CZ20011125A3

CZ20011125A3 - Molekuly nukleových kyselin, které kódují rozvětvovací enzym z bakterie rodu Neisseria, a způsob výroby alfa-1,6- rozvětvených alfa-1,4 glukanů

Info

Publication number: CZ20011125A3
Application number: CZ20011125A
Authority: CZ
Inventors: Volker Büttcher; Martin Quanz
Original assignee: Planttec Biotechnologie Gmbh Forschung & Entwicklung
Priority date: 1998-10-09
Filing date: 1999-10-08
Publication date: 2001-10-17
Also published as: WO2000022140A1; EP1806399A3; CN1325449A; US20120046458A1; US7638311B2; EP1117802A1; JP2002527068A; AU765131C; AU6469799A; CA2345904A1; US8716463B2; BR9915026A; DE59915126D1; US7732164B2; DK1117802T3; US20080020427A1; US7666623B2; EP1117802B1; PL347223A1; US7833751B2

Description

(57) Anotace:

Řešení se týká molekul nukleových kyselin, které kódují rozvětvovací enzym z bakterie rodu Neissera, vektorů, hostitelských buněk, rostlinných buněk a rostlin obsahujících tyto molekuly nukleových kyselin, stejně jako škrobu, který lze získat z těchto rostlin. Řešení se také týká způsobu in vitro výroby a-l,6-rozvětvených ct-l,4-glukanů založeného na sacharose a kombinaci enzymů složené z amylosacharasy a rozvětvovacího enzymu. Dále se řešení týká a-1,6rozvětvených a-1,4- glukanů, které mohou být získány tímto způsobem.

··

Molekuly nukleových kyselin, které kódují rozvětvovací enzym z bakterie rodu

Neisseria, a způsob výroby a-1,6-rozvětvených a-1,4-glukanů

Oblast techniky

Vynález se týká molekul nukleových kyselin, které kódují rozvětvovací enzym z bakterie rodu Neissera, vektorů, hostitelských buněk, rostlinných buněk a rostlin obsahujících tyto molekuly nukleových kyselin, stejně jako škrobu, který lze získat z těchto rostlin. Vynález se také týká způsobu in vitro výroby a-1,6-rozvětvených a-1,4-glukanů založeného na sacharose a kombinaci enzymů složené z amylosacharasy a rozvětvovacího enzymu. Dále se vynález týká glukanů, které mohou být získány popsanými způsoby.

Dosavadní stav techniky

V mnoha ohledech jsou a-1,6-rozvětvené a-1,4-glukany vysoce důležité, protože jsou vhodné například při výrobě produktů farmaceutického a kosmetického průmyslu. Mohou být například použity jako pojící činidlo v tabletách, jako nosič farmaceutických činidel, jako obalový materiál, jako nosič pro práškové přísady, jako přísada u opalovacích krému, která absorbuje UV záření, a jako nosič ochucovadel a vůní.

U rostlin mohou být a-1,6-rozvětvené a-1,4-glukany nalezeny především v podobě amylopektinu, složky škrobu. U rostlin a živočichů se glukany vyskytují hlavně v podobě glykogenu.

Polysacharid škrob je tvořen z chemicky jednotných základních stavebních jednotek, tj. z molekul glukosy. Je to však komplexní směs různých forem molekul, které se liší stupněm polymerace a větvením a které se tedy silně liší ve svých fyzikálně chemických vlastnostech. Je nutné rozlišovat amylosový škrob, který je tvořen v zásadě nerozvětveným polymerem a-1,4-glykosidicky spojených glukosových jednotek, a amylopektinový škrob, který je tvořen rozvětveným polymerem, jehož větvení je tvořeno v důsledku přítomnosti dalších a-1,6-glykosidických vazeb. Podle učebnic (Voet a Voet, Biochemistry, John Wiley & Sons, 1990) se vyskytuje a-1,6-větvení na každém 24. až

30. zbytku glukosy, což odpovídá přibližně stupni větvení 3 % až 4 %. Údaje, které se týkají stupně větvení se liší a závisí na původu příslušného škrobu (například rostlinné druhy, odrůdy rostlin). U rostlin, které jsou obvykle využívány k průmyslové výrobě škrobu, se pohybuje podíl amylosy, vzhledem k obsahu škrobu, mezi 10 % a 25 %. Byly popsány různé postupy výroby a-1,6-rozvětvených a-1,4-glukanů s různým stupněm větvení, včetně postupů zahrnujících použití (transgenních) rostlin.

Tak například heterologní exprese bakteriální glykogensyntetasy v rostlinách brambor vede k mírnému snížení obsahu amylosy, zvýšení stupně větvení a ke změně profilu větvení amylopektinu ve srovnání s rostlinami divokého typu (Shewmaker a kol., Plant. Physiol. 104 (1994), 1159- 1166). Dále bylo pozorováno, že heterologní expresí rozvětvovacího enzymu z E.coli (glgB) v mutantech brambor, které neobsahují amylosu (amf) (Jacobsen a kol., Euphytica 44 (1989), 43 - 48), byly získány molekuly amylopektinu, které obsahovaly o 25 % více větvících míst (Kortsee a kol,, Plant J. 10 (1996), 83 - 90), než tomu bylo u kontrolních rostlin (amf). Při isolaci glukanů s různým stupněm větvení, které byly vyrobeny v transgenních rostlinách, je nezbytné provést další krok čištění za účelem odstranění například amylosové složky. Tyto čisticí kroky jsou pracné, a proto časově náročné a nákladné. Navíc těmito postupy není možné dosáhnout konkrétního stupně větvení. Vzhledem k různícím se pokusným podmínkám (vlivy životního prostředí, umístění) se dále se tyto in vivo způsoby znatelně liší ve výsledné kvalitě produktu.

Glykogen má vyšší stupeň větvení, než amylopektin. Tento polysacharid také obsahuje a-1,6-rozvětvené a-1,4-glukany. Glykogen se také liší od škrobu v průměrné délce postranních řetězců a ve stupni polymerizace. Podle učebnic (Voet a Voet, Biochemistry, John Wiley & Sons, 1990) glykogen obsahuje v průměru po každých 8 až 12 glukosových zbytcích a-1,6-rozvětvovací místo. To odpovídá stupni větvení přibližně 8 % až 12 %. Jsou udávány různé údaje o molekulové hmotnosti glykogenu, která se pohybuje od 1 milionu do více než 1000 milionů (D. J. Manners v: Advances in Carbohydrate Chemistry, vydavatel M. L. Wolfrom, Academie Press, New York (1957), 261 298; Geddes a kol., Carbohydr. Res. 261 (1994), 79 - 89). Tyto údaje také velmi silně závisí na příslušném původním organismu, jeho stavu výživy a způsobu isolace glykogenu. Glykogen je obvykle získáván z mušlí (například Mytilus edulis), ze savčích jater nebo svalů (například králík, krysa) (Bell a kol., Biochem. J. 28 (1934), 882; Bueding a Orrell, J. Biol. Chem. 236 (1961), 2854). To způsobuje, že výroba v průmyslovém měřítku je velmi časově a finančně náročná.

Přirozeně se vyskytující popsané a-1,6-rozvětvené a-1,4-glukany, škrob a glykogen se velmi liší v závislosti na obsahu a-1,6-glykosidického větvení. To platí, mimo jiné, s ohledem na rozpustnost, průhlednost, enzymatickou hydrolýzu, reologii, tvorbu • · ··· · • ·

gelu a vlastnosti retrogradace. V mnoha průmyslových aplikacích však takové rozdíly ve vlastnostech nemohou vždy být tolerovány.

In vitro způsoby jsou alternativou získávání a-1,6-rozvětvených a-1,4-glukanů z rostlinných nebo živočišných organismů. V porovnání se způsoby in vivo jsou způsoby in vitro obecně lépe kontrolovatelné a ve větší míře reprodukovatelné, protože reakční podmínky mohou být in vitro přesně nastaveny ve srovnání s podmínkami v žijících organismech. To obvykle umožňuje výrobu neměnných produktů s vysokým stupněm čistoty, tedy produkty vysoké kvality, které jsou velmi důležité pro jakékoli další průmyslové zpravování. Výroba produktů stálé kvality vede k redukci nákladů, protože procesní parametry potřebné k přípravě nemusí být optimalizovány zvlášť pro každou vsádku. Další výhodou některých způsobů in vitro je absence organismů, používaných při způsobech in vivo. To je zcela nezbytné, zvláště pro použití v potravinářském a farmaceutickém průmyslu.

Obecně mohou být in vitro způsoby rozděleny do dvou skupin.

V první skupině způsobů jsou různé substráty, např. amylosa, amylopektin a glykogen, podrobeny působení rozvětvovacího enzymu.

Borovsky a kol. (Eur. J. Biochem. 59 (1975), 615 - 625) byli schopni dokázat, že použití rozvětvovacího enzymu z brambor ve spojení se substrátem amylosou vedlo k tvorbě produktů podobných amylopektinu, které se však lišily ve své struktuře.

Boyer a Preiss (Biochemistry 16 (1977), 3693 - 3699) dále prokázali, že čištěný rozvětvovací enzym (a-1,4-glukan: a-1,4-glukan-6-glykosyltransferasa) zE.coli může být použit ke zvýšení stupně větvení amylosy nebo amylopektinu.

Byl-li však glykogen z E.coli nebo králičích jater inkubován s rozvětvovacím enzymem z E.coli, byl zaznamenán pouze slabý nárůst stupně větvení (Boyer a Preiss, viz výše).

Rumbak a kol. (J. Bacteriol. 173 (1991), 6732 - 6741) také byli schopni zvýšit stupeň větvení amylosy, amylopektinu a glykogenu inkubací těchto substrátů s rozvětvovacím enzymem z Butyrivibrio fibrisolvens.

Okada a kol. použili podobného způsobu (patent číslo US 4454161) ke zlepšení vlastností potravin, které obsahují škrob. Inkubovali sloučeniny, jako amylosu, amylopektin, škrob nebo dextrin s rozvětvovacím enzymem. To mělo výhodný vliv na trvanlivost potravin, které obsahovaly odpovídajícím způsobem modifikované sloučeniny. Patentová přihláška EP-A1 0 690 170 dále popisuje reakci rosolu, tvořeného vodným • · · · roztokem škrobu, s rozvétvovacím enzymem. Výsledkem tohoto procesu byl škrob s výhodnými vlastnostmi pro výrobu papíru.

Avšak nevýhoda výše zmíněných metod tkví v tom, že není možné kvůli rozdílnému stupni větvení výsledných látek (například škrobu, amylopektinu atd.) vyrobit jednotné produkty. Navíc není možné cíleně kontrolovat stupeň větvení, navíc použité substráty jsou poměrně drahé.

Do další skupiny způsobů in vitro patří syntéza a-1,6-rozvětvených a-1,4-glukanů de novo. Vychází se při tom z různých substrátů (glukosy-1-fosfátu, ADP-glukosy, UDP-glukosy) s použitím kombinace enzymů, která je tvořena enzymem pro tvorbu1,4-glukanového řetězce (fosforylasa, škrobsyntetasa, glykogensyntetasa) a rozvětvovacím enzymem.

Illingwort a kol. (Proč. Nat. Acad. Sci. USA 47 (1961), 469 - 478) byli schopni ukázat, že je možná syntéza in vitro molekul podobných glykogenu de novo, s použitím fosforylasy A ze svalů (neznámého organismu) ve spojení s rozvétvovacím enzymem (neznámého organismu) a s použitím substrátu glukosa-1-fosfát. Boyer a Preiss (citace viz výše) připravili rozvětvené α-glukany tak, že zkombinovali enzymové aktivity králičí svalové fosforylasy nebo glykogensyntetasy z E.coli s aktivitou rozvětvovacího enzymu zE.coli a s použitím glukosa-1-fosfátu nebo UDP-glukosy jako substrátu. Borovsky a kol. (Eur. J. Biochem. 59 (1975), 615 - 625) také analyzoval de novo syntézu a-1,6-rozvětvených a-1,4-glukanů z glukosa-1-fosfátu s použitím rozvětvovacího enzymu z brambor spolu s fosforylasou (1,4-a-D-glukan: ortofosfát-a-glykosyltransferasa [EC 2.4.1.1.]) z kukuřice. Doi (Biochimica et Biophysica Acta 184 (1969), 477 - 485) ukázal, že reakce směsi enzymů škrobsyntetasy (ADP-D-glukosa: a-1,4-glukan-a-4glukosyltransferasa) ze špenátu a rozětvovacího enzymu z brambor s použitím ADPglukosy jako substrátu má za výsledek produkty podobné amylopektinu. Parodi a kol. (Arch. Biochem. Biophys. 132 (1969), 11 - 117) použili glykogensyntetasu z krysích jater společně s rozvétvovacím enzymem z krysích jater k de novo syntéze rozvětvených glukanů z UDP-glukosy. Získali tak polymer, který byl podobný přirozenému glykogenu, který se lišil od polymerů na bázi glukosa-1-fosfátu.

Nevýhodou této druhé skupiny in vitro způsobů je to, že substráty, například glukosa-1-fosfát, UDP-glukosa a ADP-glukosa, jsou velmi drahé. Navíc se ani nezdá být možná průběžná kontrola stupně větvení.

• · ··· ·

Bůtcher a kol. (J. Bacteriol. 179 (1997), 3324 - 3330) popisuje způsob výroby in vitro ve vodě nerozpustných a-1,4-glukanů s použitím amylosacharasy a sacharosy jako substrátů. Takto jsou však syntetizovány pouze lineární řetězce a-1,4-glukanů bez větvení.

Podstata vynálezu

Technickým problémem, kterého se týká tento vynález, je tedy poskytnout způsob, který umožní levnou výrobu a-1,6-rozvětvených a-1,4-glukanů pro průmyslové účely, stejně tak jako poskytnout molekuly nukleových kyselin kódující enzymy, které mohou být použity ve těchto způsobech výroby a zvláště pak rozvětvovacího enzymu.

Tento technický problém byl vyřešen tím, že byla poskytnuta provedení popsaná v nárocích.

Tento vynález se tedy týká molekuly nukleové kyseliny, která kóduje rozvětvovací enzym (EC 2.4.1.18) z bakterie rodu Neisseria, vybrané ze skupiny zahrnující:

a) molekuly nukleové kyseliny, které kódují protein obsahující aminokyselinovou sekvenci zobrazenou jako SEKV. ID. Č. 2;

b) molekuly nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci kódujícího úseku, který je zobrazen jako SEKV. ID. Č. 1;

c) molekuly nukleové kyseliny, které kódují protein obsahující aminokyselinovou sekvenci, která je kódována insertem plasmidů DSM 12425;

d) molekuly nukleové kyseliny, které obsahují úsek insertu plasmidů DSM 12425, který kóduje rozvětvovací enzym z Neisseria denitrificans;

e) molekuly nukleové kyseliny, které kódují protein, jehož sekvence vykazuje v rámci prvních 100 aminokyselin homologii alespoň 65 % k sekvenci zobrazené jako SEKV. ID. Č. 2;

f) molekuly nukleové kyseliny, jejichž komplementární řetězec hybridizuje s nukleovou kyselinou podle a), b), c), d) a/nebo e) a která kóduje rozvětvovací enzym z bakterie rodu Neisseria; a

g) molekuly nukleové kyseliny, jejichž sekvence se liší od sekvence molekuly nukleové kyseliny z bodu f) kvůli degeneraci genetického kódu.

Sekvence nukleové kyseliny zobrazená jako SEKV. ID. Č. 1 je genomová sekvence, která zahrnuje kódující úsek rozvětvovacího enzymu z Neisserie denitrificans.

Plasmid, který obsahuje zmíněnou sekvenci byl nazván jako DSM 12425. Na základě o

zmíněné sekvence nebo zmíněné molekuly může nyní odborník izolovat homologní « · · ·· · sekvence z dalších druhů nebo kmenů Neisseria. Může to provést s použitím obvykle užívaných způsobů, jako je prohledávání knihoven cDNA nebo genomových knihoven s vhodnými hybridizačními sondami. Homologní sekvence mohou být také isolovány tak, jak je popsáno v příkladu 1. Je tedy například možné identifikovat a isolovat takové molekuly nukleových kyselin, které hybridizují se sekvencí zobrazenou jako SEKV. ID. Č. 1, a které kódují rozvětvovací enzym.

Molekuly nukleových kyselin podle vynálezu mohou v zásadě kódovat rozvětvovací enzym z jakékoli bakterie rodu Neisseria, s výhodou kódují rozvětvovací enzym z Neisseria denitrificans.

Podle vynálezu znamená pojem „hybridizace“ hybridizaci za obvyklých hybridizačních podmínek, s výhodou za stringentních podmínek, jak bylo popsáno například v Sambrook a kol., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, druhé vydání (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. Zvláště výhodný je význam „hybridizace“ ve smyslu hybridizace za následujících podmínek:

hybridizační pufr:	2xSSC; 10xDenhardtův roztok (Fikoll 400 + PEG + BSA v poměru 1:1:1); 0,1% SDS; 5 mM EDTA; 50 mM Na2HPO4; 250 pg/ml DNA ze spermatu sleďů; 50 pg/ml tRNA; nebo pufr 25 M fosforečnan sodný, pH 7,2; 1 mM EDTA; 7% SDS
hybridizační teplota:	T = 65 až 68 °C
oplachovací pufr:	0,2xSSC; 0,1% SDS
oplachovací teplota:	T = 65 až 68 °C.

Molekuly nukleových kyselin, které hybridizují s molekulami nukleových kyselin z tohoto vynálezu mohou být, v principu, odvozeny od jakékoli bakterie rodu Neisseria, která exprimuje odpovídající protein, s výhodou jsou odvozeny od Neisseria denitrificans. Molekuly nukleových kyselin, které hybridizují s molekulami z tohoto vynálezu, mohou být například izolovány z genomových nebo z cDNA knihoven. Takové molekuly nukleových kyselin mohou být identifikovány a izolovány s použitím molekul nukleových kyselin z tohoto vynálezu nebo jejich částí nebo jejich reverzních komplementárních částí, např. standardními technikami hybridizace (srovnej Sambrook a kol., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, druhé vydání (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY), nebo za pomoci amplifikace PCR.

• · · · · · • ·

Jako hybridizační sonda mohou být použity molekuly nukleových kyselin, které mají přesně stejnou nebo podstatně stejnou sekvenci nukleotidů jak je zobrazena pod SEKV. ID. Č. 1, nebo její části. Fragmenty používané jako hybridizační sondy mohou být také syntetické fragmenty, které byly vyrobeny obvyklým způsobem syntézy a jejichž sekvence je v podstatné míře identická se sekvencí molekul nukleových kyselin podle vynálezu. Jestliže byly identifikovány a isolovány geny, které hybridizují s molekulami nukleových kyselin z tohoto vynálezu, měla by být stanovena jejich sekvence a měly by být analyzovány vlastnosti proteinu, který je sekvencí kódován, aby bylo zjištěno, zda jsou to rozvětvovací enzymy. Za tímto účelem je zvláště vhodné porovnání homologie sekvencí nukleových kyselin a aminokyselin a určení enzymové aktivity.

Mezi molekuly, které hybridizují s molekulami nukleových kyselin podle vynálezu, patří zvláště fragmenty, deriváty a alely výše popsaných molekul nukleových kyselin, které kódují rozvětvovací enzym z bakterie rodu Neisseria, s výhodou pak z Neisseria denitrificans. Výraz „derivát“ v této souvislosti znamená, že sekvence zmíněné molekuly nukleové kyseliny se liší od sekvence výše zmíněných molekul nukleových kyselin v jedné nebo více polohách a sdílí vysoký stupeň homologie se zmíněnými sekvencemi. Homologií je v této souvislosti myšleno, že identita sekvencí dosahuje v celé jejich délce alespoň 60 %, zvláště pak alespoň 70 %, s výhodou více než 80 %, výhodněji více než 90 % a velmi výhodně alespoň 95%. Odchylky od výše zmíněných molekul nukleových kyselin mohou být způsobeny například delecí, adicí, substitucí, inzercí nebo rekombinací.

Homologie dále znamená, že mezi příslušnými molekulami nukleových kyselin nebo proteiny jimi kódovanými existuje funkční a/nebo strukturní rovnocennost. Molekuly nukleových kyselin, které jsou homologní k výše zmíněným molekulám nukleových kyselin a které jsou od nich ovozeny, jsou obvykle variace zmíněných molekul se stejnými biologickými funkcemi. Mohou to být jak přirozeně se vyskytující varianty, např. sekvence z jiných druhů nebo kmenů Neisseria, tak mutace s těmito přirozeně se vyskytujícími mutacemi nebo zavedenými řízenou mutagenezí. Dále se může jednat o sekvence vyrobené synteticky. Alelové varianty mohou být jak přirozeně se vyskytující varianty, tak varianty vyrobené synteticky nebo technikami rekombinantní DNA.

Proteiny, které jsou kódovány různými variantami molekul nukleových kyselin podle vynálezu mají určité znaky společné. Sem například patří biologická aktivita, molekulová hmotnost, imunologická reaktivita, konformace atd., stejně jako fyzikální vlast• · ♦ · nosti jako je migrační chování při gelové elektroforéze, chromatografické chování, sedimentační koeficienty, rozpustnost, spektroskopické vlastnosti, stabilita, optimální pH, optimální teplota atp.

Molekulová hmotnost rozvětvovacího enzymu z Neisseria denitríficans je

86,3 kDa, kde molekulová hmotnost je odvozena z aminokyselinové sekvence. Odvozená molekulová hmotnost proteinu podle vynálezu se tedy s výhodou pohybuje mezi 70 kDa a 100 kDa, výhodněji od 77 kDa do 95 kDa a velmi výhodně je přibližně 86 kDa.

Vynález se také týká molekul nukleových kyselin kódujících protein s enzymovou aktivitou rozvětvovacího enzymu, kde kódovaný protein sdílí homologii alespoň 65 %, s výhodou alespoň 80 % a velmi výhodně alespoň 95 %, a to v oblasti N-konce, s výhodou prvních 100 aminokyselin, výhodněji prvních 110 aminokyselin a velmi výhodně prvních 120 aminokyselin s aminokyselinovou sekvencí zobrazenou pod SEKV. ID. Č. 2.

V dalším provedení se tato přihlášky týká molekul nukleových kyselin, které kódují protein s aktivitou rozvětvovacího enzymu, kde tento protein obsahuje alespoň jeden, s výhodou 5, výhodněji 10 a velmi výhodně 20 následujících peptidových motivů:

a) MNRNRHI (SEKV. ID. Č. 8),

b) RPDAHH (SEKV. ID. Č. 9),

c) HAPDYAL (SEKV. ID. Č. 10),

d) EGEAA(SEKV. ID. Č. 11),

e) DDYRF (SEKV. ID. Č. 12),

f) SALQH (SEKV. ID. Č. 13),

g) YETLG (SEKV. ID. Č. 14),

h) VSGVR (SEKV. ID. Č. 15),

i) VSVIG (SEKV. ID. Č. 16),

j) FNGWD (SEKV. ID. Č. 17),

k) LYKFS (SEKV. ID. Č. 18),

l) PYAFG (SEKV. ID. Č. 19),

m) RPTTAS (SEKV. ID. Č. 20),

n) FRRRA (SEKV. ID. Č. 21),

o) DELVNY (SEKV. ID. Č. 22),

p) LPLSEY (SEKV. ID. Č. 23),

q) YQATGL (SEKV. ID. Č. 24), • · ··· ·

r) DDHGL (SEKV. ID. Č. 25),

s) HQDWN (SEKV. ID. Č. 26),

t) DGIRV (SEKV. ID. Č. 27),

u) YGGSEN (SEKV. ID. Č. 28),

v) SFAEES (SEKV. ID. Č. 29),

w) DPVHR (SEKV. ID. Č. 30),

x) WQQFAN (SEKV. ID. Č. 31),

y) EILNS (SEKV. ID. Č. 32),

z) ATEIQTAL (SEKV. ID. Č. 33), aa)VKDKQAKAK (SEKV. ID. Č. 34).

Molekuly nukleových kyselin podle vynálezu mohou být jakékoli molekuly nukleových kyselin, zvláště pak molekuly DNA nebo RNA, například cDNA, genomová DNA, mRNA atd. Mohou to být přirozeně se vyskytující molekuly nebo molekuly vyrobené genetickými technikami nebo technikami chemické syntézy. Mohou to být jednořetězcové molekuly, které obsahují kódující nebo nekódující řetězec, nebo to také mohou být dvouřetězcové molekuly.

Dále se tento vynález týká molekul nukleových kyselin, které jsou dlouhé alespoň 15, s výhodou více než 50 a velmi výhodně více než 200 nukleotidů a které specificky hybridizují s alespoň jednou molekulou nukleové kyseliny podle vynálezu. Výraz „specificky hybridizují“ v této souvislosti znamená, že zmíněné molekuly hybridizují s molekulami nukeových kyselin kódujícími protein podle vynálezu, nicméně nehybridizují s molekulami nukleových kyselin kódujícími jiné proteiny. Výraz „hybridizují“ znamená, že s výhodou hybridizují za stringentních podmínek (viz výše). Zvláště se tento vynález týká molekul nukleových kyselin, které hybridizují s transkripty molekul nukleových kyselin podle vynálezu a mohou tedy zabránit jejich translaci. Takové molekuly nukleových kyselin, které specificky hybridizují s molekulami podle vynálezu, mohou být například složkami antimediátorových konstruktů nebo ribozymů nebo mohou být použity jako primery pro amplifikaci pomocí PCR.

Vynález se navíc vztahuje na vektory, zvláště plasmidy, kosmidy, viry, bakteriofágy a další vektory, které jsou používány obvykle v genovém inženýrství a které obsahují výše popsané molekuly nukleových kyselin podle vynálezu.

Ve výhodném provedení molekuly nukleových kyselin obsažené ve vektorech jsou spojeny v antikódující orientaci s regulačními úseky, které zajistí expresi φ· ··· · v prokaryontních nebo eukaryontních buňkách. Výrazem „exprese“ je v tomto smyslu míněna jak transkripce, tak transkripce následovaná translací.

