CN100516227C - 改变了淀粉分支酶活性的大麦及增加了直链淀粉含量的淀粉和含淀粉产品 - Google Patents

Abstract

大麦淀粉分支酶IIa活性降低，将导致其生产的麦粒有相对较高含量的直链淀粉。另外，该大麦淀粉分支酶IIb活性也可能降低。本发明的大麦麦粒可能具有饱满的表型，尽管其支链淀粉合成途径受到了损害。

Description

改变了淀粉分支酶活性的大麦及增加了直链淀粉含量的淀粉和含淀粉产品

技术领域

本发明涉及一种大麦作物，该大麦由于其胚乳中淀粉分支酶IIa(starch branching enzyme IIa，SBEIIa)活性降低导致了麦粒淀粉中的相对直链淀粉含量增加。同时，本发明还涉及由该大麦得到的麦粒、淀粉、食物以及非食物类产品。

背景技术

淀粉约占谷类成熟颗粒重量的45-65％。淀粉包括直链淀粉和支链淀粉。从本质上而言，直链淀粉是由α-1，4葡萄糖苷链组成的线形分子，而支链淀粉则由α-1，6葡萄糖苷键所连接的直链进行了高度分支。高等植物胚乳中淀粉的合成是在一系列酶的作用下分四个关键步骤进行的。首先，葡萄糖-1-磷酸(glucose-1-phosphate，G-1-P)和ATP在ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose pyrophosphorylase，AGPP)的催化下合成淀粉的单体前体ADP-葡萄糖。接着，淀粉合成酶将已激活的葡糖基供体ADP-葡萄糖转移到已存在的α-1，4键的未还原端。然后，淀粉分支酶通过断裂α-1，4葡聚糖的某个区域引入分支点，并将该断裂链转移到受体链形成新的α-1，6键。淀粉分支酶是唯一能给α-多葡聚糖引入α-1，6键的酶，因而在支链淀粉的生成过程中，它起到了关键性作用。最后，淀粉脱支酶消除部分分支键，该过程的作用机制目前仍不明了(Myers等，2000)。

人们已经明了高等植物中一般淀粉颗粒的合成至少需要以上四种酶的作用，同时在高等植物的胚乳中发现了每种酶的多种同工酶，并基于突变分析(Wang等，1998，Buleon等，1998)或通过转基因改变基因表达水平(Abel等，1996，Jobling等，1999，Scwall等，2000)提出了单个同工酶的特殊作用。然而，每种酶的各种同工酶对于淀粉生物合成的准确作用目前仍不清楚，而且这些作用在不同物种是否存在明显差异也不清楚。在谷类胚乳中，ADP-葡萄糖焦磷酸化酶有两种同工酶，一种在造粉体中，另一种在细胞质中(Denyer等，1996，Thorbjornsen等，1996)。每个同工酶由两种亚基组成。玉米的皱缩突变体(sh2)和脆性突变体(bt2)分别是大小两个亚基出现了的损伤(Girouz和Hannah，1994)。在谷类胚乳中，共发现四种类型的淀粉合成酶。其中一种即颗粒结合淀粉合成酶(granule-boundstarch synthase，GBSS)完全存在于淀粉颗粒中，另两种分布在颗粒部分和可溶部分之间(SSI，Li等，1999a，SSII，Li等，1999b)，第四种即SSIII则完全存在于可溶部分(Cao等，2000，Li等，1999b，Li等，2000)。GBSS对于直链淀粉合成是必要的(Shure等，1983)，SSII和SSIII的突变则会改变支链淀粉的结构(Gao等，1998，Craig等，1998)。但至今仍没有用于了解SSI活性作用的突变的描述。

在谷类胚乳中，发现了三种形式的淀粉分支酶，淀粉分支酶I(SBEI)，淀粉分支酶IIa(SBEIIa)和淀粉分支酶IIb(SBEIIb)(Hedman和Boyer，1982，Boyer和Preiss，1978，Mizuno等，1992，Sun等，1997)。在玉米和稻谷中，高直链淀粉表型源于SBEIIb基因的损伤，故其也被称为直链淀粉扩展(amylose extender，ae)基因(Boyer和Preiss，1981，Mizuno等，1993；Nishi等，2001)。在SBEIIb突变体中，胚乳淀粉颗粒呈现不正常形态，直链淀粉含量显著提高，支链淀粉分支频率降低，短链(＜DP17，特别是DP8-12)比例降低。而且淀粉的胶凝温度升高。另外，还有一种介于直链淀粉和支链淀粉的物质，一般称之为“中间体”(Boyer等，1980，Takeda等，1993b)。与此相反，玉米的SBEIIa基因突变体由于增变基因(Mu)插入因子引起的SBEIIa表达不足，尽管叶中淀粉的分支情况发生了改变，但胚乳淀粉的分支情况与野生型并没有区别(Blauth等，2001)。同样地，缺乏SBEIIa活性的稻谷胚乳中的支链淀粉的链长分布也没有显著的改变(Nakamura著，2002)。

玉米的ddull1突变会引起胚乳淀粉含量的降低和直链淀粉含量的增加，变化的幅度取决于遗传背景和其余的支链淀粉分支的增加程度(Shannon和Garwood，1984)。对应于该突变的基因已通过使用转位子增变基因的转位子标记策略得以识别与分离，并表明其编码淀粉合成酶II(SSII)(Gao等，1998)。现在人们认识到这种酶在谷类应属于SSIII家族的一员。突变体的胚乳SBEIIa活性降低与dull1突变有关。在其它谷类中未见有相应突变的报导。这些发现是否与其它谷类如大麦有关目前尚不明了。

WO94/09144建议使用正义和反义基因改变玉米中淀粉合成酶(SS)和SBE的天然比例。但是，没有资料能够证实所提出的分子策略的有效性，同时也没有提出特异性地降低SBEIIa的活性。

单独降低土豆SBEI活性对于淀粉结构仅会产生极小的影响(Filpse等，1996)，进一步的研究确认了一些定性变化(Safford等，1998)。然而，同单独降低土豆SBEII活性相比，同时降低土豆SBEII和SBEI活性会导致相对直链淀粉含量的大大增加(Schwall等，2000)。

高等植物中有两类脱支酶，根据底物特异性的不同，分别叫做异淀粉酶型脱支酶和普鲁兰酶型脱支酶(Myers等，2000)。玉米和稻谷的Sugary-1突变与这两类脱支酶的缺乏均有关联(James等，1995，Kubo等，1999)，然而原因突变却比对至异淀粉酶型脱支酶基因的同一位置。与玉米Sugary-1突变类似的Chlamydomonas sta-7突变体(Mouille等，1996)，则单独降低了异淀粉酶的活性。表1列出了从谷类克隆的淀粉生物合成酶基因。

淀粉广泛应用于食品、造纸和化工。对于食品或非食品或工业产品，淀粉的物理结构对淀粉的营养和处理性质有着重要的影响。淀粉在某方面的特性可作为其结构的表征，包括支链淀粉链长分布，结晶度和结晶的表现形式如淀粉结晶的V-复合体形态。支链淀粉的链长可作为结晶性和胶凝性改变的表征，同时，人们还认为它与支链淀粉的降解性降低有关联。另外，对于含有大量淀粉的食品，支链淀粉链长分布的变化会反映食品的感官属性。淀粉的结晶性降低反映了淀粉胶凝温度的降低，以及感官属性的增强。

大多数直链淀粉含量高的淀粉有相对较高的胶凝温度，这对一些食品应用而言是不利的。胶凝温度反映了加工这些食品需要的粉碎能量。用这些麦粒或淀粉加工得到的麦粒或面粉制作食品一般需要较高的温度。因此，含直链淀粉多的产品一般较贵。另外，消费者烹饪成品食物或用直链淀粉含量高的面粉制作食品时，需要更长的时间和更高的温度。在许多食品应用方面，具有降低的或正常的胶凝温度的高直链淀粉含量的淀粉是很有利的。

淀粉成分，特别是抗性淀粉，对肠特别是大肠的健康有重要的影响。因此，高直链淀粉含量的淀粉已在诸如玉米的一些谷物中开发出来，并用于食物以促进肠道健康。抗性淀粉的益处在于为大肠提供营养，肠内微生物群落提供能量来源使得抗性淀粉发酵生成短链脂肪酸。而这些短链脂肪酸为结肠细胞提供营养物，增强经大肠的特定营养物的吸收，促进结肠的生理活性。一般而言，如果抗性淀粉或其它食物纤维得不到供给，结肠新陈代谢会相对不活跃。

在谷物特别是大麦中的另一营养成分是β-葡萄糖。β-葡萄糖由葡萄糖单元通过β-(1-4)和/或β-(1-3)糖苷键链接而成，人体消化酶不能将它分解，可作为食物纤维的合适来源。β-葡萄糖可被结肠内的细菌部分消化，发酵产生对排列在肠和结肠中的粘膜细胞有益的短链脂肪酸(主要是醋酸酯、丙酸酯和丁酸酯)(Sakata和Engelhard，1983)。β-葡萄糖的摄取还可促进胆汁酸分泌，减少总血清胆固醇和低密度脂肪蛋白(LDL)，降低患冠心病的风险。同样地，β-葡萄糖还可减少餐后血糖浓度的变化。一般认为这些作用是基于胃和肠内的物质粘度的增加。

虽然变性淀粉或β葡萄糖能用于食物并提供未改良原料所不能提供的功能，但由于改良过程本身的原因，其会改变其它营养成分，或者产生不需要的物质。因此，提供不需改良即可直接用于食物的原料成分更可取。

大麦(Hordeum vulgare)是世界第四大粮食作物，除用于制作酒精饮料外，在人类消费的其他方面还未得到充分运用。平均而言，大麦颗粒含有约64％淀粉，11％蛋白质和5％β-葡萄糖(一般3-6％)。其余20％是水分，纤维和其它微量组分。

相对于玉米淀粉结构的变化而言，已知的大麦淀粉结构的变化是非常有限的。对应于玉米或稻谷的直链淀粉扩展表型，大麦的SBEIIb突变体仍未表征过。大麦SBEIIa和SBEIIb突变对应的表型目前仍不清楚。表征最为清楚的突变是waxy突变和一种高直链淀粉含量的突变即AC38，其中AC38可将直链淀粉含量增加到最大占总淀粉的45％，而含waxy表型的双突变体也已进行了构建和分析(Schondelmaier等，1992；Fujita等，1999)。

其它的高直链淀粉含量的大麦突变体已经识别出来。对SSIIa基因进行化学诱导突变后的麦粒淀粉，所含直链淀粉含量高达65-70％(WO 02/37955 A1)。M292和M342突变体充分表明了淀粉合成减少引起的平均麦粒重量的减少，从亲本Himalaya系的约51毫克的平均重量分别减少到M292和M342的32和35毫克。尽管这些突变型保持了野生型谷类的长度和宽度，但它们是扁平的，厚度从Himalaya的平均2.8毫米降低到1.6-1.8毫米，并且中部区域基本上是瘪的，从而导致了较差的研磨性。谷类长度(L)对厚度(T)的比例是突变等位基因的有用表征参数，突变型和野生型种子的L∶T比例分别是大于3.5和小于3.5。突变系的淀粉含量从Himalaya的49.0％分别减少到M292和M342的17.7和21.9％。当M292和M342麦粒中直链淀粉含量从6.2毫克每个颖果分别降低到4.0和4.8毫克，支链淀粉的含量从Himalaya的18.7毫克戏剧性的降低到突变体的1.6和2.9毫克。这表明相对高含量的直链淀粉是由于支链淀粉产量的降低。突变体中β-葡萄糖水平增加到了10％以上。淀粉的胶凝温度降低。SSIIa突变体改变了SBEIIa和SBEIIb活性在胚乳中的淀粉颗粒和可溶部分的分布，但它们在胚乳中作为一个整体没有变化(WO 02/37955；Morell等，2003)。

虽然这些类型的高直链淀粉含量淀粉是有用的，但具有更高的直链淀粉含量的大麦淀粉更可取，特别是该大麦还具有提高的淀粉合成量和其它特性时，例如，收获后改良需求的减少。这样的淀粉产品相对不易消化，并且更利于健康。

一般事项

本领域技术人员应该明白此处描述的发明除了那些特别描述的以外还会有变化和修改。对此应作如下理解：此处描述的发明已包括了所有的这些变化与修改。本发明也包括了所有这些步骤，特征，本说明书所参考或阐明的组分和化合物，单个地或共同地，任意两个或更多的上述步骤或特征的任意和所有组合。

本说明书中，除非上下文要求，否则“包括”一词及其变换形式应理解为包括声明的整体或步骤、或者整体或步骤的组合，同时不得排除其它任何整体或步骤、或者整体或步骤的组合。此处描述的具体实施例仅用于例证目的，本发明并不局限于此。如同此处描述的一样，功能等效产品、组分和方法清楚的列在本发明的范围内。

本说明书中作者引用的详细文献目录见本说明书的最后部分。此处提及的参考文献被整体引用。此处引用的现有技术，包括任一份或更多的现有技术文档，如果提及的现有技术在澳大利亚已成为一般通用知识或成为一般通用知识的一部分，将不再采取承认或建议。

此处的术语“来源于”用于指起源于列举物种的特殊整体或整体组，它们不需要直接来源于该列举物种。

此处核苷酸残基的命名参照国际纯粹和应用化学联合会-国际生物化学联合会(IUPAC-IUB)生物化学命名委员会的推荐做法，其中A代表腺嘌呤，C代表胞嘧啶，G代表鸟嘌呤，T代表胸腺嘧啶。

发明内容

本发明的第一方面涉及一种大麦的麦粒，所述大麦胚乳SBEIIa活性降低，所述麦粒淀粉中相对直链淀粉含量不少于40％(w/w)。优选相对直链淀粉含量高于50％或75％，优选麦粒是饱满的。

本发明的第二方面涉及一种大麦麦粒，该大麦麦粒所含淀粉的相对直链淀粉含量不低于75％(w/w)。

本发明的第三方面涉及本发明前两方面所述的麦粒制作的面粉或粗面粉，或这些面粉制作的食品。

本发明的第四方面涉及大麦麦粒的淀粉，所述大麦胚乳SBEIIa活性降低，上述淀粉不经改良且相对直链淀粉含量不少于40％(w/w)。在第四方面的某一特定形式，大麦胚乳SBEIIb活性也降低。

