DE19924342A1 - Genetisch modifizierte Pflanzenzellen und Pflanzen mit erhöhter Aktivität eines Amylosucraseproteins und eines Verzweigungsenzyms - Google Patents

Genetisch modifizierte Pflanzenzellen und Pflanzen mit erhöhter Aktivität eines Amylosucraseproteins und eines Verzweigungsenzyms

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Abstract

Es werden transgene Pflanzenzellen und Pflanzen mit einer erhöhten Aktivität eines Amylosucraseproteins und einer erhöhten Aktivität eines Verzweigungsenzyms bereitgestellt. Derartige Pflanzenzellen und Pflanzen synthetisieren eine modifizierte Stärke und/oder synthetisieren alpha-1,6 verzweigte alpha-1,4-Glukane mit einem modifizierten Verzweigungsgrad in O-6-Position und/oder weisen einen erhöhten Ertrag auf im Vergleich zu entsprechenden nicht genetisch modifizierten Wildtyppflanzen(zellen).

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft transgene Pflanzenzellen und Pflanzen mit einer erhöhten Aktivität eines Amylosucraseproteins und einer erhöhten Aktivität eines Verzweigungsenzyms. Derartige Pflanzenzellen und Pflanzen synthetisieren eine modifizierte Stärke und/oder synthetisieren α-1,6 verzweigte α-1,4-Glukane mit einem modifizierten Verzweigungsgrad in O-6-Position und/oder weisen einen erhöhten Ertrag auf im Vergleich zu entsprechenden nicht genetisch modifizierten Wildtyppflanzen(zellen).
Auf dem Gebiet der Agrar- und Forstwirtschaft ist man stetig darum bemüht, Pflanzen mit erhöhtem Ertrag zur Verfügung zu stellen, insbesondere um die Ernährung der fortwährend anwachsenden Weltbevölkerung sicherzustellen und die Versorgung mit nachwachsenden Rohstoffen zu gewährleisten. Traditionell wird versucht, ertragreiche Pflanzen durch Züchtung zu erhalten. Für jede interessierende Pflanzenart müssen entsprechende Züchtungsprogramme durchgeführt werden. Dieses ist jedoch Zeit- und arbeitsintensiv. Fortschritte wurden zum Teil bereits durch die genetische Manipulation von Pflanzen erzielt, d. h. durch die gezielte Einführung und Expression von rekombinanten Nucleinsäuremolekülen in Pflanzen. Derartige Ansätze haben den Vorteil, daß sie in der Regel nicht auf eine Pflanzenart beschränkt sind, sondern sich auch auf andere Pflanzenarten übertragen lassen. Es erscheint daher wünschenswert, Pflanzenzellen und Pflanzen zur Verfügung zu stellen, die einen erhöhten Ertrag aufweisen, sowie Verfahren zur Herstellung derartiger Pflanzenzellen und Pflanzen.
Im Hinblick auf die zunehmende Bedeutung, die pflanzlichen Inhaltsstoffen als erneuerbaren Rohstoffquellen in letzter Zeit beigemessen wird, ist es eine der Aufgaben der biotechnologi­ schen Forschung, sich um eine Anpassung dieser pflanzlichen Rohstoffe an die Anforderungen der verarbeitenden Industrie zu bemühen. Um eine Anwendung von nachwachsenden Rohstoffen in möglichst vielen Einsatzgebieten zu ermöglichen, ist es dar­ über hinaus erforderlich, eine große Stoffvielfalt zu erreichen. Ferner ist es erforderlich, die Ausbeute an diesen pflanzlichen Inhaltsstoffen zu erhöhen, um die Effizienz der Produktion erneuerbarer Rohstoffquellen aus Pflanzen zu steigern.
Neben Ölen, Fetten und Proteinen stellen Polysaccharide die wesentlichen nachwachsenden Rohstoffe aus Pflanzen dar. Eine zentrale Stellung bei den Polysacchariden nimmt neben Cellulose die Stärke ein, die einer der wichtigsten Speicherstoffe in höheren Pflanzen ist.
Das Polysaccharid Stärke findet neben der Verwendung im Nahrungsmittelbereich auch eine breite Verwendung als nachwachsender Rohstoff für die Herstellung industrieller Produkte.
Das Polysaccharid Stärke ist aus chemisch einheitlichen Grundbausteinen, den Glukosemolekülen, aufgebaut, stellt jedoch ein komplexes Gemisch unterschiedlicher Molekülformen dar, die Unterschiede hinsichtlich des Polymerisations- und des Verzweigungsgrades aufweisen und sich somit in ihren physikalisch-chemischen Eigenschaften stark voneinander unterscheiden.
Man differenziert zwischen Amylosestärke, einem im wesentlichen unverzweigten Polymer aus α-1,4-glykosidisch verknüpften Glukoseeinheiten, und der Amylopektinstärke, einem verzweigten Polymer, bei dem die Verzweigungen durch das Auftreten zusätzlicher α-1,6- glykosidischer Verknüpfungen zustande kommen. Nach Lehrbuchangaben (Voet and Voet, Biochemistry, John Wiley & Sons, 1990) treten die α-1,6-Verzweigungen durchschnittlich alle 24 bis 30 Glukosereste auf. Dies entspricht einem Verzweigungsgrad von ca. 3%-4%. Die Angaben zum Verzweigungsgrad sind variabel und abhängig von der Herkunft (z. B. Pflanzenspezies, Pflanzensorte usw.) der jeweiligen Stärke. In typischen für die industrielle Stärkeproduktion verwendeten Pflanzen variiert der Amyloseanteil am Gesamtstärkegehalt zwischen 10 und 25%.
Um eine möglichst breite Anwendung von Polysacchariden, wie z. B. Stärke zu ermöglichen, erscheint es wünschenswert, Pflanzen zur Verfügung zu stellen, die in ihrer Polysaccharidzusammensetzung verändert sind und die beispielsweise in der Lage sind, modifizierte Stärke und/oder hochverzweigte α-1,6-α-1,4-Glukane zu synthetisieren, die sich für verschiedene Verwendungszwecke besonders eignen. Eine Möglichkeit, derartige Pflanzen bereitzustellen, besteht - neben züchterischen Maßnahmen - in der gezielten genetischen Veränderung des Stärkemetabolismus stärkeproduzierender Pflanzen durch gentechnologische Methoden. Voraussetzung hierfür ist jedoch die Identifizierung und Charakterisierung der an der Stärkesynthese und/oder -modifikation beteiligten Enzyme sowie die Isolierung der entsprechenden, diese Enzyme codierende DNA-Moleküle.
Die biochemischen Synthesewege, die zum Aufbau von Stärke führen, sind im wesentlichen bekannt. Die Stärkesynthese in pflanzlichen Zellen findet in den Plastiden statt. In photo­ synthetisch aktiven Geweben sind dies die Chloroplasten, in photosynthetisch inaktiven, stärkespeichernden Geweben die Amyloplasten.
Die wichtigsten an der Stärkesynthese beteiligten Enzyme sind die Stärkesynthasen (s. beispielsweise Patentanmeldung WO 96/15248), das R1-Enzym (s. beispielsweise WO 97/11188) sowie die Verzweigungsenzyme (s. beispielsweise WO 92/14827). Bei weiteren Enzymen, wie z. B. auch den Stärkephosphorylasen (s. beispielsweise WO 98/40503), ist ihre exakte Rolle während der Stärkebiosynthese unbekannt.
Um weitere Möglichkeiten bereitzustellen, beliebige Pflanzen dahingehend zu verändern, daß sie eine modifizierte Stärke synthetisieren, ist es ferner möglich, fremde Nucleinsäuremoleküle, wie z. B. bakterielle oder pilzliche, in Pflanzen einzubringen, die in Wildtyppflanzen nicht vorhanden sind und die für Proteine codieren, die an der Synthese von Polysacchariden beteiligt sind. Beispielsweise konnte gezeigt werden, daß durch die amyloplastidäre Expression bakterieller Fruktosyltransferasen in Amyloplasten die Synthese von sogenanntem "Amylofruktan" möglich ist (Smeekens, Trends in Plant Science Vol. 2 No. 8, (1997), 286-288).
Die heterologe Expression einer bakteriellen Glykogensynthase in Kartoffelpflanzen führt zu einer leichten Absenkung des Amylosegehaltes, zu einer Steigerung des Verzweigungsgrades und zu einer Veränderung des Verzweigungsmusters des Amylopektins im Vergleich zu Wildtyppflanzen (Shewmaker et al., Plant. Physiol., 104 (1994), 1159-1166).
Ferner führt die Expression eines bakteriellen Verzweigungsenzyms in Kartoffelpflanzen in amylose-freien Kartoffelmutanten (amf) (Jacobsen et al., Euphytica, 44 (1989), 43-48) zu Amylopektinmolekülen mit 25% mehr Verzweigungspunkten (Kortstee et al., The Plant Journal, 10(1), (1996), 83-90) als die Kontrolle (amf). Die Erhöhung der Verzweigungspunkte wurde auf eine Veränderung der Kettenlängenverteilung von längerkettigen zugunsten kurzkettiger Seitenketten zurückgeführt. Auch die Erniedrigung der durchschnittlichen Kettenlänge und die Erniedrigung des λmax nach Iodfärbung deuten auf eine höher verzweigte Struktur des Amylopektins in transformierten Pflanzen im Vergleich zu nicht-transformierten Pflanzen hin (Kortstee et al., s.o.). Der Verzweigungsgrad des Glykogens von ca. 10% konnte mit diesem Ansatz jedoch nicht erreicht werden.
Glykogen, ein Polysaccharid, das im wesentlichen im Tierreich und in Bakterien zu finden ist, enthält hochverzweigte α-1,6-α-1,4-Glukane. Glykogen unterscheidet sich von Stärke auch in der durchschnittlichen Seitenkettenlänge und im Polymerisationsgrad. Es enthält nach Lehrbuchangaben (Voet and Voet, Biochemistry, John Wiley & Sons, 1990) durchschnittlich alle 8 bis 12 Glukosereste einen α-1,6-Verzweigungspunkt. Dies entspricht einem Verzweigungsgrad von ca. 8% bis 12%. Für das Molekulargewicht von Glykogen findet man unterschiedliche Angaben, die von 1 Million bis über 1000 Millionen reichen (D. J. Manners in: Advances in Carbohydrate Chemistry, Ed. M. L. Wolfrom, Academic Press, New York (1957), 261-298; Geddes et al., Carbohydr. Res., 261 (1994), 79-89). Auch diese Angaben sind stark abhängig vom jeweiligen Ursprungsorganismus, dessen Ernährungszustand sowie von der Art der Isolierung des Glykogens. Es wird in der Regel mit Hilfe kosten- und zeitintensiver Methoden aus Muscheln (z. B. Mytillus edulis), aus Säugerlebern oder - muskeln (z. B. Kaninchen, Ratten) gewonnen (Beil et al., Biochem. J. 28 (1934), 882; Bueding and Orrell, J. Biol. Chem., 236 (1961), 2854).
Ferner findet man im Pflanzenreich beispielsweise in der sul-Mutante von Mais das sogenannte Phytoglykogen, das einen Verzweigungsgrad von ca. 10%, im Vergleich zum Amylopektin eine veränderte Seitenkettenverteilung (Yun und Matheson, Carbohydrate Research 243, (1993), 307-321) und ein unterschiedliches Löslichkeitsverhalten aufweist. Solche Phytoglykogen-akkumulierenden Pflanzen weisen jedoch einen um bis zu 90% reduzierten Stärkegehalt auf (Zeeman et al., Plant Cell 10, (1998), 1699-1711).
Ferner wurde ein in vitro-Verfahren unter Verwendung einer Amylosucrase und eines Verzweigungsenzyms zur Synthese α-1,6- verzweigter α-1,4-Glukane beschrieben, das u. a. die Herstellung hochverzweigter (glykogenähnlicher) Glukane erlaubt (deutsche Patentanmeldung DE 198 46 635.8). Die Herstellung solcher Glukane in Pflanzen wird dort jedoch nicht beschrieben.
Es erscheint daher wünschenswert, alternative Mittel zur Verfügung zu stellen, die die kostengünstige Herstellung modifizierter Stärken und/oder von α-1,6-α-1,4-Glukanen mit einem modifizierten Verzweigungsgrad in O-6-Position im Vergleich zu Wildtyppflanzen in Pflanzen erlauben.
Somit liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde Pflanzenzellen und Pflanzen zur Verfügung zu stellen, welche im Vergleich zu entsprechenden nicht modifizierten Wildtyppflanzenzellen und Wildtyppflanzen einen modifizierte Zusammensetzung der in den Pflanzenzellen und Pflanzen enthaltenen Polysaccharide aufweisen und, falls möglich, auch einen erhöhten Ertrag zeigen.
Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen bezeichneten Ausführungsformen gelöst.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung transgene Pflanzenzellen die genetisch modifiziert sind, wobei die genetische Modifikation in der Einführung eines fremden Nucleinsäuremoleküls oder mehrerer fremder Nucleinsäuremoleküle besteht, dessen/deren Vorhandensein oder dessen/deren Expression zur Erhöhung der Aktivität eines Amylosucraseproteins und zur Erhöhung der Aktivität eines Verzweigungsenzymproteins führt/führen im Vergleich zu entsprechenden nicht genetisch modifizierten Pflanzenzellen von Wildtyppflanzen.
