DE19619918A1 - Nucleinsäuremoleküle codierend lösliche Stärkesynthasen aus Mais - Google Patents
Nucleinsäuremoleküle codierend lösliche Stärkesynthasen aus MaisInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft Nucleinsäuremoleküle, die
eine Form der löslichen Stärkesynthase aus Mais codieren.
Weiterhin betrifft diese Erfindung Vektoren, Bakterien, sowie
mit den beschriebenen Nucleinsäuremolekülen transformierte
Pflanzenzellen und aus diesen regenerierbare Pflanzen.
Ferner werden Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen
beschrieben, die aufgrund der Einführung von DNA-Molekülen,
die eine lösliche Stärkesynthase aus Mais codieren, eine in
ihren Eigenschaften veränderte Stärke synthetisieren.
Im Hinblick auf die zunehmende Bedeutung, die pflanzlichen In
haltsstoffen als erneuerbaren Rohstoffquellen in letzter Zeit
beigemessen wird, ist es eine der Aufgaben der biotechnologi
schen Forschung, sich um eine Anpassung dieser pflanzlichen
Rohstoffe an die Anforderungen der verarbeitenden Industrie zu
bemühen. Um eine Anwendung von nachwachsenden Rohstoffen in
möglichst vielen Einsatzgebieten zu ermöglichen, ist es dar
über hinaus erforderlich, eine große Stoffvielfalt zu errei
chen.
Neben Ölen, Fetten und Proteinen stellen Polysaccharide die
wesentlichen nachwachsenden Rohstoffe aus Pflanzen dar. Eine
zentrale Stellung bei den Polysacchariden nimmt neben Cellu
lose die Stärke ein, die einer der wichtigsten Speicherstoffe
in höheren Pflanzen ist. Hierbei ist Mais eine der interessan
testen Pflanzen, da sie die weltweit für die Stärkeproduktion
wichtigste Kulturpflanze ist.
Das Polysaccharid Stärke ist ein Polymer aus chemisch einheit
lichen Grundbausteinen, den Glucosemolekülen. Es handelt sich
dabei jedoch um ein sehr komplexes Gemisch aus unterschiedli
chen Molekülformen, die sich hinsichtlich ihres Polymerisa
tionsgrades und des Auftretens von Verzweigungen der Glucose
ketten unterscheiden. Daher stellt Stärke keinen einheitlichen
Rohstoff dar. Man unterscheidet insbesondere die
Amylose-Stärke, ein im wesentlichen unverzweigtes Polymer aus α-1,4-
glycosidisch verknüpften Glucosemolekülen, von der Amylopek
tin-Stärke, die ihrerseits ein komplexes Gemisch aus unter
schiedlich verzweigten Glucoseketten darstellt. Die Verzwei
gungen kommen dabei durch das Auftreten von zusätzlichen
α-1,6-glycosidischen Verknüpfungen zustande. In typischen für
die Stärkeproduktion verwendeten Pflanzen, wie z. B. Mais oder
Kartoffel, besteht die synthetisierte Stärke zu ca. 25% aus
Amylose-Stärke und zu ca. 75% aus Amylopektin-Stärke.
Um eine möglichst breite Anwendung von Stärke zu ermöglichen,
erscheint es wünschenswert, Pflanzen zur Verfügung zu stellen,
die in der Lage sind, modifizierte Stärke zu synthetisieren,
die sich für verschiedene Verwendungszwecke besonders eignet.
Eine Möglichkeit, derartige Pflanzen bereitzustellen, besteht -
neben züchterischen Maßnahmen - in der gezielten genetischen
Veränderung des Stärkemetabolismus stärkeproduzierender Pflan
zen durch gentechnologische Methoden. Voraussetzung hierfür
ist jedoch die Identifizierung und Charakterisierung der an
der Stärkesynthese und/oder -modifikation beteiligten Enzyme
sowie die Isolierung der entsprechenden, diese Enzyme codie
rende DNA-Moleküle.
Die biochemischen Synthesewege, die zum Aufbau von Stärke füh
ren, sind im wesentlichen bekannt. Die Stärkesynthese in
pflanzlichen Zellen findet in den Plastiden statt. In photo
synthetisch aktiven Geweben sind dies die Chloroplasten, in
photosynthetisch inaktiven, stärkespeichernden Geweben die
Amyloplasten.
Die wichtigsten an der Stärkesynthese beteiligten Enzyme sind
die Stärkesynthasen sowie die Verzweigungsenzyme. Bei den
Stärkesynthasen sind verschiedene Isoformen beschrieben, die
alle eine Polymerisierungsreaktion durch Übertragung eines
Glucosylrestes von ADP-Glucose auf α-1,4-Glucane katalysieren.
Verzweigungsenzyme katalysieren die Einführung von α-1,6-Ver
zweigungen in lineare α-1,4-Glucane.
Stärkesynthasen können in zwei Klassen eingeteilt werden: die
Stärkekorn-gebundenen Stärkesynthasen ("granule-bound starch
synthases"; GBSS) und die löslichen Stärkesynthasen ("soluble
starch synthases"; SSS). Diese Unterscheidung ist nicht in je
dem Fall eindeutig zu treffen, da einige der Stärkesynthasen
sowohl stärkekorngebunden als auch in löslicher Form vorliegen
(Denyer et al., Plant J. 4 (1993), 191-198; Mu et al., Plant
J. 6 (1994), 151-159). Für verschiedene Pflanzenspezies werden
innerhalb dieser Klassen wiederum verschiedene Isoformen be
schrieben, die sich hinsichtlich ihrer Abhängigkeit von Star
termolekülen unterscheiden (sogenannte "primer dependent" (Typ
II) und "primer independent" (Typ I) starch synthases).
Lediglich für die Isoform GBSS I gelang es bisher, die genaue
Funktion bei der Stärkesynthese zu ermitteln. Pflanzen, in de
nen diese Enzymaktivität stark oder vollkommen reduziert ist,
synthetisieren eine amylosefreie (sogenannte "waxy") Stärke
(Shure et al., Cell 35 (1983), 225-233; Visser et al., Mol.
Gen. Genet. 225 (1991), 289-296; WO 92/11376), so daß diesem
Enzym eine entscheidende Rolle bei der Synthese der Amylose-
Stärke zugesprochen wird. Dieses Phänomen wird ebenfalls in
Zellen der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii beobachtet
(Delrue et al., J. Bacteriol. 174 (1992), 3612-3620). Bei
Chlamydomonas konnte darüber hinaus gezeigt werden, daß GBSS I
nicht nur an der Synthese der Amylose beteiligt ist, sondern
auch einen Einfluß auf die Amylopektinsynthese besitzt. In Mu
tanten, die keine GBSS I-Aktivität aufweisen, fehlt eine be
stimmte Fraktion des normalerweise synthetisierten Amylopek
tins, die längerkettige Glucane aufweist.
Die Funktionen der anderen Isoformen der Stärkekorn-gebundenen
Stärkesynthasen, insbesondere der GBSS II, und der löslichen
Stärkesynthasen sind bisher unklar. Es wird angenommen, daß
die löslichen Stärkesynthasen zusammen mit Verzweigungsenzymen
an der Synthese des Amylopektins beteiligt sind (siehe z. B.
Ponstein et al., Plant Physiol. 92 (1990), 234-241) und daß
sie eine wichtige Funktion bei der Regulation der Stärkesyn
theserate spielen.
Bei Mais wurden zwei Isoformen der Stärkekorn-gebundenen, so
wie zwei bzw. drei Isoformen der löslichen Stärkesynthasen
identifiziert (Hawker et al., Arch. Biochem. Biophys. 160
(1974), 530-551; Pollock und Preiss, Arch. Biochem. Biophys.
204 (1980), 578-588; MacDonald und Preiss, Plant Physiol. 78
(1985), 849-852; Mu et al., Plant J. 6 (1994) , 151-159).
Eine GBSS I aus Mais codierende cDNA sowie eine genomische DNA
sind bereits beschrieben (Shure et al., Cell 35 (1983),
225-233; Kloesgen et al., Mol. Gen. Genet. 203 (1986), 237-244).
Weiterhin ist ein sogenannter "Expressed Sequence Tag (EST)
beschrieben worden (Shen et al., 1994, GenBank Nr.: T14684),
dessen abgeleitete Aminosäuresequenz eine starke Ähnlichkeit
zur abgeleiteten Aminosäuresequenz der GBSS II aus Erbse (Dry
et al., Plant J. 2 (1992), 193-202) und Kartoffel (Edwards et
al., Plant J. 8 (1995), 283-294) aufweist. Nucleinsäuresequen
zen, die weitere Stärkesynthase-Isoformen aus Mais codieren,
lagen jedoch bisher noch nicht vor. cDNA-Sequenzen, die für
andere Stärkesynthasen als für die GBSS I codieren, wurden
bisher lediglich für Erbse (Dry et al., Plant J. 2 (1992),
193-202), Reis (Baba et al., Plant Physiol. 103 (1993),
565-573) und Kartoffel (Edwards et al., Plant J. 8 (1995),
283-294) beschrieben.
Außer beim Mais wurden lösliche Stärkesynthasen auch in einer
Reihe weiterer Pflanzenarten identifiziert. Lösliche Stärke
synthasen sind beispielsweise bis zur Homogenität aus Erbse
(Denyer und Smith, Planta 186 (1992), 609-617) und Kartoffel
(Edwards et al., Plant J. 8 (1995), 283-294) isoliert worden.
In diesen Fällen stellte sich heraus, daß die als SSS II iden
tifizierte Isoform der löslichen Stärkesynthase identisch ist
mit der Stärkekorn-gebundenen Stärkesynthase GBSS II (Denyer
et al., Plant J. 4 (1993), 191-198; Edwards et al., Plant J. 8
(1995), 283-294). Für einige weitere Pflanzenspezies wurde das
Vorhandensein mehrerer SSS-Isoformen mit Hilfe chromatographi
scher Methoden beschrieben, beispielsweise bei Gerste (Tyynelä
und Schulman, Physiologia Plantarum 89 (1993) 835-841; Kreis,
Planta 148 (1980), 412-416) und Weizen (Rÿven, Plant Physiol.
81 (1986), 448-453). DNA-Sequenzen, die diese Proteine codie
ren, wurden jedoch bisher nicht beschrieben.
Um weitere Möglichkeiten bereitzustellen, beliebige stärke
speichernde Pflanzen dahingehend zu verändern, daß sie eine mo
difizierte Stärke synthetisieren, ist es erforderlich, jeweils
DNA-Sequenzen zu identifizieren, die weitere Isoformen der
Stärkesynthasen codieren.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde,
Nucleinsäuremoleküle zur Verfügung zu stellen, die an der
Stärkebiosynthese beteiligte Enzyme codieren und mit deren
Hilfe es möglich ist, gentechnisch veränderte Pflanzen herzu
stellen, die eine erhöhte oder erniedrigte Aktivität dieser
Enzyme aufweisen, wodurch es zu einer Veränderung der chemi
schen und/oder physikalischen Eigenschaften der in diesen
Pflanzen synthetisierten Stärke kommt.
Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung der in den Patent
ansprüchen bezeichneten Ausführungsformen gelöst.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher Nucleinsäuremoleküle,
die Proteine mit der biologischen Aktivität einer löslichen
Stärkesynthase des Typs I aus Mais codieren, wobei derartige
Moleküle vorzugsweise Proteine codieren, die die unter Seq ID
No. 2 angegebenen Aminosäuresequenz umfassen. Insbesondere
betrifft die Erfindung Nucleinsäuremoleküle, die die unter Seq
ID No. 1 angegebene Nucleotidsequenz oder einen Teil davon
enthalten, bevorzugt Moleküle, die die in Seq ID No. 1 angege
bene codierende Region umfassen bzw. entsprechende Ribo
nucleotidsequenzen.
Die Erfindung betrifft auch Nucleinsäuremoleküle, die eine Se
quenz aufweisen, die zu der gesamten oder einem Teil der unter
Seq ID No. 1 dargestellten Sequenz komplementär ist.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Nucleinsäuremole
küle, die eine lösliche Stärkesynthase aus Mais codieren und
deren einer Strang mit einem der oben beschriebenen Moleküle
hybridisiert.
Gegenstand der Erfindung sind ebenfalls Nucleinsäuremoleküle,
die eine lösliche Stärkesynthase des Typs I aus Mais codieren
und deren Sequenz aufgrund der Degeneration des genetischen
Codes von den Nucleotidsequenzen der oben beschriebenen Mole
küle abweicht.
Bei den erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen kann es sich
sowohl um DNA- als auch RNA-Moleküle handeln. Entsprechende
DNA-Moleküle sind beispielsweise genomische oder cDNA-Mole
küle.
Der Begriff "Hybridisierung" bedeutet im Rahmen dieser Erfin
dung eine Hybridisierung unter konventionellen Hybridisie
rungsbedingungen, vorzugsweise unter stringenten Bedingungen,
wie sie beispielsweise in Sambrock et al., Molecular Cloning,
A Laboratory Manual, 2. Aufl. (1989) Cold Spring Harbor Labo
ratory Press, Cold Spring Harbor, NY) beschrieben sind.
Nucleinsäuremoleküle, die mit den erfindungsgemäßen Nuclein
säuremolekülen hybridisieren, können prinzipiell aus jeder be
liebigen Maispflanze stammen, die derartige Moleküle besitzt.
Nucleinsäuremoleküle, die mit den erfindungsgemäßen Molekülen
hybridisieren, können z. B. aus genomischen oder aus cDNA-Bi
bliotheken von Maispflanzen oder Maispflanzengewebe isoliert
werden. Alternativ können sie durch gentechnische Methoden
oder durch chemische Synthese hergestellt sein.
Die Identifizierung und Isolierung derartiger Nucleinsäuremo
leküle kann dabei unter Verwendung der erfindungsgemäßen Mole
küle oder Teile dieser Moleküle bzw. der reversen Komplemente
dieser Moleküle erfolgen, z. B. mittels Hybridisierung nach
Standardverfahren (siehe z. B. Sambrook et al., 1989, Molecular
Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. Cold Spring Harbor La
boratory Press, Cold Spring Harbor, NY).
Als Hybridisierungsprobe können z . B. Nucleinsäuremoleküle ver
wendet werden, die exakt die oder im wesentlichen die unter
Seq ID No. 1 angegebene Nucleotidsequenz oder Teile dieser Se
quenz aufweisen. Bei den als Hybridisierungsprobe verwendeten
Fragmenten kann es sich auch um synthetische Fragmente han
deln, die mit Hilfe der gängigen Synthesetechniken hergestellt
wurden und deren Sequenz im wesentlichen mit der eines erfin
dungsgemäßen Nucleinsäuremoleküls übereinstimmt. Hat man Gene
identifiziert und isoliert, die mit den erfindungsgemäßen
Nucleinsäuresequenzen hybridisieren, ist eine Bestimmung der
Sequenz und eine Analyse der Eigenschaften der von dieser Se
quenz codierten Proteine erforderlich.
Die mit den erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen hybridi
sierenden Moleküle umfassen auch Fragmente, Derivate und alle
lische Varianten der oben beschriebenen Nucleinsäuremoleküle,
die eine erfindungsgemäße lösliche Stärkesynthase aus Mais co
dieren. Unter Fragmenten werden dabei Teile der Nucleinsäure
moleküle verstanden, die lang genug sind, um eines der be
schriebenen Proteine zu codieren. Der Ausdruck Derivat bedeu
tet in diesem Zusammenhang, daß die Sequenzen dieser Moleküle
sich von den Sequenzen der oben beschriebenen Nucleinsäuremo
leküle an einer oder mehreren Positionen unterscheiden und
einen hohen Grad an Homologie zu diesen Sequenzen aufweisen.
Homologie bedeutet dabei eine Sequenzidentität von mindestens
40%, insbesondere eine Identität von mindestens 60%, vor
zugsweise über 80% und besonders bevorzugt über 90%. Die Ab
weichungen zu den oben beschriebenen Nucleinsäuremolekülen
können dabei durch Deletion, Substitution, Insertion oder Re
kombination entstanden sein.
Homologie bedeutet ferner, daß funktionelle und/oder struktu
relle Äquivalenz zwischen den betreffenden Nucleinsäuremolekü
len oder den durch sie codierten Proteinen, besteht. Bei den
Nucleinsäuremolekülen, die homolog zu den oben beschriebenen
Molekülen sind und Derivate dieser Moleküle darstellen, han
delt es sich in der Regel um Variationen dieser Moleküle, die
Modifikationen darstellen, die dieselbe biologische Funktion
ausüben. Es kann sich dabei sowohl um natürlicherweise auftre
tende Variationen handeln, beispielsweise um Sequenzen aus an
deren Maissorten, oder um Mutationen, wobei diese Mutationen
auf natürliche Weise aufgetreten sein können oder durch ge
zielte Mutagenese eingeführt wurden. Ferner kann es sich bei
den Variationen um synthetisch hergestellte Sequenzen handeln.
Bei den allelischen Varianten kann es sich sowohl um natürlich
auftretende Varianten handeln, als auch um synthetisch herge
stellte oder durch rekombinante DNA-Techniken erzeugte Varian
ten.
Die von den verschiedenen Varianten der erfindungsgemäßen
Nucleinsäuremoleküle codierten Proteine weisen bestimmte ge
meinsame Charakteristika auf. Dazu können z. B. Enzymaktivität,
Molekulargewicht, immunologische Reaktivität, Konformation
etc. gehören, sowie physikalische Eigenschaften wie z. B. das
Laufverhalten in Gelelektrophoresen, chromatographisches Ver
halten, Sedimentationskoeffizienten, Löslichkeit, spektrosko
pische Eigenschaften, Stabilität; pH-Optimum, Temperatur-Opti
mum etc.
Wichtige Charakteristika einer Stärkesynthase sind: i) ihre
Lokalisation im Stroma der Plastiden pflanzlicher Zellen; ii)
ihre Fähigkeit zur Synthese linearer α-1,4-verknüpfter Poly
glucane unter Verwendung von ADP-Glucose als Substrat. Diese
Aktivität kann wie in Denyer und Smith (Planta 186 (1992),
606-617) oder wie in den Beispielen beschrieben bestimmt wer
den.
Bei den durch die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekülen co
dierten Proteine handelt es sich um eine bisher nicht identi
fizierte und charakterisierte Form einer löslichen Stärke
synthase aus Mais, die dem Typ I ("primer independent") zuge
ordnet werden kann. Derartige Stärkesynthasen bzw. Nucleinsäu
remoleküle, die derartige Proteine codieren, sind bisher aus
Mais nicht beschrieben. Das codierte Protein weist eine ge
wisse Homologie zu einer löslichen Stärkesynthase aus Reis auf
(Baba et al., Plant Physiol. 103 (1993), 565-573).
Gegenstand der Erfindung sind auch Oligonucleotide, die spezi
fisch mit einem erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekül hybridi
sieren. Derartige Oligonucleotide haben vorzugsweise eine
Länge von mindestens 10, insbesondere von mindestens 15 und
besonders bevorzugt von mindestens 50 Nucleotiden. Sie sind
dadurch gekennzeichnet, daß sie spezifisch mit erfindungsge
mäßen Nucleinsäuremolekülen hybridisieren, d. h. nicht oder nur
in sehr geringem Ausmaß mit Nucleinsäuresequenzen, die andere
Proteine, insbesondere andere Stärkesynthasen codieren. Die
erfindungsgemäßen Oligonucleotide können beispielsweise als
Primer für eine PCR-Reaktion verwendet werden. Ebenso können
sie Bestandteile von antisense-Konstrukten sein oder von
DNA-Molekülen, die für geeignete Ribozyme codieren.
Ferner betrifft die Erfindung Vektoren, insbesondere Plasmide,
Cosmide, Viren, Bacteriophagen und andere in der Gentechnik
gängige Vektoren, die die oben beschriebenen erfindungsgemäßen
Nucleinsäuremoleküle enthalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die in den Vektoren
enthaltenen Nucleinsäuremoleküle verknüpft mit regulatorischen
Elementen, die die Transkription und Synthese einer transla
tierbaren RNA in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen
gewährleisten.
Die Expression der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle in
prokaryontischen Zellen, beispielsweise in Escherichia coli,
ist insofern interessant, als daß auf diese Weise eine ge
nauere Charakterisierung der enzymatischen Aktivitäten der En
zyme, für die diese Moleküle codieren, ermöglicht wird. Es ist
insbesondere möglich, das Produkt, das von den entsprechenden
Enzymen in Abwesenheit anderer, in der pflanzlichen Zelle an
der Stärkesynthese beteiligter Enzyme synthetisiert wird, zu
charakterisieren. Dies läßt Rückschlüsse zu auf die Funktion,
die das entsprechende Protein bei der Stärkesynthese in der
Pflanzenzelle ausübt.
Darüber hinaus ist es möglich, mittels gängiger molekularbio
logischer Techniken (siehe z. B. Sambrook et al., 1989, Molecu
lar Cloning, A Laboratory Manual, 2. Aufl. Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) verschiedenartige
Mutationen in die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle ein
zuführen, wodurch es zur Synthese von Proteinen mit eventuell
veränderten biologischen Eigenschaften kommt. Hierbei ist zum
einen die Erzeugung von Deletionsmutanten möglich, bei denen
durch fortschreitende Deletionen vom 5′- oder vom 3′- Ende der
codierenden DNA-Sequenz Nucleinsäuremoleküle erzeugt werden,
die zur Synthese entsprechend verkürzter Proteine führen.
