JP5812537B2 - アミノ糖含有グルカン、その製造法および利用 - Google Patents

アミノ糖含有グルカン、その製造法および利用 Download PDF

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Description

本発明は、少なくとも１つの非還元末端にそれぞれ少なくとも１つ（好ましくはそれぞれ２以上）のアミノ単糖残基を有するグルカン、その修飾物及び結合体、ならびにそれらの製造方法および利用に関する。より好ましくは、本発明は、少なくとも１つの非還元末端にそれぞれ少なくとも１つ（好ましくはそれぞれ２以上）のグルコサミン残基を有するグルカン、その修飾物（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔ）及び結合体、ならびにそれらの製造方法および利用に関する。本発明のグルカン、その修飾物および結合体は、核酸に非共有結合的に結合して核酸の見かけの分子量を増大させる機能を有し得る。
医薬品の薬効成分は、化学合成された安定な低分子量化合物から、タンパク質、抗体、核酸などの血中で分解しやすい不安定な物質へと急激に変化している。そのため、これらの不安定な薬効成分を安定化して薬効成分の血中濃度を長時間高く保つ必要が生じている。また薬物の副作用を低下させるために、薬物を効率よくターゲット組織に送達する必要が高まっている。このような背景の下、いわゆるドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）技術が本格的に利用されるようになってきている（非特許文献１〜４）。ＤＤＳ技術とは、薬効成分を「必要な場所」に「必要な量」を「必要な時間」だけ作用させる、即ち薬物の効果を最大限に発揮させるための理想的な体内動態に制御する技術およびシステムのことをいう。
ＤＤＳ技術においては、薬効成分の改質材料が重要である。本明細書中で用語「薬効成分の改質材料」とは、薬効成分と共有結合させることにより、あるいは非共有結合的な相互作用を介して、薬効成分を改質する材料をいう。改質材料を利用することにより、薬効成分の種々の特性（例えば、体内動態（例えば、吸収、分布、代謝および排泄）、薬理効果、安定性など）を改質することが出来る。従来、薬効成分の改質材料として使用されている物質にはさまざまなものがあるが、最も汎用されているのが高分子材料である。たとえば合成高分子であるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびその誘導体は薬効成分の改質材料として広範囲に利用されている。ＰＥＧ鎖の末端に薬効成分結合用官能基を有する薬効成分改質材料が多数開発されており、そのような改質材料は実際に医薬品の製造に利用されている。具体的な応用例としてはＰＥＧ化インターフェロンα（製品名：ペガシス）が挙げられる。インターフェロンαは分子量が小さく、容易に尿に排泄されるため、血中半減期が短いことが問題であった。しかし、インターフェロンαを分子量４万のＰＥＧ鎖に共有結合させて高分子量のインターフェロンα結合体とすることにより、血中半減期を飛躍的に高めることに成功している。このように、高分子材料による、薬効成分又はＤＤＳ用ナノ粒子状キャリアの改質には顕著な効果が認められている。
しかし一方で問題点も指摘されている。例えば、生体内での分解性がなく、かつ腎臓糸球体濾過を受けない高分子量の合成高分子を血中に投与すると、その高分子が特定の臓器へ集積するリスク及びその集積に起因する副作用発生のリスクがある。これは、血中に存在する分子量数万以下の分子は、腎臓の糸球体濾過を受けてすみやかに尿中に排泄されるが、分子量数万以上の分子は、腎臓の糸球体濾過を受けず、尿への排泄が制限されるためである。そのため、安全に利用できる薬効成分用改質材料が期待されている。
また、ＰＥＧをキャリアとして利用する際には、通常ＰＥＧは薬効成分に共有結合を介して結合される。共有結合は安定性に優れているが、薬効成分の構造の一部が変化するため、薬効成分の生理活性が変化するという問題がある。また、薬効成分に複数の官能基が存在する場合、ＰＥＧ鎖の結合位置および結合本数の異なる集団が合成されるという問題がある。このような問題はバイオ医薬品、特にタンパク質性医薬品およびペプチド性医薬品においては致命的な問題となる。同一品質のものを再現性良く生産することが非常に困難であるためである。特定のアミノ酸残基にＰＥＧ分子を共有結合させるためには化学的創意工夫が必要とされ、特定のアミノ酸配列が必要とされたり、薬効成分の種類が制限されたりする場合もあるなど、種々の問題がある。
一方、近年はｓｉＲＮＡ、ＲＮＡアプタマーなどの、核酸医薬品の開発が進行している。核酸医薬品の成分であるＤＮＡおよびＲＮＡはそれぞれ、ＤＮＡ分解酵素およびＲＮＡ分解酵素により容易に分解されてしまうため、適切なキャリアを用いて、分解を防ぐことが必要となっている。また、低分子量の核酸薬効成分を含む核酸医薬品の場合には、高分子量キャリアを結合させて、血中滞留時間を延ばす必要がある。またこれら核酸用高分子キャリアには、必要に応じてターゲティング機能が付与できることが好ましい。このような問題を解決しうる、安全でかつ核酸結合性を有する高分子キャリアが求められていた。
多糖は、古くから食品原料として使用されているが、近年では環境にやさしい高分子材料として、生体適合性を有する安全な素材として、さらには機能性材料として注目を浴びるようになってきている。天然に存在する多糖は、デンプン、セルロース、およびデキストリンに代表される中性多糖；アルギン酸、およびヒアルロン酸に代表される酸性多糖に分類することができる。一方、塩基性の多糖は天然には存在しない。塩基性の多糖を人工的に製造する方法として、Ｎ−アセチルグルコサミンのホモポリマーである天然由来多糖のキチンを化学的に脱アセチル化する方法がある。このような多糖は一般的にキトサンと呼ばれており、産業利用可能な唯一の塩基性多糖である。
キトサンは分子内に多数のアミノ基を有しており、核酸と強く結合して、ポリプレックスと呼ばれる非常に巨大なキトサン：核酸会合体を形成する。このようなポリアニオンとポリカチオンとの結合は非常に強固すぎ、両者の解乖離が困難であるという問題がある。
キトサンは、濃アルカリ溶液中でキチンを煮沸することによりキチン骨格中の２位の炭素上のアセトアミド基を遊離の第一級アミノ基に変換する方法などにより製造される。しかしながらこの方法では、キチン主鎖の切断によりキトサンがより低分子量の分子へと分解され、また完全な脱アセチル化の厳密な制御が困難なため、複数のグルコサミンがＮ-アセチルグルコサミンとランダムに配列した多糖が製造される。この多糖分子中のグルコサミンの数を厳密に制御することは出来ない。またこの方法ではこの多糖の非還元末端のみを選択的に脱アセチル化して、非還元末端のみにグルコサミンが結合した多糖を製造することもできない。つまり、この方法では、キトサンと核酸との結合の強さおよび解離のしやすさを制御することは出来ない。さらにキチンおよびキトサンは体内で迅速に分解することが出来ない。このため、腎の糸球体濾過での分画サイズ以上の分子量を有するキチンおよびキトサンは、体内に蓄積するリスクがある。このように、唯一のカチオン性多糖であるキトサンは、核酸結合性は有しているものの、核酸医薬品のキャリアとしての利用には限界がある。
自然界には非還元末端にのみアミノ糖残基が結合しているアミノ糖含有グルカンは見出されていない。化学的方法を用いても、非還元末端のみにアミノ糖残基が結合しているアミノ糖含有グルカンの合成は可能ではなく、非還元末端のみにアミノ糖残基が結合しているアミノ糖含有グルカンの化学合成は開示されていなかった。また、結合するアミノ糖残基の数を厳密に制御可能な多糖は知られていない。
非特許文献５は、グルコサミン−１−リン酸（ＧｌｃＮ−１−Ｐ）が、２−アジド−２−デオキシ−グルコピラノシル−１−リン酸の化学的還元反応により合成可能であること、およびグルコサミン−１−リン酸とマルトオリゴ糖との混合物に馬鈴薯由来α−グルカンホスホリラーゼを作用させることにより、非還元末端にグルコサミン残基を有するマルトオリゴ糖が生成することを開示している。しかしながら、非特許文献５は、同様の方法を高分子量グルカンおよび分岐グルカンに適用することについて開示も示唆もしていない。グルカン分子中のグルコサミン残基の個数が制御できることを開示していない。さらにはグルカン分子中のグルコサミン残基の個数を制御することが、核酸のような負に荷電した物質との結合の強さおよび形態に重要な影響を与えることを、開示も示唆もしていない。非特許文献５には、非還元末端にグルコサミン残基１個を有するグルカンが核酸のような負に荷電した物質に対する結合性を有すること、およびこのグルカンが核酸などの負に荷電した物質の見かけの分子量を増大させる機能を有することは示唆も開示もされていない。さらに、非特許文献５に記載の方法によってグルコサミン含有グルカンを得ると、反応に使用したグルコサミン−１−リン酸と生成物であるグルコサミン含有グルカンとを分離することができない。医薬用材料は不純物の混入を許容しないため、グルコサミン−１−リン酸が除去されていないグルコサミン含有グルカンは、医薬品として利用することができないという決定的な欠点がある。
岡田弘晃、「機能性ＤＤＳキャリアの製剤設計」第１章 総論：機能性ＤＤＳキャリアを用いた製剤設計による創薬、シーエムシー出版、２００８、１−２３ 横山昌幸、「薬物キャリアに用いられる高分子材料 特集 ＤＤＳに利用される高分子化学」、Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ ２３−６，２００８：６１０−６１７ Ｍａｒｉａ Ｌａｕｒａ Ｉｍｍｏｒｄｉｎｏら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ２００６：１（３）２９７−３１５ Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ ＨａｒｒｉｓおよびＲｏｂｅｒｔ Ｂ．Ｃｈｅｓｓ，ＮＡＴＵＲＥ ＲＥＶＩＥＷＳ，ＤＲＵＧ ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ ＶＯＬＵＭＥ ２，ＭＡＲＣＨ ２００３，２１４−２２１ Ｎａｗａｊｉら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．２００８、３４３、２６９２−２６９６
本発明は、上記問題点の解決を意図するものである。
負に荷電した薬効成分についての安全に利用できる理想的な改質材料は、以下のような特徴を有しているものと考えられる：
（１）生体内で分解され得る高分子材料であること；
（２）医薬品に使用できる程度に安定した品質を備えていること。すなわち、構造が特定でき、毎回同じ品質のものを製造できること；
（３）負に荷電した薬効成分と結合又は相互作用できるアミノ基を分子内の特定の部位に任意の個数備えられる高分子材料であること。
核酸用の改質材料は、以下の特徴を有していることが好ましいと考えられる：
（４）核酸結合性を有し、核酸の見かけの分子量を増大させる機能を有すること。
本発明者らは、薬効成分の改質材料として最も優れている高分子物質はグルカン（本明細書においてグルカンとは、α−１，４−グルカン、及びα−１，６−結合により分岐したα−１，４−グルカンをいう）であると考えた。動物及び植物が貯蔵用多糖として体内に蓄積するグリコーゲン又は澱粉はグルカンの一種であることから、ヒトの体内常在成分であり、生体適合性に優れている。さらに、グルカンは、体内のα−アミラーゼによる加水分解を受けて、体内常在成分であるグルコース又はマルトオリゴ糖になる。そのため、グルカンは、最も安全な高分子材料といえる。
グルカンはその構造の設計が比較的容易であることも有利な点である。グルカンの分子量、分岐の程度、環状化などを制御する方法が公知である。グルコース残基がα−１，４−結合のみで結合している完全直鎖状のグルカン、一部のグルコース残基がα−１，６−結合により結合していることにより高頻度に分岐したグルカンなどが入手できる。分岐グルカンにおいては、α−１，６−結合がひとつ増えるたびに、新たな非還元末端がひとつ生ずることになる。α−１，６−結合の数はグルカン分子の合成の際に所望に応じて適切に調節することが可能である。
一方、グルカンを薬効成分の改質材料として利用する上での最大の課題は、薬効成分と結合又は相互作用できる官能基を備えていない点である。グルカン中に多数存在する水酸基に対して、化学反応によりカチオン性又はアニオン性の官能基を導入することは可能である。しかし、このような手法を用いる場合、グルカンに対する官能基の導入位置はランダムであり、同一品質のものを得ることが困難であり、医薬品への利用には好ましくない。
そのため、薬効成分、特に負に荷電した薬効成分について、医薬品への利用に好適な改質材料を提供することが求められる。
上記課題を解決するために、本発明者らは、アミノ糖（例えば、グルコサミン）を高分子量グルカン鎖の非還元末端に特異的に導入することが、極めて理想的なグルカンの改質方法であると考えた。高分子量グルカンの非還元末端にアミノ糖（例えば、グルコサミン）を選択的に導入できれば、導入位置がランダムではないため、同一品質のものを再現性よく製造可能であり、得られる生成物は医薬品への利用に適している。また、アミノ糖を投与することによる毒性の懸念もない。グルコサミンはアミノ基を有する単糖であり、単一成分として、またはコンドロイチン（コンドロイチン硫酸）との混合物として、サプリメントや健康食品として販売されており、安全性への懸念が低いからである。さらに、アミノ糖（例えば、グルコサミン）のアミノ基は、薬効成分との結合に利用可能である。また、アミノ糖（例えば、グルコサミン）は水溶液中で正の電荷を持つ糖残基となる。そのため、アミノ糖残基をグルカン鎖に導入することによって、負に帯電した分子（例えば、水溶液中で負に帯電する薬効成分）と相互作用する特性をグルカン鎖に付与することが可能となる。負に帯電した分子の例としては、核酸が挙げられる。水溶液中で負に帯電する分子に結合し、かつ、体内残留の懸念が無い生分解性キャリアは今まで公知でなかった。そのため、本発明のグルカンは、近年注目されている核酸を用いたバイオＤＤＳ技術においては有用なキャリアといえる。
本発明者らは、α−グルカンホスホリラーゼが、本来の基質ではない、アミノ糖−１−リン酸（例えば、グルコサミン−１−リン酸）を基質として利用可能であり、アミノ糖残基をグルカン受容体の非還元末端に転移し得ること、そしてそれにもかかわらず本酵素がその逆反応をほとんど触媒できないことを見出し、これに基づいて本発明を完成させた。α−グルカンホスホリラーゼは、本来の基質であるグルコース−１−リン酸に作用した場合、グルコース残基をグルカン受容体に転移する反応（グルカン合成反応）と、グルカンの非還元末端グルコースを加リン酸分解しグルコース−１−リン酸を生成する反応（グルカン分解反応）の両方を触媒する酵素である。しかしながら、驚くべきことに、アミノ糖−１−リン酸（例えば、グルコサミン−１−リン酸）を基質とする場合、本酵素はアミノ糖残基をグルカン受容体に転移する反応（グルカン合成反応）を触媒するが、グルカンの非還元末端アミノ糖残基を加リン酸分解してアミノ糖−１−リン酸を生成する反応（グルカン分解反応）をほとんど触媒しない。グルカン分解反応は、結合させたアミノ糖残基を再度遊離させてしまうが、本発明の方法においてα−グルカンホスホリラーゼはグルカン分解反応をほとんど触媒しないことを本発明者らは発見した。すなわち、合成反応の触媒活性が、分解反応の触媒活性に比べて非常に高い。この特徴のため、グルカンに複数の非還元末端がある場合、α−グルカンホスホリラーゼは、グルカンの複数の非還元末端にアミノ糖残基（例えば、グルコサミン残基）を次々と結合させていくことができる。この酵素のこの特徴を利用することにより、本発明のアミノ糖含有グルカンは初めて製造可能となった。特に、多数（例えば、５以上）の非還元末端を有するグルカンを原料として、高頻度（例えば、５０％以上）の非還元末端へのアミノ糖残基（例えば、グルコサミン残基）の結合率を有する非還元末端修飾グルカンは、この酵素のこの特徴を利用して初めて得ることができた。
本明細書中においてアミノ糖とは、アミノ基を有する糖であることを意味する。アミノ糖の骨格単糖を構成する糖は単糖（例えば、グルコース）であってもよく、オリゴ糖であってもよい。本明細書中においてオリゴ糖とは２以上１０以下の単糖が結合した化合物を意味する。本発明のアミノ糖含有グルカンにおいて１つの非還元末端に結合するアミノオリゴ糖の重合度は例えば約２以上、約３以上、約４以上、約５以上などであり得、例えば、約１０以下、約９以下、約８以下、約７以下、約６以下、約５以下、約４以下、約３以下、約２以下などであり得る。１つの実施形態では、本発明のアミノ糖含有グルカンにおいて１つの非還元末端に結合するアミノオリゴ糖は、２個の糖（すなわち、二量体）である。本明細書中でアミノ単糖とはアミノ糖の糖骨格が単糖であるものをいう。本明細書中でアミノオリゴ糖とはアミノ基の糖骨格がオリゴ糖であるものをいう。
また、静電的相互作用による結合は直接的に分子同士を結合しないため、この結合体からグルカンが分解されて薬効成分が分離されれば、薬効成分は元の立体構造を再び保持すると考えられる。そのため、静電的相互作用による結合は、薬効成分とキャリアとの理想的な結合様式と考えられる。しかし、静電的相互作用による結合は、塩濃度の影響を受けやすく、生体内では不安定であると予想される。そこで、グルカン分子に結合するアミノ糖（例えば、グルコサミン）残基の位置および数を厳密に制御することによって、核酸との結合の強さおよび会合体の形態を制御することが望ましい。
さらに、本発明者らは、グルカンの１以上の（好ましくは２以上の）非還元末端のそれぞれに少なくとも１つのグルコサミン残基が結合したグルコサミン含有グルカンが、核酸に非共有結合的に結合し、核酸の見かけの分子量を増大させる機能を有することを見出した。
また、本発明者らは、グルカン分子に結合するグルコサミン残基などのアミノ単糖残基の数をコントロールすることにより、核酸との結合の強さおよび会合体の形態を制御できることを見出した。
本発明者らは、新規なアミノ糖含有グルカンの開発によって、適度な自由度をもつ複数のグルカン鎖の末端のみにアミノ糖残基が結合したグルカンを作出できること、および安定的な静電的相互作用によって薬効成分とキャリアとを結合できることを見出した。
本発明のアミノ糖含有グルカン、その修飾物およびそれらの結合体においては、グルカンの非還元末端のみにアミノ糖残基が結合している。本発明の好ましい実施形態では、アミノ糖残基はグルコサミン残基、ガラクトサミン残基またはマンノサミン残基あるいはそれらの単独または組み合わせのオリゴマー（例えば、二量体）残基であり、最も好ましくはグルコサミン残基である。本発明のグルコサミン含有グルカン、その修飾物およびそれらの結合体においては、グルカンの非還元末端のみにグルコサミン残基が結合している。本発明においては、α−グルカンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．１．１）を用いてアミノ糖（例えば、グルコサミン）残基の転移を行っているため、グルカンへのアミノ糖（例えば、グルコサミン）残基の結合はα−１，４結合である。すなわち、グルカンの末端のグルコシル残基の４位の炭素原子と、アミノ糖（例えば、グルコサミン）残基の１位の炭素原子とが酸素原子を介してα結合している。グルカンへアミノ糖（例えば、グルコサミン）を高収率で直接転移可能な酵素は、本酵素以外には見つかっていない。本発明のアミノ糖含有グルカン、その修飾物およびそれらの結合体はアミノ糖を末端に有するため、水溶液中でグルカン末端が正電荷を帯び、グルカンの物理化学的性質が変化する。本アミノ糖含有グルカン、その修飾物およびそれらの結合体は食品、化粧品、医薬品などに幅広く利用が期待される。
グルカンへのアミノ糖（例えば、グルコサミン）残基の導入量は、使用するグルカンの分岐頻度と非還元末端へのアミノ糖（例えば、グルコサミン）残基の導入頻度によりコントロールできる。グルカンへのアミノ糖（例えば、グルコサミン）残基の導入量を多くしたい場合は、分岐頻度の高いグルカンを使用し、かつ非還元末端ヘのアミノ糖（例えば、グルコサミン）の導入頻度を上げることにより、導入量を増加させることができる。グルカンへのアミノ糖（例えば、グルコサミン）残基の導入量を少なくしたい場合は、分岐頻度の低いグルカンを使用したり、非還元末端ヘのアミノ糖（例えば、グルコサミン）の導入頻度を下げたりすることにより、導入量を減少させることができる。グルカンへのアミノ糖（例えば、グルコサミン）残基の導入量の下限は、グルカン１分子あたり１個のアミノ糖（例えば、グルコサミン）残基が導入された状態であるが、これは分岐をもたないグルカンの非還元末端に、アミノ糖（例えば、グルコサミン）残基を導入することにより達成できる。さらに、導入位置が末端であるため、グルカンのα−アミラーゼによる分解性にも影響は無いと考えられる。高度に分岐したグルカンの場合、非還元末端はグルカン分子の最外層に分布しているので、導入されたアミノ糖（例えば、グルコサミン）残基は、アミノ糖（例えば、グルコサミン）残基導入後のグルカン分子の最外層に分布し、薬効成分との相互作用および結合に理想的となる。このように、非還元末端に選択的にアミノ糖（例えば、グルコサミン）残基が結合したグルカンは、薬効成分の優れた改質材料になりうる。
本発明により、例えば以下が提供される：
（項目１）
グルカンの少なくとも１つの非還元末端のそれぞれに少なくとも１つのアミノ単糖残基がα−１，４結合しているが、該グルカンの非還元末端以外の位置にはアミノ糖残基が存在しないアミノ糖含有グルカンであって、該グルカンが分岐状α−１，４グルカンまたは直鎖状α−１，４グルカンであり、該グルカンの重合度が約１０以上約１×１０５以下、好ましくは約１５以上約４×１０５以下である、アミノ糖含有グルカン。
（項目２）
前記グルカンが分岐状α−１，４グルカンであり、該分岐状α−１，４グルカンの複数の非還元末端のうちの少なくとも１つ（好ましくは２以上）の非還元末端のそれぞれに少なくとも１つのアミノ単糖残基がα-１，４結合している項目１に記載のアミノ糖含有グルカン。すなわち、このアミノ糖含有グルカンは、分岐状α−１，４グルカンの複数の非還元末端のうちの少なくとも１つ（好ましくは２以上）の非還元末端のそれぞれに少なくとも１つのアミノ単糖残基がα−１，４結合しているが、該分岐状α−１，４グルカンの非還元末端以外の位置にはアミノ糖残基が存在しないアミノ糖含有分岐グルカンであって、該分岐状α−１，４グルカンの重合度が約１０以上約１×１０５以下、約１５以上約４×１０５以下である、アミノ糖含有分岐グルカンである。
（項目３）
前記分岐状α−１，４グルカンが分岐マルトオリゴ糖、デンプン、アミロペクチン、グリコーゲン、デキストリン、酵素合成分岐グルカン及び高度分岐環状グルカンからなる群より選択される項目２に記載のアミノ糖含有グルカン。
（項目４）
項目１〜３のいずれか１項に記載のアミノ糖含有グルカンの水酸基修飾物であって、該水酸基への修飾が、前記グルカンのアルコール性水酸基の一部又は全てへの修飾であり、該水酸基への修飾が、ヒドロキシアルキル化、アルキル化、アセチル化、カルボキシメチル化、硫酸化及びリン酸化からなる群より独立して選択される、水酸基修飾物。
（項目５）
項目１〜３のいずれか１項に記載のアミノ糖含有グルカン又はその水酸基修飾物の還元末端修飾物。
（項目６）
項目１〜３のいずれか１項に記載のアミノ糖含有グルカン、その水酸基修飾物又はそれらの還元末端修飾物のアミノ基修飾物であって、該アミノ基への修飾が、前記アミノ単糖残基のアミノ基の一部又は全てへの修飾であり、該アミノ基への修飾が該アミノ基とアミノ基修飾試薬との反応により得られたものであり、該アミノ基修飾試薬は、少なくとも１つのカルボキシル基および少なくとも１つの別の官能基を有する、アミノ基修飾物。
（項目７）
項目１〜３のいずれか１項に記載のアミノ糖含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物又はそれらのアミノ基修飾物の非還元末端修飾物であって、前記グルカンのグルコサミン残基が結合していない非還元末端のうちの少なくとも１つまたは前記グルコサミン残基の４位において標的性分子が結合しており、該標的性分子は、マンノース、ガラクトース、グルクロン酸、Ｎ−アセチルグルコサミン、キシロース、フコース、ガラクトサミン、抗体、抗体フラグメント、受容体、受容体フラグメント及び受容体リガンドからなる群より選択される、非還元末端修飾物。
（項目８）
グルカンとアミノ糖−１−リン酸を含む水溶液にα−グルカンホスホリラーゼを作用させることを特徴とするアミノ糖含有グルカンの製造方法であって、該グルカンが分岐状α−１，４グルカンまたは直鎖状α−１，４グルカンであり、該グルカンの重合度が約１０以上約１×１０５以下、好ましくは約１５以上約４×１０５以下である製造方法。
（項目９）
α−グルカンホスホリラーゼが、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列に対して９５％以上の配列同一性を有しかつアミノ糖を分岐グルカンの非還元末端にα−１，４結合で転移する活性を有する、項目８に記載の方法。
（項目１０）
項目１〜３のいずれか１項に記載のアミノ糖含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、それらのアミノ基修飾物又はそれらの非還元末端修飾物と、薬効成分とを含む、医薬品。
（項目１１）
前記薬効成分が、低分子量有機化合物、タンパク質、ペプチド、抗体、抗体フラグメント、受容体、受容体フラグメント、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびＲＮＡアプタマーからなる群より選択される、項目１０に記載の医薬品。
（項目１２）
項目１〜３のいずれか１項に記載のアミノ糖含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、それらのアミノ基修飾物又はそれらの非還元末端修飾物を含む、臨床診断用組成物。
（項目１３）
項目１〜３のいずれか１項に記載のアミノ糖含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、それらのアミノ基修飾物又はそれらの非還元末端修飾物を含む、ＤＤＳ用ナノ粒子状キャリア。
（項目１４）
前記ＤＤＳ用ナノ粒子状キャリアが、リポソーム、ウイルス粒子、高分子ミセルおよび疎水化高分子ナノゲルからなる群より選択される、項目１３に記載のキャリア。
（項目１５）
細胞内で発現可能な遺伝子を含む核酸分子と、項目１に記載のアミノ糖含有分岐グルカンとから形成された複合体。
（項目１６）
前記核酸分子が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびＲＮＡアプタマーからなる群より選択される、項目１５に記載の複合体。
（項目１７）
項目１５または１６に記載の複合体キャリアと、カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質とから形成された複合体。
（項目１８）
前記カチオン性ポリマーが、ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリアミノスチレン、キトサン、カチオン性グルカンおよびＤＥＡＥ−デキストランからなる群より選択される少なくとも１種類のカチオン性ポリマーを含む、項目１７に記載の複合体。
（項目１９）
項目１５〜１８のいずれか１項に記載の複合体を単離された細胞に接触させることを包含する、該細胞内への核酸分子送達方法。
１つの実施形態では、前記アミノ糖はグルコサミンであり、その場合、本発明は以下の通りである：
（項目１Ａ）
グルカンの少なくとも１つの非還元末端にそれぞれ少なくとも１つのグルコサミン残基がα−１，４結合しているが、該グルカンの非還元末端以外の位置にはグルコサミン残基が存在しないグルコサミン含有グルカンであって、該グルカンが分岐状α−１，４グルカンまたは直鎖状α−１，４グルカンであり、該グルカンの重合度が約１０以上約１×１０５以下、好ましくは約１５以上約４×１０５以下である、グルコサミン含有グルカン。すなわち、このグルコサミン含有グルカンは、分岐状α−１，４グルカンの複数の非還元末端のうちの少なくとも１つ（好ましくは２以上）の非還元末端にそれぞれ少なくとも１つのグルコサミン残基がα−１，４結合しているが、該グルカンの非還元末端以外の位置にはグルコサミン残基が存在しないグルコサミン含有分岐グルカンであって、該分岐状α−１，４グルカンの重合度が約１０以上約１×１０５以下、好ましくは約１５以上約４×１０５以下である、グルコサミン含有分岐グルカンである。
