CZ2001379A3 - Rostliny syntetizující modifikovaný škrob, způsoby získávání těchto rostlin, jejich použití a modifikovaný škrob - Google Patents

Abstract

Řešení se týká rekombinantních molekul nukleových kyselin, obsahujících dvě nebo více nukleotidových sekvencí, které kódují enzymy podílející se na metabolismu škrobu. Dále se týká postupů pro získávání transgenních rostlinných buněk a rostlin syntezujících škrob s modifikovaným obsahem fosfátů a s modifikovanou strukturou postranních řetězců. Kromě toho se týká vektorů a hostitelských buněk, které obsahují uvedené molekuly nukleových kyselin, rostlinných buněk a rostlin získaných uvedeným způsobem, škrobu syntetizovaného rostlinnými buňkami a uvedenými rostlinami a postupů přípravy tohoto škrobu.

Description

ROSTLINY SYNTETIZUJÍCÍ MODIFIKOVANÝ ŠKROB, ZPŮSOBY ZÍSKÁVÁNÍ TĚCHTO ROSTLIN, JEJICH POUŽITÍ A MODIFIKOVANÝ ŠKROB

Oblast techniky

Tento vynález se týká rekombinantních molekul nukleových kyselin obsahujících dvě nebo více nukleotidových sekvencí, které kódují enzymy, podílející se na metabolismu škrobu, postupů pro získávání transgenních rostlinných buněk a rostlin syntetizujících škrob s modifikovaným obsahem fosfátů a s modifikovanou strukturou postranních řetězců. Dále se tento vynález týká vektorů a hostitelských buněk, které obsahují molekuly nukleových kyselin podle tohoto vynálezu, rostlinných buněk a rostlin získaných postupy podle tohoto vynálezu, škrobu syntetizovaného rostlinnými buňkami a rostlinami podle tohoto vynálezu a postupů přípravy tohoto škrobu.

Dosavadní stav techniky

Rostlinné složky mají jako obnovitelné zdroje surovin stále větší význam a proto je biotechnologický výzkum zaměřen na přizpůsobování rostlinných surovin požadavkům zpracovatelského průmyslu. Aby byla oblast použitelnosti těchto obnovitelných surovin co nej širší, je nezbytné dosáhnout jejich maximální rozmanitosti.

Vedle olejů, tuků a proteinů představují důležitou obnovitelnou rostlinnou surovinu polysacharidy. Nej důležitější postavení mezi polysacharidy zaujímá vedle celulózy škrob, který je nejdůležitější zásobní látkou ve vyšších rostlinách. Důležitou úlohu při výrobě škrobu mají vedle • · kukuřice, rýže a pšenice zejména brambory,

Polysacharid škrob je polymerem, skládajícím se z chemicky jednotných základních jednotek, a to z molekul glukosy. Přitom jde o velice složitou směs různých molekulárních forem, které se liší svým polymerizačním stupněm a větvením glukosových řetězců. To tedy znamená, že škrob není jednotnou surovinou. Amylosa, která je tvořena v podstatě nerozvětveným polymerem skládajícím se z 1,4-glykosidicky vázaných molekul glukosy, se odlišuje od amylopektinu, který je tvořen komplexní směsí různě rozvětvených glukosových řetězců. Na tomto větvení se podílejí navíc i 1,6-glykosidické vazby. V rostlinách, které se používají pro výrobu škrobu v největším měřítku, jako jsou např. kukuřice nebo brambory, se skládá škrob syntetizovaný v těchto rostlinách z cca 25 % amylosy a cca 75 % amylopektinu.

Pro důležité funkční vlastnosti škrobu resp. jeho vodných roztoků je rozhodující molekulární struktura škrobu, která je určována zejména stupněm rozvětvení, poměrem amylosa/amylopektin, průměrnou délkou a rozložením postranních řetězců a rovněž přítomností fosfátových skupin. Důležitými funkčními vlastnosti jsou např. rozpustnost, chování při retrogradaci, schopnost vytvářet filmy, viskozita, barevná stálost, chování při mazovatění a rovněž použitelnost jako pojivá nebo lepidla. Pro různé aplikace může mít značný význam i velikost škrobových zrn. U některých aplikací může být obzvláště důležité získávání škrobu s vysokým obsahem amylosy. Rovněž může modifikovaný škrob obsažený v rostlinných buňkách za určitých podmínek výhodně ovlivnit chování rostlinných buněk. Tak např. je možno snížit odbourávání škrobu v průběhu skladování orgánů obsahuj ících škrob, jako jsou např. semena nebo hlízy, před jejich dalším • · · · • ···· · · zpracováním, např. před extrakcí škrobu. Rovněž by bylo zajímavé vyrábět modifikované škroby, které by umožňovaly lepší zpracovatelnost škrobnatých rostlinných buněk nebo rostlinných orgánů, jako např. při výrobě potravin, jako jsou popcorn nebo cornflakes z kukuřice nebo smažené bramborové hranolky, bramborové lupínky nebo bramborový prášek. Obzvláště zajímavé by bylo takové zlepšení vlastností škrobu, které by vedlo ke sníženému sládnutí za chladu, t.zn. ke sníženému uvolňování redukujících cukrů (zejména glukosy) při dlouhodobém skladování při nízkých teplotách. K tomu dochází zejména u brambor, které se často uchovávají při teplotách 4 až 8 °C, aby se snížilo odbourávání škrobu při jejich skladování. Redukující cukry, které se přitom uvolňují, a to zejména glukosa, způsobují potom např. při výrobě smažených bramborových hranolků nebo lupínků nežádoucí hnědnutí (tzv. Maillardova reakce).

Úprava škrobů izolovaných z rostlin pro určité průmyslové účely se často provádí chemickými modifikacemi, které jsou zpravidla časově a ekonomicky náročné. Proto je žádoucí hledat možnosti získávání takových rostlin syntetizujících škrob, jehož vlastnosti by již odpovídaly specifickým požadavkům zpracovatelského průmyslu, což by bylo výhodné jak z ekonomického, tak i z ekologického hlediska.

Alternativou ke šlechtitelským opatřením je cílená genetická modifikace metabolismu škrobu pomocí genově-technologických metod v rostlinách produkujících škrob. Předpokladem k tomu však je identifikace a charakterizace enzymů, které se podílejí na modifikaci syntézy nebo odbourávání škrobu (metabolismu škrobu) a rovněž izolace odpovídajících sekvencí DNA, které tyto enzymy kóduj i.

• 0

Cesty biochemické syntézy vedoucí k výstavbě škrobu jsou v podstatě známy. Syntéza škrobu v rostlinných buňkách probíhá v plastidech. Ve fotosynteticky aktivních tkáních fungují chloroplasty, ve fotosynteticky inaktivních škrobových zásobních tkáních amyloplasty.

Důležitými enzymy, podílejícími se na syntéze škrobu jsou např. rozvětvující enzymy (branching-enzymy), ADP-glukoso-pyrofosforylasy, škrobové synthasy vázané na škrobové zrno, rozpustné škrobové synthasy, enzymy odstraňující rozvětvení (debranching-enzymy), disproporcionační enzymy, plastidové škrobové fosforylasy a Rl-enzymy (Rl-proteiny).

Cílem tohoto vynálezu je získat další respektive alternativní genově-technické postupy pro modifikaci metabolismu škrobu v rostlinách produkujících škrob (jako jsou např. žito, ječmen, oves, kukuřice, pšenice, proso, ságo, rýže, hrách, dřeňový hrách, maniok, brambory, rajčata, řepka, sojové bohy, konopí, len, slunečnice, krmný hrách bohy mung, fazole, banány nebo maranta, nebo získat vhodné molekuly nukleových kyselin, jejichž pomocí by bylo možno transformovat rostlinné buňky tak, aby došlo k syntéze vhodných modifikovaných druhů škrobu.

Tyto modifikované druhy škrobu se liší např. změněným stupněm rozvětveni, poměrem amylosa/amylopektin, obsahem fosfátů, velikostí škrobových zrn a/nebo průměrnou délkou a rozložením postranních řetězců (tj. strukturou postranních řetězců).

Dalším cílem tohoto vynálezu je zajištění postupu, který by umožňoval získávání transgenních rostlin, synteti·· · zujících přeměněný (modifikovaný) druh škrobu.

Transgenní rostliny nebo rostlinné buňky transformované molekulami nukleových kyselin podle tohoto vynálezu nebo molekulami nukleových kyselin použitými podle tohoto vynálezu překvapivě syntetizovaly škrob, který byl modifikován postupem podle tohoto vynálezu tak, že byly pozměněny jeho fyzikálně-chemické vlastnosti a/nebo jeho struktura postranních řetězců. Naproti tomu u známých škrobů, syntetizovaných transgenními rostlinami, k přeměnám podle tohoto vynálezu nedošlo.

Podstata vynálezu

Předmětem předloženého vynálezu je způsob získání transgenní hostitelské buňky, při kterém se

a) minimálně jedna nukleotidová sekvence kódující protein s funkcí rozpustné škrobové synthasy III nebo fragmenty uvedené nukleotidové sekvence a

b) jedna nebo více nukleotidových sekvencí kódujících protein, vybraný ze skupiny A, skládající se z proteinů s funkcí rozvětvujících enzymů, ADP-glukoso-pyrofosforylas, škrobových synthas vázaných na škrobové zrno, rozpustných škrobových synthas, enzymů odstraňujících rozvětvení, disproporcionačních enzymů, pláštidových škrobových fosforylas, Rl-enzymů, amylas a glukosidas nebo jejich fragmentů ·· ·

• · · · ·.

• ··· · ··· ; ····· · · ····.

.. ; ·..· · integruj í současně nebo postupně do genomu buňky.

Výhodný je způsob, při kterém je uvedenou buňkou bakteriální nebo rostlinná buňka.

Dále je předmětem předloženého vynálezu transgenní hostitelská buňka, která obsahuje

a) minimálně jednu nukleotidovou sekvenci, kódující protein s funkcí rozpustné škrobové synthasy III nebo fragmenty uvedené nukleotidové sekvence a

b) jednu nebo více nukleotidových sekvencí, kódujících protein, vybraných ze skupiny A, skládající se z proteinů s funkcí rozvětvujících enzymů, ADP-glukoso-pyrofosforylas, škrobových synthas vázaných na škrobové zrno, rozpustných škrobových synthas, enzymů odstraňujících rozvětvení, disproporcionačních enzymů, plastidových škrobových fosforylas, Rl-enzymů, amylas a glukosidas nebo jejich fragmenty.

Uvedená hostitelská buňka je výhodně bakteriální nebo rostlinná buňka.

Předmětem tohoto vynálezu je dále rekombinantní molekula nukleové kyseliny (nukleotidové sekvence), která obsahuj e

a) alespoň jednu nukleotidovou sekvenci (polynukleotid popřípadě molekulu nukleové kyseliny), kódující protein s funkcí rozpustné škrobové synthasy III nebo • · fragmenty uvedené nukleotidové sekvence a

b) jednu nebo více nukleotidových sekvencí kódujících protein, vybraný ze skupiny A, skládající se z proteinů s funkcí rozvětvujících enzymů (BE I, Ha a lib), ADP-glukosopyrofosforylas, škrobových synthas, vázaných na škrobové zrno, rozpustných škrobových synthas I, II nebo jiných, enzymů, odstraňujících rozvětvení, disproporcionačních enzymů, plastidových škrobových fosforylas, Rl-enzymů, amylas a glukosidas nebo jejich fragmentů - především rozpustných škrobových synthas II, rozpustných škrobových synthas I a/ nebo rozvětvujících enzymů a jejich fragmentů - a molekuly nukleových kyselin, hybridizujících s uvedenými nukleotidovými sekvencemi nebo s jejich fragmenty, přednostně molekulu desoxyribonukleové kyseliny nebo ribonukleové kyseliny, nejlépe molekulu cDNA. Zvláště preferována je molekula nukleové kyseliny, která se specificky hybridizuje s některou z uvedených nukleotidových sekvencí nebo s jejich fragmenty.

Vhodné nukleotidové sekvence podle tohoto vynálezu, které kódují protein s funkcí rozpustné škrobové synthasy III jsou známy např. z EP-A-0779363. Pojmem nukleotidová sekvence, kódující protein s funkcí rozpustné škrobové synthasy III se ve smyslu tohoto vynálezu rozumějí zejména takové sekvence, jejichž kódující oblast má délku 3000-4000 bp, přednostně 3200-4250 bp, obzvláště výhodně 3400-4000 bp a jejichž homologie s celkovou kódující oblastí nukleové kyseliny kóduj ící protein s funkcí rozpustné škrobové synthasy je minimálně 70 %, výhodně minimálně 80 %, obzvláště minimálně 90 % a obzvláště výhodně minimálně 95 %.

·· ·

- 8 •···· · • ···· · podle tohoto vynálezu, jsou např. rozpustné

Vhodné nukleotidové sekvence které kódují protein ze skupiny A, škrobové synthasy (typ I, II nebo jiný) nebo isoformy škrobové synthasy vázané ne škrobové zrno (například Hergersberg, 1988, disertace, Universita Kóln; Ábel, 1995, disertace FU Berlín; Ábel a spol., 1996, Plant Journal 10(6):981-991; Visser a spol., 1989, Plant Sci. 64:185-192; van der Leij a spol., 1991, Mol. Gen. Genet. 228:240-248; EP-A-0779363; VO 92/11376; VO 96/15248, kde SSSB znamená rozpustnou škrobovou synthasu I a GBSSII znamená rozpustnou škrobovou synthasu II; VO 97/26362; VO 97/44472; VO 97/45545; Delrue a spol., 1992, J.Bacteriol. 174:3612-3620; Baba a spol., 1993, Plant. Physiol. 103:565-573; Dry a spol., 1992, The Plant Journal 2,2: 193-202 nebo i v záznamech EMBL Datenbank Eintrágen X74160; X58453; X88789), isoformy rozvětvujících enzymů (branching enzym

I, Ha, lib), isoformy enzymů odstraňujících rozvětvení (debranching enzymy, isoamylasy, pullulanasy) nebo isoformy disproporcionačních enzymů popsané např. ve VO 92/14827; VO 95/07335; VO 95/09922; VO 96/19581;

VO 97/22703; VO 97/32985; VO 97/42328; Tahaka a spol., 1993,

J. Biol.Chem. 268: 1391-1396 nebo i v záznamu EMBL Datenbank Eintrag X83969 a sekvence kódující ADP-glukosopyrofosforylasy, isoformy plastidových škrobových fosforylas a Rl-enzymy (Rl-proteiny), které jsou popsány například v EP-A-0368506; EP-A-0455316; VO 94/28146; DE 19653176.4;

VO 97/11188; Brisson a spol., 1989, The Plant Cell 1:559 -566; Buchner a spol., 1996, Planta 199:64-73; Camirand a spol., 1989, Plant Physiol. 89 (4 Suppl.) 61; Bhat & Knowler, J.Exp. Botany 41 (Suppl.) 5-7; Lin a spol., 1991, Plant Physiol. 95:1250-1253; Sonnewald a spol., 1995, Plant Mol.Biol. 27:567-576; DDBJ Nr. D23280; Lorberth a spol., 1998, Nátuře Biotechnology 16:473-477 a rovněž amylasy • 4 ·· ·

4* • » · · * 44444 • 4 >

· « 4 • 4 » · • · 4 • 4 4 4 • · • 444

a glukosidasy.

