CZ20004154A3 - Molekuly nukleových kyselin kódující enzymy z pšenice, které se podílejí na syntéze škrobu - Google Patents

Abstract

Řešení se týká molekul nukleových kyselin, kódujících enzymy, které se podílejí na syntéze škrobu v rostlinách. Tyto enzymy zahrnují rozpustné škrobové synthasy z pšenice. Dále se týká vektorů a hostitelských buněk obsahujících popsané molekuly nukleových kyselin, zejména transformovaných rostlinných buněk a rostlin, které je možno z těchto buněk regenerovat a které vykazují zvýšenou nebo sníženou aktivitu rozpustných škrobových synthas podle tohoto řešení.

Description

MOLEKULY NUKLEOVÝCH KYSELIN KÓDUJÍCÍ ENZYMY Z PŠENICE, KTERÉ SE PODÍLEJÍ NA SYNTÉZE ŠKROBU

Oblast techniky

Tento vynález se týká molekul nukleových kyselin, kódujích enzym z pšenice, který se podílí na syntéze škrobu v rostlinách. Tímto enzymem je rozpustná škrobová synthasa, typ I.

Dále se tento vynález týká vektorů, hostitelských buněk a rovněž rostlinných buněk a rostlin, které obsahují molekuly nukleových kyselin podle tohoto vynálezu.

Dále je popsán postup pro získávání transgenních rostlin, které po zavedení molekul nukleových kyselin podle tohoto vynálezu syntetizují škrob s jednou nebo více pozměněnými vlastnostmi.

Dosavadní stav techniky

V poslední době neustále stoupá význam rostlinných složek jako obnovitelných zdrojů surovin, a proto je jedním z úkolů biotechnologického výzkumu usilovat o přizpůsobení těchto rostlinných surovin požadavkům zpracovatelského průmyslu. Aby byla oblast použitelnosti těchto obnovitelných surovin co nej širší, je nezbytné kromě toho dosáhnout jejich maximální rozmanitosti.

Polysacharidy představují vedle olejů, tuků a proteinů

důležitou obnovitelnou rostlinnou surovinu. Nejdůležitější postavení mezi polysacharidy zaujímá vedle celulózy škrob, který je jednou z nejdůležitějších zásobních látek ve vyšších rostlinách. Jednou z nejdůležitějších kulturních rostlin je pšenice, z níž se získává 20 % z celkové výroby škrobu v evropském společenství.

Polysacharid škrob je polymerem skládajícím se z chemicky jednotných základních jednotek, a to z molekul glukosy. Přitom jde o velice složitou směs různých molekulárních forem, které se liší svým polymeračním stupněm, větvením glukosových řetězců a jejich délkou, a kterou je kromě toho možno derivatizovat, například fosforylovat. To tedy znamená, že škrob nepředstavuje jednotnou surovinu. Amylosa, která je tvořena v podstatě nerozvětveným polymerem skládajícím se z 1,4-glykosidicky vázaných molekul glukosy, se odlišuje od amylopektinu, který je tvořen komplexní směsí různě rozvětvených glukosových řetězců. Na tomto rozvětvení se podílejí i 1,6-glykosidické vazby. Škrob syntetizovaný v pšenici obsahuje cca 11 až 37 % amylosy.

Aby bylo možno zajistit pokud možno mnohostrannou použitelnost vhodných škrobů pro nejrůznější průmyslové účely, je zapotřebí mít k dispozici takové rostliny, které jsou schopny syntetizovat modifikované škroby, které by byly obzvláště vhodné pro různé účely použití. Jednou z možností pro získávání takovýchto rostlin jsou šlechtitelská opatření. Šlechtitelská opatření se však vzhledem k polyploidnímu charakteru pšenice (tetra- a hexaploid) uplatňují velmi obtížně. Teprve nedávno se podařilo křížením přírodních mutantů pšenice získat voskovitou waxy pšenici, která neobsahuje amylosu (Nakamura a spol., Mol. Gen. Genet. 248 (1995), 253 - 259).

Alternativou ke šlechtitelským opatřením je cílená genově-technologická modifikace rostlin produkujících škrob. Předpokladem k tomu však je identifikace a charakterizace enzymů, které se podílejí na syntéze nebo na modifikaci škrobu a rovněž izolace molekul nukleových kyselin, které tyto enzymy kódují.

Cesty biochemické syntézy vedoucí k výstavbě škrobu jsou v podstatě známy. Syntéza škrobu v rostlinných buňkách probíhá v plastidech. Ve fotosynteticky aktivních tkáních jsou to chloroplasty, ve fotosynteticky inaktivních škrobových zásobních tkáních to jsou amyloplasty.

Důležitými enzymy, podílejícími se na syntéze škrobu, jsou škrobové synthasy a rozvětvující enzymy. U škrobové synthasy byly popsány různé isoformy, které katalyzují všechny polymerační reakce přenosem glukosového zbytku z ADP-glukosy na α-l,4-glukan. Rozvětvující enzymy katalyz'ují zavedení a-2,6-rozvětvení do lineárního α-l,4-glukanu.

Škrobové synthasy je možno rozdělit do dvou tříd: škrobové synthasy vázané na škrobové zrno (granule-bound starch synthases; GBSS) a rozpustné škrobové synthasy (soluble starch synthases; SSS). Toto rozdělení není vždy jednoznačné, protože některé škrobové synthasy se vyskytují jak ve formě vázané na škrobová zrna, tak i v rozpustné formě (Denyer a spol., Plant J. 4 (1993), 191 - 198; Mu a spol. Plant J. 6 (1994), 151 - 159). U různých rostlinných druhů jsou v rámci těchto tříd popsány různé isoformy, které se, liší svou závislostí na molekule startéru (škrobové synthasy tzv. primer dependent (TypII) a primer independent (Typ I))· • · · · · « · · · • · · * · · · ♦ · · · · « · · · * · · · · • · · · · · · · · · · · • · · · · ··· ··· ·· ·· ··· ·· ···

Přesnou funkci při syntéze škrobu se doposud podařilo určit pouze u isoformy GBSS I, u níž je enzymová aktivita silně nebo úplně potlačena, při syntéze bezamylosového (tzv. waxy) škrobu (Shure a spol., Cell 35 (1983), 225 - 233; Visser a spol., Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 289 - 296; VO 92/11376), to znamená, že tento enzym má zřejmě rozhodující úlohu při syntéze amylosy. Tento jev byl pozorován i u buněk zelené řasy Chlamydomonas reinhardtii (Delrue a spol., J. Bacteriol. 174 (1992), 3612 - 3620). U Chlamydomonas bylo dále prokázáno, že GBSS I se nepodílí pouze na syntéze amylosy, ale že má vliv i na syntézu amylopektinu. U mutantů, které nevykazovaly žádnou GBSS I-aktivitu chybí určitá frakce, jinak normálně syntetizovaného amylopektinu, obsahující glukany s delším řetězcem.

Funkce jiných isoforem synthas, vázaných na škrobové zrno, zejména GBSS II, a rozpustných škrobových synthas, není dosud zcela jasná. Předpokládá se, že rozpustné škrobové synthasy spolu s rozvětvujícími enzymy se podílejí na syntéze amylopektinu (viz např. Ponstein a spol., Plant Physiol. 29 (1990), 234 - 241) a že mají důležitou funkci při regulaci rychlosti syntézy škrobu.

Ve pšenici byly na proteinové úrovni identifikovány minimálně dvě isoformy škrobové synthasy, vázané na škrobové zrno (60 kDA a 100 - 105 kDA), a jedna další isoforma, která zřejmě představuje rozpustnou škrobovou synthasu (Denyer a spol., Planta 196 (1995), 256 - 265; Rahman a spol., Aust. J. Plant Physiol. 22 (1995), 793 - 803). Existence několika SSS-isoforem byla prokázána pomocí chromatografických metod již dříve (Rijven, Plant Physiol. 81 (1986), 448 - 453).

Byla již popsána i jedna pšeničná GBSS I, kódující cDNA • · · · (Ainsworth a spolPlant Mol. Biol. 22 (1993), 67 - 82).

Sekvence nukleových kyselin, kódujících isoformy pšeničné škrobové synthasy, resp. dílčí sekvence těchto nukleových kyselin jsou popsány ve VO 97/45545.

Sekvence cDNA, kódující jiné škrobové synthasy než je GBSS I , byly dosud popsány pouze u hrachu (Dry a spol., Plant J. 2 (1992), 193 - 202), rýže (Baba a spol., Plant Physiol. 103 (1993), 565 - 573) a brambor (Edwards a spol., Plant J. 8 (1995), 283 - 294). Rozpustné škrobové synthasy byly kromě pšenice identifikovány i v řadě dalších rostlinných druhů. Rozpustné škrobové synthasy byly izolovány až do formy homogenního preparátu např. z hrachu (Denyer a Smith, Planta 186 (1992), 609 - 617) a brambor (Edwards a spol., Plant J. 8 (1995), 283 - 294).

Ukázalo se, že isoforma, která byla v těchto pracích označena jako SSS III , byla identická se škrobovou synthasou, vázanou na škrobová zrna GBSS II (Denyer a spol., Plant J. 4 (1993), 191 - 198; Edwards a spol., Plant J. 8 (1995), 283 - 294). U některých dalších rostlinných druhů byla přítomnost několika SSS-isofořem prokázána pomocí chromatograf ických metod, jako např. u ječmene (Tyynelá a Schulman, Physiologica Plantarum 89 (1993) 835 - 841; Kreis, Planta 148 (1980), 412 - 416). DNA-sekvence kódující tyto proteiny však dosud nebyly popsány.

Pro získání dalších možností pro provádění změn jakýchkoliv škrobnatých rostlin, přednostně obilí, a zejména pšenice tak, aby tyto rostliny syntetizovaly modifikovaný škrob, je zapotřebí identifikovat příslušné DNA-sekvence, které kódují další isoformy škrobových synthas.

Cílem tohoto předkládaného vynálezu byla příprava molekul nukleových kyselin, zejména nukleových kyselin z pšenice, které kódují enzymy, podílející se na biosyntéze škrobu a jejich pomocí získávat genově-technicky modifikované rostliny, které umožní výrobu rostlinných škrobů se změněnými chemickými a/nebo fyzikálními vlastnostmi.

Podstata vynálezu

Tento vynález se tedy týká molekul nukleových kyselin, kódujících proteiny s aktivitou rozpustné škrobové synthasy z pšenice, přičemž tyto molekuly kódují především proteiny, obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedenou pod Seq ID No.2. Tento vynález se zejména týká molekul nukleových kyselin, které obsahují nukleotidovou sekvenci uvedenou pod Seq ID No.l nebo její část, výhodně molekuly obsažené v kódujícím regionu uvedeném v Seq ID No.l, obvzláště výhodně nukleotid č.9 až 530 ze Seq ID No.l a rovněž příslušné ribonukleotidové sekvence.

Dále se tento vynález týká molekul nukleových kyselin hybridizovaných s jednou z molekul nukleových kyselin podle tohoto vynálezu.

