CN1875105B - 改变了分支酶活性的小麦和淀粉以及由此而获得的淀粉产品 - Google Patents

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Abstract

具有减少的SBEIIa活性水平的小麦，可以具有相对高的直链淀粉含量。A基因组上的SBEII基因有突变的小麦。这种小麦还可以附加地具有减少的SBEIIb活性。尽管支链淀粉合成路径上有机能障碍损害，本发明的麦粒还是不缩水显型的，还含有相对高的直链淀粉含量。

Description

改变了分支酶活性的小麦和淀粉以及由此而获得的淀粉产品
技术领域
本发明涉及一种麦粒中直链淀粉含量相对较高的小麦作物。本发明也涉及一种胚乳中淀粉分支酶IIa(SBEIIa)活性减少的小麦作物，以及获得所述作物的方法。本发明还涉及了由此而获得的麦粒、淀粉、食物、非食物产品。
背景技术
在谷类食物里，淀粉大约占成熟的谷粒重量的45％～56％。
淀粉中包含有两种分子类型：直链淀粉和分支淀粉。直链淀粉本质上是线性分子，包含链接在葡萄糖链的oc-1.4。而支链淀粉是高度分支的连接在线性链上得a-1，6葡萄糖甙键。
高等植物中，胚乳中淀粉的合成可以通过一系列在四个关键的步骤起催化作用得生化酶合成，。第一步，ADP-葡萄糖焦磷酸化酶通过把G-1-P和ATP合成ADP-葡萄糖，激活淀粉单体前体。第二步，活性葡糖糖供体--ADP-葡萄糖--通过淀粉合酶被转换成预先存在的al-4键的非还原性的末端。第三步，淀粉分支酶把由葡聚糖连接的oc-1，4区劈开，插入分支点。随后，将裂开的链转换为受体链，形成新的a-1，6键。淀粉分支酶是唯一一种能将a-1，6键插入oc-聚葡萄糖的酶，因而在支链淀粉的形成过程中起着非常关键的作用。最后一步，淀粉分支酶去掉一部份分支链，尽管其中得机理尚未被解决(Myers etal.，2000)。
但是，很清楚地是，高等植物的淀粉颗粒的合成过程，至少包括以上四个步骤。在突变分析(Wang et al，1998，Buleon et al.，1998)或者在通过基因改造的方法来修改基因表达水平(Abel et al.，1996，Jobling et al.，1999，Scwall etal.，2000)时，在高等作物胚乳中发现每一步骤中的多元同源异构体，每个同源异构体被认为有特定的作用。虽然如此，目前还不清楚每个同源异构体对淀粉生物合成的确切贡献，也不知道在不同物种之间这些贡献是否会显著地不同。在谷类的胚乳里，ADP-葡萄糖焦磷酸化酶有两个同源异构体：一个淀粉质体形式，一个是细胞质形式(Denyer et al.，1996，Thorbjornsen et al.，1996)。每个形式都包含着两个亚组类型。在玉米中，缩小的(Sh2)和易碎的(bt2)突变分析表现出大和小的损害(Giroux and Hannah，1994)。玉米中缩小的变体(sh2)和易碎的变体(bt2)，分别表现出大亚组和小亚组的病症(Giroux andHannan，1994)。在谷类胚乳中，发现有四类淀粉合成酶，一种同源异构体排他性地位于淀粉颗粒、颗粒结合型淀粉合成酶(GBSS)中，有两种被颗粒和可溶片段隔开(SSI，Li et al.，1999a，SSII，Li et al.，1999b)，第四种全部位于可溶片段--SSIII中(Cao et al，2000，Li et al.，1999b，Li et al，2000)。GBSS在直链淀粉合成过程起着很重要的作用(Shure et al.，1983)，而SSII和SSIII之间的突变改变了支链淀粉的结构(Gao et al，1998，Craig et al.，1998)。定义SSI活性的作用的突变还没有记载。
在麦粒胚胎中分支酶有三种表现形式，分支酶I(SBEI)，分支酶IIa(SBEIIa)，分支酶IIb(SBEIIb)(Hedman and Boyer，1982，Boyer and Preiss，1978，Mizuno et al.，1992，Sun et al.，1997))。水稻(Nakamura and Yamanouchi，1992)、玉米(Baba et al.，1991；Fisher et al.，1993；Gao et al.，1997)和小麦(Repellin et al.，1997；Nair et al.，1997；Rahman et al.，1997)的基因组和cDNA序列已经被表征。序列排列显示，核苷酸水平与氨基酸水平有高度的序列相似性，这为分组成SBEI、SBEIIa、SBEIIb提供了可能性。SBEIIa和SBEIIb通常表现出80％的相同序列，特别是基因的中心区。SBEIIa和SBEIIb也可根据他们的表达形式来区分。SBEIIb通常在胚乳中特定地表现，而SBEIIa则在作物的各个组织中表现。
小麦胚乳中，发现SBEI(Morell et al，1997)排他地出现在可溶片段里，而SBEIIa和SBEIIb则出现在可溶片段和淀粉颗粒联合片段中(Rahman et al.，1995)。玉米和小麦中，高直链淀粉显型，即直链淀粉放大(ae)基因，是由SBEIIb基因损伤而导致的(Boyer and Preiss，1981，Mizuno et al.，1993；Nishi etal.，2001)。在SBEIIb突突变种中，谷类淀粉胚乳显示出反常的形态，直链淀粉的含量显著地提高，剩下的支链淀粉的分支率减少，短链的比例(DP17，尤其是DP8-12)下降。此外，淀粉的焦化温度升高。另外，还存在一个相当数量的原料集中区域，被定义为直链淀粉和支链淀粉之间的“媒介体”(Boyeret al.，1980，Takeda，et al.，1993b)。相反，玉米作物的SRECa基因突变是由于增变基因(Mu)嵌插单元导致蛋白质表达中缺乏SBEIIa，它和野生玉米在胚乳淀粉的分支上难以被区分(Baluth et al.，2001)，尽管它们在叶片淀粉中发生了改变。同样地，缺失SBEIIa活性的稻类作物在胚乳中的支链淀粉链属性上没有明显的改变(Nankamura 2002)。在玉米和水稻中，SBEIIa和SBEIIb基因在基因组中并没有连环遗传。玉米中的无效突变(亦称零突变)，基于遗传本底的改变程度以及剩下的分支淀粉的分支率的提高(Shannon and Garwood，1984)，导致了淀粉含量的减少和胚乳中直链淀粉含量的增加。采用转位增变基因(Mu)通过转位标签法识别和分离出相应于突变的基因，该基因表现出对被指定的淀粉合成酶(SSII)进行编码(Gao et al.，1998)。该被指定的SSII酶现在已被认知是谷类SSDI家族的成员(Li et al.，2003)。突变的胚乳中，SBEIIa活性的降低与不活泼的突变有关。在其他谷类中没有相应的突变被报道过。目前不知道这些发现是否与其他谷类作物相关，如小麦。
国际申请WO 94/09144中建议使用官能基因和反官能基因来改变淀粉合成酶(SS)和SBE的天然比率。但是，目前没有数据证实这一被提议的分子策略，也没有建议明确降低SBEIIa活性。
在马铃薯中，单独的SBEI下行调节仅对淀粉结构产生细微的影响(Filpseet al.，1996)，虽然更深入的工作确定了一些定性的改变(affor et al.，1998)。但是，马铃薯中SBEII和SBEI下行调节相结合所引起的直链淀粉含量的增长，远大于单独的SBEII下行调节所带来的增长。(Schwall et al.，2000)。
基于酶作用物的特异性，高等作物中存在两种分支酶，他们被定义为异淀粉型分支酶和普鲁兰型(pullulanase type)分支酶(Myers et al.，2000)。玉米和稻谷中的Sugary-1突变与这两种分支酶的缺乏有关(James et al.，1995，Kubo et al.，1999)。然而，病原突变地图与异淀粉型分支酶基因处于同一位置。表1中列出了从谷类作物中克隆的有代表性的淀粉生物合成基因。
Figure S04818658X19960325D000041
淀粉被广泛用于食品、纸张和化学工业中。淀粉的物理结构，对淀粉的营养特性和在食品、非食用产品或工业产品中的加工特性有重大影响。某些特征是由淀粉的物理结构造成的，如支链淀粉链长的分布、结晶的类型和程度、其他特性如胶凝温度、粘性和膨胀体积等。结晶的改变、糊化的改变或支链淀粉的退化，都能带来支链淀粉链长的改变。
淀粉组合物，特别是抗性淀粉，具有高含量的直链淀粉，对肠胃的健康特别是大肠，有重要的影响。因此，作为食品以促进肠胃的健康，已开发了某些谷物如玉米，使其含有较高的直链淀粉含量。抗性淀粉的营养效果，主要体现在它给大肠提供营养储备。其中，肠微生物群发酵抗性淀粉，生成其他短链的脂肪酸而成为本身的能量源。这些短链脂肪酸给结肠粘膜细胞提供营养，促进大肠对营养的吸收，提高结肠的生理活性。通常，如果不对结肠提供抗性淀粉或其他食用纤维，结肠的代谢作用就会相对地钝化。
同时，经化学或其他方式改造的淀粉可以用来食用，以提供正常的、未经改造淀粉所没有的功能。这些加工处理，要么是修改其他价值成分，要么是去掉某些不需要的内容。因此，更可取的是提供以未经改造的形式存在的组分的食品源。
全球每年生产的小麦比其它任何一种谷类作物都要多。
相对于玉米或水稻，已知的小麦淀粉结构的改变是有限的，部分原因在于小麦的转变效率落后于其他谷类，面包小麦的六倍体性质也是一个原因。小麦中的三个基因组的存在，通过掩蔽每个基因组上的突变而具有缓冲的效果。相反，双倍体物种的突变就比较容易辨认。玉米或水稻中，SBEIIb的突变是直链淀粉混合剂的显形，但小麦却不表现出这一特征。目前还不知道小麦的SBEIIa或SBEIIb突变所赋予的显形。目前已知蜡性基因突变的显形(GBSS，Zhao和Sharp，1998)和完全缺失SGP-1蛋白质的突变的显形(Yamamori et al.，2000)，它们是以缺失A、B和D基因组特别形式的SGP-1(SSII)蛋白获得的杂交种系，其中的缺失SGP-1蛋白质可以用蛋白质电泳法化验。对SSII缺失的种子进行检测，显示该突变源于支链淀粉构成的改变、淀粉颗粒的变形和直链淀粉相对含量提高，该含量大概占淀粉的30-37％，相对于野生的小麦，这个含量提高了约8％(Yamamori et al.，2000)。直链淀粉含量可以用色度测量法、电流滴定法(两者都用碘作指示剂)和伴刀豆球蛋白A法来测定。相对于无突变的淀粉，SSII缺失突变淀粉的胶凝温度降低了。SBII缺失的麦粒中，淀粉含量从野生麦粒的60％降低到低于50％。
WO 99/14314描述了从节节麦(Aegilops tauschii)中隔离SBEII基因，节节麦与小麦相近的双倍体植物，但不产出具有改性淀粉的小麦。
WO 00/15610描述了小麦SBEIIb基因中cDNA的克隆。这些cDNA不会给小麦带来直链淀粉含量的改变，也不会导致小麦淀粉中含有至少50％的直链淀粉。
WO 01/62934也描述了小麦SBEIIb基因，建议把分支酶活性的抑制剂引入到小麦作物中，但并没有传授小麦淀粉中含有至少50％的直链淀粉。
WO 01/32886中描述了小麦胚乳中对某种形式SBEI的cDNA编码。
被编码的多肽被发现优先与A型淀粉颗粒结合，但不会抑制SBEI的活性，也不会改变淀粉颗粒的形态，也不会提高直链淀粉的含量。
因此，直链淀粉比例超过50％的小麦尚不为人知，尽管高直链淀粉含量的玉米变种和大麦变种都是已知的，但是与高直链淀粉含量的小麦相比，这些谷物还是有缺点的，因为小麦在制作诸如面包、通心粉和面条等方面是首选的谷类。
直链淀粉含量高的淀粉是有用而首选的，特别是当与改善淀粉合成和其他特性相结合时。例如，对收割期后的修正的减少。
这样的的淀粉也是相对抗消化的，给健康带来了很大的益处。
通常，本领域的技术人员都知道，本发明并不限于本说明书的描述，是可变更的和修改的。要知道，本发明在此描述的，包括这些变化和修改，还包括该文本所提及的和指出的单独或共同的所有的步骤、特征、组合物和化合物，也包括任何两个或两个以上的步骤/特征的组合。
通过本文本，“包括”和“包含”之类的词，要理解为包含规定的整体或步骤，但不排除其他的规定的整体或步骤，除非文中有特别说明。本发明不局限于所列举的实施例的范围。所列举的实施例，仅仅为了便于说明。功能相同的产品、合成物和方法都落入本发明的范围。
该文本后面，有本发明参考过的公开发行的著录的详细资料列表。本说明书中提及的参考资料是指这些完整的资料。这些现有技术中的参考资料，包括任何一种或多种现有技术文件，并不认为是对其的承认，或建议。这些现有在澳大利亚技术构成了普通的通用知识或形成了其中的一部分。
此处，“获得、取得、源于”之类的词，应被认为是表示某特定的整体来源于特定的种类，但是不要求是直接地获取。
该文本所涉及的苷残留物的名称，都是IUPAC-IUB生物化学名称委员会推荐的，其中，A表示腺嘌呤(Adenin)，C表示胞核嘧啶(Cytosine)，G表示鸟嘌呤(Guanine)，T表示腺嘧啶脱氧核苷(Thyidine)。
发明概述
本发明的第一方面，提供一种从小麦作物获得的麦粒，这种麦粒的淀粉中直链淀粉至少占50％。这种小麦作物具有降低了的SBEIIa基因表达或SBEIIa酶活性，或两者都是。优选的是SBEIIa和SBEIIb的基因表达、酶活性，或两者都是。该麦粒可以包括基因突变，该基因突变要么是SBEIIa基因突变，要么是外来的核苷酸。这种SBEIIa基因突变抑制SBEIIa基因表达、酶活性，或两者都是。
另外，该麦粒可以包含相似的SBEI基因变种，麦粒中还包含改变蛋白质的水平和/或ADP-葡萄糖焦磷酸化酶、GBSS、SSI、SSII、SSIII、异淀粉脱麸酶、普鲁兰脱麸酶的酶活性。该麦粒还包括转基因，该转基因编码非官能、共抑制、核酶、双RNA分子。该转基因降低了rnRNA编码的SBEIIa的表达水平。该麦粒可以包括SBEIIa基因的突变，其中的一种形式是SBEHa基因的无效突变，在两或三个基因组中至少有一个基因组是无效突变。
麦粒的淀粉的含量可以至少是40％、50％、55％、60％、70％或80％。该麦粒的另一种形式是，在偏振光下观察时，该麦粒中至少50％的淀粉颗粒没有双折射的特性。该麦粒可以是不缩水的，平均重量是36mg或40mg。另一种形式中，当脱壳之后，该麦粒的淀粉含量(重量比)至少是25％或至少35％，而野生麦粒的淀粉含量至少是90％。所述的麦粒是所有的谷物，有壳的、碾碎的、破裂的、碾压的、peraled、高梁或者半熟的谷物。
本发明第一方面的另一种形式，提供了一种从小麦作物中获得的麦粒，该麦粒含有淀粉和一种基因变种。相对于野生麦粒，这种基因变种导致胚乳中的SBEIIa基因表现的水平和/或SBEIIa酶活性的降低。该基因变种包括SBEIIa基因的突变或引入用于对SBEIIa基因表现的抑制剂进行编码的核酸；其中，这种麦粒的淀粉中直链淀粉成分的含量至少为30％。
本发明的第二方面，提供一种本发明第一方面所述的谷物碾磨所得的产品。这种产品包括但不限于由本发明的麦粒获得的粉、全麦、粗粒小麦粉、淀粉，或者由所述的麦粒所得的食物产品如粉、全麦、粗粒小麦粉、淀粉、或淀粉或者碾压的，剥落的或挤压的产品。这种产品包括从本发明的麦粒中得到的粉、全麦、粗粒小麦粉、淀粉与从其他源的到的粉、全麦、粗粒小麦粉、淀粉混合所得产品。
本发明的第三方方面，提供一种从本发明第一方面所述的小麦作物中获得的淀粉颗粒或者淀粉。第三方面的一种具体形式中，所述小麦作物的胚乳中有着低水平的SBEIIa酶活性。
本发明的第四方面，属于根据本发明第三方面所述的淀粉和食物成分或水所得合成物。本发明第四方面包括食物和非食物合成物，包括所述淀粉与其他淀粉或者含淀粉的产品所得混合物。
本发明的第五方面，提供一种组合物，该组合物包含本发明第四方面中所述的淀粉颗粒和另一种食物成分或水。
本发明的第六方面，提供一种小麦作物，该小麦作物可以用来生产前五个方面所属的麦粒、淀粉颗粒或淀粉。该小麦作物及其淀粉既可以是转基因的，也可以是非转基因的。
本发明的第七方面，提供一种能够生产麦粒的小麦作物的方法，包括以下步骤：
1)引入基因变种到小麦作物或者种子里。
2)识别母体小麦作物的后代小麦作物或种子。相对于野生小麦作物或种子，这种小麦作物或种子降低了胚乳中的SBEIIa基因表现的水平和/或SBEIIa酶活性；所述的麦粒含有淀粉，淀粉中直链淀粉成分的含量至少为50％。
本发明的第七方面的第二种形式，提供一种能够生产麦粒的小麦作物的方法，包括：
1)引入基因变种到小麦作物或者种子里。其中，所述的基因变种包括SBEIIa基因的变种或引入对SBEIIa基因抑制体编码的核酸。
2)识别母体小麦作物的后代小麦作物或种子。相对于野生小麦作物或种子，这种小麦作物或种子降低了胚乳中的SBEIIa基因表现的水平和/或SBEIIa酶活性；所述的麦粒含有淀粉，淀粉中直链淀粉成分的含量至少为30％。引入基因变种的步骤可以包括引入表现出SBEIIa基因表达抑制体的外来的核酸，可以包括引入母体小麦作物的突变体。
本发明的第七方面的第三种形式，提供一种能够生产麦粒的小麦作物的方法，包括：
1)引入基因变种到小麦作物或者种子里，其中，所述的基因变种包括SBEIIa基因的变种；
2)识别母体小麦作物的后代小麦作物或种子，相对于野生小麦作物或种子，这种小麦作物或种子降低了胚乳中的SBEIIa基因表现的水平和/或SBEIIa酶活性；
3)注入基因变种到母体小麦作物或者种子里，其中，基因变种包括SEBIIb基因的突变；
4)识别母体小麦作物的后代小麦作物或种子，相对于野生小麦作物或种子，这种小麦作物或种子降低了胚乳中的SBEIIb基因表现的水平和/或SBEIIa酶活性；
5)用胚乳中含有低水平SBEIIb基因表达或/和SBEIIb酶活性作物，杂交胚乳中含有低水平SBEIIa基因表达或/和SBEIIa酶活性作物；识别含有SBEIIa和SBEIIb的低水平的基因表达或/和酶活性的后代小麦作物或者种子。
本发明的第七方面的第四种形式，提供一种生产小麦作物的方法，所述的小麦作物中，其麦粒的淀粉中，直链淀粉至少占50％，胚乳中SBEIIa酶活性降低。所述的方法包括：
1)识别出小麦作物或者种子。所述的小麦作物或种子在小麦的A、B或D基因组中具有降低了的SBEIIa活性表现；
2)用第二种具有低水平SBEIIa活性的小麦作物杂交所述的小麦作物或者从上一步骤中产生的小麦作物；
3)用具有低SBEIIb酶活性水平的小麦作物与具有低SBEIIa酶活性水平的小麦作物杂交；识别含有低水平的SBEIIa与SBEIIb酶活性的小麦作物。本发明第七方面所述的小麦作物优选温带小麦(Triticum aestivum ssp.aestivum)。
本发明的第八方面，提供一种制造改造淀粉的办法。包括用上述的方法对小麦作物进行改造和提取具有改造属性的淀粉。
本发明的第九方面，提供一种识别小麦作物或种子以获得SBEIIa基因突变或者SBEIIb基因突变的方法，包含的步骤是：用连接在SBEIIa基因或SBEIIa基因上的分子标志筛选一部分小麦作物或者种子；以是否具有所述的分子标志来识别小麦作物或种子。