Vhodné nukleotidové sekvence podle tohoto vynálezu jsou pro- nebo eukaryontického původu, přednostně původu z bakterií, z hub nebo z rostlin.

Pojmem fragment ve smyslu tohoto vynálezu se rozumí části molekuly nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu nebo molekuly nukleové kyseliny, použité podle tohoto vynálezu, které mají délku mininálně 15 bp, přednostně minimálně 150 bp, obzvláště výhodně minimálně 500 bp, avšak zpravidla nepřekračují délku 5000 bp, přednostně 2500 bp.

Pojem hybridizace znamená v rámci tohoto vynálezu hybridizaci za konvenčních hybridizačních podmínek, přednostně za přísně definovaných podmínek popsaných například v publikaci Sambrook a spol., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. vyd. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Pojem fragment zahrnuje zejména biologicky aktivní molekuly.

Obzvláště výhodně se specifická hybridizace provádí za následujících přísně definovaných podmínek:

Hybridizační pufr:

x SSC; lOx roztok Denhardt (Fikoll 400 + PEG + BSA; poměr 1:1:1); 0,1 % SDS; 5 mM EDTA; 50 mM Na^PO^;

250 pg/ml DNA sledího sperma (Heringssperma-DNA);

pg/ml tRNA; nebo

0,25 M natriumfosfátový pufr pH 7,2; 1 mM EDTA; 7 % SDS • · · · β <a · · · ··· «·· · · · ·

4 4 9 9 4 · » 4 9 4 ·····«· ······· 9 9 • · · · · · ··· ·· · · · Φ · Φ · * ·

Hybridizační teplota Τ = 55 až 68 °C

Promývací pufr: 0,2 x SSC; 0,1 % SDS a

Promývací teplota: T = 40 až 68 °C

Molekuly hybridizované s molekulami nukleových kyselin podle tohoto vynálezu, popřípadě s molekulami nukleových kyselin, použitými podle tohoto vynálezu, zahrnují i fragmenty, deriváty a alelické varianty molekul nukleových kyselin podle tohoto vynálezu, popřípadě molekul nukleových kyselin, použitých podle tohoto vynálezu. Označením fragmenty nejsou míněny pouze části nukleových kyselin, které jsou dostatečně dlouhé k tomu, aby kódovaly funkčně aktivní část popsaných proteinů. Výraz derivát v souvislosti s tímto vynálezem znamená, že sekvence určité molekuly se v jedné nebo více pozicích liší od sekvencí molekul nukleových kyselin podle tohoto vynálezu resp. molekul nukleových kyselin použitých podle tohoto vynálezu a vykazuje vyšší stupeň homologie s těmito sekvencemi. Homologie přitom znamená identitu sekvencí minimálně ze 60 %, přednostně minimálně nad 70 %, zejména minimálně nad 85 %, nejlépe nad 90 % a obzvláště preferovaně nad 95 %. Odchylky od molekul nukleových kyselin podle tohoto vynálezu, popřípadě od molekul nukleových kyselin, použitých podle tohoto vynálezu, při tom mohou vznikat jednou nebo několika vyštěpeními, substitucemi, insercemi nebo rekombinacemi.

Homologie dále spočívá v tom, že existuje funkční a/nebo strukturní ekvivalence mezi příslušnými molekulami nukleových kyselin nebo jimi kódovanými proteiny. U molekul nukleových kyselin, které jsou homologické s molekulami nukleových kyselin podle tohoto vynálezu, popřípadě s mole00 0 »00 ·

0000 0000 00

0 0000 00 0 000« 00 0

0 00 0 000 kulami nukleových kyselin, použitými podle tohoto vynálezu a s deriváty těchto molekul, jde zpravidla o variace těchto molekul, představující jejich modifikace, které mají stejnou, téměř identickou nebo podobnou biologickou funkci. Přitom může jít jak o přirozeně se vyskytující variace, například o sekvence z jiných rostlinných druhů, tak i o mutace, přičemž tyto mutace mohou mít rovněž přirozený výskyt nebo mohou být zaváděny cílenou mutagenezí. Rovněž může u těchto variací jít o synteticky připravené sekvence.

U alelických variant může jít rovněž jak o varianty s přirozeným výskytem, tak i o synteticky připravené varianty nebo o varianty získané rekombinantními DNA-technikami.

U molekul nukleových kyselin podle tohoto vynálezu, popřípadě molekul nukleových kyselin, použitých podle tohoto vynálezu může jit o DNA-molekuly, zejména o cDNA-molekuly nebo případně o kombinaci genomických molekul. Dále mohou být molekulami nukleových kyselin podle tohoto vynálezu resp. molekulami nukleových kyselin použitých podle tohoto vynálezu RNA-molekuly. Molekuly nukleových kyselin podle tohoto vynálezu resp. molekuly nukleových kyselin použité podle tohoto vynálezu nebo jejich fragmenty mohou být získávány např. z přírodních zdrojů, rekombinantními technikami nebo syntetickými postupy.

Pro expresi molekul nukleových kyselin podle tohoto vynálezu, popřípadě molekul nukleových kyselin, použitých podle tohoto vynálezu, v sense- nebo antisense-orientaci v rostlinných buňkách, se tyto molekuly vážou s regulačními DNA-elementy, které zajišťují transkripci v rostlinných buňkách. Do této skupiny patří zejména promotory. Všeobecně je pro expresi možno použít jakýkoli promotor, který je aktivní v rostlinných buňkách. Tento promotor může být při · 0 · β 00 «00 000 00

0000 000« 0·

0 0000 00 0 0000 00 0 · 00 0 00 tom volen tak, aby exprese probíhala konstitutivně, nebo pouze v určité tkáni, v určitém období vývoje rostliny nebo pouze v určitém okamžiku determinovaném vnějšími vlivy, který je možno vyvolat například chemicky nebo biologicky.

Ve vztahu k transformované rostlině může být tento promotor - stejně jako nukleotidová sekvence - homologický nebo heterologický. Vhodnými promotory jsou např. 35S RNA promotor mozaikového viru květáku a ubiquitinový promotor z kukuřice pro konstitutivní expresi, patatinový promotor B33 (RochaSosa a spol., 1989, EMBO J. 8:23-29) pro specifickou expresi v hlízách brambor nebo promotor zajišťující expresi pouze ve fotosynteticky aktivních tkáních, např. ST-LSI-promotor (Stockhaus a spol., 1987, Proč.Nati. Acad.Sci. USA 84:79437947; Stockhaus a spol., 1989, EMBO J. 8:2445-2451), Ca/b promotor (např. US 5656496, US 5639952, Bansal a spol.,

1992, Proč. Nati. Acad. Sci USA, 89, 3654-3658) a Rubisco SSU-promotor (viz např. US 5034322, US 4962028) nebo pro endosperm-specifickou expresi Glutelin-promotor (Leisy a spol., Plant Mol. Biol. 14, (1990), 41-50; Zheng a spol.,

Plant J. 4, (1993), 357-366; Yoshihara a spol., FEBS Lett. 383, (1996), 213-218), Shrunken-1 promotor (Verr a spol.,

EMBO J. 4, (1985), 1373-1380, HMG-promotor z pšenice,

USP-promotor, faseolinpromotor nebo promotory zeinových genů z kukuřice (Pedersen a spol., Cell 29, (1982), 1015-1026;

Quatroccio a spol., Plant Mol. Biol. 15, (1990) 81-93).

Koncová terminační sekvence molekuly nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu může být použita pro správné ukončení transkripce a rovněž i pro adici poly-A-řetězce na tento transkript, kterému se připisuje funkce při stabilizaci transkriptů. Tyto elementy jsou popsány v literatuře (viz Gielen a spol., 1989, EMBO J. 8:23-29) a jsou zpravidla libovolně zaměnitelné.

·· · ·· · a · · · · · · » β ···· · · · · 4 • ······· ···♦··· ·

4 9· ί · 4 4

Molekuly nukleových kyselin podle tohoto vynálezu, popřípadě molekuly nukleových kyselin, použité podle tohoto vynálezu, je možno používat pro přípravu transgenních rostlinných buněk a rostlin, v nichž je aktivita rozpustné škrobové synthasy III a rovněž minimálně jednoho dalšího enzymu ovlivňujícího metabolismus škrobu zvýšena a/nebo snížena.

Při tom se molekuly nukleových kyselin podle tohoto vynálezu, popřípadě molekuly nukleových kyselin, použité podle tohoto vynálezu, vkládají do vhodných vektorů spolu s regulačními sekvencemi nukleových kyselin, potřebnými pro účinnou transkripci v rostlinných buňkách a vkládají se do rostlinných buněk. Existuje možnost použít molekuly nukleových kyselin podle tohoto vynálezu, popřípadě molekuly nukleových kyselin, použité podle tohoto vynálezu pro inhibici syntézy endogenní rozpustné škrobové synthasy III a/nebo minimálně jednoho dalšího proteinu ze skupiny A v buňkách. To je možno provést pomocí antisense-konstruktů mutagenezí in vivo, použitím kosupresního efektu nebo pomocí ribozymů konstruovaných odpovídajícím způsobem. Jinak je možno molekuly nukleových kyselin podle tohoto vynálezu, popřípadě molekuly nukleových kyselin, použité podle tohoto vynálezu, použít pro expresi rozpustné škrobové synthasy III a/nebo minimálně jednoho dalšího proteinu ze skupiny A v buňkách transgenních rostlin a tak dosáhnout zvýšení aktivity příslušných exprimovaných enzymů v buňkách.

Kromě toho existuje možnost použít molekuly nukleových kyselin podle tohoto vynálezu, popřípadě molekuly nukleových kyselin, použité podle tohoto vynálezu, pro inhibici syntézy endogenní rozpustné škrobové synthasy III a pro přeexpresi minimálně jednoho dalšího proteinu ze skupiny A v buňkách.

A konečně je možno molekuly nukleových kyselin podle tohoto

ΦΦΦ φ φφφφφ φ φ φφφ φ · φφφφφ φφ φ φφφ · φ φ φ · φφφ φφ φ φφ φ vynálezu, popřípadě molekuly nukleových kyselin, použité podle tohoto vynálezu, použít i pro expresi rozpustné škrobové synthasy III a inhibici minimálně jednoho dalšího proteinu ze skupiny A v buňkách transgenních rostlin. Obě posledně uvedené formy provedení tohoto vynálezu tak vedou k současnému potlačení a zvýšení aktivity příslušných inhibovaných resp. exprimovaných enzymů v buňkách.

Dalším předmětem tohoto vynálezu je vektor, obsažený v molekule nukleových kyselin podle tohoto vynálezu.

Pojem vektor zahrnuje plasmidy, kosmidy, viry, bakteriofágy a ostatní vektory běžné v genové technice, které obsahují molekuly nukleových kyselin podle tohoto vynálezu a které jsou vhodné pro transformaci buněk. Tyto vektory jsou vhodné zejména pro transformaci rostlinných buněk. Obzvláště výhodně umožňují tyto vektory integraci molekul nukleových kyselin podle tohoto vynálezu, případně se stínícími regulačními oblastmi, do genomu rostlinné buňky. Jako příklady je možno uvést binární vektory, jako jsou například pBinAR nebo pBinB33, které je možno použít při transferu genů, zprostředkovaném agrobakteriemi.

Při výhodné formě provedení tohoto vynálezu se vektor podle tohoto vynálezu vyznačuje tím, že se nukleotidová sekvence, která kóduje protein s funkcí rozpustné škrobové synthasy III nebo jeho fragmenty, vyskytuje v sense- nebo antisense-orientaci.

V další výhodné formě provedení- tohoto vynálezu se vektor podle tohoto vynálezu vyznačuje tím, že nukleotidová sekvence, která kóduje jeden nebo více proteinů ze skupiny A nebo jejich fragmenty, se vyskytuje v sense- nebo anti• · • « · ý · · ··· • · · · φ · · · 9 9 • « ···· 9 9 9 9999 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9

9 ·· · ·· · sense-orientaci.

V další výhodné formě provedení tohoto vynálezu se vektor podle tohoto vynálezu vyznačuje tím, že nukleotidová sekvence, která kóduje více proteinů, vybraných ze skupiny A nebo jejich fragmenty, se vyskytuje částečně v sense-orientaci a částečně v antisense-orientaci.

Vektor podle tohoto vynálezu obsahuje obzvláště výhodně jeden nebo více regulačních prvků, které umožňují transkripci a syntézu RNA v pro- nebo eukaryontických buňkách .

Kromě toho je možné pomocí běžných postupů molekulární biologie (viz např. Sambrook a spol., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. vyd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) zavádět různé mutace do DNA-sekvencí podle tohoto vynálezu resp. do sekvencí použitých podle tohoto vynálezu, přičemž dochází k syntéze proteinů, případně s pozměněnými biologickými vlastnostmi. Při tom je možno získávat deleční mutanty, u nichž se postupným vyštěpováním z 5’- nebo 3’-konce získají kódující DNA-sekvence, které vedou k syntéze příslušných zkrácených proteinů. Toto vyštěpování na 5’-konci DNA-sekvence např. umožňuje cílenou přípravu enzymů, které po odstranění příslušných transitních nebo signálních sekvencí se již nebudou vyskytovat ve svém původním (homologickém) umístění v buňkách (Kompartiment), nýbrž budou lokalizovány v cytosolu nebo po adici jiných signálních sekvencí v jedné nebo několika (heterologických) částech buňky (jako je např. plastid, vakuola, mitochondrium, apoplast).

Lokální mutace je možno zavádět i do pozic, v nichž má • · · · · • · · 9 9 9

9 9 · 99 • ······· · změna aminokyselinové sekvence vliv například na enzymovou aktivitu nebo na regulaci enzymu. Tímto způsobem je možno například připravovat mutanty, které mají změněnou hodnotu Kj^ nebo k_cat, nebo které již nepodléhají regulačním mechanismům, které v buňce normálně probíhají, jako jsou například allosterické regulace nebo kovalentní modifikace.

Pro genově-technickou manipulaci v prokaryontických buňkách mohou být DNA-sekvence nebo fragmenty těchto sekvencí podle tohoto vynálezu, popřípadě sekvencí, použitých podle tohoto vynálezu, vkládány do plasmidu, který umožňuje mutagenezi nebo změnu sekvence rekombinací DNA-sekvencí. Pomocí molekulárně-biologických standardních postupů (viz Sambrook a spol., 1989, cit.dříve) je možno provádět záměnu bází nebo připojovat přirozené nebo syntetické sekvence. Pro spojování DNA-částí navzájem je možno na tyto části připojovat adaptory nebo linkery. Dále je možno používat manipulace, které usnadňují přístup k příslušným restrikčním místům nebo které odstraňují nadbytečnou DNA nebo již nepotřebná restrikční místa. Pro provádění insercí, deleci nebo substitucí je možno používat in vitro-mutagenezi, primer repair , restrikci nebo ligací. Jako analytická metoda se používá zpravidla sekvenční analýza, restrikční analýza a případně je možno používat i další biochemické a molekulárně-biologické metody.