本发明的第五方面涉及一种组合物，该混合物包括本发明第四方面所述的淀粉和其它食物成分或水。

本发明的第六方面涉及一种组合物，该混合物包括大麦胚乳的淀粉颗粒、其它食物成分或水，所述淀粉颗粒至少包含75％(w/w)的直链淀粉。

本发明的第七方面涉及一种SBEIIa活性降低的大麦作物，该大麦麦粒淀粉的相对直链淀粉含量不低于40％(w/w)，优选不低于50％或不低于75％。

本发明的第八方面涉及一种产生大麦作物的方法，所述大麦胚乳SBEIIa活性降低，麦粒中直链淀粉含量不低于40％(w/w)，该方法包括以下步骤：a)在亲本大麦作物中引入遗传变异；和b)识别SBEIIa活性降低的子代作物或亲本大麦作物的种子。

本发明的第九方面涉及一种产生大麦作物的方法，所述大麦胚乳SBEIIa和SBEIIb活性均降低，该方法包括：a)从SBEIIa活性降低的作物得到诱变后的种子；或b)从SBEIIb活性降低的作物得到诱变后的种子；或c)将SBEIIa活性降低的作物与SBEIIb活性降低的作物杂交；识别SBEIIa和SBEIIb活性均已降低的大麦作物。

附图说明

图1是大麦SBEIIa的互补脱氧核糖核酸(cDNA)的核苷酸序列(序列号1)；

图2是大麦SBEIIb cDNA核苷酸序列(序列号2)；

图3是由A.tauschii提出的与六倍体小麦D基因组中的SBEIIa基因相对应的SBEIIa基因序列(序列号3)；

图4是小麦SBEIIb的部分基因序列(序列号4)(wbe2b染色体组)；

图5是双链RNA结构体示意图(A.基因因子排列顺序是：启动子，正义方向的SBEIIa或SBEIIb基因序列(外显子1，2和3)，内含子(内含子3)，反义方向的SBEIIa或SBEIIb基因序列(外显子1，2，3和4)，转录终止子/多腺苷酸序列。B.ds-SBEIIa和ds-SBEIIb基因转录形成“发夹式”RNA结构，该结构含有正义序列和反义序列杂交形成的双链区域。以G和AG核苷酸分界的内含子序列被剪除。)；

图6是大麦ds-SBEIIa和ds-SBEIIb转基因系PCR分析图(SBEIIb的引物对BX17F/AR2bkpnR和SBEIIa的引物对BX17F/AR2akpnR分别扩增了各自结构体的第一和第二部分，包括外显子1，2，3和内含子3(反义方向)，并用于识别阳性的转基因系。GP代表未改良的GoldenPromise。中央的泳道是分子大小标记。)；

图7是大麦ds-SBEIIa和ds-SBEIIb转基因系Southern印迹分析图(A.阳性ds-SBEIIa转基因大麦的Southern印迹杂交。预期的带大小为1836bp。B.阳性ds-SBEIIb转基因大麦的Southern印迹杂交。预期的带大小为1907bp。GP代表Golden Promise(阴性对比)。)；

图8是大麦ds-SBEIIa和ds-SBEIIb转基因系的Western印迹分析图(使用非变性PAGE和SBEIIb特异性抗体对IIb 4.3和IIb4.4系的10颗T1种子(来自于T0作物的种子)进行Western印迹分析得到的SBEIIb的表达情况。泳道1(+)是用于阳性对照的Glacier品种。)；

图9是大麦ds-SBEIIa和ds-SBEIIb转基因系的Western印迹分析图(使用非变性PAGE和SBEIIa或SBEIIb特异性抗体对IIa4.1系的T1种子(来自于T0作物的种子)进行Western印迹分析得到的SBEIIa或SBEIIb的表达情况。凝胶上的泳道均代表同样的种子。每个板的泳道1(+)是用于阳性对照Glacier品种。)；

图10是大麦ds-SBEIIa和ds-SBEIIb转基因系的Western印迹分析图(使用非变性PAGE和SBEIIb或SBEIIa特异性抗体对IIb4.1系的T1种子(来自于T0作物的种子)进行Western印迹分析得到的A.SBEIIb或B.SBEIIa的表达情况。凝胶上的泳道均代表同样的种子。每个板的泳道1(+)是用于阳性对照Glacier品种。)；

图11是ds-SBEIIa转基因大麦的淀粉颗粒形态示意图(对于ds-SBEIIa和ds-SBEIIb转基因种子，单颗种子的淀粉颗粒均可通过光学显微镜进行观察。图11A，具有野生型SBEIIa表达的种子(IIa4.2.3系)。图11B，缺乏SBEIIa表达的种子(IIa4.2.5系)。在缺乏SBEIIa而不是SBEIIb种子的淀粉中，可观察到明显的形态变化。)；

图12是淀粉颗粒的扫描电子显微镜图(SEM)(A.为野生型淀粉颗粒(IIa 4.2.3系)，B.和C.为ds-SBEIIa转基因胚乳的淀粉颗粒(IIa4.2.5系)。相对于野生型，来自于ds-SBEIIb(SBEIIb失活)种子的淀粉颗粒看起来没有形态变化。)。

具体实施方式

大麦中SBEIIa的改变

本发明基于大麦胚乳中SBEIIa活性降低会导致变性淀粉的产生，特别是大麦麦粒中直链淀粉会大量累积这一发现。这个出人意料的结果与玉米和稻谷的试验结果相反，在玉米和稻谷试验中SBEIIa的突变并没有改变支链淀粉的含量(Blauth等，20001，Nakamura，2000)。本发明优选单个或多个淀粉生物合成酶活性同时发生改变的情况，特别优选SBEIIa和SBEIIb的活性同时降低的情况。另外，优选饱满的大麦麦粒。

大麦的产生方法

一方面，本发明提出了降低大麦胚乳中SBEIIa活性的方法。与未改良大麦胚乳(对照)相比，活性的降低程度至少是40％，优选不低于50％，特别优选不低于75％，最优选不低于90％或95％。本方法包括大麦SBEIIa基因表达方式的改变和(或)大麦SBEIIa基因的突变，从而导致胚乳中SBEIIa活性降低。

本方法包括测定大麦胚乳SBEIIa活性的步骤，优选测定蛋白质水平，例如通过免疫检验，或通过本技术领域众所周知的方法如Northern印迹杂交分析或逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定相应的信使RNA(mRNA)水平。本方法还包括选择或筛选胚乳SBEIIa活性降低的大麦作物或大麦麦粒的步骤。这种选择可基于SBEIIa活性或SBEIIa蛋白质含量的降低，也可以基于大麦作物麦粒的表型，如直链淀粉含量的增加或支链淀粉含量的降低，还可以基于麦粒的可视表型，例如不饱满。

SBE的活性可通过酶试验测定，例如磷酸化酶激活试验(Boyer和Preiss，1978)。该试验测定SBE对磷酸化酶a介导的葡萄糖-1-磷酸酯和不溶于甲醇的聚合物(α-D-葡萄糖)结合的激活程度。SBE活性可也通过碘斑试验测定，该方法测定由葡萄糖聚合物的分支所引起的葡萄糖-多碘复合物吸光度的降低。SBE活性还可通过支链链接试验测定，该试验测定异淀粉酶消化还原直链淀粉所产生的还原端的数量(Takeda等，1993a)。优选在缺失SBEI或SBEIIb活性的情况下进行上述活性的测定。SBE的同工酶具有不同的底物选择性，例如SBEI对直链淀粉有较高的活性，而SBEIIa和SBEIIb则对支链淀粉有较高的活性。同工酶也可根据其转移的葡萄糖的链长加以区分。

另一方面，本发明提出了降低大麦胚乳中多个淀粉生物合成酶活性的方法，其中之一是SBEIIa。优选SBEIIa和SBEIIb的活性均被降低，特别优选SBEI的活性也被降低的情况。与SBEIIa活性同时降低的其他淀粉生物合成酶有：SSI，SSII，SSIII。淀粉脱支酶的活性也可能发生变化，例如异淀粉酶或普鲁兰酶(pullanase)。在一实施例中，淀粉生物合成酶活性变化除了发生在胚乳外，还可能发生在作物的其它组织，例如SBEI或SBEII的活性在叶中可能增加，以补偿编码SBEIIa抑制分子的转基因主要在胚乳中表达进而引起胚乳SBEIIa活性的降低。或者，当SBEIIa活性降低的时候通过一种或多种淀粉生物合成酶的过度表达，淀粉合成可能进一步提高。这些酶的编码基因可以有许多来源，例如来自于细菌或大麦外的其它来源，这些编码基因也可被修饰以进而改变酶的催化性能，例如酶的温度依赖性的变化(WO94/09144)。

又一方面，本发明提出了增加大麦麦粒中直链淀粉含量(淀粉的百分率)的方法和降低大麦胚乳SBEIIa活性的步骤。直链淀粉含量优选不低于50％，特别优选不低于60％，最优选不低于65％，70％或75％。如实施例所示，在本发明特别优选的实施例中，该方法使直链淀粉含量不低于80％或90％。

高直链淀粉表型可以通过部分或完全破坏SBEIIa基因或SBEIIa和SBEIIb基因的表达而取得。基因受抑制的程度会在某种程度上决定大麦麦粒中淀粉的特性。对从改良的大麦胚乳提取的蛋白质进行任意一种凝胶电泳技术均能揭示SBEIIa和/或SBEIIb活性变化的状况和程度。改良可以是降低SBEIIa和/或SBEIIb活性，SBEIIa和/或SBEIIb完全失活，或改变SBEIIb或其它酶在胚乳中分布。为进行这些测试，可同Rahman等，1995中叙述的那样将大麦胚乳中的淀粉提取出来，然后分析其中的蛋白质。对可溶部分和淀粉颗粒部分施行本技术领域众所周知的技术如SDS-PAGE和免疫印迹，能识别出大麦或麦粒中SBEIIa和/或SBEIIb酶发生改变的具体部位。

大麦

又一方面，本发明提供了一种大麦(Hordeum vulgare)，在麦粒的某些发育阶段，该大麦胚乳SBEIIa活性会降低，同时该大麦作物所产生的麦粒有相对较高的直链淀粉含量。相对于野生型，胚乳SBEIIa活性降低量优选不低于50％，特别优选不低于75％，最优选不低于90％或95％。术语“野生型”具有在遗传学领域的通常意义，包括大麦栽培品种或此处提及的未经改良的基因型。

本发明还提供了具有期望的父本特征的子代作物和麦粒。

除了降低SBEIIa活性外，本发明还包括了SBEIIb或其它淀粉生物合成酶活性改变的大麦。SBEIIa和SBEIIb活性降低的作物可通过SBEIIa活性降低的作物与SEBIIb活性降低的作物杂交而成，或通过引入编码SBEIIa和SBEIIb基因表达抑制剂的转基因。本发明还包括其它遗传背景的突变。最初的改良作物(突变体)可与含有更好的遗传背景的作物杂交。经过初次杂交，适当数量的回交可以去除不理想的背景。理想的遗传背景包括一系列基因的适当组合，这些基因能提供较高的产量和其它特性如农艺学特性、非生物逆境抗性或壳更少。遗传背景可能还包括其它的发生改变的淀粉生物合成酶基因或修饰酶基因，例如直链淀粉扩展表型，High Amylose Glacier大麦的amol突变(未知基因)，waxy突变(在Waxiro品种中发现)，高直链淀粉品种MK6827的突变基因(可从美国农业部农业研究局国家小谷物胚质研究所获得，阿伯丁市，爱达荷州，831290)，高直链淀粉品种M292和M342(SSIIa基因突变)或修饰基因。另外，可将上述系列组合所产生的和已存在于杂种中的双倍和三倍突变，与其它胚乳缩小(原因基因未知)的大麦系结合。

麦粒

本发明还提供含有与野生型相比属于变性淀粉的大麦麦粒。该变性淀粉至少是在大麦麦粒的胚乳发育过程中SBEIIa活性降低的部分结果。从总淀粉百分率来看，与野生型的25％直链淀粉含量和75％支链淀粉含量相比，该麦粒的直链淀粉含量增加，支链淀粉含量减少。优选胚乳发育过程中，SBEIIa和SBEIIb的活性都降低。特别优选SBEI活性也同时降低。利用本技术领域众所周知的测量方法测定的直链淀粉含量，优选最少占总淀粉的50％，特别优选不低于60％，最优选不低于65％，70％，75％，80％或90％。淀粉颗粒的不正常形态或在光学显微镜下观察到的麦粒双折射的消失或其它方法均能证明直链淀粉含量的增加。优选用碘量法测定直链淀粉含量，可以用分光光度计(如Morrison和Laignelet，1983)或高效液相色谱(HPLC，如Batey和Curtin，1996)。

该大麦麦粒中可能有升高的β-葡萄糖水平，这与更多的碳进入这种聚合物而非支链淀粉的合成有关。或者，麦粒中有正常水平的β-葡萄糖，例如占成熟麦粒重量的3.0-6.0％。优选麦粒含有升高的直链淀粉水平和正常水平的β-葡萄糖。根据SSIIa突变大麦麦粒中的淀粉组分(W002/37955)，这样的组合是出人意料的。该麦粒中的淀粉的胶凝温度发生了改变和/或在胶凝过程中和胶凝后的膨胀特性发生了改变。麦粒最好还具有饱满的表型。

本发明还提供了麦粒制成的面粉和食物。它们可以是未经处理的或处理过的，例如经过分级或漂白。本发明还提供了有助于食品生产的来自胚乳SBEIIa活性改变的大麦作物的麦粒，上述麦粒的淀粉有较高的直链淀粉含量和较低的支链淀粉含量。另外，本发明包括了用其它方法加工的麦粒，因而它们可能是研细的、碾碎的、珠状的、粗粉状的或压碎的。

淀粉

另一方面，本发明提供来源于上述大麦作物麦粒的淀粉，该作物胚乳SBEIIa活性降低，淀粉中有较高的直链淀粉含量和较低的支链淀粉含量。优选方案是SBEIIa和SBEIIb的活性均被降低，更优方案是SBEI的活性也被降低。另一方面，本发明提供了来自于大麦作物麦粒的淀粉，它至少含有50％的直链淀粉，优选直链淀粉含量不低于60％，特别优选直链淀粉含量不低于65％，70％，75％，80％或90％。可用研磨法获取麦粒中的纯淀粉，例如湿磨法，其包括淀粉与蛋白质、油和纤维的分离过程。研磨加工得到的初始产品是淀粉颗粒的混合物或组合物，因此本发明包括这些颗粒。这些淀粉颗粒至少含有50％的直链淀粉，优选70％，75％或80％。