Durch derartige Deletionen am 5′-Ende der Nucleotidsequenz ist
es beispielsweise möglich, Aminosäuresequenzen zu identifizie
ren, die für die Translokation des Enzyms in die Plastiden
verantwortlich sind (Transitpeptide). Dies erlaubt es, gezielt
Enzyme herzustellen, die durch Entfernen der entsprechenden
Sequenzen nicht mehr in den Plastiden, sondern im Cytosol lo
kalisiert sind, oder aufgrund der Addition von anderen Si
gnalsequenzen in anderen Kompartimenten lokalisiert sind.
Andererseits ist auch die Einführung von Punktmutationen denk
bar an Positionen, bei denen eine Veränderung der Aminosäure
sequenz einen Einfluß beispielweise auf die Enzymaktivität
oder die Regulierung des Enzyms hat. Auf diese Weise können
z. B. Mutanten hergestellt werden, die einen veränderten Km-
Wert besitzen oder nicht mehr den normalerweise in der Zelle
vorliegenden Regulationsmechanismen über allosterische Regula
tion oder kovalente Modifizierung unterliegen.
Des weiteren können Mutanten hergestellt werden, die eine ver
änderte Substrat- oder Produktspezifität aufweisen, wie z. B.
Mutanten, die als Substrat ADP-Glucose-6-Phosphat anstatt
ADP-Glucose verwenden. Weiterhin können Mutanten hergestellt wer
den, die ein verändertes Aktivitäts-Temperatur-Profil aufwei
sen.
Für die gentechnische Manipulation in prokaryontischen Zellen
können die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle oder Teile
dieser Moleküle in Plasmide eingebracht werden, die eine Muta
genese oder eine Sequenzveränderung durch Rekombination von
DNA-Sequenzen erlauben. Mit Hilfe von Standardverfahren (vgl.
Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A laboratory manual,
2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA) können
Basenaustausche vorgenommen oder natürliche oder synthetische
Sequenzen hinzugefügt werden. Für die Verbindung der DNA-Frag
mente untereinander können an die Fragmente Adaptoren oder
Linker angesetzt werden. Ferner können Manipulationen, die
passende Restriktionsschnittstellen zur Verfügung stellen oder
die überflüssige DNA oder Restriktionsschnittstellen entfer
nen, eingesetzt werden. Wo Insertionen, Deletionen oder Sub
stitutionen in Frage kommen, können in vitro-Mutagenese,
"primer repair", Restriktion oder Ligation verwendet werden.
Als Analysemethode werden im allgemeinen eine Sequenzanalyse,
eine Restriktionsanalyse und weitere biochemisch-molekularbio
logische Methoden durchgeführt.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung
Wirtszellen, insbesondere prokaryontische oder eukaryontische
Zellen, die mit einem oben beschriebenen erfindungsgemäßen
Nucleinsäuremolekül oder einem erfindungsgemäßen Vektor trans
formiert sind, sowie Zellen, die von derart transformierten
Zellen abstammen und ein erfindungsgemäßes Nucleinsäuremolekül
oder einen Vektor enthalten. Dabei handelt es sich vorzugs
weise um bakterielle Zellen oder pflanzliche Zellen.
Gegenstand der Erfindung sind ferner die Proteine, die durch
die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle codiert werden, so
wie Verfahren zu deren Herstellung, wobei eine erfindungsge
mäße Wirtszelle unter Bedingungen kultiviert wird, die die
Synthese des Proteins erlauben, und anschließend das Protein
aus den kultivierten Zellen und/oder dem Kulturmedium isoliert
wird.
Durch die Bereitstellung der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremo
leküle ist es nun möglich, mit Hilfe gentechnischer Methoden
in den Stärkemetabolismus von Pflanzen einzugreifen, wie es
bisher nicht möglich war, und ihn dahingehend zu verändern,
daß es zur Synthese einer modifizierten Stärke kommt, die bei
spielsweise in ihren physikalisch-chemischen Eigenschaften,
insbesondere dem Amylose/Amylopektin-Verhältnis, dem Verzwei
gungsgrad, der durchschnittlichen Kettenlänge, dem Phosphatge
halt, dem Verkleisterungsverhalten, der Stärkekorngröße
und/oder der Stärkekornform im Vergleich zu in Wildtyp-Pflan
zen synthetisierter Stärke verändert ist. Durch eine Erhöhung
der Aktivität der erfindungsgemäßen Proteine, beispielsweise
durch Überexpression entsprechender Nucleinsäuremoleküle, oder
durch die Bereitstellung von Mutanten, die nicht mehr den
zelleigenen Regulationsmechanismen unterliegen und/oder unter
schiedliche Temperaturabhängigkeiten in bezug auf ihre Aktivi
tät besitzen, besteht die Möglichkeit der Ertragssteigerung in
entsprechend gentechnisch veränderten Pflanzen. Die wirt
schaftliche Bedeutung der Möglichkeit des Eingriffs in die
Stärkesynthese allein bei Mais ist offensichtlich: Mais ist
weltweit die wichtigste Pflanze zur Stärkegewinnung. Ca. 80%
der weltweit jährlich produzierten Stärke wird aus Mais gewon
nen.
Möglich ist somit die Expression der erfindungsgemäßen
Nucleinsäuremoleküle in pflanzlichen Zellen, um die Aktivität
der entsprechenden löslichen Stärkesynthase zu erhöhen. Ferner
ist es möglich, die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle
nach dem Fachmann bekannten Methoden zu modifizieren, um er
findungsgemäß Stärkesynthasen zu erhalten, die nicht mehr den
zelleigenen Regulationsmechanismen unterliegen, bzw. verän
derte Temperaturabhängigkeiten oder Substrat- bzw. Pro
duktspezifitäten aufweisen.
Bei der Expression der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle
in Pflanzen besteht grundsätzlich die Möglichkeit, daß das
synthetisierte Protein in jedem beliebigen Kompartiment der
pflanzlichen Zelle lokalisiert sein kann. Um die Lokalisation
in einem bestimmten Kompartiment zu erreichen, muß die die Lo
kalisation in Plastiden gewährleistende Sequenz deletiert wer
den und die verbleibende codierende Region gegebenenfalls mit
DNA-Sequenzen verknüpft werden, die die Lokalisierung in dem
jeweiligen Kompartiment gewährleisten. Derartige Sequenzen
sind bekannt (siehe beispielsweise Braun et al., EMBO J. 11
(1992), 3219-3227; Wolter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
85 (1988), 846-850; Sonnewald et al., Plant J. 1 (1991),
95-106).
Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch transgene Pflan
zenzellen, die mit einem erfindungsgemäßen Nucleinsäuremolekül
transformiert wurden, sowie transgene Pflanzenzellen, die von
derartig transformierten Zellen abstammen. Derartige Zellen
enthalten ein erfindungsgemäßes Nucleinsäuremolekül, wobei
dieses vorzugsweise mit regulatorischen DNA-Elementen ver
knüpft ist, die die Transkription in pflanzlichen Zellen ge
währleisten, insbesondere mit einem Promotor. Derartige Zellen
lassen sich von natürlicherweise vorkommenden Pflanzenzellen
dadurch unterscheiden, daß sie ein erfindungsgemäßes Nuclein
säuremolekül enthalten, das natürlicherweise in diesen Zellen
nicht vorkommt oder dadurch, daß ein solches Molekül an einem
Ort im Genom der Zelle integriert vorliegt, an dem es sonst
nicht vorkommt, d. h. in einer anderen genomischen Umgebung.
Die transgenen Pflanzenzellen können nach dem Fachmann bekann
ten Techniken zu ganzen Pflanzen regeneriert werden. Die durch
Regeneration der erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen
erhältlichen Pflanzen sind ebenfalls Gegenstand der vorliegen
den Erfindung. Ferner sind Gegenstand der Erfindung Pflanzen,
die die obenbeschriebenen transgenen Pflanzenzellen enthalten.
Bei den transgenen Pflanzen kann es sich prinzipiell um Pflan
zen jeder beliebigen Pflanzenspezies handeln, d. h. sowohl
monokotyle als auch dikotyle Pflanzen. Bevorzugt handelt es
sich um Nutzpflanzen, insbesondere um stärkesynthetisierende
bzw. stärkespeichernde Pflanzen, wie z. B. Getreidearten
(Roggen, Gerste Hafer, Weizen etc.), Reis, Mais, Erbse, Maniok
oder Kartoffel.
Die Erfindung betrifft ebenfalls Vermehrungsmaterial der er
findungsgemäßen Pflanzen, beispielsweise Früchte, Samen, Knol
len, Wurzelstöcke, Sämlinge, Stecklinge etc.
Die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen und Pflanzen
synthetisieren aufgrund der Expression bzw. zusätzlichen Ex
pression eines erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküls eine
Stärke, die beispielsweise in ihren physikalisch-chemischen
Eigenschaften, insbesondere dem Amylose/Amylopektin-Verhält
nis, dem Verzweigungsgrad, der durchschnittlichen Kettenlänge,
dem Phosphatgehalt, dem Verkleisterungsverhalten, der Stärke
korngröße und/oder der Stärkekornform im Vergleich zu in Wild
typ-Pflanzen synthetisierter Stärke verändert ist. Insbeson
dere kann eine solche Stärke im Hinblick auf die Viskosität
und/oder die Gelbildungseigenschaften von Kleistern dieser
Stärke im Vergleich zu Wildtypstärke verändert sein.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit auch die aus
den erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen, Pflanzen so
wie Vermehrungsmaterial erhältliche Stärke.
Ferner ist es möglich, mit Hilfe der erfindungsgemäßen
Nucleinsäuremoleküle Maispflanzenzellen und Maispflanzen zu
erzeugen, bei denen die Aktivität eines erfindungsgemäßen Pro
teins verringert ist. Dies führt ebenfalls zur Synthese einer
Stärke mit veränderten chemischen und/oder physikalischen
Eigenschaften verglichen mit Stärke aus Wildtyp-Pflanzenzel
len.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind somit auch trans
gene Maispflanzenzellen, in denen die Aktivität eines erfin
dungsgemäßen Proteins verringert ist im Vergleich zu nicht
transformierten Zellen.
Die Herstellung von Maispflanzenzellen mit einer verringerten
Aktivität eines erfindungsgemäßen Proteins kann beispielsweise
erzielt werden durch die Expression einer entsprechenden anti
sense-RNA, einer sense-RNA zur Erzielung eines Cosuppressions
effektes oder die Expression eines entsprechend konstruierten
Ribozyms, das spezifisch Transkripte spaltet, die eines der
erfindungsgemäßen Proteine codieren, unter Verwendung der er
findungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle.
Vorzugsweise wird zur Reduzierung der Aktivität eines erfin
dungsgemäßen Proteins in pflanzlichen Zellen eine antisense-
RNA exprimiert.
Hierzu kann zum einen ein DNA-Molekül verwendet werden, das
die gesamte für ein erfindungsgemäßes Protein codierende Se
quenz einschließlich eventuell vorhandener flankierender Se
quenzen umfaßt, als auch DNA-Moleküle, die nur Teile der co
dierenden Sequenz umfassen, wobei diese Teile lang genug sein
müssen, um in den Zellen einen antisense-Effekt zu bewirken.