Dalším předmětem tohoto vynálezu je transgenní hostitelská buňka s pozměněným metabolismem škrobu, zejména prokaryontické nebo eukaryontické buňky, výhodně bakteriální nebo rostlinné (monokotylní nebo dikotylní) buňky (např. buňky z E.coli, Agrobacterium, Solanaceae, Poideae, žita, ječmene, ovsa, kukuřice, pšenice, prosa, sága, rýže, hrachu, dřeňového hrachu, manioku, brambor, rajčat, řepky, sojových

9 9 ··· · 9

9 9 · 9 · 9 · ·

9 9 9 9*9· 9 9

9999999 9999999 9 bobů, konopí, lnu, slunečnic, krmného hrachu, bohů mung, fazolí, banánů nebo maranty, které obsahují jednu nebo více molekul nukleových kyselin podle tohoto vynálezu nebo jeden nebo více vektorů podle tohoto vynálezu, nebo které z těchto buněk pocházejí.

Dalším předmětem tohoto vynálezu je transgenní hostitelská buňka s pozměněným metabolismem škrobu, zejména prokaryontické nebo eukaryontické buňky, výhodně bakteriální nebo rostlinné buňky (např. z E.coli, Agrobacterium, Solanaceae, Poideae, žita, ječmene, ovsa, kukuřice, pšenice, prosa, sága, rýže, hrachu, dřeňového hrachu, manioku, brambor, rajčat, řepky, sojových bobů, konopí, lnu, slunečnic, krmného hrachu, bobů mung, fazolí, banánů nebo maranty, které

a) obsahují minimálně jednu nukleotidovou sekvenci, kódující protein s funkcí rozpustné škrobové synthasy III nebo jejích fragmentů a

b) obsahují jednu nebo více nukleotidových sekvencí kódujících protein vybraný ze skupiny A nebo jeho fragmenty nebo nukleotidové sekvence hybridizované s těmito mokulami nukleových kyselin, nebo které z těchto buněk pocházej i.

Kromě použití molekul nukleových kyselin podle tohoto vynálezu je možno hostitelské buňky podle tohoto vynálezu připravovat i postupnou transformací (například takzvanou supertransformací), přičemž se používá několik částí nukleotidové sekvence podle tohoto vynálezu nebo několik vektorů obsahujících části nukleotidové sekvence podle tohoto vynálezu, které kódují protein s funkcí rozpustné ·· · • · škrobové synthasy III nebo jeho fragmenty, a kromě toho jeden nebo více proteinů vybraných ze skupiny A zahrnující rozvětvující enzymy, ADP-glukoso-pyrofosforylasy, škrobové synthasy vázané na škrobové zrno, rozpustné škrobové synthasy I , II nebo jiné, enzymy odstraňující rozvětvení, disproporcionační enzymy, plastidové škrobové fosforylasy, amylasy, glukosidasy, Rl-enzymy, jejich fragmenty - především rozpustné škrobové synthasy II, rozpustné škrobové synthasy I a/nebo rozvětvující enzymy a jejich fragmenty - a molekuly nukleových kyselin, hybridizující s uvedenými nukleovými sekvencemi nebo jejich fragmenty, které se v několika transformačních operacích vkládají do buněk. Při tom se buňka transformuje a) alespoň s jednou molekulou nukleové kyseliny, která kóduje protein s funkcí rozpustné škrobové synthasy III, jejím fragmentem nebo s vektorem obsahujícím uvedenou molekulu nukleové kyseliny, a b) s jednou nebo více molekulami nukleové kyseliny, kódující protein, vybraný ze skupiny A zahrnující rozvětvující enzymy, ADP-glukoso-pyrofosforylasy, škrobové synthasy vázané na škrobové zrno, rozpustné škrobové synthasy I, II nebo jiné, enzymy odstraňující rozvětvení, disproporcionační enzymy, amylasy, glukosidasy, plastidové škrobové fosforylasy a Rl-enzymy nebo jejich fragmenty - především rozpustné škrobové synthasy II, rozpustné škrobové synthasy I a/nebo rozvětvuj ící enzymy a jejich fragmenty -as molekulami nukleových kyselin, hybridizujících s jednou z uvedených nukleotidových sekvencí nebo s jejich fragmenty nebo s jedním nebo několika vektory obsahujícími jeden nebo několik uvedených molekul nukleové kyseliny, přičemž tato transformace probíhá v libovolném pořadí, současně nebo postupně.

Dalším předmětem tohoto vynálezu je způsob přípravy transgenní hostitelské buňky, bakteriální buňky, rostlinné φφ · φφ φ

φφ • φ φ φ φφφ φφφφφ φ φ φφφφφ φ

buňky nebo rostliny, syntetizující modifikovaný škrob, při kterém se a) alespoň jedna molekula nukleové kyseliny, kódující protein s funkcí rozpustné škrobové synthasy III nebo její fragmenty a b) jedna nebo více molekul nukleové kyseliny, kódujících protein vybraný ze skupiny A zahrnující rozvětvující enzymy, ADP-glukoso-pyrofosforylasy, škrobové synthasy vázané na škrobové zrno, rozpustné škrobové synthasy I, II nebo jiné, enzymy odstraňující rozvětvení, disproporcionační enzymy, amylasy, glukosidasy, plastidové škrobové fosforylasy a Rl-enzymy nebo jejich fragmenty - především rozpustné škrobové synthasy II, rozpustné škrobové synthasy I a/nebo rozvětvující enzymy a jejich fragmenty - a molekuly nukleových kyselin hybridizující s jednou z uvedených nukleotidových sekvencí nebo s jejich fragmenty integruje do genomu buňky a případně se z této transgenní rostlinné buňky regeneruje celá rostlina.

Další forma provedení tohoto vynálezu se týká způsobu přípravy transgenní hostitelské buňky, bakteriální buňky, rostlinné buňky nebo rostliny syntetizující modifikovaný škrob, při kterém se do genomu buňky integruje jedna nebo více molekul nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu nebo jeden nebo více vektorů podle tohoto vynálezu a případně se z této transgenní rostlinné buňky regeneruje celá rostlina.

Nukleové kyseliny, získané podle tohoto vynálezu, umožňují pomocí genově-technických metod zasahovat do metabolismu škrobu v rostlinách a měnit jej takovým způsobem, že dojde k syntéze modifikovaného škrobu, který má ve srovnání se škrobem, syntetizovaným divokým typem rostlinm, odlišné vlastnosti, jako jsou např. struktura,' obsah vlhkosti, obsah proteinů, obsah lipidů, obsah vlákniny, obsah popela/fosfátů, poměr amylosa/amylopektin, rozložení molekulové hmotnos·· · ··

ti, stupeň rozvětvení, velikost a tvar zrna a dále chování při toku a sorpci, teplota mazovatění, viskozita, zahušťovací schopnost, rozpustnost, struktura mazu, transparence, odolnost proti teplu, střižným silám a kyselinám, retrogradační tendence, tvorba gelů, stabilita při zmrazování a rozmrazování, tvorba komplexů, stupeň vázání jodu, schopnost tvorby filmů, lepivost, enzymatická stabilita, stravitelnost nebo reaktivita.

Zvýšením aktivity proteinů, podílejících se na metabolismu škrobu, například superexpresí odpovídajících molekul nukleové kyseliny nebo přípravou mutantů, které již nepodléhají vlastním regulačním mechanismům buňky a/nebo které mají odlišnou teplotní závislost aktivity, je možno dosáhnout u příslušných genově-technicky upravených rostlin i zvýšení výnosu. Zvýšením aktivity jednoho nebo více proteinů, podílejících se na metabolismu škrobu v určitých buňkách tkání, ukládajících škrob v transformovaných rostlinách, jako např. v hlízách brambor nebo v endospermu kukuřice nebo pšenice, je možno dosáhnout výrazného zvýšení výnosů. Ekonomický význam a výhody, plynoucí z možnosti zasahování do metabolismu škrobu jsou ohromné.

Při expresi molekuly nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu, nebo molekuly nukleové kyseliny použité podle tohoto vynálezu, v rostlinách v zásadě existuje možnost lokalizovat syntetizovaný protein do jakékoli části rostlinné buňky. Aby bylo možno provést tuto lokalizaci do určité části buňky (cytosol, vakuola, apoplast, plastidy, mitochondrie), je nutno tranzitní nebo signální sekvenci, uskutečňující tuto lokalizaci, případně vyštěpit (odstranit) a zbývající kódující oblast případně spojit s DNA-sekvencemi, zajišťujícími lokalizaci do příslušné části buňky. Takovéto • 4 • 44 4 · 4 4 4 ♦ 4 sekvence jsou známy (viz např. Braun a spol., EMBO J. 11 (1992), 3219-3227; Volter a spol., Proč. Nati. Acad. Sci.

USA 85 (1988), 846-850; Sonnewald a spol., Plant. J. 1 (1991), 95-106). Tuto lokalizaci do určitých rostlinných částí nebo tkání je možno zajistit např. pomocí specifických promotorů, které jsou odborníkům dobře známy.

Přípravu rostlinných buněk se sníženou aktivitou proteinu podílejícího se na metabolismu škrobu je možno provést například expresí příslušné antisense-RNA, sense-RNA pro dosažení ko-supresního efektu, in vivo-mutagenezí nebo expresí odpovídajícím způsobem zkonstruovaného ribozymu specificky štěpícího transkripty kódující proteiny, které se podílejí na metabolismu škrobu, s použitím molekuly nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu, přednostně expresí antisense-transkriptů.

K tomu je možno použít jednak molekulu DNA, která obsahuje celou sekvenci kódující protein, podílející se na syntéze škrobu, případně i s existujícími stínícími sekvencemi a rovněž i DNA-molekuly, které obsahují pouze části kódující sekvence, přičemž tyto části mají minimální délku 15 bp, raději minimálně 100-500 bp a zejména nad 500 bp. Zpravidla se používají molekuly DNA, které jsou kratší než 5000 bp, přednostně kratší než 2500 bp.

Je možno použít i DNA-sekvence, vykazující vysoký stupeň homologie s DNA-molekulami podle tohoto vynálezu, které s nimi však nejsou zcela identické. Minimální míra homologie by měla být vyšší než cca 75 až 85 %,- výhodná je homologie cca 85 až 95 %.

Exprese ribozymů pro snížení aktivity určitých prote22 φφ · φφ φ φφ φφφ · · φ φ • φ · φ φ · φ φ φφ φ φ φφφφ φ φ φ φφφφ φ φ φ φφφ φφφ φφ φφ φ φφ φ φφφ inů v buňkách je odborníkům známa a je popsána například v EP-B1-0 321 201. Expresi ribozymů v rostlinných buňkách popsali např. Feyter a spol. (Mol. Gen. Genet. 250 (1996), 329-338).

Snížení aktivity proteinů, podílejících se na metabolismu škrobu v rostlinných buňkách podle tohoto vynálezu, je možno dosáhnout i tzv. in vivo-mutagenezí, při níž se při transformaci buněk zavádí do buněk hybridní RNA-DNA-oligonukleotid (Chimeroplast) (Kipp P.B. a spol., Poster Session on 5¹^ International Congress of Plant Molecular Biology, 21-27, září 1997, Singapur; R. A. Dixon a C. J. Arntzen, referát na symposiu Metabolic Engineering in Transgenic Plants, Keystone Symposia, Copper Mountain, CO, USA, TIBTECH 15 (1997), 441-447; mezinárodní přihláška patentu VO 95/15972; Křen a spol., Hepatology 25 (1997), 1462-1468; Cole-Strauss a spol., Science 273 (1996), 13861389).

Část DNA-komponenty použitého RNA-DNA-oligonukleotidu je homologická se sekvencí nukleových kyselin endogenního proteinu, na rozdíl od sekvencí nukleových kyselin tohoto endogenního proteinu však vykazuje mutaci nebo obsahuje heterologickou oblast, která je homologickými oblastmi obklopena .

Párováním bází homologických oblastí RNA-DNA-oligonukleotidu a endogenní molekuly nukleové kyseliny s následující rekombinací je možno mutace nebo heterologické oblasti obsažené v DNA-složce RNA-DNA-óligonukleotidu přenést do genomu rostlinné buňky. To vede ke snížení aktivity proteinu podílejícího se na metabolismu škrobu.

4 • 44

4 4 4 4

4 4 4 4 4

4444444 4

4 4 4 4

4 44

Alternativně je možno provést snížení aktivity proteinu podílejícího se na metabolismu škrobu v rostlinných buňkách s použitím ko-supresního efektu. Tento postup popsali např. Jorgensen (Trends Biotechnol. 8 (1990), 340-344), Niebel a spol. (Curr. Top. Microbiol. Immunol. 197 (1995), 91-103), Flavell a spol., (Curr. Top. Microbiol. Immunol.

197 (1995) 43-46), Palaqui a Vaucheret (Plant. Mol. Biol.

(1995), 149-159), Vaucheret a spol., (Mol. Gen. Genet.

248 (1995), 311-317), de Borne a spol. (Mol. Gen. Genet.

243 (1994), 613-621).

Pro inhibici syntézy více enzymů, podílejících se na biosyntéze škrobu v transformovaných rostlinách, je možno pro transformaci použít DNA-molekuly, které obsahují zároveň více oblastí kódujících příslušné enzymy v anti-sense orientaci za řízení vhodného promotoru. Přitom může být alternativně každá sekvence řízena jedním vhodným promotorem, nebo je možno tyto sekvence transkribovat jako fúzi jednoho společného promotoru, takže syntéza příslušného proteinu je inhibována buď přibližně ve stejné nebo v rozdílné míře. Pro délku jednotlivých kódujících oblastí, použitých v takovémto konstruktu, platí to, co bylo uvedeno dříve u přípravy antisense-konstruktů. Horní mez pro počet transkribovaných antisense-fragmentů v promotoru, obsahujícím takovouto DNAmolekulu, v zásadě neexistuje. Vzniklý transkript by však zpravidla neměl přesahovat délku 25 kb, přednostně 15 kb.

Pomocí molekuly nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu, popřípadě molekuly nukleové kyseliny, použité podle tohoto vynálezu, je tudíž možno transformovat rostlinné buňky a současně inhibovat syntézu více enzymů.

