JP5726891B2 - 非還元末端修飾グルカン、その製造法および利用 - Google Patents

非還元末端修飾グルカン、その製造法および利用 Download PDF

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Description

本発明は、少なくとも１つ（好ましくは少なくとも２つ）の非還元末端が修飾されたグルカン、その修飾物（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔ）、ならびにそれらの製造方法および利用に関する。より好ましくは、本発明は、少なくとも１つ（好ましくは少なくとも２つ）の非還元末端のそれぞれにＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基から選択される少なくとも１つの残基がα−１，４結合したグルカン、その修飾物、ならびにそれらの製造方法および利用に関する。
医薬品の薬効成分は、化学合成された安定な低分子量化合物から、タンパク質、抗体、核酸などの血中で分解しやすい不安定な物質へと急激に変化している。そのため、これらの不安定な薬効成分を安定化して薬効成分の血中濃度を長時間高く保つ必要が生じている。また薬物の副作用を低下させるために、薬物を効率よくターゲット組織に送達する必要が高まっている。このような背景の下、いわゆるドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）技術が本格的に利用されるようになってきている（非特許文献１〜４）。ＤＤＳ技術とは、薬効成分を「必要な場所」に「必要な量」を「必要な時間」だけ作用させる、即ち薬物の効果を最大限に発揮させるための理想的な体内動態に制御する技術およびシステムのことをいう。
ＤＤＳ技術においては、薬効成分の改質材料が重要である。本明細書中で用語「薬効成分の改質材料」とは、薬効成分と共有結合させることにより、あるいは非共有結合的な相互作用を介して、薬効成分を改質する材料をいう。改質材料を利用することにより、薬効成分の種々の特性（例えば、体内動態（例えば、吸収、分布、代謝および排泄）、薬理効果、安定性など）を改質することが出来る。従来薬効成分の改質材料として使用されている物質にはさまざまなものがあるが、最も汎用されているのが高分子材料である。たとえば合成高分子であるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびその誘導体は薬効成分の改質材料として広範囲に利用されている。ＰＥＧ鎖の末端に薬効成分結合用官能基を有する薬効成分改質材料が多数開発されており、そのような改質材料は実際に医薬品の製造に利用されている。具体的な応用例としてはＰＥＧ化インターフェロンα（製品名：ペガシス）が挙げられる。インターフェロンαは分子量が小さく、容易に尿に排泄されるため、血中半減期が短いことが問題であった。しかし、インターフェロンαを分子量４万のＰＥＧ鎖に共有結合させて高分子量のインターフェロンα結合体とすることにより、血中半減期を飛躍的に高めることに成功している。このように、高分子材料による、薬効成分又はＤＤＳ用ナノ粒子状キャリアの改質には顕著な効果が認められている。
しかし一方で問題点も指摘されている。例えば、生体内での分解性がなく、かつ腎臓糸球体濾過を受けない高分子量の合成高分子を血中に投与すると、その高分子が特定の臓器へ集積するリスク及びその集積に起因する副作用発生のリスクがある。これは、血中に存在する分子量数万以下の分子は、腎臓の糸球体濾過を受けてすみやかに尿中に排泄されるが、分子量数万以上の分子は、腎臓の糸球体濾過を受けず、尿への排泄が制限されるためである。そのため、安全に利用できる薬効成分用改質材料が期待されている。
多糖は、古くから食品原料として使用されているが、近年では環境にやさしい高分子材料として、生体適合性を有する安全な素材として、さらには機能性材料として注目を浴びるようになってきている。
澱粉、グリコーゲンなどに代表されるα−１，４グルカンは、環境中においても、また人の体内においても容易に分解される、安全な天然素材であり、今後成長が期待されるＤＤＳ医薬品、再生医療、体内イメージングなどの産業における材料として有望である。α−１，４グルカンを、このような目的で利用する場合には、α−１，４グルカンに対し、薬効成分との相互作用機能、臓器および組織へのターゲティング機能を付与する必要があるとともに、α−１，４グルカンの分解性を制御する必要がある。
他方、医薬分野においては、感染症、癌、などを予防または治療するためのワクチンの開発が行なわれている。ワクチンは、抗原を体内に投与し、その抗原に対する免疫応答を利用して疾患を予防または処置するためのものである。通常抗原としては、感染症ワクチンの場合には病原体の一部、不活化した病原体全体、病原体の表面タンパク質やペプチドが用いられ、がんワクチンの場合には、がん細胞表面に特異的に発現するタンパク質やペプチドが用いられる。一般的に、抗原を単独で投与するだけでは効果的な免疫誘導に至らない場合が多いため、免疫応答を誘導する物質（アジュバント）を、抗原と一緒に体内に投与することが行なわれている。効果的なワクチン開発のためには、安全且つ有効なアジュバントを開発することが重要である。精製されたタンパク質やペプチドを抗原として投与する場合に有効に機能する、効果的で安全なアジュバントが期待されている。
近年の自然科学の進歩により、免疫系のメカニズムが明らかになっている。抗原提示細胞である樹状細胞やマクロファージが免疫反応の中心的役割を担うこと、効果的な免疫誘導のためには抗原提示細胞の活性化とその結果として起こる炎症性サイトカイン（ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−αなど）の産生誘導が必要であること、が明らかとなっている。古くからアジュバントとして利用されてきた物質は、抗原提示細胞の刺激、活性化、および炎症性サイトカインの産生誘導を通じて、免疫反応の誘導や増強に関与していることも明らかとなっている（「Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ 免疫生物学」（監訳笹月健彦 南江堂）（原書「Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ ｓｅｖｅｎｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｍｕｒｐｈｙ， Ｐａｕｌ Ｔｒａｖｅｒｓ， Ｍａｒｋ Ｗａｌｐｏｒｔ ２００８ Ｇａｒｌｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｔａｙｌａｒ ＆Ｆｒａｎｃｉｓ Ｇｒｏｕｐ， ＬＬＣ」）。
従来から多様なアジュバントが知られているが、ヒト腫瘍の治療や、転移及び再発の予防の目的で腫瘍免疫療法に使用可能な安全かつ低価格の免疫アジュバントは少ない。例えば、培養樹状細胞を利用した腫瘍免疫療法では、キーホールリンペットヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｉａｎｉｎ）が免疫アジュバントとして使用されているが（Ｇｅｉｇｅｒ， Ｊ． Ｄ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ６１， ｐｐ．８５１３−８５１９， ２００１）、キーホールリンペットヘモシアニンは高価である。樹状細胞を直接活性化する顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ：「ＧＭ−ＣＳＦ」と略す場合がある）等のサイトカイン類を免疫アジュバントとして投与する方法も提案されているが、サイトカイン類はさらに高価である。
感染症対策のためのワクチンの製造において、安全かつ低価格の免疫アジュバントとしてミョウバン（ａｌｕｍｉｎｕｍ ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ）、フロイントの不完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ｉｍｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ、このアジュバントは油性であるために毒性が懸念されている）等のように、免疫アジュバント活性が不十分な免疫アジュバントが使用されている。これらは、動物実験で使用されているフロイントの完全アジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ａｄｊｕｖａｎｔ）に比べれば、毒性が低いものの免疫アジュバント活性も弱い。
このように、従来のアジュバント（免疫アジュバントともいう）は、免疫応答を刺激する能力、安全性またはその両方において問題がある。そのため、免疫応答を刺激する能力、すなわち抗原提示細胞を刺激する能力が高くかつ安全なアジュバントを開発することは、非常に重要なことである。
岡田弘晃、「機能性ＤＤＳキャリアの製剤設計」第１章 総論：機能性ＤＤＳキャリアを用いた製剤設計による創薬、シーエムシー出版、２００８、１−２３ 横山昌幸、「薬物キャリアに用いられる高分子材料 特集 ＤＤＳに利用される高分子化学」、Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ ２３−６，２００８：６１０−６１７ Ｍａｒｉａ Ｌａｕｒａ Ｉｍｍｏｒｄｉｎｏら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ２００６：１（３）２９７−３１５ Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ ＨａｒｒｉｓおよびＲｏｂｅｒｔ Ｂ．Ｃｈｅｓｓ，ＮＡＴＵＲＥ ＲＥＶＩＥＷＳ，ＤＲＵＧ ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ ＶＯＬＵＭＥ ２，ＭＡＲＣＨ ２００３，２１４−２２１
本発明は、上記問題点の解決を意図するものである。
安全に利用できる、理想的な薬効成分の改質材料は、以下のような特徴を有しているものと考えられる：
（１）生体内で分解され得る高分子材料であること；
（２）医薬品に使用できる程度に安定した品質を備えていること。すなわち、構造が特定でき、毎回同じ品質のものを製造できること；
（３）薬効成分と結合又は相互作用できる官能基を有していること；および
（４）組織ターゲット機能または細胞刺激機能を有すること。
本発明者らは、薬効成分の改質材料として最も優れている高分子物質はグルカン（本明細書においてグルカンとは、α−１，４−グルカン、及びα−１，６−結合により分岐したα−１，４−グルカンをいう）であると考えた。動物及び植物が貯蔵用多糖として体内に蓄積するグリコーゲン又は澱粉はグルカンの一種であることから、ヒトの体内常在成分であり、生体適合性に優れている。さらに、グルカンは、体内のα−アミラーゼによる加水分解を受けて、体内常在成分であるグルコース又はマルトオリゴ糖になる。そのため、グルカンは、最も安全な高分子材料といえる。
グルカンはその構造の設計が比較的容易であることも有利な点である。グルカンの分子量、分岐の程度、環状化などを制御する方法が公知である。グルコース残基がα−１，４−結合のみで結合している完全直鎖状のグルカン、一部のグルコース残基がα−１，６−結合により結合していることにより高頻度に分岐したグルカンなどが入手できる。分岐グルカンにおいては、α−１，６−結合がひとつ増えるたびに、新たな非還元末端がひとつ生ずることになる。α−１，６−結合の数はグルカン分子の合成の際に所望に応じて適切に調節することが可能である。
一方、グルカンを薬効成分の改質材料（例えば、キャリア、ワクチンアジュバントなど）として利用する上での最大の課題は、グルカンが薬効成分と結合又は相互作用できる官能基を備えていない点である。グルカン中に多数存在する水酸基あるいは還元性末端アルデヒド基に対して、公知の化学的方法を利用してカチオン性又はアニオン性の官能基を導入することは可能である。
さらに、グルカンを薬効成分のキャリアとして利用する上では、キャリアが組織ターゲット機能を有していることが好ましい。臓器および組織へのターゲティングを実現する手段として、細胞表面の受容体またはレクチンによる糖認識機構を利用する方法が提唱されている。細胞表面の受容体およびレクチンは、グルコースを認識せず、ガラクトースまたはマンノースなどの単糖を認識する。したがって、グルカンに組織ターゲット機能を付与するためには、グルコース以外のターゲティング機能を有する単糖をグルカンの非還元末端に結合させる必要がある。
また、グルカンをワクチンアジュバントとして利用するためには、グルカンが免疫応答で中心的役割を担う抗原提示細胞に対する高い刺激活性を有することが好ましい。抗原提示細胞（樹状細胞、マクロファージなど）はグルコース残基のみからなるグルカンには活性化されず、ガラクトースまたはマンノースなどの単糖には活性化される。したがってグルカンに高い細胞刺激活性を付与するためには細胞刺激機能を有する単糖をグルカンの非還元末端に結合させる必要がある。しかしながら、グルコース以外の単糖を少なくとも２つの非還元末端を有する分岐グルカンの非還元末端にα−１，４結合させる方法はこれまで公知でなかった。例えば、Ｎａｗａｊｉら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．２００８、３４３、２６９２−２６９６においては、馬鈴薯由来のグルカンホスホリラーゼを使用してα−Ｄ−グルコサミン−１−リン酸（ＧｌｃＮ−１−Ｐ）をマルトオリゴ糖に転移できることを記載している。しかし、Ｎａｗａｊｉらは、２６９４頁右欄３〜５行において、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸（ＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐ））がホスホリラーゼによって認識されないと記載している。酵素による基質の認識は極めて厳格であり、通常の基質を少しでも修飾すると基質として認識されなくなることが多いことは当業者の常識である。グルカンホスホリラーゼについての通常の基質はグルコース−１−リン酸であり、これらの基質のアナログでグルカンホスホリラーゼによって認識されることが公知であったのは、α−Ｄ−キシロース−１−リン酸、マンノ−ス−1−リン酸、グルコサミン−１−リン酸、グルクロン酸−１−リン酸（ＧｌｃＡ−１−Ｐ）およびＮ−ホルミルグルコサミン−１−リン酸（ＧｌｃＮＦ−１−Ｐ）だけであった。そのため、ＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐ、またはガラクトース−１−リン酸（Ｇａｌ−１−Ｐ）をグルカンに転移させるためにホスホリラーゼを使用することはできないと考えられていた。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼが、本来の基質ではない、ガラクトース−１−リン酸（Ｇａｌ−１−Ｐ）およびＮ−アセチルグルコサミン−１−リン酸（ＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐ）を基質として利用可能であり、α−１，４グルカンの非還元末端にガラクトース残基（Ｇａｌ残基)またはＮ−アセチルグルコサミン残基（ＧｌｃＮＡｃ残基）をα−１，４結合で結合する反応を触媒できること、そしてそれにもかかわらず本酵素がその逆反応をほとんど触媒できないことを見出し、これに基づいて本発明を完成させた。さらに本発明者らは、馬鈴薯由来α−グルカンホスホリラーゼがＧａｌ−１−Ｐを基質として利用可能であること、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｚｉｌｌｉｇｉｉ ＡＮ１由来α−グルカンホスホリラーゼがＧａｌ−１−ＰおよびＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐを基質として利用可能であることも見出した。これらのα−グルカンホスホリラーゼは、本来の基質であるグルコース−１−リン酸に作用した場合、グルコース残基をグルカン受容体に転移する反応（グルカン合成反応）と、グルカンの非還元末端グルコースを加リン酸分解しグルコース−１−リン酸を生成する反応（グルカン分解反応）の両方を触媒する酵素である。しかしながら、驚くべきことに、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸またはガラクトース−１−リン酸を基質とする場合、本酵素はこれらの単糖の残基をグルカン受容体に転移する反応（グルカン合成反応）を触媒するが、グルカンの非還元末端に結合したこれらの単糖の残基を加リン酸分解してＮ−アセチルグルコサミン−１−リン酸またはガラクトース−１−リン酸を生成する反応（グルカン分解反応）をほとんど触媒しない。グルカン分解反応は、結合させた単糖の残基を再度遊離させてしまうが、本発明の方法においてα−グルカンホスホリラーゼはグルカン分解反応をほとんど触媒しないことを本発明者らは発見した。すなわち、合成反応の触媒活性が、分解反応の触媒活性に比べて非常に高い。この特徴のため、グルカンに複数の非還元末端がある場合、α−グルカンホスホリラーゼは、グルカンの複数の非還元末端にＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基から選択される少なくとも１つの残基を次々と結合させていくことができる。この酵素のこの特徴を利用することにより、本発明の非還元末端修飾グルカンは初めて製造可能となった。特に、多数（例えば、５以上）の非還元末端を有するグルカンを原料として、高頻度（例えば、５０％以上）の非還元末端へのＮ−アセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基の結合率を有する非還元末端修飾グルカンは、この酵素のこの特徴を利用して初めて得ることができた。さらに本発明者らは、α−１，４グルカンの非還元末端にＧａｌ残基またはＧｌｃＮＡｃ残基をα−１，４結合で結合させた場合には、α−１，４グルカンにグルコアミラーゼ抵抗性を付与することができることを見出した。さらに、本発明者らは、本発明の非還元末端修飾グルカンを、血中に投与すると特定の組織（例えば肝臓）に集積することができることを見出した。また、本発明者らは、本発明の非還元末端修飾グルカンが、抗原提示細胞（例えば樹状細胞、マクロファージ）を刺激してＩＬ−６を産生させる活性（抗原提示細胞刺激活性）を有することを見出した。また、本発明者らは、本発明の非還元末端修飾グルカンは、生分解性に優れていること、本発明の非還元末端修飾グルカンの水酸基を修飾すること（例えばアセチル化）により、この非還元末端修飾グルカンの生体内の分解を制御できることを見出した。
本発明の非還元末端修飾分岐状α−１，４グルカン（例えば、少なくとも１つ（好ましくは少なくとも２つ）の非還元末端のそれぞれにＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基から選択される少なくとも１つの残基がα−１，４結合した分岐状α−１，４グルカン）またはその水酸基修飾物、それらの非還元末端修飾物およびそれらの還元末端修飾物においては、その複数の非還元末端のうち少なくとも１つ以上の非還元末端にグルクロン酸残基、マンノース残基およびキシロース残基から選択される少なくとも１種の残基をさらに結合させると、これらのグルカンの抗原提示細胞刺激活性をさらに向上させることができる。
本発明においては、α−グルカンホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．１．１）を用いて糖（例えば、Ｎ−アセチルグルコサミンまたはガラクトース）残基の転移を行っているため、グルカンへの糖残基の結合はα−１，４結合である。すなわち、グルカンの非還元末端のグルコシル残基の４位の炭素原子と、糖（例えば、Ｎ−アセチルグルコサミンまたはガラクトース）残基の１位の炭素原子とが酸素原子を介してα結合している。
本明細書においては、グルカンの少なくとも１つの非還元末端のそれぞれにＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基から選択される少なくとも１つの残基がα−１，４結合している本発明のグルカンを、本発明の「非還元末端修飾グルカン」ともいう。
本発明の非還元末端修飾グルカンにおいて非還元末端に結合される糖残基は、単糖の残基であってもよく、オリゴ糖の残基であってもよい。すなわち、非還元末端に結合される糖残基は、Ｎ−アセチルグルコサミン残基もしくはガラクトース残基またはそれらのオリゴ糖残基であってもよい。本明細書中においてオリゴ糖とは２以上１０以下の単糖が結合した化合物を意味する。本発明の非還元末端修飾グルカンにおいて１つの非還元末端に結合する糖残基の重合度は例えば約２以上、約３以上、約４以上、約５以上などであり得、例えば、約１０以下、約９以下、約８以下、約７以下、約６以下、約５以下、約４以下、約３以下、約２以下などであり得る。１つの実施形態では、本発明の非還元末端修飾グルカンにおいて１つの非還元末端に結合する糖残基は、２個の糖（すなわち、二量体）の残基である。
グルカンへのガラクトース残基またはＮ−アセチルグルコサミン残基の導入量は、使用するグルカンの分岐頻度と非還元末端へのこれらの残基の導入頻度によりコントロールできる。グルカンへのこれらの残基の導入量を多くしたい場合は、分岐頻度の高いグルカンを使用し、かつ非還元末端ヘのこれらの残基の導入頻度を上げる。グルカンへのこれらの残基の導入量を少なくしたい場合は、分岐頻度の低いグルカンを使用したり、非還元末端ヘのこれらの残基の導入頻度を下げたりする。グルカンへのこれらの残基の導入量の下限は、グルカン１分子あたり１個のこれらの残基が導入された状態であるが、これは分岐を持たないグルカンの非還元末端に、ガラクトース残基またはＮ−アセチルグルコサミン残基を導入することにより達成できる。高度に分岐したグルカンの場合、非還元末端はグルカン分子の最外層に分布しているので、導入されたこれらの残基は、これらの残基導入後のグルカン分子の最外層に分布し、薬効成分との相互作用および結合に理想的となると考えられる。このように、非還元末端に選択的にこれらの残基が結合したグルカンは、薬効成分の優れた改質材料になりうる可能性を有している。
本発明により、例えば以下のグルカンなどが提供される：
（項目１）
グルカンの非還元末端のうちの少なくとも１つ（好ましくは２つ以上の非還元末端のうちの２つ以上）の非還元末端のそれぞれにＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基から選択される少なくとも１つの残基がα−１，４結合しているが、該グルカンの非還元末端以外の位置にはＮ−アセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基のいずれも存在しない、グルカンであって、該グルカンが分岐状α−１，４グルカンまたは直鎖状α−１，４グルカンであり、好ましくは該分岐状α−１，４グルカンまたは直鎖状α−１，４グルカンの重合度が１５以上４×１０５以下である、グルカン。なお、本発明のＮ−アセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基が結合したグルカンは、本発明の非還元末端修飾グルカンともいう。
（項目２）
前記グルカンが分岐状α−１，４グルカンであり、該分岐状α−１，４グルカンの複数の非還元末端のうちの少なくとも１つ（好ましくは２つ以上）の非還元末端のそれぞれにＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基から選択される少なくとも１つの残基が結合している項目１に記載のグルカン。すなわち、このグルカンは、分岐状α−１，４グルカンの複数の非還元末端のうちの少なくとも１つ（好ましくは２つ以上）の非還元末端のそれぞれにＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基から選択される少なくとも１つの残基がα−１，４結合しているが、該分岐状α−１，４グルカンの非還元末端以外の位置にはＮ−アセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基のいずれもが存在しない、分岐グルカンであって、好ましくは該分岐状α−１，４グルカンの重合度が１５以上４×１０５以下である、分岐グルカンである。
（項目３）
前記分岐状α−１，４グルカンが分岐マルトオリゴ糖、デンプン、アミロペクチン、グリコーゲン、デキストリン、酵素合成分岐グルカン及び高度分岐環状グルカンからなる群より選択される項目２に記載のグルカン。
（項目４）
項目１〜３のいずれか１項に記載のグルカン（非還元末端修飾グルカン）の水酸基修飾物であって、該水酸基への修飾が、前記グルカンのアルコール性水酸基の一部又は全てへの修飾であり、該水酸基への修飾が、ヒドロキシアルキル化、アルキル化、アセチル化、カルボキシメチル化、硫酸化及びリン酸化からなる群より独立して選択される、水酸基修飾物。
（項目５）
項目１〜３のいずれか１項に記載のグルカン（非還元末端修飾グルカン）又はその水酸基修飾物の還元末端修飾物。
（項目６）
前記分岐状α−１，４グルカンの複数の非還元末端のうちの少なくとも１つの非還元末端においてＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基以外の単糖残基がα−１，４結合することによってさらに修飾された項目２〜３のいずれか１項に記載のグルカン（非還元末端修飾グルカン）又はその水酸基修飾物の非還元末端修飾物、あるいはそれらの還元末端修飾物。
（項目６Ｂ）
前記単糖残基がグルクロン酸残基、グルコサミン残基、マンノース残基、およびキシロース残基から選択される１種あるいは２種である、項目６に記載のグルカン（非還元末端修飾グルカン）又はその水酸基修飾物の非還元末端修飾物、あるいはそれらの還元末端修飾物。
（項目６Ｃ）
前記単糖残基がグルクロン酸残基およびマンノース残基から選択される１種あるいは２種である、項目６に記載のグルカン（非還元末端修飾グルカン）又はその水酸基修飾物の非還元末端修飾物、あるいはそれらの還元末端修飾物。
（項目７）
グルカン（好ましくは２つ以上の非還元末端を有する分岐状α−１，４グルカン）とＮ−アセチルグルコサミン−１−リン酸またはガラクトース−１−リン酸を含む水溶液にα−グルカンホスホリラーゼを作用させることを特徴とする、２つ以上の非還元末端のそれぞれにＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基から選択される少なくとも１つの残基が結合したグルカン（すなわち、本発明の非還元末端修飾グルカン）の製造方法であって、好ましくは原料として用いられる該グルカンの重合度が１５以上４×１０５以下である、グルカンの製造方法。
（項目８）
前記α−グルカンホスホリラーゼが、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列に対して９５％以上の配列同一性を有しかつＮ−アセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基をグルカンの非還元末端にα−１，４結合で転移する活性を有する、項目７に記載の方法。
（項目９）
項目１〜３のいずれか１項に記載のＮ−アセチルグルコサミン残基もしくはガラクトース残基を含有するグルカン、その水酸基修飾物、又はそれらの還元末端修飾物と、薬効成分とを含む、医薬品。
（項目１０）
前記分岐状α−１，４グルカンの複数の非還元末端のうちの少なくとも１つの非還元末端においてＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基以外の単糖残基がα−１，４結合することによってさらに修飾されており、該単糖残基がグルクロン酸残基、グルコサミン、マンノース残基およびキシロース残基から選択される１種あるいは２種である項目２〜３のいずれか１項に記載のＮ−アセチルグルコサミン残基もしくはガラクトース残基を含有するグルカン又はその水酸基修飾物の非還元末端修飾物、あるいはそれらの還元末端修飾物と、薬効成分とを含む、医薬品。
（項目１１）
前記薬効成分が、低分子量有機化合物、タンパク質、ペプチド、抗体、抗体フラグメント、受容体、受容体フラグメント、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびＲＮＡアプタマーからなる群より選択される、項目９または１０に記載の医薬品。
（項目１１Ａ）
前記薬効成分が、抗原タンパク質あるいはペプチドである項目９〜１１のいずれか１項に記載の医薬品。
（項目１２）
項目１〜３のいずれか１項に記載のＮ−アセチルグルコサミン残基もしくはガラクトース残基を含有するグルカン、その水酸基修飾物又はそれらの還元末端修飾物を含む、臨床診断用組成物。
（項目１３）
前記分岐状α−１，４グルカンの複数の非還元末端のうちの少なくとも１つの非還元末端においてＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基以外の単糖残基がα−１，４結合することによってさらに修飾されており、該単糖残基がグルクロン酸残基、グルコサミン、マンノース残基およびキシロース残基からなる群より選択される１種あるいは２種である項目２〜３のいずれか１項に記載のＮ−アセチルグルコサミン残基もしくはガラクトース残基を含有するグルカン又はその水酸基修飾物の非還元末端修飾物、あるいはそれらの還元末端修飾物を含む、臨床診断用組成物。
（項目１４）
項目１〜３のいずれか１項に記載のＮ−アセチルグルコサミン残基もしくはガラクトース残基を含有するグルカン、その水酸基修飾物又はそれらの還元末端修飾物を含む、ＤＤＳ用ナノ粒子状キャリア。
（項目１５）