Es können im allgemeinen Sequenzen bis zu einer Mindestlänge
von 15 bp, vorzugsweise einer Länge von 100-500 bp, für eine
effiziente antisense-Inhibition insbesondere Sequenzen mit
einer Länge über 500 bp verwendet werden. In der Regel werden
DNA-Moleküle verwendet, die kürzer als 5000 bp, vorzugsweise
Sequenzen, die kürzer als 2500 bp sind.
Möglich ist auch die Verwendung von DNA-Sequenzen, die einen
hohen Grad an Homologie zu den Sequenzen der erfindungsgemäßen
DNA-Moleküle aufweisen, aber nicht vollkommen identisch sind.
Die minimale Homologie sollte größer als ca. 65% sein. Die
Verwendung von Sequenzen mit Homologien zwischen 95 und 100%
ist zu bevorzugen.
Gegenstand der Erfindung sind auch Maispflanzen, die erfin
dungsgemäße transgene Maispflanzenzellen enthalten. Die Er
findung betrifft ebenfalls Vermehrungsmaterial der erfin
dungsgemäßen Pflanzen, insbesondere Samen.
Die erfindungsgemäßen transgenen Maispflanzenzellen und Mais
pflanzen synthetisieren aufgrund der Verringerung der Aktivi
tät eines der erfindungsgemäßen Proteine eine Stärke, die bei
spielsweise in ihren physikalisch-chemischen Eigenschaften,
insbesondere dem Amylose/Amylopektin-Verhältnis, dem Verzwei
gungsgrad, der durchschnittlichen Kettenlänge, dem Phosphatge
halt, dem Verkleisterungsverhalten, der Stärkekorngröße
und/oder der Stärkekornform im Vergleich zu in Wildtyp-Pflan
zen synthetisierter Stärke verändert ist. Diese Stärke kann
beispielsweise veränderte Viskositäten und/oder Gelbil
dungseigenschaften ihrer Kleister zeigen im Vergleich zu
Stärke aus Wildtyp-Pflanzen.
Gegenstand der Erfindung ist somit auch die aus den vorgehend
beschriebenen transgenen Maispflanzenzellen, Maispflanzen so
wie Vermehrungsmaterial erhältliche Stärke.
Die erfindungsgemäßen Stärken können nach dem Fachmann bekann
ten Verfahren modifiziert werden und eignen sich in unmodifi
zierter oder modifizierter Form für verschiedene Verwendungen
im Nahrungsmittel- oder Nicht-Nahrungsmittelbereich.
Grundsätzlich läßt sich die Einsatzmöglichkeit der Stärke in
zwei große Bereiche unterteilen. Der eine Bereich umfaßt die
Hydrolyseprodukte der Stärke, hauptsächlich Glucose und
Glucanbausteine, die über enzymatische oder chemische Verfah
ren erhalten werden. Sie dienen als Ausgangsstoff für weitere
chemische Modifikationen und Prozesse, wie Fermentation. Für
eine Reduktion der Kosten kann hierbei die Einfachheit und ko
stengünstige Ausführung eines Hydrolyseverfahrens von Bedeu
tung sein. Gegenwärtig verläuft es im wesentlichen enzymatisch
unter Verwendung von Amyloglucosidase. Vorstellbar wäre eine
Kosteneinsparung durch einen geringeren Einsatz von Enzymen.
Eine Strukturveränderung der Stärke, z. B. Oberflächenvergröße
rung des Korns, leichtere Verdaulichkeit durch geringeren Ver
zweigungsgrad oder eine sterische Struktur, die die Zugäng
lichkeit für die eingesetzten Enzyme begrenzt, könnte dies be
wirken.
Der andere Bereich, in dem die Stärke wegen ihrer polymeren
Struktur als sogenannte native Stärke verwendet wird, gliedert
sich in zwei weitere Einsatzgebiete:
Stärke ist ein klassischer Zusatzstoff für viele Nah
rungsmittel, bei denen sie im wesentlichen die Funktion
des Bindens von wäßrigen Zusatzstoffen übernimmt bzw.
eine Erhöhung der Viskosität oder aber eine erhöhte Gel
bildung hervorruft. Wichtige Eigenschaftsmerkmale sind
das Fließ- und Sorptionsverhalten, die Quell- und Ver
kleisterungstemperatur, die Viskosität und Dickungslei
stung, die Löslichkeit der Stärke, die Transparenz und
Kleisterstruktur, die Hitze-, Scher- und Säurestabilität,
die Neigung zur Retrogradation, die Fähigkeit zur Film
bildung, die Gefrier/Taustabilität, die Verdaulichkeit
sowie die Fähigkeit zur Komplexbildung mit z. B. anorgani
schen oder organischen Ionen.
In diesem großen Bereich kann die Stärke als Hilfsstoff
für unterschiedliche Herstellungsprozesse bzw. als Zu
satzstoff in technischen Produkten eingesetzt. Bei der
Verwendung der Stärke als Hilfsstoffist hier insbeson
dere die Papier- und Pappeindustrie zu nennen. Die Stärke
dient dabei in erster Linie zur Retardation
(Zurückhaltung von Feststoffen), der Abbindung von Füll
stoff- und Feinstoffteilchen, als Festigungsstoff und zur
Entwässerung. Darüber hinaus werden die günstigen Eigen
schaften der Stärke in bezug auf die Steifigkeit, die
Härte, den Klang, den Griff, den Glanz, die Glätte, die
Spaltfestigkeit sowie die Oberflächen ausgenutzt.
Innerhalb des Papierherstellungsprozesses sind vier An
wendungsbereiche, nämlich Oberfläche, Strich, Masse und
Sprühen, zu unterscheiden.
Die Anforderungen an die Stärke in bezug auf die Oberflä
chenbehandlung sind im wesentlichen ein hoher Weißegrad,
eine angepaßte Viskosität, eine hohe Viskositätsstabili
tät, eine gute Filmbildung sowie eine geringe Staubbil
dung. Bei der Verwendung im Strich spielt der Feststoff
gehalt, eine angepaßte Viskosität, ein hohes Bindevermö
gen sowie eine hohe Pigmentaffinität eine wichtige Rolle.
Als Zusatz zur Masse ist eine rasche, gleichmäßige, ver
lustfreie Verteilung, eine hohe mechanische Stabilität
und eine vollständige Zurückhaltung im Papierfließ von
Bedeutung. Beim Einsatz der Stärke im Sprühbereich sind
ebenfalls ein angepaßter Feststoffgehalt, hohe Viskosität
sowie ein hohes Bindevermögen von Bedeutung.
Ein großer Einsatzbereich der Stärken besteht in der
Klebstoffindustrie, wo man die Einsatzmöglichkeiten in
vier Teilbereiche gliedert: die Verwendung als reinem
Stärkeleim, die Verwendung bei mit speziellen Chemikalien
aufbereiteten Stärkeleimen, die Verwendung von Stärke als
Zusatz zu synthetischen Harzen und Polymerdispersionen
sowie die Verwendung von Stärken als Streckmittel für
synthetische Klebstoffe. 90% der Klebstoffe auf Stärke
basis werden in den Bereichen Wellpappenherstellung, Her
stellung von Papiersäcken, Beuteln und Tüten, Herstellung
von Verbundmaterialien für Papier und Aluminium, Herstel
lung von Kartonagen und Wiederbefeuchtungsleim für Brief
umschläge, Briefmarken usw. eingesetzt.
Ein großes Einsatzfeld für die Stärken als Hilfmittel und
Zusatzstoff ist der Bereich Herstellung von Textilien und
Textilpflegemitteln. Innerhalb der Textilindustrie sind
die folgenden vier Einsatzbereiche zu unterscheiden: Der
Einsatz der Stärke als Schlichtmittel, d. h. als Hilfs
stoff zur Glättung und Stärkung des Klettverhaltens zum
Schutz gegen die beim Weben angreifenden Zugkräfte sowie
zur Erhöhung der Abriebfestigkeit beim Weben, Stärke als
Mittel zur Textilaufrüstung vor allem nach qualitätsver
schlechternden Vorbehandlungen, wie Bleichen, Färben
usw., Stärke als Verdickungsmittel bei der Herstellung
von Farbpasten zur Verhinderung von Farbstoffdiffusionen
sowie Stärke als Zusatz zu Kettungsmitteln für Nähgarne.
Der vierte Einsatzbereich ist die Verwendung der Stärken
als Zusatz bei Baustoffen. Ein Beispiel ist die Herstel
lung von Gipskartonplatten, bei der die im Gipsbrei ver
mischte Stärke mit dem Wasser verkleistert, an die Ober
fläche der Gipsplatte diffundiert und dort den Karton an
die Platte bindet. Weitere Einsatzbereiche sind die Bei
mischung zu Putz- und Mineralfasern. Bei Transportbeton
werden Stärkeprodukte zur Verzögerung der Abbindung ein
gesetzt.
Ein weiterer Markt für die Stärke bietet sich bei der
Herstellung von Mitteln zur Bodenstabilisation an, die
bei künstlichen Erdbewegungen zum temporären Schutz der
Bodenpartikel gegenüber Wasser eingesetzt werden. Kombi
nationsprodukte aus der Stärke und Polymeremulsionen sind
nach heutiger Kenntnis in ihrer Erosions- und ver
krustungsmindernden Wirkung den bisher eingesetzten Pro
dukten gleichzusetzen, liegen preislich aber deutlich un
ter diesen.
Ein Einsatzbereich liegt bei der Verwendung der Stärke in
Pflanzenschutzmitteln zur Veränderung der spezifischen
Eigenschaften der Präparate. So kann die Stärke zur Ver
besserung der Benetzung von Pflanzenschutz- und Düngemit
teln, zur dosierten Freigabe der Wirkstoffe, zur Umwand
lung flüssiger, flüchtiger und/oder übelriechender Wirk
stoffe in mikrokristalline, stabile, formbare Substanzen,
zur Mischung inkompatibler Verbindungen und zur Verlänge
rung der Wirkdauer durch Verminderung der Zersetzung ein
gesetzt werden.
Ein weiteres Einsatzgebiet besteht im Bereich der Phar
maka, Medizin und Kosmetikindustrie. In der pharmazeuti
schen Industrie kann die Stärke als Bindemittel für Ta
bletten oder zur Bindemittelverdünnung in Kapseln einge
setzt werden. Weiterhin kann die Stärke als Tabletten
sprengmittel dienen, da sie nach dem Schlucken Flüssig
keit absorbieren und nach kurzer Zeit soweit quellen, daß
der Wirkstoff freigesetzt wird. Medizinische Gleit- und
Wundpuder basieren aus qualitativen Gründen auf Stärke.
Im Bereich der Kosmetik werden Stärken beispielsweise als
Träger von Puderzusatzstoffen, wie Düften und Salicyl
säure eingesetzt. Ein relativ großer Anwendungsbereich
für die Stärke liegt bei Zahnpasta.
