABA Sigma - A1049 5 mg/mL 1000,00 µL Cefotaxima (200 mg/mL) Duchefa - C0111 100 mg/L 500,00 µL Vancomicina (100 mg/mL) Duchefa - V0155 100 mg/L 1000,00 µL Bissulfato de G418 (100 Sigma - G1279 35 mg/L 350,00 µL mg/mL) R006 - Meio de regeneração com 10 g/L de agarose Cód. do Concentração Ingredientes 1,00 l fornecedor/estoque Final Sais MS Duchefa - M0221 1x 4,30 g

Vitaminas MS Duchefa - 1000x /M0409 1x 1,00 mL Casaminoácidos BD - 223050 2000 mg/L 2,00 g Sacarose Duchefa - S0809 30 g/L 30,00 g Sorbitol Duchefa S0807 30 g/L 30,00 g pH 5,80 Agarose tipo 1 Sigma - A6013 10 g/L 10,00 g Quinetina (1mg/mL) Sigma - K0753 2 mg/L 2000,00 µL NAA (1mg/mL) Duchefa - N0903 0,02 mg/L 20,00 µL Cefotaxima (200 mg/mL) Duchefa - C0111 100 mg/L 500,00 µL Vancomicina (100 mg/mL) Duchefa - V0155 100 mg/L 1000,00 µL Bissulfato de G418 (100 Sigma - G1279 20 mg/L 200,00 µL mg/mL) R007 - Meio de regeneração Cód. do Concentração Ingredientes 1,00 l fornecedor/estoque Final Sais MS Duchefa - M0221 1x 4,30 g Vitaminas MS Duchefa - 1000x /M0409 1x 1,00 mL Sacarose Duchefa - S0809 30 g/L 30,00 g pH 5,80 Agarose tipo 1 Sigma - A6013 7 g/L 7,00 g Cefotaxima (200 mg/mL) Duchefa - C0111 100 mg/L 500,00 µL Vancomicina (100 mg/mL) Duchefa - V0155 100 mg/L 1000,00 µL Bissulfato de G418 (100 Sigma - G1279 20 mg/L 200,00 µL mg/mL) R008 - Meio de desenvolvimento Cód. do Concentração Ingredientes 1,00 l fornecedor/estoque Final Sais MS Duchefa - M0221 2,151045 g/L 2,15 g Vitamina B5 (sol. Estoque Duchefa - G0415 0,50 mL 1000x) 0,5x Sacarose Duchefa - S0809 10 g/L 10,00 g NAA Duchefa - N0903 0,05 mg/L 50,00 µL MgCl2.6H2O VWR - MERC1 0,75 g/L 0,75 g pH 5,80 Gelrite Duchefa - G1101,5 2,5 g/L 2,50 g RESULTADOS:

[113] A transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens dos calos derivados de embriões imaturos de arroz com diferentes construções contendo GRF5 leva a um aumento significativo da frequência de transformação média. Como controle ou como comparação, foi utilizada a eficiência de transformação observada para 28 outras construções aleatoriamente selecionadas sem GRF5, mostrando uma eficiência de transformação média de 63%. Para construções “únicas” a eficiência de transformação pode ser aumentada em média de 63% a 78%, para construções “duplas” até mesmo de 63% a 84% (Tabela 5).

TABELA 5 FREQUÊNCIA DE TRANSFORMAÇÃO DE EXPERIMENTOS INDEPENDENTES, COM CONSTRUÇÃO ÚNICA COM GRF5 OU COM GRF5 EM UM EMPILHAMENTO COM OUTRO GENE XY EM ARROZ.

[114] No total, foram testados 12 genes diferentes no empilhamento gênico com GRF5 de Arabidopsis thaliana (“GRF5”, sequência nucleotídica estabelecida na SEQ ID NO: 1, sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2), onde foram realizados três experimentos que foram repetidos duas vezes (indicado por Rep01 e Rep02). Além disso, o GRF5 de Sorghum bicolor (“GRF5-Sorghum”, sequência de nucleotídeos estabelecida na SEQ ID NO: 17, sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18) foi testado sozinho e em um empilhamento. As frequências de transformação médias estão indicadas em negrito.