前記分岐状α−１，４グルカンの複数の非還元末端のうちの少なくとも１つの非還元末端においてＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基以外の単糖残基がα−１，４結合することによってさらに修飾されており、該単糖残基がグルクロン酸残基、グルコサミン、マンノース残基およびキシロース残基からなる群より選択される１種あるいは２種である項目２〜３のいずれか１項目に記載のＮ−アセチルグルコサミン残基もしくはガラクトース残基を含有するグルカン又はその水酸基修飾物の非還元末端修飾物、あるいはそれらの還元末端修飾物を含む、ＤＤＳ用ナノ粒子状キャリア。
（項目１６）
前記ＤＤＳ用ナノ粒子状キャリアが、リポソーム、ウイルス粒子、高分子ミセルおよび疎水化高分子ナノゲルからなる群より選択される、項目１４または１５に記載のキャリア。
（項目１７）
項目１〜３のいずれか１項に記載のＮ−アセチルグルコサミン残基もしくはガラクトース残基を含有するグルカン、その水酸基修飾物又はそれらの還元末端修飾物を含む、ワクチンアジュバント。
（項目１８）
前記分岐状α−１，４グルカンの複数の非還元末端のうちの少なくとも１つ以上の非還元末端においてＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基以外の単糖残基がα−１，４結合することによってさらに修飾されており、該単糖残基がグルクロン酸残基およびマンノース残基から選択される１種あるいは２種である項目１７に記載のワクチンアジュバント。
本発明の非還元末端修飾グルカン（少なくとも１つ（好ましくは少なくとも２つ）の非還元末端のそれぞれにＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基から選択される少なくとも１つの残基がα−１，４結合したグルカン）、その水酸基修飾物、それらの非還元末端修飾物およびそれらの還元末端修飾物は、血中に投与すると特定の組織に集積させることができると考えられる。本発明の非還元末端修飾分岐状α−１，４グルカン（少なくとも１つ（好ましくは少なくとも２つ）の非還元末端のそれぞれにＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基から選択される少なくとも１つの残基がα−１，４結合した分岐状α−１，４グルカン）、その水酸基修飾物、それらの非還元末端修飾物およびそれらの還元末端修飾物は、樹状細胞、マクロファージなどの抗原提示細胞を刺激してＩＬ−６を産生させる活性（抗原提示細胞刺激活性）を有することからワクチンアジュバントとして利用できると考えられる。本発明の非還元末端修飾分岐状α−１，４グルカン（少なくとも１つ（好ましくは少なくとも２つ）の非還元末端のそれぞれにＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基から選択される少なくとも１つの残基がα−１，４結合した分岐状α−１，４グルカン）またはその水酸基修飾物、それらの非還元末端修飾物およびそれらの還元末端修飾物においては、その複数の非還元末端のうち少なくとも１つ以上の非還元末端にグルクロン酸残基、マンノース残基およびキシロース残基のうちの少なくとも１種の残基をさらに結合させると、これらのグルカンの抗原提示細胞刺激活性をさらに向上させることができる。
本発明の非還元末端修飾グルカン、その水酸基修飾物、それらの非還元末端修飾物およびそれらの還元末端修飾物は、血中半減期を非修飾グルカンよりも長期化することが可能であり、なおかつ、最終的には生体内で完全に分解され排出されるため、安全性が極めて高い。そのため、本発明のこれらのグルカンおよび修飾物は、薬効成分、臨床診断剤、造影剤およびＤＤＳ用ナノ粒子状キャリアの改質材料として有用である。本発明の非還元末端修飾グルカン、その水酸基修飾物、それらの非還元末端修飾物およびそれらの還元末端修飾物は、酵素反応により構造を制御し得ることから、品質安定性にも優れている。
図１は、非還元末端修飾分岐グルカン（Ｂ−ＧｌｃＮＡｃ）または非修飾分岐グルカン（Ｂ）を各種アミラーゼで消化した後のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析の結果を示す。実施例１１を参照のこと。 図２は、非還元末端修飾分岐グルカン（Ｂ−Ｇａｌ）または非修飾分岐グルカン（Ｂ）を各種アミラーゼで消化した後のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析の結果を示す。実施例１２を参照のこと。 図３は、非還元末端修飾分岐グルカンまたは非修飾分岐グルカン（Ｂ）を各種アミラーゼで分解した場合に得られると考えられる生成物の構造の模式図を示す。実施例１２を参照のこと。 図４は、Ｎ−アセチルグルコサミン残基が結合した分岐グルカンをαーアミラーゼで分解した場合の生成物の経時的な重量平均分子量の変化を示すグラフである。実施例１３を参照のこと。 図５は、アセチル化度の異なる非還元末端Ｎ−アセチルグルコサミン残基結合分岐グルカンをα−アミラーゼで分解した場合の重量平均分子量の経時変化を示すグラフである。実施例１４を参照のこと。 図６は、ガラクトース残基が結合した分岐グルカンをαーアミラーゼで分解した場合の生成物の経時的な重量平均分子量の変化を示すグラフである。実施例１５を参照のこと。 図７は、アセチル化度の異なる非還元末端ガラクトース残基結合分岐グルカンをα−アミラーゼで分解した場合の重量平均分子量の経時変化を示すグラフである。実施例１６を参照のこと。 図８は、非還元末端にＮ−アセチルグルコサミン残基が結合したアセチル化分岐グルカンおよびアセチル化した非還元末端非修飾分岐グルカン（Ｂ）の、血中グルカン残存率を示すグラフである。実施例１７を参照のこと。 図９は、非還元末端にガラクトース残基が結合したアセチル化分岐状グルカンおよびアセチル化した非還元末端非修飾分岐グルカン（Ｂ）の血中グルカン残存率を示すグラフである。実施例１８を参照のこと。 図１０は、非還元末端にガラクトース残基が結合したアセチル化分岐状グルカンおよびアセチル化した非還元末端非修飾分岐グルカン（Ｂ）の血中濃度および肝臓中濃度を示すグラフである。実施例１９を参照のこと。 図１１は、各種の非還元末端修飾グルカンを樹状細胞と接触させた場合のＩＬ−６産生量を示すグラフである。実施例２０を参照のこと。 図１２は、各種の非還元末端修飾グルカンを樹状細胞と接触させた場合のＩＬ−６産生量を示すグラフである。実施例２２を参照のこと。 図１３は、各種の非還元末端修飾グルカンを樹状細胞と接触させた場合のＩＬ−６産生量を示すグラフである。実施例２３を参照のこと。 図１４は、各種の非還元末端修飾グルカンを樹状細胞と接触させた場合のＩＬ−６産生量を示すグラフである。実施例２４を参照のこと。 図１５は、各種の非還元末端修飾グルカンをマクロファージと接触させた場合のＩＬ−６産生量を示すグラフである。実施例２５を参照のこと。 図１６は、各種の非還元末端修飾グルカンをマクロファージと接触させた場合のＩＬ−６産生量を示すグラフである。実施例２６を参照のこと。
以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
（１．材料）
（１．１）グルカンおよびグルカンの修飾物
「グルカン」とは、本明細書中で用いられる場合、Ｄ−グルコースを構成単位とする多糖である。本発明においては、グルカンとしてα−Ｄ−グルカンを使用することが好ましい。α−Ｄ−グルカン中のグルコース残基を連結する結合は、主にα−１，４−グルコシド結合からなり、α−１，６−グルコシド結合を含んでもよい。α−１，６−グルコシド結合を含むα−Ｄ−グルカンは、分岐構造を有する。分子中に少なくとも１つのα−１，６−グルコシド結合を有するグルカンを分岐状グルカンといい、分子中にまったくα−１，６−グルコシド結合を有さないグルカンを直鎖状グルカンという。本発明で使用される好ましいグルカンは、直鎖状グルカンおよび分岐状グルカンであり、より好ましくは直鎖状α−１，４−グルカン及びα−１，６−結合により分岐したα−１，４−グルカン（分岐状α−１，４グルカンともいう）である。本発明で使用されるグルカンは、α−１，３−結合を含まないことが好ましい。
直鎖状α−Ｄ−１，４−グルカンとは、Ｄ−グルコース単位がα−１，４−グルコシド結合のみで２糖単位以上結合されている多糖をいう。本明細書中では、特に断りのない限り、直鎖状α−Ｄ−１，４−グルカンを直鎖状グルカン又は直鎖状α−１，４グルカンという。直鎖状グルカンは、ひとつの非還元末端を有する。本発明に好適に利用される直鎖状グルカンの例としては、マルトオリゴ糖およびアミロースが挙げられる。
本明細書中では、用語「マルトオリゴ糖」とは、約２個〜約１０個のＤ−グルコースが脱水縮合して生じた物質であって、Ｄ−グルコース単位がα−１，４結合によって連結された物質をいう。マルトオリゴ糖の重合度は、好ましくは約３以上であり、より好ましくは約４以上であり、さらに好ましくは約５以上である。マルトオリゴ糖の重合度は、例えば、約１０以下、約９以下、約８以下、約７以下などであってもよい。マルトオリゴ糖の例としては、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、マルトオクタオース、マルトノナオース、マルトデカオースなどのマルトオリゴ糖が挙げられる。
本明細書中では用語「アミロース」とは、α−１，４結合によって連結されたグルコース単位から構成される直鎖分子をいう。アミロースは、天然の澱粉中に含まれる。アミロースは、天然の澱粉から抽出した天然アミロースであってもよく、酵素反応によって合成したアミロース（本明細書中では「酵素合成アミロース」ともいう）であってもよい。天然アミロースは、分岐部分を含む場合があるが、酵素合成アミロースは分岐を含まない。さらに、天然アミロースは分散度が大きく分子量にばらつきがあるが、酵素合成アミロース（特に、国際公開第ＷＯ０２／０９７１０７号パンフレットに記載されるＳＰ−ＧＰ法によって合成した酵素合成アミロース）は分散度が小さく極めて均一な分子量を有する。そのため、本発明においては、酵素合成アミロースを使用することが好ましい。本発明において使用されるアミロースの重合度は、好ましくは約２以上であり、より好ましくは約３以上であり、さらに好ましくは約１０以上であり、最も好ましくは約３０以上である。本発明において使用されるアミロースの重合度は、好ましくは約２×１０３以下であり、より好ましくは約１×１０３以下であり、さらに好ましくは約７００以下であり、最も好ましくは約５００以下である。
本明細書中では用語「分岐状α−Ｄ−グルカン」とは、Ｄ−グルコースがα−１，４−グルコシド結合により連結した直鎖状グルカンが、α−１，４−グルコシド結合以外の結合により分岐しているグルカンをいう。本明細書中では、特に断りのない限り、分岐状α−Ｄ−グルカンを分岐状グルカンという。分岐結合は、α−１，６−グルコシド結合、α−１，３−グルコシド結合、またはα−１，２−グルコシド結合のいずれかであるが、最も好ましくはα−１，６−グルコシド結合である。本発明で使用する分岐状α−Ｄ−グルカンはα−１，３−グルコシド結合およびα−１，２−グルコシド結合を含まないことが好ましい。分岐状グルカンは、通常、分岐結合の数と同数の非還元末端を有する。α−１，６−グルコシド結合のみを選択的に分解する酵素（例えば、イソアミラーゼ、プルラナーゼなど）で分岐状グルカンを処理すると、直鎖状α−１，４−グルカンの混合物に分解できる。これらを分岐グルカンの単位鎖といい、その重合度を単位鎖長という。
本発明に好適に利用される分岐状グルカンの例としては、２つ以上の非還元末端を有する分岐状α−１，４グルカン、分岐マルトオリゴ糖、デンプン、アミロペクチン、グリコーゲン、デキストリン、酵素合成分岐グルカン及び高度分岐環状グルカンなどが挙げられる。１つの非還元末端を有する分岐ＣＤは好ましくない。
本明細書中では用語「分岐マルトオリゴ糖」とは、約３個〜約１０個のＤ−グルコースが脱水縮合して生じた物質であって、Ｄ−グルコース単位が主にα−１，４結合によって連結されており、かつ１つ以上の分岐結合、すなわち、２つ以上の非還元末端を含む物質をいう。分岐マルトオリゴ糖の重合度は、好ましくは約４以上であり、より好ましくは約５以上であり、さらに好ましくは約６以上である。分岐マルトオリゴ糖の重合度は、例えば、約１０以下、約９以下、約８以下、約７以下などであってもよい。
本明細書中では用語「デンプン」とは、アミロースとアミロペクチンとの混合物をいう。デンプンとしては、通常市販されているデンプンであればどのようなデンプンでも用いられ得る。デンプンに含まれるアミロースとアミロペクチンとの比率は、デンプンを産生する植物の種類によって異なる。モチゴメ、モチトウモロコシなどの有するデンプンのほとんどはアミロペクチンである。他方、アミロースのみからなり、かつアミロペクチンを含まないデンプンは、通常の植物からは得られない。デンプンは、天然のデンプン、デンプン分解物および化工デンプンに区分される。
天然のデンプンは、原料により、いも類デンプンおよび穀類デンプンに分けられる。いも類デンプンの例としては、馬鈴薯デンプン、タピオカデンプン、甘藷デンプン、くずデンプン、およびわらびデンプンなどが挙げられる。穀類デンプンの例としては、コーンスターチ、小麦デンプン、および米デンプンなどが挙げられる。天然のデンプンは、ハイアミロースデンプン（例えば、ハイアミロースコーンスターチ）またはワキシーデンプンであってもよい。デンプンはまた、可溶性デンプンであってもよい。可溶性デンプンとは、天然のデンプンに種々の処理を施すことにより得られる、水溶性のデンプンをいう。デンプンは、可溶性デンプン、ワキシーデンプンおよびハイアミロースデンプンからなる群から選択され得る。デンプンはまた、化工デンプンであってもよい。
本発明において使用されるデンプンの重合度は、好ましくは約１×１０３以上であり、より好ましくは約５×１０３以上であり、さらに好ましくは約１×１０４以上であり、最も好ましくは約２×１０４以上である。本発明において使用されるデンプンの重合度は、好ましくは約１×１０７以下であり、より好ましくは約３×１０６以下であり、さらに好ましくは約１×１０６以下であり、最も好ましくは約３×１０５以下である。
アミロペクチンとは、α−１，４結合によって連結されたグルコース単位に、α−１，６結合でグルコース単位が連結された、分岐状分子である。アミロペクチンは天然のデンプン中に含まれる。アミロペクチンとしては、例えば、アミロペクチン１００％からなるワキシーコーンスターチが用いられ得る。本発明において使用されるアミロペクチンの重合度は、好ましくは約１×１０３以上であり、より好ましくは約５×１０３以上であり、さらに好ましくは約１×１０４以上であり、最も好ましくは約２×１０４以上である。本発明において使用されるアミロペクチンの重合度は、好ましくは約１×１０７以下であり、より好ましくは約３×１０６以下であり、さらに好ましくは約１×１０６以下であり、最も好ましくは約３×１０５以下である。
グリコーゲンは、グルコースから構成されるグルカンの一種であり、高頻度の枝分かれを有するグルカンである。グリコーゲンは、動物の貯蔵多糖としてほとんどあらゆる細胞に顆粒状態で広く分布している。グリコーゲンは、植物中では、例えば、トウモロコシのスイートコーン種の種子に存在する。グリコーゲンは、代表的には、グルコースのα−１，４−結合の糖鎖に対して、グルコースおよそ３単位おきに１本程度の割合で、平均重合度１２〜１８のグルコースのα−１，４−結合の糖鎖がα−１，６−結合で結合している。また、α−１，６−結合で結合している分枝鎖にも同様にグルコースのα−１，４−結合の糖鎖がα−１，６−結合で結合している。そのため、グリコーゲンは網状構造を形成する。グリコーゲンは酵素合成することも可能である。本発明において使用されるグリコーゲンの重合度は、好ましくは約５００以上であり、より好ましくは約１×１０３以上であり、さらに好ましくは約２×１０３以上であり、最も好ましくは約３×１０３以上である。本発明において使用されるグリコーゲンの重合度は、好ましくは約１×１０７以下であり、より好ましくは約３×１０６以下であり、さらに好ましくは約１×１０６以下であり、最も好ましくは約３×１０５以下である。
デキストリンは、グルコースから構成されるグルカンの一種であり、デンプンとマルトースとの中間の複雑さをもつグルカンである。デキストリンは、デンプンを酸、アルカリまたは酵素によって部分的に分解することによって得られる。また、デンプンを超音波などの物理的な処理で部分的に分解をすることによっても得られる。本発明において使用されるデキストリンの重合度は、好ましくは約１０以上であり、より好ましくは約２０以上であり、さらに好ましくは約３０以上であり、最も好ましくは約５０以上である。本発明において使用されるデキストリンの重合度は、好ましくは約１×１０４以下であり、より好ましくは約９×１０３以下であり、さらに好ましくは約７×１０３以下であり、最も好ましくは約５×１０３以下である。
酵素合成分岐グルカンとは、酵素を使用して合成された分岐グルカンをいう。ＳＰ−ＧＰ法でのアミロースの合成の際に反応液中にブランチングエンザイムを加えることにより、生成物を分岐させることができる。分岐の程度はブランチングエンザイムの添加量によって調節され得る。酵素合成分岐グルカンは、天然の分岐グルカンと比較して均一な構造を有しているため、製薬材料として使用する際に非常に有利である。例えば、本発明において使用される酵素合成分岐グルカンの重合度は、好ましくは約１５以上であり、好ましくは約２０以上であり、より好ましくは約５０以上であり、さらに好ましくは約１００以上であり、最も好ましくは約２００以上である。本発明において使用される酵素合成分岐グルカンの重合度は、好ましくは約４×１０５以下であり、好ましくは約２×１０５以下であり、より好ましくは約１×１０５以下であり、さらに好ましくは約５×１０４以下であり、最も好ましくは約３×１０４以下である。
本明細書中では、用語「高度分岐環状グルカン」とは、内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを有する、重合度が５０以上であるグルカンをいう。高度分岐環状グルカンは、分子全体として少なくとも２つの非還元末端を有すればよい。本発明で使用され得る高度分岐環状グルカンの分子全体としての重合度は、好ましくは約５０以上であり、より好ましくは約６０以上であり、さらに好ましくは約１００以上である。本発明で使用され得る高度分岐環状グルカンの分子全体としての重合度は、好ましくは約１×１０５以下であり、より好ましくは約７×１０４以下であり、さらに好ましくは約５×１０４以下である。本発明で使用され得る高度分岐環状グルカンの分子全体としての重合度は、例えば、約１×１０４以下、約７×１０３以下、または約５×１０３以下であってもよい。
高度分岐環状グルカンに存在する、内分岐環状構造部分の重合度は、好ましくは約１０以上であり、より好ましくは約１５以上であり、さらに好ましくは約２０以上である。高度分岐環状グルカンに存在する、内分岐環状構造部分の重合度は、好ましくは約５００以下であり、より好ましくは約３００以下であり、さらに好ましくは約１００以下である。
高度分岐環状グルカンに存在する、外分岐構造部分の重合度は、好ましくは約４０以上であり、より好ましくは約１００以上であり、さらに好ましくは約３００以上であり、さらにより好ましくは約５００以上である。高度分岐環状グルカンに存在する、外分岐構造部分の重合度は、好ましくは約３×１０３以下であり、より好ましくは約１×１０３以下であり、さらに好ましくは約５００以下であり、さらにより好ましくは約３００以下である。
高度分岐環状グルカンに存在する、内分岐環状構造部分のα−１，６−グルコシド結合は少なくとも１個あればよく、例えば１個以上、５個以上、１０個以上などであり得る；内分岐環状構造部分のα−１，６−グルコシド結合は例えば約２００個以下、約５０個以下、約３０個以下、約１５個以下、約１０個以下などであり得る。
本発明で使用される高度分岐環状グルカンは、外分岐構造部分の非還元末端の数が２つ以上の高度分岐環状グルカンであることが好ましい。高度分岐環状グルカンに存在する、外分岐構造部分の非還元末端の数（すなわち、「α−１，６−グルコシド結合の数」＋１）は、好ましくは約２個以上であり、より好ましくは約３個以上であり、さらに好ましくは約４個以上、特に好ましくは約５個以上、最も好ましくは約１０個以上である。高度分岐環状グルカンに存在する、外分岐構造部分の非還元末端の数は、好ましくは約５×１０３個以下であり、より好ましくは約４×１０３個以下であり、さらに好ましくは約３×１０３個以下である。
高度分岐環状グルカンは、１種類の重合度のものを単独で用いてもよいし、種々の重合度のものの混合物として用いてもよい。好ましくは、高度分岐環状グルカンの重合度は、最大の重合度のものと最小の重合度のものとの重合度の比が約１００以下、より好ましくは約５０以下、さらにより好ましくは約１０以下である。
高度分岐環状グルカンは、好ましくは、内分岐環状構造部分と外分岐構造部分とを有する、重合度が５０から５×１０４の範囲にあるグルカンであって、ここで、内分岐環状構造部分とはα−１，４−グルコシド結合とα−１，６−グルコシド結合とで形成される環状構造部分であり、そして外分岐構造部分とは、該内分岐環状構造部分に結合した非環状構造部分である、グルカンである。この外分岐構造部分の各単位鎖の重合度は、平均で好ましくは約１０以上であり、好ましくは約２０以下である。高度分岐環状グルカンおよびその製造方法は、特開平８−１３４１０４号（特許第３１０７３５８号）に詳細に記載されており、その記載に従って製造され得る。高度分岐環状グルカンは、例えば、江崎グリコ株式会社から「クラスターデキストリン」として市販されている。本発明において使用される高度分岐環状グルカンの重合度は、好ましくは約５０以上であり、より好ましくは約７０以上であり、さらに好ましくは約１００以上であり、最も好ましくは約１５０以上である。本発明において使用される高度分岐環状グルカンの重合度は、好ましくは約１×１０４以下であり、より好ましくは約７×１０３以下であり、さらに好ましくは約５×１０３以下であり、最も好ましくは約４×１０３以下である。
特定の実施形態では、分岐状グルカンは、粒子状となりうる。直径約４ｎｍ以下の粒子は腎臓から排出され、直径約４ｎｍ〜約２００ｎｍの粒子は血中を長時間循環し、直径約２００ｎｍ〜約７μｍの粒子は細網内皮系に捕捉され、直径約７μｍ以上の粒子は毛細血管を閉塞させることが公知である。細網内皮系は肝臓および脾臓に分布する。そのため、分岐グルカンの粒径を制御することにより、本発明の非還元末端修飾グルカン及びその修飾物の体内での動態を制御することができる。血中に長時間循環させることを意図する場合、粒子状分岐グルカンの粒径は、好ましくは直径約４ｎｍ以上であり、より好ましくは約１０ｎｍ以上であり、好ましくは約２００ｎｍ以下であり、より好ましくは約１００ｎｍ以下である。このような粒径の粒子状分岐グルカンの分子量は、好ましくは約５×１０５以上であり、より好ましくは約１×１０６以上であり、好ましくは約５×１０７以下であり、より好ましくは約２×１０７以下である。例えば、直径２０〜５０ｎｍの粒子はがん細胞に蓄積することが公知であるので、がん細胞に蓄積させることを意図する場合、粒子状分岐グルカンの粒径は、好ましくは直径約１０ｎｍ以上であり、より好ましくは約１５ｎｍ以上であり、好ましくは約１００ｎｍ以下であり、より好ましくは約５０ｎｍ以下である。このような粒径の粒子状分岐グルカンの分子量は、好ましくは約５×１０５以上であり、より好ましくは約１×１０６以上であり、好ましくは約２×１０７以下であり、より好ましくは約５×１０６以下である。
α−グルカンの分岐の数（すなわち、α−１，６−グルコシド結合の数）は、好ましくは約１個以上であり、より好ましくは約２個以上であり、さらに好ましくは約５個以上であり、最も好ましくは約１０個以上である。α−グルカンの分岐の数は、約３０個以上であってもよい。α−グルカンの分岐の数（すなわち、α−１，６−グルコシド結合の数）は、好ましくは約５×１０３個以下であり、より好ましくは約３×１０３個以下であり、さらに好ましくは約２×１０３個以下である。α−グルカンの分岐の数は、約１×１０３個以下であってもよい。
本発明で使用される分岐状α−グルカンにおいては、α−１，６−グルコシド結合の数に対するα−１，４−グルコシド結合の数の比（「α−１，６−グルコシド結合の数」：「α−１，４−グルコシド結合の数」）は、好ましくは１：１〜１：１×１０３であり、より好ましくは１：１．１〜１：５００であり、さらに好ましくは１：１．２〜１：１００であり、さらに好ましくは１：１．５〜１：５０であり、最も好ましくは１：２〜１：２０である。この比はまた、場合によっては、１：１０〜１：５×１０３、１：５０〜１：１×１０３、または１：１００〜１：５００であってもよい。
本発明において分岐状グルカンの分岐頻度の下限は、好ましくは０．２％以上、好ましくは１％以上、より好ましくは２％以上、最も好ましくは５％以上であり、そして、分岐頻度の上限は特にないが、例えば、９９％以下、９０％以下、８５％以下、６５％以下、５０％以下などであり得る。分岐頻度は、｛（α−１，６結合の数）／（グルカン中のα−１，４結合とα−１，６結合の合計）｝×１００によって計算される。
α−１，６−グルコシド結合は、α−グルカン中に無秩序に分布していてもよいし、均質に分布していてもよい。α−グルカン中に糖単位で５個以上の直鎖状部分ができる程度の分布であることが好ましい。
特定の実施形態では、分岐状グルカンは非還元末端数の多いものが好ましい。非還元末端の多いものほど１分子あたりのＮ−アセチルグルコサミン残基、ガラクトース残基、マンノース残基、グルクロン酸残基、グルコサミン残基、またはキシロース残基などの糖残基の結合量を増やすことができる。本発明で使用される分岐状α−１，４グルカンの非還元末端の数は、具体的には２個以上、３個以上、５個以上であり、好ましくは約１０個以上であり、より好ましくは約３０個以上、約６０個以上である。分岐状α−グルカンの非還元末端の数は、好ましくは約１×１０4個以下であり、より好ましくは約５×１０３個以下である。分岐状グルカンは非還元末端数の多いものほど好ましい。分岐ＣＤは好ましくない。分岐ＣＤは１分子に非還元末端が1つでグルコース残基が６〜８のα−１，４グルカンからなる環状骨格を有し、アミラーゼ抵抗性であるので好ましくない。
本発明においては、グルカンの代わりにグルカンの修飾物を使用してもよい。グルカンの修飾物の例としては、化工デンプンおよび上記で説明したグルカンのエステル化物などが挙げられる。グルカンの修飾物はまた、水酸基修飾物または還元末端修飾物であってもよい。また、後述するように、グルカンの少なくとも１つの非還元末端にＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基から選択される少なくとも１つの残基を結合させた後にグルカン部分を修飾してもよい。
化工デンプンは、天然のデンプンに加水分解、エステル化、またはα化などの処理を施して、より利用しやすい性質を持たせたデンプンである。糊化開始温度、糊の粘度、糊の透明度、老化安定性などを様々な組み合わせで有する幅広い種類の化工デンプンが入手可能である。化工デンプンの種類には種々ある。このようなデンプンの例は、デンプンの糊化温度以下においてデンプン粒子を酸に浸漬することにより、デンプン分子は切断するが、デンプン粒子は破壊していないデンプンである。
化工デンプン以外のグルカンの修飾物の例としては、非修飾グルカンのアルコール性水酸基のうちの少なくとも１つが修飾されたもの（以下、本明細書中では「グルカンの水酸基修飾物」という)、グルカンの非還元末端のうちの一部が修飾されたもの（以下、本明
細書中では「グルカンの非還元末端修飾物」という）およびグルカンの還元末端が修飾されたもの（以下、本明細書中では「グルカンの還元末端修飾物」という）が挙げられる。
水酸基での修飾の例としては、ヒドロキシアルキル化、アルキル化、アシル化、カルボキシメチル化、硫酸化及びリン酸化が挙げられる。水酸基での修飾は、体内の酵素によって除去され得る修飾であることが好ましい。グルカンの水酸基修飾物は、好ましくはアシル化グルカンであり、さらに好ましくはアセチル化グルカンである。アルコール性水酸基への修飾基の導入頻度は、グルカンの修飾反応の際に任意に設定することができる。アルコール性水酸基への修飾基の導入頻度はＤＳとして表し、ＤＳ１はグルコース残基あたりひとつの修飾基が導入されている状態を意味する。ＤＳは、ＤＳ＝（修飾基数）／（グルコース残基数）によって計算され得る。非修飾グルコース残基には２位、３位および６位にＯＨ基があるため、理論上、グルコース残基１個あたり最大３個の修飾基を導入し得る。そのため、ＤＳの上限値は通常３である。アルコール性水酸基への修飾基の導入頻度は、約ＤＳ０．０１以上であり、より好ましくは約ＤＳ０．０３以上であり、さらに好ましくは約ＤＳ０．０５以上であり、特に好ましくは約ＤＳ０．０７以上であり、最も好ましくは約ＤＳ０．１以上である。修飾基の導入頻度は、好ましくは約ＤＳ１．５以下であり、より好ましくは約ＤＳ１．３以下であり、さらに好ましくは約ＤＳ１．１以下であり、特に好ましくは約ＤＳ１．０以下であり、最も好ましくは約ＤＳ０．９以下である。グルカンを修飾することにより血液内あるいは体内でのグルカンの分解が抑制される。
非還元末端での修飾の例としては、マンノース残基などの標的性分子、グルクロン酸残基、グルコサミン残基などの薬剤結合用分子、およびマンノース残基、キシロース残基などの抗原提示細胞刺激性分子との結合が挙げられる。非還元末端での修飾については、以下の２．６および３において詳細に説明する。非還元末端修飾は、好ましくはマンノース残基、グルコサミン残基、グルクロン酸残基、またはキシロース残基の結合による修飾である。グルコサミン残基が結合することにより、グルカンの非還元末端にアミノ基が付与される。アミノ基は水溶液中で正電荷を有するため、水溶液中で負電荷を有する薬剤との非共有結合による結合が可能となる。またアミノ基は薬剤との共有結合を介した結合にも利用できる。またグルクロン酸残基が結合することにより、グルカンの非還元末端にカルボキシル基が付与される。カルボキシル基は水溶液中で負電荷を有するため、水溶液中で正電荷を有する薬剤との非共有結合による結合が可能となる。またカルボキシル基は薬剤との共有結合を介した結合にも利用できる。特定の実施形態では、本発明の非還元末端修飾物においては、グルコサミン残基およびグルクロン酸残基のいずれも結合していない。