Einen Einsatzbereich bietet die Stärke als Zusatzstoff zu
Kohle und Brikett. Kohle kann mit einem Stärkezusatz
quantitativ hochwertig agglomeriert bzw. brikettiert wer
den, wodurch ein frühzeitiges Zerfallen der Briketts ver
hindert wird. Der Stärkezusatz liegt bei Grillkohle zwi
schen 4 und 6%, bei kalorierter Kohle zwischen 0,1 und
0,5%. Des weiteren gewinnen Stärken als Bindemittel an
Bedeutung, da durch ihren Zusatz zu Kohle und Brikett der
Ausstoß schädlicher Stoffe deutlich vermindert werden
kann.
Die Stärke kann ferner bei der Erz- und Kohleschlammauf
bereitung als Flockungsmittel eingesetzt werden.
Ein weiterer Einsatzbereich besteht als Zusatz zu Gieße
reihilfsstoffen. Bei verschiedenen Gußverfahren werden
Kerne benötigt, die aus Bindemittel-versetzten Sänden
hergestellt werden. Als Bindemittel wird heute überwie
gend Bentonit eingesetzt, das mit modifizierten Stärken,
meist Quellstärken, versetzt ist.
Zweck des Stärkezusatzes ist die Erhöhung der Fließfe
stigkeit sowie die Verbesserung der Bindefestigkeit. Dar
über hinaus können die Quellstärken weitere produk
tionstechnische Anforderungen, wie im kalten Wasser dis
pergierbar, rehydratisierbar, gut in Sand mischbar und
hohes Wasserbindungsvermögen, aufweisen.
In der Kautschukindustrie kann die Stärke zur Verbesse
rung der technischen und optischen Qualität eingesetzt
werden. Gründe sind dabei die Verbesserung des Oberflä
chenglanzes, die Verbesserung des Griffs und des Ausse
hens, dafür wird Stärke vor der Kaltvulkanisation auf die
klebrigen gummierten Flächen von Kautschukstoffen ge
streut, sowie die Verbesserung der Bedruckbarkeit des
Kautschuks.
Eine weitere Absatzmöglichkeit der modifizierten Stärken
besteht bei der Herstellung von Lederersatzstoffen.
Auf dem Kunststoffsektor zeichnen sich folgende Einsatz
gebiete ab: die Einbindung von Stärkefolgeprodukten in
den Verarbeitungsprozeß (Stärke ist nur Füllstoff, es
besteht keine direkte Bindung zwischen synthetischem Po
lymer und Stärke) oder alternativ die Einbindung von
Stärkefolgeprodukten in die Herstellung von Polymeren
(Stärke und Polymer gehen eine feste Bindung ein).
Die Verwendung der Stärke als reinem Füllstoff ist verglichen
mit den anderen Stoffen wie Talkum nicht wettbewerbsfähig. An
ders sieht es aus, wenn die spezifischen Stärkeeigenschaften
zum Tragen kommen und hierdurch das Eigenschaftsprofil der
Endprodukte deutlich verändert wird. Ein Beispiel hierfür ist
die Anwendung von Stärkeprodukten bei der Verarbeitung von
Thermoplasten, wie Polyäthylen. Hierbei werden die Stärke und
das synthetische Polymer durch Koexpression im Verhältnis von
1 : 1 zu einem ′master batch′ kombiniert, aus dem mit granu
liertem Polyäthylen unter Anwendung herkömmlicher Verfah
renstechniken diverse Produkte hergestellt werden. Durch die
Einbindung von Stärke in Polyäthylenfolien kann eine erhöhte
Stoffdurchlässigkeit bei Hohlkörpern, eine verbesserte Wasser
dampfdurchlässigkeit, ein verbessertes Antistatikverhalten,
ein verbessertes Antiblockverhalten sowie eine verbesserte Be
druckbarkeit mit wäßrigen Farben erreicht werden.
Eine andere Möglichkeit ist die Anwendung der Stärke in Po
lyurethanschäumen. Mit der Adaption der Stärkederivate sowie
durch die verfahrenstechnische Optimierung ist es möglich, die
Reaktion zwischen synthetischen Polymeren und den Hydroxygrup
pen der Stärken gezielt zu steuern. Das Ergebnis sind Poly
urethanfolien, die durch die Anwendung von Stärke folgende
Eigenschaftsprofile erhalten: eine Verringerung des Wärmeaus
dehnungskoeffizienten, Verringerung des Schrumpfverhaltens,
Verbesserung des Druck/Spannungsverhaltens, Zunahme der Was
serdampfdurchlässigkeit ohne Veränderung der Wasseraufnahme,
Verringerung der Entflammbarkeit und der Aufrißdichte, kein
Abtropfen brennbarer Teile, Halogenfreiheit und verminderte
Alterung. Nachteile, die gegenwärtig noch vorhanden sind, sind
verringerte Druckfestigkeit sowie eine verringerte Schlagfe
stigkeit.
Die Produktentwicklung beschränkt sich inzwischen nicht mehr
nur auf Folien. Auch feste Kunststoffprodukte, wie Töpfe,
Platten und Schalen, sind mit einem Stärkegehalt von über 50%
herzustellen. Des weiteren sind Stärke/ Polymermischungen gün
stig zu beurteilen, da sie eine sehr viel höhere biologische
Abbaubarkeit aufweisen.
Außerordentliche Bedeutung haben weiterhin auf Grund ihres ex
tremen Wasserbindungsvermögen Stärkepfropfpolymerisate gewon
nen. Dies sind Produkte mit einem Rückgrat aus Stärke und
einer nach dem Prinzip des Radikalkettenmechanismus aufge
pfropften Seitengitters eines synthetischen Monomers. Die
heute verfügbaren Stärkepfropfpolymerisate zeichnen sich durch
ein besseres Binde- und Rückhaltevermögen von bis zu 1000 g
Wasser pro g Stärke bei hoher Viskosität aus. Die Anwendungs
bereiche für diese Superabsorber haben sich in den letzten
Jahren stark ausgeweitet und liegen im Hygienebereich mit Pro
dukten wie Windeln und Unterlagen sowie im
landwirtschaftlichen Sektor, z. B. bei Saatgutpillierungen.
Entscheidend für den Einsatz der neuen, gentechnisch veränder
ten Stärken sind zum einen die Struktur, Wassergehalt, Pro
teingehalt, Lipidgehalt, Fasergehalt, Asche/Phosphatgehalt,
Amylose/Amylopektinverhältnis, Molmassenverteilung, Verzwei
gungsgrad, Korngröße und -form sowie Kristallinität, zum ande
ren auch die Eigenschaften, die in folgende Merkmale münden:
Fließ- und Sorptionsverhalten, Verkleisterungstemperatur, Vis
kosität, Dickungsleistung, Löslichkeit, Kleisterstruktur
und -transparenz, Hitze-, Scher- und Säurestabilität, Retrograda
tionsneigung, Gelbildung, Gefrier/Taustabilität, Komplexbil
dung, Jodbindung, Filmbildung, Klebekraft, Enzymstabilität,
Verdaulichkeit und Reaktivität.
Die Erzeugung modifizierter Stärken mittels gentechnischer
Eingriffe in einer transgenen Pflanze kann zum einen die
Eigenschaften der aus der Pflanze gewonnenen Stärke dahinge
hend verändern, daß weitere Modifikationen mittels chemischer
oder physikalischer Verfahren nicht mehr notwendig erscheinen.
Zum anderen können die durch gentechnische Verfahren verän
derte Stärken weiteren chemischen Modifikationen unterworfen
werden, was zu weiteren Verbesserungen der Qualität für be
stimmte der oben beschriebenen Einsatzgebiete führt. Diese
chemischen Modifikationen sind grundsätzlich bekannt. Insbe
sondere handelt es sich dabei um Modifikationen durch
- - Hitzebehandlung,
- - Säurebehandlung,
- - Oxidation und
- - Veresterungen,
welche zur Entstehung von Phosphat-, Nitrat-, Sulfat-,
Xanthat-, Acetat- und Citratstärken führen. Weitere organische
Säuren können ebenfalls zur Veresterung eingesetzt werden:
- - Erzeugung von Stärkeethern Stärke-Alkylether, O-Allylether, Hydroxylalkylether, O-Carboxylmethylether, N-haltige Stärkeether, P-haltige Stärkeether, S-haltige Stärkeether
- - Erzeugung von vernetzten Stärken
- - Erzeugung von Stärke-Pfropf-Polymerisaten.
Zur Expression der erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle in
sense- oder antisense-Orientierung in pflanzlichen Zellen wer
den diese mit regulatorischen DNA-Elementen verknüpft, die die
Transkription in pflanzlichen Zellen gewährleisten. Hierzu
zählen insbesondere Promotoren. Generell kommt für die Ex
pression jeder in pflanzlichen Zellen aktive Promotor in
Frage.
Der Promotor kann dabei so gewählt sein, daß die Expression
konstitutiv erfolgt oder nur in einem bestimmten Gewebe, zu
einem bestimmten Zeitpunkt der Pflanzenentwicklung oder zu
einem durch äußere Einflüsse determinierten Zeitpunkt. In Be
zug auf die Pflanze kann der Promotor homolog oder heterolog
sein. Sinnvolle Promotoren sind z. B. der Promotor der 35S RNA
des Cauliflower Mosaic Virus und der Ubiquitin-Promotor aus
Mais für eine konstitutive Expression, der Patatingen-Promotor
B33 (Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29) für eine
knollenspezifische Expression in Kartoffeln oder ein Promotor,
der eine Expression lediglich in photosynthetisch aktiven Ge
weben sicherstellt, z. B. der ST-LS1-Promotor (Stockhaus et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7943-7947; Stock
haus et al., EMBO J. 8 (1989), 2445-2451) oder für eine en
dosperm-spezifische Expression der HMG-Promotor aus Weizen,
der USP-Promotor, der Phaseolinpromotor oder Promotoren von
Zein-Genen aus Mais.
Ferner kann eine Terminationssequenz vorhanden sein, die der
korrekten Beendigung der Transkription dient sowie der Addi
tion eines Poly-A-Schwanzes an das Transkript, dem eine Funk
tion bei der Stabilisierung der Transkripte beigemessen wird.
Derartige Elemente sind in der Literatur beschrieben (vgl.
Gielen et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29) und sind beliebig aus
tauschbar.
Die vorliegende Erfindung stellt Nucleinsäuremoleküle zur Ver
fügung, die eine neue in Mais identifizierte Form einer lösli
chen Stärkesynthase codieren. Dies erlaubt nun sowohl die
Identifizierung der Funktion dieser Stärkesynthase bei der
Stärkebiosynthese, als auch die Herstellung gentechnisch ver
änderter Pflanzen, bei denen die Aktivität dieses Enzyms ver
ändert ist. Dies ermöglicht die Synthese einer Stärke mit ver
änderter Struktur und somit veränderten physikalisch-chemi
schen Eigenschaften in derartig manipulierten Pflanzen.
Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle können prinzipiell
auch dazu verwendet werden, Pflanzen herzustellen, bei denen
die Aktivität der erfindungsgemäßen Stärkesynthase erhöht oder
verringert ist und gleichzeitig die Aktivitäten anderer, an
der Stärkebiosynthese beteiligter Enzyme verändert sind. Dabei
sind alle Kombinationen und Permutationen denkbar. Durch die
Veränderung der Aktivitäten einer oder mehrerer Isoformen der
Stärkesynthasen in Pflanzen kommt es zur Synthese einer in ih
rer Struktur veränderten Stärke. Durch die Steigerung der Ak
tivität einer oder mehrerer Isoformen der Stärkesynthasen in
den Zellen der stärkespeichernden Gewebe transformierter
Pflanzen wie z. B. in dem Endosperm von Mais oder Weizen oder
in der Knolle bei der Kartoffel kann es darüber hinaus zu
einer Ertragssteigerung kommen. Beispielsweise können Nuclein
säuremoleküle, die für ein erfindungsgemäßes Protein codieren
oder entsprechende antisense-Konstrukte, in Pflanzenzellen
eingebracht werden, bei denen bereits die Synthese endogener
GBSS I-, SSS- oder GBSS II-Proteine aufgrund eines antisense-Effektes
oder einer Mutation inhibiert ist oder die Synthese
des Verzweigungsenzyms inhibiert ist (wie z. B. beschrieben in
WO92/14827 oder der ae-Mutante (Shannon und Garwood, 1984, in
Whistler, BeMiller und Paschall, Starch:Chemistry and Techno
logy, Academic Press, London, 2nd Edition: 25-86)).
Soll die Inhibierung der Synthese mehrerer Stärke-Synthasen in
transformierten Pflanzen erreicht werden, so können DNA-Mole
küle zur Transformation verwendet werden, die gleichzeitig
mehrere, die entsprechenden Stärkesynthasen codierenden Regio
nen in antisense-Orientierung unter der Kontrolle eines geeig
neten Promotors enthalten. Hierbei kann alternativ jede Se
quenz unter der Kontrolle eines eigenen Promotors stehen, oder
die Sequenzen können als Fusion von einem gemeinsamen Promotor
transkribiert werden. Letztere Alternative wird in der Regel
vorzuziehen sein, da in diesem Fall die Synthese der entspre
chenden Proteine in etwa gleichem Maße inhibiert werden
sollte.
Weiterhin ist die Konstruktion von DNA-Molekülen möglich, bei
denen neben DNA-Sequenzen, die Stärkesynthasen codieren, wei
tere DNA-Sequenzen, die andere Proteine, die an der Stärkesyn
these oder -modifikation beteiligt sind, in antisense-Orien
tierung an einen geeigneten Promotor gekoppelt sind. Die Se
quenzen können hierbei wiederum hintereinandergeschaltet sein
und von einem gemeinsamen Promotor transkribiert werden. Für
die Länge der einzelnen codierenden Regionen, die in einem
derartigen Konstrukt verwendet werden, gilt das, was oben be
reits für die Herstellung von antisense-Konstrukten ausgeführt
wurde. Eine obere Grenze für die Anzahl der in einem derarti
gen DNA-Molekül von einem Promotor aus transkribierten anti
sense-Fragmente gibt es nicht. Das entstehende Transkript
sollte aber in der Regel eine Länge von 10 kb, vorzugsweise
von 5 kb nicht überschreiten.
Codierende Regionen, die in derartigen DNA-Molekülen in Kombi
nation mit anderen codierenden Regionen in antisense-Orientie
rung hinter einem geeigneten Promotor lokalisiert sind, können
aus DNA-Sequenzen stammen, die für folgende Proteine codieren:
Stärkekorn-gebundene (GBSS I und II) und lösliche Stärke
synthasen (SSS I und II), Verzweigungsenzyme, "Debranching"-
Enzyme, Disproportionierungsenzyme und Stärkephosphorylasen.
Dies ist nur eine beispielhafte Aufzählung. Auch die Verwen
dung anderer DNA-Sequenzen im Rahmen einer derartigen Kombina
tion ist denkbar.
Mit Hilfe derartiger Konstrukte ist es möglich, in Pflanzen
zellen, die mit diesen transformiert wurden, die Synthese meh
rerer Enzyme gleichzeitig zu inhibieren.
Weiterhin können die Konstrukte in klassische Mutanten einge
bracht werden, die für ein oder mehrere Gene der Stärkebiosyn
these defekt sind (Shannon und Garwood, 1984, in Whistler,
BeMiller und Paschall, Starch:Chemistry and Technology, Aca
demic Press, London, 2nd Edition: 25-86). Diese Defekte können
sich auf folgende Proteine beziehen: Stärkekorn-gebundene
(GBSS I und II) und lösliche Stärkesynthasen (SSS I und II),
Verzweigungsenzyme (BE I und II), "Debranching"-Enzyme (R-En
zyme), Disproportionierungsenzyme und Stärkephosphorylasen.
Dies ist nur eine beispielhafte Aufzählung.
Mit Hilfe einer derartigen Vorgehensweise ist es weiterhin
möglich, in Pflanzenzellen, die mit diesen transformiert wur
den, die Synthese mehrerer Enzyme gleichzeitig zu inhibieren.
Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflan
zen stehen eine große Anzahl von Clonierungsvektoren zur Ver
fügung, die ein Replikationssignal für E.coli und ein Marker
gen zur Selektion transformierter Bakterienzellen enthalten.
Beispiele für derartige Vektoren sind pBR322, pUC-Serien,
M13mp-Serien, pACYC184 usw. Die gewünschte Sequenz kann an
einer passenden Restriktionsschnittstelle in den Vektor einge
führt werden. Das erhaltene Plasmid wird für die Transforma
tion von E.coli-Zellen verwendet. Transformierte E.coli-Zellen
werden in einem geeigneten Medium gezüchtet, anschließend ge
erntet und lysiert. Das Plasmid wird wiedergewonnen. Als Ana
lysemethode zur Charakterisierung der gewonnenen Plasmid-DNA
werden im allgemeinen Restriktionsanalysen, Gelelektrophoresen
und weitere biochemisch-molekularbiologische Methoden einge
setzt. Nach jeder Manipulation kann die Plasmid-DNA gespalten
und gewonnene DNA-Fragmente mit anderen DNA-Sequenzen ver
knüpft werden. Jede Plasmid-DNA-Sequenz kann in den gleichen
oder anderen Plasmiden cloniert werden.
Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle ste
hen eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung. Diese Techniken
umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA un
ter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacte
rium rhizogenes als Transformationsmittel, die Fusion von Pro
toplasten, die Injektion, die Elektroporation von DNA, die
Einbringung von DNA mittels der biolistischen Methode sowie
weitere Möglichkeiten.
Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzel
len werden an sich keine speziellen Anforderungen an die ver
wendeten Plasmide gestellt. Es können einfache Plasmide wie
z. B. pUC-Derivate verwendet werden. Sollen aber aus derartig
transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, ist
die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens notwendig.
Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanzen
zelle können weitere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Werden
z. B. für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri-
Plasmid verwendet, so muß mindestens die rechte Begrenzung,
häufig jedoch die rechte und linke Begrenzung der Ti- und Ri-
Plasmid T-DNA als Flankenbereich mit den einzuführenden Genen
verbunden werden.
Werden für die Transformation Agrobakterien verwendet, muß die
einzuführende DNA in spezielle Plasmide cloniert werden, und
zwar entweder in einen intermediären Vektor oder in einen bi
nären Vektor. Die intermediären Vektoren können aufgrund von
Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch
homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid der Agrobak
terien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den
Transfer der T-DNA notwendige vir-Region. Intermediäre Vekto
ren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines
Helferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium
tumefaciens übertragen werden (Konjugation). Binäre Vektoren
können sowohl in E.coli als auch in Agrobakterien replizieren.
Sie enthalten ein Selektionsmarker-Gen und einen Linker oder
Polylinker, welche von der rechten und linken T-DNA Grenzre
gion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien
transformiert werden (Holsters et al. Mol. Gen. Genet. 163
(1978), 181-187). Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium
soll ein Plasmid, das eine vir-Region trägt, enthalten. Die
vir-Region ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle
notwendig. Zusätzliche T-DNA kann vorhanden sein. Das derartig
transformierte Agrobakterium wird zur Transformation von
Pflanzenzellen verwendet.
Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzen
zellen ist intensiv untersucht und ausreichend in EP 120 516;
Hoekema, In: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerÿ
Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Chapter V; Fraley et al.,
Crit. Rev. Plant. Sci., 4, 1-46 und An et al. EMBO J. 4
(1985), 277-287 beschrieben worden.
Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen-
Explantate zweckmäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens
oder Agrobacterium rhizogenes kokultiviert werden. Aus dem
infizierten Pflanzenmaterial (z. B. Blattstücke, Stengelsegmen
te, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspensions-kulti
vierte Pflanzenzellen) können dann in einem geeigneten Medium,
welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierter
Zellen enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert wer
den. Die so erhaltenen Pflanzen können dann auf Anwesenheit
der eingeführten DNA untersucht werden. Andere Möglichkeiten
der Einführung fremder DNA unter Verwendung des biolistischen
Verfahrens oder durch Protoplastentransformation sind bekannt
(vgl. z. B. Willmitzer, L., 1993 Transgenic plants. In: Bio
technology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise (H.J. Rehm,
G. Reed, A. Pühler, P. Stadler, eds.), Vol. 2, 627-659, VCH
Weinheim-New York-Basel-Cambridge).
Während die Transformation dikotyler Pflanzen über Ti-Plasmid-
Vektorsysteme mit Hilfe von Agrobacterium tumefaciens wohl
etabliert ist, weisen neuere Arbeiten darauf hin, daß auch
monokotyle Pflanzen der Transformation mittels Agrobacterium
basierender Vektoren sehr wohl zugänglich sind (Chan et al.,
Plant Mol. Biol. 22 (1993), 491-506; Hiei et al., Plant J. 6
(1994), 271-282).
Alternative Systeme zur Transformation von monokotylen Pflan
zen sind die Transformation mittels des biolistischen An
satzes, die Protoplastentransformation, die Elektroporation
von partiell permeabilisierten Zellen, die Einbringung von DNA
mittels Glasfasern.
Spezifisch die Transformation von Mais wird in der Literatur
verschiedentlich beschrieben (vgl. z. B. WO 95/06128, EP
0 513 849; EP 0 465 875) . In EP 292 435 wird ein Verfahren be
schrieben, mit Hilfe dessen, ausgehend von einem schleimlosen,
weichen (friable) granulösen Mais-Kallus, fertile Pflanzen er
halten werden können. Shillito et al. (Bio/Technology 7
(1989), 581) haben in diesem Zusammenhang beobachtet, daß es
ferner für die Regenerierbarkeit zu fertilen Pflanzen notwen
dig ist, von Kallus-Suspensionskulturen auszugehen, aus denen
eine sich teilende Protoplastenkultur, mit der Fähigkeit zu
Pflanzen zu regenerieren, herstellbar ist. Nach einer in vitro
Kultivierungszeit von 7 bis 8 Monaten erhalten Shillito et al.