本发明第九方面的第二种形式，提供一种用来识别SBEIIa基因突变或SBEllb基因突变的小麦作物或者种子的方法。包含的步骤是：分别用SBEIIb蛋白质或SBElla蛋白质抗体优选一部分小麦作物或种子；根据是否含有抗体结合来识别作物或种子。
本发明的第十方面，提供一种从小麦作物获得谷粒，包含有基因突变，其中染色体2A的长臂上没有SBEIIa基因，或者是染色体2A长臂上的SBEIIa基因包含着基因突变，该基因突变相对于野生麦粒导致了胚乳中SBEIIa蛋白质和/或SBEIIa酶活性的减少。所述的基因突变可以是SBEIIa基因的无效突变，也可以是SBEIIa基因的部分缺失。所述的麦粒进一步包括染色体2A的长臂上没有SBEIIb基因或者染色体2A长臂上的SBEIIb基因包含着突变，该突变相对于野生麦粒导致胚乳中SBEIIb蛋白质和/或SBEIIb酶活性的减少。所述的SBEIIa缺失和SBEIIb缺失，可能破坏染色体2A长臂上SBEIIa和SBEllb基因的表达。
所述的小麦作物可以是基因突变的硬质小麦，该基因突变相对于野生麦粒导致染色体2B长臂上被SBEIIa基因编码的淀粉分支酶活性的减少。更进一步的基因突变可以包括染色体长臂2B上没有SBEIIa基因，或染色体2B长臂上的SBEIIa基因包含着相对于野生麦粒导致了胚乳中SBEIIa酶活性减少的基因突变。
所述的小麦作物可以是可能额外地含有基因变种的温带小麦(Triticumaestivum ssp aestivum)并相对于野生麦粒导致被染色体2B和/或染色体2D长臂上SBEIIa基因编码的淀粉分支酶活性减少。更进一步的基因突变包括所述的染色体长臂上没有SBEIIa基因或者所述的染色长臂上的SBEIIa基因发生突变，相对于野生麦粒，该突变导致了胚乳中SBEIIa酶活性的减少。
所述的小麦作物可以被引入对SBEIIa基因表达和/或SBEIIa酶活性进行编码的核酸中。相对于野生麦粒，SBEIIa酶活性减少了至少40％，该麦粒淀粉中直链淀粉的含量是至少30％或至少50％。该麦粒可以是不缩水的，且平均重量是36mg。在偏振光下观察，该麦粒的淀粉颗粒至少50％表现出不具有双折射特性。该麦粒脱壳之后，淀粉含量至少占25％(w/w)，或淀粉含量至少是野生麦粒淀粉含量的90％。
相对于野生麦粒的支链淀粉，将支链淀粉异淀粉酶脱麸之后进行测量，本发明中任何形式的麦粒的支链淀粉链长度片段减少了4～12dp。
相对于野生麦粒，所述的小麦作物更进一步包含降低了SBEI蛋白质、SBEI酶活性的水平，或两者都是，而且进一步包含改变了DP-葡萄糖焦磷酸化酶、GBSS、SSI、SSII、SSIII、同工型分支酶或普鲁兰型分支酶中的部分或全部酶的水平。
本发明第十方面的各种形式是关于该麦粒、从该麦粒中提取的淀粉颗粒、该麦粒或淀粉生产的产品、比如面粉、粗面、细面等。
附图说明
图1所示是对应于六倍体小麦(温带小麦)D基因组的SBEIIa基因的A.tauschii中淀粉分支酶IIa基因(wSBEII-D1)的序列[序列号No.1]。
图2所示是温带小麦作物局部的SBEIIb基因序列(wbe2b基因组)[序列号No.2]。
图3是双RNA结构的示意图，其中：
A，所用到的基因元素的顺序是官能方向上的启动子、SBEIIa、SBEIIb基因序列(外含子1、2和3)，非官能方向上的内含子(内含子3)、SBEIIa或SBEIIb基因序列(外含子1、2、3和4)，和转录终结者/多聚腺苷酸化的序列。
B，ds-SBEIIa和ds-SBEIIb基因的转录形成了带有双链区的“发夹”RNA结构。所述的双链区由官能和非官能序列之间的杂交形成。与GT核苷和AG核苷交界的的内含子序列被剪掉了。
图4所示是通过光学显微镜观察到的淀粉颗粒。其中：
A)含有来自ds-SBEIIa转基因品种83.1b的野生种类淀粉颗粒的小麦种子。
B)含有来自ds-SBEIIa转基因改造品种50.1b的变形淀粉颗粒的小麦种子。
图5是图4下的两种淀粉颗粒在偏振光下观察到的双折射现象示意图。
图6是部分小麦SBEIIa cDNA序列比较图。Sbe9相应于AF338432.1的一部分。图中所示的序列图分别是Y11282[序列号No.3]，sr997[序列号No.4]，sr995[序列号No.5]，sbe9[序列号No.6]。
图7是在最前面的63个氨基酸上进行的部分小麦SBEIIa序列的堆积比较图。图中指出了相应于克隆的最可能的基因组的位置。
图8是推知的D基因组多肽(sr854)氨基酸序列[序列号No.7]与来自A或B基因组(Y1182)产品的序列[序列号No.8]的比较图。斜体部分是转序列(位置1-54)。
图9是从各种小麦添附物(列1-11)的SBEIIb基因的内含子3区PCR放大图，采用的启动子是ARA19F和ARA23R，并经Rsal煮解。与A、B、D相基因组对应的群组都箭头标识。列3(Aus17340)和列5(Aus10103)没有D基因组的特征标记，而列8(Aus12509)和列9(Aus12565)没有B基因组的特征标记。
图10是来自采用SBEIIb基因内含子3区探测的小麦的HindIII煮解DNA的DNA杂合法。各列分别对应：1)Aus12565，2)Aus12509，3)Aus10103，4)CSDT2DL-4，5)Aus12530(硬质小麦)，6)CSDT2BL-9，7)Aus6323，8)CSDT2DS，9)Aus17340，10)Aus12745，11)CSDT2DL-4，12)节节麦。
图11是筛选F2世代，F2通过Aus17340a和Aus12590杂交得来，用SBEIIb基因内含子3区的PCR放大，采用的启动子是AR2b19cF和AR2b23cR，接着用RsaI煮解。列8没有B和D基因组标记，因此作物BD54对应一个BD双重零种系。
图12是HindIII的DNA杂合法(列1至4)和EcoR1(列5至8)煮解的BAC克隆，采用SBEII基因的内含子3区做探测器。各列分别对应：1)BAC 4，2)BAC 5，3)BAC 9，4)BAC 12，5)BAC 4，6)BAC 5，7)BAC9，8)BAC12。
图13中：
A是把wSBEII-DA1探针和重复的DNA序列探针(pSc119.2)应用到A.tauschii染色体(右边的大图和左下角的小图)和小麦染色体(左上角的小图)的FISH；
B是小麦染色体的FISH和SBEIIb探针。
图14是野生的中国春小麦和SGP-1零小麦作物种子生长的不同阶段(开花后10、15、25天，M＝成熟)的颗粒束缚蛋白的SDS-PAGE分析图。图中，测量了银迹胶体的蛋白质谱带强度。成熟的中国春小麦种子中GBSS的谱带强度标准值为100，其他的酶的谱带强度表示为与该值的百分比。a)GBSS，b)SSI，c)SBEII。空白表示没有SGP-1。该图是中国春小麦和SGP-1零种系的颗粒束缚蛋白质的凝胶电泳图。
图15是可溶片断的SBEIIa和SBEIIb的相对数量。扫描了SDP-PAGE的免疫印迹，测量了蛋白质谱带强度。从胶体所用的SBEIIa-SBEIIb混合蛋白质可以评估出蛋白质的数量。
图16中：
A，是小麦(cv Rosella)胚乳分支酶活性的阴离子交换色谱图。胚乳可溶性蛋白质和氢硫化铵被分馏，并被套色复制到Sephacry S-200柱中，优先应用到RESOURCE Q阴离子交换柱。
B，是小麦胚乳SBEI的WBE1抗体的免疫缺失分析图，SBEI从不变性的PAGE中分离出来。标A和B的SBEI蛋白质群组分别来自A和B基因组；标Di和Dii的蛋白质群组来自D基因组。各列分别对应：1)CS，2)N7BT7A，3)N7AT7B，4)N7DT7A。
C，是纯化片断的是免疫缺失分析图，使用WBE1抗体表现了阴离子交换色谱法的活性峰值。各列分别是：1)胚乳天然可溶的提取液，
2)对应1、3峰值的片断，3)对应峰值2的片断。
图17是从VC3.1.11和CS7AL-15采用WEB I抗体，免疫缺失法筛选双单倍体后代隔离SBEI同功异构体的图。列1至14对应双单倍体后代种系，列6是三倍体零SBEI突变品种，定为A113，列7是SBEI同功异构体的正常种系，定为D28。
图18是γ射线诱导突变的种子的DNA的PCR放大图(列1至6)，这种种子是Veery 3和Gabo 1BL.1RS杂交得到的，用AR2b19cF/AR2b23cR作为启动子。列2对应于MLT2B8的突变种子，列7对应于中国春小麦。
图19是小麦品种的PCR放大图，使用特定的A基因组启动子ARIIaAF/ARIIaAR。列1至5分别为中国春小麦、MLT2B8、MLT2D1、Dt2AS和BD219(B和D基因组的SBEIIa和SBEIIb均为零突变的作物)。
图20分别是小麦品种Acc144008和Acc144087的淀粉琼脂糖(凝胶)CL 2B凝胶色谱图，用淀粉化验工具(Sigma)化验.
图21是淀粉链长的比较图。这些淀粉来自转基因小麦和非转基因控制的小麦NB1。由非转基因控制来的淀粉的低聚糖个体的总质量的百分数被从转基因种系淀粉的相应数值中减除。所用样品是085(◆)，025(▲)，008(O)。
发明的具体描述
小麦中SBEIIa的改造
本发明是基于发现小麦胚乳中SBEIIa活性的减少能带来改良的淀粉产物，更具体地，是富含直链淀粉的小麦麦粒。该发现一个意想不到的结果是，相反，在玉米/水稻中SBEIIa的突变不会改变其直链淀粉/支链淀粉的含量(Blauth et al.，2001，Nakamura，2002)。在进一步的实施例中，存在一个或多个附加的淀粉生物合成酶活性的改变。比如SBEIIb以及SBEIIa活性的降低。惊奇的发现小麦中SBEIIa与SBEIIb是紧密地连环遗传的，这一发现有助于对SBEIIa与SBEIIa基因突变的活性编码，而玉米和水稻中SBEIIa与SBEIIb则不连在一起，。我们还发现，SBEIIa与SBEIIb活性减少的小麦的麦粒，是不缩水的。
生产小麦作物的方法
本发明的一方面，提供一种生产小麦作物的方法。所述的小麦作物，其麦粒中含有改造过的淀粉，更具体地说，淀粉中直链淀粉的含量至少增加到30％。通常，在六倍体小麦和硬质小麦里，淀粉中直链淀粉含量是18％～30％，在某些突变(缺乏SGP-1)，直链淀粉的含量可以增加到35％。本发明的一个具体实施中，把一个基因突变引入到母体小麦作物或种子内，以获得一种小麦作物或种子，这种小麦作物或种子生产的麦粒，淀粉中直链淀粉至少占30％。在这里，淀粉中直链淀粉的含量被定义为重量/重量(w/w)，即，麦粒中直链淀粉的重量与麦粒的淀粉重量的比值。在进一步的实施例中，淀粉中直链淀粉的含量(w/w)至少是40％、50％、60％、65％，70％或至少75％。在本发明更一个实施例中，该方法生产的小麦作物的麦粒，淀粉中直链淀粉含量(w/w)至少占80％、至少90％。
在本发明的再一个实施例中，该方法包括改变、减少小麦中胚乳中淀粉分支酶IIa(SBEIIa)蛋白质和/或SBEIIa酶活性。就是说，被引入到小麦作物中的基因变种，直接或间接地带来了SBEIIa含量的改变，从而带来了上述的淀粉的改变。在本发明的另外一个实施例中，没有和前面的实施例互相排斥，该方法包括对小麦胚乳中SBEIIa基因表达水平的改变、减少，或者包括小麦中SBEIIa基因的突变，其中，胚乳中SBEIIa活性是被降低了的。SBEIIa基因和其他基因表达水平的降低，可以通过引入核酸来达到。例如，该核酸可以是转基因，转基因对抑制分子进行编码，该抑制分子包括非官能、共抑制、核酸性酶或双RNA分子。
在这里，术语“改变”、“增加”、“增加的”、“降低”、“减少的”、“抑制”等类似术语是相对的术语，即，相对于野生的或未经改造的状态。“蛋白质水平”是特定蛋白质的量。例如SBEIIa，这可以通过该领域内已经知道的任何一种方法来测量。例如，DNA印迹分析法(Western blot analysis)或其他免疫方法。“酶活性”是在酶化验中特定的酶的量。令人感激的是，酶活性可能是在突变中改变的，而不是被蛋白质本身的表达水平(量)改变的。相反，如果产出了过多或过少的活性蛋白质，蛋白质的量被改变了，但是活性还是保持不变的。当然，量与活性的同时减少是可能的，例如在当给酶编码的基因失活时。在某些实施例中，改造后的小麦作物胚乳中蛋白质水平或活性水平比未经改造的减少了至少40％或60％、或至少75％、或至少90％、或至少95％。蛋白质活性或酶活性，或基因表达水平的减少，可以在麦粒生长的任何阶段发生，特别是淀粉在生长的胚乳中合成时的麦粒饱满的阶段，或者在麦粒生长成熟的所有的阶段。
“淀粉”被定义为多聚糖，本质上由α-吡喃型葡萄糖个体构成。淀粉是小麦中主要的炭水化合物，在淀粉质粒体中合成，以颗粒状存在和被保存。淀粉包括直链淀粉和支链淀粉。直链淀粉是本质上线性的α-1，4-D-吡喃型葡萄糖聚合体；直链淀粉主要是支链α-1，4连接的α-1，4-D-吡喃型葡萄糖个体短链，分支点是α-1，6-糖苷键。野生作物的小麦淀粉中，直链淀粉占20％-30％，支链淀粉占70％-80％。直链淀粉和支链淀粉的一个明显区别就是他们的分子量。直链淀粉是双螺旋结构，分子量为104～106；而支链淀粉的分子量为107～108。最近的研究发现，大约0.1％的糖苷分支点发生在直链淀粉中，因此，直链淀粉被描述为“本质上线性的”。直链淀粉被定义为由α-1，4吡喃型葡萄糖连接的、类直链淀粉的长链分支淀粉组成的本质上线性的分子(参考“中间产物”或“类直链淀粉的支链淀粉”，Takeda et al.，1993b；Fergason，1994)。直链淀粉的含量可以通过本领域内包括分子筛高效液法(HPLC)在内的任何已经知道的方法来测定。例如，90％(w/v)的二甲基亚砜(DMSO)，伴刀豆球蛋白(concanavalin)A方法(Megazyme Int，Ireland)，最好是碘量法，例如实例1中所述的。HPLC法可以包括也可以不包括淀粉的脱支(Batey andCurtin，1996)。从麦粒的重量和直链淀粉的含量，可以计算出每单位麦粒中直链淀粉的量，并与基因改造的和控制种系进行比较。
在另一个实施例中，所述的方法包括用本领域中已知的任何的方法来测定小麦胚乳中SBEIIa的活性量。在某些实施例中，采用了蛋白质印迹法、ELISA化验法等免疫缺陷法测定了蛋白质水平；或者用RNA印迹杂交法、逆转录多聚酶链式反应(RC-PCR)等领域内已知的方法测定相应的mRNA水平。在另一个实施例中，所述的方法包括选出一种改变了胚乳SBEIIa蛋白质水平或SBEIIa酶活性水平的小麦作物或种子。这个选择的步骤可以基于SBEIIa蛋白质水平或SBEIIa酶活性水平的降低，或者基于小麦作物的麦粒的显型，如直链淀粉的增加/分支淀粉的减少，或者一些可见的显型，例如缩水的麦粒或改造后的颗粒性质。
令人感激的是，本发明包括用本文中所述的任何方法直接地、间接地识别改变了淀粉性质的小麦作物的方法，例如，测定小麦作物或种子中存在基因变种。这些作物可以是小麦作物世代--如小麦繁殖--中的一株，
SBE活性可以用酶化验直接测量，例如，通过磷酸化酶刺激化验法(Boyerand Preiss，1978)。该方法用磷酸化酶结合葡萄糖1-磷酸盐和α-D-葡萄糖来测量SBE的刺激性。SBE活性可以通过碘印迹法测量，它所测量的是来源于葡萄糖聚合物的分支的葡萄糖-多碘联合体的吸光率的降低。SBE活性也可以用分支链化验法来化验，该方法是测量底物上被减少了的直链淀粉的还原性端的产出，并经异淀粉酶消化(Takeda et al.，1993a)。更适宜地，是以SBEI或SBEIIb的活性的存在来测量SBE的活性。SBE的同功异构体显示出不同的底物特异性。例如，SBEI在分支直链淀粉中显示出更高的活性，而SBEIIa和SBEIIb在分支的直链淀粉底物上显示出更高的活性。这几个异构体可以根据被转换的葡聚糖链的长度来区分。SBE蛋白质也可以通过使用特定的抗体来测量。SBEII活性可以在胚乳发育过程中谷粒成长的时期测量，也可以在蛋白质还是相等而没有被改变的成熟谷粒里通过免疫化验方法来测量。
本发明另一个方面，提供一种改变、尤其是减少了小麦胚乳中多种淀粉合成酶活性的方法，其中一种酶是SBEIIa，这种小麦的麦粒中，直链淀粉至少占淀粉量的50％。在某些实施例里，SBEIIa和SBEIIb蛋白质、或SBEIIa和SbeIIb酶活性的水平是被减少了的，或者是SBEIIa、SBEIIb、SBEI这三者的都被减少了。其他与SBEIIa结合的，可能被改变的淀粉生物合成酶是SSI、SSII或SSIII。淀粉分支酶也可以被改变，如异淀粉酶或普鲁兰酶的活性。只要SBEIIa被改变了，与上述的酶结合的任何的酶都被改变。在又一个实施例里，一个或多个淀粉生物合成酶的活性在作物胚乳之外的其他组织中被改变。如叶片中SBEI或SBEII的活性可以被增加以补偿对SBEIIa抑制分子进行编码的转基因造成的活性损失。所述的SBEIIa抑制分子主要在胚乳中表现。如，所述的改造可以是量的增加或减少，或在时间表现上的改变。或者，通过结合SBEIIa的减少和一个或多个淀粉生物合成酶的过度表达，可以进一步提高淀粉合成酶。对酶的这种基因编码来自多个源，例如细菌或小麦外的其他来源。可以修正以改变这些酶的催化属性，例如，改变酶的温度差别(见WO94/09144)。
高直链淀粉显型可以通过SBEIIa基因表达的部分或全部抑制或SBEIIa和SBEIIb基因表达的部分或全部抑制来达成。基因被抑制程度，在一定程度上决定了麦粒中形成的淀粉的特性。从改良小麦胚乳中提取的蛋白质的凝胶电泳能够显示SBEIIa和/或SBEIIb活性改变的种类和程度。这些改变可以是SBEIIa和/或SBEIIb活性的减少、活性的完全消失、SBEIIb分布的改变或胚乳中其他酶的分布的改变。要做出这些检验，可以从该小麦胚乳中提取淀粉并分析其中的蛋白质。Rahman et al，1995已经描述过一个实例。该领域中著名的技术如SDS-PAGE和免疫法都是在可溶片段和淀粉颗粒片段上实施的，其结果用来识别被SBEIIa和/或SBEIIb酶改变的作物或麦粒。
小麦作物
本发明的另一方面，提供一种能够生产在麦粒的淀粉中直链淀粉的含量至少占30％的小麦作物。在另一个实施例中，直链淀粉的含量至少占40％、至少占50％、至少占55％、至少占60％、至少占65％、至少占70％、或至少占80％。在又一个实施例中，相对野生麦粒，小麦作物中麦粒的淀粉内直链淀粉的含量是上述的任何一种，这种小麦作物还包括导致了胚乳中SBEIIa基因表达和/或SBEIIa基因活性水平的降低的基因突变。在一首选的实施例中，这种基因突变包括了SBEIIa基因的突变或引入的核酸，这种引入的核酸对SBEIIa基因表达抑制子进行编码。这些抑制子包括非官能、共抑制、核酶或双RNA、或抑制SBEIIa表达和/或SBEIIa活性的相似分子。
