ES2283585T3 - Amilopectina hiperramificada para su utloizacion en procedimientos para el tratamiento quirurgico o terapeutico de mamiferos o en procedimientos de diagnostico, especialmente para su uso como extensor del volumen de plasma. - Google Patents

Abstract

Amilopectina hiperramificada, que presenta un grado de ramificación promedio, expresado como % en mol de las anhidroglucosas, que tienen puntos de ramificación, de entre >10 y 25% en mol y un promedio en peso medio del peso molecular Mw en el intervalo de desde 40.000 hasta 800.000 Dalton, y derivados de la misma para su aplicación en procedimientos para el tratamiento quirúrgico o terapéutico del cuerpo de animales o seres humanos o en procedimientos de diagnóstico.

Description

Amilopectina hiperramificada para su utilización en procedimientos para el tratamiento quirúrgico o terapéutico de mamíferos o en procedimientos de diagnóstico, especialmente para su uso como extensor del volumen de plasma.

La presente invención se refiere a la utilización de amilopectina hiperramificada.

La invención se refiere especialmente a un uso nuevo de amilopectina hiperramificada, que presenta un grado de ramificación determinado y un peso molecular Mw determinado.

En la historia del desarrollo de los extensores de volumen de plasma fue siempre un objetivo, conseguir la estructura globular del vehículo natural de la presión coloidosmótica en el suero, de la albúmina. Esta estructura globular se asemeja al glucógeno, que se produce igualmente como polisacárido natural de reserva en el organismo humano. El glucógeno consigue su estructura globular mediante su grado de ramificación muy alto. El glucógeno representa estructuralmente un polisacárido de glucosa con enlaces glucosídicos \alpha-1,4 en secciones lineales a las que están fijados puntos de ramificación glucosídicos \alpha-1,6. Debido a que el glucógeno por sí mismo no está a disposición como una fuente de materia prima barata, Wiedersheim sugirió en 1957 utilizar en su lugar la amilopectina menos ramificada como material de partida para la producción del extensor de plasma, hidroxietilalmidón (HEA). Mientras tanto, se utiliza muy ampliamente hidroxietilalmidón en muchos tipos diferentes como extensor de plasma. El desarrollo ha conducido a nuevos tipos de hidroxietilalmidón (tipos de HEA), que presentan un efecto de volumen óptimo con, por lo demás, efectos secundarios mínimos, tal como por ejemplo la influencia en la coagulación o sin embargo también la acumulación intermedia en el tejido.

Los tipos de HEA diferentes que se encuentran en el mercado se diferencian con respecto al peso molecular, el grado de sustitución promedio y el tipo de sustituciones.

A pesar del progreso notable que se consiguió con estos desarrollos, permanecen algunos inconvenientes también en los tipos de HEA optimizados en los últimos años, sobre todo la capacidad de no metabolizarse completamente.

Se conoce que el grupo hidroxietil éter es estable de manera extraordinaria química pero también metabólicamente, de tal modo que las unidades de glucosa anhidra del hidroxietilalmidón, que llevan grupos hidroxietil éter, prácticamente no pueden metabolizarse. Además se conoce, que sólo pueden romperse los enlaces glucosídicos \alpha-1,4 en la molécula de hidroxietilalmidón mediante la \alpha-amilasa sérica, que se forman mediante unidades de glucosa no sustituidas. Por esta razón puede determinarse, que incluso en el caso de los tipos de HEA optimizados puede determinarse una acumulación en el tejido mínima pero aún notable al menos durante ciertos periodos de tiempo.

Como inconveniente adicional se determina, que el HEA no presenta la estructura globular ideal de la albúmina y por esa razón su viscosidad intrínseca es más alta de manera significativa que la de la albúmina. Por esa razón es deseable una viscosidad inferior en un extensor de plasma, ya que tras su aplicación en la circulación se influiría en la viscosidad del volumen sanguíneo en el sentido de una disminución.

Por tanto, existe el objetivo de desarrollar nuevos extensores de plasma mejorados a base de amilopectina, que no presentan los inconvenientes de la capacidad de metabolizarse completamente ausente del derivado de amilopectina, hidroxietilalmidón. Simultáneamente, el nuevo extensor de plasma debe presentar una estructura más globular y con esto formar disoluciones de viscosidad relativamente baja.

También puede considerarse como objetivo de la invención, desarrollar campos de utilización adicionales para determinadas amilopectinas.