Pflanzen mit lebensfähigen Nachkommen, die jedoch Abnormalitä
ten in der Morphologie und der Reproduktivität aufweisen.
Prioli und Söndahl (Bio/Technology 7 (1989), 589) beschreiben
die Regeneration und die Gewinnung fertiler Pflanzen aus Mais-
Protoplasten der Cateto Mais-Inzuchtlinie Cat 100-1. Die Auto
ren vermuten, daß die Protoplasten-Regeneration zu fertilen
Pflanzen abhängig ist von einer Anzahl verschiedener Faktoren,
wie z. B. von Genotyp, vom physiologischen Zustand der
Donor-Zellen und von den Kultivierungsbedingungen.
Ist die eingeführte DNA einmal im Genom der Pflanzenzelle in
tegriert, so ist sie dort in der Regel stabil und bleibt auch
in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle er
halten. Sie enthält normalerweise einen Selektionsmarker, der
den transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegenüber einem
Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomy
cin, Hygromycin oder Phosphinotricin u. a. vermittelt. Der in
dividuelle gewählte Marker sollte daher die Selektion trans
formierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingeführte DNA
fehlt, gestatten.
Die transformierten Zellen wachsen innerhalb der Pflanze in
der üblichen Weise (siehe auch McCormick et al., Plant Cell
Reports 5 (1986), 81-84). Die resultierenden Pflanzen können
normal angezogen werden und mit Pflanzen, die die gleiche
transformierte Erbanlage oder andere Erbanlagen besitzen, ge
kreuzt werden. Die daraus entstehenden hybriden Individuen ha
ben die entsprechenden phänotypischen Eigenschaften. Von den
Pflanzenzellen können Samen gewonnen werden.
Es sollten zwei oder mehrere Generationen angezogen werden, um
sicherzustellen, daß das phänotypische Merkmal stabil beibe
halten und vererbt wird. Auch sollten Samen geerntet werden,
um sicherzustellen, daß der entsprechende Phänotyp oder andere
Eigenarten erhalten geblieben sind.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
In den Beispielen verwendete Medien und Lösungen:
20 × SSC:
175,3 g NaCl
88,2 g Natrium-Citrat
ad 1000 ml mit ddH₂O
pH 7,0 mit 10 N NaOH
175,3 g NaCl
88,2 g Natrium-Citrat
ad 1000 ml mit ddH₂O
pH 7,0 mit 10 N NaOH
YT:
8 g Bacto-Yeast extract
5 g Bacto-Tryptone
5 g NaCl
ad 1000 ml mit ddH₂O
8 g Bacto-Yeast extract
5 g Bacto-Tryptone
5 g NaCl
ad 1000 ml mit ddH₂O
Protoplastenisolierungsmedium (100 ml):
Cellulase Onozuka R S (Meÿi Seika, Japan)|800 mg | |
Pectolyase Y 23 | 40 mg |
KNO₃ | 200 mg |
KH₂PO₄ | 136 mg |
K₂HPO₄ | 47 mg |
CaCl₂ 2H₂O | 147 mg |
MgSO₄ 7H₂O | 250 mg |
Rinderserumalbumin (BSA) | 20 mg |
Glucose | 4000 mg |
Fructose | 4000 mg |
Saccharose | 1000 mg |
pH | 5,8 |
Osmolarität | 660 mosm |
Protoplastenwaschlösung 1: wie Protoplastenisolierlösung, aber
ohne Cellulase, Pectolyase und BSA
Transformationspuffer:
a) Glucose|0,5 M | |||
MES | 0,1% | ||
MgCl₂ 6 H₂O | 25 mM | ||
pH | 5,8 | ||
auf 600 mosm. einstellen @ | b) PEG 6000-Lösung: @ | Glucose | 0,5 M |
MgCl₂ 6 H₂O | 100 mM | ||
Hepes | 20 mM | ||
pH | 6,5 |
Dem obigen Puffer unter b) wird PEG 6000 kurz vor Gebrauch der
Lösung zugesetzt (40 Gew.-% PEG). Die Lösung wird durch ein
0,45 µm Sterilfilter filtriert.
W5 Lösung:
CaCl₂|125 mM | |
NaCl | 150 mM |
KCl | 5 mM |
Glucose | 50 mM |
Protoplasten-Kulturmedium (Angaben in mg/l):
KNO₃ | |
3000 | |
(NH₄)₂SO₄ | 500 |
MgSO₄ 7 H₂O | 350 |
KH₂PO₄ | 400 |
CaCl₂ 2 H₂O | 300 |
Fe-EDTA und Spurenelemente wie im Murashige-Skoog-Medium
(Physiol. Plant, 15 (1962), 473).
m-Inosit | |
100 | |
Thiamin HCl | 1,0 |
Nicotinsäureamid | 0,5 |
Pyridoxin HCl | 0,5 |
Glycin | 2,0 |
Glucuronsäure | 750 |
Galacturonsäure | 750 |
Galactose | 500 |
Maltose | 500 |
Glucose | 36 000 |
Fructose | 36 000 |
Saccharose | 30 000 |
Asparagin | 500 |
Glutamin | 100 |
Prolin | 300 |
Caseinhydrolysat | 500 |
2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) | 0,5 |
pH | 5,8 |
Osmolarität | 600 mosm |
In den Beispielen werden die folgenden Methoden verwendet:
Zur Clonierung in E.coli wurde der Vektor pBluescript II
SK (Stratagene) verwendet.
Für den Bluescript-Vektor und für die pUSP-Konstrukte
wurde der E.coli-Stamm DH5α (Bethesda Research Laborato
ries, Gaithersburgh, USA) verwendet. Für die in vivo
excision wurde der E.coli-Stamm XL1-Blue verwendet.
2-4 Tage, vorzugsweise 3 Tage nach dem letzten Me
diumswechsel einer Protoplastensuspensionskultur wird
das Flüssigmedium abgesaugt und die zurückbleibenden
Zellen mit 50 ml Protoplastenwaschlösung 1 gespült und
nochmals trockengesaugt. Zu jeweils 2 g der geernteten
Zellmasse wird 10 ml Protoplastenisolierungsmedium ge
geben. Die resuspendierten Zellen und Zellaggregate
werden bei 27 ± 2°C unter leichtem Schütteln (30 bis
40 rpm) 4 bis 6 h im Dunkeln inkubiert.
Sobald die Freisetzung von mindestens 1 Mio. Protopla
sten/ml erfolgt ist (mikroskopische Beobachtung), wird
die Suspension durch ein Edelstahl- und Nylonsieb von
200 bzw. 45 µm Maschenwerte gesiebt. Die Kombination
eines 100 µm und eines 60 µm Siebs ermöglicht die Ab
trennung der Zellaggregate genauso gut. Das protopla
stenhaltige Filtrat wird mikroskopisch beurteilt. Üb
licherweise enthält es 98-99% Protoplasten. Der
Rest sind unverdaute Einzelzellen. Protoplastenpräpa
rationen mit diesem Reinheitsgrad werden ohne zusätz
liche Gradientenzentrifugation für Transformationsex
perimente verwendet. Durch Zentrifugation (100 UpM im
Aufschwingrotor (100 × g, 3 min) werden die Protopla
sten sedimentiert. Der Überstand wird verworfen und
die Protoplasten in Waschlösung 1 resuspendiert. Die
Zentrifugation wird wiederholt und die Protoplasten
danach im Transformationspuffer resuspendiert.
Die in Transformationspuffer resuspendierten Protopla
sten werden bei einem Titer von 0,5-1×10⁶ Proto
plasten/ml in 10 ml Portionen in 50 ml
Polyallomer-Röhrchen eingefüllt. Die zur Transformation verwendete
DNA wird in Tris-EDTA (TE) Puffer gelöst. Pro ml Pro
toplastensuspension werden 20 µg Plasmid-DNA zugege
ben. Als Vektor wird dabei ein Phosphinotricinresi
stenz vermittelndes Plasmid verwendet (vgl. z. B.
EP 0 513 849). Nach der DNA-Zugabe wird die Protopla
stensuspension vorsichtig geschüttelt, um die DNA ho
mogen in der Lösung zu verteilen. Sofort danach wird
tropfenweise 5 ml PEG-Lösung zugetropft.
Durch vorsichtiges Schwenken der Röhrchen wird die
PEG-Lösung homogen verteilt. Danach werden nochmals 5
ml PEG-Lösung zugegeben und das homogene Durchmischen
wiederholt. Die Protoplasten verbleiben 20 min der
PEG-Lösung bei ± 2°C. Danach werden die Protoplasten
durch 3-minütiges Zentrifugieren (100 g; 1000 Upm) se
dimentiert. Der Überstand wird verworfen. Die Proto
plasten werden durch vorsichtiges Schütteln in 20 ml
W5-Lösung gewaschen und danach erneut zentrifugiert.
Danach werden sie in 20 ml Protoplastenkulturmedium
resuspendiert, nochmals zentrifugiert und erneut in
Kulturmedium resuspendiert. Der Titer wird auf 6 - 8 ×
10⁵ Protoplasten/ml eingestellt und die Protoplasten
in 3 ml Portionen in Petrischalen (⌀ 60 mm, Höhe 15
mm) kultiviert. Die mit Parafilm versiegelten Petri
schalen werden bei 25 ± 2°C im Dunkeln aufgestellt.
Während der ersten 2-3 Wochen nach der Protopla
stenisolierung und -transformation werden die Proto
plasten ohne Zugabe von frischem Medium kultiviert.
Sobald sich die aus den Protoplasten regenerierten
Zellen zu Zellaggregaten mit mehr als 20-50 Zellen
entwickelt haben, wird 1 ml frisches Protoplastenkul
turmedium zugegeben, das als Osmoticum Saccharose (90
g/l) enthält.
3-10 Tage nach der Zugabe von frischem Medium können
die aus Protoplasten entstandenen Zellaggregate auf
Agar-Medien mit 100 mg/1 L-Phosphinothricin plattiert
werden. N6-Medium mit den Vitaminen des Protoplasten
kulturmediums, 90 g/l Saccharose und 1,0 mg/l 2,4D ist
ebenso geeignet wie ein analoges Medium beispielsweise
mit den Makro- und Mikronährsalzen des MS-Mediums
(Murashige und Skoog (1962), siehe oben).