Die genetische Modifikation kann dabei jede genetische Modifikation sein, die zu einer Erhöhung der Amylosucraseaktivität und der Verzweigungsenzymaktivität führt.
In einer bevorzugten Ausführungsform besteht die genetische Modifikation darin, daß ein fremdes Nucleinsäuremolekül in das Genom der Pflanzenzelle eingeführt wird, welches ein Amylosucraseprotein und ein Verzweigungsenzym codiert.
Dieses fremde Nucleinsäuremolekül kann beispielsweise ein sogenanntes "Doppelkonstrukt" sein, worunter man einen einzigen Vektor zur Pflanzentransformation versteht, der sowohl die genetische Information codierend für ein Amylosucraseprotein als auch für ein Verzweigungsenzym enthält.
Die für das Amylosucrase- und für das Verzweigungsenzym codierenden Nucleinsäuremoleküle, die beide im "fremden Nucleinsäuremolekül" enthalten sind, können entweder unabhängig voneinander unter Kontrolle jeweils eines Promotors stehen, oder sie können nach Fusion als translationale Einheit zusammen unter Kontrolle desselben Promotors stehen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden in das Genom der Pflanzenzelle mehrere fremde Nucleinsäuremoleküle eingeführt, wobei ein fremdes Nucleinsäuremolekül ein Amylosucraseprotein und ein weiteres fremdes Nucleinsäuremolekül ein Verzweigungsenzym codiert.
Die fremden Nucleinsäuremoleküle können hierbei zeitgleich oder auch nacheinander in das Genom der Pflanzenzelle eingeführt werden. Im ersten Falle spricht man von einer "Cotransformation", im letzten Falle von einer "Supertransformation".
Der Begriff "transgen" bedeutet daher, daß die erfindungsgemäßen Pflanzenzelle mindestens ein fremdes, bevorzugt zwei fremde Nucleinsäuremolekül(e) stabil in dem Genom integriert enthält, vorzugsweise ein oder zwei Nucleinsäuremoleküle, die ein Amylosucraseprotein und ein Verzweigungsenzym codieren.
Unter dem Begriff "fremdes Nucleinsäuremolekül" wird vorzugsweise ein Nucleinsäuremolekül verstanden, das ein Protein mit Amylosucraseaktivität und ein Protein mit Verzweigungsenzymaktivität codiert und das entweder natürlicherweise in entsprechenden Pflanzen nicht vorkommt, oder das in der konkreten räumlichen Anordnung nicht natürlicherweise in den Pflanzen vorkommt oder das an einem Ort im Genom der Pflanze lokalisiert ist, an dem es natürlicherweise nicht vorkommt. Bevorzugt ist das fremde Nucleinsäuremolekül ein rekombinantes Molekül, das aus verschiedenen Elementen besteht, deren Kombination oder spezifische räumliche Anordnung natürlicherweise in Pflanzen nicht auftritt. Die erfindungsgemäßen Pflanzen enthalten mindestens ein fremdes Nucleinsäuremolekül, das ein Protein mit Amylosucraseaktivität und ein Protein mit Verzweigungsenzymaktivität codiert, wobei dieses vorzugsweise mit regulatorischen DNA- Elementen verknüpft ist, die die Transkription in Pflanzen gewährleisten, insbesondere mit einem Promotor.
Unter dem Begriff "mehrere fremde Nucleinsäuremoleküle" werden vorzugsweise zwei Nucleinsäuremoleküle verstanden, wobei das eine fremde Nucleinsäuremolekül ein Amylosucraseprotein und das zweite fremde Nucleinsäuremolekül ein Verzweigungsenzym codiert.
Prinzipiell kann (können) das fremde (die fremden) Nucleinsäuremolekül(e) jedes (jede) beliebige(n) Nucleinsäuremolekül(e) sein, das (die) für ein Amylosucraseprotein und ein Verzweigungsenzym codiert (codieren).
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem Amylosucraseprotein (Saccharose: 1,4-α-D-Glucan 4-α-Glucosyltransferase, E. C. 2.4.1.4.) ein Enzym verstanden, das die Umsetzung von Saccharose zu wasserunlöslichen α-1,4-Glucanen und Fructose katalysiert. Für dieses Enzym wird das folgende Reaktionsschema vorgeschlagen:
Saccharose + (α-1,4-D-Glucan)n→D-Fructose + (α-1,4-D-Glucan)n+1,
Es handelt sich dabei um eine Transglycosylierungsreaktion. Die Produkte dieser in-vitro- Reaktion sind wasserunlösliche α-1,4-Glucane und Fructose.
Nukleotid-aktivierte Zucker oder Cofaktoren werden bei dieser Reaktion nicht benötigt. Das Enzym wird jedoch in vitro durch die Anwesenheit von Glucosylgruppenakzeptoren (oder Primern), wie z. B. Maltooligosaccharide, Dextrin oder Glykogen, auf die der Glucosylrest der Saccharose gemäß dem obigen Reaktionsschema unter α-1,4-Glucan-Kettenverlängerung übertragen wird, stimuliert (Remaud-Simeon et al., In S. B. Petersen, B. Svenson und S. Pedersen (Hrsg.), Carbohydrate bioengineering, 313-320 (1995); Elsevier Science B. V., Amsterdam, Niederlande).
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung sind im Prinzip alle Amylosucrasen geeignet, die die Synthese linearer α-1,4-Glucane ausgehend von Saccharose katalysieren. Amylosucrasen sind bisher nur aus Bakterienarten bekannt, insbesondere hauptsächlich aus Neisseria-Spezies (MacKenzie et al., Can. J. Microbiol. 24 (1978), 357-362).
Bevorzugt wird daher eine Amylosucrase prokaryontischen Ursprungs verwendet. Amylosucrasen sind beispielsweise bekannt aus Neisseria perflava (Okada und Hehre, J. Biol. Chem. 249 (1974), 126-135; MacKenzie et al., Can. J. Microbiol. 23 (1977), 1303-­ 1307) oder Neisseria canis, Neisseria cinerea, Neisseria denitrificans, Neisseria sicca und Neisseria subflava (MacKenzie et al., Can. J. Microbiol. 24 (1978, 357-362). Weiterhin beschreibt die WO 95/31553 und die PCT/EP 98/05573 eine Amylosucrase aus Neisseria polysaccharea.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung codiert das fremde Nucleinsäuremolekül eine Amylosucrase aus einem Bakterium der Gattung Neisseria. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung codiert das fremde Nucleinsäuremolekül eine Amylosucrase aus Neisseria polysaccharea, ganz besonders bevorzugt ist eine Amylosucrase mit der in der internationalen Patentanmeldung PCT/EP 98/05573 offenbarten Nucleinsäure- oder Aminosäuresequenz.
Das Enzym, das in Neisseria polysaccharea exprimiert wird, ist extrem stabil, bindet sehr fest an die Polymerisationsprodukte und wird kompetitiv durch das Reaktionsprodukt Fructose inhibiert (MacKenzie et al., Can. J. Microbiol. 23 (1977)1303-1307). Bei der Neissena- Spezies Neisseria polysaccharea wird die Amylosucrase sekretiert (Riou et al., Can. J. Microbiol. 32 (1986), 909-911), wohingegen sie bei anderen Neisseria-Arten in der Zelle verbleibt.
Unter einem Verzweigungsenzym (α-1,4-Glucan: α-1,4-Glucan 6-Glycosyltransferase, E. C. 2.4.1.18) wird ein Protein verstanden, das eine Transglycosylierungsreaktion katalysiert, in der α-1,4-Verknüpfungen eines α-1,4-Glucandonors hydrolysiert und die dabei freigesetzten α-1,4-Glucanketten auf eine α-1,4-Glucanakzeptorkette transferiert und dabei in α-1,6- Verknüpfungen überführt werden.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung sind prinzipiell alle Verzweigungsenzyme jeglicher Herkunft (bakterieller, pilzlicher, pflanzlicher, tierischer) geeignet (siehe z. B. Baba et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 181 (1991), 87-94; Kossmann et al., Mol. Gen. Genet. 203 (1991), 237-244; Nakamura and Yamanouchi, Plant Physiol. 99 (1992), 1265-1266; Baecker et al., J. Biol. Chem. 261 (1986), 8738-8743; Kiel et al., Gene (1989), 9-17 usw.).
Die Isolierung entsprechender Gene ist für den Fachmann mit Hilfe von molekularbiologischen Standardmethoden möglich, wie u. a. bei Sambrook et al. (Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA (1989)) beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung codiert das fremde Nucleinsäuremolekül für ein Verzweigungsenzym aus einem Prokaryoten, vorzugsweise aus einem Bakterium der Gattung Neisseria, besonders bevorzugt aus Neisseria denitrificans und ganz besonders bevorzugt um ein Verzweigungsenzym mit der unter SEQ ID No. 1 dargestellten Nucleotidsequenz oder mit der unter SEQ ID No. 2 dargestellten Aminosäuresequenz.
Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle stehen eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, die Fusion von Protoplasten, die Injektion, die Elektroporation von DNA, die Einbringung der DNA mittels des biolistischen Ansatzes sowie weitere Möglichkeiten.
Die Verwendung der Agrobakterien-vermittelten Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und ausreichend in EP 0 120 516; Hoekema, IN: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B. V., Alblasserdam (1985), Chapter V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant Sci. 4, 1-46 und An et al. EMBO J. 4, (1985), 277-287 beschrieben worden. Für die Transformation von Kartoffel, siehe z. B. Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8, (1989), 29-33). Auch die Transformation monokotyler Pflanzen mittels Agrobakterium basierender Vektoren wurde beschrieben (Chan et al., Plant Mol. Biol. 22, (1993), 491-506; Hiei et al., Plant J. 6, (1994) 271-282; Deng et al. Science in China 33, (1990), 28-34; Wilmink et al., Plant Cell Reports 11, (1992), 76-80; May et al., Bio/Technology 13, (1995), 486-492; Conner und Domisse, Int. J. Plant Sci. 153 (1992), 550-555; Ritchie et al. Transgenic Res. 2, (1993), 252-­ 265). Ein alternatives System zur Transformation von monokotylen Pflanzen ist die Transformation mittels des biolistischen Ansatzes (Wan und Lemaux, Plant Physiol. 104, (1994), 37-48; Vasil et al., Bio/Technology 11 (1993), 1553-1558; Ritala et al., Plant Mol. Biol. 24, (1994), 317-325; Spencer et al., Theor. Appl. Genet. 79, (1990), 625-631), die Protoplastentransformation, die Elektroporation von partiell permeabilisierten Zellen, die Einbringung von DNA mittels Glasfasern. Insbesondere die Transformation von Mais wird in der Literatur mehrfach beschrieben (vgl. z. B. WO 95/06128, EP 0 513 849, EP 0 465 875, EP 0 292 435; Fromm et al., Biotechnology 8, (1990), 833-844; Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2, (1990), 603-618; Koziel et al., Biotechnology 11 (1993), 194-200; Moroc et al., Theor. Appl. Genet. 80, (1990), 721-726).
Auch die erfolgreiche Transformation anderer Getreidearten wurde bereits beschrieben, z. B. für Gerste (Wan und Lemaux, s.o.; Ritala et al., s.o.; Krens et al., Nature 296, (1982), 72-74) und für Weizen (Nehra et al., Plant J. 5, (1994), 285-297).
Generell kommt für die Expression des fremden Nucleinsäuremoleküls (der fremden Nucleinsäuremoleküle) jeder in pflanzlichen Zellen aktive Promotor in Frage. Der Promotor kann dabei so gewählt sein, daß die Expression in den erfindungsgemäßen Pflanzen konstitutiv erfolgt oder nur in einem bestimmten Gewebe, zu einem bestimmten Zeitpunkt der Pflanzenentwicklung oder zu einem durch äußere Einflüsse determinierten Zeitpunkt. In Bezug auf die Pflanze kann der Promotor homolog oder heterolog sein.
Sinnvolle Promotoren sind z. B. der Promotor der 35S RNA des Cauliflower Mosaic Virus und der Ubiquitin-Promotor aus Mais für eine konstitutive Expression, der Patatingen- Promotor B33 (Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29) für eine knollenspezifische Expression in Kartoffeln oder ein Promotor, der eine Expression lediglich in photosynthetisch aktiven Geweben sicherstellt, z. B. der ST-LS1-Promotor (Stockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7943-7947; Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989), 2445-­ 2451), der Ca/b-Promotor (s. beispielsweise US 5656496, US 5639952, Bansal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, (1992), 3654-3658) und der Rubisco SSU-Promotor (s. beispielsweise US 5034322, US 4962028) oder für eine endosperm-spezifische Expression der Glutelin-Promotor (Leisy et al., Plant Mol. Biol. 14, (1990), 41-50; Zheng et al., Plant J. 4, (1993), 357-366; Yoshihara et al., FEBS Lett. 383, (1996), 213-218), der Shrunken-1 Promotor (Werr et al., EMBO J. 4, (1985), 1373-1380), der HMG-Promotor aus Weizen, der USP-Promotor, der Phaseolinpromotor oder Promotoren von Zein-Genen aus Mais (Pedersen et al., Cell 29, (1982), 1015-1026; Quatroccio et al., Plant Mol. Biol. 15 (1990), 81-93).
