NL8902128A

NL8902128A - Vertakkingsenzym en gebruik daarvan.

Info

Publication number: NL8902128A
Application number: NL8902128A
Authority: NL
Original assignee: Avebe Coop Verkoop Prod
Priority date: 1989-08-23
Filing date: 1989-08-23
Publication date: 1991-03-18
Also published as: ATE113982T1; EP0418945A1; EP0418945B1; DE69014046T2; DE69014046D1; DK0418945T3

Description

BESCHRIJVING

vertakkingsenzym en gebruik daarvan Gebied van de uitvinding

De uitvinding ligt op de gebieden van de recombinant DNA technologie, de microbiologie, de enzymologie en de zetmeel- en voedingsmiddelentechnologie. De uitvinding betreft een bepaald enzym, dat bijv. voor de bereiding van voedingsmiddelen kan worden benut, en betreft het voor het enzym coderende gen, dat door de uitvinders gekloneerd is en gebruikt kan worden voor transformatie van een voor produktie van het enzym geschikt organisme.

Meer in het bijzonder heeft de uitvinding betrekking op een vertakkingsenzym van microbiële oorsprong, op een gebruik van dit vertakkingsenzym voor het modificeren van een zetmeelachtig materiaal, bijvoorbeeld in het kader van een werkwijze voor het bereiden of vervaardigen van voedingsmiddelen voor mens of dier, alsmede op een recombinant polynucleotide (in het bijzonder recombinant DNA, bijv. in de vorm van een chimeer plasmide) dat de genetische informatie omvat die voor het vertakkingsenzym codeert.

Achtergrond van de uitvinding

Diverse microorganismen (een term die hier in zijn ruime betekenis wordt gebruikt en derhalve zowel bacteriën, als ook andere kleine organismen zoals schimmels, gisten en algen omvat) beschikken over een bij de biosynthese van glycogeen betrokken enzym, dat bekend staat als vertakkingsenzym. Dit enzym is een transferase dat bij zetmeelachtige substraten, zoals amylose, amylopectine, zetmeel, dextrine en daarvan afgeleide, uit a-D-glucose opgebouwde polysacchariden, tot de vorming van a(l—>6) vertakkingen leidt. De systematische naam van dit enzym is 1,4-α-D-glucan:1,4-a-D-glucan 6-a-D-(1,4-a-D-glucano)-transferase, of EC 2.4.1.18. Glycogeen is een aan de plantaardige zetmeel-component amylopectine verwant polyglucose materiaal, dat in dieren en diverse microorganismen als koolstof- en energie-opslagmateriaal dienst doet. Evenals amylopectine is glycogeen een vertakt polyglucose materiaal, maar de vertakkingsfrequentie is bij glycogeen groter dan bij amylopectine. Het vertakkings-enzym is nodig om de a(l—>6) vertakkingen van het glycogeen te vormen.

Inmiddels zijn diverse vertakkingsenzymen van microbiële oorsprong geïsoleerd en nader onderzocht. Uit het Amerikaanse octrooischrift 4.454.161 is bijv. een uit Bacillus megaterium geïsoleerd vertakkingsenzym bekend. Dit enzym is stabiel tot ongeveer 45 °C en vertoont een optimum van de enzymactiviteit bij een temperatuur van ongeveer 25 °C.

Uit een artikel van Boyer en Preiss in Biochemistry 16, 1977, 3693-3699 is een vertakkingsenzym uit Escherichia coli bekend. Uit Baecker et al, J. Biol. Chem. 261, 1986, 8738-8743 is de nucleotidenvolgorde van het voor dit vertakkingsenzym coderende glgB gen bekend, evenals de daarmee corresponderende aminozuurvolgorde van het enzym. Dit E.. coli enzym heeft een uit de aminozuursamenstelling berekend molekuulgewicht van 84231.

Door Zevenhuizen, Biochim. Biophys. Acta 81, 1964, 608-611 is een vertakkingsenzym uit Arthrobacter globiformis beschreven.

Door Walker en Builder, Eur. J. Biochem. 20, 1971, 14-21 is een vertakkingsenzym van Streptococcus mitis beschreven.

Door Steiner en Preiss, J. Bacteriol. 129, 1977, 246-253 is een vertakkingsenzym van Salmonella typhimurium beschreven.

Door Fredrick is in J. Thermal Biol. 3, 1978, 1-4 en in Phytochemistry 19, 1980, 539-542 een vertakkingsenzym uit de alge Cyanidium caldarium beschreven.

Door Kiel et al, Gene 78, 1989, 9-17 zijn de klonering en expressie in E- coli van het voor een vertakkingsenzym van Svnechococcus sp. PCC 7942 (of Anacystis nidulans R2) coderende gen beschreven. Het gen codeert voor 2 eiwitten, waarvan het grootste, blijkens de inmiddels bepaalde nucleotidenvolgorde van het daarvoor coderende glgB gen, een molekuulgewicht heeft van 89206. De enzymactiviteit van dit vertakkingsenzym vertoont een optimum bij een temperatuur van ongeveer 35 °C. Het kleinere eiwit heeft een molekuulgewicht van ca. 72 kDa en is eveneens enzymatisch actief.

Zoals in het hierboven reeds genoemde Amerikaanse octrooi-schrift 4.454.161 is uiteengezet, kan vertakkingsenzym worden benut voor een verbetering van de kwaliteit van uiteenlopende voedingsmiddelen. De neiging van zetmeelachtige materialen tot retrogradatie, waardoor de bewaartijd en verteerbaarheid van voedingsmiddelen die deze materialen bevatten afnemen, kan door het introduceren van a(l—>6) vertakkingen met behulp van een vertakkingsenzym worden tegengegaan.