Estos objetivos, así como objetivos adicionales no representados en particular, que sin embargo pueden deducirse con soltura de la exposición preliminar, se solucionan mediante el objeto de la reivindicación 1. Las configuraciones preferidas de la invención son objeto de las reivindicaciones dependientes de la reivindicación 1.

Debido a que se utiliza amilopectina hiperramificada, que presenta un grado de ramificación promedio, expresado como % en mol de las anhidroglucosas, que tienen puntos de ramificación, de entre >10 y el 25% en mol y un peso molecular Mw en el intervalo de desde 40.000 hasta 800.000 Dalton, y dado el caso, sus derivados en procedimientos para el tratamiento quirúrgico o terapéutico del cuerpo de animales o de seres humanos (o sea de mamíferos) o en procedimientos de diagnóstico, se consigue desarrollar de una manera no predecible sin más por un lado para una amilopectina hiperramificada una serie de aplicaciones nuevas e interesantes en el campo médico. Por otro lado, se proporciona especialmente con respecto al sector de la "expansión del volumen de plasma" un material sustitutivo casi ideal, que conduce mucho menos a efectos secundarios peligrosos, para los productos de HEA a base de almidón todavía en uso en la práctica por el momento.

En referencia a la expansión del volumen de plasma, se comprobó concretamente en el marco de la invención mediante estudios y análisis costosos, que las fracciones residuales de hidroxietilalmidón en la corriente sanguínea y en la orina presentaban un fuerte aumento del grado de ramificación algunas horas o incluso días tras la aplicación de un extensor de plasma, en comparación con el hidroxietilalmidón administrado por infusión original (producto de HEA). Así aumentaron los grados de ramificación, expresados como % en mol de las anhidroglucosas, que tienen puntos de ramificación, desde aproximadamente el 5% en mol hasta por encima del 7% en mol 2 horas tras la aplicación y hasta el 8% en mol 7 horas tras la aplicación. Simultáneamente, se mostró 48 ó 42 horas tras la infusión en las fracciones recogidas de orina un grado de ramificación todavía superior del 9 o del 10% en mol. Este fenómeno se observó independientemente del peso molecular, grado de sustitución o tipo de sustitución del hidroxietilalmidón aplicado. Esto significa que estas fracciones se aproximan durante la degradación cada vez más a una ramificación o estructura similar
al glucógeno, que se exponen en la bibliografía con una ramificación de aproximadamente hasta el 10% en mol.

Se encontró ahora de manera sorprendente que puede aprovecharse la estabilidad relativa de la ramificación \alpha-(1,6) en la amilopectina y en derivados de la misma para reducir la degradación de amilopectina en comparación con la degradación por la \alpha-amilasa que domina hasta el punto en que puede producirse un polisacárido que pueda degradarse completamente, pero que aún presenta las propiedades de un extensor de plasma ideal con respecto a la farmacocinética o el efecto de volumen.

La invención comprende por tanto el uso de amilopectinas hiperramificadas y de derivados de tales amilopectinas hiperramificadas en el sector médico.

Por amilopectinas se entienden a este respecto en primer lugar muy en general almidones o productos de almidón ramificados con enlaces \alpha-(1-4) y \alpha-(1-6) entre las moléculas de glucosa. Las ramificaciones de la cadena tienen lugar a este respecto a través de los enlaces \alpha-(1-6). Estas están presentes de manera irregular en el caso de las amilopectinas que se producen naturalmente aproximadamente cada 15-30 segmentos de glucosa. El peso molecular de la amilopectina natural se encuentra muy elevado en el intervalo de desde 10^{7} hasta 2 x 10^{8} Dalton. Se parte del hecho de que la amilopectina también forma hélices en ciertos límites.

Se puede definir un grado de ramificación para las amilopectinas. La medida para la ramificación es la razón del número de moléculas de anhídridos de glucosa, que tienen puntos de ramificación (enlaces \alpha-(1-6)), con respecto al número total de moléculas de los anhídridos de glucosa de la amilopectina, expresándose esta razón en % en mol. La amilopectina que se produce en la naturaleza presenta grados de ramificación de aproximadamente el 4% en mol. Sin embargo se conoce que los clusters y segmentos de la molécula de amilopectina presentan en una consideración aislada un grado de ramificación levemente superior que el grado de ramificación promedio según la naturaleza.

Las amilopectinas hiperramificadas son ahora en el sentido de la invención aquellas amilopectinas, que presentan un grado de ramificación que supera de manera significativa el grado de ramificación conocido de la naturaleza para amilopectinas. A este respecto, se trata en el caso del grado de la ramificación en cada caso de un valor promedio (grado de polimerización promedio), dado que las amilopectinas son sustancias polidispersas.