Exprese molekul nukleových kyselin podle vynálezu v prokaryontních buňkách, např. v Escheríchia coli, umožňuje například přesnější charakterizaci enzymových aktivit kódovaných proteinů. Dále je konvenčními technikami molekulární biologie (např. Sambrook a kol., citováno výše) možné do molekul nukleových kyselin z tohoto vynálezu zavést různé mutace. To vede k syntéze proteinů, jejichž vlastnosti byly dobrovolně změněny. Je také možné vytvořit deleční mutanty postupnou delecí 5’ nebo 3’ konce kódující sekvence DNA. Tím vzniknou molekuly nukleových kyselin, které povedou k syntéze odpovídajícím způsobem zkrácených proteinů. Dále je možné zavést bodové mutace na polohách, kde ovlivní například enzymovou aktivitu nebo regulaci enzymu. Tímto způsobem mohou být vyrobeny mutanty, které mají změněnou hodnotu Km, nebo které nejsou dále podrobeny obvyklým regulačním mechanismům v buňkách prostřednictvím alosterické regulace nebo kovalentní modifikace. Dále mohou být vytvořeny mutanty, které mají změněnou substrátovou nebo produktovou specificitu. Dále mohou být vytvořeny mutanty, které mají změněný teplotní profil aktivity. Genetické manipulace v prokaryontních buňkách mohou být prováděny způsoby, které jsou odborníkům známy (Sambrook a kol., citováno výše).

Regulační úseky k expresi v prokaryontních organismech, např. E. coli, a eukaryontních organismech byly dostatečně popsány v literatuře, zvláště sekvence sloužící k expresi v kvasinkách, jako Saccharomyces cerevisiae. Přehled různých systémů, sloužících k expresi proteinů v různých hostitelských organismech je podán v Methods in Enzymology 153 (1987), 383 - 516 a EJitter a kol. (Methods in Enzymology 153 (1987), 516-544).

Molekula nukleové kyseliny podle vynálezu, která byla zavedena do vektoru podle vynálezu, je s výhodou modifikována tak, aby bylo jednodušší izolovat kódovaný protein z kultivačního média, poté co byl exprimován ve vhodném hostitelském organismu. Je zde například možnost exprimovat kódovaný rozvětvovací enzym jako fúzní protein spolu s další polypeptidovou sekvencí, kde specifické vazebné schopnosti tohoto polypeptidu umožňují izolaci fúzního proteinu afinitní chromatografií (Chong a kol., Gene 192 (1997), 271 - 281; Hopp a kol., Bio/Technology 6 (1988), 1204 - 1210; Sassenfeld, Trends Biotechnol. 8 (1990), 88 - 93).

Dále je výhodné, aby molekula nukleové kyseliny podle vynálezu, obsažená ve vektoru podle vynálezu, obsahovala sekvenci nukleotidů, která umožňuje sekreci roz·0·0 • ·· • ·· ♦ ·!

0 0*

0· ·· větvovacího enzymu do kultivačního média. S výhodou je použit signální peptid α-CGTasy zKlebsiella oxytoca M5A1 (Fiedler a kol., J. Mol. Biol. 256 (1996), 279 291; Genová banka, přístupové číslo X86014, CDS 11529 - 11618). Protein je získáván a čištěn jednodušeji díky sekreci enzymu do kultivačního média. Není nutné rozbíjet buňky a enzym může být získán z kultivačního média obvyklými způsoby, jako je např. dialýza, osmóza, chromatografické metody atd., které se používají k odstranění zbytkových složek kultivačního média.

Dále mohou vektory z tohoto vynálezu obsahovat další funkční jednotky, které mohou zajistit stabilizaci vektoru v hostitelském organismu, jako je bakteriální replikační počátek nebo 2p-DNA sloužící ke stabilizaci v S. cerevisiae.

V dalším provedení vynálezu se vynález týká hostitelských buněk, zvláště prokaryontních nebo eukaryontních buněk, které byly transformovány výše popsanou molekulou nukleové kyseliny nebo vektorem, stejně jako buněk, které jsou odvozeny od zmíněných hostitelských buněk a které obsahují zmíněné molekuly nukleových kyselin nebo vektory. Hostitelské buňky mohou být bakteriální buňky (například E. coli) nebo buňky hub (například kvasinky, zvláště S. cerevisiae), stejně tak jako rostlinné nebo živočišné buňky. Výraz „transformované“ znamená, že buňky podle vynálezu byly geneticky modifikovány molekulou nukleové kyseliny podle vynálezu tak, že obsahují alespoň jednu molekulu nukleové kyseliny podle vynálezu kromě svého přirozeného genomu. Zmíněná molekula nukleové kyseliny může být přítomna volně v buňce, případně jako samostatně se replikující molekula, nebo může být stabilně začleněna do genomu hostitelské buňky.

Výhodnými hostitelskými organismy jsou mikroorganismy. V rámci tohoto vynálezu mohou být takovými mikroorganismy veškeré bakterie a veškerá protista (například houby, zvláště pak kvasinky a řasy), jak bylo definováno například v Schlegel „Allgemeine Mikrobiologie“ (Georg Thieme Verlag (1985), 1-2).

Ve zvláště výhodném provedení jsou hostitelskými buňkami tohoto vynálezu rostlinné buňky. V principu se může jednat o buňky jakéhokoli rostlinného druhu, tj. jak jednoděložných, tak dvouděložných rostlin. S výhodou se jedná o rostlinné buňky ze zemědělsky užitečných rostlin, tj. rostlin, které lidé pěstují za nutričními nebo technickými účely, zvláště pak za průmyslovými účely. Vynález se s výhodou týká rostlinných buněk z rostlin, které tvoří vlákninu (například len, konopí, bavlna), rostlin uchovávajících olej (řepka, slunečnice, sója), rostlin uchovávajících cukr (například cukrová řepa, cukrová třtina, cukrový čirok, banán) a rostlin uchovávajících proteiny (například luštěniny).

V dalším provedení se tento vynález týká rostlinných buněk z pícnin (například pícninové trávy a trávy na pastvu (vojtěška, jetel atd.)), zeleniny (například rajčata, hlávkový salát, čekanka).

Ve výhodném provedení se vynález týká rostlinných buněk z rostlin ukládajících škrob (např. pšenice, ječmen, oves, žito, brambory, kukuřice, rýže, hrách, maniok, fazole). Obzvlášť výhodné jsou rostlinné buňky z kukuřice, rýže, pšenice a brambor.

Dále se vynález týká způsobu výroby rozvětvovacího enzymu z bakterie rodu Neisseria. V tomto způsobu jsou hostitelské buňky podle vynálezu kultivovány za podmínek, které umožňují expresi proteinu a protein je získáván z kultury, tj. z buněk nebo kultivačního média. S výhodou je použit hostitelský organismus, který rozvětvovací enzym vylučuje.

Dále se vynález týká způsobu výroby rozvětvovacího enzymu z bakterie rodu Neisseria, kde je protein vyráběn v in vitro transkripčním a translačním systému s použitím molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu. Odborníci v oboru takovéto systémy znají.

Vynález se také týká proteinů, které jsou kódovány molekulami nukleových kyselin podle vynálezu nebo které jsou získatelné způsobem podle vynálezu.

Dále se vynález týká protilátek, které specificky rozpoznávají protein podle vynálezu. Tyto protilátky mohou být například monoklonální nebo polyklonální. Mohou to také být fragmenty protilátek, které rozpoznávají proteiny podle vynálezu. Odborníci v oboru znají způsoby přípravy takových protilátek nebo fragmentů.

Dále se tento vynález týká použití rozvětvovacího enzymu podle vynálezu pro přípravu a-1,6-rozvětvených a-1,4-glukanů v in vitro systému.

Zvláště se vynález týká také transgenních rostlinných buněk, které obsahují molekuly nukleových kyselin nebo vektory podle vynálezu. S výhodou se buňky podle vynálezu vyznačují tím, že molekula nukleové kyseliny podle vynálezu, která tam byla zavedena, je stabilně zabudována do genomu a je řízena promotorem aktivním v rostlinných buňkách.

K dispozici je řada promotorů nebo regulačních úseků vhodných pro expresi molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu v rostlinných buňkách. V principu veškeré promotory, zesilovače, terminátory atd., které jsou aktivní v rostlinách, jsou regulačními úseky exprese v rostlinných buňkách. V podstatě může být použit každý promotor, který je funkční v rostlině, zvolené ke transformaci. S ohledem na použité druhy rostlin může být promotor homologni nebo heterologní. Zmíněný promotor může být zvolen tak, že exprese probíhá konstitutivně nebo pouze v konkrétním pletivu, určitém stadiu vývoje rostliny nebo v okamžiku, který je určen vnějším vlivem. Příklady vhodných promotorů jsou 35S promotor viru mozaiky květáku (Oděli a kol., Nátuře 313 (1985), 810 - 812 nebo US 5 352 605), který umožňuje konstitutivní expresi ve všech pletivech rostliny, a konstrukt promotoru, který je popsán vWO/9401571. Dalšími příklady jsou promotor ubichitinu (srov. např. US 5 614 399) a promotory polyubichitinových genů z kukuřice (Christensen a kol., výše uvedená citace). Mohou být však použity i promotory, které jsou aktivovány až vnějším vlivem (například WO/9307279). Středem zvláštního zájmu mohou být promotory proteinů teplotního šoku, které umožňují snadnou indukci. Dále mohou být použity promotory, které vedou k expresi následujících sekvencí v určitém pletivu rostliny, např. ve fotosynteticky aktivním pletivu. Příklady takových promotorů jsou ST-LS1 promotor (Stockhaus a kol., Proč. Nati. Acad. Sci USA 84 (1987), 7943 7947; Stockhaus a kol., EMBO J. 8 (1989), 2445 - 2451), Ca/b promotor (srov. např. US 5 656 496, US 5 639 952, Bansal a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89 (1992), 3654 - 3658) a promotor rubisca SSU (srov. např. US 5 034 322 a US 4 962 028). Dále by měly být zmíněny promotory, které jsou aktivní v orgánech rostlin určených k transformaci, ve kterých se skladuje škrob. U kukuřice je to například zrno, zatímco u bramboru jsou to hlízy. Za účelem nadměrné exprese molekul nukleových kyselin podle vynálezu v bramboru, může být například použit promotor B33 genu patatinu, který je specifický pro hlízy (Rocha-Sosa a kol., EMBO J. 8. (1989), 23 - 29). Promotory specifické pro semena byly již v minulosti popsány pro různé rostlinné druhy. Takovým příkladem je USP promotor z Vicia faba, který zaručuje expresi specifickou pro semena ve V. faba a jiných rostlinách (Fiedler a kol., Plant Mol. Biol. 22 (1993), 669 - 679; Báumlein a kol., Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 459-467).

Navíc mohou být použity promotory specifické pro ovoce, popsané ve WO 91/01373. Zvláště jsou výhodné promotory pro specifickou expresi v endospermu, jako je promotor glutelinu (Leisy a kol., Plant Mol. Biol. 14 (1990), 41 - 50; Zheng a kol., Plant J. 4 (1993), 357 - 366), promotor HMG z pšenice, USP promotor, promotor phaseolinu nebo promotory zeinových genů z kukuřice (Pedersen a kol., Cell 29 (1982), 1015 - 1026; Quatroccio a kol., Plant Mol. Biol. 15 (1990), 81 - 93). S využitím promotorů specifických pro endosperm je možné zvýšit množství transkriptu molekul nukleo14 ·« ···» ·« »· ·· • ♦ · · · » · • ♦ ·· · · • · · · · · » • ·» · * · . • · · · · · 9 vých kyselin z tohoto vynálezu v endospermu v porovnání s endospermem odpovídajících rostlin divokého typu.

Zvláště výhodný je tzv. „shrunken-1-promotor“ (sh-1) z kukuřice (Werr a kol., EMBO J. 4 (1985), 1373-1380).

Dále může být přítomna terminační sekvence, zodpovědná za správné ukončení transkripce a přidání poly-A konce k transkriptu, která má funkci stabilizace transkriptu. Tyto úseky byly popsány v literatuře (srov. např. Gielen a kol., EMBO J. 8 (1989), 23 29) a mohou být libovolně měněny.

Je tedy možné exprimovat molekuly nukleových kyselin podle vynálezu v rostlinných buňkách.

Tento vynález se tedy také vztahuje na způsob přípravy transgenních rostlinných buněk, který zahrnuje zavedení molekuly nukleové kyseliny nebo vektoru podle vynálezu do rostlinných buněk. Odborník v oboru má k dispozici různé transformační systémy. Například použití T-DNA k transformaci rostlinných buněk bylo studováno velmi podrobně a je popsáno v EP-A-120 516; Hoekema: The Binary Plant Vector Systém, Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), kapitola V, Fraley, Crit. Rev. Plant. Sci., 4, 1 -46aAn, Embo J. 4 (1985), 227-287.

Za účelem přenosu DNA do rostlinných buněk mohou být rostlinné explantáty kultivovány vhodným způsobem společně s Agrobacteríum tumefaciens nebo Agrobacterium rhizogenes. Celé rostliny mohou být poté regenerovány z infikovaného rostlinného materiálu (např. částí listů, segmenty stonku, kořeny a protoplasty nebo rostlinné buňky kultivované v suspenzích) ve vhodném médiu, které může obsahovat antibiotika nebo biocidy k selekci transformovaných buněk. Takto získané rostliny mohou být následně testovány na přítomnost zavedené DNA. Jsou známy další možnosti zavedení cizí DNA s použitím biolistických způsobů nebo transformací protoplastů (Willmitzer, L. 1993 Transgenic plants. V: Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise (H.J. Rehm, G. Reed, A. Puhler, P. Stadler, vydavatelé), 2. díl, 627 - 659, VCH Weinheim-New York-Basel-Cambridge).

Mezi alternativními systémy transformace jednoděložných rostlin patří biolistické metody, elektricky nebo chemicky indukovaná absorpce DNA protoplasty, elektroporace částečně permeabilizovaných buněk, mikroinjektáž DNA do květu, mikroinjektáž DNA do mikrospor a proembryí, absorpce DNA zrajícím pylem a absorpce DNA u embryí bobtnáním (srov. např. Lusardi, Plant J. 5 (1994), 571 - 582; Paszowski, Biotechnology

24(1992), 387-392).

Zatímco transformace dvouděložných rostlin s použitím systému s vektorem Ti-plasmidu a s použitím Agrobacteria tumefaciens je velmi dobře zavedena, nedávné studie poukazují na fakt, že i jednoděložné rostliny mohou být transformovány vektorem založeným na Agrobacteriu (Chán, Plant Mol. Biol. 22 (1993), 491 - 506; Hiei, Plant J. 6 (1994), 271 - 282; Bytebier, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84 (1987), 5345 - 5349; Raineri, Bio/Technology 8 (1990), 33 - 38; Gould, Plant Physiol. 95 (1991), 426 - 434; Mooney, Plant, Cell Tiss. & Org. Cult. 25 (1991), 209 - 218; Li, Plant Mol. Biol. 20 (1992), 1037-1048).

V minulosti byly tři z výše uvedených transformačních systémů adaptovány pro transformaci různých obilovin: elektroporace pletiva, transformace protoplastů a přenos DNA bombardováním částicemi v regenerovatelném pletivu a buňkách (přehled viz Jáhne, Euphytica 85 (1995), 35 - 44). Transformace pšenice byla několikrát popsána v literatuře (přehled viz Maheshwari, Critical Reviews in Plant Science 14 (2) (1995), 149-178).

Zvláště transformace kukuřice byla několikrát v literatuře popsána (srovnej například WO 95/06128, EP 0513849, EO 0465875, EP 292435; Fromm a kol., Biotechnology 8 (1990), 833 - 844; Gordon-Kamm a kol., Plant Cell 2 (1990), 603 - 618; Koziel a kol., Biotechnology 11 (1993), 194-200; Moroc a kol., Theor. Appl. Genet. 80 (1990), 721 - 726).

Také byl popsána popsána úspěšná transformace dalších druhů obilovin, například ječmene (Wan a Lemaux, viz výše; Ritala a kol., viz výše; Krens a kol., Nátuře 296 (1982), 72 - 74 a pro pšenici (Nehra a kol., Plant J. 5 (1994), 285-297).

Pro expresi molekuly nukleových kyselin podle vynálezu v rostlinách je v principu možné lokalizovat syntetizovaný protein do jakékoli části rostlinné buňky. Kódující úsek musí být případně spojen se sekvencemi DNA, které zajišťují lokalizaci do příslušné části buňky, aby byla následně dosažena lokalizace v konkrétní části buňky. Takové sekvence jsou známy (srovnej například Braun, EMBO J. 11 (1992), 3219 - 3227; Sonnenwald, Plant J. 1 (1991), 95 - 106; Rocha-Sosa, EMBO J. 8 (1989), 23 - 29).

Jako plastidová signální sekvence může být například použita sekvence zferedoxin:NADP⁺oxidoreduktasy (FNR) ze špenátu. Tato sekvence obsahuje na 5’ konci netranslatovanou oblast a přesahující sekvenci tranzitního peptidu cDNA plastidového proteinu feredoxin:NADP⁺oxidoreduktasy ze špenátu (nukleotidy -171 až +165;

Jansen a kol., Current Genetics 13 (1989), 517 - 522).

·· <···

Dále může být jako plastidová signální sekvence použit tranzitní peptid voskového proteinu z kukuřice spolu s prvními 34 aminokyselinami vyvinutého voskového proteinu (Klósgen a kol., Mol. Gen. Genet. 217 (1989), 155- 161). Dále může být použit tranzitní peptid voskového proteinu z kukuřice (srov. výše) bez 34 aminokyselin vyvinutého voskového proteinu.

Je dále možné použít následující plastidové signální sekvence: signální sekvenci malé podjednotky ribulosabisfosfátkarboxylasy (Wolter a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85 (1988), 846-850; Nawrath a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91 (1994), 12760 - 12764); signální sekvence NADPmalátdehydrohenasy (Gallardo a kol., Planta 197 (1995), 324 - 332); signální sekvence glutathionreduktasy (Creissen a kol., Plant J. 8 (1995), 167-175).

Vynález se tedy také týká transgenních rostlinných buněk, které byly transformovány jednou nebo více molekulami nukleové kyseliny z tohoto vynálezu, stejně jako rostlinných buněk, které byly odvozeny od takto transformovaných buněk. Takové buňky obsahují jednu nebo více molekul nukleové kyseliny podle vynálezu, kde zmíněné molekuly jsou s výhodou spojeny s regulačními úseky DNA, které zajišťují transkripci v rostlinných buňkách, především s promotorem. Takové buňky mohou být odlišeny od přirozeně se vyskytujících rostlinných buněk tak, že obsahují alespoň jednu molekulu nukleové kyseliny podle vynálezu.

Transgenní rostlinné buňky mohou být regenerovány na celé rostliny s použitím technik dobře známých odborníkům. Rostliny, které lze získat regenerací transgenních rostlinných buněk podle, jsou také předmětem vynálezu.

Dále rostliny, které obsahují výše zmíněné rostlinné buňky, jsou také předmětem tohoto vynálezu. Rostliny z tohoto vynálezu mohou být v principu rostliny jakéhokoli rostlinného druhu, tj. jak jednoděložné, tak dvouděložné rostliny. S výhodou se jedná o užitkové rostliny, tj. rostliny, které jsou pěstovány z důvodů nutričních nebo technických, zvláště pak pro průmyslové účely. S výhodou se tento vynález týká rostlinných buněk z rostlin, které tvoří vlákninu (např. len, konopí, bavlna), rostlin uchovávajících olej (např. řepka, slunečnice, sója), rostlin uchovávajících cukr (např. cukrová řepa, cukrová třtina, cukrový čirok, banán) a rostlin uchovávajících proteiny (např. luštěniny).

V jiném provedení se vynález týká pícnin (například pícninových trav a trav z pastvin (vojtěška, jetel, atd.)), zeleniny (například rajčata, hlávkový salát, čekanka).

*· *·♦·

Ve výhodném provedení se vynález týká rostlin uchovávajících škrob (například pšenice, ječmen, oves, žito, brambory, kukuřice, rýže, hrách, kasava, fazole mung), rostlinné buňky z kukuřice, rýže, žita a brambor jsou zvláště výhodné.

Ve výhodné podobě tohoto vynálezu mají buňky z rostlin podle vynálezu zvýšenou aktivitu proteinu podle vynálezu v porovnání s odpovídajícími rostlinnými buňkami rostlin divokého typu, které nebyly geneticky modifikovány. S výhodou jsou to buňky z pletiv, ve kterých se skladuje škrob, zvláště pak buňky z hlíz nebo endospermu, velmi výhodně jsou to buňky z hlíz brambor nebo endospermu kukuřice, žita nebo rýže.

V rámci tohoto vynálezu je pojmem „zvýšení aktivity“ míněn vzrůst exprese molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu, která kóduje protein s enzymovou aktivitou rozvětvovacího enzymu, zvýšení množství proteinu s enzymovou aktivitou rozvětvovacího enzymu a/nebo vzrůst aktivity proteinu s aktivitou rozvětvovacího enzymu v rostlinách.

Vzrůst exprese může být stanoven například měřením množství transkriptu, který kóduje zmíněné proteiny, tj. analýzou Northern blotu nebo RT-PCR. Výraz „vzrůst“ v této souvislosti značí s výhodou nárůst množství transkriptu alespoň o 10%, s výhodou o alespoň 20 %, výhodněji o alespoň 50 % a velmi výhodně alespoň o 75 % ve srovnání s rostlinnými buňkami, které nebyly geneticky modifikovány.

Množství proteinů s aktivitou rozvětvovacího enzymu může být například měřeno analýzou Western blotu. Výraz „vzrůst“ v tomto případě s výhodou značí, že se množství proteinu s aktivitou rozvětvovacího enzymu zvýší o alespoň 10 %, s výhodou o alespoň 20 %, výhodněji o alespoň 50 % a velmi výhodně alespoň o 75 % ve srovnání s odpovídajícími buňkami, které nebyly geneticky modifikovány.

Vzrůst aktivity proteinu s enzymovou aktivitou rozvětvovacího enzymu může být například stanoven způsobem popsaným v Lloyd a kol. (Biochem. J. 338 (1999), 515 až 521). Výraz „vzrůst“ v tomto případě s výhodou značí, že se aktivita rozvětvovacího enzymu zvýší o alespoň 10 %, s výhodou o alespoň 20 %, výhodněji o alespoň 50 % a velmi výhodně alespoň o 75 %.

Překvapivě bylo zjištěno, že rostliny, které obsahují rostlinné buňky podle vynálezu se zvýšenou aktivitou rozvětvovacího enzymu syntetizují modifikovaný škrob ve srovnání s odpovídajícími rostlinami divokého typu, které nebyly geneticky modifikovány. Modifikovaný škrob může mít například pozměněny fyzikálně-chemické vlastnosti, zvláště pak poměr amylosa/amylopektin, stupeň větvení, průměrnou délku řetězce, obsah fosfátu, viskozitu, velikost škrobových zrn, distribuci postranních řetězců a/nebo

9« »··· tvar škrobových granulí ve srovnání s rostlinami divokého typu. Výsledný pozměněný škrob je vhodnější pro některé konkrétní účely.

Dále bylo překvapivě zjištěno, že v rostlinných buňkách, ve kterých je zvýšena aktivita rozvětvovacího enzymu z tohoto vynálezu, je složení škrobu pozměněno tak, že má vyšší gelovou texturu a/nebo snížený obsah fosfátu a/nebo sníženou maximální viskozitu a/nebo sníženou teplotu plastifikace a/nebo zmenšenou velikost škrobových zrn a/nebo změněnou distribuci postranních řetězců ve srovnání se škrobem z odpovídajících rostlin divokého typu.

Výraz „vyšší textura gelu“ v tomto případě značí, že ve výhodném případě je vyšší o alespoň 10 %, s výhodou o alespoň 50 %, výhodněji o alespoň 100 %, alespoň o 200 % a velmi výhodně alespoň o 300 % ve srovnání s texturou gelu škrobu z rostlin divokého typu. Určování textury gelu škrobu je definováno níže.

Výraz „snížený obsah fosfátu“ v rámci tohoto vynálezu značí, že celkový obsah kovalentně vázaného fosfátu a/nebo obsah fosfátu v pozici C6 ve škrobu syntetizovaném v rostlinných buňkách podle vynálezu, se sníží o alespoň 20 %, s výhodou o alespoň 40 %, výhodněji o alespoň 60 % a velmi výhodně alespoň o 80 % v porovnání se škrobem z rostlinných buněk odpovídajících rostlin divokého typu.

Celkový obsah fosfátu nebo obsah fosfátu v pozici C6 může být stanovován níže popsanou metodou.

Výraz „snížená maximální viskozita“ v rámci tohoto vynálezu značí, že maximální viskozita je snížena o alespoň 10 %, s výhodou o alespoň 25 %, výhodněji o alespoň 50 % a velmi výhodně alespoň o 75 % v porovnání s maximální viskozitou škrobů z odpovídajících rostlin divokého typu.

Výraz „snížená teplota plastifikace“ v tomto případě značí, že teplota plastifikace se sníží o alespoň 0,5 °C, s výhodou o alespoň 1,0 °C, výhodněji o alespoň 2,0 °C a velmi výhodně alespoň o 3,0 °C v porovnání s teplotou plastifikace škrobů z odpovídajících rostlin divokého typu.

Maximální viskozita a teplota plastifikace mohou být změřeny s použitím analyzátoru Rapid Visco Analyser, níže popsaným způsobem.

Odborníkům jsou výrazy „maximální viskozita“ a „teplota plastifikace“ známy.

Výraz „zmenšená velikost škrobových zrn“ v tomto případě značí, že procentuální zastoupení částic o velikosti do 15 pm se zvýší o alespoň 10 %, s výhodou o alespoň 30%, výhodněji o alespoň 50%, 100% a velmi výhodně alespoň o 150% v porovnání s rostlinami divokého typu.

• · • «

Velikost škrobových zrn je stanovena s použitím přístroje na měření sedimentace typu „Lumosed“ (Retsch, GmbH, SRN), níže popsaným způsobem.