Een nadeel van alle tot dusver bekend geworden vertakkings-enzymen is echter dat ze bij verhoogde temperaturen niet erg actief en zelfs instabiel zijn. Dit legt grote beperkingen op aan de wijze waarop een te modificeren zetmeelachtig materiaal of een voor consumptie door mens of dier bestemd produkt, dat een te modificeren zetmeelachtig materiaal bevat, kan worden behandeld. Om verschillende redenen kan een behandeling bij verhoogde temperaturen, bijv. bij een temperatuur boven 45 °C, de voorkeur verdienen of zelfs nodig zijn. Wanneer bij hogere temperaturen kan worden gewerkt, kunnen bijv. hogere zetmeel-concentraties worden gebruikt, hetgeen voor vele toepassingen op technische schaal gewenst is. Met de bekende vertakkingsenzymen is dat niet mogelijk.

Van verschillende enzymen is het bestaan van thermostabiele varianten bekend. Zo is bijv. uit de Europese octrooiaanvrage EP-A-0057976 een thermostabiel alfa-amylase enzym bekend, dat afkomstig is van bacteriën van een Bacillus stearothermophilus stam. In deze Europese octrooiaanvrage wordt de klonering en expressie van dit thermostabiele alfa-amylase in £. coli en in £. subtilis beschreven. Alfa-amylase is een enzym, dat voor een hydrolytische afbraak van zetmeelachtige materialen kan worden gebruikt, bijv. voor de bereiding van glucose-siroop uit maïszetmeel .

Voorts is uit het Amerikaanse octrooischrift 4.612.287 een thermostabiel pullulanase enzym bekend, dat afkomstig is van het anaërobe microorganisme Thermoanaerobium brockii. In dit Amerikaanse octrooischrift wordt de klonering en expressie van dit thermostabiele pullulanase enzym in £. coli en in R. subtilis beschreven. Pullulanase is een enzym, dat specifiek de afbraak van a(l-»6) glucoside-bindingen katalyseert en dat derhalve bij amylopectine en soortgelijke zetmeelmaterialen tot een afname van het aantal vertakkingen leidt.

Totnogtoe zijn echter geen thermostabiele varianten van het vertakkingsenzym beschreven.

Beschrijving van de uitvinding

De uitvinding voorziet nu in de bestaande behoefte aan een thermostabiel vertakkingsenzym en verschaft in het bijzonder een vertakkingsenzym van microbiële oorsprong, verkregen door isolatie uit een organisme dat in staat is om het enzym tot expressie te brengen, welk nieuwe vertakkingsenzym volgens de uitvinding gekenmerkt wordt door een stabiliteit van het enzym bij temperaturen tot ten minste 50 °C en een optimum van de enzymatische activiteit bij een temperatuur boven 45 °C.

Een voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding betreft een vertakkingsenzym, dat gekenmerkt wordt door een afkomst van bacteriën van de soort Bacillus stearothermophilus, meer in het bijzonder door een afkomst van bacteriën van de stam Bacillus stearothermophilus 1503-4R var.4.

Hoewel het bekende thermofiele microorganisme Bacillus stearothermophilus normaliter geen waarneembare hoeveelheden glycogeen vormt, is de bovenstaand genoemde spontane variant Bacillus stearothermophilus 1503-4R var.4 in staat om aan het eind van de logaritmische groeifase een vertakt glucan op te hopen, waarin de gemiddelde ketenlengte van de vertakkingen bij 21 glucose-residuen ligt. Door Goldemberg is in artikelen in Biochim. Biophys. Acta 177, 1969, 166-168 en in Arch. Biochem. Biophys. 149, 1972, 252-258, alsmede in het boek "Biochemistry of the glycosidic linkage", vol.2, 1972, 621-627 over de glucan biosynthese van de genoemde variant gerapporteerd. Van een isolatie, karakterisering en klonering van het verantwoordelijke vertakkingsenzym is echter in deze publikaties geen sprake.

De onderhavige uitvinders hebben het glgB gen van Bacillus stearothermophilus 1503-4R var.4, dat voor zijn thermostabiele vertakkingsenzym codeert, gekloneerd, gekarakteriseerd en tot expressie gebracht in £. coli en £. subtllis. Uit de door hen bepaalde nucleotidenvolgorde kon de aminozuurvolgorde worden afgeleid, en daaruit het molekuulgewicht van het thermostabiele vertakkingsenzym worden berekend op 74787. Het enzym bestaat uit 639 aminozuur-residuen (zie fig. 4). Verder hebben de uitvinders de enzymatische activiteit van het desbetreffende thermostabiele vertaxkingsenzym onderzocht. Daarbij werd vastgesteld, dat het enzym tot een temperatuur van ten minste 65 °C stabiel is en een optimale activiteit vertoont bij een temperatuur van ongeveer 53 °C.

Hoewel de uitvinders blijkens het experimentele gedeelte van deze aanvrage het glgB. gen van Bacillus stearothermophilus alleen nog maar in £. coli en in B.. subtilis tot expressie hebben gebracht, heeft een deskundige aan de hierin verstrekte informatie voldoende om het gen ook in andere gastheren tot expressie te brengen. Doorgaans zal alleen een aanpassing van de regulatie-elementen en van de transformatiemethode nodig zijn, d.w.z. dat bijv. een expressie in melkzuurbacteriën zal kunnen worden gerealiseerd door het strukturele glgB gen in een voor melkzuurbacteriën bruikbare expressiecassette in te bouwen en een voor de transformatie van melkzuurbacteriën geschikte vector te gebruiken. Het gebruik van andere microorganismen kan om verschillende redenen voorkeur verdienen, bijv. om veiligheidsredenen (melkzuurbacteriën behoren tot de zg. GRAS bacteriën, .hetgeen voor voedingsmiddeltoepassingen een belangrijk voordeel is) of om redenen van produktiviteit. De uitvinding maakt het verder mogelijk om een hoge produktie van het vertakkingsenzym te realiseren door voor dat doel geschikte regulatie-elementen te gebruiken, zoals een sterke transcriptie-promoter.

