CN103282508A - 非还原端改性葡聚糖，其制备方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明的目的是提供含有选自N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的至少一个残基的葡聚糖和改性产物。本发明的支链葡聚糖是这样的支链葡聚糖：其中所述支链葡聚糖具有多个非还原端且选自N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的至少一个残基经由a-1,4-键结合到所述支链a-1,4-葡聚糖的两个或更多个非还原端的每一个上，但在所述支链a-1,4-葡聚糖的除了非还原端以外的位置不存在N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基。

Description

非还原端改性葡聚糖,其制备方法及其用途

技术领域

本发明涉及其中至少一个（优选至少两个）非还原端被改性的葡聚糖、其改性产物以及其制备方法及其用途。本发明更优选涉及其中选自N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的至少一个残基经由α-1,4-键结合到至少一个（优选至少两个）非还原端的每一个上的葡聚糖、其改性产物以及其制备方法及其用途。

背景技术

药物的药效成分（medically effective ingredient）正从化学合成的稳定低分子量化合物快速转变成容易在血液中降解的不稳定物质，如蛋白质、抗体和核酸。因此，必须稳定这些不稳定的药效成分以保持该药效成分更长时间高的血液浓度。此外，为了减少药物的副作用，将药物有效递送至靶组织的必要性在增加。在这种背景下，已正式地利用所谓的药物递送系统（DDS）技术（非专利文献1至4）。DDS技术是指能使药效成分以“所需量”对“所需位点”作用“所需时间”，即以理想的药代动力学控制其以使药物发挥最大效力的技术和系统。

在DDS技术中，药效成分的改性材料是重要的。术语“药效成分的改性材料”在本说明书中是指通过与药效成分的共价结合或通过非共价型相互作用改性药效成分的材料。通过利用改性材料，可以改变该药效成分的各种性质（例如，药代动力学（例如吸收、分布、代谢和排泄）、药理效应、稳定性等）。作为之前已用作药效成分的改性材料的物质，有多种物质，其最通常是高分子材料。例如，作为合成高分子的聚乙二醇(PEG)及其衍生物广泛用作药效成分的改性材料。已经开发出在PEG链端上具有用于结合药效成分的官能团的许多药效成分-改性材料，这样的改性材料实际用于制备药物。具体应用实例包括聚乙二醇化干扰素α（产品名：PEGASYS）。由于干扰素α具有小分子量并容易排泄到尿中，存在其在血液中具有短半衰期的问题。但是，通过使干扰素α共价结合到分子量为40,000的PEG链上以形成具有高分子量的干扰素α-结合物，成功地显著提高在血液中的半衰期。如上所述，确认了高分子材料用于改性药效成分或用作DDSs的纳米微粒载体的显著效果。

但是，另一方面，已经指出一个问题。例如，当向血液给予在活体中没有可降解性并且不经历肾小球过滤的高分子量合成高分子时，存在该高分子蓄积在特定器官中的风险和发生归因于该蓄积的副作用的风险。原因在于，存在于血液中的分子量上万或更小的分子经历肾小球过滤并快速排泄到尿中，但分子量上万或更大的分子不经历肾小球过滤并有限地排泄到尿中。因此，期待可安全使用的药效成分的改性材料。

多糖已用作食品原料很长时间，近年来，开始作为环保的高分子材料、作为具有生物相容性的安全材料和进一步作为功能材料引起注意。

以淀粉、糖原等为代表的α-1,4葡聚糖是在环境中以及在人体中容易降解的安全天然材料，并且是DDS药物、再生医学、体内成像等工业中的前景广阔的材料，其在未来有望增长。当α-1,4葡聚糖用于这种用途时，必须为该α-1,4葡聚糖提供与药效成分相互作用的功能和靶向器官和组织的功能，同时必须控制α-1,4葡聚糖的可降解性。

另一方面，在制药领域中，一直在开发用于预防或治疗传染病、癌症等的疫苗。疫苗用于向身体给予抗原并利用对抗原的免疫应答预防或治疗疾病。通常，作为抗原，在传染病疫苗的情况下，使用病原体的一部分、整个灭活病原体或病原体的表面蛋白或肽。作为抗原，在癌症疫苗的情况下，使用在癌细胞表面上特异性表达的蛋白质或肽。通常，由于仅单独给予抗原在许多情况下不造成有效的免疫诱导，与抗原一起给予身体诱发免疫应答的物质（佐剂）。为了开发有效的疫苗，开发安全有效的佐剂是重要的。期望有效安全的佐剂在给予纯化蛋白或肽作为抗原时有效发挥作用。

近年来，由于自然科学的进展，已经揭示免疫系统的机制。已经揭示，作为抗原呈递细胞的树突细胞或巨噬细胞起到免疫反应的核心作用，且活化抗原呈递细胞和诱导由活化产生的炎性细胞因子（IL-2、IL-6、IL-12、TNF-α等）生成是有效免疫诱导所必需的。还已经揭示，传统上用作佐剂的物质通过刺激和活化抗原呈递细胞以及诱导炎性细胞因子生成而参与诱导和增强免疫反应（“Janeway’s Immunobiology”（在Takehiko Sasazuki, Nankodo Co., Ltd.的监督下的译本）（原著“Janeway’s Immunobiology seventh edition Kenneth Murphy, Paul Travers, Mark Walport 2008 Garlnd Science, Taylar & Francis Group, LLC”））。

照惯例，许多佐剂是已知的，但很少有可用于肿瘤免疫疗法以治疗人类肿瘤或预防人类肿瘤转移和复发的安全和低成本的免疫佐剂。例如，在利用培养的树突细胞的肿瘤免疫疗法中，使用钥孔戚血蓝素（keyhole limpet hemocyanin）作为免疫佐剂（Geiger, J. D.,等人, Cancer Res., 61, 第8513-8519页, 2001），但钥孔戚血蓝素昂贵。已经提出给予直接活化树突细胞的细胞因子，如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（有时缩写为“GM-CSF”）作为免疫佐剂的方法，但细胞因子更昂贵。

在作为传染病对策的疫苗生产中，作为安全和低成本的免疫佐剂，使用免疫佐剂活性不足的免疫佐剂，如明矾（氢氧化铝）和弗氏不完全佐剂（由于这种佐剂是油性的，担心毒性）。与动物实验中使用的弗氏完全佐剂相比，这些低毒，但免疫佐剂活性弱。

如上所述，传统佐剂（也称作免疫佐剂）在刺激免疫应答的能力、安全性或两者中存在问题。因此，开发具有刺激免疫应答的高能力，即刺激抗原呈递细胞的能力并且安全的佐剂是非常重要的。

[现有技术文献]

[非专利文献]

[非专利文献1] Hiroaki Okada, "Drug delivery using functional DDS carriers" 第1章, General Statement: Kinousei DDS carrier wo mochiita seizai sekkei ni yoru soyaku (Drug Discovery by Preparation Design Using Functional DDS Carrier), CMC Publishing Co., Ltd., 2008, 1-23

[非专利文献2] Masayuki Yokoyama, "Polymeric materials for drug carriers, Special Topic, DDS ni riyou sareru kobunshi kagaku (Polymer Chemistry Utilized in DDS)", Drug Delivery System 23-6, 2008: 610-617

[非专利文献3] Maria Laura Immordino等人, International Journal of Nanomedicine 2006: 1(3) 297-315

[非专利文献4] J. Milton Harris和Robert B. Chess, NATURE REVIEWS, DRUG DISCOVERY, VOLUME 2, MARCH 2003, 214-221。

发明概述

本发明要解决的问题

本发明旨在解决上述问题。

可安全使用的药效成分的理想改性材料被认为具有下列特征：

(1) 该改性材料应该是可以在活体中降解的高分子材料；

(2) 该改性材料应具有稳定的品质以致其可用作药物。也就是说，可以规定该结构，并能每次生产具有相同品质的改性材料；

(3) 该改性材料应具有可以与药效成分结合或相互作用的官能团；和

(4) 该改性材料应具有组织靶向功能或细胞刺激功能。

本发明人认为，作为药效成分的改性材料的优异的高分子物质是葡聚糖（在本说明书中，葡聚糖是指α-1,4-葡聚糖和用α-1,6-键支化的α-1,4-葡聚糖）。糖原或淀粉作为贮存多糖蓄积在动物和植物体内。糖原或淀粉是一种类型的葡聚糖。因此，糖原或淀粉是人体内始终存在的组分并具有优异的生物相容性。此外，葡聚糖在体内经历α-淀粉酶的水解并转化成葡萄糖或麦芽低聚糖——这是体内始终存在的组分。因此，葡聚糖可以说是最安全的高分子材料。

葡聚糖的另一优点在于其结构的设计相对容易。控制葡聚糖的分子量、支化度、环化等的方法是已知的。可获得完全直链的葡聚糖（其中葡萄糖残基仅用α-1,4-键结合）、被用α-1,6-键结合的一些葡萄糖残基以高频率支化的葡聚糖等。在支链葡聚糖中，α-1,6-键每增加一个，就生成一个新的非还原端。在合成葡聚糖分子时可以按需要合适地调节α-1,6-键的数量。

另一方面，采用葡聚糖作为药效成分的改性材料（例如载体、疫苗佐剂等）时的最大问题在于，葡聚糖没有可以与药效成分结合或相互作用的官能团。可以使用已知化学方法将阳离子或阴离子官能团引入葡聚糖中存在的还原端上的许多羟基或醛基中。

此外，就利用葡聚糖作为药效成分的载体而言，载体优选具有组织靶向功能。作为实现靶向器官和组织的手段，已经提出利用通过细胞表面上的受体或凝集素识别糖类的机制的方法。细胞表面上的受体或凝集素不识别葡萄糖，但识别单糖，如半乳糖或甘露糖。因此，为了赋予葡聚糖组织靶向功能，必须使具有靶向功能的单糖，而非葡萄糖结合到葡聚糖的非还原端上。

为了利用葡聚糖作为疫苗佐剂，葡聚糖优选对在免疫应答中起到核心作用的抗原呈递细胞具有高刺激活性。抗原呈递细胞（树突细胞、巨噬细胞等）不被仅由葡萄糖残基构成的葡聚糖活化，但被单糖，如半乳糖或甘露糖活化。因此，为了赋予葡聚糖高细胞刺激活性，必须使具有细胞刺激功能的单糖结合到葡聚糖的非还原端上。但是，使非葡萄糖的单糖经由α-1,4键结合到具有至少两个非还原端的支链葡聚糖的非还原端上的方法之前未知。例如，在Nawaji等人, Carbohydr. Res., 2008, 343, 2692-2696中，描述了可以使用源自马铃薯的葡聚糖磷酸化酶将α-D-葡糖胺-1-磷酸（GlcN-1-P）转移给麦芽低聚糖。但是，Nawaji等人在第2694页，右栏，第3-5行描述了磷酸化酶不识别N-乙酰基葡糖胺-1-磷酸（GlcNAc-1-P）。酶对底物的识别是极严格的，本领域技术人员的常识是正常底物在许多情况下即使仅少量改性也变得无法被识别为底物。葡聚糖磷酸化酶的正常底物是葡萄糖-1-磷酸，已知被葡聚糖磷酸化酶识别的该底物的类似物只有α-D-木糖-1-磷酸、甘露糖-1-磷酸、葡糖胺-1-磷酸、葡萄糖醛酸-1-磷酸（GlcA-1-P）和N-甲酰基葡糖胺-1-磷酸（GlcNF-1-P）。因此，磷酸化酶被认为不能用于将GlcNAc-1-P或半乳糖-1-磷酸（Gal-1-P）转移给葡聚糖。

解决问题的方式

本发明人为解决上述问题进行了深入研究并发现，源自超嗜热菌（Aquifex aeolicus）VF5的α-葡聚糖磷酸化酶可利用半乳糖-1-磷酸（Gal-1-P）和N-乙酰基葡糖胺-1-磷酸（GlcNAc-1-P）（它们不是其原始底物）作为底物，可催化经由α-1,4键将半乳糖残基（Gal残基）或N-乙酰基葡糖胺残基（GlcNAc残基）结合到α-1,4葡聚糖的非还原端上的反应，尽管如此，这种酶可几乎不催化其逆反应，基于这一发现，完成本发明。此外，本发明人还发现，源自马铃薯的α-葡聚糖磷酸化酶可以使用Gal-1-P作为底物，且源自Thermococcus zilligii AN1的α-葡聚糖磷酸化酶可以使用Gal-1-P和GlcNAc-1-P作为底物。这些α-葡聚糖磷酸化酶是作用于作为原始底物的葡萄糖-1-磷酸时既催化其中将葡萄糖残基转移给葡聚糖受体的反应（葡聚糖合成反应），又催化其中将葡聚糖的非还原端上的葡萄糖磷酸解以生成葡萄糖-1-磷酸的反应（葡聚糖降解反应）的酶。但是，令人惊讶地，当这些酶使用N-乙酰基葡糖胺-1-磷酸或半乳糖-1-磷酸作为底物时，这些酶催化其中将这些单糖的残基转移给葡聚糖受体的反应（葡聚糖合成反应），但几乎不催化其中将结合在葡聚糖的非还原端上的这些单糖的残基磷酸解以生成N-乙酰基葡糖胺-1-磷酸或半乳糖-1-磷酸的反应（葡聚糖降解反应）。尽管葡聚糖降解反应再次释放结合的单糖残基，但本发明人发现，在本发明的方法中，α-葡聚糖磷酸化酶几乎不催化葡聚糖降解反应。也就是说，对该合成反应的催化活化远高于对该降解反应的催化活性。由于这种特征，如果葡聚糖具有多个非还原端，α-葡聚糖磷酸化酶可以将选自N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的至少一个残基逐个结合到葡聚糖的所述多个非还原端上。通过利用这种酶的这种特征，首次可生产本发明的非还原端改性葡聚糖。通过利用这种酶的这种特征，尤其首次可以以具有大量（例如5个或更多个）非还原端的葡聚糖为原料获得具有N-乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基（例如葡糖胺残基）结合至非还原端的高频率（例如50%或更大）结合率的非还原端改性葡聚糖。此外，本发明人发现，当Gal残基或GlcNAc残基经由α-1,4键结合到α-1,4葡聚糖的非还原端上时，可以为α-1,4葡聚糖提供葡糖淀粉酶耐受性。此外，本发明人发现，本发明的非还原端改性葡聚糖在给予到血液中时可蓄积到特定组织（例如肝）中。本发明人还发现，本发明的非还原端改性葡聚糖具有刺激抗原呈递细胞（例如树突细胞或巨噬细胞）产生IL-6的活性（抗原呈递细胞刺激活性）。此外，本发明人发现，本发明的非还原端改性葡聚糖具有优异的生物可降解性，并可以通过将本发明的非还原端改性葡聚糖的羟基改性（例如乙酰化）来控制该非还原端改性葡聚糖在活体中的降解。

在本发明的非还原端改性的支链α-1,4葡聚糖（例如其中选自N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的至少一个残基经由α-1,4键结合到至少一个（优选至少两个）非还原端的每一个上的支链α-1,4葡聚糖）或其羟基改性产物、其非还原端改性产物及其还原端改性产物中，当选自葡萄糖醛酸残基、甘露糖残基和木糖残基的至少一种残基进一步结合到所述多个非还原端中的至少一个或多个非还原端上时，可进一步改进这些葡聚糖的抗原呈递细胞刺激活性。

在本发明中，由于使用α-葡聚糖磷酸化酶（EC2.4.1.1）转移糖（例如N-乙酰基葡糖胺或半乳糖）残基，糖残基与葡聚糖的连接为α-1,4键。也就是说，在葡聚糖的非还原端的葡糖基残基的4-位处的碳原子和糖（例如N-乙酰基葡糖胺或半乳糖）残基的1位处的碳原子经由氧原子α-结合。

在本说明书中，其中选自N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的至少一个残基经由α-1,4键结合到葡聚糖的至少一个非还原端的每一个上的本发明的葡聚糖也被称作本发明的“非还原端改性葡聚糖”。

要结合到本发明的非还原端改性葡聚糖中的非还原端上的糖残基可以是单糖的残基，或可以是寡糖的残基。也就是说，要结合到非还原端上的糖残基可以是N-乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基，或其寡糖残基。在本说明书中，寡糖是指其中结合2个或更多和10个或更少单糖的化合物。结合到本发明的非还原端改性葡聚糖的一个非还原端上的糖残基的聚合度可以为例如大约2或更大，大约3或更大，大约4或更大，大约5或更大等，并可以为例如大约10或更小，大约9或更小，大约8或更小，大约7或更小，大约6或更小，大约5或更小，大约4或更小，大约3或更小，大约2或更小等。在一个实施方案中，结合到本发明的非还原端改性葡聚糖的一个非还原端上的糖残基是2个糖的残基（即二聚物）。

可以通过所用葡聚糖的支化频率和这些残基引入非还原端中的频率来控制引入葡聚糖中的半乳糖残基或N-乙酰基葡糖胺残基的量。当想要提高葡聚糖中这些残基的引入量时，使用具有高支化频率的葡聚糖并提高将这些残基引入非还原端的频率。当想要降低葡聚糖中这些残基的引入量时，使用具有低支化频率的葡聚糖并降低将这些残基引入非还原端的频率。这些残基向葡聚糖的引入量的下限是其中每葡聚糖分子引入这些残基之一的情形——这可通过将半乳糖残基或N-乙酰基葡糖胺残基引入没有分支的葡聚糖的非还原端来实现。在高支化葡聚糖的情况下，由于非还原端分布在葡聚糖分子的最外层中，引入的任一残基被认为在引入任一残基后分布在葡聚糖分子的最外层中，并且这对于与药效成分的相互作用和结合而言是理想的。如上所述，具有选择性结合到非还原端上的任一残基的葡聚糖有可能成为药效成分的优异改性材料。

例如，本发明提供下列葡聚糖等：

(项1)

葡聚糖，其中所述葡聚糖具有非还原端且选自N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的至少一个残基经由α-1,4-键结合到葡聚糖的至少一个非还原端（优选两个或更多个非还原端）的每一个上，但在所述葡聚糖的除了非还原端以外的位置不存在N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基，其中所述葡聚糖是支链α-1,4葡聚糖或直链α-1,4葡聚糖，且所述支链α-1,4葡聚糖或直链α-1,4葡聚糖的聚合度优选为15或更大和4 x 10⁵或更小。要指出，本发明的具有结合到其上的N-乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基的葡聚糖也被称作本发明的非还原端改性葡聚糖。

(项2)

根据项1的葡聚糖，其中所述葡聚糖是支链α-1,4-葡聚糖，其中所述支链α-1,4-葡聚糖具有多个非还原端且选自N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的至少一个残基结合到所述支链α-1,4-葡聚糖的至少一个（优选两个或更多个）非还原端的每一个上。也就是说，这种葡聚糖是支链α-1,4-葡聚糖，其中所述支链α-1,4-葡聚糖具有多个非还原端且选自N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的至少一个残基经由α-1,4-键结合到所述支链α-1,4-葡聚糖的至少一个（优选两个或更多个）非还原端的每一个上，但在所述支链α-1,4-葡聚糖的除了非还原端以外的位置不存在N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基，且所述支链α-1,4葡聚糖的聚合度优选为15或更大和4 x 10⁵或更小。

(项3)

根据项2的葡聚糖，其中所述支链α-1,4-葡聚糖选自支链麦芽低聚糖、淀粉、支链淀粉、糖原、糊精、酶法合成的支链葡聚糖和高支化环葡聚糖。

(项4)

根据项1至3中任一项的葡聚糖（非还原端改性葡聚糖）的羟基改性产物，其中羟基上的改性为在葡聚糖的一些或所有醇式羟基上的改性，且羟基上的改性独立地选自羟烷基化、烷基化、乙酰化、羧甲基化、硫酸化和磷酸化。

(项5)

根据项1至3中任一项的葡聚糖（非还原端改性葡聚糖）或其羟基改性产物的还原端改性产物。

(项6)

根据项2至3中任一项的葡聚糖（非还原端改性葡聚糖）或其羟基改性产物或其还原端改性产物的非还原端改性产物，其通过将除了N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基以外的单糖残基经由α-1,4-键连接至支链α-1,4葡聚糖的所述多个非还原端的至少一个非还原端而进一步改性。

(项6B)

根据项6的葡聚糖（非还原端改性葡聚糖）或其羟基改性产物或其还原端改性产物的非还原端改性产物，其中所述单糖残基是选自葡萄糖醛酸残基、葡糖胺残基、甘露糖残基和木糖残基的一种或两种。

(项6C)

根据项6的葡聚糖（非还原端改性葡聚糖）或其羟基改性产物或其还原端改性产物的非还原端改性产物，其中所述单糖残基是选自葡萄糖醛酸残基和甘露糖残基的一种或两种。

(项7)

制备葡聚糖（即本发明的非还原端改性葡聚糖）的方法，所述葡聚糖中选自N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的至少一个残基结合到两个或更多个非还原端的每一个上，其特征在于使α-葡聚糖磷酸化酶作用于包含葡聚糖（优选具有两个或更多个非还原端的支链α-1,4-葡聚糖）和N-乙酰基葡糖胺-1-磷酸或半乳糖-1-磷酸的水溶液，其中用作原材料的葡聚糖的聚合度优选为15或更大和4 x 10⁵或更小。

(项8)

根据项7的方法，其中所述α-葡聚糖磷酸化酶具有95%或更高的与源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列的序列一致性，并具有将N-乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基转移至葡聚糖的非还原端以形成α-1,4-键的活性。

(项9)

药物，其包含

根据项1至3中任一项的包含N-乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基的葡聚糖、其羟基改性产物或其还原端改性产物，和

药效成分。

(项10)

药物，其包含：

根据项2至3中任一项的包含N-乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基的葡聚糖或其羟基改性产物或其还原端改性产物的非还原端改性产物，其通过将除了N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基以外的单糖残基经由α-1,4-键连接至支链α-1,4葡聚糖的所述多个非还原端的至少一个非还原端而进一步改性，其中所述单糖残基是选自葡萄糖醛酸残基、葡糖胺、甘露糖残基和木糖残基的一种或两种；和

药效成分。

(项11)

根据项9或10中的药物，其中所述药效成分选自低分子量有机化合物、蛋白质、肽、抗体、抗体片段、受体、受体片段、DNA、RNA、siRNA、miRNA和RNA适配子。

(项11A)

根据项9至11中任一项的药物，其中所述药效成分是抗原蛋白或肽。

(项12)

临床诊断组合物，其包含根据项1至3中任一项的包含N-乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基的葡聚糖、其羟基改性产物或其还原端改性产物。

(项13)

临床诊断组合物，其包含根据项2至3中任一项的包含N-乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基的葡聚糖或其羟基改性产物或其还原端改性产物的非还原端改性产物，其通过将除了N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基以外的单糖残基经由α-1,4-键连接至支链α-1,4葡聚糖的所述多个非还原端的至少一个非还原端而进一步改性，其中所述单糖残基是选自葡萄糖醛酸残基、葡糖胺、甘露糖残基和木糖残基的一种或两种。

(项14)

DDS的纳米微粒载体，其包含根据项1至3中任一项的包含N-乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基的葡聚糖、其羟基改性产物或其还原端改性产物。

(项15)

DDS的纳米微粒载体，其包含根据项2至3中任一项的包含N-乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基的葡聚糖或其羟基改性产物或其还原端改性产物的非还原端改性产物，其通过将除了N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基以外的单糖残基经由α-1,4-键连接至支链α-1,4葡聚糖的所述多个非还原端的至少一个非还原端而进一步改性，其中所述单糖残基是选自葡萄糖醛酸残基、葡糖胺、甘露糖残基和木糖残基的一种或两种。

(项16)

根据项14或15的载体，其中DDS的纳米微粒载体选自脂质体、病毒粒子、高分子胶束和由带有疏水基团的高分子构成的纳米凝胶。

(项17)

疫苗佐剂，其包含根据项1至3中任一项的包含N-乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基的葡聚糖、其羟基改性产物或其还原端改性产物。

(项18)

根据项17的疫苗佐剂，通过将除了N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基以外的单糖残基经由α-1,4-键连接至支链α-1,4葡聚糖的所述多个非还原端的至少一个或多个非还原端而进一步改性，其中所述单糖残基是选自葡萄糖醛酸残基和甘露糖残基的一种或两种。

发明效果

本发明的非还原端改性葡聚糖（其中选自N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的至少一个残基经由α-1,4键结合到至少一个（优选至少两个）非还原端的每一个上的葡聚糖）、其羟基改性产物、其非还原端改性产物及其还原端改性产物被认为在给予到血液中时可蓄积到特定组织中。由于本发明的非还原端改性的支链α-1,4葡聚糖（其中选自N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的至少一个残基经由α-1,4键结合到至少一个（优选至少两个）非还原端的每一个上的支链α-1,4葡聚糖）、其羟基改性产物、其非还原端改性产物及其还原端改性产物具有刺激抗原呈递细胞，如树突细胞或巨噬细胞产生IL-6的活性（抗原呈递细胞刺激活性），它们被认为可用作疫苗佐剂。在本发明的非还原端改性的支链α-1,4葡聚糖（其中选自N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的至少一个残基经由α-1,4键结合到至少一个（优选至少两个）非还原端的每一个上的支链α-1,4葡聚糖）、其羟基改性产物、其非还原端改性产物和其还原端改性产物中，当葡萄糖醛酸残基、甘露糖残基和木糖残基中的至少一种残基进一步结合到所述多个非还原端中的至少一个或多个非还原端上时，可进一步改进这些葡聚糖的抗原呈递细胞刺激活性。

本发明的非还原端改性葡聚糖、其羟基改性产物、其非还原端改性产物及其还原端改性产物具有比未改性的葡聚糖的血液半衰期长的延长的血液半衰期并且非常安全，因为它们在活体中最终完全降解并排泄。因此，本发明的这些葡聚糖及其改性产物可用作药效成分的改性材料、临床诊断剂、成像剂和DDS的纳米微粒载体。由于可通过酶促反应控制本发明的非还原端改性葡聚糖、其羟基改性产物、其非还原端改性产物及其还原端改性产物的结构，它们也具有优异的品质稳定性。

附图简述

图1显示用各种淀粉酶消化非还原端改性的支链葡聚糖(B-GlcNAc)或未改性的支链葡聚糖(B)后的HPAEC-PAD分析结果。参见实施例11。

图2显示用各种淀粉酶消化非还原端改性的支链葡聚糖(B-Gal)或未改性的支链葡聚糖(B)后的HPAEC-PAD分析结果。参见实施例12。

 图3显示在用各种淀粉酶降解非还原端改性的支链葡聚糖或未改性的支链葡聚糖(B)时被认为获得的产物的结构的示意图。参见实施例12。

 图4是显示在用α-淀粉酶降解具有结合到其上的N-乙酰基葡糖胺残基的支链葡聚糖时随时间经过的产物重均分子量变化的曲线图。参见实施例13。

 图5是显示在用α-淀粉酶降解具有不同乙酰化程度的非还原端N-乙酰基葡糖胺残基-结合支链葡聚糖时随时间经过的重均分子量变化的曲线图。参见实施例14。

 图6是显示在用α-淀粉酶降解具有结合到其上的半乳糖残基的支链葡聚糖时随时间经过的产物重均分子量变化的曲线图。参见实施例15。

 图7是显示在用α-淀粉酶降解具有不同乙酰化程度的非还原端半乳糖残基-结合支链葡聚糖时随时间经过的重均分子量变化的曲线图。参见实施例16。

 图8是显示具有结合到非还原端上的N-乙酰基葡糖胺残基的乙酰化支链葡聚糖和乙酰化非还原端-未改性的支链葡聚糖(B)在血液中的葡聚糖残留比的曲线图。参见实施例17。

 图9是显示具有结合到非还原端上的半乳糖残基的乙酰化支链葡聚糖和乙酰化非还原端-未改性的支链葡聚糖(B)在血液中的葡聚糖残留比的曲线图。参见实施例18。

 图10是显示具有结合到非还原端上的半乳糖残基的乙酰化支链葡聚糖和乙酰化非还原端未改性的支链葡聚糖(B)在血液和肝中的浓度的曲线图。参见实施例19。

 图11是显示在各种非还原端改性葡聚糖与树突细胞接触时的IL-6生成量的曲线图。参见实施例20。

 图12是显示在各种非还原端改性葡聚糖与树突细胞接触时的IL-6生成量的曲线图。参见实施例22。

 图13是显示在各种非还原端改性葡聚糖与树突细胞接触时的IL-6生成量的曲线图。参见实施例23。

 图14是显示在各种非还原端改性葡聚糖与树突细胞接触时的IL-6生成量的曲线图。参见实施例24。

图15是显示在各种非还原端改性葡聚糖与巨噬细胞接触时的IL-6生成量的曲线图。参见实施例25。

 图16是显示在各种非还原端改性葡聚糖与巨噬细胞接触时的IL-6生成量的曲线图。参见实施例26。

本发明的实施方式

下面详细解释本发明。

在本说明书通篇中，应该理解的是，除非另行指明，单数形式的措辞包括其复数形式的概念。此外，应该理解的是，除非另行指明，本说明书中所用的术语以本领域中通常使用的意义使用。

(1. 材料)

(1.1) 葡聚糖和葡聚糖的改性产物

本说明书中使用的“葡聚糖”是具有D-葡萄糖作为组成单元的多糖。在本发明中，优选使用α-D-葡聚糖作为葡聚糖。在α-D-葡聚糖中连接葡萄糖残基的键主要由α-1,4-糖苷键构成并可含有α-1,6-糖苷键。含有α-1,6-糖苷键的α-D-葡聚糖具有支链结构。在分子中具有至少一个α-1,6-糖苷键的葡聚糖被称作支链葡聚糖，在分子中没有α-1,6-糖苷键的葡聚糖被称作直链葡聚糖。本发明中所用的优选葡聚糖是直链葡聚糖和支链葡聚糖，更优选是直链α-1,4-葡聚糖和用α-1,6-键支化的α-1,4-葡聚糖（也被称作支链α-1,4葡聚糖）。本发明中所用的葡聚糖优选不含α-1,3-键。

直链α-D-1,4-葡聚糖是指其中D-葡萄糖单元的两个或更多个糖单元仅用α-1,4-糖苷键结合的多糖。在本说明书中，除非另行指明，直链α-D-1,4-葡聚糖被称作直链葡聚糖或直链α-1,4-葡聚糖。直链葡聚糖具有一个非还原端。合适地用在本发明中的直链葡聚糖的实例包括麦芽低聚糖和直链淀粉。

在本说明书中，术语“麦芽低聚糖”是指通过大约2至大约10个D-葡萄糖的脱水缩合产生的物质，其中D-葡萄糖单元通过α-1,4键结合。麦芽低聚糖的聚合度优选为大约3或更大，更优选大约4或更大，更优选大约5或更大。麦芽低聚糖的聚合度可以为例如大约10或更小，大约9或更小，大约8或更小，大约7或更小等。麦芽低聚糖的实例包括麦芽低聚糖，如麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖、麦芽八糖、麦芽九糖和麦芽十糖。