在这里，小麦作物被定义为具有小麦属基因的物种中的任何作物。其中，这种小麦物种是能够商业种植的，例如，包括Triticum aestivum L.ssp.aestivum(普通或面包小麦)、其他小麦的亚种、Triticum turgidum L.ssp.Durum(硬质小麦)、Triticum monococcum L.ssp.monococcum(栽植的单粒小麦或小斯佩而0特小麦)、Triticum timopheevi ssp.timopheevi，Triticum turgigum L.ssp.Dicoccon(可栽培的双粒小麦)以及其它小麦亚种Triticum turgidum(菲尔德曼)。这种小麦可以是具有AABBDD型基因组德六倍体小麦；或者是具有AABB型基因组四倍体小麦。因为根据本发明，可以通过杂交把小麦的基因突变转移到某些相关的物种中，如黑麦、大麦。本发明还包括由此而得的杂交物种，包括小麦与黑麦的杂交所得的黑小麦。在一个具体实施例中，小麦作物是夏季小麦的物种，确切地说，是夏季小麦的亚种。或者，由于突变或转基因能够容易地从夏季小麦转移到硬质小麦中，所以更优选地，该小麦作物是硬质小麦。
本发明还提供一种胚乳中SBEIIa蛋白质和/或SBEIIa酶活性被降低的小麦作物。相对野生麦粒的淀粉，这种小麦作物能够产出淀粉中直链淀粉的含量增高了德麦粒。SBEIIa水平的减少可以发生在麦粒成长过程中，或者贯穿整个成熟的过程。在另一个实施例中，相对于野生的麦粒，这种麦粒胚乳中SBEIIa水平被减少了至少50％、至少75％、至少90％。其中，在遗传领域，“野生的”取其通常的意思，包括小麦栽培作物或基因没有被修改的小麦。
本发明也提供一种作物或者麦粒的后代，这种后代在基因型和/或显型方面有着母体小麦作物所期望的特性。本发明还延伸到这种小麦作物繁殖得到的、具有期望特性的产品，如培养的组织或细胞。
本发明中还包含被改变的，确切地说，是减少SBEIIb或其他淀粉生物合成酶水平、SBEIIa酶活性的小麦作物。要产出SBEIIa和SBEIIb活性降低的作物，可以通过将SBEIIb降低的作物与SBEIIa降低的作物进行杂交，或者通过引入对抑制SBEIIa和SBEIIb基因表达的分子进行编码的转基因。因为小麦中SBEIIa和SBEIIb基因紧密联结，要生产SBEIIa和SBEIIb活性都降低的作物，可以通过识别缺乏被小麦中一个基因组编码的SBEIIa和SBEIIb同工异构体的作物，然后把这些作物杂交以生成至少被两个基因组编码的同工异构体降低的作物。
本发明也包括其他本底或其他品种的基因突变或基因突变。所述的其他品种能够和上述的小麦作物杂交。突变后的作物可以与包含更多期望基因背景的作物相交。初次杂交之后，适当数目的不期望的本底被剪除并去除。所期望的基因本底包括适当数目基因组合。所述的基因提供商业收益和其他特性，如农学性能、非生物应力抵抗力。所述的基因本底可以包括改变淀粉生物合成或者修正基因，例如，从其他小麦种系中来的具有缩水后的胚乳的基因，其中的病原基因并不清楚。
所说的作物可以是转基因的，也可以是非转基因的。
本发明还提供一种突变的小麦作物，相对于野生麦粒，该作物中染色体2A(2AL)长臂上缺失SBEIIa基因，或者染色体2A长臂上的SBEIIa基因包括着导致所述的麦粒胚乳中SBEIIa酶活性水平降低的突变。虽然从2400个小麦添附物中进行了广泛的筛选，本发明并没有找到天然生长的此类作物。这意味着2AL上SBEIIa基因功能性的保持力的选择是自然发生的。然而，这种作物可以在突变发生后被识别和产出。这种作物并不是某些市场上所需要的非转基因产品。这些作物可以是面包小麦、硬质小麦或其他小麦。在首选的实施例中，这种小麦作物包含着至少部分去除了SBEIIa基因，或延伸到染色体2AL上至少SBEIIb的部分缺失。正如该领域中已知的，六倍体小麦如面包小麦，包含着三个基因组，这三个基因组通常被指定为A、B和D基因组。而四倍体小麦如硬质小麦，包含两个基因组，这两个基因组通常被指定为A和B基因组。每个基因组包括7对染色体，在减数分裂过程中，可以通过细胞学方法观察到这些染色体。通常根据尺寸大小由长到短的顺序来指定这些染色体，因此染色体2就是每个基因组中第二大的染色体。每个染色体都有一个着丝点，染色体2是以这个着丝点非对称分布的。染色体2的两条臂分别被定义为“长臂”和“短臂”。在这里，为了统一，“染色体2A的长臂”定义为从着丝点到长臂末梢之间的区域。同样，“染色体2B的长臂”和“染色体2D的长臂”的定义方式与上相同，除非它们分别涉及小麦染色体2的B或D基因组。
我们已经发现，小麦的染色体2上，SBEIIa和SBEIIb基因是紧密相连的。在特定的实施例中，小麦作物包含至少具有SBEIIa基因突变的染色体2AL的主要部分(超过50％)。就是说，染色体2AL本质地存在着，至少包含A基因组的SBEIIa基因的突变。2AL的存在可以用细胞学的技术测出，例如，在原位杂交技术(参见实施例9)，或采用2AL特定的分子标记。在优选的实施例中，该小麦作物对所述突变来说是同型结合的。所述的突变可以是无效突变，也可以缺失。
在特定的实施例中，等位基因的删减来源于MLT2B8或MLT2D1作物。由于这些作物上的SBEIIa等位基因突变发生在2AL染色体上，通过杂交，可以把这些等位基因引入到各种面包小麦、硬质小麦中，并由此产出麦粒和淀粉。这些等位基因可以与其他有用的淀粉生物基因、等位基因、其他有用的基因特性结合。
明显地，本发明延伸到生产、识别所述的小麦作物及其所生产的麦粒的方法。
麦粒
本发明还提供一种相对于野生麦粒而言淀粉成分被改变的麦粒。在这里，麦粒被定义本质上成熟的麦粒，包括出于商业目的而收割的麦粒。在一个实施例中，淀粉被至少部分的改变，是由于麦粒胚乳生长过程中SBEIIa活性的减少。在进一个实施例中，没有与前面的实施例互相排斥，麦粒包含着提高了比例的直链淀粉(占总淀粉量的百分比)。这可以被确定，具有与野生的麦粒的淀粉相比降低了支链淀粉的含量。野生麦粒淀粉中，直链淀粉大约占20％～30％，支链淀粉大约占70％～80％。本发明中，麦粒的淀粉中直链淀粉至少占大约50％(w/w)。在又一个实施例中，在胚乳的生长过程中，SBEIIa和SBEIIb的活性都是降低了。在再一个实施例中，SBEI的活性也被减少了。在进一个实施例中，用该领域内广泛理解的方法来测定淀粉中直链淀粉的比例(w/w)，分别是至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、或至少90％。可以通过光学显微镜观察到的双折射的损失，或该领域中其他已经掌握的方法测定淀粉颗粒反常的形态，都显示出直链淀粉含量的提高。在一特定的实施例中，测定直链淀粉的含量是采用碘量法，也可以采用分光光度法，例如Morrison和Laignelet使用的的方法(1983)，或者高性能液相色谱法(HPLC，例如Batey和Curtin使用的方法，1996)。
在另一个实施例中，该麦粒包含着物理特性已经被改变的淀粉。例如，糊化温度的降低、糊化过程中或糊化后膨胀特性的改变、粘度的改变、分支淀粉分布链长的改变，或者上述特性的任何组合。糊化温度的升高或降低，可以是在糊化第一峰值或同时在第二峰值处。但该淀粉一个或多个特性如糊化焓，可以保持不变。相对于野生麦粒的淀粉的相应数据，用差式扫描热量法测出的该麦粒淀粉的糊化第一峰值温度(apex)，可能会升高3到5℃，更多的情况是升高7或8℃，更可能的是至少10℃。在特定的实施例里，这个升高的范围是3到12℃。
所述的麦粒可以是缩水的，或不缩水的，最好是不缩水显型。在这里，“不缩水”被定义为麦粒大多数，最好是至少90％的麦粒是饱满的，具有丰满的或全填充的显型。这通常是与淀粉集聚的正常或接近正常水平相关联的。相比之下，此处的“缩水”显形是对大多数谷粒而言，至少90％的谷粒的淀粉集聚都是降低了的。相对于野生麦粒而言，轻度缩水谷粒是指淀粉含量至少减少30％，中等缩水谷粒是指淀粉含量至少减少50％，高度缩水谷粒是指淀粉含量至少减少70％。缩水率可以通过相应的淀粉含量来测定，淀粉含量用占麦粒重量的百分比来表示。未经改造的野生小麦谷粒中淀粉含量大约是65％，而在缩水的麦粒中，则降低到少于50％。
在又一个实施例里，单粒麦粒平均重量至少36mg或至少40mg。平均重量的测量，是拿已知数量的麦粒的总重量除以麦粒的数量得到的。显然，麦粒的特性如淀粉含量、平均重量、不缩水显型，都是小麦商品生产中所期望的。
本发明还提供面粉、粗粉、面团和其他从所述的小麦得来的或者用所述的小麦生产的产品。包括未加工的，和已加工的，如分馏，漂白等。本发明还提供由所属的小麦中取得的对食品生产有用的麦粒。此外，所述的麦粒包括用其他方式加工的，如碾磨的、碾碎的、成珠状的、粗磨的、裂碎的、煮或蒸的。
淀粉
本发明的另一方面，提供一种从上述的麦粒中获得的淀粉。这种淀粉中，具有增加了的直链淀粉含量和减少了的支链淀粉含量。在一个首选的实施例中，从相对于野生小麦，其胚乳中SBEIIa蛋白质和/或SBEIIb酶活性降低的麦粒中获得淀粉。在另一个实施例里，相对于野生小麦，SBEIIa和SBEIIb活性都降低了，或者SBEIIa、SBEIIb和SBEI这三者的活性都降低了。
本发明的另外一方面，提供一种从所述的麦粒中获得的淀粉。这种淀粉中，直链淀粉的含量至少是50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或90％。所述的淀粉是部分提纯的，即，淀粉已经与麦粒的其他成分分离。可以通过碾磨加工如湿磨法来获得纯淀粉。所述的碾磨加工包括把淀粉与蛋白质、油类、纤维分离。碾磨加工后的最初产品是淀粉颗粒的混合物。而本发明则包含这些颗粒，含有此处所描述的改性淀粉。
所述的淀粉具有提高或减少了的糊化温度，最好是提高了糊化温度。在具体的实施例里，相对于从野生的小麦提取的淀粉，用DSC法测量，本发明所述的淀粉第一峰值的起点温度或第一峰值的顶点温度至少升高了3℃、5℃、7℃或10℃。在另一具体的实施例里，这个温度升高的范围在3～12℃之间。特别注意的是，有可能糊化温度第一峰点的起点温度降低了，而第一峰点的顶点温度却升高了。在另一个实施例里，与前面的实施例不互相排斥地，用DSC法测定发现，对应于直链淀粉脂的分裂，淀粉糊化温度第一峰点的温度改变了，但是第二峰点的温度没有实质的改变。在又一个实施例里，淀粉糊化过程中，例如相对于野生小麦的淀粉，焓发生了降低，本发明的淀粉的焓至少降低了25％或至少降低了40％。
在另外一个实施例里，所述的淀粉中，抗性淀粉的含量提高了，这种结构的改变预示着特定的物理特性，包括消化酶的物理难接近性，这可能是因为淀粉颗粒形态的改变、与脂相关联的淀粉的存在、结晶度的改变或分支淀粉分布链长度的改变。较高的直链淀粉含量，对抗性淀粉的水平也有贡献。
本发明还提供一种从实施例的小麦作物的麦粒中获得的淀粉。所述的麦粒中食用纤维的含量增加了，优选地，抗性淀粉的水平也同时升高。这些增加，至少部分导致了直链淀粉含量的提高。
本发明还明显地延伸到生产上述小麦淀粉的方法。在一个实施例中，该方法包括从获得上述的小麦麦粒中并从其中提取淀粉。所述的小麦麦粒可以通过种植所述的小麦作物和收割小麦获得，也可以小麦生产者或进口者中获得。
减少基因活性的方法
SBEIIa和SBEIIb或者其他淀粉合成、修改基因的表达和/或活性，可以通过引入一个或多个基因变种到小麦作物中来改变。此处的“基因变种”是指小麦作物中任何可遗传基因组的改变，在上下文中，这些改变会影响相关基因的表达或活性。基因变种包括包括点突变、点插入、点置换、点复制、点迁移，优选地，包括点的缺失、把一个或多个转基因引入到基因组中。
“核酸分子”和“核酸序列”是核苷的聚合体，可以是单链或双链的。它可以包括DNA，如基因组DNA或cDNA、RNA、mRNA或以上的任何组合。为将核酸分子引入到小麦细胞中，可以采用化学的方法修改核酸分子以提升传输性与稳定性，或保护部分载体，如病毒基因载体。所述的核酸分子可以用克隆技术获得，或者通过领域内已知技术来合成取得。所述的核酸分子可以包括至少一个编码链或非编码链(非官能)，或者上述两者的组合，例如，逆向复制结构。对“对应于”基因的核酸序列，术语“对应于”是指核苷序列关系，如至少有一个与所涉及的基因相同的、或者与所象征的蛋白质核苷序列，或者至少有一个正确地补偿正常的Waston-Crick碱基配对的核苷序列，或者是一个RNA等价物如mRNA的序列，或者从基因的mRNA分离的cDNA。
此处的核苷序列出现在单链序列5’到3’的方向上，用一个标准的核苷缩写词。“补偿”描述了两个单链核酸分子或碱基对加强的序列之间的相互关系。例如，5’-GACT-3’碱基对与其补充物，5’-AGTC-3’。“同族的”或“同源的”，根据上下文，指两个或更多的核苷序列、多肽序列的相似或等同性。术语核苷序列的“等同百分比”是指两个核苷序列之间核苷匹配的百分率。该两个核苷序列采用标准化的运算法则，如CLUSTAL V运算法则，或在国家生物信息中心，网址http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASHT/，上可得到的Blastn或BLAST 2等序列程序，更适宜地，要设定一个默认的程序。类似的方式，“百分比相似度”也适用于多肽序列。
这里的“基因”，包括SBEIIa、SBEIIb或其他淀粉生物合成基因，或者对非官能、共抑制、ribozyme、双RNA之类的分子进行编码的基因，依据其作最宽泛的背景；包括经典的基因组基因，该基因组基因具有与调节区相关联的转录区，如启动子和转录终结者--多腺苷序列。该转录区包括转录而不转换的序列(非转换序列，UTR)，并选择地包括蛋白质编码的区域或内含子，该转录区接合出来形成一个成熟的RNA。“基因”包括从对应于外含子的cDNA获得的排列形式，以及在RNA基因组中发现的RNA基因。“基因”也用于描述合成的或聚合的分子编码部分或全部功能产品。
在细胞中，特别是在小麦细胞中，“基因”指示“生物活性”分子或“基因产物”的“表达”，它可以是RNA或多肽。这一过程通常是通过转录以产生RNA和转换以生成蛋白质。随后，这样的产物在细胞中被修改，例如，多聚酰苷酸化、插接、遮蔽、切成21～23个核苷断片，或由核子输出或与蛋白质共价或非共价交互作用。蛋白质可以被磷酸化作用、糖基化或脂化作用而修改。所有的这些过程，都包含在“基因表达”或者类似的词语中。
在这里用到的术语“小麦SBEIIa基因”和“小麦SBEIIb基因”以及相关词汇指从小麦中识别出来的、分别编码SBEIIa酶或SBEIIb酶的基因，而同源基因存在于其他小麦变种中。这些基因包括但不限于列在表格1中基因序列。可以理解，不同的小麦品种之间SBEIIa和SBEIIb基因的序列存在着天然的变种。有经验的技术人员能够容易地辨认出同源基因。一般认为同源SBEIIa基因或蛋白质之间的同一性至少是90％，同源SBEIIb基因或蛋白质也一样。
本发明中用到的基因可以来自于天然产生的SBEIIa、SBEIIb或经标准重组技术而来的淀粉生物合成基因中取得。“重组核酸分子”或类似的的术语指代非天然产生的序列，或者是把序列中两个或多个独立的片段人工合成的序列。该人工合成可以是把核酸独立的片段化学合成，或人为操作，例如本技术领域中著名的基因工程技术。所述的“重组”包括独立地被加成、取代而修改的核酸，或者部分缺失的核酸。通常，重组的核酸可以包括可操作的连接到启动子序列的核酸序列。这样的重组核酸可以是所采用的载体的一部分，如，用于转换细胞。
通常，基因可能屈服于突变而产生一个或多个核苷替代、缺失和/或加成物，如密码子的修改。这些基因的核苷插入衍生物包括5’和3’末端聚合，以及单个或多个核苷中的的序列内插入。插入核苷序列的多样性是由于一个或多个核苷被引入到核苷序列中预定的位置，尽管从结果产品中进行适宜地筛选的话，随机的插入似乎也是可能的。缺失的多样性是将一个活多个核苷从序列中移除来表征的。替代核苷的多样性是指序列中至少一个核苷被移除和至少一个不同的核苷被插入到该位置。这种替代可以是“沉默”的，在根本上不改变由基码所定义的氨基酸。同样，保守替代则是指有计划地把一个氨基酸改变成另一个相似的氨基酸。典型的替代如下：
保守氨基酸替代的适宜的残留物
原始的残留物  典型的替代物
Ala           Ser
Arg           Lys
Asn           Gln；His
Asp           Glu
Cys           Ser
Gln           Asn
Glu           Asp
Gly           Ala
His           Asn；Gln
Ile           Leu；Val
Leu           Ile；Val
Lys           Arg；Gln；Glu
Met           Leu；Ile
Phe           Met；Leu；Tyr
Ser           Thr
Thr           Ser
Trp         Tyr
Tyr         Trp；Phe
Val         Ile；Leu
转基因
SBEIIa、SBEIIb或其他淀粉合成酶或修正基因的活性或/和表达可以通过引入一个或多个转基因到小麦作物中来改变。在这里，“转基因”是本领域中常用的意思，包括通过DNA或RNA重组技术生产的或改变的且被引入到器官或细胞的基因序列。转基因可以包括源自器官或细胞中的基因序列，如非官能序列。典型地，转基因包括非源自所述的器官或细胞的外生核酸。“转基因的”是指器官或细胞中含有转基因。“非转基因的”是指基因组中没有任何的转基因。为了遗传的稳定性，转基因通常被整合到器官或细胞的基因组中。
本领域中有经验的技术人员应知晓，细胞中基因或互补序列的表达，要求所述的基因与启动子序列中有可操作的位置。启动子的选择，根据所要求的表达的水平和/或组织、器官、品种的表达水平的不同而不同。所述的表达特别是胚乳中特定的启动子的表达发生在组织、器官、品种中。
把核酸分子置于启动子序列的调节控制之下，意味着启动子序列能控制所述的核酸分子的表达。启动子通常但不必须在上游，或者在其所控制的核酸分子的5’-端。更进一步地，包括启动子在内的调节单元通常位于基因转录的起始位点的2kb处。在异种的启动子/结构基因结合的结构中，通常最好是启动子处于远离基因转录起始位点的位置，这之间的距离等于启动子与其所控制的基因之间固有的距离(如，源至该基因的启动子)。本领域已经知的是，这个距离可以容纳一些无损启动功能的突变。同样，最优的，相应于置于其控制之下的不同基因的调整序列单元的定位被定义为该单元的天然位置(如，源至该基因的启动子)。再次说明，本领域的技术可知，在该距离上可能会发生某种变种。
适用在本发明的基因结构中的启动子的实例包括，源至病毒基因、酵母菌基因、霉菌基因、细菌基因、昆虫基因、鸟类基因、哺乳动物基因和植物基因的启动子，优选植物细胞中的功能性基因，特别是小麦胚乳中表达的基因。启动子根据表达发生所在的组织的不同，而本质地或有差别地调节表达。此外，随着表达发生的发展阶段不同，或者随着物理压力、温度等外部刺激的不同，该表达也会不同。