Die Expression des fremden Nucleinsäuremoleküls (der fremden Nucleinsäuremoleküle) ist insbesondere in solchen Organen der Pflanze von Vorteil, die einen erhöhten Gehalt an Saccharose aufweisen oder Saccharose speichern. Solche Organe sind z. B. die Rübe der Zuckerrübe oder der Stamm des Zuckerrohrs und der Zuckerhirse. Bevorzugt werden daher Promotoren verwendet, die die Expression in diesen Organen vermitteln. Es können jedoch auch Promotoren verwendet werden, die nur zu einem durch äußere Einflüsse determinierten Zeitpunkt aktiviert werden (siehe beispielsweise WO 9307279). Von besonderem Interesse können hierbei Promotoren von heat-shock Proteinen sein, die eine einfache Induktion erlauben. Ferner können samenspezifische Promotoren, wie z. B. der USP-Promoter aus Vicia faba, der eine samenspezifische Expression in Vicia faba und anderen Pflanzen gewährleistet (Fiedler et al., Plant Mol. Biol. 22, (1993), 669-679; Bäumlein et al., Mol. Gen. Genet. 225, (1991), 459-467).; Ferner können auch fruchtspezifische Promotoren eingesetzt werden, wie z. B. beschrieben in der WO 9101373.
Ferner kann eine Terminationssequenz vorhanden sein, die der korrekten Beendigung der Transkription dient sowie der Addition eines Poly-A-Schwanzes an das Transkript, dem eine Funktion bei der Stabilisierung der Transkripte beigemessen wird. Derartige Elemente sind in der Literatur beschrieben (vgl. z. B. Gielen et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29) und sind beliebig austauschbar.
Die erfindungsgemäßen Pflanzenzellen lassen sich von natürlicherweise vorkommenden Pflanzenzellen unter anderem dadurch unterscheiden, daß sie ein oder mehrere fremdes (fremde) Nucleinsäuremolekül(e) enthalten, das (die) natürlicherweise in diesen Zellen nicht vorkommt (vorkommen) oder dadurch, daß ein solches (solche) Molekül(e) an einem Ort im Genom der Pflanze integriert vorliegt (vorliegen), an dem es (sie) sonst nicht vorkommt (vorkommen), d. h. in einer anderen genomischen Umgebung. Ferner lassen sich derartige erfindungsgemäße transgene Pflanzenzellen von natürlicherweise vorkommenden Pflanzenzellen dadurch unterscheiden, daß sie mindestens eine Kopie des/der fremden Nucleinsäuremoleküls (Nucleinsäuremoleküle) stabil integriert in ihr Genom enthalten, gegebenenfalls zusätzlich zu natürlicherweise in den Pflanzenzellen vorkommenden Kopien eines solchen Moleküls. Handelt es sich bei dem (den) in die Zelle eingeführten Nucleinsäuremolekül(en) um zusätzliche Kopien zu bereits natürlicherweise in den Pflanzern vorkommenden Molekülen, so lassen sich die erfindungsgemäßen Pflanzenzellen von natürlicherweise vorkommenden Pflanzenzellen insbesondere dadurch unterscheiden, daß diese zusätzliche(n) Kopie(n) an Orten im Genom lokalisiert ist (sind), an den sie natürlicherweise nicht vorkommt (vorkommen). Dies läßt sich beispielsweise mit der Southern Blot Analyse nachprüfen.
Weiterhin lassen sich die erfindungsgemäßen Pflanzenzellen von natürlicherweise vorkommenden Pflanzenzellen vorzugsweise durch eines der folgenden Merkmale unterscheiden: Ist das (sind die) eingeführte(n) Nucleinsäuremolekül(e) heterolog in Bezug auf die Pflanze, so weisen die transgenen Pflanzenzellen Transkripte der eingeführten Nucleinsäuremoleküle auf. Diese lassen sich z. B. durch Northern Blot Analyse nachweisen. Vorzugsweise enthalten die erfindungsgemäßen Pflanzenzellen Proteine, die durch das (die) eingeführte(n) fremde(n) Nucleinsäuremolekül(e) codiert wird (werden). Dies kann z. B. durch immunologische Methoden, insbesondere durch Western-Blot-Analyse nachgewiesen werden.
Ist das eingeführte Molekül homolog in Bezug auf die Pflanze können die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzenzellen von natürlicherweise auftretenden Pflanzenzellen beispielsweise aufgrund der zusätzlichen Expression der eingeführten fremden Nucleinsäuremoleküle unterschieden werden. Die transgenen Pflanzenzellen enthalten vorzugsweise mehr Transkripte der fremden Nucleinsäuremoleküle. Dies kann z. B. durch Nothern Blot Analyse nachgewiesen werden.
Der Begriff "genetisch modifiziert" bedeutet, daß die Pflanzenzelle durch Einführung eines fremden Nucleinsäuremoleküls oder mehrerer fremder Nucleinsäuremoleküle in ihrer genetischen Information verändert ist und daß das Vorhandensein oder die Expression des fremden (der fremden) Nucleinsäuremoleküls (Nucleinsäuremoleküle) zu einer phänotypischen Veränderung führt (führen). Phänotypische Veränderung bedeutet dabei vorzugsweise eine meßbare Veränderung einer oder mehrerer Funktionen der Pflanzen(zellen). Beispielsweise zeigen die erfindungsgemäßen Pflanzenzellen aufgrund des Vorhandenseins oder bei Expression des eingeführten Nucleinsäuremoleküls eine Erhöhung der Aktivität eines Proteins mit Amylosucraseaktivität und eines Proteins mit Verzweigungsenzymaktivität.
Der Begriff "Erhöhung der Aktivität" bedeutet dabei im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Erhöhung der Expression eines Nucleinsäuremoleküls (mehrerer Nucleinsäuremoleküle), das (die) für ein Protein mit Amylosucraseaktivität und für ein Protein mit Verzweigungsenzymaktivität codiert (codieren), eine Erhöhung der Menge an Protein mit Amylosucraseaktivität und mit Verzweigungsenzymaktivität oder eine Erhöhung der Aktivität eines Proteins mit Amylosucraseaktivität und eines Proteins mit Verzweigungsenzymaktivität in den Pflanzen.
Die Erhöhung der Expression kann beispielsweise bestimmt werden durch Messung der Menge an für solche Proteine codierenden Transkripten, z. B. durch Northern Blot Analyse. Eine Erhöhung bedeutet dabei vorzugsweise eine Erhöhung der Menge an Transkripten im Vergleich zu entsprechenden nicht genetisch modifizierten Pflanzenzellen um mindestens 10%, bevorzugt um mindestens 20%, insbesondere um mindestens 50% und besonders bevorzugt um mindestens 75%.
Die Erhöhung der Menge an Protein mit Amylosucraseaktivität oder mit Verzweigungsenzymaktivität kann beispielsweise bestimmt werden durch Western-Blot Analyse. Eine Erhöhung bedeutet dabei vorzugsweise eine Erhöhung der Menge an Protein mit Amylosucraseaktivität oder mit Verzweigungsenzymaktivität und/oder eine Erhöhung der Amylosucraseaktivität oder der Verzweigungsenzymaktivität im Vergleich zu entsprechenden nicht genetisch modifizierten Zellen um mindestens 10%, bevorzugt um mindestens 20%, insbesondere um mindestens 50% und besonders bevorzugt um mindestens 75%.
Die Aktivität des Amylosucraseproteins und des Verzweigungsenzyms kann beispielsweise nachgewiesen werden wie in den Ausführungsbeispielen beschrieben.
Es wurde überraschender Weise gefunden, daß Pflanzen, die derartige Pflanzenzellen mit erhöhter Aktivität einer Amylosucrase und eines Verzweigungsenzyms enthalten, α-1,6 verzweigte α-1,4-Glucane mit einem modifizierten Verzweigungsgrad in O-6-Position synthetisieren, welche von entsprechenden nicht genetisch modifizierten Wildtyppflanzenzellen nicht synthetisiert werden.
In einer Ausführungsform der Erfindung enthalten die erfindungsgemäßen Pflanzenzellen α- 1,6-verzweigte α-1,4-Glukane mit einem Verzweigungsgrad in O-6-Position von mindestens 2%, bevorzugt von mindestens 4%. In einer weiteren Ausführungsform beträgt der Verzweigungsgrad mindestens 6%, bevorzugt mindestens 8%, insbesondere mindestens 10% und besonders bevorzugt mindestens 12%.
Unter dem Verzweigungsgrad wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung der durchschnittliche Anteil an Verzweigungen in O-6-Position im Vergleich zu allen andersartig verknüpften Glucoseeinheiten verstanden.
Die Bestimmung des Verzweigungsgrades kann über eine Methylierungsanalyse erfolgen, wie beispielsweise weiter unten beschrieben. Allgemeine Informationen zu dieser Methode finden sich beispielsweise auch in "Analysis of Carbohydrates by GLC and MS" (herausgegeben von C. J. Biermann und G. D. McGinnis, CRC Press 1989, im Kapitel 9 von N. C. Carpita und E. M. Shea, S. 157-216) oder bei H. Björndal et al. (Angew. Chem., 82, (1970), 643-652; Int. Ed. Engl. 9, (1970) 610-619).
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung synthetisieren die erfindungsgemäßen Pflanzenzellen modifizierte Stärken, die sich von Stärken entsprechender Wildtyppflanzenzellen in ihren physikalisch-chemischen Eigenschaften insbesondere dem Amylose/Amylopektin-Verhältnis, dem Verzweigungsgrad, der durchschnittlichen Kettenlänge, dem Phosphatgehalt, dem Verkleisterungsverhalten, der Stärkekorngröße und/oder der Stärkekornform unterscheiden. Insbesondere kann eine solche Stärke im Hinblick auf die Viskosität und/oder die Gelbildungseigenschaften von Kleistern dieser Stärke im Vergleich zu Wildtypstärke verändert sein.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung weisen Pflanzen, die die erfindungsgemäßen Pflanzenzellen enthalten, im Vergleich zu entsprechenden nicht modifizierten Wildtyppflanzen einen erhöhten Ertrag auf.
Der Begriff "Wildtyppflanze" bedeutet im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung, daß es sich um Pflanzen handelt, die als Ausgangsmaterial für die Herstellung der erfindungsgemäßen Pflanzen dienten, d. h. deren genetische Information, abgesehen von der eingeführten genetischen Modifikation, der einer erfindungsgemäßen Pflanzen entspricht.
Der Begriff "erhöhter Ertrag" bedeutet hierbei eine Steigerung des Ertrags um mindestens 5%, bevorzugt um mindestens 10%, insbesondere um mindestens 20% und ganz besonders bevorzugt um mindestens 30%. Der Begriff "erhöhter Ertrag" bedeutet dabei vorzugsweise eine Erhöhung der Produktion an Inhaltsstoffen und/oder Biomasse, insbesondere, wenn diese am Frischgewicht pro Pflanze gemessen wird.
Eine derartige Erhöhung des Ertrags bezieht sich vorzugsweise auf erntebare Pflanzenteile wie Samen, Früchte, Speicherwurzeln, Wurzeln Knollen, Blüten, Knospen, Sprosse, Stämme oder Holz.
Die Erhöhung des Ertrags beträgt erfindungsgemäß mindestens 3%, bezogen auf die Biomasse und/oder Inhaltsstoffe, im Vergleich zu entsprechenden nicht-transformierten Pflanzen desselben Genotyps, wenn diese unter denselben Bedingungen kultiviert werden, bevorzugt mindestens 10%, besonders bevorzugt mindestens 20% und insbesondere bevorzugt mindestens 30% oder gar 40% im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung erfindungsgemäße Pflanzenzellen, die einen erhöhten kalorischen Wert im Vergleich zu entsprechenden nicht genetisch modifizierten Wildtyppflanzenzellen aufweisen.
Der Begriff kalorischer Wert ist gleichbedeutend mit dem Brennwert, der als diejenige Energiemenge (angegeben in Kalorien oder Joule) definiert ist, die der Körper beim Abbau der Nahrung gewinnen kann und die zur Deckung des Energiebedarfs verwendet wird. Unter dem Begriff "erhöhter kalorischer Wert" bedeutet hierbei eine Steigerung des Brennwerts um mindestens 5%, bevorzugt um mindestens 10%, insbesondere um mindestens 20% und ganz besonders bevorzugt um mindestens 30%.
Für die Nahrungsmittelindustrie sind Pflanzen mit hohem kalorischen Wert von Interesse, insbesondere zur Ernährung von Menschen mit hohem Energiebedarf, wie z. B. kranken oder alten Menschen, von Säuglingen oder von Leistungssportlern.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung weist das fremde Nucleinsäuremolekül eine oder mehrere Proteintargetingsignalsequenz(en) auf, die eine vakuoläre Lokalisation des Amylosucraseproteins und des Verzweigungsenzymproteins vermittelt (vermitteln).
Die für das Amylosucrase- und für das Verzweigungsenzym codierenden Nucleinsäuremoleküle, die beide im "fremden Nucleinsäuremolekül" enthalten sind, können entweder unabhängig voneinander unter Kontrolle einer oder mehrerer Proteintargetingsignalsequenz(en) stehen, oder sie können nach Fusion als translationale Einheit zusammen unter Kontrolle einer oder mehrerer Proteintargetingsignalsequenz(en) stehen.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung weisen die fremden Nucleinsäuremoleküle jeweils eine oder jeweils mehrere Proteintargetingsignalsequenz(en) auf, die eine vakuoläre Lokalisation des Amylosucraseproteins und des Verzweigungsenzymproteins vermittelt (vermitteln).