Dále je možno molekuly nukleové kyseliny podle tohoto • 4 · ·* · *·

4« 4 4 · · · ·

4 4 4 4 · 4 · · · • 4 44*4 4 » 4 ·4«· · · · • 44 · 4 4 · ·

4 44 « 44 4 vynálezu, popřípadě molekuly nukleové kyseliny použité podle tohoto vynálezu, vkládat do klasických mutantů, které jsou z hlediska jednoho nebo několika genů při biosyntéze škrobu deficitní nebo defektní (Shannon a Garwood, 1984, v publikaci Vhistler, BeMiller a Paschall, Starch: Chemistry a Technology, Academie Press, London, 2^n<^ Edition: 25-86). Tyto defekty se mohou vztahovat například na následující proteiny: škrobové synthasy vázané na škrobové zrno (GBSS I) a rozpustné škrobové synthasy (SSI, II, III a jiné), rozvětvující enzymy (BE I, Ha a lib), debranching enzymy (R-enzymy, isoamylasy, pullulanasy), disproporcionační enzymy a plastidové škrobové fosforylasy.

Tento vynález se týká i transgenních rostlinných buněk, které je možno získat podle některého postupu podle tohoto vynálezu, které byly transformovány molekulou nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu, popřípadě molekulou nukleové kyseliny, použité podle tohoto vynálezu, nebo vektorem a dále transgenních rostlinných buněk nebo rostlin, které z takto transformovaných buněk pocházejí. Buňky podle tohoto vynálezu obsahují jednu nebo více molekul nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu, popřípadě jednu nebo více molekul nukleové kyseliny, použité podle tohoto vynálezu, které jsou zejména spojeny s jedním nebo několika regulačními DNAprvky (např. promotor, enhancer, terminátor), které zajišťují transkripci v rostlinných buňkách, především s promotorem. Buňky podle tohoto vynálezu je možno od přirozeně se vyskytujících rostlinných buněk odlišit mimo jiné tím, že obsahují molekulu nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu, která se v přirozených buňkách nevyskytuje nebo tím, že tato molekula je integrována v takovém místě genomu buňky, kde se jinak nevyskytuje, t.zn. v odlišném genomickém prostředí.

Dále je možno transgenní rostlinné buňky podle tohoto vyná25 • •9 Φ » · · ® • Φ Φ φ Φ · Φ Φ «••Φ φ··· · · • Φ ΦΦΦΦ * Φ ΦΦΦΦΦΦ· · • « Φ ΦΦΦ lezu od přirozeně se vyskytujících rostlinných buněk odlišit tím, že alespoň jedna kopie molekuly nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu je stabilně integrována do genomu, případně spolu s přirozeně se vyskytujícími kopiemi této molekuly, popřípadě molekuly nukleové kyseliny, použité podle tohoto vynálezu, v buňkách. Jestliže jde u molekuly (molekul), zavedené do buněk, o kopie navíc k molekulám s přirozeným výskytem v těchto buňkách, je možno rostlinné buňky podle tohoto vynálezu odlišit od buněk s přirozeným výskytem zejména tím, že tyto (tato) kopie navíc je/jsou lolalizovány na těch místech v genomu, kde se přirozeně nevyskytuje/nevyskytují. Toto je možno prokázat například pomocí Southern Blot-analýzy.

Výhodné jsou takové rostlinné buňky podle tohoto vynálezu, u nichž je enzymová aktivita jednotlivých enzymů, podílejících se na metabolismu škrobu, zvýšena a/nebo snížena minimálně o 10 %, obzvláště výhodně minimálně o 30 % a zcela obzvláště výhodně minimálně o 50 %.

Dále je možno rostlinné buňky podle tohoto vynálezu výhodně odlišit od rostlinných buněk s přirozeným výskytem podle minimálně jedné z následujících charakteristik: jestliže je vložená molekula nukleové kyseliny heterologická ve vztahu k rostlinné buňce, obsahují transgenní rostlinné buňky transkripty této vložené molekuly nukleové kyseliny.

To je možno prokázat např. pomocí Northern Blot-analýzy. Rostlinné buňky podle tohoto vynálezu mohou např. obsahovat jeden nebo několik proteinů kódovaných molekulou nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu, popřípadě molekulou nukleové kyseliny, použitou podle tohoto vynálézu. To je možno prokázat např. pomocí imunologických metod, zejména VesternBlot-analýzou.

Jestliže je vložená molekula nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu, popřípadě molekula nukleové kyseliny, použitá podle tohoto vynálezu, homologická ve vztahu k rostlinné buňce, je možno buňky podle tohoto vynálezu odlišit od přirozeně se vyskytujících buněk např. pomocí další exprese molekuly nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu, popřípadě molekuly nukleové kyseliny použité podle tohoto vynálezu. Transgenní rostlinné buňky obsahují například více nebo méně transkriptů molekul nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu, popřípadě molekul nukleové kyseliny, použité podle tohoto vynálezu. To je možno prokázat například pomocí Northern Blot-analýzy. Více resp. méně přitom znamená minimálně o 10 % více resp. méně, zejména minimálně o 20 % více resp. méně a obzvláště výhodně minimálně o 50 % více resp. méně transkriptů, než v odpovídajících netransformovaných buňkách. Výhodně tyto buňky vykazují i odpovídající (minimálně 10% , 20% , popřípadě 50%) nárůst, popřípadě snížení obsahu proteinu, kódovaného zavedenou molekulou nukleové kyseliny.

Transgenní rostlinné buňky je možno regenerovat na celé rostliny postupy, které jsou odborníkům známy. Rostliny získané regenerací transgenních rostlinných buněk podle tohoto vynálezu a rovněž postupy získávání transgenních rostlin regenerací celých rostlin z rostlinných buněk podle tohoto vynálezu jsou rovněž předmětem tohoto vynálezu. Dále jsou předmětem tohoto vynálezu rostliny, které obsahují transgenní rostlinné buňky podle tohoto vynálezu. Těmito transgenními rostlinami mohou být principiálně rostliny jakéhokoli druhu, to znamená jak monokotýlní, tak i dikotylní rostliny. Výhodné jsou užitkové rostliny a rostliny ukládající škrob, jako je například obilí (žito, ječmen, oves, kukuřice, pšenice, proso atd.), ságo, rýže, hrách, dřeňový

0 ··

0 0 0 ·

0 0 0 0 0

0000000 0 • 0

0 ·

0 00 hrách, maniok, brambory, rajčata, řepka, sojové boby, konopí, len, slunečnice, krmný hrách, boby mung nebo maranta.

Tento vynález se týká i množitelského materiálu rostlin podle tohoto vynálezu, jako jsou například plody, semena, hlízy, části kořenů (Vurzelstock), semenáčky, sazenice, kally, protoplasty, buněčné kultury apod.

Změna enzymatické aktivity enzymů, podílejících se na metabolismu škrobu, způsobuje v rostlinách, získaných podle tohoto vynálezu, syntézu škrobu s pozměněnou strukturou.

Pro zavedení cizích genů do vyšších rostlin je k dispozici velký počet klonovacích vektorů, které obsahují replikační signál pro E.coli a markerový gen pro selekci transformovaných bakteriálních buněk. Jako příklady takovýchto vektorů je možno uvést pBR322, pUC-serie, M13mpserie, pACYC184 apod. Požadované sekvence je možno zavést do vektoru na příslušné restrikční místo štěpení. Získaný plasmid se použije pro transformaci buněk E.coli. Transformované buňky E.coli se napěstují ve vhodném prostředí a potom se izolují a provede se jejich lýze. Plasmid se znovu regeneruje. Jako analytické metody pro charakterizaci získané plasmid-DNA se všeobecně používá restrikční analýza, gelová elektroforéza a další biochemické a molekulárně-biochemické metody (Sambrook a spol., cit. dříve). Po každé manipulaci je možno plasmid-DNA rozštěpit a získané DNA-fragmenty navázat na jiné DNA-sekvence. Každou sekvenci plasmid-DNA je možno klonovat ve stejných nebo jiných plasmidech.

Pro zavedení DNA do rostlinné hostitelské buňky je k dispozici celá řada postupů. Tyto postupy zahrnují trans- 28 • Φ Φ · · « φ · · · · · · · φφφφ · φ φ · φφ • ······· ·····»· · formaci rostlinných buněk s T-DNA s použitím Agrobacterium tumefaciens nebo Agrobacterium rhizogenes jako transformačním prostředkem, fúzi protoplastů s použitím polyethylenglykolu (PEG), injikování, elektroporaci DNA, vkládání DNA pomocí biolistické metody a další možnosti (Gene Transfer to Plants. S. 24-29, eds. Potrykus, I. a Spannenberg, G., Springer Verlag Berlin Heidelberg 1995).

Při injikování a elektroporaci DNA do rostlinných buněk se na použité plasmidy resp. DNA nekladou žádné zvláštní požadavky. Je možno používat jednoduché plasmidy, jako např. pUC-deriváty. Jestliže se však mají z takto transformovaných buněk regenerovat celé rostliny, je nutná přítomnost vybraného markerového genu.

V závislosti na způsobu zavádění požadovaného genu do rostlinné buňky mohou být zapotřebí další DNA-sekvence. Jestliže se například pro transformaci rostlinné buňky používá Ti- nebo Ri-plasmid, musí být minimálně pravý okraj (Begrenzung), často však pravý i levý okraj Ti- a Ri-plasmid T-DNA spojen jako boční oblast se zaváděnými geny.

Jestliže se pro transformaci používají Agrobakterie, musí být zaváděná DNA klonována ve speciálních plasmidech, a to buď v intermediárním vektoru nebo v binárním vektoru. Intermediární vektory mohou být integrovány podle sekvencí, které jsou homologické se sekvencemi v T-DNA, homologickou rekombinací do Ti- nebo Ri-plasmidu Agrobakterií. Tento plasmid obsahuje kromě toho vir-region, nezbytný pro transfer T-DNA. Intermediární vektory, není možno replikovat v Agrobakteriích. S použitím pomocného plasmidu (Helferp.) je možno intermediární vektor přenést do Agrobacterium tumefaciens (konjugace). Binární vektory je možno replikovat • · • · • · · · · • ····· 9 · • · · »

jak v E.coli,, tak i v Agrobakteriích. Obsahují selekční markerový gen a linker nebo polylinker, které jsou obklopeny pravou a levou mezní oblastí T-DNA. V Agrobakteriích mohou být transformovány přímo (Holsters a spol., (1978) Mol. Gen. Genet. 163:181-187). Agrobakterium použité jako hostitelská buňka by mělo obsahovat plasmid nesoucí vir-region. Tento vir-region je nezbytný pro transfer T-DNA v rostlinné buňce. Mohou být přítomny i další T-DNA. Takto transformované Agrobakterium se použije pro transformaci rostlinných buněk.

Použití T-DNA pro transformaci rostlinných buněk je předmětem intenzivního studia a je popsáno v EP 120516; Hoekema, v práci: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), kap. V; Fraley a spol., Crit Rev.Plant. Sci. 4: 1-46 a An a spol. (1985) EMBO J. 4:277-287.

Pro transfer DNA do rostlinné buňky je možno ko-kultivovat rostlinné explantáty účelně s Agrobacterium tumefaciens nebo s Agrobacterium rhizogenes. Z infikovaného rostlinného materiálu (například kousky listů, části stonků, kořeny, ale i protoplasty nebo suspenzně kultivované rostlinné buňky) je potom možno regenerovat opět celé rostliny ve vhodném mediu, které může obsahovat např. antibiotika nebo biocidy pro selekci transformovaných buněk. U takto získaných rostlin je potom možno zjišťovat přítomnost zavedené DNA. Pro zavádění cizí DNA s použitím biolistických postupů nebo transformací protoplastů jsou známy i jiné postupy (viz např. Villmitzer L., 1993 Transgenic Plants.

V publikaci: Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise (H.J.Rehm, G. Reed, A.Puhler( P.Stadler, eds.),

Vol. 2, 627-659, VCH Veinheim-New York-Basel-Cambridge).

Zatímco transformace dikotylních rostlin prostřednictvím Ti-plasmid-vektorového systému pomocí Agrobacterium tumefaciens je dostatečně známa, naproti tomu novější práce ukazují na to, že je možno s použitím vektorů na bázi Agrobakterií provádět i transformaci monokotylních rostlin (Chán a spol., Plant Mol. Biol. 22(1993), 491-506; Hiei a spol., Plant J. 6 (1994), 271-282.

Alternativními systémy pro transformaci monokotylních rostlin jsou transformace s použitím biolistických postupů, transformace protoplastů, elektroporace částečně permeabilizovaných buněk nebo vkládání DNA pomocí skleněných vláken.

V literatuře je popisována zejména transformace kukuřice (viz např. VO 95/06128, EP 0 513 849; EP 0 465 875). V EP 292 435 je popsán postup, podle něhož je možno získat fertilní rostliny z bezslizového (schleimlos) měkkého (drobivého /friable/) granulárního kukuřičného kallusu. Shillito a spol. (Bio/Technology 7 (1989), 581) v této souvislosti pozorovali, že pro možnost regenerace na fertilní rostliny je nezbytné vycházet ze suspenzních kultur kallusu, z nichž je možno připravit dělící se kulturu protoplastů se schopností regenerace na celé rostliny. Prioli a Soendahl (Bio/Technology 7 (1989) , 589) popsali rovněž regeneraci a získávání fertilních rostlin kukuřice a kukuřičných protoplastů.

Jakmile se zaváděná DNA integruje do genomu rostlinné buňky, je v tomto místě zpravidla stabilní a zůstává zachována i u potomků původní transformované buňky. Obsahuje zpravidla jeden selekční markér, který zajišťuje transformovaným rostlinným buňkám resistencí proti biocidům nebo

9

F

9 • 9 9 9 • 9 9 9 9

99999 9 9 antibiotikům jako je kanamycin, G418, bleomycin, hygromycin nebo fosfinothricin aj. Jednotlivé vybrané markéry by měly proto umožňovat odlišení transformovaných buněk od buněk, kterým zavedená DNA chybí.

Transformované buňky rostou v rostlině normálním způsobem (viz též McCormick a spol. (1986) Plant Cell Reports

5:81-84). Získané rostliny je možno normálně pěstovat a křížit s rostlinami, které mají stejné transformované dědičné vlastnosti nebo jiné dědičné vlastnosti. Tímto způsobem získaná hybridní individua mají odpovídající fenotypové vlastnosti.

Je třeba provést pěstování dvou nebo více generací, aby bylo zajištěno, že fenotypové vlastnosti zůstaly zachovány a že jsou dědičné. Rovněž je třeba sklidit semena a podobně, aby bylo zajištěno, že zůstal zachován příslušný fenotyp a ostatní vlastnosti.

Transgenní rostlinné buňky a rostliny podle tohoto vynálezu syntetizují na základě exprese molekuly nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu škrob, který má například pozměněné fyzikálně-chemické vlastnosti v porovnání se škrobem obsaženým v původních (Vildtyp) rostlinách.

Ještě dalším předmětem tohoto vynálezu je i škrob, který je možno získat z rostlinné buňky, rostliny a jejího množitelského materiálu podle tohoto vynálezu nebo postupem podle tohoto vynálezu.

