CN103597082B - 用于在预选位点修饰植物基因组的方法和手段 - Google Patents

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Abstract

提供了以靶向方式修饰棉花植物基因组的方法和手段，使用双链DNA断裂诱导酶和胚性愈伤组织。

Description

用于在预选位点修饰植物基因组的方法和手段
发明领域
本发明涉及农艺学领域。更具体地，本发明提供了使用胚性愈伤组织在棉花植物的基因组中精确定位的核苷酸序列上引入靶向修饰的方法和手段，该靶向修饰包括插入、缺失或取代。
背景技术
在植物基因组中引入靶向修饰的需求（包括控制在植物中外源DNA整合的定位）已变得日益重要，并且为了满足这一需求，已经开发了若干方法（综述参见Kumar（库马尔）和Fladung（弗拉东），2001,Trends in Plant Science（《植物科学趋势》），6,pp155-159）。这些方法大部分依赖于经由双链断裂诱导（DSBI）酶的表达，在靶向位置初始引入的双链DNA断裂。
经由罕见切割内切核酸酶（例如I-SceI），通过诱导双链DNA断裂（DSB），激活靶基因座和/或修复或供体DNA，已经示出出增加若干数量级的同源重组的频率（Puchta（普赫塔）等人，1996,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.（美国国家科学院院刊）），93,pp5055-5060;Chilton（奇尔顿）和Que（秋），Plant Physiol.（《植物生理学》），2003;D’Halluin（阿吕安）等人，2008Plant Biotechnol.J.（《植物生物技术杂志》）6,93-102）。
WO96/14408描述了一种编码酶I-SceI的分离DNA。这种DNA序列可以并入克隆和表达载体、转化细胞系和转基因动物中。在基因作图和基因的定点插入中这些载体可以是有用的。
WO00/46386描述了通过I-SceI诱导的双链断裂，在细胞中修饰、修复、减弱和灭活一个基因或其他染色体DNA的方法。还披露了在需要其的个体中治疗或预防遗传性疾病的方法。进一步披露了嵌合的限制性内切酶。
WO2005/049842描述了使用罕见分裂“双链断裂”诱导（DSBI）酶连同改进的I-SceI编码核苷酸序列改进植物中靶向DNA插入的方法和手段。
WO2006/105946描述了用于通过同源重组在植物细胞和植物中将靶DNA序列精确交换为感兴趣的DNA序列的方法，由此可以随后去除在用于基因取代事件的临时选择的同源重组阶段期间使用的可选择的或可筛选的标记，而在去除步骤期间不遗留痕迹并且不依靠体外培养，采用其中描述的方法用于通过小孢子特异性表达的DSBI罕见分裂内切核酸酶去除选择的DNA。
WO2008/037436描述了WO2006/105946方法和手段的变体，其中通过双链断裂诱导罕见分裂内切核酸酶诱导的选择的DNA片段的去除步骤处于种系特异启动子的控制下。该方法的其他实施例依赖在修复DNA的一端的非同源末端-连接和在另一端的同源重组。WO08/148559描述了WO2008/037436方法的变体，即在真核细胞中（例如植物细胞）中通过同源重组用于将靶DNA序列精确交换为感兴趣的DNA序列的方法，由此可以随后去除在用于基因取代事件的临时选择的同源重组阶段期间使用的可选择的或可筛选的标记，而不遗留痕迹,采用用于去除在直接重复中侧翼是两个核苷酸序列的选择的DNA的方法。
WO2003/004659披露了重组系统以及用于从真核生物染色体DNA去除核酸序列的方法。本发明还涉及转基因生物（优选地植物），包含所述系统或由所述方法产生。
WO2006/032426披露了改进的重组系统以及用于从植物基因组中消除标记序列的方法。具体地，本发明基于一种表达盒的用途，该表达盒包括欧芹泛素启动子，以及可操作地连接到其上的编码特异DNA-核酸内切酶序列的核酸序列。
WO2009/006297披露了用于改变单子叶植物细胞和单子叶植物的基因组的方法和组合物，涉及使用双链断裂诱导剂以改变单子叶植物或植物细胞基因组序列，该序列包括用于双链断裂诱导剂的识别序列。
WO2004/006667描述了经由体细胞胚发生的棉花的再生和农杆菌介导的转化的改进方法。
WO2005/103271描述了经由农杆菌介导的T-DNA接合至悬浮液-培养的细胞或愈伤组织用于高效植物转化的方法，采用过滤器的膜作为用于T-DNA供体和受体的共培养的多孔固体支持物。
WO2008/112633涉及外植体材料的切除，该外植体材料包括来自棉花种子的分生组织。披露了用于转化植物的组织制备、储存、转化和选择或鉴别的方法，以及由此种方法产生的可转化的分生组织和植物、以及用于组织制备的设备（apparati）。
使用DSBI酶的基因组工程方法已经在植物，像烟草（参见例如Puchta（普赫塔）等人），1996;Townsend（汤森）等人，Nature（《自然》）459:442-445,2009）和玉米（参见例如WO2009/006297，Shukla（舒克拉）等人，Nature（《自然》）459:437-441,2009）中施用。然而，仍然存在对开发用于植物的靶向基因组修饰的方法的需求，这些植物在组织培养和转化中更顽固，例如棉花。本发明通过提供这种方法提供了一种本领域内的贡献，该方法使用棉花胚性愈伤组织用于单独或与一种修复DNA组合引入内切核酸酶，这一修复DNA将用作用于双链DNA断裂修复的模板。
发明概述
在第一实施例中，本发明提供了一种用于在预定义位点修饰棉花植物细胞基因组的方法，该方法包括以下步骤
a.在所述预定义位点或其附近诱导双链DNA断裂，所述双链断裂是通过向所述细胞引入罕见分裂内切核酸酶诱导，该酶在所述预定义位点或其附近识别一个识别序列；
b.选择一种植物细胞，其中所述双链DNA断裂已经被修复，导致了在基因组中所述预选位点的修饰，其中所述修饰选自
i.至少一个核苷酸的取代；
ii.至少一个核苷酸的缺失；
iii.至少一个核苷酸的插入；或者
iv.i.-iii.的任何组合；
其特征在于所述细胞包括在胚性愈伤组织中
在一个实施例中，可以通过将编码所述内切核酸酶的DNA分子递送至所述细胞中，将该内切核酸酶引入所述细胞。
在另一个实施例中，先于步骤b.，将一种外源修复DNA分子递送至所述细胞中，所述外源修复DNA分子被用作用于修复所述双链DNA断裂的模板。
在一个特定实施例中，该胚性愈伤组织诱导自下胚轴的外植体。胚性愈伤组织可以在包括活性炭的培养基上诱导。在所述内切核酸酶的所述引入之前、之中和之后，可以在没有激素的培养基中孵育胚性愈伤组织。在所述内切核酸酶的所述引入之前和之后，还可以在固体培养基上孵育愈伤组织。另外，在内切核酸酶的所述引入之中或之后，可以在非选择性培养基上孵育胚性愈伤组织1至4天。
在一个实施例中，通过粒子轰击将内切核酸酶编码DNA和/或外源修复DNA递送至胚性愈伤组织的细胞中。可以用约0.5pmol外源修复DNA和/或约0.5pmol内切核酸酶编码DNA实施轰击。在轰击之前胚性愈伤组织可以在包括0.2M甘露醇和0.2M山梨醇的培养基中孵育约2至约20小时。另外，在所述内切核酸酶的所述引入之中或之后，可以在非选择性培养基（包括0.2M甘露醇）上孵育胚性愈伤组织1至4天。
在一个实施例中，使用农杆菌介导的转化将内切核酸酶编码DNA和/或外源修复DNA递送至胚性愈伤组织的细胞中。可以通过将愈伤组织与一种或多种土壤农杆菌属菌株（包括这一种或多种DNA分子）在包括100μM乙酰丁香酮和/或100mg/l L-半胱氨酸的培养基中共培养来实施农杆菌介导的DNA转移。转化后，愈伤组织可以在包括250mg/L或125mg/Ltriacillin的培养基上进行孵育。
在一个具体实施例中，外源修复DNA包括至少一个侧翼核苷酸序列，该侧翼核苷酸序列与所述预定义位点的上游或下游DNA区域具有充分同源性，以允许与所述上游或下游DNA区域重组。该外源修复DNA可以包括两个位于所述外源DNA相反端的侧翼核苷酸序列，一个所述侧翼核苷酸序列与所述预定义位点的上游DNA区域具有充分同源性，另一个侧翼核苷酸序列与所述预定义位点的下游序列具有充分同源性，以允许所述侧翼核苷酸序列与所述上游和下游DNA区域之间的重组。外源修复DNA还可以包括一个可选择性标记基因和/或一个感兴趣的植物可表达基因。感兴趣的植物可表达基因可以选自下组：除草剂耐受性基因，昆虫抗性基因，疾病抗性基因，非生物逆境抗性基因，涉及油类生物合成、糖类生物合成的酶，涉及纤维强度或纤维长度的酶，涉及次生代谢生物合成的酶。
在另一个实施例中，外源DNA由两个侧翼核苷酸序列组成，一个所述侧翼核苷酸序列与所述预定义位点的上游DNA区域具有充分同源性，另一个侧翼核苷酸序列与所述预定义位点的下游序列具有充分同源性，以允许所述侧翼核苷酸序列与所述上游和下游DNA区域之间的重组。
仍在另一个实施例中，预选位点侧翼是两个具有充分同源性的区域，用于彼此重组。
本发明进一步提供了用于在预定义位点修饰棉花植物细胞基因组的方法，该方法使用如以上描述的胚性愈伤组织，其中所述棉花植物细胞进一步再生成棉花植物。由此生成的棉花植物可以进一步与另一植物进行杂交。
还提供了一种棉花植物细胞，该细胞包括在该基因组预定义位点的一个修饰，通过如以上描述的任何方法获得，连同提供了一种棉花植物或那个植物的纤维或种子或繁殖材料，包括在该基因组的预定义位点的一个修饰。
本发明进一步涉及生长如以上描述的棉花植物的方法，进一步包括向所述植物或基质施用一种化学品的步骤，其中所述植物是长成的，连同涉及一种用于生产包括在该基因组的预定义位点的修饰的植物的方法，包括将一种基本上由如以上描述的植物细胞组成的植物或如以上描述的植物与另一植物或与它自己杂交，以及可任选地收获的种子的步骤。
附图说明