（項目２Ａ）
前記グルカンが分岐状α−１，４グルカンであり、該分岐状α−１，４グルカンの複数の非還元末端のうちの少なくとも１つの非還元末端にそれぞれ少なくとも１つのグルコサミン酸残基が結合している項目１Ａに記載のグルコサミン含有グルカン。
（項目３Ａ）
前記分岐状α−１，４グルカンが分岐マルトオリゴ糖、デンプン、アミロペクチン、グリコーゲン、デキストリン、酵素合成分岐グルカン及び高度分岐環状グルカンからなる群より選択される項目２Ａに記載のグルコサミン含有グルカン。
（項目４Ａ）
項目１Ａ〜３Ａのいずれか１項に記載のグルコサミン含有グルカンの水酸基修飾物であって、該水酸基への修飾が、前記グルカンのアルコール性水酸基の一部又は全てへの修飾であり、該水酸基への修飾が、ヒドロキシアルキル化、アルキル化、アセチル化、カルボキシメチル化、硫酸化及びリン酸化からなる群より独立して選択される、水酸基修飾物。
（項目５Ａ）
項目１Ａ〜３Ａのいずれか１項に記載のグルコサミン含有グルカン又はその水酸基修飾物の還元末端修飾物。
（項目６Ａ）
項目１Ａ〜３Ａのいずれか１項に記載のグルコサミン含有グルカン、その水酸基修飾物又はそれらの還元末端修飾物のアミノ基修飾物であって、該アミノ基への修飾が、前記グルコサミン残基のアミノ基の一部又は全てへの修飾であり、該アミノ基への修飾が該アミノ基とアミノ基修飾試薬との反応により得られたものであり、該アミノ基修飾試薬は、少なくとも１つのカルボキシル基および少なくとも１つの別の官能基を有する、アミノ基修飾物。
（項目７Ａ）
項目１Ａ〜３Ａのいずれか１項に記載のグルコサミン含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物又はそれらのアミノ基修飾物の非還元末端修飾物であって、前記グルカンのグルコサミン残基が結合していない非還元末端のうちの少なくとも１つにおいて標的性分子が結合しており、該標的性分子は、マンノース、ガラクトース、グルクロン酸、Ｎ−アセチルグルコサミン、キシロース、フコース、ガラクトサミン、抗体、抗体フラグメント、受容体、受容体フラグメント及び受容体リガンドからなる群より選択される、非還元末端修飾物。
（項目８Ａ）
グルカンとグルコサミン−１−リン酸を含む水溶液にα−グルカンホスホリラーゼを作用させることを特徴とするグルコサミン含有グルカンの製造方法であって、該グルカンが分岐状α−１，４グルカンまたは直鎖状α−１，４グルカンであり、該グルカンの重合度が約１０以上約１×１０５以下、好ましくは約１５以上約４×１０５以下である製造方法。
（項目９Ａ）
α−グルカンホスホリラーゼが、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列に対して９５％以上の配列同一性を有しかつグルコサミンを分岐グルカンの非還元末端にα−１，４結合で転移する活性を有する、項目８Ａに記載の方法。
（項目１０Ａ）
項目１Ａ〜３Ａのいずれか１項に記載のグルコサミン含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、又はそれらのアミノ基修飾物と、薬効成分とを含む、医薬品。
（項目１１Ａ）
前記薬効成分が、低分子量有機化合物、タンパク質、ペプチド、抗体、抗体フラグメント、受容体、受容体フラグメント、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびＲＮＡアプタマーからなる群より選択される、項目１０Ａに記載の医薬品。
（項目１２Ａ）
項目１Ａ〜３Ａのいずれか１項に記載のグルコサミン含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、又はそれらのアミノ基修飾物を含む、臨床診断用組成物。
（項目１３Ａ）
項目１Ａ〜３Ａのいずれか１項に記載のグルコサミン含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、又はそれらのアミノ基修飾物を含む、ＤＤＳ用ナノ粒子状キャリア。
（項目１４Ａ）
前記ＤＤＳ用ナノ粒子状キャリアが、リポソーム、ウイルス粒子、高分子ミセルおよび疎水化高分子ナノゲルからなる群より選択される、項目１３Ａに記載のキャリア。
（項目１５Ａ）
細胞内で発現可能な遺伝子を含む核酸分子と、項目１Ａ〜３Ａのいずれか１項に記載のグルコサミン含有分岐グルカンとから形成された複合体。
（項目１６Ａ）
前記核酸分子が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびＲＮＡアプタマーからなる群より選択される、項目１５Ａに記載の複合体。
（項目１７Ａ）
項目１５Ａまたは１６Ａに記載の複合体キャリアと、カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質とから形成された複合体。
（項目１８Ａ）
前記カチオン性ポリマーが、ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリアミノスチレン、キトサン、カチオン性グルカンおよびＤＥＡＥ−デキストランからなる群より選択される少なくとも１種類のカチオン性ポリマーを含む、項目１７Ａに記載の複合体。
（項目１９Ａ）
項目１５Ａ〜１８Ａのいずれか１項に記載の複合体を細胞に接触させることを包含する、該細胞内への核酸分子送達方法。
本発明のアミノ糖含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、それらのアミノ基修飾物およびそれらの結合体は、グルカンの非還元末端のみにアミノ糖残基が結合している。本アミノ糖含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、それらのアミノ基修飾物およびそれらの結合体はアミノ糖を末端に有するため、グルカン末端が水溶液中で正電荷を帯び、グルカンの物理化学的性質が変化する。本アミノ糖含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、それらのアミノ基修飾物およびそれらの結合体は食品、化粧品、医薬品などに幅広く利用が期待される。薬効成分のキャリアとして用いる場合、静電的相互作用による結合のため薬効成分の化学的構造を大きく変質させることが無く、キャリア１分子に対して複数のアミノ糖を非還元末端に結合することができるため薬効成分を安定的に保持することができる特徴がある。
本発明のアミノ糖含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、それらのアミノ基修飾物は、血中半減期を非修飾グルカンより高めることが可能であり、なおかつ、最終的には生体内で完全に分解され腎臓より排出されるため、安全性が極めて高い。そのため、薬効成分、臨床診断剤、造影剤およびＤＤＳ用ナノ粒子状キャリアの改質材料として有用である。本発明のアミノ糖含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、それらのアミノ基修飾物は、酵素反応により構造を制御し得ることから、品質安定性にも優れている。
本発明のアミノ糖含有グルカンおよびその修飾物は、グルカンの非還元末端のみにアミノ糖残基が結合しているため、他の分子と相互作用する部位と分解を抑制する部位とを構造的に分離することができる。さらに、本発明のアミノ糖含有グルカンおよびその修飾物は、天然のグルカンと比較して適度に分解が抑制されており、他の分子との相互作用が強すぎず、グルカン部分の分解に伴って他の分子を適度に遊離させることができることから、他の分子と会合することにより、他の分子に対して適度な分解性を付与することができる。また、本発明のアミノ糖含有グルカンおよびその修飾物およびそれらの結合体は、体内の酵素によって分解されるため、体内に過度に長期間留まって残留性の問題を引き起こすことがない。
本発明のアミノ糖含有グルカンおよびその修飾物を、核酸分子のような負に荷電した物質と会合させた場合、その会合物の分子量を制御することが可能である。ＤＤＳにおいて投与物の分子量を調節できることは、安全性、結果の安定性、および、再現性の点から好ましいため、本発明のアミノ糖含有グルカンおよびその修飾物は、優れたＤＤＳ用キャリアとして有効に利用できる。
図１は、グルコサミン残基を分岐グルカンの非還元末端に転移する反応の模式図である。星印で示した部分の構造を四角の枠内に示した。 図２は、製造例２で得られた分岐グルカンの酵素処理物、および製造例１のＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼをグルコサミン−１−リン酸と製造例２の分岐グルカンに作用させることによって得られた産物（実施例１で得られた産物）の酵素処理物をＤＩＯＮＥＸ社製ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ装置で分析した結果である。横軸は溶出時間（分）を示す。Ａは、全ての分岐を切断するに十分な量（すなわち、過剰量）のイソアミラーゼで分岐グルカンの分岐部分を分解した後に分解産物を分析することによって得られた結果を示す。図２Ａ中のピーク上の数字は、６はマルトヘキサオース、７はマルトヘプタオースを示す。ピーク上に黒丸で示したピークは、左から右に向かってそれぞれグルコース重合度８から１４までのマルトオリゴ糖である。図２Ｂは分岐グルカンを過剰量のイソアミラーゼで分解した後、過剰量の微生物由来α−グルコシダーゼでさらに分解し、その後、得られた分解産物を分析することによって得られた結果を示す。α−グルコシダーゼはグルカンを非還元末端からグルコース単位で分解する酵素であるため、分岐グルカンは完全に分解されグルコースのピーク（図２Ｂ中Ｇｌｕｃｏｓｅで示す）が検出された。図２Ｃは本実施例１で得られたグルコサミン含有分岐グルカンを過剰量のイソアミラーゼで分解した後に得られた分解産物を分析することによって得られた結果を示す。図２Ｃ中の黒丸で示したピークは図２Ａ中の対応する位置の黒丸で示したピークと同一の溶出時間に検出されたピークであるが、それらとは間隔の異なる×で示したピークが検出された。図２Ｄは本実施例１で得られたグルコサミン含有分岐グルカンをイソアミラーゼで分解し、過剰量の微生物由来α−グルコシダーゼでさらに分解した後に、得られた分解産物を分析することによって得られた結果を示す。黒丸で示されたピーク群は分解されて消失し、その結果、グルコースのピーク（図２Ｄ中Ｇｌｕｃｏｓｅで示す）が出現したが、×で示したピークは消失しなかった。すなわち、×で示したピークに示される部分分解物は、α−グルコシダーゼに対し分解抵抗性を示した。図２Ｅは本実施例１で得られたグルコサミン含有分岐グルカンを過剰量のイソアミラーゼで分解し、さらに過剰量の微生物由来α−グルコシダーゼと過剰量のα−アミラーゼで同時に分解した後に得られた分解産物を分析することによって得られた結果を示す。その結果、グルコースのピーク以外に星印のピークが検出された。星印のピークは、α−アミラーゼおよびα−グルコシダーゼで分解できない最小単位であるグルコサミン含有オリゴ糖（３糖）であることを示しており、従って、非還元末端にグルコサミン残基が結合したグルカンが得られたことが分かる。 図３は実施例１のグルコサミン含有グルカンとＤＮＡとの複合体形成を示した図である。ラムダＤＮＡ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片０．５μｇに対し、サンプル１はイオン交換水、サンプル２は分岐グルカン０．１ｍｇ、サンプル３は分岐グルカン０．５ｍｇ、サンプル４はグルコサミン含有分岐グルカン０．１ｍｇ、サンプル５はグルコサミン含有分岐グルカン０．５ｍｇ、サンプル６はサンプル４に含まれるグルコサミンユニットと同モル濃度のグルコサミン、サンプル７はサンプル５に含まれるグルコサミンユニットと同モル濃度のグルコサミンをそれぞれ加えて１０μｌ中で５分間室温静置した後、１％アガロースゲル電気泳動を行った。サンプル１から３はバンド（ａ）が検出されたが、グルコサミン含有分岐グルカンを添加した場合はＤＮＡがアガロースゲル中を移動しなかった（ｂ）。したがって、カチオン化グルコサミン含有分岐グルカンはＤＮＡとの複合体を形成できることがわかった。さらに、グルコサミンを添加したサンプル６と７は添加しなかった場合と移動度は変わらず、グルコサミンはＤＮＡには分子量増大効果がないことが分かった。 図４は実施例３のグルコサミン含有分岐グルカン（ＢＮ５およびＢＮ６）および実施例４のグルコサミン含有分岐グルカン（ＰＮ６）とオリゴｄＴセルロースとの結合力を示す図である。オリゴｄＴセルロースを各濃度のＮａＣｌ溶液（０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．５Ｍ、１Ｍ、または２Ｍ）に懸濁し、実施例３または実施例４で得られたグルコサミン含有分岐グルカンを添加して３０分間室温で静置した後、遠心分離した上清画分に含まれる、オリゴｄＴセルロースと結合しなかったグルコサミン含有分岐グルカン量を測定し、添加したグルコサミン含有グルカン量（全糖量）に対する結合したカチオン化グルカン量（全糖量）の割合（％）を算出した。得られた結果をグラフに示している。ＰＮ６は１Ｍ以上のＮａＣｌで核酸と分離することが分かる。ＢＮ６は０．５Ｍ以上のＮａＣｌで核酸と分離することが分かる。ＢＮ５は０．２以上で核酸と分離することが分かる。１分子のグルコサミン含有分岐グルカン中に含まれるグルコサミン残基数が多い程、分離するＮａＣｌ濃度が高い傾向があった。よって、分岐グルカンにグルコサミンを結合する頻度を調節することによって、核酸との結合力を制御することができた。ポリリジンを用いた場合、ポリリジンは核酸と強固に結合し、２Ｍ ＮａＣｌ中でも核酸と分離しなかった。 図５は実施例４のグルコサミン含有分岐グルカン（ＰＮ６）を用いた場合のマクロファージ細胞株のトランスフェクション効率を示す図である。ホタル由来ルシフェラーゼをコードするＬＵＣ遺伝子を含むプラスミドと供に２４時間インキュベートした後、ルシフェラーゼ活性を測定した。図５に示すとおり、ＰＮ６はトランスフェクション機能を示すことが分かり、特に、Ｎ／Ｐ比が２００の時に最も高いトランスフェクション効率を示した。ポリエチレンイミンはＮ／Ｐ比１０および５０で高いトランスフェクション効率を示したが、Ｎ／Ｐ比２００では効率が顕著に低下した。ポリリジンはＮ／Ｐ比が２の時に最も高いトランスフェクション効率を示し、Ｎ／Ｐ比１０より高い場合は効率が顕著に低下した。 図６は実施例４のグルコサミン含有分岐グルカン（ＰＮ６）を用いた場合のマクロファージ細胞株のトランスフェクションにおける細胞毒性を評価した図である。実施例１１で得られた細胞溶解上清中のタンパク質濃度を測定し、毒性の目安とした。図６に示すとおり、ＰＮ６は細胞に対する毒性が低いことを示している。ポリエチレンイミンおよびポリリジンを用いた場合には、Ｎ／Ｐ比５０および２００で顕著な毒性が見られた。
以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ： Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ ａｎｎｕａｌ ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ： Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
本明細書において遺伝子について言及する場合、「ベクター」または「組み換えベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。そのようなベクターとしては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体および植物個体などの宿主細胞において自律複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。ベクターのうち、クローニングに適したベクターを「クローニングベクター」という。そのようなクローニングベクターは通常、制限酵素部位を複数含むマルチプルクローニング部位を含む。そのような制限酵素部位およびマルチプルクローニング部位は、当該分野において周知であり、当業者は、目的に合わせて適宜選択して使用することができる。そのような技術は、本明細書に記載される文献（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）に記載されている。好ましいベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、エピソーム、ウイルス粒子またはウイルスおよび組み込み可能なＤＮＡフラグメント（すなわち、相同組換えによって宿主ゲノム中に組み込み可能なフラグメント）が挙げられるが、これらに限定されない。
ベクターの１つの型は、「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントが連結され得る環状二重鎖ＤＮＡループをいう。別の型のベクターは、ウイルスベクターであり、ここで、さらなるＤＮＡセグメントは、ウイルスゲノム中に連結され得る。特定のベクター（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）は、これらが導入される宿主細胞中で自律的に複製し得る。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中への導入の際に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、これらが作動可能に連結される遺伝子の発現を導き得る。このようなベクターは、本明細書中で、「発現ベクター」といわれる。
従って、本明細書において「発現ベクター」または「発現プラスミド」とは、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。発現ベクターは、好ましくは、目的の構造遺伝子が転写および翻訳されるように目的の構造遺伝子に作動可能に連結されており、さらに必要に応じて宿主細胞内での複製および組換え体の選択に必要な因子を備えた媒体である。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子のような選択マーカーおよび、エンハンサーを含み得る。生物（例えば、哺乳動物）の発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。発現産物（α−グルカンホスホリラーゼまたは薬効成分）の分泌生産が意図される場合は、分泌シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチドが、目的のタンパク質をコードするＤＮＡの上流に正しいリーディングフレームで結合される。
好ましい発現ベクターとしては、大腸菌中でも発現可能なｐＴＲＣ９９Ａ（ファルマシア製）などが挙げられる。上記発現ベクター内の転写および翻訳に必要な因子に作動可能に連結するために、目的のα−グルカンホスホリラーゼ遺伝子を加工しなければならない場合がある。これらは例えばプロモーターとコード領域との間が長すぎて転写効率の低下が予想される場合、またはリボゾーム結合部位と翻訳開始コドンとの間隔が適切でない場合などである。加工の手段としては、制限酵素による消化、Ｂａｌ３１、ＥｘｏＩＩＩなどのエキソヌクレアーゼによる消化、あるいはＭ１３などの一本鎖ＤＮＡまたはＰＣＲを使用した部位特異的変異の導入が挙げられる。
本発明において用いられ得る原核生物細胞に対する「組み換えベクター」としては、ｐｃＤＮＡ３（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫ（＋／−）、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＥＦ−ＢＯＳ、ｐＥＧＦＰ、ｐＨＡＴ、ｐＵＣ１８、ｐＦＴ−ＤＥＳＴＴＭ４２ＧＡＴＥＷＡＹ、ｐＥＮＴＲＴＭ／Ｄ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などが例示される。原核生物細胞は、遺伝子の増幅、改変などに用いることができる。
本明細書において用いられ得る真核生物細胞に対する「組み換えベクター」としては、ｐＥＣＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＡｃＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ），ｐＥＹＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ），ｐＤｓＲＥＤ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ），ｐＴＲＥ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ），ｐＣＭＶ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ），ｐｃＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＴａｒｇｅｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）などを挙げることができるがそれらに限定されない。
本明細書において「哺乳動物発現ベクター」は、本発明の遺伝子の発現を調節するプロモーターなどの種々の調節エレメントが宿主細胞中で作動可能に連結されている核酸配列をいう。本願明細書で用いる用語「制御配列」は、機能的プロモーターおよび、任意の関連する転写要素（例えば、エンハンサー、ＣＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス、ＳＰＩ部位など）を有するＤＮＡ配列をいう。本願明細書で用いる用語「作動可能に連結」は、遺伝子が発現し得るように、それに関するポリヌクレオチドと、その発現を調節するプロモーター、エンハンサー等の種々の調節エレメントとが宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。哺乳動物発現ベクターは、好適には、哺乳動物遺伝子、プロモーター、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子およびエンハンサーを含み得る。発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
上記のような哺乳動物発現ベクターは、当業者に周知の遺伝子組換え技術を用いて作製され得る。哺乳動物発現ベクターの構築には、例えば、ｐＥＣＦＰ系のベクター、ｐｃＤＮＡ系のベクターなどが好適に用いられるが、これらに限定されない。
本明細書において「ターミネーター」は、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写される際の転写の終結、およびポリＡ配列の付加に関与する配列である。ターミネーターは、ｍＲＮＡの安定性に寄与し、そして遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知られている。
本明細書において「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。
プロモーターは、誘導性であっても、構成的であっても、部位特異的であっても、時期特異的であってもよいが、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターが好ましい。プロモーターとしては、例えば、哺乳動物細胞、大腸菌、酵母などの宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。
本明細書において、プロモーターの発現が「構成的」であるとは、生物のすべての組織において、その生物の成長／増殖のいずれにあってもほぼ一定の量で発現される性質をいう。具体的には、ノーザンブロット分析したとき、例えば、任意の時点で（例えば、２点以上（例えば、５日目および１５日目））の同一または対応する部位のいずれにおいても、ほぼ同程度の発現量がみられるとき、本発明の定義上、発現が構成的であるという。構成的プロモーターは、通常の生育環境にある生物の恒常性維持に役割を果たしていると考えられる。本発明のプロモーターの発現が「応答性」であるとは、少なくとも１つの因子が生物体に与えられたとき、その発現量が変化する性質をいう。特に、発現量が増加する性質を因子に対して「誘導性」といい、発現量が減少する性質を因子に対して「減少性」という。「減少性」の発現は、正常時において、発現が見られることを前提としているので、「構成的」な発現と重複する概念である。これらの性質は、生物の任意の部分からＲＮＡを抽出してノーザンブロット分析で発現量を分析することまたは発現されたタンパク質をウェスタンブロットにより定量することにより決定することができる。因子に対して誘導性のプロモーターを本発明の部位特異的組換え誘導因子をコードする核酸とともに組み込んだベクターで形質転換された哺乳動物細胞または哺乳動物（特定の組織などを含む）は、そのプロモーターの誘導活性をもつ刺激因子を用いることにより、ある条件下での部位特異的組換え配列の部位特異的組換えを行うことができる。
本発明のポリヌクレオチドは、そのままでまたは改変されて、当業者に周知の方法を用いて、適切な発現ベクターに連結され、公知の遺伝子組換え技術により、宿主細胞に導入され得る。導入された遺伝子は、宿主細胞中のＤＮＡに組み込まれて存在する。なお、宿主細胞中のＤＮＡとは、染色体のみならず、宿主細胞中に含まれる各種オルガネラ（例えば、ミトコンドリアなど）に含まれるＤＮＡを含む。
大腸菌を宿主細胞として使用する場合、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、大腸菌およびファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等を挙げることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター（Ｐｔｒｐ ｘ２）、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔ Ｉプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
本明細書において「複製起点」とは、ＤＮＡ複製が開始する染色体上の特定領域をいう。複製起点は、内因性起点を含むようにそのベクターを構築することによって提供され得るか、または宿主細胞の染色体複製機構により提供され得るかのいずれかであり得る。そのベクターが、宿主細胞染色体中に組み込まれる場合、後者が十分であり得る。あるいは、ウイルス複製起点を含むベクターを使用するよりも、当業者は、選択マーカーと本発明のＤＮＡとを同時形質転換する方法によって、哺乳動物細胞を形質転換し得る。適切な選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）またはチミジンキナーゼである（米国特許第４，３９９，２１６号を参照）。
本明細書において「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現（作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。
本明細書において、核酸分子を細胞に導入する技術は、どのような技術でもよく、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクションなどが挙げられる。そのような核酸分子の導入技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．およびその第三版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。遺伝子の導入は、ノーザンブロット、ウェスタンブロット分析のような本明細書に記載される方法または他の周知慣用技術を用いて確認することができる。
また、ベクターの導入方法としては、細胞にＤＮＡを導入する上述のような方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフェクション、形質導入、形質転換など（例えば、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法など）が挙げられる。