非還元末端の修飾は、樹状細胞やマクロファージなどの抗原提示細胞を活性化するマンノース残基、ガラクトース残基などの糖残基を結合させることが好ましい。グルカンの非還元末端に少なくとも２つ以上のＮ−アセチルグルコサミン残基、ガラクトース残基が結合することが好ましい。さらに、Ｎ−アセチルグルコサミン残基、ガラクトース残基だけでなく、マンノース残基、グルクロン酸残基、グルコサミン残基、あるいはキシロース残基を加えた２種以上の単糖残基が結合することがより好ましい。
還元末端での修飾の例としては、単糖、非還元性糖質類、生体適合性高分子、リポソーム構成成分、配糖体及びアミン基含有低分子量物質からなる群より選択される物質との結合が挙げられる。非還元末端での修飾については、以下の２．６および３において詳細に説明する。
（１．２）アセチルグルコサミンまたはガラクトース
アセチルグルコサミンは、Ｎ−アセチルグルコサミンと同義であり、ＧｌｃＮＡｃで示される。アセチルグルコサミンは、グルコースの２位のＯＨ基がＮＨＣＯＣＨ３基に置換されたものである。
ガラクトースは、Ｄ−グルコースのエピマーであり、グルコースの４位のＯＨ基とＨ基の配置が入れ替わったものである。ガラクトースは肝実質細胞表面に存在するアシアロ糖タンパク質レセプターに認識されるため、本発明において特に有効である。
本発明の方法においては、アセチルグルコサミン−１−リン酸またはガラクトース−１−リン酸が使用される。アセチルグルコサミン−１−リン酸またはガラクトース−１−リン酸は、市販のものであってよく、化学的方法、酵素的方法または醗酵などの生物学的方法により合成してもよい。アセチルグルコサミンまたはガラクトースは、アセチルグルコサミン−１−リン酸またはガラクトース−１−リン酸を合成するために使用されてもよい。
（１．３）他の単糖
本発明においては、アセチルグルコサミン−１−リン酸またはガラクトース−１−リン酸以外の単糖−１−リン酸を使用することができる。このような単糖−１−リン酸の例としては、マンノース−１−リン酸、グルクロン酸−１−リン酸、グルコサミン−１−リン酸およびキシロース−１−リン酸が挙げられる。細胞刺激活性を有するグルカンを得るためには、これらの単糖−１−リン酸の中でも特に、マンノース−１−リン酸、グルクロン酸−１−リン酸およびキシロース−１−リン酸が好ましい。これらの単糖−１−リン酸は、アセチルグルコサミン−１−リン酸およびガラクトース−１−リン酸とランダムに組み合わせて使用することができる。これらの単糖−１−リン酸は市販のものを使用してもよく、当該分野で公知の方法に従って化学合成あるいは酵素合成してもよい。
（２．非還元末端にＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基から選択される少なくとも１つの残基がα−１，４結合したグルカンの製造法）
（２．１）アセチルグルコサミン−１−リン酸またはガラクトース−１−リン酸
本発明において利用されるアセチルグルコサミン−１−リン酸またはガラクトース−１−リン酸としては、化学的な方法、酵素的な方法、醗酵などの生物学的方法により合成されたものが使用できる。アセチルグルコサミン−１−リン酸の合成方法の例については、例えば、酵素的方法が特開２００７‐９７５１７に開示されている。ガラクトース−１−リン酸の合成方法の例については、例えば、酵素的方法がＭａｎｕ Ｒ． Ｍ． Ｄｅ Ｇｒｏｅｖｅら Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｌｅｔｔ． ２００９、３１、１８７３−１８７７に開示されている。
アセチルグルコサミン−１−リン酸としては、非塩形態のアセチルグルコサミン−１−リン酸および塩の形態のアセチルグルコサミン−１−リン酸のいずれをも使用し得る。例えば、アセチルグルコサミン−１−リン酸の金属塩を使用することができ、アセチルグルコサミン−１−リン酸のアルカリ金属塩（例えば、アセチルグルコサミン−１−リン酸二ナトリウムおよびアセチルグルコサミン−１−リン酸二カリウム）を使用することができる。
ガラクトース−１−リン酸としては、非塩形態のガラクトース−１−リン酸および塩の形態のガラクトース−１−リン酸のいずれをも使用し得る。例えば、ガラクトース−１−リン酸の金属塩を使用することができ、ガラクトース−１−リン酸のアルカリ金属塩（例えば、ガラクトース−１−リン酸二ナトリウムおよびガラクトース−１−リン酸二カリウム）を使用することができる。
（２．２）α−グルカンホスホリラーゼ
本明細書において用語「α−グルカンホスホリラーゼ」は、α−グルカンホスホリラーゼ活性を有する酵素を意味する。α−グルカンホスホリラーゼは、ＥＣ２．４．１．１に分類される。α−グルカンホスホリラーゼ活性とは、無機リン酸とα−１，４−グルカンとから、グルコース−１−リン酸およびα−１，４−グルカンの部分分解物を作る反応またはその逆反応を触媒する活性をいう。α−グルカンホスホリラーゼは、加リン酸分解の逆反応であるα−１，４−グルカン合成反応をも触媒し得る。反応がどちらの方向に進むかは、基質の量に依存する。
本発明においては、所望の残基（例えば、Ｎ−アセチルグルコサミン残基をグルカンに結合させたい場合にはＮ−アセチルグルコサミン残基、またはガラクトース残基をグルカンに結合させたい場合にはガラクトース残基）をグルカンの非還元末端に転移する機能を有する限り、任意のα−グルカンホスホリラーゼが使用され得る。本発明で使用されるα−グルカンホスホリラーゼは、細菌、酵母、動物または植物に由来し得る。本発明のα−グルカンホスホリラーゼは、例えば、馬鈴薯、サツマイモ、ソラマメ（Ｆａｖａ ｂｅａｎ）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）、ホウレンソウ、トウモロコシ、イネ、コムギ、Ｃｉｔｒｕｓ ｈｙｂｒｉｄ ｃｕｌｔｉｖａｒ、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｚｉｌｌｉｇｉｉ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｐｓｅｕｄｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓなどに由来し得る。
本発明で使用するα−グルカンホスホリラーゼは、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼ、馬鈴薯由来α−グルカンホスホリラーゼまたはＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｚｉｌｌｉｇｉｉ ＡＮ１由来α−グルカンホスホリラーゼであることが好ましく、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼであることがより好ましい。Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼは転移効率が高いので非常に好ましい。
Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼの塩基配列を配列番号１に示し、そしてアミノ酸配列を配列番号２の１位〜６９２位に示す。Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列は、植物のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列に対して約２１％〜約２４％の配列同一性を有し、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列に対して約３４％の配列同一性を有し、そしてＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ由来のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列に対して約３８％の配列同一性を有する。Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ由来のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列に対して約３８％の配列同一性を有し、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｚｉｌｌｉｇｉｉ ＡＮ１由来のマルトデキストリンホスホリラーゼのアミノ酸配列に対して約３８％の配列同一性を有し、そしてＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｐｓｅｕｄｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓに対して約３３％の配列同一性を有する。
馬鈴薯由来タイプＬ α−グルカンホスホリラーゼの塩基配列を配列番号３に示し、そしてアミノ酸配列を配列番号４の１５位〜９３０位に示す。Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｚｉｌｌｉｇｉｉ ＡＮ１由来α−グルカンホスホリラーゼの塩基配列を配列番号５に示し、そしてアミノ酸配列を配列番号６の１位〜７１７位に示す。
本明細書中では、酵素がある生物に「由来する」とは、その生物から直接単離したことのみを意味するのではなく、その生物を何らかの形で利用することによりその酵素が得られることをいう。例えば、その生物から入手したその酵素をコードする遺伝子を大腸菌に導入して、その大腸菌から酵素を単離する場合も、その酵素はその生物に「由来する」という。
本明細書において配列（例えば、アミノ酸配列、塩基配列など）の「同一性」とは、２つの配列の間で同一のアミノ酸（塩基配列を比較する場合は塩基）の出現する程度をいう。一般に、２つのアミノ酸または塩基の配列を比較して、付加または欠失を含み得る最適な様式で整列されたこれら２つの配列を比較することによって決定され得る。
本明細書では配列の同一性は、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ Ｖｅｒ．４．０（株式会社ゼネティックス）のマキシマムマッチングを用いて算出される。このプログラムは、解析対象となる配列データに対して、比較対象となる配列データを置き換えおよび欠損を考慮しながら、配列間で一致するアミノ酸対が最大になるように並べ替え、その際、一致（Ｍａｔｃｈｅｓ）、不一致（Ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ）、ギャップ（Ｇａｐｓ）についてそれぞれ得点を与え合計を算出して最小となるアライメントを出力しその際の同一性を算出する（参考文献：Ｔａｋｅｉｓｈｉ，Ｋ．，およびＧｏｔｏｈ，Ｏ．１９８４．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ａｍｏｎｇ Ｖａｒｉｏｕｓ ４．５ Ｓ ＲＮＡ
Ｓｐｅｃｉｅｓ Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９２：１１７３−１１７７）。
例えば、本発明で使用されるα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列は、配列番号２、配列番号４または配列番号６と同一、すなわち、１００％同一であってよい。別の実施形態では、目的の残基（すなわち、アセチルグルコサミン残基を転移したい場合はアセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基を転移したい場合はガラクトース残基）をグルカンの非還元末端にα−１，４結合で転移する活性を有する限り、このアミノ酸配列は、対照アミノ酸配列と比較してある一定の数までアミノ酸が変化していてもよい。このような変化は、少なくとも１個（例えば、１又は数個）のアミノ酸の欠失、置換（保存および非保存置換を含む）または挿入からなる群より選択され得る。このような変化は配列番号２、配列番号４または配列番号６のアミノ酸配列のアミノ末端もしくはカルボキシ末端の位置で生じてもよく、またはこれら末端以外のどの位置で生じてもよい。アミノ酸残基の変化は、１残基ずつ点在していてもよく、数残基連続していてもよい。例えば、本発明で使用されるα−グルカンホスホリラーゼは、酵素の精製を容易にするため、安定性を高めるためなどの理由で配列番号２、配列番号４または配列番号６のアミノ酸配列のいずれかの末端に（好ましくは約２０残基以下、より好ましくは約１０残基以下、さらに好ましくは約５残基以下の）アミノ酸残基を付加したものであってもよい。
本発明で使用されるα−グルカンホスホリラーゼは、配列番号２、配列番号４または配列番号６のアミノ酸配列に対して好ましくは約５０％以上、より好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは約７０％以上、なおいっそう好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、目的の残基（すなわち、アセチルグルコサミン残基を転移したい場合はアセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基を転移したい場合はガラクトース残基）をグルカンの非還元末端にα−１，４結合で転移する活性を有する。本発明で使用されるα−グルカンホスホリラーゼは、配列番号２、配列番号４または配列番号６のアミノ酸配列に対して約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上または約９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。
反応開始時の溶液中に含まれるα−グルカンホスホリラーゼの量は、好ましくは約０．０１Ｕ／ｍｌ以上であり、より好ましくは約０．１Ｕ／ｍｌ以上であり、特に好ましくは約０．５Ｕ／ｍｌ以上であり、最も好ましくは約１Ｕ／ｍｌ以上である。反応開始時の溶液中に含まれるα−グルカンホスホリラーゼの量は、好ましくは約１０００Ｕ／ｍｌ以下であり、より好ましくは約１００Ｕ／ｍｌ以下であり、特に好ましくは約５０Ｕ／ｍｌ以下であり、最も好ましくは約２０Ｕ／ｍｌ以下である。α−グルカンホスホリラーゼの重量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、反応自体は起こるものの、グルカンの収率が低下する場合がある。なお、α−グルカンホスホリラーゼの単位量は、以下のとおりに定義される：
α−グルカンホスホリラーゼの単位量は、１分間に１μｍｏｌの無機リン酸（Ｐｉ）を生成するα−グルカンホスホリラーゼ活性を１単位（Ｕ又はＵｎｉｔ）とする。このα−グルカンホスホリラーゼ活性の測定は、Ｇ−１−Ｐから生じた遊離の無機リン酸（Ｐｉ）を定量する。２００μｌの反応液（１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）中、１２．５ｍＭ
Ｇ−１−Ｐ、１％デキストリンおよび酵素液を含む）を５０℃に１５分間インキュベートした後、８００μｌのモリブデン試薬（１５ｍＭモリブデン酸アンモニウム、１００ｍＭ酢酸亜鉛）を加え、攪拌し反応を停止する。２００μｌの５６８ｍＭのアスコルビン酸（ｐＨ５．８）を加え、混合し、３０℃に１５分間インキュベートした後、分光光度計を用いて８５０ｎｍの吸光度を測定する。濃度既知の無機リン酸を用いて同様に吸光度を測定し、標準曲線を作成し、この標準曲線に試料で得られた吸光度を当てはめ、試料中の無機リン酸を求める。無機リン酸は、リン酸イオンとして定量される。グルコース−１−リン酸の量は定量されない。
（２．３）α−グルカンホスホリラーゼの製造
本発明で用いられるα−グルカンホスホリラーゼは、上記のような自然界に存在する、α−グルカンホスホリラーゼを産生する生物から直接単離され得る。あるいは、本発明で用いられるα−グルカンホスホリラーゼは、上記の生物から単離したα−グルカンホスホリラーゼをコードする遺伝子を用いて遺伝子組換えされた微生物（例えば、細菌、真菌など）から単離してもよい。
好ましい実施形態では、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼは、配列番号１の遺伝子断片を化学合成し、この遺伝子断片を含む発現ベクターを構築し、この発現ベクターを微生物へ導入して組換え微生物を作製し、この組換え微生物を培養してα−グルカンホスホリラーゼを生産させ、そして生産されたα−グルカンホスホリラーゼを回収することにより生産される。他の生物由来のα−グルカンホスホリラーゼについても同様に生産され得る。遺伝子組換えによる酵素生産方法は、当業者に周知である。本願発明に用いられる宿主微生物には、原核生物および真核生物が含まれ、中温菌が好ましい。特に好ましい微生物としては、例えば大腸菌などが挙げられるが、これに限定されない。
本発明において用いられる配列番号２の１位〜６９２位、配列番号４の１５位〜９３０位もしくは配列番号６の１位〜７１７位のアミノ酸配列またはそれにして相同性を有しかつＮ−アセチルグルコサミン、ガラクトース、マンノース、グルクロン酸、グルコサミン、またはキシロース残基の転移活性を有するアミノ酸配列を有するα−グルカンホスホリラーゼ、ならびにそれをコードするポリヌクレオチドは、従来の遺伝子工学技術を用いて生産することができる。
（２．４）アセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基を含有するグルカンの製造
本発明のアセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基を含有するグルカンは、アセチルグルコサミン−１−リン酸またはガラクトース−１−リン酸、グルカン、およびアセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基をグルカンの非還元末端に転移する反応を触媒し得るα−グルカンホスホリラーゼ（例えば、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼ、馬鈴薯由来α−グルカンホスホリラーゼ、またはＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｚｉｌｌｉｇｉｉ ＡＮ1由来α−グルカンホスホリラーゼ）を含む反応溶液を反応させる工程を含む方法により製造され得る。この方法においてグルカンの代わりにグルカン修飾物を使用することによりアセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基を含有するグルカンの修飾物を製造することができる。以下においては、例示として、グルカンを用いる方法について説明する。
まず、反応溶液を調製する。反応溶液は、例えば、適切な溶媒に、アセチルグルコサミン−１−リン酸またはガラクトース−１−リン酸、グルカン、およびα−グルカンホスホリラーゼを添加することにより調製され得る。アセチルグルコサミン−１−リン酸およびガラクトース−１−リン酸は、どちらか一方のみを使用しても、両方を同時に使用してもよい。この反応溶液には、酵素反応を阻害しない限り、必要に応じて、ｐＨを調整する目的で任意の緩衝剤、及び無機塩類を加えてもよい。この反応溶液には、必要に応じてα−グルカンホスホリラーゼの本来の基質である、グルコース−１−リン酸を添加してもよい。アセチルグルコサミン−１−リン酸またはガラクトース−１−リン酸とグルコース−１−リン酸を共存させた反応の場合、受容体グルカンの非還元末端にグルコース残基を結合させる反応と、アセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基を結合させる反応が同時に行われることになる。グルカンの非還元末端にアセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基が結合すると、α−グルカンホスホリラーゼはアセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基の非還元末端にさらに分子を転移させることができるが、その転移効率はグルコース残基に対して転移させる効率よりも非常に低い。しかし、グルカンの非還元末端にグルコース残基が結合すると、α−グルカンホスホリラーゼは得られる分子の非還元末端にさらにグルコース残基またはアセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基を転移することができる。そのため、グルコース−１−リン酸が共存するとグルカンの鎖長を効率よく伸ばすことができる。従って、最終的に得られる非還元末端修飾グルカンの構造は、アセチルグルコサミン−１−リン酸またはガラクトース−１−リン酸とグルコース−１−リン酸の添加比率により制御されることになる。この反応溶液には、必要に応じて、枝切り酵素、ブランチングエンザイム、４−α−グルカノトランスフェラーゼおよびグリコーゲンデブランチングエンザイムからなる群より選択される酵素を添加してもよい。
反応溶液中でのアセチルグルコサミン−１−リン酸またはガラクトース−１−リン酸の量と、集団としてのグルカンの非還元末端の数との比率を変えることにより、アセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基の導入頻度を制御することができる。すなわち、（グルカンの分子数）×（分子内の非還元末端の数に対するアセチルグルコサミン−１−リン酸またはガラクトース−１−リン酸の量）を増やすほど、アセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基の導入頻度を高めることができる。また、酵素添加量または酵素反応時間を調節することにより、アセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基の導入頻度を調節することも可能である。
２種類以上の糖残基でグルカンの非還元末端修飾を行う場合は、２種類以上の糖−１−リン酸を単独で、または同一の反応液中で混合して添加して、反応を行ってもよい。例えば、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸、ガラクトース−１−リン酸、グルクロン酸−１−リン酸、グルコサミン−１−リン酸、マンノース−１−リン酸、およびキシロース−１−リン酸から選択される所望の糖−１−リン酸を１種類ずつ反応させてもよい。あるいはこれらを２種類以上同時に反応させてもよい。例えば、グルクロン酸残基、グルコサミン残基、マンノース残基、およびキシロース残基から選択される糖残基をさらに結合させることが所望される場合には、グルクロン酸−１−リン酸、グルコサミン−１−リン酸、マンノース−１−リン酸、およびキシロース−１−リン酸を単独で、または組み合わせて分岐状グルカンの非還元末端と反応させる。
次いで、反応溶液を、当該分野で公知の方法によって必要に応じて加熱することにより、反応させる。反応温度は、本発明の効果が得られる限り、任意の温度であり得る。反応温度は代表的には、約３０℃〜約９０℃の温度であり得る。この反応工程における溶液の温度は、所定の反応時間後に反応前のこの溶液に含まれるα−グルカンホスホリラーゼの活性の約５０％以上、より好ましくは約８０％以上の活性が残る温度であることが好ましい。反応温度は好ましくは約３５℃〜約８０℃であり、より好ましくは約３５℃〜約７０℃、さらにより好ましくは約３５℃〜約６５℃である。Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来のα−グルカンホスホリラーゼは耐熱性酵素であり、その反応至適温度は約８０〜９０℃である。反応速度の面からは、反応温度がある程度高いことが好ましい。一方、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来のα−グルカンホスホリラーゼの反応至適温度の面からは約８０〜９０℃での反応が可能である。しかし、得られる生成物の安定性、アセチルグルコサミン−１−リン酸またはガラクトース−１−リン酸やグルコース−１−リン酸の安定性などの観点から、反応温度はＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来のα−グルカンホスホリラーゼの反応至適温度よりも少し低いことが好ましい。反応温度は、好ましくは約３０℃以上であり、より好ましくは約３５℃以上であり、さらに好ましくは約４０℃以上である。特定の実施形態では、反応温度は約４５℃以上または約５０℃以上であってもよい。反応温度は、好ましくは約９０℃以下であり、より好ましくは約８０℃以下であり、さらに好ましくは約７０℃以下である。特定の実施形態では、反応温度は約６５℃以下または約６０℃以下であってもよい。馬鈴薯由来α−グルカンホスホリラーゼなどのより反応至適温度の低い酵素を使用する場合、反応温度はＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来のα−グルカンホスホリラーゼを使用する場合よりは低く設定されることが好ましい。
反応時間は、反応温度、酵素の残存活性を考慮して、任意の時間で設定され得る。反応時間は、代表的には約１時間〜約１００時間、より好ましくは約１時間〜約７２時間、さらにより好ましくは約２時間〜約３６時間、最も好ましくは約２時間〜約２４時間である。特定の実施形態では、反応時間は、例えば、約１時間以上、約２時間以上、約５時間以上、約１０時間以上、約１２時間以上、約２４時間以上であってもよい。特定の実施形態では、反応時間は、例えば、約１００時間以下、約７２時間以下、約６０時間以下、約４８時間以下、約３６時間以下、約２４時間以下であってもよい。
加熱は、どのような手段を用いて行ってもよいが、溶液全体に均質に熱が伝わるように、攪拌を行いながら加熱することが好ましい。溶液は、例えば、温水ジャケットと攪拌装置を備えたステンレス製反応タンクの中に入れられて攪拌される。
本発明の方法ではまた、反応がある程度進んだ段階で、アセチルグルコサミン−１−リン酸またはガラクトース−１−リン酸、グルカン、およびα−グルカンホスホリラーゼのうちの少なくとも１つを反応溶液に追加してもよい。
このようにして、非還元末端修飾グルカンを含有する溶液が生産される。
反応終了後、反応溶液は、必要に応じて例えば、１００℃にて１０分間加熱することによって反応溶液中の酵素を失活させ得る。反応終了後、反応溶液のｐＨを酸性にして酵素タンパク質を変性させることにより酵素を除去してもよい。あるいは、酵素を失活させる処理を行うことなく後の工程を行ってもよい。反応溶液は、そのまま保存されてもよいし、生産された非還元末端修飾グルカンを単離するために処理されてもよい。
反応終了後、非還元末端修飾グルカンを精製してから、または非還元末端修飾グルカンの精製前に、得られた非還元末端修飾グルカンのグルカン部分のアルコール性水酸基のうちの少なくとも１つを修飾することにより非還元末端修飾グルカンの水酸基修飾物を製造してもよい。非還元末端修飾グルカンを精製してから修飾を行うことが好ましい。修飾は、当該分野で公知の方法に従って行われ得る。修飾の例としては、ヒドロキシアルキル化、アルキル化、アシル化、カルボキシメチル化、硫酸化およびリン酸化が挙げられる。アシル化が好ましく、アセチル化がより好ましい。Ｎ−アセチルグルコサミン残基もしくはガラクトース残基を含有するグルカン又はＮ−アセチルグルコサミン残基もしくはガラクトース残基を含有するグルカンの水酸基修飾物を製造した後に、グルカンの還元末端を修飾することにより、Ｎ−アセチルグルコサミン残基もしくはガラクトース残基を含有するグルカン又はＮ−アセチルグルコサミン残基もしくはガラクトース残基を含有するグルカンの水酸基修飾物の還元末端修飾物を製造してもよい。さらに、これらのグルカン部分のうちの、Ｎ−アセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基のいずれも結合していない非還元末端を修飾してもよい。グルカンに対するアセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基の結合、水酸基の修飾、還元末端の修飾及び非還元末端の一部へのＮ−アセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基以外の修飾基での修飾は、任意の順序で行われ得る。
（２．５）非還元末端にＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基から選択される少なくとも１つの残基がα−１，４結合したグルカンの精製
＜精製方法＞
生産された非還元末端修飾グルカン（又はその修飾物）は、必要に応じて精製され得る。精製することにより除去される不純物の例は、無機リン酸、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸またはガラクトース−１−リン酸、無機塩類などである。グルカンの精製法の例としては、有機溶媒を用いる方法（Ｔ．Ｊ．Ｓｃｈｏｃｈら、Ｊ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，６４，２９５７（１９４２））および有機溶媒を用いない方法がある。