在本说明书中，术语“直链淀粉”是指由经由α-1,4-键连接的葡萄糖单元构成的直链分子。在天然淀粉中含有直链淀粉。直链淀粉可以是从天然淀粉中提取的天然直链淀粉，或可以是由酶促反应合成的直链淀粉（在本说明书也被称作“酶法合成的直链淀粉”）。天然直链淀粉在一些情况下可含有支链部分，但酶法合成的直链淀粉不含支链。此外，天然直链淀粉具有大的多分散性并具有分子量差异，但酶法合成的直链淀粉（特别是通过国际公开WO 02/097107小册子中描述的SP-GP方法合成的酶法合成的直链淀粉）具有小的多分散性并具有极其均一的分子量。因此，在本发明中，优选使用酶法合成的直链淀粉。本发明中所用的直链淀粉的聚合度优选为大约2或更大，更优选大约3或更大，再更优选大约10或更大，和最优选大约30或更大。本发明中所用的直链淀粉的聚合度优选为大约2 x 10³或更小，更优选大约1 x 10³或更小，再更优选大约700或更小，和最优选大约500或更小。

在本说明书中，术语“支链α-D-葡聚糖”是指其中直链葡聚糖（其中D-葡萄糖单元用α-1,4-糖苷键连接）用α-1,4-糖苷键以外的键支化的葡聚糖。在本说明书中，除非另行指明，支链α-D-葡聚糖被称作支链葡聚糖。支化键是α-1,6-糖苷键、α-1,3-糖苷键或α-1,2-糖苷键，和最优选是α-1,6-糖苷键。本发明中所用的支链α-D-葡聚糖优选不含α-1,3-糖苷键和α-1,2-糖苷键。该支链葡聚糖通常具有与支化键数相同数量的非还原端。当用选择性仅裂解α-1,6-糖苷键的酶（例如异淀粉酶、支链淀粉酶等）处理支链葡聚糖时，该支链葡聚糖可降解成直链α-1,4-葡聚糖的混合物。这些被称作支链葡聚糖的单元链，其聚合度被称作单元链长度。

合适地用在本发明中的支链葡聚糖的实例包括具有2个或更多个非还原端的支链α-1,4-葡聚糖、支链麦芽低聚糖、淀粉、支链淀粉、糖原、糊精、酶法合成的支链葡聚糖和高支化环葡聚糖。具有一个非还原端的支链CD不优选。

在本说明书中，术语“支链麦芽低聚糖”是指通过大约3至大约10个D-葡萄糖的脱水缩合产生的物质，其中D-葡萄糖单元主要用α-1,4键结合，且其含有一个或多个支化键，即2个或更多个非还原端。支链麦芽低聚糖的聚合度优选为大约4或更大，更优选大约5或更大，更优选大约6或更大。支链麦芽低聚糖的聚合度可以为例如大约10或更小，大约9或更小，大约8或更小，大约7或更小等。

在本说明书中，术语“淀粉”是直链淀粉和支链淀粉的混合物。作为淀粉，可以使用任何淀粉，只要其通常可商购获得。淀粉中所含的直链淀粉与支链淀粉的比率随产生淀粉的植物的种类而变。糯米、糯玉米等具有的几乎所有淀粉都是支链淀粉。另一方面，由常见植物不能获得仅由直链淀粉构成、不含支链淀粉的淀粉。淀粉被分类成天然淀粉、降解淀粉和改性淀粉。

天然淀粉根据原料被分类为块茎淀粉和谷类淀粉。块茎淀粉的实例包括马铃薯淀粉、木薯淀粉、甘薯淀粉、野葛淀粉、欧洲蕨淀粉等。谷类淀粉的实例包括玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉等。天然淀粉的实例是高直链淀粉淀粉（例如高直链淀粉玉米淀粉）或蜡质淀粉。所述淀粉可以是可溶淀粉。可溶淀粉是指通过对天然淀粉施以各种处理获得的水溶性淀粉。所述淀粉可以选自可溶淀粉、蜡质淀粉和高直链淀粉淀粉。所述淀粉可以是改性淀粉。

本发明中所用的淀粉的聚合度优选为大约1 x 10³或更大，更优选大约5 x 10³或更大，再更优选大约1 x 10⁴或更大，和最优选大约2 x 10⁴或更大。本发明中所用的淀粉的聚合度优选为大约1 x 10⁷或更小，更优选大约3 x 10⁶或更小，再更优选大约1 x 10⁶或更小，和最优选大约3 x 10⁵或更小。

支链淀粉是其中葡萄糖单元经由α-1,6键结合到经由α-1,4键结合的葡萄糖单元上的支链分子。在天然淀粉中含有支链淀粉。作为支链淀粉，例如可以使用由100%支链淀粉构成的蜡质玉米淀粉。本发明中所用的支链淀粉的聚合度优选为大约1 x 10³或更大，更优选大约5 x 10³或更大，再更优选大约1 x 10⁴或更大，和最优选大约2 x 10⁴或更大。本发明中所用的支链淀粉的聚合度优选为大约1 x 10⁷或更小，更优选大约3 x 10⁶或更小，再更优选大约1 x 10⁶或更小，和最优选大约3 x 10⁵或更小。

糖原是由葡萄糖构成的一种类型的葡聚糖，并且是具有高支化频率的葡聚糖。糖原作为动物的贮存多糖以颗粒状态广泛分布在几乎所有细胞中。在植物中存在糖原，例如在玉米的甜玉米物种的种子中。在糖原中，通常，平均聚合度为12至18的由经由α-1,4-键结合的葡萄糖构成的糖链以每大约3个葡萄糖单元大约1个链的比率通过α-1,6-键结合到由经由α-1,4-键结合的葡萄糖构成的糖链上。此外，类似地，由通过α-1,4-键结合的葡萄糖构成的糖链通过α-1,6-键结合到通过α-1,6-键结合的支链上。因此，糖原形成网络结构。也可以酶法合成糖原。本发明中所用的糖原的聚合度优选为大约500或更大，更优选大约1 x 10³或更大，再更优选大约2 x 10³或更大，和最优选大约3 x 10³或更大。本发明中所用的糖原的聚合度优选为大约1 x 10⁷或更小，更优选大约3 x 10⁶或更小，再更优选大约1 x 10⁶或更小，和最优选大约3 x 10⁵或更小。

糊精是由葡萄糖构成的一种类型的葡聚糖，并且是具有介于淀粉复杂程度与麦芽糖复杂程度之间的中等复杂程度的葡聚糖。通过用酸、烷基或酶部分降解淀粉获得糊精。也通过用物理处理，如声处理部分降解淀粉获得糊精。本发明中所用的糊精的聚合度优选为大约10或更大，更优选大约20或更大，再更优选大约30或更大，和最优选大约50或更大。本发明中所用的糊精的聚合度优选为大约1 x 10⁴或更小，更优选大约9 x 10³或更小，再更优选大约7 x 10³或更小，和最优选大约5 x 10³或更小。

酶法合成的支链葡聚糖是指使用酶合成的支链葡聚糖。通过在经SP-GP法合成直链淀粉时将分支酶添加到反应溶液中，可以使产物支化。可通过分支酶的添加量调节支化程度。由于酶法合成的支链葡聚糖与天然支链葡聚糖相比具有均一的结构，在用作制药材料时其非常有利。例如，本发明中所用的酶法合成的支链葡聚糖的聚合度优选为大约15或更大，优选大约20或更大，更优选大约50或更大，再更优选大约100或更大，和最优选大约200或更大。本发明中所用的酶法合成的支链葡聚糖的聚合度优选为大约4 x 10⁵或更小，优选大约2 x 10⁵或更小，更优选大约1 x 10⁵或更小，再更优选大约5 x 10⁴或更小，和最优选大约3 x 10⁴或更小。

在本说明书中，术语“高支化环葡聚糖”是指具有内部支化的环状结构部分和外部支化的结构部分并具有50或更大的聚合度的葡聚糖。该高支化环葡聚糖整个分子可具有至少两个非还原端。本发明中可用的高支化环葡聚糖整个分子的聚合度优选为大约50或更大，更优选大约60或更大，再更优选大约100或更大。本发明中可用的高支化环葡聚糖整个分子的聚合度优选为大约1 x 10⁵或更小，更优选大约7 x 10⁴或更小，再更优选大约5 x 10⁴或更小。本发明中可用的高支化环葡聚糖整个分子的聚合度可以为例如大约1 x 10⁴或更小，大约7 x 10³或更小，或大约5 x 10³或更小。

该高支化环葡聚糖中存在的内部支化的环状结构部分的聚合度优选为大约10或更大，更优选大约15或更大，和更优选大约20或更大。该高支化环葡聚糖中存在的内部支化的环状结构部分的聚合度优选为大约500或更小，更优选大约300或更小，和更优选大约100或更小。

该高支化环葡聚糖中存在的外部支化的结构部分的聚合度优选为大约40或更大，更优选大约100或更大，和更优选大约300或更大，再更优选大约500或更大。该高支化环葡聚糖中存在的外部支化的结构部分的聚合度优选为大约3 x 10³或更小，更优选大约1 x 10³或更小，更优选大约500或更小，和再更优选大约300或更小。

该高支化环葡聚糖中存在的内部支化的环状结构部分中的α-1,6-糖苷键数可以为至少1，并例如可以为1或更大，5或更大，10或更大等；内部支化的环状结构部分中的α-1,6-糖苷键数可以为例如大约200或更小，大约50或更小，大约30或更小，大约15或更小，大约10或更小等。

本申请中所用的高支化环葡聚糖优选是其中外部支化的结构部分中的非还原端数为2或更大的高支化环葡聚糖。该高支化环葡聚糖中存在的外部支化的结构部分中的非还原端数（也就是“α-1,6-糖苷键数”+ 1）优选为大约2或更大，更优选大约3或更大，更优选大约4或更大，尤其优选大约5或更大，和最优选大约10或更大。该高支化环葡聚糖中存在的外部支化的结构部分中的非还原端数优选为大约5 x 10³或更小，更优选大约4 x 10³或更小，更优选大约3 x 10³或更小。

作为高支化环葡聚糖，可以单独使用具有一种聚合度的高支化环葡聚糖，或可以使用具有各种聚合度的高支化环葡聚糖的混合物。优选地，高支化环葡聚糖的聚合度使得最大聚合度与最小聚合度的聚合度比率为大约100或更小，更优选大约50或更小，再更优选大约10或更小。

该高支化环葡聚糖优选是具有内部支化的环状结构部分和外部支化的结构部分并具有50至5 x 10⁴的聚合度的葡聚糖，其中该内部支化的环状结构部分是由α-1,4-糖苷键和α-1,6-糖苷键形成的环状结构部分，且外部支化的结构部分是结合到内部支化的环状结构部分上的无环结构部分。这种外部支化的结构部分的各单元链的聚合度平均为优选大约10或更大，优选大约20或更小。在日本公开出版物No. 8-134104（日本专利No. 3107358）中详细描述了高支化环葡聚糖及其制备方法，根据其描述可制备这种葡聚糖。该高支化环葡聚糖可商购获得，例如作为"Cluster Dextrin"购自Ezaki Glico Co., Ltd。本发明中所用的高支化环葡聚糖的聚合度优选为大约50或更大，更优选大约70或更大，更优选大约100或更大，和最优选大约150或更大。本发明中所用的高支化环葡聚糖的聚合度优选为大约1 x 10⁴或更小，更优选大约7 x 10³或更小，更优选大约5 x 10³或更小，和最优选大约4 x 10³或更小。

在一个具体实施方案中，该支链葡聚糖可以是微粒。已知的是，直径大约4纳米或更小的粒子从肾中排出，直径大约4纳米至大约200纳米的粒子在血液中长时间循环，直径大约200纳米至大约7微米的粒子被网状内皮系统捕获，且直径大约7微米或更大的粒子阻塞毛细血管。网状内皮系统分布在肝和脾中。因此，通过控制支链葡聚糖的粒度，可以控制本发明的非还原端改性葡聚糖及其改性产物的体内药代动力学。当希望使粒子在血液中长时间循环时，微粒支链葡聚糖的粒度按直径计优选为大约4纳米或更大，更优选大约10纳米或更大，优选大约200纳米或更小，更优选大约100纳米或更小。具有这种粒度的微粒支链葡聚糖的分子量优选为大约5 x 10⁵或更大，更优选大约1 x 10⁶或更大，优选大约5 x 10⁷或更小，更优选大约2 x 10⁷或更小。例如，由于直径20至50纳米的粒子已知蓄积在癌细胞中，当希望粒子蓄积在癌细胞中时，微粒支链葡聚糖的粒度按直径计优选为大约10纳米或更大，更优选大约15纳米或更大，优选大约100纳米或更小，更优选大约50纳米或更小。具有这种粒度的微粒支链葡聚糖的分子量优选为大约5 x 10⁵或更大，更优选大约1 x 10⁶或更大，优选大约2 x 10⁷或更小，更优选大约5 x 10⁶或更小。

该α-葡聚糖中的分支数（即α-1,6-糖苷键数）优选为大约1或更大，更优选大约2或更大，更优选大约5或更大，和最优选大约10或更大。该α-葡聚糖中的分支数可以为大约30或更大。该α-葡聚糖的分支数（即α-1,6-糖苷键数）优选为大约5 x 10³或更小，更优选大约3 x 10³或更小，更优选大约2 x 10³或更小。该α-葡聚糖中的分支数可以为大约1 x 10³或更小。

在本发明中所用的支链α-葡聚糖中，α-1,6-糖苷键数相对于α-1,4-糖苷键数的比率（“α-1,6-糖苷键数” : “α-1,4-糖苷键数”）优选为1 : 1至1 : 1 x 10³，更优选1 : 1.1至1 : 500，更优选1 : 1.2至1 : 100，再更优选1 : 1.5至1 : 50，和最优选1 : 2至1 : 20。该比率在一些情况下可以为1 : 10至1 : 5 x 10³，1 : 50至1 : 1 x 10³，或1 : 100至1 : 500。

在本发明中，该支链葡聚糖的支化频率的下限优选为0.2%或更大，优选1%或更大，更优选2%或更大，和最优选5%或更大。尽管支化频率没有具体上限，其可以为例如99%或更小，90%或更小，85%或更小，65%或更小，50%或更小等。通过{(α-1,6-键数)/(葡聚糖中α-1,4-键和α-1,6-键的总和)} x 100计算支化频率。

α-1,6-糖苷键可以无规分布在α-葡聚糖中或可以均匀分布在α-葡聚糖中。优选分布至在α-葡聚糖中可形成由5个或更多个糖单元构成的直链部分的程度。

在一个具体实施方案中，具有大量非还原端的支链葡聚糖是优选的。支链葡聚糖中的非还原端数越大，可以提高每分子的糖残基，如N-乙酰基葡糖胺残基、半乳糖残基、甘露糖残基、葡萄糖醛酸残基、葡糖胺残基或木糖残基的结合量。本发明中所用的支链α-1,4葡聚糖的非还原端数尤其为2或更大，3或更大，5或更大，优选为大约10或更大，更优选大约30或更大，和大约60或更大。支链α-葡聚糖的非还原端数优选为大约1 x 10⁴或更小，更优选大约5 x 10³或更小。具有大量非还原端的支链葡聚糖是优选的。支链CD不优选。由于支链CD具有每分子一个非还原端并具有由具有6至8个葡萄糖残基的α-1,4葡聚糖构成的环状骨架并且抗淀粉酶，这不优选。

在本发明中，可以使用葡聚糖的改性产物代替葡聚糖。葡聚糖的改性产物的实例包括改性淀粉和上文解释的葡聚糖的酯化产物。此外，葡聚糖的改性产物可以是羟基改性产物或还原端改性产物。此外，如下所述，在选自N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的至少一个残基结合到葡聚糖的至少一个非还原端上后，可以改性葡聚糖部分。

改性淀粉是通过对天然淀粉施以处理，如水解、酯化或糊化而具有更容易使用的性质的淀粉。可获得具有糊化起始温度、淀粉糊粘度、淀粉糊透明度、抗凝沉稳定性等的各种组合的各种各样的改性淀粉。有各种类型的改性淀粉。这样的淀粉的实例是通过在淀粉的糊化温度或更低温度下将淀粉颗粒浸在酸中由此切割淀粉分子但不破坏淀粉颗粒而获得的淀粉。

除改性淀粉外的葡聚糖改性产物的实例包括其中将未改性葡聚糖的至少一个醇式羟基改性的改性产物（在本说明书下文中称作“葡聚糖的羟基改性产物”）、其中将葡聚糖的一些非还原端改性的改性产物（在本说明书下文中称作“葡聚糖的非还原端改性产物”）和其中将葡聚糖的还原端改性的改性产物（在本说明书下文中称作“葡聚糖的还原端改性产物”）。

羟基处的改性的实例包括羟烷基化、烷基化、酰化、羧甲基化、硫酸化和磷酸化。羟基处的改性优选是可在体内被酶除去的改性。葡聚糖的羟基改性产物优选是酰化葡聚糖，更优选是乙酰化葡聚糖。在葡聚糖的改性反应时可任意设定改性基团引入醇式羟基中的频率。改性基团引入醇式羟基中的频率表示为DS，DS1是指其中每葡萄糖残基引入1个改性基团的状态。可以通过DS = (改性基团数)/(葡萄糖残基数)计算DS。由于在未改性的葡萄糖残基中的2-位、3-位和6-位存在OH基团，理论上，每葡萄糖残基可引入最多3个改性基团。因此，DS的上限通常为3。改性基团引入醇式羟基中的频率为大约DS 0.01或更大，更优选大约DS 0.03或更大，更优选大约DS 0.05或更大，特别优选大约DS 0.07或更大，和最优选大约DS 0.1或更大。改性基团的引入频率优选为大约DS 1.5或更小，更优选大约DS 1.3或更小，更优选大约DS 1.1或更小，特别优选大约DS 1.0或更小，和最优选大约DS 0.9或更小。通过将葡聚糖改性，抑制葡聚糖在血液中或在体内的降解。

非还原端处的改性的实例包括与靶向分子，如甘露糖残基，药物结合分子，如葡萄糖醛酸残基和葡糖胺残基，和抗原呈递细胞刺激分子，如甘露糖残基和木糖残基结合。在下面2.6和3中详细解释非还原端处的改性。非还原端改性优选为通过甘露糖残基、葡糖胺残基、葡萄糖醛酸残基或木糖残基的结合改性。通过结合葡糖胺残基，为葡聚糖的非还原端提供氨基。由于氨基在水溶液中具有正电荷，通过非共价键与在水溶液中具有负电荷的药物结合变得可行。此外，氨基也可用于经由共价键与药物结合。此外，通过结合葡萄糖醛酸残基，为葡聚糖的非还原端提供羧基。由于羧基在水溶液中具有负电荷，通过非共价键与在水溶液中具有正电荷的药物结合变得可行。此外，羧基也可用于经由共价键与药物结合。在一个具体实施方案中，在本发明的非还原端改性产物中没有结合任何葡糖胺残基和葡萄糖醛酸残基。

在非还原端的改性中，优选结合活化抗原呈递细胞，如树突细胞或巨噬细胞的糖残基，如甘露糖残基或半乳糖残基。优选N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基中的至少两个或更多个结合到葡聚糖的非还原端上。此外，更优选结合两种或更多种单糖残基，其不仅是N-乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基，还包括甘露糖残基、葡萄糖醛酸残基、葡糖胺残基或木糖残基。

还原端处的改性的实例包括与选自单糖、非还原碳水化合物、生物相容的高分子、脂质体组成部分、糖苷和含胺基的低分子量物质的物质结合。在下列第2.6和3节中详细解释非还原端处的改性。

(1.2) 乙酰基葡糖胺或半乳糖

乙酰基葡糖胺具有与N-乙酰基葡糖胺相同的含义并用GlcNAc表示。乙酰基葡糖胺是其中葡萄糖的2-位处的OH基团被NHCOCH₃基团取代的物质。

半乳糖是D-葡萄糖的差向异构体，并且是其中互换葡萄糖的4-位处的OH基团与H基团的构型的物质。由于半乳糖被肝实质细胞表面上存在的脱唾液酸糖蛋白受体识别，其在本发明中特别有效。

在本发明的方法中，使用乙酰基葡糖胺-1-磷酸或半乳糖-1-磷酸。乙酰基葡糖胺-1-磷酸或半乳糖-1-磷酸可以是可商购获得的，或可通过化学方法、酶法或生物方法，如发酵合成。乙酰基葡糖胺或半乳糖可用于合成乙酰基葡糖胺-1-磷酸或半乳糖-1-磷酸。

(1.3) 其它单糖

在本发明中，可以使用乙酰基葡糖胺-1-磷酸或半乳糖-1-磷酸以外的单糖-1-磷酸。这样的单糖-1-磷酸的实例包括甘露糖-1-磷酸、葡萄糖醛酸-1-磷酸、葡糖胺-1-磷酸和木糖-1-磷酸。为了获得具有细胞刺激活性的葡聚糖，在这些单糖-1-磷酸中，甘露糖-1-磷酸、葡萄糖醛酸-1-磷酸和木糖-1-磷酸特别优选。这些单糖-1-磷酸可以与乙酰基葡糖胺-1-磷酸和半乳糖-1-磷酸随意结合使用。作为这些单糖-1-磷酸，可以使用可商购获得的那些，或可以使用根据本领域中已知的方法化学合成或酶法合成的那些。

(2. 制备其中选自N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的至少一个残基经由α-1,4键结合到非还原端上的葡聚糖的方法)

(2.1) 乙酰基葡糖胺-1-磷酸或半乳糖-1-磷酸

作为本发明中所用的乙酰基葡糖胺-1-磷酸或半乳糖-1-磷酸，可以使用通过化学方法、酶法或生物方法，如发酵合成的那些。作为合成乙酰基葡糖胺-1-磷酸的方法的实例，例如在日本公开出版物No. 2007-97517中公开了酶法。作为合成半乳糖-1-磷酸的方法的实例，例如在Manu R. M. De Groeve等人, Biotechnol. Lett. 2009, 31, 1873-1877中公开了酶法。

作为乙酰基葡糖胺-1-磷酸，可以使用非盐形式的乙酰基葡糖胺-1-磷酸和盐形式的乙酰基葡糖胺-1-磷酸。例如可以使用乙酰基葡糖胺-1-磷酸的金属盐，并且可以使用乙酰基葡糖胺-1-磷酸的碱金属盐（例如乙酰基葡糖胺-1-磷酸二钠和乙酰基葡糖胺-1-磷酸二钾）。

作为半乳糖-1-磷酸，可以使用非盐形式的半乳糖-1-磷酸和盐形式的半乳糖-1-磷酸。例如可以使用半乳糖-1-磷酸的金属盐，并且可以使用半乳糖-1-磷酸的碱金属盐（例如半乳糖-1-磷酸二钠和半乳糖-1-磷酸二钾）。

(2.2) α-葡聚糖磷酸化酶

在本说明书中，术语“α-葡聚糖磷酸化酶”是指具有α-葡聚糖磷酸化酶活性的酶。α-葡聚糖磷酸化酶归类在EC 2.4.1.1中。α-葡聚糖磷酸化酶活性是指催化由无机磷酸和α-1,4-葡聚糖产生葡萄糖-1-磷酸和α-1,4-葡聚糖的部分降解产物的反应或其逆反应的活性。α-葡聚糖磷酸化酶也可以催化α-1,4-葡聚糖合成反应，其是磷酸解的逆反应。反应的进行方向取决于底物量。

在本发明中，可以使用任何α-葡聚糖磷酸化酶，只要其具有将所需残基（例如当希望N-乙酰基葡糖胺残基结合到葡聚糖上时，N-乙酰基葡糖胺残基；或当希望半乳糖残基结合到葡聚糖上时，半乳糖残基）转移至葡聚糖的非还原端的功能。本发明中所用的α-葡聚糖磷酸化酶可源自细菌、酵母、动物或植物。本发明的α-葡聚糖磷酸化酶可源自例如马铃薯、甘薯、蚕豆、拟南芥、菠菜、玉米、稻米、小麦、柑橘杂交品种、超嗜热菌、海栖热袍菌、Thermococcus zilligii、Thermoanaerobacter pseudethanolicus等。

本发明中所用的α-葡聚糖磷酸化酶优选是源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶、源自马铃薯的α-葡聚糖磷酸化酶或源自Thermococcus zilligii AN1的α-葡聚糖磷酸化酶，其更优选是源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶。由于源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶具有高转移效力，其相当优选。

源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶的碱基序列显示在SEQ ID NO: 1中，其氨基酸序列显示在SEQ ID NO: 2的位置1-692中。源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列具有大约21%至大约24%的与植物α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列的序列一致性，大约34%的与源自极端嗜热菌（Thermus thermophilus）的α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列的序列一致性，和大约38%的与源自Thermococcus litoralis的α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列的序列一致性。其具有大约38%的与源自海栖热袍菌的α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列的序列一致性，大约38%的与源自Thermococcus zilligii AN1的麦芽糊精磷酸化酶的氨基酸序列的序列一致性，和大约33%的与Thermoanaerobacter pseudethanolicus的序列的序列一致性。

源自马铃薯的L型α-葡聚糖磷酸化酶的碱基序列显示在SEQ ID NO: 3中，其氨基酸序列显示在SEQ ID NO: 4的位置15-930中。源自Thermococcus zilligii AN1的α-葡聚糖磷酸化酶的碱基序列显示在SEQ ID NO: 5中，其氨基酸序列显示在SEQ ID NO: 6的位置1-717中。

在本说明书中，“源自”生物体的酶不仅是指该酶直接从生物体中分离，还是指通过以任何形式利用该生物体获得的酶。例如，在将编码获自生物体的酶的基因引入大肠杆菌并从该大肠杆菌中分离酶时，该酶被称作“源自”该生物体。

在本说明书中，序列（例如氨基酸序列、碱基序列等）“一致性”是指在两个序列之间相同氨基酸（在比较碱基序列时，碱基）的出现程度。通常通过比较两个氨基酸序列或两个碱基序列和比较以最佳格式排列的这两个序列（可能含有添加或缺失）来测定一致性。

在本说明书中，使用GENETYX-WIN Ver.4.0 (Genetics Co., Ltd.)的最大匹配计算序列一致性。这种程序对齐要分析的序列数据和要比较的序列数据，以使在考虑置换和删除的同时序列之间匹配的氨基酸对变得最大，随即给出匹配、失配和间隙各自的分数，计算总和，输出在最小总和下的对齐，随即计算一致性（参考资料: Takeishi, K.和Gotoh, O. 1984. Sequence Relationships among Various 4.5 S RNA Species J. Biochem. 92:1173-1177）。

例如，本发明中所用的α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列可以与SEQ ID NO: 2、4或6相同，即其可具有100%一致性。在另一实施方案中，只要具有将预期残基（即当想要转移乙酰基葡糖胺残基时，乙酰基葡糖胺残基；或当想要转移半乳糖残基时，半乳糖残基）转移至葡聚糖的非还原端以形成α-1,4键的活性，与参照氨基酸序列相比可以在多达一定数量的氨基酸中改变这种氨基酸序列。这样的改变可选自缺失、取代（包括保守取代和非保守取代）或插入至少1个（例如1个或数个）氨基酸。这种改变可以在SEQ ID NO: 2、4或6的氨基酸序列的氨基末端或羧基末端位进行，或可以在这些末端以外的任何位置进行。氨基酸残基的改变可以被一个残基穿插，或几个残基可以邻接。例如，为了使例如酶的提纯容易、为了提高稳定性等，本发明中所用的α-葡聚糖磷酸化酶可以在SEQ ID NO: 2、4或6的氨基酸序列的任一末端添加氨基酸残基（优选大约20个或更少的残基，更优选大约10个或更少的残基，更优选大约5个或更少的残基）。

本发明中所用的α-葡聚糖磷酸化酶具有与SEQ ID NO: 2、4或6的氨基酸序列具有优选大约50%或更大，更优选大约60%或更大，再更优选大约70%或更大，再更优选大约80%或更大，特别更优选大约90%或更大，和最优选大约95%或更大的序列一致性的氨基酸序列，并具有将预期残基（即当想要转移乙酰基葡糖胺残基时，乙酰基葡糖胺残基；或当想要转移半乳糖残基时，半乳糖残基）转移至葡聚糖的非还原端以形成α-1,4键的活性。本发明中所用的α-葡聚糖磷酸化酶可具有与SEQ ID NO: 2、4或6的氨基酸序列具有大约96%或更大，大约97%或更大，大约98%或更大，或大约99%或更大的序列一致性的氨基酸序列。

在反应开始时溶液中所含的α-葡聚糖磷酸化酶的量优选为大约0.01 U/ml或更大，更优选大约0.1 U/ml或更大，特别优选大约0.5 U/ml或更大，和最优选大约1 U/ml或更大。在反应开始时溶液中所含的α-葡聚糖磷酸化酶的量优选为大约1,000 U/ml或更小，更优选大约100 U/ml或更小，特别优选大约50 U/ml或更小，和最优选大约20 U/ml或更小。如果α-葡聚糖磷酸化酶的重量太大，在反应过程中变性的酶容易聚集。如果用量太小，反应自己发生，但可能降低葡聚糖的收率。要指出，如下定义α-葡聚糖磷酸化酶的单位量：

关于1单位的α-葡聚糖磷酸化酶，每分钟产生1微摩尔无机磷酸（Pi）的α-葡聚糖磷酸化酶活性应为1单位（U或单位）。α-葡聚糖磷酸化酶活性的这一衡量标准量化G-1-P产生的游离无机磷酸（Pi）。在200微升反应溶液（含有12.5 mM G-1-P、1%糊精和在100 mM乙酸盐缓冲液中的酶溶液（pH 6.0））在50℃下培养15分钟后，加入800微升钼试剂（15 mM钼酸铵，100 mM乙酸锌），并搅拌以停止反应。加入200微升568 mM抗坏血酸（pH 5.8），接着混合。在30℃下培养15分钟后，使用分光光度计在850纳米下测定吸光度。使用具有已知浓度的无机磷酸类似地测定吸光度，并产生标准曲线。将对样品获得的吸光度值拟合至这种标准曲线，并测定该样品中的无机磷酸的量。作为磷酸离子量化无机磷酸。不量化葡萄糖-1-磷酸的量。

(2.3 α-葡聚糖磷酸化酶的制备)

本发明中所用的α-葡聚糖磷酸化酶可以直接从自然界中存在的产生α-葡聚糖磷酸化酶的生物体，如上述生物体中分离。或者，本发明中所用的α-葡聚糖磷酸化酶可以从已用从上述生物体中分离的α-葡聚糖磷酸化酶的编码基因基因修饰的微生物（例如细菌、真菌等）中分离。

在一个优选实施方案中，通过化学合成SEQ ID NO: 1的基因片段、构造含有这种基因片段的表达载体、将这种表达载体引入微生物中以产生重组微生物、培养这种重组微生物以产生α-葡聚糖磷酸化酶和收集生成的α-葡聚糖磷酸化酶来制备源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶。也可以同样制备源自其它生物体的α-葡聚糖磷酸化酶。通过基因重组的酶制备方法是本领域技术人员公知的。本发明中所用的宿主微生物包括原核生物和真核生物，嗜温细菌是优选的。特别优选的微生物的实例包括，但不限于，大肠杆菌。

可以使用传统基因工程技术制备本发明中所用的具有SEQ ID NO: 2的位置1-692、SEQ ID NO: 4的位置15-930或SEQ ID NO: 6的位置1-717的氨基酸序列、或具有其同源性氨基酸序列并具有转移N-乙酰基葡糖胺、半乳糖、甘露糖、葡萄糖醛酸、葡糖胺或木糖残基的活性的α-葡聚糖磷酸化酶和编码该α-葡聚糖磷酸化酶的多核苷酸。

