KR20000011160A

KR20000011160A - 가용성 옥수수 전분 신타아제를 코딩하는 핵산분자

Info

Publication number: KR20000011160A
Application number: KR1019980709492A
Authority: KR
Inventors: 클라우스 프로흐베르그; 젠스 코스만
Original assignee: 플랜트테크 바이오테크날러지 게엠베하
Priority date: 1996-05-17
Filing date: 1997-05-16
Publication date: 2000-02-25
Also published as: AU2956997A; EP0904389A1; JP2000511049A; WO1997044472A1; US6635804B2; DE19619918A1; US6307124B1; AU725197B2; CA2255538A1; US20020088023A1

Abstract

본 발명은 옥수수에서 가용성 전분 신타아제를 코딩하는 핵산분자에 관한 것으로서,

핵산분자는 식물내 전분합성에 포함되는 효소를 코딩하며, 상기 효소는 옥수수의 가용성 전분 신타아제의 새로운 아이소타입인 것을 특징으로 하며,

본 발명은 또한 상기 핵산분자를 함유하는 벡터 및 상기 핵산분자로 형질전환된 숙주세포, 특히 상기 단백질의 증가되거나 감소된 활성을 나타내는 형질전환된 식물세포 또는 그로부터 재생가능한 식물에 관한 것이다.

Description

가용성 옥수수 전분 신타아제를 코딩하는 핵산분자

본 발명은 옥수수에서 가용성 전분 신타아제를 코딩하는 핵산분자에 관한 것이다. 그리고 본 발명은 상기 핵산분자로 형질전환된 식물세포, 상기 세포에서 재생할 수 있는 식물 뿐만 아니라 벡터 및 세균에 관한 것이다. 게다가 옥수수에서 가용성 전분 신타아제를 코딩하는 DNA 분자를 도입함으로 인해, 특성에 있어서 변성된 전분을 합성하는 트랜스제닉(transgenic) 식물을 제조하는 방법도 기술되어 있다.

원료의 재생원으로서 식물성 물질을 생각하는 중요성이 증가하는 것에 관련하여, 생물공학연구의 목적중 하나는 가공산업에 수요되기 위해 식물성 원료를 적응시키도록 노력하는 것이다. 가능한한 넓은 영역내에서 재생성 원료를 사용할 수 있기 위해, 매우 다양한 물질을 얻는 것이 또한 중요하다.

오일, 지방 및 단백질과 달리, 다당류는 식물에서 얻어지는 필수 재생성 원료를 구성한다. 셀룰로오스와 달리, 전분은 고급식물에서 가장 중요한 저장물질중 하나인 다당류중에서 중요한 위치를 유지한다. 상기중, 옥수수는 전분생성을 위한 가장 중요한 재배식물이기 때문에 가장 관심있는 식물중 하나다.

다당류 전분은 화학적으로 균일한 기본성분, 즉 글루코오스 분자로 이루어진 중합체이다. 그러나 상기는 중합정도와 글루코오스 사슬의 분지정도에 있어서 서로 다른 여러 종류의 분자로 매우 복잡한 혼합물을 구성한다. 그러므로 전분은 균일한 원료가 아니다. 특히, α-1,4-글리코시드적 가지형 글루코오스 분자로 이루어진 기본적으로 가지형이 아닌 중합체인 아밀로오스-전분과 차례로 여러 가지형 글루코오스 사슬의 복합혼합물인 아밀로펙틴-전분 사이에는 차이가 있다. 가지는 추가의 α-1,6-글리코시드 상호결합으로 인해 얻어진다. 옥수수 또는 감자와 같이 전분을 제조하는데 전형적으로 사용되는 식물에 있어서, 합성된 전분은 대략 25% 아밀로오스-전분 및 대략 75% 아밀로펙틴-전분으로 구성되어 있다.

전분을 가능한 여러 용도로 사용하기 위해, 여러 용도에 특히 적당한 변형된 전분을 합성할 수 있는 식물을 제공하는 것이 바람직하다. 교배법외에 상기 식물을 제공하는 한가지 가능한 방법은 재조합 DNA 기술로 전분-제조 식물의 전분대사를 유전적으로 특이 변형시키는 것이다. 그러나 상기를 위한 필요조건은 동정하고, 전분합성 및/또는 전분변형에 포함되는 효소를 특징화하는 것 뿐만 아니라 상기 효소들을 코딩하는 각 DNA 분자들을 분리하는 것이다.

전분을 제조하는 생화학 경로는 기본적으로 알려져 있다. 식물세포내 전분합성은 색소체안에서 일어난다. 광합성적으로 활성인 조직내에는 엽록체가 있고, 광합성적으로 비활성인 전분-저장 조직내에는 전분체가 있다.

전분합성에 포함되는 가장 중요한 효소는 분지 효소 뿐만 아니라 전분 신타아제이다. 전분 신타아제의 경우, ADP-글루코오스의 글루코실 잔기를 α-1,4-글루칸으로 이동시킴으로써 중합반응을 모두 촉진시키는 여러 아이소타입은 기술되어 있다. 분지효소는 α-1,6 분지가 선형 α-1,4-글루칸으로 도입되는 것을 촉진시킨다.

전분 신타아제는 입자-결합 전분 신타아제(GBSS) 및 가용성 전분 신타아제(SSS)의 두 그룹으로 나뉜다. 일부 전분 신타아제는 입자-결합성 뿐만 아니라 가용성이기 때문에 상기 분류는 항상 분명한 것은 아니다(Denyer 등, Plant J. 4 (1993), 191-198; Mu 등, Plant J. 6 (1994), 151-159). 상기 분류내에서, 여러 아이소타입이 여러 종류의 식물에 대해 기술되어 있다. 상기 아이소타입은 그들의 프라이머 분자에 대한 의존도(소위 "프라이머 의존성"(유형 Ⅱ) 및 "프라이머 비의존성"(유형 Ⅰ))에 있어서 서로 다르다.

이제까지는 아이소타입 GBSS Ⅰ의 경우에서만, 전분합성동안 그의 정확한 기능이 성공적으로 검증되었다. 상기 효소활성이 강하게 또는 완전히 감소된 식물은 아밀로오스가 없는 전분(소위 "찰(waxy)"전분)을 합성하며(Shure 등, Cell 35 (1983), 225-233; Visser 등, Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 289-296; WO 92/11376); 그러므로 상기 효소는 아밀로오스-전분을 합성하는데 있어서 결정적인 역할을 해 왔다. 상기 현상은 또한 녹조류 클라미도모나스 라인하르드티이(Chlamydomonas reinhardtii)의 세포에서 발견된다(Delrue 등, J. Bacteriol. 174 (1992), 3612-3620). 클라미도모나스의 경우, GBSS Ⅰ가 아밀로오스의 합성에 포함될 뿐만 아니라 아밀로펙틴 합성에 어느 정도 영향을 미친다는 것이 증명되었다. GBSS Ⅰ 활성을 나타내지 않는 돌연변이체에는, 긴 사슬 글루칸을 나타내는 정상적으로 합성된 아밀로펙틴의 특정 프랙션이 없다.

다른 아이소타입의 입자-결합 전분 신타아제, 특히 GBSS Ⅱ 및 가용성 전분 신타아제의 기능은 지금까지 명확하지 않다. 분지효소와 함께 가용성 전분 신타아제는 아밀로펙틴의 합성에 포함되고(예를 들어, Ponstein 등, Plant Physiol. 92 (1990), 234-241 참조), 전분합성 속도의 조절에 중요한 역할을 한다고 생각된다.

옥수수의 경우, 두 아이소타입의 입자-결합 전분 신타아제 뿐만 아니라 둘 또는 세 아이소타입의 가용성 전분 신타아제가 동정되었다(Hawker 등, Arch. Biochem. Biophys. 160 (1974), 530-551; Pollock and Preiss, Arch. Biochem. Biophys. 204 (1980), 578-588; MacDonald and Preiss, Plant Physiol. 78 (1985), 849-852; Mu 등, Plant J. 6 (1994). 151-159).

게놈 DNA 뿐만 아니라 옥수수에서 GBSS Ⅰ를 코딩하는 cDNA는 이미 공지되어 있다(Shure 등, Cell 35 (1983), 225-233; Kloesgen 등, Mol. Gen. Genet. 203 (1986), 237-244). 그리고, 소위 "발현 서열 Tag"(EST)도 공지되어 있으며(Shen 등, 1994, GenBank No.:T14684); 그로부터 유도된 아미노산 서열은 완두콩(Dry 등, Plant J. 2 (1992), 193-202) 및 감자(Edwards 등, Plant J. 8 (1995), 283-294)의 GBSS Ⅱ로부터 유도된 아미노산 서열과 강한 유사성을 나타낸다. 옥수수에서 다른 전분 신타아제 아이소타입을 코딩하는 핵산서열은 아직까지는 알려지지 않았다. GBSS Ⅰ과 다른 전분 신타아제를 코딩하는 cDNA 서열은 아직까지는 완두콩(Dry 등, Plant J. 2 (1992), 193-202), 벼(Baba 등, Plant Physiol. 103 (1993), 565-573) 및 감자(Edwards 등, Plant J. 8 (1995), 283-294)에 대해서만 알려져 있다.

가용성 전분 신타아제는 옥수수외에 여러 다른 식물종으로부터 동정되어왔다. 가용성 전분 신타아제는 예를 들어 완두콩(Denyer and Smith, Planta 186 (1992), 609-617) 및 감자(Edwards 등, Plant J. 8 (1995), 283-294)로부터 균일한 형태로 분리되었다. 상기 경우, SSS Ⅱ로서 동정된 가용성 전분 신타아제의 아이소타입은 입자-결합 전분 신타아제 GBSS Ⅱ와 같다는 것을 알았다(Denyer 등, Plant J. 4 (1993), 191-198; Edwards 등, Plant J. 8 (1995), 283-294). 다른 일부 식물종의 경우, 예를 들어 보리(Tyynela and Schulman, Physiologia Plantarum 89 (1993), 835-841; Kreis, Planta 148 (1980), 412-416) 및 밀(Rijven, Plant Physiol. 81 (1986), 448-453)의 경우 여러 SSS-아이소타입의 존재는 크로마토그래피 방법에 의해 알 수 있었다. 그러나 상기 단백질을 코딩하는 DNA 서열은 아직까지 알려지지 않았다.

변성 전분을 합성할 방법으로 소망의 전분-저장 식물을 변형시킬 수 있는 다른 가능성을 제공하기 위해, 전분 신타아제의 다른 아이소타입을 코딩하는 각 DNA 서열이 동정되었다.