降低SbeIIa或其他淀粉生物合成基因的活性的方法，包括把转基因引入到小麦细胞中，以及从该转化小麦再生成一个转基因小麦作物的过程。分支淀粉合成中包含的酶包括SBEI、SBEIIa、SBEIIb。本发明包括单独把SBEIIa的表达降低，也包括连同SBEIIb或SBEI的表达一起降低。因此，转基因会钝化至少一种上述基因。此外，对SBEIIb和/或SBEI的钝化可是直接的，其转基因(如对双RNA、非官能RNA或ribozyme RNA编码的的转基因)直接把SBEIIb或SBEI基因当成表达目标，也可以是间接地改变SBEIIb或SBEI表达的改变。例如，为了序列的同一性或者碱基配对的顺序，RNA转基因可以单独把SBEIIa基因/RNA当目标；也可以通过改变蛋白质的稳定性或者蛋白质在胚乳中的分布，来降低SBEIIb或SBEI的活性。SBELLa活性的改变，与一个或多个支链淀粉合成酶活性的改变的组合，构成了本发明的附加的形式。所述的分支淀粉合成酶包括SSI、SSII、SSIII和脱麸酶如异淀粉酶或普鲁兰酶。上述的酶，都可以通过引入转基因来改变其表达水平。
目前已经知道了小麦中分支淀粉合成基因的几个DNA序列。可以以这几个序列中的任何一个为基础，设计出钝化小麦基因的转基因。这些序列包括SBEIIa(基因数据库编号Y1182，AF338431和AF338432)和SBEII(WO00/15810，WO 01/62934)。Rahmant et al.，(1997)和Rahman et al.，(1999)已经对小麦的SBEI基因进行了描述。SBEI的Triticum tauschii序列，能够在公开专利文本WO 99/14314中找到，该序列与D小麦的SBEI基因高度同源。小麦中SBEI的cDNA序列，能够在基因数据库编号AF176679中找到。来自大麦或其他近亲物种的、其他支链淀粉合成基因的同源染色体，可以用之来修改小麦的基因表达水平。可以用领域内著名的方法来获得这些基因或基因片段，包括PCR放大或经标识的探针杂交。
此处的“严厉杂交条件”意味着，探针和目前序列之间，有90％甚至95％的序列等同时，杂交才发生。严厉杂交条件的一个例子是：在50％甲酰胺、5×SSC(1×SSC＝150mM的NaCl和15mM柠檬酸化三钠)、50mM苯酚钠(PH＝7.6)、5×Denhardt′s溶液、10％硫酸化右旋糖苷和20up/ml变型剪平带DNA，如在鲑鱼精子DNA的溶液中通宵孵蛋，然后在大概65摄氏度的条件下，在0.1×SSC中清洗杂交支撑物。其它杂交和清洗的条件是已知的并被Sambrook et al，示证，“分子克隆法：实验室手册第二版，Cold Spring Harbor，NY(1989)，particularly chapter11。”
同源染色体中用来准备转基因结构的区域，应该与小麦基因具有至少85％的等同性，在适当的区域，更可能是85％甚至95～100％的同一性。最优的，该转基因是具体针对小麦胚乳中的支链淀粉合成基因的表达的，对作物中其他部分的支链淀粉合成有很小的或极微弱的影响。这可以通过适当调节序列，如转基因中的特别胚乳启动子，来做到。
非官能
基因工程近似于修改特别是降低作物中基因的活性，如小麦作物的基因活性。这些方法包括给适宜的非官能分子的表达引入基因结构。这些非官能分子与目标基因的RNA是互补的，并能与之杂交。非官能分子被认为干扰了目标基因的mRNA的转录处理或转录稳定性，从而钝化了该目标基因的表达。设计非官能序列的方法在领域内是广泛知晓的。一些相关例子可以在美国专利号5190131、欧洲专利文本0467349-A1、欧洲专利文本0223399-A1和欧洲专利文本0240208中找到。这里，参考和结合了这些的专利。作物中非官能方法的使用已被Bourque(1995)和Senior(1998)所论述。Bourque列举了很多在作物系统用非官能序列钝化基因的例子，她同时陈述，对酶活性100％抑制不是必须的，因为对酶活性的部分抑制，更可能导致作物系统的可测量的变化。Senior(1998)的陈述是，对于操作作物中基因表达的，非官能的方法是一种良好的准确的技术。
小麦SBEIIa、SBEIIb、SBEI或其他淀粉生物合成基因、淀粉修改基因的非官能分子是以小麦mRNA序列为基础的，或者是从同源的DNA或mRNA序列中取得的。所述的同源的DNA或mRNA序列来自其他物种，如大麦。这些非官能序列可以对应于这些基因的全部或部分转录，或者对应于控制这些基因表达如基因拼接的序列。所述的非官能序列可以对应于小麦SBEIIa或其他基因的目标编码区，或者对应于5’-非转换区(UTR)和/或3’-UTR的目标编码区。所述的非官能序列可以与内含子序列的一部分互补。这些内含子序列在转录时或转录后被拼接掉，最好是仅仅针对目标基因的外含子序列。通常，由于UTRs巨大的分歧，以这些区域为目标给基因抑制提供了巨大的特异性。在特定的实施例中，非官能序列的长度是至少19个连续的核苷，或至少50个、至少100个、至少200个、至少500个或至少1000个核苷。这些核苷与RNA序列互补，也会用到与整个基因转录互补的大型序列。在具体实施例中，非官能序列的长度是100～2000核苷。在另一个实施例中，非官能序列与目标转录的补体之间的同一性程度是至少85％，至少95％，或至少95～100％。非官能RNA分子理所当然地，可以包括不相关的序列，这些序列用以稳定所述的RNA分子。
共抑制
另一个可能会用到的分子生物学的方法就是共抑制。共抑制机制并不容易理解，但是被认为包含于转录后基因沉默(PTGS)中，从这一点看来，与很多非官能抑制的例子相似。其包含，为了其表达，以对应的启动子在官能方向引入一个基因的额外复制或基因片段到作物中。官能片段的大小、相应于目标基因区域、与目标基因的序列等同性的程度，见上面所述的非官能序列。在某种程度上，基因序列额外的复制干扰了目标作物基因的表达。为实施共抑制方法，可以参考专利文本WO 97/20936和欧洲专利文本0465572。
双链RNA-媒介基因沉默
另一个把基因突变引入到小麦作物中的方法就是双链RNA-媒介基因沉默。这个方法也包括PTGS。在这个方法里，引入DNA是为了被钝化，被引入的DNA和目标基因的同源体一起指导双链RNA产物的合成，其中，该DNA包含官能和非官能序列。这些序列在被转录为RNA时，能够杂交以形成双链RNA区。在优选的实施例中，官能序列和非官能序列被间隔区域隔开。所述的间隔区域包含内含子，该内含子在被转录成RNA时被拼接掉。这种安排能带来高效率的基因沉默。所述的双链区域可以包括一个或两个RNA分子，该RNA分子由一个或两个DNA区域转换而来。双链分子的存在引起了作物内生系统的反应。作物内生系统破坏了从目标作物基因转录而来的双链RNA和同源RNA，有效地降低或消除目标基因的活性。为实施该方法，可以参考澳大利亚专利文本99/29514-A和专利文本WO 99/53050。在具体的实施例中，杂交的官能和非官能序列的长度至少是19个连续的核苷，或至少30个、至少50个、至少100个、至少200个、至少500个或至少1000个核苷。对应于整个基因转录的大型的序列也可能用到。在具体实施例中，该长度为100～2000个核苷之间。在一个实施例中，目标的转录官能和非官能序列等同程度是至少85％、90％或至少95～100％。RNA分子理所当然地，可以包括不相关用以稳定所述的RNA分子的序列。RNA分子可以在RNA聚合酶II启动子或者RNA聚合酶III启动子的控制下表达。后者(启动子III)的例子包括tRNA或snRNA启动子。该双链RNA分子还包括来自一个或多个基因的、连在一起的序列，用以确定多个基因目标。
核酶
造成对小麦中基因表达进行所期望的钝化的基因变种，可以包括对一个或多个核酶进行编码的核酸分子。核酶是带有酶的或带有催化功能的RNA分子，该催化能够在指定的位点分解RNA分子。这些位点由一个或(通常是)两个杂交序列定义。RNA的分解，钝化了目标基因的表达。核酶可以扮演非官能分子的角色，促成基因钝化。核酶，特别是锤头状和发夹状的核酶，包含杂交序列间的一个或多个催化域。其他可用的核酶的主旨包括RNAseP、内含子组I或II，δ肝炎病毒类型等。参考欧洲专利文本0321201和美国专利6221661。用核酶来钝化转基因植物中的基因，已经被证实了，如Wegener et al(1994)。
遗传构体/载体
本发明还提供一种单独的包含有RNA或DNA的核酸分子，最好是编码基因抑制分子的DNA。在某些实施例中，核酸分子对非官能、官能(共抑制)、双链RNA或核酶分子进行编码。所述的核酶分子以SBEIIa基因序列为目标且钝化其在小麦颗粒胚乳中的表达。本发明还提供一种包含或编码单独的核酸分子的基因结构，并包含一个或多个调节单元如启动子、强化因子和转录末端或多腺苷序列。这些单元在本领域内是广泛知晓的。该基因结构还可以包括促进作物中--特别是单子叶作物如小麦--转基因的表达的内含子序列。这里，“内含子”是其通用含义，指已经被转录的、但没有对蛋白质进行编码的且在转换之前被拼接掉的遗传片段。如果相应的转基因对转换产物进行编码，那么内含子可以与5’-UTR或编码区合成一体；反之，可以与任何的转录区合成一体。
本发明还提供了一种载体，如质粒载体。这些载体包括有基因结构。这里，“载体”包括表达载体和转化载体。表达载体能够在体外表达和体内表达；转化载体能构从一个细胞或器官转到另一个细胞或器官中。载体包括在细胞中提供复制的序列，如原核细胞中E大肠杆菌或土壤杆菌。在具体的实施例中，载体是能够被引入到小麦细胞中的二元载体，其中包含被至少一个T-DNA边界序列定义的T-DNA序列。本发明还提供了一种细胞，这种细胞包含了所述的载体，例如土壤杆菌或可再生的小麦细胞，如幼胚盾片上的细胞。可选地，这些细胞可以转化成含转基因的小麦细胞。
启动子/终止子
在另一个实施例中，本发明中的转基因或其他基因结构包括转录起始区(启动子)。这些启动子提供小麦胚乳中调节型和组成型的表达。这些启动子可以是组织特异性的，在胚乳中具有表达选择性与排他性。这些启动子可以选自胚乳特异性(如高分子量麦谷蛋白启动子、小麦SSI启动子、，小麦SBEII启动子、小麦GBSS启动子)或非胚乳特异性(如泛素启动子或CaMV35S或增强型35S启动子)。这些启动子可以被温度、光或压力等因素调整。通常，这些启动子由被表达的基因序列的5’提供。这些构体可以包括其他加强转录的单元，如nos 3’或ocs 3’多聚腺苷酸化区域或转录终端。所列举的DNA区域可以与包含选拔标示基因序列的载体或其它单元合成一体，或与含有这些序列的载体共转化的载体合成一体。
小麦的改造方法
改造单子叶植物，如小麦的方法，是通过引入外生核酸的方式引入遗传突变到作物中，然后从原型胚体或幼胚中再生出作物。这是本领域内广泛知晓的方法。Becker et al 1994，Cheng et al 1997，He et al 1994，Hess et al 1990，Nehra et al 1994，Vasil et al 1992，Vasil et al 1993，Weeks et al 1993，Weir et al2001，美国专利申请号75460/94，欧洲专利申请号709462，国际专利公开号WO 93/04178，WO 89/12012，WO 94/13822和WO 99/14314都列举了相关的例子。携带有所期望的核苷序列或基因结构以及可选择的标志的载体可被引入到再生小麦细胞或组织中用以培养作物或外植体、或适宜的作物系统如原型作物。所述的可选择的标志基因可以为小麦细胞提供抗体或除草剂抗病体，或者允许利用底物，如甘露糖。所述的可选择的标志最好是带有黄草灵、甘氨酸或潮霉素抗病体。再生的小麦细胞最好是来自幼胚或成熟配体的盾片，或者愈合组织，或者分生组织。
所述的改造作物可以包括可选择的标志基因，或者包括在再生过程在再生之后被移除的基因。如从基因组中切除所述的可选择的标志基因，或从SBEIIa-抑制转基因中分离可选择的标志基因。
在染色体中整合有转基因或突变的作物可以被筛选出来，比如，可以采用合适的特异于该转基因或表型的显型核酸探针来筛选。为确认转基因作物的存在，可以采用任何一种可行的方法。例如，可以用聚合酶链式反应(PCR)来放大转换过的作物中特有的序列，再用凝胶电泳法或其他方法对放大产物进行探测。从作物中提取DNA的方法可以是传统的方法或PCR反应，其中，PCR反应的实施采用能区分改造过的和未经改造的作物的引子。例如，可以设定引子来放大DNA区，该DNA区来自隐藏在构体中的载体并设定反引子来放大相关基因的DNA区。如果该作物已经被成功改造，那么这些引子仅放大某一片段。另一个证实进行了有效改造的方法DNA印迹交法(Southern blothybridization)，该方法是为本领域内所广泛知晓的。可以根据他们显型来区分改造作物/突变作物与未改造作物/天然作物。例如，可选择的标志基因的存在，或免疫法的特异蛋白质的存在所带来的显型，或者某特异蛋白质不存在所带来的显型，例如用ELISA化验法或西方转渍(Western blot)分析法检测发现胚乳中不存在SBEIIa蛋白质所带来的显型。可以通过观察麦粒的表形特性来筛选这样的作物，如对不缩水麦粒/直链淀粉含量进行可视化的检测或测量，或者通过显微镜来检测双折射。
突变
导致胚乳中SBEIIa酶活性或其他淀粉生物合成酶活性的减少的遗传变种的引入可以通过对相应的基因或调节序列进行适当的突变来实现。根据本申请文本的上下文，“诱导基因”是人工诱导的基因突变，这种基因突变可以是化学、辐射或基于生物变异形成的，如转位子或T-DNA插入子。基因被抑制范围，在一定程度上决定了改造淀粉的特性。这些突变可以是截断，或者是无效突变，它们被认为对淀粉的本性有着显著的影响，然而，充分地减少了支链淀粉合成酶的活性从而带来了感兴趣的麦粒特性或淀粉特性的渗漏突变也能导致淀粉组成的改变。其它染色体重组也是有效的方法，包括插入、缺失、倒置、复制、点突变等。此处的“无效突变”是指带来导致关注基因活性的完全缺失或接近完全缺失，如，无效突变之后，就不能再检测到该基因的活性。
SBEIIa基因位于染色体2的长臂上。最好是该基因或其它基因的突变，尤其是缺失突变，是定位在相关的基因上的，如SBEIIa基因，在双突变的情况下，则可以延伸到与之连接的SBEIIb基因。本上下文的基因包括启动子区、转录末端/多腺苷信号以及转录区。转录区包括蛋白质编码区域和mRNA的5’-UTR和3’-UTR区域，以及可能存在的内含子区。基因的突变可以在基因的任何区域上或区域的组合上，可以从单独改变一个核苷到整个基因的缺失。编码区域的移位突变就属于改变一个核苷。首选基因变种上同型的作物。
缺失的大小限制在一百到几百，或许500、千基(1000)。在特定的实施例中，缺失会延伸到少于几千千基，或着少于5000千基。然而，本发明还包含有更大片段的缺失，这种大片断缺失包括了相应的基因组的染色体2的许多长臂，这种大片断缺失不是首选的，因为染色体2的长臂上有很多其他基因，这些基因影响着小麦作物的活力。因此，大片断缺失发生的地方，将对作物的活力有负面影响，从而影响了其商业生存能力。所以，至少希望多数染色体2的长臂都存在。在优选的实施例中，多数染色体2A的长臂都存在。
突变可以通过化学的或辐射的手段来完成，例如对种子进行EMS或叠氮钠(Zar and Chandler，1995)处理，或者γ辐射。突突变种的分离可以采用筛选突变作物或种子来进行。例如，可以用ELISA法，从一定数量的突变的小麦中，筛选出麦粒中直链淀粉含量高的和/或支链淀粉分布链长度更长的、或者不含SBEIIa蛋白质的、或者是改变了麦粒形态的小麦(Green et al.，1997)。筛选一般是针对缺少某种SBE活性的小麦基因型，例如SBEIIb-否定的本底。然后，通过采用具有所期望的遗传本底的作物与这种突突变种进行杂交，并通过适当数量的回交把不想要的母体遗传本底除掉，从而把这些突变被引入到所期望的遗传本底中。
在另一个实施例中，这些突变影响了小麦中SBEIIa和SBEII基因的活性/表达。与玉米和水稻不一样，小麦中SBEIIa和SBEIIb基因是紧密连环遗传的，这一意外发现帮助了识别上述突变。这两种基因中，一种基因的缺失很容易延伸到另一种基因，从而给这两种基因带来了无效突变。这也帮助了筛选至少一个基因组上的SBEIIa和SBEIIb基因存在突变的自然突变小麦；也助于筛选具有两个或三个基因组中SBEIIa和SBEIIb基因存在突变的组合突变的小麦。这样的小麦，提供直链淀粉含量高的、非基因改造的源麦粒和产品。
对SBEIIa或支链淀粉合成酶等其他酶编码的基因的突变，通常会带来直链淀粉含量的增加。碳从支链淀粉向直链淀粉中的转移，会导致每一麦粒中直链淀粉的量增加；如果每一麦粒中淀粉的产出都有明显的减少，则麦粒中直链淀粉的量减少。但在任何一种情况下，相对的直链淀粉的百分比含量都是提高的。
大麦中具有变形的淀粉颗粒的种子中具有高直链淀粉的含量，这已经被报道了(Morell et al，2003和Sidebottom et al.，1998)，而低支链淀粉(LAPS)含量的玉米中，淀粉中含有大概90％的直链淀粉。
双折射是指物质在两个方向上反射光线的能力。双折射会在淀粉颗粒上生成一个称为“马尔他十字”(“maltese cross”)的黑暗十字，这通过偏振显微镜就能观察到。双折射是聚合体与颗粒结构组织整齐程度的指示器(Thomasand Atwell，1999)。淀粉颗粒缺乏双折射特性，通常与直链淀粉含量升高有关。
适于食品生产
本发明的另一方面，提供一种对食品生产有用的小麦。这种小麦的淀粉中，直链淀粉相对含量高，支链淀粉含量低。首选地，这种小麦作物生长过程种，胚乳中SBEIIa活性是减少的。本发明的小麦作物，对食品生产特别是生业食品生产很有用。所述的食品生产包括用面粉、生面团等的食品生产。
小麦的期望遗传本底包括农业收益和其他特性。这些特性可以包括是否期望得到冬季小麦或春季小麦、农学性能、抗病体和非生物压力抗体。在澳大利亚，某些人希望把改造后的淀粉特性杂交到小麦栽培变种中。这些栽培变种包括Baxter、Kennedy、Janz、Frame、Rosella、Cadoux、Diamondbird或其他成熟的变种。所列举这些例子是特定于澳大利亚生产区的，其他的变种适于在其他区域栽培。最好是，在某一栽培区，相对于种植野生的小麦品种，本发明的小麦变种能带来不少于80％的收益，更可能的是不少于90％甚至是不少于95％的收益。这一产量可通过试验控制田很容易地测量到。
在进一个实施例中，麦粒中淀粉含量(w/w)至少是25％、35％、45％、或者55％、到65％。商业种植的野生的小麦中，淀粉含量(w/w)与栽培种植有关系，通常是55％-66％。可选地，本发明的麦粒中，淀粉含量至少是等同的、未经改变的小麦的淀粉含量的90％。降低了的麦粒中支链淀粉含量，很可能会导致淀粉含量低于野生麦粒。即使麦粒的淀粉含量很低，其对食品生产也还是有用的，因为高直链淀粉产品具有相对的高价值。其他所期望的特性包括麦粒碾模能力，特别是麦粒的硬度。另一方面，是麦粒中淀粉提取程度，淀粉提取率越高，越有用，这种小麦就越有价值。麦粒的形状也是一个特性，它能影响这种小麦的商业有用性，对碾模的难易程度产生影响。例如，细长形状的小麦就难碾磨和加工。