(2.4) 含有乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基的葡聚糖的制备

本发明的含有乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基的葡聚糖可通过包括使含有乙酰基葡糖胺-1-磷酸或半乳糖-1-磷酸、葡聚糖和可催化将乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基转移至葡聚糖的非还原端的反应的α-葡聚糖磷酸化酶（例如源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶、源自马铃薯的α-葡聚糖磷酸化酶或源自Thermococcus zilligii AN1的α-葡聚糖磷酸化酶）的溶液反应的步骤的方法制备。通过在这种方法中使用葡聚糖改性产物代替葡聚糖，可以制备含有乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基的葡聚糖改性产物。例如，下面解释使用葡聚糖的方法。

首先，制备反应溶液。可以例如通过将乙酰基葡糖胺-1-磷酸或半乳糖-1-磷酸、葡聚糖和α-葡聚糖磷酸化酶添加到合适的溶剂中来制备反应溶液。可以使用乙酰基葡糖胺-1-磷酸和半乳糖-1-磷酸的任一种，或可以同时使用乙酰基葡糖胺-1-磷酸或半乳糖-1-磷酸两者。如果必要，可以在不抑制酶促反应的程度上将用于调节pH的任何缓冲剂和无机盐添加到这种反应溶液中。如果必要，可以将作为α-葡聚糖磷酸化酶的原始底物的葡萄糖-1-磷酸添加到这种反应溶液中。在乙酰基葡糖胺-1-磷酸或半乳糖-1-磷酸和葡萄糖-1-磷酸共存的反应的情况下，同时进行将葡萄糖残基结合到受体葡聚糖的非还原端上的反应和结合乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基的反应。如果乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基结合到葡聚糖的非还原端上，α-葡聚糖磷酸化酶可进一步将分子转移至乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基的非还原端，但是，转移效率远低于转移至葡萄糖残基的效率。但是，当葡萄糖残基结合到葡聚糖的非还原端上时，α-葡聚糖磷酸化酶可进一步将葡萄糖残基或乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基转移至所得分子的非还原端。因此，当葡萄糖-1-磷酸共存时，可以有效延长葡聚糖的链长。因此，通过添加的乙酰基葡糖胺-1-磷酸或半乳糖-1-磷酸与添加的葡萄糖-1-磷酸之间的比率控制最终获得的非还原端改性葡聚糖的结构。如果必要，可以将选自脱支酶、分支酶、4-α-葡聚糖转移酶和糖原脱支酶的酶添加到这种反应溶液中。

通过改变反应溶液中乙酰基葡糖胺-1-磷酸或半乳糖-1-磷酸的量和葡聚糖的非还原端总数的比率，可以控制乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基的引入频率。也就是说，随着提高(葡聚糖分子数) x (相对于该分子中的非还原端数的乙酰基葡糖胺-1-磷酸或半乳糖-1-磷酸的量)，可以提高乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基的引入频率。此外，通过调节酶添加量或酶反应时间，也可以调节乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基的引入频率。

当用两种或更多种类的糖残基进行葡聚糖的非还原端改性时，可以通过在其中一种中加入两种或更多种类的糖-1-磷酸或混合在相同反应液体中来进行反应。例如，选自N-乙酰基葡糖胺-1-磷酸、半乳糖-1-磷酸、葡萄糖醛酸-1-磷酸、葡糖胺-1-磷酸、甘露糖-1-磷酸和木糖-1-磷酸的所需糖-1-磷酸可以一种接一种地反应。或者，其中两种或更多种类可以同时反应。例如，当希望进一步结合选自葡萄糖醛酸残基、葡糖胺残基、甘露糖残基和木糖残基的糖残基时，葡萄糖醛酸-1-磷酸、葡糖胺-1-磷酸、甘露糖-1-磷酸和木糖-1-磷酸在其中一种种类或它们的组合中与支链葡聚糖的非还原端反应。

然后，如果必要，通过本领域中已知的方法加热来使反应溶液反应。反应温度可以是任何温度，只要获得本发明的效果。反应温度代表性地为大约30℃至大约90℃的温度。这种反应步骤中的溶液温度优选是在预订反应时间后保持反应前这种溶液中所含的α-葡聚糖磷酸化酶的活性的大约50%或更大，更优选大约80%或更大活性的温度。该反应温度优选为大约35℃至大约80℃，更优选大约35℃至大约70℃，更优选大约35℃至大约65℃。源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶是耐热酶，其最佳反应温度为大约80℃至90℃。从反应速度的角度看，反应温度优选高至一定程度。另一方面，从源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶的最佳反应温度的角度看，在大约80℃至90℃下反应是可行的。但是，从所得产物的稳定性、乙酰基葡糖胺-1-磷酸或半乳糖-1-磷酸和葡萄糖-1-磷酸的稳定性等角度看，反应温度优选略低于源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶的最佳反应温度。反应温度优选为大约30℃或更高，更优选大约35℃或更高，更优选大约40℃或更高。在一个具体实施方案中，反应温度可以为大约45℃或更高或大约50℃或更高。反应温度优选为大约90℃或更低，更优选大约80℃或更低，更优选大约70℃或更低。在一个具体实施方案中，反应温度可以为大约65℃或更低或大约60℃或更低。在使用最佳反应温度较低的酶，如源自马铃薯的α-葡聚糖磷酸化酶的情况下，反应温度优选设定为低于其中使用源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶的情况。

考虑到反应温度和酶的剩余活性，反应时间可以设定为任何时期。反应时间代表性地为大约1小时至大约100小时，更优选大约1小时至大约72小时，再更优选大约2小时至大约36小时，和最优选大约2小时至大约24小时。在一个具体实施方案中，反应时间可以为例如大约1小时或更久，大约2小时或更久，大约5小时或更久，大约10小时或更久，大约12小时或更久，或大约24小时或更久。在一个具体实施方案中，反应时间可以为例如大约100小时或更短，大约72小时或更短，大约60小时或更短，大约48小时或更短，大约36小时或更短，或大约24小时或更短。

可以使用任何手段进行加热，但优选在搅拌下进行加热以使热均匀传送至整个溶液。通过将其置于例如带有温水夹套和搅拌装置的不锈钢制反应釜中，搅拌该溶液。

此外，在本发明的方法中，在反应已进行至一定程度的阶段将乙酰基葡糖胺-1-磷酸或半乳糖-1-磷酸、葡聚糖和α-葡聚糖磷酸化酶中的至少一种进一步添加到反应溶液中。

由此制备含有非还原端改性葡聚糖的溶液。

在反应完成后，在反应溶液中，如果必要，可以通过例如在100℃下加热10分钟来将反应溶液中的酶灭活。在反应完成后，可以通过使反应溶液的pH呈酸性以使酶蛋白变性来除去酶。或者，可以进行后步骤而不进行酶灭活处理。该反应溶液可以原样储存，或可以处理以分离出制备的非还原端改性葡聚糖。

在反应完成后，在提纯非还原端改性葡聚糖后或在提纯非还原端改性葡聚糖前，可以通过改性所得非还原端改性葡聚糖的葡聚糖部分的至少一个醇式羟基来制备非还原端改性葡聚糖的羟基改性产物。优选在非还原端改性葡聚糖提纯后进行改性。可以根据本领域中已知的方法进行改性。改性的实例包括羟烷基化、烷基化、酰化、羧甲基化、硫酸化和磷酸化。酰化是优选的，乙酰化更优选。通过在制备含有N-乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基的葡聚糖或含有N-乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基的葡聚糖的羟基改性产物后改性该葡聚糖的还原端，可以制备含有N-乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基的葡聚糖或含有N-乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基的葡聚糖的羟基改性产物的还原端改性产物。此外，可以改性这些葡聚糖部分的未结合N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的非还原端。乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基与葡聚糖的结合、羟基改性、还原端改性和用N-乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基以外的改性基团对一些非还原端的改性可以以任何次序进行。

(2.5 其中选自N-乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基的至少一个残基经由α-1,4键连接到非还原端上的葡聚糖的提纯)

<提纯方法>

制备的非还原端改性葡聚糖（或其改性产物）可以视需要提纯。通过提纯除去的杂质的实例包括无机磷酸、N-乙酰基葡糖胺-1-磷酸或半乳糖-1-磷酸、无机盐等。提纯葡聚糖的方法的实例包括使用有机溶剂的方法（T. J. Schoch等人, J. American Chemical Society, 64, 2957 (1942))和不使用有机溶剂的方法。

使用有机溶剂的提纯中可用的有机溶剂的实例包括丙酮、正戊醇、五唑、正丙醇、正己醇、2-乙基-1-丁醇、2-乙基-1-己醇、月桂醇、环己醇、正丁醇、3-戊醇、4-甲基-2-戊醇、d,l-龙脑、α-萜品醇、异丁醇、仲丁醇、2-甲基-1-丁醇、异戊醇、叔戊醇、薄荷醇、甲醇、乙醇和醚。

作为不使用有机溶剂的提纯方法的实例，存在在非还原端改性葡聚糖制备反应后通过对非还原端改性葡聚糖施以使用超滤膜的膜分离或色谱法来除去无机磷酸、乙酰基葡糖胺-1-磷酸或半乳糖-1-磷酸和无机盐，而不使溶解在水中的非还原端改性葡聚糖沉淀的方法。

提纯中可用的超滤膜的实例包括截止分子量为大约1 x 10³至大约1 x 10⁴，优选大约5 x 10³至大约5 x 10⁴，更优选大约1 x 10⁴至大约3 x 10⁴的超滤膜（DAICEL生产的UF膜部件）。

色谱法中可用的载体的实例包括凝胶过滤色谱法载体、配体交换色谱法载体、离子交换色谱法载体和疏水色谱法载体。

(2.6) 其中选自N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的至少一个残基经由α-1,4键结合到非还原端上的葡聚糖及其改性产物

本发明的葡聚糖是其中选自N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的至少一个残基经由α-1,4键结合到葡聚糖的至少一个非还原端的每一个上的葡聚糖。本发明的葡聚糖也被称作本发明的非还原端改性葡聚糖。本发明的葡聚糖改性产物可以是非还原端改性葡聚糖的羟基改性产物或本发明的进一步非还原端改性产物或还原端改性产物。

本发明的非还原端改性葡聚糖是其中选自N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的至少一个残基经由α-1,4键结合到葡聚糖的至少一个非还原端的每一个上的葡聚糖。如果必要，在结合到这种葡聚糖的非还原端上的N-乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基的末端上可以进一步结合糖等。当两个或更多个N-乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基或其组合结合到本发明的非还原端改性葡聚糖的一个非还原端上时，结构在于这些单糖结合并结合至一端。例如，结构在于，其中一个单糖残基结合到葡聚糖的一个非还原端上且下一单糖残基进一步结合到该单糖残基的非还原端上。在一个实施方案中，只有一个单糖残基结合到葡聚糖的非还原端的各端上。

在本发明的非还原端改性葡聚糖中，N-乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基或其组合可结合到葡聚糖的所有非还原端上，或这些单糖残基可结合到仅一部分非还原端上。也就是说，一些非还原端可保持未被这些单糖残基结合。

可以根据含有任一这些单糖残基的葡聚糖的用途等从接近0%（例如大约1%）至100%的比率中适当选择基于非还原端数的转化率，即选自N-乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基或其组合的单糖与非还原端之间的键数相对于结合这些单糖之前存在的非还原端数的比率。例如，当希望存在少量N-乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基时，可以选择低转化率，当希望存在大量N-乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基时，可以选择高转化率。

通过适当调节制备非还原端改性葡聚糖时的酶促反应的条件，例如通过调节反应时间、酶促反应的底物等的浓度，容易获得具有所选转化率的非还原端改性葡聚糖。

此外，结合到非还原端上的N-乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基的总数相对于结合这些单糖残基之前存在于葡聚糖中的非还原端数的比率可用作这些单糖的量的指标。在本说明书中，这种比率被描述为结合率。一般而言，在分析本发明的非还原端改性葡聚糖时，测定结合率比测定上述转化率更容易，因此从实用角度看基于结合率设计非还原端改性葡聚糖是有利的。

要指出，根据合成非还原端改性葡聚糖时的酶促反应的条件，在结合到一个非还原端上的任一这些单糖残基的末端上，在一些情况下可进一步结合任一这些单糖残基。也就是说，在一些情况下，该结构可以是其中两个这些单糖连续结合到一个非还原端上（也就是说，其中二糖结合到非还原端上的结构）。具有这种结构的化合物也可用作本发明的非还原端改性葡聚糖。上述结合率的优点在于，即使通过如上所述将多个这些单糖残基结合到一个非还原端上来提高N-乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基的量，也可以评估N-乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基的量。因此，不同于上述转化率，结合率在一些情况下可具有大于100%的值。可以根据其中使用该非还原端改性葡聚糖的用途等适当选择结合率。例如，当希望存在少量N-乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基时，可以选择低结合率（例如大约1%至大约2%），当希望存在大量N-乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基时，可以选择高结合率（例如大约80%至大约120%）。

当该非还原端改性的支链葡聚糖的用途是DDS的纳米微粒载体时，N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的结合率总量优选为大约2%或更大，更优选大约5%或更大，更优选大约10%或更大，和最优选大约15%或更大；N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的结合率总量优选为大约200%或更小，更优选大约150%或更小，更优选大约120%或更小，和最优选大约100%或更小。

当该非还原端改性的支链葡聚糖的用途是抗原呈递细胞刺激分子时，N-乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基的结合率总计为优选大约5%或更大，更优选大约10%或更大，更优选大约15%或更大，和最优选大约20%或更大；N-乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基的结合率总计为优选大约200%或更小，更优选大约150%或更小，更优选大约120%或更小，和最优选大约100%或更小。

当该非还原端改性的支链葡聚糖的用途是DDS载体时，每葡聚糖分子的N-乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基的键数总计为优选大约2或更大，更优选大约5或更大，更优选大约10或更大，特别优选大约20或更大，和最优选大约50或更大。每葡聚糖分子的N-乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基的键数总计为优选大约5000或更小，更优选大约4000或更小，更优选大约3000或更小，和最优选大约2000或更小。

当该非还原端改性的支链葡聚糖的用途是抗原呈递细胞刺激分子时，每葡聚糖分子的N-乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基的键数总计为优选大约2或更大，更优选大约4或更大，更优选大约8或更大，特别优选大约10或更大，和最优选大约15或更大。每葡聚糖分子的N-乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基的键数总计为优选大约2000或更小，更优选大约1000或更小，更优选大约500或更小，和最优选大约200或更小。

在本发明的非还原端改性葡聚糖中，N-乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基以外的糖残基可结合到未结合N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的非还原端上。也就是说，一些非还原端可以与N-乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基结合，其余非还原端可以与不同于这些单糖的糖残基结合。

或者，也可以制备其中一些非还原端结合到N-乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基上、一些结合到不同于这些单糖的糖残基上、其余非还原端无结合的结构。就此而言，在多个非还原端中，可以自由选择结合到N-乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基上的末端数、结合到不同于这些单糖的糖残基上的末端数和不与糖结合的末端数。

在本发明的一个具体实施方案中，结合到非还原端上的糖残基是N-乙酰基葡糖胺残基、半乳糖残基或其中一种或其组合的低聚物（例如二聚物）的残基。

羟基改性产物如上所述。

将解释非还原端改性产物。当其中选自N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的至少一个残基经由α-1,4键结合到非还原端上的葡聚糖或其改性产物的葡聚糖部分是支链α-1,4-葡聚糖并且存在未结合N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的非还原端时，其它物质可结合到未结合N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的非还原端上。在一个优选实施方案中，“靶向分子”、“药物结合分子”或“细胞刺激分子”结合到未结合氨基糖残基的非还原端上。在本说明书中，术语“靶向分子”是指具有组织靶向功能的分子。靶向分子的实例包括甘露糖、木糖、岩藻糖、半乳糖胺、抗体、抗体片段、受体、受体片段和受体配体。由于甘露糖被各种巨噬细胞（包括枯氏细胞（Kupffer cell）和肝窦样血管内皮细胞）上表达的甘露糖受体识别，其是有效的。甘露糖可结合到含有乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基的葡聚糖或其改性产物的非还原端上，例如通过使α-葡聚糖磷酸化酶作用于作为底物的甘露糖-1-磷酸。在通过酶促反应结合时，在未结合N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的非还原端葡萄糖残基的位4结合甘露糖。例如，还可以以任何比例组合甘露糖和半乳糖并结合到支链葡聚糖的多个非还原端上。

在本说明书中，术语“药物结合分子”是指含有具有与药效成分结合的功能的阴离子或阳离子官能团的分子。药物结合分子的实例包括葡糖胺、葡萄糖醛酸或其衍生物。在与葡糖胺残基的结合物的情况下，为非还原端提供氨基。由于氨基在水溶液中具有正电荷，通过非共价键与在水溶液中具有负电荷的药物结合变得可行。此外，氨基也可用于经由共价键与药物结合。此外，化学改性在葡聚糖的非还原端上提供的氨基并将疏水基团引入葡聚糖的非还原端变得可行。由此在非还原端中引入了疏水基团的葡聚糖可用于通过疏水相互作用与蛋白质或肽结合。此外，在与葡萄糖醛酸残基的结合物的情况下，为非还原端提供羧基。由于羧基在水溶液中具有负电荷，通过非共价键与在水溶液中具有正电荷的药物结合变得可行。此外，羧基也可用于经由共价键与药物结合。此外，也可以通过化学改性在葡聚糖的非还原端上提供的羧基来将疏水基团引入葡聚糖的非还原端。由此在非还原端中引入了疏水基团的葡聚糖可用于通过疏水相互作用与蛋白质或肽结合。

在本说明书中，术语“抗原呈递细胞刺激分子”是指具有刺激树突细胞或巨噬细胞（其是先天免疫应答中的抗原呈递细胞）的活性的分子。可以通过各种方法测定抗原呈递细胞刺激活性。在本发明中，优选通过白介素-6 (IL-6)的生成量测定抗原呈递细胞刺激活性。抗原呈递细胞刺激分子的实例包括N-乙酰基葡糖胺、半乳糖、甘露糖、葡萄糖醛酸和木糖。通过将这些糖残基结合到多个非还原端上，进一步增强细胞刺激活性。

在非还原端的改性中，优选结合活化抗原呈递细胞，如树突细胞或巨噬细胞的糖残基，如甘露糖残基或半乳糖残基。优选至少两个或更多个选自N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的残基结合到葡聚糖的非还原端上。此外，更优选结合不仅选自N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基，还选自甘露糖残基、葡萄糖醛酸残基、葡糖胺残基或木糖残基的至少两种或更多种单糖残基。

在本说明书中，术语“佐剂”是指与抗原一起给予并用于增强免疫应答的物质。在“Janeway's Immunobiology” （在Takehiko Sasazuki, Nankodo Co., Ltd.的监督下的译本）（原著“Janeway's Immunobiology seventh edition Kenneth Murphy, Paul Travers, Mark Walport 2008 Garlnd Science, Taylar & Francis Group, LLC”）中描述，树突细胞或巨噬细胞响应细胞感染产生IL-6，生成的IL-6活化淋巴细胞且IL-6增强用于抗感染的抗体的生成。因此，本领域技术人员可以理解，如果可增强树突细胞或巨噬细胞的活化和可增强IL-6的生成，可以增强免疫功能。如本说明书的实施例20和22至26中所示，本发明的非还原端改性葡聚糖可通过与树突细胞或巨噬细胞接触提高树突细胞或巨噬细胞的IL-6生成。因此，显而易见，本发明的非还原端改性葡聚糖可充当佐剂。

可以通过已知方法测定免疫刺激作用。免疫刺激作用具有与细胞刺激活性大致相同的含义。如上所述，IL-6生成是细胞刺激活性的指征。例如，其可以利用诱导具有免疫刺激作用的细胞因子的作用作为指征测定。在本说明书的实施例中，为了研究免疫刺激作用，通过IL-6（其是细胞因子之一）的生成测定免疫应答中涉及的树突细胞和巨噬细胞的细胞刺激活化的指征。

将解释还原端改性产物。“含N-乙酰基葡糖胺残基的葡聚糖的还原端改性产物”是指其中另一物质结合到本发明的含N-乙酰基葡糖胺残基的葡聚糖中存在的还原端上的物质。“含半乳糖残基的葡聚糖的还原端改性产物”是指其中另一物质结合到本发明的含半乳糖残基的葡聚糖中存在的还原端上的物质。在一个优选实施方案中，作为在还原端与不同物质结合的方法，有下面两种方法。第一种方法是通过已知的酶法过程或已知的化学过程将具有2或更大的聚合度，更优选3或更大的聚合度，更优选4或更大的聚合度的麦芽低聚糖的还原端结合到另一物质上、此后利用本发明的方法将乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基结合到麦芽低聚糖的非还原端上的方法。第二种方法是通过已知的酶法过程将本发明的含有乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基的葡聚糖的还原端结合到另一物质上的方法。

例如在日本公开出版物No. 5-276883、日本公开出版物No. 07-241181和国际公开No. WO 01/073106中公开了第一种方法中的将麦芽低聚糖酶法结合到不同物质上的方法。

第一种方法中的将麦芽低聚糖酶法结合到不同物质上的方法可用于具有胺基的物质。例如，作为化学结合麦芽五糖和具有胺基的物质的方法，有下面三种方法：

(A) 通过还原胺化结合麦芽五糖的还原端醛和具有胺基的物质的方法；

(B) 将麦芽五糖的还原端醛氧化成麦芽四糖基葡糖酸和此后用缩合剂将其与具有胺基的物质脱水缩合的方法；和

(C) 将麦芽五糖的还原端醛氧化成麦芽四糖基葡糖酸和此后将其脱水以制备麦芽四糖基葡糖酸内酯，和在无水溶剂条件下加热其和具有胺基的物质以便结合的方法。在日本专利申请No. 2008-121693中详细描述了这三种方法(A)、(B)和(C)。此外，具有高分子量的葡聚糖可以与这些方法类似地结合到不同物质上。

作为第二种方法（通过酶法过程将本发明的含有乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基的葡聚糖的还原端结合到不同物质上的方法）中可用的酶可以仅适用于碳水化合物和糖苷。作为该酶，使用所谓的葡聚糖链转移酶，如分支酶、CGTase、D酶、麦芽糖转葡糖基酶等。这些酶切断含有乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基的葡聚糖中的α-1,4键并将其非还原端侧上的片段（含有乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基的片段）转移给受体分子（在此为碳水化合物或糖苷）。

要结合的物质的实例包括单糖、非还原碳水化合物、生物相容的高分子、脂质体组成组分、糖苷和含胺基的低分子量物质。

单糖的实例包括具有官能团的单糖，如葡糖胺、葡萄糖醛酸和葡糖酸。特别地，葡糖胺、葡萄糖醛酸或葡糖酸是优选的。在与葡糖胺残基的结合物的情况下，为还原端提供氨基。由于氨基在水溶液中具有正电荷，通过非共价键与在水溶液中具有负电荷的药物结合变得可行。此外，氨基也可用于经由共价键与药物结合。此外，在与葡萄糖醛酸残基或葡糖酸残基的结合物的情况下，为还原端提供羧基。由于羧基在水溶液中具有负电荷，通过非共价键与在水溶液中具有正电荷的药物结合变得可行。此外，羧基也可用于经由共价键与药物结合。此外，由于可以化学改性在葡聚糖的还原端上提供的羧基以引入阳离子基团或疏水基团，例如，羧基也可用于通过疏水相互作用经由非共价键与蛋白质结合。还原碳水化合物的实例包括山梨糖醇、蔗糖、海藻糖、糊精和直链淀粉。生物相容的高分子的实例包括淀粉、纤维素、甲壳质、壳聚糖、右旋糖酐、蛋白质和肽。脂质体组成组分的实例包括磷脂、脂肪酸、神经酰胺和表面活性剂。糖苷的实例包括抗坏血酸葡糖苷、氢醌葡糖苷、橙皮苷葡糖苷、芸香苷葡糖苷、对硝基苯基麦芽五糖、十二烷基麦芽糖、黄酮苷、萜苷、酚苷、查尔酮苷和甾类糖苷。含胺基的低分子量物质的实例包括各种氨基酸、十二烷基胺、乙二胺和二乙基氨基乙胺等。

在另一实施方案中，其中选自N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的至少一个残基经由α-1,4键结合到非还原端上的葡聚糖（非还原端改性葡聚糖）的还原端改性产物是指通过氧化葡聚糖的还原端醛获得的产物。通过已知的化学过程，如高碘酸盐氧化进行还原端醛的氧化。通过该氧化，醛基团转化成羧基。其中乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基结合到直链葡聚糖的非还原端上的分子的还原端的氧化的一个实例显示在下式中：

[化学式1] 

其中n是1或更大的任何整数。

(3. 其中选自N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的至少一个残基经由α-1,4键结合到非还原端上的葡聚糖及其改性产物的用途)

在本发明的其中选自N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的至少一个残基经由α-1,4键结合到非还原端上的葡聚糖及其改性产物中，选自N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的至少一个残基结合到非还原端上，因此它们可靶向特定组织。

当本发明的非还原端改性葡聚糖用作药物的药效成分的改性材料时，必须控制该改性材料在体内的降解。当葡聚糖是直链α-1,4-葡聚糖时，其经受α-淀粉酶的快速降解，在体内的存在时间太短。在这种情况下，有可能无法实现作为改性材料的目的。随后，通过改性构成葡聚糖的葡萄糖的一些或所有羟基，可以控制降解所需的时间。含有乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基的这种葡聚糖的羟基改性产物在本发明中优选。改性是醚化或酯化。醚化优选是用烷基卤或醇醚化。醚化中所用的烷基卤或醇的碳原子数优选为1至10，更优选1至5，更优选1至3。卤素基团优选可以是氟、氯、溴或碘。酯化优选是用羧酸或酰基卤酯化。酯化中所用的羧酸或酰基卤的碳原子数优选为1至10，更优选1至5。改性合意地为酯化。酯化更优选是酰化，更优选乙酰化。

如上所述，可以自由设计本发明的非还原端改性葡聚糖及其改性产物的葡聚糖结构及其非还原端结构，并借此可随意控制药物的药效成分的药代动力学。这是药物的药效成分的改性材料，其具有在体内可完全降解的结构并可安全使用而不用担心蓄积毒性。

因此，根据本发明，提供含有本发明的非还原端改性葡聚糖或其改性产物和药效成分的药物。在本发明的药物中，药效成分优选选自低分子量有机化合物、蛋白质、肽、抗体、抗体片段、受体、受体片段、DNA、RNA、siRNA、miRNA和RNA适配子。

根据一个具体实施方案，本发明提供含有本发明的非还原端改性葡聚糖、其羟基改性产物、其还原端改性产物或羧酸基改性产物的临床诊断组合物。

根据一个具体实施方案，本发明提供DDS的纳米微粒载体，其含有本发明的非还原端改性葡聚糖、其羟基改性产物或其还原端改性产物。DDS的这种纳米微粒载体优选选自脂质体、病毒粒子、高分子胶束和由带有疏水基团的高分子构成的纳米凝胶。

(4. 本发明的其中选自N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的至少一个残基经由α-1,4-键结合到非还原端上的葡聚糖及其改性产物所具有的结构)

在本说明书中，其中至少一个N-乙酰基葡糖胺残基经由α-1,4-键结合到葡聚糖的至少一个非还原端的每一个上、但在该葡聚糖的除了非还原端以外的位置不存在N-乙酰基葡糖胺残基的葡聚糖被称作“含N-乙酰基葡糖胺的葡聚糖”。在本说明书中，其中至少一个半乳糖残基结合到葡聚糖的至少一个非还原端的每一个上、但在该葡聚糖的除了非还原端以外的位置不存在半乳糖残基的葡聚糖被称作“含半乳糖的葡聚糖”。

要指出，当两个或更多个N-乙酰基葡糖胺残基结合到葡聚糖的一个非还原端上时，结构在于，其中一个N-乙酰基葡糖胺残基结合到葡聚糖的一个非还原端上且下一个N-乙酰基葡糖胺残基结合到该N-乙酰基葡糖胺残基的末端上。在本说明书中，其中至少一个N-乙酰基葡糖胺残基经由α-1,4键结合到葡聚糖的至少一个非还原端的每一个上、但在除了非还原端以外的位置不存在N-乙酰基葡糖胺残基的葡聚糖被称作“含N-乙酰基葡糖胺残基的葡聚糖”。这些类似地适用于半乳糖残基。

在本说明书中，即使由各自经由α-1,4-键结合的两个或更多个N-乙酰基葡糖胺残基构成的糖链结合到葡聚糖的特定非还原端上并且在葡聚糖的除了非还原端以外的位置不存在N-乙酰基葡糖胺残基时，也认为N-乙酰基葡糖胺残基仅结合到非还原端上并且在除了非还原端以外的位置不存在N-乙酰基葡糖胺残基。

在本说明书中，在由分别经由α-1,4键结合的两个或更多个半乳糖残基构成的糖链结合到葡聚糖的特定非还原端上并且在葡聚糖中的除了非还原端以外的位置不存在半乳糖残基的情况下，也认为半乳糖残基仅结合到非还原端上并且在除了非还原端以外的位置不存在半乳糖残基。

本发明的非还原端改性葡聚糖是其中选自N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的至少一个残基经由α-1,4键结合到葡聚糖的至少一个非还原端的每一个上、但在葡聚糖的除了非还原端以外的位置不存在N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的非还原端改性葡聚糖，其中该葡聚糖是支链α-1,4葡聚糖或直链α-1,4葡聚糖。结合到各非还原端上的残基可独立地选自乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基。因此，作为整个分子，只有乙酰基葡糖胺残基、半乳糖残基、或乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基可结合到非还原端上。如本说明书另一部分中所述，选自葡萄糖醛酸残基、葡糖胺残基、甘露糖残基和木糖残基的残基可进一步结合至非还原端中的其上未结合乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基的非还原端，和进一步结合至结合到非还原端上的乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基。

当非还原端改性葡聚糖的葡聚糖部分是直链葡聚糖，由此非还原端数为1时，一个N-乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基结合到该非还原端上。当非还原端改性葡聚糖的葡聚糖部分是支链葡聚糖，由此有两个或更多个非还原端时，选自N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的至少一个残基结合到其中的一个或多个非还原端上。在本发明的非还原端改性葡聚糖中，在除了非还原端以外的位置不存在N-乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基。认为可以通过例如用过量α-淀粉酶和葡糖淀粉酶、或异淀粉酶处理非还原端改性葡聚糖来证实在除了非还原端以外的位置不存在N-乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基。葡糖淀粉酶是从非还原端侧切断α-1,4键和α-1,6键的酶，并在其作用于未改性的支链葡聚糖时，该葡聚糖全部降解成葡萄糖。其中选自N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的至少一个残基经由α-1,4键结合到非还原端上的葡聚糖表现出葡糖淀粉酶耐受性。另一方面，α-淀粉酶作用于α-1,4葡聚糖以产生麦芽糖和葡萄糖，但其中选自N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的至少一个残基是α-1,4键的α-1,4葡聚糖链表现出α-淀粉酶耐受性。仅在非还原端含有乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基的葡聚糖通过用过量葡糖淀粉酶和α-淀粉酶和异淀粉酶处理产生N-乙酰基葡糖胺基麦芽糖或半乳糖基麦芽糖和葡萄糖。另一方面，其中选自N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的至少一个残基经由α-1,4键也结合到除了非还原端以外的位置上的葡聚糖通过用过量α-淀粉酶和异淀粉酶处理产生N-乙酰基葡糖胺基麦芽糖或半乳糖基麦芽糖以外的糖，和葡萄糖。通过这种方法，可以证实N-乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基不结合到除了非还原端以外的位置上。