Tales amilopectinas hiperramificadas presentan un grado de ramificación significativamente superior, expresado como % en mol de los anhídridos de glucosa de ramificación, en comparación con hidroxietilalmidón o amilopectina no modificada y a consecuencia de eso son más semejantes en su estructura al glucógeno.

El grado de ramificación promedio necesario para la utilización según la invención de las amilopectinas hiperramificadas se encuentra en el intervalo de entre >10 y el 25% en mol. Esto significa, que las amilopectinas útiles en el sentido de la invención presentan en promedio un enlace \alpha-(1-6) y con ello un punto de ramificación aproximadamente cada de 10 a 4 unidades de glucosa. Si el grado de ramificación se encuentra por debajo del 10% en mol, la degradación de la amilopectina ramificada (por ejemplo en el caso de su utilización como extensor de plasma) no está ralentizada suficientemente. Si el grado de ramificación es superior al 25% en mol, la degradación está demasiado ralentizada, de tal modo que se excluye una utilización por ejemplo como extensor del volumen de plasma.

Un tipo de amilopectina que puede utilizarse preferiblemente en el campo médico se caracteriza por un grado de ramificación de entre el 11 y el 16% en mol.

Otras amilopectinas hiperramificadas preferidas tienen un grado de ramificación en el intervalo de entre el 13 y el 16% en mol.

Además, tiene también significado el peso molecular Mw de la amilopectina hiperramificada. El peso molecular Mw indica el promedio en peso del peso molecular, tal como puede medirse con métodos pertinentes, que proporcionan este valor promedio. A esto pertenecen por ejemplo la CG acuosa, HPLC, dispersión de luz y similares.

Las amilopectinas hiperramificadas que pueden utilizarse en la invención tienen en general un valor para el promedio en peso del peso molecular Mw en el intervalo de desde 40.000 hasta 800.000 Dalton. El valor límite inferior para el intervalo del peso molecular Mw se deduce en las aplicaciones preferidas básicamente del denominado "umbral renal", que en el caso de compuestos hiperramificados se establece justamente de manera aproximada en 40.000. Si el peso molecular es menor que 40.000 Dalton, las moléculas se filtrarían demasiado rápidamente a través del riñón. Por encima de un peso molecular de 800.000 Dalton, no se consigue ningún beneficio significativo adicional, aunque en el caso de estructuras globulares la viscosidad límite ya no depende del peso molecular.

Se prefieren para la utilización como extensor del volumen de plasma valores promedios del peso molecular de entre 90.000 y 300.000 Dalton, muy especialmente son apropiados pesos moleculares Mw de entre 120.000 y 250.000 Dalton.

Una configuración especial de la invención comprende amilopectina hiperramificada, siendo el grado de ramificación promedio de entre el 11 y el 16% en mol y el peso molecular Mw de entre 90.000 y 300.000 Dalton. Configuraciones adicionalmente apropiadas de la invención incluyen amilopectina hiperramificada, siendo el grado de ramificación promedio de entre el 13 y el 16% en mol y el peso molecular Mw de entre 120.000 y 250.000 Dalton.

Los parámetros mencionados anteriormente, grado de ramificación y peso molecular permiten una influencia dirigida al objetivo y por consiguiente un ajuste de una farmacocinética deseada, especialmente la obtención de una degradación por la \alpha-amilasa deseada. A este respecto al grado de ramificación de la amilopectina le corresponde un significado clave. Pero también el peso molecular tiene una influencia sobre la cinética citada. Además, también puede conseguirse mediante la variación de la distribución de los puntos de ramificación, influir en la cinética de la degradación de la amilopectina en una dirección deseada.

Sin embargo, el grado de ramificación es de significado muy especial para la degradación de la amilopectina mediante la \alpha-amilasa y con ello para la función como extensor del volumen de plasma. Debido al alto grado de ramificación, el ataque de la \alpha-amilasa fuertemente ralentizado o en intervalos de la molécula con una fuerte densidad en puntos de ramificación ya no tiene lugar, dado que allí ya no es posible el acceso de la \alpha-amilasa. Sin embargo, tales compuestos son degradables mediante otras enzimas hasta dar oligosacáridos y finalmente glucosa.