그러므로 본 발명을 이루고 있는 기술적인 문제는 상기 효소의 증가되거나 또는 감소된 활성을 나타내는 유전적으로 변형된 식물이 제조되어 상기 식물에서 합성된 전분의 화학적 및/또는 물리적 특성에 있어서 변형을 촉진시키는 방법으로 전분 생합성에 포함되는 효소를 코딩하는 핵산분자를 제공하는 것이다.

상기 문제는 본 청구의 범위에 나타낸 구체예를 제공함으로써 해결된다.

그러므로 본 발명은 옥수수에서 Ⅰ형 가용성 전분 신타아제의 생물학적 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산분자에 관한 것으로서, 상기 분자들은 바람직하게 하기 서열번호 2로 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코딩한다. 본 발명은 특히, 서열번호 1로 나타낸 뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부로 이루어진 핵산분자, 바람직하게 서열번호 1, 또는 경우에 따라 상응하는 리보뉴클레오티드 서열로 나타낸 코딩영역으로 이루어진 분자에 관한 것이다.

본 발명은 또한 상기 분자의 상보적인 가닥 또는 상기 언급된 분자중 하나와 잡종화되는 한 가닥과 옥수수에서 가용성 전분 신타아제를 코딩하는 핵산분자에 관한 것이다. 옥수수에서 Ⅰ형 가용성 전분 신타아제를 코딩하는 핵산분자 및 유전코드의 퇴보로 인한 상기 분자의 뉴클레오티드 서열과 다른 서열도 또한 본 발명의 재료이다.

본 발명은 또한 상기 언급된 분자들의 서열의 전체 또는 일부와 상보적인 서열을 나타내는 핵산분자에 관한 것이다.

본 발명의 핵산분자는 RNA 분자 뿐만 아니라 DNA 분자이다. 상응하는 DNA 분자는 예를 들어 게놈 분자 또는 cDNA 분자이다. 본 발명에서, "잡종화"라는 용어는 종래의 잡종화조건, 바람직하게 Sambrook 등의 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY에 기술된 엄격한 조건하에서 잡종화하는 것을 의미한다.

본 발명의 핵산분자와 잡종화하는 핵산분자는 상기 분자로 이루어진 소망의 옥수수 식물로부터 유도될 수 있다.

본 발명의 핵산분자와 잡종화하는 핵산분자는 옥수수 식물 또는 옥수수 식물조직으로부터의 게놈 또는 cDNA 라이브러리에서 분리된다. 선택적으로 상기는 재조합 DNA 기술 또는 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다.

상기 핵산분자의 동정 및 분리는 본 발명의 분자들 또는 상기 분자의 일부, 또는 경우에 따라 표준법에 따른 잡종화에 의한 상기 분자들의 역상보 가닥을 사용하여 일어날 수 있다(Sambrook 등의 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 참조).

잡종화하기 위한 프로브로서, 서열번호 1로 나타낸 뉴클레오티드 서열 또는 그의 일부를 정확하게 또는 기본적으로 포함하는 핵산분자가 사용될 수 있다. 잡종화 프로브로서 사용된 단편은 또한 종래의 합성법에 의해 제조된 합성단편 및 본 발명의 핵산분자의 서열과 기본적으로 동일한 서열이다. 본 발명의 핵산분자를 잡종화하는 유전자를 동정하고 분리한후, 서열이 결정되고, 상기 서열에 의해 코딩되는 단백질의 특징이 분석되어야 한다.

본 발명의 핵산분자와 잡종화하는 분자는 또한 본 발명에 기술된 바와 같이 옥수수에서 가용성 전분 신타아제를 코딩하는 상기 핵산분자의 단편, 유도체 및 대립 변이체로 이루어진다. 상기에 대해, 단편은 상기 단백질중 하나를 코딩하기 위해 충분히 긴 핵산분자의 일부로서 정의된다. 본 명세서에서, 유도체라는 용어는 상기 분자의 서열이 하나 또는 그 이상의 위치에서 상기 핵산분자의 서열과 다르고, 이들이 상기 서열에 대해 고도로 상동성을 나타내는 것을 의미한다. 본 명세서에서, 상동성은 적어도 40%, 특히 적어도 60%의 서열 동일성, 바람직하게 80% 이상 및 더 바람직하게 90% 이상의 서열 동일성을 의미한다. 상기 핵산분자와 비교할 때 일탈은 결실, 치환, 삽입 또는 재조합에 의해 야기되었다.

게다가 상동성은 기능적 및/또는 구조적 같음이 각 핵산분자 또는 그들이 코딩하는 단백질사이에 존재한다는 것을 의미한다. 상기 분자 및 상기 분자의 대표적인 유도체에 상동하는 핵산분자는 대개 같은 생물학적 기능을 발휘하는 변형을 구성하는 상기 분자의 변이체이다. 상기 변이체는 자연적으로 발생하는 변이체, 예를 들어 다른 옥수수 변이체로부터 유도된 서열, 또는 돌연변이체이며, 상기 돌연변이체는 자연적으로 일어나거나, 또는 특이 돌연변이생성에 의해 도입되었다. 게다가 변이체는 합성적으로 제조된 서열일 수 있다. 대립 변이체는 자연적으로 발생할 뿐만 아니라 합성적으로 제조된 변이체이거나 또는 재조합 DNA 기술에 의해 제조된 변이체이다.

본 발명의 핵산분자의 여러 변이체에 의해 코딩되는 단백질은 통상의 특징을 나타낸다. 효소 활성, 분자량, 면역 반응성, 배좌 등은 상기 특성 뿐만 아니라 겔 전기영동, 크로마토그래피 특성, 침강계수, 용해도, 분광 특성, 안정도; pH-최적, 온도-최적 등과 같은 물리적 특성에 속한다. 전분 신타아제의 중요한 특성은 ⅰ)식물세포의 색소체의 스트로마 내에서의 정좌, ⅱ)기질로서 ADP-글루코오스를 사용한 선형 α-1,4-결합 폴리글루칸의 합성능력이다. 상기 활성은 Denyer 및 Smith(Planta 186 (1992), 606-617)에 나타난 바 또는 실시예에 기술된 바와 같이 측정될 수 있다.

본 발명의 핵산분자에 의해 코딩되는 단백질은 Ⅰ형("프라이머 비의존성")으로서 분류되는 옥수수에서 지금까지 동정되지 않고, 특징화되지 않은 종류의 가용성 전분 신타아제이다. 상기 전분 신타아제 또는 상기 단백질을 코딩하는 핵산분자는 지금까지 옥수수에서 알려지지 않았다. 코딩된 단백질은 벼의 가용성 전분 신타아제와 상동성을 나타낸다(Baba 등, Plant Physiol. 103 (1993), 565-573).

본 발명의 핵산분자중 하나와 특이적으로 잡종화하는 올리고뉴클레오티드는 또한 본 발명의 재료이다. 상기 올리고뉴클레오티드는 바람직하게 적어도 10, 특히 적어도 15, 더 바람직하게 적어도 50 뉴클레오티드의 길이를 가진다. 이들은 본 발명의 핵산분자와 특이적으로 잡종화하는 것, 즉 다른 단백질, 특히 다른 전분 신타아제를 코딩하는 핵산서열과 잡종화하지 않거나 소규모로 잡종화하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 PCR용 프라이머로 사용된다. 이들은 또한 안티센스-구조물의 성분 또는 적당한 리보자임을 코딩하는 DNA 분자이다.

게다가 본 발명은 벡터, 특히 플라스미드, 코스미드, 비루스, 박테리오파지 및 유전공학에 있어서 통상인 다른 벡터에 관한 것이며, 이들은 본 발명의 상기 핵산분자를 함유한다.

바람직한 구체예에서, 벡터내에 함유된 핵산분자는 원핵세포 또는 진핵세포내에서 해독가능한 RNA를 전사 및 합성하는 조절요소에 결합된다.

원핵세포, 예를 들어 대장균(Escherichia coli)에서 본 발명의 핵산분자의 발현은 상기 분자에 의해 코딩되는 효소의 효소적 활성의 보다 정확한 특징화를 가능하게 하는 한에 있어서 주 관심의 대상이 된다. 특히, 식물세포에서 전분합성에 포함되는 다른 효소의 부재하에서 각 효소에 의해 합성되는 생성물을 특징화할 수 있다. 이로써 식물세포내에서 전분합성하는 동안 각 단백질이 발휘하는 기능에 관해 결론을 도출해낼 수 있다.

게다가 종래의 분자-생물학 기술로 본 발명의 핵산분자로 다양한 돌여변이를 도입할 수 있으며(Sambrook 등의 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 참조), 이는 가능하게 변성된 생물학적 특성을 갖는 단백질을 합성한다. 상기에 의해, 결실 돌연변이를 제조할 수 있으며, 여기서 핵산분자는 코딩되는 DNA-서열의 5'- 또는 3'-말단에서 결실을 계속하여 생성된다. 상기 핵산분자는 대응하게 짧아진 단백질의 합성을 유도한다. 뉴클레오티드 서열의 5'-말단에서의 상기 결실은 예를 들어, 색소체내 효소의 전좌하는 아미노산 서열(전이 펩티드)을 확인할 수 있게 한다. 이는 세포기질내를 제외하고 색소체안에서 더 이상 각 서열이 제거되지 않고, 또는 다른 구획내에서 다른 신호서열이 추가되지 않는 효소를 특이적으로 생성시킨다.

한편, 점돌연변이는 또한 아미노산 서열의 변형이 예를 들어, 효소의 조절 또는 효소 활성에 영향을 미치는 위치에 도입될 수 있다. 상기 방법으로, 예를 들어 변형된 K_m-값을 갖는 돌연변이체 또는 세포내에서 보통 일어나는 알로스테릭 조절 또는 공유 변형에 의해 더 이상 조절되는 기작에 들어가지 않는 돌연변이체가 생성된다.

그리고 ADP-글루코오스대신에 기질로서 ADP-글루코오스-6-포스페이트를 이용하는 돌연변이체와 같은 변형된 기질 또는 생성물 특이성을 나타내는 돌연변이체가 생성된다. 그리고, 변형된 활성-온도 프로필을 갖는 돌연변이체가 생성된다.