为了达到最大的产量，就期望得到饱满的麦粒，这也是本发明所要带来的某些益处，包括获得直链淀粉含量高、链长分布度被改变的淀粉等。这样麦粒有不缩水显型。但是，本发明的其他方面的益处，也可能要不太饱满的麦粒才能更好地体现。在不太饱满的麦粒中，淀粉中高蛋白淀粉层/微生物/蛋白质的含量可能会更高，这种麦粒制成的面粉或其他产品中，高蛋白淀粉层/蛋白质的含量会更高。糊份层含量更高的产品，某些维生素如叶酸的含量可能会更高，或者矿物质如钙的含量会更高。另外，更高的抗体淀粉水平，提供了增效作用，如加强肠对矿物质的吸收。
用标准的方法能够很容易地从麦粒中提取出淀粉，如Schulman et al.(1991)用到地方法。在工业上，干磨和湿磨都是都会用到。对淀粉加工业来讲，淀粉颗粒的大小很重要，在淀粉加工业中，要把大颗粒淀粉A与小颗粒淀粉B分离。从本发明的麦粒中获得的所述淀粉，直链淀粉含量相对较高。
经改造的淀粉的物理特性
胶凝作用是在过量的水中淀粉颗粒分子顺序的热驱动干扰，伴随着属性的不可逆改变，如膨胀、微晶融化、双折射的缺失、粘度的增强和淀粉溶解性等。玉米中的ae(直链淀粉增补剂)突变带来的直链淀粉含量增高，显示出玉米的胶凝温度比常态的高(Fuwa et al.，1999，Krueger et al.，1987)。换句话说，相对于控制作物，sex6突变的大麦的淀粉缺乏淀粉合成酶IIa活性，胶凝温度变低，胶凝峰点的焓减少(Morell et al.，2003)。
本发明另一方面，所述的淀粉胶凝温度被改变了，这可以通过差式扫描量热法测定。相对于野生小麦的淀粉，这个温度可能升高，也可能降低。胶凝温度的改变，可能与直链淀粉含量高有关系。用差式扫描量热法测定出野生小麦淀粉胶凝第一峰值的温度典型的是61℃(Rahman et al.，2000)，这个温度定义为开始温度。
相对于野生的麦粒的淀粉，可以通过在过量的热水中的膨胀率来描述本发明所涉及的淀粉的特征。膨胀体积的测量，通常是把淀粉或面粉和水混合，然后加热到高温，通常是90℃以上。然后通过离心法取样，膨胀体积通常用样品沉淀物的质量除以样品的干重来标示。在食品加工中，特别是含水食品加工重，要增加淀粉的含量，就期望淀粉具有低膨胀率的特性。
本发明中筛选出来的小麦淀粉的成分，与普通淀粉的是不同的。本发明筛选出来的小麦淀粉，结晶度降低。结晶度的降低，被认为能加强其感官属性，口感上会觉得更滑。淀粉结晶度的降低，可能是因为一个或多个支链淀粉合成酶活性的减少。结晶度可以通过X-射线结晶学来探测。
改变淀粉中支链淀粉结构的一个尺度就是链长的分布，或者聚合的程度。可以用荧光辅助糖类电泳(FACE)来测定链长分布。本发明中，淀粉中的支链淀粉链长分布的范围是从5到60，大于野生小麦脱麸后的淀粉的链长分布范围。具有更长链长的淀粉，分支的频率有相应的减少。而这样的淀粉在仍然具有支链淀粉的情况下，可能具有更长的支链淀粉链长的分布。
食品特性
淀粉是人类饮食中碳水化合物的主要来源，本发明所涉及的麦粒及其产物都可以用来加工食品。这些食品可以供人或动物食用，如家畜食品或宠物食品。来自改造后的小麦作物的麦粒，能够容易地用来食品加工。因此，本发明包括小麦作物中所有碾磨的、磨碎的、粗磨的、嵌珠的、碾压的麦粒或由此而得得产品，包括面粉。这些产品可以用在各种食品产品中，包括谷类食品如面包、蛋糕、饼干、增稠剂、结合剂等，还可以用来制造饮料、面条、意大利面、速食汤等。从本发明的小麦取得的麦粒或产品，在早餐食品和压缩食品中特别受欢迎。本发明的直链淀粉含量高的淀粉，可以用做强力凝胶剂，这在制糖产品中很有用，节省了成型和固化时间；还可以用来做食物敷层，如应用到油炸马铃薯上，可以减少对油的吸收。
食用纤维
在本文本中所述的食用纤维，是指碳水化合物和碳水化合物消化产物。这些消化产物没有被小肠吸收，而是进入到大肠中。包括抗性淀粉，β葡聚糖和其他可溶的或不可溶的炭水化合物聚合体。其中还计划包括碳水化合物蛋白，这种蛋白是可发酵的，至少能够被大肠的常驻微生物群部分地发酵。
本发明所述的淀粉包含着相对高含量的食用纤维，特别是相对高含量直链淀粉。本发明中的麦粒中食用纤维的含量，可以是胚乳中直链淀粉含量增加单方面造成的；也可以是多方面造成的。
本发明的其他方面包括高蛋白淀粉层于微生物的组合以及与高含量的食用纤维的结合。具体地，包括麦粒中高蛋白淀粉/微生物含量的相对提高，在麦粒轻度缩水时，胚乳的量也减少，而高蛋白淀粉层和微生物含量却相对地提高了。这样，小麦有相对高含量的一些有益的元素或者维生素、淀粉抗体等。所述的元素包括，二价阳离子、可生物利用的Ca++和维生素，包括叶酸、抗氧化剂如维生素E和生育三烯酚类等。碾磨产物的一种形式是包括高蛋白淀粉层。可以采取特殊的碾模加工，以提高碾磨产品中糊份层的量。这样，所得的食品，就具有高蛋白淀粉层和微生物，具有附加的营养成分，而不需要从其他添加相应的元素。
抗性淀粉
抗性淀粉，是一个总称，指没有被健康人体的小肠吸收而进入大肠的淀粉、淀粉产品的总称。因此，抗性淀粉不包括被小肠吸收消化的淀粉，抗性淀粉包括物理结构上的隐蔽淀粉(RS1型)，常驻淀粉(RS2型)，回生淀粉(RS3)，化学变性淀粉(RS4)。本发明中改变淀粉的组成特别是提高直链淀粉的含量，会引起食物中抗性淀粉的增加。增加的抗性淀粉可能是RS1型的，无法被消化。经V-complex结晶度测量的淀粉-脂肪的结合度，也对抗行淀粉含量升高产生影响。
可以理解，本发明的一个好处就是不需要修改麦粒的淀粉或其他的成分，就能够提供一种有营养价值的食品。不对麦粒的淀粉或其他的成分进行修改，但本发明却包含了这样的经修改的成分。修改成分的方法包括用传统的方法提取淀粉或其他成分，或者修改以增加抗性淀粉，这些修改淀粉的方法可以包括热/湿度，物理加工(如碾模)、酶促(如用α-直链淀粉或β-直链淀粉酶，普鲁兰酶等)、化学水解(采用液态或气态试剂进行湿式或干式水解)、氧化、双官能剂交联(如三偏磷酸钠、三氯氧磷等)、羧甲基化等。
升醣指数
升醣指数(GI)，涉及含淀粉食物的消化率，是用来比较试验食物与白面包或葡萄糖所带来的血液中葡萄糖浓度效果的。升醣指数根据膳食后血糖浓度来衡量食物的效用，以及要维持血液中葡萄糖的动态平衡所需要胰岛素量。本发明涉及的食物，一个重要的特性就是，降低了升醣指数。更进一步地，该食物最终消化水平低，是相对低能量的食物。低能量产品包含辗磨后面粉产物。这些低能量食品，有利于肠胃的健康，有利于减少膳食后血糖浓度和油脂浓度。
非食用的应用
本发明提供一种改造过的淀粉，其中具有提高了的直链淀粉含量或降低了的支链淀粉含量。具有这种特性的淀粉，能满足许多工业上的要求。这些广泛的非食用产业应用，包括薄膜、纸张、纺织品、瓦楞纸、粘合剂产业(Young1984)，如用作浆料。小麦淀粉可以当作生产葡萄糖浆或乙醇的原料。未经改造的淀粉，其物理特性限制了其在某些方面的使用；还经常需要对其进行化学改变，这种化学改变通常是昂贵的或者有其他方面的缺陷的。本发明提供的淀粉，收割后不需要对其做太多的改造，其支链淀粉含量已经被减少，还附带着其他物理特性。如，糊化温度、抗剪压力、成膜强度和/或淀粉的抗水性，由本发明的麦粒制造的产品的性能也可以被改变。本发明所涉及的淀粉还可以用来加工可生物降解的宽松包装材料，可以作为聚苯乙烯或者其他包装材料的替代品。
本上面已经对本发明的多个方面进行了说明，可以理解地，本发明也可以包含于上述两个或多个方面的组合。
具体实施方式
实施例1材料与方法
碳水化合物的确定与分析
采用Schulman等(1991)的方法从麦粒中分离出淀粉。采用Megazyme(Bray，Co Wicklow，爱尔兰共和国)分析工具套件确定淀粉成分，并将淀粉成分与对照植物进行比较。从总的麦粒重量中减去淀粉的重量就得到麦粒中总的非淀粉成分，以确定所减少的总重是否是由于淀粉成分的减少。
淀粉中直链淀粉的成分的确定是采用如下经稍微修订的Morrison andLaignelet(1983)比色(碘滴定)法。准确称取大约2毫克(精准至0.1毫克)淀粉加入带橡胶垫圈盖子的2毫升螺帽试管中；为去除油脂，在淀粉中加入1毫升85％(v/v)的甲醇并将试管放入65℃水浴中加热1小时，偶尔搅动水体；在13,000g下离心过滤5分钟之后小心除去表面浮物，再重复进行萃取步骤。将淀粉在65℃下干燥1小时再溶入尿素-二甲基亚砜溶液中(UDMSO；9份二甲基亚砜与1份6M的尿素)，每2毫克淀粉(上面称取的)加1毫升UDMSO；将混合物立即充分搅动并置于95℃水浴中加热1小时，间歇搅动水体直至淀粉完全溶解。取部分淀粉-UDMSO溶液(50微升)用20微升碘-碘化钾(I2-KI)试剂处理，碘-碘化钾试剂是由将2毫克碘与20毫克碘化钾溶解在1毫升水中制得的；将混合物加水至1毫升，取200微升，采用Emax精密酶标测定仪(美国分子仪器公司，Molecular Devices，USA)在650nm光波下测定混合物的吸光率。含有0～100％直链淀粉和100～0％支链淀粉的标准样品是将马铃薯直链淀粉和玉米(或马铃薯)支链淀粉(Sigma)进行处理而制成测试样品的。直链淀粉含量(直链淀粉百分率)是通过测定吸光率值再通过标准样品的回归方程式计算而得。不脱麸淀粉中直链淀粉/支链淀粉的比率同样可按照Case et al.，(1998)提供的方法或Batey and Curtin(1996)提供的分离脱麸淀粉的HPLC法测定。
淀粉的链长分布可在将淀粉样品脱麸之后，通过Morell et al(1998)的荧光辅助碳水化合物电泳方法(FACE)的毛细电泳仪来测定。淀粉的凝胶温度曲线图可通过Pyris 1微分扫描热量计来测定(Perkin Elmer，Norwalk CT，USA)。淀粉溶液的粘度可通过快速粘度测定仪来测量(RVA，NewportScientific Pty Ltd，Waniewood，Sydney)，例如采用Batey et al.，1997所报道的条件，测量的参数包括峰值粘度(最高热粘度)、上止强力、终值粘度以及糊化温度。面粉或淀粉的溶胀比可通过Konik-Rose et al(2001)方法来确定。吸水力的确定是通过称量样品面粉或淀粉在一定温度下混入水之前后的重量变化以及所聚集的胶状物来完成的。
β-葡萄糖水平可采用Megazyme(Bray，Co Wicklow，Republic of Ireland)所提供的组件来确定。
胚乳中蛋白质表现的分析
胚乳中特定蛋白质表现的分析是采用蛋白质印迹程序(Western blotprocedures)。从母体组织中切下胚乳并将0.2毫克的样品在600微升的50mM的Kpi缓冲液中均匀成粒(42mM的K2HPO4和8mM的KH2PO4)，pH值7.5，含有5mM的EDTA，20％的丙三醇、5mM的DTT以及1mM的蛋白酵素抑制剂。研磨样品在13,000g下离心分离10分钟并将表面漂浮物在使用前于-80℃下冷冻。对于总蛋白质量估算，用0，20，40，60，80及100微升的0.25毫克每毫升的牛血清清蛋白(BSA)标准建立牛血清清蛋白标准曲线，取3微升样品用蒸馏水稀释至100微升并向每一样品中加入1毫升蛋白质试剂(Coomassie Plus Protein reagent)，5分钟后在595nm处录得吸光率。在标准曲线上把含0微升BSA的样品，即不含BSA的样品的吸光率设为空白值，这样就测量出了样品的蛋白质水平。在含有20微克取自胚乳的蛋白总量的样品中加入8％的含有0.34M的三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl，pH 8.8)的非改性聚丙烯酰胺胶体、丙稀酰胺(8.0％)、过二硫酸铵(ammoniumpersulphate)(0.06％)以及TEMED(0.1％)。在电泳作用下，蛋白质以Morellet al.，(1997)方式被转移到硝化纤维膜上并与SBEIIa或SBEIIb种类抗体发生免疫反应。
实施例2小麦SBEIIa和SBEIIb表征在遗传构造的改变
双链RNA(Duplex-RNA，dsRNA)构造用于降低小麦SBEIIa或SBEIIb基因表现。在这样的构造中，所希求的核酸序列与部分SBEIIa或SBEIIb基因相符合的情况发生在相对于启动区的官能方向和反官能方向上，因此所表征的RNA包含有补充区域而能使碱基对形成双链RNA。当在转基因植物内转录部分RNA时，在官能和反官能序列的隔离区域包含有基因内区序列就会被剪除而形成紧密的“发夹式的”双重结构。基因内区的内含物被发现由于双RNA结构的关系而能增加基因沉默(gene silencing)的效率(Smith et al，2000)。所希求的核酸与高分子量的麦谷蛋白(HMWG)启动子序列(Dx5亚基因启动子，编号Accession No.X12928，Anderson et al.，1989)和来自农杆菌(Agrobacterium，nos3′)胭脂氨酸合酶基因的终止序列相连接。这提供了双链RNA胚乳的特定表现。
SBEIIa双链RNA结构包含来自小麦SBEIIa基因被PCR放大了的1536bp核苷酸序列(基因数据库编号AF338431，见附图1)。这包括：含有整体外显子(exons)1和2以及部分外显子3(附图1中核苷位置1058到1336，1664到1761以及2038到2219)的在两旁具有EcoRI和KpnI限制位的468bp序列(片断1)；由部分外显子3和4以及整体基因内区3(附图1中核苷位置2220到2731)组成的在两旁具有KpnI和SacI位SBEIIa的512bp片断(片断2)；以及由完整外显子1、2和3组成的在两旁具有BamHl和SacI位SBEIIa(附图1中核苷位置1058到1336，1664到1761，以及2038到2279)的528bp片断(片断3)。然后将片断3和片断2相对于片断1的反官能方向捆绑而将片断1、2和3捆绑在一起。双链RNA结构最初产生于包含有启动子序列和nos3’终端的遗传媒介pDV03000。pDV03000中的基因结构指定的是pDV03-IIa，而双链RNA结构指定的是ds-SBEIIa。
SBEIIb双链RNA的构造策略是相似的。SBEIIb双链RNA结构包含来自小麦SBEIIb基因被PCR放大了的1536bp片断(序列表述在附图2中)。这包括：含有整体外显子1和2以及部分外显子3(附图2中核苷位置489到640，789到934以及1598到1769)的在两旁具有EcoRI和KpnI限制位的471bp序列(片断1)，由部分外显子3和4以及整体基因内区3组成的在两旁具有KpnI和SacI位SBEIIa的(附图2中核苷位置1770到2364)589bp片断(片断2)；以及由完整外显子1、2和3组成的在两旁具有BamHl和SacI位SBEIIa(附图1中核苷位置489到640，789到934，以及1598到1827)的528bp片断(片断3)。然后将片断3和片断2相对于片断1的反官能方向捆绑而将片断1、2和3捆绑在一起。SBEIIb双链RNA结构遗传媒介pDV0300指定的是pDV03-IIb，而双链RNA结构指定的是ds-SBEIIb。该结构的示意图见附图3。
然后将每一双链RNA表现框架通过限制酶XhoI剪切并植入二元转换遗传媒介pGB53和pBIOS340中。pGB53是来自pSB11(Komari et al.，1996)，它是以水稻肌动蛋白启动子驱动向其引入了基因编码的黄灵草抗性(sul)，在导入之前在邻近右T-DNA边界处预留一个独特的XhoI位。同样，pBIOS340是来自pSB1(Komari et al.，1996)，它是以水稻肌动蛋白启动子驱动向其引入了nptII基因编码的卡那徽素基因抗性，同样在导入之前在邻近右边界处预留一个独特的XhoI位。pGB53和pBIOS340中的SBEIIa双链结构分别指定pCL51和pCL59，pGB53和pBIOS340中的SBEIIb双链结构分别指定pCL54和pCL60。
实施例3小麦的改造
小麦改造的遗传结构的是通过电穿孔导入带有vir质粒pAL4404和pSB1的卸甲农杆菌种属LBA 4404，随后在奇放线菌素上选择媒介。改造后的农杆菌种属于27℃下在凝固YEP媒介中培养2天。然后收集菌体并再悬浮于具有400mM乙酰丁香酮(acetosyringone)和650nm下光密度2.4的TSIM1中(含有100毫克每升肌醇、10克每升葡萄糖、50毫克每升pH5.5的MES缓冲溶液的MS媒介)进行小麦接种。
小麦物种(NB1品种，由Nickerson Seeds Ltd，Rothwell，Lincs.提供的春小麦品种)在昼/夜温度分别为22/15℃并每日提供光照16小时的暖房中生长。在开花期之后的14天连同50cm的幼芽杆茎收割幼芽(晶胚大约1mm长)。去除幼芽上除旗叶之外的所有叶片，以清除掉受污染的真菌孢子。小心地从最早的两朵小花中去除每一小穗上的颖苞及外稃以使未成熟的种子外露出来。通常每一小穗仅有这两粒种子未被包覆。这个程序在整个开花期都要进行，然后向抽穗喷洒70％的IMS以作表面杀菌。
将农杆菌悬浮液(1ul)通过10ul的汉密尔顿注射器在盾状结构处注射到未成熟的种子中：胚乳分界从而所有暴露出的种子都被接种。然后将幼芽放入水中，盖上半透明的塑料袋以防止种子脱水，然后放入带盖的培养皿中在23℃，每天16小时45Em-2s-1PA的光照下放置3天。经过3天的共同培养后，取出接种的未成熟的种子并先后以70％乙醇(30秒)、20％的漂白水(商品：Domestos，20分钟)进行表面消毒处理，进而在消毒后的蒸馏水中彻底清洗。未成熟的晶胚放置在W3媒介(MS补充20g/l蔗糖、2mg/l的2，4-D同6g/l的I类琼脂糖凝固，Sigma)并附加150mg/l特泯菌(Timentin，W3T)连同上部的盾状结构(每盘20个晶胚)进行无菌隔离。培养菌放置在25℃下光照(每天16小时，强度Em-2s-1PAR)。接种的5天后估算晶胚的胚胎轴，为促进胼胝体产生的需要，可以去除这些轴。晶胚在W3T中维持4周，转移到新鲜的媒介中再隔离2周并评估胚胎形成的能力。
生长4周之后，从接种后的晶胚上衍生出来的胼胝体与种植在W3T媒介中的未接种晶胚上生长出的胼胝体非常相似。从细菌的表现来看，由接种的晶胚衍生出的胼胝体并没有充分地降低胚胎形成的能力。将幼胚胚性愈伤组织转移到含有2mg/l黄灵草(此处采用衍生的pGB53)或25mg/l的Geneticin(抗生素或遗传霉素)(pBIOS340衍生物)以及150mg/l特泯菌(W32AT)的W3媒介中。幼芽组织在媒介中再维持2周，然后将每一组织分成2mm大小的小片再重新平放入W32AT中。与不含二元媒介结构的LBA4404接种产生的控制胚胎，在经挑选的媒介中不产生经改造的胼胝体。
经过两周的培养，评估所有幼胚胚性愈伤组织的发展：在经过4周的选择后，任何表现出继续发展苗头的胼胝体都被转移到再生媒介中(含40g/l麦芽糖的RMT-MS、150mg/l特泯菌，pH 5.8与6g/l的琼脂糖凝固，Sigma第一类)。嫩芽在该媒介中再生4周后也被转移到150mg/l特泯菌的MS30中进行嫩芽的生长和根部的长成。然后将幼小物种转移到土壤混合物中并在misting bench中保持2周，最后转移到暖房中。