Único/ Freq. de Gene #1 Gene #2 Empilhamento transformação [%] Único GRF5 72 Único GRF5 62 Único GRF5 73 Único GRF5 88 Único GRF5 93 Média: 78 Duplo GRF5 Gene XY-01 77

Único/ Freq. de Gene #1 Gene #2 Empilhamento transformação [%] Duplo GRF5 Gene XY-02 86 Duplo GRF5 Gene XY-03_Rep01 91 Duplo GRF5 Gene XY-03_Rep02 92 Duplo GRF5 Gene XY-04 92 Duplo GRF5 Gene XY-05_Rep01 75 Duplo GRF5 Gene XY-05_Rep02 100 Duplo GRF5 Gene XY-06 79 Duplo GRF5 Gene XY-07 89 Duplo GRF5 Gene XY-08 79 Duplo GRF5 Gene XY-09 81 Duplo GRF5 Gene XY-10_Rep01 80 Duplo GRF5 Gene XY-10_Rep02 82 Duplo GRF5 Gene XY-11 76 Duplo GRF5 Gene XY-12 77 Média: 84 Único GRF5-Sorgo 67 Média: 67 Duplo GRF5-Sorgo Gene XY-13 78 Média: 78 Controle: Média: 63

3. EXPERIMENTOS EM ZEA MAYS

[115] Construções usadas no plasmídeo binário:

[116] Os vetores binários foram produzidos por procedimentos de clonagem convencionais. Dentro do T-DNA destes vetores, a) o cDNA que codifica AtGRF5 (SEQ ID NO: 1), b) o DNA sintético que codifica ZmGRF5 (versão A) (SEQ ID NO: 208), e c) o DNA sintético que codifica ZmGRF5 (versão B) SEQ ID NO: 210) foram clonados entre um promotor adequado (por exemplo, promotor BdEF1) e o terminador garantindo níveis de expressão ectópica suficientes das proteínas GRF5 em milho. Como controle, foi utilizada uma construção contendo o gene repórter tDT sob controle do promotor 70S com o íntron ZmUbi.

[117] Transformação:

[118] A transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens foi conduzida pelo método padrão de transformação do monocotilédone usando o escutelo de embrião imaturo (por exemplo, WO 95/06722).

RESULTADOS:

[119] Conforme mostrado na Figura 10, a transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens dos embriões imaturos com construção contendo GRF derivado de Arabidopsis thaliana leva a um aumento significativo da frequência média de transformação, de 8% para 14%. Em contrapartida, o uso de ambas as versões de ZmGRF5 derivadas de diferentes genótipos de Zea mays aumentou muito mais a eficiência de transformação.

Para a versão A de ZmGRF5, a eficiência aumentou de 8% para 52% e para a versão B de ZmGRF5 a eficiência aumentou de 8% para 48%.

4. EXPERIMENTOS COM GLYCINE MAX (SOJA)

[120] Transformação da soja:

[121] A transformação da Glycine max foi realizada usando Agrobacterium rhizogenes para entrega do T-DNA nas células do meristema axilar do epicótilo localizadas no nó primário das mudas de soja da cultivar Jake (de acordo com Olhoft P.M., Bernal L.M., Grist L.B., Hill D.S., Mankin S.L., Shen Y., Kalogerakis M., Wiley H., Toren E., Song H.-S., Hillebrand H., e Jones T. 2007, A novel Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation method soybean [Glycine max (L.) Merrill] using primary-node explants from seedlings, In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant 43:536-549; e documentos US 2014237688, WO 2006024509, WO 2005121345).

[122] Produção de plasmídeos binários:

[123] Três plasmídeos binários foram produzidos seguindo procedimentos de clonagem convencionais. O primeiro plasmídeo binário foi o plasmídeo controle usado nos experimentos (referido no controle DsRed) e é o vetor base usado para os outros vetores. Ele contém no T-DNA um gene DsRed que foi usado para a pontuação fenotípica de células e tecidos vegetais transgênicos e o gene AtAHAS que foi usado para a seleção preferencial de células transgênicas. Ambos os genes foram clonados com promotor e terminadores adequados que garantem expressão ectópica suficiente para servir aos propósitos mencionados acima. O segundo plasmídeo binário contém o vetor base com o cDNA que codifica AtGRF5 (SEQ ID NO. 2) clonado entre um promotor e um terminador adequado, garantindo níveis de expressão ectópica suficientes da proteína GRF5 na soja. O terceiro plasmídeo binário contém o vetor base com o cDNA que codifica GmGRF5 (SEQ ID NO.