Uiteraard is de uitvinding niet beperkt tot het van B. stearothermophilus afkomstige vertakkingsenzym met de in fig.4 weergegeven aminozuurvolgorde. Mutanten van dit enzym met een afwijkende aminozuurvolgorde worden door de uitvinding eveneens omvat, mits ze actief zijn en aan de gestelde eisen ten aanzien van stabiliteit en activiteit bij hogere temperaturen voldoen. Hetzelfde geldt voor overeenkomstige enzymen, die afkomstig zijn uit andere microorganismen. Voor wat het voor het thermostabiele vertakkingsenzym coderende gen betreft, is de uitvinding niet beperkt tot de in fig.4 weergegeven nucleotidensequentie, maar omvat mutanten daarvan, die dankzij het ontaard zijn van de genetische code voor een enzym met dezelfde aminozuurvolgorde coderen, alsmede mutanten die voor een mutant enzym coderen indien het mutante enzym aan de hierboven gestelde voorwaarden voldoet, en in ruimere zin elk gen van microbiële oorsprong dat codeért voor een thermostabiel vertakkingsenzym zoals hierin gedefinieerd. De uitvinding omvat recombinante polynucleotiden (bij voorkeur DNA, maar recombinant RNA wordt eveneens omvat) die een dergelijk gen bevatten. Dergelijke recombinante polynucleotiden kunnen voorts regulatie-elementen omvatten, zoals een voor de gekozen gastheer geschikte transcriptie-promoter, en kunnen tevens een vectorgedeelte omvatten en de vorm hebben van een chimeer plasmide, dat een vectorplasmide omvat met daarin een insertie van DNA, die een transcriptiepromoter en eventueel andere regulatie-elementen, alsmede DNA dat codeert voor een thermostabiel vertakkingsenzym volgens de uitvinding omvat.

De uitvinding strekt zich ook uit over het gebruik van het nieuwe thermostabiele vertakkingsenzym volgens de uitvinding in werkwijzen voor het modificeren van een zetmeelachtig materiaal, zoals zetmeel, amylose, amylopectine, dextrine, en andere poly-glucose materialen, en over het aldus verkregen, gemodificeerde zetmeelachtig materiaal. Met modificeren wordt uiteraard een introduceren van (extra) vertakkingen bedoeld.

Voorts wordt de uitvinding belichaamd in een werkwijze voor het bereiden of vervaardigen van een voor consumptie door mens of dier geschikt produkt (voedingsmiddelen en diervoeders), welk produkt een zetmeelachtig materiaal omvat, dat door behandeling met een vertakkingsenzym volgens de uitvinding is gemodificeerd.

De uitvinding zal nu verder worden toegelicht aan de hand van de tekening en het hiernavolgende experimentele gedeelte.

Fiquurbeschrilving

Figuur 1 toont de kaart van het plasmide pKVS242, dat voor een deel afkomstig is van het uitgangsplasmide pHP13 (dunne lijnen). Inserties zijn met dikke lijnen aangeduid. De vette pijl vertegenwoordigt de SP02 promoter. Het open blok stelt het coderende gebied van het Bacillus stearothermophilus (fisi.) glgB gen voor. De afkortingen hebben de gebruikelijke betekenissen: Emr duidt op het erythromycine resistentie-gen,

Cmr duidt op het chloramphenicol resistentie-gen, ori duidt op de replicatie-oorsprong, E duidt op een EcoRl site, B duidt op een BamHI site, en H duidt op een HindlII site.

Figuur 2 toont de kaart van het plasmide pKSZ14, waarbij het gearceerde blok het coderende gebied van het glgB-lacZ fusie gen voorstelt. Voor de gebruikte afkortingen geldt wat voor fig.l is opgemerkt, en geldt voorts: Δ duidt op een afgeknot gen, mes duidt op een multiple cloning site, plac geeft de plaats en oriëntatie van de lacZ promoter aan, P duidt op de putatieve Bst glgB promoter, * duidt op de plaats van een NcoI-XmnI fusie, W duidt op de plaats en oriëntatie van de T1T2 terminators.

Figuur 3 toont de restrictiekaart van het plasmide pKVSl.

De dunne lijn geeft de Bst insertie aan, terwijl de vette lijn het van de vector pUC9 afkomstige DNA aanduidt. De gearceerde gebieden geven de fragmenten aan, die het sterkste met de £. coli glgB probe hybridiseerden.

Figuur 4 toont de nucleotidensequentie van het Bst glgB gen (de anti-sense streng van het 2,7 kb EcoRI-SacI fragment) en de aminozuurvolgorde van het daardoor gecodeerde vertakkingsenzym. Het open leesraam, beginnend bij nucleotide 325, is aangegeven als ORF2. Putatieve ribosoombindingsplaatsen zijn onderstreept. Putatieve promoters zijn met vetgedrukte letters aangegeven. De pijlen, stroomafwaarts van het Bst glgB gen, wijzen op een gebied van tweetallige symmetrie.