本明細書において「形質転換体」とは、形質転換によって作製された細胞などの生命体の全部または一部をいう。形質転換体としては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などが例示される。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などともいわれる。本発明において用いられる細胞は、形質転換体であってもよい。
本発明において遺伝子操作などにおいて原核生物細胞が使用される場合、原核生物細胞としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属などに属する原核生物細胞、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨ１が例示される。
本明細書において使用される場合、組換えベクターの導入方法としては、ＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法［Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）］、リポフェクション法、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，１９２９（１９７８）］、酢酸リチウム法などが挙げられる。
本明細書において遺伝子発現（たとえば、ｍＲＮＡ発現、ポリペプチド発現）の「検出」または「定量」は、例えば、ｍＲＮＡの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法またはＰＣＲ法などが例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法などが例示される。アレイ（例えば、ＤＮＡアレイ、プロテインアレイ）を用いた遺伝子解析方法によっても行われ得る。ＤＮＡアレイについては、（秀潤社編、細胞工学別冊「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」）に広く概説されている。プロテインアレイについては、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．２００２ Ｄｅｃ；３２ Ｓｕｐｐｌ：５２６−３２に詳述されている。遺伝子発現の分析法としては、上述に加えて、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＡＣＥ法、ＳＳＣＰ法、免疫沈降法、ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステム、インビトロ翻訳などが挙げられるがそれらに限定されない。そのようなさらなる分析方法は、例えば、ゲノム解析実験法・中村祐輔ラボ・マニュアル、編集・中村祐輔 羊土社（２００２）などに記載されており、本明細書においてそれらの記載はすべて参考として援用される。
（１．材料）
（１．１）グルカンおよびグルカンの修飾物
「グルカン」とは、本明細書中で用いられる場合、Ｄ−グルコースを構成単位とする多糖である。本発明においては、グルカンとしてα−Ｄ−グルカンを使用することが好ましい。α−Ｄ−グルカン中のグルコース残基を連結する結合は、主にα−１，４−グルコシド結合からなり、α−１，６−グルコシド結合を含んでもよい。α−１，６−グルコシド結合を含むα−Ｄ−グルカンは、分岐構造を有する。分子中に少なくとも１つのα−１，６−グルコシド結合を有するグルカンを分岐状グルカンといい、分子中にまったくα−１，６−グルコシド結合を有さないグルカンを直鎖状グルカンという。本明細書においては、特に断りのない限り、「グルカン」の重量平均分子量は約１×１０３以上であることが好ましい。本発明で使用される好ましいグルカンは、直鎖状グルカンおよび分岐状グルカンであり、より好ましくは直鎖状α−１，４−グルカン及びα−１，６−結合により分岐したα−１，４−グルカン（分岐状α−１，４グルカンともいう）である。本発明で使用されるグルカンは、α−１，３−結合を含まないことが好ましい。
直鎖状α−Ｄ−１，４−グルカンとは、Ｄ−グルコース単位がα−１，４−グルコシド結合のみで２糖単位以上結合されている多糖をいう。本明細書中では、特に断りのない限り、直鎖状α−Ｄ−１，４−グルカンを直鎖状グルカン又は直鎖状α−１，４グルカンという。直鎖状グルカンは、ひとつの非還元末端を有する。本発明に好適に利用される直鎖状グルカンの例としては、アミロースが挙げられる。
本明細書中では用語「アミロース」とは、α−１，４結合によって連結されたグルコース単位から構成される直鎖分子をいう。アミロースは、天然の澱粉中に含まれる。アミロースは、天然の澱粉から抽出した天然アミロースであってもよく、酵素反応によって合成したアミロース（本明細書中では「酵素合成アミロース」ともいう）であってもよい。天然アミロースは、分岐部分を含む場合があるが、酵素合成アミロースは分岐を含まない。さらに、天然アミロースは分散度が大きく分子量にばらつきがあるが、酵素合成アミロース（特に、国際公開第ＷＯ０２／０９７１０７号パンフレットに記載されるＳＰ−ＧＰ法によって合成した酵素合成アミロース）は分散度が小さく極めて均一な分子量を有する。そのため、本発明においては、酵素合成アミロースを使用することが好ましい。本発明において使用されるアミロースの重合度は、好ましくは約１０以上であり、より好ましくは約５０以上であり、さらに好ましくは約１００以上であり、最も好ましくは約１８０以上である。本発明において使用されるアミロースの重合度は、好ましくは約１×１０５以下であり、より好ましくは約１×１０４以下であり、さらに好ましくは約１×１０３以下であり、最も好ましくは約５００以下である。
本明細書中では用語「分岐状α−Ｄ−グルカン」とは、Ｄ−グルコースがα−１，４−グルコシド結合により連結した直鎖状グルカンが、α−１，４−グルコシド結合以外の結合により分岐しているグルカンをいう。本明細書中では、特に断りのない限り、分岐状α−Ｄ−グルカンを分岐状グルカンという。分岐結合は、α−１，６−グルコシド結合、α−１，３−グルコシド結合、またはα−１，２−グルコシド結合のいずれかであるが、最も好ましくはα−１，６−グルコシド結合である。本発明で使用する分岐状α−Ｄ−グルカンはα−１，３−グルコシド結合およびα−１，２−グルコシド結合を含まないことが好ましい。分岐状グルカンは、通常、分岐結合の数と同数の非還元末端を有する。α−１，６−グルコシド結合のみを選択的に分解する酵素（例えば、イソアミラーゼ、プルラナーゼなど）で分岐状グルカンを処理すると、直鎖状α−１，４−グルカンの混合物に分解できる。これらを分岐グルカンの単位鎖といい、その重合度を単位鎖長という。
本発明に好適に利用される分岐状グルカンの例としては、デンプン、アミロペクチン、グリコーゲン、デキストリン、酵素合成分岐グルカン及び高度分岐環状グルカンなどが挙げられる。
本明細書中では用語「デンプン」とは、アミロースとアミロペクチンとの混合物をいう。デンプンとしては、通常市販されているデンプンであればどのようなデンプンでも用いられ得る。デンプンに含まれるアミロースとアミロペクチンとの比率は、デンプンを産生する植物の種類によって異なる。モチゴメ、モチトウモロコシなどの有するデンプンのほとんどはアミロペクチンである。他方、アミロースのみからなり、かつアミロペクチンを含まないデンプンは、通常の植物からは得られない。デンプンは、天然のデンプン、デンプン分解物および化工デンプンに区分される。
天然のデンプンは、原料により、いも類デンプンおよび穀類デンプンに分けられる。いも類デンプンの例としては、馬鈴薯デンプン、タピオカデンプン、甘藷デンプン、くずデンプン、およびわらびデンプンなどが挙げられる。穀類デンプンの例としては、コーンスターチ、小麦デンプン、および米デンプンなどが挙げられる。天然のデンプンは、ハイアミロースデンプン（例えば、ハイアミロースコーンスターチ）またはワキシーデンプンであってもよい。デンプンはまた、可溶性デンプンであってもよい。可溶性デンプンとは、天然のデンプンに種々の処理を施すことにより得られる、水溶性のデンプンをいう。デンプンは、可溶性デンプン、ワキシーデンプンおよびハイアミロースデンプンからなる群から選択され得る。デンプンはまた、化工デンプンであってもよい。
本発明において使用されるデンプンの重合度は、好ましくは約１×１０３以上であり、より好ましくは約５×１０３以上であり、さらに好ましくは約１×１０４以上であり、最も好ましくは約２×１０４以上である。本発明において使用されるデンプンの重合度は、好ましくは約１×１０７以下であり、より好ましくは約３×１０６以下であり、さらに好ましくは約１×１０６以下であり、最も好ましくは約３×１０５以下である。
アミロペクチンとは、α−１，４結合によって連結されたグルコース単位に、α−１，６結合でグルコース単位が連結された、分岐状分子である。アミロペクチンは天然のデンプン中に含まれる。アミロペクチンとしては、例えば、アミロペクチン１００％からなるワキシーコーンスターチが用いられ得る。本発明において使用されるアミロペクチンの重合度は、好ましくは約１×１０３以上であり、より好ましくは約５×１０３以上であり、さらに好ましくは約１×１０４以上であり、最も好ましくは約２×１０４以上である。本発明において使用されるアミロペクチンの重合度は、好ましくは約１×１０７以下であり、より好ましくは約３×１０６以下であり、さらに好ましくは約１×１０６以下であり、最も好ましくは約１×１０５以下である。
グリコーゲンは、グルコースから構成されるグルカンの一種であり、高頻度の枝分かれを有するグルカンである。グリコーゲンは、動物の貯蔵多糖としてほとんどあらゆる細胞に顆粒状態で広く分布している。グリコーゲンは、植物中では、例えば、トウモロコシのスイートコーン種の種子に存在する。グリコーゲンは、代表的には、グルコースのα−１，４−結合の糖鎖に対して、グルコースおよそ３単位おきに１本程度の割合で、平均重合度１２〜１８のグルコースのα−１，４−結合の糖鎖がα−１，６−結合で結合している。また、α−１，６−結合で結合している分枝鎖にも同様にグルコースのα−１，４−結合の糖鎖がα−１，６−結合で結合している。そのため、グリコーゲンは網状構造を形成する。グリコーゲンは酵素合成することも可能である。本発明において使用されるグリコーゲンの重合度は、好ましくは約５００以上であり、より好ましくは約１×１０３以上であり、さらに好ましくは約２×１０３以上であり、最も好ましくは約３×１０３以上である。本発明において使用されるグリコーゲンの重合度は、好ましくは約１×１０７以下であり、より好ましくは約３×１０６以下であり、さらに好ましくは約１×１０６以下であり、最も好ましくは約３×１０５以下である。
デキストリンは、グルコースから構成されるグルカンの一種であり、デンプンとマルトースとの中間の複雑さをもつグルカンである。デキストリンは、デンプンを酸、アルカリまたは酵素によって部分的に分解することによって得られる。本発明において使用されるデキストリンの重合度は、好ましくは約１０以上であり、より好ましくは約２０以上であり、さらに好ましくは約３０以上であり、最も好ましくは約５０以上である。本発明において使用されるデキストリンの重合度は、好ましくは約１×１０４以下であり、より好ましくは約９×１０３以下であり、さらに好ましくは約７×１０３以下であり、最も好ましくは約５×１０３以下である。
酵素合成分岐グルカンとは、酵素を使用して合成された分岐グルカンをいう。ＳＰ−ＧＰ法でのアミロースの合成の際に反応液中にブランチングエンザイムを加えることにより、生成物を分岐させることができる。分岐の程度はブランチングエンザイムの添加量によって調節され得る。酵素合成分岐グルカンは、天然の分岐グルカンと比較して均一な構造を有しているため、製薬材料として使用する際に非常に有利である。例えば、本発明において使用される酵素合成分岐グルカンの重合度は、好ましくは約１０以上であり、より好ましくは約２０以上であり、さらに好ましくは約３０以上であり、最も好ましくは約５００以上である。本発明において使用される酵素合成分岐グルカンの重合度は、好ましくは約２×１０５以下であり、より好ましくは約１×１０５以下であり、さらに好ましくは約５×１０４以下であり、最も好ましくは約３×１０４以下である。
本明細書中では、用語「高度分岐環状グルカン」とは、内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを有する、重合度が５０以上であるグルカンをいう。高度分岐環状グルカンは、分子全体として少なくとも２つの非還元末端を有すればよい。本発明で使用され得る高度分岐環状グルカンの分子全体としての重合度は、好ましくは約５０以上であり、より好ましくは約６０以上であり、さらに好ましくは約１００以上である。本発明で使用され得る高度分岐環状グルカンの分子全体としての重合度は、好ましくは約１×１０４以下であり、より好ましくは約７×１０３以下であり、さらに好ましくは約５×１０３以下である。
高度分岐環状グルカンに存在する、内分岐環状構造部分の重合度は、好ましくは約１０以上であり、より好ましくは約１５以上であり、さらに好ましくは約２０以上である。高度分岐環状グルカンに存在する、内分岐環状構造部分の重合度は、好ましくは約５００以下であり、より好ましくは約３００以下であり、さらに好ましくは約１００以下である。
高度分岐環状グルカンに存在する、外分岐構造部分の重合度は、好ましくは約４０以上であり、より好ましくは約１００以上であり、さらに好ましくは約３００以上であり、さらにより好ましくは約５００以上である。高度分岐環状グルカンに存在する、外分岐構造部分の重合度は、好ましくは約３×１０３以下であり、より好ましくは約１×１０３以下であり、さらに好ましくは約５００以下であり、さらにより好ましくは約３００以下である。
高度分岐環状グルカンに存在する、内分岐環状構造部分のα−１，６−グルコシド結合は少なくとも１個あればよく、例えば１個以上、５個以上、１０個以上などであり得る；内分岐環状構造部分のα−１，６−グルコシド結合は例えば約２００個以下、約５０個以下、約３０個以下、約１５個以下、約１０個以下などであり得る。
高度分岐環状グルカンに存在する、外分岐構造部分の分岐の数（すなわち、α−１，６−グルコシド結合の数）は、好ましくは約２個以上であり、より好ましくは約３個以上であり、さらに好ましくは約５個以上、特に好ましくは約１０個以上である。高度分岐環状グルカンに存在する、外分岐構造部分の分岐の数（すなわち、α−１，６−グルコシド結合の数）は、好ましくは約５×１０３個以下であり、より好ましくは約４×１０３個以下であり、さらに好ましくは約３×１０３個以下である。
高度分岐環状グルカンは、１種類の重合度のものを単独で用いてもよいし、種々の重合度のものの混合物として用いてもよい。好ましくは、高度分岐環状グルカンの重合度は、最大の重合度のものと最小の重合度のものとの重合度の比が約１００以下、より好ましくは約５０以下、さらにより好ましくは約１０以下である。
高度分岐環状グルカンは、好ましくは、内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを有する、重合度が５０から５×１０３の範囲にあるグルカンであって、ここで、内分岐環状構造部分とはα−１，４−グルコシド結合とα−１，６−グルコシド結合とで形成される環状構造部分であり、そして外分岐構造部分とは、該内分岐環状構造部分に結合した非環状構造部分である、グルカンである。この外分岐構造部分の各単位鎖の重合度は、平均で好ましくは約１０以上であり、好ましくは約２０以下である。高度分岐環状グルカンおよびその製造方法は、特開平８−１３４１０４号（特許第３１０７３５８号）に詳細に記載されており、その記載に従って製造され得る。高度分岐環状グルカンは、例えば、江崎グリコ株式会社から「クラスターデキストリン」として市販されている。本発明において使用される高度分岐環状グルカンの重合度は、好ましくは約５０以上であり、より好ましくは約７０以上であり、さらに好ましくは約１００以上であり、最も好ましくは約１５０以上である。本発明において使用される高度分岐環状グルカンの重合度は、好ましくは約１×１０４以下であり、より好ましくは約７×１０３以下であり、さらに好ましくは約５×１０３以下であり、最も好ましくは約４×１０３以下である。
特定の実施形態では、分岐状グルカンは、粒子状となりうる。直径約４ｎｍ以下の粒子は腎臓から排出され、直径約４ｎｍ〜約２００ｎｍの粒子は血中を長時間循環し、直径約２００ｎｍ〜約７μｍの粒子は細網内皮系に捕捉され、直径約７μｍ以上の粒子は毛細血管を閉塞させることが公知である。細網内皮系は肝臓および脾臓に分布する。そのため、分岐グルカンの粒径を制御することにより、本発明のアミノ糖含有グルカン及びその修飾物及びそれらの結合体の体内での動態を制御することができる。血中に長時間循環させることを意図する場合、粒子状分岐グルカンの粒径は、好ましくは直径約４ｎｍ以上であり、より好ましくは約１０ｎｍ以上であり、好ましくは約２００ｎｍ以下であり、より好ましくは約１００ｎｍ以下である。このような粒径の粒子状分岐グルカンの分子量は、好ましくは約５×１０５以上であり、より好ましくは約１×１０６以上であり、好ましくは約５×１０７以下であり、より好ましくは約２×１０７以下である。例えば、直径２０〜５０ｎｍの粒子はがん細胞に蓄積することが公知であるので、がん細胞に蓄積させることを意図する場合、粒子状分岐グルカンの粒径は、好ましくは直径約１０ｎｍ以上であり、より好ましくは約１５ｎｍ以上であり、好ましくは約１００ｎｍ以下であり、より好ましくは約５０ｎｍ以下である。このような粒径の粒子状分岐グルカンの分子量は、好ましくは約５×１０５以上であり、より好ましくは約１×１０６以上であり、好ましくは約２×１０７以下であり、より好ましくは約５×１０６以下である。
α−グルカンの分岐の数（すなわち、α−１，６−グルコシド結合の数）は、好ましくは約１個以上であり、より好ましくは約１０個以上であり、さらに好ましくは約３０個以上である。α−グルカンの分岐の数（すなわち、α−１，６−グルコシド結合の数）は、好ましくは約５×１０３個以下であり、より好ましくは約３×１０３個以下であり、さらに好ましくは約１×１０３個以下である。
本発明で使用される分岐状α−グルカンにおいては、α−１，６−グルコシド結合の数に対するα−１，４−グルコシド結合の数の比（「α−１，６−グルコシド結合の数」：「α−１，４−グルコシド結合の数」）は、好ましくは１：１〜１：１×１０３であり、より好ましくは１：１．１〜１：５００であり、さらに好ましくは１：１．２〜１：１００であり、さらに好ましくは１：１．５〜１：５０であり、最も好ましくは１：２〜１：２０である。この比はまた、場合によっては、１：１０〜１：５×１０３、１：５０〜１：１×１０３、または１：１００〜１：５００であってもよい。
本発明において分岐状グルカンの分岐頻度の下限は、好ましくは０．２％以上、好ましくは１％以上、より好ましくは２％以上、最も好ましくは５％以上であり、そして、分岐頻度の上限は特にないが、例えば、９９％以下、９０％以下、８５％以下、６５％以下、５０％以下などであり得る。分岐頻度は、｛（α−１，６結合の数）／（グルカン中のα−１，４結合とα−１，６結合の合計）｝×１００によって計算される。
α−１，６−グルコシド結合は、α−グルカン中に無秩序に分布していてもよいし、均質に分布していてもよい。α−グルカン中に糖単位で５個以上の直鎖状部分ができる程度の分布であることが好ましい。
本発明においては、グルカンの代わりにグルカンの修飾物を使用してもよい。グルカンの修飾物の例としては、化工デンプンおよび上記で説明したグルカンのエステル化物などが挙げられる。グルカンの修飾物はまた、水酸基修飾物または還元末端修飾物であってもよい。また、後述するように、グルカンの少なくとも１つの非還元末端にそれぞれ少なくとも１つのアミノ単糖残基をα−１，４結合させた後にグルカン部分を修飾してもよい。
化工デンプンは、天然のデンプンに加水分解、エステル化、またはα化などの処理を施して、より利用しやすい性質を持たせたデンプンである。糊化開始温度、糊の粘度、糊の透明度、老化安定性などを様々な組み合わせで有する幅広い種類の化工デンプンが入手可能である。化工デンプンの種類には種々ある。このようなデンプンの例は、デンプンの糊化温度以下においてデンプン粒子を酸に浸漬することにより、デンプン分子は切断するが、デンプン粒子は破壊していないデンプンである。
化工デンプン以外のグルカンの修飾物の例としては、非修飾グルカンのアルコール性水酸基のうちの少なくとも１つが修飾されたもの（以下、本明細書中では「グルカンの水酸基修飾物」という)、グルカンの非還元末端のうちの一部が修飾されたもの（以下、本明細書中では「グルカンの非還元末端修飾物」という）およびグルカンの還元末端が修飾されたもの（以下、本明細書中では「グルカンの還元末端修飾物」という）が挙げられる。
水酸基での修飾の例としては、ヒドロキシアルキル化、アルキル化、アシル化、カルボキシメチル化、硫酸化及びリン酸化が挙げられる。水酸基での修飾は、体内の酵素によって除去され得る修飾であることが好ましい。グルカンの水酸基修飾物は、好ましくはアシル化グルカンであり、さらに好ましくはアセチル化グルカンである。アルコール性水酸基への修飾基の導入頻度は、グルカンの修飾反応の際に任意に設定することができる。アルコール性水酸基への修飾基の導入頻度はＤＳとして表し、ＤＳ１はグルコース残基あたりひとつの修飾基が導入されている状態を意味する。ＤＳは、ＤＳ＝（修飾基数）／（グルコース残基数）によって計算され得る。非修飾グルコース残基には２位、３位および６位にＯＨ基があるため、理論上、グルコース残基１個あたり最大３個の修飾基を導入し得る。そのため、ＤＳの上限値は通常３である。アルコール性水酸基への修飾基の導入頻度は、約ＤＳ０．０１以上であり、より好ましくは約ＤＳ０．０３以上であり、さらに好ましくは約ＤＳ０．０５以上であり、特に好ましくは約ＤＳ０．０７以上であり、最も好ましくは約ＤＳ０．１以上である。修飾基の導入頻度は、好ましくは約ＤＳ１．５以下であり、より好ましくは約ＤＳ１．３以下であり、さらに好ましくは約ＤＳ１．１以下であり、特に好ましくは約ＤＳ１．０以下であり、最も好ましくは約ＤＳ０．９以下である。グルカンを修飾することにより血液内あるいは体内でのグルカンの分解が抑制される。
非還元末端での修飾の例としては、マンノース残基、ガラクトース残基などの標的性分子との結合が挙げられる。非還元末端での修飾については、以下の２．６および３において詳細に説明する。非還元末端修飾物は、好ましくはマンノース残基との結合物又はガラクトース残基との結合物である。
還元末端での修飾の例としては、単糖、非還元性糖質類、生体適合性高分子、リポソーム構成成分、配糖体及びアミン基含有低分子量物質からなる群より選択される物質との結合が挙げられる。非還元末端での修飾については、以下の２．６および３において詳細に説明する。
（１．２）アミノ糖
アミノ糖は、少なくとも１つのヒドロキシル基がアミノ基に置換された糖の総称である。アミノ糖中の糖部分は単糖であることが好ましく、六単糖であることが好ましい。糖部分が六単糖の場合、アミノ糖中のアミノ基の数は、１〜４の任意の整数であり得るが、１または２であることが好ましく、１であることが最も好ましい。本発明においては、糖の２位のヒドロキシル基がアミノ基に置換されているアミノ糖が好ましい。代表的なアミノ糖の例としては、グルコサミン、ガラクトサミン、マンノサミンが挙げられる。本発明におけるアミノ糖としてはグルコサミンが最も好ましい。複数種類のアミノ糖を混合して使用してもよく、１種類のアミノ糖を使用してもよい。
（２．アミノ糖含有グルカンの製造法）
（２．１）アミノ糖−１−リン酸
本発明の方法においては、アミノ糖−１−リン酸が使用され得る。好ましくは、グルコサミン−１−リン酸、ガラクトサミン−１−リン酸またはマンノサミン−１−リン酸が使用される。アミノ糖−１−リン酸は、市販のものであってよく、化学的な方法、酵素的な方法、醗酵などの生物学的方法により合成されたものであってもよい。アミノ糖−１−リン酸の製造法は当該分野で公知である。例えば、グルコサミン−１−リン酸の合成方法は、例えば、Ｎａｗａｊｉら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．２００８、３４３、２６９２−２６９６に開示されている。
アミノ糖−１−リン酸としては、非塩形態のアミノ糖−１−リン酸および塩の形態のアミノ糖−１−リン酸のいずれをも使用し得る。例えば、グルコサミン−１−リン酸としては、非塩形態のグルコサミン−１−リン酸および塩の形態のグルコサミン−１−リン酸のいずれをも使用し得る。例えば、グルコサミン−１−リン酸の金属塩を使用することができ、グルコサミン−１−リン酸のアルカリ金属塩（例えば、グルコサミン−１−リン酸二ナトリウムおよびグルコサミン−１−リン酸二カリウム）を使用することができる。
（２．２）α−グルカンホスホリラーゼ
本明細書において用語「α−グルカンホスホリラーゼ」は、α−グルカンホスホリラーゼ活性を有する酵素を意味する。α−グルカンホスホリラーゼは、ＥＣ２．４．１．１に分類される。α−グルカンホスホリラーゼ活性とは、無機リン酸とα−１，４−グルカンとから、グルコース−１−リン酸およびα−１，４−グルカンの部分分解物を作る反応またはその逆反応を触媒する活性をいう。α−グルカンホスホリラーゼは、加リン酸分解の逆反応であるα−１，４−グルカン合成反応をも触媒し得る。反応がどちらの方向に進むかは、基質の量に依存する。
本発明においては、グルコサミン残基をグルカンの非還元末端に転移する機能を有する限り、任意のα−グルカンホスホリラーゼが使用され得る。本発明で使用されるα−グルカンホスホリラーゼは、細菌、酵母、動物または植物に由来し得る。本発明のα−グルカンホスホリラーゼは、例えば、馬鈴薯、サツマイモ、ソラマメ（Ｆａｖａ ｂｅａｎ）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、ホウレンソウ、トウモロコシ、イネ、コムギ、Ｃｉｔｒｕｓ ｈｙｂｒｉｄ ｃｕｌｔｉｖａｒ、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｚｉｌｌｉｇｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｐｓｅｕｄｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓなどに由来し得る。
本発明で使用するα−グルカンホスホリラーゼは、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼであることが好ましい。特定の実施形態では、馬鈴薯由来α−グルカンホスホリラーゼまたはＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｚｉｌｌｉｇｉｉ ＡＮ１由来α−グルカンホスホリラーゼが使用され得る。
Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼの塩基配列を配列番号１に示し、そしてアミノ酸配列を配列番号２の１位〜６９２位に示す。Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列は、植物のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列に対して約２１％〜約２４％の配列同一性を有し、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列に対して約３４％の配列同一性を有し、そしてＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ由来のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列に対して約３８％の配列同一性を有する。Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ由来のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列に対して約３８％の配列同一性を有し、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｚｉｌｌｉｇｉｉ由来のマルトデキストリンホスホリラーゼのアミノ酸配列に対して約３８％の配列同一性を有し、そしてＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｐｓｅｕｄｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓに対して約３３％の配列同一性を有する。