通过这种方法处理了总共3217个采用pCL54或pCL60(ds-SBEIIb)的晶胚和2010个采用pCL51或pCL59(ds-SBEIIa)的晶胚，从IIb改造的愈伤组织中再生了61株物种，从IIa改造的愈伤组织中再生了31株物种。在挑选的媒介中存活下来表明它们成功地进行了基因结构改造。大部分，但不是全部经可选择的标志基因改造的物种将被结合上SBEIIa或SBEIIb抑制基因；在下面的实施例中，这将很容易被区分。
通过试验复原具有再生潜力的多种稳定的综合结果显示该小麦接种改造方法与报道的其它方法一样有效。其它农杆菌品种如AGL1品种，或可选择的标志基因如抗潮霉素基因也可采用本方法。
实施例4小麦改造的分析
改造用下述至少一种方法来确定：对至少一个基因转殖进行PCR分析。PCR分析是将从1-2cm2鲜叶材料萃取出的基因组DNA采用Stacey and Isaac(1994)描述的“微量提取”(“mini-prep”)方法来进行的。PCR反应在下列情况下发生，如采用引子SBEIIa-For：5′-CCCGCTGCTTTCGCTCATTTTG-3′[序列号No.9]以及SBEIIa-Rev：5′-GACTACCGGAGCTCCCACCTTC-3′[序列号No.10]用于从SBEIIa中放大片断(462bp)，或SBEIIb-DupFor：5′-AGATGTGAATGGCTGCTTGCTG-3′[序列号No.11]和SBEIIb-DupRev：5′-CAGGTCGACCATATGGGAGAGC-3′[SEQ ID No.12]用于SBEIIb(505bp)。反应条件是：在94℃下“热起动”(“hot start”)3分钟，接着在95℃下进行30圈变性30秒，55℃下韧化30秒，73℃下延展2分钟，然后在73℃下循环1圈5分钟。
DNA印迹交(Southern blot hybridization)分析是针对从冻干的基本组织中大量萃取(9ml)的DNA来进行的(Stacey and Isaac，1994)。DNA样品被调节至0.2mg/ml并经限制酶煮解，如HindIII，EcoRI和KprI。Stacey and Isaac(1994)对限制酶煮解、胶体电泳、真空印迹技术进行了阐述。通过McCreeryand Helentjaris(1994)的方法制得包括ds-SBEII结构的基因内区3区的地高辛配基标记(Digoxigenin-labelled)探针。化学发光探测和探针的DNA印迹交是依据McCreery and Helentjaris(1994)提供的方法进行的。
PCR分析的结果总结于表2中。经PCR证实基因转殖成功的物种包括27个独立ds-SBEIIa改造和61个独立ds-SBEIIb改造。
表2：对小麦的SBEIIa和SBEIIb RNA双链结构改造
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实施例5由双链RNA结构改造的物种所得麦粒的分析
淀粉颗粒形学
自T0转换的小麦物种所得的成熟的T1种子的淀粉颗粒形态学可在光学显微镜下观测到。分析了从每一个经ds-SBEIIa独立转换的25个T0物种中得到10个麦粒个体和经ds-SBEIIb独立转换的12株物种。每一胚乳都细心地剥开得到淀粉颗粒，把这些淀粉颗粒分散在水中，并用光学显微镜观察。被分析的25个ds-SBEIIa种系中，12个是变形了的颗粒(如图4所示)尽管视觉的观察显示出不同的种子具有不同的变形水平。相比之下，12个ds-SBEIIb种系中的胚乳没有一个在光学显微镜下观测到明显的淀粉颗粒变形。结果见表3和表4。
表3：ds-SBEIIa基因改造小麦种系的T1种子的淀粉颗粒形态学
  载片编号   种系号   颗粒形态学
  1   44.1a   +
  2   50.1b   -
  3   50.2b   +
  4   50.3x   -
  5   52.1a   +
  6   52.2a   +
  7   52.3a   +/-
  8   58.1a   -
  9   58.2a   -
  10   61.2a   -
  11   83.1b   +
  12   84.1a   +/-
  13   85.1a   +/-
  14   85.2c   -
  15   85.3a   -
  26   85.4b   +
  17   85.5a   -
  18   109.1a   -
  19   109.2c   +
  20   109.3b   +
  21   109.4e   -
  22   109.7b   -
  23   109.8c   -
  24   109.10a   +
  25   109.11x   +
*每一种系观测了10个种子的淀粉颗粒形态学。
如果所有10个种子都是正常的颗粒形态，则形态学以“+”表示；“-”表示种子被严重的变形；“+/-”表示部分畸形，即，至少有部分的种子有一定的变形，但所有的种子都没有严重的变形。
表4：ds-SBEIIb基因改造小麦种系的T1种子的淀粉颗粒形态学
  载片编号   种系号   颗粒形态学
  1   48.1a   +
  2   55.1a   +
  3   60.1a   +
  4   60.4a   +
  5   73.1f   +
  6   75.1c   +
  7   75.3x   +
  8   77.1c   +
  9   77.2c   +
  26   110.16b   +
  27   110.17b   +
  28   110.18a   +
+表示每一种系的所有10个种子都是正常的淀粉颗粒形态
在偏振光下观测淀粉颗粒显示出变形了的ds-SBEIIa麦粒的双折射减少极大(图5)。从种系50.1b的种子中相对于其受到变形的显形观测到丧失了94％的双折射，然而同一种系的正常颗粒则显示出了全双折射(表5)。正常的颗粒被认为是受到隔离缺少基因转殖而典型地显现出常规性。
表5：ds-SBEIIa转基因小麦种系50.1b的T1种子的淀粉颗粒双折射
淀粉颗粒的光学显微镜结果在电子扫描显微镜下得到证实。为此，利用黄金对精制淀粉进行排射并在室温下以15kV进行扫描。
麦粒重量
ds-SBEIIa转换物种的个体麦粒在暖房内以同等条件生长，并称重(表6)。严重发生颗粒变形的50.1b、58.2a、61.2a以及109物种的麦粒与同等条件下生长的野生种类物种相比较，其平均重量并没有太大的减少。因此即使种子的淀粉颗粒发生严重的变形也不影响淀粉的产出。该数据同时表明降低了SBEIIa活性的野外生长小麦的胚乳产出是正常的。
表6：SBEIIa转基因小麦种系T1种子的麦粒重量
  转基因种系   种子编号   种子重量(mg)   淀粉颗粒形态   转基因种系   种子编号   种子重量(mg)   淀粉颗粒形态
  50.1b   1   16.9   +   61.2a   1   50.7   +
  2   49.8   +   2   49.0   +/-
  3   46.9   -   3   49.8   -
  4   50.0   -   4   47.0   -
  5   45.4   -   5   48.6   -
  6   42.6   -   6   46.2   -
  7   39.9   +/-   7   42.2   +
  8   41.0   +   8   50.4   -
  9   39.5   -   9   39.7   -
  10   37.0   +/-   10   46.3   -
  58.2a   1   44.0   -   109.7b   1   40.1   -
  2   37.4   +   2   34.6   -
  3   48.8   -   3   43.7   -
  4   43.2   +   4   38.8   -
  5   46.2   -   5   33.8   +/-
  6   42.1   +   6   31.1   +/-
  7   43.5   +/-   7   35.9   +
  8   45.7   -   8   44.3   +/-
  9   38.8   -   9   37.7   -
  10   38.1   +/-   10   41.4   -
+正常淀粉颗粒，-严重变形的颗粒，+/-轻微变形的颗粒
T2转基因小麦胚乳的SBEIIa and SBEIIb蛋白质分析
从代表5个独立改造种系的13个ds-SBEIIa改造的T1物种和代表3个独立改造种系的9个ds-SBEIIa改造的物种中取得种子T2，采用未改变结构的PAGE和蛋白质印迹分析进行胚乳中SBEIIa和SBEIIb蛋白质表现分析。所有的ds-SBEIIa物种都取自于具有反常的淀粉颗粒形态学的种系，所有的ds-SBEIIb物种都取自于具有正常的淀粉颗粒形态学的种系，如上所述。用于侦测SBEIIa的抗体是来自野兔的3KLH，该3KLH被培植用来抵抗合成肽，具有了氨基酸序列AASPGKVLVPDESDDLGC[序列号No.13]，与N封端的成熟SBEIIa序列一致，然后被稀释至1∶5000待用。用于侦测SBEIIb的抗体是R6，该R6被培植用来抵抗合成肽，具有了氨基酸序列AGGPSGEVMIGC[序列号No.14]，与N封端的成熟SBEIIb序列一致，然后被稀释至1∶6000待用。所采用的第二抗体是GAR-HRP(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体)变体(稀释1∶3000)，用Amersham公司的ECL检测系统观测免疫反应性群组。
对从22个T1物种中取出的每7个正在生长的麦粒(开花期后的15天)进行分析，希望其中的一些物种能被转基因杂和。13个ds-SBEIIa物种中的12个所产出的T2后代显示出胚乳中SBEIIa蛋白质水平的下降。从同一种系(50.3x.9)来的所有7个种子都显现出完全缺乏SBEIIa，而从其它4个物种种系中来的所有7个种子明显显示出降低了的SBEIIa表现(表7)。这可以表征同型结合的转基因种系。7个种系在SBEIIa缺乏或降低了SBEIIa水平情况下进行隔离，或在某些情况下没有蛋白质的表象降低，这些种系很可能表征转基因的异质结合体。第13种系(50.3x.6)是野生种类表现的同型结合(表7)。
表7：T2ds-SBEIIa转基因小麦种系胚乳蛋白质的蛋白质印迹分析
  转基因种系   基因对象   T1颗粒形态学   T2麦粒中SBEII蛋白质群组隔离
  50.3x.6   SBEIIa   +   统一的野生种类表现(+)
  58.1a.3   “   -   隔离的+/-和-
  58.1a.7   “   -   隔离的+、+/-和-
  58.1a.9   “   -   隔离的+、+/-和-
  50.1b.3   “   -   统一的+/-
  50.1b.4   “   -   隔离的/-和-
  50.1b.5   “   -   统一的+/-
  50.1b.9   “   -   隔离的+和+/-
  50.3x.9   “   -   统一的-
  61.2a.8   “   -   统一的+/-
  61.2a.9   “   -   隔离的+/-和-
  61.2a.10   “   -   统一的+/-
  85.2c.2   “   -   隔离的+/-和-
  110.16b.14   SBEIIb   +   统一的野生种类表现(+)
  110.16b.2   “   +   统一的-
  110.16b.17   “   +   统一的+
  110.16b.5   “   +   统一的-
  110.16b.19   “   +   统一的-
  110.17b.3   “   +   隔离的+/-和-
  110.17b.6   “   +   隔离的+和+/-
  110.18a.9   “   +   隔离的+/-和-
  110.18a.17   “   +   隔离的+、+/-和-
在测试的9个ds-SBEIIb转基因种系中，每个种系7个种子，有3个种系(110.16b.2、110.16b.5和110.16b.19)的21个种子统一地没有显示SBEIIb表现，另2个种系统一是野生种类表现，其它4个是隔离无表现、降低了的表现或野生种类(表7)。通过PCR筛选和蛋白质表现分析，可以对这些种子的晶胚进行培养繁殖(晶胚释放)产出T2物种和T3种子，来证实T2种子的转基因遗传状态。
这些数据表明双链RNA结构在降低小麦胚乳的SREIIa和SBEIIb基因表现上是有效的。数据同时表明单独的SBEIIb表现降低并不根本改变淀粉颗粒形态学。
同时采用蛋白质印迹分析方法对含有ds-SBEIIa转基因和缺乏SREIIa蛋白质的转基因种子的SBEIIb表现，以及含有ds-SBEIIb的种子的SREIIa基因表现进行了分析。出人意料的是，含有ds-SBEIIa的转基因种子的SBEIIb降低很多。然而，相反的结果并没有在转基因ds-SBEIIb种子上发生。种子中SBEIIb完全被ds-SBEIIb压制的情况下SBEIIa表现却保持不变。可能是因为SBEIIb表征被ds-SBEIIa结构所抑制，这是因为用于双链结构区域内基因之间的序列同族，同时也可能是由于SBEIIb的活性被ds-SBEIIa转基因以其它机制降低了。
SBEIIa和SBEIIb基因的表现水平也可通过诸如RNA印迹交或RT-PCR方法的标准技术以mRNA明确地决定下来，例如在未保藏的区域或在一个而不是另一个基因的特定位置上杂交的引子碱基对采用探针(探测)，如在3’未转化的区域上。这些区域或位置可以通过比较两个基因序列而轻易识别出来。
实施例6改造后的小麦的淀粉分析
转基因小麦麦粒的直链淀粉和支链淀粉水平。
6个集中性T1种子样品淀粉中直链淀粉含量的确定见实施例1。集中性的种子样品是从以下转基因小麦种系获得的：
集合1-含有ds-SBEIIa转基因种系85.2c的变形淀粉颗粒的种子。
集合2-含有ds-SBEIIa转基因种系85.1a的正常淀粉颗粒的种子。
集合3-含有ds-SBEIIb转基因种系110.18a的正常淀粉颗粒的种子。
集合4-含有ds-SBEIIa转基因种系58.1a、58.2a和61.2a的变形淀粉颗粒的种子集合。
集合5-含有ds-SBEIIa转基因种系83.1b的正常淀粉颗粒的种子。
集合6-含有ds-SBEIIb转基因种系75.3x的正常淀粉颗粒的种子。
每一次分析中复制4份淀粉样品。这些分析中用于将吸光率转换成直链淀粉含量的衰退方程式是Y＝57.548X-8.793，其中Y是直链淀粉含量，X是吸光率。
结果见表8。变形了的淀粉颗粒明显的与直链淀粉含量的增加有关。具有ds-SBEIIa转基因种系的变形颗粒长出的麦粒的淀粉中的直链淀粉含量比其它淀粉品种高出50％，由普通淀粉颗粒衍生出的淀粉中直链淀粉一般占21～26％。这其中包括具有降低了SBEIIb表现的来自IIb 110.18a种系的淀粉(表8)，显示出单纯的SBEIIb失活并不大幅增长麦粒淀粉中直链淀粉的含量。
表8：碘量法估算转基因小麦种系中直链淀粉的含量
Figure S04818658X19960325D000531
第二组碘量法测定中采用的样品是品种4和具有SSII缺陷的淀粉(Yamamori et al.2000)以及SSIIa突变的大麦种系M292。测定的结果表明品种4的小麦种子比SSII变种的小麦和大麦的淀粉中直链淀粉含量有相当的提高。
这说明这些麦粒淀粉中支链淀粉的含量都有相当的降低，从野生种类的75％降低到50％甚至低至20％。
通过对上述转基因植物的杂交可以得到同时具有ds-SBEIIa和ds-SBEIIb基因转殖的种系。这些麦粒的后代中直链淀粉的含量比仅含有ds-SBEIIa的物种淀粉中的含量有提高，如从75％提高到80％，表明在ds-SBEIIa的基础上再接种ds-SBEIIb即可提高直链淀粉的水平。
实施例7基因组A、B和D的SBEIIa比较
构件小麦cDNA和基因组文库
小麦胚乳cDNA和基因组文库是采用标准方法由抗菌素带菌体制得(Sambrook et al，1989)。建立两个cDNA文库，一个来自培育植物Rosella(Rahman et al.，1999)的RNA，另一个来自培育植物Wyuna(Rahman et al.，2001)。Rosella文库是在带菌体ZAPII中并采用EcoRI和NotI引子，Wyuna文库是在通过协议供应试剂的带菌体ZipLox(Life Technology)中。文库的titres编号等是采用Y1090(ZL)的E.coli群组进行2X106PFU测定。基因组文库是由A.tauschii variety 10097的DNA建立起来的。DNA经Sau3A蒸煮并与部分填充的lambdaGEM12带菌体(Promega)绑扎。克隆的片断可经SacI或XhoI细菌分解而释放出来。T.aestivum(夏季小麦)DNA的基因组文库见Turner et al.(1999)的记述。
SBEIIa cDNA序列的隔离
利用低严格度的小麦SBEI序列探针(Rahman et al.2001)可以将cDNA从由培育植物Rosella建立的文库中隔离。得到最长的克隆体，指定sbe9排序并对SBEIIa种类的序列进行编码(基因数据库AF338432.1)。随后采用探针在相应于sbe9的536到890位置将3个克隆体从由培育植物Wyuna(Rahmanet al.，2001)建立的胚乳cDNA基因组文库中隔离。文库筛选的条件是在25％的甲酰胺中杂交，5×SSC，0.1％的SDS，10×Denhardts溶液，100微克每升的鲑鱼精DNA在42℃下16小时，接着采用2xSSC，0.1％的SDS在65℃进行3个1小时的清洗(中等严格度)。通过对克隆体的排序得到三个序列，它们分别代表下述的sr995和sr997(图6)。
对这些DNA序列的研究表明小麦胚乳中有不同的序列表现，这可能与SBEIIa由不同的小麦基因组转录而来有关。对其它已知小麦SBEIIa cDNA序列进行的FILEUP比较表明sr995和sr996序列与从D-基因组序列wSBE-D1(sr854)衍生而来的mRNA序列串生(图7)，说明sr995和sr996表现出从D基因组SBEIIa的转录。Sr997与Y11282序列的串生(Nair et al.，1997)表明它们极可能来自同一基因组，A或B基因组中的任意一个。前述的sbe9(AF338432.1)可能来自同样的基因组Y11282但是代表另一结合，与一个邻近5’端的外子相一致的被剪除。