Figuur 5 toont de activiteit van het Bst vertakkingenzym, en het effect van de temperatuur op die activiteit. De vertak-kingsactiviteit werd bepaald in een met DEAE gezuiverd preparaat van £. stearothermophilus 1503-4R var.4 (kruisjes in paneel A) en in extracten van £. coli KV832[pKVS242] (open vierkantjes in paneel B) en E. subtills 5GM(amy)[pKVS242] (massieve bolletjes in paneel B) door de toename van het aantal 1,6-a-glucosidebin-dingen in amylopectine bij de aangegeven temperaturen te meten. Een eenheid van activiteit werd gedefiniëerd als de hoeveelheid enzym, die nodig was om per minuut 1 μταοί α-l, 6-glucosidebindin-gen in het substraat te introduceren.

Figuur 6 toont de expressie van de Bst glgB promoter in E. subtilis. De groeikrommen (massieve bolletjes) en het ontstaan van β-galactosidase activiteit door een correcte glgB-lacZ fusie (kruisjes) voor E. subtilis 8G5[pKSZ14] gekweekt op selectief TY-voedingsmedium (paneel A) of gekweekt op een met 0,5 % glucose aangevuld selectief TY-voedingsmedium (paneel B), en voor E. subtilis IS233[pKSZ14] gekweekt op selectief TY-voedingsmedium (paneel C) worden in deze figuur getoond. De specifieke β-galactosidase activiteiten zijn uitgedrukt in Miller eenheden per ml monster. De tijd start op het moment van verdunning in vers medium.

Experimenteel gedeelte

Klonering van het glgB gen van E. stearothermophilus

Er werd een kruishybridisatie experiment uitgevoerd, waarin DNA van E. stearothermophilus na knippen met HindlII en BamHI bij 58 °C en 61 °C werd gehybridiseerd met een daarbij als probe fungerend 1,2 kb BamHT fragment. Dit 1,2 kb BamHI fragment werd geïsoleerd uit plasmide pOPl90 en bevat nucleotiden 256-1464 van het E. coli glgB gen. De resultaten van de Southern blot analyse worden hier niet getoond.

Voor de klonering werd een HindlII fragment van ongeveer 6 kb gekozen, dat een sterke hybridisatie met de E. coli glgB probe vertoonde en voldoende groot is om het Bst glgB gen te kunnen bevatten (aannemende dat dit gen vergelijkbaar in grootte zou zijn met de glgB genen van E. coli en Synechococcus sp., die resp. 2,2 en 2,3 kb zijn). Hiertoe werd de Esi. DNA HindlII fractie van 4-7 kb geïsoleerd en gekloneerd in de HindlII site van het plasmide pUC9, waarna getransformeerd werd naar E. coli KV832. Recombinante kolonies werden op nitrocellulose filters overgebracht en bij 58 °C gehybridiseerd onder toepassing van het 1,2 kb BamHI fragment van het E. coli glgB gen als probe. Aangezien dit fragment in het chromosoom van E· col.i KV832 is gedeleteerd, zullen alleen kloons hybridiseren die Bst inserties dragen welke in sequentie overeenkomst vertonen met de E. coli glgB probe. Positieve kolonies werden geanalyseerd door het vervaardigen van restrictiekaarten en werden door aanvullende kruishybridisatie experimenten getest. Een plasmide met daarin een 6,1 kb HindlII fragment, dat een sterke hybridisatie met de E. coli glgB probe vertoonde, werd geselecteerd en aangeduid als pKVSl.

Karakterisering van pKVSl

In figuur 3 is de restrictiekaart van pKVSl weergegeven.

Ook zijn de restrictiefragmenten van de Bst insertie, die met de E. coli probe hybridiseerden, aangegeven. Het plasmide pKVSl gaf geen expressie van het Bst glgB gen, zoals werd geconcludeerd uit zijn onvermogen tot complementatie van E. coli glgB. In een complementatie experiment met het plasmide pKVS2 (een derivaat van pKVSl waarin de Bst insertie in tegengestelde oriëntatie in pUC9 is gekloneerd) werden de kolonies na kleuren met jodium echter bruin, hetgeen duidt op de aanwezigheid van een vertakt polyglucose. Dit resultaat geeft aan dat het pUC9 een voor een vertakkingsenzym coderend DNA fragment draagt.

Nucleotidensequentie van het Bst glgB gen

Van een 2,7 kb EcoRI-SacI fragment, dat het gekloneerde gen en de flankerende gebieden bevatte, werd de nucleotidensequentie bepaald. Analyse van de in figuur 4 getoonde sequentie laat een open leesraam van 1917 nucleotiden coderend voor een polypeptide van 639 aminozuren zien. Een (in fig.4 onderstreepte) Shine-Dalgarno achtige sequentie bevindt zich stroomopwaarts van het initiatie-triplet TTG. De sterkte van de wisselwerking tussen deze putatieve S.D. sequentie en het 3' uiteinde van het gram-positieve 16S rRNA werd volgens Tinoco et al, Nature 246, 1973, 40-41 berekend op AG=-15,2 kcal/mol, hetgeen een voor gram-positieve ribosoombindingsplaatsen normale waarde is.

Stroomopwaarts van het Bst crlgE gen werden geen sequenties gevonden, die overeenkomst vertonen met de consensus -35 en -10 gebieden welke door het belangrijkste vegetatieve E. subtilis RNA polymerase Ε-σΑ worden herkend. Wel werd een sterke homologie waargenomen tussen het aan de S.D. sequentie voorafgaande gebied (in fig.4 is dit gebied met vetgedrukte letters aangeduid) en de consensus sequentie voor promoters die door het sigma factor H bevattende E· subtilis RNA polymerase Ε-σΗ worden herkend.