馬鈴薯由来タイプＬ α−グルカンホスホリラーゼの塩基配列を配列番号３に示し、そしてアミノ酸配列を配列番号４の１５位〜９３０位に示す。Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｚｉｌｌｉｇｉｉ ＡＮ１由来α−グルカンホスホリラーゼの塩基配列を配列番号５に示し、そしてアミノ酸配列を配列番号６の１位〜７１７位に示す。
本明細書中では、酵素がある生物に「由来する」とは、その生物から直接単離したことのみを意味するのではなく、その生物を何らかの形で利用することによりその酵素が得られることをいう。例えば、その生物から入手したその酵素をコードする遺伝子を大腸菌に導入して、その大腸菌から酵素を単離する場合も、その酵素はその生物に「由来する」という。
本明細書において配列（例えば、アミノ酸配列、塩基配列など）の「同一性」とは、２つの配列の間で同一のアミノ酸（塩基配列を比較する場合は塩基）の出現する程度をいう。一般に、２つのアミノ酸または塩基の配列を比較して、付加または欠失を含み得る最適な様式で整列されたこれら２つの配列を比較することによって決定され得る。
本明細書では配列の同一性は、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ Ｖｅｒ．４．０（株式会社ゼネティックス）のマキシマムマッチングを用いて算出される。このプログラムは、解析対象となる配列データに対して、比較対象となる配列データを置き換えおよび欠損を考慮しながら、配列間で一致するアミノ酸対が最大になるように並べ替え、その際、一致（Ｍａｔｃｈｅｓ）、不一致（Ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ）、ギャップ（Ｇａｐｓ）についてそれぞれ得点を与え合計を算出して最小となるアライメントを出力しその際の同一性を算出する（参考文献：Ｔａｋｅｉｓｈｉ，Ｋ．およびＧｏｔｏｈ，Ｏ．１９８４．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ａｍｏｎｇ Ｖａｒｉｏｕｓ ４．５ Ｓ ＲＮＡ Ｓｐｅｃｉｅｓ Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９２：１１７３−１１７７）。
例えば、本発明で使用されるα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列は、配列番号２、配列番号４または配列番号６と同一、すなわち、１００％同一であってよい。別の実施形態では、グルコサミン残基をグルカンの非還元末端に転移する活性を有する限り、このアミノ酸配列は、対照アミノ酸配列と比較してある一定の数までアミノ酸が変化していてもよい。このような変化は、少なくとも１個（例えば、１又は数個）のアミノ酸の欠失、置換（保存および非保存置換を含む）または挿入からなる群より選択され得る。このような変化は配列番号２、配列番号４または配列番号６のアミノ酸配列のアミノ末端もしくはカルボキシ末端の位置で生じてもよく、またはこれら末端以外のどの位置で生じてもよい。アミノ酸残基の変化は、１残基ずつ点在していてもよく、数残基連続していてもよい。例えば、本発明で使用されるα−グルカンホスホリラーゼは、酵素の精製を容易にするため、安定性を高めるためなどの理由で配列番号２、配列番号４または配列番号６のアミノ酸配列のいずれかの末端に（好ましくは約２０残基以下、より好ましくは約１０残基以下、さらに好ましくは約５残基以下の）アミノ酸残基を付加したものであってもよい。
本発明で使用されるα−グルカンホスホリラーゼは、配列番号２、配列番号４または配列番号６のアミノ酸配列に対して好ましくは約５０％以上、より好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、なおいっそう好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、グルコサミン残基をグルカンの非還元末端に転移する活性を有する。本発明で使用されるα−グルカンホスホリラーゼは、配列番号２、配列番号４または配列番号６のアミノ酸配列に対して約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上または約９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。
反応開始時の溶液中に含まれるα−グルカンホスホリラーゼの量は、好ましくは約０．０１Ｕ／ｍｌ以上であり、より好ましくは約０．１Ｕ／ｍｌ以上であり、特に好ましくは約０．５Ｕ／ｍｌ以上であり、最も好ましくは約１Ｕ／ｍｌ以上である。反応開始時の溶液中に含まれるα−グルカンホスホリラーゼの量は、好ましくは約１０００Ｕ／ｍｌ以下であり、より好ましくは約１００Ｕ／ｍｌ以下であり、特に好ましくは約５０Ｕ／ｍｌ以下であり、最も好ましくは約２０Ｕ／ｍｌ以下である。α−グルカンホスホリラーゼの重量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、反応自体は起こるものの、グルカンの収率が低下する場合がある。なお、α−グルカンホスホリラーゼの単位量は、以下のとおりに定義される：
α−グルカンホスホリラーゼの単位量は、１分間に１μｍｏｌの無機リン酸（Ｐｉ）を生成するα−グルカンホスホリラーゼ活性を１単位（Ｕ又はＵｎｉｔ）とする。このα−グルカンホスホリラーゼ活性の測定は、Ｇ−１−Ｐから生じた遊離の無機リン酸（Ｐｉ）を定量する。２００μｌの反応液（１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）中、１２．５ｍＭ Ｇ−１−Ｐ、１％デキストリンおよび酵素液を含む）を５０℃に１５分間インキュベートした後、８００μｌのモリブデン試薬（１５ｍＭモリブデン酸アンモニウム、１００ｍＭ酢酸亜鉛）を加え、攪拌し反応を停止する。２００μｌの５６８ｍＭのアスコルビン酸（ｐＨ５．８）を加え、混合し、３０℃に１５分間インキュベートした後、分光光度計を用いて８５０ｎｍの吸光度を測定する。濃度既知の無機リン酸を用いて同様に吸光度を測定し、標準曲線を作成し、この標準曲線に試料で得られた吸光度を当てはめ、試料中の無機リン酸を求める。無機リン酸は、リン酸イオンとして定量される。グルコース−１−リン酸の量は定量されない。
（２．３）α−グルカンホスホリラーゼの製造
本発明で用いられるα−グルカンホスホリラーゼは、上記のような自然界に存在する、α−グルカンホスホリラーゼを産生する生物から直接単離され得る。あるいは、本発明で用いられるα−グルカンホスホリラーゼは、上記の生物から単離したα−グルカンホスホリラーゼをコードする遺伝子を用いて遺伝子組換えされた微生物（例えば、細菌、真菌など）から単離してもよい。
好ましい実施形態では、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼは、配列番号１の遺伝子断片を化学合成し、この遺伝子断片を含む発現ベクターを構築し、この発現ベクターを微生物へ導入して組換え微生物を作製し、この組換え微生物を培養してα−グルカンホスホリラーゼを生産させ、そして生産されたα−グルカンホスホリラーゼを回収することにより生産される。他の生物由来のα−グルカンホスホリラーゼについても同様に生産され得る。遺伝子組換えによる酵素生産方法は、当業者に周知である。本願発明に用いられる宿主微生物には、原核生物および真核生物が含まれ、中温菌が好ましい。特に好ましい微生物としては、例えば大腸菌などが挙げられるが、これに限定されない。
本発明において用いられる配列番号２の１位〜６９２位、配列番号４の１５位〜９３０位もしくは配列番号６の１位〜７１７位のアミノ酸配列またはそれにして相同性を有しかつグルコサミン転移活性を有するアミノ酸配列を有するα−グルカンホスホリラーゼ、ならびにそれをコードするポリヌクレオチドは、従来の遺伝子工学技術を用いて生産することができる。
（２．４）アミノ糖含有グルカンの製造
本発明のアミノ糖含有グルカンは、グルコサミン−１−リン酸、グルカン、およびグルコサミン残基をグルカンの非還元末端に転移する反応を触媒し得るα−グルカンホスホリラーゼ（例えば、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼ、馬鈴薯由来α−グルカンホスホリラーゼ、またはＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｚｉｌｌｉｇｉｉ ＡＮ１由来α−グルカンホスホリラーゼ）を含む反応溶液を反応させる工程を含む方法により製造され得る。この方法においてグルカンの代わりにグルカン修飾物を使用することによりアミノ糖含有グルカンの修飾物を製造することができる。以下においては、例示として、グルカンを用いる方法について説明する。
まず、反応溶液を調製する。反応溶液は、例えば、適切な溶媒に、アミノ糖−１−リン酸（例えば、グルコサミン−１−リン酸）、グルカン、およびα−グルカンホスホリラーゼを添加することにより調製され得る。この反応溶液には、酵素反応を阻害しない限り、必要に応じて、ｐＨを調整する目的で任意の緩衝剤、及び無機塩類を加えてもよい。この反応溶液には、必要に応じてα−グルカンホスホリラーゼの本来の基質である、グルコース−１−リン酸を添加してもよい。アミノ糖−１−リン酸とグルコース−１−リン酸を共存させた反応の場合、受容体グルカンの非還元末端にグルコース残基を結合させる反応と、アミノ単糖残基を結合させる反応が同時に行われることになる。グルカンの非還元末端にアミノ単糖残基が結合しても、α−グルカンホスホリラーゼはアミノ単糖残基の非還元末端にさらに分子を転移させることができるが、その転移効率はグルコース残基に対して転移させる効率よりも非常に低い。グルカンの非還元末端にグルコース残基が結合すると、α−グルカンホスホリラーゼは得られる分子の非還元末端にさらにグルコース残基またはアミノ単糖残基を転移することができる。そのため、グルコース−１−リン酸が共存するとグルカンの鎖長を効率よく伸ばすことができる。従って、最終的に得られるアミノ糖含有グルカンの構造は、アミノ糖−１−リン酸とグルコース−１−リン酸の添加比率により制御されることになる。この反応溶液には、必要に応じて、枝切り酵素、ブランチングエンザイム、４−α−グルカノトランスフェラーゼおよびグリコーゲンデブランチングエンザイムからなる群より選択される酵素を添加してもよい。
反応溶液中でのアミノ糖−１−リン酸の量と、集団としてのグルカンの非還元末端の数との比率を変えることにより、アミノ単糖残基の導入頻度を制御することができる。すなわち、（グルカンの分子数）×（分子内の非還元末端の数に対するアミノ糖−１−リン酸の量）を増やすほど、アミノ単糖残基の導入頻度を高めることができる。酵素添加量または酵素反応時間を調節することにより、アミノ単糖残基の導入頻度を調節することも可能である。
次いで、反応溶液を、当該分野で公知の方法によって必要に応じて加熱することにより、反応させる。反応温度は、本発明の効果が得られる限り、任意の温度であり得る。反応温度は代表的には、約３０℃〜約９０℃の温度であり得る。この反応工程における溶液の温度は、所定の反応時間後に反応前のこの溶液に含まれるα−グルカンホスホリラーゼの活性の約５０％以上、より好ましくは約８０％以上の活性が残る温度であることが好ましい。Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来のα−グルカンホスホリラーゼは耐熱性酵素であり、その反応至適温度は約８０〜９０℃である。反応速度の面からは、反応温度がある程度高いことが好ましい。一方、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来のα−グルカンホスホリラーゼの反応至適温度の面からは約８０〜９０℃での反応が可能である。しかし、得られる生成物の安定性、アミノ糖−１−リン酸やグルコース−１−リン酸の安定性などの観点から、反応温度はＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来のα−グルカンホスホリラーゼの反応至適温度よりも少し低いことが好ましい。反応温度は、好ましくは約３０℃以上であり、より好ましくは約３５℃以上であり、さらに好ましくは約４０℃以上である。特定の実施形態では、反応温度は約４５℃以上または約５０℃以上であってもよい。反応温度は、好ましくは約９０℃以下であり、より好ましくは約８０℃以下であり、さらに好ましくは約７０℃以下である。特定の実施形態では、反応温度は約６５℃以下または約６０℃以下であってもよい。馬鈴薯由来α−グルカンホスホリラーゼなどのより反応至適温度の低い酵素を使用する場合、反応温度はＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来のα−グルカンホスホリラーゼを使用する場合よりは低く設定されることが好ましい。
反応時間は、反応温度、酵素の残存活性を考慮して、任意の時間で設定され得る。反応時間は、代表的には約１時間〜約１００時間、より好ましくは約１時間〜約７２時間、さらにより好ましくは約２時間〜約３６時間、最も好ましくは約２時間〜約２４時間である。特定の実施形態では、反応時間は、例えば、約１時間以上、約２時間以上、約５時間以上、約１０時間以上、約１２時間以上、約２４時間以上であってもよい。特定の実施形態では、反応時間は、例えば、約１００時間以下、約７２時間以下、約６０時間以下、約４８時間以下、約３６時間以下、約２４時間以下であってもよい。
加熱は、どのような手段を用いて行ってもよいが、溶液全体に均質に熱が伝わるように、攪拌を行いながら加熱することが好ましい。溶液は、例えば、温水ジャケットと攪拌装置を備えたステンレス製反応タンクの中に入れられて攪拌される。
本発明の方法ではまた、反応がある程度進んだ段階で、アミノ糖−１−リン酸、グルカン、およびα−グルカンホスホリラーゼのうちの少なくとも１つを反応溶液に追加してもよい。
このようにして、アミノ糖含有グルカンを含有する溶液が生産される。
反応終了後、反応溶液は、必要に応じて例えば、１００℃にて１０分間加熱することによって反応溶液中の酵素を失活させ得る。あるいは、酵素を失活させる処理を行うことなく後の工程を行ってもよい。反応溶液は、そのまま保存されてもよいし、生産されたアミノ糖含有グルカンを単離するために処理されてもよい。
反応終了後、アミノ糖含有グルカンを精製してから、またはアミノ糖含有グルカンの精製前に、得られたアミノ糖含有グルカンのグルカン部分のアルコール性水酸基のうちの少なくとも１つを修飾することによりアミノ糖含有グルカンの水酸基修飾物を製造してもよい。アミノ糖含有グルカンを精製してから修飾を行うことが好ましい。修飾は、当該分野で公知の方法に従って行われ得る。修飾の例としては、ヒドロキシアルキル化、アルキル化、アシル化、カルボキシメチル化、硫酸化およびリン酸化が挙げられる。アシル化が好ましく、アセチル化がより好ましい。アミノ糖含有グルカン又はアミノ糖含有グルカン水酸基修飾物を製造した後に、グルカンの還元末端を修飾することによりアミノ糖含有グルカン又はアミノ糖含有グルカン水酸基修飾物の還元末端修飾物を製造してもよい。さらに、これらのグルカン部分のアミノ糖が結合していない非還元末端を修飾してもよい。グルカンに対するアミノ単糖残基の結合、水酸基の修飾、還元末端の修飾及び非還元末端の一部へのアミノ単糖残基以外の修飾基での修飾は、任意の順序で行われ得る。
（２．５）アミノ糖含有グルカンの精製
＜精製方法＞
生産されたアミノ糖含有グルカン（又はその修飾物）は、必要に応じて精製され得る。精製することにより除去される不純物の例は、無機リン酸、アミノ糖−１−リン酸、無機塩類などである。グルカンの精製法の例としては、有機溶媒を用いる方法（Ｔ．Ｊ．Ｓｃｈｏｃｈら、Ｊ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，６４，２９５７（１９４２））および有機溶媒を用いない方法がある。
有機溶媒を用いる精製に使用され得る有機溶媒の例としては、アセトン、ｎ−アミルアルコール、ペンタゾール、ｎ−プロピルアルコール、ｎ−ヘキシルアルコール、２−エチル−１−ブタノール、２−エチル−１−ヘキサノール、ラウリルアルコール、シクロヘキサノール、ｎ−ブチルアルコール、３−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、ｄ，ｌ−ボルネオール、α−テルピネオール、イソブチルアルコール、ｓｅｃ−ブチルアルコール、２−メチル−１−ブタノール、イソアミルアルコール、ｔｅｒｔ−アミルアルコール、メントール、メタノール、エタノールおよびエーテルが挙げられる。
有機溶媒を用いない精製方法の例としては、アミノ糖含有グルカン生産反応後、水に溶解しているアミノ糖含有グルカンを沈澱させずに、限外ろ過膜を用いた膜分画もしくはクロマトグラフィーに供して無機リン酸、アミノ糖−１−リン酸、無機塩類を除去する方法がある。
精製に使用され得る限外濾過膜の例としては、分画分子量約１×１０３〜約１×１０４、好ましくは約５×１０３〜約５×１０４、より好ましくは約１×１０４〜約３×１０４の限外濾過膜（ダイセル製ＵＦ膜ユニット）が挙げられる。
クロマトグラフィーに使用され得る担体の例としては、ゲル濾過クロマトグラフィー用担体、配位子交換クロマトグラフィー用担体、イオン交換クロマトグラフィー用担体および疎水クロマトグラフィー用担体が挙げられる。
本発明のアミノ糖含有グルカンの製造方法においては、高分子量のグルカンが使用されるため、製造後の分離が容易であるという利点がある。詳細に述べると、アミノ糖含有グルカンの生成反応は反応副産物である無機リン酸の濃度が上昇すると平衡に達するため、反応終了後の反応液中には大量のアミノ糖−１−リン酸が残存する。低分子量のグルカンを使用した場合、得られるアミノ糖含有グルカンおよびアミノ糖−１−リン酸はいずれもカチオン性である。これらは分子量および電荷がほぼ同じであるので、分離が非常に困難である。このため、アミノ糖−１−リン酸を不純物として含有しないアミノ糖含有グルカンを生産できない。しかし、高分子量のグルカンを使用した場合、分子量の違いを利用する生成方法を適用することによりアミノ糖−１−リン酸を不純物として含まないアミノ糖含有グルカンを生産することができた。グルカンとアミノ糖含有グルカンとは電荷の相違を利用してイオンクロマトグラフィーなどによって容易に分離することができる。
（２．６）アミノ糖含有グルカン及びその修飾物及び結合体
本発明のアミノ糖含有グルカンは、グルカンの少なくとも１つの非還元末端にそれぞれ少なくとも１つのアミノ単糖残基がα−１，４結合しているグルカンである。このグルカンの非還元末端に結合したアミノ単糖の末端には、必要に応じてさらに糖などを結合させてもよい。本発明のアミノ糖含有グルカンにおいて２つ以上のアミノ単糖残基がグルカンの非還元末端に結合している場合には、それらのアミノ単糖が一つの末端に連結して結合した構造になる。例えば、グルカンの一つの末端に一つのアミノ単糖が結合し、そのアミノ単糖の末端にさらに次のアミノ単糖が結合した構造になる。一つの実施形態では、グルカンの末端のそれぞれに一つのみのアミノ単糖が結合する。
本発明のアミノ糖含有グルカンにおいては、グルカンの非還元末端のすべてにアミノ単糖（例えばグルコサミン）が結合していてもよく、非還元末端のうちの一部分のみにアミノ単糖が結合していてもよい。すなわち、非還元末端のうちのいくつかが、アミノ単糖が結合しない状態で残っていてもよい。
非還元末端の数を基準とする転化率、すなわち、アミノ単糖を結合させる前にグルカンに存在した非還元末端の数に対する、アミノ単糖と非還元末端との間の結合の数の比率は、０％に極めて近い低い比率（例えば、約１％）から１００％まで、アミノ糖含有グルカンの使用される用途などに応じて適宜選択することができる。例えば、少量のアミノ基が存在することが望まれる場合には、低い転化率を選択すればよく、多量のアミノ基が存在することが望まれる場合には、高い転化率を選択すればよい。
アミノ糖含有グルカンを製造する際の酵素反応の条件を適宜調整することにより、例えば、その酵素反応の反応時間、基質の濃度などを調整することにより、容易に、選択された転化率を有するアミノ糖含有グルカンを得ることができる。
また、アミノ単糖を結合させる前にグルカンに存在した非還元末端の数に対する、非還元末端に結合したアミノ単糖の総数の比率を、アミノ基の量に関する指標とすることもできる。本明細書中ではこの比率を結合率と記載する。一般に、アミノ糖含有グルカンを分析する際には、上記転化率を測定することよりも、結合率を測定することが容易であるので、結合率に基づいてアミノ糖含有グルカンを設計することは実用的な観点から有利である。
なお、アミノ糖含有グルカンを合成する際の酵素反応の条件によっては、１つの非還元末端に結合したアミノ単糖の末端にさらにアミノ単糖が結合する場合がある。すなわち、１つの非還元末端に２つのアミノ単糖が続けて結合した構造（つまり、２糖が非還元末端に結合した構造）となる場合がある。このような構造の化合物も本発明のアミノ糖含有グルカンとして使用することができる。上記結合率は、このように複数のアミノ単糖が１つの非還元末端に結合することによりアミノ基の量が増えた場合にもそのアミノ基の量を評価できるという利点がある。そのため、上記転化率とは異なり、結合率は、１００％を超える値となる場合がある。結合率は、アミノ糖含有グルカンの使用される用途などに応じて適宜選択することができる。例えば、少量のアミノ基が存在することが望まれる場合には、低い結合率（例えば、約１％〜約２％）を選択すればよく、多量のアミノ基が存在することが望まれる場合には、高い結合率（例えば、約１５０％〜約２００％）を選択すればよい。
アミノ糖含有分岐グルカンの用途がＤＤＳ用ナノ粒子状キャリアの場合、アミノ単糖残基の結合率は、好ましくは約１０％以上であり、より好ましくは約２０％以上であり、さらに好ましくは約３０％以上であり、最も好ましくは約４０％以上である；アミノ単糖残基の結合率は、好ましくは約５００％以下であり、より好ましくは約４００％以下であり、さらに好ましくは約３００％以下であり、最も好ましくは約２００％以下である。
アミノ糖含有分岐グルカンの用途が複合体キャリアの場合、アミノ単糖残基の結合率は、好ましくは約１％以上であり、より好ましくは約５％以上であり、さらに好ましくは約１０％以上であり、最も好ましくは約２０％以上である；アミノ単糖残基の結合率は、好ましくは約５００％以下であり、より好ましくは約４００％以下であり、さらに好ましくは約３００％以下であり、最も好ましくは約２００％以下である。
アミノ糖含有分岐グルカンの用途がＤＤＳ用ナノ粒子状キャリアの場合、グルカン１分子あたりのアミノ単糖残基の結合数は、好ましくは約２以上であり、より好ましくは約５以上であり、さらに好ましくは約１０以上であり、最も好ましくは約２０以上である；グルカン１分子あたりのアミノ単糖残基の結合数は、好ましくは約５０００以下であり、より好ましくは約４０００以下であり、さらに好ましくは約３０００以下であり、最も好ましくは約２０００以下である。
アミノ糖含有分岐グルカンの用途が複合体キャリアの場合、グルカン１分子あたりのアミノ単糖残基の結合数は、好ましくは約１０以上であり、より好ましくは約５０以上であり、さらに好ましくは約１００以上であり、最も好ましくは約２００以上である；グルカン１分子あたりのアミノ単糖残基の結合数は、好ましくは約５０００以下であり、より好ましくは約４０００以下であり、さらに好ましくは約３０００以下であり、最も好ましくは約２０００以下である。
アミノ糖含有分岐グルカンが核酸と複合体を形成する場合、本発明のアミノ糖含有グルカンと核酸との複合体との結合率は、３７℃の０．１Ｍ ＮａＣｌ水溶液中で約５０％以上であることが好ましく、約６０％以上であることがより好ましく、約７０％以上であることがさらに好ましく、３７℃の１Ｍ ＮａＣｌ水溶液中で約４０％以下であることが好ましく、約３０％以下であることがさらに好ましく、約２０％以下であることが最も好ましい。結合率は、実施例１０に記載の方法によって測定され得る。
本発明のアミノ糖含有グルカンにおいて、アミノ単糖が結合していない非還元末端には、アミノ糖以外の糖が結合していてもよい。すなわち、非還元末端のうちのいくつかがアミノ単糖と結合し、残りの非還元末端がアミノ糖以外の糖と結合してもよい。
あるいは、非還元末端のうちのいくつかがアミノ単糖と結合し、いくつかがアミノ糖以外の糖と結合し、そして残りの非還元末端には何も結合していない構造にすることも可能である。ここで、複数の非還元末端のうちの、アミノ単糖に結合する末端の数と、アミノ単糖以外の糖に結合する末端の数と、糖に結合しない末端の数とは、自由に選択することが可能である。
本発明のアミノ糖含有グルカン及びその修飾物をさらに、アミノ糖残基のアミノ基において薬効成分と結合させることにより、結合体を得ることができる。アミノ糖含有グルカンと薬効成分とが結合したものを「アミノ糖含有グルカン薬効成分結合体」といい、アミノ糖含有グルカンの修飾物と薬効成分とが結合したものを「アミノ糖含有グルカン修飾物−薬効成分結合体」という。同様に、アミノ糖がグルコサミンの場合、グルコサミン含有グルカンと薬効成分とが結合したものを「グルコサミン含有グルカン薬効成分物質結合体」といい、グルコサミン含有グルカンの修飾物と薬効成分とが結合したものを「グルコサミン含有グルカン修飾物−薬効成分結合体」という。
アミノ糖含有グルカン修飾物は、水酸基修飾物、非還元末端修飾物または還元末端修飾物であり得る。
水酸基修飾物については上記のとおりである。
非還元末端修飾物について説明する。アミノ糖含有グルカン又はその修飾物のグルカン部分が分岐状α−１，４−グルカンであってアミノ糖残基が結合していない非還元末端が存在する場合、アミノ糖残基が結合していない非還元末端において他の物質と結合させることができる。好ましい実施形態では、アミノ糖残基が結合していない非還元末端に標的性分子を結合させる。本明細書中では、用語「標的性分子」とは、組織ターゲット機能を有する分子をいう。標的性分子の例としては、マンノース、ガラクトース、キシロース、フコース、ガラクトサミン、抗体、抗体フラグメント、受容体、受容体フラグメント及び受容体リガンドが挙げられる。特にガラクトースは肝実質細胞表面に存在するアシアロ糖タンパクレセプターに認識されるため、有効である。またマンノースはクッパー細胞をはじめとする種々のマクロファージや肝臓の類洞血管内皮細胞上に発現しているマンノースレセプターに認識されるため有効である。マンノースおよびガラクトースは、例えば、マンノース−１−リン酸又はガラクトース−１−リン酸を基質にα−グルカンホスホリラーゼを作用させることによりアミノ糖含有グルカン又はその修飾物の非還元末端に結合され得る。酵素反応により結合させる場合、マンノースおよびガラクトースはアミノ糖残基が結合していない非還元末端グルコース残基の４位において結合する。マンノースとガラクトースとを任意の比率で組み合わせて、分岐グルカンの複数の非還元末端に結合させることも可能である。１つの実施形態では、非還元末端に結合したアミノ糖残基に対してマンノースまたはガラクトースが結合し得る。
還元末端修飾物について説明する。「アミノ糖含有グルカンの還元末端修飾物」とは、本発明のアミノ糖含有グルカンに存在する還元末端に別の物質を結合させたものをいう。好ましい実施形態では、還元末端において他の物質と結合させる方法は以下の２通りがある。第一は、公知の酵素的、あるいは公知の化学的手法により、他の物質に重合度５×１０３以上、より好ましくは重合度１×１０４以上、さらに好ましくは重合度１×１０５以上のグルカンの還元末端を結合させ、その後本発明の方法を用いてアミノ糖をグルカンの非還元末端に結合させる方法である。第二の方法は、本発明のアミノ糖含有グルカンの還元末端を、公知の酵素的手法により、他の物質に結合させる方法である。
第一の方法における酵素的に他の物質にグルカンを結合する方法は、例えば、特開平５−２７６８８３号公報、特開平０７−２４１１８１号公報及び国際公開番号ＷＯ０１／０７３１０６に開示されており、これらの方法と同様にして高分子量のグルカンを他の物質に結合することができる。
第一の方法における化学的に他の物質にグルカンを結合する方法は、アミン基を有する物質に対して用いることが出来る。例えばマルトペンタオースとアミン基を有する物質の化学的結合方法には、以下の三種がある：
（Ａ）マルトペンタオースの還元末端アルデヒドとアミン基を有する物質を還元アミノ化により結合する方法；
（Ｂ）マルトペンタオースの還元末端アルデヒドを酸化してマルトテトラオシルグルコン酸としたのち、アミン基を有する物質と縮合剤により脱水縮合する方法；および