Předmětem tohoto vynálezu jsou rovněž molekuly nukleových kyselin, které kódují rozpustnou škrobovou synthasu z pšenice a jejich sekvence, které se od nukleotidových sekvencí dříve popsaných molekul liší degenerací genetického kódu.

Tento vynález se týká rovněž molekul nukleových kyše7

lin, obsahujících sekvenci, která je komplementární k celým výše uvedeným sekvencím nebo jejich částem.

Pojem hybridizace znamená v rámci tohoto vynálezu hybridizaci za konvenčních hybridizačních podmínek, výhodně za přísně definovaných podmínek, popsaných například v publikaci Sambrook a spol., Molecular Cloning,

A Laboratory Manual, 2. vyd. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Obzvláště výhodně se hybridizace provádí za následuj ících podmínek:

Hybridizační pufr:

x SSC; 10 x roztok Denhardt (Fikoll 400 + PEG + BSA; poměr 1 : 1 : 1); 0,1 % SDS;

mM EDTA; 50 mM Na₂HPO₄;

250 gg/ml DNA sledí sperma (Heringssperma-DNA);

gg/ml tRNA; nebo

0,25 M natriumfosfátový pufr pH 7,2;

mM EDTA; 7 % SDS

Hybridizační teplota: T = 65 až 70 °C

Promývací pufr:

0,2 x SSC; 0,1 % SDS

Promývací teplota:

T = 40 až 75 °C.

Molekuly nukleových kyselin hybridizované s molekulami nukleových kyselin podle tohoto vynálezu mohou principiálně kódovat škrobové synthasy z jakékoli rostliny pšenice, která tyto proteiny exprimuje.

Molekuly nukleových kyselin, hybridizované s molekulami nukleových kyselin podle tohoto vynálezu, mohou být například izolovány z genomických pšenic nebo pšeničných tkání nebo z cDNA-knihoven pšenic nebo pšeničných tkání. Alternativně mohou být připraveny genově-technickými metodami nebo chemickou syntézou.

Identifikaci a izolaci těchto molekul nukleových kyše lin je možno provádět s použitím molekul podle tohoto vynálezu nebo částí těchto molekul respektive s použitím reverz nich komplementů těchto molekul, například pomocí hybridiza ce podle standardního postupu (viz například Sambrook a spol., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual,

2. vyd. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Jako vzorek pro hybridizaci je možno například použít molekuly nukleových kyselin, obsahující přesně stejné nebo v podstatě stejné nukleotidové sekvence nebo jejich části, uvedené pod Seq ID No.l. U těchto fragmentů, použitých jako vzorek pro hybridizaci, může jít i o syntetické fragmenty připravené pomocí běžných syntetických technik, jejichž sekvence v podstatě odpovídá molekulám nukleových kyselin pole tohoto vynálezu.

Molekuly, hybridizované s molekulami nukleových kyselin podle tohoto vynálezu, zahrnují i fragmenty, deriváty a alelické varianty výše uvedených molekul nukleových kyselin, které kódují pšeničné škrobové synthasy podle tohoto vynálezu. Fragmenty se přitom rozumí části molekul nukleových kyselin, které jsou dostatečně dlouhé k tomu, aby byly • · · · · * ·· • · · 9 · · · · · ·· • · · « · φ · «φ φ ··· ·· ·· «·« ·· ··· schopny kódovat uvedené proteiny. Výraz derivát v této souvislosti znamená, že sekvence této molekuly se od sekvenci výše uvedených molekul nukleových kyselin liši na jednom nebo několika místech a že vykazují vysoký stupeň homologie s těmito sekvencemi. Homologie znamená identitu sekvence minimálně 40 %, zejména identitu minimálně 60 %, přednostně 80 % a obzvláště preferovaně 90 %. Odchylky od dříve popsaných molekul nukleových kyselin mohou vznikat vyštěpením, substitucí, insercí nebo rekombinací.

Homologie dále znamená, že existuje funkční a/nebo strukturní ekvivalence mezi příslušnými molekulami nukleových kyselin nebo jimi kódovanými proteiny. U molekul nukleových kyselin, které jsou homologické s výše uvedenými molekulami a představují deriváty těchto molekul, jde zpravidla o variace těchto molekul, které představují modifikace se stejnými biologickými funkcemi. Přitom může jít jak o přirozeně se vyskytující variace, například o sekvence z jiných organismů, tak o mutanty, přičemž tyto mutanty mohou mít přirozený výskyt nebo mohou být zaváděny cílenou mutagenezí. Dále se jedná o variace synteticky připravených sekvencí. U alelických variant může jít jak o varianty s přirozeným výskytem, tak i o varianty připravené synteticky nebo získané rekombinantní DNA-technikou.

Proteiny, kódované různými variantami molekul nukleových kyselin podle tohoto vynálezu, vykazují určité společné vlastnosti. K nim patří například enzymová aktivita, molekulová hmotnost, imunologická reaktivita, konformace a podobně a rovněž fyzikální vlastnosti, jako je například pohyblivost při gelové elektroforéze, chování při chromatografii, sedimentační koeficienty, rozpustnost, spektroskopické vlastnosti, elektrický náboj, stabilita; pH-optimum, teplot10 ní optimum a podobně.

Důležité vlastnosti škrobové synthasy jsou:

i) její lokalizace ve stromatu plastidů rostlinných buněk;

ii) její schopnost syntetizovat lineární a-l,4-vázaný polyglukan.

Tuto aktivitu je možno stanovit způsobem který uvádějí Denyer a Smith (Plaňte 186 (1992), 606 - 617). Přitom proteinem kódovaným molekulami nukleových kyselin je rozpustná škrobová synthasa typ I ze pšenice. Tyto proteiny vykazují určité homologické oblasti s dosud známými rozpustnými škrobovými synthasami z jiných rostlinných druhů.

Molekulami nukleových kyselin podle tohoto vynálezu mohou být DNA-molekuly, zejména cDNA nebo genomické mole-r kuly. Dále mohou být nukleovými kyselinami podle tohoto vynálezu RNA-molekuly, které mohou vzniknout například transkripcí některé molekuly nukleových kyselin podle tohoto vynálezu. Nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu mohou být například získávány z přírodních zdrojů nebo technikou rekombinace či synteticky.

Předmětem tohoto vynálezu jsou i oligonukleotidy specificky hybridizované s některou molekulou nukleových kyselin podle tohoto vynálezu. Takovéto oligonukleotidy mají výhodně délku minimálně 10, obzvláště minimálně 15 a obzvláště výhodně minimálně 50 nukleotidů. Oligonukleotidy podle tohoto vynálezu se vyznačují tím, že se hybridizují specificky s molekulami nukleových kyselin podle tohoto vynálezu,

• ·· ·· • · · · ·	• ·· • · · ·	• ·
• ··· · · ·	• · · ·
• · · · · ·	• · « · ·	• ·

t.zn. že se sekvencemi nukleových kyselin, které kódují jiné proteiny, zejména jiné škrobové synthasy, nepodléhají hybridizaci nebo se hybridizuji jenom v nepatrném rozsahu. Oligonukleotidy podle tohoto vynálezu mohou být použity například jako primér pro PCR-reakci nebo jako hybridizační vzorek pro izolaci příbuzných genů. Mohou tvořit i součást antisense-konstruktů nebo molekul DNA, kódujících vhodné ribozymy.

Tento vynález dále zahrnuje vektory, zejména plasmidy, kosmidy, fagemidy, viry, bakteriofágy a jiné vektory, běžné v genové technice, které v sobě obsahují výše uvedené molekuly nukleových kyselin podle tohoto vynálezu. Tyto vektory jsou vhodné pro transformaci prokaryontických nebo eukaryontických, přednostně rostlinných buněk.

Obzvláště výhodné jsou vektory, umožňující integraci molekul nukleových kyselin podle tohoto vynálezu do genomu rostlinné buňky, případně s spolu se stínícími regulačními oblastmi. Jako příklady je možno uvést binární vektory, které je možno použít při transferu genů zprostředkovaném agrobakteriemi. Výhodná je syntéza přenositelných nebo případně nepřenositelných molekul nukleových kyselin podle tohoto vynálezu v transformovaných pro- nebo eukaryontických buňkách integrací molekuly nukleových kyselin v sense- nebo anti-sense-orientaci.

Pojem vektor označuje všeobecně vhodný, odborníkům známý pomocný prostředek, umožňující cílený transfer jedné jedno- nebo dvouřetězcové molekuly nukleových kyselin do hostitelské buňky, kterou může být například DNA- nebo RNA-virus, fragment viru, plasmidový konstrukt který za přítomnosti nebo nepřítomnosti regulačních prvků může být • · · · · · · • · · · · · · · · ·· ••••tt · · tttt · tt·· tttt ·· ··· tttt ··· vhodný pro transfer nukleových kyselin do buněk, nosné materiály jako jsou skleněná vlákna nebo i částice kovů, používané například při postupu particle gun , může však jít i o molekulu nukleových kyselin, kterou je možno vložit přímo do buňky vhodným chemickým nebo fyzikálním postupem.

Při výhodném způsobu provedení jsou molekuly nukleových kyselin, obsažené ve vektorech, vázány s regulačními prvky, které umožňují transkripci a syntézu přenositelné RNA do pro- nebo eukaryontických buněk nebo - pokud je to žádoucí - které umožňují syntézu nepřenositelné RNA.

Exprese molekul nukleových kyselin podle tohoto vynálezu v prokaryontických buňkách, například v Escherichia coli, má význam pro přesnější charakterizaci enzymatické aktivity enzymů, které kódují tyto molekuly. Obzvláště je možné charakterizovat produkt, syntetizovaný příslušnými enzymy, za nepřítomnosti jiných enzymů, podílejících se na syntéze škrobu v rostlinných buňkách. To umožňuje vyvozovat závěry o funkci příslušného proteinu při syntéze škrobu v rostlinných buňkách.

Kromě toho je možné pomocí běžných postupů molekulární biologie (viz například Sambrook a spol., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. vyd. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) zavádět různé mutace do molekul nukleových kyselin podle tohoto vynálezu, přičemž se při této syntéze získají proteiny s případně přeměněnými biologickými vlastnostmi. To umožňuje přípravu delečních mutantů, u nichž postupným vyštěpováním z 5’- nebo 3’- konce je možno získat kódující DNA-sekvenci molekul nukleových kyselin, které vedou k syntéze příslušných zkrácených proteinů. Tato delece na 5’-konci nukleo- 13 • · · tidové sekvence umožňuje například identifikovat aminokyselinové sekvence, které způsobují translokaci enzymů v plastidech (transitpeptidy). To umožňuje cílenou přípravu enzymů, které po odstranění příslušných sekvencí již nejsou lokalizovány v plastidech, nýbrž v cytosolu, nebo které jsou po adici jiných signálních sekvencí lokalizovány v jiných částech buňky.