Verder stroomopwaarts van het coderende gebied van het Bst glaB gen is het N-terminale deel van een tweede open leesraam aanwezig. Dit in fig.4 met ORF2 aangeduide open leesraam strekt zich uit over de EcoRI site (nucleotide 1 van de sequentie). Er werden geen overeenkomsten tussen de partiële aminozuurvolgorde van ORF2 en bekende aminozuursequenties waargenomen. Stroomopwaarts van het ATG initiatie codon van ORF2 bevindt zich een (in fig.4 onderstreepte) putatieve S.D. sequentie met een AG voor binding aan het 3' uiteinde van het grampositieve 16S rRNA van -14,2 kcal/mol. Verder is stroomopwaarts van deze S.D. sequentie een in fig.4 met vetgedrukte letters aangeduide sequentie aanwezig, die lijkt op de door Ε-σΑ herkende -35 en -10 gebieden. Tussen de twee putatieve promoters ligt een A/T rijk gebied.

Elf nucleotiden stroomafwaarts van het translatie-terminatie codon TAA van het Bst algB gen is een uitgestrekt gebied met tweetallige symmetrie aanwezig. Dit gebied kan bij transcriptie in RNA een "stem-loop" struktuur vormen met een AG van -104 kcal/mol. Dit gebied lijkt echter niet een van rho onafhankelijke transcriptie-terminatie plaats te zijn, aangezien een thymine-rijk gebied onmiddellijk stroomafwaarts van de "stem-loop" struktuur ontbreekt.

Aminozuurvolgorde van het Bst vertakkingsenzym

Uit de in fig.4 getoonde aminozuurvolgorde blijkt dat het Bst vertakkingsenzym een molekuulgewicht heeft van 74787, dus aanzienlijk kleiner dan de molekuulgewichten van de bekende vertakkingsenzymen van E. coli (fi£) en Synechococcus sp.(£n), die resp. 84 en 89 kDa zijn. Bij een vergelijking van de amino-zuurvolgorden van deze vertakkingsenzymen is vastgesteld dat het grampositieve vertakkingsenzym de N-terminus van de gramnegatie-ve enzymen mist. Hoewel de aminozuursequenties van de Bstf Ec en üü vertakkingsenzymen in het middengedeelte van de eiwitten grote overeenstemming vertonen, is de totale homologie ten gevolge van de zeer beperkte overeenstemming in het N-terminale gedeelte betrekkelijk gering.

Codon gebruik en G+C gehalte van het Bst glgB gen

Uit een vergelijking van het codon gebruik in de genoemde glgB genen zijn grote verschillen tussen de grampositieve en gramnegatieve genen naar voren gekomen. In de gramnegatieve genen zeldzame codons zoals TTA, ATA, GTA, ACA, AAA, CGA, AGA en GGA worden veel gebruikt in het Bst glgB gen. Verder blijkt er in het grampositieve glgB gen op alle posities, maar vooral op de derde positie van de codons een sterke weerstand tegen G en C te bestaan. In de gramnegatieve genen bestaat daarentegen juist een duidelijke voorkeur voor C en weerstand tegen A op de derde positie van de codons. Het G+C gehalte van het Bst glgB gen (40,8 %) is dan ook opvallend veel lager dan dat van de gramnegatieve Ec en M glgB genen (resp. 53,2 en 56,5 %) .

Aminozuursamenstelling

Ook in de aminozuursamenstelling blijken er nogal grote verschillen tussen de genoemde vertakkingsenzymen te bestaan. Zo heeft het Bst vertakkingsenzym een veel lager arginine en een veel hoger lysine gehalte dan de vertakkingsenzymen van de gramnegatieve bacteriën, en bevat het grampositieve enzym een veel groter aantal hydrofobe aminozuren (Phe, Trp, Tyr, Ile,

Leu, Met en Val), nl. 39,3 % t.o. slechts 34,9 % in de enzymen van de gramnegatieve bacteriën.

Expressie van het Bst glgB gen in E. coli en E. subtilis

Expressie van het Bst vertakkingsenzym in £. coli. getransformeerd met pKVS2, was nogal zwak. Er werd een shuttle plasmide pKVS242 geconstrueerd om in E. coli een sterkere expressie te verkrijgen en om ook expressie in £. subtilis te verkrijgen. Dit in figuur 1 weergegeven plasmide werd geconstrueerd door een uit pKVSl geknipt 4,3 kb EcoRI-HindlII fragment met daarin het volledige Bst crlgB gen te ligeren in pHP13, dat met dezelfde restrictie-enzymen was geknipt, en vervolgens de zeer sterke E. subtilis faag SP02 promoter (Williams et al, J. Bacteriol. 146, 1981, 1162-1165) als een 280 bp EcoRI fragment in de unieke Ec&RI site te inserteren. Dit 280 bp EcoRI fragment werd geïsoleerd uit het plasmide pGKV21, dat beschreven is door van der Vossen et al in Appl. Environ. Microbiol. 50, 1985, 540-542. Uit zijn vermogen tot complementatie van £. coli KV832 bleek dat pKVS242 in staat is om het Bst glgB gen tot expressie te brengen.

Uit pKVS242 bevattende bacteriën van de bacteriestammen E. coli KV832 en E· subtilis 5GM(aniy) werden extracten bereid.

De activiteit en het effect van de temperatuur op de activiteit van het vertakkingsenzym in deze extracten werden bepaald en vergeleken met een DEAE-gezuiverd enzympreparaat van Bst 1503-4R var.4. De in figuur 5 getoonde resultaten wijzen uit, dat het aantal a-1,6-glucosidebindingen in amylopectine door extracten uit pKVS242 bevattende cellen op een efficiënte wijze wordt vergroot. In controleproeven met extracten uit KV832[pHP13] en 5GM(amy)[pHP13] werden waarden beneden 1 milli-eenheid per ml gemeten. Verder lag de activiteit in KV832[pKVS2] maar net boven de achtergrond(de gegevens worden hier niet getoond). Figuur 5 laat ook zien dat in alle gevallen de optimale vertakkings-activiteit bij ongeveer 53 °C werd verkregen, waaruit de thermostabiele aard van het gekloneerde enzym blijkt.