（Ｃ）マルトペンタオースの還元末端アルデヒドを酸化してマルトテトラオシルグルコン酸としたのち脱水してマルトテトラオシルグルコノラクトンを調製し、これを、アミン基を有する物質と無水溶媒条件で加熱して結合させる方法。（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）の３種の方法は、特願２００８−１２１６９３に詳細に記載されており、これらの方法と同様にして高分子量のグルカンを他の物質に結合することができる。
第二の本発明のアミノ糖含有グルカンの還元末端を、酵素的手法により、他の物質に結合させる方法に利用可能な酵素は、糖質及び配糖体にのみ適用可能である。酵素には、ブランチングエンザイム、ＣＧＴａｓｅ、Ｄ酵素、アミロマルターゼなどのいわゆるグルカン鎖転移酵素を用いる。これら酵素はアミノ糖含有グルカン中のα−１，４結合を切断し、その非還元末端側のフラグメント（アミノ糖含有フラグメント）を受容体分子（ここでは糖質もしくは配糖体）に転移する。
還元末端に結合させる物質の例としては、単糖、非還元性糖質類、生体適合性高分子、リポソーム構成成分、配糖体、アミン基含有低分子量物質が挙げられる。
単糖類の例としては、Ｎ−アセチルグルコサミン、グルコン酸などの官能基を有する単糖類が挙げられる。非還元性糖質類の例としては、ソルビトール、スクロース、およびトレハロースが挙げられる。生体適合性高分子の例としては、アミロース、デキストリン、デンプン、セルロース、キチン、キトサン、デキストラン、タンパク質、及びペプチドが挙げられる。リポソーム構成成分の例としては、リン脂質、脂肪酸、及び界面活性剤が挙げられる。配糖体の例としては、アスコルビン酸グルコシド、ハイドロキノングルコシド、ヘスペリジングルコシド、ルチングルコシド、パラニトロフェニルマルトペンタオース、ドデシルマルトース、フラボノイド配糖体類、テルペン配糖体類、フェノール配糖体類、カルコン配糖体類、及びステロイド配糖体類が挙げられる。アミノ基含有低分子量物質の例としては、各種アミノ酸、ドデシルアミン、などが挙げられる。
アミノ糖含有グルカン又はその修飾物のアミノ糖残基のアミノ基に別の物質を結合させる実施形態については以下の「３」に詳述する。
（３．アミノ糖含有グルカン及びその修飾物の利用）
本発明のアミノ糖含有グルカン及びその修飾物は、グルカンの非還元末端にアミノ糖残基が結合しているため、非還元末端にアミノ基を有しており、その結果、水溶液中でグルカンを正に帯電させることができる。たとえばグルカンの非還元末端に多数のアミノ糖が結合している本発明のアミノ糖含有グルカン及びその修飾物は、溶媒のｐＨを変化させることにより、非還元末端のアミノ糖のアミノ基がＮＨ３＋になった状態と、ＮＨ２のままの状態とを作り出すことが出来る。非還元末端のアミノ糖残基のアミノ基が解離した状態では、静電反発により、アミノ糖含有グルカン、その修飾物及びそれらの結合体は伸びきった構造となり、非解離の状態ではアミノ糖含有グルカン及びその修飾物は収縮した状態となると考えられる。このようなｐＨ依存的な多糖ミクロゲルのコンホメーション変化は、医薬品デリバリーへの利用が可能である。
本発明のアミノ糖含有グルカン及びその修飾物は、非還元末端に反応性基であるアミノ基を有する。このためこのアミノ基を介して、別の物質（例えば、薬効成分）にグルカン鎖を直接的にまたは適切なスペーサーを介して間接的に結合させることが出来る。その結果、当該物質の物性を改変したり、当該物質に対して機能を付与したりすることが可能である。ここで言う別の物質とは、低分子量有機化合物、高分子有機化合物、ＤＤＳ用ナノ粒子状キャリア（高分子ミセル、ウイルス粒子、リポソームなど）、無機物質（例えば、磁性微粒子）のいずれでもかまわない。別の物質は好ましくは薬効成分であり、より好ましくは水溶液中で負に帯電する薬効成分である。たとえば本発明のアミノ糖含有グルカン及びその修飾物は、カルボジイミドなどの適当な縮合剤の存在下、カルボキシル基を有する物質と反応させることにより、カルボキシル基を有する物質に容易に結合させることが出来る。カルボキシル基を有する物質がペプチド、タンパク質などの薬効成分の場合、得られる化合物は、アミノ糖含有グルカン又はその修飾物と薬効成分とが直接的に結合した結合体である。あるいは、薬効成分をアミノ糖含有グルカン又はその修飾物にスペーサーを介して結合させることができる。この場合、アミノ糖含有グルカン又はその修飾物のアミノ基に、アミノ基及び薬効成分との結合に利用可能な官能基を有する化合物を結合させることができる。薬効成分などとの結合のためにアミノ基に別の化合物を結合させることを「アミノ基の修飾」という。グルカン鎖の付与による物性の改変効果としては、水溶性の改善、水和層形成による生体親和性の付与などが期待できる。
アミノ基の修飾には、カルボキシル基と別の官能基とを有する修飾試薬を使用することができる。本明細書中では、アミノ糖含有グルカン及びアミノ糖含有グルカン修飾物のアミノ基の修飾に使用されるカルボキシル基を有する物質を「アミノ基修飾試薬」ともいう。アミノ基修飾試薬は、少なくとも１つのカルボキシル基および少なくとも１つの別の官能基を有する。この官能基の例としては、カチオン性官能基、アニオン性官能基、疎水性基、マレイミド基、チオール基及びアルデヒド基が挙げられる。カチオン性官能基の例としては、アミノ基、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、トリメチルアミノ基、アンモニウム基、ピリジニウム基が挙げられる。カチオン性官能基を有する修飾試薬の例としては、３−アミノ−２，５−ジクロロ安息香酸が挙げられる。アニオン性官能基の例としては、リン酸基、スルホン酸基、カルボキシル基、硫酸基が挙げられる。アニオン性官能基を有する修飾試薬の例としては、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、フタル酸およびクエン酸が挙げられる。疎水性基の例としては、ステアリル基、パルミチル基、メチル基、プロピル基、ブチル基等のアルキル基、フェニル基、ベンジル基、トリル基等のアリール基が挙げられる。疎水性基を有する修飾試薬の例としては、ステアリン酸、安息香酸、ケイ皮酸が挙げられる。マレイミド基を有する修飾試薬の例としては、Ｎ−（４−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミドが挙げられる。チオール基は、メルカプト基とも呼ばれる。チオール基を有する修飾試薬の例としては、チオグリコール酸、メルカプト安息香酸が挙げられる。アルデヒド基の例としては、飽和非環式アルデヒド基、不飽和非環式アルデヒド基、飽和脂環式アルデヒド基、芳香族アルデヒド基が挙げられる。アルデヒド基を有する修飾試薬の例としては、２‐カルボキシベンズアルデヒドが挙げられる。
例えば、カルボキシル基を有する物質がアルギン酸やヒアルロン酸などのウロン酸を含む多糖の場合には、本発明のアミノ糖含有グルカンを主鎖に対し多数グラフト化する（すなわち、結合させる）ことが可能となり、ウロン酸含有多糖の物性を大きく変化させることが出来る。この場合、アミノ糖含有グルカン又はその修飾物とウロン酸含有多糖との結合体が形成される。この結合体においては、アミノ糖含有グルカン又はその修飾物とウロン酸含有多糖とが直接結合している。特定の実施形態では、本発明のアミノ糖含有グルカンには、ウロン酸残基が結合していない。
また、カルボキシル基を有する物質がリン脂質の場合には、本発明のアミノ糖含有グルカン又はその修飾物が結合したリン脂質を得ることが出来る。このようなリン脂質を、アミノ糖含有グルカン又はその修飾物とリン脂質との結合体ともいう。この結合体においては、アミノ糖含有グルカン又はその修飾物とリン脂質とが直接結合している。このようなグルカン結合リン脂質を用いてリポソームを製造することにより、医薬品のデリバリーに利用可能なグルカン鎖結合リポソームを容易に得ることが出来る。
カルボキシル基を有する物質がタンパク質又はペプチドなどのタンパク質性薬効成分の場合には、グルカン鎖が結合したタンパク質又はペプチドなどのタンパク質性薬効成分を得ることが出来る。このようなタンパク質又はペプチドを、アミノ糖含有グルカン又はその修飾物とタンパク質又はペプチドとの結合体ともいう。この結合体においては、アミノ糖含有グルカン又はその修飾物とタンパク質又はペプチドとが直接結合している。この技術はタンパク性薬効成分（医薬品）の体内動態の改良に利用することが出来る。
カルボキシル基を有する物質が磁性微粒子である場合には、グルカン鎖が結合した磁性微粒子を得ることが出来、これは臨床診断用造影剤として利用できる。この場合、アミノ糖含有グルカン又はその修飾物と磁性微粒子との結合体が形成される。この結合体においては、アミノ糖含有グルカン又はその修飾物と磁性微粒子とが直接結合している。
カルボキシル基を有する物質が金属配位子（キレート剤）である場合には、グルカン鎖が結合した金属配位子を得ることが出来、これは放射性金属元素を配位することにより、臨床診断用造影剤として利用できる。この場合、アミノ糖含有グルカン又はその修飾物と金属配位子との結合体が形成される。この結合体においては、アミノ糖含有グルカン又はその修飾物と金属配位子とが直接結合している。
本発明のアミノ糖含有グルカンは、非還元末端に反応性基であるアミノ基を有する。アミノ基は中性条件下、水溶液中で正電荷を帯びる。一方、このアミノ基を化学的に修飾することにより、アニオン性官能基又は疎水性基を、グルカンの末端に導入することが出来る。一方、本発明のグルカン部分には様々な構造や分子量のグルカンが利用できる。これら技術を組み合わせると、例えば、タンパク質を包み込むことが出来る程度の分子量の分岐グルカンの末端に、カチオン性官能基、アニオン性官能基、疎水性基などをコントロールして導入することが出来る。このような修飾グルカンの末端はフレキシブルに移動することが可能で、タンパク質表面に存在する電荷を帯びた部分と静電的相互作用を、疎水性領域と、疎水性相互作用を行い、結果として本発明のグルカンは、タンパク質と非共有結合によるコンプレックスを形成する。従って、本発明のアミノ糖含有グルカン又はその修飾物とタンパク質、ペプチドなどとを溶液中で混合することにより、本発明のアミノ糖含有グルカン又はその修飾物とタンパク質、ペプチドなどとのコンプレックスを形成することができる。同様に、核酸、リポソーム、ウイルス粒子、高分子ミセル、低分子量化合物と効果的に非共有結合的なコンプレックス形成ができるグルカンの末端構造を設計することも出来る。このように、本発明のグルカン及びその末端誘導体は、タンパク質、核酸、低分子量化合物、又はＤＤＳ用ナノ粒子状キャリア（例えば、リポソーム、高分子ミセル、ウイルス粒子）と効果的にコンプレックスを形成し、これらの安定化、物性、吸収性、体内動態（例えば、臓器集積性、組織ターゲティング特性、血中滞留性）などに影響を与えることが出来る。このように本発明のグルカンは、医薬品の薬効成分のＤＤＳキャリアとして、またＤＤＳ用ナノ粒子状キャリアの改質剤として有効に利用できる。
本発明のアミノ糖含有グルカンを、医薬品の薬効成分の改質材料として利用する場合には、体内での改質材料の分解を制御する必要がある。グルカンが直鎖状α−１，４−グルカンである場合、α−アミラーゼによりすみやかな分解を受け、体内での存在時間が短くなりすぎる場合がある。このような場合、改質材料としての目的を果たすことが出来ない可能性がある。そこで、グルカンを構成するグルコースの水酸基の一部又はすべてを修飾することにより、分解に要する時間をコントロールすることが出来る。このようなアミノ糖含有グルカンの水酸基修飾物は本発明において好ましい。修飾は、エーテル化又はエステル化である。エーテル化は好ましくはハロゲン化アルキルまたはアルコールとのエーテル化である。エーテル化に使用されるハロゲン化アルキルまたはアルコールの炭素原子数は好ましくは１〜１０であり、より好ましくは１〜５であり、さらに好ましくは１〜３である。ハロゲン基は好ましくはフルオロ、クロロ、ブロモまたはヨードであり得る。エステル化は好ましくはカルボン酸またはハロゲン化アシルとのエステル化である。エステル化に使用されるカルボン酸またはハロゲン化アシルの炭素原子数は好ましくは１〜１０であり、より好ましくは１〜５である。修飾は望ましくはエステル化である。エステル化はより好ましくはアシル化であり、さらに好ましくはアセチル化である。
このように本発明のアミノ糖含有グルカン及びその修飾物及びそれらの結合体（好ましくはアミノ糖含有グルカン及びその修飾物及びそれらの結合体）は、グルカンの構造とその非還元末端の構造が自在に設計でき、これを利用することにより、医薬品の薬効成分の体内動態を自在にコントロールできる。体内で完全に分解可能な構造であり、蓄積による毒性を懸念することなく、安全に利用できる医薬品の薬効成分の改質材料である。
従って、本発明によれば、本発明のアミノ糖含有グルカン又はその修飾物（好ましくはアミノ糖含有グルカン及びその修飾物）と、薬効成分とを含む、医薬品が提供される。本発明の医薬品においては、薬効成分は、好ましくは、低分子量有機化合物、タンパク質、ペプチド、抗体、抗体フラグメント、受容体、受容体フラグメント、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびＲＮＡアプタマー、ならびに、これらの修飾物からなる群より選択される。薬効成分の修飾の例としては、たとえば、官能基の付与（リン酸化、カルボキシル化、アミド化など）が挙げられる。核酸の修飾の例としては、アミノ化、チオール化、ホスホロチオエート化、グリセリル化、およびカチオン性を付与する化学修飾（例えば、アミノ基などのカチオン基の導入）が挙げられる。
本発明の特定の実施形態によれば、本発明のアミノ糖含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、又はそれらのアミノ基修飾物と、薬効成分との結合体であって、該薬効成分は、前記アミノ糖残基のアミノ基のうちの少なくとも１つと、直接共有結合しているか、又はスペーサーを介して結合している、結合体が提供される。該薬効成分は好ましくは、低分子量有機化合物、タンパク質、ペプチド、抗体、抗体フラグメント、受容体、受容体フラグメント、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびＲＮＡアプタマー、ならびに、これらの修飾物からなる群より選択される。
特定の実施形態によれば、本発明によれば、本発明のアミノ糖含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、それらのアミノ基修飾物又はそれらの非還元末端修飾物（好ましくはグルコサミン含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、それらのアミノ基修飾物又はそれらの非還元末端修飾物）を含む、臨床診断用組成物が提供される。
本発明の特定の実施形態によれば、本発明のアミノ糖含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、又はそれらのアミノ基修飾物（好ましくはアミノ糖含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、又はそれらのアミノ基修飾物）を含む、ＤＤＳ用ナノ粒子状キャリアが提供される。このＤＤＳ用ナノ粒子状キャリアは、好ましくは、リポソーム、ウイルス粒子、高分子ミセルおよび疎水化高分子ナノゲルからなる群より選択される。
本発明によれば、核酸、リポソーム、ウイルス粒子、高分子ミセル、および低分子量化合物と効果的に非共有結合的なコンプレックス形成ができるグルカンの末端構造を設計することが出来る。このように、本発明のアミノ基含有グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物又はそれらのアミノ基修飾物は、タンパク質、核酸、低分子量化合物、又はＤＤＳ用ナノ粒子状キャリア（例えば、リポソーム、高分子ミセル、およびウイルス粒子）と効果的にコンプレックスを形成し、これらの安定化、物性、吸収性、体内動態（例えば、臓器集積性、組織ターゲティング特性、血中滞留性）などに影響を与えることが出来る。このように本発明のアミノ基含有グルカンおよびその修飾物は、医薬品の薬効成分のＤＤＳキャリアとして、またＤＤＳ用ナノ粒子状キャリアの改質剤として有効に利用できる。
従って、本発明によれば、本発明のアミノ糖含有グルカン又はその修飾物（好ましくはグルコサミン含有グルカン及びその修飾物）と、薬効成分とを含む、医薬品が提供される。本発明の医薬品においては、薬効成分は、好ましくは、低分子量有機化合物、タンパク質、ペプチド、抗体、抗体フラグメント、受容体、受容体フラグメント、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびＲＮＡアプタマー、ならびに、これらの修飾物からなる群より選択される。
（４．本発明のアミノ糖含有グルカン及びその修飾物及びそれらの結合体）
本明細書中では、グルカンの少なくとも１つの非還元末端のそれぞれに少なくとも１つのアミノ単糖残基がα−１，４結合しているがグルカンの非還元末端以外の位置にはアミノ糖残基が存在しないグルカンを「アミノ糖含有グルカン」という。なお、グルカンの１つの末端に２つ以上のアミノ単糖が結合する場合、グルカンの１つの末端に１つのアミノ単糖が結合し、そのアミノ単糖の末端に次のアミノ単糖が結合した構造になる。本明細書中では、グルカンの少なくとも１つの非還元末端にそれぞれ少なくとも１つのグルコサミン残基がα−１，４結合しているが非還元末端以外の位置にはグルコサミン残基が存在しないグルカンを「グルコサミン含有グルカン」という。
本明細書中では、グルカンの特定の非還元末端に対して、それぞれα−１，４結合で連結された２つ以上のアミノ単糖残基からなる糖鎖が結合していて、グルカン中の非還元末端以外の位置にはアミノ糖残基が存在していない場合も、非還元末端のみにアミノ糖残基が結合していて、非還元末端以外の位置にはアミノ糖残基が存在しないとみなす。
本発明のアミノ糖含有グルカンは、グルカンの少なくとも１つの非還元末端のそれぞれに少なくとも１つのアミノ単糖残基がα−１，４結合しているが、該グルカンの非還元末端以外の位置にはアミノ糖残基が存在しないアミノ糖含有グルカンであって、該グルカンが分岐状α−１，４グルカンまたは直鎖状α−１，４グルカンである。
本発明のアミノ糖含有グルカンは、好ましくはグルコサミン含有グルカンであり、より好ましくはグルコサミン含有直鎖状グルカンまたはグルコサミン含有分岐状グルカンである。アミノ糖含有グルカンのグルカン部分が直鎖状グルカンの場合、非還元末端は１つなので、その非還元末端に少なくとも１つのアミノ単糖残基がα−１，４結合している。アミノ糖含有グルカンのうちのグルカン部分が分岐状グルカンの場合、非還元末端は２つ以上あるので、そのうちの１つ以上の非還元末端に少なくとも１つのアミノ単糖残基がα−１，４結合している。１つの実施形態では、本発明のグルコサミン含有分岐グルカンは、分岐グルカンの複数の非還元末端のうちの１つ以上の非還元末端に少なくとも１つのグルコサミン残基がα−１，４結合しているが、非還元末端以外の位置にはグルコサミン残基が存在しないグルコサミン含有分岐グルカンである。
本発明のアミノ糖含有グルカンにおいて非還元末端以外の位置にはグルコサミン残基が存在しないことは、例えば、アミノ糖含有グルカンをα−アミラーゼ処理することにより確認することができる。α−アミラーゼはα−１，４グルカンに作用してマルトースとグルコースを生じるが、アミノ糖化されたα−１，４グルカン鎖のアミノ糖とグルコースと間のグリコシド結合は分解できない。そのため、アミノ糖含有グルカンは、α−アミラーゼ処理に抵抗性を示す。非還元末端にアミノ糖残基を含むグルカンはα−アミラーゼ処理することにより、マルトースとグルコースを生じ、かつアミノ糖を含むマルトトリオースが検出されることにより確認することができる。
（４．１）アミノ糖残基が結合した分岐状グルカン、その修飾物及びそれらの結合体
本発明のアミノ糖含有グルカンに含まれるグルカン部分が分岐状α−１，４グルカンである場合、アミノ糖含有グルカンは、この分岐状α−１，４グルカンが有する複数の非還元末端のうちの少なくとも１つに少なくとも１つのアミノ単糖残基がα−１，４結合している。本発明によれば、少なくとも１つの非還元末端に少なくとも１つのアミノ単糖残基がα−１，４結合した分岐状グルカンの修飾物もまた提供される。本発明によれば、少なくとも１つの非還元末端に少なくとも１つのアミノ単糖残基がα−１，４結合した分岐状グルカン又はその修飾物の結合体もまた提供される。修飾物の修飾については上記に詳述したとおりである。結合体で結合する物質についても上記に詳述したとおりである。
本発明のアミノ糖含有分岐状グルカン、その修飾物及びそれらの結合体に含まれる分岐状グルカン部分は、好ましくはデンプン、アミロペクチン、グリコーゲン、デキストリン、酵素合成分岐グルカン及び高度分岐環状グルカンからなる群より選択される。これらの分岐状グルカン部分の好適な範囲については、「（１．１）グルカンおよびグルカンの修飾物」において説明したとおりである。
本発明のアミノ糖含有分岐状グルカンの分子量は、好ましくは約５×１０３以上であり、より好ましくは約１×１０４以上であり、さらに好ましくは約５×１０４以上である。本発明のアミノ糖含有分岐状グルカンの分子量は、好ましくは約１×１０９以下であり、より好ましくは約３×１０８以下であり、さらに好ましくは約１×１０８以下である。
本発明のアミノ糖含有分岐状グルカンの修飾物の分子量は、好ましくは約５×１０３以上であり、より好ましくは約１×１０４以上であり、さらに好ましくは約５×１０４以上である。本発明のアミノ糖含有分岐状グルカンの修飾物の分子量は、好ましくは約１×１０９以下であり、より好ましくは約３×１０８以下であり、さらに好ましくは約１×１０８以下である。
本発明の結合体においては、上記のような好適な分子量のアミノ糖含有分岐状グルカンに対して他の物質（例えば、標的性分子、薬効成分など）が結合していることが好ましい。
本発明においては、アミノ糖含有分岐状グルカン修飾物が好ましい。修飾はアシル化またはエーテル化であることが好ましく、アセチル化がより好ましい。アシル化度は、好ましくは約０．１以上であり、さらに好ましくは約０．２以上であり、特に好ましくは約０．３以上である。アシル化度は、アルカリ条件下での加熱により遊離する酢酸の定量によって計算される。エーテル化度は、好ましくは約０．１以上であり、さらに好ましくは約０．２以上であり、特に好ましくは約０．３以上である。エーテル化度は、ＮＭＲによって計算される。
本発明のアミノ糖含有分岐状グルカン、その修飾物及びそれらの結合体に結合しているアミノ単糖残基の数は、１分子あたり、好ましくは１個以上であり、より好ましくは２個以上であり、さらに好ましくは３個以上である。本発明のアミノ糖含有分岐状グルカン又はその修飾物に結合しているアミノ単糖残基の数は、これらに限定されず、例えば、１分子あたり、５個以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、５０個以上、１００個以上などであってもよい。目的により適切に調整され得る。本発明のアミノ糖含有分岐状グルカン又はその修飾物に結合しているアミノ単糖残基の数の上限は、分岐状グルカン部分の非還元末端の数である。本発明のアミノ糖含有分岐状グルカン又はその修飾物に結合しているアミノ単糖残基の数は、例えば、１分子あたり、約１０００個以下、約８００個以下、約７００個以下、約６００個以下、約５００個以下、約４００個以下、約３００個以下、約２００個以下、約１００個以下、約５０個以下などであり得る。
特定の実施形態では、本発明のアミノ糖含有分岐状グルカン、その修飾物及びそれらの結合体に結合しているアミノ単糖残基の数は、分岐状グルカン部分が有する非還元末端の数の好ましくは約１０％以上であり、より好ましくは約２０％以上であり、特に好ましくは約３０％以上であり、例えば、約４０％以上、約５０％以上または約６０％以上であり得る。特定の実施形態では、本発明のアミノ糖含有分岐状グルカン、その修飾物及びそれらの結合体に結合しているアミノ単糖残基の数は、分岐状グルカン部分が有する非還元末端の数の好ましくは約１００％以下であり、より好ましくは約９０％以下であり、特に好ましくは約８０％以下であり、例えば、約７０％以下、約６０％以下または約５０％以下であり得る。
（４．２）アミノ糖残基が結合した直鎖状グルカン、その修飾物及びそれらの結合体
本発明のアミノ糖含有直鎖状グルカンは、直鎖状グルカン部分の非還元末端に少なくとも１つのアミノ単糖残基がα−１，４結合している。直鎖状グルカンは非還元末端を１つしか有さないので、アミノ単糖とグルカンとの反応時に反応液に添加するアミノ単糖の量が少なければ、本発明のアミノ糖含有直鎖状グルカンは、アミノ単糖残基を１つしか含まない。アミノ単糖とグルカンとの反応時に反応液に添加するアミノ単糖の量が多い場合、α−１，４結合で結合した２つ以上のアミノ単糖が直鎖状グルカンの非還元末端に結合する場合もある。本発明によれば、少なくとも１つのアミノ単糖残基がα−１，４結合した直鎖状グルカンの修飾物もまた提供される。本発明によれば、少なくとも１つのアミノ単糖残基がα−１，４結合した直鎖状グルカン又はその修飾物の結合体もまた提供される。修飾物の修飾については上記に詳述したとおりである。結合体においてアミノ糖含有グルカンまたはその修飾物に結合している物質についても上記に詳述したとおりである。
本発明のアミノ糖含有直鎖状グルカン又はその修飾物に含まれる直鎖状グルカン部分は、好ましくはアミロース（例えば、天然のアミロースまたは酵素合成アミロース）及びそれらの誘導体からなる群より選択される。これらの直鎖状グルカン部分の好適な範囲については、「（１．１）グルカンおよびグルカンの修飾物」において説明したとおりである。
本発明のアミノ糖含有直鎖状グルカンの分子量は、例えば約１×１０３以上であり、好ましくは約１．５×１０３以上であり、より好ましくは約２×１０３以上であり、さらに好ましくは約３×１０３以上である。本発明のアミノ糖含有直鎖状グルカンの分子量は、例えば約１×１０７以下であり、好ましくは約２×１０５以下であり、より好ましくは約１．５×１０５以下であり、さらに好ましくは約１×１０５以下である。
本発明のアミノ糖含有直鎖状グルカンの修飾物の分子量は、例えば約１×１０３以上であり、好ましくは約１．５×１０３以上であり、より好ましくは約２×１０３以上であり、さらに好ましくは約３×１０３以上である。本発明のアミノ糖含有直鎖状グルカンの修飾物の分子量は、例えば約１×１０７以下であり、好ましくは約２×１０５以下であり、より好ましくは約１．５×１０５以下であり、さらに好ましくは約１×１０５以下である。
本発明の結合体においては、上記のような好適な分子量のアミノ糖含有直鎖状グルカンまたはその修飾物に対して他の物質（例えば、標的性分子、薬効成分など）が結合していることが好ましい。
本発明においては、アミノ糖含有直鎖状グルカンの修飾物が好ましい。修飾は、アシル化またはエーテル化であることが好ましく、アセチル化がより好ましい。アシル化度は、好ましくは約０．１以上であり、さらに好ましくは約０．２以上であり、特に好ましくは約０．３以上である。アシル化度は、アルカリ条件下での加熱により遊離する酢酸の定量によって計算される。エーテル化度は、好ましくは約０．１以上であり、さらに好ましくは約０．２以上であり、特に好ましくは約０．３以上である。エーテル化度は、ＮＭＲによって計算される。
本発明のグルコサミン含有直鎖状グルカンの例は、例えば以下の式１の構造によって示され得る：
ここでｎは１以上の整数である。ｎは好ましくは約８以上であり、より好ましくは約９以上であり、さらに好ましくは約１０以上である。ｎは好ましくは約１２００以下であり、より好ましくは約９００以下であり、さらに好ましくは約６００以下である。
本発明のグルコサミン含有直鎖状グルカンおよびその還元末端修飾物の例は、例えば以下の式２によって示され得る：
ここでｎは１以上の整数である。ｎは好ましくは約８以上であり、より好ましくは約９以上であり、さらに好ましくは約１０以上である。ｎは好ましくは約１２００以下であり、より好ましくは約９００以下であり、さらに好ましくは約６００以下である。Ｘは、水素、単糖、非還元性糖質類、生体適合性高分子、リポソーム構成成分、配糖体およびアミン基含有低分子量物質からなる群より選択される。Ｘは、好ましくは、水素、グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、グルコン酸、ソルビトール、スクロース、トレハロース、デキストリン、アミロース、デンプン、セルロース、キチン、キトサン、デキストラン、タンパク質、ペプチド、リン脂質、脂肪酸、界面活性剤、アスコルビン酸グルコシド、ハイドロキノングルコシド、ヘスペリジングルコシド、ルチングルコシド、パラニトロフェニルマルトペンタオース、ドデシルマルトース、フラボノイド配糖体類、テルペン配糖体類、フェノール配糖体類、カルコン配糖体類、ステロイド配糖体類、アミノ酸及びドデシルアミンからなる群より選択される。Ｘが水素の場合、この分子はグルコサミン含有直鎖状グルカンであり、Ｘが水素以外の物質である場合、この分子はグルコサミン含有直鎖状グルカン還元末端修飾物である。