该淀粉的抗性淀粉含量升高，其结构也发生了改变，这种改变可为特定的物理性质所证实：具有一个或多个消化酶难以消化的结构单元，这可能是高含量β-葡萄糖引起的，淀粉颗粒形态发生改变，淀粉相关脂质的明显存在，结晶性改变和支链淀粉链长分布发生了变化。直链淀粉含量高也有助于提高抗性淀粉的含量。

本发明还提供了来自于示例的大麦麦粒的淀粉，它含有较高食物食纤维，优选其抗性淀粉的含量也升高。该升高同时也是相对高含量直链淀粉部分影响的结果。

降低基因活性的方法：转基因

SBEIIa和其它任意淀粉生物合成酶或修饰酶基因活性的改变可通过向作物引入遗传变异来实现，该过程可以是向大麦作物引入转基因。“遗传变异”意味着基因组的改变，在本说明书中，它影响SBEIIa的活性，除引入转基因外，还包括点突变、取代、反转、易位和删除等突变形式。此处涉及的“转基因”具有生物技术技术领域的通常意义，是由重组DNA技术或重组RNA技术产生或修饰的基因序列，该基因序列最终被引入到有机体或有关细胞。转基因包括来源于有机体或细胞的基因序列，如反义序列。转基因通常包括外源性核酸，该核酸并不来源于上述的有机体或细胞。“转基因”指的是含转基因的有机体或细胞。“非转基因”指的是基因组中没有任何转基因。转基因通常被重组到有机体或细胞的基因组中，以便进行稳定的遗传。

降低SBEIIa活性的方法包括将转基因引入大麦的可再生细胞和从转化细胞再生成含转基因的大麦作物的步骤。支链淀粉合成涉及的淀粉分支酶包括SBEI、SBEIIa和SBEIIb，本发明包括单独降低SBEIIa的表达或其与改变SBEIIb或SBEI的表达相结合。因此，转基因可能会使一种以上的基因失活。此外，SBEIIb或SBEI的失活可以是直接的，此时转基因(如编码双链RNA，反义序列或核酶RNA，如下所示)直接针对SBEIIb或SBEI基因的表达，也可能是间接地导致SBEIIb或SBEI表达的改变。例如，按照序列识别或碱基配对仅针对SBEIIa基因/RNA的转基因RNA，还可以通过改变蛋白质的稳定性或分布，导致SBEIIb或SBEI活性的降低。另外，本发明专注于将活性改变的SBEIIa和一个或多个活性改变的其它支链淀粉合成酶进行组合，这些支链淀粉合成酶包括SSI，SSII，SSIII和脱支酶如异淀粉酶或普鲁兰酶。转基因可引起任意一种或所有这些酶的表达的改变。

与大麦支链淀粉合成相关的基因中有一些已知的DNA序列，其中任意一种均可做为设计使大麦基因失活的转基因的基础。它们包括SBEIIa(GenBank入藏登记号为AF064562和AF064560)，SBEIIb(GenBank入藏登记号为AF064563和AF064561)。大麦SBEI基因的同系物可利用其他序列分离开来，这些序列在其它谷类的DNA序列的基础上构建，例如Li等以小麦(Triticum)为对象所使用的在WO99/14314中陈述的技术。和小麦D的基因组中的SBEI基因极其同源的小麦(Triticum tauschii)SBEI序列与大麦SBEI基因高度相似，可在已出版的专利说明书WO 99/14314或其引用的文献中查到，这些文献一并放到此处以供参考。小麦SBEI序列可通过入藏登记号AF076679在GenBank数据库中访问。来自小麦和其它相关物种的其它支链淀粉合成相关基因的同系物也可用于改变大麦的基因表达水平。这些基因或其片段可通过本技术领域众所周知的方法获得，包括PCR扩增或示踪探针杂交。

此处使用的“严格杂交条件”意思是：探针序列和目标序列间的序列识别不低于90％，最好是不低于95％的情况下进行杂交。严格杂交条件的示例是：在50％甲酰胺，5xSSC(lxSSC＝150mM氯化钠，15mM柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠(pH7.6)，5x Denhardt’s溶液，10％右旋糖苷硫酸酯，和20μg/ml变性剪切的DNA如鲑精DNA中孵育过夜，随后在65℃左右，用0.1xSSC清洗杂交载体。其它杂交和清洗条件是众所周知的，并且示例在Sambrook等，分子克隆：实验室指南，第二版，冷泉港，纽约(1989)中，特别是第11章。

用于构造转基因的同系物与相应的大麦基因在适当区域的同源性应不低于85％，优选不低于90％，特别优选95-100％。优选转基因能特异地靶向支链淀粉合成基因在大麦胚乳中的表达，而对作物其他部位的支链淀粉合成产生较小或很少的影响。这可通过使用合适的调节序列达到目的，如在转基因中加入胚乳特异性的启动子。

反义技术

利用基因工程或转基因方法改变特别是特异性降低作物基因活性在本技术领域内是众所周知的。向大麦引入遗传变异的方法包括合适的反义分子在作物内的表达，该反义分子和目标基因的RNA互补并能与之杂交。一般认为反义分子干扰目标基因信使RNA的转录、处理或稳定性，从而抑制其表达。设计反义序列的方法在本技术领域内是众所周知的，其范例可从以下专利查找：美国专利5190131，欧洲专利说明书0467349-A1，0223399-A1和0240208，这些专利文献一并放到此处以供参考。在作物中使用反义技术已由Bourque(1995)和Senior(1998)评论过。Bourque列出大量的范例说明了反义序列作为抑制基因的一种方法在作物系统中的应用。她同时还指出没有必要完全抑制酶的活性，因为部分抑制更可能导致系统出现可测量的变化。Senior(1998)指出反义方法目前已成为控制基因表达的非常成熟的技术。

大麦SBEIIa，SBEIIb，SBEI或其它支链淀粉生物合成酶基因的反义分子能够以大麦信使RNA序列为基础获取，或以同源的来于诸如小麦等其它物种的DNA或信使RNA序列为基础获取。反义序列应互补于结构基因或其中控制基因表达或链接的序列。例如反义序列能互补于大麦SBEIIa或其它基因的编码区域，或5’-未翻译区域或3’-未翻译区域或它们的结合。反义序列可能和转录中或转录后被剪除的内含子序列部分互补，但优选只和目标基因的外显子序列互补。鉴于未翻译区域有更大的趋异性，以这些区域为靶点可提供特异性更好的基因抑制。反义序列的长度最少应有19个连续的核苷酸，优选50个，特别优选不低于100，200，500或1000个。可使用和整个基因转录互补的全长序列。最优选的长度是100-2000个核苷酸。反义序列与转录基因的同源程度应不低于85％，优选90％，特别优选95-100％。反义RNA分子可包含仅起稳定作用的不相干的序列。

协同抑制

另一可使用的分子生物方法是协同抑制。协同抑制的机理目前仍不完全明了，但人们认为它包含了转录后基因沉默(PTGS)，从这方面看，它与反义抑制的许多例子非常相似。它通过将基因或其片段的额外拷贝沿启动子表达的正义方向引入到作物。就上述反义序列而言，正义片段的大小、对目标基因区域的应答和与目标基因的同源程度是必须予以考虑的。在一些实例中，基因序列的额外拷贝会干扰作物目标基因的表达。具体实施协同抑制的方法可参考专利说明书WO97/20936和欧洲专利说明书0465572。

双链RNA介导的基因沉默

另一可用来向大麦作物引入遗传变异的方法是双链RNA介导的基因沉默。本方法也包括转录后基因沉默(PTGS)。本方法中，引入了能指导双链RNA(至少局部双链)合成的DNA。当转录成RNA时，含有正义和反义序列的DNA能杂交形成双链RNA区域。在优选的实施例中，正义和反义序列用含有内含子的间隔区分开，当转录成RNA时，该间隔区被剪除掉。该排列可产生更高的基因沉默效率。双链区域可含有从一个或两个DNA区域转录得到的一个或两个RNA分子。双链分子能在作物体内同时破坏双链RNA和同源RNA从目标作物基因的转录，从而有效地降低或消除目标基因的活性。实施本技术的方法可参照澳大利亚专利说明书99/292514-A和专利说明书WO 99/53050。杂交的正义和反义序列的长度优选不少于19个连续的核苷酸，特别优选不少于50个核苷酸，最优选不少于100，200，500或1000个核苷酸。可使用和整个基因转录互补的全长序列。最优选的长度是100-2000个核苷酸。针对目标转录的正义和反义序列的同源程度应不低于85％，优选不低于90％，特别优选95-100％。RNA分子可包含仅起稳定作用的不相干的序列。

核糖酶

核糖酶可用于引入遗传变异，该遗传变异能使大麦中所设想的基因表达失活。核糖酶是具有酶促功能或催化功能的RNA分子，能在特定位点断裂由一个或通常是两个杂交序列定义的其它RNA分子。RNA的断裂片断能钝化目标基因的表达。核糖酶还可起钝化基因的反义分子的作用。核糖酶有一个或多个存在于杂交序列间的纺锤型或发夹型催化区。其它可用的核糖酶包括RNAseP，I或II组内含子，肝炎δ病毒。参见欧洲专利0321201和美国专利6,221,661。在转基因作物中使用核糖酶钝化基因已有实证，如Wegener等(1994)。

基因结构体/载体

本发明提供了分离的核酸分子，所述核酸分子包括编码基因抑制分子的RNA和DNA。优选该核酸分子编码了能靶向大麦SBEIIa基因序列和能有效地抑制了其在大麦麦粒胚乳中表达的反义序列、正义序列(协同抑制)、双链RNA或核糖酶分子。本发明还提供了包括分离的核酸分子，单个或多个调节因子如启动子、增强子、转录终止子或多腺苷酸序列在内的基因结构体。这些因子在本技术领域是众所周知的。基因结构体还可包括内含子序列，它能辅助转基因在作物中的表达，特别是大麦类单子叶作物。术语“内含子”使用其通常意思，即经转录但不编码蛋白质的基因片段，转录前从RNA中剪除。当转基因编码翻译产物时，内含子可整合于5’-未翻译区或编码区，而转基因没有编码翻译产物时，内含子则位于转录区域的任意位置。

本发明还提供包括了基因结构体的载体，例如质粒载体。术语“载体”包括能在体内或体外表达的表达载体，和能从一个细胞或组织转移到另一个细胞或组织的转移载体。载体含有能在大肠杆菌(E.coli)或土壤杆菌(Agrobacterium)等原核细胞中复制的序列。优选载体是含有T-DNA序列的双载体，它包含能引入到大麦细胞中的至少一个T-DNA边界序列。本发明还提供了包含载体的细胞，例如土壤杆菌或可再生的大麦细胞，如未成熟的胚盾片。相应地，这种含有转基因的细胞能转染大麦细胞。

启动子/终止子

本发明所述转基因或其它基因结构体包括转录起始区(启动子)，其用于大麦胚乳中的调控表达或组成型表达。启动子具有组织特异性，可在胚乳中选择性或专一性表达。启动子可以是胚乳特异性的(如高分子量麦谷蛋白启动子，小麦SSI启动子，小麦SBEII启动子，小麦GBSS启动子)，也可以是非胚乳特异性的(如ubiquitin启动子，或CaMV35S，或增强型35S启动子)。启动子受诸如温度、光或压力等许多因素的调控。通常，启动子可由待表达的遗传序列的5’端提供。基因结构体还可含有其它增强转录的因子，如nos 3’或ocs3’多腺苷酸区域或转录终止子。所述DNA区域可整合到含有适当的选择标记基因序列和其它因子的载体中，或整合到与含有这些序列的载体共转染的载体中。

大麦转化方法

在本技术领域，通过引入外源性核酸向作物引入遗传变异，和利用原生质体或作物未成熟的胚再生作物来转化大麦类单子叶作物的方法是众所周知的，如Wan和Lemaux(1994)，Tingay等(1997)，Nehra的加拿大专利申请2092588，加拿大国家研究委员会在澳大利亚的专利申请61781/94，日本烟草公司在澳大利亚的专利申请667939，孟山都公司的国际专利申请PCT/US97/10621，美国专利5589617，其它方法在专利说明书WO99/14314中有陈述。载有期望的核苷酸序列或基因结构体和选择标记的载体可引入可再生大麦细胞，该细胞来自于组织培养作物，或外植体，或合适的作物系统如原生质体。选择标记基因使大麦细胞具有了抗生素抗性或除草剂抗性，或允许其使用甘露糖等底物。优选选择标记使大麦细胞具有潮酶素抗性。优选可再生大麦细胞来自于未成熟的胚盾片，成熟的胚，源于上述组织的愈伤组织，或分生组织。

转基因作物可能含有选择标记基因，或那些能在再生过程中或再生后能去除的基因，例如通过切除就能去除的基因组中的选择标记基因，或通过分隔就能去除的SBEIIa-抑制性转基因中的选择标记基因。

含转基因或突变的染色体的作物可通过合适的转基因特异性的核酸探针或表型观察等进行筛选。多种方法可用于确认转基因作物的存在。例如，聚合酶链反应(PCR)可用于扩增转化作物中的特异序列，然后用凝胶电泳或其它方法检测扩增产物。可用传统方法从作物中提取DNA，再用引物进行聚合酶链反应(PCR)便能区分转基因作物与非转基因作物。例如，可设计用于扩增基因结构体所包含的转染载体中的一个DNA区域的引物，和设计感兴趣基因的反向引物。当作物被成功转化后，引物将扩增其中的一个片段。确认阳性转化株另一方法是本技术领域众所周知的Southern印迹杂交。转化或突变的作物可以通过下列因素所赋予的表型与未转化作物或野生型作物区分开：存在的选择标记基因，或经免疫学方法确认存在的特殊蛋白质，或缺失的某种蛋白质，如用ELISA试验检测到的胚乳中SBEIIa蛋白质的缺失。也可通过观测麦粒的表型特征来区分的这些作物，例如观测麦粒是否饱满，或测定直链淀粉含量是否升高，或用显微镜检查双反射是否存在。

突变

通过引入遗传变异而导致大麦胚乳SBEIIa或其它酶活性的降低亦可通过相应基因或该基因调节序列的合适突变而获得。基因受抑制的程度会在某种程度上决定得到的淀粉的特性。突变所产生的可能是切断突变体或无效突变体，它们对淀粉的性质有很大的影响，然而，使支链淀粉合成酶活性明显降低的渗漏突变体可导致支链淀粉结构的变化，进而使淀粉或大麦麦粒具有令人感兴趣的特性。其它的染色体重组也是有效的，它们包括删除，反转，复制或点突变。