Dále je možno provádět zavádění lokálních mutací do pozic, v nichž změna aminokyselinové sekvence ovlivňuje například enzymovou aktivitu nebo regulaci enzymů. Tímto způsobem je možno napříkla získat mutanty se změněnou hodnotou K_m nebo mutanty, které již nepodléhají normálním regulačním mechanismům v buňce působením allosterické regulace nebo kovalentní modifikace.

Dále je možno získat mutanty se změněnou substrátovou nebo produktovou speciíicitou proteinů podle tohoto vynálezu, které využívají napříkla ADP-glukoso-6-fosfát namísto ADP-glukosy. Kromě toho je možno připravovat mutanty proteinů podle tohoto vynálezu, které vykazují změněný profil aktivita - teplota.

Při provádění genově-technické modifikace prokaryontických buněk je možno vkládat molekuly nukleových kyselin podle tohoto vynálezu nebo jejich části do plasmidů, které umožňují provádět mutagenezi nebo změnu sekvence rekombinaci DNA-sekvencí. Pomocí standardních postupů (viz Sambrook a spol., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vyd. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA) je možno provádět záměny bází nebo připojovat přirozené nebo syntetické sekvence. Pro vzájemné spojování DNA-fragmentů je možno k těmto fragmentům připojit spojovací • ·· φφ · φφ • φ « · · ··· * φ φ • φφφ · » · · φ · φ · • φφφφ · φ · ••Φ «φ φφ φφφ φφ φφφ nebo vázací skupiny (adaptory nebo linkery). Rovněž je možno používat manipulace, které uvolňují příslušná restrikční místa štěpení, nebo které nadbytečnou DNA nebo restrikční místa odstraňují. V případech, kde přicházejí v úvahu inserce, delece nebo substituce, je možno při mutagenezí in vitro používat primer repair, restrikci nebo ligaci. Jako analytické metody byla obecně použita sekvenční analýza, restrikční analýza nebo jiné biochemické nebo molekulárněbiologické metody.

V další formě provedení se tento vynález týká hostitelských buněk, zejména pro- nebo eukaryontických buněk, které jsou transformovány s jednou z výše uvedených molekul nukleových kyselin podle tohoto vynálezu nebo s jedním z vektorů podle tohoto vynálezu, a rovněž buněk, které z takto transformovaných buněk vznikají a obsahují jednu molekulu nukleových kyselin podle tohoto vynálezu nebo jeden vektor. Přitom se přednostně jedná o pro- nebo eukaryontické buňky, zejména o rostlinné buňky.

Předmětem tohoto vynálezu jsou dále proteiny, které je možno připravit rekombinantním způsobem, a které mají aktivitu škrobové synthasy, kódované molekulami nukleových kyselin podle tohoto vynálezu, dále postup jejich přípravy, přičemž hostitelská buňka podle tohoto vynálezu je kultivována za vhodných, odborníkům známých podmínek, umožňujících syntézu proteinu podle tohoto vynálezu, a konečná izolace tohoto proteinu z hostitelských buněk a/nebo z kultivačního media.

Získané molekuly nukleových kyselin podle tohoto vynálezu nyní umožňují pomocí genově-technických metod provádět cílené zásahy do metabolismu škrobu v rostlinách

a tento metabolismus měnit do té míry, že dojde k syntéze takových modifikovaných škrobů, které ve srovnání se známými škroby budou mít jiné fyzikálně-chemické vlastnosti, jako jsou například poměr amylosy a amylopektinu, stupeň rozvětveni řetězce, průměrná délka řetězce, obsah fosfátů, vlastnosti při mazovatěni, vlastnosti při tvorbě gelu nebo filmu, velikost škrobových zrn a/nebo jejich tvar.

Je možno rovněž provádět expresi molekul nukleových kyselin podle tohoto vynálezu v rostlinných buňkách pro zvýšení aktivity příslušné škrobové synthasy, nebo zavádět molekuly nukleových kyselin podle tohoto vynálezu do buněk, které tento enzym normálně neexprimují. Dále je možno molekuly nukleových kyselin podle tohoto vynálezu modifikovat postupy, které jsou odborníkům známy, aby se získaly škrobové synthasy podle tohoto vynálezu, které již nepodléhají přirozeným regulačním mechanismům vlastní buňky, respektive které mají změněný profil teplota - aktivita nebo změněné specifické vlastnosti substrátu respektive produktu.

Při expresi molekul nukleových kyselin podle tohoto vynálezu v rostlinách existuje v zásadě možnost lokalizovat syntetizovaný protein do libovolné části rostlinné buňky.

Aby bylo možno provést lokalizaci do určité části rostlinné buňky, musí se vyštěpit sekvence, zajišťující lokalizaci v plastidech a zbývající kódující oblast, případně spojit s DNA-sekvencemi, které zajišťují lokalizaci do příslušného místa. Takovéto sekvence jsou známy (viz např. Braun a spol., EMBO J. 11 (1992), 3219 - 3227; Volter a spol.,

Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85 (1988), 846 - 850; Sonnenwald a spol., Plant J. 1 (1991), 95 - 106).

Tento vynález se týká i postupu přípravy transgenních

rostlinných buněk, které se transformují s molekulou nukleových kyselin nebo s vektorem podle tohoto vynálezu, přičemž molekula nukleových kyselin podle tohoto vynálezu nebo vektor podle tohoto vynálezu se integruje do genomu rostlinné buňky, a dále se týká i transgenních rostlinných buněk, transformovaných pomocí některé molekuly nukleových kyselin nebo vektoru podle tohoto vynálezu, a rovněž zahrnuje transgenní rostlinné buňky, které jsou z takto transformovaných buněk odvozeny. Buňky podle tohoto vynálezu obsahují jednu nebo více molekul nukleových kyselin nebo vektorů podle tohoto vynálezu, přičemž tyto molekuly nebo vektory jsou přednostně spojeny s regulačními DNA-prvky, které zajišťují transkripci v rostlinných buňkách, zejména s vhodným promotorem. Tyto buňky je možno odlišit od přirozených rostlinných buněk mimo jiné i podle toho, že obsahují molekuly nukleových kyselin podle tohoto vynálezu, které se v těchto buňkách normálně nevyskytují, nebo podle toho, že takováto molekula je integrována na určitém místě genomu buňky, kde se jinak nevyskytuje, to jest v jiném genomickém okolí. Dále je možno tyto transgenní rostlinné buňky podle tohoto vynálezu odlišit od přirozených rostlinných buněk tím, že tyto buňky obsahují ve svém genomu stabilně integrovanou minimálně jednu kopii molekuly nukleových kyselin podle tohoto vynálezu, případně navíc ke kopiím této molekuly s přirozeným výskytem v buňkách. Jestliže jde u molekuly nebo molekul nukleových kyselin, zavedených do buněk, o kopie navíc k molekulám s přirozeným výskytem v buňce, je možno rostlinné buňky podle tohoto vynálezu od přirozených buněk odlišit zejména tím, že tato nebo tyto kopie navíc jsou lokalizovány v genomu na místě nebo místech, na nichž se v přírodě nevyskytuje nebo nevyskytují. To je možno snadno prokázat například pomocí Southern-Blotanalýzy podle postupů, které jsou odborníkům známy.

Jestliže je molekula nukleových kyselin podle tohoto vynálezu, která byla zavedena do rostlinného genomu, ve vztahu k rostlinné buňce heterologní, obsahují transgenní rostlinné buňky transkripty molekul nukleových kyselin podle tohoto vynálezu, což je možno snadno prokázat například Northern-Blot-analýzou podle postupů, které jsou odborníkům známy.

Jestliže je molekula nukleových kyselin podle tohoto vynálezu ve vztahu k rostlinné buňce homologní, je možno buňky podle tohoto vynálezu odlišit od přirozeně se vyskytujících buněk například podle další exprese molekul nukleových kyselin podle tohoto vynálezu. Transgenní rostlinné buňky obsahují přednostně více transkriptů molekul nukleových kyselin podle tohoto vynálezu. To je možno prokázat například pomocí Northern-Blot-analýzy. Více znamená při tom přednostně minimálně o 10 % více, obzvláště o 20 % více a obzvláště výhodně minimálně o 50 % více transkriptů než odpovídající netransformované buňky. Přednostně vykazují tyto buňky rovněž odpovídající (minimálně 10% , 20 % , respektive 50%) zvýšení aktivity nebo případně snížení aktivity proteinů podle tohoto vynálezu. Z transgenních rostlinných buněk je možno regenerovat celé rostliny pomocí postupů, které jsou odborníkům známy.

Předmětem tohoto vynálezu je i postup získávání transgenních rostlin, přičemž jedna nebo několik molekul nukleových kyselin nebo vektorů podle tohoto vynálezu se integruje do genomu rostlinné buňky a celá rostlina se z této buňky regeneruje. Rostliny získané regeneraci transgenních rostlinných buněk podle tohoto vynálezu jsou rovněž jeho předmětem. Dále jsou předmětem tohoto vynálezu rostliny, které • ·· ·· « ·· • · · · · · · · · ·· • · · » · · · ·· · • · · · · ·· · · · ·· · výše uvedené transgenní rostlinné buňky obsahují. Tyto transgenní rostliny mohou být principiálně rostliny jakéhokoli rostlinného druhu, t.zn. jak rostliny monokotylní, tak i dikotylní. Přednostně se jedná o užitkové rostliny, obzvláště o rostliny které syntetizují respektive ukládají škrob, obzvláště výhodně žito, ječmen, oves, pšenice, proso, ságo, kukuřice, rýže, hrách, dřeňový hrách, maniok, brambory, rajčata, řepka, sojové boby, konopí, len, slunečnice, krmný hrách nebo maranta, především pšenice, kukuřice, rýže a brambory.

Tento vynález se rovněž týká množitelského materiálu rostlin podle tohoto vynálezu, jako jsou například plody, semena, hlízy, části kořenů, semenáčky, sazenice, pletiva protoplasty, buněčné kultury a podobně.

Tento předkládaný vynález se dále týká postupu pro výrobu modifikovaného škrobu, zahrnující operaci extrakce škrobu z výše uvedených rostlin podle tohoto vynálezu a/nebo ze škrobnatých částí těchto rostlin.

Postupy pro extrakci škrobu z rostlin nebo z jejich škrobnatých částí, zejména z pšenice, jsou pro odborníky známé, viz například Eckhoff a spol. (Cereal Chem. 73 (1996) 54 - 57 Škrob - Chemie a technologie (vydavatel: Vhistler, BeMiller a Paschall (1994), 2. vydání, Academie Press lne. London Ltd; ISBN 0-12-746270-8; viz např. kapitola XII, str. 412 - 468: Škroby z kukuřice a sorghumu: Výroba; Vatson; kapitola XIII, str. 469 - 479: Tapiokový, marantový /arrowroot/ a ságový škrob: Výroba; Corbishley a Miller; kapitola XIV, str. 479 - 490: Bramborový škrob: Výroba a použití; Mitch; kapitola XV, str. 491 - 506: Pšeničný škrob: Výroba, modifikace a použití; Knight a Oson;

a kapitola XVI, str. 507 až 528: Rýžový škrob: Výroba a použití; Rohmer a Klem). K zařízení, která se zpravidla k extrakci škrobu z rostlinného materiálu používají, patří separátory, dekantéry, hydrocyklony, sprayové sušárny a sušárny pro sušení ve fluidní vrstvě.