本発明のグルコサミン含有直鎖状グルカン、グルコサミン含有直鎖状グルカン水酸基修飾物およびその還元末端修飾物の例は、例えば以下の式３によって示され得る：
ここでｎは１以上の整数である。ｎは好ましくは約８以上であり、より好ましくは約９以上であり、さらに好ましくは約１０以上である。ｎは好ましくは約１２００以下であり、より好ましくは約９００以下であり、さらに好ましくは約６００以下である。Ｘは、好ましくは、水素、単糖、非還元性糖質類、生体適合性高分子、リポソーム構成成分、配糖体およびアミン基含有低分子量物質からなる群より選択される。Ｘは、より好ましくは、水素、グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、グルコン酸、ソルビトール、スクロース、トレハロース、デキストリン、アミロース、セルロース、キチン、キトサン、デキストラン、タンパク質、ペプチド、リン脂質、脂肪酸、界面活性剤、アスコルビン酸グルコシド、ハイドロキノングルコシド、ヘスペリジングルコシド、ルチングルコシド、パラニトロフェニルマルトペンタオース、ドデシルマルトース、フラボノイド配糖体類、テルペン配糖体類、フェノール配糖体類、カルコン配糖体類、ステロイド配糖体類、アミノ酸及びドデシルアミンからなる群より選択される。ここで、Ｒは、好ましくは、水素、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基およびリン酸基からなる群より独立して選択される。Ｘおよび全てのＲが水素の場合、この分子はグルコサミン含有直鎖状グルカンであり；Ｘが水素であってＲがそれぞれ独立して水素または他の基であるがただし少なくとも１つのＲが水素以外の基である場合、この分子はグルコサミン含有直鎖状グルカンの水酸基修飾物であり；Ｘが水素以外の物質であって全てのＲが水素である場合、この分子はグルコサミン含有直鎖状グルカン還元末端修飾物であり；Ｘが水素以外の物質であってＲがそれぞれ独立して水素または他の基であるがただし少なくとも１つのＲが水素以外の基である場合、この分子はグルコサミン含有直鎖状グルカン水酸基修飾物の還元末端修飾物である。
本発明のグルコサミン含有直鎖状グルカン、グルコサミン含有直鎖状グルカン水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物およびそれらのアミノ基修飾物の例は、例えば以下の式４によって示され得る：
ここでｎは１以上の整数である。ｎは好ましくは約８以上であり、より好ましくは約９以上であり、さらに好ましくは約１０以上である。ｎは好ましくは約１２００以下であり、より好ましくは約９００以下であり、さらに好ましくは約６００以下である。Ｘは、水素、単糖、非還元性糖質類、生体適合性高分子、リポソーム構成成分、配糖体およびアミン基含有低分子量物質からなる群より選択される。Ｘは、好ましくは、水素、グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、グルコン酸、ソルビトール、スクロース、トレハロース、デキストリン、アミロース、デンプン、セルロース、キチン、キトサン、デキストラン、タンパク質、ペプチド、リン脂質、脂肪酸、界面活性剤、アスコルビン酸グルコシド、ハイドロキノングルコシド、ヘスペリジングルコシド、ルチングルコシド、パラニトロフェニルマルトペンタオース、ドデシルマルトース、フラボノイド配糖体類、テルペン配糖体類、フェノール配糖体類、カルコン配糖体類、ステロイド配糖体類、アミノ酸及びドデシルアミンからなる群より選択される。ここで、Ｒは、好ましくは、水素、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基およびリン酸基からなる群より独立して選択される。ここで、Ｙは、好ましくは、アミノ基、アニオン性置換基、疎水性置換基、マレイミド基含有置換基およびスクシンイミド基含有置換基からなる群より選択される。Ｘおよび全てのＲが水素であってＹがアミノ基である場合、この分子はグルコサミン含有直鎖状グルカンであり；Ｘおよび全てのＲが水素であってＹがアミノ基以外の基（すなわち、アニオン置換基、疎水性置換基、マレイミド基含有置換基またはスクシンイミド基含有置換基）である場合、この分子はグルコサミン含有直鎖状グルカンのアミノ基修飾物であり；Ｘが水素であってＲがそれぞれ独立して水素または他の基であるがただし少なくとも１つのＲが水素以外の基であってＹがアミノ基である場合、この分子はグルコサミン含有直鎖状グルカンの水酸基修飾物であり；Ｘが水素であってＲがそれぞれ独立して水素または他の基であるがただし少なくとも１つのＲが水素以外の基であってＹがアミノ基以外の基（すなわち、カチオン性置換基、疎水性置換基、マレイミド基含有置換基またはスクシンイミド基含有置換基）である場合、この分子はグルコサミン含有直鎖状グルカンの修飾物の水酸基修飾物のアミノ基修飾物であり；Ｘが水素以外の物質であって全てのＲが水素であってＹがアミノ基である場合、この分子はグルコサミン含有直鎖状グルカン還元末端修飾物であり；Ｘが水素以外の物質であって全てのＲが水素であってＹがアミノ基以外の基（すなわち、アニオン性置換基、疎水性置換基またはマレイミド基含有置換基）である場合、この分子はグルコサミン含有直鎖状グルカンアミノ基修飾物の還元末端修飾物であり；Ｘが水素以外の物質であってＲがそれぞれ独立して水素または他の基であるがただし少なくとも１つのＲが水素以外の基であってＹがアミノ基である場合、この分子はグルコサミン含有直鎖状グルカン水酸基修飾物の還元末端修飾物であり；Ｘが水素以外の物質であってＲが独立して水素または他の基であるがただし少なくとも１つのＲが水素以外の基であってＹがアミノ基以外の基（すなわち、アニオン性置換基、疎水性置換基またはマレイミド基含有置換基）である場合、この分子はグルコサミン含有直鎖状グルカン水酸基修飾物のアミノ基修飾物である。
本発明のグルコサミン含有グルカンの例は、例えば以下の式５によって示され得る：
ここでｍは１以上の整数である。ｍは好ましくは８以上であり、より好ましくは９以上であり、さらに好ましくは１０以上であり、ｍは好ましくは約１×１０４以下であり、より好ましくは約１０００以下であり、さらに好ましくは約７００以下である。Ｒ１は独立して、Ｈ、式Ａの構造を有するグルカン鎖または式Ｂの構造を有するグルカン鎖である。全てのＲ１がＨの場合、式５に示されるグルカンは直鎖状グルカンである。少なくとも１つのＲ１が式Ａまたは式Ｂの構造を有する場合、式５に示されるグルカンは分岐状グルカンである。
式Ａにおいて、ｋは１以上の整数である。ｋは好ましくは８以上であり、より好ましくは９以上であり、さらに好ましくは１０以上であり、ｋは好ましくは約１×１０４以下であり、より好ましくは約１０００以下であり、さらに好ましくは約７００以下である。式Ａにおいて、Ｒ２はそれぞれ独立して、Ｈ、式Ａの構造を有するグルカン鎖または式Ｂの構造を有するグルカン鎖である。
式Ｂにおいて、ｓは１以上の整数である。ｓは好ましくは８以上であり、より好ましくは９以上であり、さらに好ましくは１０以上であり、ｓは好ましくは約１×１０４以下であり、より好ましくは約１０００以下であり、さらに好ましくは約７００以下である。式Ｂにおいて、Ｒ３は独立して、Ｈ、式Ａの構造を有するグルカン鎖または式Ｂの構造を有するグルカン鎖である。
上記で説明したように、式５において、Ｒ１は、式Ａの構造を有する基のＲ２または式Ｂの構造を有する基のＲ３の位置において何度か式Ａの構造を有する基または式Ｂの構造を有する基によって置換された構造を有し得る。式Ａと式Ｂで置換された回数の合計は、式５で表された分岐グルカン分子の単位鎖数に等しい。分岐グルカン分子の単位鎖数は、好ましくは１以上であり、より好ましくは２以上であり、さらに好ましくは３以上である。分岐グルカン分子の単位鎖数は、好ましくは約５×１０３以下であり、より好ましくは約２×１０３以下であり、さらに好ましくは約１×１０３以下である。
本発明のグルコサミン含有グルカン又はグルコサミン含有グルカン水酸基修飾物の例は、例えば以下の式６によって示され得る：
ここでｍは１以上の整数である。ｍは好ましくは８以上であり、より好ましくは９以上であり、さらに好ましくは１０以上であり、ｍは好ましくは約１×１０４以下であり、より好ましくは約１０００以下であり、さらに好ましくは約７００以下である。Ｒ１は独立して、Ｈ、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基、式６Ａの構造を有するグルカン鎖または式６Ｂの構造を有するグルカン鎖である。
式６Ａにおいて、ｋは１以上の整数である。ｋは好ましくは８以上であり、より好ましくは９以上であり、さらに好ましくは１０以上であり、ｋは好ましくは約１×１０４以下であり、より好ましくは約１０００以下であり、さらに好ましくは約７００以下である。式６Ａにおいて、Ｒ２はそれぞれ独立して、Ｈ、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基、式６Ａの構造を有するグルカン鎖または式６Ｂの構造を有するグルカン鎖である。
式６Ｂにおいて、ｓは１以上の整数である。ｓは好ましくは８以上であり、より好ましくは９以上であり、さらに好ましくは１０以上であり、ｓは好ましくは約１×１０４以下であり、より好ましくは約１０００以下であり、さらに好ましくは約７００以下である。式６Ｂにおいて、Ｒ３は独立して、Ｈ、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基およびリン酸基、式６Ａの構造を有するグルカン鎖または式６Ｂの構造を有するグルカン鎖である。
式６、式６Ａおよび式６Ｂにおいて、Ｒ４は、Ｈ、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基からなる群から独立して選択される。
本発明のグルコサミン含有グルカン、グルコサミン含有グルカン水酸基修飾物およびそれらの還元末端修飾物の例は、例えば以下の式７によって示され得る：
ここでｍは１以上の整数である。ｍは好ましくは８以上であり、より好ましくは９以上であり、さらに好ましくは１０以上であり、ｍは好ましくは約１×１０４以下であり、より好ましくは約１０００以下であり、さらに好ましくは約７００以下である。Ｒ１は独立して、Ｈ、式６Ａの構造を有するグルカン鎖または式６Ｂの構造を有するグルカン鎖である。式６Ａおよび式６Ｂについては、上記式６についての定義と同様である。
式７、式６Ａおよび式６Ｂにおいて、Ｒ４は、水素、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基およびリン酸基からなる群から独立して選択され、
式７において、Ｘは、好ましくは、単糖、非還元性糖質類、生体適合性高分子、リポソーム構成成分、配糖体およびアミノ基含有低分子量物質からなる群より独立して選択される。Ｘは、より好ましくは、水素、グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、グルコン酸、ソルビトール、スクロース、トレハロース、デキストリン、アミロース、デンプン、セルロース、キチン、キトサン、デキストラン、タンパク質、ペプチド、リン脂質、脂肪酸、界面活性剤、アスコルビン酸グルコシド、ハイドロキノングルコシド、ヘスペリジングルコシド、ルチングルコシド、パラニトロフェニルマルトペンタオース、ドデシルマルトース、フラボノイド配糖体類、テルペン配糖体類、フェノール配糖体類、カルコン配糖体類、ステロイド配糖体類、アミノ酸及びドデシルアミンからなる群より選択される。
本発明のグルコサミン含有グルカン、グルコサミン含有グルカン水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、又はそれらのアミノ基修飾物の例は、例えば以下の式８によって示され得る：
ここでｍは１以上の整数である。ｍは好ましくは８以上であり、より好ましくは９以上であり、さらに好ましくは１０以上であり、ｍは好ましくは約１×１０４以下であり、より好ましくは約１０００以下であり、さらに好ましくは約７００以下である。Ｒ１は独立して、Ｈ、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基、式６Ａの構造を有するグルカン鎖、式８Ａの構造を有するグルカン鎖、または式６Ｂの構造を有するグルカン鎖である。
式６Ａにおいて、ｋは１以上の整数である。ｋは好ましくは８以上であり、より好ましくは９以上であり、さらに好ましくは１０以上であり、ｋは好ましくは約１×１０４以下であり、より好ましくは約１０００以下であり、さらに好ましくは約７００以下である。式６Ａにおいて、Ｒ２はそれぞれ独立して、Ｈ、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基、式６Ａの構造を有するグルカン鎖、式８Ａの構造を有するグルカン鎖、または式６Ｂの構造を有するグルカン鎖である。
式８Ａにおいて、ｐは１以上の整数である。ｐは好ましくは８以上であり、より好ましくは９以上であり、さらに好ましくは１０以上であり、ｐは好ましくは約１×１０４以下であり、より好ましくは約１０００以下であり、さらに好ましくは約７００以下である。式８Ａにおいて、Ｒ５は独立して、Ｈ、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基、式６Ａの構造を有するグルカン鎖、式８Ａの構造を有するグルカン鎖、または式６Ｂの構造を有するグルカン鎖である。
式６Ｂにおいて、ｓは１以上の整数である。ｓは好ましくは８以上であり、より好ましくは９以上であり、さらに好ましくは１０以上であり、ｓは好ましくは約１×１０４以下であり、より好ましくは約１０００以下であり、さらに好ましくは約７００以下である。式６Ｂにおいて、Ｒ３はそれぞれ独立して、Ｈ、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基、式６Ａの構造を有するグルカン鎖、式８Ａの構造を有するグルカン鎖、または式６Ｂの構造を有するグルカン鎖である。
式８、式６Ａ、式８Ａ、および式６Ｂにおいて、Ｒ４は、水素、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基およびリン酸基からなる群から独立して選択され、
式８において、Ｘは、単糖、非還元性糖質類、生体適合性高分子、リポソーム構成成分、配糖体およびアミン基含有低分子量物質からなる群より独立して選択され、
式８において、Ｙは、アミノ基または薬効成分との結合のために導入される置換基であり、好ましくは、アミノ基、アニオン性置換基、疎水性置換基、マレイミド基含有置換基およびスクシンイミド基含有置換基からなる群より選択され、そして式８Ａにおいて、Ｙは、薬効成分との結合のために導入される置換基であり、好ましくは、アニオン性置換基、疎水性置換基、マレイミド基含有置換基およびスクシンイミド基含有置換基からなる群より選択され、Ｙは、アミノ基修飾試薬との反応により得られ、該アミノ基修飾試薬は、少なくとも１つのカルボキシル基および少なくとも１つの別の官能基を有する。
上記で説明したように、式８において、Ｒ１は、式６Ａの構造を有する基のＲ２、または式６Ｂの構造を有する基のＲ３または式８Ａの構造を有する基のＲ５の位置において何度か式６Ａの構造を有する基または式６Ｂの構造を有する基または式８Ａの構造を有する基によって置換された構造を有し得る。式６Ａの基、式６Ｂの基または式８Ａの基で置換された回数の合計は、式８で表された分岐グルカン分子の単位鎖数に等しい。分岐グルカン分子の単位鎖数は、好ましくは約２以上であり、より好ましくは約５以上であり、さらに好ましくは約１０以上である。分岐グルカン分子の単位鎖数は、好ましくは約５０００以下であり、より好ましくは約３０００以下であり、さらに好ましくは約２０００以下である。
特定の実施形態の本発明のグルコサミン含有グルカン、グルコサミン含有グルカン水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、又はそれらのアミノ基修飾物は、例えば以下の式９の構造を有し得る：

ここでｑは０または１以上の整数である。１つの実施形態では、ｑは例えば、０、１、２、３、４、または５であり得る。ｑは好ましくは０、１または２であり、より好ましくは０または１である。ｒは１以上の整数である。ｒは好ましくは８以上であり、より好ましくは９以上であり、さらに好ましくは１０以上であり、ｒは好ましくは約１×１０４以下であり、より好ましくは約１０００以下であり、さらに好ましくは約７００以下である。Ｒ１は独立して、Ｈ、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基、式９Ａの構造を有するグルカン鎖、式８Ａの構造を有するグルカン鎖、または式６Ｂの構造を有するグルカン鎖である。
式９Ａにおいて、ｔは０または１以上の整数である。１つの実施形態では、ｔは例えば、０、１、２、３、４、または５であり得る。ｔは好ましくは０、１または２であり、より好ましくは０または１である。ｕは１以上の整数である。ｕは好ましくは８以上であり、より好ましくは９以上であり、さらに好ましくは１０以上であり、ｕは好ましくは約１×１０４以下であり、より好ましくは約１０００以下であり、さらに好ましくは約７００以下である。式９Ａにおいて、Ｒ６はそれぞれ独立して、Ｈ、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基または式９Ａの構造を有するグルカン鎖である。
式９において、Ｘは、単糖、非還元性糖質類、生体適合性高分子、リポソーム構成成分、配糖体およびアミン基含有低分子量物質からなる群より独立して選択される。
式９及び式９Ａにおいて、Ｒ４は、水素、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基およびリン酸基からなる群から独立して選択され、
式９及び式９Ａにおいて、Ｙは、ＯＨ、ＮＨ２または薬効成分との結合のために導入される置換基であるが、但し少なくとも１つのＹがＮＨ２または薬効成分との結合のために導入される置換基である。Ｙは好ましくは、アミノ基、アニオン性置換基、疎水性置換基、マレイミド基含有置換基およびスクシンイミド基含有置換基からなる群より選択される。Ｙは、アミノ基修飾試薬との反応により得られ、該アミノ基修飾試薬は、少なくとも１つのカルボキシル基および少なくとも１つの別の官能基を有する。
上記で説明したように、式９において、Ｒ１は、式９Ａの構造を有する基のＲ６の位置において何度か式９Ａの構造を有する基によって置換された構造を有し得る。式９Ａの基で置換された回数の合計は、式９で表された分岐グルカン分子の単位鎖数に等しい。分岐グルカン分子の単位鎖数は、好ましくは約２以上であり、より好ましくは約５以上であり、さらに好ましくは約１０以上である。分岐グルカン分子の単位鎖数は、好ましくは約５０００以下であり、より好ましくは約３０００以下であり、さらに好ましくは約２０００以下である。
本発明のグルコサミン含有グルカンの修飾例と修飾の目的を以下の表１にまとめる。表中の構造は一例である。
表１では、非還元末端に１つのグルコサミン残基が結合した場合を例示している。本明細書中の他の箇所でも説明したとおり、２個以上のグルコサミン残基が１，４−結合したオリゴグルコサミン残基が非還元末端に結合してもよい。また、グルコサミン残基の４位にグルコース残基、マンノース残基、ガラクトース残基、またはそれらから構成されたオリゴ糖残基などが結合してもよい。
１つの実施形態では、本発明のグルコサミン含有グルカン、グルコサミン含有グルカン水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、それらのアミノ基修飾物またはそれらの非還元末端修飾物を含む、医薬品結合用組成物が提供される。本発明の医薬品結合用組成物中では、これらの物質の純度が非常に高く、これらの物質の合成に使用された物質をほとんど含まない。例えば、本発明の医薬品結合用組成物中のグルコサミン−１−リン酸の含有量は約１０重量％以下であり、より好ましくは約１重量％以下であり、さらに好ましくは約０．１重量％以下である。他の合成材料についても同様に、それぞれの含有量が約１０重量％以下であることが好ましく約１重量％以下であることがより好ましく、約０．１重量％以下であることが最も好ましい。
（医薬の製造）
本発明のグルコサミン含有分岐グルカン、水酸基修飾物、還元末端修飾物、アミノ基修飾物または非還元末端修飾物が薬物を含まない場合、これらはＤＤＳのキャリアとして好適に利用され得る。例えば、本発明のグルコサミン含有分岐グルカン、水酸基修飾物、還元末端修飾物およびアミノ基修飾物（これらをまとめて本発明のキャリアという）と負に荷電した薬物とを水溶液中で混合することにより、本発明のキャリアと負に荷電した薬物とが静電的に結合して複合体を形成する。この複合体は、分子量が適切に調節された医薬として利用され得る。この複合体は、キャリアと負に荷電した薬物との２つの成分から構成されるため、「二成分複合体」ともいう。本明細書中で使用される場合、用語「二成分複合体」とは、広義には、第一の物質または因子と、この物質または因子に特異的に相互作用する第二の物質もしくは因子との複合体をいう。
本発明の結合体において結合物質が薬物である場合、本発明の結合体は医薬として好適に使用され得る。
（アミノ糖含有グルカン、その修飾物又はそれらの結合体と核酸分子との複合体）
本発明のアミノ糖含有グルカンは、溶液中で核酸分子（ポリヌクレオチド）と複合体を形成する。この複合体中でのアミノ糖含有グルカンと核酸分子との結合は適度に強く、またアミノ糖の導入割合を制御することによってその結合の強さを調節し得るため、核酸分子を細胞中に導入するために適切に使用され得る。好ましくは、本発明の複合体は、目的の細胞内で発現可能な遺伝子を含む核酸分子と、本発明のアミノ糖含有分岐グルカンとから形成された複合体である。より好ましくは、本発明の複合体は、目的の細胞内で発現可能な遺伝子を含む核酸分子と、本発明のグルコサミン含有分岐グルカンとから形成された複合体である。この遺伝子は、目的の細胞内の適切な場所で（例えば、核内、ミトコンドリア内、細胞質内など）に導入されて発現されることが意図される遺伝子であり得る。この核酸分子は、好ましくはＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびＲＮＡアプタマーからなる群より選択され得る。
本発明のアミノ糖含有グルカンと核酸分子との複合体には、カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質が非共有結合的にさらに結合されて、さらなる複合体が形成され得る。
従って、特定の実施形態では、本発明の複合体は、本発明のアミノ糖含有グルカンと核酸分子との複合体キャリアと、カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質とから形成された複合体である。このカチオン性ポリマーは、ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリアミノスチレン、キトサン、カチオン性グルカンおよびＤＥＡＥ−デキストランからなる群より選択される少なくとも１種類のカチオン性ポリマーを含み得る。この複合体は、キャリアと核酸分子とカチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質との３つの成分から構成されるため、「三成分複合体」ともいう。
本明細書において使用される場合、用語「三成分複合体」とは、広義には、第一の物質または因子と、この物質もしくは因子に特異的に相互作用する第二の物質もしくは因子と、これら第一の物質もしくは因子または第二の物質もしくは因子のいずれかに対して特異的に相互作用する第三の物質もしくは因子との複合体をいう。このような三成分複合体としては、本発明のキャリアと、負に荷電した薬物（例えば、核酸分子）と、正に荷電した物質（例えば、ポリカチオンポリマー）との複合体が挙げられるが、これに限定されない。
（遺伝子送達方法）
本発明の複合体は、遺伝子送達のために有用に使用され得る。本発明の核酸分子送達方法は、本発明の上記アミノ糖含有グルカンと核酸分子との複合体、またはアミノ糖含有グルカンと核酸分子との複合体キャリアと、カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質とから形成された複合体を細胞に接触させることを包含する、該細胞内への核酸分子送達方法である。複合体と細胞とは、インビトロでまたはインビボで接触させられるが、好ましくはインビトロで接触させられる。
本明細書中で使用される「接触（させる）」とは、細胞を、直接的または間接的のいずれかで、本発明の複合体に対して物理的に近接させることを意味する。複合体は、緩衝液、塩、溶液などの中に存在し得る。インビトロでの接触は、複合体を含む、例えば、ビーカー、マイクロタイタープレート、細胞培養フラスコまたはマイクロアレイ（例えば、遺伝子チップ）などの中に細胞を置くことにより行われ得る。
本明細書において「複合体」（ｃｏｍｐｌｅｘ）とは、糖、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、低分子などの分子が複数種非共有連結してできた分子をいう。そのような複合体の例としては、例えば、アミノ糖含有グルカンとポリヌクレオチドとの複合体、アミノ糖含有グルカンとタンパク質との複合体、アミノ糖含有グルカンと核酸分子とカチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質との複合体などが挙げられるがそれらに限定されない。
細胞の内部へのポリヌクレオチドのインビトロおよびインビボ送達（トランスフェクション）は、三成分複合体を、トランスフェクトされるべき細胞と接触させることによって行なうことができる。好ましくは、細胞は哺乳類細胞である。インビトロでの三成分複合体と細胞との接触は、例えば以下に記載する限定ではない実施例で説明するように、当業者に知られる様々な方法で行なうことができる。インビボでの三成分複合体と細胞との接触は、好ましくは、複合体を動物（好ましくは哺乳動物）の体内に例えば全身投与または局所投与などで導入することによって行なわれ得る。好ましくは、投与は、特定ポリヌクレオチドによるトランスフェクションを必要とする細胞を持っている哺乳動物（例えばヒト）に、当該ポリヌクレオチドを含む三成分複合体を、その細胞に望ましい量のポリヌクレオチドを送達するのに有効な量で投与することによって行なわれる。そのような所望のポリヌクレオチドを送達するのに有効な三成分複合体の量は、日常的なインビトロ実験によって、および／または当業者に知られる他の方法、例えば臨床試験などによって決定することができる。
（治療方法）
本発明の複合体は、遺伝子治療、薬物治療などに有用に使用され得る。遺伝子治療の特定の実施形態では、本発明の治療方法は、本発明のアミノ糖含有グルカンと核酸分子との複合体、またはアミノ糖含有グルカンと核酸分子との複合体キャリアと、カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質とから形成された複合体を被験体に投与することを包含し、ここで、該核酸分子は、治療用遺伝子を含む、方法である。薬物治療の特定の実施形態では、本発明の治療方法は、本発明のアミノ糖含有グルカンと薬効成分との複合体を被験体に投与することを包含する。
目的の疾患の治療に適切な治療用タンパク質をコードする遺伝子を含む核酸分子もまた、従来の遺伝子工学技術を用いて生産することができる。核酸分子は発現ベクターまたはプラスミドであってよい。発現ベクター、プラスミドおよびそれらに含まれるエレメントについては一般説明を参照のこと。
以下、本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明は、実施例に限定されるものではない。実施例において使用したＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼは、以下の製造例１によって調製したＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼである。