可通过化学或辐射方法产生突变，例如用EMS或叠氮化钠对种子进行处理(Zwar和Chandler，1995)，或γ射线。突变体的分离可通过对发生诱变的作物或种子进行筛选实现。例如，已发生诱变的大麦可通过以下方式筛选出来：麦粒中直链淀粉含量升高和/或比普通支链淀粉更长的链长分布，或ELISA方法测定的SBEIIa蛋白质的缺失，或麦粒形态的改变(Green等，1997)。优选对已缺失一种SBE活性的大麦基因型进行筛选，例如SBEIIb缺失。通过将突变体与具有期望的遗传背景的作物杂交，可将突变引入到所期望的遗传背景中，同时进行适当数量的回交可去除原来的不需要的亲代遗传背景。

编码SBEI Ia或其它相关支链淀粉合成酶的基因发生突变一般会导致直链淀粉含量的相对增加。由于碳从支链淀粉向直链淀粉转移，单个麦粒中的直链淀粉量会增加，但如果麦粒的淀粉产量发生了明显下降，单个麦粒中的直链淀粉量则会减少。任意一种情况下，直链淀粉量所占的淀粉百分率都会升高。

食品生产

另一方面，本发明提供了适于食品生产的大麦，该麦粒来自于胚乳SBEIIa活性降低的大麦作物，所述麦粒直链淀粉含量相对较高，支链淀粉含量相对较低。本发明中，优选适合食品生产尤其是商业食品生产的大麦作物。该食品生产包括面粉制作或其它用作商业食品生产组分的产品的制作。

所设想的大麦遗传背景包括农作物产量和其它特性方面的考虑。这些特性包括想得到的是冬季大麦还是春季大麦，农艺学特性，抗病性和非生物逆境抗性。在澳大利亚，人们希望将其中的某个特性能杂交到的Sloop，Schooner，Chebec，Franklin，Arapiles，Tantangara，Galleon，Gairdner或Picola等大麦栽培品种中。所述例仅适合澳大利亚的某个特定生产区，其它品种适合于其它生长区。在本发明中，优选大麦品种在至少几个生长区的产量不低于相应的野生型品种产量的80％，特别优选不低于90％，最优选不低于95％。在对照田间试验中，产量可轻易地测量出。优选大麦作物是少壳的或“裸露的”，因为大麦麦粒外皮的存在会为麦粒的加工带来较大的困难。

麦粒的淀粉含量至少不低于12％(w/w)或15％，优选不低于25％，特别优选不低于35％，最优选接近野生型的45-50％(w/w)含量。淀粉含量低于野生型品种的原因可能是支链淀粉含量的降低。由于具有相对较高的直链淀粉含量，该麦粒在商业食品生产中仍然很有用。其它设想的特性包括麦粒研磨的难易程度。虽然大多数麦粒都可研磨成粉状，但某种结构的麦粒特别难研磨。对商业应用可能产生影响的另一特性是麦粒制品的着色性。麦粒外皮或其它部分显示出比一般部分更好的着色性，可能会局限其商业应用于较小范围，如作为含有有色麦粒或有色粗磨麦粒的面包的成分。大麦通常的颜色是很亮且刺眼的紫色，在大多数食品中都是不需要的。使大麦具有很高价值的另一因素是从麦粒中提取出来的淀粉的量，提取比例越高用处越大。麦粒的外形是影响其商业用途的另一特性，它可影响到麦粒研磨的难易程度。例如，直链淀粉含量高的MK6827大麦颗粒非常细长，难于研磨和加工。颗粒长度与其厚度的比率(L/T比率)可方便地用于衡量麦粒的细长形状和相应用途。该比率通常是由淀粉的性质决定。平均而言，优选比率低于5.5，特别优选4-5之间，最优选低于3.5。

就获取更高的产量而言，人们所希望得到的是饱满的麦粒，同时本发明的某些益处也得以实现，如高直链淀粉含量淀粉的生产，或两种淀粉中的一种的链长分布发生了改变。因此，优选麦粒具有饱满的表型。然而，在麦粒不饱满时，本发明的其它方面可能会得以更好地实现。麦粒不饱满时，糊粉层或胚对淀粉的比例会更高，从而由其所得到的大麦面粉或其它产品会含有更多的有益的糊粉层。高糊粉层含量的产品往往具有较高的维生素含量，如叶酸，或较高的矿物质含量，如钙，同时高糊粉层含量与较高的抗性淀粉含量和/或较高的β-葡萄糖含量结合可产生协同作用，如增强大肠对矿物质的吸收。

为使直链淀粉含量最大化，大麦作物除了SBEIIa活性降低外，还应有其它表型特征。因此遗传背景可能另外包括在AC38发生的amol突变(原因基因未知)或waxy突变(在Waxiro品种发现)。另外，在其它的胚乳缩小的大麦突变体中，可能发生双重突变，但胚乳缩小的原因基因目前尚不清楚。

通过标准方法很容易将淀粉从大麦麦粒中分离开来，例如Schulman等(1991)提出的方法。在工业规模，可使用干磨法和湿磨法。本发明涉及的大麦淀粉有相对较高的直链淀粉含量。大麦淀粉含有不低于35-45％的直链淀粉可认为直链淀粉含量较高。本发明中所涉及的大麦的直链淀粉含量大于50％(w/w)，优选不低于60％，特别优选不低于65％，70％，75％，80％或90％。

所提及的相对直链淀粉含量应作如下理解：其是相对总淀粉量而言的，所以淀粉的其余部分可能主要是某种中间类型的淀粉或支链淀粉或两者的混合物。

β-葡萄糖

众所周知，大麦中β-葡萄糖的含量变化范围较广，占大麦重量从约4％到约18％，但通常而言其变化范围是4％到约8％(例如Izydorcyk等，2000)。增强型大麦品种已被开发出来，例如，蜡样的β-葡萄糖占大麦重量从约15％到约18％。

本发明所设想的β-葡萄糖水平依赖于遗传背景，其中支链淀粉合成酶的活性包括SBEIIa均被降低。实施例表明了普通量β-葡萄糖的合成，但本发明的其他例子可以表明较高的相对β-葡萄糖含量。大麦作物麦粒的β-葡萄糖含量约为未去壳麦粒重量的3-6％(w/w)。本发明的其他例子可表明β-葡萄糖含量高于6％，或更高，例如6-8％。Waxy突变体中的β-葡萄糖水平高达15-18％，例如Prowashonupana品种，商业名为Sustagrain^TM(ConAgra^TM Specially Grain ProductsCompany，奥马哈，内布拉斯加州，美国)，而本发明所设想的β-葡萄糖水平将同它一样高，或更高。

胶凝温度

胶凝是淀粉颗粒中分子排列的崩裂(破坏)过程，同时伴随着性质方面不可逆变化，如微粒膨胀，微晶熔解，双折射丧失，粘度增加和淀粉溶液化。玉米ae(直链淀粉扩展)突变体的淀粉中的直链淀粉含量较高，其胶凝温度比普通玉米高(Fuwa等，1999，Krueger等，1987)。另一方面，缺失淀粉合成酶IIa活性的大麦sex6突变体产生的淀粉具有较低的胶凝温度，其胶凝峰值点的热焓与对照相比有所减少(Morell等，2003)。

本发明的另一方面，可通过差示扫描量热法测定淀粉的胶凝温度是否发生了变化。与野生型作物的淀粉相比，该变化可能是升高也可能是降低。淀粉胶凝温度的变化和直链淀粉的相对含量有关。胶凝温度降低时，与高直链淀粉含量的其它大麦品种产出的淀粉相比，该淀粉的直链淀粉含量是降低了，或者与正常直链淀粉含量的大麦产出的淀粉相比，该淀粉的直链淀粉含量也是降低了。本发明的其他例子设想使淀粉的胶凝温度保持不变或相对于野生型大麦淀粉的胶凝温度略有升高。通过差示扫描量热法测定的野生型大麦淀粉的胶凝温度的第一个峰值温度通常约为56℃。

膨胀体积

本发明所涉及的淀粉还可通过其在过量热水中的相对于野生型淀粉的膨胀率予以表征。膨胀体积的通常测定方法是将淀粉或面粉与过量水混合，然后加热升温，通常是高于90℃。接着用离心法收集样品，膨胀体积就是用沉淀物质的质量除以该样品的干重。在增加食品制备特别是含水食品制备中的淀粉含量时，低膨胀淀粉是很有用的。

结晶性

与从普通的大麦中分离出的淀粉相比，本发明优选的大麦突变体的淀粉结构在结晶性方面有所降低。淀粉结晶性的降低被认为同增强感官特性有关，并能产生更顺滑的口感。因此单个或多个支链淀粉合成酶活性水平的降低会导致淀粉结晶性的降低。结晶性的通常研究方法是X-射线结晶学。

支链淀粉链长分布

支链淀粉结构的变化可通过链长分布或淀粉的聚合度测定。链度分布可在异淀粉酶脱支后，使用荧光团辅助糖电泳法(fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis，FACE)测定。本发明所涉及淀粉中的支链淀粉链长分布范围是5-60，高于野生型作物淀粉脱支后测定的分布情况。长链淀粉的分支频率会相应地降低。因而在现有的支链淀粉上，淀粉可能有更长的支链淀粉链长分布。

食物特性

淀粉是人类饮食中碳水化合物的主要来源，本发明所涉及的麦粒及其制品可用于制备食物。食物可被人或动物消耗，例如畜牧业或宠物食品。源于改良大麦的麦粒能方便地在食品制作过程中使用，因此本发明包括研细的、碾碎的、粗粉状的、珠粉状的、碾细的麦粒或用处理过的或整粒的上述大麦麦粒制作的产品，包括面粉。这些产品可用于各种各样的食品，例如面包、蛋糕、饼干等淀粉制品，或者食品添加剂如增稠剂或粘合剂，或制作麦芽或其它大麦饮料，面条和快食汤。本发明所涉及的麦粒及其产品特别适合做早餐谷类。本发明所涉及的高支链淀粉含量淀粉可用于生产在糖果工业应用的高强度凝胶，或用于减少成型时间和固化时间。它们还可用作涂层，例如用于减少油炸马铃薯或其它食物的油吸附量。

食物纤维

本说明书所指的食物纤维包括碳水化合物和碳水化合物的消化产物，它们在健康人体的小肠中不被吸收，而是进入大肠。食物纤维包括抗性淀粉，β-葡萄糖和其他可溶和不溶的碳水化合物的聚合物。其中的部分碳水化合物能被大肠中的微生物所发酵，至少是部分发酵。

优选本发明的淀粉含有相对较高的食物纤维含量，尤其是高直链淀粉含量和可任意选择的高β-葡萄糖含量。本发明的麦粒的食物纤维含量可能单独或不完全来自于胚乳中增加的直链淀粉含量。β-葡萄糖含量升高有助于提高食物纤维含量。

本发明的某些方面还在于糊粉层和胚的组合同高含量食物纤维的结合。尤其是当麦粒有相对较高含量的糊粉层或胚时，这种结合就可能出现。首先，因为大麦有一个三细胞糊粉层而使其糊粉层含量比其它经济谷类均要高。其次，当大麦颗粒不太饱满时，胚乳的量就会减少，而糊粉层和胚的量则会相对上升。因而大麦除抗性增强外，还具有相对较高含量的某种有益元素或维生素，这些有益元素包括二价阳离子如能生物利用的Ca²⁺和维生素如叶酸或抗氧化剂如生育酚和生育三烯酚。钙对于骨骼和其它钙化组织的生长和沉积是必需的，并可降低在老年期患骨质疏松症的风险。在胎儿意识形成期摄取叶酸可保护神经管免受损害，叶酸也能降低患心血管疾病的风险，从而增强抗性淀粉与β-葡萄糖组合的作用效果。叶酸还可降低患某些癌症的风险。生育酚和生育三烯酚具有抗氧化剂的作用，同时可降低患癌症和心脏病的风险，还可减少食品组分的氧化所带来的不必要结果，如脂肪酸氧化产生的恶臭。研磨产品的一种特别形式是其中含有糊粉层。为增加研磨产品中糊粉层的含量，可采用特殊的研磨工艺。该方法可参见Fenech等(1999)。因而，用研磨或其他方法加工过的含有糊粉层和胚的麦粒制作的产品会有附加的营养价值，而不需要单独添加相应元素。

抗性淀粉

抗性淀粉是不被健康人体小肠吸收但进入大肠的淀粉和淀粉消化物的总称。因而，抗性淀粉不包括能被小肠消化和吸收的产物。抗性淀粉包括物理包埋淀粉(RS1型)，抗性颗粒(RS2)，老化淀粉(RS3)和化学改性淀粉(RS4)。

结构改变的淀粉，特别是本发明所涉及的高直链淀粉含量的淀粉做食物时可引起抗性淀粉的增加。如果β-葡萄糖含量增加，抗性淀粉也会增加，这可能是由于β-葡萄糖和淀粉颗粒相结合而对其中的淀粉产生保护作用。该淀粉可能是RS1型，一定程度上是难于消化的。能用V-复合结晶性(V-complex crystallinity)测定的淀粉-脂质结合体同抗性淀粉的含量也可能有一定的联系。在这种情况下，由于脂质的存在使得淀粉酶很难接近其中的淀粉，从而导致淀粉的抗性增加，相应地，这种淀粉-脂质结合体可认为是RS1淀粉。示例中的大麦淀粉是由于淀粉颗粒本身的结构所引起的消化抗性，那相应地它应含是RS2淀粉。上述这些特性可能单独出现或作为一个整体出现。

本发明的一个优点在于在不改良大麦麦粒中的淀粉或其它成分的情况下，即提供了具有高营养价值的产品。但是，可以设想对麦粒中的淀粉，β-葡萄糖或其它成分进行改良，本发明同时也包括了这些改良。改良的方法是众所周知的，包括用传统方法提取淀粉或β-葡萄糖或其它组分和改良淀粉以增加抗性组分。淀粉或β-葡萄糖可通过以下方法改良：热和/或湿气，物理处理(例如球磨研磨)，酶处理(例如使用α-或β-淀粉酶，普鲁兰酶或类似酶类)，化学水解(使用液体或气体试剂进行干法或湿法水解)，氧化，用双官能团试剂交联(例如三偏磷酸钠，氯氧化磷)，或羧甲基化。