图1：通过至少一侧的同源重组的靶向插入/取代的示意图。剪刀表明对于DSBI酶（I-SceI）的识别位点，模块箭头代表启动子，箭头P3和P4代表引物，交叉和点交叉代表靶构建体pTCV117和修复DNA pTIB323之间的潜在同源重组。潮霉素抗性（hygR）和草甘膦敏感性（glyphS）选择后，可以发生两个事件组；（II）（II），赋予潮霉素抗性的修复DNA在随机位点被整合进入基因组中并且将位于靶基因座的EPSPS基因通过在第一（左边）I-SceI位点的双链DNA断裂诱导从35S启动子的双向控制移除，在这种情况下，用引物P3xP4的PCR扩增并不生成PCR产物，亦或（I），将位于靶基因座的EPSPS基因通过与修复DNA的3’EPSPS片段的同源重组截短，由此潮霉素抗性基因并入在靶基因座，并且由此在另一端不同情况可能取决于使用的I-SceI位点（条纹图所指明），在这种情况下，允许引物P3和P4之间的区域扩增。
图2：通过非同源末端连接的靶向插入/取代的示意图。潮霉素抗性的选择可以导致修复DNA pTIB236随机整合进入该基因组，由此用引物P3XP4和P1xP2的PCR扩增并不生成PCR产物，亦或导致（I-III），取决于所使用的I-SceI位点，在DSBI位点的修复DNA的插入（I和III）或者由修复DNA引起的BAR基因的取代，(II)，导致了用不同长度的引物P3xP4和P1xP2的PCR产物。
本发明不同实施方案的详细说明
本发明的诸位发明人已经发现，在棉花中经由双链DNA断裂诱导，靶向基因组修饰可以通过使用胚性愈伤组织有效地实施，用于引入双链断裂诱导（DSBI）酶，例如通过引入一种编码这种酶的DNA分子和酶，并且可任选地一种作为用于双链DNA断裂修复的模板发挥功能的DNA分子，例如经由直接DNA转移方法（粒子轰击）或经由土壤农杆菌介导的DNA递送。使用这些递送程序进入胚性愈伤组织，靶向插入、取代和缺失可以在棉花植物的核基因组中，在双链断裂诱导的位点附近实施。
如在此使用，罕见分裂内切核酸酶是能够在具体核苷酸序列（称为“识别位点”或“识别序列”）诱导DNA断裂的酶，即它们是位点特异性内切核酸酶。它们是“罕见分裂”的，在某种意义上是由于它们的特异性、通常长的识别位点（约12-40nt），它们具有非常低频率的分裂，即使在更大的植物基因组中，例如它们在靶基因组中切割低于20x、低于10x、低于5x或仅一次。罕见分裂双链DNA断裂诱导（DSBI）酶是罕见分裂内切核酸酶，该酶在它们的识别位点诱导双链DNA断裂（DSB）。寻靶内切核酸酶，有时也称为大范围核酸酶，构成了此类罕见分裂内切核酸酶家族。它们可以由内含子、独立基因或插入序列编码，并且呈现了将它们和更经典的限制性内切酶（通常来自细菌限制修饰II型系统）区分的显著结构和功能特性。它们的识别位点具有与大多数限制性内切酶识别位点的特征性二重对称形成对比的一般不对称性（general asymmetry）。若干由内含子或内含肽编码的寻靶内切核酸酶已经示出促进它们对应的遗传元件寻靶进入等位基因的无内含子的或无内含肽位点。通过在无内含子或无内含肽等位基因中制造一种位点特异性双链断裂，这些核酸酶产生了引起重组的末端，这些末端参与基因转换过程，该过程复制了编码序列并且导致了内含子或插入序列在DNA水平的插入。
一种良好表征的标记的寻靶内切核酸酶是I-SceI。I-SceI是一种位点特异性内切核酸酶，是造成酿酒酵母中位于线粒体中内含子移动的原因。该酶是由21S rRNA基因可任选的内含子Sc LSU.1编码的并且在产生具有3’OH突出端的4bp交错切口的内含子插入位点引发双链DNA断裂。I-SceI内切核酸酶的识别位点扩大到18bp的非对称序列（Colleaux（科莱阿克斯）等人1988Proc.Natl.Acad.Sci.USA（《美国国家科学院院刊》85:6022-6026）。I-SceI的氨基酸序列以及线粒体I-SceI基因的通用密码等效物已经由例如WO96/14408提供。WO96/14408进一步披露了多个I-SceI蛋白突变体，这些突变体仍然是功能性的。
PCT申请PCT/EP04/013122（通过引用结合在此）提供了I-SceI的合成核苷酸序列突变体，这些突变体在植物中已经被优化表达。此类合成I-Sce I编码区域的核苷酸序列列举在UIPAC密码中，在SEQ ID No1中。UIPAC密码的符号具有它们的通用含义，例如N=A或C或G或T；R=A或G；Y=C或T；B=C或G或T（不是A）；V=A或C或G（不是T）；D=A或G或T（不是C）；H=A或C或T（不是G）；K=G或T；M=A或C；S=G或C；W=A或T。
其他罕见分裂DSBI酶以及它们对应的识别位点的列表提供在WO03/004659（17页至20页）的表I中（通过引用结合在此）。这些包括I-Sce I、I-Chu I、I-Dmo I、I-Cre I、I-Csm I、PI-Fli I、Pt-Mtu I、I-Ceu I、I-Sce II、I-Sce III、HO、PI-Civ I、PI-Ctr I、PI-Aae I、PI-BSU I、PI-DhaI、PI-Dra I、PI-Mav I、PI-Mch I、PI-Mfu I、PI-Mfl I、PI-Mga I、PI-Mgo I、PI-Min I、PI-Mka I、PI-Mle I、PI-Mma I、PI-Msh I、PI-Msm I、PI-Mth I、PI-Mtu I、PI-Mxe I、PI-Npu I、PI-Pfu I、PI-Rma I、PI-Spb I、PI-Ssp I、PI-Fac I、PI-MjaI、PI-Pho I、PI-Tag I、PI-Thy I、PI-Tko I或PI-Tsp I。
此外，对设计定制的罕见分裂内切核酸酶（基本上识别任何选择的核苷酸序列），方法是可用的。简言之，可以使用杂合体制备嵌合限制性内切酶，该杂合体是设计用于识别特异核苷酸序列的锌指结构域和来自天然限制性内切酶（例如FokI）的非特异性DNA-切割结构域之间的杂合体。此类酶通常是指锌指内切核酸酶（ZFE）。此类方法已经描述于例如WO03/080809、WO94/18313或WO95/09233中并且描述在Isalan（艾莎兰）等人，2001,NatureBiotechnology（《自然生物技术》）19,656-660;Liu（刘）等人，1997,Proc.Natl.Acad.Sci.USA（《美国国家科学院院刊》）94,5525-5530中。通过从突变体文库中进行选择来生产定制罕见分裂内切核酸酶或大范围核酸酶的另一种方式描述于WO2004/067736中。具有改变的序列特异性和DNA结合亲和性的定制大范围核酸酶也可以通过如描述于WO2007/047859中的合理设计来获得。定制设计罕见分裂内切核酸酶的另一个实例包括所谓的TALE核酸酶，该酶基于来自融合至例如FOKI的催化结构域的细菌属黄单胞菌属的转录激活因子样效应物（TALE）。这些TALE的DNA结合特异性是由串联排列的34/35-氨基酸重复单元的重复可变双残基（RVD）限定的，这些氨基酸重复单元可以被修饰以识别特异靶序列（Christian（克里斯蒂安）等人，2010,Genetics（《遗传学》）186:757–761、WO11/072246、WO10/079430和WO11/146121）。此类定制设计的罕见分裂内切核酸酶还可以称为非天然发生的内切核酸酶。
由于该重新设计的大范围核酸酶衍生自天然发生的内切核酸酶，所以可用的潜在识别位点不是完全随机的，而是似乎与最初由天然发生的内切核酸酶（重新设计的大范围核酸酶基于该天然发生的内切核酸酶）识别的核苷酸序列具有一些程度的相似性。如Gao（高）等人（2010,The Plant Journal（《植物杂志》），pp1-11）所阐述的，用来修饰I-CreI的DNA-结合特征的基于结构的蛋白设计方法是基于I-CreI-DNA共晶体结构的视觉检查，该共晶体结构导致了大量氨基酸取代的预测，这些氨基酸取代在它的识别位点中的具体位置改变了I-CreI碱基偏好性。单个氨基酸取代在实验上进行评估，并且在碱基偏好中赋予所希望变化的那些取代添加至可以被“混合和匹配”的突变数据库中，以产生识别高度多样化DNA位点的I-CreI衍生物。理论上，使用现有的突变数据库可获得的组合多样性足以在随机DNA序列中约每1000bp靶向工程化的内切核酸酶。
重新设计的大范围核酸酶可以基于用作支架的天然发生的大范围核酸酶I-CreI。I-CreI是一种在Chlamydomonas rheinhardti的叶绿体中发现的寻靶内切核酸酶（Thompson（汤普森）等人1992，Gene（《基因》）119，247-251。此内切核酸酶是一种在23SrRNA基因中识别假回文序列22bp DNA位点的二聚体，并且产生了一种用于内含子引入的双链DNA断裂。I-CreI是携带单一LAGLIDADG基序的内切核酸酶组的成员。LAGLIDADG酶包含一个或两个该共有基序的拷贝。单一基序酶，例如I-CreI，作为二聚体发挥功能，然而双基序酶是具有两个分离结构域的单体。因此，当衍生自I-CreI支架的重新设计的大范围核酸酶用来识别一种22bp的感兴趣的核苷酸序列时，设计了两个单体单元，每个识别该22bp识别位点的一部分，这两个单体单元需要一致行动以在该22bp识别位点诱导双链断裂（WO2007/047859）。可以通过将两个单体单元连接进入一个单链大范围核酸酶来达到一致行动，或者也可以通过促进二聚体的形成来达到，例如，如描述于WO2007/047859中。此类特别设计的大范围核酸酶的实例描述于例如EP10005926.0和EP10005941.9中（未公开）。
因此，对于此类二聚内切核酸酶的一致行动，需要亚基二聚化以能够在基因组中的预选位点诱导双链断裂。增强的一致行动也可以通过将这两个单体单元连接进入一个单链大范围核酸酶来达到，或者也可以通过促进异二聚体的形成来达到，例如，如在WO2007/047859中描述。