有機溶媒を用いる精製に使用され得る有機溶媒の例としては、アセトン、ｎ−アミルアルコール、ペンタゾール、ｎ−プロピルアルコール、ｎ−ヘキシルアルコール、２−エチル−１−ブタノール、２−エチル−１−ヘキサノール、ラウリルアルコール、シクロヘキサノール、ｎ−ブチルアルコール、３−ペンタノール、４−メチル−２−ペンタノール、ｄ，ｌ−ボルネオール、α−テルピネオール、イソブチルアルコール、ｓｅｃ−ブチルアルコール、２−メチル−１−ブタノール、イソアミルアルコール、ｔｅｒｔ−アミルアルコール、メントール、メタノール、エタノールおよびエーテルが挙げられる。
有機溶媒を用いない精製方法の例としては、非還元末端修飾グルカン生産反応後、水に溶解している非還元末端修飾グルカンを沈澱させずに、限外ろ過膜を用いた膜分画もしくはクロマトグラフィーに供して無機リン酸、アセチルグルコサミン−１−リン酸またはガラクトース−１−リン酸、無機塩類を除去する方法がある。
精製に使用され得る限外濾過膜の例としては、分画分子量約１×１０３〜約１×１０４、好ましくは約５×１０３〜約５×１０４、より好ましくは約１×１０４〜約３×１０４の限外濾過膜（ダイセル製ＵＦ膜ユニット）が挙げられる。
クロマトグラフィーに使用され得る担体の例としては、ゲル濾過クロマトグラフィー用担体、配位子交換クロマトグラフィー用担体、イオン交換クロマトグラフィー用担体および疎水クロマトグラフィー用担体が挙げられる。
（２．６）非還元末端にＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基から選択される少なくとも１つの残基がα−１，４結合したグルカン及びその修飾物
本発明のグルカンは、グルカンの少なくとも１つの非還元末端のそれぞれにＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基から選択される少なくとも１つの残基がα−１，４結合しているグルカンである。本発明のグルカンは、本発明の非還元末端修飾グルカンともいう。本発明のグルカン修飾物は、本発明の非還元末端修飾グルカンの水酸基修飾物、さらなる非還元末端修飾物または還元末端修飾物であり得る。
本発明の非還元末端修飾グルカンは、グルカンの少なくとも１つの非還元末端のそれぞれにＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基から選択される少なくとも１つの残基がα−１，４結合しているグルカンである。このグルカンの非還元末端に結合したＮ−アセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基の末端には、必要に応じてさらに糖などを結合させてもよい。本発明の非還元末端修飾グルカンの１つの非還元末端に、Ｎ−アセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基またはそれらの組合せが２つ以上結合している場合には、それらの単糖が一つの末端に連結して結合した構造になる。例えば、グルカンの一つの非還元末端に一つの単糖残基が結合し、その単糖残基の非還元末端にさらに次の単糖残基が結合した構造になる。一つの実施形態では、グルカンの非還元末端のそれぞれに一つのみの単糖残基が結合する。
本発明の非還元末端修飾グルカンにおいては、グルカンの非還元末端のすべてにＮ−アセチルグルコサミン残基もしくはガラクトース残基またはそれらの組合せが結合していてもよく、非還元末端のうちの一部分のみにそれらの単糖残基が結合していてもよい。すなわち、非還元末端のうちのいくつかが、それらの単糖残基が結合しない状態で残っていてもよい。
非還元末端の数を基準とする転化率、すなわち、Ｎ−アセチルグルコサミン残基もしくはガラクトース残基またはそれらの組合せから選択される単糖を結合させる前にグルカンに存在した非還元末端の数に対する、これらの単糖と非還元末端との間の結合の数の比率は、０％に極めて近い低い比率（例えば、約１％）から１００％まで、これらの単糖残基を含有するグルカンの使用される用途などに応じて適宜選択することができる。例えば、少量のＮ−アセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基が存在することが望まれる場合には、低い転化率を選択すればよく、多量のＮ−アセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基が存在することが望まれる場合には、高い転化率を選択すればよい。
非還元末端修飾グルカンを製造する際の酵素反応の条件を適宜調整することにより、例えば、その酵素反応の反応時間、基質の濃度などを調整することにより、容易に、選択された転化率を有する、非還元末端修飾グルカンを得ることができる。
また、Ｎ−アセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基を結合させる前にグルカンに存在した非還元末端の数に対する、非還元末端に結合したこれらの単糖の総数の比率を、これらの単糖の量に関する指標とすることもできる。本明細書中ではこの比率を結合率と記載する。一般に、本発明の非還元末端修飾グルカンを分析する際には、上記転化率を測定することよりも、結合率を測定することが容易であるので、結合率に基づいて非還元末端修飾グルカンを設計することは実用的な観点から有利である。
なお、非還元末端修飾グルカンを合成する際の酵素反応の条件によっては、１つの非還元末端に結合したこれらの単糖残基の末端にさらにこれらの単糖残基が結合する場合がある。すなわち、１つの非還元末端に２つのこれらの単糖が続けて結合した構造（つまり、２糖が非還元末端に結合した構造）となる場合がある。このような構造の化合物も本発明の非還元末端修飾グルカンとして使用することができる。上記結合率は、このように複数のこれらの単糖残基が１つの非還元末端に結合することによりＮ−アセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基の量が増えた場合にもそのＮ−アセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基の量を評価できるという利点がある。そのため、上記転化率とは異なり、結合率は、１００％を超える値となる場合がある。結合率は、非還元末端修飾グルカンの使用される用途などに応じて適宜選択することができる。例えば、少量のＮ−アセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基が存在することが望まれる場合には、低い結合率（例えば、約１％〜約２％）を選択すればよく、多量のＮ−アセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基が存在することが望まれる場合には、高い結合率（例えば、約８０％〜約１２０％）を選択すればよい。
非還元末端修飾分岐グルカンの用途がＤＤＳ用ナノ粒子状キャリアの場合、Ｎ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基の結合率の合計は、好ましくは約２％以上であり、より好ましくは約５％以上であり、さらに好ましくは約１０％以上であり、最も好ましくは約１５％以上である；Ｎ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基の結合率の合計は、好ましくは約２００％以下であり、より好ましくは約１５０％以下であり、さらに好ましくは約１２０％以下であり、最も好ましくは約１００％以下である。
非還元末端修飾分岐グルカンの用途が抗原提示細胞刺激分子の場合、Ｎ−アセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基の結合率は、合計で、好ましくは約５％以上であり、より好ましくは約１０％以上であり、さらに好ましくは約１５％以上であり、最も好ましくは約２０％以上である；Ｎ−アセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基の結合率は、合計で、好ましくは約２００％以下であり、より好ましくは約１５０％以下であり、さらに好ましくは約１２０％以下であり、最も好ましくは約１００％以下である。
非還元末端修飾分岐グルカンの用途がＤＤＳキャリアの場合、グルカン１分子あたりのＮ−アセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基の結合数は、合計で、好ましくは約２以上であり、より好ましくは約５以上であり、さらに好ましくは約１０以上であり、特に好ましくは約２０以上、最も好ましくは約５０以上である。グルカン１分子あたりのＮ−アセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基の結合数は、合計で、好ましくは約５０００以下であり、より好ましくは約４０００以下であり、さらに好ましくは約３０００以下であり、最も好ましくは約２０００個以下である。
非還元末端修飾分岐グルカンの用途が抗原提示細胞刺激分子の場合、グルカン１分子あたりのＮ−アセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基の結合数は、合計で、好ましくは約２以上であり、より好ましくは約４以上であり、さらに好ましくは約８以上であり、特に好ましくは約１０以上、最も好ましくは約１５以上である。グルカン１分子あたりのＮ−アセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基の結合数は、合計で、好ましくは約２０００以下であり、より好ましくは約１０００以下であり、さらに好ましくは約５００以下であり、最も好ましくは約２００個以下である。
本発明の非還元末端修飾グルカンにおいて、Ｎ−アセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基のいずれもが結合していない非還元末端には、これらの単糖以外の糖の残基が結合していてもよい。すなわち、非還元末端のうちのいくつかがＮ−アセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基と結合し、残りの非還元末端がこれらの単糖以外の糖の残基と結合してもよい。
あるいは、非還元末端のうちのいくつかがＮ−アセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基と結合し、いくつかがこれらの単糖以外の糖の残基と結合し、そして残りの非還元末端には何も結合していない構造にすることも可能である。ここで、複数の非還元末端のうちの、Ｎ−アセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基に結合する末端の数と、これらの単糖以外の糖の残基に結合する末端の数と、糖に結合しない末端の数とは、自由に選択することが可能である。
本発明の特定の実施形態では、非還元末端に結合している糖残基はＮ−アセチルグルコサミン残基、ガラクトース残基またはそれらの単独もしくは組み合わせのオリゴマー（例えば、二量体）残基である。
水酸基修飾物については上記のとおりである。
非還元末端修飾物について説明する。非還元末端においてＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基から選択される少なくとも１つの残基がα−１，４結合したグルカン又はその修飾物のグルカン部分が分岐状α−１，４−グルカンであってＮ−アセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基が結合していない非還元末端が存在する場合、Ｎ−アセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基が結合していない非還元末端において他の物質と結合させることができる。好ましい実施形態では、Ｎ−アセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基のいずれもが結合していない非還元末端に「標的性分子」、「薬剤結合用分子」、または「細胞刺激分子」を結合させる。本明細書中では、用語「標的性分子」とは、組織ターゲット機能を有する分子をいう。標的性分子の例としては、マンノース、キシロース、フコース、ガラクトサミン、抗体、抗体フラグメント、受容体、受容体フラグメント及び受容体リガンドが挙げられる。マンノースはクッパー細胞をはじめとする種々のマクロファージや肝臓の類洞血管内皮細胞上に発現しているマンノースレセプターに認識されるため有効である。マンノースは、例えば、マンノース１−リン酸を基質にα−グルカンホスホリラーゼを作用させることにより、アセチルグルコサミン残基もしくはガラクトース残基を含有するグルカン又はその修飾物の非還元末端に結合され得る。酵素反応により結合させる場合、マンノースはＮ−アセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基が結合していない非還元末端グルコース残基の４位において結合する。例えば、マンノースとガラクトースとを任意の比率で組み合わせて、分岐グルカンの複数の非還元末端に結合させることも可能である。
本明細書中では、用語「薬剤結合用分子」とは、薬効成分との結合機能を有するアニオン性またはカチオン性の官能基を有する分子をいう。薬剤結合用分子にはグルコサミン、グルクロン酸、またはこれらの誘導体が挙げられる。グルコサミン残基との結合物の場合、非還元末端にアミノ基が付与される。アミノ基は水溶液中で正電荷を有するため、水溶液中で負電荷を有する薬剤との非共有結合による結合が可能となる。またアミノ基は薬剤との共有結合を介した結合にも利用できる。また、グルカンの非還元末端に付与されたアミノ基を化学的に修飾して、グルカンの非還元末端に疎水性基を導入することも可能となる。このようにして非還元末端に疎水性基が導入されたグルカンはタンパク質やペプチドとの疎水性相互作用による結合に利用できる。また、グルクロン酸残基との結合物の場合、非還元末端にカルボキシル基が付与される。カルボキシル基は水溶液中で負電荷を有するため、水溶液中で正電荷を有する薬剤との非共有結合による結合が可能となる。またカルボキシル基は薬剤との共有結合を介した結合にも利用できる。また、グルカンの非還元末端に付与されたカルボキシル基を化学的に修飾することにより、グルカンの非還元末端に疎水性基を導入することも可能となる。このようにして非還元末端に疎水性基が導入されたグルカンはタンパク質やペプチドと疎水性相互作用による結合に利用できる。
本明細書中では、用語「抗原提示細胞刺激性分子」とは、自然免疫応答における抗原提示細胞である樹状細胞やマクロファージを刺激する活性を有する分子をいう。抗原提示細胞刺激活性は、種々の方法によって測定され得る。本発明においては、抗原提示細胞刺激活性をインターロイキン−６（ＩＬ−６）の産生量によって測定することが好ましい。抗原提示細胞刺激性分子の例としてはＮ−アセチルグルコサミン、ガラクトース、マンノース、グルクロン酸、およびキシロースが挙げられる。複数の非還元末端にこれらの糖残基が結合することにより細胞刺激活性がいっそう強くなる。
非還元末端の修飾は、樹状細胞やマクロファージなどの抗原提示細胞を活性化するマンノース残基、ガラクトース残基などの糖残基を結合させることが好ましい。グルカンの非還元末端にＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基からなる群より選択される少なくとも２つ以上の残基が結合することが好ましい。さらに、Ｎ−アセチルグルコサミン残基、ガラクトース残基だけでなく、マンノース残基、グルクロン酸残基、グルコサミン残基、あるいはキシロース残基からなる群より選択される少なくとも２種以上の単糖残基が結合することがより好ましい。
本明細書中では、用語「アジュバント」とは抗原と一緒に投与され、その免疫応答を増強するために用いられる物質をいう。「Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ 免疫生物学」（監訳笹月健彦 南江堂）（原書「Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ ｓｅｖｅｎｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｍｕｒｐｈｙ， Ｐａｕｌ Ｔｒａｖｅｒｓ， Ｍａｒｋ Ｗａｌｐｏｒｔ ２００８ Ｇａｒｌｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｔａｙｌａｒ ＆Ｆｒａｎｃｉｓ Ｇｒｏｕｐ， ＬＬＣ」）には、細菌感染に応答して樹状細胞やマクロファージがＩＬ−６を産生することが記載されており、産生したＩＬ−６がリンパ球を活性化することおよびＩＬ−６が感染防御に働く抗体産生を増強することが記載されている。したがって、樹状細胞やマクロファージの活性化を高め、ＩＬ−６の産生が増強できれば免疫機能を増強できることを当業者は理解できる。本明細書実施例２０および２２〜２６において示すとおり、本発明の非還元末端修飾グルカンは、樹状細胞またはマクロファージと接触させることにより樹状細胞またはマクロファージのＩＬ−６産生を増加させることができた。そのため、本発明の非還元末端修飾グルカンがアジュバントとして作用できることは明らかである。
免疫賦活作用は、公知の方法で測定することができる。免疫賦活作用は細胞刺激活性とほぼ同義である。上記のように、ＩＬ−６産生は、細胞刺激活性の指標である。例えば、免疫賦活作用を有するサイトカインを誘導する作用を指標として測定することができる。本願明細書の実施例においては、免疫賦活作用を調べるために、サイトカインの１つであるＩＬ−６の産生によって、免疫応答に関与する樹状細胞およびマクロファージの細胞刺激活性化の指標を測定した。
還元末端修飾物について説明する。「Ｎ−アセチルグルコサミン残基含有グルカンの還元末端修飾物」とは、本発明のＮ−アセチルグルコサミン残基を含有するグルカンに存在する還元末端に別の物質を結合させたものをいう。「ガラクトース残基含有グルカンの還元末端修飾物」とは、本発明のガラクトース残基を含有するグルカンに存在する還元末端に別の物質を結合させたものをいう。好ましい実施形態では、還元末端において他の物質と結合させる方法は以下の２通りがある。第一は、公知の酵素的、あるいは公知の化学的手法により、他の物質に重合度２以上、より好ましくは重合度３以上、さらに好ましくは重合度４以上のマルトオリゴ糖の還元末端を結合させ、その後本発明の方法を用いてアセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基をマルトオリゴ糖の非還元末端に結合させる方法である。第二の方法は、本発明のアセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基を含有するグルカンの還元末端を、公知の酵素的手法により、他の物質に結合させる方法である。
第一の方法における酵素的に他の物質にマルトオリゴ糖を結合する方法は、例えば、特開平５−２７６８８３号公報、特開平０７−２４１１８１号公報及び国際公開番号ＷＯ０１／０７３１０６に開示されている。
第一の方法における酵素的に他の物質にマルトオリゴ糖を結合する方法は、アミン基を有する物質に対して用いることが出来る。例えばマルトペンタオースとアミン基を有する物質の化学的結合方法には、以下の三種がある：
（Ａ）マルトペンタオースの還元末端アルデヒドとアミン基を有する物質を還元アミノ化により結合する方法；
（Ｂ）マルトペンタオースの還元末端アルデヒドを酸化してマルトテトラオシルグルコン酸としたのち、アミン基を有する物質と縮合剤により脱水縮合する方法；および
（Ｃ）マルトペンタオースの還元末端アルデヒドを酸化してマルトテトラオシルグルコン酸としたのち脱水してマルトテトラオシルグルコノラクトンを調製し、これを、アミン基を有する物質と無水溶媒条件で加熱して結合させる方法。（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）の３種の方法は、特願２００８−１２１６９３に詳細に記載されている。また、これらの方法と同様にして高分子量のグルカンを他の物質に結合することができる。
第二の本発明のアセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基を含有するグルカンの還元末端を、酵素的手法により、他の物質に結合させる方法に利用可能な酵素は、糖質及び配糖体にのみ適用可能である。酵素には、ブランチングエンザイム、ＣＧＴａｓｅ、Ｄ酵素、アミロマルターゼなどのいわゆるグルカン鎖転移酵素を用いる。これら酵素はアセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基を含有するグルカン中のα−１，４結合を切断し、その非還元末端側のフラグメント（アセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基を含有するフラグメント）を受容体分子（ここでは糖質もしくは配糖体）に転移する。
結合させる物質の例としては、単糖、非還元性糖質類、生体適合性高分子、リポソーム構成成分、配糖体、アミン基含有低分子量物質が挙げられる。
単糖類の例としては、グルコサミン、グルクロン酸、グルコン酸などの官能基を有する単糖類が挙げられる。特にグルコサミン、グルクロン酸、またはグルコン酸が好ましい。グルコサミン残基との結合物の場合、還元末端にアミノ基が付与される。アミノ基は水溶液中で正電荷を有するため、水溶液中で負電荷を有する薬剤との非共有結合による結合が可能となる。またアミノ基は薬剤との共有結合を介した結合にも利用できる。またグルクロン酸残基あるいはグルコン酸残基との結合物の場合、還元末端にカルボキシル基が付与される。カルボキシル基は水溶液中で負電荷を有するため、水溶液中で正電荷を有する薬剤との非共有結合による結合が可能となる。またカルボキシル基は薬剤との共有結合を介した結合にも利用できる。また、グルカンの還元末端に付与されたカルボキシル基を化学的に修飾し、カチオン基又は疎水基を導入することが出来るため、例えば、タンパク質との疎水性相互作用による非共有結合を介した結合にも利用できる。還元性糖質類の例としては、ソルビトール、スクロース、トレハロース、デキストリン、及びアミロースが挙げられる。生体適合性高分子の例としては、デンプン、セルロース、キチン、キトサン、デキストラン、タンパク質、及びペプチドが挙げられる。リポソーム構成成分の例としては、リン脂質、脂肪酸、セラミド、及び界面活性剤が挙げられる。配糖体の例としては、アスコルビン酸グルコシド、ハイドロキノングルコシド、ヘスペリジングルコシド、ルチングルコシド、パラニトロフェニルマルトペンタオース、ドデシルマルトース、フラボノイド配糖体類、テルペン配糖体類、フェノール配糖体類、カルコン配糖体類、及びステロイド配糖体類が挙げられる。アミン基含有低分子物質の例としては、各種アミノ酸、ドデシルアミン、エチレンジアミン、ジエチルアミノエチルアミンなどが挙げられる。
別の実施形態において、非還元末端にＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基から選択される少なくとも１つの残基がα−１，４結合したグルカン（非還元末端修飾グルカン）の還元末端修飾物とは、グルカンの還元末端アルデヒドを酸化したものをいう。還元末端アルデヒドの酸化は過ヨウ素酸酸化などの公知の化学的手法により行なう。酸化によりアルデヒド基はカルボキシル基に変換する。直鎖状グルカンの非還元末端にアセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基が結合した分子の還元末端の酸化の例を以下の式に示す：
ここで、ｎは１以上の任意の整数である。
（３．非還元末端にＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基から選択される少なくとも１つの残基がα−１，４結合したグルカン及びその修飾物の利用）
本発明の非還元末端にＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基から選択される少なくとも１つの残基がα−１，４結合したグルカン及びその修飾物は、非還元末端にＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基から選択される少なくとも１つの残基が結合しているため、特定の組織にターゲッティングさせることができる。
本発明の非還元末端修飾グルカンを、医薬品の薬効成分の改質材料として利用する場合には、体内での改質材料の分解を制御する必要がある。グルカンが直鎖状α−１，４−グルカンである場合、α−アミラーゼによりすみやかな分解を受け、体内での存在時間が短くなりすぎる場合がある。このような場合、改質材料としての目的を果たすことが出来ない可能性がある。そこで、グルカンを構成するグルコースの水酸基の一部又はすべてを修飾することにより、分解に要する時間をコントロールすることが出来る。このようなアセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基を含有するグルカンの水酸基修飾物は本発明において好ましい。修飾は、エーテル化又はエステル化である。エーテル化は好ましくはハロゲン化アルキルまたはアルコールとのエーテル化である。エーテル化に使用されるハロゲン化アルキルまたはアルコールの炭素原子数は好ましくは１〜１０であり、より好ましくは１〜５であり、さらに好ましくは１〜３である。ハロゲン基は好ましくはフルオロ、クロロ、ブロモまたはヨードであり得る。エステル化は好ましくはカルボン酸またはハロゲン化アシルとのエステル化である。エステル化に使用されるカルボン酸またはハロゲン化アシルの炭素原子数は好ましくは１〜１０であり、より好ましくは１〜５である。修飾は望ましくはエステル化である。エステル化はより好ましくはアシル化であり、さらに好ましくはアセチル化である。
このように本発明の非還元末端修飾グルカン及びその修飾物は、グルカンの構造とその非還元末端の構造が自在に設計でき、これを利用することにより、医薬品の薬効成分の体内動態を自在にコントロールできる。体内で完全に分解可能な構造であり、蓄積による毒性を懸念することなく、安全に利用できる医薬品の薬効成分の改質材料である。
従って、本発明によれば、本発明の非還元末端修飾グルカン又はその修飾物と、薬効成分とを含む、医薬品が提供される。本発明の医薬品においては、薬効成分は、好ましくは、低分子量有機化合物、タンパク質、ペプチド、抗体、抗体フラグメント、受容体、受容体フラグメント、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびＲＮＡアプタマーからなる群より選択される。
特定の実施形態によれば、本発明によれば、本発明の非還元末端修飾グルカン、その水酸基修飾物、それらの還元末端修飾物、又はそれらのカルボン酸基修飾物を含む、臨床診断用組成物が提供される。
特定の実施形態によれば、本発明によれば、本発明の非還元末端修飾グルカン、その水酸基修飾物又はそれらの還元末端修飾物を含む、ＤＤＳ用ナノ粒子状キャリアが提供される。このＤＤＳ用ナノ粒子状キャリアは、好ましくは、リポソーム、ウイルス粒子、高分子ミセルおよび疎水化高分子ナノゲルからなる群より選択される。
（４．本発明の非還元末端にＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基から選択される少なくとも１つの残基がα−１，４結合したグルカン及びその修飾物が有する構造）
本明細書中では、グルカンの少なくとも１つの非還元末端のそれぞれに少なくとも１つのＮ−アセチルグルコサミン残基がα−１，４結合で結合しているがグルカンの非還元末端以外の位置にはＮ−アセチルグルコサミン残基が存在しないグルカンを「Ｎ−アセチルグルコサミン含有グルカン」という。本明細書中では、グルカンの少なくとも１つの非還元末端のそれぞれに少なくとも１つのガラクトース残基が結合しているがグルカンの非還元末端以外の位置にはガラクトース残基が存在しないグルカンを「ガラクトース含有グルカン」という。
なお、グルカンの１つの非還元末端に２つ以上のＮ−アセチルグルコサミン残基が結合する場合、グルカンの１つの非還元末端に１つのＮ−アセチルグルコサミン残基が結合し、そのＮ−アセチルグルコサミン残基の末端に次のＮ−アセチルグルコサミン残基が結合した構造になる。本明細書中では、グルカンの少なくとも１つの非還元末端にそれぞれ少なくとも１つのＮ−アセチルグルコサミン残基がα−１，４結合しているが非還元末端以外の位置にはＮ−アセチルグルコサミン残基が存在しないグルカンを「Ｎ−アセチルグルコサミン残基含有グルカン」という。ガラクトース残基についても同様である。
本明細書中では、グルカンの特定の非還元末端に対して、それぞれα−１，４結合で連結された２つ以上のＮ−アセチルグルコサミン残基からなる糖鎖が結合していて、グルカン中の非還元末端以外の位置にはＮ−アセチルグルコサミン残基が存在していない場合も、非還元末端のみにＮ−アセチルグルコサミン残基が結合していて、非還元末端以外の位置にはＮ−アセチルグルコサミン残基が存在しないとみなす。
本明細書中では、グルカンの特定の非還元末端に対して、それぞれα−１，４結合で連結された２つ以上のガラクトース残基からなる糖鎖が結合していて、グルカン中の非還元末端以外の位置にはガラクトース残基が存在していない場合も、非還元末端のみにガラクトース残基が結合していて、非還元末端以外の位置にはガラクトース残基が存在しないとみなす。