在上文的2.6中描述了本发明的葡聚糖、其改性产物等。在下文中将描述认为本发明的具有结合到其上的N-乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基的葡聚糖所具有的结构。

(4.1) 其中选自N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的至少一个残基经由α-1,4键结合到非还原端上的支链葡聚糖及其改性产物

当本发明的非还原端改性葡聚糖中所含的葡聚糖部分是支链α-1,4葡聚糖时，在该非还原端改性葡聚糖中，选自N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的至少一个残基经由α-1,4键结合到该支链α-1,4葡聚糖具有的多个非还原端的至少一个上。根据本发明，还提供该非还原端改性的支链葡聚糖的改性产物。该改性产物的改性如上详述。结合物中结合的物质也如上详述。

本发明的非还原端改性的支链葡聚糖及其改性产物中所含的支链葡聚糖部分是具有至少2个或更多个非还原端的支链α-1,4-葡聚糖并优选选自支链麦芽低聚糖、淀粉、支链淀粉、糖原、糊精、酶法合成的支链葡聚糖和高支化环葡聚糖。这些支链葡聚糖部分的优选范围如“(1.1)葡聚糖和葡聚糖的改性产物”中所解释。

本发明的其中选自N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的至少一个残基经由α-1,4-键结合到至少2个或更多个非还原端上的支链α-1,4-葡聚糖的分子量优选为大约1 x 10³或更大，更优选大约3 x 10³或更大，更优选大约5 x 10³或更大。本发明的含有N-乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基的支链葡聚糖的分子量优选为大约1 x 10⁹或更小，更优选大约3 x 10⁸或更小，更优选大约1 x 10⁸或更小。

本发明的非还原端改性的支链α-1,4-葡聚糖的改性产物的分子量优选为大约1 x 10³或更大，更优选大约3 x 10³或更大，更优选大约5 x 10³或更大。本发明的非还原端改性的支链葡聚糖的改性产物的分子量优选为大约1 x 10⁹或更小，更优选大约3 x 10⁸或更小，更优选大约1 x 10⁸或更小。

在本发明中，其中选自N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的至少一个残基经由α-1,4-键结合到非还原端上的支链葡聚糖的改性产物是优选的。改性优选是酰化或醚化，更优选为乙酰化。酰化度优选为大约0.1或更大，更优选大约0.2或更大，特别优选大约0.3或更大。通过量化在碱条件下加热释放的乙酸，计算酰化度。醚化度优选为大约0.1或更大，更优选大约0.2或更大，特别优选大约0.3或更大。通过NMR计算醚化度。

结合到本发明的支链葡聚糖及其改性产物（其中选自N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的至少一个残基经由α-1,4-键结合到非还原端上）上的乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基数分别独立地为每分子优选1或更大，更优选2或更大，更优选3或更大。结合到本发明的支链葡聚糖或其改性产物（其中选自N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的至少一个残基经由α-1,4-键结合到非还原端上）上的N-乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基数不限于这些，并例如可以为每分子5或更大，10或更大，15或更大，20或更大，50或更大，或100或更大等。可以根据用途合适地调节该数值。结合到本发明的支链葡聚糖或其改性产物（其中选自N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的至少一个残基经由α-1,4-键结合到非还原端上）上的乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基数的上限总数是支链葡聚糖部分的非还原端数。结合到本发明的支链葡聚糖或其改性产物（其中选自N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的至少一个残基经由α-1,4-键结合到非还原端上）上的N-乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基数可以分别独立地为每分子例如大约1,000或更小，大约800或更小，大约700或更小，大约600或更小，大约500或更小，大约400或更小，大约300或更小，大约200或更小，大约100或更小，大约50或更小等。

在一个具体实施方案中，结合到本发明的支链葡聚糖（其中选自N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的至少一个残基经由α-1,4-键结合到非还原端上）及其改性产物上的N-乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基的总数优选为该支链葡聚糖部分所具有的非还原端数的大约10%或更大，更优选大约20%或更大，特别优选大约30%或更大，和例如可以是大约40%或更大，大约50%或更大，或大约60%或更大。在一个具体实施方案中，结合到本发明的支链葡聚糖（其中选自N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的至少一个残基经由α-1,4-键结合到非还原端上）及其改性产物上的N-乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基的总数优选为该支链葡聚糖部分所具有的非还原端数的大约100%或更小，更优选大约90%或更小，特别优选大约80%或更小，和例如可以是大约70%或更小，大约60%或更小，或大约50%或更小。

(4.2) 其中选自N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的至少一个残基经由α-1,4-键结合到非还原端上的直链葡聚糖及其改性产物

在本发明的非还原端改性的直链葡聚糖中，选自N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的至少一个残基经由α-1,4键结合到直链葡聚糖部分的非还原端上。由于该直链葡聚糖只有一个非还原端，本发明的非还原端改性的直链葡聚糖只含有一个N-乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基。根据本发明，还提供该非还原端改性的直链葡聚糖的改性产物。该改性产物的改性如上详述。

在本发明的非还原端改性的直链葡聚糖中，选自N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的至少一个残基经由α-1,4键结合到直链葡聚糖部分的非还原端上。由于该直链葡聚糖只有一个非还原端，如果添加到N-乙酰基葡糖胺-1-磷酸或半乳糖-1-磷酸与葡聚糖的反应中的反应液体中的N-乙酰基葡糖胺-1-磷酸或半乳糖-1-磷酸的量小，本发明的非还原端改性的直链葡聚糖只含有一个N-乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基。当添加到N-乙酰基葡糖胺-1-磷酸或半乳糖-1-磷酸与葡聚糖的反应中的反应液体中的N-乙酰基葡糖胺-1-磷酸或半乳糖-1-磷酸的量大时，两个或更多个经由α-1,4键结合的N-乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基可结合到直链葡聚糖的非还原端上。根据本发明，还提供其中选自N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的至少一个残基经由α-1,4键结合的直链葡聚糖的改性产物。根据本发明，还提供其中选自N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的至少一个残基经由α-1,4键结合的直链葡聚糖或其改性产物的结合物。该改性产物的改性如上详述。结合物中结合到含氨基糖的葡聚糖或其改性产物上的物质也如上详述。

本发明的直链葡聚糖或其改性产物（其中选自N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的至少一个残基经由α-1,4-键结合）中所含的直链葡聚糖部分优选选自麦芽低聚糖、直链淀粉（例如天然直链淀粉或酶法合成的直链淀粉）及其衍生物。这些直链葡聚糖部分的优选范围如“(1.1)葡聚糖和葡聚糖的改性产物”中所解释。

本发明的非还原端改性的直链葡聚糖的分子量优选为大约450或更大，更优选大约600或更大，更优选大约1 x 10³或更大。本发明的非还原端改性的直链葡聚糖的分子量优选为大约2 x 10⁵或更小，更优选大约1.5 x 10⁵或更小，更优选大约1 x 10⁵或更小。

本发明的非还原端改性的直链葡聚糖的改性产物的分子量优选为大约450或更大，更优选大约600或更大，更优选大约1 x 10³或更大。本发明的非还原端改性的直链葡聚糖的改性产物的分子量优选为大约2 x 10⁵或更小，更优选大约1.5 x 10⁵或更小，更优选大约1 x 10⁵或更小。

在本发明中，该非还原端改性的直链葡聚糖的改性产物是优选的。改性优选是酰化或醚化，更优选为乙酰化。酰化度优选为大约0.1或更大，更优选大约0.2或更大，特别优选大约0.3或更大。通过量化在碱条件下加热释放的乙酸，计算酰化度。醚化度优选为大约0.1或更大，更优选大约0.2或更大，特别优选大约0.3或更大。通过NMR计算醚化度。

本发明的非还原端改性的直链葡聚糖的实例可以例如由下式1的结构表示：

[化学式2] 

其中n是1或更大的整数。n优选为大约1或更大，更优选大约2或更大，更优选大约3或更大，再更优选大约5或更大，特别优选大约8或更大，和最优选大约10或更大。n优选为大约1200或更小，更优选大约900或更小，更优选大约600或更小。

本发明的非还原端改性的直链葡聚糖及其还原端改性产物的实例可以例如由下式2的结构表示：

[化学式3] 

其中n是1或更大的整数。n优选为大约1或更大，更优选大约2或更大，更优选大约3或更大，再更优选大约5或更大，特别优选大约8或更大，和最优选大约10或更大。n优选为大约1200或更小，更优选大约900或更小，更优选大约600或更小。X选自氢、单糖、非还原碳水化合物、生物相容的高分子、脂质体组成组分、糖苷和含胺基的低分子量物质。X优选选自氢、葡糖胺、葡萄糖醛酸、葡糖酸、山梨糖醇、蔗糖、海藻糖、糊精、直链淀粉、淀粉、纤维素、甲壳质、壳聚糖、右旋糖酐、蛋白质、肽、磷脂、脂肪酸、神经酰胺、表面活性剂、抗坏血酸葡糖苷、氢醌葡糖苷、橙皮苷葡糖苷、芸香苷葡糖苷、神经酰胺、对硝基苯基麦芽五糖、十二烷基麦芽糖、黄酮苷、萜苷、酚苷、查尔酮苷、甾类糖苷、氨基酸、十二烷基胺、乙二胺和二甲基氨基乙胺。X更优选选自氢、葡糖胺、葡萄糖醛酸、葡糖酸、糊精和直链淀粉。氢、葡糖胺、葡萄糖醛酸、葡糖酸和糊精特别优选。条件是当X是胺等时，由于裂解葡聚糖的还原端部分，本发明的还原端改性产物可以如下表示：

[化学式4] 

当X是氢且Y是N-乙酰基葡糖胺残基时，则这种分子是含N-乙酰基葡糖胺的直链葡聚糖，当X是非氢物质且Y是N-乙酰基葡糖胺残基时，则这种分子是含N-乙酰基葡糖胺的直链葡聚糖的还原端改性产物。当X是氢且Y是半乳糖残基时，则这种分子是含半乳糖的直链葡聚糖，当X是非氢物质且Y是半乳糖残基时，则这种分子是含半乳糖的直链葡聚糖的还原端改性产物。

本发明的非还原端改性的直链葡聚糖、其羟基改性产物及其还原端改性产物的一个实例可以由例如下式3的结构表示。

[化学式5]

其中n是1或更大的整数。n优选为大约1或更大，更优选大约2或更大，更优选大约3或更大，再更优选大约5或更大，特别优选大约8或更大，和最优选大约10或更大。n优选为大约1200或更小，更优选大约900或更小，更优选大约600或更小。X优选选自氢、单糖、非还原碳水化合物、生物相容的高分子、脂质体组成组分、糖苷和含胺基的低分子量物质。X优选选自氢、葡糖胺、葡萄糖醛酸、葡糖酸、山梨糖醇、蔗糖、海藻糖、糊精、直链淀粉、淀粉、纤维素、甲壳质、壳聚糖、右旋糖酐、蛋白质、肽、磷脂、脂肪酸、神经酰胺、表面活性剂、抗坏血酸葡糖苷、氢醌葡糖苷、橙皮苷葡糖苷、芸香苷葡糖苷、神经酰胺、对硝基苯基麦芽五糖、十二烷基麦芽糖、黄酮苷、萜苷、酚苷、查尔酮苷、甾类糖苷、氨基酸和十二烷基胺、乙二胺和二甲基氨基乙胺。X更优选选自氢、葡糖胺、葡萄糖醛酸、葡糖酸、糊精和直链淀粉。氢、葡糖胺、葡萄糖醛酸、葡糖酸和糊精特别优选。其中R优选独立地选自氢、羟烷基、烷基、乙酰基、羧基甲基、硫酸基和磷酸基。条件是当X是胺等时，由于裂解葡聚糖的还原端部分，本发明的还原端改性产物可以如下表示：

[化学式6]

当X和所有R是氢且Y是N-乙酰基葡糖胺残基时，则这种分子是含N-乙酰基葡糖胺的直链葡聚糖；当X是氢，各R独立地为氢或另一基团，条件是至少一个R是非氢基团，且Y是乙酰基葡糖胺残基时，则这种分子是含N-乙酰基葡糖胺的直链葡聚糖的羟基改性产物；当X是非氢物质，所有R是氢，且Y是N-乙酰基葡糖胺残基时，则这种分子是含N-乙酰基葡糖胺的直链葡聚糖的还原端改性产物；当X是非氢物质，各R独立地为氢或另一基团，条件是至少一个R是非氢基团，且Y是N-乙酰基葡糖胺残基时，则这种分子是含N-乙酰基葡糖胺的直链葡聚糖的羟基改性产物的还原端改性产物。当X和所有R是氢且Y是半乳糖残基时，则这种分子是含半乳糖的直链葡聚糖；当X是氢，各R独立地为氢或另一基团，条件是至少一个R是非氢基团，且Y是半乳糖残基时，则这种分子是含半乳糖的直链葡聚糖的羟基改性产物；当X是非氢物质，所有R是氢，且Y是半乳糖残基时，则这种分子是含半乳糖的直链葡聚糖的还原端改性产物；当X是非氢物质，各R独立地为氢或另一基团，条件是至少一个R是非氢基团，且Y是半乳糖残基时，则这种分子是含半乳糖的直链葡聚糖的羟基改性产物的还原端改性产物。

本发明的非还原端改性葡聚糖的实例可以例如由下式5表示：

[化学式7] 

其中m是1或更大的整数。m优选为1或更大，更优选2或更大，更优选3或更大，再更优选大约5或更大，特别优选大约8或更大，和最优选大约10或更大，且m优选为大约1200或更小，更优选大约900或更小，更优选大约600或更小。R¹独立地为H、具有式A的结构的葡聚糖链或具有式B的结构的葡聚糖链。当所有R¹是H时，式5所示的葡聚糖是直链葡聚糖。当至少一个R¹具有式A或式B的结构时，式5所示的葡聚糖是支链葡聚糖。

[化学式8] 

在式A中，k是1或更大的整数。k优选为1或更大，更优选2或更大，更优选3或更大，再更优选大约5或更大，特别优选大约8或更大，和最优选大约10或更大，且k优选为大约100或更小，更优选大约25或更小，更优选大约20或更小。在式A中，各R²独立地为H、具有式A的结构的葡聚糖链或具有式B的结构的葡聚糖链。

[化学式9]

在式B中，s是1或更大的整数。s优选为1或更大，更优选2或更大，更优选3或更大，再更优选大约5或更大，特别优选大约8或更大，和最优选大约10或更大，且s优选为大约100或更小，更优选大约25或更小，更优选大约20或更小。在式B中，R³独立地为H、具有式A的结构的葡聚糖链或具有式B的结构的葡聚糖链。

如上解释，在式5中，R¹可具有如下结构：其中具有式A结构的基团的R²或具有式B结构的基团的R³的位置被具有式A结构的基团或具有式B结构的基团取代数次。被式A和式B取代的总次数等于式5所示的支链葡聚糖分子的单元链数。支链葡聚糖分子的单元链数优选为大约1或更大，更优选大约10或更大，再更优选大约30或更大。支链葡聚糖分子的单元链数优选为大约5,000或更小，更优选大约2,000或更小，再更优选大约1,000或更小。

本发明的非还原端改性葡聚糖或其羟基改性产物的实例可以例如由下式6的结构表示：

[化学式10]

其中m是1或更大的整数。m优选为大约1或更大，更优选大约2或更大，更优选大约3或更大，再更优选大约5或更大，特别优选大约8或更大，和最优选大约10或更大，且m优选为大约1200或更小，更优选大约900或更小，更优选大约600或更小。R¹独立地为H、羟烷基、烷基、乙酰基、羧基甲基、硫酸基、磷酸基、具有式6A结构的葡聚糖链或具有式6B结构的葡聚糖链。

[化学式11]    

在式6A中，k是1或更大的整数。k优选为1或更大，更优选2或更大，更优选3或更大，再更优选大约5或更大，特别优选大约8或更大，和最优选大约10或更大，和k优选为大约100或更小，更优选大约25或更小，更优选大约20或更小。在式6A中，各R²独立地为H、羟烷基、烷基、乙酰基、羧基甲基、硫酸基、磷酸基、具有式6A结构的葡聚糖链或具有式6B结构的葡聚糖链。

[化学式12]

在式6B中，s是1或更大的整数。s优选为大约1或更大，更优选大约2或更大，更优选大约3或更大，再更优选大约5或更大，特别优选大约8或更大，和最优选大约10或更大，且s优选为大约100或更小，更优选大约25或更小，更优选大约20或更小。在式6A中，各R³独立地为H、羟烷基、烷基、乙酰基、羧基甲基、硫酸基和磷酸基、具有式6A结构的葡聚糖链或具有式6B结构的葡聚糖链。

在式6、式6A和式6B中，各R⁴独立地选自H、羟烷基、烷基、乙酰基、羧基甲基、硫酸基和磷酸基。

本发明的非还原端改性葡聚糖、其羟基改性产物及其还原端改性产物的实例可以例如由下式7的结构表示：

[化学式13]

其中m是1或更大的整数。m优选为大约1或更大，更优选大约2或更大，更优选大约3或更大，再更优选大约5或更大，特别优选大约8或更大，和最优选大约10或更大，且m优选为大约1200或更小，更优选大约900或更小，更优选大约600或更小。R¹独立地为H、具有式6A结构的葡聚糖链或具有式6B结构的葡聚糖链。式6A和式6B与对上式6的定义相同。

在式7、式6A和式6B中，R⁴独立地选自氢、羟烷基、烷基、乙酰基、羧基甲基、硫酸基和磷酸基，

在式7中，X优选独立地选自单糖、非还原碳水化合物、生物相容的高分子、脂质体组成组分、糖苷和含胺基的低分子量物质。X更优选选自氢、葡糖胺、葡萄糖醛酸、葡糖酸、山梨糖醇、蔗糖、海藻糖、糊精、直链淀粉、淀粉、纤维素、甲壳质、壳聚糖、右旋糖酐、蛋白质、肽、磷脂、脂肪酸、表面活性剂、抗坏血酸葡糖苷、氢醌葡糖苷、橙皮苷葡糖苷、芸香苷葡糖苷、神经酰胺、对硝基苯基麦芽五糖、十二烷基麦芽糖、黄酮苷、萜苷、酚苷、查尔酮苷、甾类糖苷、氨基酸和十二烷基胺、乙二胺和二乙基氨基乙胺。X更优选选自氢、葡糖胺、葡萄糖醛酸、葡糖酸、糊精和直链淀粉。氢、葡糖胺、葡萄糖醛酸、葡糖酸和糊精特别优选。条件是当X是胺等时，由于裂解葡聚糖的还原端部分，本发明的还原端改性产物可以如下表示：

[化学式14]

如本说明书中别处所述，在本发明的非还原端改性葡聚糖中，葡萄糖醛酸残基、甘露糖残基和木糖残基中的至少一种残基可结合到其多个非还原端中的至少一个或多个非还原端上。例如，在一个实施方案中，在上式5、6或7的葡聚糖的情况下，Y表示的残基是选自N-乙酰基葡糖胺残基、半乳糖残基、葡萄糖醛酸残基、甘露糖残基和木糖残基的残基，条件是分子中的至少一个Y是N-乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基。

本发明的非还原端改性葡聚糖的还原端改性的实例和该改性的用途概括在下表1中。表中的结构仅是实例。

[表1]

表1：含乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基的葡聚糖的改性实例和用途

。

表1例举其中选自N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的至少一个残基结合到非还原端上的情况。如本说明书另一部分中解释，其中选自N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的两个或更多个残基经由α-1,4键结合的寡糖残基可结合到非还原端上。此外，葡萄糖残基、甘露糖残基、葡萄糖醛酸残基、葡糖胺残基、木糖残基或由它们构成的寡糖残基等可结合到N-乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基的4-位上。此外，例如，在具有多个非还原端的支链葡聚糖的情况下，多个N-乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基可结合到表1中所示的Y的位置上。此外，可以结合除N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基外的葡萄糖残基、甘露糖残基、葡萄糖醛酸残基、葡糖胺残基、木糖残基和由它们构成的寡糖残基等中的一种或两种或更多种。

由于本发明的非还原端改性葡聚糖、其羟基改性产物、非还原端改性产物及其还原端改性产物具有生物可降解性，它们可安全地用在活体中。在本说明书中，术语“生物可降解性”是指一物质可在体内降解至使降解产物可排泄到体外的分子量。本发明的非还原端改性葡聚糖、其羟基改性产物、非还原端改性产物及其还原端改性产物可以在体内被淀粉酶的组合降解至寡糖尺寸。

本发明的非还原端改性葡聚糖、其羟基改性产物、其非还原端改性产物及其还原端改性产物也是生物相容的。在本说明书中，术语“生物相容性”是指不存在对活体的毒性和免疫排斥能力。

(药物的制备)

在本发明的非还原端改性葡聚糖、其羟基改性产物、其非还原端改性产物及其还原端改性产物中，非还原端处的N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基具有组织靶向性质和器官蓄积性质。因此，它们可有效用作DDS载体。通过将它们与药物混合或通过使用已知方法将它们结合到药物上，可合适地利用它们。

特别地，本发明的其中选自N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的至少一个残基经由α-1,4键结合到非还原端上的葡聚糖（非还原端改性葡聚糖）的非还原端改性产物和还原端改性产物可用作药效成分的有效改性材料，其具有结合药效成分的功能和组织靶向功能的双重功能。

当本发明的其中选自N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的至少一个残基经由α-1,4键结合到非还原端上的葡聚糖（非还原端改性葡聚糖）的非还原端改性产物含有例如葡萄糖醛酸残基时，为非还原端提供羧基。由于羧基在水溶液中具有负电荷，通过非共价键与在水溶液中具有正电荷的药物（例如多肽（例如蛋白质、寡肽等）、阳离子聚合物、阳离子脂质等）结合变得可行。此外，羧基也可用于经由共价键与药物结合。例如，由于可以化学改性在葡聚糖的非还原端上提供的羧基以引入阳离子基团或疏水基团，例如，羧基也可用于通过疏水相互作用经由非共价键与蛋白质结合。例如，当含有葡糖胺残基时，为非还原端提供氨基。由于氨基在水溶液中具有正电荷，通过非共价键与在水溶液中具有负电荷的药物（例如核酸分子、阴离子聚合物、阴离子脂质等）结合变得可行。此外，氨基也可用于经由共价键与药物结合。

当本发明的非还原端改性葡聚糖的还原端改性产物是例如与乙二胺的还原端结合物时，为还原端提供氨基。由于氨基在水溶液中具有正电荷，通过非共价键与在水溶液中具有负电荷的药物结合变得可行。此外，氨基也可用于经由共价键与药物结合。

当本发明的含有N-乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基的葡聚糖的还原端改性产物是例如还原端的氧化物时，为还原端提供羧基。由于羧基在水溶液中具有负电荷，通过非共价键与在水溶液中具有正电荷的药物结合变得可行。此外，羧基也可用于经由共价键与药物结合。此外，当化学改性在葡聚糖的非还原端上提供的羧基以引入阳离子基团或疏水基团时，例如，这也可用于通过疏水相互作用经由非共价键与蛋白质结合。

在本发明的非还原端改性葡聚糖、其羟基改性产物、其非还原端改性产物及其还原端改性产物中，非还原端处的N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基具有刺激抗原呈递细胞，如树突细胞或巨噬细胞的活性。因此，它们可用作药物的疫苗佐剂。本发明的在非还原端含有葡萄糖醛酸、葡糖胺、甘露糖、N-乙酰基葡糖胺、半乳糖和木糖残基中的一种或两种或更多种的至少两个的葡聚糖、其羟基改性产物、其非还原端改性产物及其还原端改性产物具有提高的刺激抗原呈递细胞，如树突细胞或巨噬细胞的活性。因此，它们可用作药物的疫苗佐剂。

根据本发明，还提供具有抗原呈递细胞刺激活性的组合物，包含其中选自N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的至少一个残基经由α-1,4键结合到非还原端上的非还原端改性葡聚糖、其羟基改性产物、其非还原端改性产物及其还原端改性产物。

(治疗方法)

本发明的其中选自N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的至少一个残基经由α-1,4键结合到非还原端上的非还原端改性葡聚糖、其羟基改性产物、其非还原端改性产物及其还原端改性产物可用作药效成分的载体。因此，还提供治疗方法，包括向受试者给予载体和药效成分的混合物。本领域技术人员可以适当地确定目标疾病和药效成分和给药途径、给药频率及其剂量等的组合。

根据本发明，还提供癌症免疫疗法、炎症疗法或免疫刺激法，包括向受试者给予本发明的具有抗原呈递细胞刺激活性的非还原端改性葡聚糖（其中选自N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的至少一个残基经由α-1,4键结合到非还原端上）、其羟基改性产物、其非还原端改性产物及其还原端改性产物。

当能带负电荷的残基或基团，如葡萄糖醛酸残基结合到本发明的非还原端改性葡聚糖上时，所得葡聚糖可有效用于抗体疗法、药物疗法等。在抗体疗法的一个具体实施方案中，本发明的治疗方法包括向受试者给予本发明的这种非还原端改性葡聚糖、其羟基改性产物、其非还原端改性产物及其还原端改性产物和抗体蛋白质分子的复合物。

当能带正电荷的残基或基团，如葡糖胺残基结合到本发明的非还原端改性葡聚糖上时，所得葡聚糖可有效用于基因疗法、药物疗法等。在基因疗法的一个具体实施方案中，本发明的治疗方法包括向受试者给予本发明的这种非还原端改性葡聚糖、其羟基改性产物、其非还原端改性产物及其还原端改性产物和核酸分子的复合物。

在一个具体实施方案中，当能带正电荷的残基或基团，如葡糖胺残基结合到本发明的非还原端改性葡聚糖上时，还提供包括向受试者给予由所得葡聚糖和核酸分子的载体复合物和阳离子聚合物或阳离子脂质形成的复合物的方法，其中该核酸分子包括用于治疗的基因。在药物疗法的一个具体实施方案中，本发明的治疗方法包括向受试者给予本发明的这种葡聚糖与药效成分的复合物。

也可以使用传统基因工程技术制备核酸分子，该核酸分子包括适合治疗目标疾病的治疗用蛋白质的编码基因。该核酸分子可以是表达载体或质粒。适合治疗目标疾病的蛋白质、该蛋白质的编码基因、用于制备或递送该基因的表达载体或质粒，以及它们中所含的元素是本领域中已知的。

实施例

下面基于实施例解释本发明，但本发明不限于实施例。实施例中所用的源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶是通过下列制备例1制备的源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶。

(制备例1: 源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶的制备)

通过下列方法重组制备源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶。

(A) 源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶基因的制备

通过本领域技术人员公知的方法化学合成具有编码源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶基因的氨基酸序列（序列表的SEQ ID NO: 2中描述的氨基酸序列；通过翻译美国国家生物技术信息中心(NCBI) 的GenBank碱基序列数据库的ACCESSION No. AE000657的第491380号至第493458号 (SEQ ID NO: 1)的碱基序列获得的氨基酸序列）的碱基序列（GenBank碱基序列数据库的ACCESSION No. AE000657的第491380号至第493458号的碱基序列）的核酸（也被称作“α-葡聚糖磷酸化酶基因”）。在这种α-葡聚糖磷酸化酶基因的翻译起始密码子上游创建NdeI位点。此外，在翻译终止密码子下游创建BαmHI位点，用NdeI和BamHI切断这种合成基因并插入已预先用NdeI和BamHI切断的质粒pET11c（Novagen生产）中以制备具有源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶基因的质粒pET-AqGP。

(B) 在大肠杆菌中表达源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶基因

根据传统方法用这种质粒pET-AqGP转化大肠杆菌BL21（DE3）以获得转化体。将含有该转化体的液体稀释并施加在含氨苄青霉素的LB琼脂培养基（100 mg/ml氨苄青霉素，1% Difco生产的胰蛋白胨，0.5% Difco生产的酵母提取物，0.5% NaCl，1.5%琼脂，pH 7.3）上以获得独立的菌落，这在37℃下培养过夜。在这种含氨苄青霉素的LB琼脂培养基上生长的大肠杆菌是包含引入的质粒并可表达引入的质粒的转化体。由此，成功制备表达α-葡聚糖磷酸化酶基因的大肠杆菌。

(C) 源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶的制备

用LB培养基（50μg/ml氨苄青霉素，1% Difco生产的胰蛋白胨，0.5% Difco生产的酵母提取物，0.5% NaCl，pH 7.3）接种上述(B)中制备的表达源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶基因的大肠杆菌并在37℃下培养5小时。然后，将IPTG（异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷）和盐酸吡哆醇添加到这种培养基中以使最终浓度变成0.1 mM IPTG和1 mM盐酸吡哆醇，这在37℃下进一步培养24小时。然后，通过该培养物的离心收集细菌细胞，并用20 mM柠檬酸盐缓冲液(pH 6.7)洗涤以除去培养基组分。细菌细胞在洗涤后悬浮在20 mM柠檬酸盐缓冲液(pH 6.7)中，用超声波仪破碎并离心，该上清液用作细菌细胞提取物。所得细菌细胞提取物在60℃下加热30分钟。然后，将这种细菌细胞提取物加载在已预先平衡的Q-Sepharose FF柱上，这以在20 mM柠檬酸盐缓冲液(pH 6.7)中0.1 M至0.3 M NaCl的浓度梯度洗脱以收集含GP纯化酶的活性馏分。

使用大约1μg所得含纯化酶的活性馏分，进行非变性PAGE（非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳）。结果，在由表达α-葡聚糖磷酸化酶的大肠杆菌获得的馏分中，在分子量大约150 kDa的位置识别出单条带，在其它位置没有发现条带。由于按照它们的氨基酸序列计算，源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶的分子量预测为大约75 kDa，根据这种非变性PAGE的结果，这种α-葡聚糖磷酸化酶被认为呈现二聚物结构。由此证实，源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶均匀提纯。

(制备例2: 支链葡聚糖的制备)

将50克蜡质玉米淀粉（SANWA CORNSTARCH CO., LTD生产）悬浮在1,000毫升10 mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)中，并将该悬浮液加热至大约100℃以糊化。将200,000单位的根据日本公开出版物No. 2000-316581的实施例1中描述的方法制备的高热稳定的分支酶添加到已冷却至大约70℃的淀粉糊中以制备反应溶液，然后使其在70℃下反应16小时。在该反应溶液在100℃下加热20分钟后，在6,500 rpm下离心10分钟后的上清液用孔径为0.8微米的膜过滤。然后，该滤液用凝胶过滤色谱（AKTA提纯器）系统（柱: GE Healthcare生产的HiPrep^TM 26/10 Desalting）脱盐以除去低分子量多糖。将1,000毫升滤液分成7.5毫升等分试样，并施加到凝胶过滤色谱系统上，并分别以10 ml/min的流速分离从2.7分钟至3.7分钟的洗脱馏分。合并获自1,000毫升滤液的洗脱馏分，合并的洗脱馏分用孔径为0.2微米的膜过滤，然后冻干以获得大约35克支链葡聚糖粉末。使用配有多角度激光散射检测器（DAWN DSP, Wyatt Technology Corporation生产）和差示折光计（Shodex RI-71, SHOWA DENKO K.K.生产）的高效液相色谱（HPLC）系统（柱: OHPAK SB-806MHQ, SHOWA DENKO K.K.生产）研究该支链葡聚糖的重均分子量。将20毫克支链葡聚糖粉末溶解在10毫升100 mM硝酸钠水溶液中，并用孔径0.45微米的膜过滤该溶液以获得滤液。将100微升所得滤液注射到上述HPLC系统中。据显示，该支链葡聚糖的重均分子量为大约140 K。