원핵세포내 유전자 처리를 위해, 본 발명의 핵산분자 또는 상기 분자의 일부는 DNA 서열의 재조합에 의해 돌연변이생성 또는 서열변형을 일으키는 플라스미드내로 삽입된다. 표준방법(Sambrook 등의 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA 참조)에 의해 염기교환이 일어나거나, 또는 자연 또는 합성서열이 첨가된다. DNA 단편을 서로 연결하기 위해, 어댑터 또는 링커가 단편에 부착된다. 게다가 적당한 제한위치를 제공하거나 또는 여분의 DNA 또는 제한위치를 제거하는 처리를 사용할 수 있다. 삽입, 결실 또는 치환이 사용되는 곳이면 어디에나, 시험관내 돌연변이생성, '프라이머 복구', 제한 또는 결찰이 사용될 수 있다. 분석하기 위해서는 보통 서열분석, 제한분석 또는 그 외의 생화학-분자생물학적 방법이 사용된다.

다른 구체예에서, 본 발명은 숙주세포, 특히, 본 발명의 상기 핵산분자 또는 본 발명의 벡터에 의해 형질전환된 원핵세포 또는 진핵세포 뿐만 아니라 본 발명의 핵산분자 또는 본 발명의 벡터를 함유하고, 상기 방법으로 형질전환된 세포로부터 유도된 세포에 관한 것이다. 이는 세균 세포 또는 식물세포가 바람직하다.

게다가, 본 발명의 핵산분자에 의해 코딩된 단백질은 본 발명의 재료가 될 뿐만 아니라 본 발명의 숙주세포가 단백질을 합성하는 조건하에서 배양되고, 단백질은 배양된 세포 및/또는 배양배지로부터 분리되는 단백질 생성방법도 소재이다.

그러므로 본 발명은 또한 형질전환된, 즉 본 발명의 핵산분자로 유전적으로 변형된 트랜스제닉 식물세포 뿐만 아니라 본 발명의 핵산분자를 함유하고, 상기 방법으로 형질전환된 세포로부터 유도된 트랜스제닉 식물세포에 관한 것이다.

본 발명의 핵산분자를 제공함으로써, 재조합 DNA 기술에 의해 이제까지 불가능했던 식물의 전분대사를 이제는 다소 방해할 수 있다. 이에 의해, 전분대사는 물리-화학적 특징, 특히 아밀로오스/아밀로펙틴 비율, 분지정도, 평균사슬길이, 포스페이트 함량, 패스티피케이션 행동, 전분과립의 크기 및/또는 전분과립의 형태에 관해 야생형 식물에서 합성되는 전분과 비교했을 때 변형된, 즉 변형된 전분이 합성되는 방법으로 변형된다. 본 발명의 단백질 활성을 증가시킴으로써, 예를 들어 본 발명의 각 핵산분자를 과잉발현시키거나, 또는 그들의 활성에 관해 세포-특이 조절기구 및/또는 다른 온도-의존도에 더 이상 속하지 않는 돌연변이체를 제조함으로써 유전적으로 변형된 식물의 수득량을 증가시킬 수 있다. 옥수수 단독의 전분합성을 방해하는 기회의 경제적 중요성은 명백하며; 옥수수는 전분생성에 관해서는 세계에서 가장 중요한 식물이다. 세계적으로 연간 생산되는 전분의 약 80%는 옥수수에서 배출된다.

그러므로 각 가용성 전분 신타아제의 활성을 증가시키기 위해 식물세포내에서 본 발명의 핵산분자를 발현할 수 있다. 그리고 본 발명의 핵산분자는 세포-특이 조절기작에 더 이상 들어가지 않거나, 또는 변형된 온도-의존도 또는 기질 또는 생성물 특이성을 나타내는 본 발명의 전분 신타아제를 생성하기 위해 당업자에게 공지된 방법으로 변형된다.

본 발명의 세포는 본 발명의 핵산분자를 함유하며, 이는 조절 DNA 요소에 바람직하게 결합되고, 식물내에서 특히 프로모터와 함께 전사를 확실하게 한다. 상기 세포들은 상기 세포안에서 자연적으로 발생하지 않는 본 발명의 핵산분자를 함유하고, 또는 상기 분자가 다른 게놈 환경에서 자연적으로 발생하지 않는 세포의 게놈내 위치에 삽입된다는 점에서 자연적으로 발생하는 식물세포와 다르다.

식물내 본 발명의 핵산분자를 발현하는데 있어서, 합성된 단백질은 원칙적으로 식물세포내 소망의 구획내에 위치될 수 있다. 특정 구획내에 상기 단백질을 위치시키기 위해, 색소체내 정좌하는 서열이 결실되어야 하며, 남은 코딩영역은 각 구획내에 정좌하는 DNA 서열내에 선택적으로 결합되어야 한다. 상기 서열은 공지되어 있다(Braun 등, EMBO J. 11 (1992), 3219-3227; Wolter 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 846-850; Sonnewald 등, Plant J. 1 (1991), 95-106 참조).

본 발명의 다른 재료는 본 발명의 세포를 함유하는 식물이다. 이는 당업자에 공지된 방법으로 본 발명의 트랜스제닉 식물세포를 재생하여 얻어진다. 트랜스제닉 식물은 소망의 종류의 식물이며, 즉 쌍자엽 식물 뿐만아니라 단자엽 식물이다. 바람직하게 식물, 특히 곡류(호밀, 보리, 귀리, 밀 등), 벼, 옥수수, 완두콩, 카사바 또는 감자와 같은 전분-저장 식물 또는 전분-합성 식물이 유용한 식물이다. 본 발명은 또한 과실, 종자, 괴경, 뿌리-저장물, 실생식물, 벌채물(cuttings), 칼리(calli), 세포 배양체 등과 같은 본 발명의 세포들을 함유하는 본 발명의 식물의 증식물질에 관한 것이다.

본 발명의 트랜스제닉 식물세포, 식물 및 증식물질로부터 얻어질 수 있는 전분은 또한 본 발명의 재료가 된다.

발현 또는 경우에 따라 본 발명의 핵산분자의 추가의 발현으로 인해, 본 발명의 트랜스제닉 식물세포 및 식물은 야생형 식물내에서 합성된 전분에 비해 물리-화학적 특징, 특히 아밀로오스/아밀로펙틴 비율, 분지정도, 평균사슬길이, 포스페이트 함량, 패스티피케이션 행동, 전분과립의 크기 및/또는 전분과립의 형태면에서 변형된 전분을 합성한다. 야생형-전분과 비교할때, 상기 전분은 상기 전분의 점도 및/또는 아교의 겔형성 특성에 관해 특히 변형된다.

형질전환되지 않은 세포에 비해 본 발명의 단백질 활성이 감소된 트랜스제닉 옥수수 식물세포는 본 발명의 또다른 재료이다. 본 발명의 핵산분자에 의해, 본 발명의 단백질의 활성이 감소된 옥수수 식물세포 및 옥수수 식물을 제조할 수 있다. 야생형 식물세포의 전분과 비교할 때, 상기는 화학적 및/또는 물리적 특성에 있어서 변형된 전분을 합성한다.

본 발명의 단백질의 활성이 감소된 옥수수 식물세포의 생성은 본 발명의 핵산분자를 사용하여 본 발명의 단백질중 하나를 코딩하는 전사물을 특이적으로 제거하는 상응하게 구조된 리보자임의 발현 또는 공억제 효과를 얻기 위한 상응하는 안티센스-RNA, 센스-RNA의 발현에 의해 얻어질 수 있다.

공억제 효과에 의해 식물세포내에서 본 발명의 효소활성을 감소시키는 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 Jorgensen(Trends Biotechnol. 8 (1990), 340-344), Niebel 등(Curr. Top. Microbiol. Immunol. 197 (1995), 91-103), Flavell 등(Curr. Top. Microbiol. Immunol. 197 (1995), 43-46), Palaqui 및 Vaucheret(Plant. Mol. Biol. 29 (1995), 149-159), Vaucheret 등(Mol. Gen. Genet. 248 (1995), 311-317), de Borne 등(Mol. Gen. Genet. 243 (1994), 613-621) 및 다른 문헌에 기술되어 있다.

세포내에서 특정효소의 활성을 감소시키는 리보자임의 발현도 또한 당업자에게 공지되어 있으며, 이는 예를 들어 EP-B1 0 321 201에 기술되어 있다. 식물세포내 리보자임의 발현은 Feyter 등의 (Mol. Gen. Genet. 250 (1996), 329-338)에 기술되어 있다.

본 발명의 단백질 활성을 감소시키기 위해, 안티센스-RNA는 식물세포내에서 바람직하게 발현된다.

안티센스-RNA를 발현하기 위해, 세포내에서 안티센스-효과를 촉진하기 위해 충분히 길어야 하는 코딩서열의 일부로 구성된 DNA 분자 뿐만 아니라 가능하게 존재하는 플랭킹 서열을 포함하는 본 발명의 단백질을 코딩하는 완전한 서열로 구성된 DNA 분자가 사용될 수 있다. 기본적으로 15bp의 최소길이, 바람직하게 100-500bp의 길이를 갖고, 효과적인 안티센스-저해를 위한 서열, 특히 500bp 이상의 길이를 갖는 서열이 사용될 수 있다. 일반적으로 5000bp보다 짧은, 서열이 바람직하게 2500bp 이하의 길이를 갖는 DNA 분자가 사용된다.

또한 본 발명의 DNA 분자의 서열에 완전히 동일한 것을 제외하고는 매우 상동한 DNA 서열을 사용할 수 있다. 최소의 상동성은 약 65% 이상이어야 한다. 바람직하게 95 내지 100%의 상동성을 갖는 서열을 사용해야 한다.

본 발명의 트랜스제닉 옥수수 식물세포를 함유하는 옥수수 식물은 또한 본 발명의 재료이다. 본 발명은 또한 본 발명의 식물의 증식물질, 특히 종자에 관한 것이다.

상기 트랜스제닉 옥수수 식물세포, 옥수수 식물 및 증식물질에서 얻어질 수 있는 전분도 또한 본 발명의 재료이다.

본 발명의 단백질 활성의 감소로 인해, 트랜스제닉 옥수수 식물세포 및 옥수수 식물은 야생형 식물내에서 합성된 전분에 비해, 물리-화학적 특징, 특히 아밀로오스/아밀로펙틴 비율, 분지정도, 평균사슬길이, 포스페이트 함량, 패스티피케이션 행동, 전분과립의 크기 및/또는 전분과립의 형태면에서 변형된 전분을 합성한다. 야생형-전분과 비교하면, 상기 전분은 상기 전분의 아교의 점도 및/또는 겔형성 특성에 관해 특히 변형된다.

본 발명의 전분은 당 분야의 기술을 가진 자에게 공지된 방법에 의하여 식료품 및 비식료품 산업에 사용하기에 적당한 변형된 형태 뿐만 아니라 변형되지 않은 형태로 변형될 수 있다.

