KR20010099681A - 나이세리아속 세균에서 가지화 효소를 코딩하는 핵산분자및 α-1,6-가지화 α-1,4-글루칸을 제조하는 방법 - Google Patents

나이세리아속 세균에서 가지화 효소를 코딩하는 핵산분자및 α-1,6-가지화 α-1,4-글루칸을 제조하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 나이세리아속 세균에서 가지화 효소를 코딩하는 핵산분자, 상기 핵산분자를 함유하는 벡터, 숙주세포, 식물세포 및 식물 뿐만 아니라, 상기 식물로부터 얻을 수 있는 전분에 관한 것이며,
그리고 수크로스 및 아밀로수크라아제와 가지화 효소의 효소조합에 기초하여 α-1,6-가지화 α-1,4-글루칸을 생체외 제조하는 방법 뿐만 아니라 상기 방법에 의해 얻을 수 있는 α-1,6-가지화 α-1,4-글루칸에 관한 것이다.

Description

나이세리아속 세균에서 가지화 효소를 코딩하는 핵산분자 및 α-1,6-가지화 α-1,4-글루칸을 제조하는 방법{NUCLEIC ACID MOLECULES WHICH CODE A BRANCHING ENZYME FROM BACTERIA OF THE GENUS NEISSERIA, AND A METHOD FOR PRODUCING α-1,6-BRANCHED α-1,4-GLUCANS}
본 발명은 나이세리아속 세균에서 가지화 효소를 코딩하는 핵산분자, 상기 핵산분자를 함유하는 벡터, 숙주세포, 식물세포 및 식물 뿐만 아니라, 상기 식물로부터 얻을 수 있는 전분에 관한 것이다. 그리고, 본 발명은 수크로스를 기초로 하여 α-1,6 가지화 α-1,4-글루칸을 생체외에서 제조하는 방법 및 아밀로수크라아제와 가지화 효소를 효소조합하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 얻을 수 있는 글루칸에 관한 것이다.
다방면에서, α-1,6-가지화 α-1,4-글루칸은 약학산업 및 화장품 산업에서 제품을 제조하는데 있어서 적당하기 때문에 관심이 많다. 이들은 예를 들어, 정제용 결합제, 약학제제용 부형제, 포장재, 분말첨가제용 부형제, 선크림용 UV-흡수첨가제 및 향료와 향수의 부형제로서 사용될 수 있다.
식물에서, α-1,6-가지화 α-1,4-글루칸은 전분성분인 아밀로펙틴으로서 주로 발견될 수 있다. 동물 및 세균에서, 글루칸은 글리코겐의 형태로 주로 발생한다.
다당전분은 글루코스 분자와 같은 화학적으로 균일한 기본적 형성블록의 형태로 형성되지만, 그의 물리화학적 특성이 매우 다른 중합화 및 가지화 정도에 관해 상이한, 다른 형태의 분자의 복합혼합물이다. 이는 α-1,4-글리코시드결합 글루코스 유닛의 비-가지화 중합체인 아밀로스 전분과, 추가의 α-1,6-글리코시드 결합의 존재로 인해 가지화된 가지화 중합체인 아밀로펙틴 전분사이에서 분화되어야 한다. 참고문헌(Voet and Voet, Biochemistry, John Wiley & Sons, 1990)에 따라, 평균 24 내지 30개의 글루코스 잔기뒤에 α-1,6-가지화가 일어나며, 이는 약 3% 내지 4%의 가지화 정도에 대응된다. 가지화 정도의 표시법은 다양하며, 각 전분의 기원(예를 들면, 식물종, 식물변종)에 따라 다르다. 전분을 산업적으로 제조하기 위해 보통 사용되는 식물에 있어서, 전분의 전체비율에서 아밀로스의 비율은 10% 내지 25%로 다양하다. 다른 가지화 정도로 α-1,6-가지화 α-1,4-글루칸을 제조하기 위한 다양한 접근방법은 이미 개시되어 있으며, 상기 접근방법에는 (유전자도입) 식물을 사용하는 것도 포함되어 있다.
예를 들어, 감자식물내에서 세균성 글리코겐 신타아제이 이종발현되면, 야생형 식물에 비해 아밀로스 함량이 약간 감소하며, 가지화 정도가 증가하고, 아밀로펙틴의 가지화 패턴이 변형된다(Shewmaker 외 다수, Plant. Physiol. 104(1994) 1159-1166). 그리고, 아밀로스-유리 감자 돌연변이체(amf)(Jacobsen 외 다수, Euphytica 44 (1989), 43-48)내 E.coli의 가지화 효소(glgB)를 이종발현시키면, 대조군(amf)보다 25% 높은 가지화 지점(Kortstee 외 다수, Plant J. 10 (1996), 83-90)을 갖는 아밀로펙틴 분자를 생성시킨다. 유전자도입 식물내에서 제조되는, 다른 가지화 정도를 갖는 글루칸을 분리하기 위해, 예를 들어 아밀로스 성분을 제거하기 위한 추가의 정제단계를 실시할 필요가 있다. 상기 정제단계는 어려우며, 따라서 시간-소모적이고, 비용-집약적이다. 그리고, 상기 접근방법에 의해 특정 가지화 정도를 얻을 수는 없다. 실험조건(환경요인, 장소)을 다양하게 함으로써, 상기 생체내 방법들은 생성물의 질과 관련하여 매우 다양하다.
글리코겐은 아밀로펙틴보다 높은 가지화 정도를 가진다. 상기 다당류는 또한 α-1,6-가지화 α-1,4-글루칸도 함유한다. 글리코겐은 또한, 측사슬의 평균길이 및 중합화 정도에 있어서 전분과 다르다. 참고문헌(Voet and Voet, Biochemistry, John Wiley & Sons, 1990)에 따르면, 글리코겐은 평균적으로 8 내지 12개의 글루코스 잔기뒤에 α-1,6-가지화 지점을 포함한다. 이는 약 8% 내지 12%의 가지화 정도와 상응한다. 글리코겐의 분자량 정도는 100만 내지 10억의 범위에서 다양하다(D.J.Manners in: Advances in Carbohydrate Chemistry, Ed. M. L. Wolfrom, Academic Press, New York (1957), 261-298; Geddes 외 다수, Carbohydr. Res. 261 (1994), 79-89). 상기 정도는 또한, 기원의 각 유기체, 그의 영양상태 및 글리코겐의 분리법 유형에 따라 크게 다르다. 글리코겐은 보통, 마합류(예를 들면, 담치), 포유류 간 또는 근육(예를 들면, 토끼, 쥐)로부터 회수된다(Bell 외 다수, Biochem. J. 28 (1934), 882; Bueding and Orrell, J. Biol. Chem. 236 (1961), 2854). 이는 산업규모 시간소모적 및 비용-집약적인 제조가 된다.
자연발생 α-1,6-가지화 α-1,4-글루칸, 전분 및 글리코겐은 1,6-글리코시드 가지화의 함량에 따라 매우 다르다. 그중에서 용해도, 투명도, 효소적 가수분해,리올로지, 겔형성 및 퇴화 특성과 관련된 것은 사실이다. 그러나, 많은 산업용도를 위해, 특성에 있어서의 상기 변수는 항상 극복될 수는 없다. 생체외 접근방법은 식물 또는 동물유기체로부터 α-1,6-가지화 α-1,4-글루칸을 회수하기 위한 선택적인 방법이다. 생체내 방법에 비해, 생체외 반응조건이 생체조건에 비해 정확히 제어될 수 있기 때문에 생체외 방법은 보통 대조군보다 나으며, 매우 재생가능하다. 이로써 고도의 균일도 및 순도, 결국 높은 품질을 갖는 불변생성물을 제조하게 되며, 따라서 추가의 산업용도를 위해 매우 중요하다. 일정한 품질의 생성물을 제조하면, 제조에 필요한 공정변수들이 모든 제조구성을 위해 최적화될 필요가 없기 때문에, 비용이 절감된다. 특정 생체외 방법의 다른 잇점은 상기 생성물에 생체내 방법에 사용된 유기체와 유리되어 있다는 점이다. 이는 식품 및 약학용도에서 특정 용도를 위해 절대적으로 필요하다.
보통, 생체외 방법은 2개의 다른 그룹으로 세분화될 수 있다.
첫번째 그룹의 방법에서, 다양한 기질, 가령 아밀로스, 아밀로펙틴 및 글리코겐이 가지화 효소의 활성의 영향을 받는다.
기질 아밀로스와 연관된 감자의 가지화 효소를 사용하여, 아밀로펙틴과 유사하지만 그의 구조에 있어서 상이한 생성물을 생성할 수 있다는 것을 Borovsky 외 다수(Eur. J. Biochem. 59 (1975), 615-625)는 입증할 수 있었다.
그리고, Boyer 및 Preiss(Biochemistry 16 (1977), 3693-3699)는 E.coli의 정제된 가지화 효소(α-1,4-글루칸: α-1,4-글루칸 6-글리코실전달효소)가 아밀로스 또는 아밀로펙틴의 가지화 정도를 증가시키는데 사용될 수 있다는 것을 입증하였다. 그러나, E.coli 또는 토끼 간의 글리코겐이 E.coli의 가지화 효소와 함께 배양된다면, 가지화 정도는 약간만 증가될 수 있다(Boyer 및 Preiss, 상기 인용됨).
Rumbak 외 다수(J. Bacteriol. 173 (1991), 6732-6741)는 부티리비브리오 피브리솔벤스(Butyrivibrio fibriosolvens)의 가지화 효소와 함께 아밀로스, 아밀로펙틴 및 글리코겐을 배양함으로써 상기 기질들의 가지화 정도를 실질적으로 증가시킬 수 있었다.
Okada 외 다수는 전분-함유 식료품의 특성들을 향상시키기 위해 유사하게 접근하였다(미국특허 제4454161호). 이들은 가령 아밀로스, 아밀로펙틴, 전분 또는 덱스트린과 같은 기질들을 가지화 효소와 함께 배양하였다. 이는 대응하게 변형된 기질을 함유하는 식료품의 내구성에 유리한 영향을 미쳤다. 그리고, 유럽특허 EP-A1 0 690 170에는 가지화 효소를 사용하여 수용액내에서 젤리화 전분을 반응시키는 것이 기술되어 있다. 상기 생체외 방법의 단점은 추출물(예를 들면, 전분, 아밀로펙틴 등)의 다양한 가지화 정도로 인해 균일한 생성물을 제조하는 것이 불가능하다는 점이다. 그리고, 가지화 정도를 의도적으로 제어할 수도 없으며, 사용된 기질은 매우 비싸다.
다른 그룹의 생체외 방법은 1,4-글루칸-사슬-형성 효소(가인산분해효소(phophorylase, 전분 합성효소, 글리코겐 합성효소) 및 가지화 효소로 구성된 효소 조합물을 사용하여 여러 기질들(글루코스-1-포스페이트, ADP 글루코스, UDP 글루코스)로부터 출발하여 α-1,6-가지화 α-1,4-글루칸을 새로 합성하는 것을 포함한다.
Illingwort 외 다수(Proc. Nat. Acad. Sci. USA 47 (1961), 469-478)는 가지화 효소(비공지 유기체)와 조합한 근육(비공지 기질)으로부터 가인산분해효소를 사용한 생체외 방법에 대해, 기질 글루코스-1-포스페이트를 사용하여 글리코겐과 유사한 분자들을 새로 합성하는 것이 가능하다는 것을 입증할 수 있었다. Boyer 및 Prieiss(상기 인용)는 기질 글루코스-1-포스페이트 또는 UDP 글루코스를 사용하여 E.coli의 글리코겐 합성효소 또는 토끼 근육의 가인산분해효소의 효소활성을 조합하고, 상기 방법으로 가지화 α-글루칸을 발생시켰다. Borovsky 외 다수(Eur. J. Biochem. 59 (1975) 615-625)는 또한, 옥수수의 가인산분해효소(1,4-α-D-글루칸: 오르토포스페이트 α-글리코실전달효소[EC 2.4.1.1])와 조합하여 감자의 가지화 효소를 사용하여 글루코스-1-포스페이트로부터 α-1,6-가지화 α-1,4-글루칸을 새로 합성하는 것을 분석하였다. Doi(Biochimica et Biophysica Acta 184 (1969), 477-485)는 기질 ADP 글루코스를 사용하여 시금치의 전분 합성효소(ADP-D-글루코스: α-1,4-글루칸 α-4-글루코실전달효소) 및 감자의 가지화 효소를 효소조합하면 아밀로펙틴과 유사한 생성물이 생성된다는 것을 입증하였다. Parodi 외 다수(Arch. Biochem. Biophys. 132 (1969), 11-117)는 UDP 글루코스로부터 가지화 글루칸을 새로 합성하기 위해 쥐 간의 가지화 효소와 조합된 주 간의 글리코겐 합성효소를 사용하였다. 이들은 천연 글리코겐과 유사하고, 글루코스-1-포스페이트에 기초한 중합체와 상이한 중합체를 얻었다.
상기 두번째 그룹의 생체외 방법의 단점은 기질, 예를 들어 글루코스-1-포스페이트, UDP 글루코스 및 ADP 글루코스가 매우 비싸다는 점이다.
그리고, 가지화 정도를 의도적으로 제어할 수도 없는 것 같다.
Buettcher 외 다수의 (J. Bacteriol. 179 (1997), 3324-3330)에는 기질로서 아밀로수크라아제 및 수크로스를 사용하여 불용성 α-1,4-글루칸을 제조하는 생체외 방법이 기술되어 있다. 그러나, 가지화 없이 선형 α-1,4-글루칸만 합성된다.
따라서, 본 발명을 이루는 기술적인 문제는 α-1,6-가지화 α-1,4-글루칸을 산업적인 목적으로 저렴하게 제조하는 방법 뿐만 아니라, 상기 방법에 사용될 수 있는 효소, 특히 가지화 효소를 코딩하는 핵산분자를 제공하는 것이다.
상기 기술적인 문제는 청구의 범위에서 특징화된 구체적인 내용을 제공함으로써 해결되었다.
그러므로, 본 발명은
(a)서열번호 2에 기술된 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 핵산분자;
(b)서열번호 1에 기술된 코딩영역의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산분자;
(c)플라스미드 DSM 12425의 삽입물(insert)에 의하여 코딩된 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 핵산분자;
(d)나이세리아 데니트리피칸스의 가지화 효소를 코딩하고, 플라스미드 DSM 12425의 삽입영역을 포함하는 핵산분자;
(e)처음 100개의 아미노산이 서열번호 2에 기술된 서열에 관해 적어도 65%의상동성을 갖는 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 핵산분자;
(f)상보가닥이 (a), (b), (c), (d) 및/또는 (e)에 따른 핵산분자와 교잡(hybrid)하고, 나이세리아속 세균의 가지화 효소를 코딩하는 핵산분자; 및
(g)유전코드의 퇴화(the degeneracy of the genetic code)로 인해 (f)에 따른 핵산분자의 서열과 상이한 핵산서열을 포함하는 핵산분자로 이루어진 그룹에서 선택된 나이세리아속 세균의 가지화 효소(EC 2.4.1.18)를 코딩하는 핵산분자에 관한 것이다.
서열번호 1에 기술된 핵산서열은 나이세리아 데니트리피칸스(Neisseria denitrificans)에 대한 코딩영역을 포함하는 게놈 서열이다. 상기 DNA 서열을 포함하는 플라스미드는 DSM 12425로 기탁되어 있다. 상기 서열 또는 상기 분자에 의해 당업자는 기타 나이세리아 종 또는 나이세리아 균주로부터 상동서열을 새로 분리할 수 있다. 그/그녀는 적당한 교잡(hybridization) 프로브에 의해 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 선별하는 것과 같은 종래의 방법을 사용하여 실시할 수 있다. 동종서열은 또한, 실시예 1에 기술된 바대로 분리될 수 있다. 따라서, 서열번호 1에 기술된 서열로 교잡하고, 가지화 효소를 코딩하는 핵산분자를 동정 및 분리할 수 있다.
본 발명의 핵산분자는 나이세리아속 세균의 가지화효소를 코딩하며, 나이세리아 데니트리피칸스의 가지화 효소를 코딩하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따라, "교잡(hybridization)"라는 용어는 종래의 교잡 조건, 바람직하게는 Sambrook 외 다수의 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ndedition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY에 기술된 엄격한 조건(stringent condition)하에서의 교잡을 의미한다. 특히 바람직하게는, "교잡"라는 용어는 하기 조건하에서의 교잡을 의미한다:
교잡 버퍼: 2xSSX; 10x 덴하르트 용액(Fikoll 400+PEG+BSA; 1:1:1 비율); 0.1% SDS; 5mM EDTA; 50mM Na2HPO4; 250㎍/㎖ 청어 정자 DNA; 50㎍/㎖ tRNA; 또는 25M 인산나트륨 완충액, pH 7.2; 1mM EDTA; 7% SDS
교잡온도: T = 65 내지 68℃
세척버퍼: 0.2xSSC; 0.1% SDS
세척온도: T = 65 내지 68℃
본 발명의 핵산분자로 교잡하는 핵산분자들은 대응 단백질을 발현하는 나이세리아속 세균으로부터 유도되며, 바람직하게는 나이세리아 데니트리피칸스로부터 유도된다. 본 발명의 분자들로 교잡하는 핵산분자들은 예를 들어, 게놈 또는 cDNA 라이브러리로부터 분리된다. 상기 핵산분자는 기본방법(Sambrook 외 다수, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)에 따라 교잡하거나, 또는 PCR에 의해 증폭함으로써 상기 분자들의 역 상보분자 또는 상기 분자들의 일부 또는 본 발명의 핵산분자를 사용하여 동정(identified) 및 분리될 수 있다.
교잡 프로브로서는, 서열번호 1에 기술된 뉴클레오티드 또는 그의 일부를 정확히 또는 본질적으로 가지는 핵산분자들이 사용될 수 있다. 교잡 프로브로서 사용된 단편은 종래의 합성기술에 의해 생성된 합성단편 및 본 발명의 핵산분자중 하나와 상동한 서열이다.
본 발명의 핵산서열이 교잡하는 유전자가 동종 및 분리된다면, 상기 서열은 측정되어야 하며, 상기 서열에 의해 코딩된 단백질의 특성은 상기 단백질이 가지화 효소인지를 알기 위해 분석되어야 한다. 상기 목적을 위해, 핵산 및 아미노산 서열수준에 대한 상동성을 비교하고, 효소활성을 측정하는데 특히 적당하다.
본 발명의 핵산분자로 교잡하는 분자는 나이세리아속 세균, 바람직하게는 나이세리아 데니트리피칸스의 가지화 효소를 코딩하는 상기 핵산분자의 단편, 유도체 및 대립 변이체를 포함한다. 본 명세서에서, "유도체(derivative)"라는 용어는 상기 분자의 서열이 하나 이상의 위치에서 상기 핵산분자의 서열과 상이하며, 상기 서열과 고도로 상동하다는 것을 의미한다. 본 명세서에서, 상동성은 전체 길이에 대해 적어도 60%, 특히 적어도 70%, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상 및 가장 바람직하게는 적어도 95%의 서열 상동성이 있다는 것을 의미한다. 상기 핵산분자의 편차는 예를 들어, 결실, 첨가, 치환, 삽입 또는 재조합에 의해 야기된다.