106) clonado entre um promotor e um terminador adequado, garantindo níveis de expressão ectópica suficientes da proteína GRF5 na soja.

[124] Esterilização das Sementes e Germinação:

[125] As sementes de soja da cultivar ‘Jake’ foram esterilizadas em uma câmara com um gás cloro produzido pela adição de 3,5 mL de HCl 12N a 100 mL de alvejante. Após a esterilização, aproximadamente 65 sementes foram semeadas em meio de germinação sólido (sais e vitaminas B5 1X, sacarose a 2%, ágar Noble a 0,8% (A5431 Sigma-Aldrich®); pH 5,8) em PlantCons®. As mudas foram germinadas sob luz (150 μm -2s-2) a 26ºC por 7 dias e utilizadas como material de explante para a transformação.

[126] Preparação do Agrobacterium:

[127] O Agrobacterium rhizogenes (WO 2006024509) foi transformado com um dos seguintes vetores contendo: (1) com marcador selecionável, pSUPER:DsRed e pPcUBI:AHAS, como controle, ou o vetor controle mais (2) pPcUbi-AtGRF5 ou (3) pPcUBI -GmGRF5. O A. rhizogenes foi cultivado e novamente suspenso em 50 mL de meio de inoculação líquido (1/10º sais B5 (G768 Phytotech), sacarose a 3%, 20 mM de MES, vitaminas de Gamborg 1X, 200 μM de acetosiringona, 1,44 μM de ácido giberélico, 5,0 μM cinetina; pH 5,4) em tubo Falcon até uma OD600 de 1,5. A suspensão de Agrobacterium foi então colocada em uma placa de Petri profunda para receber explantes preparados.

[128] Preparação e Transformação do Explante:

[129] Os explantes de mudas foram preparados a partir das mudas de 8 dias de idade, removendo as raízes e a maioria do hipocótilo, um cotilédone, o crescimento do tecido axilar no nó cotilédone e o epicótilo acima do nó primário, incluindo todas as folhas pré-formadas. Após a preparação dos explantes, aproximadamente 45-50 explantes foram incubados com a suspensão de Agrobacterium na placa de Petri por 30 minutos. Os explantes foram então colocados em placas de Petri em um papel de filtro molhado contendo meio de cocultura (1/10º sais B5 (G768 Phytotech), sacarose a 3%, 20 mM de MES, ágar Noble a 0,5% (A5431 Sigma-Aldrich®), vitaminas de Gamborg 1X, 200 μM de acetosiringona, 1,44 μM de ácido giberélico, 5,0 μM de cinetina, 4,1 mM de L-cisteína, 0,5 mM de ditiotreitol, 0,5 mM de tiossulfato de sódio; pH 5,4), e selados em um recipiente durante 5 dias em temperatura ambiente.

[130] Desenvolvimento e Seleção dos Brotos:

[131] Após 5 dias, os explantes foram transferidos para meio de seleção (sais B5 1X e vitaminas (G398 Phytotech), sacarose a 3%, 3 mM de MES, 1 μM de 6-benzil-aminopurina, 5 μM de cinetina, 250 mg/L de timentina STK, 3 μM de imazapir, ágar Noble 0,8% (A5431 Sigma-Aldrich®); pH 5,6) em cinco explantes por placa, e foram cultivados a 26ºC. Os explantes tiveram um crescimento significativo no meristema axilar-nó primário após 16 dias no meio de seleção e foram pontuados primeiro para o melhor desenvolvimento (regeneração). Após 22 dias de seleção (final da seleção), os explantes foram removidos do meio sólido e colocados no meio de cultivo Oasis® antes da pontuação para (1) qualidade da formação da parte aérea (broto) e (2) fluorescência DsRed nos brotos em desenvolvimento no nó-primário.