（製造例１：Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼの調製）
下記の方法によりＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼを組換え生産した。
（Ａ）Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼ遺伝子の作製
Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼ遺伝子のアミノ酸配列（配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列；米国生物工学情報センター（ＮＣＢＩ； Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＧｅｎＢａｎｋ塩基配列データベースのＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号ＡＥ０００６５７の４９１３８０−４９３４５８番目までの塩基配列を翻訳して得られるアミノ酸配列）をコードする塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ塩基配列データベースのＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号ＡＥ０００６５７の４９１３８０−４９３４５８番目までの塩基配列）を有する核酸（「α−グルカンホスホリラーゼ遺伝子」ともいう）を、当業者に周知の方法により、化学的に合成した。このα−グルカンホスホリラーゼ遺伝子の翻訳開始コドン上流にはＮｄｅＩサイトを設けた。また、翻訳停止コドン下流にはＢａｍＨＩサイトを設け、この合成遺伝子をＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで切断し、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩであらかじめ切断したプラスミドｐＥＴ１１ｃ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に挿入し、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼ遺伝子をもったプラスミドｐＥＴ−ＡｑＧＰを作製した。
（Ｂ）Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼ遺伝子の大腸菌における発現
このプラスミドｐＥＴ−ＡｑＧＰで、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を常法に従って形質転換し、形質転換体を得た。形質転換体を含む液体を、アンピシリン含有ＬＢ寒天培地（１００μｇ／ｍｌアンピシリン、Ｄｉｆｃｏ製トリプトン１％、Ｄｉｆｃｏ製酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ０．５％、寒天１．５％、ｐＨ７．３）に独立したコロニーが得られるように希釈して塗布し、３７℃で一晩培養した。このアンピシリン含有ＬＢ寒天培地で増殖した大腸菌は、導入したプラスミドを保有し、かつ発現することができる形質転換体である。このようにしてα−グルカンホスホリラーゼ遺伝子を発現する大腸菌を作製できた。
（Ｃ）Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼ酵素の調製
上記（Ｂ）で作製した、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼ遺伝子を発現する大腸菌を、ＬＢ培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリン、Ｄｉｆｃｏ製トリプトン１％、Ｄｉｆｃｏ製酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ、０．５％、ｐＨ ７．３）に植菌し、３７℃で５時間培養した。次いで、最終濃度が０．１ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）および１ｍＭ塩酸ピリドキシンとなるようにこの培養液にＩＰＴＧおよび塩酸ピリドキシンを加え、さらに３７℃で２４時間培養した。次いで、培養液を遠心分離することにより菌体を回収し、２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）で培地成分を洗浄し、除去した。洗浄後の菌体を２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）に懸濁し、超音波破砕機によって菌体を破砕し、遠心分離し、その上清を菌体抽出液とした。得られた菌体抽出液を、６０℃３０分間加熱した。次いで、この菌体抽出液を予め平衡化されたＱ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦカラムにロードし、２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ ６．７）中、０．１Ｍから０．３ＭのＮａＣｌの濃度勾配で溶出し、ＧＰ精製酵素含有活性画分を回収した。
得られた精製酵素含有活性画分を約１μｇ使用して、ネイティブＰＡＧＥ（Ｎａｔｉｖｅ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を行った。その結果、α−グルカンホスホリラーゼを発現する大腸菌から得られた画分では、分子量約１５０ｋＤａの位置に単一のバンドが認められ、他の場所にはバンドが見られなかった。Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼの分子量は、アミノ酸配列から計算して約７５ｋＤａであると推定されるので、このネイティブＰＡＧＥの結果、このα−グルカンホスホリラーゼは、ダイマー構造をとっていると考えられる。このようにして、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼが均質に精製されたことが示された。
（製造例２：分岐グルカン（Ｂ）の製造）
５０ｇのワキシーコーンスターチ（三和澱粉工業（株）製）を１０００ｍｌの１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、約１００℃に加熱することによりワキシーコーンスターチを糊化させた。約７０℃まで冷却した澱粉糊液に特開２０００−３１６５８１の実施例１に記載された方法に従って調製した高度耐熱性ブランチングエンザイムを２００，０００単位添加して反応液を調製した後、７０℃で１６時間反応させた。反応液を１００℃で２０分間加熱した後、６，５００ｒｐｍで１０分間遠心後の上清を孔径０．８μｍの膜でろ過した。次に、濾液をゲルろ過クロマトグラフィー（ＡＫＴＡ ｐｕｒｉｆｅｒ）システム（カラム：ＧＥヘルスケア製 ＨｉＰｒｅｐＴＭ ２６／１０ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ）を用い脱塩し、低分子量多糖をした。１０００ｍｌの濾液を７．５ｍｌのアリコートに分けてゲルろ過クロマトグラフィーシステムにアプライし、それぞれ流速１０ｍｌ／分の２．７分から３．７分までの溶出画分を分取した。１０００ｍｌの濾液から得られた溶出画分を合わせ、孔径０．２μｍの膜でろ過した後凍結乾燥することにより、分岐グルカン（Ｂ）の粉末約３５ｇを得た。分岐グルカンの重量平均分子量は多角度レーザー光散乱光度計（ワイアットテクノロジー社製、ＤＡＷＮ ＤＳＰ）と示差屈折計（昭和電工（株）製、Ｓｈｏｄｅｘ ＲＩ−７１）を備えた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システム（カラム：昭和電工（株）製、ＯＨＰＡＫ ＳＢ−８０６ＭＨＱ）を用いて調べた。分岐グルカンの粉末２０ｍｇを１０ｍｌの１００ｍＭ硝酸ナトリウム水溶液に溶解し、孔径０．４５μｍの膜でろ過して濾液を得た。得られた濾液のうちの１００μｌを上記ＨＰＬＣシステムに注入した。分岐グルカン（Ｂ）の重量平均分子量は約１４０Ｋであることが示された。
上述の分岐グルカンにイソアミラーゼを作用させ、還元力を改変パークジョンソン法（Ｈｉｚｕｋｕｒｉら、Ｓｔａｒｃｈ，Ｖｏｌ．３５，ｐｐ．３４８−３５０（１９８３））により調べたところ、分岐の単位鎖長は平均約１５、分岐数は平均約６０であることが示された。
（製造例３：分岐グルカン（Ｐ）の製造）
ショ糖１５０ｇを１０００ｍｌの蒸留水に溶かし孔径０．２μｍの膜でろ過することによりショ糖水溶液を調製した。このショ糖水溶液８００ｍｌ、５％分岐グルカン（Ｂ）水溶液（上述の分岐グルカン製造例２で製造した分岐グルカン（Ｂ）５％水溶液を孔径０．２μｍの膜でろ過することにより調製した）２０ｍｌ、１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）４ｍｌ、国際公開第ＷＯ０２／０９７１０７号パンフレットの実施例２．５に記載されたとおりの方法で調製した組換えＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓスクロースホスホリラーゼ１，８００Ｕ、本願製造例１で製造したα−グルカンホスホリラーゼ１，２００Ｕ、および製造例２で使用した特開２０００−３１６５８１の実施例１に記載された方法に従って調製した高度耐熱性ブランチングエンザイム６００，０００Ｕを混合し、蒸留水で液量を１０００ｍｌに調整した後、５５℃で２４時間反応させた。反応液を１００℃で２０分間加熱した後、６，５００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、得られた上清を孔径０．８μｍの膜でろ過することにより、濾液を得た。さらに、得られた濾液をゲルろ過クロマトグラフィー（ＡＫＴＡ ｐｕｒｉｆｅｒ）システム（カラム：ＧＥヘルスケア製 ＨｉＰｒｅｐＴＭ ２６／１０ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ）を用いて脱塩し、低分子量多糖を除去した。１０００ｍｌの濾液を７．５ｍｌのアリコートに分けてゲルろ過クロマトグラフィーシステムにアプライし、それぞれ流速１０ｍｌ／分で２．７分から３．７分までの溶出画分を分取した。１０００ｍｌの濾液から得られた溶出画分を合わせ、孔径０．２μｍの膜でろ過した後凍結乾燥することにより、分岐グルカン（Ｐ）約４０ｇを得た。分岐グルカンの製造例２と同様にグルカンの重量平均分子量を調べたところ、分岐グルカン（Ｐ）の重量平均分子量は約４，０００Ｋ（重合度にして約２５，０００）であることが示された。また、製造例２と同様に還元力を測定した結果、得られた分岐グルカン（Ｐ）の分岐の単位鎖長は平均約１５、分岐数は平均約１，６００であることが示された。さらに分岐グルカン（Ｐ）の平均粒径を濃厚系粒径アナライザー（大塚電子製、ＦＰＡＲ‐１０００）で測定したところ、平均粒径約３７ｎｍであった。
（製造例４：低分子量アミロペクチンの製造）
水中１％ワキシーコーンスターチ懸濁液１００ｍｌを超音波破砕機（Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ、ＵＨ−６００Ｓ）で１０分処理した後、１０，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清の可溶性画分を回収した。得られた可溶性画分を脱塩カラム（ＨｉＰｒｅｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎ，ＧＥ社）を用いて部分精製してデンプン画分を得て、このデンプン画分を凍結乾燥することにより粉末を得た。得られた粉末を角度光散乱検出器付きサイズ排除クロマトグラフィーで分析したところ、重量平均分子量約６，１００ｋＤａの低分子量アミロペクチンが得られたことが確認された。また、製造例２と同様に還元力を測定した結果、得られた低分子量アミロペクチンの分岐の単位鎖長は平均約２２、分岐数は平均約１，６００であることが示された。
（製造例５：アセチル化分岐グルカンの製造）
製造例２で得られた分岐グルカン（Ｂ）をジメチルスルホキシドに１．８％（ｗ／ｖ）となるように溶解し、０．２％炭酸ナトリウム、０．０５５Ｍ 酢酸ビニルを添加して、２５℃で１時間撹拌を行った。得られた溶液を超純水で２倍に希釈し、ゲルろ過カラム（ＰＤ−１０）を用いてグルカン画分を回収することにより、アセチル化分岐グルカンを得た。アセチル化度の確認のため、回収画分のうちの３００μｌに５Ｎ 水酸化ナトリウム水溶液を２００μｌ加え、５５℃で３０分の加熱を行い、脱アセチル化反応を行った。この反応液に１Ｎ トリス緩衝液（ｐＨ７．０）を３００μｌ加え、さらに５Ｎ塩酸を２００μｌ加え中和をした。中和後の溶液をフェノール硫酸法でグルコース定量した。また、遊離酢酸定量キットにて中和後の溶液中の遊離酢酸の定量を行った。これらの結果、アセチル化度が０．４３のアセチル化分岐グルカンが得られたことが確認された。
（製造例６：組換え馬鈴薯α−グルカンホスホリラーゼの組換え生産）
特表２００４−５２６４６３に示された下記の方法によりタイプＬ馬鈴薯α−グルカンホスホリラーゼを組換え生産した。
馬鈴薯α−グルカンホスホリラーゼ遺伝子（Ｎａｋａｎｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １０６：６９１−６９５（１９８９）；配列番号４のアミノ酸配列をコードする核酸配列である配列番号３）の上流および下流にＢａｍＨＩサイトを設け、この遺伝子をＢａｍＨＩで切断し、ＢａｍＨＩであらかじめ切断したｐＥＴ３ｄ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に組み込み、プラスミドｐＥＴ−ＰＧＰ１１３を得た。このプラスミドでは、α−グルカンホスホリラーゼ遺伝子を、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導性プロモーターの制御下に作動可能に連結した。このプラスミドを、大腸菌ＴＧ−１（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に、コンピテントセル法により導入した。この大腸菌を、抗生物質アンピシリンを含むＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス（ともにＤｉｆｃｏ社製）、１％塩化ナトリウム、１．５％寒天））を含むプレートにプレーティングして、３７℃で一晩培養した。このプレート上で増殖した大腸菌を選択することにより、馬鈴薯由来α−グルカンホスホリラーゼ遺伝子が導入された大腸菌を得た。得られた大腸菌がα−グルカンホスホリラーゼ遺伝子を含むことを、導入された遺伝子の配列を解析することによって確認した。また、得られた大腸菌がα−グルカンホスホリラーゼを発現していることを、活性測定によって確認した。
この大腸菌を、抗生物質アンピシリンを含むＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス（ともにＤｉｆｃｏ社製）、１％塩化ナトリウム）１リットルに接種し、１２０ｒｐｍで振盪させながら３７℃で３時間振盪培養した。その後、ＩＰＴＧを０．１ｍＭ、ピリドキシンを１ｍＭになるようにそれぞれこの培地に添加し、２２℃でさらに２０時間振盪培養した。次いで、この培養液を５，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離して、大腸菌の菌体を収集した。得られた菌体を、５０ｍｌの０．０５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）中に懸濁し、次いで超音波処理により破砕し、菌体破砕液５０ｍｌを得た。この破砕液中には、４．７Ｕ／ｍｇのα−グルカンホスホリラーゼが含まれていた。
この菌体破砕液を、５５℃で３０分間加熱する。加熱後、８，５００ｒｐｍにて２０分間遠心分離し、不溶性のタンパク質などを除去して上清を得る。得られた上清を、あらかじめ平衡化しておいた陰イオン交換樹脂Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに流してα−グルカンホスホリラーゼを樹脂に吸着させた。樹脂を、２００ｍＭ塩化ナトリウムを含む緩衝液で洗浄して不純物を除去した。続いて、タンパク質を３００ｍＭ塩化ナトリウムを含む緩衝液で溶出させ、組換え馬鈴薯α−グルカンホスホリラーゼ酵素溶液とした。
（製造例７：Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｚｉｌｌｉｇｉｉ ＡＮ１由来α−グルカンホスホリラーゼの調製）
Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼ遺伝子の代わりに、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｚｉｌｌｉｇｉｉ ＡＮ１由来α−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列（配列番号６）をコードする塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ塩基配列データベースのＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号ＡＪ３１８４９９に記載される１〜２１５１番目までの塩基配列、配列番号５）を有する核酸を使用して製造例１と同様にしてα−グルカンホスホリラーゼ液を得た。
（実施例１：グルコサミン含有分岐グルカンの製造）
５０ｍＭグルコサミン−１−リン酸、１００ｍＭ クエン酸緩衝液、製造例１で得られたＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼ（１８Ｕｎｉｔ／ｍｌ）および製造例２で得られた分岐グルカン（Ｂ）を含む反応液を５５℃で６時間保温し、酵素反応させることにより、酵素反応産物を得た。酵素反応産物の構造を特定するために、製造例２で得られた分岐グルカンの酵素処理物および本実施例１で得られた酵素反応産物の酵素処理物をＤＩＯＮＥＸ社製ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ装置で分析した結果を図２に示す。図２Ａは、全ての分岐を切断するに十分な量（すなわち、過剰量）のイソアミラーゼで分岐グルカンの分岐部分を分解した後に得られた分解産物をＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ装置により分析することによって得られた結果であり、分岐グルカンのグルカン直鎖部分の長さの分布を示す。図２Ａ中のピーク上の数字は、６はマルトヘキサオース、７はマルトヘプタオースを示す。ピーク上に黒丸で示したピークは、左から右に向かってそれぞれグルコース重合度８から１４までのマルトオリゴ糖である。図２Ｂは全ての分岐を切断するに十分な量（すなわち、過剰量）のイソアミラーゼで分岐グルカンの分岐部分を分解した後に過剰量の微生物由来α−グルコシダーゼ（２０００Ｕｎｉｔ／ｍｌ）を用いてさらに分解し、得られた分解産物を分析することによって得られた結果を示す。α−グルコシダーゼはグルカンを非還元末端からグルコース単位で分解する酵素であるため、分岐グルカンは完全に分解されグルコースのピーク（図２Ｂ中Ｇｌｕｃｏｓｅで示す）が検出された。図２Ｃは本実施例１で得られたグルコサミン含有分岐グルカンを過剰量のイソアミラーゼで分解した後に得られた分解産物を分析することによって得られた結果を示す。図２Ｃ中の黒丸で示したピークは図２Ａ中の対応する位置の黒丸で示したピークと同一の溶出時間に検出されたピークであるが、それらとは間隔の異なる×で示したピークが検出された。図２Ｄは本実施例１で得られたグルコサミン含有分岐グルカンを過剰量のイソアミラーゼで分解し、過剰量の微生物由来α−グルコシダーゼでさらに分解した後に、得られた分解産物を分析することによって得られた結果を示す。黒丸で示されたピーク群は分解されて消失し、その結果、グルコースのピーク（図２Ｄ中Ｇｌｕｃｏｓｅで示す）が出現したが、×で示したピークは消失しなかった。すなわち、×で示したピークに示される部分分解物は、α−グルコシダーゼに対し分解抵抗性を示した。従って、本実施例１において非還元末端にグルコサミン残基が結合した分岐グルカンが得られたことが確認された。図２Ｅは本実施例１で得られたグルコサミン含有分岐グルカンを過剰量のイソアミラーゼで分解し、さらに過剰量のα−グルコシダーゼとα−アミラーゼで同時に分解した後、得られた分解産物を分析することによって得られた結果を示す。分岐グルカンをα−アミラーゼとα−グルコシダーゼで分解した場合にはα−アミラーゼはα−１，４結合をランダムに加水分解してグルコースとマルトースに分解し、α−グルコシダーゼはマルトースをグルコースにまで分解するため、α−グルコシダーゼとα−グルコシダーゼを分岐グルカンに同時に反応させると分岐グルカンは完全にグルコースまで分解されるが、グルコサミン含有分岐グルカンの場合にはα−アミラーゼとα−グルコシダーゼはグルコサミン−グルコース間の結合を切断することができないために、星印で示したピークとして検出された。このようにして、多数の非還元末端にそれぞれ少なくとも１つのグルコサミン残基が結合した構造を有する、本発明のグルコサミン含有分岐グルカン（１つの非還元末端に結合したグルコサミン残基の数を１とした例示的な構造を図１に示す）が製造できたことが確認された。
分岐グルカンへのグルコサミン結合率は、反応液の反応液中の遊離の無機リン酸量を定量し、以下の式を用いて算出した：
グルコサミン結合率＝（反応液中に生じた無機リン酸数／非還元末端数）×１００（％）
（注：非還元末端数＝分岐グルカンの分岐数＋１）
無機リン酸量は、以下のようにして測定した。まず、試料（無機リン酸を含む水溶液）（２００μｌ）に対し、８００μｌのモリブデン試薬（１５ｍＭ モリブデン酸アンモニウム、１００ｍＭ 酢酸亜鉛）を混合し、続いて２００μｌの５６８ｍＭアスコルビン酸水溶液（ｐＨ５．０）を加えて攪拌し、反応系を得た。この反応系を、３０℃で２０分間保持した後、分光光度計を用いて８５０ｎｍでの吸光度を測定した。濃度既知の無機リン酸を用いて同様に吸光度を測定し、標準曲線を作成した。この標準曲線に試料で得られた吸光度を当てはめ、試料中の無機リン酸を求めた。その結果、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼを用いて、分岐グルカン（Ｂ）に対して非還元末端あたり５８％のグルコサミンを結合することができたことが確認された。
（実施例２：分岐グルカンを原料として使用したグルコサミン含有グルカンの製造）
製造例１で得られたＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼ（１８Ｕｎｉｔ／ｍｌ）の代わりに、製造例６で得られた馬鈴薯由来α−グルカンホスホリラーゼ（１８Ｕｎｉｔ／ｍｌ）または製造例７で得られたＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｚｉｌｌｉｇｉｉ ＡＮ１由来α−グルカンホスホリラーゼ（１８Ｕｎｉｔ／ｍｌ）を使用して、実施例１と同様に酵素反応させることにより、グルコサミン含有グルカンを製造することができた。実施例１と同様に反応液中の遊離の無機リン酸量を定量することにより、グルコサミン含有グルカンの非還元末端に結合されたグルコサミン量をもとめた。その結果、馬鈴薯由来α−グルカンホスホリラーゼを用いて、分岐グルカン（Ｂ）に対して、非還元末端あたり３７％のグルコサミン残基を結合することができたことが確認された。
（実施例３：グルコサミン結合比率の異なる各種グルコサミン含有分岐グルカン（ＢＮ）の製造）
製造例２で製造した分岐グルカン、グルコサミン−１−リン酸、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を含む反応液にＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼ（１８Ｕｎｉｔ／ｍｌ）を５５℃で４時間または１８時間作用させ、グルコサミン結合比率の異なる７種のグルコサミン含有分岐グルカン（ＢＮ１からＢＮ７）を製造した。各種グルコサミン含有分岐グルカンの反応条件（分岐グルカン、グルコサミン−１−リン酸濃度および反応時間）、およびグルコサミン結合率を表２に示した。実施例１と同様に反応液中の遊離の無機リン酸量を定量することにより、グルコサミン含有グルカンの非還元末端に結合されたグルコサミン量をもとめた。
表２に示したように、グルコサミン−１−リン酸の添加濃度を増加させることによりグルコサミン結合率は増加した。また、反応時間を延長することによりグルコサミン結合率は増加した。このように、分岐グルカンに対するグルコサミン−１−リン酸の添加割合と反応時間を変えることで、分岐グルカンの非還元末端への導入量を調節することができた。ＢＮ６およびＢＮ７については結合率が１００％を超えている。これは、１つの非還元末端に対してグルコサミン残基が２回以上結合し、結果として１つの非還元末端に対して重合度２以上のオリゴグルコサミン残基が結合したことを示す。すなわち、グルコサミン残基が非還元末端に均等に結合したと仮定すると、ＢＮ７のグルコサミン含有分岐グルカンにおいては、非還元末端のうち７１％には重合度２のオリゴグルコサミン残基が結合しており、残りの２９％にはグルコサミン残基が結合していることを示す。このように、非還元末端に１つのグルコサミン残基がα−１，４結合した後に、さらに別のグルコサミン残基がα−１，４結合できることが確認された。
（実施例４：グルコサミン結合比率の異なる各種グルコサミン含有分岐グルカンの製造）
製造例２で製造した分岐グルカン（Ｂ）、製造例３で製造した分岐グルカン（Ｐ）、製造例４で製造した低分子量アミロペクチン、または製造例５で製造したアセチル化分岐グルカンに対し、グルコサミン−１−リン酸を表３に示す濃度で添加し、１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）とＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼ（１８Ｕｎｉｔ／ｍｌ）を加え、５５℃で反応させた。反応時間は表３に示すとおりである。その結果、グルコサミン含有分岐グルカン（ＢＮ１からＢＮ７、ＰＮ１からＰＮ６、ＡＮ１、およびＡｃＢＮ８）を作製することができた。実施例３と同様に反応液中の遊離の無機リン酸量を定量することにより、分岐グルカンの非還元末端に結合されたグルコサミンの量を求めた。
表３に示したように、分岐グルカンに対するグルコサミン−１−リン酸の添加割合と反応時間を変えることで、分岐グルカンの非還元末端へのグルコサミン導入量を調節することができた。
（実施例５：グルコサミンとマンノースを結合した各種分岐グルカンの製造）
実施例４で製造したＢＮ７、ＰＮ５、ＡＮ１の３種のグルコサミン含有分岐グルカン各５ｍＭに対し、５ｍＭのマンノース−１−リン酸、１００ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）、およびＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼ（１８Ｕｎｉｔ／ｍｌ）を加え、５５℃で４２時間反応した。その結果、グルコサミン含有分岐グルカンにマンノースを結合した、グルコサミン／マンノース含有分岐グルカンを作製することができた。実施例３と同様に反応液中の遊離の無機リン酸量を定量することにより、グルコサミン含有分岐グルカンの非還元末端に結合されたマンノース量を求めた。ＢＮ７、ＰＮ５、ＡＮ１に対してそれぞれ非還元末端数の１３％、９％、１８％のマンノースを導入することができた。この結果、非還元末端にグルコサミン残基とマンノース残基が結合した分岐グルカンを作製することができた。
（実施例１〜５のまとめ）
実施例１〜５において原料として使用したグルカンおよびそれぞれの実施例において得られたグルコサミン含有分岐グルカンについて以下に示す。
（実施例６：タンパク質の高分子化）