그리고, 상동성이란 상기에 의해 코딩되는 각 핵산분자 또는 단백질사이의 기능적 및/또는 구조적 동등성이 있음을 의미한다. 상기 핵산분자와 상동하고, 상기 분자들의 유도체인 핵산분자는 같은 생물학적 기능을 갖는 변이체이다. 상기는 자연발생 변이체, 예를 들어 기타 나이세리아종 또는 나이세리아 균주의 서열 및 자연발생하거나 또는 지정 돌연변이생성에 의해 유도된 상기 돌연변이에 의한 돌연변이 모두가 된다. 그리고, 상기 변이체는 합성적으로 생성된 서열이다. 대립 변이체는 재조합 DNA 기술에 의해 또는 합성적으로 생성된 변이체 및 자연-발생 변이체 모두가 된다.
본 발명의 핵산분자의 기타 변이체에 의해 코딩된 단백질은 특정 특징들을 가진다. 상기는 예를 들어, 생물학적 활성, 분자량, 면역반응성, 입체구조 등 뿐만 아니라, 물리적 특성, 가령 겔 전기영동시 이동행동, 크로마토그래프 행동, 침강계수, 용해도, 분광특성, 안정성; pH 최적, 온도최적 등을 포함한다.
나이세리아 데니트리피칸스의 가지화 효소의 분자량은 86.3kDa이며, 상기 분자량은 아미노산 서열로부터 알 수 있다. 그리고, 본 발명의 단백질의 추론된 분자량은 바람직하게는 70kDa 내지 100kDa, 보다 바람직하게는 77kDa 내지 95kDa 및 가장 바람직하게는 약 86kDa이다.
본 발명은 또한, 서열번호 2에 기술된 아미노산 서열에 대해, N-말단영역, 처음 100개의 아미노산, 보다 바람직하게는 처음 110개의 아미노산 및 가장 바람직하게는 처음 120개의 아미노산에서 적어도 65%, 바람직하게는 적어도 80% 및 가장 바람직하게는 적어도 95%의 상동성을 갖는 인코딩 단백질을 갖는 가지화 효소의 효소활성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산분자에 관한 것이다.
다른 구체예에서, 본 발명은 가지화 효소의 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산분자에 관한 것으로서, 상기 단백질은 하기의 펩티드 모티프중 적어도 1개, 바람직하게는 적어도 5개, 보다 바람직하게는 적어도 10개 및 가장 바람직하게는 적어도 20개를 포함한다:
(a)MNRNRHI(서열번호 8),
(b)RPDAHH(서열번호 9),
(c)HAPDYAL(서열번호 10),
(d)EGEAA(서열번호 11),
(e)DDYRF(서열번호 12),
(f)SALQH(서열번호 13),
(g)YETLG(서열번호 14),
(h)VSGVR(서열번호 15),
(i)VSVIG(서열번호 16),
(j)FNGWD(서열번호 17),
(k)LYKFS(서열번호 18),
(l)PYAFG(서열번호 19),
(m)RPTTAS(서열번호 20),
(n)FRRRA(서열번호 21),
(o)DELVNY(서열번호 22),
(p)LPLSEY(서열번호 23),
(q)YQATGL(서열번호 24),
(r)DDHGL(서열번호 25),
(s)HQDWN(서열번호 26),
(t)DGIRV(서열번호 27),
(u)YGGSEN(서열번호 28),
(v)SFAEES(서열번호 29),
(w)DPVHR(서열번호 30),
(x)WQQFAN(서열번호 31),
(y)EILNS(서열번호 32),
(z)ATEIQTAL(서열번호 33),
(aa)VKDKQAKAK(서열번호 34).
본 발명의 핵산분자는 특정 핵산분자, 특히 DNA, 또는 RNA 분자, 예를 들어 cDNA, 게놈 DNA, mRNA 등이다. 이들은 유전적 또는 화학적 합성기술에 의해 생성된 분자 또는 자연발생분자이다. 이들은 코딩 또는 비-코딩가닥을 포함하는 단일-가닥 분자이거나, 또는 이중-가닥 분자이다.
그리고, 본 발명은 길이가 적어도 15, 바람직하게는 50 이상, 및 가장 바람직하게는 200개 이상의 뉴클레오티드인 핵산분자에 관한 것이며, 상기 핵산분자들은 본 발명의 적어도 1개의 핵산분자로 특이적으로 교잡한다. 본 명세서에서, "특이적으로 교잡하는"이라는 용어는 상기 분자가 본 발명의 단백질을 코딩하는 핵산분자로 교잡하지만, 다른 단백질을 코딩하는 핵산분자로는 교잡하지 않는다는 것을 의미한다. "교잡"이라는 용어는 엄격한 조건하에서 교잡하는 것을 의미한다(상기 참조). 특히, 본 발명은 본 발명의 핵산분자의 전사물을 교잡하고, 그럼으로써 그의 해독을 억제할 수 있는 핵산분자에 관한 것이다. 본 발명의 핵산분자로 특이적으로 교잡하는 상기 핵산분자는 예를 들어, 안티-센스 구조물 또는 리보좀의 성분이거나, 또는 PCR에 의해 증폭을위한 프라이머로서 사용된다.
또한, 본 발명은 유전공학에서 보통 사용되고, 본 발명의 상기 핵산분자를 함유하는 벡터, 특히 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 박테리오파지 및 기타 벡터들에 관한 것이다.
바람직한 구체예에서, 벡터내에 함유되어 있는 핵산분자는 원핵세포 또는 진핵세포에서 발현을 보장하는 조절요소에 센스-배향으로 결합된다. 본 명세서에서, "발현(expression)"이라는 용어는 전사 또는 전사 및 해독을 모두 의미한다.
원핵세포, 예를 들어 Escherichia coli에서 본 발명의 핵산분자를 발현하면, 코딩된 단백질의 효소적 활성의 보다 정확한 특징화가 가능해진다. 그리고, 종래의 분자생물학 기술(Sambrook 외 다수의 문헌 참조, 상기 인용됨)에 의해 본 발명의 핵산분자로 여러 돌연변이를 도입할 수 있다. 이는 선택적으로 변형된 특성들을 갖는 단백질을 합성할 수 있게 한다. 또한, 인코딩 DNA 서열의 5' 또는 3' 단부를 연속결실시킴으로써 결실 돌연변이체를 생성할 수 있으며, 그럼으로써 핵산분자를 발생시키면 대응하게 짧아진 단백질을 얻게 된다. 그리고, 예를 들어 효소활성 또는 효소조절에 영향을 미치는 위치에서 점 돌연변이를 도입할 수 있다. 상기 방법에서, 변형된 KM값을 가지고, 알로스테릭 조절 또는 공유 변형을 통해 세포내에서 통상의 조절기작에 더이상 들어가지 않는 돌연변이체가 발생된다. 그리고, 변형된 기질 또는 생성물 특이성을 가지는 돌연변이체가 생성된다. 또한, 변형된 활성-온도 프로필을 갖는 돌연변이체가 생성된다. 원핵세포내 유전조작은 당업자들에게 공지된 방법(Sambrook 외 다수의 문헌 참조, 상기 인용)에 따라 실시된다.
E.coli와 같은 원핵유기체 및 진핵유기체에서 발현하기 위한 조절서열, 특히 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 효모내 발현을 위한 서열은 참고문헌에 충분히 기술되어 있다. Methods in Enzymology 153 (1987), 383-516 및 Bitter 외 다수의 (Methods in Enzymology 153 (1987), 516-544)에는 여러 숙주 유기체내에서 단백질을 발현하기 위한 여러 시스템들의 개략도가 제공되어 있다.
바람직하게는, 본 발명의 벡터내에 삽입된 본 발명의 핵산분자는 적당한 숙주 유기체내에서 발현된 후에 배양배지로부터 코딩된 단백질을 분리하기가 더 쉬운 방법으로 변형된다. 친화도 크로마토그래피에 의해 융합단백질을 분리시키는 특정 결합특성을 갖는 추가의 폴리펩티드 서열과 함께 융합단백질로서 코딩된 가지화 효소를 발현할 수 있다(Chong 외 다수, Gene 192 (1997), 271-281; Hopp 외 다수, Bio/Thechnology 6 (1988), 1204-1210; Sassenfeld, Trends Biotechnol. 8 (1990), 88-93 참조).
그리고, 본 발명의 벡터내에 함유된 핵산분자는 배양배지로 가지화 효소를 분비하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, Klebsiella oxytoca M5A1로부터 α-CGT아제의 시그널 펩티드를 코딩하는 서열이 사용된다(Fiedler 외 다수, J. Mol.Biol. 256 (1996), 279-291; Genebank acc. no. X86014, CDS 11529-11618). 배양배지로 효소를 분비함으로써 회수 및 정제가 보다 쉬워진다. 세포의 파괴가 피해지며, 상기 효소는 종래의 방법, 가령 투석, 삼투압, 크로마토그래피 방법 등, 배양배지의 잉여성분을 제거하는데 사용되는 방법에 의해 배양배지로부터 제거될 수 있다.
그리고, 본 발명의 벡터는 숙주 유기체내 벡터의 안정화를 일으키는 기타 작용 유닛, 가령 세균 복제기원 또는 사카로마이세스 세레비지애에서 안정화를 위한 2μ-DNA를 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 숙주세포, 특히 상기의 핵산분자 또는 벡터에 의해 형질전환된 원핵세포 또는 진핵세포 뿐만 아니라 상기 숙주세포로부터 유도되고, 상기 핵산분자 또는 벡터를 함유하는 세포에 관한 것이다. 숙주세포는 세균세포(예를 들어, E. coli) 또는 균류 세포(예를 들어, 효모, 특히 사카로마이세스 세레비지애) 뿐만 아니라 식물 또는 동물세포이다. "형질전환된"이라는 용어는 본 발명의 세포가 그들의 자연 게놈에 더해 본 발명의 적어도 하나의 핵산분자를 함유하는 한에서는 본 발명의 핵산분자에 의해 유전적으로 변형된다는 것을 의미한다. 상기 핵산분자는 자기-복제분자로서 세포내에 자유 존재되거나, 또는 숙주세포의 게놈으로 안정하게 통합된다.
숙주세포는 미생물인 것이 바람직하다. 본 발명에서, 예를 들어 Schlegel "Allgemeine Mikrobiologie"(Georg Thieme Verlag(1985). 1-2)에 기술된 바와 같이 상기 미생물은 모든 세균 및 모든 원생생물(예를 들어, 균류, 특히 효모 및 조류)이다.
본 발명의 숙주세포는 식물세포인 것이 특히 바람직하다. 본래, 상기는 단자엽식물 및 쌍자엽식물 모두를 포함하는 식물종의 세포를 포함한다. 바람직하게는, 상기 세포는 농업용으로 유용한 식물, 즉 영양 또는 기술적인 목적, 특히 산업적인 목적으로 배양하는 식물의 식물세포이다. 본 발명은 바람직하게는, 섬유-형성 식물(예. 아마, 대마, 면), 오일-저장 식물(예. 유채, 해바라기, 콩), 당-저장 식물(예. 사탕무, 사탕수수, 사탕기장, 바나나) 및 단백질-저장 식물(예. 콩과식물)로부터의 식물세포에 관한 것이다.
다른 구체예에서, 본 발명은 사료작물(예. 벼과사료작물 및 목초작물(알팔파, 클로버 등)), 식용식물(예. 토마토, 양상치, 치커리)로부터의 식물세포에 관한 것이다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 전분-저장 식물(예. 밀, 보리, 귀리, 호밀, 감자, 옥수수, 벼, 완두, 카사바, 녹두)로부터의 식물세포에 관한 것이다. 옥수수, 벼, 밀 및 감자로부터의 식물세포가 특히 바람직하다.
그리고, 본 발명은 나이세리아속 세균으로부터 가지화 효소를 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법에서, 본 발명의 숙주세포는 단백질을 발현시키는 조건하에서 배양되며, 상기 단백질은 세포 및/또는 배양배지와 같은 배양액으로부터 회수된다. 바람직하게는, 가지화 효소를 분비하는 숙주 유기체가 사용된다.
그리고, 본 발명은 나이세리아속 세균으로부터 가지화 효소를 제조하는 방법에 관한 것이며, 상기 단백질은 본 발명의 핵산분자를 사용하여 생체외 전사 및 해독 시스템에서 생성된다. 당업자는 상기 시스템과 친숙하다.
본 발명은 또한, 본 발명의 핵산분자에 의해 코딩되거나, 또는 본 발명의 방법에 의해 얻을 수 있는 단백질에 관한 것이다.
그리고, 본 발명은 본 발명의 단백질을 특이적으로 인식하는 항체에 관한 것이다. 상기 항체들은 모노클론 또는 다중클론 항체이다. 이들은 또한, 본 발명의 단백질을 인식하는 항체의 단편이다. 당업자는 상기 항체 또는 단편을 제조하는 방법에 익숙하다.
또한, 본 발명은 생체외 시스템에서 α-1,6-가지화 α-1,4-글루칸을 제조하기 위해 본 발명의 가지화 효소를 사용하는 것에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 또한 본 발명의 핵산분자 또는 벡터를 함유하는 유전자도입 식물세포에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 세포는 도입된 본 발명의 핵산분자가 게놈으로 안정하게 통합되고, 식물세포에서 프로모터에 의해 조절되는 것을 특징으로 한다.
식물세포내에는 본 발명의 핵산분자를 발현하기 위해 처리하는 다수의 프로모터 또는 조절요소가 있다. 본래, 식물내에서 활성을 갖는 모든 프로모터, 인핸서, 종결제 등은 식물세포내 발현을 위한 조절요소이다. 기본적으로, 형질전환을 위해 선택된 식물내에서 작용성인 프로모터가 사용될 수 있다. 사용된 식물종에 관해, 프로모터는 동종 또는 이종일 수 있다. 상기 프로모터는 발현이 식물의 발달시간 또는 외부영향에 의해 측정되는 시간에 특정 조직에서만 또는 구성적인 방법으로 일어나는 방법으로 선택될 수 있다. 적당한 프로모터의 예는 꽃양배추(Cauliflower) 모자이크 바이러스의 35S 프로모터가 있으며(Odell 외 다수, Nature 313 (1985), 810-812 또는 US 5 352 605), 이는 국제공개 WO/9401571에 기술된 식물의 모든 조직 및 프로모터 구조물을 구성발현시킨다. 유비퀴틴 프로모터(예를 들어, US 5 614 399 참조) 및 옥수수의 폴리유비퀴틴 유전자의 프로모터(Christensen 외 다수, 상기 인용됨)는 추가의 예이다. 그러나, 외부영향(예를 들어, WO/9307279 참조)에 의해 측정된 시간에 단지 활성화된 프로모터도 또한 사용될 수 있다. 간단히 유도시키는 열쇼크 단백질의 프로모터는 특히 관심이 있다. 그리고, 광합성적으로 활성인 조직과 같이 식물의 특정 조직내 다운스트림 서열을 발현시키는 프로모터도 사용될 수 있다. 그의 예로는 ST-LS1 프로모터(Stockhaus 외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7943-7947; Stockhaus 외 다수, EMBO J. 8 (1989), 2445-2451 참조), Ca/b 프로모터(US 5 656 496, US 5 639 952, Bansal 외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 3654-3658 참조) 및 루비스코 SSU 프로모터(US 5 034 322 및 US 4 962 028 참조)가 있다. 그리고, 형질전환되는 식물의 전분-저장 기관내에서 활성을 갖는 프로모터를 언급한다. 예를 들어, 옥수수에서는 옥수수 알맹이인 반면에, 감자에서는 괴경이다. 본 발명의 핵산분자를 감자내에서 과잉-발현하기 위해, 괴경-특이적 파타틴(patatin) 유전자 프로모터 B33(Rocha-Sosa 외 다수, EMBO J. 8 (1989), 23-29)이 사용될 수있다. 종자-특이적 프로모터는 여러 식물종에 대해 이미 개시되어 있다. V. faba 및 기타 식물에서 종자-특이적 발현을보장하는 Vicia faba의 USP 프로모터(Fiedler 외 다수, Plant Mol. Biol. 22 (1993), 669-679; Baumlein 외 다수, Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 459-467)가 그의 예이다.
그리고, WO 91/01373에 기술된 열매-특이적 프로모터도 또한 사용될 수 있다. 배유-특이적 발현을 위한 프로모터, 가령 글루텔린 프로모터(Leisy 외 다수,Plant Mol. Biol. 14 (1990), 41-50; Zheng 외 다수, Plant J. 4 (1993), 357-366), 밀의 HMG 프로모터, USP 프로모터, 파세올린 프로모터 또는 옥수수의 제인 유전자의 프로모터(Pedersen 외 다수, Cell 29 (1982), 1015-1026; Quatroccio 외 다수, Plant Mol. Biol. 15 (1990), 81-93)가 특히 바람직하다. 배유-특이적 프로모터에 의해, 대응하는 야생형 식물의 배유에 비해 배유내에서 본 발명의 핵산분자의 전사물 양을 증가시킬 수 있다.
옥수수의 쉬렁큰-1-프로모터(sh-1)(Werr 외 다수, EMBO J. 4 (1985), 1373-1380)가 특히 바람직하다.
그리고, 전사물을 안정화시키는 기능을 갖는 전사물에 poly-A 꼬리를 부가하고 전사를 정확하게 종결시키는데 반응성인 종결제 서열이 있다. 상기 요소들은 문헌 (예를 들어, Gielen 외 다수, EMBO J. 8 (1989), 23-29)에 기술되어 있으며, 변경될 수 있다.
그러므로, 식물세포내에서 본 발명의 핵산분자를 발현할 수 있다.
따라서, 본 발명은 식물세포로 본 발명의 핵산분자 또는 벡터를 도입하는 것으로 이루어진 유전자도입 식물세포의 제조방법에 관한 것이다. 당업자는 처리시에 여러 식물 형질전환 시스템을 가지며, 예를 들어 식물세포를 형질전환시키기 위한 T-DNA의 용도가 광범위하게 조사되었으며, EP-A-120 516; Hoekema: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Chapter V, Fraley, Crit. Rev. Plant. Sci., 4, 1-46 및 An, EMBO J. 4 (1985), 277-287에 기술되어 있다.