Groeifase-afhankelijke expressie in fi. subtilis

Om te testen, of bij gebruik van een door Ε-σ11 herkende promoter transcriptie van het Bst algB gen plaats vindt, werd het in figuur 2 getoonde plasmide pKSZ14 geconstrueerd, dat een gloB-jacZ fusie-gen (met een correct leesraam) bevat. Het plasmide werd geconstrueerd uit 4 fragmenten, namelijk een uit pKVSl geïsoleerd 840 bp EcoRI-BamHl fragment dat het 5' uiteinde van het Bst glgB gen met inbegrip van de putatieve transcriptie en translatie regulatie elementen bevat; de met Ncol (blunt gemaakt) en EcoRI geknipte fi. subtilis./E. coli shuttle vector pHP13; een uit pMLBl034 geknipt 4,3 kb BamHI-XmnI fragment dat een afgeknot lacZ gen bevat; en een 500 bp EcoRI fragment dat de E. coli rrnB T1T2 terminators bevat (Brosius, Gene 27, 1984, 161-172). Het glgB-lacZ fusie-gen codeert voor een fusie-eiwit met β-galactosidase activiteit. Verder stopt de T1T2 terminator transcriptie die stroomopwaarts van het fusie-gen bij de lacZ promoter begint en een nauwkeurige bepaling van de activiteit van de putatieve Bst glgB promoter zou hinderen. Bij een transformatie van £. subtilis 8G5 met pKSZ14 werden na langdurige groei op XGal bevattende selectieve TY agar platen blauwe kolonies verkregen.

In paneel A van figuur 6 is het expressiepatroon van de β-galactosidase activiteit in E. subtilis 8G5[pKSZ14] getoond. Tijdens vegetatieve groei werd geen toename van de activiteit waargenomen. Kennelijk was de promoter van het Bst clorB gen in deze groeifase uitgeschakeld (de gemeten β-galactosidase activiteit is waarschijnlijk de restactiviteit van de overnacht cultuur die als inoculum was gebruikt). Aan het einde van de exponentiële groeifase steeg de β-galactosidase activiteit snel, hetgeen erop duidt dat het gen in de latere groeistadia tot expressie wordt gebracht. Wanneer de cellen in medium werden gekweekt, dat met glucose was aangevuld, kon daarentegen nauwelijks enige activiteit worden gedetecteerd (zie paneel B in fig.6). Hoewel het expressiepatroon van β-galactosidase gelijk bleef, werd een 500-voudige vermindering van de activiteit waargenomen. Deze resultaten bevestigen dat het Est. glgB gen niet door Ε-σΑ tot expressie komt, maar dat een of meer van de ondergeschikte sigma factors betrokken zijn bij de expressie van het gen in E. subtilis. Afhankelijkheid van Ε-σΗ werd getest door plasmide pKSZ14 in E. subtilis IS233 te brengen, welke stam sigma factor H mist. De in paneel C van fig.6 getoonde resultaten laten zien dat dan zeer weinig β-galactosidase activiteit wordt verkregen. Kennelijk is dus inderdaad sigma factor H betrokken bij de expressie van het Bst glgB gen in E. subtilis.

Bacteriën, plasmiden, media en (bio)chemicaliën

De gebruikte bacteriestammen en plasmiden zijn onderstaand aangegeven. De daarin vermelde E. subtilis stam 5GM(ajny) werd verkregen door congressie na transformatie van competente 6GM cellen met DNA van E. subtilis stam 1-85(amy) en selectie voor tyr+ recombinanten.

E. subtilis.

8G5 trpC2 msi. bis. u,r.a rib byr nis. jrnxA

Bron en Venema, Mutation Res. 15, 1972, 1-10 6GM trpC2 met his ura rib tyr r*f πιμ+

Haima et al, Mol. Gen. Genet. 209, 1987, 335-342 5GM(amy) trpC.2 met Eis. ura rib amy rM~ mM+ zie de hierboven gegeven beschrijving 1-85 trpC2 amy

Yuki, J. Genet. 42, 1967, 251-261 IS233 trpC2 phe-1 spoOHAHind

Weir et al, J. Bacteriol. 157, 1984, 405-412 E. stearothermophilus 1503-4R variant van E· stearothermophilus 1503-4R die glucan var.4 ophoopt

Goldemberg en Algranati, Biochim. Biophys. Acta 177, 1969, 166-168

E. qqII

KV832 F" ara A(lac-pro) thi strA <E>80dlacZAMl5 Δα1αΒ1200::Kmr Kiel et al, Mol. Gen. Genet. 207, 1987, 294-301 JM101 supE thi Δ(lac-proAB~) iF1traD36 proAB+ lad^ lacZAM151

Messing, Recombinant DNA Technical Bulletin, NIH publ. No.79-99, vol.2, No.2, 1979, 43-48 blasmiden pUC9 Apr, 2,7 kb, E. coli replicon

Vieira en Messing, Gene 19, 1982, 259-268 pHP13 Emr Cmr, 4,9 kb, E. coli en B. subtilis replicons Haima et al, Mol. Gen. Genet. 209, 1987, 335-342 PMLB1034 Apr, 6,3 kb, E. coli replicon, afgeknot lacZ gen