Výraz „změněná distribuce postranních řetězců“ v tomto případě značí, že výskyt postranních řetězců o DP (stupeň polymerizace) od 6 do 9 je zvýšen o alespoň 25 %, s výhodou o alespoň 50%, výhodněji o alespoň 100% a velmi výhodně alespoň o 200 % v porovnání s výskytem postranních řetězců o DP od 6 do 9 v amylopektinu z rostlin divokého typu.

V dalším provedení tohoto vynálezu pojem „změněná distribuce postranních řetězců” znamená, že výskyt řetězců o DP od 6 do 8, s výhodou pak od 6 do 7, je zvýšen o alespoň 25 %, s výhodou o alespoň 50 %, výhodněji o alespoň 100 % a velmi výhodně alespoň o 200 % v porovnání s výskytem postranních řetězců o odpovídajícím stupni polymerace v amylopektinu z rostlin divokého typu.

Výskyt postranních řetězců je stanoven měřením procentuálního zastoupení konkrétního bočního řetězce vzhledem k celkovému podílu všech bočních řetězců. Celkový podíl všech bočních řetězců je stanoven měřením celkové plochy pod vrcholy, které představují stupeň polymerace o DP od 6 do 30 v HPLC chromatogramu. Procentuální zastoupení konkrétního bočního řetězce vzhledem k celkovému podílu všech bočních řetězců je stanovováno měřením poměru ploch pod vrcholem, kterému odpovídá zmíněný boční řetězec na HPLC chromatogramu vůči celkové ploše. S výhodou je použit program AI-450, verze 3.31 od Dionexu, USA.

V dalším provedení se vynález týká škrobu, který obsahuje amylopektin s bočními řetězci o DP 5 v porovnání s amylopektinem škrobů z rostlin divokého typu.

Dále se tento vynález týká způsobu výroby transgenních rostlin, které syntetizují modifikovaný škrob vyznačující se tím, že:

(a) rostlinná buňka je geneticky modifikována zavedením molekuly nukleové kyseliny z tohoto vynálezu a/nebo vektoru z tohoto vynálezu, jejichž přítomnost nebo exprese vede ke vzrůstu aktivity proteinu majícího aktivitu rozvětvovacího enzymu;

(b) rostlina je regenerována z rostlinné buňky, vyrobené podle bodu (a) a (c) případné další rostliny jsou vyráběny z rostliny vyrobené podle bodu (b).

Ve výhodném provedení způsobu je škrob modifikován tak, že má vyšší texturu gelu a/nebo snížený obsah fosfátu a/nebo sníženou maximální viskozitu a/nebo sníženou teplotu plastifikace a/nebo zmenšenou velikost škrobových zrn a/nebo změněnou distribuci postranních řetězců v porovnání se škrobem odpovídajících rostlin divokého typu.

·· 4 ···· · · • · ··· 9 9 9 9 9 9

9 Λ 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

V tomto kontextu mají výrazy „vyšší textura gelu“, „snížený obsah fosfátu“, „snížená maximální viskozita“, „snížená teplota plastifikace“, „zmenšená velikost škrobových zrn“ a „změněná distribuce postranních řetězců“ výše definovaný význam.

Totéž, co bylo vysvětleno v jiné souvislosti s ohledem na rostliny z tohoto vynálezu, se týká také genetické modifikace zavedené v bodu (a). Regenerace rostlin podle bodu (b) může být dosaženo způsoby, které jsou odborníkům známé. Další rostliny podle bodu (b) způsobu vynálezu mohou být například vyrobeny vegetativním množením (tj. řízky, hlízami nebo přes kalusovou kulturu s následnou regenerací celé rostliny) nebo pohlavním množením. S výhodou je prováděno řízené pohlavní množení, tj. vybrané rostliny s konkrétními vlastnostmi jsou vzájemně kříženy a dále množeny.

Tento vynález se také týká rostlin, které lze získat způsobem z tohoto vynálezu.

Tento vynález se také týká propagačního materiálu rostlin z tohoto vynálezu, stejně tak jako transgenních rostlin vyrobených podle způsobu z tohoto vynálezu. Výraz „propagagační materiál“ zahrnuje, v tomto kontextu, ty části rostlin, které jsou vhodné k tvorbě potomstva vegetativní nebo generativní cestou, například pro vegetativní propagaci jsou vhodné řízky, kalusy, rhizomy, hlízy. Další propagační materiál zahrnuje např. plody, semena, sazenice, protoplasty, buněčné kultury atd. Výhodným propagačním materiálem jsou hlízy a semena.

Škrob, získatelný z transgenních rostlinných buněk a rostlin podle vynálezu stejně tak jako z propagačního materiálu je také předmětem tohoto vynálezu.

Transgenní rostlinné buňky a rostliny podle vynálezu syntetizují škrob, který je modifikovaný s ohledem na fyzikálně-chemické vlastnosti, zvláště pak textura gelu a/nebo plastifikační chování a/nebo velikost škrobových zrn a/nebo obsah fosfátu a/nebo distribuce postranních řetězců ve srovnání se škrobem, který syntetizují rostliny divokého typu. Děje se tak díky expresi molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu nebo vektoru podle vynálezu, kde jejich exprese vede ke zvýšení aktivity rozvětvovacího enzymu v porovnání s geneticky nemodifikovanými rostlinnými buňkami divokého typu.

Dále se tento vynález týká škrobů, jejichž charakteristikou je vyšší textura gelu a/nebo snížený obsah fosfátu a/nebo snížená maximální viskozita a/nebo snížená teplota plastifikace a/nebo zmenšená velikost škrobových zrn a/nebo změněná distribuce postranních řetězců.

Ve zvláště výhodném provedení se tento vynález vztahuje na škroby z brambor.

V této souvislosti jsou používány výrazy „vyšší textura gelu“, „snížená teplota plastifi21 kace“, „snížený obsah fosfátu“, „snížená maximální viskozita“, „zmenšená velikost škrobových zrn“ a „změněná distribuce postranních řetězců“ tak, jak byly definovány výše.

Dále se tento vynález týká způsobu výroby modifikovaného škrobu, který zahrnuje krok extrakce škrobu z rostliny (buňky) z tohoto vynálezu tak, jak bylo popsáno výše, a/nebo z částí takovýchto rostlin, v nichž se ukládá škrob. S výhodou takový způsob zahrnuje také krok zpracování pěstovaných rostlin a/nebo částí takovýchto rostlin, v nichž se ukládá škrob, před tím než je extrahován škrob. S ještě větší výhodou zahrnuje takový způsob také krok pěstování rostlin z tohoto vynálezu před jejich zpracováním. Odborníci znají způsoby extrakce škrobu z rostlin nebo částí rostlin ukládajících škrob. Způsoby extrakce škrobu z různých částí rostlin, které ukládají škrob, byly popsány například v „Starch: Chemistry and Technology“ (vydavatelé: Whistler, BeMiller a Paschall (1994), 2. vydání, Academie Press lne. London Ltd.; ISBN 0-12-746270-8; srovnej například kapitolu XII., str. 412-468: „Maize and Sorghum Starches: Production“; autor Watson; kapitolu XIII., str. 469-479; „Tapioca, Arrow Root and Ságo Starches: Production“; autoři Corbishley a Miller; kapitolu XIV, str. 479-490: „Potato Starch: Production and Applications“; autor Mitch; kapitola XV, str. 491 až 506: „Wheat Starch: Production, Modification and Applications“; autoři Knight a Oson; a kapitolu XVI, str. 507-528: „Rice Starch: Production and Applications“; autoři Rohmer a Klem; Maize Starch: Eckhoff a kol., Cereal Chem. 73 (1996), 54-57, (extrakce škrobu z kukuřice v průmyslovém měřítku obvykle probíhá způsobem tzv. mokrého mletí)). Zařízení, která jsou obvykle využívána ve způsobech extrakce škrobu z rostlinného materiálu zahrnují odstředivky, dekantéry, hydrocyklony, rozprašovací sušárny a vířivé sušárny.

Škrob, který lze získat výše popsaným způsobem, je také předmětem vynálezu.

Škroby podle vynálezu mohou být modifikovány způsoby, které jsou odborníkům známy. Jsou vhodné pro různé užití v potravinářském nebo jiném průmyslu, a to v modifikované nebo původní formě.

Možnosti užití mohou být principielně rozděleny na dvě velké oblasti. Jedna zahrnuje produkty hydrolýzy škrobu, hlavně glukosové a glukanové stavební jednotky získané enzymatickými nebo chemickými způsoby. Slouží jako vstupní materiál dalších chemických modifikací a procesů, jako je kvašení. Za účelem snížení výdajů je významná jednoduchost a levné provedení způsobu hydrolýzy. V současné době se v podstatě používá enzymatický způsob s použitím amyloglukosidasy. Náklady by bylo možné snížit omezením použití enzymů. Toho by mohlo být dosaženo změnou struktury škrobu, například zvětšením povrchu škrobových zrn, jednodušší štěpitelností • · · · · · • ·

v důsledku nízkého stupně větvení nebo omezením stérických zábran přístupnosti pro použitý enzym.

Další oblast, ve které je využíván tzv. nativní škrob díky své polymerní struktuře, může být dále rozdělena na dvě další oblasti užití:

1. Použití v potravinách

Škrob je klasickou složkou různých potravin, kde v podstatě slouží k vazbě vodných složek a/nebo zvyšuje viskozitu nebo zvyšuje tvorbu gelu. Mezi důležité vlastnosti patří tokové a sorpční vlastnosti, bobtnání a teplota plastifikace, viskozita a houstnutí, rozpustnost škrobu, průhlednost a pastovitá struktura, odolnost vůči teplotě, střihu a kyselinám, tendence retrogradace, schopnost tvorby filmu, odolnost ke zmrazování/rozpouštění, štěpitelnost, podobně jako schopnost tvorby komplexů například s anorganickými či organickými ionty.

2. Jiné použití

Další velkou oblastí užití je použití škrobu jako pomocné látky v různých výrobních procesech nebo jako aditiva v technických výrobcích. Hlavní oblastí pro aplikaci škrobu jako adjuvancia je především průmysl papírenský a lepenkový. V této oblasti je škrob využíván hlavně k retenci (udržení pevných částic pohromadě), jako výplň a jemné částice, jako ztužovací látka a k vysoušení. Dále jsou využívány výhodné vlastnosti škrobu, jako jsou tuhost, tvrdost, zvuk, pohmat, lesk, hladkost, pevnost v dotržení i povrch.

2.1 Průmysl papírenský a zpracování kartonů

V průběhu výrobního procesu papíru mohou být rozlišeny čtyři oblasti užití, jmenovitě povrch, potah, hmotnost a nástřik.

Požadavky na škrob s ohledem na povrchovou úpravu nezbytně zahrnují vysoký stupeň jasu, odpovídající viskozitu, vysokou stabilitu viskozity, dobrou schopnost filmotvornost a nízkou tvorbu prachu. Při použití k potahování hrají důležitou roli obsah pevných látek, odpovídající viskozita, vysoká schopnost vázat a vysoká afinita k pigmentům. Pro hmotnostní přídavek jsou důležité rychlá, homogenní bezeztrátová disperze, vysoká mechanická stabilita a úplná schopnost udržení v papírovině. Pro škrob použitý k nástřiku je důležité, aby obsahoval odpovídající obsah pevných látek, aby měl vysokou viskozitu a vysokou schopnost vázat.

«φ ' · · · · • · · · · • · · · · · • · · · · • * ♦ ·

2.2 Průmysl adheziv

Jedno z hlavních použití je například použití v průmyslu adheziv. Použití lze rozdělit do čtyř oblastí: použití v čistém škrobovém lepidle, použití ve škrobových lepidlech s přídavkem speciálních chemikálií, použití škrobu jako přísady k syntetickým pryskyřicím a polymerním disperzím a použití škrobu jako plniva v syntetických lepidlech. 90 % veškerých adheziv na bázi škrobu se používá při výrobě vlnité lepenky, papírových pytlů a tašek, kompozitních materiálů pro papír a hliník, krabic a lepidel na obálky, známky atd.

2.3Textilie a produkty k ochraně textilu

Dalším možným použitím je pomocná látka a aditivum při výrobě textilií a výrobků sloužících k jejich ochraně. V textilním průmyslu je možné rozlišit následující čtyři oblasti užití: použití škrobu jako klížidla, tj. jako pomocná látka k uhlazení a zesílení odřepíkování k ochraně před tažnými silami při tkaní, pro zvýšení odolnosti vůči opotřebení během tkaní, jako činidla ke zkvalitnění textilií, hlavně po použití takových předběžných úpravách ničících kvalitu jako je bělení, barvení atd., jako zahušťovadla při výrobě barvících past k zabránění difúze barviva a jako přísady do kroutících činidel šicích přízí.

2.4Stavební průmysl

Dále může být škrob použit jako přísada stavebních materiálů. Příkladem je výroba sádrokartonových desek. V těch se škrob přimíchaný v řídké sádře rozpouští ve vodě a difunduje na povrch sádrových desek a tak slepuje sádrovou a kartónovou desku. Dalšími oblastmi užití je vmíchávání škrobu do sádry a minerálních vláken. V dovážené betonové směsi může být škrob použit ke zpomalení tuhnutí.

2.5 Stabilizace půdy

Dále může být škrob s výhodou používán k výrobě prostředků sloužících při stabilizaci půdy, které jsou používány k dočasné ochraně půdních částic před vodou při umělých přesunech půdy. Podle znalostí dosavadního stavu techniky lze usuzovat, že kombinované výrobky, které obsahují škrob a polymerní emulze, mají stejné účinky na snižování eroze a enkrustace jako výrobky v současné době používané, avšak jsou výrazně levnější.

2.6Použití v ochranných prostředcích a hnojivech pro rostliny

Další oblast využití škrobu tkví v použití škrobu v ochranných prostředcích pro rostliny, což změní specifické vlastnosti těchto přípravků. Škrob je například využíván ke zlepšení smáčecích vlastností ochranných prostředků a hnojiv pro rostliny, k dávkovanému uvolňování aktivních složek, ke konverzi kapalných, těkavých a/nebo páchnoucích aktivních složek na mikrokrystalické, stabilní, deformovatelné látky, ke smíchávání nemísitelných složek a k prodloužení trvání účinku v důsledku sníženého rozkladu.

2.7 Léky, medicína a kosmetický průmysl

Škrob může být použit také v oblastech léků, medicíny a kosmetického průmyslu. Ve farmaceutickém průmyslu může být škrob použit jako pojidlo pro tablety nebo ke zředění pojidla v kapslích. Dále je škrob vhodnou látkou způsobující rozklad tablety, protože po polknutí absorbuje roztok a po krátkém čase se nasaje natolik, že je uvolněna aktivní složka. Z kvalitativních důvodů jsou další oblastí užití lékařské lubrikační a hojivé zásypy. V oblasti kosmetiky může být škrob použit například jako nosič prachových přísad, jako jsou vůně a kyselina salycilová. Relativně širokou oblastí použití škrobu jsou zubní pasty.

2.8Škrob jako přísada do uhlí a briket

Škrob může být také použit jako přísada do uhlí a briket. Přidáním škrobu je uhlí možné kvantitativně slepovat a/nebo vytvářet z něj brikety o vysoké kvalitě. Tím se zabrání předčasnému rozpadu briket. Grilovací uhlí obsahuje mezi 4 až 6 % přidaného škrobu, kalorované uhlí mezi 0,1 až 0,5 %. Škrob je také vhodnou pojící přísadou do uhlí a briket proto, že může znatelně snížit emise toxických látek.

2.9Zpracování rudného a uhelného kalu

Dále může být škrob použit jako pomocné flokulační činidlo při zpracování rudných a uhelných kalů.

2.10 Přísada do slévárenských materiálů

Další oblastí použití je použití škrobu jako přísady při zpracování materiálů ve slévárenství. Při různých odlévacích procesech je zapotřebí jader, která jsou zhotovena z ♦ ♦ ···· písků smíchaných s pojidly. V současné době je nejpoužívanějším pojidlem bentonit smíchaný s modifikovanými škroby, většinou bobtnajícími škroby.

Účelem přidávání škrobu je zvýšení odporu proti proudění a také zvýšení pojící síly. Bobtnající škroby mohou dále splňovat další požadavky kladené na výrobní proces, jako jsou např. dispergovatelnost ve studené vodě, schopnost opětné hydratace, dobrá mísitelnost s pískem a vysoká schopnost vázat vodu.

2.11 Gumárenský průmysl

V gumárenském průmyslu může být škrob používán pro zlepšení technické a optické kvality. Důvodem k tomu jsou zvýšený povrchový lesk, pohmat a vzhled. Za tímto účelem je škrob dispergován na lepkavé pogumované povrchy gumových látek před chladnou vulkanizací. Může být také použit ke zlepšení potisknutelnosti gumy.

2.12 Výroba náhražek kůže

Další oblastí, ve které je využíván modifikovaný škrob, je výroba náhražek kůže.

2.13 Škrob v syntetických polymerech

Na trhu s plasty se nachází následující oblasti užití: začlenění výrobků odvozených od škrobu do zpracovacího procesu (škrob je pouhým plnivem, neexistuje přímá vazba mezi syntetickým polymerem a škrobem), nebo se případně jedná o zapojení výrobků odvozených od škrobu do výroby polymerů (škrob a polymer tvoří stabilní vazbu).

Použití škrobu jako pouhého plniva nemůže soutěžit s jinými látkami, jako je například talek. Situace se změní, když se specifické vlastnosti škrobu ukáží efektivní a spektrum vlastností výsledného výrobku se tedy jasně změní. Jedním příkladem je použití škrobových produktů při zpracování termoplastických materiálů, např. polyethylenu. Škrob je smíchán prostřednictvím koexprese v poměru 1:1 se syntetickým polymerem, čímž se vytvoří ‘předsměsi’, ze které se vyrábí různé produkty běžnými způsoby s použitím granulovaného polyethylenu. Integrace škrobu do polyethylenových filmů může způsobit zlepšenou permeabilitu látky do dutých těles, zlepšenou propustnost pro vodní páru, zlepšené antistatické chování, zlepšené protiblokovací chování a také zlepšenou potiskovatelnost vodnými barvivý.

• 9 ♦ ·· · • ·

Další možností je použití škrobu v polyuretanových pěnách. Díky přizpůsobení derivátů škrobu i díky optimalizaci způsobů zpracování je možné specificky kontrolovat reakci mezi syntetickými polymery a hydroxylovými skupinami škrobu. Výsledkem jsou polyuretanové filmy, které mají díky použití škrobu následující spektrum vlastností: snížený koeficient teplotní roztažnosti, snížené smršťování, zlepšené vlastnosti při působení tlaku/napětí, zvýšenou propustnost pro vodní páry beze změny odolnosti vůči příjmu vody, sníženou hořlavost a hustotu trhlin, nesnížený podíl spalitelných částí, žádné halogenidy a snížené stárnutí.

Vývoj filmů není však jedinou možností. Také pevné plastové výrobky, např. džbány, talíře a mísy, mohou být vyráběny s více než 50% obsahem škrobu. Dále mají směsi škrobu a polymeru tu výhodu, že jsou mnohem jednodušeji biodegradovatelné.

Velmi důležitými se staly škrobové roubované polymery pro jejich extrémní schopnost vázat vodu. Jsou to výrobky, které mají škrobovou kostru a postranní síť ze syntetického monomeru naroubovaného na principu radikálového řetězového mechanismu. V současné době dostupné škrobové roubované polymery jsou charakteristické tím, že mají zlepšenou vazebné a zadržovací schopnost, a to až 1000 g vody na 1 g škrobu o vysoké viskozitě. Tyto „superabsopční“ látky jsou využívány hlavně v oblasti hygieny, např. ve výrobcích jako jsou pleny nebo prostěradla, a také v zemědělství, např. v granulích semen.

Rozhodující pro použití nového škrobu modifikovaného technikami rekombinantní DNA jsou na jedné straně struktura, obsah vody, obsah proteinů, obsah lipidů, obsah vlákniny, obsah popelu/fosforečnanu, poměr amylosy a amylopektinu, distribuce relativní molekulové hmotnosti, stupeň větvení, velikost zrn a jejich tvar, i krystalizace, a na druhé straně vlastnosti, které mají za následek: tokové a sorpční vlastnosti, teplota plastifikace, viskozita, zahušťování, rozpustnost, pastovitá struktura, průhlednost, odolnost vůči teplu, smyku a kyselinám, tendence retrogradace, schopnost tvorby gelu, odolnost ke zmrazování a rozmrazování, schopnost tvorby komplexů, vázání jódu, tvorba filmu, adhezní síla, enzymová stabilita, odbouratelnost a reaktivita.

Výroba modifikovaného škrobu genetickými manipulacemi transgenních rostlin může ovlivnit vlastnosti škrobu získaného z těchto rostlin do té míry, že nebude třeba dalších modifikací chemickými nebo fyzikálními způsoby. Na druhé straně však mohou být škroby získané způsobem technik rekombinantní DNA podrobeny další chemické modifikaci, jejímž výsledkem bude další zlepšení kvality v určité, výše zmíněné oblasti • · *♦· · použití. Tyto chemické modifikace jsou principielně známy. Zvláště jsou to metody modifikace pomocí:

- tepelného zpracování

- působení kyselin

- tvorby éterů škrobu škrobalkyléter, O-alyléter, hydroxyalkyléter, O-karboxymetyléter, étery škrobu obsahující dusík, étery škrobu obsahující fosfor a étery škrobu obsahující síru

- tvorby rozvětvených škrobů

- tvorby škrobových roubovaných polymerů

- oxidace a

- esterifikace vedoucí k tvorbě fosforečnanového, dusičnanového, síranového, xantogenátového, octanového a citronanového škrobu. K esterifikacím lze použít i jiné organické kyseliny.

V dalším provedení se tento vynález týká částí rostlin podle vynálezu, které mohou být sklízeny, například plody, zásobní kořeny, kořeny, květy, poupata, výhonky nebo stonky. S výhodou jsou to semena nebo hlízy, které obsahují buňky z tohoto vynálezu a mohou být sklízeny.

Dále se tento vynález týká regulačního úseku, který u bakteriálních buněk přirozeně kontroluje transkripci výše popsané molekuly nukleové kyseliny z tohoto vynálezu, které kódují rozvětvovací enzym z bakterie rodu Neisseria.

V rámci tohoto vynálezu se výraz „regulační úsek“ vztahuje na úsek, který ovlivňuje specifitu a/nebo rozsah exprese sekvence genu, např. tak, že se exprese spouští určitými vnějšími signály nebo v určitém čase. Tyto regulační úseky jsou umístěny většinou v úseku, který se nazývá promotor. V rámci tohoto vynálezu zahrnuje výraz „promotor“ sekvence nukleotidů, které jsou nezbytné pro započetí transkripce, tj. nezbytné pro vazbu RNA-polymerasy a může také obsahovat TATA box(y).

Ve výhodném provedení obsahuje regulační úsek z tohoto vynálezu sekvenci nukleotidů vybranou ze skupiny, která zahrnuje:

(a) sekvence nukleotidů obsahující nukleotidy 1 až 169 sekvence nukleotidů, zobrazené na SEKV. ID. Č. 1;

• 9 · 9 · ·· 99 • · 9 9 9 · * · ♦ ·9 ♦ 9 9 999999 «9 99 99 ··· · (b) sekvenci nukleotidů regulačního úseku obsaženého v insertu plasmidu DSM 12425 nebo její části a (c) sekvence nukleotidů, které hybridizují se sekvencemi z bodu (a) nebo (b) za stringentních podmínek.

Nukleotidy 1 až 169 sekvence zobrazené jako SEKV. ID. Č. 1 tvoří část regulačního úseku genu rozvětvovacího enzymu z Neissería denitrificans. Předpokládané sekvence promotoru leží v pozicích 36 až 44, 51 až 55 a 157 až 162, přičemž sekvence „GGGAGA“ je možnou sekvencí Shine-Delgarnovou.

Tento vynález se také týká regulačních úseků, které mají tak vysokou homologii k výše zmíněným regulačním úsekům, že hybridizují k alespoň jednomu ze zmíněných úseků, s výhodou za stringentních podmínek. Zvláště výhodné jsou regulační úseky, které mají sekvenční identitu alespoň 80 %, s výhodou alespoň 90 % a velmi výhodně alespoň 95 % se kterýmkoli z výše zmíněných regulačních úseků, zvláště pak s tím, který je zobrazen jako SEKV. ID. ČÍS. 1.

Obsahují také regulační úseky, které jsou modifikované vzhledem k výše popsaným regulačním úsekům, například díky jedné nebo více delecím, insercím, substitutcím, adicím a/nebo rekombinacím a/nebo modifikacím.

Odborníci znají způsoby zavedení těchto modifikací do regulačních úseků. Odborníci dále vědí, že regulační úseky z toho vynálezu mohou být spojovány s dalšími elementy, které ovlivňují transkripci u bakteriálních buněk, například se zesilovači.

Tento vynález se také týká molekul rekombinantní DNA, která obsahuje regulační úsek z tohoto vynálezu.

U takové molekuly rekombinantní DNA je s výhodou regulační úsek spojen s hetrologní sekvencí DNA. V této souvislosti znamená výraz „heterologní“, že zmíněná sekvence není za přirozeně spojena s regulačním úsekem. Dále může molekula rekombinantní DNA z tohoto vynálezu obsahovat další regulační elementy, které jsou důležité s ohledem na transkripci a/nebo translaci v bakteriálních buňkách, například transkripční nebo translační zesilovače.

Dále se tento vynález týká hostitelských buněk, které jsou transformovány s regulačním úsekem, molekulou rekombinantní DNA nebo vektorem z tohoto vynálezu.

Dále se tento vynález týká vektorů, které obsahují regulační úsek z tohoto vynálezu nebo molekulu rekombinantní DNA z tohoto vynálezu. Zmíněnými vektory mo·· · φφ · ·· φφ ··· • * * φ φ φ φφ ♦ • · φ φ · · φ· • · · · ♦ ΦΦΦ ·♦ • φ φ φ φ φ ·φ

Φ· ΦΦ ·9 ♦···· hou být například plasmidy, kosmidy, bakteriofágy, viry atd., které jsou obvykle používány ve způsobech molekulární genetiky.