Transgenní rostlinné buňky a rostliny podle tohoto vynálezu syntetizují na základě exprese molekul nukleových kyselin podle tohoto vynálezu škroby, které se svými fyzikálně -chemickými vlastnostmi, jako je například poměr amylosy a amylopektinu, stupeň rozvětvení řetězce, průměrná délka řetězce, obsah fosfátů, vlastnosti při mazovatění, velikost škrobových zrn a/nebo jejich tvar, liší od škrobů syntetizovaných přírodními rostlinami. U těchto škrobů se může měnit zejména jejich viskozita a/nebo jejich vlastnosti při tvorbě filmu a vlastnosti vzniklých škrobových mazů v porovnání s vlastnostmi známých škrobů.

Předmětem tohoto předkládaného vynálezu je dále škrob, který je možno získat z rostlinných buněk, rostlin a z jejich množitelského materiálu podle tohoto vynálezu a škrob, který je možno získat výše uvedenými postupy podle tohoto vynálezu.

Dále je možno pomocí molekul nukleových kyselin podle tohoto vynálezu produkovat rostlinné buňky a rostliny, u nichž je aktivita proteinu podle tohoto vynálezu snížena. To vede rovněž k syntéze škrobu se změněnými chemickými a/nebo fyzikálními vlastnostmi v porovnání se škroby z původních rostlinných buněk.

Dalším předmětem tohoto vynálezu jsou transgenní rostlinné buňky, obsahující molekulu nukleových kyselin podle

tohoto vynálezu, v nichž je aktivita škrobové synthasy v porovnání s netransformovanými buňkami snížena.

Přípravu rostlinných buněk se sníženou aktivitou škrobové synthasy je možno například provádět expresí jedné příslušné anti-sense-RNA, jedné sense-RNA pro dosažení ko-supresního efektu nebo expresí jednoho, odpovídajícím způsobem konstruovaného ríbozymu, který specificky štěpí transkript kódující škrobovou synthasu s použitím molekul nukleových kyselin podle tohoto vynálezu podle postupu, který je odborníkům znám, viz Jorgensen (Trends Biotechnol. 8 (1990), 340 - 344), Niebel a spol., (Curr. Top. Microbiol. Immunol. 197 (1995), 91 - 103), Flavell a spol. (Curr. Top.

Microbiol.	Immunol. 197	(1995), 43	- 46)	, Palaqui a
Vaucheret	(Plant. Mol.	Biol. 29 (1995),	149 - 159),
Vaucheret	a spol. (Mol.	Gen. Genet.	248	(1995), 311 -	317) ,
de Borne a	spol., (Mol.	Gen. Genet.	243	(1994), 613 -	621) .

Výhodně se pro snížení aktivity škrobové synthasy podle tohoto vynálezu používá snížení počtu kódujících transkriptů v rostlinných buňkách, například expresí antisenseRNA.

Při tom je možno použít molekulu DNA, která obsahuje úplnou sekvenci kódující protein podle tohoto vynálezu včetně případně přítomných stínících sekvenci, a rovněž DNA-molekuly, obsahující pouze části kódující sekvence, přičemž tyto části musí být dostatečně dlouhé k tomu, aby v buňkách vyvolaly antisense-efekt. Obecně se mohou používat sekvence o minimální délce 15 bp, přednostně o délce 100 - 500 bp, pro účinnou antisense-inhibici zejména sekvence o délce nad 500 bp. Zpravidla se používají DNA-molekuly, které jsou kratší než 5000 bp, přednostně sekvence, které jsou kratší • · · · · · než 2500 bp.

Je možno používat i DNA-sekvence, které vykazují vysoký stupeň homologie se sekvencemi molekul DNA podle tohoto vynálezu, které však nejsou zcela identické. Minimální homologie by měla být vyšší než cca 65 %. Přednostně se používají sekvence se stupněm homologie mezi 95 a 100 %.

Předmětem tohoto vynálezu je i postup přípravy modifikovaného škrobu, zahrnující postup extrakce škrobu z buňky nebo z rostliny podle tohoto vynálezu a/nebo ze škrobnatých částí těchto rostlin.

Předmětem tohoto vynálezu je dále škrob, který je možno získat z buněk, rostlin a rovněž množitelského materiálu nebo jeho částí podle tohoto vynálezu a dále škrob, který je možno získat postupem podle tohoto vynálezu.

Škroby podle tohoto vynálezu je možno modifikovat postupy, které jsou odborníkům známy, přičemž tyto škroby v modifikované nebo nemodifikované formě jsou vhodné pro různá použití v potravinářské nebo nepotravinářské oblasti.

Možnosti použití škrobů podle tohoto vynálezu se v podstatě dělí do dvou velkých oblastí. Jedna oblast zahrnuje produkty hydrolýzy škrobu, zejména glukosu a glukanové stavební jednotky, které je možno získat enzymatickými nebo chemickými postupy. Tyto látky slouží jako výchozí suroviny pro další chemické modifikace a procesy, jako je například fermentace. Pro snížení finančních nákladů může mít v tomto případě značný význam jednoduchost a nepříliš nákladné provedení hydrolytického postupu. V současné době se tato hydrolýza provádí převážně enzymaticky s použitím amyloglu22

kosidasy. Lze předpokládat, že úspory nákladů by se mohlo dosáhnout snížením množství použitých enzymů. Určitý vliv by mohla mít i strukturní přeměna škrobu, jako je například sníženi stupně rozvětvení nebo změna sterické struktury, která určuje přístupnost molekuly pro použité enzymy.

Druhá oblast, v níž by se škroby podle tohoto vynálezu mohly vzhledem k jejich polymerní struktuře používat jako takzvané nativní škroby, se dělí na dvě hlavní oblasti použití:

1. Potravinářský průmysl

Škrob je klasickou přísadou do řady potravin, v nichž zpravidla plní funkci pojivá pro vodné složky respektive používá se pro zvýšení viskozity nebo způsobuje zvýšenou tvorbu gelu. Důležitými vlastnostmi jsou přitom tekutost a sorpce, teplota botnání a mazovatění, viskozita a zahušťovací schopnost, rozpustnost škrobu, průhlednost a struktura škrobového mazu, stálost vůči působení tepla, střižných sil a kyselin, tendence k retrogradaci, schopnost tvorby filmů, stabilita při zmrazováni/rozmrazování, viskozitní stálost v solných roztocích, stravitelnost a rovněž schopnost tvorby komplexů například s anorganickými nebo organickými ionty.

2. Nepotravinářský průmysl

V této široké oblasti je možno používat škrob jako pomocnou látku při různých výrobních procesech, resp.

• · · · · jako přísadu do technických produktů. Škrob jako pomocná látka se používá zejména v papírenském průmyslu a v průmyslu výroby lepenky. Škrob se v této aplikaci používá především pro retardaci (vázání pevných látek) , vázání plnidel a jemných částic, jako ztužovací prostředek a prostředek pro odvodňování. Kromě toho se využívají výhodné vlastnosti škrobu pro dosažení tuhosti, tvrdosti, akustických vlastností, požadovaného omaku, lesku, hladkosti, odolnosti proti rozštěpení a rovněž pro dosažení požadovaných vlastností povrchu.

2.1 Průmysl výroby papíru a lepenky

Při výrobě papíru se rozlišují čtyři oblasti použití, a to úprava povrchu, natírání, úprava vlastností papírenské hmoty a postřik. Požadavky na škrob pro úpravu povrchu jsou zejména vysoký stupeň bělosti, odpovídající viskozita, vysoká viskozitní stálost, dobrá schopnost ke tvorbě filmů a minimální tvorba prachu. Při použití škrobu pro nátěry je důležitý obsah pevných látek, odpovídající viskozita, vysoká vaznost a rovněž vysoká afinita k pigmentům.

Při použití škrobu jako přísady do papírenské hmoty se požaduje jeho rychlé, rovnoměrné a bezeztrátové rozptýleni, vysoká mechanická stabilita a úplné zadržení škrobu v proudu papíroviny. Při použití škrobu pro postřikování jsou rovněž důležitými vlastnostmi odpovídající obsah pevných látek, vysoká viskozita a vysoká vaznost.

2.2

Průmysl výroby lepidel ··* * · • ·

Průmysl výroby lepidel představuje širokou oblast použití škrobů, kterou je možno rozdělit na čtyři dílčí oblasti; použití jako čistě škrobové lepidlo, použití do škrobových lepidel s přísadou speciálních chemikálií, použití škrobu jako přísady k syntetickým pryskyřicím a k disperzím polymerů a konečně použití škrobů jako nastavovacího prostředku do syntetických lepidel. 90 % lepidel na bázi škrobu se používá při výrobě vlnité lepenky, papírových sáčků, pytlů a kornoutů, pro výrobu spojovacích materiálů pro papír a hliník, pro výrobu kartonáže a jako zvlhčovači lepidlo pro dopisní obálky, známky apod.

2.3 Textilní průmysl a průmysl pomocných textilních přípravků

Velkým odběratelem škrobů je textilní průmysl a průmysl textilních přípravků, kde se škroby používají jako pomocný prostředek a přísada. V rámci textilního průmyslu je možno rozlišit čtyři oblasti použití: použití škrobu jako šlichtovacího prostředku, tj. jako pomocného prostředku pro vyhlazení, zpevnění a zvýšení soudržnosti textilních surovin na ochranu proti působení tahových sil při spřádání a tkaní a rovněž pro zvýšení odolnosti proti oděru při tkaní, použití škrobu jako prostředku pro zušlechťování textilu zejména po úpravách zhoršujících kvalitu jako je bělení, barvení apod., škrob se dále používá jako zahušťovací prostředek při výrobě barvicích past pro potlačení difúze barev a konečně se škrob používá jako přísada k prostředkům pro spojování nití.

• ·· ·· · ·· · ·· · · · · ·· « · ·· ······ ··· • · · · 9 · · · 9 · 9 9 • ···« ··· ··· ·· ·· ··· ·· 999

2.4 Stavebnictví

Čtvrtou oblastí použití je používání škrobu jako přísady do stavebnin. Jako příklad je možno uvést sádrokartonové panely, kde škrob přidaný do sádrové kaše působením vody mazovatí, difunduje na povrch sádrové desky a váže karton na tuto desku. Další oblastí použití je přidávání škrobu do omítek a minerálních vláken. Při přepravě betonu se škrobové produkty používají pro zpomalení tvrdnutí betonu.

2.5 Stabilizace půdy

Další oblastí spotřeby škrobu je výroba prostředků pro stabilizaci půdy, které se používají při umělých pohybech půdy pro dočasnou ochranu částic půdy proti vodě. Kombinované produkty skládající se ze škrobu a emulzí polymerů jsou podle současných znalostí ve svých účincích pro snižování eroze a tvorby krusty srovnatelné s dosud používanými výrobky, jsou však podstatně levnější.