In dieser Ausführungsform werden in das Genom der Pflanzenzelle mehrere fremde Nucleinsäuremoleküle eingeführt, wobei ein fremdes Nucleinsäuremolekül ein Amylosucraseprotein und ein weiteres fremdes Nucleinsäuremolekül ein Verzweigungsenzym codiert. Wie bereits oben erwähnt, können die fremden Nucleinsäuremoleküle zeitgleich oder auch nacheinander in das Genom der Pflanzenzelle eingeführt werden.
Jedes der eingeführten fremden Nucleinsäuremoleküle enthält eine oder mehrere Proteintargetingsignalsequenz(en), die jeweils eine vakuoläre Lokalisation des Amylosucraseproteins und des Verzweigungsenzymproteins vermittelt (vermitteln) und die sich gleichen oder sich voneinander unterscheiden können.
Als Signalsequenz kann beispielsweise die N-terminale Sequenz (146 Aminosäuren) des Patatinproteins verwendet werden (Sonnewald et al., Plant J. 1, (1998), 95-106). In einer bevorzugten Ausführungsform wird die unter SEQ ID No. 7 dargestellte Signalsequenz verwendet.
Weitere vakuoläre Signalsequenzen sind beispielsweise beschrieben bei Matsuoka und Neuhaus, Journal of Experimental Botany 50, (1999), 165-174; Chrispeels und Raikhel, Cell 68, (1992), 613-616; Matsuoka und Nakamura, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, (1991), 834-­ 838; Bednarek und Raikhel, Plant Cell 3, (1991), 1195-1206; Nakamura und Matsuoka, Plant Phys. 101, (1993), 1-5.
Da die Vakuole in der Regel große Mengen an Saccharose speichern kann, die der Amylosucrase als Substrat dient, ist dieses Kompartiment gut geeignet, um Pflanzenzellen zu erzeugen, die aufgrund einer erhöhten Aktivität eines Amylosucraseproteins und einer erhöhten Aktivität eines Verzweigungsenzyms in der Vakuole α-1,6- verzweigte α-1,4- Glucane synthetisieren. In einer Ausführungsform der Erfindung weisen diese Glucane in O- 6-Position einen Verzweigungsgrad von mindestens 1%, bevorzugt von mindestens 4%, insbesondere von mindestens 7% und ganz besonders bevorzugt von mindestens 10% auf.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung weist das fremde Nucleinsäuremolekül eine oder mehrere Proteintargetingsignalsequenz(en) auf, die eine plastidäre Lokalisation des Amylosucraseproteins und des Verzweigungsenzymproteins vermittelt (vermitteln).
Die für das Amylosucrase- und für das Verzweigungsenzym codierenden Nucleinsäuremoleküle, die beide im "fremden Nucleinsäuremolekül" enthalten sind, können entweder unabhängig voneinander unter Kontrolle einer oder mehrerer Proteintargetingsignalsequenz(en) stehen, oder sie können nach Fusion als translationale Einheit zusammen unter Kontrolle einer oder mehrerer Proteintargetingsignalsequenz(en) stehen.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung weisen die fremden Nucleinsäuremoleküle jeweils eine oder jeweils mehrere Proteintargetingsignalsequenz(en) auf, die eine plastidäre Lokalisation des Amylosucraseproteins und des Verzweigungsenzymproteins vermittelt (vermitteln).
In dieser Ausführungsform werden in das Genom der Pflanzenzelle mehrere fremde Nucleinsäuremoleküle eingeführt, wobei ein fremdes Nucleinsäuremolekül ein Amylosucraseprotein und ein weiteres fremdes Nucleinsäuremolekül ein Verzweigungsenzym codiert. Wie bereits oben erwähnt, können die fremden Nucleinsäuremoleküle zeitgleich oder auch nacheinander in das Genom der Pflanzenzelle eingeführt werden.
Jedes der eingeführten fremden Nucleinsäuremoleküle enthält eine oder mehrere Proteintargetingsignalsequenz(en), die jeweils eine plastidäre Lokalisation des Amylosucraseproteins und des Verzweigungsenzymproteins vermittelt (vermitteln) und die sich gleichen oder sich voneinander unterscheiden können.
Als Signalsequenz kann beispielsweise die Signalsequenz der Ferrodoxin:NADP+ oxidoreductase (FNR) aus Spinat verwendet werden. Die Sequenz enthält den 5' nichttranslatierten Bereich sowie die flankierende Transitpeptidsequenz der cDNA des plastidären Proteins Ferrodoxin:NADP+ oxidoreductase aus Spinat (Nukleotid -171 bis +­ 165; Jansen et al., Current Genetics 13, (1988), 517-522).
Ferner kann als Signalsequenz beispielsweise das Transitpeptid des waxy-Proteins aus Mais plus die ersten 34 Aminosäuren des maturen waxy-Proteins (Klösgen et al., Mol Gen Genet. 217, (1989), 155-161) verwendet werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das Transitpeptid des waxy-Proteins aus Mais (s.o.) verwendet (s. Beispiel 1) ohne die ersten 34 Aminosäuren des maturen waxy-Proteins.
Durch die amyloplastidäre Expression bakterieller Fruktosyltransferasen konnte gezeigt werden, daß auch die Plastiden Saccharose enthalten, die durch die Fruktosyltransferasen in Amyloplasten in "Amylofruktan" umgesetzt werden kann (Smeekens, Trends in Plant Science Vol. 2 No. 8, (1997), 286-288.). Daher eignet sich dieses Kompartiment ebenfalls für die kombinierte Expression eines Amylosucrasegens und eines Verzweigungsenzymgens und ermöglicht die Synthese modifizierter Stärke, die beispielsweise in ihren physikalisch- chemischen Eigenschaften, insbesondere dem Amylose/Amylopektin-Verhältnis, dem Verzweigungsgrad, der durchschnittlichen Kettenlänge, dem Phosphatgehalt, dem Verkleisterungsverhalten, der Stärkekorngröße und/oder der Stärkekornform im Vergleich zu in Wildtyp-Pflanzen synthetisierter Stärke verändert ist.
Die aus den erfindungsgemäßen Pflanzenzellen isolierten Stärken können nach dem Fachmann bekannten Verfahren modifiziert werden und eignen sich in unmodifizierter oder modifizierter Form für verschiedene Verwendungen im Nahrungsmittel- oder Nicht- Nahrungsmittelbereich.
Grundsätzlich läßt sich die Einsatzmöglichkeit der Stärke in zwei große Bereiche unterteilen. Der eine Bereich umfaßt die Hydrolyseprodukte der Stärke, hauptsächlich Glucose und Glucanbausteine, die über enzymatische oder chemische Verfahren erhalten werden. Sie dienen als Ausgangsstoff für weitere chemische Modifikationen und Prozesse, wie Fermentation. Für eine Reduktion der Kosten kann hierbei die Einfachheit und ko­ stengünstige Ausführung eines Hydrolyseverfahrens von Bedeutung sein. Gegenwärtig verläuft es im wesentlichen enzymatisch unter Verwendung von Amyloglucosidase. Vorstellbar wäre eine Kosteneinsparung durch einen geringeren Einsatz von Enzymen. Eine Strukturveränderung der Stärke, z. B. Oberflächenvergrößerung des Korns, leichtere Verdaulichkeit durch geringeren Verzweigungsgrad oder eine sterische Struktur, die die Zugänglichkeit für die eingesetzten Enzyme begrenzt, könnte dies bewirken.
Der andere Bereich, in dem die Stärke wegen ihrer polymeren Struktur als sogenannte native Stärke verwendet wird, gliedert sich in zwei weitere Einsatzgebiete:
1. Nahrungsmittelindustrie
Stärke ist ein klassischer Zusatzstoff für viele Nahrungsmittel, bei denen sie im wesentlichen die Funktion des Bindens von wäßrigen Zusatzstoffen übernimmt bzw. eine Erhöhung der Viskosität oder aber eine erhöhte Gelbildung hervorruft. Wichtige Eigenschaftsmerkmale sind das Fließ- und Sorptionsverhalten, die Quell- und Ver­ kleisterungstemperatur, die Viskosität und Dickungsleistung, die Löslichkeit der Stärke, die Transparenz und Kleisterstruktur, die Hitze-, Scher- und Säurestabilität, die Neigung zur Retrogradation, die Fähigkeit zur Filmbildung, die Gefrier/Taustabilität, die Viskositätsstabilität in Salzlösungen, die Verdaulichkeit sowie die Fähigkeit zur Komplexbildung mit z. B. anorganischen oder organischen Ionen.
2. Nicht-Nahrungmittelindustrie
In diesem großen Bereich kann die Stärke als Hilfsstoff für unterschiedliche Herstellungsprozesse bzw. als Zusatzstoff in technischen Produkten eingesetzt. Bei der Verwendung der Stärke als Hilfsstoff ist hier insbesondere die Papier- und Pappeindustrie zu nennen. Die Stärke dient dabei in erster Linie zur Retardation (Zurückhaltung von Feststoffen), der Abbindung von Füllstoff und Feinstoffteilchen, als Festigungsstoff und zur Entwässerung. Darüber hinaus werden die günstigen Eigenschaften der Stärke in bezug auf die Steifigkeit, die Härte, den Klang, den Griff, den Glanz, die Glätte, die Spaltfestigkeit sowie die Oberflächen ausgenutzt.
2.1 Papier- und Pappeindustrie
Innerhalb des Papierherstellungsprozesses sind vier Anwendungsbereiche, nämlich Oberfläche, Strich, Masse und Sprühen, zu unterscheiden.
Die Anforderungen an die Stärke in bezug auf die Oberflächenbehandlung sind im wesentlichen ein hoher Weißegrad, eine angepaßte Viskosität, eine hohe Viskositätsstabilität, eine gute Filmbildung sowie eine geringe Staubbildung. Bei der Verwendung im Strich spielt der Feststoffgehalt, eine angepaßte Viskosität, ein hohes Bindevermögen sowie eine hohe Pigmentaffinität eine wichtige Rolle. Als Zusatz zur Masse ist eine rasche, gleichmäßige, verlustfreie Verteilung, eine hohe mechanische Stabilität und eine vollständige Zurückhaltung im Papierfließ von Bedeutung. Beim Einsatz der Stärke im Sprühbereich sind ebenfalls ein angepaßter Feststoffgehalt, hohe Viskosität sowie ein hohes Bindevermögen von Bedeutung.
2.2 Klebstoffindustrie
Ein großer Einsatzbereich der Stärken besteht in der Klebstoffindustrie, wo man die Einsatzmöglichkeiten in vier Teilbereiche gliedert: die Verwendung als reinem Stärkeleim, die Verwendung bei mit speziellen Chemikalien aufbereiteten Stärkeleimen, die Verwendung von Stärke als Zusatz zu synthetischen Harzen und Polymerdispersionen sowie die Verwendung von Stärken als Streckmittel für synthetische Klebstoffe. 90% der Klebstoffe auf Stärkebasis werden in den Bereichen Wellpappenherstellung, Herstellung von Papiersäcken, Beuteln und Tüten, Herstellung von Verbundmaterialien für Papier und Aluminium, Herstellung von Kartonagen und Wiederbefeuchtungsleim für Briefumschläge, Briefmarken usw. eingesetzt.
2.3 Textil- und Textilpflegemittelindustrie
Ein großes Einsatzfeld für die Stärken als Hilfsmittel und Zusatzstoff ist der Bereich Herstellung von Textilien und Textilpflegemitteln. Innerhalb der Textilindustrie sind die folgenden vier Einsatzbereiche zu unterscheiden: Der Einsatz der Stärke als Schlichtmittel, d. h. als Hilfsstoff zur Glättung und Stärkung des Klettverhaltens zum Schutz gegen die beim Weben angreifenden Zugkräfte sowie zur Erhöhung der Abriebfestigkeit beim Weben, Stärke als Mittel zur Textilaufrüstung vor allem nach qualitätsverschlechternden Vorbehandlungen, wie Bleichen, Färben usw., Stärke als Verdickungsmittel bei der Herstellung von Farbpasten zur Verhinderung von Farbstoffdiffusionen sowie Stärke als Zusatz zu Kettungsmitteln für Nähgarne.
2.4 Baustoffindustrie
Der vierte Einsatzbereich ist die Verwendung der Stärken als Zusatz bei Baustoffen. Ein Beispiel ist die Herstellung von Gipskartonplatten, bei der die im Gipsbrei ver­ mischte Stärke mit dem Wasser verkleistert, an die Oberfläche der Gipsplatte diffundiert und dort den Karton an die Platte bindet. Weitere Einsatzbereiche sind die Beimischung zu Putz- und Mineralfasern. Bei Transportbeton werden Stärkeprodukte zur Verzögerung der Abbindung eingesetzt.
2.5 Bodenstabilisation
Ein weiterer Markt für die Stärke bietet sich bei der Herstellung von Mitteln zur Bodenstabilisation an, die bei künstlichen Erdbewegungen zum temporären Schutz der Bodenpartikel gegenüber Wasser eingesetzt werden. Kombinationsprodukte aus der Stärke und Polymeremulsionen sind nach heutiger Kenntnis in ihrer Erosions- und verkrustungsmindernden Wirkung den bisher eingesetzten Produkten gleichzusetzen, liegen preislich aber deutlich unter diesen.