用于将DNA递送至细胞/组织中的不同方法是本领域已知的，并且包括：如美国专利号5,384,253中所说明的电穿孔；如美国专利号5,015,580；5,550,318；5,538,880；6,160,208；6,399,861；和6,403,865中所说明的微粒轰击（基因枪）；如美国专利号5,635,055；5,824,877；5,591,616；5,981,840；和6,384,301中所说明的农杆菌介导的转化；如美国专利号5,508,184中所说明的原生质体转化，电穿孔、化学辅助转化、脂质体介导的转化（参见，例如，A.Deshayes（德莎耶丝）等人，（1985）EMBO J.4:2731-7），碳纤维、碳化硅纤维或硼酸铝纤维（通常称为晶须）（参见，例如，J.Brisibe（布里斯比）,Exp.Bot.（《实验植物学》）51(343):187-196（2000）；Dunwell（唐威尔）（1999）Methods Mol.Biol.（《分子生物学方法》）111:375-82；和美国专利号5,464,765），微量注射（参见，例如，TJ.Reich（赖希）等人，（1986）Biotechnology（《生物技术》）4:1001-1004）和病毒-介导的转化（参见，例如，S.B.Gelvin（格尔文），（2005）Nat Biotechnol.（《自然生物技术》）23:684-5），用异源外源DNA粘附粒子的植物细胞轰击，弹道质点加速度，气溶胶束转化（美国专利申请号20010026941；美国专利号4,945,050；国际公开号WO91/00915；美国专利申请号2002015066，WO01/038514；全部通过引用结合在此），Lec1转化、PEG转化、和用来转移DNA的不同其他非粒子直接介导方法。
根据本发明所述的用于靶基因组修饰的棉花细胞的靶向基因组修饰在胚性愈伤组织，优选脆弱愈伤组织上实施。术语“愈伤组织”或“胚性愈伤组织”是指作为植物组织培养的结果，主要是产生的胚性细胞和细胞群的无组织团块。脆弱愈伤组织是指具有脆弱质地的愈伤组织，它具有形成嫩枝和根并最终再生成完整植物的潜力。此类愈伤组织可以进一步区别在于鹦鹉绿/乳脂色、液体培养基中容易分散的细胞团、以及一种结节状形状。因此，如在此使用，“包括在胚性愈伤组织中的植物细胞”是指作为愈伤组织细胞本身的细胞，即作为愈伤组织的一部分的细胞。
愈伤组织可以是再生自/诱导自不同组织的外植体，例如下胚轴、子叶、不成熟的合子胚，叶、花药、花瓣、胚珠、根、和分生组织、茎细胞和叶柄。在本发明的一个实施例中，外植体取自下胚轴或子叶。在一个实施例中，胚性愈伤组织的诱导通过将外植体在包括活性炭的培养基中孵育2至4个月，优选4个月，或者至少直至已经在暗光条件下形成胚性愈伤组织来实施。
在一个实施例中，在愈伤组织再生、DNA转移和随后的选择和再生的整个过程期间，靠不存在激素的培养基供养愈伤组织。如在此使用，激素是指植物激素，例如植物生长激素（例如2.4-D）和细胞分裂素（例如Kin）。在一个实施例中，在整个过程期间靠固体培养基供养细胞。
在另一个实施例中，DNA递送后，靠非选择性培养基（例如不包含选择性化合物的培养基）供养愈伤组织1-4天，优选3天。该非选择性培养基可以包括M100基质组分。在非选择性培养基上1-4天后，愈伤组织可以转移至可以包括M100基质组分和选择性化合物的培养基上。如果将包括赋予对选择性化合物耐受性的可选择性标记基因的修复DNA共递送，那么转化后使用选择性化合物允许靶向重组事件的富集。胚性愈伤组织进行选择后，胚诱导和胚生芽可以发生在可以包括M104基质组分和活性炭的选择性培养基上。进一步胚发育可以发生在可以包括M702基质组分的非选择性基质上并且植物再生可以发生在包括M700基质组分的培养基上。不同基质组分在以下描述。
如在此使用，DNA递送是指将一个或多个DNA分子引入细胞中。这涉及两个稳定的转染，其中引入的DNA分子稳定地整合进入宿主细胞的基因组，连同细胞中那一种或多种分子的瞬时存在。将清楚的是，为了实施本发明的方法，并不要求细胞变为用编码内切核酸酶的DNA稳定转化，而是内切核酸酶的瞬时表达可能已经足以诱导DNA双链断裂。
用于将DNA递送至细胞/组织中的不同方法是本领域已知的，并且包括：如美国专利号5,384,253中所说明的电穿孔；如美国专利号5,015,580；5,550,318；5,538,880；6,160,208；6,399,861；和6,403,865中所说明的微粒轰击（基因枪）；如美国专利号5,635,055；5,824,877；5,591,616；5,981,840；和6,384,301中所说明的农杆菌介导的转化；如美国专利号5,508,184中所说明的原生质体转化，电穿孔、化学辅助转化、脂质体介导的转化（参见，例如，A.Deshayes（德莎耶丝）等人，（1985）EMBO J.4:2731-7），碳纤维、碳化硅纤维或硼酸铝纤维（通常称为晶须）（参见，例如，J.Brisibe（布里斯比）,Exp.Bot.（《实验植物学》）51(343):187-196（2000）；Dunwell（唐威尔）（1999）Methods Mol.Biol.（《分子生物学方法》）111:375-82；和美国专利号5,464,765），微量注射（参见，例如，TJ.Reich（赖希）等人，（1986）Biotechnology（《生物技术》）4:1001-1004）和病毒-介导的转化（参见，例如，S.B.Gelvin（格尔文），（2005）Nat Biotechnol.（《自然生物技术》）23:684-5），用异源外源DNA粘附粒子的植物细胞轰击，弹道质点加速度，气溶胶束转化（美国专利申请号20010026941；美国专利号4,945,050；国际公开号WO91/00915；美国专利申请号2002015066，WO01/038514；全部通过引用结合在此），Lec1转化、PEG转化、和用来转移DNA的不同其他非粒子直接介导方法。
在一个特定实施例中，根据本发明所述的将DNA递送至包括棉花细胞的愈伤组织中是通过直接DNA转移方法，例如粒子轰击来实施的。
在一个实施例中，粒子轰击之前，将愈伤组织在包括甘露醇和山梨醇的培养基中预先质壁分离约2至20小时，优选约2至4小时。
在另一个特定实施例中，根据本发明所述的将DNA递送进棉花细胞中是通过土壤农杆菌介导的转化实施的。在一个实施例中，胚性愈伤组织与包含即将引入棉花细胞的DNA的土壤农杆菌属菌株接触，接触之后愈伤组织与该土壤农杆菌属菌株在包括乙酰丁香酮和L-半胱氨酸的培养基中在黑暗中共培养约3天。
在另一个实施例中，共培养后，将转化的胚性愈伤组织在进一步包括triacillin的选择性培养基上（例如包括一种或更多选择性化合物）进行选择。
将理解，内切核酸酶编码DNA和外源修复DNA可以使用相同或不同的递送方法按顺序（或按相反顺序）共递送至该细胞或组织（例如愈伤组织），或者它们可以同时共递送，例如，由此外源修复DNA和内切核酸酶编码DNA包括在相同的混合物中或者甚至在相同的分子中。
内切核酸酶可以但不需要包括核定位信号（NLS）（Raikhel（雷克海尔），PlantPhysiol.（《植物生理学》）100：1627-1632（1992）和其中的参考文献），例如SV40巨大T-抗原的NLS（Kalderon（卡得隆）等人，Cell（《细胞》）39：499-509，1984）。核定位信号可以位于蛋白的任何位置，但是方便地位于蛋白的N-端。核定位信号可以取代一个或多个双链断裂诱导酶的氨基酸。
在预选位点的双链断裂的诱导允许若干潜在应用。如果没有引入外源修复DNA，那么靠近内切核酸酶识别位点的DNA区域可以通过一个或若干个至许多个核苷酸的缺失、取代或插入来改变。以那种方式，在预选位点的小的或更大缺失或插入的形成可以例如将包括预选位点/识别位点的核苷酸序列的基因灭活。如果位于预选位点或识别位点的上游和下游的基因组DNA区域彼此具有充分的同源性以允许上游和下游DNA区域之间重组，那么插入DNA区域（即两个同源上游和下游DNA区域之间的DNA区域）可以缺失（环凸）。例如这可以用于移除预先引入的序列（例如标记基因），如例如描述于WO06/105946中。
如果双链DNA断裂诱导伴随着用作模板的外源修复DNA分子的引入，那么双链断裂修复基本上可以按三种方式发生。修复DNA可以在DSB位点通过在两端的非同源末端连接整合进入基因组DNA，或者如果在修复DNA中存在一个或两个与预选位点的上游和/或下游区域具有同源性的侧翼区域，那么修复DNA的整合也可以通过同源重组发生（部分地）。照此，在预选位点的双链断裂也将有助于将那一位点附近的DNA区域取代为感兴趣的DNA区域，例如，如描述于WO06/105946、WO08/037436或WO08/148559中。
通过同源重组在预选位点插入一个外源DNA，该外源DNA可以包括至少一个侧翼DNA区域，该侧翼DNA区域具有与预选位点上游或下游的DNA区域的核苷酸序列相似的核苷酸序列。外源DNA也可以包括位于该分子相反端的两个侧翼DNA区域，并且这些区域分别与预选位点上游和下游的DNA区域的核苷酸序列具有充分同源性，以允许所述侧翼区域与所述上游和下游区域之间的重组。
如在此使用，“预选位点”或“预定义位点”指示在该植物核基因组中的具体的核苷酸序列，该核苷酸序列位于该靶DNA序列中或靠近该靶DNA序列，在此位点所希望的是将外源DNA插入或将该靶DNA序列进行交换。本领域普通技术人员将能够选择一种识别选择的靶核苷酸序列的双链DNA断裂诱导（“DSBI”）酶或者亦或将此类DSBI内切核酸酶工程化。可替代地，使用任何常规转化方法或通过使用在它的基因组中具有DSBI内切核酸酶识别位点的植物株系的常规繁殖，可以将DSBI内切核酸酶识别位点引入到该植物基因组中，并且然后可以将任何所希望的外源DNA引入到预先引入的预选靶位点。
如在此使用，“位于附近”是指双链DNA断裂诱导位点，即位于与预定义位点之间500bp、1kbp、2kbp、3kbp、4kbp、5kbp至10kbp距离的内切核酸酶的识别位点，即在基因组DNA中将被修饰的位点（靶位点）。