식물세포내에서 DNA를 전달하기 위해, 식물 외식편이 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 또는 아그로박테리움 리조겐스(Agrobacterium rhizogenes)와 함께 적당하게 공-배양될 수 있다. 그후, 형질전환된 세포를 선별하기 위한 항생물질 또는 살생제를 함유할 수 있는 적당한 배지내에서 감염된 식물재료(예를 들어, 잎 일부, 줄기 단편, 뿌리, 및 원형질체 또는 현탁액내에서 배양된 식물세포)로부터 전체 식물이 발생될 수 있다. 상기 방법으로 얻은 식물은 도입된 DNA의 존재에 대해 시험될 수 있다. 생분해 방법을 사용하거나, 또는 원형질체 형질전환에 의해 외부 DNA를 도입할 수 있는 다른 가능성은 공지되어 있다(Willmitzer, L. 1993 Transgenic plants. In: Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise (H.J.Rehm, G.Reed, A.Puhler, P.Stadler, eds), Vol. 2, 627-659, VCH Weinheim-New York-Basel-Cambridge 참조).
단자엽 식물을 형질전환시키기 위한 선택적인 시스템은 생분해 방법, 원형질체에서 전기적 또는 화학적으로 유도된 DNA 흡수, 일부 투과성 세포의 전기천공법, 화서내에 DNA의 미량주입, 소포자 및 전배내에 DNA의 미량주입, 발아 화분을 통한 DNA 흡수 및 팽창에 의한 배아내 DNA 흡수에 의해 형질전환하는 것이다(예를 들어, Lusardi, Plant J. 5 (1994), 571-582; Paszowski, Biotechnology 24 (1992), 387-392 참조).
아그로박테리움 튜머파시엔스에 의해 Ti-플라스미드 벡터 시스템을 통해 쌍자엽 식물을 형질전환시키는 것은 잘 알려져 있는 반면, 최근의 연구는 단자엽 식물도 아그로박테리움에 기초한 벡터에 의해 형질전환될 수 있다는 사실에 중점을두었다(Chain, Plant Mol. Biol. 22 (1993), 491-506; Hiei, Plant J. 6 (1994), 271-282; Bytebier, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 5345-5349; Raineri, Bio/Technology 8 (1990), 33-38; Gould, Plant Physiol. 95 (1991), 426-434; Mooney, Plant, Cell Tiss. & Org. Cult. 25 (1991), 209-218; Li, Plant Mol. Biol. 20 (1992), 1037-1048 참조).
과거에는, 상기 3개의 형질전환 시스템이 여러 곡류에 대해 정립되었다: 조직의 전기천공법, 원형질체의 형질전환 및 재생가능조직 및 세포내 입자 폭격에 의한 DNA 전달(Jahne, Euphytica 85 (1995), 35-44 참조). 밀의 형질전환은 문헌 (Maheshwari, Critical Reviews in Plant Science 14(2) (1995), 149-178 참조)에 여러 차례 기술되어 있다.
특히, 옥수수의 형질전환은 문헌 (예를 들어, WO 95/06128, EP 0513849, EO 0465875, EP 292435; Fromm 외 다수, Biotechnology 8 (1990), 833-844; Gordon-Kamm 외 다수, Plant Cell 2 (1990), 603-618; Koziel 외 다수, Biotechnology 11 (1993), 194-200; Moroc 외 다수, Theor. Appl. Genet. 80 (1990), 721-726)에 여러 차례 기술되어 있다.
다른 종류의 곡류의 성공적인 형질전환은 예를 들어 보리(Wan and Lemaux, 상기 인용; Ritala 외 다수, 상기 인용; Krens 외 다수, Nature 296 (1982), 72-74) 및 밀(Nehra 외 다수, Plant J. 5 (1994), 285-297)에 대해 또한 기술되어 있다.
식물내에서 본 발명의 핵산분자를 발현하기 위해, 합성단백질을 식물세포의구획내에 위치시킬 수 있다.
코딩 영역은 특정 구획내 집적을 이루기 우해 각 구획내에 집적을 보장하는 DNA 서열에 선택적으로 결합되어야 한다. 상기 서열들은 공지되어 있다(예를 들어, Braun, EMBO J. 11 (1992), 3219-3227; Sonnewald, Plant J. 1 (1991), 95-106; Rocha-Sosa, EMBO J. 8 (1989), 23-29 참조).
색소체의 시그널 서열로서, 시금치의 페록도신:NADP+산화환원효소(FNR) 중 하나가 사용될 수 있다. 상기 서열은 시금치의 색소체 단백질 페록도신:NADP+산화환원효소의 cDNA의 플랭킹 트랜싯 펩티드 서열 및 5' 비-해독 영역을 포함한다(뉴클레오티드 -171 내지 +165; Jansen 외 다수, Current Genetics 13 (1988), 517-522).
그리고, 옥수수의 왁시 단백질의 트랜싯 펩티드 + 성숙한 왁시 단백질의 처음 34개의 아미노산(Klosgen 외 다수, Mol. Gen. Genet. 217 (1989), 155-161)도 또한 색소체 시그널 서열로서 사용될 수 있다. 그리고, 옥수수의 왁시 단백질의 트랜싯 펩티드(상기 참조)는 또한 성숙한 왁시 단백질의 34개의 아미노산 없이 사용될 수도 있다.
게다가, 하기의 색소체 시그널 서열들을 사용하는 것도 생각할 수 있다: 리불로스 비포스페이트 카르복실라아제 소 서브유닛의 시그널 서열(Wolter 외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 846-850; Nawrath 외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994), 12760-12764); NADP 말레이트 탈수소효소의 시그널 서열(Gallardo 외 다수, Planta 197 (1995), 324-332); 글루타티온 환원효소의 시그널 서열(Creissen 외 다수, Plant J. 8 (1995), 167-175).
그러므로, 본 발명은 또한, 본 발명의 하나 이상의 핵산분자에 의해 형질전환된 유전자도입 식물세포 뿐만 아니라, 상기 방법으로 형질전환된 세포로부터 유도된 유전자도입 식물세포에 관한 것이다. 상기 세포는 식물세포내에서 전사를 보장하는 조절 DNA 요소에 결합되는 상기 분자, 특히 프로모터에 의해 본 발명의 하나 이상의 핵산분자를 함유한다. 상기 세포는 본 발명의 적어도 하나의 핵산분자를 함유한다는 점에서 자연발생 식물세포로부터 분화될 수 있다.
유전자도입 식물세포는 당 분야에 보통의 기술을 가진 자들에게 잘 알려져 있는 방법을 사용하여 전체 식물로 재생될 수 있다. 본 발명의 유전자도입 식물세포의 재생에 의해 얻을 수 있는 식물도 또한 본 발명의 주제가 된다.
그리고, 상기 식물세포를 함유하는 식물은 본 발명의 주제가 된다. 본 발명의 식물은 단자엽식물 및 쌍자엽식물 둘다 된다. 이들은 영양적 또는 기술적, 특히 산업적인 목적으로 재배된 식물과 같이 유용한 식물이 바람직하다. 바람직하게는, 본 발명은 섬유-형성 식물(예. 아마, 대마, 면), 오일-저장 식물(예. 유채, 해바라기, 콩), 당-저장 식물(예. 사탕무, 사탕수수, 사탕기장, 바나나) 및 단백질-저장 식물(예. 콩과식물)로부터의 식물세포에 관한 것이다.
다른 구체예에서, 본 발명은 사료작물(예. 벼과사료작물 및 목초작물(알팔파, 클로버 등)), 식용식물(예. 토마토, 양상치, 치커리)로부터의 식물세포에 관한 것이다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 전분-저장 식물(예. 밀, 보리, 귀리, 호밀,감자, 옥수수, 벼, 완두, 카사바, 녹두)로부터의 식물세포에 관한 것이다. 옥수수, 벼, 밀 및 감자로부터의 식물세포가 특히 바람직하다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 식물세포는 유전적으로 변형되지 않은 야생형 식물의 대응 식물세포에 비해 본 발명의 단백질의 증가된 활성을 가진다. 이들은 전분-저장 조직의 세포, 특히 괴경세포 또는 배유세포, 가장 바람직하게는 감자괴경 세포 또는 옥수수, 밀 또는 벼식물의 배유 세포가 바람직하다.
본 발명의 범주내에서, "활성증가"라는 용어는 가지화 효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 본 발명의 핵산분자의 발현 증가, 가지화 효소활성을 갖는 단백질의 양 증가 및/또는 식물내에서 가지화 효소활성을 갖는 단백질의 활성 증가를 의미한다.
발현 증가는 노던 블롯 분석 또는 RT-PCR에 의해 상기 단백질을 코딩하는 전사물의 양을 측정함으로써 측정될 수 있다. 본 명세서에서, "증가"라는 용어는 유전적으로 변형되지 않은 식물세포에 비해 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 보다 바람직하게는 적어도 50%, 및 가장 바람직하게는 적어도 75%까지 전사물의 양이 증가함을 의미한다.
가지화 효소 활성을 갖는 단백질의 양은 웨스턴 블롯 분석에 의해 측정될 수 있다. 본 명세서에서, "증가"라는 용어는 가지화 효소 활성을 갖는 단백질의 양이 유전적으로 변형되지 않은 대응세포에 비해 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 보다 바람직하게는 적어도 50% 및 가장 바람직하게는 적어도 75%까지 증가함을 으미한다.
가지화 효소 활성 증가는 Lloyd 외 다수의 (Biochem. J. 338 (1999), 515-521)에 기술되어 있는 방법에 따라 측정될 수 있다. 본 명세서에서, "증가"라는 용어는 가지화 효소 활성이 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 보다 바람직하게는 적어도 50% 및 가장 바람직하게는 적어도 75%까지 증가함을 의미한다.
가지화 효소 활성이 증가된 본 발명의 식물세포를 함유하는 식물이 유전적으로 변형되지 않은 대응 야생형 식물에 비해 변형된 전분을 합성한다는 것을 알았다. 변형된 전분은 야생형 식물내에서 합성된 전분에 비해, 물리-화학적 특성, 특히 아밀로스/아밀로펙틴 비율, 가지화 정도, 평균 사슬길이, 포스페이트 함량, 점도, 전분입자의 크기, 측사슬의 분포 및/또는 전분입자의 형태에 관해 변형될 수 있다. 결과적으로, 변형된 전분은 특정 목적에 보다 적당하다.
그리고, 본 발명의 가지화 효소의 활성은 증가하고, 전분의 조성은 대응 야생형 식물의 전분에 비해 높은 겔 조직 및/또는 감소된 포스페이트 함량 및/또는 감소된 피크 점도 및/또는 감소된 패스티피케이션 온도 및/또는 감소된 전분입자 크기 및/또는 측사슬의 변형된 분포를 갖는 방법으로 변형된다는 것을 알았다.
본 명세서에서, "증가된 겔 조직"이라는 용어는 야생형 식물의 전분의 겔 조직에 비해 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 100%, 적어도 200% 및 가장 바람직하게는 적어도 300%까지 증가한다는 것을 의미한다. 겔 조직은 하기에 기술된 바와 같이 측정된다:
본 발명의 범주에서, "감소된 포스페이트 함량"이라는 용어는 본 발명의 식물세포내에서 합성된 전분의 C-6 위치내 포스페이트의 함량 및/또는 공유결합된 포스페이트의 전체함량이 대응 야생형 식물의 식물세포로부터의 전분에 비해 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 40%, 보다 바람직하게는 적어도 60% 및 가장 바람직하게는 적어도 80%까지 감소된다는 것을 의미한다.
C-6 위치에서 포스페이트의 함량 또는 전체 포스페이트 함량은 하기 기술된 방법에 따라 측정될 수 있다.
본 발명의 범주내에서, "감소된 피크 점도"라는 용어는 피크 점도가 야생형 식물의 전분의 피크점도에 비해 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 25%, 보다 바람직하게는 적어도 50% 및 가장 바람직하게는 적어도 75%까지 감소된다는 것을 의미한다.
본 발명의 범주내에서, "감소된 패스티피케이션 온도"라는 용어는 야생형 식물의 전분의 패스티피케이션 온도에 비해 적어도 0.5℃, 바람직하게는 적어도 1.0℃, 보다 바람직하게는 적어도 2.0℃, 가장 바람직하게는 적어도 3.0℃까지 감소된다는 것을 의미한다.
피크 점도 및 패스티피케이션 온도는 하기 기술된 방법에서 Rapid Visco Analyzer에 의해 측정될 수 잇다.
당업자는 "피크 점도" 및 "패스티피케이션 온도"라는 용어에 친숙할 것이다.
"감소된 전분입자크기"라는 용어는 크기가 15㎛ 이하인 전분입자의 비율이 야생형 식물에 비해 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 30%, 보다 바람직하게는 적어도 50%, 100%까지 증가한다는 것을 의미한다.
전분입자크기는 하기에 기술된 방법에서 독일의 Retsch, GmbH제 "Limosed"형포토세디멘토미터에 의해 측정된다.
본 명세서에서, "측사슬의 변형된 분포"라는 용어는 6 내지 9의 DP를 갖는 측사슬의 비율이 야생형 식물의 아밀로펙틴의 6 내지 9의 DP를 갖는 측사슬의 비율에 비해 적어도 25%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 100% 및 가장 바람직하게는 적어도 200%까지 증가된다는 것을 의미한다.
본 발명의 다른 구체예에서, "측사슬의 변형된 분포"라는 용어는 6 내지 8, 바람직하게는 6 내지 7의 DP를 갖는 측사슬의 비율이 야생형 식물의 아밀로펙틴의 대응 중합화 정도를 갖는 측사슬의 비율에 비해 적어도 25%, 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 100% 및 가장 바람직하게는 적어도 200%까지 증가된다는 것을 의미한다.
측사슬의 비율은 모든 측사슬의 전체 비율에 관해 특정 측사슬의 비율을측정함으로써 알 수 있다. 모든 측사슬의 전체 빙류은 HPLC 크로마토그래프에서 DP 6 내지 30의 중합화 정도를 나타내는 피크이하의 전체 면적을 측정함으로써 알 수 있다. 모든 측사슬의 전체 비율에 관해 특정 측사슬의 비율은 전체 면적에 대한, HPLC 크로마토그래프에서 상기 측사슬을 나타내는 피크아래의 면적비율을 측정함으로써 알 수 있다. 바람직하게는, USA의 Dionex제 프로그램 Al-450 버젼 3.31이 사용된다.
다른 구체예에서, 본 발명은 야생형 식물의 전분의 아밀로펙틴에 비해 5의 DP를 갖는 측사슬을 가지는 아밀로펙틴을 가지는 전분에 관한 것이다.
그리고, 본 발명은 변형된 전분을 합성하는 유전자도입 식물을 제조하기 위한 방법에 관한 것으로서,
(a)식물세포는 가지화 효소 활성을 갖는 단백질의 활성을 증가시키는 발현의 존재를 본 발명의 핵산분자 및/또는 본 발명의 벡터에 도입함으로써 유전적으로 변형되며;
(b)단계(a)에 따라 제조된 세포로부터 식물이 재생되며; 및
(c)단계 (b)에 따라 제조된 식물로부터 선택적으로 추가의 식물이 생성된다.
바람직한 구체예 방법에 있어서, 전분은 대응하는 야생형 식물의 전분에 비해 증가된 겔 조직 및/또는 감소된 포스페이트 함량 및/또는 감소된 피크 점도 및/또는 감소된 패스티피케이션 온도 및/또는 감소된 전분입자크기 및/또는 변형된 측사슬 분포를 갖는 방법으로 변형된다.
본 명세서에서, "증가된 겔 조직", "감소된 포스페이트 함량", "감소된 피크점도", "감소된 패스티피케이션 온도", "감소된 전분입자크기" 및 "변형된 측사슬분포"라는 용어는 상기에 정의되어 있다.
단계 (a)에 따라 도입된 유전적인 변형에 관해서는, 본 발명의 식물에 관한 다른 문헌에 설명된 바와 동일하다.
단계 (b)에 따른 식물의 재생은 당업자에게 공지된 방법에 의해 얻을 수 있다.
본 발명의 방법중 단계 (b)에 따른 추가의 식물은 영양번식(예를 들면, 절단, 괴경 또는 칼러스 배양 및 전체 식물 재생) 또는 유성생식에 의해 생성될 수 있다. 바람직하게는, 유성생식은 조절되는데, 즉 특정 성질을 갖는 선택된 식물들이 교잡육종되고, 생식된다.
본 발명은 또한, 본 발명의 방법에 의해 얻을 수 있는 식물에 관한 것이다.
본 발명은 본 발명의 식물 뿐만 아니라 본 발명의 방법에 따라 생성된 유전자도입 식물의 생식물질에 관한 것이다. 본 명세서에서, "생식물질"이라는 용어는 유성 또는 무성 방법으로 프로게니를 생성하기에 적당한 식물의 성분들이 유성 생식에 적당한 절단, 칼러스 배양, 라이좀 또는 괴경인 것을 의미한다. 다른 생식물질은 예를 들어, 과실, 종자, 파종, 원형질체, 세포 배양액 등을 포함한다. 생식물질은 괴경 및 종자인 것이 바람직하다.
본 발명의 유전자도입 식물세포 및 식물 뿐만 아니라 생식물질로부터 얻을 수 있는 전분은 본 발명의 또다른 주제가 된다.
본 발명의 벡터 또는 본 발명의 핵산분자의 발현으로 인해, 유전적으로 변형되지 않은 야생형 식물의 식물세포에 비해 가지화 효소의 활성을 증가시키며, 본발명의 유전자 식물세포 및 식물은 그의 물리화학적 특성, 특히 겔 조직 및/또는 패스티피케이션 행동 및/또는 전분입자의 크기 및/또는 포스페이트 함량 및/또는 측사슬의 분포에 관해, 야생형 식물에서 합성된 전분에 비해 변형된 전분을 합성한다.
그리고, 본 발명은 또한, 증가된 겔 조직 및/또는 감소된 포스페이트 함량 및/또는 감소된 피크 점도 및/또는 감소된 패스티피케이션 온도 및/또는 감소된 전분입자크기 및/또는 변형된 측사슬 분포를 갖는 것을 특징으로 하는 전분에 관한 것이다.
특히 바람직한 구체예에서, 본 발명은 감자전분에 관한 것이다.
본 명세서에서, "증가된 겔 조직", "감소된 포스페이트 함량", "감소된 피크 점도", "감소된 패스티피케이션 온도", "감소된 전분입자크기" 및 "측사슬의 변형된 분포"라는 용어는 상기에 정의되어 잇다.
그리고, 본 발명은 상기와 같이 본 발명의 (식물)세포로부터, 및/또는 상기 식물의 전분-저장부로부터 전분을 추출하는 단계를 포함하는 변형된 전분을 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 또한, 전분이 추출되기 전에, 재배식물 및/또는 상기 식물의 전분-저장부를 수확하는 단계 및 보다 바람직하게는, 그들을 수확하기 전에 본 발명의 식물을 재배하는 단계를 포함한다. 당업자는 식물 또는, 식물의 전분-저장부의 전분을 추출하는 방법을 알 것이다. 그리고, 여러 전분-저장 식물로부터 전분을 추출하는 방법은 예를 들어, "Starch: Chemistry and Technologt(ed.: Whistler, BeMiller and Paschall (1994), 2nd edition, Academic Press Inc. London Ltd.; ISBN 0-12-746270-8; chapter XII, p. 412-468: Maize and Sorghum Starches: Production; by Watson; chapter XII, p. 469-479; Tapioca, Arrow Root and Sago Starches: Production; by Corbishley and Miller; chapter XIV, p. 479-490: Potato Starch: Production and Applications; by Mitch; chapter XV, p 491-506: Wheat Starch: Production, Modification and Applications; by Rohmer and Klem; Maize Starch: Eckhoff 외 다수, Cereal Chem. 73 (1996), 54-57(옥수수 전분을 산업적인 용도로 추출하는 것은 소위 습식 밀링에 의해 실시된다) 참조). 식물재료로부터 전분을 추출하는 방법에 보통 사용되는 도구로는 분리기, 상층액분리기, 하이드로사이클론, 분무건조기 및 유동층 건조기가 있다.