当使异淀粉酶作用于上述支链葡聚糖并通过修改的Park-Johnson方法（Hizukuri等人, Starch, 第35卷, 第348-350页, (1983)）研究还原力时，表明分支的单元链长度为平均大约15，分支数为平均大约60。

(制备例3: 重组马铃薯α-葡聚糖磷酸化酶的重组制备)

通过日本国家阶段PCT公开出版物No. 2004-526463中显示的下列方法重组生产L型马铃薯α-葡聚糖磷酸化酶。

在马铃薯葡聚糖磷酸化酶基因的上游和下游创建BamHI位点（Nakano等人, Journal of Biochemistry 106: 691-695 (1989)；编码SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的SEQ ID NO: 3），用BamHI切断这种基因并并入已预先用BamHI切断的pET3d（STRATAGENE生产）中以获得质粒pET-PGP113。在这种质粒中，葡聚糖磷酸化酶基因在异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导型启动子的控制下切实连接。通过感受态细胞法将这种质粒引入大肠杆菌TG-1（STRATAGENE生产）中。将这种大肠杆菌涂覆在装有含抗生素氨苄青霉素的LB培养基（1%胰蛋白胨（Difco生产）、0.5%酵母提取物（Difco生产），1%氯化钠和1.5%琼脂）的板上，这在37℃下培养整夜。选择在这种板上生长的大肠杆菌以获得其中已引入源自马铃薯的葡聚糖磷酸化酶基因的大肠杆菌。通过分析引入的基因的序列证实，所得大肠杆菌含有葡聚糖磷酸化酶基因。此外，通过活性测定证实，所得大肠杆菌表达葡聚糖磷酸化酶。

将这种大肠杆菌接种在含有抗生素氨苄青霉素的1升LB培养基（1%胰蛋白胨（Difco生产）、0.5%酵母提取物（Difco生产）和1%氯化钠）中，这在以120 rpm摇振下在37℃下培养3小时。此后，将IPTG添加到这种培养基中至0.1mM，并将吡哆醇添加到这种培养基中至1mM，这在摇振下在22℃下再培养20小时。然后，将这种培养物以5,000 rpm离心5分钟以收集大肠杆菌细胞。将所得细胞悬浮在50毫升含有0.05% Triton X-100的20 mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.0)中，然后将这超声破碎以获得50毫升破碎细胞液。这种破碎细胞液含有4.7 U/mg葡聚糖磷酸化酶。

将这种破碎细胞液在55℃下加热30分钟。在加热后，其以8,500rpm离心20分钟以除去不可溶蛋白质等，以获得上清液。将所得上清液施加到已预平衡的阴离子交换树脂Q-Sepharose上，使葡聚糖磷酸化酶吸附到树脂上。该树脂用含有200 mM氯化钠的缓冲液洗涤以除去杂质。随后，用含有300 mM氯化钠的缓冲液洗脱蛋白质，以获得重组马铃薯葡聚糖磷酸化酶溶液。

(制备例4: 源自微生物的α-葡聚糖磷酸化酶的制备)

使用具有编码源自Thermococcus zilligii AN1的α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列（SEQ ID NO: 6）的碱基序列（GenBank碱基序列数据库的ACCESSION No. AJ318499中描述的第1号至第2151号的碱基序列；SEQ ID NO: 5）的核酸代替源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶基因，以与制备例1相同的方式获得α-葡聚糖磷酸化酶液体。

(实施例1: 各酶的反应特异性的证实)

使1毫升含有10 mM麦芽五糖(G5)、100 mM乙酸钠缓冲液(pH 5.5)、10 mM下表2中所示的葡萄糖-1-磷酸类似物和在任一制备例1、3或4中制备的酶(10 U)的反应液在50℃下作用24小时。当各酶催化从各种葡萄糖-1-磷酸类似物至G5的非还原端的糖转移反应时，产生无机磷酸。然后，测定反应液中的无机磷酸浓度，使用下列公式计算糖与G5的结合率，结果显示在表2中。要指出，由于在这种糖转移反应中作为副反应发生的各种反应，发生葡聚糖链长的歧化，因此在使用聚合度为5的麦芽五糖作为原材料时，获得具有3或更大的葡萄糖残基聚合度的各种含糖残基的麦芽低聚糖，但为了简化计算，计算糖与G5的结合率。

糖与G5的结合率 = (反应液中产生的无机磷酸的浓度(mM)/反应液中的G5浓度(mM)) x 100 (%)

要指出，通过将800微升钼试剂（15 mM钼酸铵，100 mM乙酸锌）混入含有无机磷酸的水溶液（200微升）中、随后添加200微升568 mM抗坏血酸水溶液(pH 5.0)、搅拌该混合物、使该混合物在30℃下保持20分钟并使用分光光度计测定在850 nm的吸光度，获得无机磷酸浓度(mM)。使用具有已知浓度的无机磷酸类似地测定吸光度以制备标准曲线。通过将样品中获得的吸光度拟合至这种标准曲线，获得反应液中的无机磷酸(mM)浓度。

[表2]

表2: 使用各种酶时葡萄糖-1-磷酸类似物与G5的结合率(%)

在该表中，ND是指该值在检测范围以下，NT是指未实施测定。

如从表2中可以理解，发现源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶除作为原始底物的葡萄糖-1-磷酸外还作用于葡萄糖醛酸-1-磷酸（GlcA-1-P）、葡糖胺-1-磷酸（GlcN-1-P）、N-乙酰基葡糖胺-1-磷酸（GlcNAc-1-P）、甘露糖-1-磷酸（Man-1-P）和半乳糖-1-磷酸（Gal-1-P），并可催化将各种糖残基结合到G5的非还原端上的反应（也就是说，这些类似物可用作底物）。但是，源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶不能使用半乳糖胺-1-磷酸（GalN-1-P）、半乳糖醛酸-1-磷酸（GalA-1-P）和岩藻糖-1-磷酸（Fuc-1-P）作为底物。

另一方面，源自马铃薯的α-葡聚糖磷酸化酶作用于GlcN-1-P、Man-1-P和Gal-1-P并可催化将各种糖结合到G5的非还原端上的反应，但不能作用于GlcA-1-P、GlcNAc-1-P、GalN-1-P、GalA-1-P和Fuc-1-P。源自Thermococcus zilligii AN1的α-葡聚糖磷酸化酶作用于GlcN-1-P并可催化将各种糖结合到G5的非还原端上的反应。源自Thermococcus zilligii AN1的α-葡聚糖磷酸化酶可略微作用于GlcNAc-1-P、GalN-1-P和Man-1-P，但不能作用于GlcA-1-P、GalN-1-P和GalA-1-P。如上所述，这并不是说α-葡聚糖磷酸化酶可利用除作为原始底物的葡萄糖-1-磷酸外的任何葡萄糖-1-磷酸类似物。据显示，可使用哪种葡萄糖-1-磷酸类似物作为底物随所用酶的来源而完全不同。

(实施例2: 具有结合到其上的N-乙酰基葡糖胺残基的麦芽低聚糖的制备)

使制备例1中获得的源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶（50 U）在50℃下作用于5毫升含有10 mM麦芽五糖（G5）、10 mM N-乙酰基葡糖胺-1-磷酸和100 mM乙酸钠缓冲液(pH 5.5)的反应液24小时。结果获得具有结合到其上的N-乙酰基葡糖胺残基的麦芽低聚糖。由于在这种糖转移反应中作为副反应发生的各种反应，发生葡聚糖链长的歧化，因此在使用聚合度为5的麦芽五糖作为原材料时，获得其中葡萄糖残基聚合度为3或更大的具有结合到其上的N-乙酰基葡糖胺残基的各种麦芽低聚糖。

制备的具有结合到其上的N-乙酰基葡糖胺残基的麦芽低聚糖的摩尔浓度等于反应液中无机磷酸的摩尔浓度。然后，通过量化反应液中无机磷酸的摩尔浓度，计算具有结合到其上的N-乙酰基葡糖胺残基的麦芽低聚糖的摩尔浓度。基于这种浓度，计算具有结合到其上的N-乙酰基葡糖胺残基的麦芽低聚糖的量。结果证实，在上述反应液中制成28.3毫克具有结合到其上的N-乙酰基葡糖胺残基的麦芽低聚糖。

(实施例3: 具有结合到其上的半乳糖残基的麦芽低聚糖的制备)

使制备例1中获得的源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶（50 U）在50℃下作用于5毫升含有10 mM麦芽五糖（G5）、10 mM半乳糖-1-磷酸和100 mM乙酸钠缓冲液(pH 5.5)的反应液24小时。结果获得具有结合到其上的半乳糖残基的麦芽低聚糖。由于在这种糖转移反应中作为副反应发生的各种反应，发生葡聚糖链长的歧化，因此在使用聚合度为5的麦芽五糖作为原材料时，获得其中葡萄糖残基聚合度为3或更大的具有结合到其上的半乳糖残基的各种麦芽低聚糖。

制备的具有结合到其上的半乳糖残基的麦芽低聚糖的摩尔浓度等于反应液中无机磷酸的摩尔浓度。然后，通过量化反应液中无机磷酸的摩尔浓度，计算具有结合到其上的半乳糖残基的麦芽低聚糖的摩尔浓度。基于这种浓度，计算具有结合到其上的半乳糖残基的麦芽低聚糖的量。结果证实，在反应液中制成19.8毫克具有结合到其上的半乳糖残基的麦芽低聚糖。

(参比例4: 葡糖胺结合的麦芽低聚糖的制备)

使制备例1中获得的源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶（50 U）在50℃下作用于5毫升含有10 mM麦芽五糖（G5）、10 mM葡糖胺-1-磷酸和100 mM乙酸钠缓冲液(pH 5.5)的反应液24小时。结果获得具有结合到其上的葡糖胺残基的麦芽低聚糖。由于在这种糖转移反应中作为副反应发生的各种反应，发生葡聚糖链长的歧化，因此在使用聚合度为5的麦芽五糖作为原材料时，获得其中葡萄糖残基聚合度为3或更大的具有结合到其上的葡糖胺残基的各种麦芽低聚糖。

制备的葡糖胺结合的麦芽低聚糖的摩尔浓度等于反应液中无机磷酸的摩尔浓度。然后，通过量化反应液中无机磷酸的摩尔浓度，计算具有结合到其上的葡糖胺残基的麦芽低聚糖的摩尔浓度。基于这种浓度，计算具有结合到其上的半乳糖残基的麦芽低聚糖的量。结果证实，在上述反应液中制成34.2毫克具有结合到其上的葡糖胺残基的麦芽低聚糖。

(实施例5: 具有结合到其上的N-乙酰基葡糖胺残基的支链葡聚糖的制备)

使制备例1中获得的源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶（50 U）在50℃下作用于5毫升含有110毫克制备例2中获得的支链葡聚糖、10 mM N-乙酰基葡糖胺-1-磷酸和100 mM乙酸钠缓冲液(pH 5.5)的反应液24小时。

转移到支链葡聚糖中的N-乙酰基葡糖胺的量等于在反应液中产生的无机磷酸的量。然后量化反应液中的无机磷酸浓度，并由所得的无机磷酸的浓度获得转移到支链葡聚糖中的N-乙酰基葡糖胺的量。假设N-乙酰基葡糖胺均等结合到反应液中的支链葡聚糖上，获得具有结合到其上的N-乙酰基葡糖胺残基的支链葡聚糖的量。在上述反应液中，制成114.8毫克具有结合到其上的N-乙酰基葡糖胺残基的支链葡聚糖。要指出，与非还原端的结合率为46.8%。

(实施例6: 具有结合到其上的半乳糖残基的支链葡聚糖的制备)

使制备例1中获得的源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶（50 U）在50℃下作用于5毫升含有110毫克制备例2中获得的支链葡聚糖、10 mM半乳糖-1-磷酸和100 mM乙酸钠缓冲液(pH 5.5)的反应液24小时。

转移到支链葡聚糖中的半乳糖的量等于在反应液中产生的无机磷酸的量。然后量化反应液中的无机磷酸浓度，并由所得的无机磷酸的浓度获得转移到支链葡聚糖中的半乳糖的量。假设半乳糖均等结合到反应液中的支链葡聚糖上，获得具有结合到其上的半乳糖残基的支链葡聚糖的量。在上述反应液中，制成113.1毫克具有结合到其上的半乳糖残基的支链葡聚糖。要指出，非还原端的结合率为38.5%。

(参比例7: 具有结合到其上的葡糖胺残基的支链葡聚糖的制备)

使制备例1中获得的源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶（50 U）在50℃下作用于5毫升含有110毫克制备例2中获得的支链葡聚糖、10 mM葡糖胺-1-磷酸和100 mM乙酸钠缓冲液(pH 5.5)的反应液24小时。

转移到支链葡聚糖中的葡糖胺的量等于在反应液中产生的无机磷酸的量。然后量化反应液中的无机磷酸浓度，并由所得的无机磷酸的浓度获得转移到支链葡聚糖中的葡糖胺的量。假设葡糖胺均等结合到反应液中的支链葡聚糖上，获得具有结合到其上的葡糖胺残基的支链葡聚糖的量。在上述反应液中，制成115.4毫克具有结合到其上的葡糖胺残基的支链葡聚糖。要指出，与非还原端的结合率为66.8%。

(实施例8: 含半乳糖的麦芽低聚糖的还原端改性产物的制备)

向10毫升5%麦芽五糖（G5）中加入10毫升0.2 M I₂/MeOH溶液，并在30℃下搅拌该液体的同时分份逐滴缓慢加入4毫升4% KOH/MeOH溶液，以进行碘酸氧化反应。进一步逐滴加入4% KOH/MeOH溶液直至碘颜色消失，以在搅拌该液体的同时进行反应1小时。添加所得反应液体积的3倍量的甲醇以使G5氧化物沉淀，离心收集沉淀物。获得大约0.4克G5-还原端改性产物，其中G5还原端被羧化。

在这种氧化反应中，发生下列反应。

[化学式15]

接着，使制备例1中获得的源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶（50 U）在50℃下作用于5毫升含有10 mM如上获得的G5-还原端改性产物、10 mM半乳糖-1-磷酸和100 mM乙酸钠缓冲液(pH 5.5)的反应液24小时。结果获得具有结合到其上的半乳糖残基的麦芽低聚糖的还原端改性产物。由于在这种糖转移反应中作为副反应发生的各种反应，发生葡聚糖链长的歧化，因此在使用聚合度为5的麦芽五糖作为原材料时，获得其中葡萄糖残基聚合度为3或更大的、具有结合到其上的半乳糖残基的麦芽低聚糖的各种还原端改性产物。

制备的具有结合到其上的半乳糖残基的麦芽低聚糖的还原端改性产物的摩尔浓度等于反应液中无机磷酸的摩尔浓度。然后，通过量化反应液中无机磷酸的摩尔浓度，计算具有结合到其上的半乳糖残基的麦芽低聚糖的还原端改性产物的摩尔浓度。基于这种浓度，计算具有结合到其上的半乳糖残基的麦芽低聚糖的量。结果证实，在上述反应液中制成20.1毫克具有结合到其上的半乳糖残基的麦芽低聚糖的还原端改性产物。

(实施例9A: 具有结合到还原端上的葡糖酸的含半乳糖的支链葡聚糖或含N-乙酰基葡糖胺的葡聚糖的制备)

将10毫升0.2 M I₂/MeOH溶液添加到10毫升5%麦芽五糖（G5）中并在30℃下搅拌下逐滴缓慢加入4毫升4% KOH/MeOH溶液，以进行碘酸盐氧化反应。进一步逐滴加入4% KOH/MeOH溶液直至碘颜色消失，以在搅拌该液体的同时进行反应1小时。添加所得反应液体积的3倍量的甲醇以使G5氧化物沉淀，离心收集沉淀物（大约0.4克）。该沉淀物是麦芽六糖基（maltohexaosyl）葡糖酸，其中麦芽五糖的还原端葡萄糖转化成葡糖酸。向6克葡萄糖-1-磷酸和0.6毫克麦芽六糖基葡糖酸溶解在100毫升0.2 M马来酸盐缓冲液(pH 6.0)中获得的溶液中，添加150 U制备例1中制备的源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶和2,000 U根据日本公开出版物 No. 2000-316581的实施例1中描述的方法制备的高热稳定的分支酶以制备反应溶液，此后该反应在50℃下搅拌下进行16小时。通过加热该溶液，灭活该酶，并通过经玻璃过滤器过滤除去灭活的酶。将两倍量的乙醇添加到该滤液中以使葡聚糖反应产物沉淀，随后离心。沉淀物用300毫升1:1 水:乙醇溶液洗涤两次，以除去共存的葡萄糖-1-P，并用乙醇进一步洗涤两次，此后冻干。以1.7克收率获得分子量为120 kDa的具有结合到改性还原端上的葡糖酸的支链葡聚糖。

使制备例1中制备的源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶（18单位/毫升）在50℃下作用于含有1.6毫克/毫升上述还原端改性的支链葡聚糖、10 mM半乳糖-1-磷酸或N-乙酰基葡糖胺-1-磷酸和100 mM乙酸钠缓冲液(pH 5.5)的各反应液20小时以使半乳糖残基或N-乙酰基葡糖胺残基结合到具有结合到还原端上的葡糖酸的支链葡聚糖的非还原端上。通过与实施例3相同的方法获得半乳糖或N-乙酰基葡糖胺的结合率并分别为33%和32%。由此获得还原端改性的、用半乳糖残基或N-乙酰基葡糖胺残基非还原端改性的支链葡聚糖。

(实施例9: 具有结合到其上的半乳糖和葡糖胺的支链葡聚糖的制备)

使制备例1中获得的源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶（50 U）在50℃下作用于5毫升含有110毫克制备例2中获得的支链葡聚糖、10 mM半乳糖-1-磷酸和100 mM乙酸钠缓冲液(pH 5.5)的反应液5小时。

转移到支链葡聚糖中的半乳糖的量等于在反应液中产生的无机磷酸的量。然后量化反应液中的无机磷酸浓度，并由所得的无机磷酸的浓度获得转移到支链葡聚糖中的半乳糖的量。假设半乳糖均等结合到反应液中的支链葡聚糖上，获得具有结合到其上的半乳糖残基的支链葡聚糖的量。制成111.7毫克半乳糖结合的支链葡聚糖。要指出，半乳糖残基与非还原端的结合率为20.8%。

使用PD-10柱（GE Healthcare生产）根据制备商的指示从含有这种具有结合到其上的半乳糖残基的支链葡聚糖的反应液中除去该反应液中的未反应半乳糖-1-磷酸和无机磷酸。使制备例1中获得的源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶（50 U）在50℃下作用于5毫升含有110毫克具有结合到非还原端上的半乳糖残基的所得支链葡聚糖、10 mM葡糖胺-1-磷酸和100 mM乙酸钠缓冲液(pH 5.5)的反应液5小时。通过与转移到上述支链葡聚糖上的半乳糖量相同的方法获得转移到具有结合到其上的半乳糖残基的支链葡聚糖上的葡糖胺的量。制成112.7毫克具有结合到其上的半乳糖和葡糖胺残基的支链葡聚糖。要指出，葡糖胺残基与非还原端的结合率为33.8%。

(实施例10: 具有结合到其上的各种糖残基的支链葡聚糖的葡糖淀粉酶可降解性的评估)

在含有0.5%的在实施例5、实施例6或参比例7中制备的具有结合到其上的糖残基的支链葡聚糖、20 mM乙酸钠缓冲液(pH 5.5)和葡糖淀粉酶（17 U/ml；EC3.2.1.3）的反应液在37℃下培养18小时后，通过使用葡萄糖CII-Test Wako（Wako Pure Chemical Industries, Ltd.生产）的葡萄糖氧化酶法量化该反应液中的葡萄糖量。根据下列公式，已被葡糖淀粉酶降解的葡聚糖部分相对于整个支链葡聚糖的比率作为葡糖淀粉酶降解率(%)获得，尚未被葡糖淀粉酶降解的葡聚糖部分相对于整个支链葡聚糖的比率作为葡糖淀粉酶耐受性(%)获得。结果显示在表3中。

葡糖淀粉酶降解率 = (反应后溶液中的葡萄糖量(mg)/反应前溶液中的葡聚糖量(mg)) x 100

葡糖淀粉酶耐受性 = 1-葡糖淀粉酶降解率

[表3]

表3: 具有结合到其上的各种糖残基的支链葡聚糖的淀粉酶耐受性(%)

	制备例2的支链葡聚糖	实施例5的具有结合到其上的N-乙酰基葡糖胺残基的支链葡聚糖	实施例6的具有结合到其上的半乳糖残基的支链葡聚糖	参比例7的具有结合到其上的葡糖胺残基的支链葡聚糖
					与非还原端的结合率(%)	0	46.8	38.5	66.8
葡糖淀粉酶降解率(%)	100	26.2	69.6	96.4
					葡糖淀粉酶耐受性(%)	0	73.8	30.4	3.6

具有结合到其上的N-乙酰基葡糖胺残基的支链葡聚糖和具有结合到其上的半乳糖残基的支链葡聚糖表现出对葡糖淀粉酶的耐受性。但是，几乎所有的具有结合到其上的葡糖胺残基的支链葡聚糖被葡糖淀粉酶降解并且没有表现出葡糖淀粉酶耐受性。如上所述，发现在半乳糖或N-乙酰基葡糖胺结合到非还原端上时可提供葡糖淀粉酶耐受性。

本发明的葡聚糖表现出仅耐受葡糖淀粉酶的特有性质。但是，由于在体内存在各种淀粉酶，即使该葡聚糖耐受葡糖淀粉酶，该葡聚糖也被认为是生物可降解性优异的安全物质，其最终在体内代谢并降解至能排泄到体外的尺寸。

(实施例11: 具有结合到非还原端上的N-乙酰基葡糖胺残基的支链葡聚糖的提纯和结构确认)

通过与实施例5相同的方法，制备具有结合到非还原端上的N-乙酰基葡糖胺残基的支链葡聚糖。首先，使制备例1中获得的源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶（50 U）在50℃下作用于2.5毫升含有28毫克制备例2中获得的支链葡聚糖、15 mM N-乙酰基葡糖胺-1-磷酸和100 mM乙酸钠缓冲液(pH 5.5)的反应液24小时。当与实施例5类似地分析非还原端改性率时，转移到支链葡聚糖中的N-乙酰基葡糖胺的量（非还原端改性率）为62.9%。在用5 N HCl溶液将所得反应液调节至pH 3后，通过离心除去含有变性蛋白质的沉淀物。收集上清液并用5 N NaOH溶液中和。然后，使用PD-10柱，除去小分子，并同时将该溶液脱盐，这用0.2微米过滤器进一步过滤，将所得滤液冻干，由此获得具有结合到非还原端上的N-乙酰基葡糖胺残基的非还原端改性的支链葡聚糖的粉末。在下文中，具有结合到非还原端上的N-乙酰基葡糖胺残基的支链葡聚糖也被称作B-GlcNAc。

如下所述，通过与制备例2中制备的支链葡聚糖（未改性的支链葡聚糖；B）相比，确认非还原端改性的支链葡聚糖（B-GlcNAc）的结构。

将如上所述获得的纯化非还原端改性的支链葡聚糖（B-GlcNAc）的粉末溶解在10 mM乙酸盐缓冲液(pH 5.5)中至0.2重量%，向其中加入表4的条件1至4的各种淀粉酶，并在适当温度下培养该混合物，由此消化葡聚糖。此后，测定该反应液中的葡萄糖量。由于表4中所示的酶量是过量，可被酶或酶的组合切断的所有键都被切断。葡萄糖氧化酶法用于量化葡萄糖。

此外，用DIONEX制备的HPAEC-PAD装置（泵送系统: DX300，检测器: PAD-2，分析柱: CarboPacPA100）分析在各自条件2至4下酶消化后的反应液。在流速: 1 ml/min、NaOH浓度: 150 mM、乙酸钠浓度: 0 min-50 mM、1 min-50 mM、27 min-350 mM（梯度曲线No. 4）、35 min-850 mM（梯度曲线No. 7）、37 min-850 mM的条件下进行洗脱。结果显示在图1中，此外，由这些酶促反应的性质推断的在酶法处理后获得的产物的结构的示意图显示在图3中。图1显示用各种淀粉酶消化非还原端改性的支链葡聚糖(B-GlcNAc)或未改性的支链葡聚糖(B)后的HPAEC-PAD分析结果。各自的样品如下：图1-1: G1至G6；图1-2: 制备例2的支链葡聚糖(B)的异淀粉酶降解产物；图1-3: 用异淀粉酶和葡糖淀粉酶降解制备例2的支链葡聚糖(B)的产物；图1-4: 用异淀粉酶、葡糖淀粉酶和α-淀粉酶降解制备例2的支链葡聚糖(B)的产物；图1-5: 具有结合到非还原端上的N-乙酰基葡糖胺残基的支链葡聚糖的异淀粉酶降解产物；图1-6: 用异淀粉酶和葡糖淀粉酶降解具有结合到非还原端上的N-乙酰基葡糖胺残基的支链葡聚糖的产物；图1-7: 用异淀粉酶、葡糖淀粉酶和α-淀粉酶降解具有结合到非还原端上的N-乙酰基葡糖胺残基的支链葡聚糖的产物。

关于葡萄糖的量，将未改性的支链葡聚糖(B)在条件4下反应产生的葡萄糖生成量计算为100%，在各自的条件下的葡萄糖生成量(%)显示在表4中。下面将解释这些结果。

在条件1下，使从非还原端侧切断葡萄糖单元中的葡聚糖的α-1,4和α-1,6键的葡糖淀粉酶发挥作用。因此，在仅由葡萄糖残基构成的制备例2的未改性支链葡聚糖中，葡萄糖的量为100%，这种未改性支链葡聚糖全部降解成葡萄糖。但是，在其中N-乙酰基葡糖胺残基结合到葡聚糖的非还原端上的B-GlcNAc中，葡萄糖的量为31.2%，这种非还原端改性的支链葡聚糖中大约68%的键无法降解。这一比率的值接近由实施例5中所示的磷酸浓度量化的N-乙酰基葡糖胺与非还原端的结合率(62.9%)。因此推定，具有从非还原端侧切断α-1,4糖苷键的性质的葡糖淀粉酶无法对末端改性的支链葡聚糖（B-GlcNAc）的结构起作用，因此，N-乙酰基葡糖胺残基结合到非还原端部分上。

在条件2下，使切断α-1,6键的异淀粉酶发挥作用。在条件2下，对于制备例2的支链葡聚糖和实施例5的末端改性的支链葡聚糖，葡萄糖的量为0.0%。

此外，在条件3下，使异淀粉酶和葡糖淀粉酶联合发挥作用。在条件3下，用异淀粉酶切断α-1,6键，但对于制备例2的支链葡聚糖和实施例5的末端改性的支链葡聚糖，葡萄糖的量不与条件1不同，分别为100%和31.2%。

在条件4下，使异淀粉酶、葡糖淀粉酶和α-淀粉酶联合发挥作用。α-淀粉酶具有无规切断葡聚糖的α-1,4键的性质。在条件4下，制备例2的未改性支链葡聚糖全部降解成葡萄糖，但其中N-乙酰基葡糖胺残基结合到非还原端上的B-GlcNAc中仅83.7%的键降解。因此，在B-GlcNAc中，用能降解制备例2的未改性支链葡聚糖的各种淀粉酶无法降解的结构部分占总量的16.3%，并推定具有这种结构的产物是具有结合到非还原端上的N-乙酰基葡糖胺残基的寡糖（图1-7中的实心星形标记）。要指出，图1-7中的具有实心星形标记的洗脱位置（通过HPAEC-PAD）与其中N-乙酰基葡糖胺残基经由α-1,4键结合到麦芽糖的非还原端上的4-O-α-N-乙酰基葡糖胺基麦芽糖的可信样品的洗脱位置一致。

[表4]

表4: 在用各种淀粉酶消化B-GlcNAc或B后的反应液中的葡萄糖量

。

(实施例12: 具有结合到非还原端上的半乳糖残基的支链葡聚糖的提纯和结构确认)

使制备例1中获得的源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶（50 U）在50℃下作用于2.5毫升含有28毫克制备例2中获得的支链葡聚糖、15 mM半乳糖-1-磷酸和100 mM乙酸钠缓冲液(pH 5.5)的反应液24小时。转移到支链葡聚糖中的半乳糖的量为62.2%。通过与实施例11相同的方法提纯所得反应液，获得具有结合到非还原端上的半乳糖残基的支链葡聚糖的粉末。在下文中，具有结合到非还原端上的半乳糖残基的支链葡聚糖也被称作B-Gal。

如下所述，通过与制备例2中制备的支链葡聚糖（未改性的支链葡聚糖；B）相比，确认具有结合到非还原端上的半乳糖残基的改性支链葡聚糖（B-Gal）的结构。

将如上所述获得的纯化非还原端支链葡聚糖（B-Gal）的粉末溶解在10 mM乙酸盐缓冲液(pH 5.5)中至0.2重量%，向其中加入表5的条件1至4的各种淀粉酶，并在适当温度下培养该混合物，由此消化葡聚糖。此后，测定该反应液中的葡萄糖量。由于表5中所示的酶量是过量，可被酶或酶的组合切断的键都被切断。葡萄糖氧化酶法用于量化葡萄糖。

此外，通过实施例11的方法用HPAEC-PAD分析在各条件2至4下酶消化后的反应液。结果显示在图2中。此外，由这些酶促反应的性质推断的在酶法处理后获得的产物的结构的示意图显示在图3中。图2显示用各种淀粉酶消化非还原端改性的支链葡聚糖（B-Gal）或未改性的支链葡聚糖(B)后的HPAEC-PAD分析结果。各自的样品如下：图2-1: G1至G6；图2-2: 制备例2的支链葡聚糖(B)的异淀粉酶降解产物；图2-3: 用异淀粉酶和葡糖淀粉酶降解制备例2的支链葡聚糖(B)的产物；图2-4: 用异淀粉酶、葡糖淀粉酶和α-淀粉酶降解制备例2的支链葡聚糖(B)的产物；图2-5: 具有结合到非还原端上的半乳糖残基的支链葡聚糖的异淀粉酶降解产物；图2-6: 具有结合到非还原端上的半乳糖残基的支链葡聚糖的异淀粉酶和葡糖淀粉酶降解产物；图2-7: 具有结合到非还原端上的半乳糖残基的支链葡聚糖的异淀粉酶、葡糖淀粉酶和α-淀粉酶降解产物。

以未改性的支链葡聚糖(B)在条件4下的反应中产生的葡萄糖生成量为100%，计算在各自的条件下的葡萄糖生成量(%)并显示在表5中。下面将解释这些结果。

在条件1下，使从非还原端侧切断葡萄糖单元中的葡聚糖的α-1,4和α-1,6键的葡糖淀粉酶发挥作用。因此，仅由葡萄糖残基构成的制备例2的未改性支链葡聚糖的葡萄糖量为100%，这种未改性支链葡聚糖全部降解成葡萄糖。但是，在其中半乳糖残基结合到葡聚糖的非还原端上的B-Gal中，葡萄糖的量为30.2%，这种非还原端改性的支链葡聚糖中大约70%的键无法降解。这一比率的值接近由磷酸浓度量化的半乳糖与非还原端的结合率(62.2%)。因此推定，具有从非还原端侧切断α-1,4葡糖苷键的性质的葡糖淀粉酶无法对实施例5中制备的末端改性的支链葡聚糖的结构起作用，因此，半乳糖残基结合到非还原端部分上。