기본적으로, 전분의 용도는 두개의 주요분야로 세분화될 수 있다. 한 분야는 전분의 가수분해 생성물과, 특히 효소적 또는 화학적 처리에 의해 얻어지는 글루코오스 및 글루칸 성분으로 구성된다. 이것은 발효와 같은 화학적 변형 및 가공에 개시물질로서 이용될 수 있다. 상기에 있어서, 가수분해 과정이 간단하고 저비용으로 실시될 수 있다는 점이 중요하다. 현재에는, 이것은 아밀로글루코시다아제를 효소적으로 실시된다. 이것은 전분구조를 변화시키는 가수분해용 효소를 소량 사용하여, 예를 들어 사용된 효소에 대하여 접근성을 제한하는 입체구조 또는 적은 분지로 인한 향상된 소화성, 입자의 표면적을 증가시킴으로써 비용을 줄일 수 있다.

전분이 그의 천연전분으로서의 중합체 구조 때문에 사용되어지는 다른 분야는 두 개의 추가 영역으로 세분화될 수 있다.

1. 식료품으로서의 용도

전분은 본래 수성 첨가제를 결합할 목적으로 제공하고/또는 증가된 점도 또는 증가된 겔 형성을 야기하는 다양한 식료품용 전형적인 첨가제이다. 중요한 특징적 성질은 유동 및 흡착습성, 팽창 및 파스티피케이션 온도, 점도 및 농화 수행도, 전분의 용해도, 투명도 및 페이스트 구조, 열, 전단응력 및 산 내성, 퇴화 경향, 필름형성 능력, 냉동 및 해동에 대한 내성, 소화능 뿐만아니라 무기 또는 유기 이온과의 복합체 형성 능력이다.

천연전분의 바람직한 용도영역은 제과-식품 및 파스타 분야이다.

2. 비식품용으로서의 용도

용도의 다른 주요분야는 다양한 제조과정에서의 보조제 또는 기술적 제품내 첨가제로서의 전분의 용도이다. 보조제로서 전분을 사용하는 용도의 주요분야는, 우선, 종이 및 판지 산업이다. 이 분야에서, 전분은 주로 유지(고체회수), 충진제 및 미세과립 정립(sizing), 응고물로서 및 탈수에 사용된다. 게다가 강성, 경도, 소리, 그립, 광택, 부드러움, 찢는 강도 뿐만아니라 표면에 관한 전분의 유리한 성질이 이용된다.

2.1 종이 및 판지 산업

종이제조 과정에서는 표면, 코팅, 질량 및 분무로 용도가 네 분야로 분화될 수 있다. 표면처리에 관해 전분에 필요한 것은 본질적으로 고도의 밝기, 대응되는 점성도, 높은 점성도 안정성, 양호한 필름형성 뿐만아니라 먼지가 적게 형성되는 것이다. 고체 함유물을 코팅하는데 사용될때, 대응되는 점성, 높은 결합능력 뿐만 아니라 높은 색소 친화력이 중요한 역할을 한다. 부피(mass)에 대한 첨가제로서, 신속함, 균일함, 무손실 분산, 높은 기계적 안정성 및 종이 펄프내에서의 완전한 유지가 중요하다. 분무에 전분을 사용할때, 고체의 대응하는 함유량, 높은 점성도 뿐만 아니라 높은 결합능력이 또한 중요하다.

2.2 접착제 산업

적용되는 주요분야는, 이를테면, 접착제 산업인데, 적용분야는 4개의 영역으로 세분화된다: 순 전분아교로서의 용도, 특별한 화학물로 제조된 전분아교에 있어서의 용도, 합성수지 및 중합체 분산물에 대한 첨가제로서 전분의 용도 뿐만아니라 합성 접착체용 확장제로서 전분의 용도. 모든 전분계 접착제의 90%는 골판지, 종이 마대 및 백, 종이 및 알루미늄용 합성물질, 박스 및 봉투용 습윤아교, 스탬프 등을 제조하는데 사용된다.

2.3 직물 및 직물보호 제품

보조제 및 첨가제로서의 다른 가능한 용도는 직물 및 직물보호 제품의 제조에 있다. 직물산업에서는, 다음과 같은 네 개의 분야에서 분화될 수 있다: 직조시 활성인 장력에 대해 보호하기 위해 절삭행동을 약화 및 강화하는 것 뿐만 아니라 직조동안 내마모성을 증가시키기 위한 보조제와 같은 정립제로서의 용도, 표백, 염색등과 같은 질을 악화시키는 전처리후의 주로 직물 향상제로서의 용도, 염료 확산을 방해하기 위한 염료 페이스트의 제조시 농후제로서의 용도 및 실을 재봉하기 위한 워핑용 첨가제로서의 용도.

2.4 건축산업

그리고 전분은 건축재료에서 첨가제로서 사용되어질 수 있다. 한가지 예로서 석고반죽 보드의 제조인데, 여기서 얇은 회반죽에서 혼합된 전분은 물로 체이스트화되고, 석고보드의 표면에서 확산되어 판지를 보드와 결합시킨다. 적용되는 또다른 분야는 전분을 회반죽과 광물섬유에 혼합하는 것이다. 미리 혼합한 콘크리트에서, 전분은 정립처리를 감속하는데 사용된다.

2.5 지표 안정화

그리고, 전분은 인공적인 대지이동시 물에 대해 지표입자들을 일시적으로 보호하는데 사용되는 지표안정화 수단으로서 제작하는데 유리하다. 당 분야의 지식에 따라, 전분과 중합체 에멀션으로 구성된 조합제품은 지금까지 사용된 제품과 같이 부식-감소 및 외피화-감소 효과를 가지는 것으로 인지될 수 있으나, 이것은 상대적으로 덜 비싸다.

2.6 식물보호제 및 비료로서의 용도

적용되는 다른 분야로는 상기 제조물의 특별한 성질을 변형시키기 위한 식물보호제로서의 용도이다. 이를테면, 전분은 식물보호제 및 비료의 습윤도를 향상시키고, 활성 성분의 투여량을 방출하고, 액체, 휘발성 및/또는 냄새나는 활성 성분을 미정질의 안정하고 변형된 물질로 전환시키고, 양립불가능한 조성물을 혼합시키고, 및 감소된 분해로 인한 효과의 지속을 연장시키는데 이용된다.

2.7 약품, 의약품 및 화장품 산업

전분은 또한 약품, 의약품 및 화장품 산업의 분야에서 사용되어질 수 있다. 제약산업에서, 전분은 정제용 결합제와 캡슐에서 결합제의 희석을 위한 결합제로 사용되어질 수 있다. 또한, 전분은 삼킬때 유액을 흡수하여 단시간후에 부풀어 활성성분이 되도록 많이 방출되기 때문에 정제용 정제 분해물질로서 적당하다. 이러한 성질상의 이유로, 의약적 유동성(flowance)과 가루 분말이 다른 분야에서 적용되어진다. 화장품분야에서, 전분은 향기나 살리실산과 같은 분말 첨가제의 운반체로서 사용될 수 있다. 전분을 적용할수 있는 상대적으로 비싼 분야는 치약이다.

2.8 석탄 및 연탄에서 첨가제로서의 전분

석탄 및 연탄에서 첨가제로서의 전분의 용도도 또한 생각할 수 있다. 전분을 첨가함으로써, 석탄은 정량적으로 덩어리화 및/또는 고급 질의 연탄화될 수 있어 연탄의 조숙한 붕괴를 막을 수 있다. 바비큐 석탄은 4 내지 6%의 첨가된 전분, 칼로레이티드(calorated) 석탄 0.1 내지 0.5%를 함유한다. 또한, 석탄과 연탄에 전분을 첨가하면 유독성 물질의 방출이 감소하기 때문에 전분은 결합제로서 적당하다.

2.9 광석 및 석탄슬러리의 가공

전분은 광석 및 석탄슬러리의 가공시 응집제(flocculant)로서 사용될 수 있다.

2.10 주조시 첨가제로서의 전분

또 다른 적용분야는 주조시, 물질을 처리하는 첨가제로서의 용도이다. 다양한 주조처리를 위해, 결합제와 혼합된 모래에서 제조된 코어가 필요하다. 오늘날, 가장 통상 사용되는 결합제는 대부분이 팽윤 전분인, 변형된 전분과 혼합된 벤토나이트이다. 전분을 첨가하는 목적은 유동저항성을 증가시킬뿐만 아니라 결합강도를 향상시키는 것이다. 그리고 팽윤 전분은, 냉수에서의 분산능력, 재수화능력, 모래 내에서의 양호한 혼합능력 및 물과의 높은 결합능력과 같은, 제조공정을 위한 필요조건을 보다 잘 만족시킬 수 있다.

2.11 고무 산업

고무 산업에서 전분은 기술적 및 시각적 질을 향상시키기 위하여 사용되어진다. 그 이유는 표면광택, 그립 및 외관을 향상시키기 때문이다. 이러한 목적을 위해서, 전분은 냉 가황전에 고무체의 끈적이는 고무화 표면상에 분산되어진다. 이것은 또한 고무의 프린트능력을 향상시키기 위하여 사용되어진다.

2.12 가죽 대용품의 제조

변형된 전분을 적용할 수 있는 또 다른 분야는 가죽 대용품의 제조이다.

2.13 합성 중합체에서의 전분

플라스틱 시장에서 다음의 적용분야가 나타나고 있다: 전분에서 유도된 제품의 처리공정으로의 통합(전분은 단지 충진제일뿐이고, 합성중합체와 전분사이에는 직접적 결합이 없음), 또는 선택적으로 전분에서 유도된 제품의 중합체제조로의 통합(전분 및 중합체는 안정한 결합을 형성함).

순수한 충진제로서의 전분의 용도는 활석과 같은 다른 물질과는 필적할 수 없다. 이러한 상황은 특이 전분 성질이 효과적으로 되어 최종제품의 성질프로필이 명확하게 변화될때에는 다르다. 한가지 예로서 폴리에틸렌과 같이 열가소성 물질의 처리시 전분제품의 용도이다. 이것에 의해, 전분 및 합성중합체는 '마스타 배치(master batch)'를 형성하기 위해 공발현에 의해 1:1의 비율로 결합되고, 이로부터 다양한 제품이 입자화 폴리에틸렌을 사용한 통상의 기술에 의하여 제조된다. 폴리에틸렌 필름에서 전분의 완성은 중공체내 물질투과도를 향상시키고, 수증기의 투과도를 향상시키고, 정전기방지 행동을 향상시키고, 항블록 행동을 향상시킬 뿐만아니라 수성 염료와의 프린트능력을 향상시킨다.