2.6 Použití v prostředcích pro ochranu rostlin a v hnoj ivěch

V této oblasti se škrob používá do prostředků pro ochranu rostlin pro úpravu jejich specifických vlastností. Škroby se používají pro zlepšené smáčení prostředků pro ochranu rostlin a hnojiv, pro postupné uvolňování účinných látek, pro přeměnu kapalných, těkavých a/nebo zapáchajících látek na mikrokrystalické, stabilní a tvarovatelné látky, pro míšení nekompatibilních sloučenin a pro prodloužení doby účinnosti zpomalením rozkladu.

• ·· ·» · ··· · · · · · • · · · · · • · · · » · · · • · · · · • ·· ·· »· ··· • · ·· ·· ·

2.7 Farmaceutický, zdravotnický a kosmetický průmysl

Další oblastí používání škrobu je farmaceutický, zdravotnický a kosmetický průmysl. Ve farmaceutickém průmyslu se škrob používá jako pojivo pro tablety nebo pro zřeďování pojiv v kapslích. Dále se škrob používá jako prostředek pro rychlý rozpad tablet (Tablettensprengmittel), kde tablety po polknutí absorbují tekutinu a po krátké době zbotnaji, přičemž uvolňují účinnou látku. Lékařské zásypy a pudry na zasypávání ran obsahují jako základní látku škrob. . V oblasti kosmetiky se škroby používají např. jako nosiče přísad, jako jsou vonné látky a salicylová kyselina, do pudrů. Poměrně značná množství škrobů se používají do zubních past.

2.8 Přidávání škrobů do uhlí a briket

Škroby se přidávají i do uhlí a briket. Uhlí se po přídavku škrobu lépe aglomeruje resp. briketuje, což brání předčasnénmu rozpadu briket. Do grilovacího uhlí se přidává 4 až 6 % škrobu, do uhlí pro topení 0,1 až 0,5 %. Škroby jako pojivo do uhlí nabývají stále většího významu, poněvadž přídavek škrobu do uhlí a briket může značně snížit emise škodlivých látek.

··· · · • · · · » · · ··· ·· ·* ··· ··

2.9 Úprava rudných a uhelných kalů

Škroby je možno používat i pro úpravu rudných a uhelných kalů jako flokulační prostředek.

2.10 Pomocné prostředky ve slévárenství

Další oblastí je použití škrobu jako přísady do pomocných slévárenských prostředků. Při různých postupech odlévání jsou zapotřebí jádra, která se vyrábějí z písků s přísadou pojivá. Jako pojivo se v současné době používá převážně bentonit, ke kterému se přidávají modifikované škroby, zejména botnavé škroby (Quellstárken). Přídavek škrobu se používá pro zvýšení pevnosti při toku (Fliessfestigkeit) a pro zlepšení vaznosti (Bindefestigkeit). Kromě toho mohou botnavé škroby splňovat další technické požadavky, jako je dispergovatelnost ve studené vodě, snadná rehydratace, dobrá mísitelnost s pískem a vysoká schopnost vázat vodu.

2.11 Použití v gumárenském průmyslu

V gumárenském průmyslu se může škrob používat pro zlepšení technické a optické kvality výrobků. Používá se pro zlepšení lesku povrchu, pro zlepšení omaku (Griff) a vzhledu, přičemž se před vulkanizací za studená popráší škrobem lepivé pogumované plochy. Škrob se rovněž používá i pro zlepšení • «· ·» tt *·

J · » · « · · tt tttt • ····* β · tttt í • · · * · · * tt tttt tttt tttt >»·· * · potiskovatelnosti pryžových výrobků.

2.12 Výroba náhražek kůže

Další oblastí uplatnění modifikovaných škrobů je výroba náhražek kůže.

2.13 Škroby v syntetických polymerech

V oblasti plastů se škroby používají k následujícím účelům: přídavek škrobových produktů při zpracování (škrob funguje pouze jako plnidlo, mezi syntetickým polymerem a škrobem nevzniká přímá vazba) nebo alternativně k vázání škrobových produktů při výrobě polymerů (škrob a polymer vytvářejí pevnou vazbu).

Používání škrobu jako pouhého plnidla není v porovnání s jinými látkami, jako je například mastek, perspektivní. Jiná je však situace, jestliže se uplatní specifické vlastnosti škrobu a dojde k podstatné změně vlastností konečného produktu. Jako příklad je možno uvést použití škrobových produktů při zpracování termoplastů, jako je polyethylen.

Při tom se škrob a polymer zpracují koexpresi v poměru 1 :

na předsměs, z níž se s granulovaným polyethylenem za použití běžných technologických postupů vyrábějí různé produkty. Navázání škrobu v polyethylenových fóliích může zvýšit látkovou propustnost fóliových dutých těles, zlepšit propustnost pro vodní páru, zlepšit antistatické vlastnosti a rovněž zlepšit potiskovatelnost barvami ředitelnými vodou .

φ φ • φ φ

φ •

Λ

Φ *

Další možností je použití škrobu do polyurethanových pěn. Úpravou škrobových derivátů a rovněž optimalizací technologických parametrů je možno cíleně řídit reakci mezi syntetickými polymery a hydroxylovými skupinami škrobu. Výsledkem jsou polyurethanové fólie, kterým použití škrobu dodává následující vlastnosti: snížení koeficientu tepelné roztažnosti, snížení srážlivosti, zlepšení vlastností při působení tlaku/tahu, vzrůst propustnosti pro vodní páru bez změny schopnosti přijímat vodu, snížení zápalnosti a možnosti roztržení, nedochází k odkapávání hořících dílů, absence halogenů a zpomalené stárnutí. Nevýhodami, které se v současné době projevují, jsou snížená pevnost v tlaku a snížená rázová odolnost. Vývoj výrobků se však neomezil pouze na fólie. V současné době se vyrábějí i masivní výrobky, jako jsou např. hrnky, talíře a misky, obsahující i více než 50 % škrobu. Kromě toho jsou směsi škrobu a polymerů hodnoceny velice příznivě z ekologického hlediska, poněvadž mají podstatně vyšší biologickou odbouratelnost.

Mimořádný význam získaly vzhledem k jejich extrémní schopnosti vázat vodu roubované škrobové polymerizáty. Jde o produkty jejichž hlavní řetězec tvoří škrob a na tento řetězec jsou podle principu radikálového mechanismu roubovány postranní vedlejší řetězce syntetického monomeru. Roubované škrobové polymerizáty, které jsou v současné době k dispozici, se vyznačují zlepšenou schopností vázat a zadržovat vodu, a to až do množství 1 000 g vody na 1 g škrobu při vysoké viskozitě. Oblasti použití těchto superabsorpčních látek se v posledních letech velmi rozšířily a tyto látky se uplatňují v oblasti hygieny jako pleny a vložky a rovněž v zemědělství, jako například pro pota: í

4, ·» «· · · · • · 9 9 · 9 9 · · • · · • ·· · 9 • · · · hování osiva.

Pro použití nových genově-technicky přeměněných škrobů jsou rozhodující jednak jejich struktura, obsah vlhkosti, obsah proteinů, obsah lipidů, obsah vlákniny, obsah popela/fosfátů, poměr amylosa/amylopektin, rozložení molárních hmotností, stupeň rozvětvení, velikost zrn a jejich tvar a krystalinita, a jednak vlastnosti, z nichž vyplývají následující charakteristiky: chování při toku a sorpční vlastnosti, teplota mazovatění, viskozita, stálost viskozity v solných roztocích, zahušfovací schopnost, rozpustnost, struktura a transparence škrobového mazu, odolnost vůči teplu, střižným silám a kyselinám, tendence k retrogradaci, tvorba gelů, stabilita při zmrazování/rozmrazování, schopnost tvořit komplexy, vázáni jodu, tvorba filmů, pevnost lepeného spoje, stálost vůči enzymům, stravitelnost a reaktivita.

U modifikovaných škrobů, získaných z příslušných rostlin pomocí genově-technických postupů, může dojít k takové změně jejich vlastností, že další modifikace pomocí chemických nebo fyzikálních postupů již není nutná. Jinak je možno škroby pozměněné genově-technickými postupy dále modifikovat chemickými postupy, takže se dosáhne dalšího zlepšení kvality pro výše uvedené účely použití. Tyto chemické úpravy jsou v zásadě známy. Při tom se používají zejména úpravy působením tepla, působením organických nebo anorganických kyselin, oxidace a reesterifikace, přičemž vznikají například fosfáty, nitráty, sulfáty, xantháty, acetáty nebo citráty škrobu. Dále je možno použít jedno- nebo vícefunkční alkoholy za přítomnosti silných kyselin pro přípravu etherů škrobu, přičemž vznikají alkylethery, O-allylethery, hydroxyalkylethery a O-karboxymethylethery škrobu, dusík obsahu31 • · · > · * φ» • ···«)· · · * * φ • · * · · · * • ο· ·· ·· ·»· ·« jící thery škrobu, fosfor obsahující ethery škrobu, síru obsahující ethery škrobu, zesíťované škroby nebo roubované škrobové polymery.

Výhodným použitím škrobů podle tohoto vynálezu je jednak výroba obalových materiálů a výrobků pro jedno použití a jednak použití těchto škrobů jako potravin a potravinářských polotovarů.

Pro expresi molekul nukleových kyselin podle toho- to vynálezu v sense- nebo antisense-orientaci v rostlinných buňkách se tyto molekuly spojí s regulačními DNA-prvky, které potom uskutečňují transkripci v rostlinných buňkách. K tomu se ještě přiřazují zejména promotory, enhancery a terminátory. Všeobecně se exprese může účastnit kterýkoli aktivní promotor v rostlinné buňce.

Promotor je při tom možno volit tak, aby exprese pro- . bíhala konstitutivně, nebo pouze v určité tkáni, v určitém časovém úseku vývoje rostliny nebo v určitém okamžiku, stanoveném vnějšími vlivy. Ve vztahu k rostlině může být tento promotor homologický nebo heterologický. Vhodnými promotory pro konstitutivní expresi jsou například promotor 35S RNA viru květákové mozaiky a ubiquitinový promotor z kukuřice, pro expresi specifickou pro hlízy (knollenspezifische E.) je vhodný patatinový promotor B33 (Rocha-Sosa a spol., EMBO J.

(1989), 23 - 29), jako promotor zajišťující expresi pouze ve fotosynteticky aktivních tkáních je vhodný například promotor ST-LS-1 (Stockhaus a spol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7943 - 7947; Stockhaus a spol., EMBO J. 8 (1989), 2445 - 2451), pro endosperm-specifickou expresi je možno použít HMG-promotor z pšenice, USP-promotor, faseolin-promotor nebo promotory ze zeinových genů kukuřice.

• · «

« • · ·

Dále může být k dispozici terminační sekvence, která zajišťuje správné ukončení transkripce a zajišťuje rovněž adici poly-A-konce na transkript, kterému je připisována funkce při stabilizaci transkriptů. Tyto prvky jsou v literatuře popsány (viz např. Gielen a spol., EMBO J. 8 (1989) a jsou libovolně zaměnitelné.