本発明の非還元末端修飾グルカンは、グルカンの少なくとも１つの非還元末端のそれぞれにＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基から選択される少なくとも１つの残基がα−１，４結合しているが、該グルカンの非還元末端以外の位置にはＮ−アセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基のいずれもが存在しない非還元末端修飾グルカンであって、該グルカンが分岐状α−１，４グルカンまたは直鎖状α−１，４グルカンである、非還元末端修飾グルカンである。非還元末端のそれぞれに結合する残基は、アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基から独立して選択され得る。それゆえ、分子全体としては、非還元末端には、アセチルグルコサミン残基のみ、ガラクトース残基のみ、またはアセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基が結合していてもよい。本明細書中の別の箇所に記載するとおり、非還元末端のうち、アセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基が結合していない非還元末端および非還元末端に結合しているアセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基には、グルクロン酸残基、グルコサミン残基、マンノース残基、およびキシロース残基から選択される残基がさらに結合していてもよい。
非還元末端修飾グルカンのグルカン部分が直鎖状グルカンの場合、非還元末端は１つなので、その非還元末端に１つのＮ−アセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基が結合している。非還元末端修飾グルカンのうちのグルカン部分が分岐状グルカンの場合、非還元末端は２つ以上あるので、そのうちの１つ以上の非還元末端にＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基から選択される少なくとも１つの残基が結合している。本発明の非還元末端修飾グルカンにおいては、非還元末端以外の位置にはＮ−アセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基が存在しない。非還元末端以外の位置にＮ−アセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基が存在しないことは、例えば、非還元末端修飾グルカンを過剰量のα−アミラーゼとグルコアミラーゼ、イソアミラーゼで処理することにより確認することができると考えられる。グルコアミラーゼはα−１,４およびα−１,６結合を非還元末端側から切断する酵素であり、非修飾分岐グルカンに作用させるとすべてグルコースに分解する。非還元末端にＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基から選択される少なくとも１つの残基がα−１，４結合したグルカンはグルコアミラーゼに抵抗性を示す。一方、α−アミラーゼはα−１，４グルカンに作用してマルトースとグルコースを生じるが、Ｎ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基から選択される少なくとも１つの残基がα−１，４結合したα−１，４グルカン鎖はα−アミラーゼに抵抗性を示す。非還元末端のみにアセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基を含むグルカンは過剰量のグルコアミラーゼとα−アミラーゼとイソアミラーゼで処理することにより、Ｎ−アセチルグルコサミニルマルトースまたはガラクトシルマルトース、グルコースを生じる。一方、非還元末端以外にもＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基から選択される少なくとも１つの残基がα−１，４結合したグルカンは過剰量のα−アミラーゼとイソアミラーゼで処理することにより、Ｎ−アセチルグルコサミニルマルトースまたはガラクトシルマルトース、グルコース以外の糖を生じる。この方法により、非還元末端以外の位置にＮ−アセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基が結合していないことを確認することができる。
本発明のグルカン、その修飾物などについては上記２．６に記載している。ここでは、本発明によるＮ−アセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基が結合したグルカンが有すると考えられる構造について以下に記載する。
（４．１）非還元末端にＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基から選択される少なくとも１つの残基がα−１，４結合した分岐状グルカン、その修飾物
本発明の非還元末端修飾グルカンに含まれるグルカン部分が分岐状α−１，４グルカンである場合、非還元末端修飾グルカンは、この分岐状α−１，４グルカンが有する複数の非還元末端のうちの少なくとも１つにＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基から選択される少なくとも１つの残基がα−１，４結合している。本発明によれば、非還元末端修飾分岐状グルカンの修飾物もまた提供される。修飾物の修飾については上記に詳述したとおりである。結合体で結合する物質についても上記に詳述したとおりである。
本発明の非還元末端修飾分岐状グルカン及びその修飾物に含まれる分岐状グルカン部分は、少なくとも２つ以上の非還元末端を有する分岐状α−１，４グルカンであって、好ましくは分岐マルトオリゴ糖、デンプン、アミロペクチン、グリコーゲン、デキストリン、酵素合成分岐グルカン及び高度分岐環状グルカンからなる群より選択される。これらの分岐状グルカン部分の好適な範囲については、「（１．１）グルカンおよびグルカンの修飾物」において説明したとおりである。
本発明の少なくとも２つ以上の非還元末端にＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基から選択される少なくとも１つの残基がα−１，４結合した分岐状α−１，４グルカンの分子量は、好ましくは約１×１０３以上であり、より好ましくは約３×１０３以上であり、さらに好ましくは約５×１０３以上である。本発明のＮ−アセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基を含有する分岐状グルカンの分子量は、好ましくは約１×１０９以下であり、より好ましくは約３×１０８以下であり、さらに好ましくは約１×１０８以下である。
本発明の非還元末端修飾分岐状α−１，４グルカンの修飾物の分子量は、好ましくは約１×１０３以上であり、より好ましくは約３×１０３以上であり、さらに好ましくは約５×１０３以上である。本発明の非還元末端修飾分岐状グルカンの修飾物の分子量は、好ましくは約１×１０９以下であり、より好ましくは約３×１０８以下であり、さらに好ましくは約１×１０８以下である。
本発明においては、非還元末端にＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基から選択される少なくとも１つの残基がα−１，４結合した分岐状グルカンの修飾物が好ましい。修飾はアシル化またはエーテル化であることが好ましく、アセチル化がより好ましい。アシル化度は、好ましくは約０．１以上であり、さらに好ましくは約０．２以上であり、特に好ましくは約０．３以上である。アシル化度は、アルカリ条件下での加熱により遊離する酢酸の定量によって計算される。エーテル化度は、好ましくは約０．１以上であり、さらに好ましくは約０．２以上であり、特に好ましくは約０．３以上である。エーテル化度は、ＮＭＲによって計算される。
本発明の非還元末端にＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基から選択される少なくとも１つの残基がα−１，４結合した分岐状グルカン及びその修飾物に結合しているアセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基の数は、それぞれ独立して、１分子あたり、好ましくは１個以上であり、より好ましくは２個以上であり、さらに好ましくは３個以上である。本発明の非還元末端にＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基から選択される少なくとも１つの残基がα−１，４結合した分岐状グルカン又はその修飾物に結合しているＮ−アセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基の数は、これらに限定されず、例えば、１分子あたり、５個以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、５０個以上、１００個以上などであってもよい。目的により適切に調整され得る。本発明の非還元末端にＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基から選択される少なくとも１つの残基がα−１，４結合した分岐状グルカン又はその修飾物に結合しているアセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基の数の上限は、合計として、分岐状グルカン部分の非還元末端の数である。本発明の非還元末端にＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基から選択される少なくとも１つの残基がα−１，４結合した分岐状グルカン又はその修飾物に結合しているＮ−アセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基の数は、例えば、それぞれ独立して、１分子あたり、約１０００個以下、約８００個以下、約７００個以下、約６００個以下、約５００個以下、約４００個以下、約３００個以下、約２００個以下、約１００個以下、約５０個以下などであり得る。
特定の実施形態では、本発明の非還元末端にＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基から選択される少なくとも１つの残基がα−１，４結合した分岐状グルカン及びその修飾物に結合しているＮ−アセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基の数は、合計として、分岐状グルカン部分が有する非還元末端の数の好ましくは約１０％以上であり、より好ましくは約２０％以上であり、特に好ましくは約３０％以上であり、例えば、約４０％以上、約５０％以上または約６０％以上であり得る。特定の実施形態では、本発明の非還元末端にＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基から選択される少なくとも１つの残基がα−１，４結合した分岐状グルカン及びその修飾物に結合しているＮ−アセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基の数は、合計として、分岐状グルカン部分が有する非還元末端の数の好ましくは約１００％以下であり、より好ましくは約９０％以下であり、特に好ましくは約８０％以下であり、例えば、約７０％以下、約６０％以下または約５０％以下であり得る。
（４．２）非還元末端にＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基から選択される少なくとも１つの残基がα−１，４結合した直鎖状グルカン及びその修飾物
本発明の非還元末端修飾直鎖状グルカンは、直鎖状グルカン部分の非還元末端にＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基から選択される少なくとも１つの残基がα−１，４結合している。直鎖状グルカンは非還元末端を１つしか有さないので、本発明の非還元末端修飾直鎖状グルカンは、Ｎ−アセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基を１つしか含まない。本発明によれば、非還元末端修飾直鎖状グルカンの修飾物もまた提供される。修飾物の修飾については上記に詳述したとおりである。
本発明の非還元末端修飾直鎖状グルカンは、直鎖状グルカン部分の非還元末端にＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基から選択される少なくとも１つの残基がα−１，４結合している。直鎖状グルカンは非還元末端を１つしか有さないので、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸またはガラクトース−１−リン酸とグルカンとの反応時に反応液に添加するＮ−アセチルグルコサミン−１−リン酸またはガラクトース−１−リン酸の量が少なければ、本発明の非還元末端修飾直鎖状グルカンは、Ｎ−アセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基を１つしか含まない。Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸またはガラクトース−１−リン酸とグルカンとの反応時に反応液に添加するＮ−アセチルグルコサミン−１−リン酸またはガラクトース−１−リン酸の量が多い場合、α−１，４結合で結合した２つ以上のＮ−アセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基が直鎖状グルカンの非還元末端に結合する場合もある。本発明によれば、Ｎ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基から選択される少なくとも１つの残基がα−１，４結合した直鎖状グルカンの修飾物もまた提供される。本発明によれば、Ｎ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基から選択される少なくとも１つの残基がα−１，４結合した直鎖状グルカン又はその修飾物の結合体もまた提供される。修飾物の修飾については上記に詳述したとおりである。結合体においてアミノ糖含有グルカンまたはその修飾物に結合している物質についても上記に詳述したとおりである。
本発明のＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基から選択される少なくとも１つの残基がα−１，４結合した直鎖状グルカン又はその修飾物に含まれる直鎖状グルカン部分は、好ましくはマルトオリゴ糖、アミロース（例えば、天然のアミロースまたは酵素合成アミロース）及びそれらの誘導体からなる群より選択される。これらの直鎖状グルカン部分の好適な範囲については、「（１．１）グルカンおよびグルカンの修飾物」において説明したとおりである。
本発明の非還元末端修飾直鎖状グルカンの分子量は、好ましくは約４５０以上であり、より好ましくは約６００以上であり、さらに好ましくは約１×１０３以上である。本発明の非還元末端修飾直鎖状グルカンの分子量は、好ましくは約２×１０５以下であり、より好ましくは約１．５×１０５以下であり、さらに好ましくは約１×１０５以下である。
本発明の非還元末端修飾直鎖状グルカンの修飾物の分子量は、好ましくは約４５０以上であり、より好ましくは約６００以上であり、さらに好ましくは約１×１０３以上である。本発明の非還元末端修飾直鎖状グルカンの修飾物の分子量は、好ましくは約２×１０５以下であり、より好ましくは約１．５×１０５以下であり、さらに好ましくは約１×１０５以下である。
本発明においては、非還元末端修飾直鎖状グルカンの修飾物が好ましい。修飾は、アシル化またはエーテル化であることが好ましく、アセチル化がより好ましい。アシル化度は、好ましくは約０．１以上であり、さらに好ましくは約０．２以上であり、特に好ましくは約０．３以上である。アシル化度は、アルカリ条件下での加熱により遊離する酢酸の定量によって計算される。エーテル化度は、好ましくは約０．１以上であり、さらに好ましくは約０．２以上であり、特に好ましくは約０．３以上である。エーテル化度は、ＮＭＲによって計算される。
本発明の非還元末端修飾直鎖状グルカンの例は、例えば以下の式１の構造によって示され得る：
ここでｎは１以上の整数である。ｎは好ましくは約１以上であり、より好ましくは約２以上であり、さらに好ましくは約３以上であり、なおさらに好ましくは約５以上であり、特に好ましくは約８以上であり、最も好ましくは約１０以上である。ｎは好ましくは約１２００以下であり、より好ましくは約９００以下であり、さらに好ましくは約６００以下である。
本発明の非還元末端修飾直鎖状グルカンおよびその還元末端修飾物の例は、例えば以下の式２の構造によって示され得る：
ここでｎは１以上の整数である。ｎは好ましくは約１以上であり、より好ましくは約２以上であり、さらに好ましくは約３以上であり、なおさらに好ましくは約５以上であり、特に好ましくは約８以上であり、最も好ましくは約１０以上である。ｎは好ましくは約１２００以下であり、より好ましくは約９００以下であり、さらに好ましくは約６００以下である。Ｘは、水素、単糖、非還元性糖質類、生体適合性高分子、リポソーム構成成分、配糖体およびアミン基含有低分子量物質からなる群より選択される。Ｘは、好ましくは、水素、グルコサミン、グルクロン酸、グルコン酸、ソルビトール、スクロース、トレハロース、デキストリン、アミロース、デンプン、セルロース、キチン、キトサン、デキストラン、タンパク質、ペプチド、リン脂質、脂肪酸、セラミド、界面活性剤、アスコルビン酸グルコシド、ハイドロキノングルコシド、ヘスペリジングルコシド、ルチングルコシド、セラミド、パラニトロフェニルマルトペンタオース、ドデシルマルトース、フラボノイド配糖体類、テルペン配糖体類、フェノール配糖体類、カルコン配糖体類、ステロイド配糖体類、アミノ酸、ドデシルアミン、エチレンジアミン及びジメチルアミノエチルアミンからなる群より選択される。より好ましくは水素、グルコサミン、グルクロン酸、グルコン酸、デキストリン、アミロースからなる群より選択される。特に、水素、グルコサミン、グルクロン酸、グルコン酸、デキストリンが好ましい。ただし、Ｘがアミンなどの場合、グルカンの還元末端部分は開裂するため、本発明の還元末端修飾物は以下のように示され得る：
Ｘが水素であってＹがＮ−アセチルグルコサミン残基である場合、この分子はＮ−アセチルグルコサミン含有直鎖状グルカンであり、Ｘが水素以外の物質であってＹがＮ−アセチルグルコサミン残基である場合、この分子はＮ−アセチルグルコサミン含有直鎖状グルカン還元末端修飾物である。Ｘが水素であってＹがガラクトース残基である場合、この分子はガラクトース含有直鎖状グルカンであり、Ｘが水素以外の物質であってＹがガラクトース残基である場合、この分子はガラクトース含有直鎖状グルカン還元末端修飾物である。
本発明の非還元末端修飾直鎖状グルカン、その水酸基修飾物およびその還元末端修飾物の例は、例えば以下の式３の構造によって示され得る：
ここでｎは１以上の整数である。ｎは好ましくは約１以上であり、より好ましくは約２以上であり、さらに好ましくは約３以上であり、なおさらに好ましくは約５以上であり、特に好ましくは約８以上であり、最も好ましくは約１０以上である。ｎは好ましくは約１２００以下であり、より好ましくは約９００以下であり、さらに好ましくは約６００以下である。Ｘは、好ましくは、水素、単糖、非還元性糖質類、生体適合性高分子、リポソーム構成成分、配糖体およびアミン基含有低分子量物質からなる群より選択される。Ｘは、より好ましくは、水素、グルコサミン、グルクロン酸、グルコン酸、ソルビトール、スクロース、トレハロース、デキストリン、アミロース、デンプン、セルロース、キチン、キトサン、デキストラン、タンパク質、ペプチド、リン脂質、脂肪酸、セラミド、界面活性剤、アスコルビン酸グルコシド、ハイドロキノングルコシド、ヘスペリジングルコシド、ルチングルコシド、セラミド、パラニトロフェニルマルトペンタオース、ドデシルマルトース、フラボノイド配糖体類、テルペン配糖体類、フェノール配糖体類、カルコン配糖体類、ステロイド配糖体類、アミノ酸及びドデシルアミン、エチレンジアミン及びジメチルアミノエチルアミンからなる群より選択される。より好ましくは水素、グルコサミン、グルクロン酸、グルコン酸、デキストリン、アミロースからなる群より選択される。特に、水素、グルコサミン、グルクロン酸、グルコン酸、デキストリンが好ましい。ここで、Ｒは、好ましくは、水素、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基およびリン酸基からなる群より独立して選択される。ただし、Ｘがアミンなどの場合、グルカンの還元末端部分は開裂するため、本発明の還元末端修飾物は以下のように示され得る：
Ｘおよび全てのＲが水素であってＹがＮ−アセチルグルコサミン残基である場合、この分子はＮ−アセチルグルコサミン含有直鎖状グルカンであり；Ｘが水素であってＲがそれぞれ独立して水素または他の基であるがただし少なくとも１つのＲが水素以外の基であって、Ｙがアセチルグルコサミン残基である場合、この分子はＮ−アセチルグルコサミン含有直鎖状グルカンの水酸基修飾物であり；Ｘが水素以外の物質であって全てのＲが水素であって、ＹがＮ−アセチルグルコサミン残基であるである場合、この分子はＮ−アセチルグルコサミン含有直鎖状グルカン還元末端修飾物であり；Ｘが水素以外の物質であってＲがそれぞれ独立して水素または他の基であるがただし少なくとも１つのＲが水素以外の基であって、ＹがＮ−アセチルグルコサミン残基である場合、この分子はＮ−アセチルグルコサミン含有直鎖状グルカン水酸基修飾物の還元末端修飾物である。Ｘおよび全てのＲが水素であってＹがガラクトース残基である場合、この分子はガラクトース含有直鎖状グルカンであり；Ｘが水素であってＲがそれぞれ独立して水素または他の基であるがただし少なくとも１つのＲが水素以外の基であって、Ｙがガラクトース残基である場合、この分子はガラクトース含有直鎖状グルカンの水酸基修飾物であり；Ｘが水素以外の物質であって全てのＲが水素であって、Ｙがガラクトース残基であるである場合、この分子はガラクトース含有直鎖状グルカン還元末端修飾物であり；Ｘが水素以外の物質であってＲがそれぞれ独立して水素または他の基であるがただし少なくとも１つのＲが水素以外の基であって、Ｙがガラクトース残基である場合、この分子はガラクトース含有直鎖状グルカン水酸基修飾物の還元末端修飾物である。
本発明の非還元末端修飾グルカンの例は、例えば以下の式５の構造によって示され得る：
ここでｍは１以上の整数である。ｍは好ましくは約１以上であり、より好ましくは約２以上であり、さらに好ましくは約３以上であり、なおさらに好ましくは約５以上であり、特に好ましくは約８以上であり、最も好ましくは約１０以上であり、ｍは好ましくは約１２００以下であり、より好ましくは約９００以下であり、さらに好ましくは約６００以下である。Ｒ１は独立して、Ｈ、式Ａの構造を有するグルカン鎖または式Ｂの構造を有するグルカン鎖である。全てのＲ１がＨの場合、式５に示されるグルカンは直鎖状グルカンである。少なくとも１つのＲ１が式Ａまたは式Ｂの構造を有する場合、式５に示されるグルカンは分岐状グルカンである。
式Ａにおいて、ｋは１以上の整数である。ｋは好ましくは約１以上であり、より好ましくは約２以上であり、さらに好ましくは約３以上であり、なおさらに好ましくは約５以上であり、特に好ましくは約８以上であり、最も好ましくは約１０以上であり、ｋは好ましくは約１００以下であり、より好ましくは約２５以下であり、さらに好ましくは約２０以下である。式Ａにおいて、Ｒ２はそれぞれ独立して、Ｈ、式Ａの構造を有するグルカン鎖または式Ｂの構造を有するグルカン鎖である。
式Ｂにおいて、ｓは１以上の整数である。ｓは好ましくは約１以上であり、より好ましくは約２以上であり、さらに好ましくは約３以上であり、なおさらに好ましくは約５以上であり、特に好ましくは約８以上であり、最も好ましくは約１０以上であり、ｓは好ましくは約１００以下であり、より好ましくは約２５以下であり、さらに好ましくは約２０以下である。式Ｂにおいて、Ｒ３は独立して、Ｈ、式Ａの構造を有するグルカン鎖または式Ｂの構造を有するグルカン鎖である。
上記で説明したように、式５において、Ｒ１は、式Ａの構造を有する基のＲ２または式Ｂの構造を有する基のＲ３の位置において何度か式Ａの構造を有する基または式Ｂの構造を有する基によって置換された構造を有し得る。式Ａと式Ｂで置換された回数の合計は、式５で表された分岐グルカン分子の単位鎖数に等しい。分岐グルカン分子の単位鎖数は、好ましくは約１以上であり、より好ましくは約１０以上であり、さらに好ましくは約３０以上である。分岐グルカン分子の単位鎖数は、好ましくは約５０００以下であり、より好ましくは約２０００以下であり、さらに好ましくは約１０００以下である。
本発明の非還元末端修飾グルカン又はその水酸基修飾物の例は、例えば以下の式６の構造によって示され得る：
ここでｍは１以上の整数である。ｍは好ましくは約１以上であり、より好ましくは約２以上であり、さらに好ましくは約３以上であり、なおさらに好ましくは約５以上であり、特に好ましくは約８以上であり、最も好ましくは約１０以上であり、ｍは好ましくは約１２００以下であり、より好ましくは約９００以下であり、さらに好ましくは約６００以下である。Ｒ１は独立して、Ｈ、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基、式６Ａの構造を有するグルカン鎖または式６Ｂの構造を有するグルカン鎖である。
式６Ａにおいて、ｋは１以上の整数である。ｋは好ましくは約１以上であり、より好ましくは約２以上であり、さらに好ましくは約３以上であり、なおさらに好ましくは約５以上であり、特に好ましくは約８以上であり、最も好ましくは約１０以上であり、ｋは好ましくは約１００以下であり、より好ましくは約２５以下であり、さらに好ましくは約２０以下である。式６Ａにおいて、Ｒ２はそれぞれ独立して、Ｈ、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基、式６Ａの構造を有するグルカン鎖または式６Ｂの構造を有するグルカン鎖である。
式６Ｂにおいて、ｓは１以上の整数である。ｓは好ましくは約１以上であり、より好ましくは約２以上であり、さらに好ましくは約３以上であり、なおさらに好ましくは約５以上であり、特に好ましくは約８以上であり、最も好ましくは約１０以上であり、ｓは好ましくは約１００以下であり、より好ましくは約２５以下であり、さらに好ましくは約２０以下である。式６Ｂにおいて、Ｒ３は独立して、Ｈ、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基およびリン酸基、式６Ａの構造を有するグルカン鎖または式６Ｂの構造を有するグルカン鎖である。
式６、式６Ａおよび式６Ｂにおいて、Ｒ４は、Ｈ、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基、リン酸基からなる群から独立して選択される。
本発明の非還元末端修飾グルカン、その水酸基修飾物およびそれらの還元末端修飾物の例は、例えば以下の式７の構造によって示され得る：
ここでｍは１以上の整数である。ｍは好ましくは約１以上であり、より好ましくは約２以上であり、さらに好ましくは約３以上であり、なおさらに好ましくは約５以上であり、特に好ましくは約８以上であり、最も好ましくは約１０以上であり、ｍは好ましくは約１２００以下であり、より好ましくは約９００以下であり、さらに好ましくは約６００以下である。Ｒ１は独立して、Ｈ、式６Ａの構造を有するグルカン鎖または式６Ｂの構造を有するグルカン鎖である。式６Ａおよび式６Ｂについては、上記式６についての定義と同様である。
式７、式６Ａおよび式６Ｂにおいて、Ｒ４は、水素、ヒドロキシアルキル基、アルキル基、アセチル基、カルボキシメチル基、硫酸基およびリン酸基からなる群から独立して選択され、
式７において、Ｘは、好ましくは、単糖、非還元性糖質類、生体適合性高分子、リポソーム構成成分、配糖体およびアミン基含有低分子量物質からなる群より独立して選択される。Ｘは、より好ましくは、水素、グルコサミン、グルクロン酸、グルコン酸、ソルビトール、スクロース、トレハロース、デキストリン、アミロース、デンプン、セルロース、キチン、キトサン、デキストラン、タンパク質、ペプチド、リン脂質、脂肪酸、界面活性剤、アスコルビン酸グルコシド、ハイドロキノングルコシド、ヘスペリジングルコシド、ルチングルコシド、セラミド、パラニトロフェニルマルトペンタオース、ドデシルマルトース、フラボノイド配糖体類、テルペン配糖体類、フェノール配糖体類、カルコン配糖体類、ステロイド配糖体類、アミノ酸及びドデシルアミン、エチレンジアミン及びジメチルアミノエチルアミンからなる群より選択される。より好ましくは水素、グルコサミン、グルクロン酸、グルコン酸、デキストリン、アミロースからなる群より選択される。特に、水素、グルコサミン、グルクロン酸、グルコン酸、またはデキストリンが好ましい。ただし、Ｘがアミンなどの場合、グルカンの還元末端部分は開裂するため、本発明の還元末端修飾物は以下のように示され得る：
本明細書中の他の箇所に記載するように、本発明の非還元末端修飾グルカンは、その複数の非還元末端のうちの少なくとも１つ以上の非還元末端にグルクロン酸残基、マンノース残基およびキシロース残基のうちの少なくとも１種の残基が結合していてもよい。例えば、１つの実施形態において、上記式５、６または７のグルカンの場合、Ｙで示される残基は、Ｎ−アセチルグルコサミン残基、ガラクトース残基、グルクロン酸残基、マンノース残基およびキシロース残基からなる群より選択される残基であり、ただし、分子中の少なくとも１つのＹはＮ−アセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基である。
本発明の非還元末端修飾グルカンの還元末端修飾例と修飾の目的を以下の表１にまとめる。表中の構造は一例である。