Rovněž je dalším předmětem tohoto vynálezu postup přípravy škrobu známým způsobem, přičemž se zpracovávají resp. integruji do tohoto postupu hostitelské buňky, rostlinné • · · ·· · • · · · · · · · · ··»· · · · · · · • ·····*· ······· e • · · ··· · · • · « · · * · · · buňky, rostliny, části rostlin nebo množitelský materiál podle tohoto vynálezu.

Škrob podle tohoto vynálezu se vyznačuje v jedné výhodné formě provedení tím, že v porovnání se škrobem, získaný z netransformovaných buněk nebo rostlin (tzv. divoký typ), má snížený obsah fosfátů minimálně o 30 %, výhodně minimálně o 50 % , obzvláště minimálně o 70 % a obzvláště výhodně minimálně o 90 % a jeho podíl glukanu (viz frakce 3 v příkladu č.13) po úpravě isoamylasou v eluátu, získaném ze systému HPLC kolon, skládajícího se ze dvou za sebou zařazených kolon s náplní TSK-Gel 2000SV a TSK-Gel 3000SV v 10 mM natriumacetátového pufru pH 3,0 (při průtoku 0,35 ml/min, jak je uvedeno v příkladu č.13), je zvýšen minimálně o 50 %, výhodně minimálně o 150 %, obzvláště minimálně o 300 % a obzvláště výhodně minimálně o 500 %.

V další formě provedení tohoto vynálezu se škrob podle tohoto vynálezu vyznačuje tím, že v porovnání se škrobem, získaným z netransformovaných buněk nebo rostlin (tzv. divoký typ), má obsah fosfátů zvýšený minimálně o 10 %, výhodně minimálně o 30 % a obzvláště výhodně minimálně o 50 % a jeho podíl glukanu (viz frakce 3 v příkladu č.13) po úpravě isoamylasou v eluátu, získaném ze systému HPLC kolon, skládajícího se ze dvou za sebou zařazených kolon náplní TSK-Gel 2000SV a TSK-Gel 3000SV v 10 mM natriumacetátového pufru pH 3,0 (při průtoku 0,35 ml/min jak je uvedeno v příkladu č.

13) je zvýšen minimálně o 50 % , výhodně minimálně o 150 %, obzvláště minimálně o 300 % a obzvláště výhodně minimálně o 500 %.

Postupy pro extrakci škrobu z rostlin nebo ze škrobnatých částí rostlin jsou odborníkům známy. Postupy pro extrakci škrobu z kukuřičných zrn jsou popsány například v práci, kterou publikovali Eckhoff a spol. (Cereal Chem.

(1996) 54-57). Extrakce kukuřičného škrobu v průmyslovém měřítku se provádí zpravidla tzv. mletím za mokra. Dále jsou postupy pro extrakci škrobu z různých šrobnatých rostlin popsány např. v publikacích Starch: Chemistry and Technology (Škrob - Chemie a technologie (vydavatel: Vhistler, BeMiller a Paschall (1994), 2. vydání, Academie Press lne. London Ltd; ISBN 0-12-746270-8; viz např. kapitola XII, str. 412-468: Škroby z kukuřice a sorghumu: Výroba; Vatson; kapitola XIII, str. 469-479: Tapiokový, marantový a ságový škrob: Výroba; Corbishley a Miller; kapitola XIV, str. 479-490: Bramborový škrob: Výroba a použití; Mitch; kapitola XV, str. 491-506: Pšeničný škrob: Výroba, modifikace a použití; Knight a Oson; a kapitola XVI, str. 507 až 528: Rýžový škrob: Výroba a použití; Rohmer a Klem). K zařízení, která se zpravidla k extrakci škrobu z rostlinného materiálu používají, patří separátory, dekantéry, hydrocyklony, sprayové sušárny a sušárny pro sušení ve fluidni vrstvě.

Další formou provedení tohoto vynálezu je i použití škrobu podle tohoto vynálezu v průmyslu, zejména při výrobě potravin, obalových materiálů nebo výrobků pro jedno použití .

Škrob podle tohoto vynálezu je možno modifikovat chemickými a/nebo fyzikálními postupy, které jsou odborníkům známy, přičemž tyto škroby v modifikované nebo nemodifikované formě jsou vhodné pro různé aplikace v potravinářské nebo nepotravinářské oblasti.

Možnosti použití škrobu podle tohoto vynálezu je možno v zásadě rozdělit do dvou velkých oblastí. Jedna oblast zahrnuje produkty hydrolýzy škrobu, zejména glukosu a glukosové stavební jednotky, které je možno získat enzymatickými nebo chemickými postupy. Tyto látky slouží jako výchozí suroviny pro další chemické modifikace a procesy, jako je například fermentace. V tomto případě může mít značný význam jednoduchost a nepříliš nákladné provedení hydrolytického postupu, který se v současné době provádí převážně enzymaticky s použitím amyloglukosidasy. Lze předpokládat, že úspory nákladů by se mohlo dosáhnout snížením množství použitých enzymů. Určitý vliv by mohla mít i strukturní přeměna škrobu, jako je např. zvětšení povrchu zrn, lehčí stravitelnost dosažená snížením stupně rozvětvení nebo změna sterické struktury, která určuje přístupnost molekuly pro použité enzymy.

Druhá oblast, v níž by se škroby podle tohoto vynálezu mohly vzhledem k jejich polymerní struktuře používat jako takzvané nativní škroby, se dělí na dvě hlavní oblasti použití:

1. Potravinářský průmysl

Škrob je klasickou přísadou do řady potravin, v nichž zpravidla plní funkci pojivá pro vodné složky, popřípadě se používá pro zvýšení viskozity nebo způsobuje zvýšenou tvorbu gelu. Důležitými vlastnostmi jsou přitom tekutost a sorpce, teplota botnání a mazovatění, viskozita a zahušfovací schopnost, rozpustnost škrobu, průhlednost a struktura škrobového mazu, odolnost proti působení tepla, -sťřižných sil a kyselin, tendence k retrogradaci, schopnost tvorby filmů, stabilita při zmrazování/rozmrazování, stravitelnost a rovněž schopnost tvorby komplexů například s anorganickými nebo • · φφφ φφ • · φ · · · φ φ · • · · · φ ♦ φ · φ φ • φφφφφφφ φφφφφφφ φ φφφ φφφ φφ •Φ φ φφ φ φφφ organickými ionty.

2. Nepotravinářský průmysl

V této široké oblasti je možno používat škrob jako pomocnou látku při různých výrobních procesech, popřípadě jako přísadu do technických produktů. Škrob jako pomocná látka se používá zejména v papírenském průmyslu a v průmyslu výroby lepenky. Škrob se v této aplikaci používá především pro retardaci (vázání pevných látek), vázání plnidel a jemných částic, jako ztužovací prostředek a jako prostředek pro odvodňováni. Kromě toho se využívají výhodné vlastnosti škrobu pro dosažení tuhosti, tvrdosti, akustických vlastností, požadovaného omaku, lesku, hladkosti, odolnosti proti štěpení a rovněž pro dosažení požadovaných vlastností povrchu.

2.1 Průmysl výroby papíru a lepenky

Při výrobě papíru se rozlišují čtyři oblasti použití, a to úprava povrchu, natírání, úprava vlastnosti papírenské hmoty a postřik. Na škroby, používané pro úpravu povrchu, připadá největší spotřebované množství, a to 80 % spotřeby, % se používá jako škrob pro natírání, 7 % jako přísada do papírenské hmoty a 5 % jako škrob pro postřikování. U škrobu pro úpravu povrchu se vyžaduje zejména vysoký stupeň bělosti, odpovídající viskozita, vysoká viskozitní stálost, dobrá schopnost ke tvorbě filmů a minimální tvorba prachu. Při použití škrobu pro nátěry je důležitý obsah pevných látek, odpovídající viskozita, vysoká vaznost a rovněž vysoká afinita k pigmentům. Při použití škrobu jako přísady do papírenské hmoty se požaduje jeho rychlé, rovnoměrné a bezeztrátové rozptýlení, vysoká mechanická stabilita a úplné ·· · ·· · ·· ··· · · · · 4 · • 444 4 4 4 4 4 4 • · ···· · · 4 4444 · · 4 ··· · · · ··

4 44 4 444 zadržení škrobu v proudu papíroviny. Při použití škrobu pro postřikování jsou důležitými vlastnostmi i odpovídající obsah pevných látek, vysoká viskozita a vysoká vaznost.

2.2. Průmysl výroby lepidel

Průmysl výroby lepidel představuje širokou oblast použití škrobů, kterou je možno rozdělit na čtyři dílčí oblasti: použití jako čistě škrobové lepidlo, použití do škrobových lepidel s přísadou speciálních chemikálií, použití škrobu jako přísady k syntetickým pryskyřicím a k disperzím polymerů a konečně použití škrobů jako nastavovacího prostředku do syntetických lepidel. 90 % lepidel na bázi škrobu se používá při výrobě vlnité lepenky, papírových sáčků, pytlů a kornoutů, pro výrobu spojovacích materiálů pro papír a hliník, pro výrobu kartonáže a jako zvlhčovači lepidlo pro dopisní obálky, známky apod.

2.3 Textilní průmysl a průmysl pomocných textilních přípravků

Velkým odběratelem škrobů je textilní průmysl a průmysl textilních přípravků, kde se škroby používají jako pomocný prostředek a přísada. V rámci textilního průmyslu je možno rozlišit čtyři oblasti použití: použití škrobu jako šlichtovacího prostředku, tj. jako pomocného prostředku pro vyhlazení, zpevnění a zvýšení soudržnosti textilních surovin na ochranu proti působení tahových sil při spřádání a tkaní a rovněž pro zvýšení odolnosti proti oděru při tkaní, použití škrobu jako prostředku pro zušlechťování textilu zejména po úpravách zhoršujících kvalitu jako je bělení, barvení apod., škrob se dále používá jako zahušťovací prostředek při výrobě barvicích past pro potlačení difúze

444 4 444 4 4

44444 4 4 44444 4 4 4

4 4 4 4 4 4

4 44 4 44 <4 4 barev a konečně se škrob používá jako přísada k prostředkům pro spojování šicích nití.

2.4 Stavebnictví

Čtvrtou oblastí použiti je používání škrobu jako přísady do stavebnin. Jako příklad je možno uvést sádrokartonové panely, kde škrob přidaný do sádrové kaše působením vody mazovatí, difunduje na povrch sádrové desky a váže karton na tuto desku. Další oblastí použití je přidávání škrobu do omítek a minerálních vláken. Při přepravě betonu se škrobové produkty používají pro zpomalení tvrdnutí betonu.

2.5 Stabilizace půdy

Další menší oblastí odbytu škrobových výrobků je výroba prostředků pro stabilizaci půdy, které se používají při umělých pohybech půdy pro dočasnou ochranu částic půdy proti vodě. Kombinované produkty, skládající se ze škrobu a emulzí polymerů, jsou podle současných znalostí ve svých účincích pro snižování eroze a tvorby krusty srovnatelné s dosud používanými výrobky, jsou však podstatně levnější.

2.6 Použití v prostředcích pro ochranu rostlin a v hnoj ivěch

V této oblasti se škrob používá do prostředků pro ochranu rostlin pro úpravu jejich specifických vlastností. Škroby se používají pro zlepšené smáčení prostředků pro ochranu rostlin a hnojiv, pro řízené uvolňování účinných látek, pro přeměnu kapalných, těkavých a/nebo zapáchajících látek na mikrokrystalické, stabilní a tvarovatelné látky,

0 00 · ·· • •0 000 000 0000 0000 0·

0 0000 0 0 0 0000 0 0 0 «00 000 00

0 00 0 000 pro míšení nekompatibilních sloučenin a pro prodloužení doby účinnosti zpomalením rozkladu.

2.7 Farmaceutický, zdravotnický a kosmetický průmysl

Další oblastí používání škrobu je farmaceutický, zdravotnický a kosmetický průmysl. Ve farmaceutickém průmyslu se škrob používá jako pojivo pro tablety nebo pro zřeďování pojiv v kapslích. Dále se škrob používá jako prostředek pro rychlý rozpad tablet (Tablettensprengmittel), kde tablety po polknutí absorbují tekutinu a po krátké době zbotnajί, přičemž uvolňují účinnou látku. Lékařské zásypy a pudry na zasypávání ran obsahují jako základní látku škrob. V oblasti kosmetiky se škroby používají do pudrů např. jako nosiče přísad, jako jsou vonné látky a salicylová kyselina. Poměrně značná množství škrobů se používají do zubních past.

2.8 Přidávání škrobů do uhlí a briket

Škroby se přidávají i do uhlí a briket. Uhlí se po přídavku škrobu lépe aglomeruje resp. briketuje, což brání předčasnénmu rozpadu briket. Do grilovacího uhlí se přidává 4 až 6 % škrobu, do uhlí pro topení 0,1 až 0,5 %. Škroby jako pojivo do uhlí nabývají stále většího významu, poněvadž přídavek škrobu do uhlí a briket může značně snížit emise škodlivých látek.

2.9 Úprava rudných a uhelných kalů

Škroby je možno používat i pro -úpravu rudných a uhelných kalů jako flokulační prostředek.

·· 9

9 9

9 9 9

9 9999 9 • 99

9

9

9 9 · · 9

99999 9

9 9

9· 9

9

2.10 Pomocné prostředky ve slévárenství

Další oblastí je použití škrobu jako přísady do pomocných slévárenských prostředků. Při různých postupech odlévání jsou zapotřebí jádra, která se vyrábějí z písků s přísadou pojivá. Jako pojivo se v současné době používá převážně bentonit, ke kterému se přidávají modifikované škroby, zejména botnavé škroby. Přídavek škrobu se používá pro zlepšení vlastností při toku a pro zlepšení vaznosti. Kromě toho mohou botnavé škroby splňovat další technické požadavky, jako je dispergovatelnost ve studené vodě, snadná rehydratace, dobrá mísitelnost s pískem a vysoká schopnost vázat vodu.

2.11 Použití v gumárenském průmyslu

V gumárenském průmyslu se škrob používá pro zlepšení technické a optické kvality výrobků. Používá se pro zlepšení lesku povrchu, pro zlepšení omaku a vzhledu, přičemž se lepivé pogumované plochy před vulkanizací za studená popráší škrobem. Škrob se používá i pro zlepšení potiskovatelnosti pryžových výrobků.

2.12 Výroba náhražek kůže

Další oblastí uplatnění modifikovaných škrobů je výroba náhražek kůže.

2.13 Škroby v syntetických polymerech'

V oblasti plastů se škroby používají k následujícím účelům: škrobové produkty se přidávají při zpracování (škrob funguje pouze jako plnidlo, mezi syntetickým polymerem a škrobem nevzniká přímá vazba) nebo alternativně dochází k vázání škrobových produktů při výrobě polymerů (škrob a polymer vytvářej í pevnou vazbu).