在条件2下，使切断α-1,6键的异淀粉酶发挥作用。在条件2下，对于制备例2的支链葡聚糖，产生麦芽低聚糖（图2-2）。当使异淀粉酶作用于具有结合到其上的半乳糖的支链葡聚糖时，产生其中非还原端是葡萄糖残基的寡糖（图2-5中的实心圆，分别在与图2-2相同的洗脱位置洗脱）和具有结合到非还原端上的半乳糖的寡糖（图2-5中的实心星形）。

在条件3下，在使异淀粉酶和葡糖淀粉酶作用于实施例5中制备的非还原端改性葡聚糖时，图2-5中的实心圆所示的峰降解并产生葡萄糖(G1)，但具有结合到非还原端上的半乳糖的寡糖的峰不变（图2-5中的实心星形）。其中半乳糖残基结合到非还原端上的B-Gal在条件3下的葡萄糖量为30.3%。

在条件4下，使异淀粉酶、葡糖淀粉酶和α-淀粉酶联合发挥作用。α-淀粉酶具有无规切断葡聚糖的α-1,4键的性质。在条件4下，制备例2的未改性支链葡聚糖全部降解成葡萄糖，但其中半乳糖残基结合到非还原端上的B-Gal中仅90.9%的键降解。因此，在B-Gal中，用能降解制备例2的未改性支链葡聚糖的各种淀粉酶无法降解的结构部分占总量的9.1%，并推定这种产物是具有结合到非还原端上的半乳糖残基的寡糖（图2-7中的实心星形标记）。要指出，图2-7中的具有实心星形标记的洗脱位置（通过HPAEC-PAD）与其中半乳糖残基经由α-1,4键结合到麦芽糖的非还原端上的4-O-α-半乳糖基麦芽糖的可信样品的洗脱位置一致。

[表5]

表5: 在用各种淀粉酶消化B-Gal或B后的反应液中的葡萄糖量

。

(实施例13: 具有结合到其上的N-乙酰基葡糖胺残基的支链葡聚糖(1)的生物可降解性)

实施例11中提纯的具有结合到其上的N-乙酰基葡糖胺残基的支链葡聚糖的粉末通过添加到20 mM乙酸盐缓冲液(pH 5.5)中而溶解至0.5重量%，向这种溶液中加入23 U/ml α-淀粉酶，并在37℃下培养该混合物，由此使α-淀粉酶发挥作用，随时间经过研究该产物的重均分子量的降低。

为了测定该产物的重均分子量，使用制备例2中所示的测定支链葡聚糖的重均分子量的方法。结果显示在表6和图4中。

通过α-淀粉酶的作用，具有结合到其上的N-乙酰基葡糖胺残基的支链葡聚糖的重均分子量降低，重均分子量在10分钟反应时间内变成1/2或更小，在30分钟反应时间内变成大约1/5。在60分钟反应时间后，具有结合到其上的N-乙酰基葡糖胺残基的支链葡聚糖降解成分子量为30000或更小的分子。血液中的淀粉酶是α-淀粉酶。因此，认为本发明的非还原端改性的支链葡聚糖被血液中的淀粉酶降解成分子量为30000或更小的分子。由于分子量为30000或更小的分子被认为排泄到尿中，认为本发明的非还原端改性的支链葡聚糖可生物降解。

[表6]

表6: 用α-淀粉酶降解具有结合到其上的N-乙酰基葡糖胺残基的支链葡聚糖时，产物随时间经过的重均分子量变化

反应时间 (min)	重均分子量 (x 103)
		0	157.9
10	75.8
		20	58.4
30	37.8
		60	28.4

(实施例14: 具有结合到其上的N-乙酰基葡糖胺残基的乙酰化支链葡聚糖(2)的生物可降解性)

通过将制备例2的支链葡聚糖乙酰化，制备粉状支链葡聚糖，并通过与实施例11相同的方法制备具有结合到其上的N-乙酰基葡糖胺残基的乙酰化支链葡聚糖。通过以表7中的组成混合溶解在二甲亚砜（DMSO）中的支链葡聚糖、DMSO、4% Na₂CO₃水溶液和5 M在DMSO中制备的乙酸乙烯酯，进行支链葡聚糖的乙酰化，并使其在搅拌下在25℃下反应1小时。所得反应液用超纯水稀释2倍，脱盐并使用凝胶过滤柱(PD-10)除去溶剂，用超纯水以水溶液形式收集纯化的乙酰化支链葡聚糖。向300微升收集的纯化乙酰化支链葡聚糖的水溶液中加入200微升5 N氢氧化钠水溶液，这在55℃下加热30分钟，由此将乙酰化支链葡聚糖脱乙酰。向这种反应液中加入300微升1 N Tris缓冲液(pH 7)，并进一步加入200微升5 N盐酸以中和该溶液。当通过苯酚硫酸法量化中和后的溶液中的葡萄糖量、用游离乙酸量化试剂盒量化中和后的溶液中的游离乙酸并获得乙酰化程度时，证实所得乙酰化支链葡聚糖的乙酰化程度为0.1至1.3。如上所述，获得三种含有乙酰化葡聚糖的水溶液。将各乙酰化葡聚糖水溶液冻干以获得各大约300毫克的乙酰化葡聚糖粉末。

[表7]

表7: 反应条件的概述

乙酰化程度	0	0.1	0.5	1.3
					1.87%支链葡聚糖(B) (ml)	16.00	16.00	16.00	16.00
DMSO(ml)	3.00	2.86	2.78	2.56
					4% Na2CO3 (ml)	1.00	1.00	1.00	1.00
5 M乙酸乙烯酯(ml)	0	0.14	0.22	0.44

将制备例1中制备的源自超嗜热菌的α-葡聚糖磷酸化酶（50 U/ml）添加到含有2.5%所得乙酰化支链葡聚糖粉末、10 mM N-乙酰基葡糖胺-1-磷酸和100 mM乙酸盐缓冲液(pH 5.5)的反应液中并使其在50℃下反应18小时。在用5 N HCl溶液将含有具有结合到其上的N-乙酰基葡糖胺残基的支链葡聚糖的所得反应液调节至pH 3后，通过离心除去含有变性蛋白质的沉淀物。收集上清液并用5 N NaOH溶液中和。然后，使用凝胶过滤柱(PD-10)，除去小分子，同时将该溶液脱盐，这用0.2μm过滤器进一步过滤，将所得滤液冻干，由此获得通过实施例14的方法制备的乙酰化支链葡聚糖的粉末。

将23 U/ml α-淀粉酶添加到含有0.5重量%具有结合到其上的N-乙酰基葡糖胺残基的乙酰化支链葡聚糖和20 mM乙酸盐缓冲液(pH 5.5)的所得反应液中，这在适当温度下培养，由此使α-淀粉酶作用于乙酰化支链葡聚糖，随时间经过研究该产物的重均分子量的降低。

与实施例13类似地进行分子量的测定。结果显示在表8和图5中。由这种结果表明，通过支链葡聚糖部分的乙酰化，可以控制具有结合到其上的N-乙酰基葡糖胺残基的支链葡聚糖的降解。

[表8]

表8: 用α-淀粉酶降解具有不同乙酰化程度的非还原端N-乙酰基葡糖胺残基结合的支链葡聚糖时随时间经过的重均分子量变化

。

(实施例15: 具有结合到其上的半乳糖残基的支链葡聚糖(1)的生物可降解性)

实施例12中提纯的具有结合到其上的半乳糖残基的支链葡聚糖的粉末通过添加到20 mM乙酸盐缓冲液(pH 5.5)中而溶解至0.5重量%，向这种溶液中加入23 U/ml α-淀粉酶，这在37℃下培养以使α-淀粉酶发挥作用，随时间经过研究该产物的重均分子量的降低。

为了测定该产物的重均分子量，使用制备例2中所示的测定支链葡聚糖的重均分子量的方法。结果显示在表9和图6中。

通过α-淀粉酶的作用，具有结合到其上的半乳糖残基的支链葡聚糖的重均分子量降低，重均分子量在10分钟反应时间内变成1/3或更小，在20分钟反应时间内变成大约1/5。在60分钟反应时间后，具有结合到其上的半乳糖残基的支链葡聚糖快速降解成分子量为30000或更小的分子。血液淀粉酶是α-淀粉酶，因此，认为本发明的非还原端改性的支链葡聚糖被血液淀粉酶降解成分子量为30000或更小的分子。由于分子量为30000或更小的分子被认为排泄到尿中，认为本发明的非还原端改性的支链葡聚糖可生物降解。

[表9]

表9: 用α-淀粉酶降解具有结合到其上的上的半乳糖残基的支链葡聚糖时，产物随时间经过的重均分子量变化

反应时间 (min)	重均分子量 (x 103)
		0	145.2
10	42.1
		20	29.0
30	27.6
		60	23.2

(实施例16: 具有结合到其上的半乳糖残基的乙酰化支链葡聚糖(2)的生物可降解性)

制备乙酰化支链葡聚糖，其中半乳糖残基结合到实施例14中所用的乙酰化支链葡聚糖的非还原端上，并研究淀粉酶可降解性的控制。

将制备例1中制备的源自超嗜热菌的α-葡聚糖磷酸化酶（50 U/ml）添加到含有2.5%所得乙酰化支链葡聚糖、10 mM半乳糖-1-磷酸和100 mM乙酸盐缓冲液(pH 5.5)的反应液中并使其在50℃下反应18小时。在用5 N HCl溶液将含有具有结合到其上的半乳糖残基的支链葡聚糖的所得反应液调节至pH 3后，通过离心除去含有变性蛋白质的沉淀物。收集上清液并用5 N NaOH溶液中和。然后，使用PD-10柱，除去小分子，同时将该溶液脱盐，这用0.2 μm过滤器进一步过滤，此后将所得滤液冻干，由此获得其中半乳糖残基结合到通过实施例14的方法制备的乙酰化支链葡聚糖的非还原端上的粉末。

将23 U/ml α-淀粉酶添加到含有0.5重量%具有结合到其上的半乳糖残基的所得支链葡聚糖和20 mM乙酸盐缓冲液(pH 5.5)的反应液中，该混合物在适当温度下培养，由此使α-淀粉酶作用于乙酰化支链葡聚糖，并随时间经过研究该产物的重均分子量的降低。

为了测定该产物的重均分子量，使用制备例2中所示的测定支链葡聚糖的重均分子量的方法。结果显示在表10和图7中。由这种结果表明，通过支链葡聚糖部分的乙酰化，可以控制具有结合到其上的半乳糖残基的支链葡聚糖的降解。

[表10]

表10: 用α-淀粉酶降解具有不同乙酰化程度的非还原端半乳糖残基结合的支链葡聚糖时随时间经过的重均分子量变化

。

(实施例17: 具有结合到其上的N-乙酰基葡糖胺残基的支链葡聚糖(3)的生物可降解性)

研究具有结合到其上的N-乙酰基葡糖胺残基的支链葡聚糖的体内生物可降解性。简言之，作为评估样品，将制备例2中制备的支链葡聚糖和通过实施例14中所示的方法制备的乙酰化支链葡聚糖分别荧光标记，并通过GPC-荧光标记法研究血液和尿液中的葡聚糖量。

为了荧光标记葡聚糖，分别在50 mg/ml DMSO溶液中制备支链葡聚糖和乙酰化程度为0.5的乙酰化支链葡聚糖。将2毫升在DMSO中的各葡聚糖溶液置于试管中并在90℃下搅拌。向其中分别加入56微升和112微升的量的50 mg/ml异硫氰酸荧光素(FITC)的DMSO溶液。逐滴加入1滴吡啶和1滴二月桂酸二正丁基锡，并将该混合物在90℃下搅拌2小时。在反应完成后，向反应液中加入20毫升乙醇，并将该溶液以3500 rpm离心5分钟并收集沉淀物。此外，添加乙醇以进行洗涤，将沉淀物溶解在1毫升超纯水中，将1毫升该溶液施加在凝胶过滤柱(PD-10)上，使1.5毫升超纯水经过其上。此后，用超纯水收集2毫升以进行提纯。将所得样品冻干。对一部分所得样品而言，测定在490纳米的UV吸收。使用荧光素钠作为标准物质以根据下列公式获得FITC-标记的支链葡聚糖(F-B)和乙酰化支链葡聚糖(F-AcB)的FITC引入量，证实引入率分别为0.86%和0.82%。

FITC引入率(W/W%)=((FITC-标记的支链葡聚糖的荧光素浓度)/(FITC-标记的支链葡聚糖的总糖量)) x 100

由所得的两种异硫氰酸荧光素化支链葡聚糖，通过实施例3的方法进一步制备F-B-GlcNAc（结合率64.6%）和F-AcB-GlcNAc（结合率51.7%），其中N-乙酰基葡糖胺结合到葡聚糖的非还原端上。所得产物以25 mg/kg的量给予9周大的雄性SD大鼠（6个动物）的尾静脉，并使用配有荧光检测器（Shimadzu Corporation生产的10RF 10AXL）的高效液相色谱法（HPLC）系统（柱: Tosoh Corporation生产, TSK-gel G4000PWXL, 流速 1.0 ml/min, 洗脱剂200 mM NaCl 20 mM Tris-HCl缓冲剂(pH 7.8)）研究给药后FITC-标记体在血液中的浓度。在表11中所示的从给药后5分钟至48小时的各时间点收集各300微升血液，并在以10,000 rpm离心1分钟后收集100微升上清液。在添加10微升30重量%三氟乙酸后，以10,000 rpm进行离心5分钟。向60微升收集的上清液中，加入60微升200 mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.8)。如果必要，稀释样品。此后，其用0.45μm过滤器过滤，并将100微升滤液倒入HPLC系统中。

结果显示在表11和图8中。显示了具有结合到其上的N-乙酰基葡糖胺的支链葡聚糖在血液中快速降解并消失的趋势。具有结合到其上的N-乙酰基葡糖胺的乙酰化支链葡聚糖表现出分子量极慢降低且葡聚糖缓慢降解和消失的趋势。据发现，可以通过乙酰化控制具有结合到其上的N-乙酰基葡糖胺的支链葡聚糖的降解。

[表11]

。

(实施例18: 具有结合到其上的半乳糖残基的支链葡聚糖(3)的生物可降解性)

研究具有结合到其上的半乳糖残基的支链葡聚糖的体内生物可降解性。

用实施例4的方法进一步处理实施例17中制备的FITC-标记的支链葡聚糖(F-B)和乙酰化支链葡聚糖(F-AcB)以制备F-B-Gal（结合率64.3%）和F-AcB-Gal（结合率51.4%），其中半乳糖残基结合到葡聚糖的非还原端上。所得物以25 mg/kg的量给予9周大的雄性SD大鼠（6个动物）的尾静脉，并通过实施例17的方法测定给药后FITC-标记体在血液中的浓度。结果显示在表12和图9中。显示了具有结合到其上的半乳糖的支链葡聚糖(F-B-Gal)在血液中快速降解并消失的趋势。具有结合到其上的半乳糖残基的乙酰化支链葡聚糖(F-AcB-Gal)表现出分子量极慢降低且葡聚糖缓慢降解和消失的趋势。要理解的是，可以通过乙酰化控制具有结合到其上的半乳糖残基的支链葡聚糖的降解。

[表12]

表12

。

(实施例19: 具有结合到非还原端上的半乳糖残基的支链葡聚糖的靶向评估)

研究具有结合到非还原端上的半乳糖残基的支链葡聚糖是否比没有半乳糖残基结合到其上的支链葡聚糖更大量进入肝中。

将实施例14中制备的乙酰化支链葡聚糖（F-AcB140）和实施例15中制备的其中半乳糖残基结合到非还原端上的乙酰化支链葡聚糖（F-AcB140 (Gal)）给予7周大的雄性ICR小鼠（大约30克）的尾静脉，并在给药后2分钟收集眼眶血液，在给药后10分钟、1小时、2小时和6小时进行全血收集和除脏。通过如实施例17中的GPC荧光检测法分析血清和肝匀浆提取液。结果显示在表13和图10中。

关于血清，300微升血液以10000 rpm离心1分钟以收集血清，在其中混入10微升30%三氟乙酸，该混合物进一步以10000 rpm离心1分钟以获得60微升上清液。以60微升的量添加200 mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.8)。关于肝，将4倍量的PBS添加到肝中，将这匀浆，然后将匀浆以10000 rpm离心5分钟以获得200微升上清液。在其中混入20微升30%三氟乙酸，该混合物进一步以10000 rpm离心5分钟以获得150微升上清液，添加等量的200 mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.8)以制备其。

对于具有结合到其上的半乳糖残基的支链葡聚糖，在血液中的浓度显著降低，另一方面，在肝中的浓度显著提高。由这些结果表明适用于靶向肝。

[表13]

表13

。

(实施例20: 各种非还原端改性葡聚糖的树突细胞刺激活性)

在进行制备例2的支链葡聚糖的蛋白质脱除、脱盐和小分子脱除后，用0.2 μm过滤器进行过滤，然后进行冻干。将50 U制备方法1的AqGP添加到5毫升含有110毫克所得支链葡聚糖粉末、1、3、10或15 mM葡萄糖-1-磷酸衍生物（N-乙酰基葡糖胺-1-P（GlcNAc-1-P）、半乳糖-1-P（Gal-1-P）、甘露糖-1-P（Man-1-P）、葡糖胺-1-P（GlcN-1-P）或葡萄糖醛酸-1-P（GlcA-1-P））和100 mM乙酸钠缓冲液(pH 5.5)的反应液中，并使这在50℃下反应24小时。用5 N HCl溶液将该反应液调节至pH 3，并通过离心除去含有变性蛋白质的沉淀物。收集上清液并用5 N NaOH溶液中和。然后，用PD-10柱进行小分子脱除和将其脱盐，其用0.2 μm过滤器过滤，然后将其冻干。

然后刺激树突细胞。细节如下：为了制备树突细胞，从C3H/HeJ小鼠（7周大，雌性，Japan SLC, Inc.）的股骨中分离骨髓细胞，悬浮在10毫升含有10% FBS (胎牛血清, Invitrogen)、50 ng/ml rm GM-CSF (PEPROTECH)、25 ng/ml IL-4 (BD Biosciences)和50μg/ml庆大霉素(Sigma)的RPMI1640 (Sigma)培养基中至5 × 10⁶个细胞/毫升，并在CO₂培养器中在37℃下用陪替氏培养皿培养7天。从培养开始第2天和第4天各加入2.5毫升RPMI培养基。在培养7天后，除去培养基，将PBS缓冲液置于陪替氏培养皿中，除去悬浮的细胞。此外，含有5 mM EDTA的冰冷PBS缓冲液在陪替氏培养皿底部上冲洗，并用水流剥离粘附的未成熟树突细胞。所得未成熟树突细胞悬浮液在4℃和1,200 rpm下离心5分钟以收集沉淀物。将所得树突细胞悬浮在含有10% FBS (胎牛血清, Invitrogen)和50 mg/ml庆大霉素(Sigma)的RPMI培养基中至5 x 10⁵个细胞/毫升。将该树突细胞悬浮液（180微升）置于96孔板中并在CO₂培养器中在37℃下培养1小时以使细胞粘附到板上。将INF-γ（10 ng/ml）和上文制备的具有表14中所述的与非还原端的结合率的各种非还原端改性葡聚糖（1 mg/ml）添加到这种细胞中并在CO₂培养器中在37℃下培养48小时，由此实施细胞刺激。在细胞刺激后，通过离心收集细胞上清液，使用OptEIA ELISA试剂盒(BD Biosciences)通过ELISA方法测定上清液中的IL-6生成量并计算通过树突细胞刺激产生的IL-6。

结果显示在表14和图11中。

[表14] 

与末端的平均结合率(%): 非还原端改性的支链葡聚糖的各糖残基的平均结合率

与末端的平均结合数: {各非还原端改性的支链葡聚糖的分支数 x 与末端的平均结合率}/100

Gal = 半乳糖残基

GlcNAc = N-乙酰基葡糖胺残基

Man = 甘露糖残基

GlcA = 葡萄糖醛酸残基

GlcN = 葡糖胺残基

(实施例21: 各种非还原端改性葡聚糖的制备)

与结合表15的条件1至15中所示的糖一起，制备非还原端改性的支链葡聚糖。

关于条件1至6，将50 U制备方法1的AqGP添加到5毫升含有110毫克支链葡聚糖粉末（其在制备例2的支链葡聚糖的蛋白质脱除、脱盐和小分子脱除、用0.2μm过滤器过滤、然后冻干后获得）、15 mM葡萄糖-1-磷酸衍生物（N-乙酰基葡糖胺-1-P（GlcNAc-1-P）、半乳糖-1-P（Gal-1-P）、甘露糖-1-P（Man-1-P）、葡糖胺-1-P（GlcN-1-P）或葡萄糖醛酸-1-P（GlcA-1-P））和100 mM乙酸钠缓冲液(pH 5.5)的反应液中，并使这在50℃下反应24小时。将反应后的无机磷酸的量化结果计算为结合到非还原端上的量并显示在表中。用5 N HCl溶液将该反应液调节至pH 3，并通过离心除去含有变性蛋白质的沉淀物。收集上清液并用5 N NaOH溶液中和。然后，用PD-10柱除去小分子和将其脱盐，其进一步用0.2μm过滤器过滤。关于条件7至14，与条件1至6类似地制备5毫升含有110毫克制备例2的支链葡聚糖粉末和10 mM N-乙酰基葡糖胺-1-P或半乳糖-1-P的反应液。此后，对其施以小分子脱除和脱盐，并与条件1至6类似地制备含有1毫升其中非还原端被一种类型的糖改性的支链葡聚糖和10 mM葡萄糖醛酸-1-P、葡糖胺-1-P、半乳糖-1-P或甘露糖-1-P的2毫升反应液。此后，对其施以小分子脱除和脱盐。关于条件16至22，与条件1至6类似地制备10毫升含有220毫克制备例2的支链葡聚糖粉末和10 mM N-乙酰基葡糖胺-1-P或半乳糖-1-P的反应液。此后，对其施以小分子脱除和脱盐以获得其中非还原端被一种类型的糖改性的支链葡聚糖。与条件1至6类似地制备含有1毫升其中非还原端被一种类型的糖改性的支链葡聚糖以及10 mM葡萄糖醛酸-1-P、葡糖胺-1-P、半乳糖-1-P或甘露糖-1-P中的两种类型的2毫升反应液。此后，对其施以小分子脱除和脱盐。关于条件23，与条件1至6类似地制备5毫升含有110毫克制备例2的支链葡聚糖粉末、10 mM甘露糖-1-P、葡萄糖醛酸-1-P和葡糖胺-1-P的反应液。关于条件1至23，使所有样品发生酶促反应，此后施以GP酶蛋白质变性、小分子脱除和脱盐，用0.2μm过滤器过滤和冻干。所得各种支链葡聚糖用在实施例22至27中。

[表15]

表15

GlcA = 葡萄糖醛酸残基

GlcN = 葡糖胺残基

GlcNAc = N-乙酰基葡糖胺残基

Gal = 半乳糖残基

Man = 甘露糖残基。

(实施例22: 具有结合到非还原端上的各种糖之一的支链葡聚糖的树突细胞刺激活性)

将实施例21中制备的各种支链葡聚糖（1 mg/ml细胞液）添加到实施例20中制备的源自C3H/HeJ小鼠（雌性，7周大）的树突细胞中，并使这些在CO₂培养器中在37℃下反应48小时。收集该反应液的上清液，并通过ELISA法测定通过细胞刺激产生的IL-6。结果显示在表16和图12中。

关于具有结合到非还原端上的葡萄糖醛酸、N-乙酰基葡糖胺、半乳糖或甘露糖的所有支链葡聚糖，IL-6生成量比制备例2的支链葡聚糖提高。另一方面，关于具有结合到其上的葡糖胺的支链葡聚糖，IL-6生成量比制备例2的支链葡聚糖降低，并显示出抑制IL-6生成的趋势。

[表16]

表16: 生成条件

。

(实施例23: 其中N-乙酰基葡糖胺和各种其它糖结合到非还原端上的支链葡聚糖的树突细胞刺激活性)

将实施例19中制备的各种支链葡聚糖（1 mg/ml细胞液）添加到通过与实施例20相同的方法制备的树突细胞中，并使它们在CO₂培养器中在37℃下反应48小时。收集该反应液的上清液，并通过ELISA法测定通过细胞刺激产生的IL-6。结果显示在表17和图13中。

关于具有结合到非还原端上的N-乙酰基葡糖胺的支链葡聚糖，IL-6生成量比制备例2的支链葡聚糖提高。联合使用N-乙酰基葡糖胺和半乳糖或甘露糖，进一步提高IL-6生成量。具有结合到非还原端上的N-乙酰基葡糖胺的支链葡聚糖被确定为具有刺激树突细胞的活性，此外，通过另外使半乳糖或甘露糖同时与N-乙酰基葡糖胺结合，认识到该细胞刺激活性的协同效应。

[表17]

表17

。

(实施例24: 具有结合到非还原端上的半乳糖和其它各种糖的支链葡聚糖的树突细胞刺激活性)

类似于实施例21，研究其中同时结合半乳糖和其它糖的支链葡聚糖的IL-6生成量。结果显示在表18和图14中。关于具有结合到其上的半乳糖的支链葡聚糖，IL-6生成量比制备例2的支链葡聚糖大，通过结合半乳糖和葡萄糖醛酸、N-乙酰基葡糖胺或麦芽糖，进一步提高IL-6生成量。具有结合到非还原端上的半乳糖的支链葡聚糖被确定为具有刺激树突细胞的活性，此外，通过除半乳糖外另外结合葡萄糖醛酸、N-乙酰基葡糖胺或甘露糖，认识到该树突细胞刺激活性的协同效应。

[表18]

表18

。

(实施例25: 其中N-乙酰基葡糖胺和其它各种糖结合到非还原端上的支链葡聚糖的巨噬细胞刺激活性)

使用C3H/HeJ小鼠（雌性，7周大）腹腔细胞，将该细胞添加到实施例19中制备的各种支链葡聚糖（1 mg/ml细胞液）中以使它们反应48小时。收集该反应液的上清液，并通过ELISA法测定通过细胞刺激产生的IL-6。结果显示在表19和图15中。

关于具有结合到非还原端上的N-乙酰基葡糖胺的支链葡聚糖，IL-6生成量比制备例2的支链葡聚糖大，通过结合N-乙酰基葡糖胺和半乳糖或甘露糖，进一步提高IL-6生成量。具有结合到非还原端上的N-乙酰基葡糖胺的支链葡聚糖被确定为具有刺激巨噬细胞的活性，此外，通过另外使半乳糖或甘露糖结合到N-乙酰基葡糖胺上，认识到该细胞刺激活性的协同效应。

[表19]

表19

。

(实施例26: 其中半乳糖和其它各种糖结合到非还原端上的支链葡聚糖的巨噬细胞刺激活性)

类似于实施例23，研究同时结合半乳糖和其它糖的支链葡聚糖的IL-6生成量。结果显示在表20和图16中。在具有结合到其上的半乳糖的支链葡聚糖中，IL-6生成量比制备例2的支链葡聚糖大，通过结合半乳糖和葡萄糖醛酸、N-乙酰基葡糖胺或麦芽糖，进一步提高IL-6生成量。具有结合到非还原端上的半乳糖的支链葡聚糖被确定为具有刺激巨噬细胞的活性，此外，通过另外使葡萄糖醛酸、N-乙酰基葡糖胺或甘露糖结合到半乳糖上，认识到该细胞刺激活性的协同效应。

[表20]

表20

。

如上所述，已经使用本发明的优选实施方案例示本发明，但本发明不应被解释为限于这些实施方案。要理解的是，只应通过权利要求书解释本发明的范围。要理解的是，根据本发明的具体优选实施方案的描述，本领域技术人员可基于本发明的描述和公知技术常识实施等效范围。要理解的是，本说明书中引用的专利、专利申请和参考资料的内容应并入本文作为参考，就像该内容本身具体描述在本说明书中那样。

工业适用性

本发明的其中选自N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的至少一个残基经由α-1,4键结合到非还原端上的葡聚糖（非还原端改性葡聚糖）、其羟基改性产物及其还原端改性产物被认为在给予血液中时可蓄积到特定组织中。因此，它们可用于药效成分的组织靶向。由于本发明的非还原端改性葡聚糖、其羟基改性产物、其非还原端改性产物及其还原端改性产物具有刺激抗原呈递细胞，如树突细胞或巨噬细胞产生IL-6的活性（抗原呈递细胞刺激活性），它们可用于刺激抗原呈递细胞并可进一步用作疫苗佐剂。由于本发明的非还原端改性葡聚糖、其羟基改性产物、其非还原端改性产物及其还原端改性产物具有比未改性的葡聚糖长的延长的血液半衰期并在活体中最终完全降解并排泄，它们极其安全，因此可用作药效成分的改性材料、临床诊断剂、成像剂和DDS的纳米微粒载体。本发明的非还原端改性葡聚糖、其羟基改性产物及其还原端改性产物可广泛用于食品、化妆品和药物。

序列表自由文本

SEQ ID NO: 1: 源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶的碱基序列

SEQ ID NO: 2: 源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列

SEQ ID NO: 3: 源自马铃薯的α-葡聚糖磷酸化酶的碱基序列

SEQ ID NO: 4: 源自马铃薯的α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列

SEQ ID NO: 5: 编码源自Thermococcus zilligii AN1的α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列的碱基序列

SEQ ID NO: 6: 源自Thermococcus zilligii AN1的α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列。

                         序列表

 

<110>  EZAKI GLICO CO., LTD.