2.6 Einsatz bei Pflanzenschutz- und Düngemitteln
Ein Einsatzbereich liegt bei der Verwendung der Stärke in Pflanzenschutzmitteln zur Veränderung der spezifischen Eigenschaften der Präparate. So kann die Stärke zur Verbesserung der Benetzung von Pflanzenschutz- und Düngemitteln, zur dosierten Freigabe der Wirkstoffe, zur Umwandlung flüssiger, flüchtiger und/oder übelriechender Wirkstoffe in mikrokristalline, stabile, formbare Substanzen, zur Mischung inkompatibler Verbindungen und zur Verlängerung der Wirkdauer durch Verminderung der Zersetzung eingesetzt werden.
2.7. Pharmaka, Medizin und Kosmetikindustrie
Ein weiteres Einsatzgebiet besteht im Bereich der Pharmaka, Medizin und Kosmetikindustrie. In der pharmazeutischen Industrie kann die Stärke als Bindemittel für Tabletten oder zur Bindemittelverdünnung in Kapseln eingesetzt werden. Weiterhin kann die Stärke als Tablettensprengmittel dienen, da sie nach dem Schlucken Flüssigkeit absorbieren und nach kurzer Zeit soweit quellen, daß der Wirkstoff freigesetzt wird. Medizinische Gleit- und Wundpuder basieren aus qualitativen Gründen auf Stärke. Im Bereich der Kosmetik werden Stärken beispielsweise als Träger von Puderzusatzstoffen, wie Düften und Salicylsäure eingesetzt. Ein relativ großer Anwendungsbereich für die Stärke liegt bei Zahnpasta.
2.8 Stärkezusatz zu Kohlen und Briketts
Einen Einsatzbereich bietet die Stärke als Zusatzstoff zu Kohle und Brikett. Kohle kann mit einem Stärkezusatz quantitativ hochwertig agglomeriert bzw. brikettiert wer­ den, wodurch ein frühzeitiges Zerfallen der Briketts verhindert wird. Der Stärkezusatz liegt bei Grillkohle zwischen 4 und 6%, bei kalorierter Kohle zwischen 0,1 und 0,5%. Des weiteren gewinnen Stärken als Bindemittel an Bedeutung, da durch ihren Zusatz zu Kohle und Brikett der Ausstoß schädlicher Stoffe deutlich vermindert werden kann.
2.9 Erz- und Kohleschlammaufbereitung
Die Stärke kann ferner bei der Erz- und Kohleschlammaufbereitung als Flockungsmittel eingesetzt werden.
2.10 Gießereihilfsstoff
Ein weiterer Einsatzbereich besteht als Zusatz zu Gießereihilfsstoffen. Bei verschiedenen Gußverfahren werden Kerne benötigt, die aus Bindemittel-versetzten Sänden hergestellt werden. Als Bindemittel wird heute überwiegend Bentonit eingesetzt, das mit modifizierten Stärken, meist Quellstärken, versetzt ist. Zweck des Stärkezusatzes ist die Erhöhung der Fließfestigkeit sowie die Verbesserung der Bindefestigkeit. Darüber hinaus können die Quellstärken weitere produk­ tionstechnische Anforderungen, wie im kalten Wasser dispergierbar, rehydratisierbar, gut in Sand mischbar und hohes Wasserbindungsvermögen, aufweisen.
2.11 Einsatz in der Kautschukindustrie
In der Kautschukindustrie kann die Stärke zur Verbesserung der technischen und optischen Qualität eingesetzt werden. Gründe sind dabei die Verbesserung des Oberflächenglanzes, die Verbesserung des Griffs und des Aussehens, dafür wird Stärke vor der Kaltvulkanisation auf die klebrigen gummierten Flächen von Kautschukstoffen gestreut, sowie die Verbesserung der Bedruckbarkeit des Kautschuks.
2.12 Herstellung von Lederersatzstoffen
Eine weitere Absatzmöglichkeit der modifizierten Stärken besteht bei der Herstellung von Lederersatzstoffen.
2.13 Stärke in synthetischen Polymeren
Auf dem Kunststoffsektor zeichnen sich folgende Einsatzgebiete ab: die Einbindung von Stärkefolgeprodukten in den Verarbeitungsprozeß (Stärke ist nur Füllstoff, es besteht keine direkte Bindung zwischen synthetischem Polymer und Stärke) oder alternativ die Einbindung von Stärkefolgeprodukten in die Herstellung von Polymeren (Stärke und Polymer gehen eine feste Bindung ein).
Die Verwendung der Stärke als reinem Füllstoff ist verglichen mit den anderen Stoffen wie Talkum nicht wettbewerbsfähig. Anders sieht es aus, wenn die spezifischen Stärkeeigenschaften zum Tragen kommen und hierdurch das Eigenschaftsprofil der Endprodukte deutlich verändert wird. Ein Beispiel hierfür ist die Anwendung von Stärkeprodukten bei der Verarbeitung von Thermoplasten, wie Polyethylen. Hierbei werden die Stärke und das synthetische Polymer durch Koexpression im Verhältnis von 1 : 1 zu einem "master batch" kombiniert, aus dem mit granuliertem Polyethylen unter Anwendung herkömmlicher Verfahrenstechniken diverse Produkte hergestellt werden. Durch die Ein­ bindung von Stärke in Polyethylenfolien kann eine erhöhte Stoffdurchlässigkeit bei Hohlkörpern, eine verbesserte Wasserdampfdurchlässigkeit, ein verbessertes Antistatikverhalten, ein verbessertes Antiblockverhalten sowie eine verbesserte Be­ druckbarkeit mit wäßrigen Farben erreicht werden.
Eine andere Möglichkeit ist die Anwendung der Stärke in Polyurethanschäumen. Mit der Adaption der Stärkederivate sowie durch die verfahrenstechnische Optimierung ist es möglich, die Reaktion zwischen synthetischen Polymeren und den Hydroxygruppen der Stärken gezielt zu steuern. Das Ergebnis sind Polyurethanfolien, die durch die Anwendung von Stärke folgende Eigenschaftsprofile erhalten: eine Verringerung des Wärmeaus­ dehnungskoeffizienten, Verringerung des Schrumpfverhaltens, Verbesserung des Druck/Spannungsverhaltens, Zunahme der Wasserdampfdurchlässigkeit ohne Veränderung der Wasseraufnahme, Verringerung der Entflammbarkeit und der Aufrißdichte, kein Abtropfen brennbarer Teile, Halogenfreiheit und verminderte Alterung. Nachteile, die gegenwärtig noch vorhanden sind, sind verringerte Druckfestigkeit sowie eine verringerte Schlagfestigkeit.
Die Produktentwicklung beschränkt sich inzwischen nicht mehr nur auf Folien. Auch feste Kunststoffprodukte, wie Töpfe, Platten und Schalen, sind mit einem Stärkegehalt von über 50% herzustellen. Des weiteren sind Stärke/Polymermischungen günstig zu beurteilen, da sie eine sehr viel höhere biologische Abbaubarkeit aufweisen.
Außerordentliche Bedeutung haben weiterhin auf Grund ihres extremen Wasserbindungsvermögen Stärkepfropfpolymerisate gewonnen. Dies sind Produkte mit einem Rückgrat aus Stärke und einer nach dem Prinzip des Radikalkettenmechanismus aufgepfropften Seitengitters eines synthetischen Monomers. Die heute verfügbaren Stärkepfropfpolymerisate zeichnen sich durch ein besseres Binde- und Rückhaltevermögen von bis zu 1000 g Wasser pro g Stärke bei hoher Viskosität aus. Die Anwendungsbereiche für diese Superabsorber haben sich in den letzten Jahren stark ausgeweitet und liegen im Hygienebereich mit Produkten wie Windeln und Unterlagen sowie im landwirtschaftlichen Sektor, z. B. bei Saatgutpillierungen.
Entscheidend für den Einsatz der neuen, gentechnisch veränderten Stärken sind zum einen die Struktur, Wassergehalt, Proteingehalt, Lipidgehalt, Fasergehalt, Asche/Phosphatgehalt, Amylose/Amylopektinverhältnis, Molmassenverteilung, Verzweigungsgrad, Korngröße und - form sowie Kristallinität, zum anderen auch die Eigenschaften, die in folgende Merkmale münden: Fließ- und Sorptionsverhalten, Verkleisterungstemperatur, Viskosität, Viskositätsstabilität in Salzlösungen, Dickungsleistung, Löslichkeit, Kleisterstruktur und - transparenz, Hitze-, Scher- und Säurestabilität, Retrogradationsneigung, Gelbildung, Gefrier/Taustabilität, Komplexbildung, Jodbindung, Filmbildung, Klebekraft, Enzymstabilität, Verdaulichkeit und Reaktivität.
Die Erzeugung modifizierter Stärken mittels gentechnischer Eingriffe in einer transgenen Pflanze kann zum einen die Eigenschaften der aus der Pflanze gewonnenen Stärke dahinge­ hend verändern, daß weitere Modifikationen mittels chemischer oder physikalischer Verfahren nicht mehr notwendig erscheinen. Zum anderen können die durch gentechnische Verfahren veränderte Stärken weiteren chemischen Modifikationen unterworfen werden, was zu weiteren Verbesserungen der Qualität für bestimmte der oben beschriebenen Einsatzgebiete führt. Diese chemischen Modifikationen sind grundsätzlich bekannt. Insbe­ sondere handelt es sich dabei um Modifikationen durch
  • - Hitzebehandlung,
  • - Säurebehandlung,
  • - Oxidation und
  • - Veresterungen,
welche zur Entstehung von Phosphat-, Nitrat-, Sulfat-, Xanthat-, Acetat- und Citratstärken führen. Weitere organische Säuren können ebenfalls zur Veresterung eingesetzt werden:
  • - Erzeugung von Stärkeethern
    Stärke-Alkylether, O-Allylether, Hydroxylalkylether,
    O-Carboxylmethylether, N-haltige Stärkeether, P-haltige Stärkeether, S-haltige Stärkeether
  • - Erzeugung von vernetzten Stärken
  • - Erzeugung von Stärke-Pfropf-Polymerisaten
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung weist das fremde Nucleinsäuremolekül eine oder mehrere Proteintargetingsignalsequenz(en) auf, die eine zellwandspezifische Lokalisation des Amylosucraseproteins und des Verzweigungsenzymproteins vermittelt (vermitteln).
Die für das Amylosucrase- und für das Verzweigungsenzym codierenden Nucleinsäuremoleküle, die beide im "fremden Nucleinsäuremolekül" enthalten sind, können entweder unabhängig voneinander unter Kontrolle von einer oder von mehreren Proteintargetingsignalsequenz(en) stehen, oder sie können nach Fusion als translationale Einheit zusammen unter Kontrolle von einer oder mehreren Proteintargetingsignalsequenz(en) stehen.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung weisen die fremden Nucleinsäuremoleküle jeweils eine oder jeweils mehrere Proteintargetingsignalsequenz(en) auf, die eine zellwandspezifische Lokalisation des Amylosucraseproteins und des Verzweigungsenzymproteins vermittelt (vermitteln).
In dieser Ausführungsform werden in das Genom der Pflanzenzelle mehrere fremde Nucleinsäuremoleküle eingeführt, wobei ein fremdes Nucleinsäuremolekül ein Amylosucraseprotein und ein weiteres fremdes Nucleinsäuremolekül ein Verzweigungsenzym codiert. Wie bereits oben erwähnt, können die fremden Nucleinsäuremoleküle zeitgleich oder auch nacheinander in das Genom der Pflanzenzelle eingeführt werden. Im ersten Falle spricht man von einer "Cotransformation", im letzten Falle von einer "Supertransformation".
Jedes der eingeführten fremden Nucleinsäuremoleküle enthält eine oder mehrere Proteintargetingsignalsequenz(en), die jeweils eine zellwandspezifische Lokalisation des Amylosucraseproteins und des Verzweigungsenzymproteins vermittelt (vermitteln) und die sich gleichen oder sich voneinander unterscheiden können.
Als Signalsequenz kann beispielsweise die des Proteinase Inhibitors II aus Kartoffel (von Schaewen et al., EMBO J. 9, (1990), 3033-3044; Keil et al., Nucleic Acid Research 14, (1986), 5641-5650) verwendet werden.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung vermittelt (vermitteln) das fremde (die fremden) Nucleinsäuremoleküle eine cytosolische Lokalisation des Amylosucraseproteins und des Verzweigungsenzymproteins.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung transgene Pflanzen, die derartige Pflanzenzellen mit erhöhter Aktivität einer Amylosucrase und eines Verzweigungsenzyms enthalten.