또한 폴리우레탄 폼(foam)에서 전분을 이용할 수 있다. 전분 유도체의 적용 뿐만아니라 처리기술의 최적화로 인해, 합성 중합체와 전분의 히드록시기사이의 반응을 특이적으로 조절할 수 있다. 전분을 사용함으로써 다음의 성질 프로필을 가지는 폴리우레탄 필름이 수득된다: 감소된 열팽창계수, 감소된 수축작용, 향상된 압력/인장 행동, 물 흡수의 변화없이 증가된 수증기 침투도, 감소된 가연성 및 균열밀도, 감소되지 않은 가연성 부분, 없는 할로겐화물 및 감소된 노화. 현재까지 남아있는 단점이라면 압력 및 충격강도가 감소된다는 것이다.

필름의 제품개발은 선택적이 아니다. 또한 화분, 판 및 사발과 같은 고체 플라스틱 제품은 50% 이상의 전분함량으로 제조될 수 있다. 그리고 전분/중합체 혼합물은 매우 쉽게 생분해가능한 잇점을 제공한다.

그리고 그들의 물과의 우수한 결합력으로 인해 가장 중요한 전분결합 중합체가 얻어진다. 이들은 라디칼 사슬 기작의 원칙에 따라 결합된 합성 단량체의 측 격자 및 전분의 백본을 갖는 제품이다. 오늘날 사용가능한 전분결합 중합체는 높은 점성도에서 전분 1g당 물 1000g이상의 향상된 결합 및 보유능력이 특징이다. 상기 초흡수제는 종자 펠릿과 같은 농업 분야에서 뿐만 아니라 기저귀 및 종이와 같은 제품과 같은 위생분야에 주로 사용된다.

재조합 DNA 기술에 의해 변형된 전분의 용도에 결정적인 것은 구조, 물함량, 단백질 함량, 지방 함량, 섬유 함량, 재/인산 함량, 아밀로오스/아밀로펙틴 비율, 상대몰질량 분포, 분지정도, 입자크기 및 형태 뿐만 아니라 결정화이며, 한편, 하기의 특징을 얻는다: 흐름 및 흡착습성, 패스티피케이션 온도, 점성도, 농후화 행동, 용해도, 페이스트 구조, 투명도, 열, 전단력 및 내산성, 재분해하는 경향, 겔형성 능력, 냉동/해동에 대한 내성, 복합체 형성능력, 요오드 결합, 필름 형성, 접착강도, 효소 안정성, 소화력 및 반응성.

트랜스제닉 식물을 유전자 조작에 의해 변형된 전분을 제조함으로써 불필요한 화학적 또는 물리적 방법에 의해 또 다른 변형을 하는 방법으로 식물에서 얻어지는 전분의 특성을 변형시킬수 있다. 한편, 재조합 DNA 기술에 의해 변형된 전분은 또 다른 화학적 변형을 받을 수 있으며, 이는 상기 분야의 응용에 질적인 개선을 가져올 것이다. 상기 화학적 변형은 원래 당업자에 공지되어 있다. 특히 열처리, 산처리, 산화 및 에스테르화에 의한 변형은 인산염, 질산염, 황산염, 크산틴산염, 초산염 및 구연산염 전분의 형성을 유도한다. 다른 유기산은 또한 에스테르화에 사용되어질 수 있다:

―전분 에테르의 형성

전분 알킬 에테르, O-알릴 에테르, 히드록실알킬 에테르, O-카르복실메틸 에테르, N-함유 전분 에테르, P-함유 전분 에테르 및 S-함유 전분 에테르.

―분지된 전분의 형성

―전분결합 중합체의 형성.

식물세포내 센스-배향 또는 안티센스-배향에서 본 발명의 핵산분자를 발현하기 위해, 이들은 식물세포내에서 전사시키는 조절 DNA 요소에 보통 결합된다. 상기 조절 DNA 요소는 특히 프로모터이다. 기본적으로 식물세포내에서 활성인 프로모터는 발현에 사용될 수 있다.

프로모터는 식물발달 시간의 특정지점 또는 외부환경에 의해 결정된 시간지점에서 어떤 조직에서만 또는 구성적으로 일어나는 방법으로 선택된다. 식물에 관해, 프로모터는 상동하거나 이종성이다. 구성적인 발현을 위한 적당한 프로모터는 예를 들어 양배추 모자이크 바이러스의 35S RNA 프로모터 및 옥수수의 유비퀴틴 프로모터이다. 감자에서 괴경-특이 발현을 위해, 파타틴(patatin) 유전자 프로모터 B33(Rocha-Sosa 등, EMBO J. 8 (1989), 23-29)이 사용될 수 있다. 광합성적으로 활성인 조직에서만 발현시키는 프로모터는 예를 들어 ST-LS1 프로모터(Stockhaus 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7943-7947; Stockhaus 등, EMBO J. 8 (1989), 2445-2451)이다. 배유-특이 발현을 위해 밀의 HMG 프로모터, USP 프로모터, 파세올린(phaseolin) 프로모터 또는 옥수수의 제인(zein) 유전자의 프로모터가 적당하다.

그리고, 전사를 정확하게 끝내고, 전사물을 안정화시키는 것으로 사료되는 전사물에 폴리-A-꼬리를 첨가하는 종결서열이 존재한다. 상기 요소는 문헌(Gielen 등, EMBO J. 8 (1989), 23-29 참조)에 기술되어 있으며, 바람직하게 교환될 수 있다.

본 발명은 옥수수에서 동정되는 새로운 종류의 가용성 전분 신타아제를 코딩하는 핵산분자를 제공한다. 이는 효소활성이 변형된 유전적으로 변형된 식물의 생성 뿐만 아니라 전분 생합성에서 상기 전분 신타아제의 기능을 확인시킨다. 이로써 변형된 구조를 갖는 전분을 합성시킬 수 있으므로, 식물내 변형된 물리-화학적 특징은 상기 방법으로 조절된다.

원칙적으로, 본 발명의 전분 신타아제의 활성이 증가되거나 감소되고, 동시에 전분 생합성에 관련한 다른 효소의 활성이 변형되는 식물을 생산하기 위해 본 발명의 핵산 분자가 사용되어질 수 있다. 이 점에 있어서, 모든 종류의 치환과 과돌연변이가 생각되어질 수 있다. 식물내 전분 신타아제의 하나 또는 그이상의 아이소타입의 활성을 변형시켜, 구조에 있어서 변형된 전분의 합성을 일으켰다. 형질전환된 식물의 전분-저장 조직의 세포내 예를 들어, 옥수수 또는 밀의 배유내 또는 감자의 경우 괴경내 전분 신타아제의 하나 또는 그 이상의 아이소타입의 활성을 증가시켜, 또한 수득량을 증가시킨다. 예를들면, 본 발명의 단백질을 코딩하는 핵산 분자 또는 그에 상응하는 안티센스-구조물은 분지 효소의 합성이 억제되거나, 안티센스-효과나 돌연변이로 인해 su-유전자의 또는 내인성 GBSS Ⅰ-, SSS Ⅰ-, Ⅱ- 또는 GBSS Ⅱ-단백질의 합성이 이미 억제되는 식물 세포로 도입될 수 있다(예를 들어 WO92/14827에 기술된 것 또는 ae 변이체와 관련(Shannon and Garwood, 1984, in Whistler, BeMiller and Paschall, starch: Chemistry and Technology, Academic Press, London, 2^ndEdition 25-86참조)).

형질전환된 식물내 여러 전분 신타아제의 합성이 억제된다면, DNA 분자가 형질전환을 위해 사용되어질 수 있고, 동시에 적당한 촉진제에 의해 조절되고, 상응하는 전분 신타아제를 코딩하는 안티센스-배향의 다수 영역을 포함한다. 각 서열은 자신의 프로모터에 의해 선택적으로 제어될 수도 있고, 또는 다른 서열은 공통 프로모터로부터 융합될 때 전사되어질 수 있다. 마지막 대안은 상기 경우에서처럼 각 단백질 합성이 같은 정도로 저해되는 것이 바람직하다. 더구나, 전분 신타아제를 코딩하는 DNA 서열을 제외한 전분 합성이나 변형과 관계된 다른 단백질을 코딩하는 다른 서열로 구성된 분자를 제조할 수 있다. 상기 서열은 적당한 프로모터에 결합된다. 다시말해, 서열은 차례로 연결되어지고 공통 프로모터로부터 전사된다. 상기 구조물에 사용되는 단일 코딩영역의 길이에 대해, 상기 DNA 분자에서 한 프로모터로부터 전사되어지는 안티센스 단편의 갯수에는 상한(上限)이 없다. 그러나 얻은 전사물은 보통 10kb보다 길지 않고, 바람직하게 5kb보다 길지 않아야 한다.

상기 DNA 분자에서 적당한 프로모터의 아랫 방향흐름으로 다른 코딩 영역과 조합하여 위치되어지는 코딩 영역은 다음의 단백질을 코딩하는 DNA 서열로부터 유도되어진다: 입자-결합 전분 합성효소(GBSS Ⅰ 및 Ⅱ) 및 용해성 전분 신타아제(SSS Ⅰ 및 Ⅱ), 다른 가용성 전분 합성효소(SSS Ⅰ 및 Ⅱ), 분지효소, 탈분지효소, 불균형화 효소 및 전분 가인산분해효소. 상기 목록은 단지 예에 불과하다. 상기 조합의 구성 내에서 다른 DNA를 사용하는 것도 생각할 수 있다.

상기 구조물에 의해서 동시에 상기 구조물로 형질전환된 식물 세포 내에서 여러 효소의 합성을 억제할 수 있다.

더구나, 상기 구조물은 적어도 하나의 전분 생합성 유전자에 결함이 있는 종래의 변이체에 도입될 수 있다(Shannon and Garwood, 1984, in Whistler, BeMiller and Paschall, Starch: Chemistry and Technology, Academic Press, London, 2^ndedition: 25-86). 상기 결함은 다음 단백질과 관련될 수 있다: 입자-결합(GBSS Ⅰ과 Ⅱ) 및 가용성 전분 합성효소(예를들면 SSS Ⅰ과 Ⅱ), 분지 효소(BE Ⅰ과 Ⅱ), 탈분지효소(R-유전자좌), 불균형화 효소 및 전분 가인산분해효소. 다시말해, 상기 목록은 단지 예에 불과하다.

상기 방법으로 처리하여, 형질전환된 여러 효소의 합성을 동시에 저해할 수 있다.