血糖生成指数

血糖生成指数(GI)是食物和白面包或葡萄糖对血糖浓度变化的影响的对比。血糖生成指数可反映食物对饭后血清葡萄糖浓度的可能影响和为保持血糖动态平衡的所需胰岛素的量。由于高直链淀粉含量和高β-葡萄糖含量的影响，本发明提供了一种重要的低血糖生成指数的低热产品。低热产品以包括面粉在内的来自研磨大麦麦粒的产物为基础制作。可在初次处理麦粒时去除麦粒重量的10％或20％，从而移去糊粉层并尽可能移去胚。该处理过程的作用是减少脂质含量，从而降低食物的热值。由此制作的食物在低热的同时，还具有饱肚子，增强大肠健康，减少饭后血清葡萄糖和脂质浓度的作用。由于糊粉层和胚能提供一定的营养价值，所以使用该处理得到的产品将导致营养价值的减少。因为用上述方法加工处理后的产品会更白，所以用该产品生产的面粉有更好的外观。

非食品应用

本发明提供了改进或改良的淀粉，其直链淀粉含量升高或支链淀粉含量降低同时其性质可满足任何工业需求。淀粉广泛应用于非食品工业，包括造纸、纺织、瓦楞纸和粘合剂工业(Young，1984)。未改良淀粉的物理性质限制了它在某些方面的应用，常需要进行化学改良，而化学改良往往非常昂贵或有其它缺点。主要因为支链淀粉含量降低和由此其它物理性质的出现，本发明提供的淀粉在收获后不需要很多的改良。例如，用本发明的麦粒制成的淀粉和产品的起浆温度、剪应力抗性、膜强度和/或抗水性均可能改变。该淀粉也可作为聚苯乙烯的替代品用于制备可生物降解的、蓬松的包装材料。

虽然对本发明的不同方面均给出了各种各样的示例，但该发明仍包括两个或多个方面的组合。

实施例

实施例1.材料与方法

愈伤组织诱导溶液

用含麦草畏(Dicamba)(2.5mg/l)的BCI-DM溶液诱导大麦的胚的愈伤组织。每升溶液的组成如下：

MS salt Macro(10x stock)：    100ml

MS micro(100x stock)：        10ml

铁(200x stock)：              5ml

EDTA(200x stock)：            5ml

麦芽糖：                      15.0g

维生素B1-氯化氢(1mg/ml)：     1ml

肌醇：                        250mg

酪蛋白水解物：                1g

麦草畏(1mg/ml)：              2.5ml

脯氨酸：                      345mg

将pH值调节到5.8，然后加入3.5g/l的植物凝胶。对溶液进行高压蒸气灭菌之后，加入150mg/l的特美汀(Timentin)和50mg/l的潮霉素(Hygromycin)。

大麦再生溶液

大麦愈伤组织在含有BAP(1mg/l)的FHG溶液中再生

FHG-I Macro(10x stock)：            100ml

FHG-II Micro(100x stock)：          10ml

维生素B1-氯化氢(1mg/ml)：           1ml

铁(200x stock)：                    5ml

EDTA(200x stock)：                  5ml

BAP(1mg/ml)：                       1ml

肌醇：                              100mg

谷氨酰胺：                          730mg

麦芽糖：                            62g

将pH值调节到5.8，然后加入3.5g/l的植物凝胶。对溶液进行高压蒸气灭菌之后，加入150mg/l的特美汀和20mg/l的潮霉素。

碳水化合物的测定与分析

应用Schulman等(1991)的方法将淀粉从大麦麦粒分离出来。

利用Megazyme公司(Bray，Co Wicklow，爱尔兰共和国)提供的总淀粉分析成套工具测定淀粉含量。淀粉含量与对照植物对比。从总麦粒质量中减去淀粉质量得到的麦粒总的非淀粉质量可以确定总质量的减少是不是由于淀粉的减少。

将脱支淀粉分离出来后，其中的直链淀粉含量或直链淀粉/支链淀粉比率可用HPLC方法测定，或利用Batey和Curtin(1996)描述的碘结合法进行测定。简言之，淀粉首先溶解在二甲基亚砜(DMSO)中脱脂，然后加入乙醇使之再沉淀。将淀粉重新溶解在二甲基亚砜中并加入水，稀释，加入碘/碘化钾溶液，在605nm测定溶液的吸光度。直链淀粉含量通过标准曲线测定，标准曲线用含0-100％直链淀粉的直链淀粉和支链淀粉的混合物绘制。未脱支淀粉的直链淀粉/支链淀粉比率的测定可按照Case等(1998)中的方法进行。

利用Megazyme公司(Bray，Co Wicklow，爱尔兰共和国)提供的成套工具测定β-葡萄糖水平。

淀粉脱支后，可按Morell等(1998)中的方法用毛细管电泳柱进行荧光团辅助糖电泳(FACE)对链长分布进行分析。

差示扫描量热法(DSC)

差示扫描量热法可用来测定淀粉由于直链淀粉和支链淀粉比率的改变引起的胶凝温度的变化。用Pyris 1差示扫描量热仪(PerkinElmer，Norwalk CT，美国)测定胶凝温度。淀粉与水按照2份水：1份淀粉的比率混合，将混合物(40-50mg，准确称量)放入不锈钢盘中并密封。在20℃到140℃范围内扫描样品，升温速度为10℃每分钟，同时用空的不锈钢盘作为参比。使用Pyris软件测定胶凝温度和焓。

RVA分析

面粉粘度用快速粘度分析仪(Rapid-Visco-Analyser，RVA)(Newport Scientific Pty Ltd，Warriewood，悉尼)测定，测试条件同Batey等1997报道的全麦面粉的测试条件。为了抑制α-淀粉酶，在所有测试中均使用浓度为12mM的硝酸银。测定的参数包括峰值粘度(最大热浆粘度)，热浆粘度，最终粘度和起浆温度。

面粉润胀

面粉润胀体积根据Konik-Rose等(2001)提出的方法测定。将样品和规定温度的水混合，收集胶凝物质并测定其质量，和混合前的样品相比即可得出吸水量。

实施例2从大麦分离SBE基因

构建大麦cDNA和基因组文库

大麦cDNA和基因组文库可在噬菌体载体中用标准方法构建(Sambrook等，1989)。根据试剂的使用方法可在ZipLox载体(LifeTechnology)中构建cDNA。该库的滴定度经大肠杆菌的Y1090(ZL)株测定应为2x10⁶ pfu。从E.Lagudah(CSIRO)得到的大麦基因组文库根据Morex.品种的DNA制备。该DNA用MboI消化并连接到EcoRI/BamHI消化的EMBL3cos载体上。克隆片段用SalI消化释放。

从H.vulgare基因组文库分离SBEIIa和SBEIIb基因序列

库筛选条件是：25％甲酰胺，5x SSC，0.1％SDS，10x Denhardts溶液，100μg/ml鲑精DNA中42℃杂交16小时，接着用2x SSC，0.1％SDS在65℃清洗3次，每次1小时(中等严谨度)。然后将含SBEIIa和SBEIIb基因的克隆分离并测序。所得的DNA序列与表1中入藏登记号对应的序列对比可以证实这两种基因均已从大麦中分离出来。SBEIIa和SBEIIb的cDNA序列还可用特别的引物进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)获得，这在本技术领域是众所周知的。大麦SBEIIa和SBEIIb的cDNA序列见图1和2，小麦SBEIIa和SBEIIb基因组序列见图3和4。

表1.谷类作物中淀粉分支酶基因的特性

实施例3：在改变大麦SBEIIa和SBEIIb表达的转化试验中使用的结构体

双链RNA(dsRNA)结构体用于降低大麦SBEIIa或SBEIIb基因的表达。在该结构体中，对应于部分SBEIIa或SBEIIb基因的核酸序列相对于启动子以反义和正义方向排列，这种排列使得表达得到的含互补区域的RNA能碱基配对并形成双链RNA。反义和正义序列间的间隔区含有内含子序列，当它在转化的作物中作为RNA的一部分被转录时，会被剪除并形成紧密的“发夹”式双链结构。内含子的存在会提高双链RNA结构体所引起的基因沉默的效率(Smith等，2000)。所设计的核酸与高分子量麦谷蛋白(HMWG)启动子序列(DX5亚基因启动子，入藏登记号X12928，Anderson等，1989)和来自于土壤杆菌的胭脂碱合成酶基因的终止子序列(nos3’)相连接。

由于大麦和小麦基因之间有高度的序列同源性，含有SBEIIa或SBEIIb反义/正义片段的双链RNA结构体可从小麦的SBEIIa和SBEIIb基因获取，该结构体最初在pDV03000载体上产生，然后被切掉并连接到大麦转化载体pWBVec8中。该结构体的示意图参见图5。pWBVec8载体含有许多限制性内切酶位点以便所需的DNA序列能掺入。

SBEIIa双链RNA结构体中含有从小麦SBEIIa基因经聚合酶链反应扩增得到的1536bp的核苷酸序列(GenBank入藏登记号AF338431，见图3)。它包括：由外显子1、2和外显子3的一部分组成的468bp序列(核苷酸位置1058到1336，1664到1761和2038到2219，见图3)，该序列两端均有EcoRI和KpnI限制性位点(片段1)，由外显子3和4的一部分、SBEIIa的内含子3组成的512bp序列(核苷酸位置中2220到2731，见图3)，该序列两面均有KpnI和SacI位点(片段2)，和由SBEIIa的外显子1，2和3组成的528bp片段(核苷酸位置1058到1336，1664到1761和2038到2279，见图3)，其两端均有BamHI和SacI位点(片段3)。然后将片段1，2和3连接起来以便片段3序列能沿片段1的反义方向连接到片段2。pDV03000载体上的基因结构体命名为pDV03-IIa，而双链RNA基因命名为ds-SBEIIa。

SBEIIb双链RNA结构体的构建策略是类似的。SBEIIb结构体含有从小麦SBEIIb基因经聚合酶链反应扩增得到的1607bp片段(序列如图4所示)。它包括：由外显子1、2和外显子3的一部分组成的471bp序列(核苷酸位置489到640，789到934和1598到1769，见图4)，该序列两端均有EcoRI和KpnI限制性位点(片段1)，由外显子3和4的一部分、SBEIIb的内含子3组成的589bp序列(核苷酸位置1770到2364，见图4)，该序列两面均有KpnI和SacI位点(片段2)，和由SBEIIb的外显子1，2和3组成的528bp片段(核苷酸位置489到640，789到934和1598到1827，见图4)，其两端均有BamHI和SacI位点(片段3)。然后将片段1，2和3连接起来以便片段3序列能沿片段1的反义方向连接到片段2。pDV03000载体上的SBEIIb双链RNA结构体基因命名为pDV03-IIb，双链RNA基因命名为ds-SBEIIb。

使用限制性内切酶ApaI和NotI将启动子-正义序列/反义序列-终止子盒子插入双载体pWBVec8中。pWBVec8中的SBEIIa结构体命名为pVec8-IIa，pWBVec8中的SBEIIb结构体命名为pVec8-IIb。结构见图5所示。

将小麦SBEIIa序列和相应的大麦SBEIIa序列用Gap程序比较，它们的同源性为93％。用类似方法比较小麦SBEIIb序列和相应的大麦SBEIIb序列可知它们的同源性为92％。当双链区域序列的同源性大于85％时，双链RNA技术能有效地沉默该基因的表达，因此可以设想用小麦序列构造的双链结构体对大麦序列是有效的。

实施例4：大麦的转化

用根癌土壤杆菌或生物弹介导的大麦转化方法已有叙述(Tingay等，1997；Wan等，1994)，同时该方法还可用于转移DNA结构体以产生转基因作物。本例中，如上所述的双载体中的基因结构体通过三亲株结合法引入到剧毒的土壤杆菌菌株，然后用它将含抑制基因(ds-SBEIIa或ds-SBEIIb)的T-DNA和选择标记基因(编码潮霉素抗性，从CaMV35S启动子表达得到)引入到可再生的大麦未成熟胚盾片细胞中，过程如下。

在开花12-15天之后，将正在发育的Golden Promise品种大麦种子从温室中的成熟作物的穗状花序中采摘下来，在20％(v/v)漂白液中消毒10分钟，然后用95％乙醇漂洗一次，再用无菌水漂洗七次。将胚(大约尺寸为1.5到2.5mm)在无菌条件下从种子中移出，并将胚中的胚轴切除。胚切边后放置到盛有愈伤组织诱导溶液的陪替氏培养皿中。将土壤杆菌转化结合子(AGL1菌株)在含壮观霉素(50mg/l)、利福平(20mg/l)的MG/L培养液(1升溶液中含5g甘露醇，1gL-谷氨酸，0.2g KH₂PO₄，0.1g NaCl，0.1g MgSO₄.7H₂O，5g胰胨，2.5g酵母抽提物，和1μg维生素H，pH7.0)中培养，28℃通风培养到浓度约为2-3x 10⁸个细胞/ml，然后取约300μl细胞悬浮液加入到放有胚的陪替氏培养皿中。2分钟后，倾出多余的液体，并将胚翻转以使切边(盾片的腋面)朝上。接着将胚转移到放有愈伤组织诱导溶液的新培养皿中，24℃避光放置2-3天。将胚转移到愈伤组织诱导溶液进行选择(50μg/ml潮霉素和150μg/ml特美汀)。于24℃避光中放置2周。将正常的愈伤组织分开并放在新的具选择作用的溶液中24℃避光继续培养2周。紧接着，将胚放到含细胞分裂素的再生溶液中24℃见光培养2周，然后再转移到含细胞分裂素和植物生长素的植根介质中培养六周。幼体植物接着被转移到土壤混合物中并在潮湿的工作台中放置2周，最后转移到温室。总共有400个使用pVec8-IIb的胚和300个使用pVec8-IIa的胚用本方法处理，来自于7个愈伤组织用IIb转化的18颗植物和来自于14个愈伤组织用IIa转化的18颗植物在具选择作用的溶液中存活，表明它们顺利地被该基因结构体转染了。不是所有为选择标记基因转化的植物都整合了SBEIIa或SBEIIb的抑制基因；接下来的例子中所述的方法会很容易地将它们区分。