如在此使用，“侧翼DNA区域”是具有一种核苷酸序列的DNA，该核苷酸序列分别与靶DNA序列或预选位点的上游和/或下游的DNA区域具有同源性。这允许更好地控制打算的修饰的精度。的确，通过同源重组的整合将允许上升至核苷酸水平的外源DNA片段精确连接至植物核基因组。
为了具有充分同源性用于重组，修复DNA的侧翼DNA区域可以在长度方面变化并且应至少约10个核苷酸长。然而，侧翼区域在实际中可以尽可能长（例如高达约100-150kb），例如完全细菌人工染色体（BAC）。优选地，侧翼区域将是约50bp至约2000bp。此外，在感兴趣的外源DNA侧翼的区域不需要和在预选位点侧翼的DNA区域相同，并且可以与在预选位点侧翼的DNA区域具有约80%至约100%之间的序列一致性，优选约95%至约100%的序列一致性。侧翼区域越长，对于同源性的要求越不严格。此外，优选的是在实际中在DSB附近序列一致性尽量高。此外，为了达到交换靶DNA序列而不改变毗邻DNA序列的DNA序列，侧翼DNA序列应优选与在预选位点侧翼的上游或下游DNA区域或与注定被交换的靶DNA序列相同。同样的标准适用于彼此带有同源性的上游和下游区域之间的重组，以移除插入DNA序列。
此外，在感兴趣的外源DNA侧翼的区域不需要与就在预选位点侧翼的区域具有同源性，但是可以和距离预选位点更远的基因组的DNA区域具有同源性。然后基因组DNA和修复DNA之间的同源重组将导致预选插入位点和DNA同源区域之间靶DNA的移除。换言之，位于该同源区域之间的靶DNA将被取代为侧翼区域之间的外源DNA。当修复DNA仅由两个侧翼序列组成时，即缺乏任何插入序列，可以使用这种方法特异地删除位于两个同源区域之间的基因组区域。
将清楚的是，在同源区域存在于外源修复DNA中的情况下，也可以使用位点特异性重组酶类实施本发明的方法。位点特异性重组酶类需要两个识别位点，这些识别位点不但可以位于相同的DNA分子而且可以位于两个不同的DNA分子，在这两个识别位点之间发生重组。因此，包括至少一个这种识别位点的修复DNA可以靶向也包括至少一个这种位点的基因组座。位点特异性重组酶类的实例在本领域是熟知的，并且包括：例如来自噬菌体P1的Cre-Lox系统（Austin（奥斯丁）等人，1981，Cell（《细胞》），25:729-736），来自酿酒酵母的Flp-Frt系统（Broach（布罗奇）等人，1982，CelI（《细胞》），29:227-234），来自鲁氏接合酵母的R-RS系统（Araki（阿拉基）等人，1985，J.MoL Biol.，（《分子生物学杂志》）182：191-203），和来自链霉菌噬菌体PhiC31的整合酶（Thorpe（索普）&Smith（史密斯），1998，Proc.Natl.Acad.Sci.，（《美国国家科学院院刊》）95：5505-5510，Groth（格罗思）等人，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.,（《美国国家科学院院刊》）97：5995-6000）。
外源DNA还可以包括一个可选择性标记或可筛选标记，这些标记可以或可以不在插入之后移除，如例如描述于WO06/105946、WO08/037436和WO08/148559中。
如在此使用，“可选择性或可筛选标记”具有本领域通常的含义并且包括，但不局限于植物可表达的草丁膦乙酰转移酶、新霉素磷酸转移酶、草甘膦氧化酶、草甘膦耐受EPSP酶、腈水解酶基因、突变型乙酰乳酸合酶或乙酰羟酸合酶基因、β-葡萄糖醛酸酶（GUS）、R-基因座基因、绿色荧光蛋白等。可选择性标记可以提供对选择性化合物的耐受性或抗性，这些选择性化合物例如草丁膦、新霉素、草甘膦、潮霉素、ALS-抑制性除草剂（例如磺酰脲等）或者可以另外提供用于选择或富集细胞的手段（其中已经发生了所希望的修饰），例如通过视觉手段（GUS染色、荧光）。
植物细胞或植物的选择（其中可选择的或可筛选的标记和剩余的外源DNA分子通过侧翼DNA区域的同源重组已经引入）可以例如通过筛选存在于转化DNA中但是位于侧翼DNA区域之外的序列的不存在来达到。的确，来自侧翼DNA区域之外的转化DNA的序列的存在将表明转化植物细胞的起源是通过随机DNA插入。为此，可选择的或可筛选的标记可以包括在侧翼DNA区域之外的转化DNA分子中，然后这些标记可以用于鉴别那些不具有位于转化DNA之外的可选择性或可筛选标记的植物细胞以及那些已经由通过侧翼DNA区域的同源重引起的植物细胞。可替代地，转化DNA分子可以包含侧翼DNA区域之外的可选择的标记，这些标记允许筛选此类基因的不存在（阴性可选择性标记基因）。
将清楚的是根据本发明所述的方法允许任何感兴趣的DNA的插入，这些感兴趣的DNA包括：包括具有具体核苷酸序列签名的核苷酸序列的DNA（例如用于随后的鉴别）。感兴趣的DNA还可以是一个或多个植物可表达的基因，这些基因包括但不局限于除草剂耐受性基因、昆虫抗性基因、疾病抗性基因、非生物逆境抗性基因、涉及油类生物合成或碳水化合物生物合成的酶、涉及纤维强度和/或纤维长度的酶、涉及次生代谢生物合成的酶。
除草剂耐受性基因包括编码酶5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶（EPSPS）的基因。此类EPSPS基因的实例是鼠伤寒沙门杆菌的AroA基因（突变体CT7）（Comai（措美）等人，1983，Science（《科学》）221，370-371），土壤杆菌属的CP4基因（Barry（巴里）等人，1992，Curr.Topics Plant Physiol.（《当代热带植物生理学》）7，139-145，编码矮牵牛花EPSPS的基因（Shah（沙阿）等人，1986，Science（《科学》）233，478-481），编码番茄EPSPS的基因（Gasser（加塞）等人，1988，J.Biol.Chem.（《生物化学杂志》）263，4280-4289），或编码蟋蟀草属EPSPS的基因（WO01/66704）。它还可以是如描述于例如EP0837944、WO00/66746、WO00/66747或WO02/26995中的突变的EPSPS。草甘膦耐受性植物还可以通过表达一种基因获得，该基因编码如描述于美国专利号5,776,760和5,463,175中的草甘膦氧化还原酶。草甘膦耐受性植物还可以通过表达一种基因获得，该基因编码如描述于例如WO02/36782、WO03/092360、WO05/012515和WO07/024782中的草甘膦乙酰基转移酶。草甘膦耐受性植物还可以通过选择包含以上提到基因的天然发生突变的植物来获得，如描述于例如WO01/024615或WO03/013226中。赋予草甘膦耐受性的EPSPS基因描述于例如美国专利申请号11/517,991、10/739,610、12/139,408、12/352,532、11/312,866、11/315,678、12/421,292、11/400,598、11/651,752、11/681,285、11/605,824、12/468,205、11/760,570、11/762,526、11/769,327、11/769,255、11/943801或12/362,774中。赋予草甘膦耐受性的其他基因，例如脱羧酶基因描述于例如美国专利申请11/588,811、11/185,342、12/364,724、11/185,560或12/423,926中。
其他除草剂耐受性基因可以编码一种使除草剂脱毒的酶或者对抑制有抗性的突变型谷氨酰胺合酶，例如描述于美国专利申请号11/760,602中。一种此类有效脱毒酶是编码草丁膦乙酰转移酶（例如来自链霉菌属物种的bar或pat蛋白）的酶。草丁膦乙酰转移酶是例如描述于美国专利号5,561,236、5,648,477、5,646,024、5,273,894、5,637,489、5,276,268、5,739,082、5,908,810和7,112,665中。
除草剂耐受性基因还可以赋予对抑制酶羟基苯丙酮酸双氧化酶（HPPD）的除草剂的耐受性。羟基苯丙酮酸双氧化酶是催化其中对羟基苯丙酮酸（HPP）被转化成尿黑酸盐的反应的多种酶。可以用编码天然发生的抗HPPD酶的一种基因或编码突变的或嵌合的HPPD酶的一种基因转化对HPPD抑制剂耐受的植物，如描述于WO96/38567、WO99/24585以及WO99/24586、WO2009/144079、WO2002/046387、或US6,768,044中。还可以通过用编码某些使得能够形成尿黑酸盐的酶的基因转化植物获得对HPPD抑制剂的耐受性，尽管被HPPD抑制剂抑制了天然的HPPD酶。这样的植物和基因描述于WO99/34008和WO02/36787中。还可以通过用除了一种编码HPPD耐受酶的基因之外的一种编码具有酶预苯酸脱氢酶（PDH）活性的基因转化植物来改进对HPPD抑制剂的耐受性，如描述于WO2004/024928中。另外，可以通过向它们的基因组中添加编码够使HPPD抑制剂代谢或降解的酶（例如WO2007/103567和WO2008/150473中示出的CYP450酶）的基因来使植物对HPPD抑制剂除草剂更具耐受性。
仍另外的除草剂耐受性基因编码变体ALS酶（也称为乙酰羟酸合成酶，AHAS），如例如描述于Tranel（特瑞纳）和Wright（赖特）（2002，Weed Science（《杂草科学》）50:700-712）中，而且在美国专利号5,605,011、5,378,824、5,141,870、以及5,013,659中。硫酰脲耐受植物以及咪唑啉酮耐受植物的生产描述于美国专利号5,605,011、5,013,659、5,141,870、5,767,361、5,731,180、5,304,732、4,761,373、5,331,107、5,928,937、以及5,378,824、以及国际公开WO96/33270中。其他的咪唑啉酮耐受性基因还描述于例如WO2004/040012、WO2004/106529、WO2005/020673、WO2005/093093、WO2006/007373、WO2006/015376、WO2006/024351、以及WO2006/060634中。另外的硫酰脲以及咪唑啉酮耐受性基因描述于例如WO07/024782和美国专利申请号61/288958中。