Silhavy et al, Experiments with gene fusions, 1984

pOPl90 Tcr, 11,5 kb, £. coli replicon, £. coli asd en σΐgR

genen

Kiel et al, Mol. Gen. Genet. 207, 1987, 294-301 pKVSl zie eerdere beschrijving in experimenteel deel pKVS2 zie eerdere beschrijving in experimenteel deel pKVS242 zie eerdere beschrijving in experimenteel deel pKSZ14 zie eerdere beschrijving in experimenteel deel

Medium 2 bevatte per liter 10 g casitone, 1 g gistextract, 3 g glucose, 1,5 g K2HP04, 1 g KH2P04, 8 g NaCl, 0,04 g CaCl2.2H20, 0,2 g MgS04 en 0,02 g FeCl3.6H20 pH 7,2. Een TY-voedingsmedium bevatte per liter 10 g tryptone, 5 g gistextract, 5 g NaCl en 20 mg MnCl24H20 pH 7,4. Indien nodig, werden 0,5 % glucose, 1,5 % agar, of 40 μg/ml XGal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-p-D-galactoside) toegevoegd. Naar behoefte werden de antibiotica aangevuld: voor £. coli Ap 100 μg/ml, Cm 10 μg/ml, Em 150 μg/ml, Km 50 μg/ml, en Tc 10 μg/ml; voor R. subtilis Cm 5 μg/ml en Em 1 μg/ml. De media en procedures, gebruikt voor transformatie van competente cellen van R. subtilis waren zoals beschreven door Bron en Venema, Mutation Res. 15, 1972, 1-10. De restrictie-enzymen, T4 DNA ligase en Klenow polymerase waren afkomstig van Boehringer, Mannheim, BRD en ze werden volgens de voorschriften van de producent gebruikt. Alle andere chemicaliën waren van analytische kwaliteit.

DNA preparaten

Totaal DNA werd geïsoleerd uit £. coli JM101, die bij 37 °C op TY-voedingsmedium werd gekweekt, en uit R. stearothermophilus 1503-4R var.4, die bij 55 °C werd gekweekt op TY-voedingsmedium, aangevuld met 0,5 % glucose en 0,38 g CaCl2, zoals beschreven door Kiel et al, Mol. Gen. Genet. 207, 1987, 294-301. Prepara-tieve hoeveelheden plasmide DNA werden verkregen uit £. coli volgens de alkalische lysis procedure van Maniatis et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1982. Voor de extractie van plasmide DNA uit 2 ml cultures van £. coli en 5 ml cultures van R. subtilis werd de analytische "miniprep" procedure van

Ish-Horowicz en Burke, Nucleic Acids Res. 9, 1981, 2989-2998, gebruikt.

Procedures voor molekulaire klonering

Routine DNA manipulaties werden uitgevoerd zoals beschreven door Maniatis et al. DNA restrictiefragmenten werden geïsoleerd van agarosegels met NA-45 DEAE membraanfilters volgens de door de producent gegeven instructies (Schleicher und Schuell,

Dassel, BRD).

Kruishybridisatie

Southern blot transfer werd uitgevoerd door elektroblotting van DNA restrictiefragmenten op Genesereen plus filters volgens de door de producent gegeven instructies (Dupont, NEN, Boston, USA). Kolonie-blotting werd uitgevoerd op nitrocellulose filters (Schleicher und Schuell, Dassel, BRD) zoals beschreven door Maniatis et al. De filters werden ten minste 40 uur bij 58 °C of 61 °C gehybridiseerd met [a-32P]dCTP (3000 Ci/mmol, RadioChemical Centre, Amersham, UK) gelabelde probes in 5x SSC; 1 % SDS; 0,02 % polyvinylpyrrolidon; 0,02 % runderserum albumine; 0,02 % ficoll 400 en 250 μg/ml kalfthymus DNA. Na hybridisatie werden de filters 3 keer bij de hybridisatietemperatuur gewassen met 5x SSC; 0,5 % SDS gedurende 1 uur. De filters werden daarna aan de lucht gedroogd en blootgegeven aan Kodak Omat films (XR-1).

Bepalingen van de vertakkingsenzym activiteit

Voor de detectie van plasmide-gecodeerde vertakkingsactivi-teit in £. coli KV832 werd de complementatie analyse toegepast, die beschreven is door Kiel et al, Gene 78, 1989, 9-17. Voor de detectie van vertakkingsactiviteit in E. stearothermophilus f in £. coli en in £. subtilis werd de volgende procedure gevolgd: E. stearothermophilus 1503-4R var.4 cellen werden in medium 2 gekweekt tot aan de vroege stationaire fase en vervolgens door centrifugeren geoogst. De celpellet werd gesuspendeerd in 10 mM Tris-Cl pH 7,5, 1 mM EDTA, 1 mM DTT (buffer A) corresponderend met een concentratie van 5 % droog gewicht, en de cellen werden met behulp van een ultrageluidsbron (MSE Ltd.) in 20 min met pulsen van 60 sec en tussenpozen van 30 sec opengebroken. Cel-resten werden door centrifugeren verwijderd. Vervolgens werd fractionering met (NH4)2SC>4 uitgevoerd. Het materiaal dat tussen 20 en 55 % verzadiging neersloeg werd gepelleteerd, opgelost in buffer A en grondig gedialyseerd tegen dezelfde buffer. Daarna werd het extract op een DEAE-cellulose kolom (40 ml, Whatman DE 52) in buffer A gebracht. De kolom werd daarna geëlueerd met een lineaire zoutgradiënt (van 0 tot 0,675 M NaCl in buffer A). De vertakkingsactiviteit elueerde bij 0,35 M NaCl en was nagenoeg vrij van amylase activiteit. Extracten uit getransformeerde E.. coli KV832 en E· subtilis 5GM(ainjr) cellen, gekweekt op een met 0,5 % glucose aangevulde selectieve TY-voedingsbodem, werden bereid zoals door Kiel et al, Gene 78, 1989, 9-17 is beschreven. De vertakkingsactiviteit werd in deze extracten bepaald met de in dezelfde publikatie beschreven procedure, die een kwantitatieve meting van a-1,6-glucosidebindingen toelaat, maar de substraat concentratie werd verhoogd tot 1,0 % amylopectine.