Auf dem Selektivmedium können die aus stabil transfor
mierten Protoplasten hervorgegangenen Kalli ungehin
dert weiterwachsen. Nach 3-5 Wochen, vorzugsweise 4
Wochen können die transgenen Kalli auffrisches Selek
tionsmedium transferiert werden, welches ebenfalls 100
mg/l L-Phosphinothricin enthält, das aber kein Auxin
mehr enthält. Innerhalb von 3-5 Wochen differenzie
ren ca. 50% der transgenen Maiskalli, die das L-Phos
phinothricinacetyltransferase-Gen in ihr Genom inte
griert haben, auf diesem Medium in Gegenwart von
L-Phosphinothricin erste Pflanzen.
Das embryogene transformierte Maisgewebe wird auf hor
monfreiem N6-Medium (Chu C.C. et al., Sci. Sin. 16
(1975) , 659) in Gegenwart von 5×10-4 M L-Phosphinothri
cin kultiviert. Auf diesem Medium entwickeln sich
Maisembryonen, die das Phsphinothricinacetyltransfe
rase-Gen (PAT-Gen) hinreichend stark exprimieren, zu
Pflanzen. Nicht transformierte Embryonen oder solche
mit nur sehr schwacher PAT-Aktivität sterben ab. So
bald die Blätter der in vitro-Pflanzen eine Länge von
4-6 mm erreicht haben, können diese in Erde transfe
riert werden. Nach Abwaschen von Agarresten an den
Wurzeln werden die Pflanzen in ein Gemisch von Lehm,
Sand, Vermiculit und Einheitserde im Verhältnis
3 : 1:1 : 1 gepflanzt und während der ersten 3 Tage nach
dem Verpflanzen bei 90-100% relativer Luft feuchte
an die Erdkultur adaptiert. Die Anzucht erfolgt in
einer Klimakammer mit 14 h Lichtperiode ca. 25000 Lux
in Pflanzenhöhe bei einer Tag/Nachttemperatur von 23 ±
1/17 ± 1°C. Die adaptierten Pflanzen werden bei einer
Luftfeuchte von 65 ± 5% kultiviert.
Die radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten wurde mit
Hilfe eines DNA-Random Primer Labelling Kits der Firma
Boehringer (Deutschland) nach den Angaben des Herstellers
durchgeführt.
Um eine neue lösliche Stärkesynthase aus Mais zu isolieren,
wurden polyclonale Antikörper gegen Peptid 1 hergestellt.
Peptid 1: NH₂-GTGGLRDTVENC-COOH (Seq. ID No. 3)
Dieses Peptid wurde an den KLH-Carrier ("keyhole limpet ho
mocyanin") gekoppelt und anschließend zur Herstellung polyclo
naler Antikörper in Kaninchen verwendet (Eurogentec, Seraing,
Belgien).
Der resultierende Antikörper wurde als anti-SSI bezeichnet.
Der Antikörper anti-SSI wurde anschließend verwendet, um eine
cDNA-Bibliothek aus Mais nach Sequenzen durchzumustern, die
lösliche Stärkesynthasen aus Mais codieren. Hierfür wurde eine
cDNA-Bibliothek aus Endosperm-polyA⁺ RNA, angelegt im Vektor
λ-ZAP, verwendet. Zur Analyse der Phagenplaques wurden diese auf
Nitrozellulosefilter übertragen, die vorher für 30-60 min. in
einer 10 mM IPTG-Lösung inkubiert und anschließend auf Filter
papier getrocknet wurden. Der Transfer erfolgte für 3 h bei
37°C. Anschließend wurden die Filter für 30 min. bei Raumtem
peratur in Blockreagenz inkubiert und zweimal für 5-10 min. in
TBST-Puffer gewaschen. Die Filter wurden mit dem polyclonalen
Antikörper anti-SS1 in geeigneter Verdünnung für 1 h bei Raum
temperatur oder für 16 h bei 4°C geschüttelt. Die Identifizie
rung von Plaques, die ein Protein exprimierten, das von dem
Antikörper anti-SS1 erkannt wurde, erfolgte mit Hilfe des
"Blotting detection kit for rabbit antibodies RPN 23"
(Amersham UK) nach den Angaben des Herstellers.
Phagenclone der cDNA-Bibliothek, die ein Protein exprimierten,
das von dem Antikörper anti-SS1 erkannt wurde, wurden unter
Anwendung von Standardverfahren weiter gereinigt. Mit Hilfe
der in vivo excision-Methode (Stratagene) wurden von positiven
Phagenclonen E.coli-Clone gewonnen, die ein doppelsträngiges
pBlueskript II SK-Plasmid mit der jeweiligen cDNA-Insertion
zwischen der EcoRI- und der Xho I-Schnittstelle des Polylinkers
enthalten. Nach Überprüfung der Größe und des Restriktionsmu
sters der Insertionen wurde ein geeigneter Clon einer Sequenz
analyse unterzogen.
Aus einem entsprechend Beispiel 1 erhaltenen E. coli-Clon
wurde das Plasmid pSSS1 isoliert und seine cDNA-Insertion
durch Standardverfahren mittels der Didesoxynucleotidmethode
(Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977),
5463-5467) bestimmt. Die Insertion ist 2383 bp lang und stellt eine
partielle cDNA dar. Die Nucleotidsequenz ist unter Seq ID No.
1 angegeben. Die korrespondierende Aminosäuresequenz ist unter
Seq ID No. 2 dargestellt.
Eine Sequenzanalyse und ein Sequenzvergleich mit bekannten Se
quenzen zeigte, daß die unter Seq ID No. 1 dargestellte Se
quenz neu ist und eine neue lösliche Stärkesynthase des Typs I
Aus Mais codiert. Die partielle codierende Region weist Homo
logie zu Stärkesynthasen aus verschiedenen Organismen auf,
insbesondere zu einer Stärksynthase aus Reis. Das durch diese
cDNA-Insertion oder durch hybridisierende Sequenzen codierte
Protein wird im Rahmen dieser Anmeldung als SSS1Zm bezeichnet.
Mit Hilfe dieser partiellen cDNA-Sequenz ist es für eine in
der Molekularbiologie erfahrene Person ohne weiteres möglich,
die gesamte codierende Region enthaltende Vollängenclone zu
isolieren und ihre Sequenzen zu bestimmen. Dazu wird z. B. eine
blattspezifische cDNA-Expressionsbank aus Zea mays, Linie B73
(Stratagene GmbH, Heidelberg), nach Standardverfahren mittels
Hybridisierung mit einem 5′-Fragment der cDNA-Insertion des
Plasmids pSSS1 (200 bp) auf Vollängen-Clone hin
durchgemustert. So erhaltene Clone werden sodann sequenziert.
Eine andere Möglichkeit zum Erhalt der noch fehlenden 5′-ter
minal gelegenen Sequenzen besteht in der Anwendung der 5′-Race
Methode (Stratagene o. vgl. Hersteller).
Claims (22)
1. Nucleinsäuremolekül, codierend ein Protein aus Mais mit
der biologischen Aktivität einer Stärkesynthase des Typs
I, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
- (a) Nucleinsäuremolekülen, die ein Protein codieren, das die unter Seq ID No. 2 angegebene Aminosäuresequenz umfaßt;
- (b) Nucleinsäuremolekülen, die die unter Seq ID No. 1 dar gestellte Nucleotidsequenz umfassen oder eine komple mentäre Sequenz oder eine korrespondierende Ribonucleo tidsequenz;
- (c) Nucleinsäuremolekülen, deren einer Strang mit den unter (a) oder (b) genannten Nucleinsäuremolekülen hybridi siert; und
- (d) Nucleinsäuremolekülen, deren Nucleotidsequenz aufgrund der Degeneration des genetisches Codes von der Sequenz der unter (a), (b) oder (c) genannten Nucleinsäuremole küle abweicht.
2. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, das ein DNA-Molekül
ist.
3. DNA-Molekül nach Anspruch 2, das ein cDNA-Molekül ist.
4. Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1, das ein RNA-Molekül
ist.
5. Oligonucleotid, das spezifisch mit einem Nucleinsäuremole
kül nach einem der Ansprüche 1 bis 4 hybridisiert.
6. Vektor, enthaltend ein DNA-Molekül nach einem der
Ansprüche 1 bis 3.
7. Vektor nach Anspruch 6, wobei das DNA-Molekül in sense-
Orientierung mit regulatorischen Elementen verknüpft ist,
die die Transkription und Synthese einer translatierbaren
RNA in pro- oder eukaryontischen Zellen gewährleisten.
8. Wirtszelle, die mit einem Nucleinsäuremolekül nach einem
der Ansprüche 1 bis 4 oder einem Vektor nach Anspruch 6
oder 7 transformiert ist oder von einer solchen Zelle ab
stammt.
9. Protein oder biologisch aktives Fragment davon, codiert
durch ein Nucleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1
bis 4.
10. Verfahren zur Herstellung eines Proteins nach Anspruch 9
oder eines biologisch aktiven Fragmentes davon, bei dem
eine Wirtszelle nach Anspruch 8 unter Bedingungen kulti
viert wird, die die Synthese des Proteins erlauben, und
das Protein aus den kultivierten Zellen und/oder dem Kul
turmedium isoliert wird.
11. Transgene Pflanzenzelle, die mit einem Nucleinsäuremolekül
nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder einem Vektor nach
Anspruch 6 oder 7 transformiert wurde oder die von einer
solchen Zelle abstammt, wobei das Nucleinsäuremolekül, das
das Protein mit der biologischen Aktivität einer Stärke
synthase codiert, unter der Kontrolle regulatorischer Ele
mente steht, die die Transkription einer translatierbaren
mRNA in pflanzlichen Zellen erlauben.
12. Pflanze, enthaltend Pflanzenzellen nach Anspruch 11.
13. Pflanze nach Anspruch 12, die eine Nutzpflanze ist.
14. Pflanze nach Anspruch 13, die eine stärkespeichernde
Pflanze ist.
15. Pflanze nach Anspruch 14, die eine Maispflanze ist.
16. Vermehrungsmaterial einer Pflanze nach einem der Ansprüche
12 bis 15, enthaltend Pflanzenzellen nach Anspruch 11.
17. Stärke, erhältlich aus einer Pflanze nach einem der
Ansprüche 12 bis 15 oder aus Vermehrungsmaterial nach
Anspruch 16.
18. Transgene Maispflanzenzelle, dadurch gekennzeichnet, daß
in dieser Pflanzenzelle die Aktivität eines Proteins nach
Anspruch 9 verringert ist.
19. Maispflanzenzelle nach Anspruch 18, wobei die Reduktion
der Aktivität in dieser Zelle durch die Expression einer
antisense-RNA zu Transkripten eines DNA-Moleküls nach An
spruch 1 erreicht wird.
20. Maispflanze, enthaltend Pflanzenzellen nach Anspruch 18
oder 19.
21. Vermehrungsmaterial einer Maispflanze nach Anspruch 20,
enthaltend Zellen nach Anspruch 18 oder 19.
22. Stärke, erhältlich aus Maispflanzen nach Anspruch 20 oder
aus Vermehrungsmaterial nach Anspruch 21.
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