Tento předkládaný vynález poskytuje molekuly nukleových kyselin, které kódují protein s funkcí rozpustné škrobové synthasy z pšenice. Molekuly nukleových kyselin podle tohoto vynálezu umožňují získávání tohoto enzymu, který se funkčně účastní biosyntézy škrobu a který umožňuje získávání genově-technicky změněných rostlin, v nichž je aktivita tohoto enzymu změněna a umožňuje tak v takto modifikovaných rostlinách provádět syntézu škrobu se změněnou strukturou a se změněnými fyzikálně-chemickými vlastnostmi.

Molekuly nukleových kyselin podle tohoto vynálezu mohou být principiálně používány i k získávání rostlin, v nichž je aktivita škrobové synthasy podle tohoto vynálezu zvýšena nebo snížena a současně v nichž je aktivita jiných enzymů, které se podílejí na syntéze škrobu, změněna. Tato změna aktivity škrobové synthasy v rostlinách vede k syntéze škrobu s pozměněnou strukturou. Dále mohou být vnášeny molekuly nukleových kyselin, které kódují škrobovou synthasu, nebo odpovídající anti-šense konstrukty do rostlinných buněk, v nichž již byla inhibována syntéza endogenních GBSSI-, SSS- nebo GBSS II-proteinů působením antisenseefektu nebo mutací (jako např. ve VO 92/14827 nebo Shannon a Garwood, 1984, v publikaci Vhistler, BeMiller a Paschall, Škrob: Chemie a technologie, Academie Press, Londýn, 2.

vyd.: 25 - 86) • · « · * · · « « » 9 9. 9 9 · 9 · · • ·«··« · * » · I « · · * · « « «·»·· ·· ··· «·) ♦

Jestliže se má dosáhnout v transformovaných rostlinách inhibice více enzymů podílejících se na biosyntéze, je možno pro transformaci použít DNA-molekuly, které současně obsahují více oblastí, kódujících odpovídající enzymy v antisense-orientaci za kontroly vhodného promotoru. Při tom může být alternativně bud’ každá sekvence kontrolována jedním vlastním promotorem, nebo mohou být sekvence transkribovány jako fúze jedním společným promotorem nebo mohou být všechny sekvence kontrolovány jedním společným promotorem. Zpravidla se preferuje tato poslední alternativa, poněvadž v tomto případě je syntéza příslušných proteinů inhibována přibližně ve stejné míře. Pro délku jednotlivých kódujících oblastí využívanou v získaném konstruktu platí to, co bylo již dříve uvedeno při přípravě antisense-konstruktů. Horní hranice počtu antisense-transkribovaných fragmentů v promotoru jedné DNA molekuly principiálně neexistuje. Vznikající transkript by však neměl být delší než 10 kb, preferovaně by neměl překročit délku 5 kb.

Kódující oblasti, které jsou lokalizovány v těchto DNA-molekulách, v kombinaci s ostatními kódujícími oblastmi v antisense-orientaci za příslušným promotorem, mohou pocházet z DNA-sekvencí, které kódují následující proteiny: synthasa vázaná na škrobové zrno (GBSS I a II) a rozpustné synthasy (SSS I a II), enzymy ovlivňující rozvětvování (isoamylasy, pullulanasy, R-enzym, Branching-enzym, Debranching-enzym), škrobové fosforylasy a disproporcionační enzym. Tento výčet je pouze orientační. V rámci těchto kombinací je možno použít i jiné DNA-sekvence.

Tyto konstrukty umožňují v rostlinných buňkách, které jsou jejich působením transformovány, současně inhibovat ♦ 4 4 ·

4·· 4 4 · 4 · « 44 • « · 4 · e *4

4 4 4 Γ» 4 4 4 * · »

A 4 4 4 4 » 4 • •44· 4« 444 4* 4 syntézu více enzymů.

Dále je možno tyto konstrukty vkládat do rostlinných mutantů, které jsou pro jeden nebo více genů biosyntézy škrobu defektní (Shannon a Garwood, 1984, v publikaci VhistChemie a technologie,

- 86). Tyto defekty se synthasa vázaná na škrobové ler, BeMiller a Paschall, Škrob Academie Press, Londýn, 2. vyd. mohu týkat následujících enzymů zrno (GBSS I a II) a rozpustné synthasy (SSS I a II), enzymy ovlivňující rozvětvování (BE I a II), Debranching-enzym (R-enzym), disproporcionační enzymy a škrobové fosforylasy. Tento výčet je pouze orientační.

Pomocí tohoto postupu je dále možno v rostlinných buňkách transformovaných tímto způsobem současně inhibovat syntézu několika enzymů.

Pro zavedení cizích genů do vyšších rostlin je k dispozici velký počet klonovacích vektorů, které obsahují replikační signál pro E. coli a markerový gen pro selekci transformovaných bakteriálních buněk. Jako příklady těchto vektorů je možno uvést pBR322, pUC-serie, M13mp-serie, pACYC184 a další. Požadovanou sekvenci je možno zavést do vektoru v příslušném restrikčním štěpném místě. Získaný plasmid se použije pro transformaci buněk E.coli. Transformované buňky E.coli se kultivují ve vhodném mediu, nakonec se provede jejich izolace a lýze. Plasmid se regeneruje.

Jako analytické metody pro charakterizaci získané plasmidDNA se obecně používají restrikční analýza, gelová elektroforéza a další biochemické a molekulárně-biologické metody. Po každé manipulaci je možno plasmid-DNA rozštěpit a získané DNA-fragmenty vázat na jiné DNA-sekvence. Každou sekvenci plasmid-DNA je možno klonovat ve stejném plasmidu nebo

ΦΦΦ ·· « · φ · φ · φ · « · · φ · · «φ • » φ « φ · φφφ » «φφφφ φ φ * · φ φ φφφ φ φ φ· «φφ ♦· φφφ v jiných plasmidech.

Pro zavedení DNA do rostlinné hostitelské buňky existuje řada postupů. K těmto postupům patří transformace rostlinných buněk s T-DNA s použitím Agrobacterium tumefaciens nebo Agrobacterium rhizogenes jako transformačním prostředkem, fúze protoplastů, injekce, elektroporace DNA, vkládání DNA pomocí biolistické metody a další možnosti.

Při injikaci a elektroporaci DNA do rostlinných buněk nejsou na použité plasmidy kladeny žádné speciální požadavky. Je možno použít jednoduché plasmidy jako například pUCderiváty. Jestliže se však má z takto transformovaných buněk regenerovat celá rostlina, je zpravidla nutná přítomnost příslušného markérového genu.

V závislosti na způsobu zavádění požadovaných genů do rostlinné buňky může být zapotřebí použít další DNA-sekvence . Jestliže se například pro transformaci rostlinné buňky používá Ti- nebo Ri-plasmid, musí být alespoň pravé ohraničení, často však pravé i levé ohraničení Ti- a Riplasmidu T-DNA spojeno jako chránící oblast se zaváděným genem.

Jestliže se pro transformaci používají agrobakterie, musí být zaváděná DNA klonována ve speciálním plasmidu, a to buď v intermediárním vektoru nebo v binárním vektoru. Intermediární vektory je možno na základě sekvencí homologických se sekvencemi v T-DNA integrovat do Ti- nebo Ri-plasmidu agrobakterií pomocí homologické rekombinace. Tento plasmid obsahuje nadto i vir-region potřebný pro transfer T-DNA. Intermediární vektory není možno replikovat v agrobakteriích. S použitím pomocného plasmidu je možno • ·· φ * φ · · φ« φ φ φ φφφ φ φφ • «φφφφ · φ φφ φ φ φ · φ φ φ · • φφ φ · φφ φφφ ·* · intermediární vektor přenášet na Agrobacterium tumefaciens (konjugace). Binární vektory je možno replikovat jak v E. coli, tak i v agrobakteriích. Tyto vektory obsahují jeden selekční markerový gen a jeden vazný člen (linker nebo polylinker), které rámují zprava a zleva hraniční oblast T-DNA. Tyto vektory je možno transformovat přímo v agrobakteriích (Holsters a spol., Mol. Gen. Genet. 163 (1978), 181 - 187). Agrobakterium jako hostitelská buňka by měla obsahovat plasmid nesoucí vir-region. Tento vir-region je nutný pro transfer T-DNA do rostlinné buňky. Mohou být přítomny i další T-DNA. Takto transformované buňky Agrobakterium je možno použít pro transformaci rostlinných buněk.

Používání T-DNA pro transformaci rostlinných buněk je předmětem intenzivního studia a je dostatečně popsáno v EP 120 516; Hoekema, v publikacích The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V, Alblasserdam (1985), kapitola V; Fraley a spol. , Crit Rev. Plant. Sci. ,4,1- '46 a An a spol., EMBO J. 4 (1985), 277-287.

Pro transfer DNA do rostlinné buňky je možno účelně ko-kultivovat rostlinné explantáty s Agrobacterium tumefaciens nebo Agrobacterium rhizogenes. Z infikovaného rostlinného materiálu (jako jsou například kousky listů, části stonků, kořeny, ale i protoplasty nebo suspenzně kultivované rostlinné buňky) je potom možno ve vhodném mediu, obsahujícím mimo jiné určité cukry, aminokyseliny, antibiotika nebo biocidy pro selekci transformovaných buněk, regenerovat opět celé rostliny. V takto získaných rostlinách je potom možno sledovat přítomnost zavedené DNA. Jsou známy i jiné možnosti pro zavedení cizí DNA s použitím biolistického postupu nebo pomocí transformace protoplastů (viz například Villmitzer, • « * 11 · 11 · •9 1 · 9 119 9 9 19

9 9 9 9 9 1 1 1

11111 1 1 «· · tt « · · 9 1 111

9 11 11 m 9 1 · · «

L., 1933 Transgenic plants, v publikaci Biotechnology,

A Multi-Volume Comprehensive Treatise (edit. H.J. Rehm, G.Reed, A.Píihler, P.Stadler), díl 2, 627 - 659, VCH Veinheim-New York-Basel-Cambridge).

Zatímco transformace dikotylních rostlin prostřednictvím Tí-plasmidových vektorových systémů pomocí Agrobacterium je známa dostatečně, ukazují novější práce, že transformaci pomocí vektorů vycházejících z Agrobacterium je možno provádět i u monokotylních rostlin (Chán a spol.,

Plant Mol. Biol. 22 (1993), 491 - 506; Hiei a spol·., Plant J. 6 (1994), 271 - 282).

Alternativními postupy k transformaci monokotylních rostlin jsou použití biolistických postupů, transformace protoplastů nebo fyzikálně nebo chemicky indukované vložení DNA do protoplastů, například pomocí elektroporace částečně permeabilizovaných buněk, transfer DNA pomocí skleněných vláken, makroinjekce DNA do květenství, mikroinjekce DNA do mikrospor nebo pro-embryonů, vkládání DNA pomocí klíčícího pylu a vkládání DNA do embryonů bobtnáním ( Přehled:

Potrykus, Physiol. Plant (1990), 269 - 273).