Dále se vynález týká způsobu přípravy a-1,6-rozvětveného a-1,4-glukanu in vitro, s použitím sacharosy jako substrátu a enzymové směsi amylosacharasy a rozvětvovacího enzymu. V rámci tohoto vynálezu znamená výraz „způsob in vitro“ konverzi, tj. reakci probíhající mimo živý organismus. Zvláště pak výraz „in vitro“ znamená, že způsob probíhá v reakční nádobě. Velmi výhodně výraz „in vitro“ znamená, že reakce probíhá bez přítomnosti živých buňek.

Výhodou způsobu z tohoto vynálezu je možnost kontroly stupně větvení a možnosti měnit pomocí této kontroly vlastnosti syntetizovaných glukanů vzhledem k plánovanému použití glukanů. Vzhledem k použití jako enkapsulačního materiálu ve farmacii je zde tudíž možnost optimalizace rychlosti uvolňování léčivé látky záměrným nastavením stupně větvení.

V rámci tohoto vynálezu je amylosacharasa (sacharosa: 1,4-a-D-glukan-4-a-glukosyltransferasa, E.C. 2.4.1.4) enzymem, který katalyzuje konverzi sacharosy na ve vodě nerozpustný a-1,4-glukan a fruktosu. Pro tento enzym je navrženo následující reakční schéma:

Sacharosa + (a-1,4-D-glukan)_n -> D-fruktosa + (a-1,4-D-glukan)_n+i

Jedná se o transglykosylační reakci. Produkty reakce jsou ve vodě nerozpustné a-1,4-glukany a fruktosa. Transglykosylace může proběhnout jak v nepřítomnosti, tak v přítomnosti molekul akceptoru. Takovými molekulami akceptoru mohou být například polysacharidy jako maltooligosacharidy, dextrin nebo glykogen. Je-li molekulou akceptoru lineární, oligomerní a-1,4-glukan, produktem transgykosylační reakce, s použitím amylosacharasy, je polymerní lineární a-1,4-glukan. Je-li je transglykosylační reakce s použitím amylosacharasy prováděna bez jakékoli molekuly akceptoru, získá se glukan s molekulou fruktosy na konci. V rámci tohoto vynálezu jsou veškeré produkty reakce amylosacharasy, ať již v přítomnosti nebo nepřítomnosti molekuly akceptoru, nazývány a-1,4-glukany.

Je navržen následující reakční mechanismus pro transglykosylaci s pomocí amylosacharasy v nepřítomnosti molekuly akceptoru:

G-F + n(G-F) -> Gn-G-F + nF, kde G-F je sacharosa, G je glukosa, F je fruktosa a G_n-G-F je a-1,4-glukan.

• Φ Φ·Φ · <· · ·· ·· φ · · · · · · φ φ · · · ·· · · φ · · · · · ♦ · · · · • · « · ♦ φ · · ·· • Φ ·· · · ·· · ·

Je navržen následující reakční mechanismus pro transglykosylaci s pomocí amylosacharasy v přítomnosti molekuly akceptoru:

Gn⁺ mG-F —> G_n+m⁺ mF,

G_n je molekula akceptoru polysacharidu, G_n-_m je polysacharid obsahující akceptor plus k němu nasyntetizovaný a-1,4-glukanový řetězec, G-F je sacharosa, F je fruktosa, G je glukosa.

Ke transglykosylační reakci pomocí amylosacharasy není třeba žádných kofaktorů. Principielně jsou pro provádění způsobu z tohoto vynálezu vhodné všechny amylosacharasy, které katalyzují syntézu lineárních a-1,4-glukanů, počínaje od sacharosy.

Doposud jsou známy amylosacharasy z několika bakteriálních druhů, zvláště pak z rodu Neissería (MacKenzie a kol., Can. J. Microbiol. 24 (1978), 357 - 362).

S výhodou je tedy používána amylosacharasa prokaryontního původu. Jsou známy například amylosacharasy z Neissería perflava (Okada a Hehre, J. Biol. Chem. 249 (1974), 126 - 135; MacKenzie a kol., Can. J. Microbiol. 23 (1977), 1303 - 1307)) nebo z Neissería canis, Neissería cinerea, Neissería denitrificans, Neissería sicca a Neissería subflava (MacKenzie a kol., Can. J. Microbiol. 24 (1978), 357 - 362). Dále je popsána Neissería polysaccharea ve WO 95/31553. S výhodou je použita amylosacharasa, která je přirozeně sekretována prokaryonty.

Ve výhodné podobě tohoto vynálezu je použita amylosacharasa z Neissería polysaccharea.

Enzym exprimovaný v Neissería polysaccharea je extrémně stabilní a váže se velmi pevně na produkty polymerace a je kompetitivně inhibován reakčním produktem fruktosou (MacKenzie a kol., Can. J. Microbiol. 23 (1977), 1303 - 1307). Co se týká rodu Neissería je u Neisserie polysaccharea amylosacharasa sekretována (Riou a kol., Can. J. Microbiol. 32 (1986), 909 - 911), zatímco u ostatních druhů Neissería zůstává uvnitř buňky. Zvláště je upřednostňováno použití amylosacharasy, jejíž sekvence je znázorněna jako SEKV. ID. Č. 5.

V další výhodné podobě tento vynález užívá čištěné amylosacharasy. V této souvislosti je za čištěný považován enzym, který není znečištěn buněčnými komponentami z buněk, ve kterých je protein syntetizován. S výhodou se termín „čištěný enzym“ vztahuje na amylosacharasu, jejíž čistota dosahuje více než 70 %, s výhodou alespoň 85 % a s ještě větší výhodou 90 %.

• · ·♦· ·

J · ·.··>····· *

·..··..· *./

Použití čištěného enzymu k výrobě a-1,4-glukanů přináší různé výhody. Na rozdíl od způsobů, ve kterých se používá extraktů částečně čištěného enzymu, neobsahuje reakční prostředí ve způsobu z tohoto vynálezu žádné zbytky produkčních kmenů (mikroorganismů), které byly použity k čištění proteinu nebo k jeho přípravě pomocí genového inženýrství.

Co víc, použití čištěného proteinu přináší výhody ve farmaceutickém a potravinářském průmyslu. Je-li definováno reakční prostředí a byly-li odstraněny všechny nepotřebné složky, jsou také složky produktu lépe definovány. To vede k méně náročným postupům obchodní autorizace těchto produktů, které byly vyrobeny s použitím biotechnologie v potravinářském nebo farmaceutickém průmyslu, zvláště proto, že u zmíněných produktů se předpokládá, že neobsahují žádné stopy transgenních mikroorganismů.

V rámci tohoto vynálezu je rozvětvovacím enzymem (a-1,4-glukan:a-1,4-glukan-6-glykosyltransferasa, E.C. 2.4.1.18) protein, který katalyzuje transglykosylační reakci, ve které jsou hydrolyzovány a-1,4-vazby a-1,4-glykanového donoru a uvolněné a-1,4-glykanové řetězce jsou přemístěny na akceptorový řetězec a-1,4-glykanu za vzniku a-1,6-vazeb.

K provedení způsobu vynálezu jsou vhodné v principu všechny rozvětvovací enzymy jakéhokoli původu (bakteriálního, houbového, rostlinného, živočišného) (srovnej například Baba a kol., Biochem. Biophys. Res. Commun. 181 (1991), 87 - 94; Kossmann a kol., Mol. Gen. Genet. 203 (1991), 237 - 244; Nakamura a Yamanouchi, Plant Physiol. 99 (1992), 1265 - 1266; Baecker a kol., J. Biol. Chem. 261 (1986), 8738 8743; Kiel a kol., Gene (1989), 9-17 atd.).

Odborník může isolovat odpovídající geny standardními způsoby molekulární biologie, jak byly popsány mimo jiné v Sambrook a kol. (Sambrook a kol., Molecular Cloning, A Laboratotry Manual, druhé vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA (1989)).

Ve výhodném provedení vynálezu je rozvětvovacím enzymem rozvětvovací enzym z prokaryontů, s výhodou z bakterie rodu Neisseria, výhodněji z Neisseria denitrificans a velmi výhodně z rozvětvovacího enzymu podle vynálezu, jak je popsán níže. Obzvlášť výhodný je rozvětvovací enzym, který má sekvenci aminokyselin popsanou SEKV. ID. Č. 1.

V dalším výhodném provedení vynálezu je rozvětvovací enzym čištěný. V této souvislosti je čištěný rozvětvovací enzym enzymem, který neobsahuje buněčné složky

ΦΦ φφφφ φφφφ φ φ • · φ φ ·· φ φ • φ ··· φ · ΦΦΦ · φφφφ φφφφ φφ φφφφ ·· ·· ·· z buněk, ve kterých byl protein syntetizován. S výhodou se termín „čištěný rozvětvovací enzym“ vztahuje na amylosacharasu, jejíž čistota dosahuje více než 70%, s výhodou alespoň 85% a s ještě větší výhodou 90%.

Navíc v rámci způsobu podle vynálezu jsou s výhodou používány proteiny připravené rekombinantně. V rámci tohoto vynálezu jsou zmíněné proteiny vyrobené zavedením sekvence DNA, která kóduje zmíněný protein, do hostitelské buňky a její následnou expresí. Protein může být následně získán zpět z hostitelské buňky a/nebo kultivačního média. S výhodou je hostitelskou buňkou bakterie nebo protista (např. houby, zvláště pak kvasinky, řasy), jak je definováno například v Schlegel „Algemeine Mikrobiologie“ (Georg Thieme Verlag, 1985, 1 - 2). Zvláště je výhodné, aby byly proteiny hostitelskou buňkou sekretovány ven. Takovéto hostitelské buňky pro tvorbu rekombinantního proteinu mohou být vytvořeny způsoby, které jsou odborníkům známé.

Přehled různých expresních systémů je v Mehods in Enzymology 153 (1987), 385 - 516; Bitter a kol., Mehods in Enzymology 153 (1987), 516 - 544; Sawers a kol., Applied Microbiology and Biotechnology 46 (1996), 1 - 9; Billmann-Jacobe, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 500 - 504; Hockney, Trends in Biotechnology 12 (1994), 456 - 463 a Griffiths a kol., Methods in Molecular Biology 75 (1997), 427 - 440. Expresní vektory byly ze široka popsány v literatuře. Kromě selekčního značkovacího genu a počátku replikace, který zajišťuje replikaci ve vybraném hostitelském organismu, obvykle obsahují bakteriální nebo virový promotor a většinou terminační signál transkripce. Mezi promotorem a terminačním signálem je alespoň jedno restrikční místo nebo polylinker, který umožňuje vložení kódující sekvence DNA. Sekvence DNA, která přirozeně kontroluje transkripci odpovídajícího genu, může být použita jako sekvence promotoru, je-li aktivní ve vybraném hostitelském organismu. Tato sekvence však může být také zaměněna za jiné sekvence promotoru. Mohou být použity jak promotory vykonávající konstitutivní expresi genu, tak indukovatelné promotory, které umožňují přímou regulaci exprese následujícího genu. Sekvence bakteriálních a virových promotorů s těmito vlastnostmi byly široce popsány v literatuře. Regulační sekvence sloužící k expresi v mikroorganismech (např. E.coli, S.cerevisiae) byly dostatečně popsány v literatuře. Mezi promotory, které umožňují obzvlášť silnou expresi za nimi zařazených genů, např. T7 promotor (Studier a kol., Methods in Enzymology 185 (1990), 60 - 89, lacUV5, trp, trp-lacUV5 (DeBoer a kol. v: Rodriguez a Chamberlain (vydavatelé) Promotors, Structure and Function; Praeger, New York (1982), 462 - 481; DeBoer a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1983), 21 - 25, γρ1, rac (Boros a kol., Gene 42 (1986), 97 ·· ···· • · · · · · • · ·· · · • · · · · · · • · · · · · ·· ·φ ··

100). Za normálních okolností dosahuje množství proteinu svého maxima přibližně mezi polovinou a koncem logaritmické fáze růstového cyklu mikroorganismů. Proto jsou k syntéze proteinů s výhodou používány indukovatelné promotory. Tyto indukovatelné promotory vedou často k vyšším výtěžkům proteinů než promotory konstitutivní. Vzhledem ke konstantní transkripci a translaci klonovaného genu způsobuje použití silných konstitutivních promotorů často ztrátu energie potřebné k jiným nezbytným buněčným funkcím a tím je zpomalen růst buněk (Bernard R. Glick/Jack J. Pasternak, Molekulare Biotechnologie (1995), Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg Berlin Oxford, str. 342). Je tedy většinou použit dvoustupňový způsob k dosažení optimálního množství proteinů. Nejprve jsou hostitelské buňky kultivovány za optimálních podmínek, než je dosaženo relativně vysoké hustoty buněk. Ve druhém kroku je indukována transkripce v závislosti na druhu použitého promotoru. V této souvislosti je zvláště vhodný promotor tac, který je indukovatelný laktosou nebo IPTG (= isopropyl-P-D-thiogalaktopyranosid) (DeBoer a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 80 (1983), 21 - 25). Terminační signály pro transkripci byly také popsány v literatuře.

Transformace hostitelské buňky s DNA, která kóduje odpovídající protein, může být normálně provedena standardními způsoby, jak je popsáno například v Sambrook a kol. (Molecular Cloning: A Laboratory Course Manual, druhé vydání (1989), Cold Spring Harbor Press, New York). Hostitelská buňka je kultivována v kultivačních médiích, která odpovídají potřebám příslušných hostitelských buněk. Zvláště je brán ohled na hodnotu pH, teplotu, koncentraci solí, aeraci, antibiotika, vitamíny a stopové prvky.

Enzym vytvořený hostitelskou buňkou může být čištěn standardními čisticími technikami, jako jsou precipitace, iontoměničová chromatografie, afinitní chromatografie, gelová filtrace, HPLC chromatografie s převrácenými fázemi atd. Modifikací DNA exprimované v hostitelských buňkách lze vytvořit v hostitelské buňce polypeptid, který se snáze izoluje z kultivačního média díky určitým vlastnostem. Je tedy možné exprimovat protein jako fúzní protein spolu s jinou polypeptidovou sekvencí, jejíž specifické vazebné vlastnosti umožňují izolaci fúzního proteinu pomocí afinitní chromatografie (například Hopp a kol., Bio/Technology 6 (1988), 1204 - 1210; Sassenfeld, Trends Biotechnol. 8 (1990), 88-93).

Ve výhodném provedení způsobu podle vynálezu jsou použity enzymy, které byly vyrobeny rekombinantně a které byly sekretovány hostitelskou buňkou do kultivačního média, takže není zapotřebí rozbíjet buňky nebo dále čistit protein, protože sekre·· ····

tovaný protein může být získán ze supernatantu. Způsoby známé v procesním inženýrství, např. dialýza, reverzní osmóza, chromatografické metody atd., mohou být použity k odstranění zbytků složek kultivačního média. Totéž platí i o zpětném koncentrování proteinů vylučovaných do kultivačního média. Za normálních okolností je vylučování proteinů mikroorganismy zprostředkováno signálními peptidy s koncovým dusíkem (signální sekvence, vedoucí peptid). Proteiny, které mají tuto sekvenci, mohou prostupovat buněčnou membránou mikroorganismu. Vylučování proteinů může být dosaženo spojením sekvence DNA, která kóduje signální peptid, s odpovídajícím úsekem, který kóduje enzym.

Výhodný je signální peptid, který se někdy vyskytuje přirozeně, např. signální peptid amylosacharasy z Neisseria polysaccharea.

Zvláště výhodné jsou signální peptidy α-CGTasy zKlebsiella oxytoca M5A1 (Fiedler a kol., J. Mol. Biol. 256 (1996), 279 - 291) nebo signální peptid, jak je kódován nukleotidy 11529 - 11618 sekvence přístupné v genové bance (GenBank) pod přístupovým číslem X86014.

Alternativně mohou být enzymy, použité ve způsobu podle vynálezu, vyráběny s použitím in vitro systému transkripce a translace, což vede k expresi proteinů bez použití mikroorganismů.

V dalším výhodném provedení jsou amylosacharosa a/nebo rozvětvovací enzym imobilizovány na nosném materiálu.

Imobilizace enzymů má tu výhodu, že mohou být enzymy jednoduchým způsobem získány z reakční směsi zpět jako katalyzátory syntetické reakce a mohou být použity několikrát. Jelikož čištění enzymů obvykle vyžaduje hodně času a peněz, mohou být imobilizací a recyklací znatelně ušetřeny náklady. Další výhodou je stupeň čistoty reakčních produktů, které neobsahují žádné zbytkové proteiny.

K dispozici je dostatek mnoho nosných materiálů k imobilizací proteinů, přičemž vazba s nosným materiálem může být kovalentní nebo nekovalentní (přehled viz Methods in Enzymology 135, 136, 137). Jako nosné materiály jsou široce využívány například agarosa, alginan, celulosa, polyakrylamid, oxid křemičitý nebo nylon.

V dalším výhodném provedení způsobu je použit hrubý (částečně čištěný) enzymový extrakt amylosacharasy a/nebo rozvětvovacího enzymu. Hrubý extrakt v této souvislosti znamená přípravek amylosacharasy a/nebo rozvětvovacího enzymu, který má snížený stupeň čistoty ve srovnání s čištěným enzymem (srovnej příklady 5 a 6).

Ve výhodném provedení je ve způsobu podle vynálezu stupeň větvení a-1,6-větvených a-1,4-glukanů modifikován změnou poměru proteinové aktivity rozvětvovacího enzymu a amylosacharasy. V této souvislosti je poměrem proteinové aktivity myšlen poměr aktivit (u) proteinů amylosacharasy a rozvětvovacího enzymu. Proteinové aktivity mohou být stanoveny podle popisu v příkladech 7 a 8. Při provádění způsobu podle vynálezu (srovnej příklad 9) se může poměr proteinových aktivit (jednotky amylosacharasy/jednotky rozvětvovacího enzymu) pohybovat od 1/4000 do 2000/1.

Ve výhodném provedení se poměr aktivit pohybuje od 1/1500 do 1500/1.

Ve dalším výhodném provedení se poměr aktivit pohybuje od 1/800 do 1300/1.

Ve zvláště výhodném provedení se poměr aktivit pohybuje od 1/400 do 1200/1.

Stupeň větvení a-1,6-větvených a-1,4-glukanů je možné modifikovat na základě změn poměru proteinových aktivit od 0,05 % do 35 %.

Ve výhodném provedení je stupeň větvení a-1,6-větvených a-1,4-glukanů na šesté pozici možné modifikovat od 0,15% do 25%, ve výhodnějším provedení od 0,20 % do 15 % a velmi výhodně od 0,25 % do 12 %.

Jestliže je použit způsob z tohoto vynálezu, je zvláště možné vyrobit produkty s vyšším stupněm větvení, než má glykogen.

V rámci tohoto vynálezu znamená stupeň větvení průměrný podíl míst větvení v O-6 poloze vůči celkovému počtu jinak spojených glukosových jednotek. Stupeň větvení může být stanoven například metylační analýzou (srovnej příklad 10).

V dalším výhodném provedení je ve způsobu z tohoto vynálezu modifikována molekulová hmotnost produktů změnou poměru proteinových aktivit. Zvláště je možné měnit poměr proteinových aktivit v průběhu reakce, která vede k syntéze a-1,6-větvených a-1,4-glukanů.

V dalším výhodném provedení způsobu vynálezu je způsob proveden při různých koncentracích sacharosy. Principielně je možné, aby byla metoda provedena s výhodou při koncentracích od 1 % do 80 % sacharosy (hmotn./obj.), výhodněji od 5 % do 50 % a velmi výhodně od 10 % do 40 %.

V tomto vynálezu je molekulová hmotnost stanovována pomocí rozptylu světla (Light Scattering from Polymer Solutions, vydavatel: Huglin, Μ. B., Academie Press, Londýn, 1972) podle Berryho (J. Chem. Phys. 44 (1966), str. 4550). Způsobem podle vynálezu je zvláště možné přizpůsobit molekulovou hmotnost a-1,6-větvených a-1,4-glukanů vytvořených tímto způsobem v rozmezí od 1000 do 3000 x 10⁶. S výhodou mají a-1,6-větvené a-1,4-glukany molekulovou hmotnost v rozmezí od 100 000 do

4» ·· ·· » · · · · · • · ·» « · φ9 1 ·· ·

1500x10®, výhodněji od 100 000 do 1000x10®, ještě výhodněji od 262 000 do 1000 x 10® a nejvýhodněji od 262 000 do 499 x 10®.

Dále se tento vynález týká a-1,6-větvených a-1,4-glukanů, které lze získat výše zmíněným způsobem podle vynálezu. Tyto a-1,6-větvené a-1,4-glukany mají stupeň větvení vyšší, než jakého by bylo dosaženo při použití pouze aktivity amylosacharasy a který dosahuje maximálně 25 % mol.

Ve výhodném provedení vynálezu jsou to a-1,6-větvené a-1,4-glukany se stupněm větvení v rozsahu od 0,05 % do 20 %, s výhodou od 0,15 % do 17 %, výhodněji od 0,2 % do 15 %, ještě výhodněji od 0,25 % do 13 % a velmi nejvýhodně od 0,3 % do 12 %. V dalším výhodném provedení se stupeň větvení pohybuje v rozmezí od 0,35 % do 11 %, zvláště pak od 0,4 % do 10,5 %.

a-1,6-větvené a-1,4-glukany z tohoto vynálezu mohou být použity jak v potravinářském, tak v jiném průmyslu, jak bylo výše popsáno v souvislosti se škrobem podle vynálezu.

Plasmid pBB48, který byl vyroben v rámci tohoto vynálezu, byl dán do „Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Německá sbírka mikroorganismů a buněčných kultur) v Braunschweigu, dne 25. září 1998 s přístupovým číslem DSM 12425 podle požadavků Budapešťské dohody. Tato sbírka byla schválena jako mezinárodní sbírka.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 schematicky znázorňuje strukturu plasmidu pBB48 (DSM 12425)

Obr. 2 ukazuje řadu a-1,4-glukanů s rozdílným stupněm a-1,6-větvení, které byly vytvořeny způsobem podle vynálezu a které byly následně zbarveny Lugolovým činidlem.

Z leva doprava: amylosacharasa (vlevo), amylosacharasa + zvyšující se množství aktivity rozvětvovacího enzymu. Maxima absorpce odpovídajících vzorků byla: 615 nm, 483 nm, 500 nm, 526 nm, 534 nm, 560 nm, 577 nm.

Obr. 3 znázorňuje HPLC chromatogram vysoce větveného produktu (A), jehož větvení bylo odstraněno isoamylasou, a vzorek glykogenu z krysích jater (B), jehož větvení bylo odstraněno isoamylasou.

Obr. 4 ukazuje schéma metylační analýzy.

· · ·

Obr. 5 znázorňuje graf výsledků analýzy vzorku 7, popsaného v příkladu 9 a 10 po jednom a po dvou metylačních krocích. Hodnoty pro 2, 3 a 6-metylaci jsou 96,12 % a 96,36 % v tomto pořadí.

Obr. 6 znázorňuje grafickou ilustraci podílů koncových („2346 Me“) a 6-větvených („23 Me“) glukosových jednotek testovaných glukanových vzorků.

Obr. 7 a Obr. 8 představují chromatogramy vzorků 3 a 7, které jsou popsány v příkladech.

Obr. 9 schematicky znázorňuje plasmid pBE-fnr-Km.

Obr. 10 ukazuje aktivitní barvení gelu s rozvétvovacím enzymem.

Obr. 11 ukazuje schematické znázornění profilu RVA.

Obr. 12 ukazuje distribuci velikosti zrn linií 143-13A a 143-59A ve srovnání s divokým typem.

Obr. 13 zobrazuje mikroskopické zvětšení škrobových zrn linií 143-13A, 143-34A a 143-59A ve srovnání se škrobovými zrny rostlin divokého typu (světelný mikroskop Leitz, Německo).

Obr. 14 ukazuje texturu gelu škrobů různých transgenních linií v porovnání se škrobem z rostlin z divokého typu. Textura byla stanovena pomocí analyzátoru textury.

Obr. 15 ukazuje profil RVA škrobů linií 143-11A, 143-13A, 143-59A v porovnání s divokým typem.

Obr. 16 až Obr. 18 ukazují výsledky HPLC chromatografií, které představují model distribuce bočních řetězců linií 143-WT (=divoký typ), 143-13Aa 143-59A.

Obr. 19 znázorňuje eluční gradient, který byl použit při chromatografiích znázorně’ ných na obrázcích 16 až 18.

Obr. 20 znázorňuje procentuální odchylku bočních řetězců, které mají určitou délku řetězce, škrobů analyzovaných na obrázcích 16 až 18 od divokého typu.

β φ • ·

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady dokreslují vynález.

Materiály:

Pufr na rozbíjení: 100 mM Tris/HCI, pH 8,5; 5 mM NažEDTA; 2 mM DTT; 1 mM

Promývací pufr: Pufr HIC:

Pefabloc ® 50 mM Tris/HCI, pH 8,5; 5 mM Na2EDTA; 10% glycerol 50 mM pufr fosforečnan draselný, pH 7,0; 5 mM EDTA; 2 mM DTT; 10% glycerol

glykogen typu II z ústřice (Sigma G8751)

Metody:

Analýza škrobu (a) Stanovení poměru amylosy ku amylopektinu

Škrob byl isolován z rostlin bramboru standardními způsoby a poměr amylosy k amylopektinu byl stanoven způsobem popsaným Hovenkamp-Hermelinkem a kol. (Potato Research 31 (1988), 241 -246).

(b) Stanovení obsahu fosforečnanu

Uhlíky v pozicích C2, C3 a C6 glukosových jednotek ve škrobu mohou být fosforylovány.