상기 방법에 의해 얻을 수 있는 전분은 또한, 본 발명의 주제가 된다.
본 발명의 전분은 당업자에게 공지된 방법에 따라 변형될 수 있으며, 변형되지 않거나 또는 변형된 형태로 식료품 또는 비-식료품 산업에서 여러 용도에 적합하다.
본래, 2개의 대규모 분야로 용도가 세분화될 수 있다. 한 분야는 전분생성물, 즉 효소적 또는 화학적 방법을 통해 얻은 글루코스 및 글루칸 생성 블록을 가수분해하는 것을 포함한다. 이들은 발효과 같은 추가의 화학적 변형 및 방법을 위한 출발물질로서 제공한다. 비용을 절감시키기 위해, 가수분해 방법을 간단하고 저렴하게 실시하는 것이 중요할 수 있다. 현재, 상기 방법은 아밀로글루코시다아제를 사용하는 효소적이다. 효소의 사용을 줄임으로써 비용을 절감할 수 있다. 이는 전분의 구조, 예를 들어 입자의 표면구획을 변경시킴으로써 이루어지며, 사용된 효소에 대한 접속력을 제한하는 입체구조 또는 낮은 가지화 정도로 인해 소화하기가 쉬워질 수 있었다.
중합성 구조로 인해 전분이 천연 전분으로서 사용되는 다른 분야는 2개의 분야로 추가로 세분화될 수 있다.
1. 식료품에 있어서의 용도
전분은 여러 식료품을 위한 엄가제이며, 이는 수성 첨가제를 결합시킬 목적으로 제공되고/또는 점도 또는 겔 형성을 증가시킨다. 중요한 특징적 특성은 유동및 수착행동, 팽윤 및 패스티피케이션 온도, 점도 및 농후 행동, 전분의 용해도, 투명성 및 페이스트 구조, 열, 전단력 및 산 내성, 퇴화성향, 막형성력, 동결/해동, 소화력 뿐만 아니라, 무기 또는 유기산에 의한 복합체 형성능력이 있다.
2. 비-식료품에 있어서의 용도
다른 주 용도는 여러 제조방법에서 보조제로서, 기술적 생성물에서 첨가제로서 전분을 사용하는 것이다. 전분을 보조제로서 사용하기 위한 주요 용도분야는 먼저, 종이 및 카드보드 산업이다. 상기 분야에서, 전분은 보유(고체 회수), 충진제 및 미세입자의 사이징, 물질의 고화 및 탈수를 위해 주로 사용된다. 그리고, 강성도, 경도, 사운드, 그립, 광택, 연화도, 인열강도 뿐만 아니라 표면에 관한 전분의 유리한 특성이 사용된다.
2.1 종이 및 카드보드 산업
종이제조방법에서, 4개의 용도분야, 즉 표면, 코팅, 질량 및 분무사이에 분화가 일어날 수 있다. 표면처리에 관한 전분의 조건은 본래, 고도의 광택, 대응 점도, 고 점도 안정성, 양호한 막형성 뿐만 아니라 먼지의 적은 형성이다. 물질에 대한 첨가제로서, 신속하고, 균일하고, 손실-자유 분산도, 높은 기계적 안정성 및 종이펄프에 있어서의 완전한 보유력이 중요하다. 분무시 전분을 사용할때, 고체의 대응함량, 고점도 뿐만 아니라 높은 결합력이 또한 중요하다.
2.2 접착제 산업
주요 용도분야는 접착제 산업이며, 이 분야는 4개의 영역: 순수한 전분 야교로서의 용도, 특정 화학물에 의해 제조된 전분 아교에 있어서의 용도, 합성수지 및중합체 분산물에 대한 첨가제로서의 전분의 용도 뿐만 아니라 합성 첨가제용 확장제로서의 전분의 용도로 세분화된다. 모든 전분-계 접착제중 90%는 골판지, 종이 색 및 백, 종이 및 알루미늄용 조성재료, 박스 및 봉투용 습식아교, 스탬프를 제조하기 위해 사용된다.
2.3 직물 및 직물 보호제품
보조제 및 첨가제로서 사용할 수 있는 용도는 직물 및 직물보호제품을제조하기 위해 가능하다. 직물산업에서, 직조시에 작용하는 인장력에 대한 보호 뿐만 아니라 직조시에 내마모성를 증가시키기 위한 버링 행동을 강화하고 연화하기 위한 보조제와 같은 사이징 제제로서, 표백, 염색 등과 같은 품질-퇴화 전처리후에 주로 직물을 개선시키기 위한 제제로서, 염료 확산을 방지하기 위한 염료 페이스트를 제조하는데 있어서 농후제로서, 및 실을 제봉하기 위한 와핑제에 대한 첨가제로서 전분을 사용하는 것과 같은 4개의 용도분야로 세분화될 수 있다.
2.4 건설 산업
그리고, 전분은 건설재료에서 첨가제로서 사용될 수 있다. 한 예로는 석고플라스터 보드를 제조하는 예인데, 여기에서, 얇은 플라스터로 혼합된 전분이 물에 의해 패스티화되며, 석고보드 표면에서 확산하고, 카드보드를 보드에 결합시킨다. 다른 분야로는 상기를 플라스터 및 광물섬유에 혼합시키는 것이다. 이미-혼합된 콘크리트에서, 전분은 사이징 과정을 감소시키기 위해 사용된다.
2.5 지상 안정화
그리고, 전분은 인공 지반상승시 물에 대해 지상의 입자들을 임시적으로 보호하기 위해 사용된 지상 안정화를 위한 수단을 제조하는데 유리하다. 당 분야의 통상의 지식에 따라, 전분 및 중합체 현탁액으로 구성된 조합 생성물은 지금까지 사용된 생성물과 같은 부식-감소 효과 및 증피-감소효과를 가지는 것으로 고려될 수 있지만, 이들은 상당히 덜 비싸다.
2.6 식물보호제 및 비료에 있어서의 용도
다른 용도로는 상기 제조물의 특성들을 변형시키기 위한 식물 보호제에 있어서 전분의 용도가 있다. 예를 들면, 전분은 식물보호제 및 비료의 습식력을 향상시키기 위해, 유효성분의 제어방출을 위해, 액체인 휘발성 및/또는 방향성 유효성분을 미세결정질의 안정하고, 변형가능한 물질로 전환시키기 위해, 비혼화성 조성물을 혼합하기 위해, 및 감소된 분해로 인해 효과지속을 연장시키기 위해 사용된다.
2.7 약품, 제약 및 화장품 산업
전분은 또한, 약품, 제약 및 화장품 산업에서 사용될 수 있다. 제약 산업에서, 전분은 캡슐내 결합제를 희석시키기 위해 정제용 결합제로서 사용될 수 있다. 그리고,전분은 팽창시에 유액을 흡수하고 단시간후에 팽창하여 많은 유효성분이 방출되기 때문에 정제를 위한 분해제로서 적당하다. 질적인 이유로 인해, 의약 윤활 및 외상용 산포제가 추가의 용도분야이다. 화장품 분야에서, 전분은 향료 및 살리실산과 같이, 분말 첨가제의 부형제로서 사용될 수 있다. 비교적 광범위한 전분의 용도는 치약이다.
2.8 석탄 및 연탄에 있어서 첨가제로서의 전분
전분은 또한 석탄 및 연탄에 있어서 첨가제로서 사용될 수 있다. 전분을 첨가함으로써, 석탄은 정량적으로 응집될 수 있으며, 또한 고품질로 연탄화되어 연탄이 조기에 부서지는 것을 막을 수 있다. 바비큐 석탄은 0.1 내지 0.5%의 석탄열량기준부 4 내지 6% 첨가된 전분을 함유한다. 그리고, 전분은 석탄 및 연탄에 첨가할때 독성물질이 방출되는 것을 상당히 감소시킬 수 있기 때문에 결합제로서 적당하다.
2.9 광석 및 석탄 슬러리의 처리
그리고, 전분은 광석 및 석탄 슬러리를 처리하는데 있어서 응집제로서 사용된다.
2.10 주조물질용 첨가제
다른 용도분야는 주조시에 재료를 처리하기 위한 첨가제로서 사용하는 것이다. 여러 주조처리를 위해, 결합제와 혼합된, 모래로부터 생성된 핵심이 필요하다. 오늘날, 가장 통상적으로 사용된 결합제는 변형된 전분, 대개 팽창 전분과 혼합된 벤토나이트이다. 전분을 첨가하는 목적은 유동내성을 증가시킬 뿐만 아니라 결합강도를 향상시키는 것이다. 그리고, 전분은 냉수내 분산능력, 재수화능력, 모래내 양호한 혼합능력 및 물과의 높은 결합능력과 같이 제조과정을 위한 필수불가결한 조건을 만족시킨다.
2.11 고무 산업
고무산업에서, 전분은 기술적 및 광학품질을 향상시키기 위해 사용된다. 상기 목적을 위해, 전분은 냉 가황화전에 고무물질의 끈적이는 고무화 표면상에 분산된다. 또한, 고무의 인쇄능력을 향상시키기 위해 사용될 수 있다.
2.12 가죽 대용품의 제조
변형된 전분의 다른 용도는 가죽 대용품을 제조하는 것이다.
2.13 합성 중합체에 있어서의 전분
플라스틱 시장에서, 하기 용도들이 포함된다: 전분으로부터 유도된 생성물을 처리과정으로 통합시키는 용도(전분은 단지 충진제이며, 합성 중합체와 전분 사이에는 직접적인 결합이 없음) 또는, 선택적으로 전분으로부터 유도된 생성물을 중합체의 제조에 통합시키는 용도(전분 및 중합체는 안정한 결합을 형성함).
순수한 충진제로서 전분을 사용하는 것은 탈크와 같은 다른 물질과 경쟁할 수 없다. 상기 상황은 특정 전분 특성이 유효해지고, 최종 생성물의 특성 프로필이 명확하게 변경될때와 다르다. 한 실시예는 열가소성 재료, 가령 폴리에틸렌을 처리하는데 있어서 전분 생성물을 사용하는 것이다. 그럼으로써, 전분 및 합성 중합체는 동시발현에 의해 1:1의 비율로 조합되어 '마스터 배치'를 형성하며, 이로부터 여러 생성물이 입자화 폴리에틸렌을 사용한 통상의 기술에 의해 생성된다. 폴리에틸렌막내에 전분을 통합하면, 수성 염료에 의해 인쇄능력을 향상시킬 뿐만 아니라 중공체내 물질투과능력을 향상시키고, 수증기 투과능력을 향상시키고, 정전기 방지행동을 향상시키고, 항-블록 행동을 향상시킨다.
폴리우레탄 기포체에 전분을 사용할 수 있다. 처리과정을 최적화하는 것 뿐만 아니라 전분 유도체를 적응시키는 것으로 인해, 전분의 히드록시기와 합성중합체 사이의 반응을 특이적으로 조절할 수 있다. 그 결과, 전분을 사용함으로써 하기 특성 프로필을 갖는 폴리우레탄 막을 얻게 된다: 감소된 열확장계수, 감소된 수축행동, 향상된 압력/장력 행동, 수분 수용에 있어서 변경없이 증가된 수증기 투과능력, 감소된 방염성 및 균열밀도, 연소부 소모 없고, 할로겐화물 없고, 숙성 감소됨. 여전히 존재하는 단점은 감소된 압력과 충격강도이다.
막의 제품 개발은 선택적만은 아니다. 또한, 고체 플라스틱 제품, 가령 항아리, 플레이트 및 볼은 50% 이상의 전분함량에 의해 제조될 수 있다. 그리고, 전분/중합체 혼합물은 훨씬 생분해되기 쉽다는 장점을 제공한다.
그리고, 물을 결합할 수 있는 능력으로 인해, 전분 결합 중합체는 매우 중요하다. 이들은 라디칼 사슬 기작의 원리에 따라 결합된 합성 단량체의 측 격자와 전분의 백본을 갖는 생성물이다. 오늘날 사용가능한 전분결합 중합체는 높은 점도에서 g당 물 1000g 이하의 향상된 결합 및 보유능력을 특징으로 한다. 상기 초흡수제는 위생분야, 예를 들어 납베 및 쉬트와 같은 제품, 뿐만 아니라 농업분야, 예를 들어 종자 펠릿에 주로 사용된다.
재조합 DNA 기술에 의해 변형된 전분을 사용하는데 결정적인 것은 구조, 물 함량, 단백질 함량, 지질 함량, 섬유 함량, 회분/포스페이트 함량, 아밀로스/아밀로펙틴 비율, 상대몰량의 분포, 가지화 정도, 입자크기 및 형태 뿐만 아니라, 결정화이며, 한편 하기 특성들로 인한 성질: 유동 및 흡수 행동, 패스티피케이션 온도, 점도, 농후 행동, 용해도, 페이스트 구조, 투명도, 열, 전단력 및 산 내성, 퇴화성향, 겔 형성력, 동결/해동에 대한 내성, 복합체 형성능력, 요오드 결합, 막형성, 접착강도, 효소 안정성, 소화능력 및 반응성이다.
유전자도입 식물로 유전적으로 조작함으로써 변형된 전분을 제조하면, 화학적 또는 물리적 방법에 의한 추가의 변형이 초유동적이 되도록 식물로부터 얻은 전분의 특성들을 변형시킬 수 있다. 한편, 재조합 DNA 기술에 의해 변형된 전분은 추가로 화학적으로 변형되어, 상기 용도 분야를 위해 품질을 추가로 향상시킬 것이다. 상기 화학적인 변형은 본래 알려져 있다. 이들은 특히,
-열처리
-산처리
-전분 에테르, 전분 알킬 에테르, O-알릴 에테르, 히드록시알킬 에테르, O-카르복시메틸 에테르, N-함유 전분 에테르, P-함유 전분 에테르 및 S-함유 전분 에테르의 형성
-가지화 전분의 형성
-전분 결합 중합체의 형성
-산화 및
-포스페이트, 니트레이트, 설페이트, 크산테이트, 아세테이트 및 시트레이트 전분을 형성시키는 에스테르화에 의한 변형이다.
다른 유기산도 또한 에스테르화에 사용될 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명은 수확될 수 있는 식물의 일부, 예를 들어 과실, 저장뿌리, 꽃, 눈, 싹 또는 줄기, 바람직하게는 수확될 수 있는 상기 일부를 갖는 종자 또는 괴경에 관한 것이다.
다른 면에서, 본 발명은 나이세리아속 세균에서 가지화 효소를 코딩하는 본발명의 상기 핵산분자의 전사를 세균세포내에서 자연적으로 조절하는 조절영역에 관한 것이다.
본 발명의 의미내에서, "조절영역"이라는 용어는 특정 시간에 또는 특정 외부 자극에 대해 발현이 일어나는 방법으로 유전자서열의 발현정도 및/또는 특이성에 영향을 미치는 영역에 관한 것이다. 상기 조절영역은 보통 소위프로모터라고 하는 영역내에 위치되어 있다. 본 발명의 범주내에서, "프로모터"라는 용어는 RNA 중합화효소를 결합시키기 위해 전사를 개시하는데 필요한 뉴클레오티드 서열을 포함하며, TATA 박스를 포함할 수도 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 조절영역은:
(a)서열번호 1에 기술된 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 1 내지 169를 포함하는 뉴클레오티드 서열;
(b)플라스미드 DSM 12425의 삽입물 또는 그의 일부에 포함된 조절영역의 뉴클레오티드 서열; 및
(c)엄격한 조건하에서 (a) 또는 (b)의 서열과 교잡하는 뉴클레오티드로 구성된 글부에서 선택된 뉴클레오티드 서열로 이루어진다.
서열번호 1에 기술된 서열의 뉴클레오티드 1 내지 169는 나이세리아 데니트리피칸스의 가지화 효소 유전자의 조절영역중 일부를 형성한다. 추정 프로모터 서열은 위치 36 내지 44, 51 내지 55 및 157 내지 162에 위치되어 있으며, 서열 "GGGAGA"는 샤인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열이다.
본 발명은 또한, 상기 조절영역에 대해 상동성을 갖는 조절영역에 관한 것으로서, 상기 조절영역의 상동성은 바람직하게 엄격한 조건하에서 상기 영역중 적어도 하나와 교잡할만큼 높다. 상기 조절영역, 특히 서열번호 1에 기술된 것중 어느 하나에 대해 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 및 가장 바람직하게는 적어도 95%의 서열 상동성을 갖는 조절영역이 특히 바람직하다.
이들은 또한, 결실, 삽입, 치환, 부가 및/또는 재조합 및/또는 변형에 의해 상기 조절영역에 관해 변형된 조절영역을 포함할 수도 있다.
당업자는 조절영역에 상기 변형들을 도입하는 방법을 알 것이다. 그리고, 당업자는 본 발명의 조절영역이 세균세포내 전사에 영향을 미치는 추가의 요소, 예를 들어 인핸서 요소와 함께 결합될 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 조절영역을 포함하는 재조합 DNA 분자에 관한 것이다.
상기 재조합 DNA 분자에서, 조절영역은 이종 DNA 서열에 결합되는 것이 바람직하다. 본 명세서에서, "이종성"이라는 용어는 상기 서열이 조절영역에 자연적으로 결합되지 않는다는 것을 의미한다. 그리고, 본 발명의 재조합 DNA 분자는 세균세포내에서 전사 및/또는 해독과 관련하여 중요한 추가의 조절요소, 예를 들어 전사 또는 해독 인핸서를 포함할 수 있다.
그리고, 본 발명은 본 발명의 조절영역, 재조합 DNA 분자 또는 벡터에 의해 형질전환된 숙주세포에 관한 것이다.
그리고, 본 발명은 본 발명의 조절영역 또는 본 발명의 재조합 DNA 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 상기 벡터는 분자유전학 방법에 보통 사용되는 플라스미드, 코스미드, 박테리오파지, 바이러스 등을 포함한다.
그리고, 본 발명은 아밀로수크라아제 및 가지화 효소의 효소 조합 및 기질 수크로스를 사용하여 α-1,6-가지화 α-1,4-글루칸을 제조하는 생체외 방법에 관한 것이다. 본 발명의 명세서에서, "생체외 방법"이라는 용어는 생체 유기체 밖에서 일어나는 반응, 즉 전환반응에 관한 것이다. 특히, "생체외"라는 용어는 본 발명의 방법이 반응용기내에서 일어나는 것을 의미한다. 가장 바람직하게는, "생체외"라는 용어는 생세포의 부재하에서 반응이 일어나는 것을 의미한다.