Tři z výše uvedených transformačních systémů byly již dříve používány pro různé druhy obilí: elektroporace tkáně, transformace protoplastů a DNA-transfer vstřelováním částic do regenerovatelné tkáně a buněk (Přehled: Jáhne a spol., Euphytica 85 (1995), 25 - 44) .

Transformace pšenice byla popsána v řadě prací (Přehled: Maheswari a spol., Critical Rewievs in Plant Science 14 (2) (1995), 149 až 178). Hess a spol. (Plant Sci 72 (1990), 233) použili postup makroinjekce, aby dostali do

• · · ·	9 9	• 9	• ·	• ·
• * « ·	9 9 ·	• «	* ·
• 4	• ·	•	• ·
• » · · 9	• ·	• · «	• ·	• ·

bezprostřední vzájemné blízkosti pyl a agrobakterie. Mobilizace plasmidů obsahujícího nptll gen jako volitelný markér byla prokázána pomocí Southern-Blot-analýzy a NPTII testem. Tyto transformanty vykazovaly normální fenotyp a byly fertilní. Ve dvou po sobě jdoucích generacích bylo možno prokázat resistenci vůči kanamycinu.

První transgenní fertilní rostlinu pšenice, kterou bylo možno regenerovat po vstřelování DNA vázané na mikroprojektily popsali Vasil a spol. (Bio/Technology 10 (1992), 667 - 674). Cílovou tkání pro vstřelování byla embryogenní kultura kaliu (Kallus typ C). Jako selekční markér byl použit čistý gen (bar Gen) kódující fosfinothricin-acetyltransferasu a zajišťoval tak resistenci proti herbicidu Phosphinothricin. Další systém popsali Veeks a spol. (Plant Physiol. 102 (1993), 1077 - 1084) a Becker a spol. (Plant J. 5(2) (1994), 299 - 307). V tomto případě bylo cílovou tkání pro DNA-transformaci skutellum nezralých embryonů, které byly v počáteční in vitro-fázi stimulovány k indukci sóma-’ tických embryonů. Stupeň účinnosti této transformace byl u systému, který vyvinuli Becker a spol. (citace viz dříve), s 1 transgenní rostlinou na 83 embryonů druhu Florida podstatně vyšší než u systému který vypracovali Veeks a spol. s 1 až 2 transgenními rostlinami na 1 000 embryonů druhu Bohwhite.

Systém, který vyvinuli Becker a spol. (citace viz dříve) tvoří základ transformačních pokusů popsaných v Příkladech.

Jakmile se vložená DNA integruje do genomu, zůstává v něm uložena zpravidla stabilně a zůstává zachována i v potomstvu původních transformovaných buněk. Obsahuje zpra39

00 » 0 * · • 00 · 0

0 00 0 vidla jeden z výšeuvedených selekčních markérů, který zajišťuje transformovaným rostlinným buňkám např. odolnost proti biocidním prostředkům jako je Phosphinothricin nebo proti antibiotikům jako je kanamycin, G418, Bleomycin nebo Hygromycin nebo umožňuje provádět selekci za přítomnosti nebo nepřítomnosti určitých cukrů nebo aminokyselin. Individuálně zvolený markér by měl proto umožňovat selekci transformovaných buněk za buňky, kterým vložená DNA chybí.

Transformované buňky rostou v rostlině normálním způsobem (viz např. McCormick a spol., Plant Cell Reports 5 (1986), 81 - 84). Výsledné rostliny je možno normálně pěstovat a je možno je křížit s rostlinami, které mají stejné nebo odlišné dědičné vlastnosti. Takto vzniklá hybridní individua mají odpovídající fenotypové vlastnosti.

Z rostlinných buněk je možno získat semena.

Aby bylo zajištěno, že fenotypová vlastnost zůstala zachována a že je dědičná, je třeba provést pěstování dvou nebo několika generací. Je třeba sklidit i semena, aby bylo zajištěno, že zůstal zachován příslušný fenotyp nebo ostatní charakteristické vlastnosti.

Následující příklady ilustrují tento vynález, v žádném případě jej však nevymezují.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Postup klonování

• · · • 9 9		9 «	•	• 9 9	•	* 9 •	9 ·
• · ··	« ·		•	»	9 9	*
< 9	•		•	•		«
9 · · »		• »				9 9	9 9

Pro klonování E.coli byl použit vektor pBluescript II SK (stratagen).

Příklad 2

Kmeny bakterií

Pro vektor Bluescript a pro antisense-konstrukty byl použit E.coli kmen DH5a (Bethesda Laboratories, Gaithersburg, USA). Pro excisi prováděnou in vivo byl použit E.coli kmen XLl-Blue.

Příklad 3

Transformace nezralých pšeničných embryonů

Media:

MS:

100 ml/makrosůl ml/1 mikrosůl ml/1 Fe/NaEDTA 30 g/l sacharosa (D.Becker a H.Lorz, Plant Tissue Culture Manual (1996), B 12 : 1

20) #30:

#31 :

MS + 2,4-D (2 mg/1)

MS + 2,4-D (2 mg/1) + Phosphinothricin (PPT, aktivní komponenta herbicidu BASTA (2 mg/1) #32:

#39:

MS + 2,4-D (0,1 mg/1)

MS + 2,4-D (2 mg/1) + PPT (2 mg/1) + po 0,5 N mannit/sorbit • •4 a · · · · * 4 » « · · · · • »· · · ·♦* ·* ·

V uvedených mediích byla hodnota pH nastavena pomocí KOH na 5,6 a media byla ztužena 0,3 % přípravku Gelrite.

Metodu transformace nezralých embryonů z pšenice vyvinuli a optimalizovali Becker a Lórz (D.Becker a H.Lórz, Plant Tissue Culture Manual (1996), B 12 : 1 až 20).

V dále popsaných pokusech byl dodržován protokol, který vypracovali Becker a Lórz (citace viz dříve).

Pro transformaci byly klasy s karyopsy ve stupni vývoje 12 až 14 dnů po antezi sklízeny a povrchově sterilisovány. Izolované skutelly byly naneseny s pro medium vhodnými embryony na indukční medium #30.

Po dvoudenní až čtyřdenní předběžné kultivaci (26 °C, tma) byly explantáty převedeny na medium #39 pro osmotickou předběžnou kultivaci (2 až 4 hodiny, 26 °C, tma).

Při biolistické transformaci bylo pro jedno vstřelování (Schuss) použito cca 29 gg částic zlata, na které bylo předtím vysráženo několik pg cílové DNA. Vzhledem k tomu, že při prováděných pokusech šlo o ko-transformanty, byla cílová DNA ke srážení přidávána s cílovým genem a resistentním markerovým genem (bar-Gen) v poměru 1:1.

Příklad 4.

DIG-značení DNA-fragmentů

Značení DNA-fragmentů použitých jako screeningové sondy bylo provedeno pomocí specifické PCR se vkládáním • ·4 4 · 4 · * ··> 4 4 444 4 44

44444 4 4 ·· · >·»4 44

44··· ♦· ·♦· ·»

DIG-značeného dUTP (Boehringer Mannheim, Německo).

Media a roztoky použité v příkladech:

x SSC 175,3 g NaCI

88,2 g natriumcitrát doplnit do 1 000 ml redest. vodou úprava na pH 7,0 roztokem 10 N NaOH

Ve sbírce mikroorganismů a buněčných kultur DSMZ v Braunschweigu, SRN, bylo provedeno uložení plasmidu pTaSSI 8/1 podle budapešťské smlouvy pod číslem DSM 12794.

Příklad A

Identifikace, izolace a charakterizace cDNA, kódující rozpustnou škrobovou synthasu (SS I) z pšenice (Triticum aestivum L., odrůda Florida)

Pro identifikaci úplné cDNA, kódující isoformu rozpustné škrobové synthasy (SS I) z pšenice, byla použita strategie homologického screeningu. Při tom byla cDNA-banka z pšenice prozkoumána (byl proveden screening) pomocí vhodných oligonukleotidů. SSI-specifický oligonukleotid, který byl použit pro screening, byl izolován pomocí postupu 5’RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends - rychlá amplifikace cDNA konců), jak je popsáno dále.

Syntéza pšeničné cDNA-banky byla provedena z póly (A) + RNA z cca 20 dnů starých karyopsů (endosperm) ve vektoru Lambda Zap II podle údajů výrobce (Sada /kit/ pro syntézu Lambda ZAP II-cDNA, Stratagene GmbH, Heidelberg, Německo). Po stanovení titru cDNA-banky byla stanovena ··« · · « ·· ·

9 9 9 · · » · 9 9 99

9 9 9 9 9 9 9 9 • 999 · 9 9 9 99 9 9

9 9 9 9 9 9 9

999 99 99 999 9 9 999 hodnota primárního titru 1,26 x IO** pfu/ml.

Hodnocení cDNA-banky bylo provedeno pomocí sondy SS I z pšenice. Pomocí postupu 5’RACE byl izolován fragment DNA a amplifikace 5’-konce byla provedena pomocí sady 5’-RACE (dále jen sada - kit) od firmy Boehringer (Mannheim, Německo). Všechny kroky byly provedeny podle údajů výrobce. Byly použity pouze enzymy a chemikálie z uvedeného kitu, pokud není uvedeno j inak.

Nejprve byly póly(A) + RNA cca dvacet dnů staré karyopsy transkribovány v cDNA s jedním řetězcem a byla provedena tailing-reakce. Vzniklá cDNA, která měla v oblasti 5’ připojený Oligo(dA)Anker#9 (Kit), byla při první reakci s primerem 01igo(dT)#8 (Kit) a B2F5 podle upraveného protokolu amplifikována následujícím způsobem: Do 50 μΐ násady bylo přidáno 5 μΐ upravené cDNA, 5 μΐ lOx reakčního pufru (Life Technologies), 0,25 μΜ priméru B2F5, 0,75 μΜ 01igo(dT)#8, 0,2 mM dNTP a přípravek 5U Taq Polymerase (rekombinantní, Life Technologies). PCR profil byl následující:

°C 3’/94 °C 45’’/56 °C 1’/72 °C 1’30’’ , cyklů/72 °C 5’.

Potom následovala další PCR s primerem 01igo(dT)#8 (Kit), B2F5 a vhodným 5’-primerem B2F6. Do 50 μΐ násady byl přidán 1 μΐ PCR-produktů, 5 μΐ lOx reakčního puftu (Life Technologies), 0,25 μΜ B2F5-priméru, 0,25 μΜ B2F6-priméru, 0,75 μΜ B2F5, 0,75 μΜ 01igo(dT)#8, 0,2 mM dNTP a přípravek 5U TAQ Polymerase (rekombinantní, Life Technologies). PCR-profil byl následující:

°C 3’/94 °C 45’’/60 °C 1 ’/72 °C l’3O”;

cyklů/72 °C 5’

B2F5: 5’CCTCCCAATTCAAGGATTAGTG 3’(Seq. ID No. 3)

B2F6: 5’CCTCGCATGCAGCATAGCAA 3’(Seq. ID No. 4)

PCR-produkty získané podle uvedených postupů byly rozděleny na agarosovém gelu a byly izolovány fragmenty DNA o velikosti nad 800 bp. Klonování těchto PCR-fragmentů bylo provedeno pomocí sady pCR-Script SK(+) Cloning Kit od firmy Stratagene (Heidelberg). Pomocí sekvenční analýzy klonovaných subfragmentů byla identifikována dosud neznámá sekvence klonu SS I o velikosti cca 150 bp.