       

<120>  非还原端改性葡聚糖，其制备方法及其用途

 

<130>  EG038PCT

 

<150>  JP 2010-249087

<151>  2010-11-05

 

<160>  6    

 

<170>  PatentIn version 3.4

 

<210>  1

<211>  2079

<212>  DNA

<213>  超嗜热菌

 

 

<220>

<221>  CDS

<222>  (1)..(2079)

 

<400>  1

atg gaa gaa gaa aaa gta aaa gag gga ttg tgg gag tta gct tac aac       48

Met Glu Glu Glu Lys Val Lys Glu Gly Leu Trp Glu Leu Ala Tyr Asn        

1               5                   10                  15             

 

ctg tgg tgg acg tgg aat ccg ccg gct aag gaa tta ttc aga agc att       96

Leu Trp Trp Thr Trp Asn Pro Pro Ala Lys Glu Leu Phe Arg Ser Ile        

            20                  25                  30                 

 

gac ccg ctt ttg tgg aag gaa act aag gaa aac ccc att gag tta ttg      144

Asp Pro Leu Leu Trp Lys Glu Thr Lys Glu Asn Pro Ile Glu Leu Leu        

        35                  40                  45                     

 

agg aaa acc aaa ctc ctt gaa aac aag ctc aaa gac gaa gat ttt ata      192

Arg Lys Thr Lys Leu Leu Glu Asn Lys Leu Lys Asp Glu Asp Phe Ile        

    50                  55                  60                         

 

tct cac ttc aag tac gtt tat tcc ctt tac aaa acc tac atg aac agg      240

Ser His Phe Lys Tyr Val Tyr Ser Leu Tyr Lys Thr Tyr Met Asn Arg        

65                  70                  75                  80         

 

cat tcg aaa tac gag gat acg tat aag aag cct ata gtt ttc ctg tct      288

His Ser Lys Tyr Glu Asp Thr Tyr Lys Lys Pro Ile Val Phe Leu Ser        

                85                  90                  95             

 

ccc gag tac gga ctt cac cac aca cta ctt ata tac gcg ggg gga ctg      336

Pro Glu Tyr Gly Leu His His Thr Leu Leu Ile Tyr Ala Gly Gly Leu        

            100                 105                 110                

 

ggc ttt tta gca gga gat ata ctc aag gag agc agt gac ttg gga ttt      384

Gly Phe Leu Ala Gly Asp Ile Leu Lys Glu Ser Ser Asp Leu Gly Phe        

        115                 120                 125                    

 

ccg ctt ata ggt gtc ggg ttt atg tac cct cag ggc tac gta aag cag      432

Pro Leu Ile Gly Val Gly Phe Met Tyr Pro Gln Gly Tyr Val Lys Gln        

    130                 135                 140                        

 

agg ata agg gtt gac gga tgg cag gaa gac ctt gac gca caa aat caa      480

Arg Ile Arg Val Asp Gly Trp Gln Glu Asp Leu Asp Ala Gln Asn Gln        

145                 150                 155                 160        

 

aag gaa tta atg ccc gtt aaa aaa gtt ctg gac aaa gaa gga aaa tgg      528

Lys Glu Leu Met Pro Val Lys Lys Val Leu Asp Lys Glu Gly Lys Trp        

                165                 170                 175            

 

ctc aag tgc tac gtt tac gta agg gat gaa aag gtt tac ttt gga gtc      576

Leu Lys Cys Tyr Val Tyr Val Arg Asp Glu Lys Val Tyr Phe Gly Val        

            180                 185                 190                

 

tgg gaa gtt aac gtg gga aag aca aag ctc tac ctt ctt gac acg aac      624

Trp Glu Val Asn Val Gly Lys Thr Lys Leu Tyr Leu Leu Asp Thr Asn         

        195                 200                 205                    

 

gta gag gaa aat act ccc tgg aac agg gaa ata tcc tca aga ctc tac      672

Val Glu Glu Asn Thr Pro Trp Asn Arg Glu Ile Ser Ser Arg Leu Tyr        

    210                 215                 220                        

 

gtt ccg gac aaa gac ctg agg tta aga caa cag ata gtt ctt ggt ttt      720

Val Pro Asp Lys Asp Leu Arg Leu Arg Gln Gln Ile Val Leu Gly Phe        

225                 230                 235                 240         

 

ggc acc gta ata ctc ctt gaa aag ctg ggc att gat gca gga ggt ttt      768

Gly Thr Val Ile Leu Leu Glu Lys Leu Gly Ile Asp Ala Gly Gly Phe        

                245                 250                 255            

 

cac ata aac gaa gat tat ccc tcg ttc gtg ttc ctt gca gaa ata ttt      816

His Ile Asn Glu Asp Tyr Pro Ser Phe Val Phe Leu Ala Glu Ile Phe        

            260                 265                 270                

 

aaa ctt cta aaa aaa ggt ctg acc tgg gat aag gcg ata gaa gaa gta      864

Lys Leu Leu Lys Lys Gly Leu Thr Trp Asp Lys Ala Ile Glu Glu Val        

        275                 280                 285                    

 

aga aag att tct ctc ttt acc acg cac aca cca cta cgg gtt gcc gta      912

Arg Lys Ile Ser Leu Phe Thr Thr His Thr Pro Leu Arg Val Ala Val        

    290                 295                 300                        

 

aat act tat ccc ttc cac atg ata gag gaa cag ttt cta ttc gtt aag      960

Asn Thr Tyr Pro Phe His Met Ile Glu Glu Gln Phe Leu Phe Val Lys         

305                 310                 315                 320        

 

gat gtt tac gga ata gac gta aag aaa gtt ctg gaa ctc gga acg aat     1008

Asp Val Tyr Gly Ile Asp Val Lys Lys Val Leu Glu Leu Gly Thr Asn        

                325                 330                 335            

 

cct gaa gac cct tcg gag ggt ttt aac agt acg att atg tcc ctc aga     1056

Pro Glu Asp Pro Ser Glu Gly Phe Asn Ser Thr Ile Met Ser Leu Arg        

            340                 345                 350                 

 

ctc gca aag tac gta aac gca gtg agt aaa aga cat caa gaa gtt tca     1104

Leu Ala Lys Tyr Val Asn Ala Val Ser Lys Arg His Gln Glu Val Ser        

        355                 360                 365                    

 

agc aag atg tgg agt ttt tta ttt aaa gaa aag gag aat cca ata gat     1152

Ser Lys Met Trp Ser Phe Leu Phe Lys Glu Lys Glu Asn Pro Ile Asp        

    370                 375                 380                        

 

tac gta acg aac ggt gtt cac ttt ccc aca tgg att tgt tca gat ttg     1200

Tyr Val Thr Asn Gly Val His Phe Pro Thr Trp Ile Cys Ser Asp Leu        

385                 390                 395                 400        

 

aga aga ctg tac gag gag tat ttg gga gag aac ttt gtg gaa ctt cac     1248

Arg Arg Leu Tyr Glu Glu Tyr Leu Gly Glu Asn Phe Val Glu Leu His        

                405                 410                 415            

 

gac cac aag tct ctg tgg gaa tta ata aga gac ata ccc gac gaa gaa     1296

Asp His Lys Ser Leu Trp Glu Leu Ile Arg Asp Ile Pro Asp Glu Glu        

            420                 425                 430                

 

ctg tgg gaa tat cac ata aga aat aaa gaa aga ctt att gag cac ata     1344

Leu Trp Glu Tyr His Ile Arg Asn Lys Glu Arg Leu Ile Glu His Ile        

        435                 440                 445                    

 

aaa gac agg gca agg gaa agg tgg gtc aag gaa aaa gcg gat cct tca     1392

Lys Asp Arg Ala Arg Glu Arg Trp Val Lys Glu Lys Ala Asp Pro Ser        

    450                 455                 460                         

 

atc ctt atg gcc gaa ggt ctg ttc ctt gat tct gac gtt ctt acg gtc     1440

Ile Leu Met Ala Glu Gly Leu Phe Leu Asp Ser Asp Val Leu Thr Val        

465                 470                 475                 480        

 

ggt ttt gcg agg agg atg acc ggt tac aaa aga ccg gat ctt ata ttc     1488

Gly Phe Ala Arg Arg Met Thr Gly Tyr Lys Arg Pro Asp Leu Ile Phe        

                485                 490                 495            

 

acg gat gta gaa cgc tta aaa aag ata gtg aat gat tcg gaa aga cct     1536

Thr Asp Val Glu Arg Leu Lys Lys Ile Val Asn Asp Ser Glu Arg Pro        

            500                 505                 510                

 

gtt cag ata ata ttc gcg gga aag gct cat ccg gct gat atc gaa ggg     1584

Val Gln Ile Ile Phe Ala Gly Lys Ala His Pro Ala Asp Ile Glu Gly        

        515                 520                 525                    

 

aaa aag ata atc cag aga ata ttt aac ttt gcg aaa gat ccg gaa ttt     1632

Lys Lys Ile Ile Gln Arg Ile Phe Asn Phe Ala Lys Asp Pro Glu Phe        

    530                 535                 540                        

 

ggg gga aga ata gct ttc gtt gaa gat tac gac gaa ctc ctt gcc cat     1680

Gly Gly Arg Ile Ala Phe Val Glu Asp Tyr Asp Glu Leu Leu Ala His        

545                 550                 555                 560        

 

tac atg gtg agg ggt gtg gac gta tgg ttg aac aac cct ctt cct ccc     1728

Tyr Met Val Arg Gly Val Asp Val Trp Leu Asn Asn Pro Leu Pro Pro        

                565                 570                 575            

 

ctt gaa gcc tgc ggg aca agc ggt atg aaa gct tct atg aac gga gtg     1776

Leu Glu Ala Cys Gly Thr Ser Gly Met Lys Ala Ser Met Asn Gly Val        

            580                 585                 590                

 

ctt cac ctt tca ata ctt gac ggt tgg tgg att gag ggt tat aac gga     1824

Leu His Leu Ser Ile Leu Asp Gly Trp Trp Ile Glu Gly Tyr Asn Gly        

        595                 600                 605                    

 

aag aac ggt tgg gct ttc gga gat tac gaa gtt gaa gga gac agg aac     1872

Lys Asn Gly Trp Ala Phe Gly Asp Tyr Glu Val Glu Gly Asp Arg Asn        

    610                 615                 620                        

 

aga gcg gat gcg gag gcc att tac aac atc ctt gag aat gaa gta atc     1920

Arg Ala Asp Ala Glu Ala Ile Tyr Asn Ile Leu Glu Asn Glu Val Ile        

625                 630                 635                 640        

 

ccc ctt tat tac gaa agg gac gag agg gga gtg cca gtt aag tgg ata     1968

Pro Leu Tyr Tyr Glu Arg Asp Glu Arg Gly Val Pro Val Lys Trp Ile        

                645                 650                 655            

 

agt atg atg aag gaa gct ata aaa agc att acc cct aac ttt tgc tcc     2016

Ser Met Met Lys Glu Ala Ile Lys Ser Ile Thr Pro Asn Phe Cys Ser        

            660                 665                 670                

 

aga agg atg tta aaa gat tac ata aat aag ttc tat tca aaa att tta     2064

Arg Arg Met Leu Lys Asp Tyr Ile Asn Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Leu        

        675                 680                 685                     

 

aag gag gag gga tga                                                 2079

Lys Glu Glu Gly                                                        

    690                                                                

 

 

<210>  2

<211>  692

<212>  PRT

<213>  超嗜热菌

 

<400>  2

 

Met Glu Glu Glu Lys Val Lys Glu Gly Leu Trp Glu Leu Ala Tyr Asn

1               5                   10                  15     

 

 

Leu Trp Trp Thr Trp Asn Pro Pro Ala Lys Glu Leu Phe Arg Ser Ile

            20                  25                  30         

 

 

Asp Pro Leu Leu Trp Lys Glu Thr Lys Glu Asn Pro Ile Glu Leu Leu

        35                  40                  45             

 

 

Arg Lys Thr Lys Leu Leu Glu Asn Lys Leu Lys Asp Glu Asp Phe Ile

    50                  55                  60                 

 

 

Ser His Phe Lys Tyr Val Tyr Ser Leu Tyr Lys Thr Tyr Met Asn Arg

65                  70                  75                  80 

 

 

His Ser Lys Tyr Glu Asp Thr Tyr Lys Lys Pro Ile Val Phe Leu Ser

                85                  90                  95     

 

 

Pro Glu Tyr Gly Leu His His Thr Leu Leu Ile Tyr Ala Gly Gly Leu

            100                 105                 110        

 

 

Gly Phe Leu Ala Gly Asp Ile Leu Lys Glu Ser Ser Asp Leu Gly Phe

        115                 120                 125            

 

 

Pro Leu Ile Gly Val Gly Phe Met Tyr Pro Gln Gly Tyr Val Lys Gln

    130                 135                 140                

 

 

Arg Ile Arg Val Asp Gly Trp Gln Glu Asp Leu Asp Ala Gln Asn Gln

145                 150                 155                 160

 

 

Lys Glu Leu Met Pro Val Lys Lys Val Leu Asp Lys Glu Gly Lys Trp

                165                 170                 175    

 

 

Leu Lys Cys Tyr Val Tyr Val Arg Asp Glu Lys Val Tyr Phe Gly Val

            180                 185                 190        

 

 

Trp Glu Val Asn Val Gly Lys Thr Lys Leu Tyr Leu Leu Asp Thr Asn

        195                 200                 205            

 

 

Val Glu Glu Asn Thr Pro Trp Asn Arg Glu Ile Ser Ser Arg Leu Tyr

    210                 215                 220                

 

 

Val Pro Asp Lys Asp Leu Arg Leu Arg Gln Gln Ile Val Leu Gly Phe

225                 230                 235                 240

 

 

Gly Thr Val Ile Leu Leu Glu Lys Leu Gly Ile Asp Ala Gly Gly Phe

                245                 250                 255    

 

 

His Ile Asn Glu Asp Tyr Pro Ser Phe Val Phe Leu Ala Glu Ile Phe

            260                 265                 270        

 

 

Lys Leu Leu Lys Lys Gly Leu Thr Trp Asp Lys Ala Ile Glu Glu Val

        275                 280                 285            

 

 

Arg Lys Ile Ser Leu Phe Thr Thr His Thr Pro Leu Arg Val Ala Val

    290                 295                 300                

 

 

Asn Thr Tyr Pro Phe His Met Ile Glu Glu Gln Phe Leu Phe Val Lys

305                 310                 315                 320

 

 

Asp Val Tyr Gly Ile Asp Val Lys Lys Val Leu Glu Leu Gly Thr Asn

                325                 330                 335    

 

 

Pro Glu Asp Pro Ser Glu Gly Phe Asn Ser Thr Ile Met Ser Leu Arg

            340                 345                 350        

 

 

Leu Ala Lys Tyr Val Asn Ala Val Ser Lys Arg His Gln Glu Val Ser

        355                 360                 365             

 

 

Ser Lys Met Trp Ser Phe Leu Phe Lys Glu Lys Glu Asn Pro Ile Asp

    370                 375                 380                

 

 

Tyr Val Thr Asn Gly Val His Phe Pro Thr Trp Ile Cys Ser Asp Leu

385                 390                 395                 400

 

 

Arg Arg Leu Tyr Glu Glu Tyr Leu Gly Glu Asn Phe Val Glu Leu His

                405                 410                 415    

 

 

Asp His Lys Ser Leu Trp Glu Leu Ile Arg Asp Ile Pro Asp Glu Glu

            420                 425                 430        

 

 

Leu Trp Glu Tyr His Ile Arg Asn Lys Glu Arg Leu Ile Glu His Ile

        435                 440                 445            

 

 

Lys Asp Arg Ala Arg Glu Arg Trp Val Lys Glu Lys Ala Asp Pro Ser

    450                 455                 460                

 

 

Ile Leu Met Ala Glu Gly Leu Phe Leu Asp Ser Asp Val Leu Thr Val

465                 470                 475                 480

 

 

Gly Phe Ala Arg Arg Met Thr Gly Tyr Lys Arg Pro Asp Leu Ile Phe

                485                 490                 495    

 

 

Thr Asp Val Glu Arg Leu Lys Lys Ile Val Asn Asp Ser Glu Arg Pro

            500                 505                 510        

 

 

Val Gln Ile Ile Phe Ala Gly Lys Ala His Pro Ala Asp Ile Glu Gly

        515                 520                 525            

 

 

Lys Lys Ile Ile Gln Arg Ile Phe Asn Phe Ala Lys Asp Pro Glu Phe

    530                 535                 540                

 

 

Gly Gly Arg Ile Ala Phe Val Glu Asp Tyr Asp Glu Leu Leu Ala His

545                 550                 555                 560

 

 

Tyr Met Val Arg Gly Val Asp Val Trp Leu Asn Asn Pro Leu Pro Pro

                565                 570                 575    

 

 

Leu Glu Ala Cys Gly Thr Ser Gly Met Lys Ala Ser Met Asn Gly Val

            580                 585                 590        

 

 

Leu His Leu Ser Ile Leu Asp Gly Trp Trp Ile Glu Gly Tyr Asn Gly

        595                 600                 605            

 

 

Lys Asn Gly Trp Ala Phe Gly Asp Tyr Glu Val Glu Gly Asp Arg Asn

    610                 615                 620                

 

 

Arg Ala Asp Ala Glu Ala Ile Tyr Asn Ile Leu Glu Asn Glu Val Ile

625                 630                 635                 640

 

 

Pro Leu Tyr Tyr Glu Arg Asp Glu Arg Gly Val Pro Val Lys Trp Ile

                645                 650                 655    

 

 

Ser Met Met Lys Glu Ala Ile Lys Ser Ile Thr Pro Asn Phe Cys Ser

            660                 665                 670        

 

 

Arg Arg Met Leu Lys Asp Tyr Ile Asn Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Leu

        675                 680                 685            

 

 

Lys Glu Glu Gly

    690        

 

 

<210>  3

<211>  2793

<212>  DNA

<213>  马铃薯

 

 

<220>

<221>  CDS

<222>  (1)..(2790)

 

<220>

<221>  信号肽

<222>  (1)..(42)

 

<220>

<221>  成熟肽

<222>  (43)..(2790)

 

<400>  3

atg gct agc atg act ggt gga cag caa atg ggt cgg atc ctc acc ttg       48

Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Ile Leu Thr Leu        

                -10                 -5              -1  1              

 

agt gag aaa att cac cat ccc att act gaa caa ggt ggt gag agc gac       96

Ser Glu Lys Ile His His Pro Ile Thr Glu Gln Gly Gly Glu Ser Asp        

        5                   10                  15                     

 

ctg agt tct ttt gct cct gat gcc gca tct att acc tca agt atc aaa      144

Leu Ser Ser Phe Ala Pro Asp Ala Ala Ser Ile Thr Ser Ser Ile Lys        

    20                  25                  30                          

 

tac cat gca gaa ttc aca cct gta ttc tct cct gaa agg ttt gag ctc      192

Tyr His Ala Glu Phe Thr Pro Val Phe Ser Pro Glu Arg Phe Glu Leu        

35                  40                  45                  50         

 

cct aag gca ttc ttt gca aca gct caa agt gtt cgt gat tcg ctc ctt      240

Pro Lys Ala Phe Phe Ala Thr Ala Gln Ser Val Arg Asp Ser Leu Leu        

                55                  60                  65             

 

att aat tgg aat gct acg tat gat att tat gaa aag ctg aac atg aag      288

Ile Asn Trp Asn Ala Thr Tyr Asp Ile Tyr Glu Lys Leu Asn Met Lys        

            70                  75                  80                 

 

caa gcg tac tat cta tcc atg gaa ttt ctg cag ggt aga gca ttg tta      336

Gln Ala Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Phe Leu Gln Gly Arg Ala Leu Leu        

        85                  90                  95                     

 

aat gca att ggt aat ctg gag ctt act ggt gca ttt gcg gaa gct ttg      384

Asn Ala Ile Gly Asn Leu Glu Leu Thr Gly Ala Phe Ala Glu Ala Leu        

    100                 105                 110                        

 

aaa aac ctt ggc cac aat cta gaa aat gtg gct tct cag gaa cca gat      432

Lys Asn Leu Gly His Asn Leu Glu Asn Val Ala Ser Gln Glu Pro Asp        

115                 120                 125                 130        

 

gct gct ctt gga aat ggg ggt ttg gga cgg ctt gct tcc tgt ttt ctg      480

Ala Ala Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly Arg Leu Ala Ser Cys Phe Leu        

                135                 140                 145            

 

gac tct ttg gca aca cta aac tac cca gca tgg ggc tat gga ctt agg      528

Asp Ser Leu Ala Thr Leu Asn Tyr Pro Ala Trp Gly Tyr Gly Leu Arg        

            150                 155                 160                

 

tac aag tat ggt tta ttt aag caa cgg att aca aaa gat ggt cag gag      576

Tyr Lys Tyr Gly Leu Phe Lys Gln Arg Ile Thr Lys Asp Gly Gln Glu        

        165                 170                 175                    

 

gag gtg gct gaa gat tgg ctt gaa att ggc agt cca tgg gaa gtt gtg      624

Glu Val Ala Glu Asp Trp Leu Glu Ile Gly Ser Pro Trp Glu Val Val        

    180                 185                 190                        

 

agg aat gat gtt tca tat cct atc aaa ttc tat gga aaa gtc tct aca      672

Arg Asn Asp Val Ser Tyr Pro Ile Lys Phe Tyr Gly Lys Val Ser Thr        

195                 200                 205                 210        

 

gga tca gat gga aag agg tat tgg att ggt gga gag gat ata aag gca      720

Gly Ser Asp Gly Lys Arg Tyr Trp Ile Gly Gly Glu Asp Ile Lys Ala        

                215                 220                 225            

 

gtt gcg tat gat gtt ccc ata cca ggg tat aag acc aga acc aca atc      768

Val Ala Tyr Asp Val Pro Ile Pro Gly Tyr Lys Thr Arg Thr Thr Ile        

            230                 235                 240                

 

agc ctt cga ctg tgg tct aca cag gtt cca tca gcg gat ttt gat tta      816

Ser Leu Arg Leu Trp Ser Thr Gln Val Pro Ser Ala Asp Phe Asp Leu        

        245                 250                 255                    

 

tct gct ttc aat gct gga gag cac acc aaa gca tgt gaa gcc caa gca      864

Ser Ala Phe Asn Ala Gly Glu His Thr Lys Ala Cys Glu Ala Gln Ala        

    260                 265                 270                        

 

aac gct gag aag ata tgt tac ata ctc tac cct ggg gat gaa tca gag      912

Asn Ala Glu Lys Ile Cys Tyr Ile Leu Tyr Pro Gly Asp Glu Ser Glu        

275                 280                 285                 290        

 

gag gga aag atc ctt cgg ttg aag caa caa tat acc tta tgc tcg gct      960

Glu Gly Lys Ile Leu Arg Leu Lys Gln Gln Tyr Thr Leu Cys Ser Ala        

                295                 300                 305            

 

tct ctc caa gat att att tct cga ttt gag agg aga tca ggt gat cgt     1008

Ser Leu Gln Asp Ile Ile Ser Arg Phe Glu Arg Arg Ser Gly Asp Arg        

            310                 315                 320                

 

att aag tgg gaa gag ttt cct gaa aaa gtt gct gtg cag atg aat gac     1056

Ile Lys Trp Glu Glu Phe Pro Glu Lys Val Ala Val Gln Met Asn Asp        

        325                 330                 335                    

 

act cac cct aca ctt tgt atc cct gag ctg atg aga ata ttg ata gat     1104

Thr His Pro Thr Leu Cys Ile Pro Glu Leu Met Arg Ile Leu Ile Asp        

    340                 345                 350                        

 

ctg aag ggc ttg aat tgg aat gaa gct tgg aat att act caa aga act     1152

Leu Lys Gly Leu Asn Trp Asn Glu Ala Trp Asn Ile Thr Gln Arg Thr        

355                 360                 365                 370        

 

gtg gcc tac aca aac cat act gtt ttg cct gag gca ctg gag aaa tgg     1200

Val Ala Tyr Thr Asn His Thr Val Leu Pro Glu Ala Leu Glu Lys Trp        

                375                 380                 385            

 

agt tat gaa ttg atg cag aaa ctc ctt ccc aga cat gtc gaa atc att     1248

Ser Tyr Glu Leu Met Gln Lys Leu Leu Pro Arg His Val Glu Ile Ile        

            390                 395                 400                

 

gag gcg att gac gag gag ctg gta cat gaa att gta tta aaa tat ggt     1296

Glu Ala Ile Asp Glu Glu Leu Val His Glu Ile Val Leu Lys Tyr Gly        

        405                 410                 415                    

 

tca atg gat ctg aac aaa ttg gag gaa aag ttg act aca atg aga atc     1344

Ser Met Asp Leu Asn Lys Leu Glu Glu Lys Leu Thr Thr Met Arg Ile        

    420                 425                 430                        

 

tta gaa aat ttt gat ctt ccc agt tct gtt gct gaa tta ttt att aag     1392

Leu Glu Asn Phe Asp Leu Pro Ser Ser Val Ala Glu Leu Phe Ile Lys        

435                 440                 445                 450        

 

cct gaa atc tca gtt gat gat gat act gaa aca gta gaa gtc cat gac     1440

Pro Glu Ile Ser Val Asp Asp Asp Thr Glu Thr Val Glu Val His Asp        

                455                 460                 465            

 

aaa gtt gaa gct tcc gat aaa gtt gtg act aat gat gaa gat gac act     1488

Lys Val Glu Ala Ser Asp Lys Val Val Thr Asn Asp Glu Asp Asp Thr        

            470                 475                 480                

 

ggt aag aaa act agt gtg aag ata gaa gca gct gca gaa aaa gac att     1536

Gly Lys Lys Thr Ser Val Lys Ile Glu Ala Ala Ala Glu Lys Asp Ile        

        485                 490                 495                    

 

gac aag aaa act ccc gtg agt ccg gaa cca gct gtt ata cca cct aag     1584

Asp Lys Lys Thr Pro Val Ser Pro Glu Pro Ala Val Ile Pro Pro Lys        

    500                 505                 510                        

 

aag gta cgc atg gcc aac ttg tgt gtt gtg ggc ggc cat gct gtt aat     1632

Lys Val Arg Met Ala Asn Leu Cys Val Val Gly Gly His Ala Val Asn        

515                 520                 525                 530        

 

gga gtt gct gag atc cat agt gaa att gtg aag gag gag gtt ttc aat     1680

Gly Val Ala Glu Ile His Ser Glu Ile Val Lys Glu Glu Val Phe Asn        

                535                 540                 545            

 

gac ttc tat gag ctc tgg ccg gaa aag ttc caa aac aaa aca aat gga     1728

Asp Phe Tyr Glu Leu Trp Pro Glu Lys Phe Gln Asn Lys Thr Asn Gly        

            550                 555                 560                

 

gtg act cca aga aga tgg att cgt ttc tgc aat cct cct ctt agt gcc     1776

Val Thr Pro Arg Arg Trp Ile Arg Phe Cys Asn Pro Pro Leu Ser Ala        

        565                 570                 575                    

 

atc ata act aag tgg act ggt aca gag gat tgg gtc ctg aaa act gaa     1824

Ile Ile Thr Lys Trp Thr Gly Thr Glu Asp Trp Val Leu Lys Thr Glu        

    580                 585                 590                        

 

aag ttg gca gaa ttg cag aag ttt gct gat aat gaa gat ctt caa aat     1872

Lys Leu Ala Glu Leu Gln Lys Phe Ala Asp Asn Glu Asp Leu Gln Asn        

595                 600                 605                 610        

 

gag tgg agg gaa gca aaa agg agc aac aag att aaa gtt gtc tcc ttt     1920

Glu Trp Arg Glu Ala Lys Arg Ser Asn Lys Ile Lys Val Val Ser Phe        

                615                 620                 625            

 

ctc aaa gaa aag aca ggg tat tct gtt gtc cca gat gca atg ttt gat     1968

Leu Lys Glu Lys Thr Gly Tyr Ser Val Val Pro Asp Ala Met Phe Asp        

            630                 635                 640                

 

att cag gta aaa cgc att cat gag tac aag cga caa ctg tta aat atc     2016

Ile Gln Val Lys Arg Ile His Glu Tyr Lys Arg Gln Leu Leu Asn Ile        

        645                 650                 655                    

 

ttc ggc atc gtt tat cgg tat aag aag atg aaa gaa atg aca gct gca     2064

Phe Gly Ile Val Tyr Arg Tyr Lys Lys Met Lys Glu Met Thr Ala Ala        

    660                 665                 670                        

 

gaa aga aag act aac ttc gtt cct cga gta tgc ata ttt ggg gga aaa     2112

Glu Arg Lys Thr Asn Phe Val Pro Arg Val Cys Ile Phe Gly Gly Lys         

675                 680                 685                 690        

 

gct ttt gcc aca tat gtg caa gcc aag agg att gta aaa ttt atc aca     2160

Ala Phe Ala Thr Tyr Val Gln Ala Lys Arg Ile Val Lys Phe Ile Thr        

                695                 700                 705            

 

gat gtt ggt gct act ata aat cat gat cca gaa atc ggt gat ctg ttg     2208

Asp Val Gly Ala Thr Ile Asn His Asp Pro Glu Ile Gly Asp Leu Leu        

            710                 715                 720                 

 

aag gta gtc ttt gtg cca gat tac aat gtc agt gtt gct gaa ttg cta     2256

Lys Val Val Phe Val Pro Asp Tyr Asn Val Ser Val Ala Glu Leu Leu        

        725                 730                 735                    

 

att cct gct agc gat cta tca gaa cat atc agt acg gct gga atg gag     2304

Ile Pro Ala Ser Asp Leu Ser Glu His Ile Ser Thr Ala Gly Met Glu        

    740                 745                 750                        

 

gcc agt gga acc agt aat atg aag ttt gca atg aat ggt tgt atc caa     2352

Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met Lys Phe Ala Met Asn Gly Cys Ile Gln        

755                 760                 765                 770        

 

att ggt aca ttg gat ggc gct aat gtt gaa ata agg gaa gag gtt gga     2400

Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val Glu Ile Arg Glu Glu Val Gly        

                775                 780                 785            

 

gaa gaa aac ttc ttt ctc ttt ggt gct caa gct cat gaa att gca ggg     2448

Glu Glu Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala Gln Ala His Glu Ile Ala Gly         

            790                 795                 800                

 

ctt aga aaa gaa aga gct gac gga aag ttt gta cct gat gaa cgt ttt     2496

Leu Arg Lys Glu Arg Ala Asp Gly Lys Phe Val Pro Asp Glu Arg Phe        

        805                 810                 815                    

 

gaa gag gtg aag gaa ttt gtt aga agc ggt gct ttt ggc tct tat aac     2544

Glu Glu Val Lys Glu Phe Val Arg Ser Gly Ala Phe Gly Ser Tyr Asn        

    820                 825                 830                         

 

tat gat gac cta att gga tcg ttg gaa gga aat gaa ggt ttt ggc cgt     2592

Tyr Asp Asp Leu Ile Gly Ser Leu Glu Gly Asn Glu Gly Phe Gly Arg        

835                 840                 845                 850        

 

gct gac tat ttc ctt gtg ggc aag gac ttc ccc agt tac ata gaa tgc     2640

Ala Asp Tyr Phe Leu Val Gly Lys Asp Phe Pro Ser Tyr Ile Glu Cys        

                855                 860                 865            

 

caa gag aaa gtt gat gag gca tat cgc gac cag aaa agg tgg aca acg     2688

Gln Glu Lys Val Asp Glu Ala Tyr Arg Asp Gln Lys Arg Trp Thr Thr        

            870                 875                 880                

 

atg tca atc ttg aat aca gcg gga tcg tac aag ttc agc agt gac aga     2736

Met Ser Ile Leu Asn Thr Ala Gly Ser Tyr Lys Phe Ser Ser Asp Arg        

        885                 890                 895                    

 

aca atc cat gaa tat gcc aaa gac att tgg aac att gaa gct gtg gaa     2784

Thr Ile His Glu Tyr Ala Lys Asp Ile Trp Asn Ile Glu Ala Val Glu        

    900                 905                 910                        

 

ata gca taa                                                         2793

Ile Ala                                                                

915                                                                     

 

 

<210>  4

<211>  930

<212>  PRT

<213>  马铃薯

 

<400>  4

 

Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Ile Leu Thr Leu

                -10                 -5              -1  1      

 

 

Ser Glu Lys Ile His His Pro Ile Thr Glu Gln Gly Gly Glu Ser Asp

        5                   10                  15             

 

 

Leu Ser Ser Phe Ala Pro Asp Ala Ala Ser Ile Thr Ser Ser Ile Lys

    20                  25                  30                 

 

 

Tyr His Ala Glu Phe Thr Pro Val Phe Ser Pro Glu Arg Phe Glu Leu

35                  40                  45                  50 

 

 

Pro Lys Ala Phe Phe Ala Thr Ala Gln Ser Val Arg Asp Ser Leu Leu

                55                  60                  65     

 

 

Ile Asn Trp Asn Ala Thr Tyr Asp Ile Tyr Glu Lys Leu Asn Met Lys

            70                  75                  80         

 

 