[132] Desenho experimental e resultados:

[133] Um experimento foi realizado por quatro pesquisadores e três construções (Tabela 6). Os meristemas axilares do nó primário da soja foram transformados com o controle DsRed, AtGRF5 e GmGRF5. No total, 524 explantes de mudas foram transformados e pontuados após 16 dias na seleção (21 dias após a transformação) e 22 dias na seleção (27 dias após a transformação). Após 16 dias de seleção, os brotos estavam crescendo rapidamente no nó primário e eram uma combinação de pequenas almofadas compactas e brotações maiores e mais alongadas (Figura 11). A regeneração [(número de explantes com brotações)/total de explantes * 100] no tecido alvo (o nó primário) estava entre 80-100% para todas as construções e foi fixada em 16 dias na seleção. Entre 16 e 22 dias, os brotos nos explantes continuaram a crescer rapidamente. Para ambos os pontos no tempo, os explantes foram pontuados subjetivamente quanto à presença de crescimento saudável e prolongado do broto com uma morfologia (‘boa’) que é preditiva da formação bem-sucedida de uma planta transgênica enraizada (Figura 12). Houve um aumento de brotações com formação ‘boa’ nos explantes transformados com todas as três construções nos dois pontos no tempo, especialmente nos explantes transformados com AtGRF5 e GmGRF5. Nas quatro repetições, os explantes transformados com qualquer forma de GRF5 tenderam a ter uma formação de brotamento mais avançada (brotações maiores, mais alongadas) quando comparados ao controle DsRed (Figura 13).

[134] Para obter uma medição precoce das eficiências de transformação, os explantes foram pontuados nos dias 16 e 22 da seleção quanto à presença ou ausência de brotações fluorescentes DsRed no nó primário, devido às células transgênicas que expressam a proteína DsRed. A expressão DsRed foi notavelmente mais intensa nas construções contendo AtGRF5 ou GmGRF5 do que nas construções controle DsRed nos dois momentos; entretanto, essa diferença foi mais intensa no dia 16 de seleção (Figura 11). Os explantes que foram caracterizados como tendo ‘boa’ morfologia de brotações geralmente tiveram brotações com expressão de DsRed (Figura 11). A porcentagem de explantes com brotações expressando DsRed foi significativamente maior (em α = 0,05) nos explantes que foram transformados com AtGRF5 ou GmGRF5 do que em comparação com os explantes transformados com o controle DsRed nos dois momentos (Tabela 6; Figura 14). Dentre os explantes transformados com a construção controle DsRed, 54,5% apresentaram brotações expressando DsRed comparados a 70,2% e 74,6% com as construções expressando AtGRF5 e GmGRF5, respectivamente, após 22 dias de seleção (Tabela 6). Os dados indicam que, aos 27 dias após a transformação, os explantes de soja transformados com AtGRF5 ou GmGRF5 têm brotações transgênicas significativamente mais regeneradas no nó primário do que os explantes não transformados com qualquer forma de GRF5.

TABELA 6

REGENERAÇÃO DE BROTAÇÕES TRANSFORMADAS AUMENTOU SIGNIFICATIVAMENTE EM EXPLANTES TRANSFORMADOS COM ATGRF5 OU GMGRF5 NOS DIAS 16 E 22 DA SELEÇÃO.

[135] A média, o intervalo na regeneração e os brotos fluorescentes com DsRed são mostrados. As construções que foram significativamente diferentes (em α = 0,05) são seguidas por letras diferentes; 1 = [(número de explantes com brotações no nó primário/número total {n} de explantes inoculados) x 100]; 2 = [(número de explantes com brotações DsRed no nó primário/número total {n} de explantes inoculados) x 100] Explantes (%) com Regeneração (%)1 brotações DsRed2 dia 16 na seleção dia 16 na seleção dia 22 na seleção Construção n Méd. Interv. (%) Méd. Interv. (%) Méd. Interv. (%) 162 89,8 a 81,8-95,2 31,4 a 20,5-40,5 54,5 a 50,0-57,1 DsRed controle 180 88,4 a 82,6-91,3 58,0 b 52,2-66,7 70,2 b 65,2-78,6 AtGRF5 182 94,6 a 85,4-100 53,3 b 45,2-61,9 74,6 b 62,5-86,0 GmGRF5

5. EXPERIMENTOS COM BRASSICA NAPUS (CANOLA)

[136] Transformação de Canola:

[137] A transformação de Brassica napus foi realizada usando Agrobacterium rhizogenes para entrega de T-DNA em segmentos de hipocótilo de mudas de B. napus do genótipo BNS3.