昆虫抗性基因可以包括一种编码序列，该序列编码：
1)一种来自苏云金杆菌的杀昆虫晶体蛋白或它的一个杀昆虫部分，例如由Crickmore（克里克莫尔）等人列举的杀昆虫晶体蛋白（1998，Microbiology and MolecularBiology Reviews（《微生物学和分子生物学综述》），62：807-813），由Crickmore（克里克莫尔）等人（2005）在苏云金杆菌毒素命名法中更新，联机在：http:// www.lifesci.sussex.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/），或它的杀昆虫部分，例如Cry蛋白类Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1B、Cry1C、Cry1D、Cry1F、Cry2Ab、Cry3Aa、或Cry3Bb的蛋白或它的杀昆虫部分（例如EP1999141和WO2007/107302），或者由如例如描述于美国专利申请号12/249,016中的合成基因编码的这种蛋白；或
2)一种来自苏云金杆菌的晶体蛋白或它的一部分，该部分在一个第二其他的来自苏云金杆菌的晶体蛋白或它的一部分的存在下是杀昆虫的，例如由Cry34和Cry35晶体蛋白构成的二元毒素（Moellenbeck（默勒本克）等人，2001，Nat.Biotechnol.（《自然生物技术》）19：668-72；Schnepf（史涅夫）等人2006，Applied Environm.Microbiol.（《应用与环境微生物学》）71，1765-1774）或由Cry1A或Cry1F蛋白和Cry2Aa或Cry2Ab或Cry2Ae蛋白组成的二元毒素（美国专利申请号12/214,022和EP08010791.5）；或
3)一种包括来自苏云金杆菌的不同的杀昆虫晶体蛋白的部分的杂交杀昆虫蛋白，例如以上1)的蛋白的杂交体或以上2)的蛋白的杂交体，例如由玉米事件MON98034（WO2007/027777）生产的Cry1A.105蛋白；或
4)以上1)至3)的任意一种蛋白，其中一些特别是1至10个氨基酸已经被另一氨基酸取代以便获得一个对目标昆虫物种的更高杀昆虫活性、和/或用以扩大所影响的目标昆虫物种的范围、和/或由于在克隆或转化期间引入编码DNA的变化，例如在玉米事件MON863或MON88017中的Cry3Bb1蛋白、或在玉米事件MIR604中的Cry3A蛋白；或
5)一种来自苏云金杆菌或蜡样芽胞杆菌的杀昆虫分泌蛋白或它的一个杀昆虫部分，例如列举在：http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html的营养期杀昆虫蛋白（VIP），例如来自VIP3Aa蛋白类的蛋白；或
6)一种来自苏云金杆菌或蜡样芽胞杆菌的分泌蛋白，该分泌蛋白在来自苏云金杆菌或蜡样芽胞杆菌的一个第二分泌蛋白的存在下是杀昆虫的，例如由VIP1A和VIP2A蛋白构成的二元毒素（WO94/21795）；或
7)一种包括来自苏云金杆菌或蜡样芽胞杆菌的不同的分泌蛋白的部分的杂交杀昆虫蛋白，例如以上1)中的蛋白的一种杂交体或以上2)中的蛋白的一种杂交体；或
8)以上5)至7)的任意一种蛋白，其中一些特别是1至10个氨基酸已经被另一氨基酸取代以便获得一个对目标昆虫物种的更高杀昆虫活性、和/或用以扩大所影响的目标昆虫物种的范围、和/或由于在克隆或转化期间引入编码DNA的变化（尽管仍然编码一种杀昆虫蛋白），例如在棉花事件COT102中的VIP3Aa蛋白；或
9)一种来自苏云金杆菌或蜡样芽胞杆菌的分泌蛋白，该分泌蛋白在来自苏云金杆菌的晶体蛋白的存在下是杀昆虫的，例如由VIP3和Cry1A或Cry1F构成的二元毒素（美国专利申请号61/126083和61/195019）或由VIP3蛋白和Cry2Aa或Cry2Ab或Cry2Ae蛋白构成的二元毒素（美国专利申请号12/214,022和EP08010791.5）；
10)以上9)的一种蛋白，其中一些特别是1至10个氨基酸已经被另一氨基酸取代以便获得一个对目标昆虫物种的更高杀昆虫活性、和/或用以扩大所影响的目标昆虫物种的范围、和/或由于在克隆或转化期间引入编码DNA的变化（尽管仍然编码一种杀昆虫蛋白）。
如在此使用，“昆虫抗性基因”，进一步包括转基因，这些转基因包含一个在表达时生产双链RNA的序列，该双链RNA被植物昆虫有害生物摄取时抑制这种昆虫有害生物的生长，如例如描述于WO2007/080126、WO2006/129204、WO2007/074405、WO2007/080127和WO2007/035650中。
非生物胁迫耐受性基因包括
1)在植物细胞或植物中能够减少聚（ADP核糖）聚合酶（PARP）基因的表达和/或活性的一种转基因，如描述于WO00/04173、WO/2006/045633、EP04077984.5或EP06009836.5中。
2)能够减少植物或植物细胞的PARG编码基因的表达和/或活性的一种转基因，如例如描述于WO2004/090140中。
3)编码一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸补救合成通路的植物功能性酶的一种转基因，这些酶包括烟酰胺酶、烟酰酸磷酸核糖基转移酶、烟酸单核苷酸腺嘌呤转移酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸合成酶或烟酰胺磷酸核糖基转移酶，如例如描述于EP04077624.7、WO2006/133827、PCT/EP07/002433、EP1999263或WO2007/107326中。
涉及碳水化合物生物合成的酶包括描述于以下的那些，例如：EP0571427、WO95/04826、EP0719338、WO96/15248、WO96/19581、WO96/27674、WO97/11188、WO97/26362、WO97/32985、WO97/42328、WO97/44472、WO97/45545、WO98/27212、WO98/40503、WO99/58688、WO99/58690、WO99/58654、WO00/08184、WO00/08185、WO00/08175、WO00/28052、WO00/77229、WO01/12782、WO01/12826、WO02/101059、WO03/071860、WO2004/056999、WO2005/030942、WO2005/030941、WO2005/095632、WO2005/095617、WO2005/095619、WO2005/095618、WO2005/123927、WO2006/018319、WO2006/103107、WO2006/108702、WO2007/009823、WO00/22140、WO2006/063862、WO2006/072603、WO02/034923、EP06090134.5、EP06090228.5、EP06090227.7、EP07090007.1、EP07090009.7、WO01/14569、WO02/79410、WO03/33540、WO2004/078983、WO01/19975、WO95/26407、WO96/34968、WO98/20145、WO99/12950、WO99/66050、WO99/53072、US6,734,341、WO00/11192、WO98/22604、WO98/32326、WO01/98509、WO01/98509、WO2005/002359、US5,824,790、US6,013,861、WO94/04693、WO94/09144、WO94/11520、WO95/35026或WO97/20936，或涉及多聚果糖，尤其是菊粉和果聚糖型的生产的酶，如披露于EP0663956、WO96/01904、WO96/21023、WO98/39460、和WO99/24593中，如披露于WO95/31553、US2002031826、US6,284,479、US5,712,107、WO97/47806、WO97/47807、WO97/47808和WO00/14249中的α-1,4-葡聚糖的生产，如披露于WO00/73422中的α-1,6分支α-1,4-葡聚糖的生产，如披露于例如WO00/47727、WO00/73422、EP06077301.7、US5,908,975和EP0728213的alternan的生产，如例如披露于WO2006/032538、WO2007/039314、WO2007/039315、WO2007/039316、JP2006304779、和WO2005/012529中的透明质酸的生产。
本领域的普通技术人员将理解的是，除了核基因组，本发明的方法还可以适用于修饰例如叶绿体基因组或线粒体基因组，由此DSB诱导在预定义位点，并且可以进一步通过向内切核酸酶提供正确靶信号而得到增强。
而且本发明的目标是提供根据本发明的方法产生的棉花植物细胞和植物。通过传统育种方法产生的包括基因组修饰的植物的配子、种子、胚（合子亦或体细胞的）、后代或杂合体也包括在本发明的范围内。此类植物可以包含插入到靶序列处或替代靶序列的异源或外源DNA序列或者可以包含一个缺失，并且与其祖先植物的区别将仅在于存在具体修饰。
在一些实施例中，本发明的植物细胞，即包括T-DNA组合的植物细胞连同根据本发明方法产生的包括打算的基因组修饰的植物细胞，可以是非繁殖细胞。