Používání škrobu pouze jako plnidla není v porovnání s jinými látkami, jako je například mastek, perspektivní. Jiná je však situace, jestliže se uplatní specifické vlastnosti škrobu a dojde k podstatné změně vlastnosti konečného produktu. Jako příklad je možno uvést použití škrobových produktů při zpracování termoplastů, jako je polyethylen.

Při tom se škrob a polymer zpracují koexpresí v poměru 1 : 1 na tzv. master batch (předsměs), z níž se s granulovaným polyethylenem za použití běžných technologických postupů vyrábějí různé produkty. Navázání škrobu v polyethylenových fóliích může zvýšit látkovou propustnost fóliových hadic, zlepšit propustnost pro vodní páru, zlepšit antistatické vlastnosti a rovněž zlepšit potiskovatelnost barvami ředitelnými vodou. Nevýhodami, které se v současné době vyskytují, jsou nedostatečná průhlednost, snížená pevnost v tahu a snížená tažnost.

Další možností je použití škrobu do polyurethanových pěn. Úpravou škrobových derivátů a rovněž optimalizací technologických parametrů je možno cíleně řídit reakci mezi syntetickými polymery a hydroxylovými skupinami škrobu. Výsledkem jsou polyurethanové fólie, kterým použití škrobu dodává následující vlastnosti: snížení koeficientu tepelné roztažnosti, snížení srážlivosti, zlepšení vlastností při působení tlaku/tahu, vzrůst propustnosti pro vodní páru bez změny schopnosti přijímat vodu, snížení zápálnosti a zvýšení odolnosti proti roztržení, nedochází k odkapávání hořícího materiálu, absence halogenů a zpomalené stárnutí. Nevýho• · · • · β • · 9 9 • 9 9 9 9 9

9·9 «9 9

dami, které se v současné době projevuji, jsou snížená pevnost v tlaku a snížená rázová odolnost.

Vývoj výrobků se však neomezil pouze na fólie. V současné době se vyrábějí i masivní výrobky, jako jsou např. hrnky, talíře a misky, obsahující i více než 50 % škrobu. Směsi škrobu a polymerů jsou nadto hodnoceny velice příznivě i z ekologického hlediska, poněvadž mají podstatně vyšší biologickou odbouratelnost.

Mimořádný význam získaly roubované škrobové polymery díky jejich extrémní schopnosti vázat vodu. Jde o produkty, jejichž hlavní řetězec tvoří škrob a na tento řetězec jsou podle principu radikálového mechanismu roubovány postranní vedlejší mřížky syntetického monomeru. Roubované škrobové polymery, které jsou v současné době k dispozici, se vyznačují zlepšenou schopností vázat a zadržovat vodu, a to až do množství 1000 g vody na 1 g škrobu při vysoké viskozitě. Oblasti použití těchto superabsorpčních látek se v posledních letech velmi rozšířily a tyto látky se uplatňují v oblasti hygieny jako pleny a podložky a rovněž v zemědělství, jako např. pro tabletování osiva.

Pro použití nových genově-technicky přeměněných škrobů jsou rozhodující jednak jejich struktura, obsah vlhkosti, obsah proteinů, obsah lipidů, obsah vlákniny, obsah popela/fosfátů, poměr amylosa/amylopektin, rozložení molárních hmotností, stupeň rozvětvení, velikost zrn a jejich tvar a krystalinita, a jednak vlastnosti, z nichž vyplývají následující charakteristiky: chování pri toku a sorpční vlastnosti, teplota mazovatění, viskozita, zahušťovací schopnost, rozpustnost, struktura a transparence škrobového mazu, odolnost vůči teplu, střižným silám a kyselinám, ten42

dence k retrogradaci, tvorba gelů, stabilita při zmrazování/rozmrazování, schopnost tvořit komplexy, vázání jodu, tvorba filmů, pevnost lepeného spoje, stálost vůči enzymům, stravitelnost a reaktivita.

Při získávání modifikovaných škrobů pomocí genovětechnických postupů například z rostlin může dojít k takové změně jejich vlastností, že další modifikace pomocí chemických nebo fyzikálních postupů již není nutná. Jinak je možno škroby pozměněné genově-technickými postupy dále modifikovat chemickými postupy, takže se dosáhne dalšího zlepšení kvality pro výše uvedené účely použití. Tyto chemické úpravy jsou v zásadě známy. Při tom se používají zejména úpravy působením tepla a tlaku, působením organických nebo anorganických kyselin, enzymatická úprava, oxidace a reesterifikace, přičemž vznikají např. fosfáty, nitráty, sulfáty, xantháty, acetáty nebo citráty škrobu. Dále je možno pro přípravu etherů škrobu použít jedno- nebo vícefunkční alkoholy za přítomnosti silných kyselin, přičemž vznikají škrob-alkylethery, O-allylethery, hydroxyalkylethery, O-karboxymethylethery, škrobové ethery obsahující dusík, škrobové ethery obsahující fosfor, škrobové ethery obsahující síru, zesíťované škroby nebo roubované škrobové polymery .

Výhodným použitím škrobů podle tohoto vynálezu jsou průmyslové aplikace, zejména pro výrobu potravin nebo pro výrobu obalových materiálů a výrobků pro jedno použití.

Příklady provedení vynálezu

Dále uvedené příklady ilustrují tento vynález, ·· · • · • ·

v žádném případě jej však neomezují.

Použité zkratky:

BE rozvětvující (branching) enzym bp pár bází

GBSS škrobová synthasa vázaná na škrobové zrno (granule bound starch synthase)

IPTG isopropyl-β-D-thiogalaktopyranosid

SS rozpustná škrobová synthasa (soluble starch synthase) PMSF fenylmethylsulfonylfluorid

Media a roztoky použité v příkladech provedení :

x SSC 175,3 g NaCl

88,2 g natriumcitrát doplnit do 1000 ml redest.vodou úprava na pH 7,0 roztokem 10 N NaOH

Pufr A mM Tris-HCl pH 8,0

2,5 mM DTT mM EDTA

0,4 mM PMSF % glycerin

0,1 % natriumdithionit

Pufr B

Pufr C mM Tris-HCl pH 7,6

2,5 mM DTT 2 mM EDTA

0,5 M natriumcitrát pH 7,6 50 mM Tris-HCl pH 7,6

2,5 mM DTT

• · « mM EDTA x TBS x TBST

0,2 M Tris-HCl pH 7,5 5,0 M NaCl lOx TBS

0,1 % (obj.) Tween 20

Promývací pufr 25 mM Tris-HCl pH 7,0

250 mM glycin

Dialyzační pufr 50 mM Tris-HCl pH 8,3 mM NaCl 2 mM EDTA

14,7 mM beta-merkaptoethanol 0,5 mM PMSF

Proteinový pufr 50 mM natriumfosfátový pufr pH 7,2 mM EDTA 0,5 mM PMSF

14,7 mM beta-merkaptoethanol

Popis vyobrazení:

znázorňuje schematicky RVA-teplotní profil (viskozita a teplota vs. čas /min/) s viskozimetrickými parametry T = teplota mazovatění, teplota v okamžiku začátku mazovatění;

Max označuje maximální viskozitu;

Min označuje minimální viskozitu;

Fin označuje viskozitu na konci měření; Set je rozdíl (D) mezi Min a Fin (zatuhnutí - Setback)

Obr. 2 zobrazuje rozložení postranních řetězců vzorků amylopektinu:

vpravo stanovené pomocí HPAEC-PAC (napětí /mV/ vs. čas /min./, vlevo stanovené pomocí gelové permeační chromatografie (náboj /nC/ vs. čas /min./.

A = kontrolní vzorek (divoký typ, č.l);

B = (asSSII, č.7);

C = (asSSIII, č.8);

D = (asSSII asSSIII, č.13);

E = (asSSII asSSIII, č.14)

Čísla uvedená v závorkách u popisu obrázků odpovídají číslování vzorků škrobu uvedených v Tab. 1 a 2.

V uvedených příkladech byly použity následující metody:

1. Postup klonování

Pro klonování v E.coli byl použit vektor pBluescript II SK (Stratagene).

Pro transformace rostlin byly použity genové konstrukce klonované v binárním vektoru pBinARHyg (Hófgen a Villmitzer, 1990, Plant Sci.66:221-230) a pBinB33-Hyg.

» 0

0 0 0 0 0 000· • 0··· 0

2. Bakteriální kmeny a plasmidy

Pro vektor pBluescript II KS (Stratagene) a pro konstrukty pBinARHyg a pBinB33-Hyg byl použit kmen E.coli DH5a (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, USA). Pro excisi prováděnou in vivo byl použit E.coli kmen

XLl-Blue.

pBinAR

Plasmid pBinAR je derivátem binárního vektorplasmidu pBinl9 (Bevan, 1984) a byl konstruován následujícím způsobem:

Fragment o délce 529 bp zahrnující nukleotid 6909-7437 z 35S-promotoru viru květákové mozaiky byl izolován jako EcoRI/KpnI-fragment z plasmidu pDH51 (Pietrzak a spol.,

1986) a navázán mezi štěpná místa EcoRI- a KpnI- polylinkeru z pUC 18 a byl označen jako plasmid pUC18-35S. Z plasmidu pAGV40 (Herrera-Estrella a spol., 1983) byl pomocí restrikčních endonukleas HindiII a PvuII izolován fragment o délce 192 bp, který zahrnoval DNA z Ti-plasmidu pTiACH5 (Gielen a spol., 1984) (nukleotidy 11749-11939). Po adici Sphllinkeru na místo štěpení PvuII byl tento fragment navázán mezi místa štěpení SpHI- a HindlII v pUC18-35 a byl označen jako plasmid pA7. Potom byl celý polylinker obsahující 35S-promotor a ocs-terminátor vyštěpen s EcoRI a HindlII a navázán do příslušného vyštěpeného pBinl9. Tak byl získán rostlinný expresní vektor pBinAR (Hófgen a Villmitzer,

1990) .

• · • · · • »··· pBinB33

Tento promotor patatinového genu ze Solanum tuberosum (Rocha-Sosa a spol., 1989) byl navázán jako Dral-fragment (nukleotidy -1512 - +14) do vektoru pUC19 vyřízutého pomocí Sstl, jehož konce byly upraveny pomocí T4-DNA polymerasy. Vznikl tak plasmid pUC19-B33. Z tohoto plasmidu byl vyštěpen B33-promotor s EcoRI a Smál a navázán do příslušného vyštěpeného vektoru pBinAR. Byl tak získán rostlinný expresní vektor pBin33.

pBinAR-Hyg

Výchozím materiálem byl plasmid pA7 (viz popis vektoru pBinAR); EcoRI-HindiII-fragment zahrnující 35S-promotor, ocs-terminátor a část polylinkeru mezi 35S-promotorem a ocs-terminátorem byl vložen do odpovídajícím způsobem vyštěpeného plasmidu pBin-Hyg.

pBinB33-Hyg

Výchozím materiálem byl plasmid pBinB33;

EcoRI-HindiII-fragment zahrnující B33-promotor, část polylinkeru a ocs-terminátor byl vyštěpen a vložen do odpovídajícím způsobem vyštěpeného vektoru pBin-Hyg.

Vznikl tak rostlinný expresní vektor pBinB33-Hyg.

3. Transformace Agrobacterium tumefaciens

Transfer DNA byl proveden přímou transformací podle metody kterou publikovali Hófgen a Villmitzer (1988, Nucleic Acids Res. 16:9877). Tyto plasmid-DNA-transformované Agro99 9

9 9

9 9 9 • 9999 9 9 • 9 9

bakterie byly izolovány metodou kterou popsali Birnboim a Doly (1979, Nucleic Acids Res. 7:1513-1523) a po příslušném restrikčním štěpení byly analyzovány pomocí gelové chromatografie.

Transformace brambor

Transformace plasmidu v rostlinách brambor (Solanum tuberosum L.cv. Desiree, Vereinigte Saatzuchten eG, Ebstorf) byla provedena pomocí Agrobacterium tumefaciens kmen C58C1 (Dietze a spol. (1995) v publikaci Gene Transfer to Plants S. 24-29, edit. Potrykus, I. a Spangenberg, G., Springer Verlag, Deblaere a spol., 1985, Nucl. Acids Res. 13: 47774788).

Deset malých kousků listů sterilní bramborové kultury, které byly poraněny skalpelem, bylo vloženo do 10 ml MS-media (Murashige a Skoog (1962) Physiol. Plant 15:473) s 2 % sacharosy, obsahujícího 50 ml kultury Agrobacterium tumefaciens selektivně pěstované přes noc. Po 3- až 5-timinutovém lehkém protřepání byla provedena další inkubace po dobu 2 dnů ve tmě. Potom byly tyto části listů pro indukci růstu kallusů vloženy do MS-media s 1,6 % glukosy, mg/1 naftyloctové kyseliny, 0,2 mg/1 benzylaminopurinu,

250 mg/1 Claforanu, 50 mg/ml kanamycinu a 0,80 % Bacto Agaru. Po jednotýdenní inkubaci při 25 °C a 3000 Lux byly listy vloženy pro vyvolání růstu do MS-media s 1,6 % glukosy, 1,4 mg/1 zeatinribosy, 20 mg/1 naftyloctové kyseliny, 20 mg/1 gibberelinové kyseliny, 250 mg/1 Claforanu, 50 mg/ml kanamycinu a 0,80 % Bacto Agaru.

5.

Uchovávání rostlin

• · · · • ···· « ·

Rostliny brambor byly udržovány ve skleníku za následujících podmínek:

Perioda svícení Perioda tmy h při 25 000 luxech a 22 °C 8 h při 15 °C

Vlhkost vzduchu 60 %

6. Radioaktivní značení DNA-fragmentů

Radioaktivní značení DNA-fragmentů bylo provedeno s použitím sady DNA-Random Primer Labelling Kit od firmy Boehringer Mannheim (Německo) podle pokynů výrobce.

7. Stanovení aktivity škrobové synthasy

Stanovení aktivity škrobové synthasy bylo provedeno stanovením vložené ¹⁴C-glukosy z ADP[¹⁴C-glukosy] v produktu nerozpustném ve směsi methanol/KCl, jak popsali Denyer a Smith, 1992, Planta 186:609-617.

8. Důkaz rozpustných škrobových synthas v nativním gelu

Pro důkaz aktivity rozpustných škrobových synthas pomocí nedenaturující gelové elektroforézy byly vzorky tkáně z bramborových hlíz vloženy do 50 mM Tris-HCl pufru pH 7,6, mM DTT, 2,5 mM EDTA, 10 % glycerinu a 0,4 mM PMSF.

Elektroforéza byla provedena v komůrce MiniProtean II Kammer (BioRAD). Koncentrace monomeru v gelu o tloušťce 1,5 mm byla 7,5 % (hmotn./obj.), jako pufr pro gel a pro průtok byl použit 25 mM Tris-glycin pH 8,4. Nanášena byla vždy stejná množství proteinového extraktu a dělení bylo prováděno vždy po dobu 2 hod. při 10 mA.