[138] Esterilização das Sementes e Germinação:

[139] As sementes foram esterilizadas na superfície, colocando 200-300 sementes por 2 minutos em etanol 70% em um tubo Falcon de 50 mL.

Após agitação suave durante 2 minutos, o etanol foi removido e foram adicionados 40 a 50 mL de alvejante Clorox a 30% com 1 gota de Tween. As sementes foram incubadas por 10 minutos com mistura ocasional. O líquido foi removido e, em seguida, as sementes foram lavadas com água estéril três vezes antes de serem colocadas em meio de germinação (sais MS 1/2x/vitaminas, 10 g L-1 de sacarose, ágar 7 g L-1 de ágar Phytoagar; pH 5,8) em caixas PlantCon. As caixas foram colocadas em uma câmara por 4 a 5 dias no escuro a 23ºC.

[140] Preparação do Agrobacterium:

[141] O Agrobacterium rhizogenes foi transformado com um dos seguintes vetores: (1) marcador selecionável pSUPER:DsRed e pPcUBI:AHAS como controle, ou o vetor controle mais (2) PcUbi-AtGRF5 ou (3) PcUBI- BnGRF5 (SEQ ID NO. 108). O Agrobacterium rhizogenes foi cultivado até uma OD600 de 1,0 e subsequentemente diluído para 0,1 com meio de infecção líquido (sais MS 1x/vitaminas, 30 g L-1 de sacarose; pH 5,8). A suspensão de Agrobacterium foi então colocada em uma placa para receber explantes de hipocótilo.

[142] Preparação e Transformação do Explante:

[143] Os explantes de hipocótilo foram preparados a partir de mudas etioladas de quatro a cinco dias, removendo da caixa de germinação e colocando em papel de filtro estéril umedecido com meio de infecção sem Agrobacterium para manter as mudas túrgidas. Os segmentos de hipocótilo com 7 a 10 mm de comprimento foram preparados após remoção da raiz, cotilédone e epicótilo. Após o corte, o explante foi mergulhado na suspensão de Agrobacterium, secado em papel de filtro estéril seco e finalmente colocado em papel de filtro sobre o meio de cocultura (sais MS 1x/vitaminas, 30 g L -1 de sacarose, 30 g L-1 de sacarose, 0,6 g L-1 de MES, 18 g L-1 de manitol, 7 g L-1 de ágar Phytoagar, 1 mg L-1 de 2,4-D, 100 mg L-1 de acetoseringona, 200 mg L-1 de L-cisteína; pH 5,6) em placas. Uma vez que ~ 50 explantes foram semeados, as placas foram seladas com fita microporosa e cultivadas à luz a 23ºC em um fotoperíodo de 16 h claro/8 h escuro por 3 dias.

[144] Desenvolvimento de calo e iniciação de brotos:

[145] Após 3 dias, todos os explantes foram transferidos para o meio de recuperação (sais MS 1x/vitaminas, 30 g L -1 de sacarose, 0,6 g L-1 de MES, 18 g L-1 de manitol, 7 g L-1 de ágar Phytoagar, 1 mg L-1 de 2, 4-D, 300 mg L-1 de timentina; pH 5,6), selados com fita microporosa, e cultivados a 23ºC durante 7 dias. Os explantes foram transferidos para o meio de seleção #1