본 발명의 방법의 장점은 가지화 정도를 조절할 수 있고, 상기 조절에 의해 글루칸을 사용하기 위해 합성된 글루칸의 특성을 제어할 수 있다는 점이다. 따라서, 약품에서 캡슐화 재료로서의 용도에 관해, 가지화 정도를 의도적으로 조정함으로써 약학제제의 방출속도를 최적화할 수 있다.
본 발명의 범주내에서, 아밀로수크라아제(수크로스: 1,4-α-D-글루칸 4-α-글루코실전달효소, E.C. 2.4.1.4)는 수크로스가 불용성 α-1,4-글루칸과 프룩토스로 전환되는 것을 촉매하는 효소이다. 상기 효소에 대해, 하기 반응식이 제시된다:
수크로스 + (α-1,4-D-글루칸)n→D-프룩토스 + (α-1,4-D-글루칸)n+1
상기는 트랜스글리코실화 반응이다. 상기 반응의 생성물은 불용성 α-1,4-글루칸과 프룩토스이다. 트랜스글리코실화는 수용체 분자의 존재 또는 부재하에서일어난다. 상기 수용체 분자는 예를 들어, 말토-올리고당, 덱스트린 또는 글리코겐과 같은 다당류이다. 상기 수용체 분자가 선형의 올리고머 α-1,4-글루칸이라면, 아밀로수크라아제에 의한 트랜스글리코실화 반응에서 얻은 생성물은 중합성 선형 α-1,4-글루칸이다. 아밀로수크라아제에 의한 트랜스글리코실화 반응이 수용체 분자없이 실시된다면, 말단 프룩토스 분자를 갖는 글루칸이 얻어진다. 본 발명의 범주내에서, 수용체 분자의 부재 또는 존재하에서 아밀로수크라아제에 의해 얻은 모든 생성물은 소위 α-1,4-글루칸이다.
수용체 분자의 부재하에서 아밀로수크라아제에 의한 트랜스글리코실화 반응기작을 위해, 하기 반응식 2가 제시된다:
G-F + n(G-F) → Gn-G-F + nF
(상기 반응식 2에서, G-F는 수크로스이며, G는 글루코스이고, F는 프룩토스이고, Gn-G-F는 α-1,4-글루칸이다)
수용체 분자의 존재하에서 아밀로수크라아제에 의한 트랜스글리코실화 반응기작을 위해, 하기 반응식 3이 제시된다:
mG-F + Gn→ Gn-m+ mF
(상기 반응식 3에서, Gn는 다당류 수용체 분자이며, Gn-m는 수용체와, 그로 합성된 α-1,4-글루칸 사슬로 구성된 다당류이며, G-F는 수크로스이고, F는 프룩토스이고, G는 글루코스이다)
아밀로수크라아제에 의한 트랜스글리코실화에 보조인자가 필요없다. 본래, 수크로스로부터 출발하여 선형 α-1,4-글루칸의 합성을 촉매하는 모든 아밀로수크라아제는 본 발명의 방법을 실시하기에 적당하다.
지금까지, 여러 세균종, 특히 나이세리아종으로부터의 아밀로수크라아제는 공지되어 있다(MacKenzie 외 다수, Can. J. Microbiol. 24 (1978), 357-362).
따라서, 원핵기원의 아밀로수크라아제가 사용되는 것이 바람직하다. 예를 들어 나이세리아 퍼플라바(Ockda and Hehre, J. Biol. Chem. 249 (1974), 126-135; MacKenzie 외 다수, Can. J. Microbiol. 23 (1977), 1303-1307), 또는 나이세리아 캐니스, 나이세리아 시네레아, 나이세리아 데니트리피칸스, 나이세리아 시카 및 나이세리아 수브플라바(MacKenzie 외 다수, Can. J. Microbiol. 24 (1978), 357-362)의 아밀로수크라아제가 알려져 있다. 그리고, WO 95/31553에는 나이세리아 폴리사카레아의 아밀로수크라아제가 기술되어 있다. 원핵동물에 의해 자연적으로 분비된 아밀로수크라아제를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 나이세리아 폴리사카레아의 아밀로수크라아제가 사용된다.
나이세리아 폴리사카레아에서 발현된 효소는 특히 안정하며, 중합생성물로 매우 단단히 결합하고, 반응생성물 프룩토스에 의해 경쟁적으로 억제된다(MacKenzie 외 다수, Can. J. Microbiol. 23 (1977), 1303-1307). 나이세리아종 나이세리아 폴리사카레아에 관해, 아밀로수크라아제가 분비되며(), 반면에,다른 나이세리아 종에서 세포에 남는다. 서열번호 5에 기술된 아미노산 서열을 갖는 아밀로수크라아제를 사용하는 것이 특히 바람직하다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 정제된 아밀로수크라아제가 사용된다.
본 명세서에서, 정제된 아밀로수크라아제는 단백질이 합성되는 세포의 세포성분이 실질적으로 유리되어 있는 효소이다. 바람직하게는, "정제된 아밀로수크라아제"라는 용어는 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 85% 및 가장 바람직하게는 적어도 90%의 순도를 가지는 아밀로수크라아제를 의미한다.
α-1,4-글루칸을 제조하기 위해 정제된 단백질을 사용하면 여러 장점이 있다. 일부 정제된 단백질 추출물을 사용한 방법에 비해, 본 발명의 방법의 반응매질은 단백질을 정제하고, 유전공학에 의해 이를 제조하는데 사용되는 생성균주(미생물)의 잔여물을 함유하지 않는다.
특히, 정제된 단백질이 사용된다면, 식료품 및 제약산업에 유리하다. 반응매질이 정의되고, 모든 비필수 성분들이 제거된다면, 생성물의 성분들이 보다 정확하게 정의된다. 상기 생성물이 유전자도입 미생물의 흔적을 나타내지 않기 위해 제시되기 때문에, 생명공학에 의해 제조된 상기 제품들의 권한을 시판하기 위한 과정을 보다 저렴하게 한다.
본 발명의 범주내에서, 가지화 효소(α-1,4-글루칸:α-1,4-글루칸 6-글리코실전달효소, E.C. 2.4.1.18)는 α-1,4-글루칸 주개의 α-1,4,-결합이 가수분해되고, 방출된 α-1,4-글루칸 사슬이 α-1,4-글루칸 수용체 사슬로 전달되고, α-1,6-결합으로 전환되는 트랜스글리코실화 반응을 촉매하는 단백질이다.
본래, 모든 가지화 효소(세균류, 균류, 식물, 동물)는 본 발명의 방법을 실시하기에 적당하다(예를 들어, Baba 외 다수, Biochem. Biophys. Res. Commun. 181 (1991), 87-94; Kossmann 외 다수, Mol. Gen. Genet. 203 (1991), 237-244; Nakaamura 및 Yamanouchi, Plant Physiol. 99 (1992), 1265-1266; Baecker 외 다수, J. Biol. Chem. 261 (1986), 8738-8743; Kiel 외 다수, Gene (1989), 9-17 등 참조).
당업자는 Sambrook 외 다수의 (Sambrook 외 다수, Molecular Cloning, ALaboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA(1989))에서 분자생물학의 표준방법에 의해 대응 유전자를 분리할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 가지화 효소는 원색세포, 바람직하게는 나이세리아속 세균, 보다 바람직하게는 나이세리아 데니트리피칸스의 가지화 효소 및 가장 바람직하게는 하기 기술된 본 발명의 가지화 효소이다. 서열번호 1에 기술된 아미노산 서열을 갖는 가지화 효소가 특히 바람직하다.
다른 바람직한 구체예에서, 가지화 효소는 정제된 가지화 효소이다. 본 명세서에서, 정제된 가지화 효소는 단백질이 합성되는 세포의 세포성분이 실질적으로 유리되어 있는 효소이다. 바람직하게는, "정제된 가지화 효소"라는 용어는 효소가 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 85% 및 가장 바람직하게는 적어도 90%의 순도를 가지는 것을 의미한다.
그리고, 본 발명의 방법에서, 재조합제조된 단백질이 사용되기에 바람직하다. 본 발명의 범주내에서, 상기 단백질은 상기 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 숙주세포로 도입하고, 그것을 거기에서 발현함으로써 제조되는 단백질이다. 상기 단백질은 숙주세포 및/또는 배양배지로부터 회수된다. 숙주세포는 세균 또는 원생생물(예. 균류, 특히 효모, 조류)인 것이 바람직하다(Schlegel "Allgemeine Mikrobiologie"(Georg Thieme Verlag, 1985, 1-2) 참조). 특히, 단백질은 숙주세포에 의해 분비되는 것이 바람직하다. 재조합 단백질을 제조하기 위한 상기 숙주세포는 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 발생될 수 있다.
Methods in Enzymology 153b (1987), 385-516, Bitter 외 다수(Methods in Enzymology 153 (1987), 516-544; Sawers 외 다수, Applied Microbiology and Biotechnology 46 (11996), 1-9; Billmann-Jacobe, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 500-504; Hockney, Trends in Biotechnology 12 (1994), 456-463 및 Griffiths 외 다수, Methods in Molecular Biology 75 (1997), 427-440에는 상이한 발현시스템의 개략도가 제공되어 있다.
발현벡터는 문헌에 광범위하게 기술되어 있다. 선택된 숙주내에서 복제를 보장하는 복제기원 및 선택 마커 유전자와 달리, 이들은 전사를 위한 세균 또는 바이러스 프로모터, 대개 종결 시그널을 함유한다. 프로모터와 종결 시그널 사이에, 인코딩 DNA 서열을 삽입시키는 폴리링커 또는 적어도 하나의 제한위치가 있다. 대응 유전자의 전사를 자연적으로 조절하는 DNA 서열은 선택된 숙주 유기체내에서 활성이라면 프로모터 서열로서 사용될 수 있다. 그러나, 상기 서열은 다른 프로모터 서열에 대해 교환될 수 있다. 다운스트림 유전자의 발현을 직접 조절하는 유도성 프로모터와 유전자의 구조발현을 실시하는 프로모터 모두 사용될 수 있다. 상기특성을 갖는 세균 및 바이러스 프로모터 서열은 문헌에 기술되어 있다. 미생물(예. E. coli, 사카로마이세스 세레비지애)내 발현을 위한 조절서열은 문헌에 충분히 기술되어 있다. 다운스트림 유전자의 특히 강한 발현을 하는 프로모터는 예를들어, T7 프로모터(Studier 외 다수, Methods in Enzymology 185 (1990), 60-89), lacuv5, trp, trp-lacUV5(DeBoer 외 다수, in Rodriguez and Chamberlin(eds) Promoters, Structure and Function; Praeger, New York (1982), 462-481; DeBoer 외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983), 21-25), λp1, rac(Boros 외 다수, Gene 42 (1986), 97-100)을 포함한다. 보통, 단백질의 양은 미생물의 성장주기중 대수증식기 중반 내지 종반에서 최고 수준에 도달한다. 그러므로, 유도성 프로모터가 단백질 합성에 사용되는 것이 바람직하다. 상기 유도성 프로모터는 종종 구성 프로모터보다 높은 단백질 수율을 얻는다. 클론된 유전자의 일정한 전사 및 해독으로 인해, 강한 구성 프로모터를 사용하면, 다른 필수 세포기능을 위한 에너지가 손실되고, 따라서 세포성장이 느려진다는 효과를 가진다(Bernard R. Glick/Jack J. Pasternak, Molekulare Biotechnologie (1995), Sperktrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg Berlin Oxford, p.342). 그리고, 최적량의 단백질을 얻기 위해 이단계 방법이 종종 사용된다. 먼저, 숙주세포는 비교적 높은 세포밀도에 도달할때까지 최적조건하에서 배양된다. 두번째 단계에서, 전사는 사용된 프로모터의 종류에 따라 달리 유도된다. 본 명세서에서, 락토스 또는 IPTG(=이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드)에 의해 유도가능한 tac 프로모터는 특히 적당하다(DeBoer 외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 21-25). 전사를 위한 종결 시그널은 문헌에 기술되어 있다.
대응 단백질 DNA를 코딩하는 DNA에 의해 숙주 세포를 형질전환하는 것은 보통 Sambrook 외 다수의 (Molecular Cloning: A Laboratory Course Manual, 2nd edition (1989), Cold Spring Harbor Press, New York)에 기술된 표준 방법에 따라 실시될 수 있다. 숙주세포는 각 숙주세포의 필요성에 대응하는 배양배지내에서 배양된다. 특히, pH값, 온도, 염 농도, 통기, 항생제, 비타민 및 미량원소 등을 생각할 수 있다.
숙주세포에 의해 생성된 효소는 표준정제방법, 가령 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 겔 여과, HPLC 역단계 크로마토그래피 등에 따라 정제될 수 있다.
숙주세포내에서 발현된 DNA를 변형시킴으로써, 숙주세포내에서 폴리펩티드를 생성할 수 있으며, 이는 특정 성질로 인한 배양 배지로부터 보다 더 쉽게 분리된다. 따라서, 친화도 크로마토그래피를 통해 융합 단백질을 분리하는 특이 결합성질을 갖는 다른 폴리펩티드 서열과 함께 융합 단백질로서 발현되는 단백질을 발현할 수 있다(Hopp 외 다수, Bio/Technology 6 (1988), 1204-1210; Sassenfeld, Trends Biotechnol. 8 (1990), 88-93).
본 발명의 방법의 바람직한 구체예에서, 재조합제조되고, 숙주세포에 의해 배양배지로 분비되는 효소가 사용되어, 분비된 단백질이 상층액으로부터 회수되기 때문에 세포를 더이상 파괴하거나 또는 단백질을 더이상 정제하지 않아도 된다. 투석, 역삼투압, 크로마토그래프 방법 등과 같은 공지방법은 배양배지의 잔류 성분들을 제거하기 위해 사용될 수 있다. 배양배지로 분비되는 단백질을 마찬가지로 재농축시킨다. 보통, 미생물에 의한 단백질 분비는 N-말단 시그널 펩티드(시그널 서열, 리더 펩티드)에 의해 매개된다. 상기 시그널 서열을 갖는 단백질은 미생물의 세포막을 통해 통과할 수 있다. 단백질 분비는 상기 시그널 펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 효소를 코딩하는 대응 영역에 결합시킴으로써 이루어질 수 있다.
자연발생하는 시그널 펩티드, 예를 들어 나이세리아 폴리사카레아로부터의 아밀로수크라아제의 시그널 펩티드가 바람직하다.
클레브시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca) M5A1로부터의 α-CGT아제의 시그널 펩티드(Fiedler 외 다수, J. Mol. Biol. 256 (1996), 279-291) 또는 기탁번호 X86014로 GenBank에 기탁되어 있는 서열의 뉴클레오티드 11529-11618에 의해 코딩된 시그널 펩티드가 특히 바람직하다.
선택적으로, 본 발명의 방법에 사용되는 효소는 또한, 미생물을 사용하지 않고 단백질을 발현하는 생체외 전사 및 해독 시스템을 사용하여 제조될 수 있다.
다른 바람직한 구체예에서, 아밀로수크라아제 및/또는 가지화 효소는지지 재료상에 부동화된다.
효소를 부동화시키면, 효소가 합성반응의 촉매로서 간단한 방법으로 반응혼합물로부터 회수될 수 있고, 여러번 사용될 수 있다는 장점이 있다. 효소를 정제하는데는 시간과 경비가 많이 들기 때문에, 부동화 및 재생은 상당히 비용을 절감할 수 있다. 어느 단백질도 함유하지 않는 반응생성물의 순도도 또다른 장점이 된다.
효소를 부동화하기 위해 다수의 지지재료를 처리하며, 여기에서 지지재료와의 결합은 공유결합 또는 비공유결합을 통해 일어난다(Methods in Enzymology 135, 136, 137 참조). 예를 들면, 아가로스, 알긴산염, 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 실리카 EH는 나일론이 지지재료로서 사용된다.
다른 바람직한 구체예에서, 아밀로수크라아제 및/또는 가지화 효소의 (일부 정제된) 효소 조추출물이 사용된다. 본 명세서에서, 조 추출물은 정제된 효소에 비해 감소된 순도를 갖는 아밀로수크라아제 및/또는 가지화 효소이다(실시예 5 및 6 참조).
바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법에서 α-1,6-가지화 α-1,4-글루칸의 가지화 정도는 가지화 효소와 아밀로수크라아제의 단백질 활성비율을 변경시킴으로써 변형된다. 본 명세서에서, 단백질 활성비율은 아밀로수크라아제 및 가지화 효소로부터의 단백질 활성비율(u)이다. 단백질 활성은 실시예 7 및 8에 기술된 바와 같이 측정될 수 있다. 본 발명의 방법이 실시될 경우(실시예 9 참조), 단백질 활성비율(아밀로수크라아제 단위/가지화 효소 단위)은 1/4000 내지 2000/1이다.
바람직한 구체예에서, 단백질 활성비율은 1/1500 내지 1500/1이다.
다른 바람직한 구체예에서, 단백질 활성비율은 1/800 내지 1300/1이다.
특히 바람직한 구체예에서, 단백질 활성비율은 1/400 내지 1200/1이다.
단백질 활성비율을 변경시킴으로써 얻은 α-1,6-가지화 α-1,4-글루칸의 가지화 정도를 0.05% 내지 35% 변경시킬 수 있다.
바람직한 구체예에서, 6-위치에서 α-1,6-가지화 α-1,4-글루칸의 가지화 정도를 0.15% 내지 25%, 보다 바람직하게는 0.20% 내지 15% 및 가장 바람직하게는 0.25% 내지 12% 변경시킬수 있다.
본 발명의 방법이 사용된다면, 글리코겐보다 높은 가지화 정도를 갖는 생성물을 제조할 수 있다.
본 발명의 명세서에서, 가지화 정도는 다르게 결합된 모든 글루코스 단위에 비해 O-6 위치에서 평균정도의 가지화이다. 가지화 정도는 메틸화 분석에 의해 측정될 수 있다(실시예 10 참조). 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법에서 생성물의 분자량은 단백질 활성비율을 변경시킴으로써 변경된다. 특히, α-1,6-가지화 α-1,4-글루칸을 합성시키는 반응동안 단백질 활성비율을 변경시킬 수 있다.
본 발명의 방법의 다른 바람직한 구체예에서, 상기 방법은 다른 수크로스 농도로 실시된다. 본래, 상기 방법은 바람직하게는 1% 내지 80% 수크로스(w/v), 보다 바람직하게는 5% 내지 50% 및 가장 바람직하게는 10% 내지 40%의 농도로 실시될 수 있다.
본 발명에서, 분자량은 Berry(Light Scattering from Polymer Solutions, editor: Huglin, M.B., Academic Press, London, 1972)에 따라 광산란 실험(J. Chem. Phys. 44 (1966), pp. 4550)에 의해 측정된다. 본 발명의 방법에 의해, 상기 방법에서 제조된 α-1,6-가지화 α-1,4-글루칸의 분자량을 1000 내지 3000의 범위로 조정할 수 있다. 바람직하게는, α-1,6-가지화 α-1,4-글루칸은 100,000 내지 1500×106, 보다 바람직하게는 100,000 내지 1000×106, 보다 바람직하게는,262,000 내지 1000×106및 가장 바람직하게는 262,000 내지 499×106범위의 분자량을 가진다.