고등식물로 외래 유전자의 도입을 준비하기 위해, 형질전환된 세균 세포의 선별을 위한 마커 유전자와 E. coli를 위한 복제신호를 포함하는 많은 클로닝 벡터들이 이용가능하다. 상기 벡터의 예로는 pBR322, pUC 시리즈, M13mp 시리즈, pACYC184 등이 있다. 바람직한 서열은 적당한 제한 자리에서 벡터로 통합될 수 있다. 얻어진 플라스미드는 E. coli 세포의 형질전환을 위해 사용되어진다. 형질전환된 E. coli 세포는 적당한 배지내에서 배양된 후, 회수되고 분해된다. 플라스미드가 회복된다. 얻어진 플라스미드 DNA의 특징화를 분석하는 방법으로서 제한 분석, 겔 전기영동 및 다른 화학-분자생물학적 방법이 사용된다. 각 조작후에 플라스미드 DNA는 쪼개어지고, 얻어진 DNA 단편은 다른 DNA 서열에 결합될 수 있다. 각 플라스미드 DNA 서열은 동일한 플라스미드나 다른 플라스미드로 클론되어질 수 있다.

식물 숙주 세포로 DNA를 도입하기 위해, 광범위한 기술이 사용된다. 상기 기술들은 형질전환 매개물로써 아그로박테륨 튬파시엔스이나 아그로박테륨 리조유전자(rhizogene)를 사용하여 T-DNA와의 식물 세포 형질전환, 원형질체 융합, DNA의 일렉트로포레이션(electroporation)과 주입법, 바이오리스틱(biolistic)법에 의한 DNA 도입 및 그외 가능한 다른 방법들을 포함한다. DNA의 식물 세포로의 일렉트로포레이션 및 주입의 경우에, 플라스미드를 사용하는데 특별한 요구 사항이 없다. pUC 유도체와 같은 간단한 플라스미드가 사용되어질 수 있다. 그러나, 전체 식물이 상기 방법으로 형질전환된 세포로부터 재생되어지는 경우에는 선별가능한 마커 유전자가 있어야 한다. 식물 세포로 바람직한 유전자를 도입하는 방법에 따라, 다른 DNA 서열이 필요하다. 예를 들어 식물 세포의 형질전환을 위해 Ti- 또는 Ri-플라스미드가 사용된다면, Ti- 또는 Ri-플라스미드 T-DNA의 적어도 오른쪽 경계, 바람직하게 오른쪽과 왼쪽 경계는 플랭킹(flanking) 영역으로써 도입되어지는 외래 유전자에 연결되어야 한다.

형질전환을 위해 아그로박테리아가 사용된다면, 통합되어지는 DNA는 특별한 플라스미드, 즉 매개 벡터나 이진(binary) 벡터로 클론되어야 한다. T-DNA내의 서열에 대한 서열상동성으로 인해, 매개 벡터는 상동 재조합에 기인한 아그로박테리아의 Ti- 또는 Ri-플라스미드로 통합되어질 수 있다. 상기는 또한 T-DNA의 이동에 필요한 vir-영역을 포함한다. 매개 벡터는 아그로박테리아내에서 복제될수 없다. 헬퍼 플라스미드에 의해 매개 벡터는 아그로박테륨 튬파시엔스으로 이동될 수 있다(결합). 이진 벡터는 아그로박테리아 뿐만 아니라 E. coli에서 복제될수 있다. 이들은 오른쪽과 왼쪽 T-DNA 경계 영역에 의해 만들어지는 링커 또는 폴리링커뿐만 아니라 선별가능한 마커 유전자를 포함한다. 이들은 아그로박테리아로 직접 형질전환될 수 있다(Holsters 등의 Mol. Gen. Genet. 163 (1978), 181-187). 숙주세포로서 작용하는 아그로박테리아는 vir-영역을 운반하는 플라스미드를 포함해야한다. vir-영역은 T-DNA의 식물 세포로의 이동을 위해 필요하다. 부가적인 T-DNA가 존재할 수 있다. 상기 방법으로 형질전환된 아그로박테륨은 식물 세포의 형질전환에 사용되어진다.

식물 세포의 형질전환을 위한 T-DNA의 용도는 유럽 특허 공보 제 EP 120 516호; Hoekeman, In: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam(1985), Chapter Ⅴ; Fraley 등의 Crit. Rev. Plant. Sci., 4, 1-46 및 An 등의 EMBO J. 4(1985), 277-287에 충분히 연구되어 설명되어 있다.

식물 세포로 DNA를 이동시키기 위해, 식물 외식(explant)은 아그로박테리아 튬파시엔스이나 아그로박테륨 리조유전자와 함께 적당히 공배양되어질 수 있다. 감염된 식물체(예를들면, 잎 조각, 줄기 조각, 뿌리 뿐만아니라 원형질체나 현탁 배양된 식물 세포)으로부터 전체 식물은 형질전환된 세포의 선별을 위해 항생물질이나 바이오지드를 함유하는 적당한 배지내에서 재생된다. 상기 방법으로 얻어진 식물은 도입된 DNA의 존재유무에 따라 검사되어진다. 원형질체를 형질전환하거나 바이오리스틱 방법을 사용함으로써 외래 DNA를 도입하기 위한 다른 가능성은 당업자에게 공지되어 있다(예를들면 Willmitzer, L., 1993 Transgenic plants. In: Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise(H. J. Rehm, G. Reed, A. Puhler, P. Stadler, editors), Vol. 2, 627-659, VCH Weinheim-New York-Basel-Cambridge 참조).

아그로박테륨 튬파시엔스에 의한 Ti-플라스미드 벡터 시스템을 통한 쌍자엽 식물의 형질전환이 확실히 이루어지는 반면에, 최근의 연구에서는 단자엽 식물의 경우에 아그로박테륨에 근거한 벡터에 의해 형질전환된다는 것을 알 수 있다(Chan 등의 Plant Mol. Biol. 22(1993), 491-506; Hiei 등의 Plant J. 6(1994), 271-282).

단자엽 식물의 형질전환을 위한 대안 시스템은 바이오리스틱 접근에 의한 형질전환, 원형질체 형질전환, 부분적으로 투과가능화된 세포의 일렉트로포레이션, 유리섬유에 의한 DNA 도입이다.

특히 옥수수의 형질전환을 다룬 관계 문헌은 다양하다(참고로 예를들면 WO95/06128, 유럽 특허 EP 0 513 849호; 유럽 특허 EP 0 465 875호). 유럽 특허 EP 292 435에 생식 식물이 무점액, 무른 과립질 옥수수 유합 조직으로부터 얻어질 수 있는 방법이 개시되어 있다. 상기 문헌에서 실리토(Shillito)등에 의해 (Bio/Technology 7 (1989) 581) 생식 식물을 재생하기 위해서, 식물로 재생이 가능하고, 원형질체를 나누는 배양액이 만들어질 수 있는 유합조직-현탁 배양액으로부터 시작할 필요가 있음을 알았다. 7개월 내지 8개월의 실험관내 배양 주기 후에 실리토 등은 생존가능한 후손을 가지는 식물을 얻었지만, 형태학과 생식력에 있어서 기형을 나타냈다.

프리올리(Prioli)와 쇤달(Soendahl)의 (Bio/Technology 7 (1989), 589)에는 카테토(Cateto) 옥수수 근교계 Cat 100-1의 옥수수 원형질체로부터 시작하여 생식 식물을 재생시키고, 얻는 방법이 기술되어 있다. 상기 저자는 원형질체가 생식 식물로 재생하는 것은 배양조건과 주개-세포의 생리학적 상태, 유전자형과 같은 다수의 다양한 요인에 의존한다고 가정한다.

도입된 DNA가 식물세포의 게놈내에 통합되면, 보통 안정하게 계속하며, 원래 형질전환된 세포의 자손내에 남는다. 상기는 바이오지드(biozid)에 대한 내성 또는 카나마이신, G 418, 블레오마이신, 히그로마이신 또는 포스피노트리신 등과 같은 항생성에 대한 내성을 형질전환된 식물세포에 전달하는 선별가능한 마커를 보통 포함한다. 그러므로 개별적으로 선별된 마커는 도입된 DNA가 없는 세포에 대해 형질전환된 세포를 선별시켜준다.

형질전환된 세포는 식물내에서 보통의 방법으로 성장한다(또한 McCormick 등, Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84 참조). 수득한 식물은 보통의 방법으로 배양될 수 있으며, 동일한 형질전환된 유전적 형질 또는 다른 유전적 형질을 갖는 식물과 이종교배될 수 있다. 수득된 잡종은 각각 상응하는 표현형적 특징을 가진다.

표현형적 특징이 안정하게 유지되는지, 이동되는지 확실하게 하기 위해 두 개 또는 그 이상의 세 개가 배양되어야 한다. 그리고 종자는 상응하는 표현형 또는 다른 특징이 남을 것을 확인하기 위해 수확되어야 한다.

도 1은 벡터 pUBIbar를 모식적으로 나타냄.

유비퀴틴-Pro = 유비퀴틴 프로모터

인트론 = 옥수수의 인트론

nos = A.tumefaciens의 노팔린(nopalin)신타아제 유전자의 종결신호

35S = CaMV의 35S 프로모터

T35S = CaMV의 35S 종결자

도 2는 벡터 pUBI-bar-aMasy를 모식적으로 나타냄.

유비퀴틴-Pro = 유비퀴틴 프로모터

인트론 = 옥수수의 인트론

nos = A.tumefaciens의 노팔린 신타아제 유전자의 종결신호

35S = CaMV의 35S 프로모터

T35S = CaMV의 35S 종결자

상기 벡터는 유비퀴틴 프로모터에 대해 안티센스-배향에서 실시예 1에 기술된 바와 같이 옥수수의 전분 신타아제를 코딩하는 cDNA를 함유한다.

본 실시예는 본 발명을 설명한다.

실시예에 사용되는 배지 및 용액:

20×SSC: NaCl 175.3g

시트르산 나트륨 88.2g

ddH₂O로 1000㎖ 첨가

10N NaOH로 pH 7.0으로 함

YT 박토-이스트 추출물 8g

박토-트립톤 5g

NaCl 5g

ddH₂O로 1000㎖ 첨가

원형질체 분리배지(100㎖)

셀룰라아제 오노주카(onozuka) R S(메이지 세이카, 일본) 800㎎

펙토리아제 Y 23 40㎎

KNO₃200㎎

KH₂PO₄136㎎

K₂HPO₄47㎎

CaCl₂2H₂O 147㎎

MgSO₄7H₂O 250㎎

소혈청 알부민(BSA) 20㎎

글루코오스 4000㎎

프룩토오스 4000㎎

수크로오스 1000㎎

pH 5.8

삼투압 660mosm.