表１では、非還元末端にＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基から選択される少なくとも１つの残基が結合した場合を例示している。本明細書中の他の箇所でも説明したとおり、Ｎ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基から選択される２個以上の残基がα１，４−結合したオリゴ糖残基が非還元末端に結合してもよい。また、Ｎ−アセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基の４位にグルコース残基、マンノース残基、グルクロン酸残基、グルコサミン残基、キシロース残基またはそれらから構成されたオリゴ糖の残基などが結合してもよい。また、例えば、複数の非還元末端を有する分岐グルカンの場合、表１に示されるＹの位置には、Ｎ−アセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基が複数結合してもよい。またＮ−アセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基以外のグルコース残基、マンノース残基、グルクロン酸残基、グルコサミン残基、キシロース残基またはそれらから構成されたオリゴ糖の残基などが１種または２種以上結合してもよい。
本発明の非還元末端修飾グルカン、その水酸基修飾物、非還元末端修飾物および還元末端修飾物は、生分解性があるため、生体に安全に使用することができる。本明細書中では、用語「生分解性」とは、体内において、体外へ排泄可能な分子量まで分解され得ることをいう。本発明の非還元末端修飾グルカン、その水酸基修飾物、非還元末端修飾物および還元末端修飾物は、体内のアミラーゼの組合せによってオリゴ糖サイズまで分解され得る。
本発明の非還元末端修飾グルカン、その水酸基修飾物、非還元末端修飾物および還元末端修飾物はまた、生体適合性である。本明細書中では、用語「生体適合性」とは、生体に対して毒性および免疫学的拒絶能がないことをいう。
（医薬の製造）
本発明の非還元末端修飾グルカン、水酸基修飾物、非還元末端修飾物および還元末端修飾物は、非還元末端のＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基が組織ターゲティング特性および臓器集積性を有しているため、ＤＤＳキャリアとして有効に利用できる。薬物と混合することにより、あるいは公知の方法を用いて薬物と結合させることにより、好適に利用され得る。
特に、本発明の非還元末端にＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基から選択される少なくとも１つの残基がα−１，４結合したグルカン（非還元末端修飾グルカン）の非還元末端修飾物および還元末端修飾物は、薬効成分の結合機能および組織ターゲティング機能の２つの機能を兼ね備えた有効な薬効成分の改質材料として利用できる。
本発明の非還元末端にＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基から選択される少なくとも１つの残基がα−１，４結合したグルカン（非還元末端修飾グルカン）の非還元末端修飾物が、例えばグルクロン酸残基を含有する場合、非還元末端にカルボキシル基が付与される。カルボキシル基は水溶液中で負電荷を有するため、水溶液中で正電荷を有する薬剤（例えばポリペプチド（例えば、タンパク質、オリゴペプチドなど)、カチオン性ポリマー、カチオン性脂質など）との非共有結合による結合が可能となる。またカルボキシル基は薬剤との共有結合を介した結合にも利用できる。例えば、グルカンの非還元末端に付与されたカルボキシル基を化学的に修飾し、カチオン基又は疎水基を導入することが出来るため、例えば、タンパク質との疎水性相互作用による非共有結合を介した結合にも利用できる。例えば、グルコサミン残基を含有する場合、非還元末端にアミノ基が付与される。アミノ基は水溶液中で正電荷を有するため、水溶液中で負電荷を有する薬剤（例えば、核酸分子、アニオン性ポリマー、アニオン性脂質など）との非共有結合による結合が可能となる。またアミノ基は薬剤との共有結合を介した結合にも利用できる。
本発明の非還元末端修飾グルカンの還元末端修飾物が、例えば、エチレンジアミンとの還元末端結合物の場合、還元末端にアミノ基が付与される。アミノ基は水溶液中で正電荷を有するため、水溶液中で負電荷を有する薬剤との非共有結合による結合が可能となる。また、アミノ基は薬剤との共有結合を介した結合にも利用できる。
本発明のＮ−アセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基を含有するグルカンの還元末端修飾物が、例えば、還元末端の酸化物である場合、還元末端にカルボキシル基が付与される。カルボキシル基は水溶液中で負電荷を有するため、水溶液中で正電荷を有する薬剤との非共有結合による結合が可能となる。またカルボキシル基は薬剤との共有結合を介した結合にも利用できる。また、グルカンの非還元末端に付与されたカルボキシル基を化学的に修飾し、カチオン基又は疎水基を導入した場合には、例えば、タンパク質との疎水性相互作用による非共有結合を介した結合にも利用できる。
本発明の非還元末端修飾グルカン、その水酸基修飾物、非還元末端修飾物および還元末端修飾物は、非還元末端のＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基が樹状細胞、マクロファージなど抗原提示細胞の刺激活性を有しているため医薬品用ワクチンアジュバントとして利用できる。本発明のグルクロン酸、グルコサミン、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン、ガラクトースまたはキシロース残基を１種または２種以上、非還元末端に少なくとも２つ以上が含有するグルカン、水酸基修飾物、非還元末端修飾物および還元末端修飾物は、樹状細胞、マクロファージなど抗原提示細胞の刺激活性が増加しているため医薬品用ワクチンアジュバントとして利用できる。
本発明によれば、非還元末端にＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基から選択される少なくとも１つの残基がα−１，４結合した非還元末端修飾グルカン、その水酸基修飾物、その非還元末端修飾物およびその還元末端修飾物を含む、抗原提示細胞刺激活性用組成物もまた提供される。
（治療方法）
本発明の非還元末端にＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基から選択される少なくとも１つの残基がα−１，４結合した非還元末端修飾グルカン、その水酸基修飾物、その非還元末端修飾物およびその還元末端修飾物は、薬効成分のキャリアとして使用される。そのため、これらのキャリアと薬効成分との混合物を被験体に投与することを含む治療方法もまた提供される。目的とする疾患と薬効成分との組み合わせ、その投与経路、投与頻度、投与量などは当業者が適切に設定することができる。
本発明によれば、抗原提示細胞刺激活性を有する本発明の非還元末端にＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基から選択される少なくとも１つの残基がα−１，４結合した非還元末端修飾グルカン、その水酸基修飾物、その非還元末端修飾物およびその還元末端修飾物を被験体に投与することを包含する、癌免疫療法、炎症治療方法または免疫賦活方法もまた提供される。
本発明の非還元末端修飾グルカンにグルクロン酸残基などの負に荷電し得る残基または基を結合させた場合、得られるグルカンは、抗体治療、薬物治療などに有用に使用され得る。抗体治療の特定の実施形態では、本発明の治療方法は、本発明のこのような非還元末端修飾グルカン、その水酸基修飾物、その非還元末端修飾物およびその還元末端修飾物と抗体タンパク質分子との複合体を被験体に投与することを包含する。
本発明の非還元末端修飾グルカンにグルコサミン残基などの正に荷電し得る残基または基を結合させた場合、得られるグルカンは、遺伝子治療、薬物治療などに有用に使用され得る。遺伝子治療の特定の実施形態では、本発明の治療方法は、本発明のこのような非還元末端修飾グルカン、その水酸基修飾物、その非還元末端修飾物およびその還元末端修飾物と核酸分子との複合体を被験体に投与することを包含する。
特定の実施形態では、本発明の非還元末端修飾グルカンにグルコサミン残基などの正に荷電し得る残基または基を結合させた場合、得られるグルカンと核酸分子との複合体キャリアと、カチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質とから形成された複合体を被験体に投与することを包含する方法であって、該核酸分子は、治療用遺伝子を含む、方法もまた提供される。薬物治療の特定の実施形態では、本発明の治療方法は、本発明のこのようなグルカンと薬効成分との複合体を被験体に投与することを包含する。
目的の疾患の治療に適切な治療用タンパク質をコードする遺伝子を含む核酸分子もまた、従来の遺伝子工学技術を用いて生産することができる。核酸分子は発現ベクターまたはプラスミドであってよい。目的の疾患の治療に適切なタンパク質、それをコードする遺伝子、その調製、送達などに用いられる発現ベクター、プラスミドおよびそれらに含まれるエレメントについては当該分野で公知である。
以下、本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明は、実施例に限定されるものではない。実施例において使用したＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼは、以下の製造例１によって調製したＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼである。
（製造例１：Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼの調製）
下記の方法によりＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼを組換え生産した。
（Ａ）Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼ遺伝子の作製
Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼ遺伝子のアミノ酸配列（配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列；米国生物工学情報センター（ＮＣＢＩ； Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＧｅｎＢａｎｋ塩基配列データベースのＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号ＡＥ０００６５７の４９１３８０−４９３４５８番目までの塩基配列（配列番号１）を翻訳して得られるアミノ酸配列）をコードする塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ塩基配列データベースのＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号ＡＥ０００６５７の４９１３８０−４９３４５８番目までの塩基配列）を有する核酸（「α−グルカンホスホリラーゼ遺伝子」ともいう）を、当業者に周知の方法により、化学的に合成した。このα−グルカンホスホリラーゼ遺伝子の翻訳開始コドン上流にはＮｄｅＩサイトを設けた。また、翻訳停止コドン下流にはＢａｍＨＩサイトを設け、この合成遺伝子をＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで切断し、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩであらかじめ切断したプラスミドｐＥＴ１１ｃ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に挿入し、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼ遺伝子をもったプラスミドｐＥＴ−ＡｑＧＰを作製した。
（Ｂ）Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼ遺伝子の大腸菌における発現
このプラスミドｐＥＴ−ＡｑＧＰで、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を常法に従って形質転換し、形質転換体を得た。形質転換体を含む液体を、アンピシリン含有ＬＢ寒天培地（１００μｇ／ｍｌアンピシリン、Ｄｉｆｃｏ製トリプトン１％、Ｄｉｆｃｏ製酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ０．５％、寒天１．５％、ｐＨ７．３）に独立したコロニーが得られるように希釈して塗布し、３７℃で一晩培養した。このアンピシリン含有ＬＢ寒天培地で増殖した大腸菌は、導入したプラスミドを保有し、かつ発現することができる形質転換体である。このようにしてα−グルカンホスホリラーゼ遺伝子を発現する大腸菌を作製できた。
（Ｃ）Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼ酵素の調製
上記（Ｂ）で作製した、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼ遺伝子を発現する大腸菌を、ＬＢ培地（５０μｇ／ｍｌアンピシリン、Ｄｉｆｃｏ製トリプトン１％、Ｄｉｆｃｏ製酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ ０．５％、ｐＨ ７．３）に植菌し、３７℃で５時間培養した。次いで、最終濃度が０．１ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）および１ｍＭ塩酸ピリドキシンとなるようにこの培養液にＩＰＴＧおよび塩酸ピリドキシンを加え、さらに３７℃で２４時間培養した。次いで、培養液を遠心分離することにより菌体を回収し、２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）で培地成分を洗浄し、除去した。洗浄後の菌体を２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．７）に懸濁し、超音波破砕機によって菌体を破砕し、遠心分離し、その上清を菌体抽出液とした。得られた菌体抽出液を、６０℃３０分間加熱した。次いで、この菌体抽出液を予め平衡化されたＱ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦカラムにロードし、２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ ６．７）中、０．１Ｍから０．３ＭのＮａＣｌの濃度勾配で溶出し、ＧＰ精製酵素含有活性画分を回収した。
得られた精製酵素含有活性画分を約１μｇ使用して、ネイティブＰＡＧＥ（Ｎａｔｉｖｅ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を行った。その結果、α−グルカンホスホリラーゼを発現する大腸菌から得られた画分では、分子量約１５０ｋＤａの位置に単一のバンドが認められ、他の場所にはバンドが見られなかった。Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼの分子量は、アミノ酸配列から計算して約７５ｋＤａであると推定されるので、このネイティブＰＡＧＥの結果、このα−グルカンホスホリラーゼは、ダイマー構造をとっていると考えられる。このようにして、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼが均質に精製されたことが示された。
（製造例２：分岐グルカンの製造）
５０ｇのワキシーコーンスターチ（三和澱粉工業株式会社製）を１０００ｍｌの１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、約１００℃に加熱することにより糊化させた。約７０℃まで冷却した糊液に特開２０００−３１６５８１の実施例１に記載された方法に従って調製した高度耐熱性ブランチングエンザイムを２００，０００単位添加して反応液を調製した後、７０℃で１６時間反応させた。反応液を１００℃で２０分間加熱した後、６，５００ｒｐｍで１０分間遠心後の上清を孔径０．８μｍの膜でろ過した。次に、濾液をゲルろ過クロマトグラフィー（ＡＫＴＡ ｐｕｒｉｆｅｒ）システム（カラム：ＧＥヘルスケア製 ＨｉＰｒｅｐＴＭ ２６／１０ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ）を用い脱塩し、低分子量多糖を除去した。１０００ｍｌの濾液を７．５ｍｌのアリコートに分けてゲルろ過クロマトグラフィーシステムにアプライし、それぞれ流速１０ｍｌ／分の２．７分から３．７分までの溶出画分を分取した。１０００ｍｌの濾液から得られた溶出画分を合わせて孔径０．２μｍの膜でろ過した後凍結乾燥することにより、分岐グルカンの粉末約３５ｇを得た。分岐グルカンの重量平均分子量は多角度レーザー光散乱光度計（ワイアットテクノロジー社製、ＤＡＷＮ ＤＳＰ）と示差屈折計（昭和電工株式会社製、Ｓｈｏｄｅｘ ＲＩ−７１）を備えた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システム（カラム：昭和電工株式会社製、ＯＨＰＡＫ ＳＢ−８０６ＭＨＱ）を用いて調べた。分岐グルカンの粉末２０ｍｇを１０ｍｌの１００ｍＭ硝酸ナトリウム水溶液に溶解し、孔径０．４５μｍの膜でろ過して濾液を得た。得られた濾液のうちの１００μｌを上記ＨＰＬＣシステムに注入した。分岐グルカンの重量平均分子量は約１４０Ｋであることが示された。
上述の分岐グルカンにイソアミラーゼを作用させ、還元力を改変パークジョンソン法（Ｈｉｚｕｋｕｒｉら、Ｓｔａｒｃｈ，Ｖｏｌ．３５，ｐｐ．３４８−３５０， （１９８３））により調べたところ、分岐の単位鎖長は平均約１５、分岐数は平均約６０であることが示された。
（製造例３：組換え馬鈴薯α−グルカンホスホリラーゼの組換え生産）
特表２００４−５２６４６３に示された下記の方法によりタイプＬ馬鈴薯α−グルカンホスホリラーゼを組換え生産した。
馬鈴薯グルカンホスホリラーゼ遺伝子（Ｎａｋａｎｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １０６：６９１−６９５（１９８９）；配列番号４のアミノ酸配列をコードする配列番号３）の上流および下流にＢａｍＨＩサイトを設け、この遺伝子をＢａｍＨＩで切断し、ＢａｍＨＩであらかじめ切断したｐＥＴ３ｄ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に組み込み、プラスミドｐＥＴ−ＰＧＰ１１３を得た。このプラスミドでは、グルカンホスホリラーゼ遺伝子を、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導性プロモーターの制御下に作動可能に連結した。このプラスミドを、大腸菌ＴＧ−１（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に、コンピテントセル法により導入した。この大腸菌を、抗生物質アンピシリンを含むＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス（ともにＤｉｆｃｏ社製）、１％塩化ナトリウム、１．５％寒天））を含むプレートにプレーティングして、３７℃で一晩培養した。このプレート上で増殖した大腸菌を選択することにより、馬鈴薯由来グルカンホスホリラーゼ遺伝子が導入された大腸菌を得た。得られた大腸菌がグルカンホスホリラーゼ遺伝子を含むことを、導入された遺伝子の配列を解析することによって確認した。また、得られた大腸菌がグルカンホスホリラーゼを発現していることを、活性測定によって確認した。
この大腸菌を、抗生物質アンピシリンを含むＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス（ともにＤｉｆｃｏ社製）、１％塩化ナトリウム）１リットルに接種し、１２０ｒｐｍで振盪させながら３７℃で３時間振盪培養した。その後、ＩＰＴＧを０．１ｍＭ、ピリドキシンを１ｍＭになるようにそれぞれこの培地に添加し、２２℃でさらに２０時間振盪培養した。次いで、この培養液を５，０００ｒｐｍにて５分間遠心分離して、大腸菌の菌体を収集した。得られた菌体を、５０ｍｌの０．０５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）中に懸濁し、次いで超音波処理により破砕し、菌体破砕液５０ｍｌを得た。この破砕液中には、４．７Ｕ／ｍｇのグルカンホスホリラーゼが含まれていた。
この菌体破砕液を、５５℃で３０分間加熱する。加熱後、８，５００ｒｐｍにて２０分間遠心分離し、不溶性のタンパク質などを除去して上清を得る。得られた上清を、あらかじめ平衡化しておいた陰イオン交換樹脂Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに流してグルカンホスホリラーゼを樹脂に吸着させた。樹脂を、２００ｍＭ塩化ナトリウムを含む緩衝液で洗浄して不純物を除去した。続いて、タンパク質を３００ｍＭ塩化ナトリウムを含む緩衝液で溶出させ、組換え馬鈴薯グルカンホスホリラーゼ酵素溶液とした。
（製造例４：微生物由来α−グルカンホスホリラーゼの調製）
Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼ遺伝子の代わりに、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｚｉｌｌｉｇｉｉ ＡＮ１由来α−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列（配列番号６）をコードする塩基配列（ＧｅｎｅＢａｎｋ塩基配列データベースのＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号ＡＪ３１８４９９に記載される１〜２１５１番目までの塩基配列、配列番号５）を有する核酸を使用して製造例１と同様にしてα−グルカンホスホリラーゼ液を得た。
（実施例１：各酵素の反応特異性の確認）
１０ｍＭマルトペンタオース（Ｇ５）、１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）、及び以下の表２に示す１０ｍＭグルコース−１−リン酸アナログと製造例１、３または４のいずれかで製造した酵素（１０Ｕ）を含む反応液１ｍｌを、５０℃で２４時間作用させた。それぞれの酵素が、各種グルコース−１−リン酸アナログからＧ５の非還元末端への糖転移反応を触媒した場合、無機リン酸を生じる。そこで反応液中の無機リン酸濃度を測定し、以下の式を用いて、Ｇ５への糖の結合率を算出し、結果を表２に示す。なお、この糖転移反応においては副反応として種々の反応が起こるため、グルカン鎖の長さの不均化が起こり、その結果、出発物質として重合度５のマルトペンタオースを使用した場合、グルコース残基の重合度が３以上の種々の糖残基含有マルトオリゴ糖が得られるが、計算を単純化するためにＧ５への糖の結合率とした。
Ｇ５への糖の結合率＝（反応液中に生じた無機リン酸濃度（ｍＭ）／反応液中のＧ５濃度（ｍＭ））×１００（％）
なお、無機リン酸濃度（ｍＭ）は無機リン酸を含む水溶液（２００μｌ）に対し、８００μｌのモリブデン試薬（１５ｍＭ モリブデン酸アンモニウム、１００ｍＭ 酢酸亜鉛）を混合し、続いて２００μｌの５６８ｍＭアスコルビン酸水溶液（ｐＨ５．０）を加えて撹拌した後、３０℃で２０分間保持した後、分光光度計を用いて８５０ｎｍの吸光度を測定した。濃度既知の無機リン酸を用いて同様に吸光度を測定し、標準曲線を作成する。この標準曲線に試料で得られた吸光度を当てはめ、反応液中の無機リン酸濃度（ｍＭ）を求めた。
表２からわかるように、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼは、本来の基質であるグルコース−１−リン酸以外に、グルクロン酸−１−リン酸（ＧｌｃＡ−１−Ｐ）、グルコサミン−１−リン酸（ＧｌｃＮ−１−Ｐ）、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸（ＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐ）、マンノース−１−リン酸（Ｍａｎ−１−Ｐ）およびガラクトース−１−リン酸（Ｇａｌ−１−Ｐ）に作用し、Ｇ５の非還元末端に各種糖残基を結合する反応を触媒できること（すなわち、これらのアナログを基質として利用できること）がわかった。しかし、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼは、ガラクトサミン−１−リン酸（ＧａｌＮ−１−Ｐ）、ガラクツロン酸−１−リン酸（ＧａｌＡ−１−Ｐ）およびフコース−１−リン酸（Ｆｕｃ−１−Ｐ）を基質として利用することができなかった。
一方、馬鈴薯由来α−グルカンホスホリラーゼは、ＧｌｃＮ−１−Ｐ、Ｍａｎ−１−ＰおよびＧａｌ−１−Ｐに作用し、Ｇ５の非還元末端に各種糖を結合する反応を触媒できたが、ＧｌｃＡ−１−Ｐ、ＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐ、ＧａｌＮ−１−Ｐ、ＧａｌＡ−１−ＰおよびＦｕｃ−１−Ｐには作用できなかった。Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｚｉｌｌｉｇｉｉ ＡＮ１由来α−グルカンホスホリラーゼは、ＧｌｃＮ−１−Ｐに作用し、Ｇ５の非還元末端に各種糖を結合する反応を触媒できた。Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｚｉｌｌｉｇｉｉ ＡＮ１由来α−グルカンホスホリラーゼは、ＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐ、ＧａｌＮ−１−ＰおよびＭａｎ−１−Ｐにはわずかに作用できたが、ＧｌｃＡ−１−Ｐ、ＧａｌＮ−１−Ｐ、およびＧａｌＡ−１−Ｐには作用できなかった。このように、α−グルカンホスホリラーゼが、本来の基質であるグルコース−１−リン酸以外のどのようなグルコース−１−リン酸アナログでも利用できるわけではない。どのようなグルコース−１−リン酸アナログを基質として利用できるかは、使用する酵素の起源により全く異なることが明らかとなった。
（実施例２：Ｎ−アセチルグルコサミン残基が結合したマルトオリゴ糖の製造）
１０ｍＭマルトペンタオース（Ｇ５）、１０ｍＭ Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸、および１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を含む反応液５ｍｌに、製造例１で得られたＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼ（５０Ｕ）を５０℃で２４時間作用させた。この結果、Ｎ−アセチルグルコサミン残基が結合したマルトオリゴ糖が得られた。この糖転移反応においては副反応として種々の反応が起こるため、グルカン鎖の長さの不均化が起こり、その結果、出発物質として重合度５のマルトペンタオースを使用した場合、グルコース残基の重合度が３以上である、Ｎ−アセチルグルコサミン残基が結合した種々のマルトオリゴ糖が得られた。
製造されたＮ−アセチルグルコサミン残基が結合したマルトオリゴ糖のモル濃度は、反応液中の無機リン酸のモル濃度に等しい。そこで、反応液中の無機リン酸のモル濃度を定量することにより、Ｎ−アセチルグルコサミン残基が結合したマルトオリゴ糖のモル濃度を算出した。この濃度に基づいてＮ−アセチルグルコサミン残基が結合したマルトオリゴ糖の量を計算した。その結果、上記反応液中には、Ｎ−アセチルグルコサミン残基が結合したマルトオリゴ糖が２８．３ｍｇ製造されたことが確認された。
（実施例３：ガラクトース残基が結合したマルトオリゴ糖の製造）
１０ｍＭマルトペンタオース（Ｇ５）、１０ｍＭ ガラクトース−１−リン酸、および１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を含む反応液５ｍｌに、製造例１で得られたＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼ（５０Ｕ）を５０℃で２４時間作用させた。この結果、ガラクトース残基が結合したマルトオリゴ糖が得られた。この糖転移反応においては副反応として種々の反応が起こるため、グルカン鎖の長さの不均化が起こり、その結果、出発物質として重合度５のマルトペンタオースを使用した場合、グルコース残基の重合度が３以上である、ガラクトース残基が結合した種々のマルトオリゴ糖が得られた。
製造されたガラクトース残基が結合したマルトオリゴ糖のモル濃度は、反応液中の無機リン酸のモル濃度に等しい。そこで、反応液中の無機リン酸のモル濃度を定量することにより、ガラクトース残基が結合したマルトオリゴ糖のモル濃度を算出した。この濃度に基づいてガラクトース残基が結合したマルトオリゴ糖の量を計算した。その結果、上記反応液中には、ガラクトース残基が結合したマルトオリゴ糖が１９．８ｍｇ製造されたことが確認された。
（参考例４：グルコサミン結合マルトオリゴ糖の製造）
１０ｍＭマルトペンタオース（Ｇ５）、１０ｍＭ グルコサミン−１−リン酸、および１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を含む反応液５ｍｌに、製造例１で得られたＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼ（５０Ｕ）を５０℃で２４時間作用させた。この結果、グルコサミン残基が結合したマルトオリゴ糖が得られた。この糖転移反応においては副反応として種々の反応が起こるため、グルカン鎖の長さの不均化が起こり、その結果、出発物質として重合度５のマルトペンタオースを使用した場合、グルコース残基の重合度が３以上である、グルコサミン残基が結合した種々のマルトオリゴ糖が得られた。