Die erfindungsgemäßen Pflanzen können zu jeder beliebigen Pflanzenspezies gehören, d. h. sowohl zu monokotyledonen als auch zu dikotyledonen Pflanzen. Bevorzugt handelt es sich um Pflanzen aus landwirtschaftlichen Nutzpflanzen, d. h. aus Pflanzen, die vom Menschen kultiviert werden für Zwecke der Ernährung oder für technische, insbesondere industrielle Zwecke. Vorzugsweise betrifft die Erfindung faserbildende (z. B. Flachs, Hanf, Baumwolle), ölspeichernde (z. B. Raps, Sonnenblume, Sojabohne), stärkespeichernde Pflanzen (z. B. Weizen, Gerste, Hafer, Roggen, Kartoffel, Mais, Reis, Erbse, Maniok), zuckerspeichernde (z. B. Zuckerrübe, Zuckerrohr, Zuckerhirse) und proteinspeichernde Pflanzen (z. B. Leguminosen).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung Futterpflanzen (z. B. Futter- und Weidegräser (Alfalfa, Klee etc.), Gemüsepflanzen (z. B. Tomate, Salat, Chicoree). Besonders bevorzugt sind Zuckerrübe, Zuckerrohr, Mais, Weizen und Reis.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen, die einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu Wildtyppflanzen aufweisen, wobei
  • a) eine pflanzliche Zelle genetisch modifiziert wird durch die Einführung eines fremden (mehrerer fremder) Nucleinsäuremoleküls (Nucleinsäuremoleküle), dessen (deren) Vorhandensein oder dessen (deren) Expression zur Erhöhung der Aktivität eines Proteins mit Amylosucraseaktivität und zur Erhöhung der Aktivität eines Proteins mit Verzweigungsenzymaktivität führt;
  • b) aus der gemäß a) hergestellten Zelle eine Pflanze regeneriert wird; und
  • c) aus der gemäß Schritt b) erzeugten Pflanze gegebenenfalls weitere Pflanzen erzeugt werden.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze, die α-1,6 verzweigte α-1,4-Glucane mit einem modifizierten Verzweigungsgrad in O-6-Position im Vergleich zu entsprechenden nicht genetisch modifizierten Wildtyppflanzen synthetisiert, wobei
  • a) eine pflanzliche Zelle genetisch modifiziert wird durch die Einführung eines oder mehrerer fremder Nucleinsäuremolekül(s)e, deren/dessen Vorhandensein oder deren/dessen Expression zur Erhöhung der Aktivität eines Proteins mit der Aktivität einer Amylosucrase und zur Erhöhung der Aktivität eines Proteins mit der Aktivität eines Verzweigungsenzyms führt;
  • b) aus der gemäß a) hergestellten Zelle eine Pflanze regeneriert wird; und
  • c) aus der gemäß Schritt b) erzeugten Pflanze gegebenenfalls weitere Pflanzen erzeugt werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze, die eine modifizierte Stärke synthetisiert im Vergleich zu entsprechenden nicht genetisch modifizierten Wildtyppflanzen, wobei
  • a) eine pflanzliche Zelle genetisch modifiziert wird durch die Einführung eines oder mehrerer fremder Nucleinsäuremolekül(s)e, deren/dessen Vorhandensein oder deren/dessen Expression zur Erhöhung der Aktivität eines Proteins mit der Aktivität einer Amylosucrase und zur Erhöhung der Aktivität eines Proteins mit der Aktivität eines Verzweigungsenzyms führt;
  • b) aus der gemäß a) hergestellten Zelle eine Pflanze regeneriert wird; und
  • c) aus der gemäß Schritt b) erzeugten Pflanze gegebenenfalls weitere Pflanzen erzeugt werden.
Für die laut Schritt a) eingeführte genetische Modifikation gilt dasselbe, was bereits oben in anderem Zusammenhang mit den erfindungsgemäßen Pflanzen erläutert wurde.
Die Regeneration von Pflanzen gemäß Schritt b) kann nach dem Fachmann bekannten Methoden erfolgen.
Die Erzeugung weiterer Pflanzen gemäß Schritt c) der erfindungsgemäßen Verfahren kann z. B. erfolgen durch vegetative Vermehrung (beispielsweise über Stecklinge, Knollen oder über Calluskultur und Regenration ganzer Pflanzen) oder durch sexuelle Vermehrung. Die sexuelle Vermehrung findet dabei vorzugsweise kontrolliert statt, d. h. es werden ausgewählte Pflanzen mit bestimmten Eigenschaften miteinander gekreuzt und vermehrt.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die durch die erfindungsgemäßen Verfahren erhältlichen Pflanzen.
Dabei ist dem Fachmann bekannt, daß er die erfindungsgemäßen Pflanzen nicht nur durch die vorgenannten erfindungsgemäßen Verfahren erhalten kann, sondern auch durch Kreuzung beispielsweise einer genetisch modifizierten Pflanze, die durch Einführung eines fremden Nucleinsäuremoleküls eine Erhöhung der Aktivität eines Proteins mit Amylosucrase- Aktivität aufweist, mit einer transgenen Pflanze, die durch die Einführung eines fremden Nucleinsäurernoleküls eine Erhöhung der Aktivität eines Proteins mit Verzweigungsenzymaktivität aufweist. Ferner ist dem Fachmann bekannt, daß die oben beschriebene Supertransformation nicht unbedingt bei Primärtransformanten durchgeführt wird, sondern vorzugsweise bei zuvor ausgewählten stabilen transgenen Pflanzen, die vorteilhafterweise bereits durch entsprechende Experimente auf beispielsweise Fertilität, stabile Expression des Fremdgens, Hemi- und Homozygotie etc. getestet wurden. Daher sind Gegenstand der vorliegenden Erfindung auch transgene Pflanzenzellen und Pflanzen, die durch die vorgenannten Verfahren erhältlich sind und die den in den vorstehenden Ausführungsformen beschriebenen Phänotyp aufweisen.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Vermehrungsmaterial erfindungsgemäßer Pflanzen sowie der gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten transgenen Pflanzen. Der Begriff Vermehrungsmaterial umfaßt dabei jene Bestandteile der Pflanze, die geeignet sind zur Erzeugung von Nachkommen auf vegetativem oder generativem Weg. Für die vegetative Vermehrung eignen sich beispielsweise Stecklinge, Calluskulturen, Rhizome oder Knollen. Anderes Vermehrungsmaterial umfaßt beispielsweise Früchte, Samen, Sämlinge, Protoplasten, Zellkulturen etc. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Vermehrungsmaterial um Knollen und Samen.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von einem oder von mehreren Nucleinsäuremolekül(en), das (die) ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Amylosucrase und ein Protein mit der enzymatischen Aktivität eines Verzweigungsenzyms codiert (codieren), zur Herstellung von Pflanzen, die im Vergleich zu Wildtyppflanzen einen erhöhten Ertrag aufweisen und/oder die eine Stärke synthetisieren, die im Vergleich zu Stärke aus Wildtyppflanzen modifiziert ist und/oder die α-1,6 verzweigte α-1,4-Glukane mit einem modifizierten Verzweigungsgrad in O-6-Position im Vergleich zu entsprechenden nicht genetisch modifizierten Wildtyppflanzen synthetisieren.
Figurenbeschreibung
Fig. 1 pBinAR mit modifizierter "multiple cloning site" (MCS)
Fig. 2 Plasmidkarte pAmsu-wxy-Hyg
Fig. 3 Plasmidkarte pAmsu-pat-Hyg
Fig. 4 Plasmidkarte pBE-fnr-Km
Fig. 5 Plasmidkarte pBE-pat-Km
Fig. 6 Plasmidkarte pAmsu-cyt-Km
Fig. 7 Aktivitätsgel Amylosucrase
Fig. 8 Aktivitätsgel Verzweigungsenzym
Im Zusammenhang mit der Beschreibung wichtige und in den Beispielen verwendete Materialien und Methoden 1. Bestimmung des Verzweigungsgrades mittels Methylierungsanalyse
Der Verzweigungsgrad der erhaltenen Glucane kann über eine Methylierungsanalyse bestimmt werden.
Allgemeines
  • - Methylierung aller freien OH-Gruppen der Glucanproben, jeweils Doppelbestimmungen
  • - Hydrolyse der permethylierten Polymere, gefolgt von Reduktion an C-1 und Acetylierung der Monomermischung
  • - Gaschromatographische Analyse und Quantifizierung der Reaktionsprodukte
Die Aufklärung des Verzweigungsgrades der Glucanproben erfolgte über eine Methylierungsanalyse. Die freien OH-Gruppen des Polymers werden durch Überführung in Methylether markiert.
Der Abbau zu den Monomeren erfolgt säurehydrolytisch und führt zu partiell methylierten Glucosemolekülen, die in pyranosider/furanosider Form sowie als α- und β-Glucoside vorliegen. Diese Varianten werden durch Reduktion mit NaBH4 im jeweiligen partiell methylierten Sorbitderivat fokussiert. Durch die abschließende Acetylierung freier OH- Gruppen lassen sich die Reaktionsprodukte gaschromatographisch untersuchen.
Experimenteller Teil a) Herstellung der DMSO-Lösungen
Es werden 1%ige Lösungen (w/v) in DMSO hergestellt.
b) Methylierung
2 ml der DMSO-Lösung (d.h 20 mg Polymer) werden in einen 50 ml Stickstoffkolben überführt, im N2-Strom mit 5 Äquivalenten/OH (eq/OH) frisch hergestellter Dimsyllösung versetzt und für 30 Minuten gerührt. Der Kolbeninhalt wird in einem Eisbad eingefroren, mit 10 eq/OH Methyliodid versetzt und nach dem Auftauen für mindestens 2 h gerührt. Vor dem zweiten Deprotonierungs- und Methylierungsschritt wird überschüssiges Methyliodid im Vakuum entfernt.
Die Aufarbeitung erfolgt nach Entfernen des überschüssigen Methyliodids durch Zugabe von 50 ml Wasser und 5maliger Extraktion mit je 10 ml Dichlormethan. Die organische Phase wird anschließend durch 3-malige Extraktion mit Wasser von DMSO-Spuren befreit, mit CaCl2 getrocknet, filtriert und eingeengt. Anhand einer Probe wird zunächst geprüft, wieviele Methylierungsschritte zur Permethylierung der Hydroxylgruppen notwendig sind. Nach der ersten Methylierung wird die Hälfte des Ansatzes aufgearbeitet, die andere Hälfte nochmals methyliert. Nach dem Abbau beider Proben werden die Ergebnisse der GC-Analysen verglichen. Um eine eventuelle Verzweigung an C-3 zu verifizieren, die auch durch eine Untermethylierung an dieser Position vorgetäuscht werden kann, wird in jedem Fall eine zweite Methylierung angeschlossen.
c) Hydrolyse
2 mg der methylierten Probe werden in ein 1 ml Druckglas eingewogen, mit 0,9 ml 2 M Trifluoressigsäure versetzt und für 2.5 h bei 120°C gerührt. Nach dem Abkühlen des Glases wird im N2-Strom eingeengt. Zur Entfernung von Säurespuren wird dreimal Toluol zugegeben und abgeblasen.
d) Reduktion
Der Rückstand aus dem vorigen Reaktionsschritt wird mit 0,5 ml einer 0,5 M ammoniakalischen NaBD4-Lösung versetzt und für 1 h bei 60°C gerührt. Das Reagenz wird vorsichtig mit einigen Tropfen Eisessig zerstört, das entstandene Borat durch fünfmalige Zugabe von 15%iger methanolischer Essigsäure und nachfolgendem Abblasen als Borsäuretrimethylester entfernt.
e) Acetylierung
Der Rückstand aus dem vorigen Reaktionsschritt wird mit 50 µl Pyridin und 250 µl Essigsäureanhydrid versetzt und für 2 h bei 95°C gerührt. Nach dem Abkühlen wird das Reaktionsgemisch in 10 ml gesättigte NaHCO3-Lösung getropft und fünfmal mit Dichlormethan extrahiert. Die Reaktionsprodukte in der organischen Phase werden gaschromatographisch untersucht.
f) Gaschromatographie
Die gaschromatographischen Untersuchungen werden an einem Gerät der Firma Carlo Erba GC 6000 Vega Series 2 mit on-column-Einlaß und FID-Detektor vorgenommen. Die Trennungen erfolgen an einer fused-silica-Kapillarsäule Supelco SPB5 (Innendurchmesser 0,2 mm, Länge 30 m) mit Wasserstoff als Trägergas und einem Druck von 80 kPa. Es wird folgendes Temperaturprogramm verwendet: 60°C (1 min) -25°C/min → 130°C-4°C/min → 280°C.
Ergebnisse
Die Auswertung der Gaschromatogramme erfolgt durch Identifikation der Peaks, Integration der Peakflächen und Korrektur der Daten mit Hilfe des ECR-Konzeptes von Sweet et al. (Sweet et al., Carbohydr. Res. 40 (1975), 217).
1. Reinigung einer Amylosucrase aus Neisseria polysaccharea
Zur Herstellung einer Amylosucrase wurden E. coli-Zellen verwendet, die mit einer Amylosucrase aus Neisseria polysaccharea transformiert waren. Die DNA stammt aus einer genomischen Bibliothek von N. polysaccharea und weist die in der internationalen Patentanmeldung PCT/EP 98/05573 angegebene Nucleotidsequenz auf.
Eine Über-Nacht-Kultur dieser E. coli-Zellen, die das Gen codierend für eine Amylosucrase aus Neisseria polysaccharea expremieren, wurde abzentrifligiert und in ca. 1/20 Volumen 50 mM Natriumcitratpuffer (pH 6,5), 10 mM DTT (Dithiothreitol), 1 mM PMSF (Phe­ nylmethylsulfonylfluorid) resuspendiert. Anschließend wurden die Zellen mit einer French- Press bei 16.000 p.s.i. zweimal aufgeschlossen. Danach wurde dem Zell-Extrakt 1 mM MgCl2 zugegeben sowie Benzonase (von Merck; 100,000 Units; 250 Units µl-1) in einer Endkonzentration von 12,5 Units ml-1. Anschließend wurde der Ansatz bei 37°C unter leichtem Rühren mindestens 30 min inkubiert. Der Extrakt wurde mindestens 1,5 Stunden auf Eis stehen gelassen. Anschließend wurde 30 min bei 4°C bei ca. 40 000 g zentrifugiert, bis der Überstand relativ klar war.