Za účelem stanovení obsahu fosfátových skupin v pozicích C6, bylo hydrolyzováno 100 mg škrobu v 1 ml 0,7 M HCI po dobu 4 hodin při 95 °C (Nielsen a kol., Plant Physiol. 105 (1994), 11 - 117). Po neutralizaci 0,7 Μ KOH, bylo 50 ml hydrolyzátu podrobeno enzymově optické zkoušce ke stanovení glukosa-6-fosfátu. Byla stanovena změna absorbance testované směsi (100 mM imidazol/HCI; 10 mM MgCI₂; 0,4 mM NAD; 2 jednotky glukosa-6-fosfátdehydrogenasy z Leukonostoka mesenteroides' 30 °C) při 334 nm.

Celkový obsah fosforečnanů byl stanoven způsobem podle Amese (Methods in

Enzymology Vlil (1996), 115-118).

Přibližně 50 mg škrobu bylo přidáno do 30 μΙ roztoku dusičnanu hořečnatého v etanolu a spáleno na popel při 500 °C po dobu 3 hodin v muflové peci. Ke zbytku bylo přidáno 300 μΙ 0,5 M HCI a inkubováno po dobu 30 minut při 60 °C.

• ·

Pak byla alikvotní část doplněna do 300 μΙ 0,5 M HCI a přidána do směsi 100 μΙ

10% kyseliny askorbové a 600 μΙ 0,42% molybdenanu amonného ve 2 M kyselině sírové. Směs byla inkubována 20 minut při 45 °C.

Následně bylo provedeno fotometrické stanovení při vlnové délce 820 nm s použitím kalibrační přímky vytvořené ze standardních roztoků fosforečnanu.

(c) Stanovování textury gelu (analyzátor textury) g škrobu (TS) byly hněteny ve 25 ml H2O (srovnej RVA) a následně vzduchotěsně uzavřeny a skladovány 24 hodin při 25 °C. Vzorky byly upevněny pod sondou (oblý cejch) analyzátoru textury TA-XT2 od Stable Micro Systems. Textura byla měřena s následujícími parametry:

testovací rychlost hloubka průniku kontaktní plocha tlak

0,5 mm/s mm

113 mm²

2g (d) Měření viskozity g škrobu (TS) byly přidány do 25 ml H₂O a to bylo vloženo do analyzátoru Rapid Visco Analyzer (Newport Scientific Pty Ltd., Investment Support Group, Warriewod NSW 2102, Austrálie). Přístroj byl obsluhován podle návodu výrobce. Před měřením viskozity vodných roztoků byla nejdříve suspenze škrobu zahřívána z 50 °C na 95 °C rychlostí 12 °C za minutu. Poté byla udržována po dobu

2,5 minuty teplota 95 °C. Následně byl roztok chlazen z 95 °C na 50 °C rychlostí 12 °C za minutu. Viskozita byla stanovována po celou dobu.

Plastifikační teplota byla stanovena jako směrnice z grafu závislosti viskozity na čase. Jestliže směrnice dosáhla hodnoty vyšší než 1,2 (tato hodnota byla zadána uživatelem), počítačový program vyhodnotil tuto teplotu jako teplotu plastifikace.

(e) Stanovení glukosy, fruktosy a sacharosy

Obsah glukosy, fruktosy a sacharosy byl stanovován způsobem podle Stitta a kol. (Methods in Enzymology 174 (1989), 518-552).

(f) Analýza distribuce postranních řetězců amylopektinu

Distribuce postranních řetězců a příprava byly stanoveny tak, jak bylo popsáno v Lloyd a kol. (Biochem. J. 338 (1999), 515 - 521). Ukazuje to na fakt, že použitím této metody jsou odštěpeny postranní řetězce pouze u amylopektinu a že amylosa byla odstraněna před odštěpováním thymolovým srážením. Byly zvoleny následující podmínky eluce (zjednodušená ilustrace, přesný eluční profil je uveden na obrázku 19):

čas 0,15 M NaOH 1 M NaAc v 0,15 M NaOH

min	%	%
0	100	0
5	100	0
20	85	15
35	70	30
45	68	32
60	0	100
70	0	100
72	100	0
80	100	0
(g) Stanovení velikosti zrn

Velikost zrn byla měřena s použitím fotosedimentometru typu „Lumosed“ od Retsch GmbH, Německo.

Distribuce velikosti zrn byla stanovována ve vodném roztoku a byla prováděna podle postupu daného výrobcem a také na základě literatury, například H. Pitsch, KorongróBenbestimmung; LABO - 1988/3 Fachzeitschrift fůr Labortechnik, Darmstadt.

(h) Stanovení schopnosti vázat vodu

Schopnost vázat vodu byla stanovena vážením zbytku po oddělení rozpustných částí škrobu, nabobtnalého při 70 °C, centrifugací. Schopnost škrobu vázat vodu (WBV) byla stanovena vzhledem k počáteční váze, korigované na rozpustnou hmotu.

WBV (g/g) = (zbytek - (počáteční hmotnost - rozpustná část))/(počáteční hmotnost - rozpustná část).

• · · · · · ·

Příklad 1

Izolace sekvence genomové DNA, která kóduje rozvětvovací enzym z Neisseria denitrificans

Aby mohl být izolován rozvětvovací enzym z Neisseria denitríficans, musela být nejdříve vyrobena genomová knihovna. Za tímto účelem byly nejdříve buňky Neisseria denitríficans, kmen ATCC 14686 zATCC, kultivovány na miskách s krevním agarem Columbia a následně zpracovány. Genomová DNA byla izolována a čištěna způsobem podle Ausubel a kol. (v: Current Protocols in Molecular Biology (1987); J. Wiley & Sons, NY). Po parciálním štepení restrikční endonukleasou Sau3A byla provedena ligace sfágovou DNA vektoru naštěpenou BamHI (lambdaZAPExpress od Stratagene). Po excizi fágové knihovny in vivo, byly získané plasmidy transformovány do mutantu E. coli (PGM-) (Adhya a Schwartz, J. Bacteriol. 108 (1971), 621 - 626). Tento mutant tvoří lineární polysacharidy, když je pěstován na maltose. Tyto polysacharidy se při barvení jodem zbarvují modře. Na misku s agarem YT, IPTG (1 mM), kanamycinem (12,5 mg/l) a maltosou (1 %) bylo naočkováno 60 000 transformantů. Po 16hodinové inkubaci při 37 °C byly transformanti vaporizovány jodem. Bylo vybráno 60 kolonií bakterií, jejichž barva byla po vaporizaci červená, hnědá nebo žlutá, ze kterých byla následně izolována plasmidová DNA (Birnboim-Doly, Nucleic Acid Res. 7, 1513 - 1523). Izolované plasmidy byly poté použity pro opětnou transformaci stejného mutantu E.coli (PGM) (Adhya a Schwartz, J. Bacteriol. 108 (1971), 621 - 626). Po opětném očkování a vaporizaci jodem byl počet klonů snížen ze 60 na 4. Byla provedena restrikční analýza všech čtyř plasmidů, která vykazovaly fragment EcoRI (1,6 kb), který měl stejnou délku u všech čtyř plasmidů (obr. 1).

Příklad 2

Analýza sekvence genomového fragmentu plasmidů pBB48

Byl izolován fragment EcoRI o délce 1,6 kb (Geneclean, Biol 01) z klonu získaného podle příkladu 1 (pBB48), který měl přibližně 3,9 kb dlouhý insert ve vektoru pBK-CMV (Stratagene). Za účelem sekvenování byl fragment klonován do vektoru pBluescript, který byl naštěpen EcoRI. Takovýmto způsobem získaný plasmid byl sekvenován. Sekvence DNA kódující rozvětvovací enzym, podobně jako sekvence přiléhá• ♦ • Φ ·· • · · · · • · · · · : : ’· * · · · : : :

.· ·· ·· ·· ·· jících úseků byla stanovena s použitím pBB48 (SEKV. ČÍS. 1). Plasmid pBB48 je znázorněn na obrázku 1. Plasmid je deponován v databázi pod číslem DSM 12425.

Příklad 3

Exprese rozvětvovacího enzymu v rekombinantních buňkách E.coli

U laboratorních kmenů E.coli je obecně exprimován endogenní rozvětvovací enzym (glgB). Z toho důvodu byl použit k detekci enzymové aktivity rozvětvovacího enzymu mutantní kmen E.coli G6MD2. Kmen E.coli Hfr G6MD2 (E.coli Genetic Stock Center, Yale University, CGSC#5080) má rozsáhlou deleci v oblasti genů pro syntézu glukanů (glgA, glgB, glgC). Za účelem detekce enzymové aktivity rozvětvovacího enzymu byla zmíněná mutanta transformována plasmidem pBB48 a následně byl připraven hrubý lyzát z napěstovaných buněk. Proteiny z tohoto hrubého lyzátu byly elektroforeticky separovány v polyakrylamidovém gelu a následně, za účelem detekce enzymové aktivity, inkubovány jednak s a jednak bez králičí fosforylasy B (100 mM citronan sodný, pH 7,0; AMP, glukosa-1-fosfát). Fialové skvrny, ukazující silnou rozvětvovací aktivitu se objevily pouze na gelu stimulovaném fosforylasou.

Příklad 4

Příprava a-1,6-rozvětvených a-1,4-glukanů in vitro s použitím surových extraktů proteinů v bezbuněčném systému

Za účelem exprese rozvětvovacího enzymu byl mutantní kmen E.coli G6MD2 transformován plasmidem pBB48. Buňky byly kultivovány v médiu YT s kanamycinem (12,5 mg/l) po dobu 16 hodin za stálého míchání v Erlenmeyerových baňkách. Sediment získaný po centrifugaci (5000 x g) byl promyt 100 mM Tris/HCI, pH 7,5, 1 mM DTT a rozsuspendován ve stejném pufru. Následně byly buňky rozbity ultrazvukovou sondou. Další centrifugaci (10000 x g) byly odděleny zbytky buněk od rozpustných proteinů a byl získán nažloutlý supernatant, který obsahoval proteiny o koncentraci přibližně 10 mg/ml.

Různá množství (100 pl, 10 μΙ, 1 μΙ, 0,1 μΙ, 0,01 μΙ, 0,001 μΙ) tímto způsobem získaného supernatantu byla přidána k neměnnému množství amylosacharasy v 50 ml

100 mM citronanu sodného, pH 7,0 s 20% sacharosou a 0,02% azidem sodným. Po ·· ··♦·

několika hodinách se začal objevovat v reakční směsi první zákal. Po třech dnech byla směs centrifugována a vytvořené produkty byly opláchnuty deionizovanou vodou.

Produkty jsou rozpustné v DMSO a mohou být charakterizovány proměřením absorpčního spektra s Lugolovým roztokem, čímž může být odhadnut stupeň větvení produktu. Za tímto účelem byl roztok DMSO silně zředěn vodou, byl přidán Lugolův roztok a ihned bylo měřeno spektrum od 400 nm do 700 nm na spektrofotometru Beckmann (srovnej obr. 2).

Separace postranních řetězců, které byly odštěpeny isoamylasou na HPLC (DIONEX; pohyblivá fáze: 150 mM NaOH s gradientem 1M octanu sodného) koloně Carbopak PA100, měla stejný charakter u silně větvených produktů jako u glykogenu z krysích jater s odstraněným větvením isoamylasou (obr. 3).

Po inkubaci s pullulanasou byly postranní řetězce odštěpeny pouze ve velmi malé míře.

Příklad 5 Čištění rozvětvovacího enzymu a N-terminální sekvenování proteinu

Za účelem izolace rozvětvovacího enzymu z Neisseria denitrificans z rekombinantních buněk E.coli Hfr G6MD2 (viz výše), které byly transformovány plasmidem pBB48, byla nejdříve centrifugována kultura těchto buněk pěstovaná přes noc. Buněčná sraženina pak byla suspendována ve 3 objemech rozbíjecího pufru a následně rozbita s použitím lisu French press při tlaku přibližně 110,32 MPa až 117,21 MPa. Po centrifugaci při 10 000 g po dobu jedné hodiny byl supernatant zředěn na čtyřnásobný objem promývacím pufrem. Poté byl navázán na DEAEcelulosu DE52 periodickým postupem a naplněn do chromatografické kolony, která byla promyta 2 až 3 objemy kolony promývacím pufrem. Následně byl k eluci aplikován lineární gradient 1M NaCl. Frakce mající aktivitu rozvětvovacího enzymu byly smíchány (viz příklad 8) a byl přidán (NH₄)₂SO4 (na výslednou koncentraci 20 % hmotn./obj.). Směs byla nanesena na kolonu TSK butyl Toyopearl 650M. Po promytí 2 až 3 objemy kolony pufrem HIC, do kterého byl navíc předem přidán roztok síranu amonného o stupni nasycení 20% (114 g síranu amonného na litr), byl rozvětvovací enzym eluován v pufru HIC, gradientem síranu amonného, který klesá lineárně z 20 % na 0 %. Frakce obsahující aktivitu rozvětvovacího enzymu byly spojeny. Kvůli zakoncentrování proteinu byl krok čištění se spojenými frakcemi následně zopakován s použitím malé kolony TSK butyl

Toyopearl 650M (Tose Haas (Montgomery Ville, Pensylvania)). Přečištěný protein byl pak aplikován na polyakrylamidový gel, blotován na PVDF membránu, znovu rozpuštěn a N-koncově sekvenován Edmanovou metodou firmou WITA GmbH, Teltow, Německo.

Byla získána sekvence: MNRNXH (Sekv. id. č. 3).

Příklad 6

Čištění amylosacharasy

K výrobě amylosacharasy byly použity buňky E.coli, které byly transformovány DNA kódující amylosacharasu z Neisseria polysaccharea. DNA má sekvenci nukleotidů znázorněnou pod sekv. id. č. 4 a je odvozena z genomové knihovny N. polysaccharea.

Kultura zmíněných buněk E.coli, sekretujících amylosacharasu z Neisserie polysaccharea, která byla kultivována přes noc, byla odcentrifugována a znovu suspendována v přibližně 1/20 objemu 50 mM pufru citronanu sodného (pH 6,5), 10 mM DTT (dithiothreitol), 1 mM PMSF (fenylmetylsulfonylfluorid). Poté byly buňky dvakrát rozbity pomocí aparatury French Press při 110,32 MPa. Následně byl k buněčnému extraktu přidán 1 mM MgCh a bensonasa (Měrek, 100 000 jednotek; 250 jednotek μΓ¹) ve výsledné koncentraci 12,5 jednotek ml·¹. Pak byla směs inkubována při 37 °C po dobu alespoň 30 min za mírného třepání. Extrakt byl ponechán po dobu alespoň 1,5 hod na ledu. Potom byl centrifugován při 4 °C po dobu 30 minut při přibližně 40 000 g, do té doby než byl supernatant relativně čistý.

Roztok byl předběžně filtrován přes PVDF membránu („Durapore“ od fy. Millipore, nebo podobné), která měla průměr pórů 0,45 pm. Extrakt byl ponechán přes noc při 4 °C. Před provedením Hl (hydrofóbně interakční) chromatografie byl do extraktu přidán pevný NaCl, jehož koncenterace byla nastavena na 2 M NaCl. Poté byla směs opět centrifugována při přibližně 40 000 g při 4 °C po dobu 30 minut. Zbývající zbytky E.coli byly odstraněny z extraktu filtrací přes PVDF membránu („Durapore“ od fy. Millipore, nebo podobné), která měla průměr pórů 0,22 pm. Přefiltrovaný extrakt byl separován na koloně s butylsepharosou-4B (Pharmacia) (objem kolony: 93 ml, délka:

17,5 cm). Na kolonu bylo naneseno přibližně 50 ml extraktu s amylosovou aktivitou od 1 do 5 jednotek pl'¹. Nenavázané proteiny pak byly vymyty z kolony 150 ml pufru B (pufr B: 50 mM citronan sodný, pH 6,2 a 2 M NaCl). Nakonec byla amylosacharasa eluována z kolony klesajícím lineárním gradientem NaCl (od 2 M do 0 M NaCl v 50 mM citronanu sodném a v objemu 433 ml a při průtoku 1,5 ml min’¹). Gradient byl tvořen automatic• · · kým čerpacím systémem (FPLC, Pharmacia). Eluce amylosacharasy probíhala mezi

0,7 M a 0,1 M NaCI. Frakce byly sebrány, odsoleny na koloně se sephadexem PD10 (Pharmacia), stabilizovány 8,7% glycerolem, testovány na přítomnost amylosové sacharosové aktivity a nakonec hluboce zmraženy ve skladovacím pufru (8,7% glycerol, mM citronan).

Příklad 7

Stanovování amylosacharasové aktivity

Amylosacharasová aktivita byla stanovována tak, že čištěný protein nebo hrubý proteinový extrakt byl inkubován v různém zředění při 37 °C v 1 ml reakčních směsích, které obsahovaly 5% sacharosu, 0,1% dextrin a 100 mM citronan, pH 6,5. Alikvoty o objemu 10 pl jsou odebírány v časech 0 min, 30 min, 60 min, 120 min, 180 min, 240 min, 300 min a 360 min a je zastavena enzymová aktivita amylosacharasy okamžitým zahřáním na 95 °C. Podíl fruktosy uvolněné amylosacharasou je pak stanoven kombinovaným fotometrickým stanovením. 1 μΙ až 10 μΙ inaktivovaného vzorku je dáno do 1 ml směsi, která obsahuje 50 mM imidazolový pufr o pH 9,6; 2 mM MgCI₂, 1 mM ATP, 0,4 mM NAD⁺ a 0,5 U/ml hexokinasy. Po následném přidání glukosa-6-fosfátdehydrogenasy (z Leuconostoca mesenteroides) a fosfoglukosaisomerasy je měřena změna absobce při 340 nm. Následně je vypočítán obsah uvolněné fruktosy podle Lambert-Beerova zákona.

Jestliže je získaná hodnota vztažena na čas, ve kterém byl konkrétní vzorek odebrán, může být stanoven počet jednotek (1U = pmol fruktosy/min) (na μΙ proteinového extraktu nebo čištěného proteinu).

Příklad 8

Stanovování enzymové aktivity rozvětvovacího enzymu z Neissería denitrificans

Enzymová aktivita rozvětvovacího enzymu byla stanovena v souladu se způsobem popsaným v literatuře (Krisman a kol., Analytical Biochemistry 147 (1985), 491 496; Brown a Brown, Meth. Enzymol. 8 (1966), 395 - 403). Způsob je založen na principu vazebné afinity redukovaného jódu k rozvětveným glukanům ve srovnání s nevětvenými a-1,4-glukany.

·· ····

Enzymová aktivita rozvětvovacího enzymu byla stanovována tak, že byla rozpipetována série vzorků o různých ředěních rozvětvovacího enzymu do chlazené mikrotitrační destičky. Reakce byla následně startována přídavkem 190 μΙ amylosové reakční směsi (příprava viz níže) a inkubována v inkubátoru při 37 °C. Reakce byla zastavena přesně po 30 minutách přídavkem 100 μΙ Lugolova činidla (0,5 mM) a vzorky byly měřeny ve čtečce mikrotitračních destiček (Molecular Devices) při 650 nm. Jako kontrola sloužila směs bez amylosy. Srovnávací vzorek, který měl maximální hodnotu zhášení a obsahoval amylosu, ale neobsahoval žádný rozvětvovací enzym, měl ODeso o velikosti 1,2.

Aby bylo možné lépe porovnat nezávislé testy, byla použita pro výpočet pouze taková ředění, která vedla ke snížení absorbance o 0,5 jednotky v průběhu inkubačního času 30 minut.

Definice aktivitní jednotky (U) rozvětvovacího enzymu:

Půl jednotky rozvětvovacího enzymu je takové množství enzymu, které vede ke snížení ODsso o půl jednotky z 1,2 na 0,7 za 30 min ve výše popsaném stanovení.

Příprava reakční směsi s amylosou:

Za stálého míchání je k 1 ml 0,5% roztoku amylosy (výrobce: Fluka; amylosa z brambor) hmotn./obj. v DMSO přidáno 10 ml pufru citronanu sodného (100 mM, pH 6,5; 0,02% hmotn./obj. NaNs). Pro měření je čirý zásobní roztok opět zředěn pufrem z citronanu sodného v poměru 1:4 až 1:8. Při stanovení by měla absorbance použitého srovnávacího vzorku (maximum) dosahovat hodnoty 1,2.

Příklad 9

Příprava a-1,6-větvených a-1,4-glukanů s různým stupněm větvení

K přípravě a-1,6-větvených a-1,4-glukanů s různým stupněm větvení byla přidána amylosacharasa z Neissería polysaccharea (srovnej příklad 6) a čištěný rozvětvovací enzym z Neissería denitrificans (srovnej příklad 5) do 20% roztoku sacharosy (hmotn./obj.) v reakčním objemu 10,86 ml. V závislosti na zkoumané směsi byly tyto dva enzymy použity v různých vzájemných poměrech proteinové aktivity (stanovení ak• · · · · · ti vity amylosacharasy viz příklad 7; stanovení aktivity rozvětvovacího enzymu viz příklad

8) (viz tabulka 1):

Příprava amylosacharasy: 6,2 U/mg; 1,8 mg/ml

Příprava rozvětvovacího enzymu: 75 U/mg; 6,9 mg/ml

Tabulka 1

číslo	μΙ BE	μΙ Amsu	jednotky BE	jednotky Amsu	jednotky Amsu/ jednotky BE
1	725	140	375	1,6	1/234,4
2	181,3	140	94	1,6	1/58,8
3	45,5	140	24	1,6	1/15
4	11,4	140	5,90	1,6	1/3,7
5	2,8	140	1,45	1,6	1,1/1
6	0,713	140	0,37	1,6	4,3/1
7	0,179	140	0,09263	1,6	17,3/1
8	0,0446	140	0,02308	1,6	69,3/1
9	0,0112	140	0,00580	1,6	275,9/1
10	0,0028	140	0,00145	1,6	1103,4/1
11	0	140	0	1,6
13	glykogen	z	Mytillus	edulis	—

BE = rozvětvovací enzym

Amsu = amylosacharasa jednotky = stanovení viz příklady 7 a 8

4< ··«· • · · • · · • · · • · · · ·· ··

Příklad 10

Stanovení stupně větvení metylační analýzou

Stupeň větvení získaných glukanů byl následně stanovován s pomocí metylační analýzy.

1. Provedené testy

- metylace všech volných OH skupin glukanových vzorků, v každém čase dvojí stanovení

- hydrolýza permetylováných polymerů následovaná redukcí v pozici C-1 a acetylace směsi monomerů

- analýza a kvantifikace reakčních produktů plynovou chromatografií

Stupeň větvení vzorků glukanů byl stanoven metylační analýzou (srovnej obr. 4). Volné OH skupiny polymeru jsou značeny konverzí na metyléter.

Degradace na monomery probíhá způsobem kyselé hydrolýzy a vede k částečně metylovaným molekulám glukosy, které jsou přítomny ve formě pyranos/furanos a jako a- a α-glukosidy. Ty jsou koncentrovány redukcí NaBH4 v odpovídajícím částečně metylovaném derivátu sorbitolu. Následná acetylace volných OH skupin umožňuje zkoumání reakčních produktů plynovou chromatografií.

Následující tabulka ukazuje texturu získaných glukanů a jejich rozpustnost v DMSO.

Tabulka 2

vzorek	textura	Rozpustnost v DMSO (studeném)	Rozpustnost v DMSO (100 °C)
1	Bezbarvé, plastické podobné pěně	(+)	+ (mírně kalný roztok)
2	n. d.	n. d.	n. d.
3	Bezbarvé, plastické podobné pěně	(+)	+ (mírně kalný roztok)
4	n. d.	n. d.	n. d.
5	Bezbarvý prášek	+	+
6	n. d.	n. d.	n. d.
7	Bezbarvý prášek	+	+
8	n. d.	n. d.	n. d.
9	Bezbarvý prášek	+	+
10	n. d.	n. d.	n. d.
11	Bezbarvý prášek	+	+
13	Nažloutlý prášek	(+)	+

n.d. = není stanoveno

2. Experimentální část

a) Příprava roztoků DMSO

1% roztoky (hmotn./obj.) byly připraveny v DMSO. Ne všechny vzorky byly dobře rozpustné za laboratorní teploty: Vzorky 1, 3 a 13 musely být zahřívány 30 minut na 110 °C. S výjimkou roztoků 1 a 3, které byly mírně kalné, se jednalo o opticky čiré roztoky (srovnej tabulku 2).

b) Metylace ml DMSO roztoku (tj. 20 mg polymeru) byly přeneseny do láhve s dusíkem o objemu 50 ml, přidány do 5 ekvivalentů/OH (eq/OH) čerstvě připraveného roztoku dimsylu (dimetylsulfoxidkarbanion) v proudu N₂. Celá směs byla míchána po dobu 30 minut. Roztok se zakalil a zvýšila se jeho viskozita. Obsah láhve byl zmražen v ledové lázni, bylo přidáno 10 eq/OH metyljodidu a po rozpuštění byla směs míchána po dobu alespoň 2 hodin. Před druhou deprotonací a metylačním krokem byl odstraněn nadbytek metyljodidu ve vakuu.

Po odstranění nadbytku metyljodidu pokračovalo zpracování přidáním 50 ml vody a pětinásobnou extrakcí, vždy s 10 ml dichlormetanu. Zbytky DMSO byly • · · ···· · · · · • · · · · · · · · · • · · · · · · ··· · · • · β · ···· · · · • · Ο · 9 9 9 9 9 9 99 9 odstraněny ze směsi trojnásobnou extrakcí s vodou. Organická fáze byla následně vysušena pomocí CaCI₂, přefiltrována a zkoncentrována. Produkty byly čiré nažloutlé filmy.

Pomocí vzorku 7 bylo nejdříve vyzkoušeno, kolik metylačních kroků je třeba k permetylaci hydroxylových skupin. Po první metylaci byla zpracována polovina směsi, zatímco druhá polovina byla metylována ještě jednou. Poté byly oba vzorky degradovány a byly porovnány výsledky GC analýzy. Ukázalo se, že už po prvním metylačním kroku byla reakce téměř kvantitativní (srovnej obr. 5). K identifikaci možného větvení v pozici C-3, u něhož se může zdát, že je přítomné pouze v důsledku submetylace v této pozici, byla vždy prováděna druhá metyl ace.