实施例5.双链RNA结构体转化的大麦作物和麦粒的分析

大麦作物或子代种子或作物中是否存在转基因可通过聚合酶链反应(PCR)技术或Southern印迹杂交分析确定。DNA用标准方法从假定转化了的作物的叶子制备。

已转化大麦的PCR分析-转基因的测定

用于筛选是否存在ds-SBEIIa转基因的正向和反向引物分别是BX17 3’(5’-CAA CCA TGT CCT GAA CCT TCA CC-3’)序列号为5和AR2akpnR(5’-GGT ACC CCA TCT CCT GGT TTT GGG ACA AC-3’)序列号为6。该引物对从含ds-SBEIIa转基因的作物中扩增得到的是一个569bp的产物，其对应于转基因HMWG启动子序列和2219号核苷酸间的一段区域，见图3。用于筛选是否存在的ds-SBEIIb转基因的正向和反向引物分别是BX17 3’(同上)和AR2bkpnR(5’-GGT ACCGTC CAT TTC CCG GTG GTG GCA G-3’)序列号7。该引物对从含ds-SBEIIb转基因的作物中扩增得到的是一个571bp的产物，其对应于转基因HMWG启动子序列到2219号核苷酸间的一段区域，见图4。PCR扩增在含2.5个单位Hotstar Taq，1x缓冲溶液的20μl容器中进行，然后加入含1.5mM MgCl₂，0.125mM的四种三磷酸脱氧核苷酸(dNTPs)，1μM正向和反向引物及100ng DNA。PCR程序包括首先在95℃变性5分钟，然后循环36次，95℃下30秒，59℃下1分钟和72℃下2分钟，最后72℃下5分钟。对于SBEIIa和SBEIIb结构体均确认有阳性大麦转换体(图6)。数据归纳于表2。

表2.大麦SBEIIa和SBEIIb转基因系的PCR和Southern杂交结果

SBEIIb转基因系编号	转化事件编号<sup>a</sup>	PCR	Southern	SBEIIa转基因系编号	转化事件编号<sup>a</sup>	PCR	Southern
								IIb1.1	1	-	-	IIa1.1	1	-	-
IIb1.2	1	-	-	IIa2.1	2	-	-
								IIb1.3	1	+	+(vf)	IIa3.1	3	+	-
IIb2.1	2	+	+	IIa3.2	3	+	-
								IIb2.2	2	+	+	IIa4.1	4.1	+	+
IIb3.1	3	+	+	IIa4.2	4.2	+	+

IIb4.1	4	+	+	IIa5.1	5	+	nr
								IIb4.2	4	+	+	IIa5.2	5	+	+
IIb4.3	4	+	+	IIa6.1	6	+	+
								IIb4.4	4	+	+	IIa6.2	6	+	+
IIb4.5	4	+	+	IIa7.1	7	-	-
								IIb4.6	4	-	+	IIa9.1	9	+	nr
IIb5.1	5	+	+(f)	IIa10.1	10	+	nr
								IIb8.1	8	+	-	IIa11.1	11	-	-
IIb8.3	8	+	-	IIa13.2	13	+	nr
								IIb8.4	8	+	+(f)	IIa13.3	13	+	nr
IIb9.1	9	+	+	IIa15.1	15	+	nr
												IIa16.1	16	-	-

a：转化事件编号。具相同编号者为从同一愈伤组织分离得来，可能是同一来源也可能是独立来源。不同编号：独立转换体。

(f)：弱；(vf)：很弱；nr：无结果

转化大麦的Southern印迹杂交分析

对来自含ds-SBEIIa和ds-SBEIIb转基因的作物和其子代的DNA进行Southern印迹杂交分析以确认PCR结果。用标准方法从作物制备的DNA，经EcoR1消化，在1％琼脂糖凝胶中进行电泳，并印迹到Hybond N⁺尼龙膜(Amersham)。放射标记的探针从SBEIIa基因的内含子3区域(位置2220到2731，见图3)和SBEIIb基因的内含子3区域(位置2019到2391，见图4)产生。这些片断分别是ds-SBEIIa和ds-SBEIIb结构体的一部分(例3)，使用Megaprime DNA标记系统(Amersham Pharmac ia Biotech UK Ltd)将它们进行放射性标记并用于杂交。杂交在25％(v/v)甲酰胺、5x SSC、0.1％SDS、10xDenhardt’s溶液，100μg/ml鲑精DNA中，42°进行16小时，然后用2x SSC，0.1％SDS在65℃漂洗3次，每次1小时。该尼龙膜经放射自显影术处理如显示有杂交带则表明相应的作物已被双链RNA结构体转化(图7)。由于使用的小麦内含子3探针的遗传分化，杂交中没有检测出内源性的SBEIIa和SBEIIb基因片段。

PCR和Southern杂交分析结果归纳见表2。一般而言，PCR和Southern杂交结果的相关性很好。由于假阴性的影响，可能会出现差异性，但它可很容易地通过重复试验来解决。两种方法均证实转基因结果为阳性的作物包括4个独立的ds-SBEIIa Southern转化事件(IIa4.1，IIa4.2，IIa5和IIa6)和5个独立的ds-SBEIIb Southern转化事件(事件编号为IIb2，IIb3，IIb4，IIb5和IIb9)。

用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析大麦胚乳蛋白质

为确定ds-SBEIIa和ds-SBEIIb转基因在转化作物中对大麦SBEIIa和SBEIIb基因表达的影响，可用未变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western印迹测定发育麦粒中胚乳组织表达的特定蛋白质。因为可从T1种子(种子来源于T0作物)中分离转基因，所以在开花20天后，从每个T0作物选取10颗正在发育的T1麦粒，分析其中每个麦粒胚乳的SBEIIa和SBEIIb蛋白质表达。为保存T1作物，从正在发育的麦粒中取出胚进行培养，以重新生成T1作物。将从母系组织取出的胚乳(0.2g)均匀分散到600μl的50mM的Kpi缓冲液中(42mM K₂HPO₄和8mM KH₂PO₄)，pH7.5，含有5mM EDTA，20％甘油，5mM DTT和1mM Pefabloc。样品研磨后在13,000g速度下离心分离10分钟，上清液等分后在-80℃冷冻保存以备用。蛋白质水平以BSA为参照用Coomassie试剂测定。将从胚乳中提取的总可溶蛋白质放入泳道中，每个里面约放20μg，在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，该凝胶含0.34M Tris-HCl(pH8.8)、丙烯酰胺(8.0％)、过硫酸铵(0.06％)和TEMED(0.1％)。电泳完成后，按照Morell等(1997)规定的步骤，将蛋白质转移到硝化纤维膜，并与SBEIIa或SBEIIb的特异性抗体发生免疫反应。用于检测SBEIIa的抗体是来源于野兔的3KLH，该抗体可抗序列号为8的合成肽AASPGKVLVPDESDDLGC(来自SBEIIa N-端的序列)，使用时需先以l∶5000稀释。用于检测SBEIIb的抗体是R6，该抗体可抗序列号为9的合成肽AGGPSGEVMIGC(推测的来自SBEIIb N-端的序列)，使用时需先以1∶6000稀释。使用的二抗是GAR-HRP结合体(1∶3000稀释)，免疫反应带可用Amersham ECL-检测系统检定。

ds-SBEIIa或ds-SBEIIb基因转化作物的正在发育的T1种子中的蛋白质表达被分割成1∶2∶1比例，即强带：中-弱带：无带，对一些转化系无带(例如，见图8和9)。该比例与设想的纯合子(野生型＝非转基因)：杂合子：转基因纯合子的分割比例一致。源于回收胚的T1作物生长产生T2种子，该种子通过多聚酶链反应和蛋白质表达分析筛选可确认T1种子转基因的遗传状况。

这些数据表明：双链RNA结构体在减少大麦胚乳SBEIIa和SBEIIb的基因表达方面有效。

含ds-SBEIIa转基因的种子的SBEIIb基因的表达和含ds-SBEIIb的种子的SBEIIa基因的表达也可通过Western印迹方法分析。出乎意料的是，含ds-SBEIIa转基因的种子，例如转化事件IIa 4.1，SBEIIb的表达大大降低。图9表明来自于IIa 4.1.8系的种子SBEIIb仅有低水平的表达(需要注意的是7条带中有4条很弱的带)。该系含ds-SBEIIa转基因，其SBEIIa表达可忽略。然而，含ds-SBEIIb转基因的种子却没有观察到相反的结果。种子的中SBEIIa表达没有变化，而SBEIIb完全被ds-SBEIIb沉默(图10)，即转化事件IIb4和IIb2中的转基因系。包含外显子1-3的区域被用于ds-SBEIIa和ds-SBEIIb双链结构体。该区域中SBEIIa和SBEIIb的序列排列仅有约70％同源性。同源性为100％的最长片断是外显子2中的一个21bp区域。由于序列的同源性，尽管SBEIIb的表达有可能是被ds-SBEIIa结构体所抑制，但SBEIIb的活性也可能由于ds-SBEIIa转基因通过其他的机理而降低。

SBEIIa和SBEIIb基因的表达水平也可通过信使RNA的水平使用Northern杂交或RT-PCR等标准技术予以特异性地测定，例如，使用来自于非保留区域的探针或能在特定位点与单个基因杂交而不与其它基因杂交的引物对，如在3’未翻译区。通过比较两个基因序列，这样的区域或位点很容易识别。

例6.包括淀粉在内的麦粒组成与含量分析

麦粒的组成与含量，特别是淀粉，可使用诸如实施例1描述的标准方法测定。

含ds-SBEIIa转基因的正在发育的种子采用如上所述方法将可溶性蛋白质提取出来之后，在光学显微镜下观察个体胚乳样品的淀粉颗粒。在检验的五种转化事件中，有三种事件，即IIa 4.1，IIa 4.2和IIa 13，其胚乳中SBEIIa的表达已减少，在这些正在发育的胚乳中，可看到淀粉颗粒形态的明显变化(例如见图11)，但对于仅存在较低程度基因抑制的事件IIa 5或IIa 6中，却看不到这种变化。例如，来自于IIa 4.2.5种子的淀粉，在蛋白质免疫印迹没有SBEIIa带，与IIa 4.2.3种子的正常麦粒相比发生了严重变形，而后者在蛋白质免疫印迹中有SBEIIa强带(表3)。光学显微镜的观测结果被扫描电子显微镜所证实，扫描电子显微镜可用于直接观察淀粉颗粒。为进行该项工作，纯净的淀粉用金轰击并在室温用15Kv电压进行扫描。SBEIIa表达降低的种子在扫描电子显微镜下呈现扭曲的不规则形状，例如，与IIa 4.2.3种子相比，IIa 4.2.5种子的淀粉颗粒就发生了变形(图12)。

与含有ds-SBEIIa的作物相反，，ds-SBEIIb转化的作物在显微镜中呈现正常形态的胚乳淀粉颗粒，例如IIb 4.1系(见表3)。这说明，SBEIIb表达的单独降低不会实质性地改变淀粉颗粒的形态。

表3.大麦ds-SBEIIa和ds-SBEIIb转基因系T1胚乳组织的淀粉颗粒形态

编号	转基因系	免疫印迹的蛋白质带	淀粉颗粒形态(光学显微镜)
				1	IIa 4.1.8	无带	变形
2	IIa 4.1.4	强带	正常
				3	IIa 4.1.3	强带	正常
4	IIa 4.2.1	无带	变形
				5	IIa 4.2.9	无带	变形
6	IIa 4.2.5	无带	变形
				7	IIa 6.2.8	无带	正常
8	IIa 5.2.3	无带	正常
				9	IIa 6.2.2	强带	正常
10	IIa 4.2.3	强带	正常
				11	IIa 13.1.9	无带	正常
12	IIa 13.1.10	弱带	正常
				13	IIa 13.1.3	强带	正常
14	IIa 13.2.4	无带	部分变形
				15	IIa 13.1.6	弱带	正常
16	IIb 4.1.9	无带	正常
				17	IIb 4.1.8	无带	正常
18	IIb 4.1.2	无带	正常

双折射是指物质沿两个方向折射光的能力，当用偏光显微镜观察时，它会在每个淀粉颗粒上产生被称为“马尔他十字”的黑色交叉。双折射是颗粒内部聚合物的组织结构有序程度的指示器(Thomas和Atwell，1999)。在偏振光照射下，IIa 4.2.5种子胚乳中的淀粉颗粒(SBEIIa活性已降低)，与来自于IIa 4.2.3的种子(野生型)相比，其双折射明显消失。平均而言，和IIa 4.2.3种子的2.2％形成对比的是，IIa 4.2.5种子颗粒中有44.8％没有双折射(表4)。淀粉颗粒中双折射的丧失与其中直链淀粉含量的增加通常有很好的相关性。

表4.大麦ds-SBEIIa转基因系T1胚乳淀粉颗粒的双折射

BF：双折射

对含ds-SBEIIa的IIa 4.2系的转基因种子的麦粒质量进行分析，该作物生长在温室中，结果表明麦粒重量和淀粉产量没有发生明显降低，即便在淀粉颗粒高度扭曲的种子中亦如此(表5)。这与在大麦SSIIa基因突变体中观测到的麦粒重量和淀粉产量减少相反(Morell等，2003)。这就表明该平均麦粒重量和田间种植的胚乳SBEIIa活性降低的大麦的产量基本正常。

表5.大麦SBEIIa转基因IIa4.2系T1种子的麦粒重量

编号	种子来源系列号	淀粉颗粒形态	麦粒重量(mg)
				1	IIa 4.2.1	正常	46.4
2	IIa 4.2.2	高度变形	39.3
				3	IIa 4.2.3	变形	39.0
4	IIa 4.2.4	变形	40.8
				5	IIa 4.2.5	高度变形	37.3
6	IIa 4.2.6	正常	41.8
				7	IIa 4.2.7	正常	35.0
8	IIa 4.2.8	高度变形	41.5
				9	IIa 4.2.9	高度变形	41.1
10	IIa 4.2.10	高度变形	38.6

转基因大麦麦粒的直链淀粉和支链淀粉含量

在直链淀粉含量高的情况下，大麦种子的淀粉颗粒会发生变形(Morell等，2003)，在直链淀粉含量为90％的低支链淀粉(LAPS)玉米中，其淀粉颗粒也会变形(Sidebottom等，1998)。直链淀粉含量可在90％(w/v)二甲基亚砜(DMSO)通过体积排阻HPLC测定，或者用实施例1所述的碘蓝值(碘量法)测定。根据麦粒和直链淀粉的重量，可计算出转基因系与对照系麦粒中的直链淀粉含量并进行对比。