••«4 · 4

Nakonec byla provedena inkubace aktivních gelů (Aktivitáts-Gele) v 50 mM pufru tricin-NaOH pH 8,5, 25 mM octan draselný, 2 mM EDTA, 2 mM DTT, 1 mM ADP-glukosa, 0,1 % (hmotn./obj.) amylopektin a 0,5 M citran sodný. Vzniklé glukany byly vybarvovány Lugolovým roztokem.

9. Analytika škrobu

Škrob vzniklý v transgenních rostlinách brambor byl charakterizován následujícmi metodami:

a) Stanovení poměru amylosa/amylopektin ve škrobu z brambor

Škrob z brambor byl izolován standardními metodami a poměr amylosa/amylopektin byl stanoven metodou kterou popsali Hovenkamp-Hermelink a spol. (Potato Research 31 (1988) 241-246).

b) Stanovení obsahu fosfátů

V bramborovém škrobu mohou být některé glukosové jednotky na atomech uhlíku C2, C3 a C6 fosforylovány. Pro stanovení stupně fosforylace glukosy na C6 bylo 100 mg škrobu hydrolyzováno v 1 ml 0,7 M HCI po dobu 4 hodin při teplotě 95 °C (Nielsen a spol. (1994) Plant Physiol. 105:111-117). Po neutralizaci 0,7 M KOH bylo v 50 ml tohoto hydrolyzátu provedeno stanovení obsahu glukoso-6-fosfátu pomocí opticko-enzymatického testu. Změna absorpce reakční směsi (100 mM Imidazol/HCl; 10 mM MgC^t 0,4 mM NAD; 2 jednotky glukoso-6-fosfát-dehydrogenasy z Leuconostoc mesenteroid.es ·, 30 °C) byla měřena při 334 nm.

·· • · • ••4

Stanovení celkového obsahu fosfátů bylo provedeno metodou kterou popsal Ames, 1996, Methods in Enzymology VIII, 115-118.

c) Analýza postranních řetězců amylopektinu

Pro stanovení rozložení a délky postranních řetězců ve vzorcích škrobu byl 1 ml 0,1 -%ního roztoku škrobu natráven 0,4 jedn. isoamylasy (Megazyme International Ireland Ltd., Bray, Irsko) přes noc při 37 °C ve 100 mM Na-citrátovém pufru, pH 3,5.

Další analýzy byly provedeny, pokud není uvedeno jinak, podle údajů které publikovali Tomlinson a spol., (1997), Plant J. 11:31-47.

d) Stanovení velikosti zrn

Velikost zrn byla stanovována pomocí fotosedimentometru typ Lumosed od firmy Retsch GmbH, Německo. Přitom bylo 0,2 g škrobu suspendováno v cca 150 ml vody a ihned bylo provedeno měření. Podle programu dodaného výrobcem byl vypočítán střední průměr škrobových zrn za předpokladu, že průměrná hustota škrobu je 1,5 g/1.

e) Vlastnosti při mazovatění

Vlastnosti při mazovatění resp. viskozitní vlastnosti škrobu byly stanovovány na zařízení Viskograph E od firmy Brabender OHG, Německo nebo na zařízení - Rapid Visco Analyzer, Newport, Scientific Pty Ltd, Investment Support group, Varriewood NSV 2102, Austrálie. Při použiti Viskografu E byla suspenze 20 g škrobu ve 450 ml vody

9999999 9 podrobena následujícímu tepelnému programu: záhřev z 50 °C na 96 °C rychlostí 3/min, 30 minut teplotní výdrž, zchlazení na 30 °C rychlosti 3/min a opět 30 minut tepelná výdrž. Teplotní profil zachycuje charakteristické vlastnosti při mazovatění.

Při měření na přístroji Rapid Visco Analyzer (RVA) byla suspenze 2 g škrobu ve 25 ml vody vystavena následujícímu tepelnému programu: suspendování 60 s při 50 °C, záhřev z 50 °C na 95 °C rychlostí 12/min, 2,5 minuty tepelná výdrž, zchlazení na 50 °C rychlostí 12/min a opět 2 minuty konstantní výdrž. RVA-teplotní profil poskytl viskozimetrické parametry sledovaných škrobů, a to maximální (Max) a konečnou viskozitu (Fin), teplotu mazovatění (Τ), minimální viskozitu (Min) dosaženou po maximální viskozitě a rovněž rozdíl minimální a konečné viskozity (Setback, Set - zatuhnutí) (viz tabulka 1 a obr. 1).

f)

Stanovení pevnosti gelu

Pro stanovení pevnosti gelu na přístroji Textuře Analyser byly 2 g škrobu zmazovatěny ve 25 ml vody (viz měření na RVA) a získaný škrobový maz byl vzduchotěsně uzavřen a uložen po dobu 24 hodin při 25 °C. Vzorky byly upevněny pod sondou (kruhový razník - Stempel) přístroje Textuře Analyser TA-XT2 (Stable Micro Systems) a pevnost gelu byla stanovována při následujících parametrech:

zkušební rychlost hloubka vniknutí styková plocha razníku tlak/kontaktní plocha

0,5 mm 7 mm 113 mnů 2 g • · · ··

• · · · * ···· · · <· ·

10. Stanovení glukosy, fruktosy a sacharosy

Pro stanovení obsahu glukosy, fruktosy a sacharosy byly malé kousky bramborových hlíz (průměr cca 10 mm) zmrazený v kapalnému dusíku a potom byly po dobu 30 minut při 80 °C v 0,5 ml mM HEPES, pH 7,5 extrahovány 80 %-ním (obj.) ethanolem. Supernatant, který obsahoval rozpustné složky, byl oddělen a byl změřen jeho objem. Tento roztok byl použit pro stanovení množství rozpustných cukrů. Kvantitativní stanovení rozpuštěné glukosy, fruktosy a sacharosy bylo provedeno v reakční směsi o následujícím složení;

100,0 mM imidazol/HCl, pH 6,9

1,5 mM MgCl₂

0,5 mM NADP⁺

1,3 mM ATP

10-50 μΐ vzorku

1,0 jedn. glukoso-6-fosfátdehydrogenasa z droždí

Tato reakční směs byla inkubována po dobu 5 minut při laboratorní teplotě. Stanovení cukrů bylo potom provedeno fotometricky měřením absorpce při 340 nm po postupném přidávání

1,0 jedn. hexokinasy z droždí (pro stanovení glukosy)

1,0 jedn. fosfoglucinisomerasy z droždí (pro stanovení fruktosy) a

I, 0 jedn. invertasy z droždí (pro stanovení sacharosy).

II. Stanovení nasákavosti (VAK) φφ · • · • φ

φ φ

φ φ

Pro stanovení nasákavosti byl zbytek získaný po oddělení rozpustného podílu odstředěním (10 minut při 10000 x g) ze škrobu zbotnaného při 70 °C zvážen. Nasákavost škrobu byla vztažena na navážku škrobu korigovanou o hmotnost rozpustného podílu.

VAK (g/g) _ (zbytek - (navážka - rozp.podíl)) (navážka - rozp.podíl)

Příklad 1

Příprava plasmidu p35SaSSI-Hyg

Fragment Asp718/Xbal o délce 1831 bp, obsahující parciální cDNA kódující SSI z brambor (Ábel, G., (1995) disertace, Freie Universitát Berlin), byl zaveden v antisense-orientaci vzhledem k 35S-promotoru mezi štěpná místa Asp718- a Xbal vektoru pBinAR-Hyg.

Příklad 2

Příprava plasmidu p35S-SSI-Kan

Fragment EcoRI o délce 2384 bp, obsahující cDNA kódující SS I z brambor (Ábel 1995 cit.dříve), byl vyhlazen (gegláttet) a zaveden do vektoru pBinAR upraveného Smál v sense-orientaci vzhledem k 35S-promotoru.

Příklad 3

Příprava plasmidu p35SaSSII-Kan ·· · • · · • · · » • ··♦»*· • · · • Φ « φφ » * φ * • · · · • · φφφφ · φφφ φφ · φφ ·

Fragment Smal/Asp718 ο délce 1959 bp, obsahující parciální cDNA kódující SSII z brambor (Ábel, G., v této práci je použito označení GBSSII), byl vyhlazen a zaveden v antisense-orientaci vzhledem k 35S-promotoru do místa štěpení Smál vektoru pBinAR.

Příklad 4

Příprava plasmidu pB33-SSII-Hyg

Fragment Smal/Sall o délce 2619 bp, obsahující cDNA kódující SS II z brambor (Ábel, G. , cit.dříve), byl zaveden v sense-orientaci vzhledem k 35S-promotoru do vektoru pBinB33-Hyg upraveného Smál a Sáli.

Příklad 5

Příprava plasmidu p35SaSSIII-Hyg

Fragment Asp718/Xbal o délce 4212 bp, obsahující cDNA kódující SS III z brambor (Ábel a spol., 1996, Plant J. 10(6):981-991), byl zaveden v antisense-orientaci vzhledem k 35S-promotoru mezi štěpná místa Asp718- a Xbal vektoru pBinAR-Hyg.

Příklad 6

Příprava plasmidu p35S-SSIII-Kan

Fragment EcoRI o délce 4191 bp, obsahující cDNA kódující SS III z brambor (Ábel, G., 1996, cit.dříve), byl vyhlazen a zaveden v sense-orientaci vzhledem k 35S-promotoru do štěpného místa Smál vektoru pBinAR.

• 9 9 * 9 ·

4 4 4

4 4 4 4 · ·

4 · 9 9 9 « 4 4 4 * 4 • 9*44444 *

9 9 9 9 «9 9 99 *

Příklad 7

Příprava plasmidů pB33aBEaSSIII-Kan

Fragment HindiI o délce 1650 bp, obsahující parciální cDNA kódující BE-enzym z brambor (Kossmann a spol., 1991, Mol. & Gen.Genetics 230(1-2):39-44), byl vyhlazen a zaveden v antisense-orientaci vzhledem k B33-promotoru do vektoru pBinB33 upraveného Smál. Získaný plasmid byl naštěpen pomocd BamHI. Do tohoto štěpného místa byl zaveden fragment BamHI o délce 1362 bp, obsahující parciální cDNA kódující enzym SSIII z brambor (Ábel a spol., 1996, cit. dříve) rovněž v antisense-orientaci vzhledem k B33-promotoru.

Příklad 8

Příprava plasmidů p35SaSSII-aSSIII-Kan

Fragment EcoRV/HincII o délce 1546 bp, obsahující parciální cDNA kódující SSII z brambor (Ábel, G., 1995, cit.dříve), byl klonován ve vektoru pBluescript II KS upraveném EcoRV/HincII a po natrávení Asp718/BamHI byl opět vyštěpen a zaveden do rovněž natráveného vektoru pBínAR v antisense-orientaci vzhledem k 35S-promotoru. Potom byl do štěpného místa BamHI vektoru pBinAR-SSII zaveden fragment BamHI o délce 1356 bp, obsahující parciální cDNA kódující SS III z brambor (Ábel a spol,, 1996, cit. dříve), rovněž v antisense-orientaci vzhledem k 35S-promotoru.

Příklad 9

Příprava plasmidů pB33aSSIaSSIII-Kan • 3 · • φ ·

ΦΦΦ φΦΦ ΦΦ

ΦΦΦΦ φφφφ ΦΦ

Φ ΦΦΦΦΦ ΦΦ φφφφφ φΦ Φ 3 Φ φ ΦΦΦ ΦΦ

ΦΦ · ΦΦ φ Φ·

Fragment EcoRI ο délce 2384 bp, obsahující cDNA kódující SS I z brambor (Ábel, G., 1995, cit.dříve), byl vyhlazen a klonován v antisense-orientaci vzhledem k B33-promotoru ve štěpném místě Smál vektoru pBinB33. Fragment BamHI o délce 1362 bp obsahující parciální cDNA kódující SS III z brambor (Ábel a spol., 1996, cit.dříve) byl v místě štěpení BamHI vzniklého vektoru zaveden rovněž v antisense-orientaci vzhledem k B33-promotoru.

Příklad 10

Příprava plasmidu p35SaSSII-Hyg

Fragment Smal/Asp718 o délce 1959 bp, obsahující parciální cDNA kódující SSII z brambor (Ábel, G., 1995, cit.dříve), byl vyhlazen a zaveden v antisense-orientaci vzhledem k 35S-promotoru do místa štěpení Smál vektoru pBinAR-Hyg.

Příklad 10 B

Příprava plasmidu pB33aRI-Hyg

Fragment o délce 1,9 kB z Rl ze S. tuberosum (VO 97/11188) byl získán natrávením (Verdau) Asp718 z vektoru pBlueskript. Tento fragment byl klonován v místě štěpení Asp718 za B33-promotorem v antisense-orientaci k vektoru pB33-Binar-Hyg. Tento vektor má hygromycinovou resistenci.

Příklad 11 »

• 99 *J 9 9 <99 • · · · 9 · 9 « · ·

99····· ····«·· · ··· ··· · · < · · A 9 · «

Zavedení plasmidů do genomu buňky brambor

Plasmidy uvedené v příkladech 1 až 10 byly transferovány jednotlivě a/nebo jeden po druhém postupně do Agrobakterií, jejichž pomocí byla provedena transformace buněk brambor dříve popsaným způsobem. Z transformovaných rostlinných buněk byly potom regenerovány celé rostliny.

Transgenní rostlinné buňky genotypu asSSI-asSSIIasSSIII byly získány transformací plasmidem p35SaSSI-Hyg popsaným v příkladu 1 a následující retransformací plasmidem p35SaSSII-aSSIII-Kan popsaným v příkladu 8.

Transgenní rostlinné buňky genotypu asSSII-asSSIasSSIII byly získány transformací plasmidem p35SaSSII-Hyg popsaným v příkladu 10 a následující retransformací plasmidem pB33aSSIaSSIII-Kan popsaným v příkladu 9.

V důsledku těchto transformací syntetizovaly tyto transgenní rostliny brambor pozměněné druhy škrobu.

Příklad 12

Fyzikálně-chemická charakterizace modifikovaných škrobů

Škrob syntetizovaný transgenními rostlinami získanými podle příkladu 11 se liší např. od škrobu syntetizovaného divokými typy rostlin (brambory) obsahem fosfátů a amylosy, viskozitními vlastnostmi a vlastnostmi při mazovatění stanovenými pomocí přístroje RVA. Výsledky stanovení fyzikálněchemických charakteristik modifikovaných škrobů jsou uvedeny v tabulce 1. U antisense-konstruktů byla enzymová aktivita potlačovaných (suprimovaných) rozpustných škrobových synthas až o 85 % nižší než u netransformovaných kontrolních • · · «·· 9 · ·

9··· ···· · · • ······· ······· · ti i. · I « ·· · · « rostlin.