Obr. 5 znázorňuje výsledky analýz vzorku 7 po prvním a druhém metylačním kroku. Hodnoty odpovídající 2,3,6-metylaci jsou 96,12 %, respektive 96,36 %.

c) Hydrolýza

Byly naváženy 2 mg metylovaného vzorku do 1 ml tlakové láhve. Bylo přidáno 0,9 ml 2M trifluoroctové kyseliny a směs byla míchána po dobu 2,5 hodin při 120 °C. Po ochlazení láhve byla směs koncentrována v proudu N₂. K odstranění zbytků kyseliny byl třikrát přidán toluen, který byl vždy odpařen.

• 4 • 4 • ·

	vzorek 1	vzorek 3	vzorek 5	vzorek 7	vzorek 9	vzorek 11	vzorek 13
metoda 1
Počáteční	21,9	22,7	21,7	32,5	23,4	22,6	23,5
hmotnost
(mg)
(mmol)	0,135	0,140	0,134	0,200	0,144	0,139	0,145
Výsledná	30,4	29,2	28,0	25D	27,7	28,8	30,4
hmotnost
(mg)
(mmol)	0,149	0,143	0,137	0,122¹)	0,136	0,141	0,149
teoretické %	110	102	102	-1)	94	101	103
metoda 2
Počáteční	23,7	22,1	20,7	20,8	23,1	21,5	19,5
hmotnost
(mg)
(mmol)	0,146	0,136	0,128	0,128	0,142	0,133	0,120
Výsledná	31,1	30,6	27,5	16,0²)	31,4	29,4	25,5
hmotnost
(mg)
(mmol)	0,152	0,150	0,135	0,078²)	0,154	0,144	0,125
teoretické %	104	110	105	61²)	108	108	104

¹⁾ Polovina z tohoto vzorku byl již odebrána a zpracována po prvním metylačním kroku, takže nejsou dostupná exaktní data.

²⁾ Malý objem byl způsoben chybou při zpracování.

d) Redukce

0,5 ml 0,5 M roztoku NaBD₄ v amoniaku bylo přidáno ke zbytku z předchozího reakčního kroku. Směs byla míchána po dobu 1 hodiny při 60 °C. Chemikálie byla opatrně rozbita několika kapkami ledové kyseliny octové. Vzniklý boritan byl odstraněn přídavkem pětinásobku 15% roztoku kyseliny octové v metanolu a následným odpařením v podobě trimetylesteru kyseliny borité.

e) Acetylace ·· ···· ·♦ ·· • · · · · ♦ ♦ * · ·· • · * ···· ··· • · «·· · · · · · · ·

·..··..· ·..*·..· ·..· .·· pg pyridinu a 250 pl anhydridu kyseliny octové bylo přidáno ke zbytku z předchozího reakčního kroku. Směs byla míchána po dobu 2 hodin při 95 °C. Po ochlazení byla reakční směs po kapkách přidána do 10 ml nasyceného roztoku NaHCC>3. Směs byla pětkrát extrahována dichlormetanem. Reakční produkty z organické fáze byly analyzovány plynovou chromatografií (produkt; srovnej obr. 4).

f) Plynová chromatografie

Analýzy pomocí plynové chromatografie byly prováděny s použitím přístroje Carlo Erby GC 6000 Vega Series 2 se vstupem na kolonu a detektorem FID. Separace byly prováděny na kapilární koloně z fúzního oxidu křemičitého zvané Supelco SPB5 (vnitřní průměr 0,2 mm, délka 30 m) s použitím vodíku jako nosného plynu a o tlaku 80 kPa. Byl použit následující teplotní program: 60 °C (1 min) - 25 °C/min -> 130 °C - 4 °C/min -> 280 °C.

3. Výsledky

Plynové chromatogramy byly zpracovány identifikací píků, integrací ploch pod píky a korekcí dat ve smyslu ECR konceptu podle Sweet a kol. (Sweet a kol., Carbohydr. Res. 40(1975), 217).

Ve vzorcích 1 a 3 mohly být, díky vysokému stupni větvení na C-6, pozorovány 1,6-anhydrosloučeniny. V průběhu hydrolýzy to vede k monomerům, které mají volnou OH skupinu v pozici C-6, která mohla za daných reakčních podmínek dále reagovat za tvorby těchto derivátů. Při výpočtu stupně větvení byly tyto hodnoty přidány k hodnotě „2,3-Me“.

Obr. 6 ilustruje poměr koncových („2,3,4,6-Me“) a na C-6 navázaných („2,3-Me“) glukosových jednotek zkoumaných vzorků glukanu.

• · · · · ·

Tabulka 4: Výsledky analýzy v molárních %: zkratky (A, B, atd.) odpovídají zkratkám, použitým na obr. 1; „16AnhPy“ = 1,6-anhydro-4-O-acetyl-2,3-di-O-metyl-D-gluko pyranosa, „16AnhFu“ = 1,6-anhydro-5-O-acetyl-2,3-di-O-metyl-D-glukofuranosa; „Me1“ a „Me2“ označují dvě nezávislé metylační analýzy příslušných vzorků.

	vzorek 1	vzorek 3
Me1	Me2	Průměrná hodnota	Me1	Me2	Průměrná hodnota
16AnhPy	0,37	stopy	0,19	stopy	stopy	-
16AnhFu	0,53	0,47	0,50	stopy	stopy	-
2346-Me (A)	11,73	11,94	11,84	9,49	10,68	10,08
234-Me (B)	stopy	stopy	-	-	-	-
236-Me (C)	76,37	77,80	77,09	82,97	80,67	81,82
23-Me (D)	9,75	9,16	9,46	7,54	8,34	7,94
26-Me (E)	0,45	0,31	0,38	stopy	0,32	0,16
36-Me	0,44	0,31	0,38	stopy	stopy
2-Me	0,20	-	0,10	-	-
3-Me	-	-	-	-	-
6-Me	-	-	-	-	-
Un-Me	0,20	-	0,10	-	-
		vzorek 5		vzorek 7
	Me1	Me2	Průměrná	Me1	Me2	Průměrná
			hodnota			hodnota
16AnhPy	-	-	-	-	-	-
16AnhFu	-	-	-	-	-	-
2346-Me (A)	2,42	2,51	2,47	2,60	2,77	2,69
234-Me (B)	-	-	-	-	-	-
236-Me (C)	95,54	96,18	95,86	96,36	96,89	96,63
23-Me (D)	1,36	1,05	1,21	0,48	0,33	0,41
26-Me (E)	0,37	stopy	0,19	0,26	stopy	0,13
36-Me	0,30	0,26	0,28	0,29	stopy	0,15
2-Me	-	-	-	-
3-Me	-	-	-	-
6-Me	-	-	-	-
Un-Me	-	-	-	-

• · φφφφ • φ • φ • · · · · ·· * · • φ φφφ · · · · φ · • · « φ ·· · φ φ · φφφ

	vzorek 9	vzorek 11
Me1	Me2	Průměrná hodnota	Me1	Me2	Průměrná hodnota
16AnhPy	-	-	-	-	-	-
16AnhFu	-	-	-	-	-	-
2346-Me (A)	2,89	2,79	2,84	2,60	2,49	2,55
234-Me (B)	-	-	-	-	-	-
236-Me (C)	95,62	95,62	95,62	96,21	97,20	96,70
23-Me (D)	0,67	0,69	0,68	0,52	0,31	0,42
26-Me (E)	0,36	0,42	0,39	0,36	stopy	0,18
36-Me	0,47	0,48	1,47	0,30	stopy	0,15
2-Me	-	-	-	-	-	-
3-Me	-	-	-	-	-	-
6-Me	-	-	-	-	-	-
Un-Me	-	-	-	-	-	-
		vzorek 13
	Me1	Me2	Průměrná hodnota
16AnhPy	stopy	stopy	-
16AnhFu	stopy	stopy	-
2346-Me (A)	8,91	7,46	8,19
234-Me (B)	stopy	stopy	-
236-Me (C)	83,71	85,45	84,58
23-Me (D)	7,07	6,87	6,97
26-Me (E)	0,32	0,22	0,27
36-Me	stopy	stopy	-
2-Me	-	-	-
3-Me	-	-	-
6-Me	-	-	-
Un-Me	-	-	-

Příklad 11

Výroba α-1,6-rozvětvených α-1,4-glukanů s rozdílnou molekulovou hmotností

K výrobě a-1,6-rozvětvených a-1,4-glukanů s rozdílnou molekulovou hmotností byla do 20% roztoku sacharosy (hmotn./obj.) v reakčním objemu 10,86 ml přidána čištěná amylosacharasa z Neissería polysaccharea (srovnej příklad 6) a čištěný rozvětvovací enzym z Neissería denitríficans (srovnej příklad 5). V závislosti na zkoušené směsi byly tyto dva enzymy přidávány v různých poměrech proteinových aktivit (stanovení aktivity amylosacharasy viz příklad 7; stanovení aktivity rozvětvovacího enzymu viz příklad 8) (srovnej tabulku 1). Molekulové hmotnosti a poloměr inertnosti R_g byly stanoveny » · • · · ·· ·

pomocí rozptylu světla (Líght Scattering of Polymer Solutions; vydavatel: Huglin, Μ. B., Academie Press, London, 1972). Vysušené vzorky 1-11 byly rozpuštěny v DMSO a H₂O (v poměru 90:10). Různá ředění (přibližně od 2,5 g/l do 0,25 g/l) byla anaylzována na přístroji měřícím rozptyl světla (SOFICA, Societě frangaise ďinstruments de contróle et ďanalyses. Le Mesnil Saint-Denis, France). Získaná data byla [,..]¹ podle Berryho (J. Chem. Phys. 44 (1966), 4550 a násl.).

Tabulka 5

vzorek	Poměr amylosacharasa: rozvětvovací enzym	Poloměr inertnosti Rg v nm	Molekulová hmotnost v g/mol
1	0,05	104	282x10⁶
2	0,2	154	499 x10⁶
3	0,8	76	228 x10⁶
4	3,21	⁶⁴	76 x10⁶
5	12,84	63	20 x10⁶
6	51,22	38	1,1 x10⁵
7	204,03	277	472 000
8	818,87	n. d.	n. d.
9	3275,49	170	469 000
10	13043,48	n. d.	n. d.
11	Žádný rozvětvovací enzym	143	262 000
13	glykogen (mořské mušle)	14,3	1,59 χ10θ g/mol (Burchard, W. : Macromolecules 10: 919 (1977))

n.d. = nebylo stanoveno

Příklad 12

Konstrukce expresní kazety, sloužící k transformaci rostlin pro expresi rozvětvovacího enzymu z Neisseria denitríficans v plastidech

Oligonukleotidy BE-5’ a BE-3’ (Sekv. id. č. 6 a 7) byly použity k amplifikaci sekvence kódující rozvětvovací enzym z Neisseria denitríficans pomocí PCR začínající od ¹ chybějící slovo - poznámka překladatele do angličtiny • · ···♦ ♦· ·· ·* · • · ·*·· ·♦·· • · ···« ·· · • · · · ·· ·♦· · · • · 9 9 ·· · · · · · · ♦ plasmidů pBB48 (uložen v Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Německá sbírka mikroorganismů a buněčných kultur) v Braunschweigu s přístupovým číslem DSM 12425). Výsledné amplifikované sekvence byly štěpeny restrikčími endonukleasami Sall a Sdal a klonovány do plasmidů pBinAR-fnr, který byl nejdříve také štěpen s pomocí Sall a Sdal. Výsledný plasmid byl pojmenován pBE-fnrKm (obr. 9).

Podmínky PCR:

Byly použity pufr a polymerasa od Boehringer Mannheim (Pwo polymerasa číslo: 1644947)

DNA x pufr + MgSCU dNTP (každý 10 mM) primer BE-5' primer BE-3'

Pwo polymerasa Destilovaná voda

0,2 ng μΙ μΙ

120 nM

1,0 jednotek μΙ

Reakčni podmínky

krok 1	95 °C	2:00 min
krok 2	95 °C	0:30 min
krok 3	66 °C	0:30 min
krok 4	72 °C	2:00 min (plus 1 s na cyklus)
krok 5	72 °C	8:00 min

Kroky 2 až 4 byly opakovány ve 40 cyklech.

Plasmid pBE-fnr-Km byl použit k transformaci rostlin bramboru podle standardních způsobů (viz výše).

···· • ♦ • ·

Příklad 13

Identifikace a detekce transgenních rostlin bramboru s aktivitou rozvětvovacího enzymu

S použitím analýzy Northern blotu bylo možné identifikovat mezi transgenními rostlinami bramboru, které byly vyrobeny podle příkladu 12, takové rostliny, které obsahovaly mRNA rozvětvovacího enzymu zNeisseria denitrificans. K detekci enzymové aktivity rozvětvovacího enzymu u stabilně transformovaných rostlin byl hluboce zamrazen listový materiál z těchto rostlin v tekutém dusíku a následně rozdrcen v hmoždíři předchlazeném tekutým dusíkem. Před roztáním materiálu byl přidán extrakční pufr (50 mM citronan sodný, pH 6,5, 4 mM DTT, 2 mM chlorid vápenatý). K přibližně 100 mg (čerstvá váha) rostlinného materiálu bylo přidáno asi 200 μΙ extrakčního pufru. Pevné složky suspenze rostlinného materiálu a extrakčního pufru byly odstraněny centrifugací (10 000 x g). Alikvót odtud získaného čirého supernatantu byl smíchán se čtvrtinou extrakčního objemu průtokového pufru (40% glycerol, 250 mM Tris, pH 8,8, 0,02% bromfenolová modř) a separován na polyakrylamidovém gelu (viz níže) při konstantní intenzitě proudu 20 mA na gel. (Před nanesením supernatantů byla proběhla elektroforéza po dobu 20 minut za výše uvedených podmínek). Poté, co bromfenolová modř ze průtokového pufru vyšla z gelu, byla elektroforéza zastavena. Pak byl gel pětkrát uveden do rovnováhy v promývacím pufru (100 mM citronan sodný, pH 6,5) o objemu, který byl pětkrát větší než objem gelu, při laboratorní teplotě vždy po dobu 20 minut za stálého míchání. Následně byl gel inkubován v inkubačním pufru (100 mM citronan sodný, pH 6,5, 5% sacharosa, 0,625 jednotek čištěné amylosacharasy z Neissería polysaccharea (stanovení aktivity a čištění enzymu viz výše), a to v množství, které bylo pětkrát větší než objem gelu, po dobu 16 hodin při 30 °C. Po dekantaci inkubačního pufru a po přidání Lugolova roztoku (který byl zředěn v poměru 1:5) byl zviditelněn glukan vytvořený amylosacharasou v kombinaci s rozvětvovacím enzymem, jako modrohnědý proužek (obr. 10). Veškerý zbylý polyakrylamidový gel se zbarvil modře v důsledku amylosacharasové aktivity v inkubačním pufru.

Složení polyakrylamidového gelu:

a) separační gel

375 mM Tris, pH 8,8

7,5% polyakrylamid (Biorad č. EC-890) • · · · ♦ · ♦ · ·· ·· • · f ·· • · · · · ·· ··· ·· · · · ·· • · ♦ · · · ·· • 4 ·· · ·· · · pro polymerizaci:

1/2000 objemu TEMED

1/100 objemu amoniumpersulfátu

b) koncentrační gel

125 mMTris, pH 6.8

4% polyakrylamid (Biorad čís. EC-890) kvůli polymerizaci:

1/2000 objemu TEMED

1/100 objemu peroxodisíranu amonného

c) pufr pro elektroforézu

375 mM Tris, pH 8,8

200 mM glycin

Příklad 14 Analýza škrobu z rostlin, které mají zvýšenou aktivitu rozvětvovacího enzymu

Škrob byl izolován standardními způsoby z transgenních rostlin bramboru, připravených podle příkladů 12 a 13, a analyzován s ohledem na jeho fyzikálně chemické vlastnosti. Bylo zjištěno, že se škrob syntetizovaný transgenními rostlinami bramboru liší od škrobu syntetizovaného rostlinami divokého typu, například v obsahu fosforečnanů, viskozitě a plastifikačních vlastnostech stanovených pomocí RVA. Výsledky fyzikálně chemického stanovení modifikovaného škrobu, založené na výše zmíněných analytických technikách, jsou znázorněny v následující tabulce.

č.	genotyp	Fosforečnan v C6 (%)	Obsah amylosy	RVA max. (%)	RVA min. (%)	RVA fin. (%)	RVA set. (%)	RVÁT (%)	Textura gelu (%)
1	Desiree (divoký typ)	100	22.0	100	100	100	100	100	100
2	143-13A	36	20,9	50	83	82	79	79	162
3	143-11A	—	22,5	92	90	88	80	99,5	—
4	143-59A	22	20,9	36	69	78	114	99	225

• · ·♦·· ·· ·· • · · · · ♦ · • · · · · ·· ·· ······ • · · · · · ♦ · • · ·· ·· ·· legenda:

143-13A, 143-11 A, 143-59A = transgenní rostliny bramboru, které přeexprimují rozvětvovací enzym z Neisseria denitrificans.

RVA = Rapid Visco Analyzer max. = maximální viskozita = viskozita v píku min. = minimální viskozita fin. = viskozita na konci měření set. = pokles = rozdíl mezi min. a fin.

T = teplota plastifikace

S výjimkou obsahu amylosy jsou procentuální hodnoty vztaženy k divokému typu (= 100%).

Výsledky analýzy RVA, analýzy distribuce velikosti škrobových zrn a textura gelu jsou také ukázány na obrázcích 11 až 15.

Dále obrázky 16 až 18 znázorňují výsledky HPLC chromatografie, které ukazují profil distribuce postranních řetězců linií 143-WT (= divoký typ), 143-13A a 143-59A.

Obr. 19 znázorňuje eluční gradient použitý v souvislosti s analýzou HPLC. Na obr. 20 je znázorněna procentuální odchylka postranních řetězců, které mají určitou délku od divokého typu.

Následující dvě tabulky vysvětlují, jak byly vypočítány podíly postranních řetězců.

• · ··· ·

Tabulka 7

143-59A (měření 1)	143-59A (měření 2)
Název píku	Plocha píku	Podíl součtu [%1	Plocha píku	Podíl součtu [%]	Průměrná hodnota podílu plochy
	A2	B2	C2	D2	E2
DP6	577122	4,5	690167	5,08	4,79
DP7	504371	3,93	544770	4,01	3,97
DP8	341520	2,66	377170	2,77	2,72
DP9	387706	3,02	462686	3,40	3,21
DP 10	511664	3,99	602911	4,43	4,21
DP 11	684394	5,34	776228	5,71	5,52
DP 12	884346	6,90	976001	7,18	7,04
DP 13	1038389	8,10	1138027	8,37	8,23
DP 14	1080589	8,43	1175544	8,65	8,54
DP 15	1046585	8,16	1144404	8,42	8,29
DP 16	977127	7,62	1016555	7,48	7,55
DP 17	850092	6,63	881777	6,49	6,56
DP 18	720854	5,62	739080	5,44	5,53
DP 19	626277	4,88	627135	4,61	4,75
DP20	526159	4,10	522122	3,84	3,97
DP21	439356	3,43	431106	3,17	3,30
DP 22	354956	2,77	336907	2,48	2,62
DP23	281320	2,19	266412	1,96	2,08
DP24	224165	175	200219	1,47	1,61
DP 25	176641	1,38	169596	1,25	1,31
DP 26	152651	1,19	145821	1,07	1,13
DP 27	153046	1,19	123171	0,91	1,05
DP 28	117125	0,91	103599	0,76	0,84
DP29	92294	0,72	85067	0,63	0,67
DP 30	73885	0,58	59729	0,44	0,51
	ΣΑ2 12822634		ΣΟ2 13596204
součet	100,00	100,00	100,00

Plochy píku ve sloupcích A1, A2, C1 a C2 byly stanoveny s použitím aplikačního programu Al 450, verze 3.31 od výrobce Dionex.

·· ···· • ·

99

Tabulka 8

143-WT (měření 1)	143-WT (měření 2)
Název píku	Plocha píku	Podíl součtu t%]	Plocha píku	Podíl součtu [%1	Průměrná hodnota podílu plochy
	A2	B2	C2	D2	E2
DP6	123190	1,75	160046	1,68	1,72
DP7	95526	1,36	137396	1,45	1,40
DP8	87365	1,24	126639	1,33	1,29
DP9	158742	2,26	210845	2,22	2,24
DP 10	308544	4,39	382957	4,03	4,21
DP 11	465107	6,61	581774	6,12	6,36
DP 12	574882	8,17	721814	7,59	7,88
DP 13	634154	9,01	796824	8,38	8,70
DP 14	633566	9,01	798684	8,40	8,70
DP 15	594327	8,45	766484	8,06	8,25
DP 16	537537	7,64	699141	7,35	7,50
DP 17	470522	6,69	609229	6,41	6,55
DP 18	403081	5,73	539584	5,67	5,70
DP 19	352504	5,01	486633	5,12	5,06
DP 20	313708	4,46	432720	4,55	4,51
DP21	265289	3,77	385358	4,05	3,91
DP 22	211722	3,01	323248	3,40	3,20
DP 23	179015	2,54	274938	2,89	2,72
DP24	148758	2,11	227219	2,39	2,25
DP 25	119135	1,69	197839	2,08	1,89
DP 26	103902	1,48	177493	1,87	1,67
DP27	88686	1,26	147919	1,56	1,41
DP28	67024	0,95	131325	1,38	1,17
DP29	61086	0,87	104515	1,10	0,98
DP 30	37850	0,54	87704	0,92	0,73
	ΣΑ1 7035222		Σ C 1 9508328
součet	100,00	100,00	100,00

SEKVENČNÍ PROTOKOL <110> PlantTec Biotechnologie GmbH

Max-Planck-Gesellschaft zur Fórderung der Wissensc <120> Molekuly nukleových kyselin kódující větvicí enzym z bakterie

Neisseria a způsoby výroby α-l,6-rozvětvených a-1,4-glukanů rodu <130> C 1434 PCT <140>

<141>

<160> 34 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 2475 <212> DNA <213> Neisseria denitrificans <220>

<221> CDS <222> (170)..(2458) <400> 1 actgtatgcc gtgcagctgg aaaacctgct gggcgtacgc gacaacctca atattcccgg60 cgtggccgaa ggctatccga actgggcgcg caaaatgccg cagcctctgg aagcctttgc120 ccgccacccg caaatgggca agcagcttgc catgatggga gacatccgc atg aac ega178

Met Asn Arg

aac ege

cat

atc

ega

ege

ggc

tac

cac

ccg

gaa

gcc

gga

gaa

ege

caa

226

Asn Arg

His

Ile

Arg

Gly

Tyr

His

Pro

Glu

Ala

Gly

Glu

Arg

Gin

5

10

15

atc

gac

agc

ctg

ttt

gcc

acc

cac

agc

gat

ccg

ttt

gcc

tat

274

Ile

Asp

Ser

Leu

Phe

Ala

Thr

His

Ser

Asp

Pro

Phe

Ala

Tyr

25 30 35 • · ···· ·· ♦ · <· • · φ ···· · « · » · · ···· · t \a · · · · ·· ··· · • · · · ···« ♦ ·