(sais MS 1x/vitaminas, sacarose 30 g L-1, 0,5 g L-1 de MES, 7 g L-1 de ágar Phytoagar, 3 mg L-1 de BAP, 0,1 mg L-1 de NAA, 0,1 mg L-1 de GA3, 2,5 mg L-1 de AgNO3, 100 nM de imazetapir, 300 mg L-1 de timentina; pH 5,8) após uma semana e cultivada por 14 dias a 23ºC sob fotoperíodo de 16 h de luz/8 h de escuro. Após duas semanas de seleção, os explantes foram transferidos para o Meio de Seleção 2 (sais MS 1x/vitaminas, sacarose 30 g L -1, 0,5 g L-1 de MES, 7 g L-1 de ágar Phytoagar, 0,5 mg L-1 de BAP, 0,1 mg L-1 de GA3, 2,5 mg L-1 de AgNO3, 100 nM de imazetapir, 300 mg L-1 de timentina; pH 5,8).

[146] Desenho experimental e resultados:

[147] Cinco experimentos ao longo do tempo foram conduzidos em três pesquisadores com um mínimo de uma repetição por pesquisador (Tabela Canola-1). No experimento 1, os hipocótilos de Brassica napus foram transformados com o controle DsRed e as construções BnGRF5 apenas para o experimento 1; nos outros experimentos, os explantes foram transformados com as construções controle DsRed, e com AtGRF5 e BnGRF5. No total, 3.156 explantes foram inoculados e pontuados quanto à fluorescência DsRed após 16 a 22 dias. Nesse momento, os explantes estavam desenvolvendo calo rapidamente, principalmente nas extremidades cortadas do hipocótilo. Os explantes foram pontuados quanto à presença ou ausência de fluorescência DsRed nos explantes, independentemente do tamanho, intensidade e frequência em um único explante. A frequência dos setores expressando DsRed é um indicador precoce da eficiência da transformação para um tratamento.

[148] A expressão DsRed foi notavelmente mais intensa nas construções contendo AtGRF5 ou BnGRF5 do que no controle DsRed (Figura 15). A porcentagem de explantes com brotações expressando DsRed foi significativamente maior nos explantes que foram transformados com AtGRF5 ou BnGRF5 em comparação com os explantes transformados com o controle

DsRed (Tabela 7; Figura 16). Dentre os explantes transformados com a construção controle DsRed, 20,1% apresentaram brotações expressando DsRed comparados a 56,6% e 58,5% com as construções expressando AtGRF5 e GmGRF5, respectivamente. Os dados indicam que, aos 21 dias após a transformação, os explantes de B. napus transformados com AtGRF5 ou BnGRF5 têm quase três vezes mais setores de calo transgênico do que os explantes não transformados com nenhuma das formas de GRF5 (α = 0,05; estatisticamente significativo). Diferenças significativas entre pesquisadores e experimentos não foram detectadas entre os tratamentos (construções).

TABELA 7

CALOS TRANSFORMADOS AUMENTARAM SIGNIFICATIVAMENTE EM EXPLANTES TRANSFORMADOS COM ATGRF5 OU BNGRF5 EM 21 DIAS APÓS A INOCULAÇÃO.

[149] A média, o intervalo na regeneração e os calos fluorescentes com DsRed são mostrados. As construções significativamente diferentes (α = 0,05) são seguidas por letras diferentes; 1 = [(número de explantes com calo DsRed/número total {n} de explantes inoculados) x 100]. Pesquisadores Explantes (%) com DsRed1 Experimento inoculados Replicatas Explantes Construção média Intervalo Controle 5 3 20 1202 20,1 a 13 - 28,7 AtGRF5 4 3 15 822 56,6 b 40,8 - 70,3 BnGRF5 5 3 20 1132 58,5 b 44,0 - 78,4

Claims (15)