Es wurde eine Vorfiltration mit einer PVDF Membrane (Millipore "Durapore", o. ä.) durchgeführt, die einen Porendurchmesser von 0,45 µm besaß. Der Extrakt wurde über Nacht bei 4°C stehen gelassen. Vor Durchführung der HI-(hydrophobic interaction)- Chromatographie wurde der Extrakt mit festem NaCl versetzt, und auf eine Konzentration von 2 M NaCl eingestellt. Anschließend wurde wiederum für 30 min bei 4°C und ca. 40 000 mg zentrifugiert. Danach wurde der Extrakt von letzten Resten an E. coli befreit, indem er mit einer PVDF Membrane (Millipore "Durapore", o. ä.) filtriert wurde, die einen Porendurchmesser von 0,22 µm aufwies. Der filtrierte Extrakt wurde über eine Butylsepharose-4B-Säule (Pharmacia) aufgetrennt (Volumen der Säule: 93 ml, Länge: 17,5 cm). Ca. 50 ml Extrakt mit einer Amylosucrase-Aktivität von 1 bis 5 Units µl-1 wurden auf die Säule gegeben. Anschließend wurden mit 150 ml Puffer B nicht-bindende Proteine von der Säule (Puffer B: 50 mM Natriumcitrat pH 6,5, 2 M NaCl) gewaschen. Die Amylosucrase wurde schließlich mit Hilfe eines fallenden, linearen NaCl-Gradient eluiert (von 2 M bis zu 0 M NaCl in 50 mM Natriumcitrat in einem Volumen von 433 ml bei einer Zuflußrate von 1,5 ml min-1), welcher mit Hilfe eines automatischen Pumpsystems (FPLC, Pharmacia) generiert wurde. Die Elution der Amylosucrase erfolgt zwischen 0,7 M und 0,1 M NaCl. Die Fraktionen wurden gesammelt, über eine PD10 Sephadex Säule (Pharmacia) entsalzen, mit 8,7% Glycerol stabilisiert, auf Amylosucrase-Aktivität überprüft und schließlich in Lagerpuffer (8,7% Glycerol, 50 mM Citrat) eingefroren.
2. Bestimmung der Amylosucrase-Aktivität
Aufgereinigtes Protein oder Proteinrohextrakt wird in unterschiedlichen Verdünnungen in 1 ml Ansätzen enthaltend 5% Saccharose, 0,1% Glycogen und 100 mM Citrat pH 6,5 gegeben und bei 37°C inkubiert. Nach 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 25 min und 30 min werden diesem Ansatz je 10 µl entnommen und durch sofortiges Erhitzen auf 95°C wird die enzymatische Aktivität der Amylosucrase beendet. Im gekoppelten photometrischen Test wird anschließend der Anteil der durch die Amylosucrase freigesetzten Fructose bestimmt. Dazu werden 1 µl bis 10 µl der inaktivierten Probe in 1 ml 50 mM Imidazolpuffer pH 6,9, 2 mM MgCl2, 1 mM ATP; 0,4 mM NAD und 0,5 U/ml Hexokinase gegeben. Nach sequentieller Zugabe von Glucose-6-phosphat Dehydrogenase (aus Leuconostoc mesenteroi­ des) und Phosphoglucose-Isomerase wird die Absorptionsänderung bei 340 nm gemessen. Anschließend wird mit Hilfe des Lambert-Beerschen-Gesetzes die Menge an freigesetzter Fructose berechnet.
Setzt man den erhaltenen Wert mit dem Zeitpunkt der Probennahme in Beziehung, so läßt sich die Zahl der Units (1 U = µmol Fructose/min) (pro µl Proteinextrakt bzw. µg aufgerei­ nigtes Protein) bestimmen.
In den Beispielen verwendete Vektoren:
1. pBinAR-N
In das Plasmid pBinAR (Höfgen und Willmitzer, Plant Science 66, (1990), 221-230) wurde unter Verwendung von Nukleinsäureoligonukleotiden mittels molekularbiologischer Standardmethoden (s. beispielsweise Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA (1989)) der Polylinker zwischen dem 35S Promotor und dem OCS Terminator ausgetauscht (Fig. 1). Daraus resultierte das Plasmid pBinAR-N.
2. pBinAR-Hyg-N
Das den 35S Promotor, den folgenden Polylinker und den OCS Terminator enthaltende EcoRI/HinDIII Fragment aus pBinAR-N wurde mittels molekularbiologischer Standardmethoden (s. beispielsweise Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA (1989)) in gleiche Restriktionsschnittstellen des Plasmides pBIB-Hyg (Becker, Nucleic Acids Research 18, (1990), 203) kloniert. Das daraus resultierende Plasmid trägt die Bezeichnung pBinAR-Hyg- N.
3. pBinAR-wxy-Hyg
Für die Klonierung der codierenden Sequenzen des Signalpeptides des waxy Proteins aus Zea mays (s. beispielsweise Klösgen et al., Mol. Gen. Genet. 217, (1989), 155-161) wurden die entsprechenden Sequenzen unter Verwendung der Oligonukleotide (s. SEQ ID Nos. 3 und 4) mittels PCR, ausgehend von genomischer DNA aus Zea mays (Stratagene) als Template, amplifiziert. Die dabei erhaltenen DNA Fragmente wurden mit den Restriktionsendonuklease XbaI und SalI inkubiert und in den mit SpeI und SalI geschnittenen Vektor pBinAR-Hyg-N kloniert. Das resultierende Plasmid wurde mit pBinAR-wxy-Hyg bezeichnet.
Bedingungen der PCR Reaktion Puffer und Polymerase von Gibco BRL (PlatinumTaq DNA Polymerase High Fidelity Nr.: 11304-011)
DNA 0,2 µg
10x Puffer 5 µl
MgSO4(50 mM) 2,0 µl
dNTPs (je 10 mM) 1 µl
Primer Sp-wxy-5' 100 nM
Primer Sp-wxy-3' 100 nM
Taq Platinum Hifi Polymerase 1,5 Einheiten
Dest. Wasser ad 50 µl
Reaktionsbedingungen
4. pBinAR-pat-Hyg und pBinAR-pat
Unter Verwendung der Oligonukleotide Sp-pat-5' und Sp-pat-3' (s. SEQ ID No. 5 und SEQ ID No. 6) wurden die für das Signalpeptid des Patatingens aus Kartoffel codierenden Sequenzen vom Plasmid pgT5 (Rosahl et al., Mol. Gen. Genet. 203, (1986), 214-220; Sonnewald et al., Plant J. 1, (1998), 95-106) amplifiziert, die erhaltenen Fragmente mit den Restriktionsendonuklease XbaI und SalI verdaut und in die mit SpeI und SalI geschnittenen Plasmide pBinAR-N bzw. pBinAR-Hyg-N kloniert. Die resultierenden Plasmide wurden mit pBinAR-pat bzw. pBinAR-pat-Hyg bezeichnet. Die in diesen Plasmiden enthaltene Nucleinsäuresequenz, codierend das hier verwendete Signalpeptid des Patatin-Proteins, ist in Seq ID No. 7 dargestellt, weil sie von der publizierten Signalsequenz abweicht (Aminosäureaustausch der dritten Aminosäure).
Bedingungen der PCR Reaktion Puffer und Polymerase von Boehringer Mannheim (Pwo Polymerase Nr.: 1644947)
DNA 0,2 ng
10x Puffer + MgSO4 5 µl
dNTPs (je 10 mM) 1 µl
Primer Sp-pat-5' 120 nM
Primer Sp-pat-3' 120 nM
Pwo Polymerase 1,0 Einheiten
Dest. Wasser ad 50 µl
Reaktionsbedingungen
5. Klonierung des Signalpeptides des FNR aus Spinat
Die für das FNR Signalpeptid codierenden Sequenzen aus Spinat wurden unter Verwendung der Primer Sp-fnr-5' und Sp-fnr-3' (s. Seq ID No. 8 und SEQ ID No. 9) ausgehend vom Plasmid p6SocFNR-15 (Jansen et al., Current Genetics 13, (1988), 517-522) amplifiziert. Nach Verdau der erhaltenen Fragmente mit den Restriktionsendonukleasen XbaI und SalI wurden diese in das mit SpeI und SalI geschnittene Plasmid pBinAR-N kloniert. Das resultierende Plasmid wurde mit pBinAR-fnr-N bezeichnet.
Bedingungen der PCR Reaktion Puffer und Polymerase von Gibco BRL (PlatinumTaq DNA Polymerase High Fidelity Nr.: 11304-011)
DNA 0,2 ng
10x Puffer 5 µl
MgSO4 2,0 µl
dNTPs (je 10 mM) 1 µl
Primer Sp-fnr-5' 150 nM
Primer Sp-fnr-3' 150 nM
Taq Platinum Hifi Polymerase 1,5 Einheiten
Dest. Wasser ad 50 µl
Reaktionsbedingungen
Beispiel 1 Herstellung von Expressionskassetten zur Transformation von Pflanzen: vakuoläre bzw. plastidäre Expression einer Amylosucrase aus Neisseria polysaccharea
Unter der Verwendung der Oligonukleotide AS-5' und AS-3' (s. Seq ID No. 10 und SEQ ID No. 11) wurde die für Amylosucrase codierenden Sequenzen ausgehend von dem Plasmid pNB2 (s. internationale Patentanmeldung WO 95/31553, hinterlegt bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) in Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland unter der Hinterlegungsnummer DSM 9196) mittels PCR amplifiziert. Die daraus erhaltenen Amplifikate wurden mit den Restriktionsendonukleasen XhoI und PstI verdaut und in die mit SalI und SdaI geschnittenen Plasmide pBinAR-wxy- Hyg bzw. pBinAR-pat-Hyg kloniert. Die daraus resultierenden Plasmide wurden mit pAmsu- wxy-Hyg (Fig. 2) bzw. pAmsu-pat-Hyg (Fig. 3) bezeichnet.
Bedingungen der PCR Reaktion Puffer und Polymerase von Boehringer Mannheim (Pwo Polymerase Nr.: 1644947)
DNA 0,2 ng
10x Puffer + MgSO4 5 µl
dNTPs (je 10 mM) 1 µl
Primer Sp-AS-5' 100 nM
Primer Sp-AS-3' 100 nM
Pwo Polymerase 1,0 Einheiten
Dest. Wasser ad 50 µl
Reaktionsbedingungen
Die Plasmide pAmsu-wxy-Hyg bzw. pAmsu-pat-Hyg können zur Transformation von Pflanzen nach Standardmethoden (s.o.) verwendet werden.
Beispiel 2 Herstellung von Expressionskassetten zur Transformation von Pflanzen: vakuoläre bzw. plastidäre Expression eines Verzweigungsenzyms aus Neisseria denitrificans
Unter der Verwendung der Oligonukleotide BE-5' und BE-3' (SEQ ID No. 12 und SEQ ID. No. 13) wurde die für das Verzweigungsenzym aus Neisseria denitrifleans codierende Sequenze ausgehend von dem Plasmid pBB48 (hinterlegt bei der Deutschen Sammlung für Mikroorgansimen und Zellkulturen (DSMZ) in Braunschweig, Bundesrepublik Deutschland unter der Hinterlegungsnummer DSM 12425) mittels PCR amplifiziert. Die daraus erhaltenen Amplifikate wurden mit den Restriktionsendonukleasen SalI und SdaI verdaut und in die mit SalI und SdaI geschnittenen Plasmide pBinAR-fnr bzw. pBinAR-pat kloniert. Die daraus resultierenden Plasmide wurden mit pBE-fnr-Km (Fig. 4) bzw. pBE-pat-Km (Fig. 5) bezeichnet.
Bedingungen der PCR Reaktion Puffer und Polymerase von Boehringer Mannheim (Pwo Polymerase Nr.: 1644947)
DNA 0,2 ng
10x Puffer + MgSO4 5 µl
dNTPs (je 10 mM) 1 µl
Primer BE-5' 120 nM
Primer BE-3' 120 nM
Pwo Polymerase 1,0 Einheiten
Dest. Wasser ad 50 µl
Reaktionsbedingungen
Die Plasmide pBE-fnr-Km bzw. pBE-pat-Km können zur Transformation von Pflanzen nach Standardmethoden (s.o.) verwendet werden.
Beispiel 3 Herstellung von Expressionskassetten zur Transformation von Pflanzen: cytosolische Expression einer Amylosucrase aus Neisseria polysaccharea
Ein für eine Amylosucrase aus Neisseria polysaccharea codierendes Fragment wurde mit den Restriktionsendonukleasen XmnI und EagI aus dem Plasmid pNB2 (s.o.) isoliert und die Fragmentenden mit Klenow DNA Polymerase geglättet. Anschließend erfolgte die Klonierung des Fragmentes in das mit SmaI geschnittenem Plasmid pBinAR (Höfgen und Willmitzer, Plant Science 66, (1990), 221-230). Das resultierende Plasmid wurde mit pAmsu- cyt-Km (Fig. 6) bezeichnet und kann zur Transformation von Pflanzen verwendet werden.
Beispiel 4 Identifizierung und Nachweis von transgenen Kartoffelpflanzen mit Amylosucraseaktivität
Mittels Northern Blot Analyse konnten transgene Kartoffelpflanzen identifiziert werden, die die mRNA einer Amylosucrase aus Neisseria polysaccharea aufwiesen. Anschließend wurde gezeigt, daß die Amylosucrase in solchen Pflanzen aktiv ist.