··

• · gtg Val

Λ · cgc Arg

• · gtg Val 50

• · ctg Leu

• · fl 322

ctt Leu

ggg Gly

cgg Arg

cat His

cgt Arg 40

gtc Val

aac Asn

gac Asp

gaa Glu

cgc Arg 45

gaa Glu

gcc Ala

cgt

ccc

gac

gcg

cac

atc

gac

atc

gac

cgc

cac

aca

ggc

gca

370

Arg

Pro

Asp

Ala

His

Ile

Asp

Ile

Asp

Arg

His

Thr

Gly

Ala

55

60

65

gtc

atc

atg

ccg

tet

gaa

aaa

atc

gac

gag

cgc

ggc

ctg

ttt

gcc

418

Val

Ile

Met

Pro

Ser

Glu

Lys

Ile

Asp

Glu

Arg

Gly

Leu

Phe

Ala

70

75

80

gta

ttg

ccc

gaa

cac

gcg

ccc

gac

tac

gcc

ctg

gtg

aca

tac

cac

466

Val

Leu

Pro

Glu

His

Ala

Pro

Asp

Tyr

Ala

Leu

Val

Thr

Tyr

His

85

90

95

gag

ggc

gaa

gcc

gta

cgc

gaa

gat

gac

tac

cgc

ttc

ggc

age

514

Glu

Gly

Glu

Ala

Val

Arg

Glu

Asp

Tyr

Arg

Phe

Gly

Ser

100

105

110

115

gcg

ctg

caa

cat

acc

gat

gcc

tgg

ctg

ggc

gaa

ggc

acg

cac

ctg

562

Ala

Leu

Gin

His

Thr

Asp

Ala

Trp

Leu

Gly

Glu

Gly

Thr

His

Leu

120

125

130

cgc

cct

tat

gaa

acg

ctg

ggc

gca

cat

ttc

gcc

gaa

atg

gac

ggc

gta

610

Arg

Pro

Tyr

Glu

Thr

Leu

Gly

Ala

His

Phe

Ala

Glu

Met

Asp

Gly

Val

135

140

145

tcc

ggc

gtg

cgc

ttt

gcc

gtt

tgg

gcg

ccc

aac

gcg

cgg

gta

tcg

658

Ser

Gly

Val

Arg

Phe

Ala

Val

Trp

Ala

Pro

Asn

Ala

Arg

Val

Ser

150

155

160

gtc

atc

ggc

gaa

ttc

aac

ggc

tgg

gac

age

cgc

cat

gcc

atg

cgt

706

Val

Ile

Gly

Glu

Phe

Asn

Gly

Trp

Asp

Ser

Arg

His

Ala

Met

Arg

165

170

175

ccg

cac

aca

ggc

aac

ggc

ctg

tgg

gac

atc

ttt

atc

ccc

ggc

gtc

ggc

754

Pro

His

Thr

Gly

Asn

Gly

Leu

Trp

Asp

Ile

Phe

Ile

Pro

Gly

Val

Gly

180

185

190

195

ctc aac gcg ctg tat aaa ttc tcc gta ctc gat gcc aac ggc aac atc 802

9 999 9

99 99

Leu

Asn

Ala

Leu

Tyr 200

Lys

Phe

Ser

Val

Leu 205

Asp

• · • · • ♦ 9 9 b * Ala

• • • « · • · Asn

• • • 9 9 9 ¹ Gly

• · • · · • 9 9 9 9 99 Asn 210

• · » • ·. · • · *· Ile

• · · • o • · • · • · 9

cgc

gaa

aaa

gcc

gac

ccc

tac

gca

ttc

ggc

gcg

gag

ctg

cgc

ccg

acc

850

Arg

Glu

Lys

Ala

Asp

Pro

Tyr

Ala

Phe

Gly

Ala

Glu

Leu

Arg

Pro

Thr

215

220

225

acc

gca

tcc

gtg

cgc

ggc

ttg

ccg

gcc

aaa

gcc

gaa

gcg

ccc

get

898

Thr

Ala

Ser

Val

Arg

Gly

Leu

Pro

Ala

Lys

Ala

Glu

Ala

Pro

Ala

230

235

240

ttc

cgc

gcc

aac

tcc

gtg

gaa

gcg

ccc

atc

age

att

tac

gaa

946

Phe

Arg

Ala

Asn

Ser

Val

Glu

Ala

Pro

Ile

Ser

Ile

Tyr

Glu

245

250

255

gtc

cat

ctc

ggc

tcg

tgg

cgg

cgc

aat

ccc

gaa

aac

tac

tgg

ctc

994

Val

His

Leu

Gly

Ser

Trp

Arg

Asn

Pro

Glu

Asn

Tyr

Trp

Leu

260

265

270

275

acc

tac

acg

cag

ctg

gcc

gac

gaa

ttg

gtg

aac

tat

gta

aaa

gac

atg

1042

Thr

Tyr

Thr

Gin

Leu

Ala

Asp

Glu

Leu

Val

Asn

Tyr

Val

Lys

Asp

Met

280

285

290

ggc

ttc

acc

cac

atc

gag

ctg

ccc

ttg

tcc

gaa

tat

ccg

ttc

gac

1090

Gly

Phe

Thr

His

Ile

Glu

Leu

Pro

Leu

Ser

Glu

Tyr

Pro

Phe

Asp

295

300

305

ggc

tca

tgg

ggc

tac

caa

gcc

acc

ggc

ctg

tat

gca

ccg

acc

age

cgc

1138

Gly

Ser

Trp

Gly

Tyr

Gin

Ala

Thr

Gly

Leu

Tyr

Ala

Pro

Thr

Ser

Arg

310

315

320

ttc

ggc

tcg

ccc

gat

gag

ctg

aaa

gcc

ctg

att

gac

gcc

cac

gcc

1186

Phe

Gly

Ser

Pro

Asp

Glu

Leu

Lys

Ala

Leu

Ile

Asp

Ala

His

Ala

325

330

335

gcc

ggc

atc

age

gtg

att

ctc

gac

tgg

gta

gcg

ggg

cac

ttc

ccc

acc

1234

Ala

Gly

Ile

Ser

Val

Ile

Leu

Asp

Trp

Val

Ala

Gly

His

Phe

Pro

Thr

340

345

350

355

gac

cac

ggc

ctc

aac

acc

ttc

gac

ggc

acg

gcg

ctt

tac

gaa

cac

1282

Asp

His

Gly

Leu

Asn

Thr

Phe

Asp

Gly

Thr

Ala

Leu

Tyr

Glu

His

360 365

370

9999 999 · 9 9 9 9 I «·9 • 9 9 9999 · ·9

9 999 99 999 99

9999 9999 999 #9 99 99 99 99999

gcc Ala

gac Asp

ccg Pro

cgc Arg 375

gaa Glu

ggc Gly

tac Tyr

cat His

cag Gin 380

gat Asp

tgg Trp

aac Asn

acg Thr

ctg Leu 385

att Ile

tac Tyr

1330

aac

ttc

ggc

cgc

aac

gaa

gtc

aaa

aac

ttc

ctg

cag

ggc

aac

gcg

ctc

1378

Asn

Phe

Gly

Arg

Asn

Glu

Val

Lys

Asn

Phe

Leu

Gin

Gly

Asn

Ala

Leu

390

395

400

tac

tgg

att

gag

cgt

ttc

ggc

ttc

gac

ggc

atc

cgc

gtg

gac

gcc

gtg

1426

Tyr

Trp

Ile

Glu

Arg

Phe

Gly

Phe

Asp

Gly

Ile

Arg

Val

Asp

Ala

Val

405

410

415

gcc

tcg

atg

att

tac

cgc

aac

tac

tcg

cgc

aaa

gac

ggc

gag

tgg

att

1474

Ala

Ser

Met

Ile

Tyr

Arg

Asn

Tyr

Ser

Arg

Lys

Asp

Gly

Glu

Trp

Ile

420

425

430

435

ccc

aac

cgc

tac

ggc

age

gaa

aat

ctg

gaa

gcc

atc

gcc

ttt

ttg

1522

Pro

Asn

Arg

Tyr

Gly

Ser

Glu

Asn

Leu

Glu

Ala

Ile

Ala

Phe

Leu

440

445

450

cgc

caa

acc

aat

gcc

gtc

tta

aaa

age

gaa

aca

ccc

ggc

gcc

ggc

tcg

1570

Arg

Gin

Thr

Asn

Ala

Val

Leu

Lys

Ser

Glu

Thr

Pro

Gly

Ala

Gly

Ser

455

460

465

ttt

gcc

gaa

tcg

act

tcc

ttt

gcc

gac

gta

acc

cgc

gaa

gcc

ggc

1618

Phe

Ala

Glu

Ser

Thr

Ser

Phe

Ala

Asp

Val

Thr

Arg

Glu

Ala

Gly

470

475

480

ctg

aac

ttc

gat

ttc

aaa

tgg

aat

atg

ggc

tgg

atg

aac

gac

acc

ctg

1666

Leu

Asn

Phe

Asp

Phe

Lys

Trp

Asn

Met

Gly

Trp

Met

Asn

Asp

Thr

Leu

485

490

495

cgc

tat

atg

cag

gaa

gac

ccc

gtc

cac

cgc

aaa

tac

cac

ggc

aaa

1714

Arg

Tyr

Met

Gin

Glu

Asp

Pro

Val

His

Arg

Lys

Tyr

His

Gly

Lys

500

505

510

515

atg

aca

ttc

ggc

atg

tac

caa

tac

age

gaa

aac

ttc

gtt

ctg

ccc

1762

Met

Thr

Phe

Gly

Met

Tyr

Gin

Tyr

Ser

Glu

Asn

Phe

Val

Leu

Pro

520

525

530

ctg

tcg

cac

gac

gaa

gtg

gta

cac

ggc

aaa

cgc

tcg

ctg

ggc

aaa

1810

Leu

Ser

His

Asp 535

Glu

Val

His

Gly 540

Lys

Arg

Ser

Leu

Leu 545

Gly

Lys

atg

ccg

ggc

gac

tgc

tgg

cag

ttt

gcc

aac

ctg

cgc

gcc

tat

tac

1858

Met

Pro

Gly

Asp

Cys

Trp

Gin

Phe

Ala

Asn

Leu

Arg

Ala

Tyr

550

555

560

ggc

ttt

atg

tac

ggc

ttc

ccc

ggc

aaa

ctc

cta

ttt

atg

ggc

aac

1906

Gly

Phe

Met

Tyr

Gly

Phe

Pro

Gly

Lys

Leu

Phe

Met

Gly

Asn

565

570

575

gaa

ttt

gcc

caa

ggc

cgc

gag

tgg

aat

tat

cag

gaa

gga

ctg

gat

tgg

1954

Glu

Phe

Ala

Gin

Gly

Arg

Glu

Trp

Asn

Tyr

Gin

Glu

Gly

Leu

Asp

Trp

580

585

590

595

cat

ctg

ctc

gac

gaa

gcg

ggc

tgg

cac

aaa

ggc

gtg

cag

gat

tat

2002

His

Leu

Asp

Glu

Ala

Gly

Trp

His

Lys

Gly

Val

Gin

Asp

Tyr

600

605

610

gta

cgc

gac

ctg

aac

cac

atc

tac

acc

gcc

cac

gcc

ccg

ctc

tac

cag

2050

Val

Arg

Asp

Leu

Asn

His

Ile

Tyr

Thr

Ala

His

Ala

Pro

Leu

Tyr

Gin

615

620

625

ctc

gac

cag

ccc

gag

ggc

ttt

gaa

tgg

ctg

gtg

gcc

gac

age

2098

Leu

Asp

Gin

Pro

Glu

Gly

Phe

Glu

Trp

Leu

Val

Ala

Asp

Ser

630

635

640

gac

aat

tcg

gta

ttc

gta

ttc

gag

cgc

gac

cgc

gca

ggc

aac

cgc

2146

Asp

Asn

Ser

Val

Phe

Val

Phe

Glu

Arg

Asp

Arg

Ala

Gly

Asn

Arg

645

650

655

atc

gtc

atc

age

aac

ttt

acc

ccg

gtg

cgc

gaa

cac

tac

cgc

2194

Ile

Val

Ile

Ser

Asn

Phe

Thr

Pro

Val

Arg

Glu

His

Tyr

Arg

660

665

67 0

675

ttc

ggc

gtc

aac

gcg

ccc

ggc

cgc

tat

acc

gaa

atc

ctg

aat

tcc

gac

2242

Phe

Gly

Val

Asn

Ala

Pro

Gly

Arg

Tyr

Thr

Glu

Ile

Leu

Asn

Ser

Asp

680

685

690

cgc

acg

cag

tat

caa

ggc

age

ggc

atc

gca

aac

ggc

gcg

gac

atc

acg

2290

Arg

Thr

Gin

Tyr

Gin

Gly

Ser

Gly

Ile

Ala

Asn

Gly

Ala

Asp

Ile

Thr

695

700

705

gcg Ala

gaa Glu

aac Asn 710

gtg Val

cct Pro

tcg Ser

cac His

ggc Gly 715

aaa Lys

gcg Ala

cag Gin

tcg Ser

ctg Leu 720

agc Ser

ctg Leu

acc Thr

2338

ctg

ccg

ctg

gcc

acg

gtc

tat

ctg

tat

cag

aaa

gcc

gcg

ccc

gca

2386

Leu

Pro

Leu

Ala

Thr

Val

Tyr

Leu

Tyr

Gin

Lys

Ala

Pro

Ala

725

730

735

acg

gaa

att

cag

acg

gcc

ttg

cgc

gcc

gac

aag

cag

ccg

gcg

gta

aaa

2434

Thr

Glu

Ile

Gin

Thr

Ala

Leu

Arg

Ala

Asp

Lys

Gin

Pro

Ala

Val

Lys

740

745

750

755

gat

aag

cag

gca

aaa

gcc

aaa

taa

agcggcacca tactgcc

2475

Asp

Lys

Gin

Ala

Lys

Ala

Lys

760 <210> 2 <211> 762 <212> PRT <213> Neisseria denitrificans

<400> 2

Asn

Arg His 5

Ile

Arg Arg

Gly 10

Tyr

His

Pro

Glu

Ala 15

Gly

Met 1

Asn

Arg

Glu

Arg

Gin

Ile

Asp

Ser

Leu

Phe

Ala

Thr

His

Ser

Asp

Pro

20

25

30

Phe

Ala

Tyr

Leu

Gly

Arg

His

Arg

Val

Asn

Asp

Glu

Arg

Glu

Ala

Val

35

40

45

Arg

Val

Leu

Arg

Pro

Asp

Ala

His

Ile

Asp

Ile

Asp

Arg

His

50

55

60

Thr

Gly

Ala

Val

Ile

Met

Pro

Ser

Glu

Lys

Ile

Asp

Glu

Arg

Gly

Leu

65

70

75

80

Phe

Ala

Val

Leu

Pro

Glu

His

Ala

Pro

Asp

Tyr

Ala

Leu

Val

	Thr	Tyr	His	Glu 100	Gly	Glu	Ala	Ala
	Phe	Gly	Ser	Ala	Leu	Gin	His	Thr
			115					120
-	Thr	His	Leu	Arg	Pro	Tyr	Glu	Thr
		130					135
	Asp	Gly	Val	Ser	Gly	Val	Arg	Phe
-·	145					150
*	Arg	Val	Ser	Val	Ile	Gly	Glu	Phe
					165
	Ala	Met	Arg	Pro	His	Thr	Gly	Asn
				180
	Gly	Val	Gly	Leu	Asn	Ala	Leu	Tyr
			195					200
	Gly	Asn	Ile	Arg	Glu	Lys	Ala	Asp
		210					215
	Arg	Pro	Thr	Thr	Ala	Ser	Val	Val
	225					230
	Ala	Pro	Ala	Phe	Arg	Arg	Arg	Ala
-					245
	Ile	Tyr	Glu	Val	His	Leu	Gly	Ser
				260
	Tyr	Trp	Leu	Thr	Tyr	Thr	Gin	Leu
			275					280
	Lys	Asp	Met	Gly	Phe	Thr	His	Ile
		290					295
	Pro	Phe	Asp	Gly	Ser	Trp	Gly	Tyr
	305					310

			• * • ·	···· •	·· •	• · · · · • · · · · ··
			• ·	9	•	• · · · · ·
			• ·	•	• ·	9 9 9 9 9 · 9
			Φ 9	• ·	• »	99 99 999
Val	Arg	Glu	Glu	Asp	Asp	Tyr Arg
105					110
Asp	Ala	Trp	Leu	Leu	Gly	Glu Gly
				125
Leu	Gly	Ala	His	Phe	Ala	Glu Met
			140
Ala	Val	Trp	Ala	Pro	Asn	Ala Arg
		155				160

Asn Gly Trp Asp Ser Arg Arg His

170	175
Gly 185	Leu	Trp	Asp	Ile	Phe 190	Ile	Pro
Lys	Phe	Ser	Val	Leu 205	Asp	Ala	Asn
Pro	Tyr	Ala	Phe 220	Gly	Ala	Glu	Leu
Arg	Gly	Leu 235	Pro	Ala	Lys	Ala	Glu 240
Asn	Ser 250	Val	Glu	Ala	Pro	Ile 255	Ser
Trp 265	Arg	Arg	Asn	Pro	Glu 270	Asn	Asn
Ala	Asp	Glu	Leu	Val 285	Asn	Tyr	Val
Glu	Leu	Leu	Pro 300	Leu	Ser	Glu	Tyr
Gin	Ala	Thr	Gly	Leu	Tyr	Ala	Pro

315

320

	Thr	Ser	Arg	Phe	Gly 325	Ser	Pro	Asp
	Ala	His	Ala	Ala	Gly	Ile	Ser	Val
				340
	Phe	Pro	Thr	Asp	Asp	His	Gly	Leu
			355					360
	Tyr	Glu	His	Ala	Asp	Pro	Arg	Glu
•		370					375
*	Leu	Ile	Tyr	Asn	Phe	Gly	Arg	Asn
	385					390
	Asn	Ala	Leu	Tyr	Trp	Ile	Glu	Arg
					405
	Asp	Ala	Val	Ala	Ser	Met	Ile	Tyr
				420
	Glu	Trp	Ile	Pro	Asn	Arg	Tyr	Gly
			435					440
	Ala	Phe	Leu	Arg	Gin	Thr	Asn	Ala
		450					455
	Ala	Gly	Ser	Phe	Ala	Glu	Glu	Ser
-	465					470
9	Glu	Ala	Gly	Leu	Asn	Phe	Asp	Phe
					485
	Asp	Thr	Leu	Arg	Tyr	Met	Gin	Glu
				500
	His	Gly	Lys	Met	Thr	Phe	Gly	Met
			515					520
	Val	Leu	Pro	Leu	Ser	His	Asp	Glu
		530					535

Glu	Leu 330	Lys	• · • · • » • · • · ♦ · Ala	• · · · • • • · • · Leu	9 · • • • · • • · Ile	• · • · • · · • · • · • · Asp 335	• « · Φ • · • · · · • · · • · · Ala
Ile 345	Leu	Asp	Trp	Val	Ala 350	Gly	His
Asn	Thr	Phe	Asp	Gly 365	Thr	Ala	Leu
Gly	Tyr	His	Gin 380	Asp	Trp	Asn	Thr
Glu	Val	Lys 395	Asn	Phe	Leu	Gin	Gly 400
Phe	Gly 410	Phe	Asp	Gly	Ile	Arg 415	Val
Arg 425	Asn	Tyr	Ser	Arg	Lys 430	Asp	Gly
Gly	Ser	Glu	Asn	Leu 445	Glu	Ala	Ile
Val	Leu	Lys	Ser 460	Glu	Thr	Pro	Gly
Thr	Ser	Phe 475	Ala	Asp	Val	Thr	Arg 480
Lys	Trp 490	Asn	Met	Gly	Trp	Met 495	Asn
Asp 505	Pro	Val	His	Arg	Lys 510	Tyr	His
Met	Tyr	Gin	Tyr	Ser 525	Glu	Asn	Phe
Val	Val	His	Gly 540	Lys	Arg	Ser	Leu

» »

Leu Gly 545

Lys

Met

Pro

Gly 550

Asp

Cys

Trp

Gin

Gin 555

Phe

Ala

Asn

Leu

Arg 560

Ala

Tyr

Gly

Phe

Met

Tyr

Gly

Phe

Pro

Gly

Lys

Leu

Phe

565

570

575

Met

Gly

Asn

Glu

Phe

Ala

Gin

Gly

Arg

Glu

Trp

Asn

Tyr

Gin

Glu

Gly

580

585

590

Leu

Asp

Trp

His

Leu

Asp

Glu

Ala

Gly

Trp

His

Lys

Gly

Val

595

600

605

Gin

Asp

Tyr

Val

Arg

Asp

Leu

Asn

His

Ile

Tyr

Thr

Ala

His

Ala

Pro

610

615

620

Leu

Tyr

Gin

Leu

Asp

Gin

Pro

Glu

Gly

Phe

Glu

Trp

Leu

Val

Ala

625

630

635

640

Asp

Ser

Asp

Asn

Ser

Val

Phe

Val

Phe

Glu

Arg

Asp

Arg

Ala

645

650

655

Gly

Asn

Arg

Ile

Val

Ile

Ser

Asn

Phe

Thr

Pro

Val

Arg

Glu

660

665

670

His

Tyr

Arg

Phe

Gly

Val

Asn

Ala

Pro

Gly

Arg

Tyr

Thr

Glu

Ile

Leu

675

680

685

Asn

Ser

Asp

Arg

Thr

Gin

Tyr

Gin

Gly

Ser

Gly

Ile

Ala

Asn

Gly

Ala

690

695

700

Asp

Ile

Thr

Ala

Glu

Asn

Val

Pro

Ser

His

Gly

Lys

Ala

Gin

Ser

Leu

705

710

715

720

Ser

Leu

Thr

Leu

Pro

Leu

Ala

Thr

Val

Tyr

Leu

Tyr

Gin

Lys

Ala

725

730

735

Ala

Pro

Ala

Thr

Glu

Ile

Gin

Thr

Ala

Leu

Arg

Ala

Asp

Lys

Gin

Pro

740

745

750

Ala Val Lys Asp Lys Gin Ala Lys Ala Lys

755 760

99 99 • 44·· 4 · ··· ······ « · ·φ· 4 4 ·4·* ···· ······ • 9 44 ·· 9 999 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Neisseria denitrificans <400> 3

Met Asn Arg Asn Xaa His

5 <210> 4 <211> 2914 <212> DNA <213> Neisseria polysaccharea <220>

<221> CDS <222> (957)..(2867) <400> 4

gagttttgcg	ttcccgaacc	gaacgtgatg	cttgagccga	acacctgtcc	ggcaaggcgg	60
ctgaccgccc	ccttttgccc	catcgacatc	gtaacaatcg	gtttggtggc	aagctctttc	120
gctttgagcg	tggcagaaag	caaagtcagc	acgtcttccg	cgctttgcgg	catcaccgca	180
attttgcaga	tgtccgcgcc	gcagtcctcc	atctgtttca	gacggcatac	gatttcttct	240
tgcggcggcg	tgcggtgaaa	ctcatgattg	cagagcaggg	cggcgatgcc	gtttttttga	300
gcatgcgcca	cggcgcgccg	gacggcggtt	tcgccggaaa	aaagctcgat	atcgataatg	360
tcgggcaggc	ggctttcaat	cagcgagtcg	agcagttcaa	aataataatc	gtccgaacac	420
gggaacgagc	cgccttcgcc	atgccgtctg	aacgtaaaca	gcagcggctt	gtcgggcagc	480
gcgtcgcgga	cggtctgcgt	gtggcgcaat	acttcgccga	tgctgcccgc	gcattccaaa	540

aaatcggcgc ggaactcgac gatatcgaag ggcaggtttt tgatttggtc aagtacggcg 600

4444 44 44 ·· ·

4 4444 4 · 44

4 4444 *4 ·

4 444 44 444 * *

4444 4444 4* ·

44 4» 44 4« «*4

gaaagtacgg	cggcatcgcg	ggcgacaagc	ggcacggcga	ttttggtgcg	tccgcttccg	660
ataacggtgt	ttttgacggt	caggctggtg	tgcatggcgg	ttgttgcggc	tgaaaggaac	720
ggtaaagacg	caattatagc	aaaggcacag	gcaatgtttc	agacggcatt	tctgtgcggc	780
cggcttgata	tgaatcaagc	agcatccgca	tatcggaatg	cagacttggc	acaagccctg	840
tcttttctag	tcagtccgca	gttcttgcag	tatgattgca	cgacacgccc	tacacggcat	900
ttgcaggata	cggcggcaga	ccgccggtcg	gaaacttcag	aatcggagca	ggcatc atg Met	959

ttg

acc

ccc

acg

cag

caa

gtc

ggt

ttg

att

tta

cag

tac

ctc

aaa

aca

1007

Leu

Thr

Pro

Thr

Gin

Val

Gly

Leu

Ile

Leu

Gin

Tyr

Leu

Lys

Thr

5

10

15

cgc

atc

ttg

gac

atc

tac

acg

ccc

gaa

cag

cgc

gcc

ggc

atc

gaa

aaa

1055

Arg

Ile

Leu

Asp

Ile

Tyr

Thr

Pro

Glu

Gin

Arg

Ala

Gly

Ile

Glu

Lys

20

25

30

tcc

gaa

gac

tgg

cgg

cag

ttt

tcg

cgc

atg

gat

acg

cat

ttc

ccc

1103

Ser

Glu

Asp

Trp

Arg

Gin

Phe

Ser

Arg

Met

Asp

Thr

His

Phe

Pro

35

40

45

aaa

ctg

atg

aac

gaa

ctc

gac

age

gtg

tac

ggc

aac

gaa

gcc

ctg

1151

Lys

Leu

Met

Asn

Glu

Leu

Asp

Ser

Val

Tyr

Gly

Asn

Glu

Ala

Leu

50

55

60

65

ctg

cct

atg

ctg

gaa

atg

ctg

gcg

cag

gca

tgg

caa

age

tat

tcc

1199

Leu

Pro

Met

Leu

Glu

Met

Leu

Ala

Gin

Ala

Trp

Gin

Ser

Tyr

Ser

70

75

80

caa

cgc

aac

tea

tcc

tta

aaa

gat

atc

gat

atc

gcg

cgc

gaa

aac

1247

Gin

Arg

Asn

Ser

Leu

Lys

Asp

Ile

Asp

Ile

Ala

Arg

Glu

Asn

85

90

95

ccc

gat

tgg

att

ttg

tcc

aac

aaa

caa

gtc

ggc

gtg

tgc

tac

gtt

1295

Pro

Asp

Trp

Ile

Leu

Ser

Asn

Lys

Gin

Val

Gly

Val

Cys

Tyr

Val

100 105

110 • · ♦>····♦ • · φ φφφφ φ*

φ φ φφ

Φ • Φ

Φ Φ ΦΦ

Φ · ♦ *

• < « φ *

gat

ttg

ttt

gcc

ggc

gat

ttg

aag

ggc

ttg

aaa

gat

aaa

att

cct

tat

1343

Asp

Leu

Phe

Ala

Gly

Asp

Leu

Lys

Gly

Leu

Lys

Asp

Lys

Ile

Pro

Tyr

115

120

125

ttt

caa

gag

ctt

ggt

ttg

act

tat

ctg

cac

ctg

atg

ccg

ctg

ttt

aaa

1391

Phe

Gin

Glu

Leu

Gly

Leu

Thr

Tyr

Leu

His

Leu

Met

Pro

Leu

Phe

Lys

130

135

140

145

tgc

cct

gaa

ggc

aaa

age

gac

ggc

tat

gcg

gtc

age

tac

ege

1439

Cys

Pro

Glu

Gly

Lys

Ser

Asp

Gly

Tyr

Ala

Val

Ser

Tyr

Arg

150

155

160

gat

gtc

aat

ccg

gca

ctg

ggc

aca

ata

ggc

gac

ttg

ege

gaa

gtc

att

1487

Asp

Val

Asn

Pro

Ala

Leu

Gly

Thr

Ile

Gly

Asp

Leu

Arg

Glu

Val

Ile

165

170

175

get

gcg

ctg

cac

gaa

gcc

ggc

att

tcc

gcc

gtc

gat

ttt

atc

ttc

1535

Ala

Leu

His

Glu

Ala

Gly

Ile

Ser

Ala

Val

Asp

Phe

Ile

Phe

180

185

190

aac

cac

acc

tcc

aac

gaa

cac

gaa

tgg

gcg

caa

ege

tgc

gcc

ggc

1583

Asn

His

Thr

Ser

Asn

Glu

His

Glu

Trp

Ala

Gin

Arg

Cys

Ala

Gly

195

200

205

gac

ccg

ctt

ttc

gac

aat

ttc

tac

tat

att

ttc

CCC

gac

ege

cgg

atg

1631

Asp

Pro

Leu

Phe

Asp

Asn

Phe

Tyr

Ile

Phe

Pro

Asp

Arg

Met

210

215

220

225

CCC

gac

caa

tac

gac

ege

acc

ctg

ege

gaa

atc

ttc

ccc

gac

cag

cac

1679

Pro

Asp

Gin

Tyr

Asp

Arg

Thr

Leu

Arg

Glu

Ile

Phe

Pro

Asp

Gin

His

230

235

240

ccg

ggc

ttc

tcg

caa

ctg

gaa

gac

gga

ege

tgg

gtg

tgg

acg

acc

1727

Pro

Gly

Phe

Ser

Gin

Leu

Glu

Asp

Gly

Arg

Trp

Val

Trp

Thr

245

250

255

ttc

aat

tcc

ttc

caa

tgg

gac

ttg

aat

tac

age

aac

ccg

tgg

gta

ttc

1775

Phe

Asn

Ser

Phe

Gin

Trp

Asp

Leu

Asn

Tyr

Ser

Asn

Pro

Trp

Val

Phe

260

265

270

ege

gca

atg

gcg

ggc

gaa

atg

ctg

ttc

ctt

gcc

aac

ttg

ggc

gtt

gac

1823

φ • »