通过在此描述的方法获得的棉花植物可以进一步通过传统育种技术与其他植物杂交，以获得包括根据本发明获得的靶向修饰的后代植物。
根据本发明所述的棉花植物和种子可以进一步用化合物，例如选自以下列表的化合物处理：
·除草剂：敌草隆、伏草隆、MSMA、乙氧氟草醚、扑草净、氟乐灵、唑草酮、烯草酮、吡氟禾草灵、草甘膦、达草灭、二甲戊乐灵、嘧草硫醚、三氟啶磺隆、吡喃草酮、草铵膦、丙炔氟草胺、噻苯隆
·杀昆虫剂：乙酰甲胺磷、涕灭威、毒死稗、氯氰菊酯、溴氰菊酯、阿维菌素、啶虫脒、依马克丁苯钾酸酯、吡虫啉、茚虫威、λ-氯氟氰菊酯、多杀菌素、硫双威、γ-氯氟氰菊酯、螺甲螨酯、丁虫丙醚、氟定虫酰胺、氟虫酰胺、杀铃脲、氯虫酰胺、β-氟氯氰菊酯、螺虫乙酯、噻虫胺、噻虫嗪、噻虫啉、Dinetofuran、氟虫酰胺、氰虫酰胺、多杀菌素、Spinotoram、γ-氯氟氰菊酯、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2,2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、硫双威、阿维菌素、氟定虫酰胺、啶虫丙醚、螺甲螨酯、砜虫啶
·杀真菌剂：嘧菌酯、Bixafen、啶酰菌胺、多菌灵、百菌清、铜、环唑醇、苯醚甲环唑、醚菌胺、氟环唑、咪唑菌酮、氟啶胺、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯、Fluxapyroxad、异菌脲、异哌拉赞、异噻菌胺、代森锰锌、代森锰、苯氧菌胺、吡噻菌胺、啶氧菌酯、甲基代森锌、丙硫菌唑、唑菌胺酯、五氯硝基苯、戊唑醇、氟醚唑、甲基硫菌灵、肟菌酯
如在此使用，棉花是指任何存在的棉花品种。例如，棉花植物细胞可以来自对生长棉花有用的品种。最常用的棉花品种是海岛棉、陆地棉、亚洲棉和草棉。另外的品种包括阿非利加棉和雷蒙德氏棉。
在此披露的棉花植物的实例包括胚性愈伤组织可以衍生自的那些，例如：柯克棉312、柯克棉310、柯克棉5阿卡拉SJ-5、GSC25110、FIBERMAX819、Siokra1-3、T25、GSA75、阿卡拉SJ2、阿卡拉SJ4、阿卡拉SJ5、阿卡拉SJ-C1、阿卡拉B1644、阿卡拉B1654-26、阿卡拉B1654-43、阿卡拉B3991、阿卡拉GC356、阿卡拉GC510、阿卡拉GAM1、阿卡拉C1、阿卡拉罗亚尔、阿卡拉美兆、阿卡拉普雷、阿卡拉B638、阿卡拉B1810、阿卡拉B2724、阿卡拉B4894、阿卡拉B5002、非阿卡拉“采摘者”Siokra、“剥离器”品种FC2017、柯克棉315、STONEVILLE506、STONEVILLE825、DP50、DP61、DP90、DP77、DES119、McN235、HBX87、HBX191、HBX107、FC3027、CHEMBRED A1、CHEMBRED A2、CHEMBRED A3、CHEMBRED A4、CHEMBRED B1、CHEMBRED B2、CHEMBRED B3、CHEMBRED C1、CHEMBRED C2、CHEMBRED C3、CHEMBRED C4、PAYMASTER145、HS26、HS46、SICALA、PIMA S6ORO BLANCO PIMA、FIBERMAX FM5013、FIBERMAX FM5015、FIBERMAX FM5017、FIBERMAX FM989、FIBERMAX FM832、FIBERMAX FM966、FIBERMAX FM958、FIBERMAX FM989、FIBERMAX FM958、FIBERMAX FM832、FIBERMAX FM991、FIBERMAX FM819、FIBERMAX FM800、FIBERMAX FM960、FIBERMAX FM966、FIBERMAX FM981、FIBERMAX FM5035、FIBERMAX FM5044、FIBERMAX FM5045、FIBERMAX FM5013、FIBERMAX FM5015、FIBERMAXFM5017或FIBERMAX FM5024以及具有其衍生基因型的植物。这些适合施用以上描述的方法。
如在此使用，“包括”将被解释为指定如提及的陈述的特征、整体、步骤或组分的存在，但是并不预先排除一个或多个特征、整体、步骤或组分、或它们的组的存在或添加。因此，例如一种包括一个核苷酸或氨基酸的序列的核酸或蛋白可以包括比实际引用的一个序列更多的核苷酸或氨基酸，即被包含在一个更大的核酸或蛋白中。一种包括功能上或结构上定义的DNA区域的嵌合基因可以包括额外的DNA区域等。
术语“植物”也包括保留亲代的区别特征的植物子代，例如通过自交或杂交获得的种子，例如杂合种子、杂合植物和衍生自其的植物部分。
如在此使用，“植物部分”包括任何植物器官或植物组织，包括但不局限于果实、种子、胚、纤维、分生组织区、愈伤组织、叶、根、芽、花、配子、孢子体、花粉和小孢子。
如在此使用，术语“蛋白”或“多肽”描述了由多于30个氨基酸组成的分子组，而术语“肽”描述了由至多30个氨基酸组成的分子。蛋白和肽可以进一步形成二聚体、三聚体和更高的寡聚体，即由多于一个（多）肽分子组成。形成此类二聚体、三聚体等的蛋白或肽可以是相同的或不同的。因此，相应的更高级的结构被称为同或异二聚体，同或异三聚体等。术语“蛋白”和“肽”也指天然修饰的蛋白或肽，其中修饰是例如由糖基化、乙酰化、磷酸化等实现的。此类修饰在本领域中是熟知的。
出于本发明的目的，两个相关的核苷酸或氨基酸序列的“序列一致性”（表示为一个百分数）是指在这两个最佳比对序列中的具有相同残基的位置的数目（x100）除以所比较的位置的数目。一个缺口（即一个比对中的一个位置，其中一个残基在一个序列中存在但是在另一个序列中不存在）被视为具有不相同残基的一个位置。通过Needleman（尼德曼）和Wunsch（翁施）算法来实施这两个序列比对（Needleman（尼德曼）和Wunsch（翁施）1970）。可以使用标准软件程序（例如是部分的威斯康星软件包版本10.1（遗传学计算机组，麦迪逊、威斯康星州，美国）的缺口（GAP），使用具有空位创建罚分50和空位延伸罚分3的默认评分矩阵）方便地实施以上的计算机辅助序列比对。
该序列表包含在命名的文件中，“BCS11-2008_WO_ST25”，为59个千字节（大小如在微软视窗操作系统（Microsoft）中测量），包含SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4的4个序列，通过电子提交归档并且通过引用结合在此。
以下的非限制性实例描述了使用DSBI酶和在胚性愈伤组织上土壤农杆菌介导的连同直接递送方法用于修饰棉花植物细胞基因组的方法。
除非在实例中另行说明，所有的重组DNA技术是根据如描述于Sambrook（萨姆布鲁克）等人，（1989）Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition（《分子克隆：实验室手册》，第二版），Cold Spring Harbor Laboratory Press（冷泉港实验室出版社），纽约和在Ausubel（奥苏贝尔）等人，（1994）Current Protocols in Molecular Biology,Current Protocols,USA（《美国，当前技术方案，分子生物学的当前技术方案》）中卷1和卷2的标准方案来进行的。用于植物分子工作的标准材料和方法描述于由R.D.D.Croy（克罗伊）撰写的Plant Molecular Biology Labfax（《植物分子生物学实验》）（1993）中，由BIOSScientific Publications Ltd（UK）（BIOS科学出版有限公司（英国））和BlackwellScientific Publications,UK（布莱克威尔科学出版物，英国）联合出版。其他用于标准分子生物技术的参考文献包括Sambrook（萨姆布鲁克）和Russell（拉塞尔）（2001），MolecularCloning：A Laboratory Manual,Third Edition（《分子克隆：实验手册，第三版》），冷泉港实验室出版社，纽约，Brown（布朗），Molecular Biology LabFax,Second Edition,（《分子生物学实验，第二版》），学术出版社（英国）（1998）。用于聚合酶链式反应的标准材料和方法可以在Dieffenbach（迪芬巴赫）和Dveksler（德福柯思乐）（1995），PCR Primer：ALaboratory Manual,（《PCR引物：实验室手册》）Cold Spring Harbor Laboratory Press（冷泉港实验室出版社）（1995）中，以及在McPherson（麦克弗森）等人（2000），PCR-Basics:From Background to Bench,First Edition,（《PCR基础：从背景到平台，第一版》）（2000）Springer Verlag（施普林格），德国中找到。
在此提到的所有专利、专利申请和出版物，都出于所有目的通过引用以其全文结合在此。
实例
实例1：载体构建
使用标准重组DNA技术，构建以下的DNA载体，包括以下可操作连接元件（在图1和图2中概述地描绘）：
靶DNA载体pTCV117（SEQ ID NO1）：
·LB：左T-DNA边界（nt12540-12564）
·I-SceI位点（nt31-14）
·3′nos：包括来自pTiT37的T-DNA的胭脂氨酸合酶基因的3’非翻译区域的序列（Depicker（德匹克）等人，1982）（nt32-220，反向互补）
·Bar：吸水链霉菌的BAR基因的编码区域（nt240-791，反向互补）