원형질체 세척액 1: 원형질체 분리용액과 유사하나, 셀룰라아제, 펙토리아제 및 BSA가 없다.

형질전환 완충액:

a) 글루코오스 0.5M

MES 0.1%

MgCl₂6H₂O 25mM

pH 5.8

600mosm.으로 조정

b) PEG 6000-용액

글루코오스 0.5M

MgCl₂6H₂O 100mM

헤페스(Hepes) 20mM

pH 6.5

PEG 6000은 용액(40% w/v PEG)을 사용하기 바로 전에 b)에 기재된 완충액에 첨가된다. 이 용액은 0.45㎛ 멸균 여과기를 통해 여과된다.

W5 용액

CaCl₂125mM

NaCl 150mM

KCl 5mM

글루코오스 50mM

원형질체 배양배지(㎎/ℓ)

KNO₃3000

(NH₄)₂SO₄500

MgSO₄7H₂O 350

KH₂PO₄400

CaCl₂2H₂O 300

무라시게-스쿠그(Murashige-Skoog) 배지로서의 Fe-EDTA 및 미량원소(Physiol. Plant, 15 (1962), 473).

m-이노사이트 100

티아민 HCl 1.0

니코틴산 아미드 0.5

피리독신 HCl 0.5

글리신 2.0

글루쿠론산 750

갈락투론산 750

갈락토오스 500

말토오스 500

글루코오스 36,000

프룩토오스 36,000

수크로오스 30,000

아스파라긴 500

글루타민 100

프롤린 300

카세인가수분해물 500

2,4 디클로로페녹시 아세트산(2,4-D) 0.5

pH 5.8

삼투압 600mosm.

하기 실시예에서는 하기의 방법들이 사용되었다.

1. 클로닝 방법

E.Coli를 클로닝하기 위해 벡터 pBluescript Ⅱ SK(스트라타 유전자(stratagene))을 사용하였다.

2. 세균 균주

Bluescript 벡터 및 pUSP 구조물용으로 E.coli 균주 DH5α를 사용하였다(미국, 게이스버그의 베데스다 연구실험실). E.coli 균주 XL1-Blue는 생체조건내 절단에 사용하였다.

3. 옥수수의 형질전환

(a) 세포계통 DSM 6009의 원형질체 제조

원형질체 분리

원형질체 현탁배양시 배지를 마지막으로 교체하고 2-4일후, 바람직하게 3일후 액체배지를 빼내고, 남은 세포를 50㎖ 원형질체 세척액 1로 세척하고, 한번더 흡인건조시켰다. 채취된 세포덩어리 2g에 10㎖ 원형질체 분리배지를 첨가하였다. 재현탁된 세포와 세포집합물을 약하게 쉐이킹(30 내지 40rpm)하면서 27±2℃의 암실에서 4 내지 6시간동안 배양하였다.

원형질체 정제

1㎖당 적어도 만개(현미경적 조사)의 원형질체가 나오자마자 메쉬크기가 200 또는 45㎛인 스테인레스 스틸 또는 나일론 체를 통해 현탁액을 체친다. 세포 집합물을 적당하게 분리하기 위해 100㎛ 및 60㎛ 체를 함께 이용한다. 원형질체-함유 여과물을 현미경적으로 조사한다. 보통 98-99% 원형질체를 함유한다. 나머지는 소화되지 않은 단일세포들이다. 상기 정도의 순도를 갖는 원형질체 제조물은 추가의 구배 원심분리없이 형질전환 실험에 사용한다. 원형질체는 원심분리로 침강된다(회전 로터(100×g, 3분)내에서 100UpM). 상층액은 따라내고, 원형질체는 세척액 1내에서 재현탁된다. 원심분리를 반복하고, 계속해서 원형질체를 형질전환 완충액내에서 재현탁한다.

(b) 원형질체 형질전환

형질전환 버퍼내에서 재현탁된 원형질체를 0.5-1×10⁶원형질체/㎖의 적정기에서 50㎖ 폴리알로머 튜브내로 10㎖비율로 채운다. 형질전환에 사용된 DNA를 트리스-EDTA(TE) 완충액용액에 용해시킨다. 플라스미드 DNA 20㎍을 각 ㎖ 원형질체 현탁액에 첨가한다. 포스피노트리신에 내성을 제공하는 플라스미드는 벡터로서 이용한다(예를 들어 EP 0 513 849를 참조). DNA 첨가후, 용액내에 DNA가 균일하게 분포되도록 원형질체 현탁액을 조심스럽게 흔든다. 바로후에 5㎖ PEG 용액을 적상첨가한다.

조심스럽게 상기 튜브를 흔들어서 PEG 용액을 균일하게 분포시킨다. 그런후에 5㎖ PEG 용액을 첨가하고, 균일한 혼합을 반복한다. 원형질체를 PEG 용액내 ±2℃에서 20분동안 잔류시킨다. 후에 원형질체를 3분동안 원심분리하여 침강시킨다(100g; 1000Upm). 상층액은 따라낸다. 원형질체는 조심스럽게 흔들면서 20㎖ W5 용액내에서 세척하고, 다시 원심분리시킨다. 그리고나서 20㎖ 원형질체 배양배지내에서 재현탁하고, 다시한번 원심분리하고, 배양배지내에서 다시 재현탁시킨다. 적정기는 6-8×10⁵원형질체로 조정하고, 원형질체는 페트리 접시(Ø60㎜, 높이 15㎜)내에서 3㎖ 비율로 배양한다. 페트리 접시를 파라필름으로 밀봉하고, 25±2℃의 암실에서 저장한다.

(c)원형질체 배양

원형질체 분리 및 형질전환하고 처음 2-3주동안 신선한 배지를 첨가하지 않고 원형질체를 배양한다. 원형질체로부터 발생된 세포가 20 내지 50개의 세포 이상을 갖는 세포 집합물로 발전하자마자 삼투성 수크로오스(90g/ℓ)를 함유하는 1㎖ 신선한 원형질체 배양배지를 첨가한다.

(d)형질전환된 옥수수 세포의 선별 및 식물 재생

신선한 배지를 첨가하고 3-10일후, 원형질체로부터 발전한 세포 집합물을 100㎎/ℓ L-포스피노트리신을 갖는 한천배지상에 펼친다. 원형질체 배양배지, 수크로오스 90g/ℓ 및 2,4D 1.0㎎/ℓ를 갖는 N6-배지는 MS 배지의 다량- 및 미량-영양 염을 갖는 배지와 같이 유사한 배지로서 적당하다(무라시게 및 스쿠그(1962), 상기 참조).

안정하게 형질전환된 원형질체로부터 발달한 칼리는 선택적인 배지상에서 더 성장한다. 3 내지 5주후, 바람직하게 4주후, 트랜스제닉 칼리를 더 이상 옥신을 함유하지 않고, L-포스피노트리신 100㎎/ℓ을 함유하는 신선한 선별배지에 옮긴다. L-포스피노트리신-아세틸-트랜스퍼라아제 유전자가 그들의 게놈내에 통합된 트랜스제닉 옥수수 칼리의 약 50%는 3 내지 5주내에 L-포스피노트리신의 존재하에 상기 배지상에서 식물로 분화하기 시작한다.

(e)트랜스제닉 생식 식물의 성장

배발생 형질전환된 옥수수조직은 5×10^-4M L-포스피노트리신의 존재하에 호르몬이 없는 N6-배지(Chu C.C. 등, Sci. Sin. 16 (1975), 659)상에서 배양한다. 상기 배지상에서, 충분히 강한 방법으로 포스피노트리신-아세틸-트랜스퍼라아제 유전자(PAT 유전자)를 발현하는 옥수수 배는 식물로 발달한다. 형질전환되지 않은 배 또는 아주 약한 PAT 활성을 갖는 것은 죽는다. 실험관내 식물의 잎의 길이가 4 내지 6㎜가 되자마자 이들을 흙으로 옮긴다. 뿌리에 남아있는 한천을 세척한 후, 진흙, 모래, 질석 및 화분흙이 3:1:1:1의 비율로 있는 혼합물에 상기 식물을 심고, 심은후 첫 3일동안 90-100%의 상대 대기습도에서 흙배양에 적응시킨다. 성장은 23±1/17±1℃의 낮/밤 온도에서 식물높이에서 약 25000lux의 14시간 광주기를 갖는 기후챔버내에서 실시한다. 적응된 식물은 65±5% 대기습도에서 배양한다.

4.DNA 단편의 방사성 표시

DNA 단편의 방사성 표시는 제조자의 소개에 따라 보에링거(독일)제 DNA-무작위 프라이머 라벨링으로 실시하였다.

실시예 1

옥수수에서 전분 신타아제의 새로운 아이소타입을 코딩하는 cDNA의 동정, 분리 및 특징화

옥수수에서 가용성 전분 신타아제를 분리하기 위해 펩티드 1에 대한 폴리클론 항체를 제조하였다.

펩티드 1: NH₂-GTGGLRDTVENC-COOH (서열번호 3)

상기 펩티드를 KLH("키홀 림펫 호모시아닌(keyhole limpet homocyanin)" 담체에 결합시키고, 토끼(Eurogentec, Seraing, 벨기에)내 폴리클론 항체를 제조하는데 사용하였다.

얻은 항체는 안티-SS1으로 하였다.

계속해서, 옥수수에서 가용성 전분 신타아제를 코딩하는 서열용 옥수수의 cDNA 라이브러리를 선별하기 위해 안티-SS1 항체를 사용하였다. 상기를 위해, λ-ZAP 벡터내에서 구조된 배유 폴리A⁺RNA로부터의 cDNA 라이브러리를 사용하였다. 파지 플라크를 분석하기 위해, 30-60분동안 10mM IPTG 용액에서 배양하기 전에 니트로스셀룰로오스위에 상기를 옮기고, 여과지위에서 건조시켰다. 이동은 37℃에서 3시간동안 일어났다. 필터를 블록시약에서 실온에서 30분동안 배양하고, TBST 버퍼에서 5 내지 10분동안 2회 세척했다. 실온에서 1시간동안, 또는 4℃에서 16시간동안 적당한 희석액에서 폴리클론 항체 안티-SS1으로 필터를 쉐이킹하였다. 안티-SS1 항체에 의해 인지된 단백질이 발현된 플라크를 확인하는 것은 제조자의 소개에 따른 "토끼 항체 RPN 23용 블롯팅 검출 킷"(Amersham UK)으로 실시하였다.