Nucleotidensequentie analyse DNA restrictiefragmenten werden gesubkloneerd in M13mpl8 en M13mpl9 (Norrander et al, Gene 26, 1983, 101-106) en getransformeerd naar £· coll JM101. Nucleotidensequenties werden bepaald volgens de dideoxy nucleotide keten-terminatie methode van Sanger et al, PNAS USA 74, 1977, 5463-5467, gebruikmakend van het Klenow fragment van DNA polymerase I, de universele sequentie primer en [35S]dATPaS (Biggin et al, PNAS USA 80, 1983, 3963-3965).

Bepaling van de β-galactosidase activiteit

Cellen werden een nacht bij 37 °C in 10 ml selectief TY-voedingsmedium, of met 0,5 % glucose aangevuld selectief TY-voedingsmedium gekweekt. De cultures werden vervolgens 1000-voudig verdund in 15 ml vers medium. De cellen werden dan bij 37 °C onder hevig schudden gekweekt. Elke 30-60 minuten werden monsters van 0,1-1,0 ml genomen, zonodig in TY-voedingsmedium verdund, waarna de ODgoO werd bepaald. Tegelijkertijd werd een monster van 0,2 ml genomen en een nacht bij -20 °C bewaard. Na ontdooien werden de bacteriën met chloroform en SDS permeabel gemaakt en werd de β-galactosidase activiteit bepaald met o-nitrofenyl-p-D-galactopyranoside als substraat volgens de methode van Miller, 1972. De activiteiten, niet gecorrigeerd voor OD600 waarden en derhalve de activiteit per ml cultuur voorstellend, zijn in Miller eenheden uitgedrukt.

Claims

1. Vertakkingsenzym van microbiële oorsprong, verkregen door isolatie uit een organisme dat in staat is om het enzym tot expressie te brengen, gekenmerkt door een stabiliteit van het enzym bij temperaturen tot ten minste 50 °C en een optimum van de enzymatische activiteit bij een temperatuur boven 45 °C.

2. Vertakkingsenzym volgens conclusie 1, gekenmerkt door een afkomst van bacteriën van de soort Bacillus stearothermophilus.

3. Vertakkingsenzym volgens conclusie 1, gekenmerkt door een afkomst van bacteriën van de stam Bacillus stearothermophilus 1503-4R var.4.

4. Vertakkingsenzym volgens conclusie 1, gekenmerkt door de in fig.4 weergegeven aminozuurvolgorde

5. Vertakkingsenzym volgens conclusie 1, gekenmerkt doordat het geïsoleerd is uit bacteriën die door genetische manipulatie met behulp van een recombinant polynucleotide zijn voorzien van genetische informatie, die nodig is om het enzym tot expressie te kunnen brengen.

6. Werkwijze voor het modificeren van een zetmeelachtig materiaal door het te behandelen met een vertakkingsenzym van microbiële oorsprong, verkregen door isolatie uit een organisme dat in staat is om.het enzym tot expressie te brengen, met het kenmerk, dat een vertakkingsenzym .volgens een van de conclusies 1-5 wordt toegepast.

7. Gemodificeerd zetmeelachtig materiaal, verkregen onder toepassing van de werkwijze volgens conclusie 6.

8. Werkwijze voor het bereiden of vervaardigen van een voor consumptie door mens of dier geschikt produkt, welk produkt een zetmeelachtig materiaal omvat, dat door behandeling met een vertakkingsenzym van microbiële oorsprong is gemodificeerd, met het kenmerk, dat voor de modificatie van het zetmeelachtige materiaal een vertakkingsenzym volgens een van de conclusies 1-5 wordt toegepast.

9. Voor consumptie door mens of dier geschikt produkt, verkregen onder toepassing van de werkwijze volgens conclusie 8.

10. Recombinant polynucleotide, in het bijzonder recombinant DNA, met het kenmerk, dat het genetische informatie bevat welke codeert voor een vertakkingsenzym volgens een van de conclusies 1-5.

11. Recombinant polynucleotide volgens conclusie 10, met het kenmerk, dat het de in figuur 4 weergegeven, voor vertakkingsenzym van bacteriën van de stam Bacillus stearothermophilus 1503-4R var.4 coderende nucleotidenvolgorde omvat.

12. Recombinant polynucleotide volgens conclusie 10 of 11, met het kenmerk, dat het bovendien een transcriptiepromoter en eventueel andere regulatie-elementen omvat.

13. Chimeer plasmide, omvattende een vectorplasmide met daarin een insertie van DNA, die een transcriptiepromoter en eventueel andere regulatie-elementen omvat, met het kenmerk, dat de DNA insertie tevens DNA omvat dat codeert voor een vertakkingsenzym volgens een van de conclusies 1-5.

14. Chimeer plasmide volgens conclusie 13, met het kenmerk, dat de DNA insertie de in fig.4 weergegeven, voor vertakkingsenzym van bacteriën van de stam Bacillus stearothermophilus 1503-4R var.4 coderende nucleotidenvolgorde omvat.