그리고, 본 발명은 상기 방법에 의해 얻을 수 있는 α-1,6-가지화 α-1,4-글루칸에 관한 것이다. 상기 α-1,6-가지화 α-1,4-글루칸은 아밀라아제의 활성이 사용될때만 얻어지는 것보다 높고, 최대한 25몰%인 가지화 정도를 가진다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, α-1,6-가지화 α-1,4-글루칸은 0.05% 내지 20%, 바람직하게는 0.15% 내지 17%, 보다 바람직하게는 0.2% 내지 15%, 보다 바람직하게는 0.25% 내지 13% 및 가장 바람직하게는 0.3% 내지 12%의 가지화 정도를 가진다. 본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 가지화 정도는 0.35% 내지 11% 및 특히, 0.4% 내지 10.5%이다.
본 발명의 α-1,6-가지화 α-1,4-글루칸은 본 발명의 전분에 관해 상기 기술된 것과 같은 식품 및 비-식품 산업에 사용될 수 있다.
본 발명에서 제조된 플라스미드 pBB48은 부다페스트 조약에 따라 기탁번호 DSM 12425로 국제기탁 브라운쉬베이그에서 도이취 삼믈룽 폰 미크로오가니스멘 운트 첼쿨투렌(DSMZ, German Collection of microorganism and cell cultures)에 기탁되어 있다.
도 1은 플라스미드 pBB48(DSM 12425)의 구조를 도시적으로 도시하고 있으며,
도 2는 본 발명의 방법에 의해 제조되고, 루골(Lugol) 용액에 의해 염색된α-1,6-가지화의 다양한 정도를 갖는 α-1,4-글루칸의 수를 도시한 것이다. 좌측에서 우측으로: 아밀로수크라아제(좌측), 아밀로수크라아제+감소량의 가지화 효소활성. 대응 샘플의 최대 흡광도는 615nm, 483nm, 500nm, 526nm, 534nm, 560nm, 577nm이다.
도 3은 이소아밀라아제에 의해 탈가지화된 고도로 가지화된 공정생성물(A)과 이소아밀라아제에 의해 탈가지화된 쥐 간 글리코겐 샘플(B)의 HPLC 크로마토그래프를 도시하며,
도 4는 메틸화 분석의 개략도를 도시한 것이며,
도 5는 1개 및 2개의 메틸화 단계후에 실시예 9 내지 10에 기술된 샘플 7의 분석결과를 모식도로 도시한 것이고, 2,3,6-메틸화 값은 각각 96.12% 및 96.36%이다.
도 6은 시험된 글루칸 샘플의 말단("2346 Me") 및 6-결합된 ("23 Me") 글루코스 단위를 그래프로 도시한 것이며,
도 7 및 도 8은 실시예에 기술된 샘플 3 및 7의 가스 크로마토그래피를 도시한 것이고,
도 9는 플라스미드 pBE-fnr-Km을 도시한 것이며,
도 10은 가지화 효소를 위한 활성 겔을 도시한 것이고,
도 11은 RVA 프로필을 도시한 것이며,
도 12는 야생형에 비해 계통 143-13A 및 143-59A의 입자크기분포를 도시한 것이며,
도 13은 야생형 식물의 전분입자에 비해 계통 143-13A, 143-34A 및 143-59A의 전분입자를 현미경으로 확대한 것이며(독일 Leitz제 광학 현미경),
도 14는 야생형 식물의 전분에 비해 다른 유전자 도입계통의 전분의 겔 조직을 도시한 것이고, 상기 조직은 조직 분석기에 의해 측정된다.
도 15는 야생형에 비해 계통 143-11A, 143-13A, 143-59A의 전분의 RVA 프로필을 도시한 것이고,
도 16 내지 18은 계통 143-WT(=야생형), 143-13A 및 143-59A의 측사슬의 분포패턴을 나타내는 HPLC 크로마토그래프의 결과를 도시한 것이며,
도 19는 도 16 내지 18에 도시된 크로마토그래프에 사용된 용출구배를 도시한 것이고,
도 20은 야생형으로부터 도 16 내지 18에서 분석된 전분의 특정 사슬길이를 갖는 측사슬의 이탈율을 도시한 것이다.
하기 실시예는 본 발명을 상술할 것이다.
재료:
파괴 버퍼: 100mM Tris/HCl, pH 8.5; 5mM Na2EDTA; 2mM DTT; 1mM Pefabloc(상표명)
세척 버퍼: 50mM Tris/HCl, pH 8.5; 5mM Na2EDTA; 10% 글리세롤
HIC 버퍼: 50mM 인산칼륨 버퍼, pH 7.0; 5mM EDTA; 2mM DTT; 10% 글리세롤
굴의 굴 글리코겐 타입 Ⅱ(Sigma G8751)
방법:
전분 분석
(a)아밀로스/아밀로펙틴 비율의 측정
표준방법에 따라 감자식물로부터 전분을 분리하고, 아밀로펙틴에 대한 아밀로스의 비율을 Hovenkamp-Hermelink 외 다수(Potato Research 31 (1988), 241-246)의 방법에 따라 측정하였다.
(b)포스페이트 함량의 측정
전분에서, 글루코스 단위의 위치 C2, C3 및 C6을 인산화한다.
C6 위치에서 포스페이트기의 함량을 측정하기 위해 전분 100㎎95℃에서 4시간동안 1㎖ 0.7M HCl내에서 가수분해하였다(Nielsen 외 다수, Plant Physiol. 105 (1994), 11-117). 0.7M KOH에 의해 중화한후, 글루코스-6-포스페이트를측정하기 위한 광학-효소 시험에 가수분해물 50㎖를 적용시켰다. 334nm에서 시험 혼합물(Leuconostoc mesenteroides제 100mM 이미다졸/HCl; 10mM MgCl2; 0.4mM NAD; 글루코스-6-포스페이트-탈수소화 효소 2단위; 30℃)의 흡광도 변화를 측정하였다.
포스페이트의 전체함량은 Ames(Methods in Enzymology Ⅷ (1996), 115-118)의 방법에 따라 측정하였다.
에탄올성 질산 마그네슘 용액 30㎕에 전분 약 50㎎을 첨가하고 간접가열노안 500℃에서 3시간동안 애쉬(ash)하였다. 0.5M 염산 300㎕을 잔여물에 첨가하고, 60℃에서 30분동안 배양하였다. 그후, 분취액을 0.5M 염산 300㎕ 이하까지 채우고,2M 황산내 10% 아스코르브산 100㎕ 및 0.42% 몰리브덴산 암모늄 600㎕의 혼합물에 첨가하고, 45℃에서 20분동안 배양하였다.
그후, 820nm에서의 광도측정은 포스페이트 스탠다드를 사용한 보정곡선에 의해 실시한다.
(c)겔 조직의 측정(조직 분석기)
전분(TS) 2g을 25㎖ H2O(RVA 참고)내에 페이스트시키고, 공기가 통하지 않게 밀봉하고, 25℃에서 24시간동안 저장한다. 상기 샘플을 Stable Micro Systems제 조직 분석기 TA-XT2의 프로브(라운드 스탬프)하에 고정시키고, 겔 조직을 하기 변수들에 관해 측정하였다:
- 시험속도 0.5㎜/s
- 침투깊이 7㎜
- 접촉면적 113㎟
- 압력 2g
(d)점도 프로필
전분(TS) 2g을 25㎖ H2O내에 첨가하고, 분석하기 위해 Rapid Visco Analyzer(Newport Scientific Pty Ltd., Investment Support Group, Warriewod NSW 2102, Australia)에 넣었다. 상기 장치는 제조사의 지시에 따라 작동시켰다. 전분 수용액의 점도를 측정하기 위해, 먼저 모든 전분 현탁액을 50℃에서 95℃로 분당 12℃의 속도로 가열한다. 그후, 온도를 95℃에서 2.5분동안 유지시킨다. 그후, 상기 용액을 95℃에서 50℃로 분당 12℃의 속도로 냉각시킨다. 상기 점도는 전체 시간동안 측정한다.
패스티피케이션 온도는 시간에 따른 점도 그래프의 기울기에 의해 측정한다. 그래프의 기울기가 1.2(이 값은 사용자에 의해 설정됨) 이상이면, 컴퓨터 프로그램은 패스티피케이션 온도에 따른 모멘트로 측정된 온도를 확인한다.
(e)글루코스, 프룩토스 및 수크로스의 측정
글루코스, 프룩토스 및 수크로스의 함량은 Stitt외 다수의 (Methods in Enzymology 174 (1989), 518-552)에 기술된 방법에 따라 측정된다.
(f)아밀로펙틴의 측사슬의 분포분석
측사슬 및 제조물의 분포는 Lloyd 외 다수의 (Biochem. J. 338 (1999), 515-521)에 기술된 바에 따라 측정된다. 상기 방법을 사용하여, 아밀로펙틴만 탈가지화되고, 아밀로스는 티몰 침전에 의해 탈가지화되기 전에 아밀로펙틴으로부터 분리된다는 점을 주목한다. 용출액의 하기 조건들이 선택된다(간략함, 정확한 용출 프로필은 도 19에 도시되어 있음):
시간(분) 0.15M NaOH(%) 0.15M NaOHso 1M NaAc(%)
0 100 0
5 100 0
20 85 15
35 70 30
45 68 32
60 0 100
70 0 100
72 100 0
80 100 0
(g)입자크기 측정
입자의 크기는 독일의 Retsch GmbH제 "Lumosed"형 포토세디멘토미터에 의해 측정하였다.
입자크기분포는 수용액내에서 측정하고, 제조사의 지시 뿐만 아니라 문헌, 예를 들어 H. Pitsch, Korngroessenbestimmung; LABO-1988/3 Fachzeitschrift fur Labortechnik, Darmstadt에 따라 실시하였다.
(h)물-결합력 측정
물-결합력을 측정하기 위해, 원심분리에 의해 70℃까지 팽창된 전분의 가용성 부분을 분리한후에 잔여물의 중량을 쟀다. 전분의 물-결합력(WBV)은 가용성 질량에 의해 보정된 초기 중량을 참고하여 측정하였다.
WBV(g/g)=(잔여물-(초기중량-가용성 부분))/(초기중량)-가용성 부분)
실시예 1
나이세리아 데니트리피칸스의 가지화 효소를 코딩하는 게놈 DNA 서열의 분리
나이세리아 데니트리피칸스의 가지화 효소를 분리하기 위해, 먼저 게놈 라이브러리를 제조하였다. 상기 목적을 위해, ATCC에 ATCC 14686d로 기탁된 균주의 나이세리아 데니트리피칸스의 세포를 컬럼비아 혈액 아가 플레이트상에서 배양하고, 그후에 채취하였다. 게놈 DNA를 Ausubel 외 다수의 (Current Protocols in Molecular Biology (1987); J. Wiley & Sons, NY)의 방법에 따라 분리 및 정제하였다. 제한 엔도뉴클레아제 Sau3A에 의해 일부 제한소화후에, BamHI-제거된 파지 벡터 DNA(스트라타유전자(Stratagene)에 의한 lambdaZAPExpress)와의 결찰을 실시하였다. 파지 라이브러리를 생체내 적출후, 얻은 플라스미드를 E.coli 돌연변이체(PGM-)으로 형질전환하였다(Adhya and Schwartz, J. Bacteriol. 108 (1971), 621-626). 말토스상에서 배양할 때, 상기 돌연변이체는 요오드에 의한 착색후 청색으로 변하는 선형 다당류를 형성한다. IPTG(1mM), 카나마이신(112.5㎎/ℓ) 및 말토스(1%)를 함유하는 YT 아가 플레이트에 60,000개의 형질전환체를 넣고, 37℃에서 16시간동안 배양한후, 요오드에 의해 증발시켰다. 요오드에 의한 증발후, 적색, 갈색 또는 황색을 띠는 60개의 세균 콜로니를 선별하고, 플라스미드 DNA를 그로부터 분리해냈다(Birnboim-Doly, Nucleic Acid Res. 7, 1513-1523). 분리된 플라스미드를 동일한 E.coli-(PGM)-돌연변이체의 재형질전환에 사용하였다(Adhya and Schwartz, J. Bacteriol. 108 (1971), 621-626). 반복된 플레이팅 및 요오드에 의한 증발후, 클론은 60개의 분리물에서 4개의 분리물로 감소할 수 있었다. 제한 분석은 네 개의 플라스미드에 있어서 같은 크기를 갖는 EcoRI 단편(1.6kb)를 나타내는 상기 4개의 플라스미드에 의해 실시되었다(도 1).
실시예 2
플라스미드 pBB48의 게놈 단편의 서열분석
벡터 pBK-CMV(스트라타유전자)내에 약 3.9kb의 삽입물을 갖는 실시예 1에 따라 얻은 클론(pBB48)으로부터 1.6kb EcoRI 단편을 분리하였다(Geneclean, Bio101). DNA 시퀀싱을 하기 위해, EcoRI에 의해 제거된 단편을 벡터 pBluescript로 클론하였다. 상기 방법으로 얻은 플라스미드를 시퀀싱하였다. 그후, 가지화 효소를 코딩하는 전체 DNA 서열 뿐만 아니라 플랭킹 영역의 서열은 출발 플라스미드 pBB48(서열번호 1)에 의해 측정하였다. 플라스미드 pBB48은 도 1에 도시되어 있다. 플라스미드는 DSM 12425에 기탁되어 있다.
실시예 3
재조합 E.coli 세포내 가지화 효소의 발현
보통, 내인성 가지화 효소(glgB)는 E.coli 실험실 균주내에서 발현된다. 상기 이유로 인해, E.coli의 G6MD2 돌연변이체는 가지화 효소 활성을 검출하기 위해 사용되었다. 균주 E.coli Hfr G6MD2(E.coli Genetic Stock Center, Yale University, CGSC#5080)글루칸 합성유전자(glgA, glgB, glgC)의 영역내에서 확장소실되었다. 가지화 효소 활성을 검출하기 위해, 상기 돌연변이체는 플라스미드 pBB48에 의해 형질전환되고, 조추출물은 증식세포로 제조되었다. 상기 조추출물의 단백질을 폴리아크릴아미드 겔내에서 전기영동분리하고, 그후 가지화 효소 활성을 측정하기 위해, 토끼 포스포릴라아제 B(100mM 시트르산 나트륨, pH 7.0; AMP, 글루코스-1-포스페이트)와 함께 및 없이 배양하였다. 포스포릴라아제에 의해 자극된 겔내에 자색 밴드만 나타났으며, 이는 강한 가지화 효소 활성을 나타냈다.
실시예 4
세포-유리 시스템에서 단백질 조추출물에 의한 α-1,6-가지화 α-1,4-글루칸의 생체외 제조
가지화 효소를 발현하기 위해, 돌연변이체 E.coli G6MD2를 플라스미드 pBB48로 형질전환시켰다. 상기 세포를 삼각플라스크에서 쉐이킹하면서 16시간동안 카나마이신(12.5㎎/ℓ)과 함께 YT 배지에서 배양하였다. 원심분리(5000×g)후에, 얻은펠릿을 100mM Tris/HCl, pH 7.5, 1mM DTT에 의해 세척하고, 같은 버퍼로 현탁한후, 상기 세포들을 초음파 프로브로 파괴하였다. 추가의 원심분리(10,000×g)에 의해 세포 잔해를 가용성 단백질로부터 분리하고, 약 10㎎/㎖의 단백질 농도를 갖는 황색 상층액을 얻었다.
상기 방법에서 얻은 단백질 조추출물로부터, 다른 양(100㎕, 10㎕, 1㎕, 0.1㎕, 0.01㎕, 0.001㎕)을 20% 수크로스 및 0.02% 아지드 나트륨와 함께 pH 7.0의 100mM 시트르산 나트륨 50㎖내 불변량의 아밀로수크라아제에 첨가하였다. 몇시간후, 반응혼합물내에서 첫 번째 클라우딩이 발견되었다. 3일후, 상기 혼합물을 원심분리하고, 형성된 생성물을 탈이온수에 의해 세척하였다.
상기 생성물은 DMSO내에서 가용성이고, 형성된 생성물의 가지화 정도가 측정되는 방법에 의해 루골 용액에 의해 흡수스펙트럽을 측정함으로써 특징화될 수 있다. 상기 목적을 위해, DMSO 용액을 물에 의해 강하게 희석시키고, 루골 용액을 첨가하고, 400㎚ 내지 700㎚의 스펙트럼을 벡크만 분광광도계에서 즉시 측정하였다(도 2 참조).
HPLC에 의해 카보팍(Carbopak) PA100 컬럼상에서 이소아밀라아제에 의해 분리된 측사슬의 분리(DIONEX; 진행제제: 1M 아세트산 나트륨 구배를 갖는 150mM NaOH)는 이소아밀라아제에 의해 탈가지화된 쥐 간 글리코겐에 대한 강하게 가지화된 생성물에 대한 것과 같은 패턴을 나타낸다(도 3).
풀루라나아제와 함께 배양한후, 측사슬을 극소량으로 분리하였다.
실시예 5
단백질의 N-말단 및 가지화 효소의 정제
pBB48로 형질전환된 재조합 Hfr G6MD2 E.coli 세포로부터 나이세리아 데니트리피칸스의 가지화 효소를 분리하기 위해(상기 참조), 먼저 상기 세포를 밤새 배양한 것을 원심분리하였다. 그후 세포 침전물을 3용적 파괴 버퍼내에서 현탁하고, 약 16,000 내지 17,000psi의 압력에서 French press에서 파괴시켰다. 1시간동안 10,000g에서 원심분리한후, 상층액을 희석하여 세척 버퍼를 첨가함으로써 4-배 부피에 도달했다. 그후, 배치-방법을 사용하여 DEAE 셀룰로스 DE52에 결합시키고, 크로마토그래피로 채우고, 2 내지 3컬럼 부피의 세척 버퍼에 의해 세척하였다. 계속해서, 선형 1M NaCl 구배를 용출에 가했다. 가지화 효소 활성을 갖는 프랙션을 조합하고(실시예 8 참조), (NH4)2SO4를 첨가하고(최종농도 20%(w/v)), TSK 부틸 도요펄 650M 컬럼에 가했다. 2 내지 3컬럼부피의 HIC 버퍼에 의해 세척한후, 여기에 20%의 포화도를 갖는 황산암모늄 용액(황산암모늄 114g/ℓ)을 추가로 첨가하고, 20%에서 0%로 떨어지는 황산암모늄 구배를 사용하여 HIC 버퍼내에서 가지화 효소를 용출시켰다. 가지화 효소 활성을 갖는 프랙션을 조합했다. 단백질을 농축시키기 위해, 소규모 TSK 부틸 도요펄 650M 컬럼(Tose Haas(Montgomery Ville, 펜실바니아))을 사용하여 조합된 프랙션을 갖는 정제단계를 계속 반복했다. 정제된 단백질을 폴리아크릴아미드 겔에 가하고, PVDF막위에 블롯시키고, 다시 용해시키고, Edman법에 따라 독일의 Teltow의 WITA GmbH에 의해 N-말단을 서열화하였다. 얻은 서열은 MNRNXH(서열번호 3)이었다.