·5′cab22L：包括来自矮牵牛的叶绿素a/b结合蛋白基因的前导序列的序列（Harpster（哈普斯特）等人，1988）（nt801-857，反向互补）
·P35S2：35S启动子（nt858-1405，反向互补）
·3′g7：根瘤土壤杆菌章鱼碱类型T-DNA的基因7的3’末端终止和多聚腺苷酸化区域（nt1612-1409，反向互补）
·I-SceI识别位点（nt1643-1617）
·内含子1h3At：包括拟南芥变体组蛋白H3.III的基因II的第一内含子的序列（Chaubet（卓百特）等人，1992）（nt1662-2127）
·TPotpC：编码最优转运肽的序列，包含玉米（Zea mays）（玉米（corn））和向日葵（Helianthus annuus）（向日葵（sunflower））的RuBisCO小亚基基因的序列，如由Lebrun（勒布朗）等人（1996）描述的，（nt2145-2510）
·2mepsps：来自玉米的双重突变体EPSPS编码区域（nt2517-3852）
·3′组蛋白At：包括拟南芥组蛋白H4基因的3′非翻译区的序列（Chabouté等人，1987）（nt3871-4537）
·RB：右T-DNA边界（nt4594-4618）
修复DNA载体pTIB232（SED ID NO2）：
·LB：左T-DNA边界（nt25-1）
·bar（del1-403）：吸水链霉菌的BAR基因的5’片段（nt46-448，反向互补）
·5′cab22L：包括来自来牵牛叶绿素a/b结合蛋白基因的前导序列的序列（Harpster（哈普斯特）等人，1988）（nt458-514，反向互补）
·P35S2：35S启动子（nt515-1062，反向互补）
·3′g7：根瘤土壤杆菌章鱼碱类型T-DNA的基因7的3’末端终止和多聚腺苷酸化区域（nt1409-1612）
·Pcsvmv XYZ：CsVMV启动子片段（1285-1724）
·5′csvmv：CsVMV启动子的前导区（nt1725-1797）
·hyg-1Pa：大肠杆菌的潮霉素抗性基因（nt1804-2829）
·3′35S：3’35S转录终止和聚腺苷酸化区（nt2841-3065）
·2mepsps（5′del）：来自玉米的双重突变体EPSPS基因的3’片段（nt3096-3501）
·3′组蛋白At：来自拟南芥的组蛋白4基因的3’端区域（nt3520-4186）
·RB：右T-DNA边界（nt4267-4243）
修复DNA和内切核酸酶表达载体pTIB236（SEQ ID NO3）：
·LB：左T-DNA边界（nt1-25）
·3′35S：35S转录终止和聚腺苷酸化区（nt104-328，反向互补）
·hyg-1Pa：来自大肠杆菌的潮霉素抗性基因（nt340-1365，反向互补）
·5′csvmv：CsVMV的前导区（nt1372-1444，反向互补）
·Pcsvmv XYZ：CsVMV启动子片段（1445-1884，反向互补）
·3′35S：35S聚腺苷酸化区（nt1963-2097，反向互补）
·I-SceI：通用密码I-SceI编码区域（nt2185-2919，反向互补）
·NLSsv40：SV40核定位信号（nt-2887-2910-，反向互补）
·5′ats1b：来自拟南芥rbcS ATS1A基因的前导序列（nt2936-2976，反向互补）
·P35S2：35S启动子（nt2976-3496，反向互补）
·RB：右T-DNA边界（nt4592-5655）
包括通用密码I-SceI编码区域的内切核酸酶表达载体ptrr26（SEQ ID NO4）（WO2006/074956）：
·RB：右T-DNA边界
·P35S2：35S启动子
·5′ats1b：来自拟南芥rbcS ATS1A基因的前导序列
·NLSsv40：SV40核定位信号
·I-SceI：通用密码I-SceI编码区域
·3′35S
·LB：左T-DNA边界
实例2：培养基和缓冲液
在胚性愈伤组织生成和转化期间使用的培养基和缓冲液，如在以下实例3、4和5中描述的：
共培养基质：具有1/2MS盐（pH=5.2）浓度的M100，+100μM AS+100mg/L L-半胱氨酸（L-半胱氨酸总是新鲜配制并且高压灭菌后添加）
M100基质：MS盐、B5维生素、MES0.5g/L、MgCl2.6H2O0.94g/L、脱乙酰吉兰糖胶2g/L、葡萄糖30g/L、pH5.8
M104基质：=M100基质+1g/L KNO3，pH5.8
M700基质：斯图尔特盐+维生素、MgCl2.6H2O0.47g/L、脱乙酰吉兰糖胶1g/L、植物琼脂2.25g/L、蔗糖20g/L、pH6.8
M702基质：斯图尔特盐+维生素、MgCl2.6H2O0.71g/L、脱乙酰吉兰糖胶1.5g/L、植物琼脂5g/L、蔗糖5g/L、pH6.8
AC：活性炭2g/L
AS：DMSO中的乙酰丁香酮100μM
实例3：脆弱的胚性愈伤组织的生成
在黑暗中在28℃将来自柯克棉312的棉花种子在不含激素的固体萌发培养基M100上生芽7-10天。接下来，通过将来自籽苗的下胚轴外植体在固体培养基M100（不含激素）上孵育来实施胚性愈伤组织的诱导。约2个月后，当在下胚轴的剖面处的创伤愈伤组织开始示出快速增殖时，为了富集并且维持胚性愈伤组织的进一步传代培养在具有活性炭（2g/L）的固体培养基M100上进行。在28℃胚性愈伤组织的诱导和维持发生在暗光条件下（强度：1至7μmol m-2sec-1；光周期：16H光/8H黑暗）。
实例4：通过粒子轰击的棉花胚性愈伤组织的转化
遵循以下程序来使用粒子轰击转化棉花胚性愈伤组织：
·在轰击之前，将向其中引入DSB诱导的靶向修饰的靶标株系的实例3的脆弱棉花胚性愈伤组织（EC）在传代培养后2至3周进行收集，并且借助Büchner滤器，在滤纸顶部上，涂布成一个薄层，在具有0.2M甘露醇和0.2M山梨醇M100基质上约2至约20小时。
·在具有0.2M甘露醇和0.2M山梨醇的M100基质上预质壁分离约2至约20小时后，可任选地在修复DNA（约0.5pmol）的存在下，将EC用内切核酸酶DNA（约0.5pmol）进行轰击
·轰击条件：
o金属粒子直径：0.3-3μm
o爆破片：1100-1350psi
o距靶组织距离：9cm
o真空室约27（按Hg计）
o伯乐公司（BioRAD）PPS_1000/He生物弹射粒子递送系统
·轰击后，将滤器转移至具有0.2M甘露醇的M10基质上或者不含有选择剂的M100基质上。
·在28℃在避眩灯条件下在非选择性基质上1至4天后，将滤器转移至具有50mg/L潮霉素或1mM草甘膦或5mg/L PPT的选择性M100基质上
·约2至3周后，增殖愈伤组织选自滤器，并且进一步作为小堆传代培养至在具有50mg/L潮霉素亦或1mM草甘膦或5mg/L PPT的选择性M100基质上。按约每3周一次的传代培养间隔进行约6周的传代培养时期后，在28℃在避眩灯条件下在选择性M100基质上，可以选择转化的EC/体细胞胚。
·用于鉴别靶向修饰事件的分子筛选在转化的EC/体细胞胚水平上实施。
·在28℃，在光亮条件下（强度：40至70μmol m-2sec-1；光周期：16H光/8H黑暗），通过将EC/体细胞胚涂布在具有活性炭（AC）和相应选择剂的M104上，植物再生起始自靶向修饰事件。
·约一个月之后，将0.5-1cm的单独胚转移至具有AC和相应选择剂的M104上的滤纸顶部上。
·在28℃，在光条件下（强度：40至70μmol m-2sec-1；光周期：16H光/8H黑暗），将进一步良好生芽的胚转移至非选择性萌发基质M702上。
·一至两个月后，在28℃在光条件下（强度：40至70μmol m-2sec-1；光周期：16H光/8H黑暗），将进一步发育的胚转移至M700基质上，用于发育成小苗。
实例5：通过土壤农杆菌介导的DNA递送的棉花胚性愈伤组织的转化
遵循以下程序来使用土壤农杆菌转化棉花胚性愈伤组织：
·将向其中引入DSB诱导的靶向修饰的靶标株系的实例3的脆弱棉花胚性愈伤组织（EC）在基质100上传代培养后2至3周进行收集，并且在pH5.2的具有100μM的乙酰丁香酮（AS）的M100基质中的5x108细胞/ml的土壤农杆菌悬液中浸没20’。土壤农杆菌菌株携带包含修复DNA和编码内切核酸酶基因的载体。
·在24℃，在黑暗中，在M100（具有pH5.2的1/2MS盐浓度，具有100μM AS和100mg/L的L-半胱氨酸）上共培养3天后，借助Büchner滤器，将EC涂布在滤纸顶部上，亦或作为小堆转移在M100基质上（pH5.8，250mg/L triacillin和选择剂（潮霉素50mg/L或PPT5mg/L或草甘膦1至1.5mM)），并且在暗光中（强度：1至7μmol m-2sec-1；16H光/8H黑暗）在28℃孵育。
·2至3周后，将愈伤组织进一步作为小堆传代培养在具有50mg/L潮霉素亦或1mM草甘膦或5mg/L PPT的选择性M100基质上。约每3周一次的传代培养间隔进行约6周的传代培养时期后，在28℃在避眩灯条件下在选择性M100基质上，可以选择转化的EC/体细胞胚。
·用于鉴别靶向修饰事件的分子筛选在转化的EC/体细胞胚水平上实施。
·在28℃，在光亮条件下（强度：40至70μmol m-2sec-1；光周期：16H光/8H黑暗），通过将EC/体细胞胚涂布在具有活性炭和相应选择剂的M104上，植物再生起始自修饰事件。从这个步骤开始，基质不再包含抗生素。
·约一个月之后，将0.5-1cm的单独胚转移至具有活性炭（AC）和相应选择性基质的M104上的滤纸顶部上。
·在28℃在光条件下（强度：40至70μmol m-2sec-1；光周期：16H光/8H黑暗）将进一步良好生芽的胚转移至非选择性萌发基质M702上。
·一至两个月后，在28℃在光条件下（强度：40至70μmol m-2sec-1；光周期：16H光/8H黑暗），将进一步发育的胚转移至M700基质上，用于发育成小苗。
实例6：用于靶基因组工程评估的靶植物的产生