Gln Ala Tyr Tyr Leu Ser Met Glu Phe Leu Gln Gly Arg Ala Leu Leu

        85                  90                  95             

 

 

Asn Ala Ile Gly Asn Leu Glu Leu Thr Gly Ala Phe Ala Glu Ala Leu

    100                 105                 110                

 

 

Lys Asn Leu Gly His Asn Leu Glu Asn Val Ala Ser Gln Glu Pro Asp

115                 120                 125                 130

 

 

Ala Ala Leu Gly Asn Gly Gly Leu Gly Arg Leu Ala Ser Cys Phe Leu

                135                 140                 145    

 

 

Asp Ser Leu Ala Thr Leu Asn Tyr Pro Ala Trp Gly Tyr Gly Leu Arg

            150                 155                 160        

 

 

Tyr Lys Tyr Gly Leu Phe Lys Gln Arg Ile Thr Lys Asp Gly Gln Glu

        165                 170                 175            

 

 

Glu Val Ala Glu Asp Trp Leu Glu Ile Gly Ser Pro Trp Glu Val Val

    180                 185                 190                

 

 

Arg Asn Asp Val Ser Tyr Pro Ile Lys Phe Tyr Gly Lys Val Ser Thr

195                 200                 205                 210

 

 

Gly Ser Asp Gly Lys Arg Tyr Trp Ile Gly Gly Glu Asp Ile Lys Ala

                215                 220                 225    

 

 

Val Ala Tyr Asp Val Pro Ile Pro Gly Tyr Lys Thr Arg Thr Thr Ile

            230                 235                 240        

 

 

Ser Leu Arg Leu Trp Ser Thr Gln Val Pro Ser Ala Asp Phe Asp Leu

        245                 250                 255            

 

 

Ser Ala Phe Asn Ala Gly Glu His Thr Lys Ala Cys Glu Ala Gln Ala

    260                 265                 270                

 

 

Asn Ala Glu Lys Ile Cys Tyr Ile Leu Tyr Pro Gly Asp Glu Ser Glu

275                 280                 285                 290

 

 

Glu Gly Lys Ile Leu Arg Leu Lys Gln Gln Tyr Thr Leu Cys Ser Ala

                295                 300                 305    

 

 

Ser Leu Gln Asp Ile Ile Ser Arg Phe Glu Arg Arg Ser Gly Asp Arg

            310                 315                 320        

 

 

Ile Lys Trp Glu Glu Phe Pro Glu Lys Val Ala Val Gln Met Asn Asp

        325                 330                 335            

 

 

Thr His Pro Thr Leu Cys Ile Pro Glu Leu Met Arg Ile Leu Ile Asp

    340                 345                 350                

 

 

Leu Lys Gly Leu Asn Trp Asn Glu Ala Trp Asn Ile Thr Gln Arg Thr

355                 360                 365                 370

 

 

Val Ala Tyr Thr Asn His Thr Val Leu Pro Glu Ala Leu Glu Lys Trp

                375                 380                 385    

 

 

Ser Tyr Glu Leu Met Gln Lys Leu Leu Pro Arg His Val Glu Ile Ile

            390                 395                 400        

 

 

Glu Ala Ile Asp Glu Glu Leu Val His Glu Ile Val Leu Lys Tyr Gly

        405                 410                 415            

 

 

Ser Met Asp Leu Asn Lys Leu Glu Glu Lys Leu Thr Thr Met Arg Ile

    420                 425                 430                

 

 

Leu Glu Asn Phe Asp Leu Pro Ser Ser Val Ala Glu Leu Phe Ile Lys

435                 440                 445                 450

 

 

Pro Glu Ile Ser Val Asp Asp Asp Thr Glu Thr Val Glu Val His Asp

                455                 460                 465    

 

 

Lys Val Glu Ala Ser Asp Lys Val Val Thr Asn Asp Glu Asp Asp Thr

            470                 475                 480        

 

 

Gly Lys Lys Thr Ser Val Lys Ile Glu Ala Ala Ala Glu Lys Asp Ile

        485                 490                 495            

 

 

Asp Lys Lys Thr Pro Val Ser Pro Glu Pro Ala Val Ile Pro Pro Lys

    500                 505                 510                

 

 

Lys Val Arg Met Ala Asn Leu Cys Val Val Gly Gly His Ala Val Asn

515                 520                 525                 530

 

 

Gly Val Ala Glu Ile His Ser Glu Ile Val Lys Glu Glu Val Phe Asn

                535                 540                 545    

 

 

Asp Phe Tyr Glu Leu Trp Pro Glu Lys Phe Gln Asn Lys Thr Asn Gly

            550                 555                 560        

 

 

Val Thr Pro Arg Arg Trp Ile Arg Phe Cys Asn Pro Pro Leu Ser Ala

        565                 570                 575            

 

 

Ile Ile Thr Lys Trp Thr Gly Thr Glu Asp Trp Val Leu Lys Thr Glu

    580                 585                 590                

 

 

Lys Leu Ala Glu Leu Gln Lys Phe Ala Asp Asn Glu Asp Leu Gln Asn

595                 600                 605                 610

 

 

Glu Trp Arg Glu Ala Lys Arg Ser Asn Lys Ile Lys Val Val Ser Phe

                615                 620                 625     

 

 

Leu Lys Glu Lys Thr Gly Tyr Ser Val Val Pro Asp Ala Met Phe Asp

            630                 635                 640        

 

 

Ile Gln Val Lys Arg Ile His Glu Tyr Lys Arg Gln Leu Leu Asn Ile

        645                 650                 655             

 

 

Phe Gly Ile Val Tyr Arg Tyr Lys Lys Met Lys Glu Met Thr Ala Ala

    660                 665                 670                

 

 

Glu Arg Lys Thr Asn Phe Val Pro Arg Val Cys Ile Phe Gly Gly Lys

675                 680                 685                 690

 

 

Ala Phe Ala Thr Tyr Val Gln Ala Lys Arg Ile Val Lys Phe Ile Thr

                695                 700                 705    

 

 

Asp Val Gly Ala Thr Ile Asn His Asp Pro Glu Ile Gly Asp Leu Leu

            710                 715                 720        

 

 

Lys Val Val Phe Val Pro Asp Tyr Asn Val Ser Val Ala Glu Leu Leu

        725                 730                 735            

 

 

Ile Pro Ala Ser Asp Leu Ser Glu His Ile Ser Thr Ala Gly Met Glu

    740                 745                 750                

 

 

Ala Ser Gly Thr Ser Asn Met Lys Phe Ala Met Asn Gly Cys Ile Gln

755                 760                 765                 770

 

 

Ile Gly Thr Leu Asp Gly Ala Asn Val Glu Ile Arg Glu Glu Val Gly

                775                 780                 785    

 

 

Glu Glu Asn Phe Phe Leu Phe Gly Ala Gln Ala His Glu Ile Ala Gly

            790                 795                 800        

 

 

Leu Arg Lys Glu Arg Ala Asp Gly Lys Phe Val Pro Asp Glu Arg Phe

        805                 810                 815            

 

 

Glu Glu Val Lys Glu Phe Val Arg Ser Gly Ala Phe Gly Ser Tyr Asn

    820                 825                 830                

 

 

Tyr Asp Asp Leu Ile Gly Ser Leu Glu Gly Asn Glu Gly Phe Gly Arg

835                 840                 845                 850

 

 

Ala Asp Tyr Phe Leu Val Gly Lys Asp Phe Pro Ser Tyr Ile Glu Cys

                855                 860                 865    

 

 

Gln Glu Lys Val Asp Glu Ala Tyr Arg Asp Gln Lys Arg Trp Thr Thr

            870                 875                 880        

 

 

Met Ser Ile Leu Asn Thr Ala Gly Ser Tyr Lys Phe Ser Ser Asp Arg

        885                 890                 895            

 

 

Thr Ile His Glu Tyr Ala Lys Asp Ile Trp Asn Ile Glu Ala Val Glu

    900                 905                 910                

 

 

Ile Ala

915    

 

 

<210>  5

<211>  2151

<212>  DNA

<213>  Thermococcus zilligii

 

 

<220>

<221>  CDS

<222>  (1)..(2151)

 

<400>  5

atg gcg gac gtt tcc cac aca gtt gag aat tta ata agg gcg aag ctc       48

Met Ala Asp Val Ser His Thr Val Glu Asn Leu Ile Arg Ala Lys Leu        

1               5                   10                  15             

 

ccc tac ccg ctg gag aat ctc gca gaa ctg gcc tat aac tac tgg tgg       96

Pro Tyr Pro Leu Glu Asn Leu Ala Glu Leu Ala Tyr Asn Tyr Trp Trp        

            20                  25                  30                 

 

agc tgg aac aga cgt gcc acc cgg ctc tgg gag tac ata gac tcc gaa      144

Ser Trp Asn Arg Arg Ala Thr Arg Leu Trp Glu Tyr Ile Asp Ser Glu        

        35                  40                  45                     

 

cac tgg cgt gag tac aag aac ccg gtc aag ctc ctt ctt gac acg ccc      192

His Trp Arg Glu Tyr Lys Asn Pro Val Lys Leu Leu Leu Asp Thr Pro        

    50                  55                  60                         

 

gaa gag agg ttc tgg gag ctc ctc aag gat gac gac ttc atg aac ctc      240

Glu Glu Arg Phe Trp Glu Leu Leu Lys Asp Asp Asp Phe Met Asn Leu        

65                  70                  75                  80         

 

tac gag ctc gtt atg gac cag ttt acc gca tac atg aac ccg aaa tca      288

Tyr Glu Leu Val Met Asp Gln Phe Thr Ala Tyr Met Asn Pro Lys Ser        

                85                  90                  95             

 

acg tgg ttc tcg acc aac tac ccc aaa tgg gac aaa ccg ata gtc tat      336

Thr Trp Phe Ser Thr Asn Tyr Pro Lys Trp Asp Lys Pro Ile Val Tyr        

            100                 105                 110                

 

ctc tgc atg gag tac ggc ata agc aag agc ctc ccg att tac tcc ggt      384

Leu Cys Met Glu Tyr Gly Ile Ser Lys Ser Leu Pro Ile Tyr Ser Gly        

        115                 120                 125                    

 

ggc ctc gga atc ctc gcc ggg gat cac ctc aaa acc gcg agt gac ctc      432

Gly Leu Gly Ile Leu Ala Gly Asp His Leu Lys Thr Ala Ser Asp Leu        

    130                 135                 140                        

 

ggc ctt ccc ttc ata gct ata ggc ctc ctc tac aag cac ggc tac ttc      480

Gly Leu Pro Phe Ile Ala Ile Gly Leu Leu Tyr Lys His Gly Tyr Phe        

145                 150                 155                 160        

 

agg cag gag ata gac agg gac gga agg cag agg gag ata ttc ccg gaa      528

Arg Gln Glu Ile Asp Arg Asp Gly Arg Gln Arg Glu Ile Phe Pro Glu        

                165                 170                 175            

 

tac agg ccc gag gaa atg ccg ata aag cct gtt cta agc aaa gac gga      576

Tyr Arg Pro Glu Glu Met Pro Ile Lys Pro Val Leu Ser Lys Asp Gly        

            180                 185                 190                

 

aaa ccc cta ctc gtt gag gtc ccc att gaa aac agg atc gtc tac gcg      624

Lys Pro Leu Leu Val Glu Val Pro Ile Glu Asn Arg Ile Val Tyr Ala        

        195                 200                 205                    

 

agg gcc ttt gag gtc agc gtc ggc atg gcc aag ctc tac ctc ctt gac      672

Arg Ala Phe Glu Val Ser Val Gly Met Ala Lys Leu Tyr Leu Leu Asp        

    210                 215                 220                        

 

aca gat gtg ccc gag aac agc ccg gag gat agg gcg atc tgc gac tac      720

Thr Asp Val Pro Glu Asn Ser Pro Glu Asp Arg Ala Ile Cys Asp Tyr        

225                 230                 235                 240        

 

ctc tac aac gcc gag atg gac aag aga ata aaa cag gag atc ctc ctc      768

Leu Tyr Asn Ala Glu Met Asp Lys Arg Ile Lys Gln Glu Ile Leu Leu        

                245                 250                 255            

 

gga ata ggc gga atg aga ctg ctc cag gcc ctc ggc atc gag ccc ggt      816

Gly Ile Gly Gly Met Arg Leu Leu Gln Ala Leu Gly Ile Glu Pro Gly        

            260                 265                 270                

 

gtg gtt cac ctc aac gag ggg cat ccc gcc ttt gcc aac ctc cag aga      864

Val Val His Leu Asn Glu Gly His Pro Ala Phe Ala Asn Leu Gln Arg        

        275                 280                 285                    

 

ata gcc tgg tac atg gaa aaa ggc ctc aca ttc acg gaa gct ttg agc      912

Ile Ala Trp Tyr Met Glu Lys Gly Leu Thr Phe Thr Glu Ala Leu Ser        

    290                 295                 300                        

 

atc gtc agg gga acc acg gtt ttc acc acc cac acg ccg gtt cct gca      960

Ile Val Arg Gly Thr Thr Val Phe Thr Thr His Thr Pro Val Pro Ala        

305                 310                 315                 320        

 

ggc cac gac agg ttc ccg atc gcg gaa gtt agg aag agg ctt tca aaa     1008

Gly His Asp Arg Phe Pro Ile Ala Glu Val Arg Lys Arg Leu Ser Lys        

                325                 330                 335            

 

ttc ctc gag gga agg gag gag cta ctc gaa ctc ggc cgc gag ggc gac     1056

Phe Leu Glu Gly Arg Glu Glu Leu Leu Glu Leu Gly Arg Glu Gly Asp        

            340                 345                 350                

 

cag atc aac atg acc ctg ctt gca ata aga act tcg agc tac gtc aac     1104

Gln Ile Asn Met Thr Leu Leu Ala Ile Arg Thr Ser Ser Tyr Val Asn        

        355                 360                 365                    

 

ggc gta agc cag ctc cac gcg gag gta agc aag cgc atg tgg aaa gac     1152

Gly Val Ser Gln Leu His Ala Glu Val Ser Lys Arg Met Trp Lys Asp        

    370                 375                 380                        

 

ctc tgg ccc gga gtt ccc ctc aac gag atc cct ata gag ggc atc aca     1200

Leu Trp Pro Gly Val Pro Leu Asn Glu Ile Pro Ile Glu Gly Ile Thr         

385                 390                 395                 400        

 

aac ggc gtc cac aca atg acg tgg gtc cac gac gag atg agg aag ctc     1248

Asn Gly Val His Thr Met Thr Trp Val His Asp Glu Met Arg Lys Leu        

                405                 410                 415            

 

ttc gac cgc tac atc ggc aag gtc tgg agg gag cac acc aac ata gag     1296

Phe Asp Arg Tyr Ile Gly Lys Val Trp Arg Glu His Thr Asn Ile Glu        

            420                 425                 430                 

 

ggc atc tgg tac gcc gtg gaa agg atc ccg gat gaa gag ctc tgg gga     1344

Gly Ile Trp Tyr Ala Val Glu Arg Ile Pro Asp Glu Glu Leu Trp Gly        

        435                 440                 445                    

 

gcc cac ctc gag gcc aag aga cag ctc ata gag ttc ctc agg gag aag     1392

Ala His Leu Glu Ala Lys Arg Gln Leu Ile Glu Phe Leu Arg Glu Lys        

    450                 455                 460                        

 

aca atg gag agg aac agg agg ctc gga acc gat gac ccg ata ccg gag     1440

Thr Met Glu Arg Asn Arg Arg Leu Gly Thr Asp Asp Pro Ile Pro Glu        

465                 470                 475                 480        

 

ata gac gag aac gcc ctc ata atc ggc ttt gcc aga cgc ttt gcg acc     1488

Ile Asp Glu Asn Ala Leu Ile Ile Gly Phe Ala Arg Arg Phe Ala Thr        

                485                 490                 495            

 

tat aag agg gca act ctc atc ctg agc gac ctt gag agg ctg aag aaa     1536

Tyr Lys Arg Ala Thr Leu Ile Leu Ser Asp Leu Glu Arg Leu Lys Lys         

            500                 505                 510                

 

atc ctc aac aac cca gaa agg ccg gtt tac ata gtc ttc ggc ggg aag     1584

Ile Leu Asn Asn Pro Glu Arg Pro Val Tyr Ile Val Phe Gly Gly Lys        

        515                 520                 525                    

 

gcc cat ccg cgc gac gag gct ggg aag gag ttc ctg agg agg gtt tac     1632

Ala His Pro Arg Asp Glu Ala Gly Lys Glu Phe Leu Arg Arg Val Tyr        

    530                 535                 540                         

 

gag gtc agc cag atg ccg gag ttc agg ggc aag ata ttc gtc ctc gag     1680

Glu Val Ser Gln Met Pro Glu Phe Arg Gly Lys Ile Phe Val Leu Glu        

545                 550                 555                 560        

 

aac tac gac atg ggg agc gcg agg ctc atg gtc gct gga gtc gac gtc     1728

Asn Tyr Asp Met Gly Ser Ala Arg Leu Met Val Ala Gly Val Asp Val        

                565                 570                 575            

 

tgg ctc aac aac ccg cgc aga ccg ctt gaa gca agc ggg acg agc ggc     1776

Trp Leu Asn Asn Pro Arg Arg Pro Leu Glu Ala Ser Gly Thr Ser Gly        

            580                 585                 590                

 

atg aag gcc ggc ctc aac ggt gtc ctc aac gcg agc atc ttc gac gga     1824

Met Lys Ala Gly Leu Asn Gly Val Leu Asn Ala Ser Ile Phe Asp Gly        

        595                 600                 605                    

 

tgg tgg gtt gaa ggc tac aat ggg aaa aac ggc tgg gtc att ggg gag     1872

Trp Trp Val Glu Gly Tyr Asn Gly Lys Asn Gly Trp Val Ile Gly Glu        

    610                 615                 620                        

 

gag acc acc gag ccg gag agc gaa gag gac gac gcg aag gac gct gag     1920

Glu Thr Thr Glu Pro Glu Ser Glu Glu Asp Asp Ala Lys Asp Ala Glu        

625                 630                 635                 640        

 

agc ctc tac acc ctg ctc gag aag gag ata atc ccc acc tac tac ggg     1968

Ser Leu Tyr Thr Leu Leu Glu Lys Glu Ile Ile Pro Thr Tyr Tyr Gly        

                645                 650                 655             

 

aac agg agc cgc tgg ata tac atg atg aag gag agc ata aag agc ata     2016

Asn Arg Ser Arg Trp Ile Tyr Met Met Lys Glu Ser Ile Lys Ser Ile        

            660                 665                 670                

 

gcc ccg cgc ttc agc acg cac agg atg gtc aag gag tac atg gac agg     2064

Ala Pro Arg Phe Ser Thr His Arg Met Val Lys Glu Tyr Met Asp Arg        

        675                 680                 685                    

 

ttc tac tcc aag gcc atg agc aac tac atc tgg ctc acg agg gag aac     2112

Phe Tyr Ser Lys Ala Met Ser Asn Tyr Ile Trp Leu Thr Arg Glu Asn        

    690                 695                 700                        

 

tac aag ggg gcc agg gaa ata gcg gcc tgg aag gag agg                 2151

Tyr Lys Gly Ala Arg Glu Ile Ala Ala Trp Lys Glu Arg                    

705                 710                 715                            

 

 

<210>  6

<211>  717

<212>  PRT

<213>  Thermococcus zilligii

 

<400>  6

 

Met Ala Asp Val Ser His Thr Val Glu Asn Leu Ile Arg Ala Lys Leu

1               5                   10                  15     

 

 

Pro Tyr Pro Leu Glu Asn Leu Ala Glu Leu Ala Tyr Asn Tyr Trp Trp

            20                  25                  30         

 

 

Ser Trp Asn Arg Arg Ala Thr Arg Leu Trp Glu Tyr Ile Asp Ser Glu

        35                  40                  45             

 

 

His Trp Arg Glu Tyr Lys Asn Pro Val Lys Leu Leu Leu Asp Thr Pro

    50                  55                  60                 

 

 

Glu Glu Arg Phe Trp Glu Leu Leu Lys Asp Asp Asp Phe Met Asn Leu

65                  70                  75                  80 

 

 

Tyr Glu Leu Val Met Asp Gln Phe Thr Ala Tyr Met Asn Pro Lys Ser

                85                  90                  95     

 

 

Thr Trp Phe Ser Thr Asn Tyr Pro Lys Trp Asp Lys Pro Ile Val Tyr

            100                 105                 110        

 

 

Leu Cys Met Glu Tyr Gly Ile Ser Lys Ser Leu Pro Ile Tyr Ser Gly

        115                 120                 125            

 

 

Gly Leu Gly Ile Leu Ala Gly Asp His Leu Lys Thr Ala Ser Asp Leu

    130                 135                 140                

 

 

Gly Leu Pro Phe Ile Ala Ile Gly Leu Leu Tyr Lys His Gly Tyr Phe

145                 150                 155                 160

 

 

Arg Gln Glu Ile Asp Arg Asp Gly Arg Gln Arg Glu Ile Phe Pro Glu

                165                 170                 175    

 

 

Tyr Arg Pro Glu Glu Met Pro Ile Lys Pro Val Leu Ser Lys Asp Gly

            180                 185                 190        

 

 

Lys Pro Leu Leu Val Glu Val Pro Ile Glu Asn Arg Ile Val Tyr Ala

        195                 200                 205            

 

 

Arg Ala Phe Glu Val Ser Val Gly Met Ala Lys Leu Tyr Leu Leu Asp

    210                 215                 220                

 

 

Thr Asp Val Pro Glu Asn Ser Pro Glu Asp Arg Ala Ile Cys Asp Tyr

225                 230                 235                 240

 

 

Leu Tyr Asn Ala Glu Met Asp Lys Arg Ile Lys Gln Glu Ile Leu Leu

                245                 250                 255     

 

 

Gly Ile Gly Gly Met Arg Leu Leu Gln Ala Leu Gly Ile Glu Pro Gly

            260                 265                 270        

 

 

Val Val His Leu Asn Glu Gly His Pro Ala Phe Ala Asn Leu Gln Arg

        275                 280                 285             

 

 

Ile Ala Trp Tyr Met Glu Lys Gly Leu Thr Phe Thr Glu Ala Leu Ser

    290                 295                 300                

 

 

Ile Val Arg Gly Thr Thr Val Phe Thr Thr His Thr Pro Val Pro Ala

305                 310                 315                 320

 

 

Gly His Asp Arg Phe Pro Ile Ala Glu Val Arg Lys Arg Leu Ser Lys

                325                 330                 335    

 

 

Phe Leu Glu Gly Arg Glu Glu Leu Leu Glu Leu Gly Arg Glu Gly Asp

            340                 345                 350        

 

 

Gln Ile Asn Met Thr Leu Leu Ala Ile Arg Thr Ser Ser Tyr Val Asn

        355                 360                 365            

 

 

Gly Val Ser Gln Leu His Ala Glu Val Ser Lys Arg Met Trp Lys Asp

    370                 375                 380                

 

 

Leu Trp Pro Gly Val Pro Leu Asn Glu Ile Pro Ile Glu Gly Ile Thr

385                 390                 395                 400

 

 

Asn Gly Val His Thr Met Thr Trp Val His Asp Glu Met Arg Lys Leu

                405                 410                 415    

 

 

Phe Asp Arg Tyr Ile Gly Lys Val Trp Arg Glu His Thr Asn Ile Glu

            420                 425                 430        

 

 

Gly Ile Trp Tyr Ala Val Glu Arg Ile Pro Asp Glu Glu Leu Trp Gly

        435                 440                 445            

 

 

Ala His Leu Glu Ala Lys Arg Gln Leu Ile Glu Phe Leu Arg Glu Lys

    450                 455                 460                

 

 

Thr Met Glu Arg Asn Arg Arg Leu Gly Thr Asp Asp Pro Ile Pro Glu

465                 470                 475                 480

 

 

Ile Asp Glu Asn Ala Leu Ile Ile Gly Phe Ala Arg Arg Phe Ala Thr

                485                 490                 495    

 

 

Tyr Lys Arg Ala Thr Leu Ile Leu Ser Asp Leu Glu Arg Leu Lys Lys

            500                 505                 510        

 

 

Ile Leu Asn Asn Pro Glu Arg Pro Val Tyr Ile Val Phe Gly Gly Lys

        515                 520                 525            

 

 

Ala His Pro Arg Asp Glu Ala Gly Lys Glu Phe Leu Arg Arg Val Tyr

    530                 535                 540                

 

 

Glu Val Ser Gln Met Pro Glu Phe Arg Gly Lys Ile Phe Val Leu Glu

545                 550                 555                 560

 

 

Asn Tyr Asp Met Gly Ser Ala Arg Leu Met Val Ala Gly Val Asp Val

                565                 570                 575    

 

 

Trp Leu Asn Asn Pro Arg Arg Pro Leu Glu Ala Ser Gly Thr Ser Gly

            580                 585                 590        

 

 

Met Lys Ala Gly Leu Asn Gly Val Leu Asn Ala Ser Ile Phe Asp Gly

        595                 600                 605            

 

 

Trp Trp Val Glu Gly Tyr Asn Gly Lys Asn Gly Trp Val Ile Gly Glu

    610                 615                 620                 

 

 

Glu Thr Thr Glu Pro Glu Ser Glu Glu Asp Asp Ala Lys Asp Ala Glu

625                 630                 635                 640

 

 

Ser Leu Tyr Thr Leu Leu Glu Lys Glu Ile Ile Pro Thr Tyr Tyr Gly

                645                 650                 655    

 

 

Asn Arg Ser Arg Trp Ile Tyr Met Met Lys Glu Ser Ile Lys Ser Ile

            660                 665                 670        

 

 

Ala Pro Arg Phe Ser Thr His Arg Met Val Lys Glu Tyr Met Asp Arg

        675                 680                 685            

 

 

Phe Tyr Ser Lys Ala Met Ser Asn Tyr Ile Trp Leu Thr Arg Glu Asn

    690                 695                 700                

 

 

Tyr Lys Gly Ala Arg Glu Ile Ala Ala Trp Lys Glu Arg

705                 710                 715          

Claims (20)

1.支链葡聚糖，

其中所述支链葡聚糖具有多个非还原端，且

选自N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的至少一个残基经由α-1,4-键结合到所述支链α-1,4-葡聚糖的两个或更多个非还原端的每一个上，

但在所述支链α-1,4-葡聚糖的除了非还原端以外的位置不存在N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基，且

所述支链α-1,4-葡聚糖的聚合度为15或更大和4 x 10⁵或更小。

2.根据权利要求1的支链葡聚糖，其中所述支链α-1,4-葡聚糖选自支链麦芽低聚糖、淀粉、支链淀粉、糖原、糊精、酶法合成的支链葡聚糖和高支化环葡聚糖。

3.根据权利要求1的支链葡聚糖的羟基改性产物，其中羟基上的改性是在葡聚糖的一些或所有醇式羟基上的改性，且羟基上的改性独立地选自羟烷基化、烷基化、乙酰化、羧甲基化、硫酸化和磷酸化。

4.根据权利要求1的支链葡聚糖或其羟基改性产物的还原端改性产物。

5.根据权利要求1的支链葡聚糖或其羟基改性产物或其还原端改性产物的非还原端改性产物，其通过将除了N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基以外的单糖残基经由α-1,4-键连接至支链α-1,4葡聚糖的所述多个非还原端的至少一个非还原端而进一步改性。

6.根据权利要求5的支链葡聚糖或其羟基改性产物或其还原端改性产物的非还原端改性产物，其中所述单糖残基是选自葡萄糖醛酸残基、葡糖胺残基、甘露糖残基和木糖残基的一种或两种或更多种。

7.根据权利要求5的支链葡聚糖或其羟基改性产物或其还原端改性产物的非还原端改性产物，其中所述单糖残基是选自葡萄糖醛酸残基、甘露糖残基和木糖残基的一种或两种或更多种。

8.制备支链葡聚糖的方法，所述支链葡聚糖中选自N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基的至少一个残基结合到两个或更多个非还原端的每一个上，其特征在于使α-葡聚糖磷酸化酶作用于包含具有两个或更多个非还原端的支链α-1,4-葡聚糖和N-乙酰基葡糖胺-1-磷酸或半乳糖-1-磷酸的水溶液，其中所述支链α-1,4-葡聚糖的聚合度为15或更大和4 x 10⁵或更小。

9.根据权利要求8的方法，其中所述α-葡聚糖磷酸化酶具有95%或更高的与源自超嗜热菌VF5的α-葡聚糖磷酸化酶的氨基酸序列的序列一致性，并具有将N-乙酰基葡糖胺残基或半乳糖残基转移至葡聚糖的非还原端以形成α-1,4-键的活性。

10.药物，其包含

根据权利要求1的支链葡聚糖、其羟基改性产物或其还原端改性产物，和

药效成分。

11.药物，其包含：

根据权利要求1的支链葡聚糖或其羟基改性产物或其还原端改性产物的非还原端改性产物，其通过将除了N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基以外的单糖残基经由α-1,4-键连接至支链α-1,4葡聚糖的所述多个非还原端的至少一个非还原端而进一步改性，其中所述单糖残基是选自葡萄糖醛酸残基、葡糖胺残基、甘露糖残基和木糖残基的一种或两种；和

药效成分。

12.根据权利要求10或11的药物，其中所述药效成分选自低分子量有机化合物、蛋白质、肽、抗体、抗体片段、受体、受体片段、DNA、RNA、siRNA、miRNA和RNA适配子。

13.根据权利要求10或11的药物，其中所述药效成分是抗原蛋白或肽。

14.临床诊断组合物，其包含根据权利要求1的支链葡聚糖、其羟基改性产物或其还原端改性产物。

15.临床诊断组合物，其包含根据权利要求1的支链葡聚糖或其羟基改性产物或其还原端改性产物的非还原端改性产物，其通过将除了N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基以外的单糖残基经由α-1,4-键连接至支链α-1,4葡聚糖的所述多个非还原端的至少一个非还原端而进一步改性，其中所述单糖残基是选自葡萄糖醛酸残基、葡糖胺残基、甘露糖残基和木糖残基的一种或两种。

16.DDS的纳米微粒载体，其包含根据权利要求1的支链葡聚糖、其羟基改性产物或其还原端改性产物。

17.DDS的纳米微粒载体，其包含根据权利要求1的支链葡聚糖或其羟基改性产物或其还原端改性产物的非还原端改性产物，其通过将除了N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基以外的单糖残基经由α-1,4-键连接至支链α-1,4葡聚糖的所述多个非还原端的至少一个非还原端而进一步改性，其中所述单糖残基是选自葡萄糖醛酸残基、葡糖胺残基、甘露糖残基和木糖残基的一种或两种。

18.根据权利要求16或17的载体，其中所述DDS的纳米微粒载体选自脂质体、病毒粒子、高分子胶束和由带有疏水基团的高分子构成的纳米凝胶。

19.疫苗佐剂，其包含根据权利要求1的支链葡聚糖、其羟基改性产物或其还原端改性产物。

20.根据权利要求19的疫苗佐剂，其中所述支链α-1,4葡聚糖通过将除了N-乙酰基葡糖胺残基和半乳糖残基以外的单糖残基经由α-1,4-键连接至葡聚糖的所述多个非还原端的至少一个非还原端而进一步改性，其中所述单糖残基是选自葡萄糖醛酸残基和甘露糖残基的一种或两种。

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