０．２ｍｇのアルブミン（ウシ血清由来）と実施例１で製造したグルコサミン含有分岐グルカン２ｍｇを７００μｌの０．１Ｍ ２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸（２−［Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ］ｅｔｈａｎｅ ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ；ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ ５．０）に溶解した。１ｍｇの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を添加し、２時間室温で反応させた後、反応液を水で４分の１に希釈した後ＰＤ−１０カラム（ＧＥ社製）を用いて脱塩した。得られた溶液をＳｕｐｅｒｏｓｅ ６ １０／３００ ＧＬカラム（サイズ分画用カラム、ＧＥ社製）を用いたＦＰＬＣ分析によって分析した。溶離液（５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム）を用い、０．５ｍｌ／分で溶出し、生成物をＵＶ（２８０ｎｍ）で検出した。グルコサミン含有グルカンとアルブミンを縮合反応したサンプルの生成物は溶出時間が早く、分子サイズが大きいことが示された。したがって、グルコサミン含有グルカンとタンパク質を脱水縮合し高分子化できることが示された。
（実施例７および比較例１：グルコサミン含有分岐グルカンと核酸との複合体形成）
ラムダＤＮＡ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片０．５μｇに対し、各種サンプルをそれぞれ加えて１０μｌ中で５分間室温静置した後、１％アガロースゲル電気泳動を行った。使用したサンプルはそれぞれ以下の通りであった：サンプル１はイオン交換水であり（比較例１−１）；サンプル２は製造例２で得られた分岐グルカン０．１ｍｇであり（比較例１−２）；サンプル３は製造例２で得られた分岐グルカン０．５ｍｇであり（比較例１−３）；サンプル４は実施例１で得られたグルコサミン含有分岐グルカン０．１ｍｇであり（実施例７−１）；サンプル５は実施例１で得られたグルコサミン含有分岐グルカン０．５ｍｇであり（実施例７−２）；サンプル６はサンプル４に含まれるグルコサミンユニットと同モル濃度のグルコサミンであり（比較例１−４）；サンプル７はサンプル５に含まれるグルコサミンユニットと同モル濃度のグルコサミンであった（比較例１−５）。アガロースゲル電気泳動の結果を図３に示す。図３において、レーン１はサンプル１の結果であり、レーン２はサンプル２の結果であり、レーン３はサンプル３の結果であり、レーン４はサンプル４の結果であり、レーン５はサンプル５の結果であり、レーン６はサンプル６の結果であり、レーン７はサンプル７の結果である。サンプル１、２および３ではバンド（ａ）が検出されたが、グルコサミン含有分岐グルカンを添加したサンプル４および５ではＤＮＡがアガロースゲル中を移動しなかった（ｂ）。したがって、カチオン化グルコサミン含有グルカンはＤＮＡとの複合体を形成できることがわかった。この結果は図３のレーン４および５から明らかである。一方、グルコサミンを用いた場合は、アガロースゲル電気泳動でＤＮＡの移動度に変化は見られず、グルコサミンはＤＮＡの荷電および分子量を変化させることはできないことが確認された。この結果は図３のレーン６および７から明らかである。
（参考例８：直鎖状グルカンを原料として使用したグルコサミン含有グルカンの製造）
製造例２で得られた分岐グルカンの代わりに、直鎖状グルカン（重量平均分子量約５０００）を使用して、実施例１と同様に酵素反応させることにより、グルコサミン含有グルカンを製造した。実施例１と同様に分析したところ、得られたグルコサミン含有グルカンには、非還元末端に１つのグルコサミン残基が結合していることが確認された。
（参考例９：グルコサミン含有直鎖状グルカンによる核酸の安定化及び複合体形成）
実施例１で得られたグルコサミン含有分岐グルカンの代わりに参考例８で得られたグルコサミン含有直鎖状グルカン（重量平均分子量約５０００）を使用したこと以外は実施例７に記載の方法と同じ処理を行ない、アガロースゲル電気泳動を行った。ＤＮＡの移動度に変化が見られ、分子量増大効果が確認できた。しかし、その分子量増大効果は、実施例１で得られたグルコサミン含有分岐グルカンと比較するとわずかであった。
（実施例１０、比較例２および比較例３：グルコサミン含有分岐グルカンと核酸との結合力の評価）
オリゴｄＴセルロース（和光純薬）５０ｍｇをあらかじめ２Ｍ ＮａＣｌ溶液で洗浄した後、超純水で平衡化した。平衡化されたオリゴｄＴセルロースを０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．５Ｍ、１Ｍ、２ＭのＮａＣｌ溶液１ｍｌに懸濁し、実施例３または実施例４で得られたグルコサミン含有分岐グルカン（ＢＮ５、ＢＮ６またはＰＮ６）、製造例２で得られた分岐グルカン（Ｂ）、参考例８で得られたグルコサミン含有直鎖状グルカン、またはポリリジンの０．２ｍｇ／２０μＬを添加して混合し、混合物を３０分間室温で静置した後、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清画分に含まれる、オリゴｄＴセルロースと結合しなかったグルコサミン含有分岐グルカン（または、分岐グルカンもしくは直鎖状グルカン）の量を、フェノール硫酸法によってもとめ、添加したグルコサミン含有グルカン（または、分岐グルカンもしくは直鎖状グルカン）の量（全糖量）に対する結合したカチオン化グルカン量（全糖量）の割合（％）を算出した。結果を図４に示す。ＢＮ５よりもカチオン化グルカンのグルコサミン結合量が多いＢＮ６の方が高いＮａＣｌ濃度下で結合を保持することが分かった。また、ＢＮ６よりも分子量が大きく分岐が多いＰＮ６の方がより高い濃度のＮａＣｌでも安定して結合を保つことが分かった。これらの結果から、グルコサミン残基の結合量によって核酸との結合力を制御できることが分かった。
上記のように、製造例２で得られた分岐グルカンを用いて、オリゴｄＴセルロースとの結合力を評価した。図４に示すとおり、分岐グルカンは核酸に対する結合力がほとんど無いことが分かった。
上記のように、ポリリジンを用いて、オリゴｄＴセルロースとの結合力を評価した。ただし、ポリリジンの定量はＰｒｏｔｅｉｎ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（同仁化学製）を用い、製造業者の指示に従って測定した。図４に示すとおり、ポリリジンとオリゴｄＴセルロースとの結合力は非常に強く、ＮａＣｌ濃度を２Ｍまで上げても両者の結合は分離できなかった。
ポリリジンはカチオン性アミノ酸の重合物なので荷電が非常に強く、核酸と複合体化した場合には強固に結合して分離できない。そのため、ポリリジンと核酸との複合体を医薬品の薬効成分として利用する場合には、その薬効成分の毒性が非常に高いことが予想され、問題である。
グルコサミン含有分岐グルカンの場合、生理的食塩水レベルである０．１５Ｍ ＮａＣｌで安定して核酸と結合するが、１Ｍ ＮａＣｌで核酸と分離できる。
一方、ここで使用したグルコサミン含有直鎖状グルカンはＢＮ５のイソアミラーゼ分解物であるが、この直鎖状グルカンは低濃度のＮａＣｌの条件では核酸と分離する。特に、この直鎖状グルカンは、生理的食塩水レベルでは、核酸と分離する。すなわち、核酸に対するこの直鎖状グルカンの結合力は、体内で使用するには弱すぎる。この直鎖状グルカンの結果は同時に、グルコサミン含有分岐グルカンが生体内に投与された場合に、生体内のグルカン分解酵素によって分岐グルカンが分解されることによって、生成物と核酸との結合力が低下し、その結果、徐々に核酸を放出させることができることを示している。
核酸とグルコサミン含有グルカンとが安定して結合するＮａＣｌ濃度は、好ましくは約０．１Ｍ以上約２Ｍ以下であり、より好ましくは約０．１５Ｍ以上約１Ｍ以下である。
（実施例１１：グルコサミン含有分岐グルカンを用いたマクロファージ細胞株のトランスフェクション実験）
ホタル由来ルシフェラーゼをコードするＬＵＣ遺伝子を含むｐＧＬ４．５１［ｌｕｃ２Ｐ／ＣＭＶ／ＮＥＯ］Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を実施例４で得られたグルコサミン含有分岐グルカン（ＰＮ６）、ポリエチレンイミンまたはポリリジンと水溶液中で混合して室温で１５分間静置することにより、このベクターとグルコサミン含有グルカンとの複合体を形成させた。混合比率はＮ／Ｐ比（ＤＮＡのリン酸基とグルコサミン含有分岐グルカンとのモル比）を基準とし、ＰＮ６についてはＮ／Ｐ比２、１０、５０または２００とし、ポリエチレンイミンおよびポリリジンについてはＮ／Ｐ比２００とした。複合体を含む溶液を精製せずに、マクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７（ＤＳファーマバイオメディカルより購入）培養液（ウェルあたりの細胞数４×１０４／０．１ｍＬ／ウェルで播種し、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｄ−ＭＥＭ）で２４時間培養したもの）に添加した。この培養液を３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で２４時間インキュベーションした後に培地を除きＲｅｐｏｒｔｅｒ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を加えて細胞を溶解した。全て、製造業者の指示に従って、９６穴プレート上で発光反応を行い、ルミノメーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社製，Ｃｅｎｔｒｏ ＬＢ ９６０）を用いて、細胞溶解上清中のルシフェラーゼ活性を決定した。
図５に示すとおり、ＰＮ６はトランスフェクション機能を示すことが分かり、特に、Ｎ／Ｐ比が２００の時に最も高いトランスフェクション効率を示した。ポリエチレンイミンはＮ／Ｐ比２００では効率が顕著に低かった。ポリリジンはＮ／Ｐ比２００では効率が顕著に低かった。
（実施例１２：グルコサミン含有分岐グルカンを用いたマクロファージ細胞株のトランスフェクションにおける細胞毒性の評価）
実施例１１で得られた細胞溶解上清中のタンパク質濃度を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（同仁化学製）を用いて製造業者の指示に従って測定することにより、トランスフェクションによる細胞量の変化を調べた。タンパク質濃度が低いほど、細胞毒性が強いことを示す。図６に示すとおり、ポリエチレンイミンおよびポリリジンがＮ／Ｐ比２００で高い毒性を生じたのに対し、ＰＮ６はＮ／Ｐ比５０以上でも顕著な毒性は示されなかった。このように、ポリエチレンイミンおよびポリリジンはＮ／Ｐ比２００ではトランスフェクション効率が低く毒性も高いために使用することができないが、本発明のグルコサミン含有分岐グルカンはＮ／Ｐ比が高くても毒性が低く、トランスフェクション効率も高いため、トランスフェクションのキャリアとして非常に有用であることが示された。
（実施例１３：グルコサミン含有分岐グルカンとポリエチレンイミンを組み合わせて用いた場合の、マクロファージ細胞株のトランスフェクションにおける相乗効果）
ホタル由来ルシフェラーゼをコードするＬＵＣ遺伝子を含むｐＧＬ４．５１［ｌｕｃ２Ｐ／ＣＭＶ／ＮＥＯ］Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を実施例３で得られたグルコサミン含有分岐グルカンＢＮ７と水溶液中で混合して室温で１５分間静置することにより、このベクターとグルコサミン含有グルカンとの複合体を形成させた。混合比率はＮ／Ｐ比（ＤＮＡのリン酸基とグルコサミン含有分岐グルカンとのモル比）を基準とし、Ｎ／Ｐ比２、１０、５０または２００とした。その後、この混合物にポリエチレンイミンをＮ／Ｐ比１０となるように添加し、その後、室温で１５分間静置することにより、ベクターとグルコサミン含有グルカンとの複合体にさらにポリエチレンイミンを複合体化させた。得られた複合体をマクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７（ＤＳファーマバイオメディカルより購入）培養液（ウェルあたりの細胞数４×１０４／０．１ｍＬ／ウェルで播種し、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｄ−ＭＥＭ）で２４時間培養したもの）に添加した。この培養液を３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で２４時間インキュベーションした後に培地を除きＲｅｐｏｒｔｅｒ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ製）を加えて細胞を溶解した。全て、製造業者の指示に従って、９６穴プレート上で発光反応を行い、ルミノメーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社製，Ｃｅｎｔｒｏ ＬＢ９６０）を用いて、細胞溶解上清中のルシフェラーゼ活性を決定した。結果を表４に示す。ポリエチレンイミンあるいはグルコサミン含有分岐グルカン単独の場合と比較して、ポリエチレンイミンとグルコサミン含有分岐グルカンの両者を添加した時の方が、トランスフェクション効率が顕著に高いことが分かった。
（実施例１４：α−アミラーゼ消化性）
実施例４で得られたグルコサミン含有分岐グルカンの各１％溶液を、０．２Ｍ 酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）、１ｍＭ 塩化カルシウム、ブタ膵臓由来α−アミラーゼ（２６ｕｎｉｔ／ｍＬ）を含む反応液中で作製し、３７℃で４時間反応させた。４時間後に反応液の一部を取り、グルコースＣＩＩ−テストワコーを用いて、製造業者の指示に従ってグルコースを定量した。全糖量をフェノール硫酸法によって求め、消化率（％）＝｛グルコース含量（ｇ）／全糖量（ｇ）｝×１００を算出した。グルコサミン含有分岐グルカンのα−アミラーゼ消化は３１．６％であり、グルコサミン含有アセチル化分岐グルカンのα−アミラーゼ消化率は９．３％であった。よって、グルカンをアセチル化することによって、α−アミラーゼ消化性を抑制させることができた。
（実施例１５：グルコサミン含有分岐グルカンとアニオン性グルカンによる粒子形成）
実施例４で得られたグルコサミン含有グルカンＢＮ５とアニオン性グルカンを混合し、粒子サイズを調べた。アニオン性グルカンについては、製造例２で製造した分岐グルカン１０ｍＭに対し１５ｍＭグルクロン酸−１−リン酸を添加し、１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）とＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼ（１８Ｕｎｉｔ／ｍｌ）を加え、５５℃で１８時間反応させることにより、グルクロン酸含有グルカン（アニオン性グルカン）を作製した。分岐グルカンへのグルクロン酸結合率は、実施例３と同様に反応液中の遊離の無機リン酸量を定量することにより求め、その結果、５０％であった。ＢＮ５とアニオン性グルカンそれぞれの１％溶液を調製し、各比率で混合し、室温で２０分間静置した後、粒子径測定装置（ｚｅｔａ ｓｉｚｅｒ ｎａｎｏ, Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ製）を用いて測定した。
ＢＮ５の粒度は２０ｎｍであり、アニオン性グルカンの粒度は２３ｎｍであった。ＢＮ５とアニオン性グルカンとの混合物は複合体粒子を形成した。ＢＮ５とアニオン性グルカンとの１：１混合物の粒度は２００μｍであり、１０：１混合物の粒度は５３μｍであり、そして１００：１混合物の粒度は７７４ｎｍであった。
（実施例１６：グルコサミン含有分岐グルカンの蛍光ラベル化）
実施例４で得られたグルコサミン含有分岐グルカンＢＮ５またはＡｃＢＮ８をそれぞれ５０ｍｇ／ｍｌジメチルスルホキシド溶液に調製した。各グルカン／ジメチルスルホキシド溶液２ｍｌを試験管に入れ、９０℃で撹拌した。これに５０ｍｇ／ｍｌフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）のジメチルスルホキシド溶液をそれぞれ５６μｌまたは１１２μｌ加え、ピリジン１滴、およびジラウリン酸ジ−ｎ−ブチルすず１滴を滴下して反応液を得た。この反応液を９０℃で２時間撹拌した。反応終了後、この反応液にエタノールを２０ｍｌ加え、３，５００ｒｐｍで５分遠心分離を行い、沈殿を回収した。この沈殿にさらにエタノールを加えて洗浄を行い、洗浄後の沈殿を超純水１ｍｌで溶解し、ゲルろ過カラム（ＰＤ−１０）に１ｍｌのせ、１．５ｍｌの超純水で通液し、その後２ｍｌを超純水で回収し精製を行った。得られたサンプルを凍結乾燥した。得られたサンプルの一部は４９０ｎｍにおけるＵＶ吸収を測定した。ウラニンを標準物質とし、ＢＮ５およびＡｃＢＮ８のＦＩＴＣ導入量を求めたところ、それぞれの導入率は０．８６％、０．８２％の、であることが確認できた。（ＦＩＴＣ導入率（Ｗ／Ｗ％）＝（（ＦＩＴＣ標識された分岐グルカンのフルオレセイン濃度）／（ＦＩＴＣ標識された分岐グルカンの全糖量））ｘ１００）
（実施例１７：グルコサミン含有グルカンの還元末端修飾物の製造）
グルコース−１−リン酸６ｇとマルトシルトレハロース０．５ｍｇを１００ｍｌの０．２Ｍマレイン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解した溶液に、本願製造例１で製造したＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼを１５０Ｕと、特開２０００−３１６５８１の実施例１に記載された方法に従って調製した高度耐熱性ブランチングエンザイム２，０００Ｕを添加して反応液を調製した後、５０℃で攪拌しながら１６時間反応を行なった。反応液を加熱することにより酵素を失活させ、ガラスフィルターにて濾過することにより失活酵素を除去した。濾液に２倍量のエタノールを加えてグルカン反応物を沈殿させ、遠心分離した。水：エタノール１：１の溶液３００ミリリットルで沈殿を２度洗浄して共存するグルコース−１−Ｐを取り除き、さらに、エタノールで沈殿を２回洗浄した後、凍結乾燥した。収量１．８ｇで、分子量１１０ｋＤａの還元末端修飾分岐グルカンが得られた。
上記還元末端修飾分岐グルカン１．６ｍｇ／ｍＬ、１０ｍＭグルコサミン−１−リン酸、および５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を含む反応液に本願製造例１で製造したＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼ（１８Ｕｎｉｔ／ｍｌ）を５５℃で１８時間作用させることにより、グルコサミン含有グルカンを製造することができた。グルコサミン結合率は実施例３と同様の方法で求め、７４％であった。このようにして、還元末端が修飾された、グルコサミン含有分岐グルカンが得られた。
（実施例１８：還元末端にグルコン酸残基がさらに結合しているグルコサミン含有グルカンの製造）
５％マルトペンタオース（Ｇ５）１０ｍｌに０．２Ｍ Ｉ２／ＭｅＯＨ溶液１０ｍｌを加え、３０℃で攪拌しながら、４％ＫＯＨ／ＭｅＯＨ溶液４ｍｌを少しずつゆっくり滴下することにより、ヨウ素酸酸化反応させた。ヨウ素の色が消えるまで４％ＫＯＨ／ＭｅＯＨ溶液をさらに滴下し攪拌しながら１時間反応させた。得られた反応液の体積の３倍量のメタノールを加えることによりＧ５酸化物を沈殿させ、遠心分離により沈殿物（約０．４ｇ）を回収した。沈殿物は、マルトペンタオースの還元末端グルコース残基がグルコン酸残基に変換したマルトヘキサオシルグルコン酸であった。グルコース−１−リン酸６ｇとマルトヘキサオシルグルコン酸０．６ｍｇを１００ｍｌの０．２Ｍマレイン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解した溶液に、本願製造例１で製造したＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼを１５０Ｕと、特開２０００−３１６５８１の実施例１に記載された方法に従って調製した高度耐熱性ブランチングエンザイム２，０００Ｕを添加して反応液を調製した後、５０℃で攪拌しながら１６時間反応を行なった。溶液を加熱することにより酵素を失活し、ガラスフィルターにて濾過し失活酵素を除去した。濾液に２倍量のエタノールを加えてグルカン反応物を沈殿させ、遠心分離した。水：エタノール１：１の溶液３００ミリリットルで沈殿を２度洗浄して共存するグルコース−１−Ｐを取り除き、さらに、エタノールで２回洗浄した後、凍結乾燥した。収量１．７ｇ、分子量１２０ｋＤａの還元末端にグルコン酸が結合している分岐グルカンを得た。
上記還元末端修飾分岐グルカン１．６ｍｇ／ｍＬ、１０ｍＭグルコサミン−１−リン酸、および５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を含む反応液にＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ ５由来α−グルカンホスホリラーゼ（１８Ｕｎｉｔ／ｍｌ）を添加して５５℃で１８時間作用させることにより、還元末端にグルコン酸残基が結合している分岐グルカンの非還元末端にグルコサミン残基を結合させた。グルコサミン結合率は実施例３と同様の方法で求め、７０％であった。このようにして、還元末端が修飾された、グルコサミン含有分岐グルカンが得られた。
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
本発明の新規なアミノ糖含有グルカンは、非還元末端のみにアミノ糖残基が結合している。本アミノ糖含有グルカンはアミノ糖を末端に有するため、グルカン末端が正電荷を帯び、グルカンの物理化学的性質が変化する。アミノ糖の導入頻度によって電荷の強さを変えることができる。本アミノ糖含有グルカンは、核酸に非共有結合的に結合し、核酸の見かけの分子量を増大させる。本アミノ糖含有グルカンは食品、化粧品、医薬品などに幅広く利用できる。
配列番号１：Ａｑｕｉｆｅｘ Ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼの塩基配列。
配列番号２：Ａｑｕｉｆｅｘ Ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列。
配列番号３：馬鈴薯由来α−グルカンホスホリラーゼの塩基配列。
配列番号４：馬鈴薯由来α−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列。
配列番号５：Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｚｉｌｌｉｇｉｉ ＡＮ１由来α−グルカンホスホリラーゼの塩基配列。
配列番号６：Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｚｉｌｌｉｇｉｉ ＡＮ１由来α−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列。

Claims (18)

  1. 分岐状α−１，４グルカンの複数の非還元末端のうちの２以上の非還元末端のそれぞれに少なくとも１つのグルコサミン残基がα−１，４結合しているが、該分岐状α−１，４グルカンの非還元末端以外の位置にはグルコサミン残基が存在しないグルコサミン含有分岐グルカンであって、該分岐状α−１，４グルカンの重合度が１５以上４×１０５以下である、グルコサミン含有分岐グルカン。
  2. 前記分岐状α−１，４グルカンが分岐マルトオリゴ糖、デンプン、アミロペクチン、グリコーゲン、デキストリン、酵素合成分岐グルカン及び高度分岐環状グルカンからなる群より選択される請求項１に記載のグルコサミン含有分岐グルカン。
  3. 請求項１に記載のグルコサミン含有分岐グルカンの水酸基修飾物であって、該水酸基への修飾が、前記グルカンのアルコール性水酸基の一部又は全てへの修飾であり、該水酸基への修飾が、ヒドロキシアルキル化、アルキル化、アセチル化、カルボキシメチル化、硫酸化及びリン酸化からなる群より独立して選択される、水酸基修飾物。
  4. 請求項１に記載のグルコサミン含有分岐グルカン又は請求項３に記載の水酸基修飾物の還元末端修飾物。
  5. 請求項１に記載のグルコサミン含有分岐グルカン、請求項３に記載の水酸基修飾物又は請求項４に記載の還元末端修飾物のアミノ基修飾物であって、該アミノ基への修飾が、前記グルコサミン残基のアミノ基の一部又は全てへの修飾であり、該アミノ基への修飾が該アミノ基とアミノ基修飾試薬との反応により得られたものであり、該アミノ基修飾試薬は、少なくとも１つのカルボキシル基および少なくとも１つの別の官能基を有する、アミノ基修飾物。
  6. 請求項１に記載のグルコサミン含有分岐グルカン、請求項３に記載の水酸基修飾物、請求項４に記載の還元末端修飾物又は請求項５に記載のアミノ基修飾物の非還元末端修飾物であって、前記分岐状グルカンのグルコサミン残基が結合していない非還元末端のうちの少なくとも１つにおいて標的性分子が結合しており、該標的性分子は、マンノース、ガラクトース、グルクロン酸、Ｎ−アセチルグルコサミン、キシロース、フコース、ガラクトサミン、抗体、抗体フラグメント、受容体、受容体フラグメント及び受容体リガンドからなる群より選択される、非還元末端修飾物。
  7. 分岐状α−１，４グルカンとグルコサミン−１−リン酸を含む水溶液にα−グルカンホスホリラーゼを作用させることを特徴とする、請求項１に記載のグルコサミン含有分岐グルカンの製造方法であって、該分岐状α−１，４グルカンの重合度が１５以上４×１０５以下である製造方法。
  8. α−グルカンホスホリラーゼが、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列に対して９５％以上の配列同一性を有しかつグルコサミンを分岐グルカンの非還元末端にα−１，４結合で転移する活性を有する、請求項７に記載の方法。
  9. 請求項１に記載のグルコサミン含有分岐グルカン、請求項３に記載の水酸基修飾物、請求項４に記載の還元末端修飾物、請求項５に記載のアミノ基修飾物又は請求項６に記載の非還元末端修飾物と、薬効成分とを含む、医薬品。
  10. 前記薬効成分が、低分子量有機化合物、タンパク質、ペプチド、抗体、抗体フラグメント、受容体、受容体フラグメント、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびＲＮＡアプタマーからなる群より選択される、請求項９に記載の医薬品。
  11. 請求項１に記載のグルコサミン含有分岐グルカン、請求項３に記載の水酸基修飾物、請求項４に記載の還元末端修飾物、請求項５に記載のアミノ基修飾物又は請求項６に記載の非還元末端修飾物を含む、臨床診断用組成物。
  12. 請求項１に記載のグルコサミン含有分岐グルカン、請求項３に記載の水酸基修飾物、請求項４に記載の還元末端修飾物、請求項５に記載のアミノ基修飾物又は請求項６に記載の非還元末端修飾物を含む、ＤＤＳ用ナノ粒子状キャリア。
  13. 前記ＤＤＳ用ナノ粒子状キャリアが、リポソーム、ウイルス粒子、高分子ミセルおよび疎水化高分子ナノゲルからなる群より選択される、請求項１２に記載のキャリア。
  14. 核酸分子と、請求項１に記載のグルコサミン含有分岐グルカンとから形成された複合体。
  15. 前記核酸分子が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびＲＮＡアプタマーからなる群より選択される、請求項１４に記載の複合体。
  16. 請求項１４に記載の複合体キャリアと、カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質とから形成された複合体。
  17. 前記カチオン性ポリマーが、ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリアミドアミンデンドリマー、ポリアミノスチレン、キトサン、カチオン性グルカンおよびＤＥＡＥ−デキストランからなる群より選択される少なくとも１種類のカチオン性ポリマーを含む、請求項１６に記載の複合体。
  18. 請求項１４に記載の複合体を単離された細胞に接触させることを包含する、該細胞内への核酸分子送達方法。
JP2012541754A 2010-11-05 2011-11-07 アミノ糖含有グルカン、その製造法および利用 Active JP5812537B2 (ja)

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