从夏季小麦(T.aestivum)A，B和D基因组中区分SBEIIa基因或RNA转录序列的不同可作为在基因水平或RNA水平上突变筛选之中区分A，B和D基因组特定引子的基础。例如，图6比较了包含有基因数据库编号Y11282的cDNAs的SBEIIa核苷酸序列，以及cDNAs sbe9(AF338432.1)、sr997和sr995的部分序列。由夏季小麦可得到SBEIIa基因的基因组序列，如见表1。这些基因组序列被归于A，B和D基因组。对比显示，采用分子方法，任何一个多态现象都可用于区分这些序列。
基于外子5(5′-ATCACTTACCGAGAATGGG-3′)[序列号No.15]区域的向前的引子和基于外子6(5′-CTGCATTTGGATTCCAATTG-3′)[序列号No.16]序列的向后的引子被用于区分从A，B和D基因组。该引子可用于PCR反应以筛选来自A，B和D基因组的一个或多个SBEIIa基因突变异种的变种或添附物(见下)。
基于PCR的遗传标志同样也被开发用于从小麦A，B和D基因组中区分SBEIIb基因。例如，与引子对ARA19F(5′-CACCCATTGTAATTGGGTACACTG-3′)[序列号No.17]和ARA 15R(5′-TCCATGCCTCCTTCGTGTTCATCA-3′)[序列号No.18]进行PCR反应，随后采用限制酶RsaI对放大产物进行煮解，即可从上述3个基因组中区分SBEIIb基因。
cDNA序列的不同反映在推断的蛋白质序列中。例如，推断的D基因组(sr854)和A或B基因组(Yl 1282)多肽标准长度氨基酸序列的比较见图8。明显在区域688-698和735-6中有很大不同，从而可被用于制造SBEIIa蛋白质的特别基因组抗体，用作筛选缺乏一个或多个特别基因组活性的小麦变种的目的。其它不同之处发生在相应于氨基酸位置1-54的转运缩氨酸序列中，见图8。
实施例8一个或多个SBEII基因突变异种小麦多样性的识别
B和D基因组中SBEIIb零突变的识别
采用引子ARA19F(见上)和ARA23R(5′-CTGCGCATAAATCCAAACTTCTCG-3′)[序列号No.19]，对应于多形态基因内区3区域，通过PCR对SBEIIb遗传标志放大的方法，对总共1500个小麦增添物进行筛选，包括300个澳大利亚小麦变种，900个来自澳大利亚冬小麦品种收集(AWCC，Tamworth，澳大利亚Tamworth作物改良中心)的小麦增添物和300个小麦地方品种。PCR放大的条件如上所述。放大的产物经限制酶煮解，并在聚丙烯酰胺胶体中进行电泳。得到缺乏D基因组遗传标志的3个种系和缺乏B基因组遗传标志(图9)的2个种系。这些种系表征B或D基因组的SBEIIb基因中推测的零突变。
对零突变种系的DNA进行DNA印迹交分析以证实PCR结论。用标准方法由物种精制的经HindIII煮解的DNA在1％的琼脂糖胶体中电泳，再在带正电荷尼龙膜(Amersham公司)上转渍(印迹)。采用Megaprime DNA标识系统(Amersham Pharmacia Biotech UK Ltd)在SBEllb(位置2019到2391，见图2)基因内区3区域进行放射性同位素示踪的探测，并在严格的条件下进行杂交培植。D基因组中的Aus17340和Aus10103缺少了～4.8kB波段，B基因组中的Aus12509和Aus12565缺少了～3.4kB波段。因此这些种系分别被证实是D或B基因组SBEllb基因的零突变。
B+D双零突变世代的产生
对下述组合进行杂交：
Aus17340a×Aus12509
Aus17340b×Aus12509
Aus17340a×Aus12565
Aus17340b×Aus12565
Aus12745×Aus12509
Aus12745×Aus12565
Aus17340a和Aus17340b是同一Aus17340培育植物的两个不同生物种类；两者都被证实对于D基因组SBEIIb基因标志是零突变。F1物种进行自花受精而F2后代则通过PCR方法筛选出同时具有B和D基因组SBEIIb基因的突变物种(双零突变)。采用引子对AR2b19cF(5′-CTATGCCAATTGAACAACAATGC-3′)[序列号No.20]和AR2b23cR(5′-CGTGTTCATCAATGTCTGAACG-3′)[序列号No.21]通过PCR放大，进而用限制酶Rsal煮解，观测到SBEIIb突变的分离。典型的分离模式如图11所示。卡方分析(Chi-Square Analysis)显示Aus17340a x Aus 12509和Aus17340a x Aus12565杂交的分离模式符合预期的比率9∶3∶3∶1(表9)。在其它杂交中这种分离发生了严重的变形。
表9：B和D次基因组的SBEIIb零突变杂交的F2族群的卡方分析
  杂交表型   17340a×12509   17340b×12509   1734a×12565   17340×12565   12745×12509   12745×12565
  正常   85   63   56   72   95   21
  B零   38   39   25   35   11   2
  D零   23   29   11   11   57   16
  BD零   6   10   4   6   3   0
  总计   152   141   96   124   166   39
x2(9∶3∶3∶1) 5.52 9.73 6.19 12.91 39.79 16.66
x2(9∶3∶3∶1)(0.05)的列表值，df3＝7.81
在所有与亲本种系无关的杂交中都探测到了白化变种物种，表明叶绿素相关基因的突变也在族群中发生分离。在24个分析的白化变种物种中，23个是B+D双零突变，另一个表现出野生种类。5个B+D双零突变的看上去正常绿色的物种从718种系测试中得到鉴别。其中的三个是来自Aus17340b xAus12509杂交(BD219，BD303，BD341)，一个来自Aus17340a x Aus12509(BD54)杂交，另一个来自Aus17340b x Aus12565(BD636)。结果显示B和D基因组的SBEIIb基因突变与当两个变异的基因座在一起的时候表现出白化显型的叶绿素相关基因的突变是紧密连锁的。然而，识别到SBEIIb基因与叶绿素相关基因的再结合的发生，增加了正常的B+D双零突变种系，尽管其出现的频率很低。这表明这两种基因紧密连锁的，但是可被分离。
实施例9SBEIIa和SBEIIb在小麦中是连环遗传的
BAC克隆的隔离
由A.tauschii的变种meyeri(Moullet et al.，1999)构建的大片断柯斯质粒二元柯斯质粒(BAC，细菌人工染色体)文库在SBEIIb基因的基因内区3区域被探测到来隔离含有SBEIIb基因的BACs。4个确定的克隆被隔离并指定BAC-4，-5，-9和-12。为证实其中含有SBEIIb基因，从这些克隆体中萃取出DNA，用HindIII或EcoR1煮解，并用同样的探针进行DNA印迹交分析(图12)。克隆体BAC-5在EcoR1中于～7.5kB大小处显示出强烈的杂交波段，在HindIII中于-6.1，3.6，2.3和1.7大小处有4个波段。这证明在BAC-5中存在SBEIIb。为测试在BAC-5基因的3’区域中存在基因，对该克隆体进行PCR放大，基于SBEIIb cDNA序列，为增强外子17(AR2b3pr2F，5′-GGATATGTATGATTTCATGG-3′[序列号No.22]，和AR2b3pr2R，5′-CCATAAAGTTAAGATAACCC-3′)[序列号No.23]和20(AR2b3pr1F，5′-GACATCAGACCACCAGTACG-3′[序列号No.24]，and AR2b3pr1R，5′-CTTCCCAGGCTTTAAACAGC-3′)[序列号No.25]专门设计了引子。两套引子符合了预计的为外子17的128bp大小的产物和为外子20的145bp，说明BAC-5中含有3’端子的SBEIIb。这进一步被外子20的PCR产物排序所证实。
BAC-5同时也被测试，表明在呈现有SBEIIb的同时也有SBEIIa。采用引子AR2akpnIF 5′-GGTACCGCAGAAAATATACGAGATTGACCC-3′[序列号No.26]进行的核苷酸序列反应得到了相应于SBEIIa基因内区3区域的序列，它与wSBEII-D1的2265到2478位置上的序列是相同的(图1)。这一结果表明SBEIIa同样出现在BAC-5中，意味着SBEIIa和SBEIIb极有可能在小麦中是连环遗传的。
荧光原位杂交技术(FISH)
对wSBE II-D1基因克隆体F2(Rahman et al.，2001)和wSBE II-D2基因克隆体(Rahman et al.，2001)的原位杂交是在由Aegilops tauschii和小麦挤压的染色体中进行的，如Turner et al.，(1999)所述。杂交染色体的特性是采用pSc119.2双标识证实的，它是一种用于染色体鉴定中的重复顺序(Mukai et al.，1990)。两种wSBEII克隆体都在接近染色体2的区域进行杂交(图13)，
表明小麦中的这两种SBEII基因的近似性。
小麦SBEIIb零突变也是SBEIIa突变
上述识别SBEIIb的零突变被筛选用作SBEIIa的突变，使用的引子是Sr913F(5′-ATCACTTACCGAGAATGGG-3′)[序列号No.27]和E6R(5′-CTGCATTTGGATTCCAATTG-3′)[序列号No.28]。这些引子被设计用于放大wSBE II-D1的基因内区5区域，以及在A，B和D基因组中区分SBEIIa基因。
Aus12565和Aus12509的SBEIIb B基因组零突变也在SBEIIa基因的B基因组零突变中被发现。同样的，SBEIIb的D基因组零突变，Aus17340和Aus10103，也在SBEIIa的D基因组零突变中被发现。此外，B+D基因组的SBEIIb双突变种系，BD341和BD636，同时也是SBEIIa基因的B+D基因组零突变。与水稻和玉米相比较，数据证明SBEIIa和SBEIIb在小麦中是连环遗传的，这与水稻和玉米相反。数据还表明上述基因的B和D基因组突变副本表征了缺失突变体。
三重零SBEIIa小麦突变
上述方法可被用于隔离SBEIIa和/或SBEIlb的A基因组突变体。例如，与SBEIIa和/或SBEIlb紧密连接的BAC-5区域被当作探针或作为PCR引子设计来筛选基因中的A基因组突变体。A基因组突变体与B+D双零突变种系杂交而制得A+B+D三重零突变种系。同样，通过放射或其它方式可得到B+D基因组双零突变基因，完全缺失SBEIIa活性和随机SBEIIb活性的三重零突变也被识别出。从而提供了一种直链淀粉含量非常高的非转基因小麦品种。
实施例10小麦中SBEIIA基因的突变
通过伽马射线照射或化学突变方式，如乙基甲基磺酸酯(Ethyl methanesulfonate，EMS)，进行的小麦SBEIIa基因的突变使得SBEIIa活性的降低，对于伽马射线降低的突变，种子在钴60放射源下以20-50kR剂量照射(Zikiryaeva and Kasimov，1972)。EMS突变是把种子用0.03％，v/v的EMS进行处理(Mullins et al.，1999)。在B+D双零突变背景下，以增加了直链淀粉含量和改变了淀粉颗粒形态为基础来识别突变麦粒，并被上述方法所证实。保持了SBEIIb活性的SBEIIa突变可被再次诱变处理，并筛选出具有失去SBEIIa和SBEIIb活性的后代，或者SBEIIa突变的后代可与SBEIIb突变相交叉以联合突变并产出胚乳中相当缺乏SBEII活性的非转基因小麦品种。
实施例11SGP-1突变异种降低了SBEIIa和SBEIIb活性
来自小麦(Triticum aestivurn)的A，B和D基因组的淀粉合成酶II对分子量为100～105kDa的多肽编码，该多肽也是已知的淀粉颗粒蛋白质(SGP-1)。SSII(SGP-1)由三个大概的分子量在100，104和105kDa的多肽组成，并在染色体短臂7B，7A和7D处对应地被一组部分同源的基因编码(Denyer et al.，1995；Yamamori and Endo，1996)。Yamamori et al.(2000)通过杂交缺乏A，B和D基因组的特殊方式制得了一种SGP-1零突变(不含SGP-1)的小麦，其中的SGP-1蛋白质进行蛋白质电泳化验。SGP-1零突变种子检验表明变异的结果是改变了支链淀粉结构，提高了直链淀粉含量和变形的淀粉颗粒(Yamamori et al.，2000)。同时，对成熟麦粒的电泳试验表明，SBEII(SGP-2)和SSI(SGP-3)颗粒结合也有相当的降低。导致SGP-1为零的种系的分子基础还不清楚。
对成熟麦粒中完全缺乏SGP-1的淀粉颗粒进行试验以进一步描述小麦种系的特征。为确定SGP-1为零的小麦的每一A，B和D基因组中是否有SSII基因存在，从SGP-1为零的小麦、野生种类以及中国春小麦中提取出DNA，并进行PCR分析，所采用的引子联合体是：对B基因组采用ssIIa(5′-CCAAGTACCAGTGGTGAACGC-3′)[序列号No.29]和ssIIb(5′-CGGTGGGATCCAACGGCCC-3′)[序列号No.30]，或对A和D基因组采用ssIIa和ssIIc(5′-CATGTGAGCTAGCTTTCGCCC-3′)[序列号No.31]。放大了的区域是介于wSSIIA(基因数据库序列号AF155217)的2472-282Ibp位置之间或wSSIIB与wSSIID的相应区域。放大的区域构成了外子8的一部分，并由于其准许对A，B和D基因组产物进行清晰的界定而被选择。放大的操作条件是采用35周波在94℃下进行30秒，60℃下进行1分钟以及72℃下进行2分钟。从SGP-1为零的小麦的A，B和D基因组制得的PCR片断与从中国春小麦制得的相应片断的尺寸大小相同。异淀粉酶和SSI基因的基因片断的PCR放大，是相对于SSII位置最接近的淀粉生物合成基因并定位在SSII的每一侧(Li et al.，2002)，这表明这些基因可被SGP-1为零的小麦的每一个A，B和D基因组放大。因此，SGP-1显型并不是来自对染色体7的短臂上任何基因的缺失。
通过对SGP-1为零的生长中的种子从开花期10天之后到成熟之时进行电子显微镜扫描，发现它们明显地具有缺陷。突变品种中脱麸淀粉的链长分布显示，通过毛细管电泳测试发现短链(达到DP 8)的比率上升了而DP9-22的则下降。
SGP-1胚乳中淀粉合酶和分歧酶的表现
对SGP-1为零淀粉颗粒中淀粉合酶和分歧酶的表现进行了研究并与野生栽培植物和中国春小麦进行了比较。对种子的生长阶段不予考虑，SGP-1为零的种系中，除不存在SSII之外(图14)，颗粒的SBEII和SSI总量也急剧降低了90％～96％。采用特殊的抗体显示，中国春小麦中由颗粒获取的SBEII群组以大约1∶3的比率的SBEIIa和SBEIIb组成。在SGP-1为零的变异体中由于其总量太低而无法被同样的抗体测定出相关比例。在颗粒的早期生长过程中，GBSS I的水平也在下降。非常明确的是，在SGP-1突变体中淀粉颗粒关联的多肽水平减低了，包括SBEIIa和SBEIIb。用于产出SGP-1为零的小麦(Yamamori et al.，2000)种系的麦粒中，并不能被观测到淀粉颗粒关联的多肽(SBEII和SSI)水平的减低，说明该结果明确地就是由于缺少SSII而导致的。
对溶性相的生长中的胚乳中的淀粉合酶和分歧酶也进行了分析。SGP-1为零种系与中国春小麦中的可溶性SBEIIb的相关总量相似，但突变体的溶性相中SBEIIa的总量也降低了(图15)。然而这可能部分地归因于SGP-1为零的种系的系谱。
这些数据证实，SBEIIa活性可因SSII基因突变而多项性地降低。尽管单独的SSII突变导致淀粉中相关的直链淀粉水平低于50％，这联想到除SBEIIa之外的基因突变与SBEII突变相结合就可提高直链淀粉水平并产出改变后的淀粉。
实施例12引人注目的SBEI-多重同源异构体
通过阴离子交换树脂色谱法对小麦分歧酶进行净化，解析出了3个活性峰值(图16，Morell et al.，1997)。采用多克隆抗体、抗WBE-1，并用相对应于峰值1的蛋白质的N-封端序列的氨基酸序列对抗合成肽，从中国春小麦培育植物中萃取出胚乳，显示出4个SBEI多肽在非变性PAGE上的存在。对中国春小麦缺对染色体的四体生物的分析显示，这些多肽被染色体7所编码；免疫印迹群组被分配给A(A群)，B(B群)和D(Di和Dii群)基因组，相应的活性分别定义为A为主的，B为主的和D为主的活性。对净化后的片断进行的免疫印迹分析表征由阴离子交换色谱法得到的活性峰值，显示出第一峰值包含有SBEI以A为主的和D为主的活性，第二峰值包含SBEI以B为主的活性(图16C)。
染色体7上SBEI活性基因的位置编码是由三个具有良好特性的相关基因，wSBEI-D2、wSBEI-D3和wSBEI-D4的确定位置构成的。演绎出的SBEI为主的蛋白质序列显示，它是被这些最后的基因，wSBEI-D4所编码(Rahmanet al.，1997，Suzuki et al.，2003)。第四SBEI基因的出现被认为是基于DNA印迹交数据(Suzuki et al.，2003)。
以SBEI为主的零突变的识别
为了识别缺少至少一种SBEI同源异构体表现的零突变，在进行非变形胶体电泳之后对小麦胚质收集进行以SBEI为主的缺失的免疫印迹探测筛选。上述的抗-wSBEI抗体也被使用到。在对182种澳大利亚六倍体小麦添附物的分析中，13个种系被识别出不具有以SBEI-D为主的表现，16种缺乏以SBEI-B为主(的表现)，10种缺乏以SBEI-A为主(的表现)，另有两种(Bindawarra和Vectis)同时缺乏A和B同源异构体。这些种系被认为是相应基因组SBEI基因的零突变。以SBEI为主的基因的零突变频率(～23％)与GBSS基因的零突变频率(22％)(Boggini et al.，2001)相似。
以SBEI为主的三重零突变种系世代
从免疫印迹分析可清楚地知道培育植物Bindawarra和Vectis缺失了以A为主和以B为主的SBEI活性，同时培育植物Cadoux被识别出缺失了以D为主的活性。对从Vectis×Cadoux杂交中获得的185种系的F2后代族群进行免疫印迹筛选。然而，没有一个种系同时缺失所有三种活性，说明这些后代具有低活性或在基因组之间具有某种交互作用。因此，把缺失以B和D为主的活性的后代种系VC3.1.11同缺失以A为主的活性的染色体改造后的中国春小麦(CS7AL-15)相杂交。同时采用免疫印迹和以ARBE1CF(5′-GGGCAAACGGAATCTGATCC-3′)[序列号No.32]和ARA9R(5′-CCAGATCGTATATCGGAAGGTCG-3′)[序列号No.33]为引子的PCR分析筛选出双单倍体种系，通过在非变形性胶体种的免疫印迹判断，在160个种系中有两个种系(A113和D13)完全缺乏以SBEI为主的活性。图17表示的是典型的双单倍体种系(包括A113)的隔离模式(列6)。