안티-SS1에 의해 인지된 단백질을 발현하는 cDNA 라이브러리의 파지 클론은 표준방법에 따라 정제하였다. 생체내 절단방법(Stratagene)에 의해, 폴리링커의 Xho Ⅰ 및 EcoRⅠ사이에 삽입한 각 cDNA를 갖는 이중가닥 pBlueskript Ⅱ SK 플라스미드를 함유하는 E.coli 클론은 양성 파지 클론에서 얻었다. 삽입물의 크기 및 제한패턴을 체크한후, 적당한 클론을 서열분석하였다.

실시예 2

플라스미드 pSSS1의 cDNA 삽입물의 서열분석

플라스미드 pSSS1을 실시예 1에서 얻은 E.coli 클론으로부터 분리하고, 디데스옥시뉴클레오티드-방법(Sanger 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467)에 의해 표준경로로 그의 cDNA 삽입물을 측정하였다. 삽입물은 2383bp의 길이를 가지며, 부분적인 cDNA를 구성한다. 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1로 나타낸다. 상응하는 아미노산 서열은 서열번호 2로 나타낸다.

서열분석 및 공지된 서열과의 비교는 서열번호 1로 나타낸 서열이 새로우며, 옥수수의 Ⅰ형 가용성 전분 신타아제를 코딩하는 것을 나타낸다. 부분적인 코딩영역은 다른 여러 유기체의 전분 신타아제와 상동성을 나타내며, 특히 벼의 전분 신타아제와 상동성을 나타낸다. 상기 적용의 골격내에서, 상기 cDNA 삽입물 또는 잡종화 서열에 의해 코딩되는 단백질은 일명 SSS1Zm이다. 분자생물학 분야에 보통의 기술을 가진자들은 상기 부분적 cDNA 서열에 의해 완전한 코딩영역으로 구성된 완전한 길이의 클론을 분리하고, 다른 수고없이 서열을 결정할 수 있다. 상기와 같이 하기 위해, Zea mays의 잎-특이 cDNA 발현 라이브러리, 라인 B73(Stratagene GmbH, 하이델베르그)은 플라스미드 pSSS1(200bp)의 cDNA 삽입물의 5'-단편과의 잡종화에 의한 표준방법에 따라 완전한 길이의 클론으로 스크린된다. 상기 방법으로 얻어진 클론은 계속해서 서열화된다. 한편, 손실된 말단 5'-서열은 5'-레이스-방법(Stratagene 또는 다른 제조사)을 사용하여 얻어질 수 있다.

실시예 3

벡터 pUBI-bar-aMASY의 식물 형질전환 벡터의 구성 및 트랜스제닉 옥수수식물의 제조

본 발명의 핵산분자에 대한 안티센스-RNA를 코딩하는 식물 형질전환 벡터를 제조하기 위해, 벡터 pUBIbar(도 1 참조)를 제한효소 Hpal로 선형화하고, 알칼리 인산화효소로 탈인산화한다. 실시예 1에 따라 분리된 cDNA(약 2.4kb)를 선형화 벡터로 클론하고; cDNA를 EcoRV/Smal 단편으로서 pBluescriptSK 플라스미드에서 얻었다. 제한분석에 의해, 프로모터에 대해 안티센스-배향으로 옥수수의 전분 신타아제를 코딩하는 cDNA가 함유된 플라스미드를 동정하였다. 상기 플라스미드를 pUBI-bar-aMasy로 명명하였다. 상기 벡터는 유비퀴틴 프로모터 및 옥수수의 인트론(Christensen 등, Plant Mol. Biol. 18 (1992), 675-689), A.tumefaciens의 노팔린 신타아제 유전자의 전자종결 신호(Depicker 등, J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982), 561-573), Streptomyces hygroscopicus의 비알라포스(bialaphos) 내성 유전자의 코딩영역으로 구성된 bar 마커 유전자(Thompson 등, EMBO J. 6 (1987), 2519-2523) 뿐만 아니라 35S 프로모터 및 bar 유전자와 연결되는 CaMV의 종결자(Franck 등, Cell 21 (1980), 285-294)를 함유한다. 그리고 플라스미드는 인트론과 nos-종결자사이의 유비퀴틴 프로모터에 대한 안티센스-배향으로 옥수수의 전분 신타아제를 코딩하는 cDNA를 함유한다. 플라스미드는 도 2에 나타나 있다. 벡터 pUBI-bar-aMASY는 상기 방법으로 옥수수 원형질체에 도입되었다. 그럼으로써 4.8×10⁷원형질체 및 플라스미드 DNA 100㎍을 사용하였다.

408 포스피노트리신-내성 클론을 얻었다. 상기 중에서 40은 도입된 DNA의 발현에 관해 분석하였다. 결과는 얻은 클론중 12가 도입된 DNA로 발현된다는 것이다. 상기 클론중 6은 전체 식물로 재생되고, 온실로 옮겨졌다.

서열 목록

(1)일반적 정보 :

(ⅰ)출원인 :

(A)성명 : 플랜트테크 바이오테크날러지 게엠베하 포르스헝 앤드 엔트뷔클룽

(B)주소 : 헤르만스베르더 14

(C)도시 : 포츠담

(E)국가 : 독일

(F)우편번호 : 14195

(G)전화 : +49 30 83000760

(H)팩스 : +49 30 83000736

(ⅱ)발명의 명칭 : 옥수수의 가용성 전분 신타아제를 코딩하는 핵산분자

(ⅲ)서열수 : 3

(ⅳ)컴퓨터 해독 형태 :

(A)매개형태 : 플로피 디스크

(B)컴퓨터 : IBM PC 호환형

(C)운용체계 : PC-DOS/MS-DOS

(D)소프트웨어 : Patent In Release #1.0, Version #1.30(EPA)

(2)서열번호 1의 정보

(ⅰ)서열특성 :

(A)길이: 2383 염기쌍

(B)형: 뉴클레오티드

(C)쇄의 수 : 2 본쇄

(D)형태 : 직쇄상

(ⅱ)서열의 종류 : cDNA 내지 mRNA

(ⅲ)추정서열 : 아니오

(ⅳ)안티센스 : 아니오

(ⅵ)기원 :

(A)생물명 : Zea mays

(F)조직의 종류 : 배유

(ⅸ)서열의 특징 :

(A)이름/키이 : CDS

(B)위치 : 2..1950

(D)기타 정보 : /기능="전분합성"

/생성물="가용성 전분 신타아제"

(ⅹⅰ)서열 : 서열번호 1:

(2)서열번호 2의 정보

(ⅰ)서열 특성 :

(A)길이 : 649 아미노산

(B)형 : 아미노산

(D)형태 : 직쇄상

(ⅱ)서열의 종류 : 단백질

(ⅹⅰ)서열 : 서열번호 2:

(2)서열번호 3의 정보 :

(ⅰ)서열 특성 :

(A)길이 : 12 아미노산

(B)형 : 아미노산

(C)쇄의 수 : 1 본쇄

(D)형태 : 직쇄상

(ⅱ)서열의 종류 : 펩티드

(ⅲ)추정서열 : 예

(ⅳ)안티센스 : 아니오

(ⅴ)단편형 : 중간부 단편

(ⅹⅰ)서열 : 서열번호 3:

Claims

(가) 서열번호 2에 나타낸 아미노산으로 이루어진 단백질을 코딩하는 핵산분자;

(나) 서열번호 1에 나타낸 뉴클레오티드 서열 또는 상보서열 또는 상응하는 리보뉴클레오티드 서열로 이루어진 핵산분자;

(다) (가) 또는 (나)에서 언급된 핵산분자와 잡종화하는 가닥중 하나인 핵산분자; 및

(라) 유전코드의 퇴화로 인해 (가), (나) 또는 (다)에서 언급된 핵산분자의 서열로부터 벗어난 뉴클레오티드인 핵산분자로 구성된 그룹에서 선택되는 Ⅰ형 가용성 전분 신타아제의 생물학적 활성을 갖는 옥수수의 단백질을 코딩하는 핵산분자.
제 1 항에 있어서,

상기 핵산분자는 DNA 분자인 것을 특징으로 하는 핵산분자.
제 2 항에 있어서,

상기 DNA 분자는 cDNA 분자인 것을 특징으로 하는 핵산분자.
제 1 항에 있어서,

상기 핵산분자는 RNA 분자인 것을 특징으로 하는 핵산분자.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 핵산분자와 특이적으로 잡종화하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 DNA 분자를 함유하는 것을 특징으로 하는 벡터.
제 6 항에 있어서,

상기 DNA 분자는 원핵세포 또는 진핵세포에서 해독가능한 RNA의 합성 및 전사하는 조절요소에 대해 센스-배향으로 결합되는 것을 특징으로 하는 벡터.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 핵산분자 또는 제 6 항 또는 제 7 항의 벡터로 유전적으로 변형된 것을 특징으로 하는 숙주세포.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 핵산분자에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는 단백질.
제 8 항의 숙주세포가 단백질을 합성하기 위한 조건하에서 배양되고, 단백질이 배양된 세포 및/또는 배양배지로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 제 9 항의 단백질 또는 그의 생물학적으로 활성인 단편의 제조방법.
전분 신타아제의 생물학적 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산분자가 식물세포안에서 해독가능한 mRNA를 전사하는 조절요소를 조절하는데 사용되는 것을 특징으로 하는 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한항의 핵산분자 또는 제 6 항 또는 제 7 항의 벡터로 변형된 트랜스제닉 식물세포.
제 11 항의 식물세포로 이루어진 것을 특징으로 하는 식물.
제 12 항에 있어서,

유용한 식물인 것을 특징으로 하는 식물.
제 13 항에 있어서,

전분-저장 식물인 것을 특징으로 하는 식물.
제 14 항에 있어서,

옥수수 식물인 것을 특징으로 하는 식물.
제 11 항의 식물세포를 함유하는 것을 특징으로 하는 제 12 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항의 식물의 증식물질.
(가) 식물세포내에서 활성인 프로모터; 및

(나) (ⅰ) 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 핵산분자에 대해 안티센스-RNA를 코딩하는 핵산서열;

(ⅱ) 제 4 항의 RNA 분자를 특이적으로 제거하는 리보자임을 코딩하는 핵산서열; 및

(ⅲ) 발현으로 인해 공억제 효과를 내는 제 9 항의 단백질에 대해 센스-RNA를 코딩하는 핵산서열로 구성되고, 재조합 분자가 안정하게 삽입되는 게놈내에서, 형질전환되지 않은 세포에 비해 제 9 항의 단백질의 감소된 활성을 나타내는 트랜스제닉 옥수수 식물세포.
제 17 항의 식물세포를 함유하는 것을 특징으로 하는 옥수수 식물.
제 17 항의 식물세포를 함유하는 것을 특징으로 하는 제 18 항의 옥수수 식물의 증식물질.