Φ· ·ΦΦ«

Arg Ala 275

Met

Ala

Gly

Glu

Met 280

Leu

Phe

Leu

Ala Asn 285

Leu

Gly

Val

Asp

atc

ctg

cgt

atg

gat

gcg

gtt

gcc

ttt

att

tgg

aaa

caa

atg

ggg

aca

1871

Ile

Leu

Arg

Met

Asp

Ala

Val

Ala

Phe

Ile

Trp

Lys

Gin

Met

Gly

Thr

290

295

300

305

agc

tgc

gaa

aac

ctg

ccg

cag

gcg

cac

gcc

ctc

atc

cgc

gcg

ttc

aat

1919

Ser

Cys

Glu

Asn

Leu

Pro

Gin

Ala

His

Ala

Leu

Ile

Arg

Ala

Phe

Asn

310

315

320

gcc

gtt

atg

cgt

att

gcc

gcg

ccc

gcc

gtg

ttc

aaa

tcc

gaa

gcc

1967

Ala

Val

Met

Arg

Ile

Ala

Pro

Ala

Val

Phe

Lys

Ser

Glu

Ala

325

330

335

atc

gtc

cac

ccc

gac

caa

gtc

caa

tac

atc

ggg

cag

gac

gaa

tgc

2015

Ile

Val

His

Pro

Asp

Gin

Val

Gin

Tyr

Ile

Gly

Gin

Asp

Glu

Cys

340

345

350

caa

atc

ggt

tac

aac

ccc

ctg

caa

atg

gca

ttg

tgg

aac

acc

ctt

2063

Gin

Ile

Gly

Tyr

Asn

Pro

Leu

Gin

Met

Ala

Leu

Trp

Asn

Thr

Leu

355

360

365

gcc

acg

cgc

gaa

gtc

aac

ctg

ctc

cat

cag

gcg

ctg

acc

tac

cgc

cac

2111

Ala

Thr

Arg

Glu

Val

Asn

Leu

His

Gin

Ala

Leu

Thr

Tyr

Arg

His

370

375

380

385

aac

ctg

ccc

gag

cat

acc

gcc

tgg

gtc

aac

tac

gtc

cgc

agc

cac

gac

2159

Asn

Leu

Pro

Glu

His

Thr

Ala

Trp

Val

Asn

Tyr

Val

Arg

Ser

His

Asp

390

395

400

gac

atc

ggc

tgg

acg

ttt

gcc

gat

gaa

gac

gcg

gca

tat

ctg

ggc

ata

2207

Asp

Ile

Gly

Trp

Thr

Phe

Ala

Asp

Glu

Asp

Ala

Tyr

Leu

Gly

Ile

405

410

415

agc

ggc

tac

gac

cac

cgc

caa

ttc

ctc

aac

cgc

ttc

gtc

aac

cgt

2255

Ser

Gly

Tyr

Asp

His

Arg

Gin

Phe

Leu

Asn

Arg

Phe

Val

Asn

Arg

420

425

430

ttc

gac

ggc

agc

ttc

get

cgt

gg<=

gta

ccg

ttc

caa

tac

aac

cca

agc

2303

Phe

Asp

Gly

Ser

Phe

Ala

Arg

Gly

Val

Pro

Phe

Gin

Tyr

Asn

Pro

Ser

435 440 445

aca Thr 450

ggc Gly

gac Asp

tgc Cys

cgt Arg

gtc Val 455

agt Ser

ggt Gly

aca Thr

gcc Ala

gcg Ala 460

gca Ala

ttg Leu

gtc Val

ggc Gly

ttg Leu 465

2351

gcg

caa

gac

gat

ccc

cac

gcc

gtt

gac

cgc

atc

aaa

ctc

ttg

tac

agc

2399

Ala

Gin

Asp

Pro

His

Ala

Val

Asp

Arg

Ile

Lys

Leu

Tyr

Ser

470

475

480

att

gct

ttg

agt

acc

ggc

ggt

ctg

ccg

ctg

att

tac

cta

ggc

gac

gaa

2447

Ile

Ala

Leu

Ser

Thr

Gly

Leu

Pro

Leu

Ile

Tyr

Leu

Gly

Asp

Glu

485

490

495

gtg

ggt

acg

ctc

aat

gac

tgg

tcg

caa

gac

agc

aat

aag

agc

2495

Val

Gly

Thr

Leu

Asn

Asp

Trp

Ser

Gin

Asp

Ser

Asn

Lys

Ser

500

505

510

gac

agc

cgt

tgg

gcg

cac

cgt

ccg

cgc

tac

aac

gaa

gcc

ctg

tac

2543

Asp

Ser

Arg

Trp

Ala

His

Arg

Pro

Arg

Tyr

Asn

Glu

Ala

Leu

Tyr

515

520

525

gcg

caa

cgc

aac

gat

ccg

tcg

acc

gca

gcc

ggg

caa

atc

tat

cag

ggc

2591

Ala

Gin

Arg

Asn

Asp

Pro

Ser

Thr

Ala

Gly

Gin

Ile

Tyr

Gin

Gly

530

535

540

545

ttg

cgc

cat

atg

att

gcc

gtc

cgc

caa

agc

aat

ccg

cgc

ttc

gac

ggc

2639

Leu

Arg

His

Met

Ile

Ala

Val

Arg

Gin

Ser

Asn

Pro

Arg

Phe

Asp

Gly

550

555

560

ggc

agg

ctg

gtt

aca

ttc

aac

acc

aac

aag

cac

atc

ggc

tac

2687

Gly

Arg

Leu

Val

Thr

Phe

Asn

Thr

Asn

Lys

His

Ile

Gly

Tyr

565

570

575

atc

cgc

aac

aat

gcg

ctt

ttg

gca

ttc

ggt

aac

ttc

agc

gaa

tat

ccg

2735

Ile

Arg

Asn

Ala

Leu

Ala

Phe

Gly

Asn

Phe

Ser

Glu

Tyr

Pro

580

585

590

caa

acc

gtt

acc

gcg

cat

acc

ctg

caa

gcc

atg

ccc

ttc

aag

gcg

cac

2783

Gin

Thr

Val

Thr

Ala

His

Thr

Leu

Gin

Ala

Met

Pro

Phe

Lys

Ala

His

595

600

605

gac

ctc

atc

ggt

ggc

aaa

act

gtc

agc

ctg

aat

cag

gat

ttg

acg

ctt

2831

·« ····

Asp Leu Ile Gly Gly Lys Thr Val Ser Leu Asn Gin Asp Leu Thr Leu
610	615	62 0	625

cag	ccc tat	cag	gtc	atg	tgg	ctc	gaa	atc	gcc tga cgcacgcttc	2877
Gin	Pro Tyr	Gin	Val	Met	Trp	Leu	Glu	Ile	Ala
			630					635

ccaaatgccg tctgaaccgt ttcagacggc atttgcg

2914 <210> 5 <211> 636 <212> PRT <213> Neissería polysaccharea <400> 5

Met 1

Leu

Thr

Pro

Thr 5

Gin

Val

Gly

Leú 10

Ile

Leu

Gin

Tyr

Leu 15

Lys

Thr

Arg

Ile

Leu

Asp

Ile

Tyr

Thr

Pro

Glu

Gin

Arg

Ala

Gly

Ile

Glu

20

25

30

Lys

Ser

Glu

Asp

Trp

Arg

Gin

Phe

Ser

Arg

Met

Asp

Thr

His

Phe

35

40

45

Pro

Lys

Leu

Met

Asn

Glu

Leu

Asp

Ser

Val

Tyr

Gly

Asn

Glu

Ala

50

55

60

Leu

Pro

Met

Leu

Glu

Met

Leu

Ala

Gin

Ala

Trp

Gin

Ser

Tyr

65

70

75

80

Ser

Gin

Arg

Asn

Ser

Leu

Lys

Asp

Ile

Asp

Ile

Ala

Arg

Glu

Asn

85

90

95

Asn

Pro

Asp

Trp

Ile

Leu

Ser

Asn

Lys

Gin

Val

Gly

Val

Cys

Tyr

100

105

110

Val

Asp

Leu

Phe

Ala

Gly

Asp

Leu

Lys

Gly

Leu

Lys

Asp

Lys

Ile

Pro

115

120

125

Tyr

Phe

Gin

Glu

Leu

Gly

Leu

Thr

Tyr

Leu

His

Leu

Met

Pro

Leu

Phe

130

135

140 ·· ·♦♦·

Lys 145

Cys

Pro

Glu Gly

Lys 150

Ser

Asp

Gly Gly

Tyr 155

Ala

Val

Ser

Tyr 160

Arg

Asp

Val

Asn

Pro

Ala

Leu

Gly

Thr

Ile

Gly

Asp

Leu

Arg

Glu

Val

165

170

175

Ile

Ala

Leu

His

Glu

Ala

Gly

Ile

Ser

Ala

Val

Asp

Phe

Ile

180

185

190

Phe

Asn

His

Thr

Ser

Asn

Glu

His

Glu

Trp

Ala

Gin

Arg

Cys

Ala

195

200

205

Gly

Asp

Pro

Leu

Phe

Asp

Asn

Phe

Tyr

Ile

Phe

Pro

Asp

Arg

210

215

220

Met

Pro

Asp

Gin

Tyr

Asp

Arg

Thr

Leu

Arg

Glu

Ile

Phe

Pro

Asp

Gin

225

230

235

240

His

Pro

Gly

Phe

Ser

Gin

Leu

Glu

Asp

Gly

Arg

Trp

Val

Trp

Thr

245

250

255

Thr

Phe

Asn

Ser

Phe

Gin

Trp

Asp

Leu

Asn

Tyr

Ser

Asn

Pro

Trp

Val

260

265

270

Phe

Arg

Ala

Met

Ala

Gly

Glu

Met

Leu

Phe

Leu

Ala

Asn

Leu

Gly

Val

275

280

285

Asp

Ile

Leu

Arg

Met

Asp

Ala

Val

Ala

Phe

Ile

Trp

Lys

Gin

Met

Gly

290

295

300

Thr

Ser

Cys

Glu

Asn

Leu

Pro

Gin

Ala

His

Ala

Leu

Ile

Arg

Ala

Phe

305

310

315

320

Asn

Ala

Val

Met

Arg

Ile

Ala

Pro

Ala

Val

Phe

Lys

Ser

Glu

325

330

335

Ala

Ile

Val

His

Pro

Asp

Gin

Val

Gin

Tyr

Ile

Gly

Gin

Asp

Glu

340

345

350

Cys

Gin

Ile

Gly

Tyr

Asn

Pro

Leu

Gin

Met

Ala

Leu

Trp

Asn

Thr

355

360

365 • 9 9·9· 9« 99 *·9 • ♦ 9 · 9 · 99*99 • 99 9999 9 99 • 9 9 9 9 99 999 99

9999 9999 · ··

Μ 99 ·· 99 999·9

Leu Ala 370

Thr Arg

Glu Val Asn 375

Leu

His

Gin

Ala 380

Leu

Thr

Tyr

Arg

His

Asn

Leu

Pro

Glu

His

Thr

Ala

Trp

Val

Asn

Tyr

Val

Arg

Ser

His

385

390

395

400

Asp

Ile

Gly

Trp

Thr

Phe

Ala

Asp

Glu

Asp

Ala

Tyr

Leu

Gly

405

410

415

Ile

Ser

Gly

Tyr

Asp

His

Arg

Gin

Phe

Leu

Asn

Arg

Phe

Val

Asn

420

425

430

Arg

Phe

Asp

Gly

Ser

Phe

Ala

Arg

Gly

Val

Pro

Phe

Gin

Tyr

Asn

Pro

435

440

445

Ser

Thr

Gly

Asp

Cys

Arg

Val

Ser

Gly

Thr

Ala

Leu

Val

Gly

450

455

460

Leu

Ala

Gin

Asp

Pro

His

Ala

Val

Asp

Arg

Ile

Lys

Leu

Tyr

465

470

475

480

Ser

Ile

Ala

Leu

Ser

Thr

Gly

Leu

Pro

Leu

Ile

Tyr

Leu

Gly

Asp

485

490

495

Glu

Val

Gly

Thr

Leu

Asn

Asp

Trp

Ser

Gin

Asp

Ser

Asn

Lys

500

505

510

Ser

Asp

Ser

Arg

Trp

Ala

His

Arg

Pro

Arg

Tyr

Asn

Glu

Ala

Leu

515

520

525

Tyr

Ala

Gin

Arg

Asn

Asp

Pro

Ser

Thr

Ala

Gly

Gin

Ile

Tyr

Gin

530

535

540

Gly

Leu

Arg

His

Met

Ile

Ala

Val

Arg

Gin

Ser

Asn

Pro

Arg

Phe

Asp

545

550

555

560

Gly

Arg

Leu

Val

Thr

Phe

Asn

Thr

Asn

Lys

His

Ile

Gly

565

570

575

Tyr

Ile

Arg

Asn

Ala

Leu

Ala

Phe

Gly

Asn

Phe

Ser

Glu

Tyr

580

585

590

• 4	··♦·	• 4		44	··	4
* 4	4	4 4	4	4	4 4	44
• ·	•	• 4		• 4	• 4	4
• 4	• ·	• 4	•	4 4	• ·	•
• 4	4 ·	4 4	4	•	4 4	4
44	44	• 4		• 4	4·	44 4

Pro

Gin

Thr Val 595

Thr

Ala

His

Thr 600

Leu

Gin Ala

Met

Pro 605

Phe

Lys Ala

His

Asp

Leu

Ile

Gly

Lys

Thr

Val

Ser

Leu

Asn

Gin

Asp

Leu

Thr

610

615

620

Leu

Gin

Pro

Tyr

Gin

Val

Met

Trp

Leu

Glu

Ile

Ala

625

630

635

<210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Uměle vytvořená sekvence <220>

<223> Popis uměle vytvořené sekvence: uměle vytvořená sekvence <400> 6 gtcgacatga accgaaaccg ccatatc <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Uměle vytvořená sekvence <220>

<223> Popis uměle vytvořené sekvence: uměle vytvořená sekvence <400> 7 cctgcaggta tggtgccgct ttatttggc 29 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Neisseria denitrificans <400> 8 ·· ··«« *· ·* ·· • · · ♦ · ♦ » * · • · · 9 9 99·· • 9 999 99 9999

9999 9 9 9 999

9* »9 9 99 9

Met Asn Arg Asn Arg His Ile

<210>	9
<211>	6
<212>	PRT
<213>	Neisseria	denitrificans
<400>	9
Arg Pro Asp Ala	His His
1		5

<210>	10
<211>	7
<212>	PRT
<213>	Neisseria	denitrificans
<400>	10
His Ala Pro Asp	Tyr Ala Leu
1		5

<210>	11
<211>	5
<212>	PRT
<213>	Neisseria	denitrificans
<400>	11
Glu Gly Glu Ala	Ala
1		5

<210>	12
<211>	5
<212>	PRT

<213> Neisseria denitrificans

• 9		··	• 9	4«
•	•	•	9 9	•	♦	•	9 9
•	•	•	• ·	• ·		•	•
•	•	• ·	• ·	•	•	• 9	•
	•	• 9	• ·	•	•	•	•
··		• 9	• 9	··		9·	•

<400> 12

Asp Asp Tyr Arg Phe

<210>	13
<211>	5
<212>	PRT
<213>	Neisseria	denitrificans
<400>	13
Ser Ala Leu Gin	His
1		5

<210>	14
<211>	5
<212>	PRT
<213>	Neisseria	denitrificans
<400>	14
Tyr Glu Thr Leu	Gly
1		5

<210>	15
<211>	5
<212>	PRT
<213>	Neisseria	denitrificans
<400>	15
Val Ser Gly Val	Arg
1		5

<210> 16 <211> 5 ·· ·*·· ·· «« ·· • · · · · · 0 0 0 • · · · · · 0 · 0 • · » · 0 ·· ♦ 0 · 0 • · 0 · «000 0« • 0 ·· 00 00 00 <212> PRT <213> Neisseria denitrificans <400> 16

Val Ser Val Ile Gly

5

<210>	17
<211>	5
<212>	PRT
<213>	Neisseria	denitrificans
<400>	17
Phe Asn Gly Trp	Asp
1		5

<210>	18
<211>	5
<212>	PRT
<213>	Neisseria	denitrificans
<400>	18
Leu Tyr Lys Phe	Ser
1		5

<210>	19
<211>	5
<212>	PRT
<213>	Neisseria	denitrificans
<400>	19
Pro Tyr Ala Phe	Gly
1		5

·« ·<··· • · · <210> 20 <211> 6 <212> PRT <213> Neisseria denitrificans <400> 20

Arg Pro Thr Thr Ala Ser

5

<210>	21
<211>	5
<212>	PRT
<213>	Neisseria	děnitrificans
<400>	21
Phe Arg Arg Arg	Ala
1		5

<210>	22
<211>	6
<212>	PRT
<213>	Neisseria	denitrificans
<400>	22
Asp Glu Leu Val	Asn Tyr
1		5

<210>	23
<211>	6
<212>	PRT
<213>	Neisseria	denitrificans
<400>	23
Leu Pro Leu Ser	Glu Tyr
1		5

*··« <210> 24 <211> 6 <212> PRT <213> Neisseria denitrificans <400> 24

Tyr Gin Ala Thr Gly Leu

5

<210>	25
<211>	5
<212>	PRT
<213>	Neisseria	denitrificans
<400>	25
Asp Asp His Gly	Leu
1		5

<210>	26
<211>	5
<212>	PRT
<213>	Neisseria	denitrificans
<400>	26
His Gin Asp Trp	Asn
1		5

<210> 27 <211> 5 <212> PRT <213> Neisseria denitrificans <400> 27

Asp Gly Ile Arg Val

• 0	• ΦΦ»	··		• Φ	«Φ	•
• φ	•	Φ Φ	Φ	Φ	Φ Φ	Φ φ
• «	9	Φ Φ		9 ·	• Φ	Φ
Φ ·	Φ Φ	Φ Φ	•	Φ	Φ Φ 9	Φ
0 ·	> Φ	» Φ	Φ	Φ	Φ Φ	Φ
ΦΦ	• Φ	··		Φ 9	9Φ	9 · Φ

<210>	28
<211>	6
<212>	PRT
<213>	Neissería	denitrificans
<400>	28
Tyr Gly Gly Ser	Glu Asn
1		5

<210>	29
<211>	6
<212>	PRT
<213>	Neissería	denitrificans
<400>	29
Ser Phe Ala Glu	Glu Ser
1		5

-	<210>	30
	<211>	5
	<212>	PRT
	<213>	Neissería	denitrificans
	<400>	30
•	Asp Pro Val His	Arg
	1		5

<210>	31
<211>	6
<212>	PRT

<213> Neissería denitrificans

··	····	··		··	a
3	•	•	•	•	e	•	•	•	··
• ·		•	•		··	>	•	•
•	«	• ·	•	•	•	•	♦ ·		•
• ·	* ·	«		•	•	• ·	•
• ·	·»	·♦				··	>··

<40.0> 31

Trp Gin Gin Phe Ala Asn

5

<210>	32
<211>	5
<212>	PRT
<213>	Neisseria	denitrificans
<400>	32
Glu Ile Leu Asn	Ser
1		5

<210>	33
<211>	8
<212>	PRT
<213>	Neisseria	denitrificans
<400>	33
Ala Thr Glu Ile	Gin Thr Ala Leu
1		5

<210>	34
<211>	9
<212>	PRT
<213>	Neisseria	denitrificans
<400>	34
Val Lys Asp Lys	Gin Ala Lys Ala Lys
1		5

Φ · φ · · ·

Claims

PATENTOVÉ • ·· φ ·· • ·· φ φ φ · ·· ··

NÁROKY

Φ Φ · · · · · φφ ·· ·· ··· _Λ

TV cfco \ -

1. Molekula nukleové kyseliny, která kóduje rozvětvovací enzym z bakterie rodu Neissería, vybraná ze skupiny skládající se z (a) molekul nukleové kyseliny kódujících protein, který obsahuje sekvenci znázorněnou pod Sekv. id. č. 2;

(b) molekul nukleové kyseliny, které obsahují kódovací úsek znázorněný pod Sekv. id. č. 1;

(c) molekul nukleové kyseliny kódujících protein, který obsahuje sekvenci aminokyselin kódovanou insertem v plasmidu DSM 12425;

(d) molekul nukleové kyseliny, které obsahují kódující úsek pro rozvětvovacího enzym, který je obsažen v insertu plasmidu DSM 12425;

(e) molekul nukleové kyseliny kódujících protein, jehož sekvence má v rámci prvních 100 aminokyselin homologii alespoň 65 % s aminokyselinovou sekvencí znázorněnou pod Sekv. id. č. 2;

(f) molekul nukleové kyseliny, jejichž komplementární řetězec hybridizuje s molekulou nukleové kyseliny z (a), (b), (c), (d) a/nebo (e) a které kódují rozvětvovací enzym z bakterie rodu Neissería', a (g) molekul nukleové kyseliny, jejichž sekvence se liší od sekvence molekuly nukleové kyseliny z (f) díky degeneraci genetického kódu.
2. Vektor, který obsahuje molekulu nukleové kyseliny podle nároku 1.
3. Vektor podle nároku 2, kde je molekula nukleové kyseliny spojena v kódující orientaci s regulačními sekvencemi, které zajišťují transkripci v prokaryontních nebo eukaryontních buňkách.
4. Hostitelská buňka, která je geneticky modifikována molekulou nukleové kyseliny podle nároku 1 nebo vektorem podle nároku 2 nebo 3.
5. Způsob výroby rozvětvovacího enzymu z bakterie rodu Neissería, vyznačující se tím, že hostitelská buňka podle nároku 4 je pěstována za takových podmínek, které umožňují expresi proteinu, a kde protein je izolován z kultivovaných buněk a/nebo kultivačního média.

Φ· ···· * · • · * 9 9 9 9 9 9 φ 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 ·· · · · · 9 9 9 9
6. Způsob výroby rozvětvovacího enzymu z bakterie rodu Neisseria, vyznačující se tím, že protein je produkován systémem transkripce a translace in vitro s použitím molekuly nukleové kyseliny podle nároku 1.
7. Protein kódovaný molekulou nukleové kyseliny podle nároku 1 nebo získatelný způsobem podle nároků 5 nebo 6.
8. Protilátka, která specificky rozpoznává protein podle nároku 7.
9. Použití proteinu podle nároku 7 k výrobě a-1,6 větvených a-1,4-glukanů v systé- mech in vitro.
10. Transgenní rostlinná buňka obsahující molekulu nukleové kyseliny podle nároku 1, kde molekula nukleové kyseliny je spojena s regulačními sekvencemi zabezpečujícími transkripci v rostlinných buňkách.

H.Transgenní rostlinná buňka podle nároku 10, kde molekula nukleové kyseliny je spojena se sekvencí kódující signální sekvenci, která zajišťuje lokalizaci kódovaného proteinu do plastidů této buňky.
12. Transgenní rostlina obsahující rostlinné buňky podle nároků 10 nebo 11.
13. Způsob výroby transgenních rostlin, vyznačující se tím, že (a) rostlinná buňka je geneticky modifikována zavedením molekuly nukleové kyse- liny podle nároku 1 nebo vektorem podle nároku 2 nebo 3;

(b) rostlina je regenerována z buňky produkované podle kroku (a); a (c) případně jsou produkovány další rostliny z rostliny, která byla vyrobena podle kroku (b).
14. Zpracovatelné části rostlin podle nároku 12 nebo rostlin, které lze získat způsobem podle nároku 13, kde části rostlin obsahují transgenní rostlinné buňky podle nároku

10 nebo 11.

·· **·♦
15. Škrob, který lze získat z transgenních rostlinných buněk podle nároku 10 nebo 11, z transgenních rostlin podle nároku 12, z transgenních rostlin, které lze získat způsobem podle nároku 13, nebo z částí rostlin podle nároku 14.
16. Škrob podle nároku 15, kde složení škrobu je modifikováno takovým způsobem, že má zvýšenou texturu gelu a/nebo snížený obsah fosforečnanů a/nebo sníženou píkovou viskozitu a/nebo sníženou teplotu plastifikace a/nebo zmenšenou velikost škrobových zrn a/nebo změněnou distribuci postranních řetězců ve srovnání se škrobem z odpovídajících rostlin divokého typu.
17. Regulační úsek, který přirozeně řídí transkripci molekuly nukleové kyseliny podle nároku 1 v bakteriálních buňkách.
18. Regulační úsek podle nároku 17 obsahující sekvenci nukleotidů vybranou ze skupiny skládající se ze:

(a) sekvencí nukleotidů obsahujících nukleotidy 1 až 169 nukleotidové sekvence znázorněné pod Sekv. id. č. 1;

(b) sekvence nukleotidů regulačního úseku, který je obsažen v insertu plasmidů DSM 12425, nebo jeho části;

(c) sekvencí nukleotidů hybridizujících k sekvencím z bodů (a) nebo (b) za stringentních podmínek.
19. Způsob výroby a-1,6 větvených a-1,4-glukanů in vitro za použití sacharosy jako substrátu a kombinace enzymů amylosacharasy a rozvětvovacího enzymu.
20. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, Že rozvětvovací enzym je kódován molekulou nukleové kyseliny podle nároku 1.