실시예 6
아밀로수크라아제의 정제
아밀로수크라아제를 제조하기 위해, 나이세리아 폴리사카레아의 아밀로수크라아제를 코딩하는 DNA에 의해 형질전환된 E.coli 세포를 사용하였다. 상기 DNA는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 가지며, 나이세리아 폴리사카레아의 게놈 라이브러리로부터 유도된다.
나이세리아 폴리사카레아로부터 아밀로수크라아제를 분비하는 상기 E.coli 세포의 밤새 배양물을 원심분리 제거하고, 약 1/20부피의 50mM 시트르산 나트륨 버퍼(pH 6.5), 10mM DTT(디티오트레이톨), 1mM PMSF(페닐메틸설포닐플루오라이드)내에 현탁하였다. 그후, 상기 세포를 16,000psi에서 French press에 의해 2회 파괴시켰다. 그후, 1mM MgCl2및 벤조나아제(Merck제; 100,000유닛; 250유닛㎕-1)를 12.5유닛 ㎖-1의 최종농도로 세포 추출물에 첨가하였다. 그후, 상기 혼합물을 조심스럽게 쉐이킹하면서 적어도 30분동안 37℃에서 배양하였다. 적어도 1.5시간동안 얼음위에 상기 추출물을 올려 놓았다. 그후, 상층액이 비교적 투명해질때까지 약 40,000g으로 30분동안 4℃에서 원심분리하였다.
0.45㎛의 공극직경을 갖는 PVDF 막에 의해 예비-여과(Millipore "Durapore", 또는 유사)를 실시하였다. 추출물을 4℃에서 밤새 두었다. Hl-(소수성 상호반응) 크로마토그래피를 실시하기 전에, 고체 NaCl을 추출물에 첨가하고, 2M NaCl의 농도로 조정하였다. 그후, 상기 혼합물을 약 40,000㎎에서 30분동안 4℃에서 다시 원심분리하였다. 계속해서, E.coli의 남은 잔여물을 0.22㎛의 공극직경을 갖는 PVDF막(Millipore "Durapore", 또는 유사)으로 여과함으로써 추출물로부터 제거하였다. 여과된 추출물을 부틸세파로스-4B 컬럼(Pharmacia)상에서 분리하였다(컬럼부피: 93㎖, 길이: 17.5㎝). 1 내지 5 유닛㎕-1의 아밀로스 활성을 갖는 추출물 약 50㎖를 컬럼에 가했다. 그후, 비결합 단백질을 버퍼 B(버퍼 B: 50mM 시트르산 나트륨, pH 6.5, 2M NaCl) 150㎖를 갖는 컬럼에 의해 세척제거되었다. 마지막으로, 자동 펌프 시스템(FPLC, Pharmacia)에 의해 발생된 감소형 선형 NaCl 구배(50mM 시트르산 나트륨 50mM내 2M 내지 0M NaCl, 부피 433㎖, 유입속도 1.5㎖/분-1)에 의해 아밀로수크라아제를 용출시켰다. 아밀로수크라아제의 용출은 0.7M 내지 0.1NaCl에서 일어났다. 프랙션을 수집하고, PD10 세파덱스 컬럼(Pharmacia)상에서 염분제거하고, 8.7% 글리세롤에 의해 안정화하고, 아밀로스 수크로스 활성을 시험하고, 저장 버퍼(8.7% 글리세롤, 50mM 시트레이트)내에서 최종적으로 급속냉동시켰다.
실시예 7
아밀로수크라아제 활성의 측정
5% 수크로스, 0.1% 덱스트린 및 100mM 스트레이트, pH 6.5를 함유하는 반응혼합물 1㎖내에서 37℃에서 다른 의석액내 정제된 단백질 또는 단백질 조추출물을 배양함으로써 아밀로수크라아제 활성을 측정하였다. 0분, 30분, 60분, 120분, 180분, 240분, 300분 및 360분후에, 각 10㎕를 상기 혼합물로부터 취하고, 95℃로 즉시 가열함으로써 아밀로수크라아제의 효소활성을 정지시켰다. 그후, 아밀로수크라아제에 의해 방출된 프룩토스의 비율을 조합된 광도계 시험으로 측정하였다. 비활성화 샘플 1㎕ 내지 10㎕를 50mM 이미다졸 버퍼 1㎖, pH 6.9, 2mM MgCl2, 1mM ATP, 0.4mM NAD+및 0.5U/㎖ 헥소키나아제에 넣었다. 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소(Leuconostoc mesenteroides제) 및 포스포글루코스 이소머라아제를 순서대로 첨가한후, 흡광도 변화를 340㎚에서 측정하였다. 계속해서, 방출된 프룩토스의 양을 Lambert-Beer법에 의해 계산하였다.
샘플을 취했을때 얻은 값이 시간에 비례하면, 유닛의 수(1U=프룩토스 μmol/분)(단백질 추출물 ㎕당 또는 정제된 단백질 ㎍당)가 측정될 수 있다.
실시예 8
나이세리아 데니트리피칸스의 가지화 효소의 효소활성측정
가지화 효소의 효소활성은 문헌 (Krisman 외 다수, Analytical Biochemistry 147 (1985), 491-496; Brown and Brown, Meth. Enzymol. 8 (1966), 395-403)에 기술된 방법에 따라 측정하였다. 상기 방법은 비-가지화 α-1,4-글루칸에 비해 감소된 요오드 결합친화력을 갖는 가지화 글루칸에 기초한다.
가지화 효소의 효소활성을 측정하기 위해, 가지화 효소의 여러 희석액 샘플시리즈를 냉각된 미량적정기 플레이트에 넣었다. 그후, 아밀로스 반응혼합물(제조는 하기 참조) 190㎕을 첨가함으로써 반응을 개시하고, 37℃의 배양기내에서 배양하였다. 정확히 30분후, 루골용액(0.5mM) 100㎕을 첨가함으로써 반응을 정지시키고, 650㎚에서 미량적정기 해독장치(Molecular Devices)에서 반응을 측정하였다.아밀로스가 없는 혼합물은 대조군으로 제공하였다. 아밀로스만 함유하고, 가지화 효소는 함유하지 않는 참고샘플의 최대 흡광도 값은 1.2의 OD650이었다.
독립적으로 분석비교하기 위해, 30분 배양시간동안 OD650이 0.5유닛까지 감소하는 계산을 위해 샘플 희석액만 사용하였다.
가지화 효소의 활성유닛(U)의 정의:
상기 시험에서 30분내에 1.2 내지 0.7으로부터 0.5 유닛까지 OD650을 감소시키는 효소의 양은 가지화 효소의 유닛의 반이다.
아밀로스 반응혼합물의 제조예:
교반하는동안, DMSOso 0.5% 아밀로스 용액(제조사: Fluka; 감자의 아밀로스) 1㎖(w/v)를 시트르산 나트륨 버퍼(100mM, pH 6.5, 0.02% w/v NaV3) 10㎖에 첨가한다. 측정하기 위해, 맑은 저장용액을 1:4 내지 1:8의 비율로 시트르산 나트륨 버퍼에 의해 다시 희석한다. 상기 시험에서, 루골용액에 의한 흡광도는 사용된 참고샘플에서 1.2이어야 한다(최대).
실시예 9
다른 가지화 정도를 갖는 α-1,6-가지화 α-1,4-글루칸의 제조
다른 가지화 정도를 갖는 α-1,6-가지화 α-1,4-글루칸을 제조하기 위해, 나이세리아 폴리사카레아의 정제된 아밀로수크라아제(실시예 6 참조) 및 나이세리아 데니트리피칸스의 정제된 가지화 효소(실시예 5 참조)를 10.86㎖의 반응부피에서 20% 수크로스 용액(w/v)에 첨가했다. 시험 혼합물에 따라, 각 효소에 대한 다른단백질 활성 비율로 2개의 효소를 사용하였다(아밀로수크라아제 측정에 대해서는 실시예 7 참조; 가지화 효소 측정에 대해서는 실시예 8 참조)(표 1 참조).
아밀로수크라아제 제조: 6.2U/㎎; 1.8㎎/㎖
가지화 효소 제조: 75U/㎎; 6.9㎎/㎖
번호 BE(㎕) Amsu(㎕) BE(유닛) Amsu(유닛) Amsu(유닛)/BE(유닛)
1 725 140 375 1.6 1/234.4
2 181.3 140 94 1.6 1/58.8
3 45.5 140 24 1.6 1/15
4 11.4 140 5.90 1.6 1/3.7
5 2.8 140 1.45 1.6 1.1/1
6 0.713 140 0.37 1.6 4.3/1
7 0.179 140 0.09263 1.6 17.3/1
8 0.0446 140 0.02308 1.6 69.3/1
9 0.0112 140 0.00580 1.6 275.9/1
10 0.0028 140 0.00145 1.6 1103.4/1
11 0 140 0 1.6 --------
13 글리코겐 from Mytillus edulis --------
BE = 가지화 효소
Amsu = 아밀로수크라아제
유닛 = 측정단위, 실시예 7 및 8 참조
실시예 10
메틸화 분석에 의한 가지화 정도 측정
얻은 글루칸의 가지화 정도는 메틸화 분석에 의해 측정되었다.
1. - 각 회마다 이중측정으로 글루칸 샘플의 모든 자유 OH-기를 메틸화하고,
- 과메틸화 중합체를 가수분해한후, C-1에서 환원하고, 단량체 혼합물을 아세틸화하며,
- 반응생성물의 기체 크로마토그래피 분석 및 정량화를 실시하였다.
글루칸 샘플의 가지화 정도는 메틸화 분석에 의해 평가하였다(도 4 참조). 중합체의 자유 OH-기는 메틸에테르로 전환시킴으로써 표지한다.
단량체로의 분해는 산 가수분해 방법으로 실시하며, 피라노시드/푸라노시드 형태 및 α- 및 α-글루코시드로 존재하는 일부 메틸화된 글루코스 분자로 된다. 상기 변이체는 대응 일부 메틸화된 소르비트 유도체내에서 NaBH4에 의해 환원시킴으로써 포커스된다. 자유 OH-기의 아세틸화에 의해, 상기 반응혼합물을 기체 크로마토그래피에 의해 시험할 수 있다.
하기 표는 얻은 글루칸의 조직 및 DMSO 용해도를 나타낸다.
샘플 조직 DMSO 용해도(냉각) DMSO 용해도(100℃)
1 플라스틱 기포-형무색 (+) +(약간 뿌연 용액)
2 n.d. n.d. n.d.
3 플라스틱 기포-형무색 (+) +(약간 뿌연 용액)
4 n.d. n.d. n.d.
5 무색 분말 + +
6 n.d. n.d. n.d.
7 무색 분말 + +
8 n.d. n.d. n.d.
9 무색 분말 + +
10 n.d. n.d. n.d.
11 무색 분말 + +
13 황색 분말 (+) +
n.d. = 측정되지 않음.
2. 실험예
a)DMSO 용액의 제조
1% 용액(w/v)을 DMSO에서 제조하였다. 모든 샘플이 실온에서 잘 용해되는 것은 아니었으며, 1, 3 및 13은 110℃에서 30분동안 가열하였다. 약간 뿌연 용액 1 및 3에서와 달리, 맑은 용액도 있었다(표 2 참조).
b)메틸화
DMSO 용액 2㎖(중합체 20㎎)을 50㎖-질소 플라스크에 옮기고, N2스트림에서 새로 제조된 딤실 용액의 5당량/OH(eq/OH)에 첨가하고, 30분동안 교반했다. 상기 용액은 불투명해지고, 점성이 생겼다. 플라스크의 내용물을 얼음-배스에서 동결시키고, 10eq/OH 메틸리오디드를 첨가하고, 해동후 상기 혼합물을 적어도 2시간동안 교반하였다. 제2 비양성자첨가반응 및 메틸화 단계전에, 잉여 메틸리오디드를 진공하에서 제거하였다.
잉여 메틸리오디드를 제거한후, 물 50㎖를 첨가하고, 디클로로메탄 10㎖에 의해 5회 추출함으로써 처리하였다. 물에 의해 3회 추출함으로써 유기상으로부터 미량의 DMSO를 제거하고, 그후 유기상을 CaCl2에 의해 건조시키고, 여과 및 농축시켰다. 생성물은 맑고, 황색의 막이었다.
샘플 7에 의해, 히드록실기의 과메틸화를 위해 얼마나 많은 메틸화 단계가 필요한지를 먼저 체크하였다. 제1 메틸화후에, 혼합물의 반응 처리하고, 반은 다시 메틸화하였다. 두 샘플을 분해한후, GC-분석결과를 비교하였다. 먼저, 반응이 한 메틸화 단계후 거의 정량화되었다는 것을 알았다(도 5 참조). C-3에서 서브메틸화로 인해 존재하는 것으로 보이는 것을 가지화할 수 있는지를 확인하기 위해, 제2 메틸화를 실시하였다.
도 5는 1회의 메틸화 단계 및 2회 메틸화 단계후 샘플 7의 분석결과를 나타내는 모식도이며; 2,3,6-메틸화에 대한 값은 각각 96.12% 및 96.36%이다.
c)가수분해
메틸화 샘플 2㎎을 1㎖-압력 유리위에서 중량을 재고, 2M 트리플루오 아세트산 0.9㎖를 첨가하고, 120℃에서 2.5시간동안 교반하였다. 유리를 냉각시킨후, 혼합물을 N2스트림에서 농축시켰다. 미량의 산을 제거하기 위해, 톨루엔을 3회 첨가하고, 분출제거시켰다.
메틸화 데이터
샘플 1 샘플 3 샘플 5 샘플 7 샘플 9 샘플 11 샘플 13
방법 1
초기중량(㎎) 21.9 22.7 21.7 32.5 23.4 22.6 23.5
(mmol) 0.135 0.140 0.134 0.200 0.144 0.139 0.145
결과중량(㎎) 30.4 29.2 28.0 251) 27.7 28.8 30.4
(mmol) 0.149 0.143 0.137 0.1221) 0.136 0.141 0.149
이론량(%) 110 102 102 -1) 94 101 103
방법 2
초기중량(㎎) 23.7 2.1 20.7 20.8 23.1 21.5 19.5
(mmol) 0.146 0.136 0.128 0.128 0.142 0.133 0.120
결과중량(㎎) 31.1 30.6 27.5 16.02) 31.4 29.4 25.5
(mmol) 0.152 0.150 0.135 0.0782) 0.154 0.144 0.125
이론량(%) 104 110 105 612) 108 108 104
1)상기 샘플의 반을 이미 취하여, 첫번째 메틸화 단계후에 처리하고, 따라서 정확한 데이터를 사용할 수 없었다.
2)소량은 처리상 오류로 인한 것이다.
d)환원
0.5M 암모니아칼 NaBD4 용액 0.5㎖를 이전 반응단계의 나머지에 첨가하고, 60℃에서 1시간동안 교반하였다. 빙초산 몇방울로 상기 제제를 조심스럽게 파괴시켰다. 15% 메탄올계 아세트산을 5회 첨가하고, 이후에 붕산 트리메틸에스테르를 방출시킴으로써 결과 붕산염을 제거하였다.
e)아세틸화
피리딘 50㎕ 및 아세트산 250㎕을 이전 반응단계의 나머지에 첨가하고, 95℃에서 2시간동안 교반하였다. 냉각후, 반응혼합물을 10㎖ 포화 NaHCO3용액에 떨어뜨리고, 디클로로메탄에 의해 5회 추출하였다. 유기상내 반응혼합물을 가스 크로마토그래피에 의해 시험하였다(생성물, 도 4 참조).
f)가스 크로마토그래피
가스 크로마토그래피에 의핸 시험은 온-컬럼 입구 및 FID 검출기를 구비한 Carlo Erby GC 6000 Vega 시리즈 2 장치를 사용하여 실시하였다. 소휘 슈펠코(Supelco) SPB5(내부직경 0.2㎜, 길이 30m)인 융합-실리카 모세관 컬럼상에서 운반기체로서 수소를 사용하여 80kPa의 압력에서 분리를 실시하였다. 하기 온도 프로그램을 사용하였다: 60℃(1분)-25℃/분 →130℃-4℃/분 →280℃.
3. 결과
피크를 확인하고, 피크면적을 통합하고, Sweet 외 다수의 ECR 컨셉(Sweet 외 다수, Carbohydr. Res. 40 (1975), 217)에 의해 데이터를 보정함으로써 가스 크로마토그래피를 분석하였다.
샘플 1과 3에서 관찰될 수 있었던 1,6-안하이드로-화합물은 C-6에서 높은 갖화 정도를 나타냈다. 가수분해하는동안, 이들은 반응조건하에서 상기유도체를 형성하기 위해 추가로 반응하는 C-6에서 자유 OH-기를 갖는 단량체를 형성한다. 가지화 정도를 계산할때, 상기 비율은 "2,3-Me"값으로 부가된다.
도 6은 시험된 글루칸 샘플의 말단("2346Me") 및 6-결합된 ("23"Me) 글루코스 유닛의 비율을 도시한 것이다.
분석결과(몰%): 약어(A, B 등)는 도 1에 대응한다; "16AnhPy" = 1,6-안하이드로-4-O-아세틸-2,3-디-O-메틸-D-글루코피라노스, "16AnhFu" = 1,6-안하이드로-5-O-아세틸-2,3-디-O-메틸-D-글루코푸라노스; "Me1" 및 "Me2"는 각 샘플의 2개의 메틸화 분석을 나타낸다.