REIVINDICAÇÕES

1. MÉTODO PARA TRANSFORMAR UMA CÉLULA VEGETAL, caracterizado por compreender as etapas de; (a1) introdução em uma célula vegetal de maneira paralela ou sequencial de; i. pelo menos uma sequência nucleotídica de interesse; e ii. um cassete de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo GRF5, o mRNA que codifica um polipeptídeo GRF5, ou polipeptídeo(s) GRF5; ou (a2) introdução de pelo menos uma sequência nucleotídica de interesse em uma célula vegetal; e introdução, de maneira paralela ou sequencial, de um nível de expressão intensificado de um gene endógeno que codifica um polipeptídeo GRF5 na referida célula vegetal; e (b) opcionalmente, cultivo da célula vegetal de (a1) ou (a2) ou uma célula vegetal derivada da célula vegetal de (a1) ou (a2) sob condições em que, na célula vegetal, o polipeptídeo GRF5 é expresso a partir do cassete de expressão, o polipeptídeo GRF5 é traduzido a partir do mRNA introduzido, o polipeptídeo GRF5 tem a expressão aumentada a partir do gene endógeno, ou estão presentes polipeptídeos GRF5.

2. MÉTODO PARA MODIFICAR O GENOMA de uma célula vegetal, caracterizado por compreender as etapas de; (a1) introdução de um cassete de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo GRF5, o mRNA que codifica um polipeptídeo GRF5, ou polipeptídeo(s) GRF5 em uma célula vegetal; ou

(a2) indução de um nível de expressão intensificado de um gene endógeno que codifica um polipeptídeo GRF5 em uma célula vegetal; e (b) cultivo da célula vegetal de (a1) ou (a2) ou de uma célula vegetal derivada da célula vegetal de (a1) ou (a2) sob condições em que, na célula vegetal, o polipeptídeo GRF5 é expresso a partir do cassete de expressão, o polipeptídeo GRF5 é traduzido a partir do mRNA introduzido, o polipeptídeo GRF5 tem a expressão aumentada a partir do gene endógeno, ou estão presentes polipeptídeos GRF5; (c) modificação do genoma da célula vegetal de (b) por meio de uma enzima indutora de quebra do DNA de fita dupla (DSB) que reconhece preferencialmente um sítio predeterminado no genoma da referida célula e, opcionalmente, por meio de uma molécula de ácido nucleico de reparação, em que a modificação do referido genoma no referido sítio predeterminado é selecionada a partir de i. uma substituição de pelo menos um nucleotídeo; ii. uma deleção de pelo menos um nucleotídeo; iii. uma inserção de pelo menos um nucleotídeo; ou iv. qualquer combinação de i. - iii.; e em que a etapa (c) é conduzida simultaneamente à etapa (a1)/(a2) e/ou (b), antes da etapa (a1)/(a2), entre a etapa (a1)/(a2) e (b) ou após a etapa (b).

3. MÉTODO PARA PRODUZIR UMA PLANTA TRANSGÊNICA, caracterizado por compreender as etapas de: (a) transformação de uma célula vegetal de acordo com o método da reivindicação 1, e

(b) regeneração a partir da célula vegetal de (a) ou a partir de uma célula vegetal derivada da célula vegetal de (a) de uma planta compreendendo pelo menos uma célula que compreende a pelo menos uma sequência nucleotídica de interesse como transgene.

4. MÉTODO PARA PRODUZIR UMA PLANTA GENÉTICAMENTE MODIFICADA, caracterizado por compreender as etapas de: (a) modificação do genoma de uma célula vegetal de acordo com o método da reivindicação 2, e (b) regeneração a partir da célula vegetal de (a) ou a partir de uma célula vegetal derivada da célula vegetal de (a) de uma planta compreendendo em pelo menos uma célula a modificação do genoma.

5. MÉTODO PARA PRODUZIR UM EMBRIÃO VEGETAL HAPLOIDE, caracterizado por compreender as etapas de: (a1) introdução de um cassete de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo GRF5, mRNA que codifica o polipeptídeo GRF5 ou polipeptídeo GRF5 em um gametófito masculino imaturo ou micrósporo; ou (a2) indução de um nível de expressão intensificado de um gene endógeno que codifica um polipeptídeo GRF5 em um gametófito masculino imaturo ou micrósporo; e (c) cultivo do gametófito masculino imaturo ou micrósporo de (a) sob condições em que no gametófito masculino imaturo ou no micrósporo o polipeptídeo GRF5 é expresso a partir do cassete de expressão, o polipeptídeo GRF5 é traduzido a partir do mRNA introduzido, a expressão do polipeptídeo

GRF5 é intensificada a partir do gene endógeno ou os polipeptídeos GRF5 estão presentes; e (d) seleção do embrião vegetal haploide derivado do gametófito masculino imaturo ou do micrósporo da etapa (b).