製造されたグルコサミン結合マルトオリゴ糖のモル濃度は、反応液中の無機リン酸のモル濃度に等しい。そこで、反応液中の無機リン酸のモル濃度を定量することにより、グルコサミン残基が結合したマルトオリゴ糖のモル濃度を算出した。この濃度に基づいてガラクトース残基が結合したマルトオリゴ糖の量を計算した。その結果、上記反応液中には、グルコサミン残基が結合したマルトオリゴ糖が３４．２ｍｇ製造されたことが確認された。
（実施例５：Ｎ−アセチルグルコサミン残基が結合した分岐グルカンの製造）
製造例２で得られた分岐グルカン１１０ｍｇ、１０ｍＭ Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸、および１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を含む反応液５ｍｌに、製造例１で得られたＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼ（５０Ｕ）を５０℃で２４時間作用させた。
分岐グルカンに転移されたＮ−アセチルグルコサミンの量は、反応液中に生成した無機リン酸の量に等しい。そこで、反応液中の無機リン酸濃度を定量し、得られた無機リン酸濃度から分岐グルカンに転移されたＮ−アセチルグルコサミンの量を求めた。反応液中の分岐グルカンにＮ−アセチルグルコサミンは均等に結合していると仮定して、Ｎ−アセチルグルコサミン残基が結合した分岐グルカン量を求めた。上記反応液中には、Ｎ−アセチルグルコサミン残基が結合した分岐グルカンが１１４．８ｍｇ製造された。なお、非還元末端結合率は４６．８％であった。
（実施例６：ガラクトース残基が結合した分岐グルカンの製造）
製造例２で得られた分岐グルカン１１０ｍｇ、１０ｍＭ ガラクトース−１−リン酸、および１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を含む反応液５ｍｌに、製造例１で得られたＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼ（５０Ｕ）を５０℃で２４時間作用させた。
分岐グルカンに転移されたガラクトースの量は、反応液中に生成した無機リン酸の量に等しい。そこで、反応液中の無機リン酸濃度を定量し、得られた無機リン酸濃度から分岐グルカンに転移されたガラクトースの量を求めた。反応液中の分岐グルカンにガラクトースは均等に結合していると仮定して、ガラクトース残基が結合した分岐グルカン量を求めた。上記反応液中には、ガラクトース残基が結合した分岐グルカンが１１３．１ｍｇ製造された。なお、非還元末端結合率は３８．５％であった。
（参考例７：グルコサミン残基が結合した分岐グルカンの製造）
製造例２で得られた分岐グルカン１１０ｍｇ、１０ｍＭ グルコサミン−１−リン酸、および１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を含む反応液５ｍｌに、製造例１で得られたＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼ（５０Ｕ）を５０℃で２４時間作用させた。
分岐グルカンに転移されたグルコサミンの量は、反応液中に生成した無機リン酸の量に等しい。そこで、反応液中の無機リン酸濃度を定量し、得られた無機リン酸濃度から分岐グルカンに転移されたグルコサミンの量を求めた。反応液中の分岐グルカンにグルコサミンは均等に結合していると仮定することにより、グルコサミン残基が結合した分岐グルカン量を求めた。上記反応液中には、グルコサミン残基が結合した分岐グルカンが１１５．４ｍｇ製造された。なお、非還元末端結合率は６６．８％であった。
（実施例８：ガラクトース含有マルトオリゴ糖の還元末端修飾物の製造）
５％マルトペンタオース（Ｇ５）１０ｍｌに０．２Ｍ Ｉ２／ＭｅＯＨ溶液１０ｍｌを加え、３０℃で攪拌しながら、４％ＫＯＨ／ＭｅＯＨ溶液４ｍｌを少しずつゆっくり滴下し、ヨウ素酸酸化反応させた。ヨウ素の色が消えるまで４％ＫＯＨ／ＭｅＯＨ溶液をさらに滴下し攪拌しながら１時間反応させた。得られた反応液の体積の３倍量のメタノールを加え、Ｇ５酸化物を沈殿させ、遠心分離により沈殿物を回収した。約０．４ｇのＧ５の還元末端がカルボキシル化されたＧ５還元末端修飾物を得た。
この酸化反応においては以下のような反応が起きた：
次に上記で得られた１０ｍＭのＧ５還元末端修飾物、１０ｍＭ ガラクトース−１−リン酸、および１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を含む反応液５ｍｌに、製造例１で得られたＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼ（５０Ｕ）を５０℃で２４時間作用させた。この結果、ガラクトース残基が結合したマルトオリゴ糖還元末端修飾物が得られた。この糖転移反応においては副反応として種々の反応が起こるため、グルカン鎖の長さの不均化が起こり、その結果、出発物質として重合度５のマルトペンタオースを使用した場合、グルコース残基の重合度が３以上である、ガラクトース残基が結合した種々のマルトオリゴ糖還元末端修飾物が得られた。
製造されたガラクトース残基が結合したマルトオリゴ糖還元末端修飾物のモル濃度は、反応液中の無機リン酸のモル濃度に等しい。そこで、反応液中の無機リン酸のモル濃度を定量することにより、ガラクトース残基が結合したマルトオリゴ糖還元末端修飾物のモル濃度を算出した。この濃度に基づいてガラクトース残基が結合したマルトオリゴ糖の量を計算した。その結果、上記反応液中には、ガラクトース残基が結合したマルトオリゴ糖還元末端修飾物が２０．１ｍｇ製造されたことが確認された。
（実施例９Ａ：還元末端にグルコン酸が結合しているガラクトース含有分岐グルカンまたはＮ−アセチルグルコサミン含有グルカンの製造）
５％マルトペンタオース（Ｇ５）１０ｍｌに０．２Ｍ Ｉ２／ＭｅＯＨ溶液１０ｍｌを加え、３０℃で攪拌しながら、４％ＫＯＨ／ＭｅＯＨ溶液４ｍｌを少しずつゆっくり滴下し、ヨウ素酸酸化反応させた。ヨウ素の色が消えるまで４％ＫＯＨ／ＭｅＯＨ溶液をさらに滴下し攪拌しながら１時間反応させた。得られた反応液の体積の３倍量のメタノールを加え、Ｇ５酸化物を沈殿させ、遠心分離により沈殿物（約０．４ｇ）を回収した。沈殿物は、マルトペンタオースの還元末端グルコースがグルコン酸に変換したマルトヘキサオシルグルコン酸であった。グルコース−１−リン酸６ｇとマルトヘキサオシルグルコン酸０．６ｍｇを１００ｍｌの０．２Ｍマレイン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解した溶液に、製造例１に記載のＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼを１５０Ｕと、特開２０００−３１６５８１の実施例１に記載された方法に従って調製した高度耐熱性ブランチングエンザイム２，０００Ｕを添加して反応液を調製した後、５０℃で攪拌しながら１６時間反応を行なった。溶液を加熱し酵素を失活し、ガラスフィルターにて濾過し失活酵素を除去した。濾液に２倍量のエタノールを加えてグルカン反応物を沈殿させ、遠心分離した。水：エタノール１：１の溶液３００ミリリットルで沈殿を２度洗浄して共存するグルコース−１−Ｐを取り除き、さらに、エタノールで２回洗浄した後、凍結乾燥した。収量１．７ｇ、分子量１２０ｋＤａの還元末端にグルコン酸が結合している分岐グルカンを得た。
上記還元末端修飾分岐グルカン１．６ｍｇ／ｍＬ、１０ｍＭ１０ｍＭガラクトース−１−リン酸またはＮ−アセチルグルコサミン−１−リン酸、１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を含む各反応液に製造例１で調製したＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ ５由来α−グルカンホスホリラーゼ（１８Ｕｎｉｔ／ｍｌ）を５０℃で２０時間作用させ、還元末端にグルコン酸が結合している分岐グルカンの非還元末端にガラクトース残基またはＮ−アセチルグルコサミン残基を結合させた。ガラクトースまたはＮ−アセチルグルコサミンの結合率は実施例３と同様の方法で求め、それぞれ３３％、３２％であった。このようにして、還元末端が修飾された、ガラクトース残基またはＮ−アセチルグルコサミン残基で非還元末端修飾された分岐グルカンが得られた。
（実施例９：ガラクトースおよびグルコサミンが結合した分岐グルカンの製造）
製造例２で得られた分岐グルカン１１０ｍｇ、１０ｍＭ ガラクトース−１−リン酸、および１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を含む反応液５ｍｌに、製造例１で得られたＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼ（５０Ｕ）を５０℃で５時間作用させた。
分岐グルカンに転移されたガラクトースの量は、反応液中に生成した無機リン酸の量に等しい。そこで、反応液中の無機リン酸濃度を定量し、得られた無機リン酸濃度から分岐グルカンに転移されたガラクトースの量を求めた。反応液中の分岐グルカンにガラクトースは均等に結合していると仮定して、ガラクトース残基が結合した分岐グルカン量を求めた。ガラクトース結合分岐グルカンが１１１．７ｍｇ製造された。なお、ガラクトース残基の非還元末端結合率は２０．８％であった。
このガラクトース残基が結合した分岐グルカンを含む反応液から、ＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケア社製）を製造業者の指示に従って用いて反応液中の未反応のガラクトース−１−リン酸および無機リン酸を除去した。得られた非還元末端にガラクトース残基が結合した分岐グルカン１１０ｍｇ、１０ｍＭ グルコサミン−１−リン酸、および１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を含む反応液５ｍｌに、製造例１で得られたＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来αグルカンホスホリラーゼ（５０Ｕ）を５０℃で５時間作用させた。上記分岐グルカンに転移されたガラクトースの量と同様の方法でガラクトース残基が結合した分岐グルカンに転移されたグルコサミンの量を求めた。ガラクトースおよびグルコサミン残基が結合した分岐グルカンが１１２．７ｍｇ製造された。なお、グルコサミン残基の非還元末端結合率は３３．８％であった。
（実施例１０：各種糖残基が結合した分岐グルカンのグルコアミラーゼ分解性の評価）
実施例５、実施例６、または参考例７で製造した糖残基が結合した分岐グルカンを０．５％、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）、およびグルコアミラーゼ（１７Ｕ／ｍｌ；ＥＣ３．２．１．３）を含む反応液を３７℃に１８時間保温した後、反応液中のグルコース量をグルコースＣＩＩ−テストワコー（和光純薬製）を用いたグルコースオキシダーゼ法で定量した。全分岐グルカンに対する、グルコアミラーゼにより分解されたグルカン部分の割合をグルコアミラーゼ分解率（％）、グルコアミラーゼにより分解されなかったグルカン部分の割合をグルコアミラーゼ耐性（％）として以下の式にしたがって求めた。結果を表３に示す。
グルコアミラーゼ分解率＝（反応後の溶液中のグルコース量（ｍｇ）／反応前の溶液中のグルカン量（ｍｇ））×１００
グルコアミラーゼ耐性＝１−グルコアミラーゼ分解率
Ｎ−アセチルグルコサミン残基が結合した分岐グルカンおよびガラクトース残基が結合した分岐グルカンは、グルコアミラーゼに抵抗性を示した。しかしながら、グルコサミン残基が結合した分岐グルカンはグルコアミラーゼでほぼすべてが分解され、グルコアミラーゼ抵抗性を示さなかった。このように非還元末端にガラクトースあるいはＮ−アセチルグルコサミンを結合させた場合、グルコアミラーゼ耐性を付与できることがわかった。
本発明のグルカンは、グルコアミラーゼ単独に対して抵抗性を持つ特長的な性質を示す。しかしながら、体内には種々のアミラーゼが存在するため、グルコアミラーゼに対して抵抗性があっても、最終的には体内で代謝されたり、体外に排出可能な大きさまで分解されたりする、生分解性に優れた安全な物質であると考えられる。
（実施例１１：非還元末端にＮ‐アセチルグルコサミン残基が結合した分岐グルカンの精製および構造確認）
実施例５と同様の方法で非還元末端にＮ‐アセチルグルコサミン残基が結合した分岐グルカンを製造した。まず、製造例２で得られた分岐グルカン２８ｍｇ、１５ｍＭ Ｎ−アセチルグルコサミン−１−リン酸、および１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を含む反応液２.５ｍｌに、製造例１で得られたＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼ（５０Ｕ）を５０℃で２４時間作用させた。実施例５と同様にして非還元末端修飾率を分析したところ、分岐グルカンに転移されたＮ‐アセチルグルコサミンの量（非還元末端修飾率）は、６２．９％であった。得られた反応液を５Ｎ ＨＣｌ溶液でｐＨ３に調整した後、遠心分離により変性タンパク質を含む沈殿物を除去した。上清を回収し、５Ｎ ＮａＯＨ溶液で中和後、ＰＤ−１０カラムで低分子を除去するとともに脱塩し、さらに０．２μｍのフィルターでろ過した後、得られた濾液を凍結乾燥することにより、Ｎ‐アセチルグルコサミン残基が非還元末端に結合した非還元末端修飾分岐グルカンの粉末を得た。以下、Ｎ‐アセチルグルコサミン残基が非還元末端に結合した分岐グルカンを、Ｂ−ＧｌｃＮＡｃとも記載する。
以下に記載のように、製造例２で製造した分岐グルカン（非修飾分岐グルカン；Ｂ）との比較により、非還元末端修飾分岐グルカン（Ｂ−ＧｌｃＮＡｃ）の構造を確認した。
上記のようにして得られた、精製された非還元末端修飾分岐グルカン（Ｂ−ＧｌｃＮＡｃ）の粉末を０．２重量％になるように１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解し、表４の条件１〜４の各種アミラーゼを添加して適切な温度でインキュベートすることにより消化した後の反応液中のグルコース量を測定した。表４に示す酵素量は過剰量であるため、その酵素または酵素組合せによって切断可能な結合は全て切断される。グルコースの定量にはグルコースオキシダーゼ法を用いた。
また、それぞれ条件２〜４での酵素消化後の反応液をＤＩＯＮＥＸ社製ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ装置（送液システム：ＤＸ３００、検出器：ＰＡＤ−２、分析カラム：ＣａｒｂｏＰａｃＰＡ１００）により分析した。溶出は、流速：１ｍｌ／分、ＮａＯＨ濃度：１５０ｍＭ、酢酸ナトリウム濃度：０分−５０ｍＭ、１分−５０ｍＭ、２７分−３５０ｍＭ（Ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃｕｒｖｅ Ｎｏ．４）、３５分−８５０ｍＭ（Ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃｕｒｖｅ Ｎｏ．７）、３７分−８５０ｍＭの条件で行った。結果を図１に示す。また、これらの酵素反応の特性から推定した、酵素処理後に得られる生成物の構造の模式図を図３に示す。図１は、非還元末端修飾分岐グルカン（Ｂ-ＧｌｃＮＡｃ）または非修飾分岐グルカン（Ｂ）を各種アミラーゼで消化した後のＨＰＡＥＣ-ＰＡＤ分析の結果を示す。それぞれのサンプルは以下の通りであった：図１−１：Ｇ１〜Ｇ６；図１−２：製造例２の分岐グルカン（Ｂ）のイソアミラーゼ分解物；図１−３：製造例２の分岐グルカン（Ｂ）のイソアミラーゼおよびグルコアミラーゼでの分解物；図１−４：製造例２の分岐グルカン（Ｂ）のイソアミラーゼ、グルコアミラーゼおよびα−アミラーゼでの分解物；図１−５：非還元末端にＮ‐アセチルグルコサミン残基が結合した分岐グルカンのイソアミラーゼ分解物；図１−６：非還元末端にＮ‐アセチルグルコサミン残基が結合した分岐グルカンのイソアミラーゼおよびグルコアミラーゼでの分解物；図１−７：非還元末端にＮ‐アセチルグルコサミン残基が結合した分岐グルカンのイソアミラーゼ、グルコアミラーゼおよびα−アミラーゼでの分解物。
グルコース量は、非修飾分岐グルカン（Ｂ）の条件４の反応で生じたグルコース生成量を１００％として各条件でのグルコース生成量（％）を表４に示す。これらの結果について以下に説明する。
条件１では、グルカンのα−１，４およびα−１，６結合を非還元末端側からグルコース単位で切断するグルコアミラーゼを作用させた。そのため、グルコース残基のみで構成された製造例２の非修飾分岐グルカンでは、グルコース量は１００％であり、この非修飾分岐グルカンはすべてグルコースに分解された。しかし、グルカンの非還元末端にＮ‐アセチルグルコサミン残基が結合したＢ−ＧｌｃＮＡｃでは、グルコース量は３１．２％であり、この非還元末端修飾分岐グルカン中の結合の約６８％は分解できなかった。この割合は、実施例５で示したリン酸濃度から定量したＮ‐アセチルグルコサミンの非還元末端結合率（６２．９％）と近い値であった。この結果、末端修飾分岐グルカン（Ｂ−ＧｌｃＮＡｃ）は、非還元末端側からα−１，４グルコシド結合を切断するという特性を有するグルコアミラーゼが作用できない構造を有すること、従って非還元末端部分にＮ−アセチルグルコサミン残基が結合していることが推定される。
条件２では、α−１，６結合を切断するイソアミラーゼを作用させた。条件２では、製造例２の分岐状グルカンおよび実施例５の末端修飾分岐グルカンのいずれについても、グルコース量は０．０％であった。
さらに、条件３では、イソアミラーゼとグルコアミラーゼとを組み合わせて作用させた。条件３では、イソアミラーゼによりα−１，６結合は切断されたが、製造例２の分岐状グルカンおよび実施例５の末端修飾分岐グルカンのいずれについても条件１とグルコース量に変化はなく、それぞれ１００％および３１．２％であった。
条件４ではイソアミラーゼ、グルコアミラーゼ、およびα−アミラーゼを組み合わせて作用させている。α−アミラーゼは、グルカンのα−１，４結合をランダムに切断するという特性を有する。条件４では、製造例２の非修飾分岐グルカンはすべてグルコースへと分解されたが、非還元末端にＮ‐アセチルグルコサミン残基が結合したＢ−ＧｌｃＮＡｃ中の結合は８３．７％しか分解されなかった。従って、Ｂ−ＧｌｃＮＡｃには、製造例２の非修飾分岐グルカンを分解できる各種アミラーゼで分解できない構造の部分が全体の１６．３％であり、この構造の生成物は、非還元末端にＮ‐アセチルグルコサミン残基が結合したオリゴ糖であると推定される。（図１−７の★印）。なお、この図１−７の★印のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤの溶出位置は、マルトースの非還元末端にα−１，４結合している４−О−α−Ｎ−アセチルグルコサミニルマルトース標品の溶出位置と一致した。
（実施例１２：非還元末端にガラクトース残基が結合した分岐グルカンの精製および構造確認）
製造例２で得られた分岐グルカン２８ｍｇ、１５ｍＭ ガラクトース−１−リン酸、および１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を含む反応液２.５ｍｌに、製造例１で得られたＡｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼ（５０Ｕ）を５０℃で２４時間作用させた。分岐グルカンに転移されたガラクトースの量は、６２．２％であった。得られた反応液を実施例１１と同じ方法で精製することにより、ガラクトース残基が非還元末端に結合した分岐グルカンの粉末を得た。以下、ガラクトース残基が非還元末端に結合した分岐グルカンを、Ｂ−Ｇａｌとも記載する。
以下に記載のように、製造例２で製造した分岐グルカン（非修飾分岐グルカン；Ｂ）との比較により、ガラクトース残基が非還元末端に結合した修飾分岐グルカン（Ｂ−Ｇａｌ）の構造を確認した。
上記のようにして得られた、精製された非還元末端分岐グルカン（Ｂ−Ｇａｌ）の粉末を０．２重量％になるように１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解し、表５の条件１〜４の各種アミラーゼを添加して適切な温度でインキュベートすることにより消化した後の反応液中のグルコース量を測定した。表５に示す酵素量は過剰量であるため、その酵素または酵素組合せによって切断可能な結合は全て切断される。グルコースの定量にはグルコースオキシダーゼ法を用いた。
また、それぞれ条件２〜４での酵素消化後の反応液を実施例１１の方法でＨＰＡＥＣ−ＰＡＤにより分析した。結果を図２に示す。また、これらの酵素反応の特性から推定した、酵素処理後に得られる生成物の構造の模式図を図３に示す。図２は、非還元末端修飾分岐グルカン（Ｂ−Ｇａｌ）または非修飾分岐グルカン（Ｂ）を各種アミラーゼで消化した後のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析の結果を示す。それぞれのサンプルは以下の通りであった：図２−１：Ｇ１〜Ｇ６；図２−２：製造例２の分岐グルカン（Ｂ）のイソアミラーゼ分解物；図２−３：製造例２の分岐グルカン（Ｂ）のイソアミラーゼおよびグルコアミラーゼでの分解物；図２−４：製造例２の分岐グルカン（Ｂ）のイソアミラーゼ、グルコアミラーゼおよびα−アミラーゼでの分解物；図２−５：非還元末端にガラクトース残基が結合した分岐グルカンのイソアミラーゼ分解物；図２−６：非還元末端にガラクトース残基が結合した分岐グルカンのイソアミラーゼおよびグルコアミラーゼ分解物；図２−７：非還元末端にガラクトース残基が結合した分岐グルカンのイソアミラーゼ、グルコアミラーゼおよびα−アミラーゼ分解物。
グルコース量は、非修飾分岐グルカン（Ｂ）の条件４の反応で生じたグルコース生成量を１００％として各条件でのグルコース生成量（％）を表５に示す。これらの結果について以下に説明する。
条件１では、グルカンのα−１，４およびα−１，６結合を非還元末端側からグルコース単位で切断するグルコアミラーゼを作用させた。そのため、グルコース残基のみで構成された製造例２の非修飾分岐グルカンのグルコース量は１００％であり、この非修飾分岐グルカンはすべてグルコースに分解された。しかし、グルカンの非還元末端にガラクトース残基が結合したＢ−Ｇａｌでは、グルコース量は３０．２％であり、この非還元末端修飾分岐グルカン中の結合の約７０％は分解できなかった。この割合は、リン酸濃度から定量したガラクトースの非還元末端結合率（６２．２％）と近い値であった。この結果、実施例５で製造された末端修飾分岐グルカンは、非還元末端側からα−１，４グルコシド結合を切断するという特性を有するグルコアミラーゼが作用できない構造を有すること、従って非還元末端部分にガラクトース残基が結合していることが推定される。
条件２では、α−１，６結合を切断するイソアミラーゼを作用させた。条件２では、製造例２の分岐グルカンについてはマルトオリゴ糖が生成された（図２−２）。ガラクトースが結合した分岐グルカンにイソアミラーゼを作用させると、非還元末端がグルコース残基のオリゴ糖（図２−５の●、それぞれ図２−２と同じ溶出位置に溶出した）とガラクトースが非還元末端に結合したオリゴ糖（図２−５の★）が生じた。
条件３では、実施例５で製造された非還元末端修飾グルカンにイソアミラーゼとグルコアミラーゼを作用させると、図２−５の●のピークは分解され、グルコース（Ｇ１）が生成されたが、ガラクトースが非還元末端に結合したオリゴ糖（図２−５の★）のピークに変化はなかった。非還元末端にガラクトース残基が結合したＢ−Ｇａｌの条件３のグルコース量は３０．３％であった。
条件４ではイソアミラーゼ、グルコアミラーゼ、およびα−アミラーゼを組み合わせて作用させている。α−アミラーゼは、グルカンのα−１，４結合をランダムに切断するという特性を有する。条件４では、製造例２の非修飾分岐グルカンはすべてグルコースへと分解されたが、非還元末端にガラクトース残基が結合したＢ−Ｇａｌ中の結合は９０．９％しか分解されなかった。従って、Ｂ−Ｇａｌには、製造例２の非修飾分岐グルカンを分解できる各種アミラーゼで分解できない構造の部分が全体の９．１％であり、この生成物は、非還元末端にガラクトース残基が結合したオリゴ糖であると推定される。（図２−７の★印）。なお、この図２−７の★印のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤの溶出位置は、マルトースの非還元末端にα−１,４結合している４−О−α−ガラクトシルマルトース標品の溶出位置と一致した。
（実施例１３：Ｎ−アセチルグルコサミン残基が結合した分岐グルカンの生分解性（１））
実施例１１で精製したＮ−アセチルグルコサミン残基が結合した分岐グルカン粉末を０．５重量％になるように、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）中に添加して溶かし、この溶液に２３Ｕ／ｍｌのα−アミラーゼを添加して３７℃でインキュベートすることにより作用させ、生成物の重量平均分子量の低下を経時的に調べた。
生成物の重量平均分子量の測定には製造例２に示した分岐グルカンの重量平均分子量の測定法を用いた。結果を表６および図４に示す。
Ｎ−アセチルグルコサミン残基が結合した分岐グルカンの重量平均分子量は、α−アミラーゼの作用で低下し、重量平均分子量は反応時間１０分で１／２以下、反応時間３０分で約１／５になった。反応時間６０分では、Ｎ−アセチルグルコサミン残基が結合した分岐グルカンは分子量３万以下に分解された。血中アミラーゼはα−アミラーゼである。従って、本発明の非還元末端修飾分岐グルカンは、血中アミラーゼにより分子量３万以下まで分解されると考えられる。分子量３万以下の分子は尿中に排泄されると考えられるので、本発明の非還元末端修飾分岐グルカンは生分解性であると考えられる。
（実施例１４：Ｎ−アセチルグルコサミン残基が結合したアセチル化分岐グルカンの生分解性（２））
製造例２の分岐グルカンをアセチル化した粉末分岐グルカンを作製し、実施例１１と同じ方法でＮ−アセチルグルコサミン残基が結合したアセチル化分岐グルカンを製造した。分岐グルカンのアセチル化は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した分岐グルカン、ＤＭＳＯ、４％Ｎａ２ＣＯ３水溶液、ＤＭＳＯで調製した５Ｍ酢酸ビニルを表７の組成で混合し、２５℃で１時間撹拌しながら反応させることによって行った。得られた反応液を超純水で２倍に希釈し、ゲルろ過カラム（ＰＤ−１０）を用いて脱塩溶媒除去を行い、超純水で精製アセチル化分岐グルカンを水溶液として回収した。回収した精製アセチル化分岐グルカン水溶液３００μｌに５Ｎ 水酸化ナトリウム水溶液２００μｌを加え、５５℃で３０分の加熱を行うことにより、アセチル化分岐グルカンを脱アセチル化反応した。この反応液に１Ｎ トリスバッファー（ｐＨ７）を３００μｌ加え、さらに５Ｎ塩酸を２００μｌ加え中和をした。中和後の溶液中のグルコース量をフェノール硫酸法で定量し、また、遊離酢酸定量キットにて中和後の溶液中の遊離酢酸の定量を行い、アセチル化度を求めたところ、得られたアセチル化分岐グルカンのアセチル化度が０．１〜１．３であることが確認された。このようにして、アセチル化グルカンを含む３種類の水溶液が得られた。各アセチル化グルカン水溶液を凍結乾燥してアセチル化グルカンの粉末をそれぞれ約３００ｍｇ得た。
得られたアセチル化分岐グルカン粉末を２．５％、１０ｍＭ Ｎ−アセチルグルコサミン‐１−リン酸、および１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を含む反応液に製造例１によって調製したＡｑｕｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ由来α‐グルカンホスホリラーゼ（５０Ｕ／ｍｌ）を加え、５０℃で１８時間反応させた。得られたＮ−アセチルグルコサミン残基が結合した分岐グルカンを含む反応液を５Ｎ ＨＣｌ溶液でｐＨ３に調整した後、遠心分離により変性タンパク質を含む沈殿物を除去した。上清を回収し、５Ｎ ＮａＯＨ溶液で中和後、ゲルろ過カラム（ＰＤ−１０）で低分子を除去するとともに脱塩し、さらに０．２μｍのフィルターでろ過した後、得られた濾液を凍結乾燥することにより、実施例１４の方法で製造したアセチル化分岐グルカンの粉末を得た。
得られたＮ−アセチルグルコサミン残基が結合したアセチル化分岐グルカン０．５重量％、および２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を含む反応液に２３Ｕ／ｍｌのα−アミラーゼを添加して適切な温度でインキュベートすることによりα−アミラーゼをアセチル化分岐グルカンに作用させ、生成物の重量平均分子量の低下を経時的に調べた。
分子量の測定は実施例１３と同様に行なった。結果を表８、および図５に示す。この結果からＮ−アセチルグルコサミン残基が結合した分岐グルカンは、分岐グルカン部分のアセチル化により分解を制御できることが示された。
（実施例１５：ガラクトース残基が結合した分岐グルカンの生分解性（１））
実施例１２で精製したガラクトース残基が結合した分岐グルカン粉末を０．５重量％になるように、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）中に添加して溶かし、この溶液に２３Ｕ／ｍｌのα−アミラーゼを添加して３７℃でインキュベートすることにより作用させ、生成物の重量平均分子量の低下を経時的に調べた。
生成物の重量平均分子量の測定には製造例２に示した分岐グルカンの重量平均分子量の測定法を用いた。結果を表９および図６に示す。