En caso necesario, pueden derivatizarse las amilopectinas hiperramificadas que han de aplicarse según la invención. Tales derivados comprenden derivados químicos de la amilopectina, tal como están disponibles por ejemplo mediante reacciones químicas o biotecnológicas.

Los derivados preferidos de la amilopectina hiperramificada son hidroxietil-, hidroxipropil- y acetil-amilopectina. De aquí puede utilizarse por otra parte la hidroxietilamilopectina de manera muy favorable. Por lo tanto también mediante la derivatización puede influirse en la cinética de la degradación de la amilopectina. Sin embargo, es ventajoso que el grado de la derivatización, por ejemplo el grado de hidroxietilación, debe ser en estos casos considerablemente inferior, para presentar un efecto de volumen comparable, o una farmacocinética similar, en comparación con un hidroxietilalmidón (HEA), que se ha producido a partir de amilopectina ramificada normal.

La producción de amilopectina hiperramificada, que es adecuada en el sentido de la invención entre otros y preferiblemente para la utilización como extensor de plasma, tiene lugar de una manera en sí conocida mediante transformación enzimática mediante las denominadas enzimas de ramificación, que catalizan la hidrólisis de los enlaces glucosídicos \alpha-1,4 y su transformación en compuestos glucosídicos \alpha-1,6. Las denominadas enzimas de transferencia de ese tipo pueden extraerse de una manera en sí conocida por ejemplo de algas según el documento PCT WO 0018893. Pero también se conocen otras enzimas de ramificación de glucógeno a partir de la patente estadounidense número 4454161 y del documento EP 0418 945, que también pueden utilizarse correspondientemente. La realización de la transglucosilación enzimática tiene lugar de una manera en sí conocida por ejemplo mediante incubación de almidón de maíz céreo con las correspondientes enzimas en condiciones suaves a valores de pH de aproximadamente 7,5 y temperaturas de aproximadamente 30ºC en disolución acuosa. El reacondicionamiento de la mezcla básica de reacción tiene lugar a continuación de manera también conocida, desactivándose o extrayéndose previamente las enzimas mediante modificación del valor de pH o etapas de filtración.

En una etapa de hidrólisis posterior, que preferiblemente tiene lugar mediante ácido clorhídrico, se ajusta entonces el peso molecular deseado del producto. A continuación, se libera el producto mediante diafiltración con membranas con un corte de aproximadamente 3.000 Dalton de compuestos de bajo peso molecular tales como cloruro de sodio, que se produce en la neutralización de la mezcla básica de hidrólisis ácida. El producto se aísla por ejemplo mediante secado por pulverización.

Junto con la utilización como extensor del volumen de plasma, las amilopectinas hiperramificadas pueden utilizarse también de manera útil en otros campos de la medicina.

Así puede utilizarse la amilopectina hiperramificada en todas aquellas aplicaciones en el tratamiento y cirugía, en las que también pueden utilizarse productos de HEA habituales a base de almidones ramificados de manera normal.

Además de la aplicación como extensor del volumen de plasma, a este respecto se trata preferiblemente de la aplicación para mejorar la microcirculación, la aplicación como ayudante de la sedimentación en la separación celular en el contexto de la leucoforesis o la utilización para la crioconservación de los componentes sanguíneos como eritrocitos o granulocitos.

Ejemplo modelo 1

Ensayos de degradación comparativos con glucosacáridos \alpha-1-4/\alpha-1-6 ramificados de manera diferente

Se degradó glucógeno de la ostra de la empresa SIGMA mediante la \alpha-amilasa termorresistente BAN 480L de la empresa NOVOZYMES en una mezcla DMSO/agua con un porcentaje del 30% de DMSO a 70ºC y un valor de pH de 6,0.

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A este respecto se observó el transcurso de la reacción mediante la medición del cambio del peso molecular por medio de cromatografía en gel y tras aproximadamente 2 horas se paró la reacción mediante la adición de solución cáustica para inactivar la enzima. Tras la neutralización, se fraccionó el producto mediante ultrafiltración por medio de un ultrafiltro de acetato de celulosa con un corte nominal de 1.000 D y 25.000 D para la eliminación de porcentajes de bajo peso molecular así como los porcentajes de alto peso molecular. A continuación, se trató el producto con el intercambiador de iones Amberlita IR 200 C así como carbón activo, se precipitó con etanol y se secó a 80ºC.

El grado de ramificación determinado mediante espectroscopía de ^{1}H-RMN (integración de las señales de los protones anómeros) dio un grado de ramificación del 15% en mol, el peso molecular promedio Mw ascendió a 7.000 Dalton.