Zum Nachweis der Aktivität der Amylosucrase in stabil transformierten Pflanzen wurde Blattmaterial der zu untersuchenden Pflanzen in flüssigem Stickstoff eingefroren und anschließend in einem mit flüssigem Stickstoff vorgekühlten Mörser zerkleinert. Bevor das zerkleinerte Material auftaute, erfolgte die Zugabe von Extraktionspuffer (50 mM Natriumcitrat, pH 6.5, 4 mM DTT, 2 mM Calciumchlorid). Zu ca. 100 mg Pflanzenmaterial (Frischgewicht) wurden ca. 500 µl Extraktionspuffer gegeben. Feste Bestandteile der Suspension aus zerkleinertem Pflanzenmaterial und Extraktionspuffer wurden mittels Zentrifugation (10000 × g) abgetrennt. Ein Aliquot des daraus erhaltenen klaren Überstandes wurde mit einem viertel des Extraktvolumens Laufpuffer (40% Glycerin, 250 mM Tris pH 8.8, 0,02% Bromphenolblau) vermischt und im Polyacrylamidgel (siehe unten) bei konstanter Stromstärke von 20 mA pro Gel aufgetrennt. (Bevor die Proteinextrakte aufgetragen wurden, erfolgte eine Elektrophorese der Gele für 20 Minuten unter den oben angegebenen Bedingungen.) Nachdem der Farbstoff Bromphenolblau aus dem Gel herausgelaufen war, wurde die Elektrophorese beendet. Das Gel wurde anschließend fünf mal in Waschpuffer (100 mM Natriumcitrat pH 6.5) in jeweils dem fünffachen Volumen des Gelvolumens für jeweils 20 Minuten unter Schwenken bei Raumtemperatur equilibriert. Anschließend wurde das Gel in der fünffachen Menge des Gelvolumens Inkubationspuffer (100 mM Natriumcitrat pH 6.5, 5% Saccharose) bei 37°C für 16 Stunden inkubiert. Nach Abgießen des Inkubationspuffers wurde unter Zugabe Lugolscher Lösung (1 : 5 verdünnt) das von der Amylosucrase gebildete Glucan als bräunlich-blaue Bande sichtbar (Fig. 7).
Zusammensetzung des Polyacrylamidgels a) Trenngel
375 mM Tris pH 8,8
7,5% Polyacrylamid (Biorad Nr. EC-890)
Für die Polymerisation:
1/2000 Volumen TEMED
1/100 Volumen Ammoniumpersulfat
b) Sammelgel
125 mM Tris pH 6,8
4% Polyacrylamid (Biorad Nr. EC-890)
Für die Polymerisation:
1/2000 Volumen TEMED
1/100 Volumen Ammoniumpersulfat
c) Elektrophoresepuffer
375 mM Tris pH 8.8
200 mM Glycin
Beispiel 5 Identifizierung und Nachweis von transgenen Kartoffelpflanzen mit Verzweigungsenzymaktivität
Mittels Northern Blot Analyse konnten transgene Kartoffelpflanzen identifiziert werden, die die mRNA eines Verzweigungsenzyms aus Neisseria denitrificans aufwiesen. Zum Nachweis der Aktivität des Verzweigungsenzyms in stabil transformierten Pflanzen wurde Blattmaterial der zu untersuchenden Pflanzen in flüssigem Stickstoff eingefroren und anschließend in einem mit flüssigem Stickstoff vorgekühlten Mörser zerkleinert. Bevor das zerkleinerte Material auftaute, erfolgte eine Zugabe von Extraktrionspuffer (50 mM Natriumcitrat, pH 6.5, 4 mM DTT, 2 mM Calciumchlorid). Zu ca. 100 mg Pflanzenmaterial (Frischgewicht) wurden ca. 200 µl Extraktionspuffer gegeben. Feste Bestandteile der Suspension aus zerkleinertem Pflanzenmaterial und Extraktionspuffer wurden durch Zentrifugation (10000x g) abgetrennt. Ein Aliquot des daraus erhaltenen klaren Überstandes wurde mit einem viertel des Extraktvolumens Laufpuffer (40% Glycerin, 250 mM Tris pH 8.8, 0,02% Bromphenolblau) vermischt und im Polyacrylamid Gel (siehe unten), bei konstanter Stromstärke von 20 mA pro Gel aufgetrennt. (Bevor die Proteinextrakte aufgetragen wurden, erfolgte eine Elektrophorese der Gele für 20 Minuten unter den oben angegebenen Bedingungen). Nachdem der im Laufpuffer vorhandene Farbstoff Bromphenolblau aus dem Gel herausgelaufen war, wurde die Elektrophorese beendet. Das Gel wurde anschließend fünf mal in Waschpuffer (100 mM Natriumcitrat pH 6.5) in jeweils dem fünffachen Volumen des Gelvolumens für jeweils 20 Minuten unter Schwenken bei Raumtemperatur equilibriert. Anschließend wurde das Gel in der fünffachen Menge des Gelvolumens Inkubationspuffer (100 mM Natriumcitrat pH 6.5, 5% Saccharose, 0.625 Einheiten gereinigte Amylosucrase aus Neisseria polysaccharea (Reinigung des Enzyms und Bestimmung der Aktivität s.o.) bei 30°C für 16 Stunden inkubiert. Nach Abgießen des Inkubationspuffers wird nach Zugabe Lugolscher Lösung (1 : 5 verdünnt) das von der Amylosucrase in Kombination mit dem Verzweigungsenzym gebildete Glucan als bläulich-braune Bande (Fig. 8) sichtbar. Das gesamte restliche Polyacrylamidgel färbt sich dabei durch die von der im Inkubationspuffer vorhandene Amylosucraseaktivität blau.
Zusammensetzung des Polyacrylamidgels a) Trenngel
375 mM Tris pH 8,8
7,5% Polyacrylamid (Biorad Nr. EC-890)
Für die Polymerisation:
1/2000 Volumen TEMED
1/100 Volumen Ammoniumpersulfat
b) Sammelgel
125 mM Tris pH 6,8
4% Polyacrylamid (Biorad Nr. EC-890)
Für die Polymerisation:
1/2000 Volumen TEMED
1/100 Volumen Ammoniumpersulfat
c) Elektrophoresepuffer
375 mM Tris pH 8.8
200 mM Glycin
SEQUENCE LISTING

Claims (21)

1. Transgene Pflanzenzelle, die genetisch modifiziert ist, wobei die genetische Modifikation in der Einführung eines fremden Nucleinsäuremoleküls oder mehrerer fremder Nucleinsäuremoleküle besteht, dessen/deren Vorhandensein oder dessen/deren Expression zur Erhöhung der Aktivität eines Amylosucraseproteins und zur Erhöhung der Aktivität eines Verzweigungsenzymproteins führt/führen im Vergleich zu entsprechenden nicht genetisch modifizierten Pflanzenzellen von Wildtyppflanzenzellen.
2. Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 1, die α-1,6 verzweigte α-1,4-Glucane mit einem modifizierten Verzweigungsgrad in O-6-Position synthetisiert, welche von entsprech­ enden nicht genetisch modifizierten Wildtyppflanzenzellen nicht synthetisiert werden.
3. Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 1 oder 2, die eine modifizierte Stärke synthetisiert, welche von entsprechenden nicht genetisch modifizierten Wildtyppflanzenzellen nicht synthetisiert wird.
4. Transgene Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das fremde Nucleinsäuremolekül ein Protein mit der Aktivität einer Amylosucrase aus einem Bakterium der Gattung Neisseria und ein Protein mit der Aktivität eines Verzweigungsenzyms aus einem Bakterium der Gattung Neisseria codiert.
5. Transgene Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei eines der fremden Nucleinsäuremoleküle ein Protein mit der Aktivität einer Amylosucrase aus einem Bakterium der Gattung Neisseria codiert und wobei ein weiteres Nucleinsäuremolekül ein Protein mit der Aktivität eines Verzweigungsenzyms aus Neisseria denitrificans codiert.
6. Transgene Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das fremde Nucleinsäuremolekül eine oder mehrere Proteintargetingsignalsequenz(en) aufweist, die eine vakuoläre Lokalisation des Amylosucraseproteins und des Verzweigungsenzymproteins vermittelt (vermitteln).
7. Transgene Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die fremden Nucleinsäuremoleküle jeweils eine oder jeweils mehrere Proteintargetingsignalsequenz(en) aufweisen, die eine vakuoläre Lokalisation des Amylosucraseproteins und des Verzweigungsenzymproteins vermittelt (vermitteln).
8. Transgene Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das fremde Nucleinsäuremolekül eine oder mehrere Proteintargetingsignalsequenz(en) aufweist, die eine plastidäre Lokalisation des Amylosucraseproteins und des Verzweigungsenzymproteins vermittelt (vermitteln).
9. Transgene Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die fremden Nucleinsäuremoleküle jeweils eine oder jeweils mehrere Proteintargetingsignalsequenz(en) aufweisen, die eine plastidäre Lokalisation des Amylosucraseproteins und des Verzweigungsenzymproteins vermittelt (vermitteln).
10. Transgene Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das fremde Nucleinsäuremolekül eine oder mehrere Proteintargetingsignalsequenz(en) aufweist, die eine zellwandspezifische Lokalisation des Amylosucraseproteins und des Verzweigungsenzymproteins vermittelt (vermitteln).
11. Transgene Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die fremden Nucleinsäuremoleküle jeweils eine oder jeweils mehrere Proteintargetingsignalsequenz(en) aufweisen, die eine zellwandspezifische Lokalisation des Amylosucraseproteins und des Verzweigungsenzymproteins vermittelt (vermitteln).
12. Transgene Pflanze enthaltend transgene Pflanzenzellen nach einem der Ansprüche 1 bis 11.
13. Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 1 bis 11, die einen erhöhten Ertrag im Vergleich zu entsprechenden nicht genetisch modifizierten Wildtyppflanzen aufweist.
14. Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 12 oder 13, die eine faserbildende oder ölspeichernde oder stärkespeichernde oder zuckerspeichernde oder proteinspeichernde Pflanze ist.
15. Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 12 oder 13, die eine Futter- oder Gemüsepflanze ist.
16. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze, die im Vergleich zu Wildtyppflanzen einen erhöhten Ertrag aufweist, wobei
  • a) eine pflanzliche Zelle genetisch modifiziert wird durch die Einführung eines oder mehrerer fremder Nucleinsäuremolekül(s)e, deren/dessen Vorhandensein oder deren/dessen Expression zur Erhöhung der Aktivität eines Proteins mit der Aktivität einer Amylosucrase und zur Erhöhung der Aktivität eines Proteins mit der Aktivität eines Verzweigungsenzyms führt;
  • b) aus der gemäß a) hergestellten Zelle eine Pflanze regeneriert wird; und
  • c) aus der gemäß Schritt b) erzeugten Pflanze gegebenenfalls weitere Pflanzen erzeugt werden.
17. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze, die α-1,6 verzweigte α-1,4-Glucane mit einem modifizierten Verzweigungsgrad in O-6-Position im Vergleich zu entsprechenden nicht genetisch modifizierten Wildtyppflanzen synthetisiert, wobei
  • a) eine pflanzliche Zelle genetisch modifiziert wird durch die Einführung eines oder mehrerer fremder Nucleinsäuremolekül(s)e, deren/dessen Vorhandensein oder deren/dessen Expression zur Erhöhung der Aktivität eines Proteins mit der Aktivität einer Amylosucrase und zur Erhöhung der Aktivität eines Proteins mit der Aktivität eines Verzweigungsenzyms führt;
  • b) aus der gemäß a) hergestellten Zelle eine Pflanze regeneriert wird; und
  • c) aus der gemäß Schritt b) erzeugten Pflanze gegebenenfalls weitere Pflanzen erzeugt werden.
18. Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze, die eine modifizierte Stärke synthetisiert im Vergleich zu entsprechenden nicht genetisch modifizierten Wildtyppflanzen, wobei
  • a) eine pflanzliche Zelle genetisch modifiziert wird durch die Einführung eines oder mehrerer fremder Nucleinsäuremolekül(s)e, deren/dessen Vorhandensein oder deren/dessen Expression zur Erhöhung der Aktivität eines Proteins mit der Aktivität einer Amylosucrase und zur Erhöhung der Aktivität eines Proteins mit der Aktivität eines Verzweigungsenzyms führt;
  • b) aus der gemäß a) hergestellten Zelle eine Pflanze regeneriert wird; und
  • c) aus der gemäß Schritt b) erzeugten Pflanze gegebenenfalls weitere Pflanzen erzeugt werden.
19. Transgene Pflanze erhältlich durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 18.
20. Vermehrungs- oder Erntematerial von Pflanzen nach einem der Ansprüche 12 bis 15 oder 19.
21. Verwendung von einem oder mehreren Nucleinsäuremolekül(en), das (die) ein Protein mit der enzymatischen Aktivität einer Amylosucrase und ein Protein mit der enzymatischen Aktivität eines Verzweigungsenzyms codiert (codieren), zur Herstellung von Pflanzen, die im Vergleich zu Wildtyppflanzen einen erhöhten Ertrag aufweisen und/oder die eine Stärke synthetisieren, die im Vergleich zu Stärke aus Wildtyppflanzen modifiziert ist und/oder die α-1,6 verzweigte α-1,4-Glukane mit einem modifizierten Verzweigungsgrad in O-6-Position im Vergleich zu entsprechenden nicht genetisch modifizierten Wildtyppflanzen synthetisieren.
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