샘플 1 샘플 3 샘플 5
Me1 Me2 평균값 Me1 Me2 평균값 Me1 Me2 평균값
16AnhPy 0.37 미량 0.19 미량 미량 - - - -
16AnhFu 0.53 0.47 0.50 미량 미량 - - - -
2346-Me(A) 11.73 11.94 11.84 9.49 10.68 10.08 2.42 2.51 2.47
234-Me(B) 미량 미량 - - - - - - -
236-Me(C) 76.37 77.80 77.09 82.97 80.67 81.82 95.54 96.18 95.86
23-Me(D) 9.75 9.16 9.46 7.54 8.34 7.94 1.36 1.05 1.21
26-Me(E) 0.45 0.31 0.38 미량 0.32 0.16 0.37 미량 0.19
36-Me 0.44 0.31 0.38 미량 미량 - 0.30 0.26 0.28
2-Me 0.20 - 0.10 - - - - - -
3-Me - - - - - - - - -
6-Me - - - - - - - - -
Un-Me 0.20 - 0.10 - - - - - -
샘플 7 샘플 9 샘플 11
Me1 Me2 평균값 Me1 Me2 평균값 Me1 Me2 평균값
16AnhPy - - - - - - - - -
16AnhFu - - - - - - - - -
2346-Me(A) 2.60 2.77 2.69 2.89 2.79 2.84 2.60 2.49 2.55
234-Me(B) - - - - - - - - -
236-Me(C) 96.36 96.89 96.63 95.62 95.62 95.62 96.21 97.20 96.70
23-Me(D) 0.48 0.33 0.41 0.67 0.69 0.68 0.52 0.31 0.42
26-Me(E) 0.26 미량 0.13 0.36 0.42 0.39 0.36 미량 0.18
36-Me 0.29 미량 0.15 0.47 0.48 1.47 0.30 미량 0.15
2-Me - - - - - - - - -
3-Me - - - - - - - - -
6-Me - - - - - - - - -
Un-Me - - - - - - - - -
샘플 13
Me1 Me2 평균값
6AnhPy 미량 미량 -
16AnhFu 미량 미량 -
2346-Me(A) 8.91 7.46 8.19
234-Me(B) 미량 미량 -
236-Me(C) 83.71 85.45 84.58
23-Me(D) 7.07 6.87 6.97
26-Me(E) 0.32 0.22 0.27
36-Me 미량 미량 -
2-Me - - -
3-Me - - -
6-Me - - -
Un-Me - - -
실시예 11
다른 분자량을 갖는 α-1,6-가지화 α-1,4-글루칸의 제조
다른 분자량을 갖는 α-1,6-가지화 α-1,4-글루칸을 제조하기 위해, 나이세리아 폴리사카레아의 정제된 아밀로수크라아제(실시예 6 참조) 및 나이세리아 데니트리피칸스의 정제된 가지화 효소(실시예 5 참조)를 10.86㎖의 반응부피로 20% 수크로스 용액에 첨가했다. 시험 혼합물에 따라, 다른 단백질 비율로 2개의 효소를 사용하였다(아밀로수크라아제 활성측정은 실시예 7을 참고하고, 가지화 효소측정은 실시예 8을 참고한다)(표 1 참조). 분자량 및 삽입반경(Rg)은 광산란에 의해 측정하였다(Light Scattering from Polymer Solutions; editor: Huglin, M.B., Academic Press, London, 1972). 건조된 샘플 1-11을 DMSO내에 용해시키고, (90:10의 비율의) H2O 및 다른 희석액(약 2.5g/ℓ 내지 0.25g/ℓ)을 광 산란에 대해 측정하는 장치에서 분석하였다(SOFICA, Societe francaise d'instruments de condrole et d'analyses. Le Mesnil Saint-Denis, 프랑스). 상기 방법에서 얻은 데이터는 Berry의 (J.Chem.Phys. 44 (1966), 4550et set)에 따라 [...]1이었다.
샘플 아밀로수크라아제:가지화 효소의 비 삽입반경 Rg(㎚) 분자량(g/mol)
1 0.05 104 282×106
2 0.2 154 499×106
3 0.8 76 228×106
4 3.21 64 76×106
5 12.84 63 20×106
6 51.22 38 1.1×105
7 204.03 277 472,000
8 818.87 n.d. n.d.
9 3275.49 170 469,000
10 13043.48 n.d. n.d.
11 가지화 효소 없음 143 262,000
13 글리코겐(바다 홍합) 14.3 1.59×106g/mol(Burchard, W.:Macromolecules 10:919(1977))
n.d. = 측정되지 않음
실시예 12
나이세리아 데니트리피칸스의 가지화 효소의 색소체 발현을 위한 형질전환 식물의 발현 카셋트 구조
플라스미드 pBB48(Braunschweig내 Deutsch Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ, German Colletion of microorganisms and cell cultures)에 기탁번호 DSM 12425로 기탁됨)로부터 출발하는 PCR에 의해 나이세리아 데니트리피칸스의 가지화효소에 대한 서열코딩을 증폭하기위해 올리고뉴클레오티드 BE-5' 및 BE-3'(서열번호 6 및 서열번호 7)을 사용하였다. 그로부터 얻은 증폭서열을 제한 엔도뉴클레아제 SalI 및 SdaI에 의해 소화시키고, SalI 및 SdaI에 의해 제거된 플라스미드 pBinAR-fnr로 클론시켰다. 상기에서 얻은 플라스미드를 pBE-fnr-Km으로 표시하였다(도 9).
PCR 조건:
보에링거 만하임(Boehringer Mannheim)제 버퍼 및 중합효소(Pwo 중합효소 제1644947호)
DNA 0.2ng
10x버퍼 + MgSO4 5㎕
dNTPs(각 10mM) 1㎕
프라이머 BE-5' 120nN
프라이머 BE-3' 120nM
Pwo 중합효소 1.0유닛
증류수 ad 50㎕
반응조건
단계 1 95℃ 2:00분
단계 2 95℃ 0:30분
단계 3 66℃ 0:30분
단계 4 72℃ 2:00분(주기당 +1초)
단계 5 72℃ 8:00분
단계 2 내지 4는 40주기 반복하였다.
플라스미드 pBE-fnr-Km은 표준방법에 따라 감자식물을 형질전환하기 위해 사용하였다(상기 참조).
실시예 13
가지화 효소 활성을 갖는 유전자도입 감자식물의 확인 및 검출
노던 블롯 분석에 의해, 나이세리아 데니트리피칸스의 가지화 효소의 mRNA를 나타내는 식물을 실시예 12의 유전자도입 감자식물에서 확인할 수 있었다. 안정하게 형질전환된 식물내 가지화 효소의 활성을 검출하기 위해, 시험되는 식물의 잎재료를 액체질소내에서 급속냉동시키고, 액체 질소에 의해 모르타르 전-냉각하여 분쇄하였다. 해동된 재료를 분쇄하기 전에, 추출 버퍼를 첨가하였다(50mM 시트르산 나트륨, pH 6.5, 4mM DTT, 2mM 염화칼슘). 추출 버퍼 약 200㎕를 식물재료 약 100㎎(생체중)에 첨가했다. 분쇄된 식물재료와 추출 버퍼의 현탁액의 고체 성분을원심분리(10,000×g)에 의해 분리하였다. 그로부터 얻은 분취량의 맑은 상층액을 추출용적의 진행 버퍼(40% 글리세롤, 250mM Tris, pH 8.8, 0.02% 브로모페놀 블루)의 1/4와 혼합하고, 겔당 20mA의 일정세기로 폴리아크릴아미드 겔(하기 참조)내에서 분리하였다. (단백질 추출물을 가하기 전에, 겔의 전기영동을 상기 조건하에서 20분간 실시하였다). 진행 버퍼내에서 염료 브로모페놀 블루가 겔 밖으로 나가면 전기영동을 정지하였다. 그후, 각 교반시 20분간 겔 부피의 5배가 되는 부피에서 실온에서 상기 겔을 세척 버퍼(100mM 시트르산 나트륨, pH 6.5)에서 평형시켰다. 계속해서, 30℃에서 16시간동안 겔 부피의 5배인 양으로 배양버퍼(100mM 시트르산 나트륨, pH 6.5, 5% 수크로스, 나이세리아 폴리사카레아의 정제된 아밀로수크라아제 0.625유닛(효소의 정제 및 활성 측정은 상기를 참조한다))내에서 상기 겔을 배양하였다. 배양버퍼를 경사분리하고, 루골용액(1:5의 비율로 희석됨)을 첨가한후에, 가지화 효소와 조합한 아밀로수크라아제에 의해 형성된 글루칸을 푸른-갈색 밴드로서 볼 수 있다(도 10). 전체 남은 폴리아크릴아미드 겔은 배양버퍼내 아밀로수크라아제 활성으로 인해 청색으로 변하였다.
폴리아크릴아미드 겔의 조성:
a)분리 겔
375mM Tris, pH 8.8
7.5% 폴리아크릴아미드(Biorad No.EC-890)
중합용:
1/2000 부피 TEMED
1/100 부피 과황산암모늄
b)수집 겔
125mM Tris, pH 6.8
4% 폴리아크릴아미드(Biorad No.EC-890)
중합용:
1/2000 부피 TEMED
1/100 부피 과황산암모늄
c)전기영동 버퍼
375mM Tris, pH 8.8
200mM 글리신
실시예 14
증가된 가지화 효소 활성을 갖는 식물의 전분 분석
표준 방법에 따라, 실시예 12 및 13에 따라 제조된 유전자도입 감자식물로부터 전분을 분리하고, 그의 물리화학적 특성에 관해 시험하였다. 유전자도입 감자식물에 의해 형성된 전분은 예를 들어, 그의 포스페이트 함량, 점도 및 RVA에 의해 측정된 패스티피케이션 성질에 있어서 야생형 식물내에서 합성된 전분과 상이하다는 것을 발견하였다. 상기 분석기술에 기초한 변형된 전분의 물리화학적 특성의 결과는 하기 표에 나타나 있다.
번호 유전형 C6내포스페이트(%) 아밀로스함량 RVA max.(%) RVA min.(%) RVA fin.(%) RVA ser.(%) RVA T(%) 겔조직(%)
1 Desiree(야생형) 100 22.0 100 100 100 100 100 100
2 143-13A 36 20.9 50 83 82 79 79 162
3 143-11A -- 22.5 92 90 88 80 99.5 --
4 143-59A 22 20.9 36 69 78 114 99 225
범례"
143-13A, 143-11A. 143-59A = 나이세리아 데니트리피칸스의 가지화 효소를 과잉-발현하는 유전자도입 감자식물
RVA = Rapid Visco Analyzer
max. = 최대 점도 = 피크 점도
min. = 최소 점도
fin. = 측정후반 점도
set. = setback = min.과 fin.의 차이
T = 패스티피케이션 온도
아밀로스 함량외에, 퍼센테이지 값은 야생형을 인용한다(=100%).
RVA 분석, 전분입자의 크기분포 및 겔 조직의 분석결과는 도 11 내지 15에 도시되어 있다.
그리고, 도 16 내지 18은 계통 143-WT(=야생형), 143-13A 및 143-59A의 측사슬 분포패턴을 나타내는 HPLC 크로마토그래프의 결과를 나타낸다. 도 19는 HPLC 분석과 연관되어 사용된 용출구배를 도시한 것이다. 도 20에서, 야생형의 특정 사슬길이를 갖는 측사슬의 이탈율이 도시되어 있다.
측사슬의 비율을 계산하는 방법은 하기 2개의 표에 설명되어 있다.
143-59A(측정 1) 143-59A(측정 2)
피크명 피크면적 합 비율[%] 피크면적 합 비율[%] 면적비율의 평균값
A2 B2 C2 D2 E2
DP 6 577122 4.5 690167 5.08 4.79
DP 7 504371 3.93 544770 4.01 3.97
DP 8 341520 2.66 377170 2.77 2.72
DP 9 387706 3.02 462686 3.40 3.21
DP 10 511664 3.99 602911 4.43 4.21
DP 11 684394 5.34 776228 5.71 5.52
DP 12 884346 6.90 976001 7.18 7.04
DP 13 1038389 8.10 1138027 8.37 8.23
DP 14 1080589 8.43 1175544 8.65 8.54
DP 15 1046585 8.16 1144404 8.42 8.29
DP 16 977127 7.62 1016555 7.48 7.55
DP 17 850092 6.63 881777 6.49 6.56
DP 18 720854 5.62 739080 5.44 5.53
DP 19 626277 4.88 627135 4.61 4.75
DP 20 526159 4.10 522122 3.84 3.97
DP 21 439356 3.43 431106 3.17 3.30
DP 22 354956 2.77 336907 2.48 2.62
DP 23 281320 2.19 266412 1.96 2.08
DP 24 224165 1.75 200219 1.47 1.61
DP 25 176641 1.38 169596 1.25 1.31
DP 26 152651 1.19 145821 1.07 1.13
DP 27 153046 1.19 123171 0.91 1.05
DP 28 117125 0.91 103599 0.76 0.84
DP 29 92294 0.72 85067 0.63 0.67
DP 30 73885 0.58 59729 0.44 0.51
∑A212822634 ∑C213596204
합 100.00 100.00 100.00
컬럼 A1, A2, C1 및 C2에서 피크면적은 Dionex제 응용 프로그램 Al 450 버젼 3.31에 의해 측정하였다.
143-WT(측정 1) 143-WT(측정 2)
피크명 피크면적 합 비율[%] 피크면적 합 비율[%] 면적비율의 평균값
A2 B2 C2 D2 E2
DP 6 123190 1.75 160046 1.68 14.72
DP 7 95526 1.36 137396 1.45 1.40
DP 8 87365 1.24 126639 1.33 1.29
DP 9 158742 2.26 210845 2.22 2.24
DP 10 308544 4.39 382957 4.03 4.21
DP 11 465107 6.61 581774 6.12 6.36
DP 12 574882 8.17 721814 7.59 7.88
DP 13 634154 9.01 796824 8.38 8.70
DP 14 633566 9.01 798684 8.40 8.70
DP 15 594327 8.45 766484 8.06 8.25
DP 16 537537 7.64 699141 7.35 7.50
DP 17 470522 6.69 609229 6.41 6.55
DP 18 403081 5.73 539584 5.67 5.70
DP 19 352504 5.01 486633 5.12 5.06
DP 20 313708 4.46 432720 4.55 4.51
DP 21 265289 3.77 385358 4.05 3.91
DP 22 211722 3.01 323248 3.40 3.20
DP 23 179015 2.54 274938 2.89 2.72
DP 24 148758 2.11 227219 2.39 2.25
DP 25 119135 1.69 197839 2.08 1.89
DP 26 103902 1.48 177493 1.87 1.67
DP 27 88686 1.26 147919 1.56 1.41
DP 28 67024 0.95 131325 1.38 1.17
DP 29 61086 0.87 104515 1.10 0.98
DP 30 37850 0.54 87704 0.92 0.73
∑A17035222 ∑C19508328
합 100.00 100.00 100.00

Claims (20)

  1. (a)서열번호 2에 기술된 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 핵산분자;
    (b)서열번호 1에 기술된 코딩영역을 포함하는 핵산분자;
    (c)플라스미드 DSM 12425의 삽입물에 의하여 코딩된 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 핵산분자;
    (d)플라스미드 DSM 12425의 삽입물에 포함된, 가지화 효소를 위한 코딩영역을 포함하는 핵산분자;
    (e)처음 100개의 아미노산이 서열번호 2에 기술된 아미노산 서열에 관해 적어도 65%의 상동성을 갖는 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 핵산분자;
    (f)상보가닥이 (a), (b), (c), (d) 및/또는 (e)의 핵산분자와 교잡하고, 나이세리아속 세균의 가지화 효소를 코딩하는 핵산분자; 및
    (g)유전코드의 퇴화로 인해 (f)의 핵산분자의 서열과 상이한 서열을 포함하는 핵산분자로 이루어진 그룹에서 선택된 나이세리아속 세균의 가지화 효소를 코딩하는 핵산분자.
  2. 제 1 항의 핵산분자를 함유하는 벡터.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 핵산분자는 원핵세포 또는 진핵세포내에서 전사를 보장하는 조절서열에 센스-배향으로 결합되는 것을 특징으로 하는 벡터.
  4. 제 1 항의 핵산분자 또는 제 2 항 또는 제 3 항의 벡터에 의해 유전적으로 변형된 숙주세포.
  5. 단백질을 발현시키는 조건하에서 제 4 항의 숙주세포가 배양되고, 상기 단백질이 배양세포 및/또는 배양배지로부터 분리되는, 나이세리아속 세균으로부터 가지화 효소를 제조하는 방법.
  6. 제 1 항의 핵산분자를 사용하여 생체외 전사 및 해독 시스템에서 단백질이 생성되는, 나이세리아속 세균으로부터 가지화 효소를 제조하는 방법.
  7. 제 1 항의 핵산분자에 의해 코딩되거나, 또는 제 5 항 또는 제 6 항의 방법에 의해 얻을 수 있는 단백질.
  8. 제 7 항의 단백질을 특이적으로 인식하는 항체.
  9. 생체외 시스템에서 α-1,6-가지화 α-1,4-글루칸을 제조하기 위한 제 7 항의 단백질의 용도.
  10. 식물세포내 전사를 보장하는 조절영역에 핵산분자가 결합되는, 제 1 항의 핵산분자를 함유하는 유전자도입 식물세포.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 핵산분자는 식물의 색소체내 코딩된 단백질의 집적을 보장하는 시그널 서열을 코딩하는 서열에 결합되는 것을 특징으로 하는 유전자도입 식물세포.
  12. 제 10 항 또는 제 11 항의 식물세포를 함유하는 유전자도입 식물.
  13. (a)식물세포는 제 1 항의 핵산분자 또는 제 2 항 또는 제 3 항의 벡터를 도입함으로써 유전적으로 변형되고,
    (b)식물은 단계(a)에서 생성된 세포로부터 재생되며; 및
    (c)단계 (b)에서 생성된 식물로부터 추가의 식물들이 생성되는, 유전자도입 식물을 제조하는 방법.
  14. 상기 식물의 일부가 제 10 항 또는 제 11 항의 유전자도입 식물세포를 함유하는, 제 12 항의 식물 또는 제 13 항의 방법에 의해 얻을 수 있는 식물의 수확가능한 부분.
  15. 제 10 항 또는 제 11 항의 유전자도입 식물세포, 제 12 항의 유전자도입 식물, 제 13 항의 방법에 의해 얻을 수 있는 유전자도입 식물 또는 제 14 항의 식물의 일부로부터 얻을 수 있는 전분.
  16. 제 15 항에 있어서,
    상기 전분의 조성은 대응하는 야생형 식물의 전분에 비해 증가된 겔 조직 및/또는 감소된 포스페이트 함량 및/또는 감소된 피크 점도 및/또는 감소된 패스티피케이션 온도 및/또는 감소된 전분입자크기 및/또는 변형된 측사슬 분포를 갖도록 하는 방법으로 변형되는 것을 특징으로 하는 전분.
  17. 세균세포내에서 제 1 항의 핵산분자의 전사를 자연적으로 조절하는 조절영역.
  18. 제 17 항에 있어서,
    상기 조절영역은
    (a)서열번호 1에 기술된 뉴클레오티드 서열중 뉴클레오티드 1 내지 169를 포함하는 뉴클레오티드 서열;
    (b)플라스미드 DSM 12425의 삽입물내에 포함된 조절영역의 뉴클레오티드 서열 또는 그의 일부;
    (c)엄격한 조건하에서 (a) 또는 (b)의 서열과 교잡하는 뉴클레오티드 서열을포함하는 군에서 선택되는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 것을 특징으로 하는 조절영역.
  19. 기질 수크로스 및 아밀로수크라아제와 가지화 효소의 효소조합을 사용하여 α-1,6-가지화 α-1,4-글루칸을 생체외 제조하는 방법.
  20. 제 19 항에 있어서,
    상기 가지화 효소는 제 1 항의 핵산분자에 의해 코딩되는 것을 특징으로 하는 α-1,6-가지화 α-1,4-글루칸의 제조방법.
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