Se trató almidón de maíz céreo modificado (\geq95% de amilopectina) (empresa Cerestar) de la misma manera tal como se describió anteriormente. La fracción aislada, altamente ramificada de los cluster de ramificación presentó un grado de ramificación del 11% en mol, el peso molecular Mw promedio ascendió a 8.000 Dalton.

Se sometieron después las fracciones de cluster altamente ramificadas de amilopectina y glucógeno a un ensayo de degradación mediante la \alpha-amilasa del páncreas porcino (empresa Roche) en tampón fosfato pH 7,2 en una disolución al 1% a 37ºC y 0,5 UI/ml de enzima y se observó la cinética de la degradación mediante la medición de los cambios del peso molecular por medio de la cromatografía en gel. También se realizó un ensayo comparativo de la degradación con un extensor de plasma de hidroxietilalmidón habitual en el comercio (Voluven, empresa Fresenius Kabi). A este respecto se registraron diferencias claras en las cinéticas de degradación. El tiempo de vida media del peso molecular (degradación del peso molecular Mw promedio de la sustancia de partida a la mitad del valor de partida) ascendió en el caso de la fracción con un grado de ramificación del 15% a 60 minutos y a este respecto consiguió el tiempo de vida media determinado en las mismas condiciones de ensayo que el extensor de plasma Voluven.

El tiempo de vida media para la fracción con un grado de ramificación promedio del 11% en mol ascendió por el contrario a sólo 25 minutos y con esto fue básicamente más corto.

Ejemplo modelo 2

Se sometió almidón de maíz céreo modificado de la empresa Cerestar con un grado de ramificación promedio del 4% en mol, determinado mediante RMN de manera correspondiente a las indicaciones del ejemplo 1, a un ensayo de degradación mediante la \alpha-amilasa del páncreas porcino. Para esto, se gelatinizó una disolución al 1% en tampón fosfato pH 7,2 mediante calentamiento corto hasta 90ºC y se añadió la enzima a la mezcla básica tras el enfriamiento en una cantidad, que se obtuvieron 0,5 U.I. por ml.

La temperatura de ensayo ascendió a 37ºC.

Se observó la cinética de la degradación mediante el registro de los cambios del peso molecular mediante la cromatografía en gel. En las mismas condiciones que en el ejemplo 1, se redujo el peso molecular de la sustancia de partida a la mitad del valor en el plazo de 10 minutos.

En comparación con los glucosacáridos \alpha-1-4/\alpha-1-6 altamente ramificados del ejemplo 1, se degradó por consiguiente el almidón de maíz céreo modificado, relativamente poco ramificado en promedio mediante la \alpha-amilasa tan rápidamente que no podría usarse como extensor del plasma.

Con esto, los dos ejemplos modelo 1 y 2 demuestran que también cuando los pesos moleculares son bajos, una ramificación superior conduce a una ralentización de la degradación por la \alpha-amilasa y que este efecto puede utilizarse para la producción de un extensor de plasma.

Claims (7)

1. Amilopectina hiperramificada, que presenta un grado de ramificación promedio, expresado como % en mol de las anhidroglucosas, que tienen puntos de ramificación, de entre >10 y 25% en mol y un promedio en peso medio del peso molecular Mw en el intervalo de desde 40.000 hasta 800.000 Dalton, y derivados de la misma para su aplicación en procedimientos para el tratamiento quirúrgico o terapéutico del cuerpo de animales o seres humanos o en procedimientos de diagnóstico.

2. Amilopectina hiperramificada según la reivindicación 1, como extensor del volumen de plasma.

3. Amilopectina hiperramificada según la reivindicación 1, para la mejora de la microcirculación.

4. Amilopectina hiperramificada según la reivindicación 1, como agente auxiliar de la sedimentación en la separación celular en el contexto de la leucoforesis.

5. Amilopectina hiperramificada según la reivindicación 1, para la crioconservación de componentes sanguíneos tales como eritrocitos o granulocitos.

6. Amilopectina hiperramificada según una de las reivindicaciones anteriores, siendo el grado de ramificación promedio de entre el 11 y el 16% en mol y el peso molecular Mw de entre 90.000 y 300.000 Dalton.

7. Amilopectina hiperramificada según una de las reivindicaciones anteriores 1 a 5, siendo el grado de ramificación promedio de entre el 13 y el 16% en mol y el peso molecular Mw de entre 120.000 y 250.000 Dalton.