Z oblasti 5’ této nové sekvence byly vybrány oligonukleotidy B2R00 a B2F6.2 pro amplifikaci DNA-fragmentu (SS I-sonda), který byl potom označen popsaným způsobem přípravkem Digoxygenin-11-dUTP a který byl použit jako sonda pro screening pšeničné cDNA-banky. Značkování této SS I-sondy bylo provedeno pomocí PCR-reakce s primery B2R00 a B2F6.2 podle údajů v příručce The DIG systém User’s Guide for Filter Hybridisation (Boehringer Mannheim).

B2R00: 5’TGTGGCTGCAAGTGAGGAGG 3’ (Seq. ID No. 5)

B2F6.2 5’CCAGTCACAAACACGTAGCTACG 3’ (Seq. ID No. 6)

Pro průzkum pšeničné cDNA-banky bylo naneseno na desku cca 700.000 fágů. Nanášení fágů (Ausplattieren) a snímání (Abziehen) desek bylo provedeno podle standardního protokolu. Předběžná hybridizace a hybridizace filtru byly provedeny v roztoku, který tvořily 5X SSC, 3 % Blocking (Boehringer Mannheim), 0,2 % natriumdodecylsulfát (SDS),

0,1 % natriumlaurylsarkosin a 50 gg/ml DNA sledího spermatu • · 0 0 0 · ·· • 00 * 0 0 · 0 9 99

0 0 0 0 0 · · • 999 * 0 0 0 00 0

0 0 0 0 0 0

000 00 00 000 00 0 (Heringssperma) při 65 °C. K hybridizačnímu roztoku bylo přidáno 1,3 ng/ml DIG-značené SS I-sondy a hybridizace byla provedena inkubací přes noc. Filtr byl promyt podle protokolu popsaného v příručce The DIG systém User’s Guide for Filter Hybridisation (Boehringer Mannheim) při teplotě 65 °C. Pozitivní klony byly spojeny při dvou následujících kolech screeningu. In vivo excizí byly získány spojené klony jako pBluescript SK Phagemide (provedení podle údajů výrobce; Stratagene, Heidelberg).

Podle analýzy tohoto klonu pomocí miniprepacace a restrinkce Plasmid-DNA byl klon TaSSI 8/1 dále analyzován.

Příklad 2

Sekvenční analýza cDNA-inzercí plasmidu pTaSSI 8/1

Z klonu TaSSI 8/1 byl izolován plasmid-DNA a sekvence cDNA-inzercí byla stanovena didesoxynukleotidovou metodou (Sanger a spol., Proč. Nat. Acad. Sci. USA 74 (1977),

5463 - 5467). Inzerce klonu TaSSI 8/1 má délku 2805 bp a představuje úplnou cDNA. Nukleotidová sekvence je uvedena pod označením Seq ID No.l. Příslušná sekvence aminokyselin je uvedena pod označením Seq ID No.2. Z porovnání s již publikovanými sekvencemi vyplynulo, že sekvence uvedená pod označením Seq ID No.l je nová a že zahrnuje úplnou kódující oblast.

Příklad 3

Příprava rostlinného transformačního vektoru pT a-gamma-SSI-8/1 • ·· ·· · · · ···· · · ·· 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 • 999 9 9 9 · 99 9

9 9 9 9 9 9

9 ·· 9 9 99 9 9 9 9

Pro expresi izolované cDNA podle příkladu A byl konstruován na základě základního plasmidu pUC19 rostlinný transformační vektor pTa-gamma-SSI-8/1. Při konstrukci tohoto vektoru byla cDNA-inzerce plasmidu TaSSI 8/1 úplně spojena v sense-orientaci s 3’-koncem ubiquitinového promotoru. Tento promotor se skládá z prvního nepřenosného exonu (untranslatierter Exon) a prvního intronu genu ubiquitin 1 z kukuřice (Christensen A.H. a spol., Plant Molecular Biology 18 (1992), 675 - 689). Části polylinkeru a NOS-terminátoru pocházejí z plasmidu pACTl.cas (CAMBIA, TG 0063;

Cambia, GPO Box 3200, Canberra ACT 2601, Austrálie). Vektorové konstrukty s tímto terminátorem a konstrukce založené na pACTl.cas jsou popsány v práci MCElroy a spol. (Molecular Breeding 1 (1995), 27 - 37). Takto vzniklý vektor byl pojmenován PUbi.cas.

Klonování tohoto expresního vektoru bylo prováděno restrikci fragmentu z klonu TaSSI 8/1 pomocí restrikčních enzymů Xba I a Ssp.I. Tento fragment byl na koncích doplněn pomocí Klenowovy reakce a potom byl navázán na klonovací místo Sma I expresního vektoru pUbi.cas. Vzniklý expresní vektor byl označen pTA-gamma-SSI 8/1. Ve druhém konstruktu byl 5’-nepřenosný leader klonu TaSSI-8/1 nejprve odstraněn působením exonnukleasy. Potom bylo provedeno klonování v expresním vektoru pUbi.cas. Tento konstrukt byl označen Ta-gamma-SSI- 8/1-2.

Vektory pTa-gamma-SSI-8/1 a pTa-gamma-SSI-8/1-2 byly potom použity pro transformaci pšenice.

Claims (26)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   I · · · ·

   9 99 9 9 9 g^vokát »00 PRAHA fc ^í/Ur-p Wijf

   1. Molekuly nukleových kyselin, kódující protein s funkcí škrobové synthasy z pšenice, vybraná ze skupiny, kterou tvoří (a) molekula nukleové kyseliny, kódující protein, která zahrnuje sekvenci aminokyselin uvedenou pod Seq ID NO. 2, (b) molekula nukleové kyseliny, zahrnující nukleotidovou sekvenci uvedenou pod Seq ID NO. 1 nebo její část nebo tomu odpovídající ribonukleotidovou sekvenci, (c) molekula nukleové kyseliny, hybridizovaná s některou z molekul nukleové kyseliny uvedené pod (a) nebo (b) nebo je s ní komplementární, a (d) molekula nukleové kyseliny, jejíž nukleotidová sekvence je na základě degenerace genetického kódu odlišná od sekvence molekul nukleové kyseliny uvedené pod (a), (b) nebo (c).
2. 2. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 1, vyznačující se tím, že jde o molekulu DNA.
3. 3. DNA-molekula podle nároku 2, vyznačující se tím, že jde o molekulu cDNA.
4. 4. Molekula nukleové kyseliny podle jednoho nebo více z nároků 1 až 3, která obsahuje regulační prvky.
5. 5. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 1, vyznačující se tím, že jde o molekulu RNA.
6. 6. Molekula nukleové kyseliny specificky hybridizovaná s molekulou nukleové kyseliny podle některého z nároků 1 až 5.
7. 7. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 6, která je oligonukleotidem o délce minimálně 15 nukleotidů.
8. 8. Vektor, obsahující DNA-molekulu podle některého z nároků 1 až 5.
9. 9. Vektor podle nároku 8, v němž je uvedená molekula nukleové kyseliny spojena s regulačními prvky v sense-orientaci , která zajišťuje transkripci a syntézu přenositelné RNA do prokaryontických nebo eukaryontických buněk.
10. 10. Vektor podle nároku 8, v němž je uvedená molekula nukleové kyseliny spojena s regulačními prvky v sense-orientaci, která zajišťuje transkripci a syntézu nepřenositelné RNA do prokaryontických nebo eukaryontických buněk.
11. 11. Vektor podle nároku 8, v němž je uvedená molekula nukleové kyseliny spojena s regulačními prvky v antisenseorientaci, která zajišťuje transkripci a syntézu nepřenositelné RNA do prokaryontických nebo eukaryontických buněk.
12. 12. Hostitelská buňka, transformovaná molekulou nukleové kyseliny podle jednoho nebo více z nároků 1 až 5 nebo vektorem podle jednoho nebo více patentových nároků 8 až 11 nebo buňka z takovéto buňky odvozená.

    • ·· *· · ·· ···· · · · · · · · ··· ··· * · • ····· · · «V · • · · · · · · ····· · · ··· · · ·
13. 13. Protein, kódovaný molekulou nukleové kyseliny podle jednoho nebo více z nároků 1 až 4.
14. 14. Způsob výroby proteinu podle nároku 13, při kterém je hostitelská buňka podle nároku 12 kultivována za podmínek, umožňujících syntézu uvedeného proteinu a tento uvedený protein se z kultivovaných buněk a/nebo z kultivačního media izoluje.
15. 15. Způsob výroby transgenní rostlinné buňky, při kterém se

    a) molekula nukleové kyseliny podle jednoho nebo více nároků 1 až 5 nebo

    b) vektor podle jednoho nebo více nároků 8 až 11 integruje do genomu rostlinné buňky.
16. 16. Transgenní rostlinná buňka transformovaná molekulou nukleové kyseliny podle jednoho nebo více nároků 1 až 5 nebo vektorem podle jednoho nebo více nároků 8 až 11 nebo buňka z takovéto buňky pocházej ící.
17. 17. Způsob výroby transgenní rostlinné buňky, při kterém se al) molekula nukleové kyseliny podle jednoho nebo více nároků 1 až 5 nebo (f · a2) vektor podle jednoho nebo více nároků 8 až 11 integruje do genomu rostlinné buňky a

    b) z uvedené rostlinné buňky se regeneruje celá rostlina.
18. 18. Rostlina, obsahující rostlinnou buňku podle nároku 16
19. 19. Rostlina podle nároku 19, která je monokotylní nebo dikotylní rostlinou.
20. 20. Rostlina podle nároku 19, která je užitkovou rostlinou .
21. 21. Rostlina podle nároku 20, která je rostlinou ukládající škrob.
22. 22. Rostlina podle nároku 21, kterou je rostlina kukuřice rýže, brambor nebo pšenice.
23. 23. Množitelský materiál rostliny podle jednoho nebo více nároků 18 až 22.
24. 24. Škrob, získatelný z rostlinné buňky podle z rostliny podle jednoho nebo více nároků 18 až z množitelského materiálu podle nároku 23.

    nároku 16, 22 nebo
25. 25. Použití škrobu podle nároku 24 pro výrobu potravin nebo potravinářských polotovarů, výhodně pečivá nebo těstovin .
26. 26. Použití škrobu podle nároku 24 pro výrobu obalových materiálů nebo výrobků pro jedno použití.