ガラクトース残基が結合した分岐グルカンの重量平均分子量は、α−アミラーゼの作用で低下し、重量平均分子量は反応時間１０分で１／３以下、反応時間２０分で約１／５になった。反応時間６０分では、ガラクトース残基が結合した分岐グルカンは分子量３万以下に速やかに分解された。血中アミラーゼはα−アミラーゼである。従って、本発明の非還元末端修飾分岐グルカンは、血中アミラーゼにより分子量３万以下まで分解されると考えられる。分子量３万以下の分子は尿中に排泄されると考えられるので、本発明の非還元末端修飾分岐グルカンは生分解性であると考えられる。
（実施例１６：ガラクトース残基が結合したアセチル化分岐グルカンの生分解性（２））
実施例１４で用いたアセチル化分岐グルカンの非還元末端にガラクトース残基を結合したアセチル化分岐グルカンを調製しアミラーゼ分解性の制御を検討した。
得られたアセチル化分岐グルカンを２．５％、１０ｍＭガラクトース‐１−リン酸、および１００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を含む反応液に製造例１によって調製したＡｑｕｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ由来α‐グルカンホスホリラーゼ（５０Ｕ／ｍｌ）を加え、５０℃で１８時間反応させた。得られたガラクトース残基が結合した分岐グルカンを含む反応液を５Ｎ ＨＣｌ溶液でｐＨ３に調整した後、遠心分離により変性タンパク質を含む沈殿物を除去した。上清を回収し、５ＮＮａＯＨ溶液で中和後、ＰＤ−１０カラムで低分子を除去するとともに脱塩し、さらに０．２μｍのフィルターでろ過した後、得られた濾液を凍結乾燥することにより、実施例１４の方法で製造したアセチル化分岐グルカンの非還元末端にガラクトース残基を結合した粉末を得た。
得られたガラクトース残基が結合した分岐グルカン０．５重量％、および２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を含む反応液に２３Ｕ／ｍｌのα−アミラーゼを添加して適切な温度でインキュベートすることによりα−アミラーゼをアセチル化分岐グルカンに作用させ、生成物の重量平均分子量の低下を経時的に調べた。
生成物の重量平均分子量の測定は製造例２に示した分岐グルカンの重量平均分子量の測定法を用いた。結果を表１０、および図７に示す。この結果からガラクトース残基が結合した分岐グルカンは、分岐グルカン部分のアセチル化により分解を制御できることが示された。
（実施例１７：Ｎ−アセチルグルコサミン残基が結合した分岐グルカンの生分解性（３））
Ｎ−アセチルグルコサミン残基が結合した分岐グルカンのｉｎ ｖｉｖｏでの生分解性を調べた。手短に述べると、評価サンプルは製造例２で製造した分岐グルカンおよび実施例１４に示した方法で調製したアセチル化分岐グルカンをそれぞれ蛍光標識して血中および尿中のグルカン量をＧＰＣ−蛍光標識法で調べた。
グルカンの蛍光標識は、分岐グルカンおよびアセチル化度０．５のアセチル化分岐グルカンをそれぞれ５０ｍｇ／ｍｌ ＤＭＳＯ溶液に調製した。各グルカンＤＭＳＯ溶液２ｍｌを試験管に入れ、９０℃で撹拌した。これに５０ｍｇ／ｍｌフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）のＤＭＳＯ溶液をそれぞれ５６μｌ、１１２μｌ加え、ピリジン１滴、ジラウリン酸ジ−ｎ−ブチルすず１滴を滴下し９０℃で２時間撹拌を行った。反応終了後、反応液にエタノールを２０ｍｌ加え、３５００ｒｐｍで５分遠心を行い、沈殿を回収した。さらにエタノールを加え洗浄を行い、これを超純水１ｍｌで溶解し、ゲルろ過カラム（ＰＤ−１０）に１ｍｌのせ、１．５ｍｌの超純水で通液し、その後２ｍｌを超純水で回収し精製を行った。得られたサンプルを凍結乾燥した。得られたサンプルの一部は４９０ｎｍにおけるＵＶ吸収を測定した。ウラニンを標準物質とし、ＦＩＴＣ標識された分岐グルカン（Ｆ−Ｂ）およびアセチル化分岐グルカン（Ｆ−ＡｃＢ ）のＦＩＴＣ導入量を下記の式に従って求めたところ、それぞれ導入率は０．８６％、０．８２％であることが確認できた。
ＦＩＴＣ導入率（Ｗ／Ｗ％）＝（（ＦＩＴＣ標識された分岐グルカンのフルオレセイン濃度）／（ＦＩＴＣ標識された分岐グルカンの全糖量））×１００
得られた２種のＦＩＴＣ化した分岐グルカンをさらに実施例３の方法でグルカンの非還元末端のＮ−アセチルグルコサミンが結合したＦ−Ｂ−ＧｌｃＮＡｃ（結合率６４．６％）およびＦ−ＡｃＢ−ＧｌｃＮＡｃ（結合率５１．７％）を作製した。得られた９週齢雄ＳＤラット（６匹）の尾静脈に２５ｍｇ／ｋｇ投与し、投与後の血液のＦＩＴＣ標識体の濃度を蛍光検出器（島津製作所製 １０ＲＦ １０ＡＸＬ）を備えた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システム（カラム：東ソー製、ＴＳＫ−ｇｅｌ Ｇ４０００ＰＷＸＬ、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ、溶出液２００ｍＭＮａＣｌ ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ− ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．８））を用いて調べた。血液は表１１に示した投与５分から４８時間までの各時間に３００μｌずつ採取し、１０，０００ｒｐｍ１分遠心後上清を１００μｌ回収した。３０ｗｔ％トリフルオロ酢酸１０μｌを添加後１０，０００ｒｐｍ５分遠心し回収した上清６０μｌに２００ｍＭＴｒｉｓ− ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．８）６０μｌを加え、必要に応じてサンプルを希釈後０．４５μｍのフィルターろ過し１００μｌを上記ＨＰＬＣシステムに注入した。
結果を表１１と図８に示す。血液中ではＮ−アセチルグルコサミンが結合した分岐グルカンは速やかに分解し、消失する傾向を示した。アセチル化したＮ−アセチルグルコサミンが結合した分岐グルカンは分子量の低下が非常に遅く、緩やかに分解されて消失する傾向を示した。Ｎ−アセチルグルコサミンが結合した分岐グルカンの分解はアセチル化することにより制御可能なことがわかった。
（実施例１８：ガラクトース残基が結合した分岐グルカンの生分解性（３））
ガラクトース残基が結合した分岐グルカンのｉｎ ｖｉｖｏでの生分解性を調べた。
実施例１７で調製したＦＩＴＣ標識された分岐グルカン（Ｆ−Ｂ）およびアセチル化分岐グルカン（Ｆ−ＡｃＢ）をさらに実施例４の方法でグルカンの非還元末端にガラクトース残基が結合したＦ−Ｂ−Ｇａｌ（結合率６４．３％）およびＦ−ＡｃＢ−Ｇａｌ（結合率５１．４％）を作製した。９週齢雄ＳＤラット（６匹）の尾静脈に２５ｍｇ／ｋｇ投与し、投与後の血液のＦＩＴＣ標識体の濃度を実施例１７の方法で測定した。結果を表１２と図９に示す。血液中ではガラクトースが結合した分岐グルカン（Ｆ−Ｂ−Ｇａｌ）は速やかに分解、消失する傾向を示した。アセチル化したガラクトース残基が結合した分岐グルカン（Ｆ−ＡｃＢ−Ｇａｌ）は分子量の低下が非常に遅く、緩やかに分解されて消失する傾向を示した。ガラクトース残基が結合した分岐グルカンの分解はアセチル化することにより制御可能なことがわかった。
（実施例１９：非還元末端にガラクトース残基を結合した分岐グルカンのターゲティング評価）
非還元末端にガラクトース残基を結合した分岐グルカンが、ガラクトース残基を結合していない分岐グルカンよりも肝臓への取りこみが多くなるかどうか調べた。
実施例１４で作製したアセチル化分岐グルカン（Ｆ−ＡｃＢ１４０）および実施例１５で作製した非還元末端にガラクトース残基が結合したアセチル化分岐グルカン（Ｆ−ＡｃＢ１４０（Ｇａｌ））を７週齢雄ＩＣＲマウス（３０ｇ前後）の尾静脈投与し、投与後２分後に眼窩採血、投与後１０分、１時間、２時間、６時間後に前採血、臓器摘出を行なった。血清および、肝臓ホモジネート抽出液を実施例１７と同様にＧＰＣ蛍光検出法で分析した。その結果を表１３および図１０に示す。
血清は、血液３００μｌを１００００ｒｐｍで１分間遠心分離して血清を回収し３０％トリフルオロ酢酸１０μｌを混合しさらに１００００ｒｐｍで１分間遠心分離して上清を６０μｌ得た。２００ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）を６０μｌ加えた。肝臓は４倍量のＰＢＳを加えホモジナイズした後、１００００ｒｐｍで５分間遠心分離して上清２００μｌを得た。３０％トリフルオロ酢酸２０μｌを混合しさらに１００００ｒｐｍで５分間遠心分離して上清を１５０μｌ得、等量の２００ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８）を加えて調製した。
ガラクトース残基が結合した分岐グルカンは血中濃度が有意に減少し、一方、肝臓中の濃度が有意に増加した。この結果から肝臓ターゲティングへの応用が示唆された。
（実施例２０：各種非還元末端修飾グルカンの樹状細胞刺激活性）
製造例２の分岐グルカンのタンパク質除去、脱塩、低分子除去を行った後、０．２μｍのフィルターろ過後凍結乾燥を行った。得られた分岐グルカン粉末１１０ｍｇ、１、３、１０、1５ｍＭグルコース−1−リン酸誘導体（Ｎ−アセチルグルコサミン−１−Ｐ（ＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐ）、ガラクトース−１−Ｐ（Ｇａｌ−１−Ｐ）、マンノース−１−Ｐ（Ｍａｎ−１−Ｐ）、グルコサミン−１−Ｐ（ＧｌｃＮ−１−Ｐ）、あるいはグルクロン酸−１−Ｐ（ＧｌｃＡ−１−Ｐ））および１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を含む反応液５ｍｌに製造法１のＡｑＧＰ５０Ｕを加えて５０℃で２４時間反応させた。反応液を5ＮＨＣｌ溶液でｐＨ3に調整し遠心分離により変性タンパク質を含む沈殿物を除去した。上清を回収し、5ＮＮａＯＨ溶液で中和後、ＰＤ−１０カラムで低分子除去、脱塩しさらに０．２μｍのフィルターろ過後凍結乾燥した。
次いで、樹状細胞の刺激を行った。詳細には以下の通りであった。樹状細胞の調製は、Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス（７週齢、雌、日本エスエルシー株式会社）の大腿骨から骨髄細胞を分離し、５ｘ１０６ｃｅｌｌ／ｍｌとなるように、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５０ｎｇ／ｍｌ ｒｍ ＧＭ−ＣＳＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ）、２５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−４（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ）を含むＲＰＭＩ１６４０（Ｓｉｇｍａ）培地１０ｍｌに懸濁し、シャーレで３７℃のＣＯ２インキュベーターで７日間培養した。培養開始２日目、４日目に上記ＲＰＭＩ培地を２．５ｍｌずつ加えた。７日間培養後、培地を除去し、ＰＢＳ緩衝液をシャーレに入れて浮遊細胞を取り除く。さらに氷冷した５ｍＭＥＤＴＡを含むＰＢＳＢｕｆｆｅｒをシャーレ底面にかけてその水流で付着性の未熟樹状細胞を剥がした。得られた未熟樹状細胞懸濁液を４℃で１，２００ｒｐｍ５分間遠心し沈殿を回収した。得られた樹状細胞を５ｘ１０５ｃｅｌｌ／ｍｌとなるように１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ）を含むＲＰＭＩ培地に懸濁した。１８０μｌの樹状細胞懸濁液を９６ｗｅｌｌプレートに入れ、３７℃のＣＯ２インキュベーターで１時間保持しプレートに細胞を固着させた。ＩＮＦ−γ（１０ｎｇ／ｍｌ）、上記調製した表１４に記載の非還元末端結合率の各種非還元末端修飾グルカン（１ｍｇ／ｍｌ）をこの細胞に加えて３７℃のＣＯ２インキュベーターで４８時間保持することにより、細胞刺激を行った。細胞刺激後に細胞上清を遠心分離で回収し、上清中のＩＬ−６産生量をＥＬＩＳＡ法でＯｐｔＥＩＡ ＥＬＩＳＡキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて測定し、樹状細胞刺激により産生されたＩＬ−６を計算した。
結果を表１４、および図１１に示す。
（実施例２１：各種非還元末端修飾グルカンの製造）
表１５の条件１〜１５に示した結合糖の組み合わせで非還元末端修飾分岐グルカンを製造した。
条件１〜６は、製造例２の分岐グルカンのタンパク質除去、脱塩、低分子除去を行った後、０．２μｍのフィルターろ過後凍結乾燥を行った分岐グルカン粉末１１０ｍｇを１５ｍＭグルコース−1−リン酸誘導体（Ｎ−アセチルグルコサミン−１−Ｐ（ＧｌｃＮＡｃ−１−Ｐ）、ガラクトース−１−Ｐ（Ｇａｌ−１−Ｐ）、マンノース−１−Ｐ（Ｍａｎ−１−Ｐ）、グルコサミン−１−Ｐ（ＧｌｃＮ−１−Ｐ）、あるいはグルクロン酸−１−Ｐ（ＧｌｃＡ−１−Ｐ））および１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）を含む反応液５ｍｌに製造法１のＡｑＧＰ５０Ｕを加えて５０℃で２４時間反応させた。反応後の無機リン酸を定量した結果を非還元末端結合量とし表に示す。反応液を５ＮＨＣｌ溶液でｐＨ3に調整し遠心分離により変性タンパク質を含む沈殿物を除去した。上清を回収し、５ＮＮａＯＨ溶液で中和後、ＰＤ−１０カラムで低分子除去、脱塩しさらに０．２μｍのフィルターろ過した。条件７〜１４は、製造例２の分岐グルカン粉末１１０ｍｇを１０ｍＭＮ−アセチルグルコサミン−１−Ｐ、またはガラクトース−１−Ｐを含む反応液5mlを条件１〜６と同様に調製した後、低分子除去、脱塩した１種類の糖で非還元末端を修飾した分岐グルカン１ｍｌを１０ｍＭグルクロン酸−１−Ｐ、グルコサミン−１−Ｐ、ガラクトース−１−Ｐ、またはマンノース−１−Ｐを含む反応液２ｍｌを条件１〜６と同様に調製した後、低分子除去、脱塩した。条件１６〜２２は、製造例２の分岐グルカン粉末２２０ｍｇを１０ｍＭＮ−アセチルグルコサミン−１−Ｐ、またはガラクトース−１−Ｐを含む反応液１０ｍｌを条件１〜６と同様に調製した後、低分子除去、脱塩した１種類の糖で非還元末端を修飾した分岐グルカン１ｍｌを１０ｍＭグルクロン酸−１−Ｐ、グルコサミン−１−Ｐ、ガラクトース−１−Ｐ、またはマンノース−１−Ｐの２種類を含む反応液２ｍｌを条件１〜６と同様に調製した後、低分子除去、脱塩した。条件２３は製造例２の分岐グルカン粉末１１０ｍｇを１０ｍＭマンノース−１−Ｐ、グルクロン酸−１−Ｐ、およびグルコサミン−１−Ｐを含む反応液５ｍｌを条件１〜６と同様に調製した。条件１〜２３のサンプルはすべて酵素反応後ＧＰ酵素タンパク質の変性、低分子除去、脱塩し０．２μｍのフィルターろ過したのち、凍結乾燥した。得られた各種分岐グルカンを実施例２２〜２７で使用した。
（実施例２２：非還元末端に１種類の各種糖が結合した分岐グルカンの樹状細胞刺激活性）
実施例２０で調製したＣ3Ｈ／ＨｅＪマウス（雌、７週齢）由来樹状細胞に実施例２１で製造した各種分岐グルカン（１ｍｇ／ｍｌ細胞液）を添加し４８時間、３７℃でＣＯ2インキュベーターで反応させた。反応液の上清を回収し、ＥＬＩＳＡ法で細胞刺激により産生したＩＬ−６を測定した。結果を表１６および図１２に示す。
非還元末端にグルクロン酸、Ｎ−アセチルグルコサミン、ガラクトース、マンノースが結合した分岐グルカンはいずれも製造例２の分岐グルカンに比べてＩＬ−６産生量が増加した。一方、グルコサミンを結合させた分岐グルカンはＩＬ−６の産生量が製造例２の分岐グルカンより減少しており、ＩＬ−６の産生が抑制される傾向を示した。
（実施例２３：非還元末端にＮ−アセチルグルコサミンおよびその他の各種糖が結合した分岐グルカンの樹状細胞刺激活性）
実施例１９で調製した各種分岐グルカン（１ｍｇ／ｍｌ細胞液）を実施例２０と同様の方法で調製した樹状細胞に添加し、４８時間３７℃でＣＯ２インキュベーターで反応させた。反応液の上清を回収し、ＥＬＩＳＡ法で細胞刺激により産生したＩＬ−６を測定した。結果を表１７および図１３に示す。
非還元末端にＮ−アセチルグルコサミンが結合した分岐グルカンは製造例２の分岐グルカンに比べてＩＬ−６産生量が増加した。Ｎ−アセチルグルコサミンとガラクトースあるいはマンノースを組み合わせることでさらにＩＬ−６の産生量は増加した。Ｎ−アセチルグルコサミンが非還元末端に結合した分岐グルカンは樹状細胞の刺激活性を有すること、さらにガラクトース、マンノースを同時に結合させることで細胞刺激活性の相乗効果が認められた。
（実施例２４：非還元末端にガラクトースおよびその他の各種糖が結合した分岐グルカンの樹状細胞刺激活性）
実施例２１と同様にガラクトースとその他の糖の結合を組み合わせた分岐グルカンのＩＬ−６産生量を調べた。結果を表１８および図１４に示す。ガラクトースが結合した分岐グルカンは製造例２の分岐グルカンに比べてＩＬ−６産生量が多く、ガラクトースとグルクロン酸、Ｎ−アセチルグルコサミンあるいはマルトースを組み合わせることでさらにＩＬ−６の産生量は増加した。ガラクトースが非還元末端に結合した分岐グルカンは樹状細胞の刺激活性を有すること、さらにグルクロン酸、Ｎ−アセチルグルコサミン、マンノースを同時に結合させることで樹状細胞刺激活性の相乗効果が認められた。
（実施例２５：非還元末端にＮ−アセチルグルコサミンおよびその他の各種糖が結合した分岐グルカンのマクロファージ刺激活性）
Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス（雌、７週齢）腹腔内細胞を用いて、実施例１９で調製した各種分岐グルカン（１ｍｇ／ｍｌ細胞液に添加し、４８時間反応させた。反応液の上清を回収し、ＥＬＩＳＡ法で細胞刺激により産生したＩＬ−６を測定した。結果を表１９および図１５に示す。
非還元末端にＮ−アセチルグルコサミンが結合した分岐グルカンは製造例２の分岐グルカンに比べてＩＬ−６産生量が多く、Ｎ−アセチルグルコサミンとガラクトースあるいはマンノースを組み合わせることでさらにＩＬ−６の産生量は増加した。Ｎ−アセチルグルコサミンが非還元末端に結合した分岐グルカンはマクロファージの刺激活性を有すること、さらにガラクトース、マンノースを同時に結合させることで細胞刺激活性の相乗効果が認められた。
（実施例２６：非還元末端にガラクトースおよびその他の各種糖が結合した分岐グルカンのマクロファージ刺激活性）
実施例２３と同様にガラクトースとその他の糖の結合を組み合わせた分岐グルカンのＩＬ−６産生量を調べた。結果を表２０および図１６に示す。ガラクトースが結合した分岐グルカンは製造例２の分岐グルカンに比べてＩＬ−６産生量が多く、ガラクトースとグルクロン酸、Ｎ−アセチルグルコサミンあるいはマルトースを組み合わせることでさらにＩＬ−６の産生量は増加した。ガラクトースが非還元末端に結合した分岐グルカンはマクロファージの刺激活性を有すること、さらにグルクロン酸、Ｎ−アセチルグルコサミン、マンノースを同時に結合させることで細胞刺激活性の相乗効果が認められた。
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
本発明の非還元末端にＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基から選択される少なくとも１つの残基がα−１，４結合したグルカン（非還元末端修飾グルカン）、その水酸基修飾物およびそれらの還元末端修飾物は、血中に投与すると特定の組織に集積させることができると考えられる。そのため、薬効成分の組織ターゲッティングに有用である。本発明の非還元末端修飾グルカン、その水酸基修飾物、それらの非還元末端修飾物およびそれらの還元末端修飾物は樹状細胞、マクロファージなどの抗原提示細胞を刺激してＩＬ−６を産生させる活性（抗原提示細胞刺激活性）を有することから、抗原提示細胞刺激のために有用であり、さらにはワクチンアジュバントとして有用である。本発明の非還元末端修飾グルカン、その水酸基修飾物、それらの非還元末端修飾物およびそれらの還元末端修飾物は、血中半減期を非修飾グルカンよりも長期化することが可能であり、なおかつ、最終的には生体内で完全に分解され排出されるため、安全性が極めて高く、そのため、薬効成分、臨床診断剤、造影剤およびＤＤＳ用ナノ粒子状キャリアなどの改質材料として有用である。本発明の非還元末端修飾グルカン、その水酸基修飾物およびそれらの還元末端修飾物は食品、化粧品、医薬品などに幅広く利用できる。
配列番号１：Ａｑｕｉｆｅｘ Ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼの塩基配列。
配列番号２：Ａｑｕｉｆｅｘ Ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来α−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列。
配列番号３：馬鈴薯由来α−グルカンホスホリラーゼの塩基配列。
配列番号４：馬鈴薯由来α−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列。
配列番号５：Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｚｉｌｌｉｇｉｉ ＡＮ１由来α−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列をコードする塩基配列。
配列番号６：Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｚｉｌｌｉｇｉｉ ＡＮ１由来α−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列。

Claims (20)

  1. 分岐状α−１，４グルカンの複数の非還元末端のうちの２つ以上の非還元末端のそれぞれにＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基から選択される少なくとも１つの残基がα−１，４結合しているが、該分岐状α−１，４グルカンの非還元末端以外の位置にはＮ−アセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基のいずれも存在しない、分岐グルカンであって、該分岐状α−１，４グルカンの重合度が１５以上４×１０５以下である、分岐グルカン。
  2. 前記分岐状α−１，４グルカンが分岐マルトオリゴ糖、デンプン、アミロペクチン、グリコーゲン、デキストリン、酵素合成分岐グルカン及び高度分岐環状グルカンからなる群より選択される請求項１に記載の分岐グルカン。
  3. 請求項１に記載の分岐グルカンの水酸基修飾物であって、該水酸基への修飾が、前記グルカンのアルコール性水酸基の一部又は全てへの修飾であり、該水酸基への修飾が、ヒドロキシアルキル化、アルキル化、アセチル化、カルボキシメチル化、硫酸化及びリン酸化からなる群より独立して選択される、水酸基修飾物。
  4. 請求項１に記載の分岐グルカン又は請求項３に記載の水酸基修飾物の還元末端修飾物。
  5. 前記分岐状α−１，４グルカンの複数の非還元末端のうちの少なくとも１つの非還元末端においてＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基以外の単糖残基がα−１，４結合で結合することによってさらに修飾された請求項１に記載の分岐グルカン、請求項３に記載の水酸基修飾物又は請求項４に記載の還元末端修飾物の非還元末端修飾物。
  6. 前記単糖残基がグルクロン酸残基、グルコサミン残基、マンノース残基、およびキシロース残基から選択される１種あるいは２種以上である請求項５に記載の非還元末端修飾物。
  7. 前記単糖残基がグルクロン酸残基、マンノース残基、およびキシロース残基から選択される１種あるいは２種以上である請求項５に記載の非還元末端修飾物。
  8. ２つ以上の非還元末端を有する分岐状α−１，４グルカンとＮ−アセチルグルコサミン−１−リン酸またはガラクトース−１−リン酸を含む水溶液にα−グルカンホスホリラーゼを作用させることを特徴とする、２つ以上の非還元末端のそれぞれにＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基から選択される少なくとも１つの残基が結合した分岐グルカンの製造方法であって、該分岐状α−１，４グルカンの重合度が１５以上４×１０５以下である、方法。
  9. 前記α−グルカンホスホリラーゼが、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ ＶＦ５由来のα−グルカンホスホリラーゼのアミノ酸配列に対して９５％以上の配列同一性を有しかつＮ−アセチルグルコサミン残基またはガラクトース残基をグルカンの非還元末端にα−１，４結合で転移する活性を有する、請求項８に記載の方法。
  10. 請求項１に記載の分岐グルカン、請求項３に記載の水酸基修飾物、又は請求項４に記載の還元末端修飾物と、薬効成分とを含む、医薬品。
  11. 前記分岐状α−１，４グルカンの複数の非還元末端のうちの少なくとも１つの非還元末端においてＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基以外の単糖残基がα−１，４結合することによってさらに修飾されており、該単糖残基がグルクロン酸残基、グルコサミン残基、マンノース残基、およびキシロース残基から選択される１種あるいは２種である請求項５に記載の非還元末端修飾物と、薬効成分とを含む、医薬品。
  12. 前記薬効成分が、低分子量有機化合物、タンパク質、ペプチド、抗体、抗体フラグメント、受容体、受容体フラグメント、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびＲＮＡアプタマーからなる群より選択される、請求項１０または１１に記載の医薬品。
  13. 前記薬効成分が、抗原タンパク質あるいはペプチドである請求項１０または１１に記載の医薬品。
  14. 請求項１に記載の分岐グルカン、請求項３に記載の水酸基修飾物、又は請求項４に記載の還元末端修飾物を含む、臨床診断用組成物。
  15. 前記分岐状α−１，４グルカンの複数の非還元末端のうちの少なくとも１つの非還元末端においてＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基以外の単糖残基がα−１，４結合することによってさらに修飾されており、該単糖残基がグルクロン酸残基、グルコサミン残基、マンノース残基、およびキシロース残基から選択される１種あるいは２種である請求項５に記載の非還元末端修飾物を含む、臨床診断用組成物。
  16. 請求項１に記載の分岐グルカン、請求項３に記載の水酸基修飾物、又は請求項４に記載の還元末端修飾物を含む、ＤＤＳ用ナノ粒子状キャリア。
  17. 前記分岐状α−１，４グルカンの複数の非還元末端のうちの少なくとも１つの非還元末端においてＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基以外の単糖残基がα−１，４結合することによってさらに修飾されており、該単糖残基がグルクロン酸残基、グルコサミン残基、マンノース残基、およびキシロース残基から選択される１種あるいは２種である請求項５に記載の非還元末端修飾物を含む、ＤＤＳ用ナノ粒子状キャリア。
  18. 前記ＤＤＳ用ナノ粒子状キャリアが、リポソーム、ウイルス粒子、高分子ミセルおよび疎水化高分子ナノゲルからなる群より選択される、請求項１６または１７に記載のキャリア。
  19. 請求項１に記載の分岐グルカン、請求項３に記載の水酸基修飾物、又は請求項４に記載の還元末端修飾物を含む、ワクチンアジュバント。
  20. 前記分岐状α−１，４グルカンが、該グルカンの複数の非還元末端のうちの少なくとも１つの非還元末端においてＮ−アセチルグルコサミン残基およびガラクトース残基以外の単糖残基がα−１，４結合することによってさらに修飾されており、該単糖残基がグルクロン酸残基およびマンノース残基から選択される１種あるいは２種である、請求項１９に記載のワクチンアジュバント。
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JPN6012004355; 梅ヶ谷　勇太　他: 'ホスホリラーゼによる分岐状多糖へのグルクロン酸残基の転移反応' セルロース学会年次大会講演要旨集 Ｖｏｌ．１７ｔｈ, 20100701, ｐ．４４ *
JPN6012004358; 門川　淳一　他: '酵素的グルクロン酸残基の転移反応を利用したアニオン性多分岐多糖の合成' 高分子学会予稿集 Ｖｏｌ．５９　Ｎｏ．２, 20100901, ｐ．４８７５ *
JPN6012004366; 河添　智史　他: '耐熱性ホスホリラーゼによるＮ-ホルミルグルコサミン残基のマルトオリゴへの転移反応' 日本化学会講演予稿集 Ｖｏｌ．９０ｔｈ，Ｎｏ．４, 20100312, ｐ．１０３２ *
JPN6014040037; Ｎａｗａｊｉ　ｅｔ　ａｌ．: Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｖｏｌ．３４３, ｐ．２６９２-２６９６（２００８） *
JPN6014040040; Ｋａｗａｚｏｅ　ｅｔ　ａｌ．: Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｖｏｌ．３４５, ｐ．６３１-６３６（２０１０） *

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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JP2014057534A (ja) * 2012-09-18 2014-04-03 Niigata Univ オリゴ糖合成酵素並びにβ−１，２−マンノビオース及びその誘導体の製造方法

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