将淀粉从用于分离ds-SBEIIa的T1代作物，含ds-SBEIIa转基因的T2代作物(可能是ds-SBEIIa的纯合子)或IIa 4.2.5系和IIb4.3.8系的杂种(含有ds-SBEIIa和ds-SBEIIb)的大麦麦粒中分离出来，其中的直链淀粉含量可通过Morrison和Laignelet(1983)提出的比色法测定。如下所示，五个池中的麦粒样品的直链淀粉含量被测定。650nm的吸光度读数用回归方程，Y＝137.38x-30.361，换算成直链淀粉含量的百分率，该回归方程由土豆直链淀粉和支链淀粉组成的标准样品(直链淀粉含量为0到100％)导出，式中的x代表在650nm测得的吸光度，Y代表直链淀粉含量的百分率。

样品：

池1：转基因IIa 4.1系的7颗T1种子，其中的淀粉颗粒严重变形。

池2：转基因IIa 4.1系的6颗T1种子，其中的淀粉颗粒略有变形。

池3：转基因IIa 4.1系的7颗T1种子，其颗粒具有正常外观。

池4：转基因的IIa 4.2.5系的6颗T2种子，其淀粉颗粒严重变形。

池5：IIa 4.2.5和IIb 4.3.8(ds-SBEIIb转基因系)杂交的5颗F1种子，其淀粉颗粒严重变形。

对照：大麦SSIIa突变体M292(Morel等，2003)，大麦cv Himalaya和SSIIa小麦突变体(Yamamori等，2000)

变形的淀粉颗粒表明SBEIIa活性降低的大麦麦粒淀粉中有超过80％直链淀粉。通过对比样品池1，2和3可知，直链淀粉含量随淀粉颗粒变形程度的增加而增加(表6)。样品池1，2中的直链淀粉含量高于大麦SSIIa突变体M292(表6)。池5是来自于ds-SBEIIa和ds-SBEIIb转基因系杂交的F1麦粒，其直链淀粉含量更高(＞90％)。需要注意的是，用本方法测得的吸光度值可能会受到支链淀粉结构的轻微影响。

表6.SBEIIa活性降低的转基因大麦系麦粒中的直链淀粉含量

因为谷类淀粉几乎完全由直链淀粉和支链淀粉组成，这就意味着这些麦粒淀粉中的支链淀粉含量会明显地减少，即从野生型中的约75％到低于20％，或甚至低于10％。

例7.大麦SBEIIa基因突变

大麦SBEIIa基因突变可导致SBEIIa的不表达，而这种突变可通过γ射线辐射或化学诱变实现，例如硫酸甲乙酯(EMS)。对于γ射线诱导的突变，种子用20-50kR剂量的⁶⁰Co源γ射线照射(Zikiryaeva和Kasimov，1972)。EMS诱变则按Mullins等(1999)的方法用EMS(0.03％，v/v)处理种子。突变体的麦粒根据直链淀粉含量的增加和淀粉颗粒形态的变化进行识别，并用上述方法证实。SBEIIa的突变体能够进行重诱变，从而可筛选出缺失了SBEIIb活性的子代，以及缺失了SBEIIa活性的子代，或者SBEIIa突变体和SBEIIb突变体杂交以合并突变并产生不含转基因且其胚乳SBEII活性消失的大麦品种。

例8.克隆SBEI基因和抑制SBEI基因在大麦表达的结构体

通过探针和大麦cDNA或基因组文库杂交或多聚酶链反应(PCR)实现SBEI基因的分离。PCR引物可基于小麦的同源基因而确定，例如基于Genbank AF076679阐述的DNA序列。使用的引物可以是序列号为10的5’ACGAAGATGCTCT GCCTCAC 3’和序列号为11的5’GTCCAACATCATAGCCATTT 3’，它应能产生约1015bp的PCR产品。与上述的SBEIIa和SBEIIb相似，可用SBEI基因序列构建抑制基因结构体，然后引入大麦中。

例9.SBEIIa突变体与其它淀粉合成酶突变体的结合

含ds-SBEIIa转基因和低活性SBEIIa基因的作物与大麦系M292(SSIIa突变体)和High Amylose Glacier(HAG)杂交，可建立以下四种杂交形式：

1.IIa 4.1.10系x HAG

2.IIa 4.1.16系x HAG

3.IIa 4.1.20系x M292

4.IIa 4.1.19系x HAG

F1作物可自我繁殖，突变的纯合子系可通过遗传和分子分析识别。ds-SBEIIa转基因作物与SSIIa突变体杂交有望得到直链淀粉和β-葡萄糖含量均很高的淀粉。ds-SBEIIa转基因作物与HAG突变体杂交除直链淀粉含量升高外，还会进一步改变淀粉组分，进而提高其性能。

例10.田间种植大麦的特性

包括M292和M342系(SSIIa突变体，大致含60-65％直链淀粉)在内的多个田间种植的大麦品种的去壳麦粒重量和β-葡萄糖含量被测定。由结果(表7)可知M292和M342的去壳麦粒尺寸变小了，但β-葡萄糖含量相对于野生型品种(3.0-6.0％β-葡萄糖)有所增加。在该条件下长成的田间种植野生型麦粒的平均重量是35-45g/1000个去壳麦粒，野生型品种麦粒的β-葡萄糖含量是3-6％。

表7.田间种植大麦的去壳麦粒重量和β-葡萄糖含量

品种

1000去壳麦粒重量<sup>a</sup>(g)

％β-葡萄糖<sup>a</sup>

Tantangera	34.90，35.40	3.01，3.37
			Sloop	37.90，41.90	3.04，2.54
Waxiro	36.60，37.10	5.14，6.86
			Schooner	42.60，38.60	3.85，3.73
Gairdner	44.80，37.10	4.61，4.19
			Namoi	40.80，40.80	5.19，4.34
Himalaya	39.60，37.90	6.04，5.50
			M292	25.10，28.70	10.01，9.53
M342	28.90，30.30	8.02，8.65
			Tantangera x M292DH	21.20，20.40	9.08，10.95

a：在田间多次统计并给出了重复值

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，熟知本领域的技术人员对此所作的任何修改和变化，均应包含在本发明的保护范围之内。

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序列表

<110>联邦科技产业研究组织

<120>改变了淀粉分支酶活性的大麦及增加了直链淀粉含量的淀粉和含淀粉产品

<160>11

<210>1

<211>2554

<212>DNA

<213>大麦

<220>

<223>SSBEIIa cDNA

<400>1

ggcgagatgg cggaagtaaa catgacaggg ggggctgcag aaaaacttga atcttcagaa60

ccgactcagg gtattgcgga aacaatcact gatggtgtaa ccaaaggagt taaagaacta120

gtcgttgggg agaaaccgca agttgtccca aaaccaggag atgggcaaaa aatatacgag180

attgacccaa cgctgaaaga ttttcggagc catcttgact accgatacag cgaatacaag240

agaattcgtg ctgctattga ccaacatgaa ggtggattgg aagttttttc tcgtggttat300

gaaaagcttg gatttacccg cagtgctaaa ggtatcactt accgagaatg ggctcctgga360

gcgcattctg cagcattagt aggtgacttc aacaattgga acccaaatgc agatactatg420

accagagatg attatggtgt ttgggagatt ttcctcccta acaatgctga tggatcccct480

gctattcctc atggctcacg tgtaaagata cggatggata ctccatctgg tgtgaaggat540

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aattcatatg ctaattttag ggatgaggtg ctgccaagaa ttaaaaggct tggatacaat780

gcagtgcaga taatggcaat ccaggagcat tcatactatg cgagctttgg gtaccatgtt840

actaattttt ttgcaccaag tagccgtttt ggaactccag aggacttaaa atccttgatc900

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<210>2

<211>2780

<212>DNA

<213>大麦

<220>

<223>SSBEIIb cDNA

<400>2

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cgtcgatcca gcggggcaga gccgagatcg ctgctcttcg gccgcaacaa gggcacccgt120

ttcccccgtg ccgtcggcgt cggaggttct gggtggcgcg tggtcatgcg cgcgggcggc180

ccgtccgggg aggtgatgat ccctgacggc ggtagtggcg gaagcggaac accgccttcc240

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cctgaagagg agaagtatgt attcaagcat cctcaaccta aacgaccaaa atcattgcgg960

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ttcagagatg aggtgcttcc aagaattaaa agacttggat acaatgcagt tcaaataatg1080

gcaatccaag agcattcata ctatggaagc tttgggtacc atgttaccaa tttctttgca1140

ccaagtagcc gttttgggtc cccagaagat ttaaaatcct tgattgatag agctcacgag1200

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ctaattcacg cgctttatcc tgaagccgtt actattggtg aagatgttag tggaatgcct1620

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gaggaagata aggtgatcgt gtttgaaaaa ggggacttgg tatttgtgtt caacttccac2280

tggagtaata gctatttcga ctaccgggtc ggttgcttaa agcctgggaa gtacaaggtg2340

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ccaaaaaaaa aaaaaaaaaa                                            2780

<210>3

<211>11476

<212>DNA

<213>节节麦(Aegilops tauschii)

<220>

<223>ssBEIIa基因

<400>3

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acagcggacg tgagtgcgtg acacatgggg tcatctatgg gcgtcggagc aaggaagaga  300

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gatggagaga gatagctgga ttaggcgatc gcgcttcctg aacctgtatt ttttcccccg  1500

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taatgcctac ccgctgcttt cgctcatttt gaattaaggt cctttcatca tgcaaatttg  2340

gggaacatca aagagacaaa gactagggac caccatttca tacagatccc ttcgtggtct  2400

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aattcgaatg attttgggta tacctcggtg gattcaacag atacagcgaa tacaagagaa  2700

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ctaattgcat atcttataag aaaatttata attcctgttt tcccctctct tttttccagt  2880

gctgaaggta tcgtctaatt gcatatctta taagaaaatt tatattcctg ttttccccta  2940

ttttccagtg ctgaaggtat cacttaccga gaatgggctc cctggagcgc atgttatgtt  3000

cttttaagtt ccttaacgag acaccttcca atttattgtt aatggtcact attcaccaac  3060

tagcttactg gacttacaaa ttagcttact gaatactgac cagttactat aaatttatga  3120

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catattggca agtgcaaaac tttgcttcct ctttgtctgc ttgttctttt gtcttctgta  4380

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gtttcttgga tgccgcctaa aggagtgatt tttattggat agattcctgg ccgagtcttc  9180

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gactcggtct aatactagaa ctattttccg aatctaccct aaccatccta gcagttttag  10860