6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo polipeptídeo GRF5 compreender um domínio PFAM PF08880 e um domínio PFAM PF08879, de preferência em que o domínio PFAM PF08880 encontra uma correspondência de sequência de pelo menos 90% de cobertura na porção N-terminal ou próximo à porção N-terminal do polipeptídeo GRF5; e o domínio PFAM PF08879 encontra uma correspondência de sequência de pelo menos 90% na porção C-terminal localizada no domínio PFAM PF08880 no polipeptídeo GRF5.

7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por ambos os trechos de aminoácidos correspondentes estarem localizados na metade N-terminal do polipeptídeo GRF5, preferencialmente o trecho de aminoácidos correspondendo ao domínio PFAM PF08880 está localizado no quarto N-terminal do polipeptídeo GRF5.

8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizado pelo polipeptídeo GRF5 compreender o motivo [D]-[PL]- [E]-[P]-[G]-[R]-[C]-[R]-[R]-[T]-[D]-[G]-[K]-[K]-[W]-[R]-[C]-[SA]-[RK]-[ED]-[A]-[YH]- [P]-[D]-[S]-[K]-[Y]-[C]-[E]-[KR]-[H]-[M]-[H]-[R]-[G]-[RK]-[N]-[R] (SEQ ID NO: 177) com um número máximo de três posições não correspondentes no pareamento de sequência (mismatches), em que preferencialmente o motivo consiste em qualquer uma das sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 a SEQ ID NO: 104 ou SEQ ID NO: 113 a SEQ ID NO: 176, e/ou preferencialmente o motivo contém uma sub-região do trecho de aminoácido correspondente ao domínio PFAM PF08879.

9. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizado pelo polipeptídeo GRF5; compreender: (i) uma sequência de aminoácidos compreendendo a SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 106, 108, 110, 112 ou 209; ou (ii) uma sequência de aminoácidos compreendendo uma sequência que é pelo menos 70% idêntica ao aminoácido de (i).

10. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, caracterizado pelo polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo GRF5; compreender: (i) uma sequência nucleotídica compreendendo a SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 105, 107, 109, 111, 207, 208 ou 210; (ii) uma sequência nucleotídica compreendendo uma sequência que é pelo menos 70% idêntica a sequência nucleotídica de (i).

(iii) uma sequência nucleotídica que codifica um polipeptídeo codificado por (i) ou (ii), dentro do escopo da degenerescência do código genético; (iv) uma sequência nucleotídica complementar a uma sequência nucleotídica de (i), (ii) ou (iii); ou (v) uma sequência nucleotídica que hibridiza com uma sequência nucleotídica de (iv) sob condições estringentes.

11. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, caracterizado pela introdução do cassete de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo GRF5 em uma célula vegetal resultar em uma integração estável do mesmo no genoma da célula vegetal; ou a introdução do cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo GRF5, mRNA que codifica o polipeptídeo GRF5 ou o(s) polipeptídeo(s) GRF5 ou indução do nível de expressão intensificado de um gene endógeno que codifica um polipeptídeo GRF5 em uma célula vegetal resultar em uma ocorrência transitória do(s) polipeptídeo(s) GRF5 na célula vegetal ou na progênie da mesma.

12. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 11, caracterizado pelo polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo GRF5 estar operacionalmente ligado com pelo menos uma sequência reguladora adequada para a expressão do polipeptídeo GRF5 em uma célula vegetal.

13. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pela célula vegetal da etapa (a1) ou (a2) ser uma célula de tecido somático, tecido caloso, tecido meristemático, tecido embrionário ou um protoplasto.

14. PLANTA, caracterizada por ser obtida ou obtenível pelo método da reivindicação 3 ou 4, ou uma planta descendente da mesma.

15. CÉLULA VEGETAL OU SEMENTE DE PLANTA, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pela célula vegetal ou semente compreender pelo menos uma sequência nucleotídica de interesse como transgene ou compreender a modificação no genoma.