Tabulka 1 : Vlastnosti modifikovaných škrobů

č.	Genotyp	fos- <fáty (%)	amy- losa (%)	RVA Max (%)	RVA Min (%)	RVA Fin (%)	RVA Set (%)	RVA T (%)	pevnost gelu (%)
1	Désirée (divoký typ)	100	100	100	100	100	100	100	100
2	asSSI	100	100	113	100	100	114	100	112
3	oeSSI	140	100	118	152	111	45	100	106
4	oeSSI	91	100	87	178	131	55	100	335
5	oeSSI	127	100	100	157	121	63	100	313
6	cosSSI	100	100	106	100	100	100	100	127
7	asSSII	55	118	76	91	95	113	98	151
8	asSSIII	197	123	82	75	76	79	95	84
9	oeSSIII	100		100	100	88	87	100	68
10	cosSSIII	210		100	60	70	74	95	83
11	asBE	170	91	124	94	90	76	100	91
12	asBE-asSSIII	292		128	69	75	97	95	100
13	asSSII-asSSIII	31	124	30	77	107	229	93	212
14	asSSII-asSSIII	39	110	45	88	113	216	94	189
15	asSSI-asSSIII	115
15b	asSSI-asSSIII	86	100	82	74 ,	96	168	100	100
16	asSSU-asSSIII- asSSI
17	asSSI-asSSII-as SSIII	54	115	60	141	105	133	97	105

• · · · φ · · · · • ·····♦· *> · · · ·· >

• · · · · · • · · · · · ··«···· · · • · · · · • · · ·«»

Tabulka 1 (pokračování)

č.	Genotyp	fos- fáty (%)	amy- losa (%)	RVA Max (%)	RVA Min (%)	RVA Fin (%)	RVA Set (%)	RVA T (%)	pevnost gelu (%)
18	asSSII-asSSI-as SSIII
19	asBE-asSSIil- oeSSI	370	85	131	55	60	84	93	66
20	asBE-asSSIH- asR1	125	136
21	oeSSHi-oeSSII	105	100	127	122	126	136	94	189

Legenda :

SSI = škrobová synthasa isoforma I;

SSII = škrobová synthasa isoforma II;

SSIII = škrobová synthasa isoforma III;

BE = rozvětvující branching enzym;

as = anti-sense;

oe = přeexprimováno (sense);

cos = ko-suprimováno (sense);

data z přístroje Rapid Visco-Analyzer:

Max označuje maximální viskozitu;

Min označuje minimální viskozitu;

Fin označuje viskozitu na konci měření;

Set je rozdíl (D) mezi hodnotami Min a Fin (Setback - zatuhnuti) a

T je teplota mazovatění.

Procentuální hodnoty jsou vztaženy na přirozený divoký typ (= 100 %).

• w · · * · · · • · · ··· · ♦ · • < · « · · · · * * • ·····*»· ······· ·

Příklad 13

Charakterizace postranních řetězců modifikovaných škrobů

Dělení glukanových řetězců bylo po oddělení amylosy thymolovým srážením (Tomlinson a spol., cit.dříve) provedeno chromatografickým systémem s použitím vysoce výkonného anexu (High-Performance-Anionenaustauscher-Chromatographie-System) s ampérometrickým detektorem (HPEAC-PAD, Dionex). Vzorky (10 mg/ml amylopektin) byly rozpuštěny ve 40 % DMSO a byla přidána 1/10 objemu 100 mM natriumacetátu pH 3,5 a 0,4 jedn. isoamylasy (Megazyme). Po inkubaci bylo 10 μΐ vzorku naneseno na systém kolon a eluce byla provedena podle údajů které publikovali Tomlinson a spol. (cit.dříve).

Výsledky HPEAC-PAD-analýzy týkající se délky a rozložení postranních řetězců vzorků škrobu č. 1, 7, 8, 14 a 14 (viz tab. 1 a 2) jsou uvedeny v obr. 2.

Další HPLC-systém pro stanovení rozložení postranních řetězců se skládal ze 3 za sebou zařazených kolon (2 TSK-Gel 2000SV a 1 TSK-Gel 3000SV, Fa. TosoHaas, Stuttgart, SRN) jak uvedl Hizukuri ((1986) Carbohydr.Res. 147:342-347). 100 μΐ připraveného vzorku bylo naneseno na systém kolon. Jako eluční činidlo byl použit 10 mM natriumacetát pH 3,0 s průtokem 0,35 ml/min. Glukany byly prokazovány pomocí detektoru indexu lomu (Gynkotek), stanovení délky řetězců eluovaných lineárních glukanů bylo provedeno jednak pomocí hmotové spektrometrie, jednak jodometricky (Hizukuri (1986), cit. viz dříve).

Výsledky gelově-chromatografické HPLC-analýzy týkající se délky a rozložení postranních řetězců vzorků škrobu č.

tt · <· • · · · · · * · ·· *

1, 7, 8, 13 a 14 (viz tab. 1 a 2) jsou uvedeny v obr. 2.

V tabulce 2 je uveden přehled podílů různých frakcí postranních řetězců v analyzovaných škrobech. Frakce 1 představuje podíl A- a Bl-řetězců (podle Hizukuri (1986) cit. dříve), frakce 2 představuje podíl B2-, B3- a B4řetězců (podle Hizukuri (1986) cit. dříve) a frakce 3 představuje podíl vysokomolekulárních glukanů získaných v eluátu.

Tabulka 2:

Rozložení postranních řetězců amylopektinu v modifikovaných škrobech

č.	Genotyp	frakce 1 (%)	frakce 2 (%)	frakce 3 (%)
1	Désirée (divoký typ)	58,7	40,3	1,0
7	asSSil	62,6	36,5	0,9
8	asSSill	72,4	26,3	1,3
13	asSSIlasSSII!	66,9	27,5	5,6
14	asSSIlasSSIII	61,5	35,1	3,4

· · « » ” • * · 0 0 · • · · · 0 · · • 0000000 · ·I « · 0 ·· · 0··

Claims (30)

1. NÁROKY rfwito wmoš ysetecM advokát

   O ® PRAHA «· -WiW$««s $

   PATENTOVÉ

   1. Způsob získání transgenní kterém se minimálně jedna nukleotidová sekvence, kódující protein s funkcí rozpustné škrobové synthasy III nebo fragmenty uvedené nukleotidové sekvence ostitelské buňky, při

   b) jedna nebo více nukleotidových sekvencí, kódujících protein, vybraný ze skupiny A, skládající se z proteinů s funkcí rozvětvujících enzymů, ADP-glukoso-pyrofosforylas, škrobových synthas vázaných na škrobové zrno, rozpustných škrobových synthas, enzymů odstraňujících rozvětvení, disproporcionačních enzymů, plastidových škrobových fosforylas, Rl-enzymů, amylas a glukosidas nebo jejich fragmentů, integrují současně nebo postupně do genomu buňky.
2. 2. Způsob podle nároku 1, přičemž buňkou je bakteriální nebo rostlinná buňka.
3. 3. Transgenní hostitelská buňka, obsahující

   a) minimálně jednu nukleotidovou sekvenci, kódující protein s funkcí rozpustné škrobové -synthasy III nebo fragmenty uvedené nukleotidové sekvence • 4 ♦ «· • · · «>

   • · · · · · 0 * · ···♦·♦· ·····*· « • · · · · · «φ

   b) jednu nebo více nukleotidových sekvencí, kódujících protein, vybraný ze skupiny A, skládající se z proteinů s funkcí rozvětvujících enzymů, ADP-glukoso-pyrofosforylas, škrobových synthas vázaných na škrobové zrno, rozpustných škrobových synthas, enzymů odstraňujících rozvětvení, disproporcionačních enzymů, plastidových škrobových fosforylas, Rl-enzymů, amylas a glukosidas nebo jejich fragmenty.
4. 4. Hostitelská buňka podle nároku 3, která je bakteriální nebo rostlinnou buňkou.
5. 5. Rekombinantní molekula nukleové kyseliny obsahující

   a) minimálně jednu nukleotidovou sekvenci, kódující protein s funkcí rozpustné škrobové synthasy III nebo fragmenty uvedené nukleotidové sekvence

   b) jednu nebo více nukleotidových sekvencí, kódujících protein, vybraný ze skupiny A, skládající se z proteinů s funkcí rozvětvujících enzymů, ADP-glukoso-pyrofosforylas, škrobových synthas, vázaných na škrobové zrno, rozpustných škrobových synthas, enzymů odstraňujících rozvětvení, disproporcionačních enzymů, plastidových škrobových fosforylas, Rl-enzymů, amylas a glukosidas nebo jejich fragmenty.
6. 6. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 5, která je molekulou desoxyribonukleové kyseliny.
7. 7. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 6, která je cDNA-molekulou.
8. 8. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 5, která je molekulou ribonukleové kyseliny.
9. 9. Molekula nukleové kyseliny, která se s některou molekulou nukleové kyseliny podle jednoho nebo několika nároků 5 až 8 hybridizuje, výhodně specificky hybridizuje.
10. 10. Vektor, obsahující molekulu nukleové kyseliny podle jednoho nebo několika nároků 5 až 9 .
11. 11. Vektor, obsahující molekulu nukleové kyseliny podle jednoho nebo několika nároků 5 až 9 , vyznačující se tím, že nukleotidová sekvence, kódující protein, s funkcí rozpustné škrobové syntha sy nebo její fragmenty má sense- nebo anti-sense-orientaci.
12. 12. Vektor, obsahující molekulu nukleové kyseliny podle jednoho nebo několika nároků 5 až 9 , vyznačující se tím, že nukleotidová sekvence, kódující jeden nebo několik proteinů, vybraných ze skupiny A nebo jejich fragmenty, má sense- nebo anti-sense-orientaci .
13. 13. Vektor, obsahující molekulu nukleové kyseliny podle jednoho nebo několika nároků 5 až 9 , vyznačující se tím, že nukleotidová sekvence, kódující jeden nebo několik proteinů, vybraných ze skupiny A nebo jejich fragmenty, má částečně sense- a částečně anti-sense-orientaci.

    ·* · ·· ·

    9 9 9 · · · • 9 9 9 9 9 9 9 • 9 9999 9 9 9 999

    9 9 9 9 9 9
14. 14. Vektor, obsahující molekulu nukleové kyseliny podle jednoho nebo několika nároků 5 až 9 , vyznačující se tím, že je vázán s jedním nebo několika regulačními prvky, které zajišťují transkripci a syntézu RNA v pro- nebo eukaryontické buňce.
15. 15. Způsob podle jednoho nebo více nároků 1 a 2, při němž se jedna nebo několik molekul nukleové kyseliny podle jednoho nebo několika nároků 5 až 9, nebo jeden nebo několik vektorů podle jednoho nebo několika nároků 10 až 14 integruje do genomu buňky.
16. 16. Hostitelská buňka podle jednoho nebo více nároků 3 a 4 , vyznačuj ící se tím, že tato buňka obsahuje jednu nebo několik molekul nukleové kyseliny podle jednoho nebo několika nároků 5 až 9 nebo jeden nebo několik vektorů podle jednoho nebo několika nároků 10 až 14.
17. 17. Způsob přípravy transgenní rostliny, syntetizující modifikovaný škrob, která byla regenerována na celou rostlinu minimálně z jedné rostlinné buňky podle jednoho nebo více z nároků 3, 4 a 16.
18. 18. Rostlina, obsahující jednu nebo více buněk podle jednoho nebo několika z nároků 3, 4 a 16.
19. 19. Rostlina podle nároku 18, která je rostlinou ukládající škrob.
20. 20. Rostlina podle nároku 19, která je užitkovou rostli-

    9 9
21. 21. Rostlina podle jednoho nebo několika nároků 18 až 20, kterou je rostlina pšenice, kukuřice, brambor nebo rýže.
22. 22. Množitelský materiál rostliny podle jednoho nebo několika nároků 18 až 21.
23. 23. Způsob přípravy škrobu podle některého ze známých způsobů, přičemž do tohoto postupu jsou zahrnuty buňky podle jednoho nebo několika nároků 3, 4 a 16, rostliny podle jednoho nebo několika nároků 18 až 21 nebo množitelský materiál podle nároku 22.
24. 24. Škrob, získatelný z buňky podle jednoho nebo několika nároků 3, 4 a 16, z rostliny podle jednoho nebo několika nároků 18 až 21 nebo z množitelského materiálu podle nároku 22.
25. 25. Škrob podle nároku 24 , vyznačující se tím, že v porovnání se škrobem, získatelným z netransformované buňky nebo rostliny, vykazuje minimálně o 30 % nižší obsah fosfátů a že jeho glukanový podíl po úpravě isoamylasou v eluátu získaném v HPLC-systému kolon skládajícím se ze dvou za sebou zařazených kolon s náplní TSK-Gel 2000SV a TSK-Gel 3000SV v 10 mM natriumacetátu pH 3,0 je vyšší minimálně o 50 %.
26. 26. Škrob podle nároku 24 , vyznačující se tím, že v porovnání se škrobem, získatelným z netransformované buňky nebo rostliny, vykazuje minimálně o 10 % vyšší obsah fosfátů a že jeho glukanový podíl po úpravě isoamylasou v eluátu získaném v HPLC-systému kolon skládajícím se ze dvou za sebou zařazených kolon s náplní TSK-Gel 2000SV a TSK-Gel 3000SV v 10 • Φ φ φφφ φφφ φφφ φφφφ φφφφ φφ φ φ φφφφ φ φ φ φφφφ · · · φφφ φφφ φ φ ·· · φφ φ φφ φ mM natriumacetátu ρΗ 3,0 je vyšší minimálně o 50 %.
27. 27. Použití škrobu podle jednoho nebo několika nároků 24 až 26 pro průmyslové aplikace, výhodně pro výrobu potravin, obalových materiálů nebo výrobků pro jedno použití.
28. 28. Použití

    a) alespoň jedné nukleotidové sekvence, kódující protein s funkcí rozpustné škrobové synthasy III nebo fragmety uvedené nukleotidové sekvence a

    b) jedné nebo více nukleotidových sekvencí, kódujících protein, vybraný ze skupiny A, skládající se z proteinů s funkcí rozvětvujících enzymů, ADP-glukoso-pyrofosforylas, škrobových synthas vázaných na škrobové zrno, rozpustných škrobových synthas I, II nebo jiných, enzymů odstraňujících rozvětvení, disproporcionačních enzymů, plastidových škrobových fosforylas, Rl-enzymů, amylas a glukosidas nebo jejich fragmentů pro přípravu transgenních buněk, výhodně bakteriálních nebo rostlinných buněk.
29. 29. Použití jedné nebo více molekul nukleových kyselin podle jednoho nebo několika nároků 5 až 9 nebo jednoho nebo více vektorů podle jednoho nebo několika nároků 10 až 14 pro přípravu transgenních buněk, výhodně bakteriálních nebo rostlinných buněk.
30. 30 .

    Použití buněk podle jednoho nebo několika nároků 3, • φφφ • Φ 9 9 9 ·· 9 · · φ Φ

    99999 9 Φ φφφφφ • Φ φφφ • ΦΦ ·

    4 a 16, rostlin podle jednoho nebo několika nároků 18 až 21 nebo množitelského materiálu podle nároku 22 pro výrobu škrobu.

    čas (min)