agcagcccca tttggacaat tggctgggtt tttgttagtt gtgacagttt ctgctatttc  10920

ttaatcaggt ggccttggac tctgacgatg cactctttgg tggattcagc aggcttgatc  10980

atgatgtcga ctacttcaca accgtaagtc tgggctcaag cgtcacttga ctcgtcttga  11040

ctcaactgct tacaaatctg aatcaacttc ccaattgctg atgcccttgc aggaacatcc  11100

gcatgacaac aggccgcgct ctttctcggt gtacactccg agcagaactg cggtcgtgta  11160

tgcccttaca gagtaagaac cagcagcggc ttgttacaag gcaaagagag aactccagag  11220

agctcgtgga tcgtgagcga agcgacgggc aacggcgcga ggctgctcca agcgccatga  11280

ctgggagggg atcgtgcctc ttccccagat gccaggagga gcagatggat aggtagcttg  11340

ttggtgagcg ctcgaaagaa aatggacggg cctgggtgtt tgttgtgctg cactgaaccc  11400

tcctcctatc ttgcacattc ccggttgttt ttgtacatat aactaataat tgcccgtgcg  11460

ctcaacgtga aaatcc                                                  11476

<210>4

<211>6550

<212>DNA

<213>节节麦

<220>

<223>局部ssBEIIb基因

<400>4

aagctttgta gccttgcacg ggctccccaa caaactgcct cactcgattg tcaaaaaagt  60

aaaaatgatt gtagaaaaaa aaactgactc sctcgtcact accctaccgt cctacatgac  120

acctggccgc aagacgacgc cgtcctcctg ccgcgcgcgt ccgcgatcac accaccgcaa  180

aaaccaaaac ctcttcgccg gtgcgtccca cgctaccatc catgcagccg tccgcccgcg  240

cgcgcgttgc ccgcaccacc cgctggcggc caccacgccg ccactctcgc gtgaaggctc  300

cgtccgcttc ctcctagttc cactctctct ccgtgctagc agtatatagc atccgccctc  360

cgccccctcc caatcttaga acacccctcc ctttgcctcc tcatttcgct cgcgtgggtt  420

taagcaggag acgaggcggg gtcagttggg cagttaggtt ggatccgatc cggctgcggc  480

ggcggcgacg ggatggctgc gccggcattc gcagtttccg cggcggggct ggcccggccg  540

tcggctcctc gatccggcgg ggcagagcgg agggggcgcg gggtggagct gcagtcgcca  600

tcgctgctct tcggccgcaa caagggcacc cgttcacccc gtaattattt gcgccacctt  660

tctcactcac attctctcgt gtattctgtc gtgctcgccc ttcgccgacg acgcgtgccg  720

attccgtatc gggctgcggt gttcagcgat cttacgtcgg ttccctcctg gtgtggtgat  780

gtctgtaggt gccgtcggcg tcggaggttc tggatggcgc gtggtcatgc gcgcgggggg  840

gccgtccggg gaggtgatga tccctgacgg cggtagtggc ggaacaccgc cttccatcga  900

cggtcccgtt cagttcgatt ctgatgatct gaaggtagtt ttttttttgc atcgatctga  960

aggtacttga catatactac tgtattaccc tgagtaaata ctgccaccat atttttatgg  1020

ttcgcttgaa atacctgttt acttgctacg gttttcactt tcattgagac gtcggacgaa  1080

attcactgaa ttcctataat ttggtagaca ccgaaatata tactactcct tccgtcccat  1140

aatataagag cgtttttggc sccttatatt atagggcgga gggagtacct tttaggtcaa  1200

aatattgtgg tagtttcaat tgtatacaag aattcaaata ttttttttaa aaaaaaatca  1260

actaattggt tgagtttcas gtgaagcgtt ttggtccttt ggctgagatg taaaccgaaa  1320

tcactgaaat tcatagtagc cgaaacttta atagaactga aactcsasst ctgctatccg  1380

gcgaaattct aaagatttgc ttatttcaca cgtaggttgc agtacaccct ctttctaatt  1440

tattggggaa ggggtattat tatcttgtta gtacctgcct gcatgacaat tgaaatctaa  1500

gacaaaacac catatgcgag gcctacacac ggtaggttgg tttscaacta tgtgtgccac  1560

agttcgtctg aactttttgt ccttcacatc gtgttaggtt ccattcattg atgatgaaac  1620

aagcctacag gatggaggtg aagatagtat ttggtcttca gagacaaatc aggttagtga  1680

agaaattgat gctgaagaca cgagcagaat ggacaaagaa tcatctacga gggagaaatt  1740

acgcattctg ccaccaccgg gaaatggaca gcaaatatac gagattgacc caacgctccg  1800

agactttaag taccatcttg agtatcggta tgcttcgctt ctattgtgtg cactttsasa  1860

acaatttaca gtctttgata agatgtgaat ggctgcttgc tgtgacacga aactcttgaa  1920

gttcgtagtc actcttgtgt gttcatggtt ctgaggtaac atggtaaccg aacaaaaata  1980

ggaaagtggc aagcactgca atgtgagcta ctgataacca cccattgtaa ttgggtacac  2040

tgattaatat atatgtcttc atgggctcta ttttttttca atatctatgc caattgaaca  2100

acaatgcttt gtggacgggt gttcttttac cctcttcttc tatcaataga tgatatgcat  2160

actcatgcgt atcctacaaa aaattgaaca acaatgccac tttcccccgt gttgcttttg  2220

taaggatgaa acacatatgt ccagatcaaa ctatactagc agtctaactg tgccttaatg  2280

gatcaaaaac agatatagcc tatacaggag aatacgttca gacattgatg aacacgaagg  2340

aggcatggat gtattttccc gcggttacga gaagtttgga tttatgcgca ggtgaaattt  2400

cttgactaaa taactatgta tctacctttt ctttgtactc tatcaacatt cctcttccca  2460

tgcagcgctg aaggtatcac ttaccgagaa tgggctcctg gagcagatgt acgttcttct  2520

aaccatctga tcgtttacct gactatacta attctatctt tcaactaatt gtgaataatt  2580

actgctcatc agctatccta aggttgggga ttttgcacct cccagatgaa cagcatatta  2640

agtcgcacaa ctagcattat taagaactaa ctcctgcttc caattgcagt ctgcagcatt  2700

agttggcgac ttcaacaatt gggatccaaa tgcagaccat atgagcaaag tatgcatgta  2760

gtttcacaaa tatatcatat tttctttgta gatttttttt tttagatcgg cttatctatt  2820

taaatgtggt tgaatataca ccttatatgt acgttgagct gtaaatatag ttggaagtgt  2880

ttaggagtat taaattcact ggactctatt ctttcacttg cctgttgcac gagcccatta  2940

ctagatatca atgttgatga tgcttttgtt gtatgaggtc gaagtgaaac atgcatgtta  3000

cccttttata taagtaaggt tgcacatgta ttttttatga tctaaacatt atttactgat  3060

tttgttcttg caagacacta agcagtttta cataataatg gcgttggagc aggccgactg  3120

cacatctgaa ctgtagctcc atgtggttga tatagattac aaatgctcat attcaatgta  3180

actgttttca gaatgacctt ggtgtttggg agatttttct gccaaacaat gcagatggtt  3240

cgccaccaat tcctcacggc tcacgggtga aggttgtttt cttctccttg ccaacggtgt  3300

taggctcagg aacatgtcct gtattactca gaagctcttt tgaacatcta ggtgagaatg  3360

gatactccat ctgggataaa ggattcaatt cctgcttgga tcaagtactc cgtgcagact  3420

ccaggagata taccatacaa tggaatatat tatgatcctc ccgaagaggt attttacttc  3480

atcttctgtg cttttagatt tcagatattt ttattagaag aaaattatga ttttttccct  3540

cacgaacctt cccaattgct atttcaagct gtcctactta tttgctgctg gcatcttatt  3600

tttctattct ctaaccagtt atgaaattcc ttacatgcat atgcaggaga agtatgtatt  3660

caagcatcct caacctaaac gaccaaaatc attgcggata tatgaaacac atgttggcat  3720

gagtagcccg gtatttcatc tttaccatgt attccataaa tgaagttagc tatatgcagt  3780

tcaaatttat ttacaggttg ttacaatggt atttttgtgt tggtgccctt ctttcgtttt  3840

ataagtaaaa aacttatcat aaatttattt gttatgccgc ttggttaata caatctgaaa  3900

aatgtaactg tggacaatct agaactagat aatacaaatc tgaaaaaaca tgctggaata  3960

gtgtcatttc agtcaactag gatgttttga atgctcaaga gaagtactag tgtgtagcat  4020

caaaagctgg tgtccatttg ttcaaatgtt taattaacac tatagtgaaa acaagtaatt  4080

gcacaaagaa acaagtaatt gcccaagttc atatgttttt tcactatatt acatgtttca  4140

tcaacaattt aattaacctc attccttaca aacatttgta tttacatttg ttcctacata  4200

tatagttatt ttatatatca actttataaa tcatgactgt tataattaaa accgatggta  4260

tatcaacgat tgagataatt tggcatatgt ggatgaattt tgtggcttgt tatgctcttg  4320

ttttaataac ataataaata gattatgctt gttggtagcc tttttacatt aacacatggg  4380

caattacttg tttctttgtg caaccaggaa ccaaagatcg acacatatgc aaacttcagg  4440

gatgaggtgc ttccaagaat taaaagactt ggatacaatg cagtgcaaat aatggcaatc  4500

caagagcact catactatgg aagctttggg tagttctctg ggtcgatttc tggttctttt  4560

agttatcttt tgtccataga acatatttca actttagcaa ctatactatt atattaactt  4620

ttcagctatt gtcttncttt ttcttatgtg agagactgct gcntcttgct acttcctgtg  4680

ttctcattca gagtanacat cttatganta gacaactcta tgtngacatt ccggaagtat  4740

ncactggctg attcggtcta aaataacata ctgctcagat agccacataa cagtacgatt  4800

acacacataa tgaccatgtt tgcatagagt ggcggtagta tgttcctcac catactagca  4860

taatgacttg ttatataaga gtatatcata ttaacttctt ttccaatgac atggaagctg  4920

taacaacttt caaatcattt ttgtctttta agtgctgctt ttttcctgtt tgacaattaa  4980

tacaatacca cttttatgtg tttttacttc tattgcaggt accatgttac caatttcttt  5040

gcaccaagta gccgttttgg gtccccagaa gatttaaaat ctttgattga tagagctcac  5100

gagcttggct tggttgtcct catggatgtt gttcacaggt acttaatgta atttgaggtt  5160

ggcgtgttaa gttcacatta atcttaattc tttatttcaa ttcctatggc ctctctccta  5220

gattggaaca gtaaaagcat catccagttt gtataaattg ctaaaagaac attttacatg  5280

ttaagtattt tcaattacta tgaaacatat aaatttacat acttattgat tttacgacag  5340

aagtaccgat ctcacaagat gaacaattgg ttgatcacat atcatttcat actacaatac  5400

aagaaaatga atagagaacg agttaatatt agccttggta aaatcagcaa cttgtttgga  5460

aataaagtat agtgatgcca gtgcaaanaa caaggcatca agttggtttc agctcccacg  5520

gtcggtgcta gctgtcaagg gtaatttgca cgtagtcgca catagatttg tgtgggagtg  5580

gaaagtaacc acagattgtc cgaggaacac gggacacacg tcttagccac aggtttgggc  5640

tccccttgat gcgggtagta gctttactcc ttatatgaaa ttatctcaag atagatttca  5700

atttggggtt acacttanga actcancaag ttaaggatca actcnctgag ttctatacga  5760

ctgatctttg accgagatat cttgatcagg ctaagtanca aaatccaggc cttgagatgt  5820

tgaacatgtc cttcattttg ggctgggtgc ccttgggcat aaggtgtngt ccttccttca  5880

tgtgcttctt gcagcgtatg acataaacnt cctctgagtt ggtanatgca cggttccctt  5940

tgaggaaatc aggggtagtc gcatctnggg aaagttggtc acccangcat ggatcctcng  6000

cgcacaccgg gcaaacacgg tgaaaccact tctcctcgac actagctaac ttgacattca  6060

agcaaactaa gaatataact ttatntctaa atgaaccgga caccctcctt gtgcctgcac  6120

ctacagagta caatgccagt tttggactga actcttgtgt tcatgtatgt gctaatnaca  6180

taggttctaa ccatgattct aaatagcgcg ttataactcc actatagtaa tgctatagcg  6240

tttanaagat cccgcactaa gggaccttag tccaaataca tgatcaaaca ttttacatag  6300

cgcgctatag ctatttaaaa ctatggtcac ccgctaagag gcataactcg ctatttaaaa  6360

ctatggttct aacttttaat ctattttatg tcttggtcca aagccccttt ttgttctata  6420

gctttacctt tgggttgaga tcacccttaa cccattggta atcctggttg atttactcca  6480

tcctttcttg cgtagcttta cttttggttt tttgtttctc acagtcacgc gtcaaataat  6540

accttggacg                                                         6550

<210>5

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<223>引物

<400>5

caaccatgtc ctgaaccttc acc                        23

<210>6

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<223>引物

<400>6

ggtaccccat ctcctggttt tgggacaac                  29

<210>7

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<223>引物

<400>7

ggtaccgtcc atttcccggt ggtggca                        27

<210>8

<211>18

<212>PRT

<213>人工序列

<223>蛋白质片段

<400>8

Ala Ala Ser Pro Gly Lys Val Leu Val Pro Asp Glu Ser Asp Asp

1            5                10               15

Leu Gly Cys

<210>9

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<223>蛋白质片段

<400>9

Ala Gly Gly Pro Ser Gly Glu Val Met  Ile Gly Cys

1            5                10

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<223>引物

<400>10

acgaagatgc  tctgcctcac                                20

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<223>引物

<400>11

gtccaacatc atagccattt                20

Claims (25)

1、一种用于食品制品的大麦作物的麦粒，其特征在于，所述麦粒是研细的、碾碎的、珠状的、碾细的、粗粉状的或是压碎的，所述大麦作物具有一个引入的遗传变异，包括作为淀粉分支酶IIa活性抑制剂的外源核酸或者淀粉分支酶IIa基因的变异，相比较于野生型大麦作物，所述大麦作物的胚乳中包含降低活性后的淀粉分支酶IIa和淀粉分支酶IIb，所述麦粒的淀粉中包含相对含量不低于40％(w/w)的直链淀粉。

2、根据权利要求1所述的大麦作物的麦粒，其特征在于，所述大麦作物中包含一种外源性核酸，作为淀粉分支酶IIa活性的抑制剂。

3、根据权利要求2所述的大麦作物的麦粒，其特征在于，所述抑制剂用于降低淀粉分支酶IIa的表达水平。

4、根据权利要求1所述的大麦作物的麦粒，其特征在于，所述麦粒中淀粉含量至少为25％(w/w)。

5、根据权利要求4所述的大麦作物的麦粒，其特征在于，所述麦粒中淀粉含量至少为35％(w/w)。

6、根据权利要求5所述的大麦作物的麦粒，其特张在于，所述麦粒中淀粉含量为45-50％(w/w)。

7、根据权利要求1所述的大麦作物的麦粒，其特征在于，所述麦粒的长度与厚度之比的平均值低于3.5。

8、根据权利要求1所述的大麦作物的麦粒，其特征在于，所述淀粉中直链淀粉的相对含量至少为60％(w/w)。

9、根据权利要求8所述的大麦作物的麦粒，其特征在于，所述淀粉中直链淀粉的相对含量至少为70％(w/w)。

10、根据权利要求9所述的大麦作物的麦粒，其特征在于，所述淀粉中直链淀粉的相对含量至少为80％(w/w)。

11、一种用于食品制品的大麦麦粒，所述麦粒是研细的、碾碎的、珠状的、碾细的、粗粉状的或是压碎的，其特征在于，所述大麦麦粒包含具有相对直链淀粉含量不低于75％(w/w)的淀粉。

12、根据权利要求11所述的大麦麦粒，其特征在于，所述直链淀粉含量用碘量法测定。

13、根据权利要求11所述的大麦麦粒，其特张在于，所述大麦麦粒中含有3-6％(w/w)β-葡萄糖。

14、根据权利要求11所述的大麦麦粒，其特征在于，所述大麦麦粒中含有6-8％(w/w)β-葡萄糖。

15、根据权利要求1到14中任一项所述的麦粒的面粉或粗面粉。

16、一种来自于大麦作物麦粒的淀粉，其特征在于，所述大麦作物具有一个引入的遗传变异，包括作为淀粉分支酶IIa活性抑制剂的外源核酸或者淀粉分支酶IIa基因的变异，相比较于野生型大麦作物，所述大麦作物胚乳中包含降低活性后的淀粉分支酶IIa和淀粉分支酶IIb，所述麦粒的淀粉中包含相对含量不低于40％(w/w)的直链淀粉。

17、根据权利要求16所述的淀粉，其特征在于，所述大麦作物中包含一种外源性核酸，作为淀粉分支酶IIa活性的抑制剂。

18、根据权利要求17所述的淀粉，其特征在于，相比较于野生型大麦作物，所述抑制剂用于降低淀粉分支酶IIa的表达水平。

19、根据权利要求16所述的淀粉，其特征在于，所述淀粉中直链淀粉的相对含量至少为60％(w/w)。

20、根据权利要求19所述的淀粉，其特征在于，所述淀粉中直链淀粉的相对含量至少为70％(w/w)。

21、根据权利要求20所述的淀粉，其特征在于，所述淀粉中直链淀粉的相对含量至少为80％(w/w)。

22、一种可生成淀粉至少含有40％(w/w)直链淀粉的麦粒的大麦作物的生产方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)通过引入表达淀粉分支酶IIa活性的抑制子的外源核酸向亲本大麦作物或种子中引入遗传变异；以及

(2)识别步骤(1)中亲本大麦作物或种子产生的子代作物或种子，其中相比较于野生型大麦作物或种子，子代作物或种子的胚乳中包含降低活性后的淀粉分支酶IIa。

23、根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)引入遗传变异包括引入表现为淀粉分支酶IIa抑制剂的外源性核酸。

24、一种生产其胚乳中淀粉分支酶IIa和淀粉分支酶IIb活性降低的大麦作物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)将淀粉分支酶IIa活性降低的大麦作物与淀粉分支酶IIb活性降低的大麦作物杂交；

(2)识别相比较于野生型大麦作物，淀粉分支酶IIa和淀粉分支酶IIb活性均降低的大麦作物。

25、一种大麦淀粉颗粒，其特征在于，相比较于野生型大麦作物淀粉颗粒，所述大麦淀粉颗粒中淀粉分支酶IIa蛋白质水平降低，且淀粉中直链淀粉含量至少为40％(w/w)。

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