通过如描述于实例5中的土壤农杆菌产生包括pTCV117靶DNA载体的转基因棉花植物。pTCV117载体包括在两个I-SceI识别位点之间的功能性35S-驱动的bar基因和无启动子EPSPS基因（参见图1）。为了评估靶重组，最初旨在用35S-I-SceI表达盒和具有与靶DNA的同源区域的修复DNA转化这些植物，用于通过插入组蛋白启动子恢复无启动子epsps基因，由此导致草甘膦耐受性的获得。然而，可能由于35S启动子的双向转录活性，这些pTCV117植物似乎已经具有对草甘膦高水平的耐受性，由此使该测定不可用。
实例7：通过同源重组的靶向插入或取代
因此，构建了具有与靶DNA同源区域的新修复DNApTIB232，包括功能性CSVMV驱动的潮霉素抗性基因，该基因在一端侧翼是3’epsps基因片段（允许与EPSPS基因在靶基因座同源重组，由此用潮霉素基因取代了EPSPS基因的5’部分）并且在另一端侧翼是5’bar基因片段的35S-启动子，如在图1中示意性表明的。用pTIB232载体和ptrr26载体（包括可操作地连接至35S启动子的通用密码子I-SceI编码区域），使用如描述于实例4中的粒子轰击转化pTCV117靶植物。
首先，筛选转化株的潮霉素耐受性，因为这表明了修复DNA pTIB232的插入。随后评估HygR事件的草甘膦抗性的丧失，这表明了在靶基因座的重组。通过使用识别EPSPS基因上游的基因组区域和潮霉素基因的引物对P3x P4的PCR分析，进一步表征这36个由此获得的hygR和GlyS重组体（图1）。这导致了8个潜在正确基因靶向事件（通过至少一侧的同源重组，用潮霉素基因取代epsps基因5’部分：图1中的配置I），随后通过用引物组P3，P4获得的PCR产物的序列分析确认了确实正确的基因靶向事件。
实例8：通过非同源末端连接的靶向插入或取代
用修复DNA和内切核酸酶表达载体pTIB236，包括功能性hygR基因和与靶位点没有同源性的功能性通用密码子I-SceI编码基因，使用如描述于实例5中的土壤农杆菌介导的DNA转移对pTCV117植物进行转化（参见图2）。
使用2个引物对P1xP2和P3xP4，通过PCR分析由此得的200个hygR事件；引物对P1xP2识别hygR基因以及bar基因下游的基因组区域，并且另一对识别EPSPS基因上游的基因组区域和潮霉素基因）（图2）。这导致了17个潜在靶向插入/取代事件的识别。在4个这些事件上完成的序列分析示出它们确实是靶向插入/取代事件（图2中的配置I、II）。
实例9：经由非同源末端连接使用土壤农杆菌介导的转化的靶向插入或取代
用包括修复DNA和内切核酸酶表达载体pTIB236的土壤农杆菌菌株A5280=EHA101（pTIB236），如描述于实例5中那样转化靶株系G4GH198-01901。
选择潮霉素抗性（HygR）事件，对其中的200个，使用引物对P1xP2和P3x P4，通过PCR分析hyg基因在一个或多个靶I-SceI位点的插入。这200个事件中，发现约10%是靶向事件。一些这些靶向事件的序列分析揭示bar基因已经被hyg基因取代亦或hyg基因已经紧贴bar基因插入（堆叠事件）。
实例10：使用定制的大范围核酸酶的靶向双链断裂诱导
胚性愈伤组织来自PPT-抗性棉花植物，该植物包含：包括在CSVMV启动子控制下的bar基因的嵌合基因，这些植物经由粒子轰击用包括编码定制工程化的大范围核酸酶的嵌合基因的载体进行转化，该大范围核酸酶识别一个在bar基因中的靶序列，该靶序列作为单链（pCV170:SEQ ID NO.5）亦或作为异质二聚体（pCV177:SEQ ID NO.6）。用包含作为可选择性标记基因的赋予草甘膦耐受性的在植物可表达启动子控制下的2mEPSPS基因的载体完成大范围核酸酶载体的共递送。获得约3000个草甘膦抗性愈伤组织，其中85个事件出现了PPT敏感性，表明bar基因的破坏。这些事件中，通过使用在靶位点侧翼的引物的PCR和随后PCR产物的测序表征79个事件的基因型（表1）。
表1：PPT-敏感性草甘膦抗性转化事件的表征。PCR产物的不存在是围绕靶位点巨大缺失的指示。
因此，这些结果证实了可能用一个单链连同一个异质二聚体的定制设计的大范围核酸酶在所希望的位置诱导靶向双链DNA断裂，以及证实了可以使用在棉花中的此类大范围核酸酶获得这种靶向缺失、取代和插入事件。

Claims (26)

1.一种用于在预定义位点修饰棉花植物细胞基因组的方法，该方法包括以下步骤
a.在所述预定义位点或其附近诱导双链DNA断裂，所述双链断裂是通过向所述细胞引入罕见分裂内切核酸酶诱导的，该罕见分裂内切核酸酶在所述预定义位点或其附近识别一个识别序列；
b.选择一种植物细胞，其中所述双链DNA断裂已经被修复，导致了在基因组中在所述预选位点的修饰，其中所述修饰选自
i.至少一个核苷酸的取代；
ii.至少一个核苷酸的缺失；
iii.至少一个核苷酸的插入；或者
iv.i.-iii.的任何组合；
其特征在于所述细胞包括在脆弱胚性愈伤组织内，其中在包括活性炭的培养基上诱导所述脆弱胚性愈伤组织并维持在暗光条件下，其中所述暗光条件的光强度是1至7μmol m-2sec-1，光周期是16H光/8H黑暗。
2.如权利要求1所述的方法，其中通过将编码所述内切核酸酶的DNA分子递送至所述细胞中，将所述内切核酸酶引入所述细胞。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中先于步骤b.，将一种外源修复DNA分子递送至所述细胞中，所述外源修复DNA分子被用作用于修复所述双链DNA断裂的模板。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中所述胚性愈伤组织诱导自下胚轴外植体。
5.如权利要求1或2所述的方法，其中在所述内切核酸酶的所述引入之前、之中和之后，将所述胚性愈伤组织在没有激素的培养基中进行孵育。
6.如权利要求1或2所述的方法，其中在所述内切核酸酶的所述引入之前和之后，将所述胚性愈伤组织在固体培养基上进行孵育。
7.如权利要求1或2所述的方法，其中在所述内切核酸酶的所述引入之中或之后，将所述胚性愈伤组织在非选择性培养基上孵育1至4天。
8.如权利要求3所述的方法，其中所述DNA递送通过粒子轰击实施。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述轰击用0.5pmol外源修复DNA和/或0.5pmol内切核酸酶编码DNA实施。
10.如权利要求8或9所述的方法，其中在轰击之前，所述胚性愈伤组织在包括0.2M甘露醇和0.2M山梨醇的培养基上孵育2至20小时。
11.如权利要求8所述的方法，其中在所述内切核酸酶的所述引入之中或之后，将所述胚性愈伤组织在包括0.2M甘露醇的非选择性培养基上孵育1至4天。
12.如权利要求3所述的方法，其中所述DNA递送使用农杆菌属实施。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述DNA递送通过在包括100μM乙酰丁香酮和/或100mg/l L-半胱氨酸的培养基中将所述胚性愈伤组织与所述农杆菌属共培养三天实施。
14.如权利要求12或13所述的方法，其中所述转化之后，所述胚性愈伤组织在包括250mg/L或125mg/L triacillin的培养基上孵育。
15.根据权利要求3和12-13中任一项所述的方法，其中所述外源修复DNA包括至少一个侧翼核苷酸序列，该核苷酸序列与所述预定义位点的上游或下游DNA区域具有充分同源性，以允许与所述上游或下游DNA区域重组。
16.根据权利要求3和12-13中任一项所述的方法，其中所述外源修复DNA包括两个位于所述外源DNA相反端的侧翼核苷酸序列，一个所述侧翼核苷酸序列与所述预定义位点的上游DNA区域具有充分同源性，另一个侧翼核苷酸序列与所述预定义位点的下游序列具有充分同源性，以允许所述侧翼核苷酸序列与所述上游和下游DNA区域之间的重组。
17.根据权利要求3和12-13中任一项所述的方法，其中所述外源修复DNA包括一个可选择性标记基因。
18.根据权利要求3和12-13中任一项所述的方法，其中所述外源DNA包括一个感兴趣的植物可表达基因。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述感兴趣的植物可表达基因选自下组：除草剂耐受性基因，昆虫抗性基因，疾病抗性基因，非生物逆境抗性基因，涉及油类生物合成、糖类生物合成的酶，涉及纤维强度或纤维长度的酶，涉及次生代谢生物合成的酶。
20.根据权利要求3和12-13中任一项所述的方法，其中所述外源DNA由两个侧翼核苷酸序列组成，一个所述侧翼核苷酸序列与所述预定义位点的上游DNA区域具有充分同源性，另一个侧翼核苷酸序列与所述预定义位点的下游序列具有充分同源性，以允许所述侧翼核苷酸序列与所述上游和下游DNA区域之间的重组。
21.如权利要求1、2或12-13中任一项所述的方法，其中所述预选位点侧翼是两个具有充分同源性的区域，用于彼此重组。
22.根据权利要求1-2和12-13中任一项所述的方法，其中所述棉花植物细胞进一步再生成棉花植物。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述植物进一步与另一植物杂交。
24.根据权利要求1或2的方法，其中所述脆弱胚性愈伤组织在暗光条件下并且在包含活性炭的培养基上维持2-4个月。
25.一种生产棉花植物细胞或棉花植物的方法，包括根据权利要求1-24任一项所述的方法产生棉花植物细胞或棉花植物的步骤，其中所述棉花植物细胞或棉花植物包含在基因组的预定义位点的修饰。
26.根据权利要求25的方法，包括将所述棉花植物与另一植物或与它自己杂交，以及可任选地收获种子或纤维的额外步骤。
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