对A113种系的残留SBE活性进行了检测。野生物种D28显现出两个SBEI活性峰值。相比较之下，A113提取物给出了第一个峰值而第二个峰值则完全缺失了。从含有这种活性的净化后的片断获取的氨基酸序列显示在A113中存在SBEI类型的蛋白质。然而，该片断在非变形性胶体中并不与抗-WBEI抗体发生反应。A113中的分支活性(branching activity)符合于可能是一种SBEII类型酶的～80kDa蛋白质，因为它与马铃薯SBE抗体和玉米SBEII抗体交互反应。
这些数据证实SBEI突变种系可发生于小麦中。SBEI突变与SBEIIa和选择性的SBEIIb突变的结合可产出淀粉颗粒中具有非常高直链淀粉水平的小麦物种。
实施例13染色体2A上含有SBEII基因突变的小麦种系突变体的识别
为了识别含有SBEIIa或SBEIIb基因突变的小麦种系，对2400种小麦添附物的六倍体进行了在A、B和D基因组SBEIIb零突变的筛选。对每一种系小麦物种的基因体DNA样品进行PCR反应，采用AR2b19cF/AR2b23cR作引子，接着以RsaI和胶体电泳对放大的产物进行煮解。该标记放大基因内区3区域(小麦SBjE/7基因中核苷位置2085到2336，图2)并对SBEIIb来说是特定的。前面的实施例中已经对识别三种D基因组SBEII-零突变和两种B基因组SBEII-零突变的这种筛选进行了描述。并没有检测到相对应于SBEIIb缺乏A基因组群组的突变种系。这说明含有突变SBEIIb基因的染色体2A的小麦种系并不是天然发生的。
以Tony Prior and Rohit Mago(CSIRO)方式进行的伽马射线(钴60放射源)诱导突变得到的小麦种群被用于筛选小麦SBEII的诱导突变。小麦种群是由Gabo 1BL.1RS×Veery 3杂交的F2后代得到的。从该种群中有总计2649粒突变种子通过上述采用AR2b19cF和AR2b23cR作引子的PCR反应进行了筛选。从同一物种而来的两粒种子MLT2B8和MLT2D1被识别出缺乏SBEIIbA基因组等位基因(图18)。种群中没有种子被识别出含有B或D基因组的SBEIIb零突变。
如前面的实施例所述，SBEIIa和SBEIIb基因在小麦染色体2的长臂处是紧密连环遗传连接的的。为此，采用Sr913F/E6R为引子对这些种子中的DNA进行PCR反应，以测试是否存在A基因组SBEIIa基因。这些引子放大wSBEII-D1的基因内区5区域(核苷位置2959到3189，图1[序列号No.1])。经放大后，产物经5％的测序胶(ABI Prism DNA顺序分析仪)电泳。荧光标识的产物进行软件Genescan(扫描与凝胶成像分析系统)分析。扫描的概图显示突变种子MLT2B8和MLT2D1两者的放大产物都缺乏A基因组SBEIIa基因的相应产物，这表明两个种子在基因组除SBEIIb之外，对A基因组SBEIIa来说都是无效等位基因。
这些种子的零突变进一步被A基因组SBEIIa特定标记所证实，ARIIaAF(5′-GCAAAAGCCAGATCATAAATTTAGAGC-3′)[序列号No.34]和ARIIaAR(5′-CTTCCAATTCATTGTIAATGGTCACAC-3′)[序列号No.35]仅仅放大A基因组SBEIIa基因(wSBE II-DA1的核苷位置3024到3131，图1)的产物。在这对引子放大中国春小麦品种的物种材料的110bp产物的同时，该产物明显地在这两个被公认的种子中缺乏。这与阴性控制dt2AS是同样的，dt2AS是一种缺失染色体2长臂的经染色体改造后的中国春小麦种系。由于SBEIIa和SBEIIb基因都位于染色体2的长臂，而该种系缺乏这两种A基因组等位基因，故可被用作阴性控制(图19)。
由突变种子MLT2B8和MLT2D1而来的晶胚，被确定是SBEIIa和SBEIIb的A基因组突变，被培养用于产出物种。对从这些物种获取的种子的淀粉进行直链淀粉含量、链长及其它性质分析以确定在A基因组的SBEIIa和SBEIIb二者的零突变是否会影响到淀粉的性质。
如前所述，得到五种在B和D基因组SBEIIa和SBEIIb基因同时发生突变的种系。其中，种系BD 219和BD 636在温室中培养并与A零突变种系MLT2B8和MLT2D1杂交。从这些杂交体的F1种子中产出的双单倍体被用于提供同型结合的三重零突变物种。该三重零突变物种在双单倍体种群中的出现几率是8分之1。通过同样的杂交方式可将A基因组零突变与B基因组突变或D基因组突变相结合。在进一步的杂交中，为农业或其它遗传特征，任何适合的零等位基因都可被导入任何适合的遗传本底。
下列杂交方式被用于进行在A基因组SBEIIa和SBEIIb突变的硬质小麦(如Wollaroi品种)的生产：
1)Wollaroi×MLT2B8或MLT2D1，用于在Wollaroi本底下生产A基因组SBEIIa/SBEIlb零突变硬质小麦。
2)A基因组零突变硬质小麦(Wollaroi)×B基因组零突变SBEIIa/SBEIIb小麦种系，用于生产AB双零突变SBEIIa/SBEIIb硬质小麦(Wollaroi)。或者，
1)Wollaroi×B基因组零突变小麦种系，用于生产B基因组零突变硬质小麦(Wollaroi)。
2)B基因组零突变Wollaroi×A零突变小麦种系，用于生产AB双零突变SBEIIa/SBEIIb硬质小麦。
实施例14用琼脂糖凝胶2B分离法确认麦粒中的高直链淀粉含量
包含SBEIIa/SBEIIb抑制的遗传结构的转基因小麦作物麦粒淀粉中直链淀粉的含量，可以用琼脂糖凝胶分离法来测定。在这种方法里，基于淀粉分子的重量把淀粉分子分离到亲和柱中。然后根据厂商的指示，用淀粉化验工具(Starch assay kit，Sigma)来化验这些被分离的片断。
把约10mg的淀粉溶解到3.0ml的1当量的NaOH溶液(de-gased)中，在37℃下培育30分钟。然后把该淀粉溶液离心分离15分钟，分离出未溶解的组分。接着以3ml/min的泵浦速度把上层清液抽取到琼脂糖CL2B亲和柱中。随后用10mM的NaOH作为缓冲液，运行该亲和柱，收集50个馏分，每个馏分2.5ml。用35ul 1M的HCl，把馏分9～50的PH值调到4.5。把这些抽取的样品，按250ul的整数转移到试管中，随后，往每个试管中添加250ul的淀粉试剂(Starch assay kit，Sigma)。空白试验包括：淀粉化验试剂空白，仅仅包括淀粉试剂(250ul)和水(250ul)；葡萄糖化验试剂空白，仅仅包括500ul的水；样本空白，包括仅仅250ul的淀粉样本；以及250ul的水和样本测试空白，包括250ul的淀粉试剂和250ul淀粉样本。这些样本和空白试验，在60℃环境下培育60分钟，然后把每个试管中的200ul转移到另一个新的试管，接着往这些新试管中添加1ml的葡萄糖试剂(Starch assay kit，Sigma)，然后在37℃的下培育30分钟。最后，根据化验工具提供的说明，通过在340nm下测定吸光率来测量每个馏分中的淀粉质量(mg)。
从琼脂糖亲和柱中洗提的淀粉样本，其色谱图显示出2个峰值。每个样本的直链淀粉含量(第二个峰值)，计算为在两个峰值区间内占淀粉总量的百分比。
使用这个方法，ds-SBEIIa转基因种系Acc.144087的直链淀粉含量，经计算为78％；ds-SBEIIb转基因种系Acc.144008(由结果号IIb 110.16b进行同型结合基因改性而来)的直链淀粉含量，经评估为23％(图20)。相比较之下，碘量法对这些种系测量的数值分别为88.4％和27.29％(表10)。
功能属性如凝胶温度、粘度、淀粉膨胀体积分别采用差式扫描量热法(DSC)、快速粘度测定仪(RVA)、淀粉膨胀力检测仪来分析。淀粉的结构用X-射线结晶学和微粒粒级分析法来分析。
表10：用碘量法估算的小麦转基因品种直链淀粉的含量
  品种   目标酶   结果号   直链淀粉含量(％)
  NB1   没有变性   -   31.8
  144008   SBE IIb   IIb 110.16b   27.3
  144087   SBE IIa   IIa 85.3a   88.5
  144025   SBE IIa   IIa 50.1b   75.8
  LSD   -   -   7.7
实施例15链长分布分析
在用异淀粉酶脱麸淀粉之后，用荧光辅助糖电泳法(FACE)来测定淀粉样品的链长分布。表格11中对列举的是基因改造的DP6-11，DP12-30和DP31-60种子与未经改造的控制体的链长的比较。附图21所示的是将高直链淀粉转基因种系的标准化链长分布从同基因的非转基因控制体的标准化链长分布中减除之后的摩尔差分图(Molar difference plots)。
表11：转基因小麦种系中异淀粉酶脱麸淀粉的链长分布
  品种   目标基因   事件号   DP4-12   DP13-24   DP24-36   ＞36
NB1   未经改造的控制体 - 57.39 37.38 3.83 1.40
  144087   SBEIIa   IIa 85.3a   47.40   42.27   6.16   4.17
  144025   SBEIIa   IIa 50.1b   49.99   44.40   5.60   -
144008 SBEIIb   IIb110.16b 57.98 37.65 4.37 -
由上表可以看出，相对于未突变的种子或ds-SBEIIb转基因种子，ds-SBEIIa转基因种子的淀粉DP4-12的链长比例明显降低。ds-SBEIIa转基因种子的淀粉＞DP13的链长比例高于其他品种。这些结果显示着，在小麦淀粉中SBEIIa可能被选择性地与和DP4-12相关的短链合成。但是SSIIa突变的淀粉，其中的直链淀粉中短的链长比例增加了。
实施例16转基因小麦的淀粉特性
由ds-SBEIIa和ds-SBEIIb转基因种系而得的淀粉的物理特性，包括胶凝温度，都可以用Perkin-Elmer Diamond差示扫描量热仪(DSC)来分析。每种淀粉取20mg左右，以1∶2的比例与水混合，即水份含量66.7％。把这种混合物密封到DSC盘中，以每分钟10℃的加热率加热该混合物和标准样品，并记录下0℃到150℃的数据。然后，用DSC软件分析这些数据。
在每种淀粉的DSC温谱图上都可以观测到两个吸热峰值。第一个吸热峰值，是淀粉胶凝过程中晶体结构的分解，第二个峰值是直链淀粉-脂肪的分裂吸热。Ds-SBEIIa转基因品种淀粉的胶凝峰值温度，相对于非转基因控制体淀粉，提高了大概7～10℃，相对于ds-SBEIIb转基因品种的，提高了大概3～7℃。
表格12：DSC测量的转基因小麦淀粉的热性质
Figure S04818658X19960325D000681
Figure S04818658X19960325D000691
可以观察到，与非转基因控制体和ds-SBEIIb转基因种系相比，这些种系第一峰值的结束温度有显著的提高，大概提高16～19℃。Ds-SBEIIa转基因种系第一峰值的起始温度，要比控制体或ds-SBEIIb转基因种系的低。Ng et al.，1997报告指出，高直链淀粉的玉米淀粉第一峰值的起始温度与正常的玉米淀粉的相似，但峰值温度有显著的升高。Ds-SbeIIa转基因种系淀粉的胶凝焓，与控制体和ds-SBEIIb转基因种系相比，都有显著的减少。看来，胶凝峰值(第一峰值)面积的降低，反映了ds-SBEIIa转基因种系中支链淀粉的量的减少。这些种系，在直链淀粉-脂分裂峰上没有显著的区别。以上是我们观察到的这种具有一系列新颖特性的淀粉。
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序列表
<110>联邦科技产业研究组织
生物胞芽公司
GF集团服务有限公司
<120>改变了分支酶活性的小麦和淀粉以及由此而获得的淀粉产品
<160>35
<210>1
<211>11476
<212>DNA
<213>节节麦
<223>wSBEII-D1基因
<400>1
agaaacacct ccattttaga tttttttttt gttcttttcg gacggtgggt cgtggagaga    60
ttagcgtcta gttttcttaa aagaacaggc catttaggcc ctgctttaca aaaggctcaa    120
ccagtccaaa acgtctgcta ggatcaccag ctgcaaagtt aagcgcgaga ccaccaaaac    180
aggcgcattc gaactggaca gacgctcacg caggagccca gcaccacagg cttgagcctg    240
acagcggacg tgagtgcgtg acacatgggg tcatctatgg gcgtcggagc aaggaagaga    300
gacgcacatg aacaccatga tgatgctatc aggcctgatg gagggagcaa ccatgcacct    360
tttcccctct ggaaattcat agctcacact tttttttaat ggaagcaaga gttggcaaac    420
acatgcattt tcaaacaagg aaaattaatt ctcaaaccac catgacatgc aattctcaaa    480
ccatgcaccg acgagtccat gcgaggtgga aacgaagaac tgaaaatcaa catcccagtt    540
gtcgagtcga gaagaggatg acactgaaag tatgcgtatt acgatttcat ttacatacat    600
gtacaaatac ataatgtacc ctacaatttg ttttttggag cagagtggtg tggtcttttt    660
tttttacacg aaaatgccat agctggcccg catgcgtgca gatcggatga tcggtcggag    720
acgacggaca atcagacact caccaactgc ttttgtctgg gacacaataa atgtttttgt    780
aaacaaaata aatacttata aacgagggta ctagaggccg ctaacggcat ggccaggtaa    840
acgcgctccc agccgttggt ttgcgatctc gtcctcccgc acgcagcgtc gcctccaccg    900
tccgtccgtc gctgccacct ctgctgtgcg cgcgcacgaa gggaggaaga acgaacgccg    960
cacacacact cacacacggc acactccccg tgggtcccct ttccggcttg gcgtctatct    1020
cctctccccc gcccatcccc atgcactgca ccgtacccgc cagcttccac ccccgccgca    1080
cacgttgctc ccccttctca tcgcttctca attaatatct ccatcactcg ggttccgcgc    1140
tgcatttcgg ccggcgggtt gagtgagatc tgggcgactg gctgactcaa tcactacgcg    1200
gggatggcga cgttcgcggt gtccggcgcg actctcggtg tggcgcgggc cggcgtcgga    1260
gtggcgcggg ccggctcgga gcggaggggc ggggcggact tgccgtcgct gctcctcagg    1320
aagaaggact cctctcgtac gcctcgctct ctcgaatctc ccccgtctgg ctttggctcc    1380
ccttctctct cctctgcgcg cgcatggcct gttcgatgct gttccccaat tgatctccat    1440
gagtgagaga gatagctgga ttaggcgatc gcgcttcctg aacctgtatt ttttcccccg    1500
cggggaaatg cgttagtgtc acccaggccc tggtgttacc acggctttga tcattcctcg    1560
tttcattctg atatatattt tctcattctt tttcttcctg ttcttgctgt aactgcaagt    1620
tgtggcgttt tttcactatt gtagtcatcc ttgcattttg caggcgccgt cctgagccgc    1680
gcggcctctc cagggaaggt cctggtgcct gacggcgaga gngacgactt ggcaagtccg    1740
gcgcaacctg aagaattaca ggtacacaca ctcgtgccgg taaatcttca tacaatcgtt    1800
attcacttac caaatgccgg atgaaaccaa ccacggatgc gtcaggtttc gagcttcttc    1860
tatcagcatt gtgcagtact gcactgcctt gttcattttg ttagccttgg ccccgtgctg    1920
gctcttgggc cactgaaaaa atcagatgga tgtgcattct agcaagaact tcacaacata    1980
atgcaccgtt tggggtttcg tcagtctgct ctacaattgc tatttttcgt gctgtagata    2040
cctgaagata tcgaggagca aacggcggaa gtgaacatga caggggggac tgcagagaaa    2100
cttcaatctt cagaaccgac tcagggcatt gtggaaacaa tcactgatgg tgtaaccaaa    2160
ggagttaagg aactagtcgt gggggagaaa ccgcgagttg tcccaaaacc aggagatggg    2220
cagaaaatat acgagattga cccaacactg aaagattttc ggagccatct tgactaccgg    2280
taatgcctac ccgctgcttt cgctcatttt gaattaaggt cctttcatca tgcaaatttg    2340
gggaacatca aagagacaaa gactagggac caccatttca tacagatccc ttcgtggtct    2400
gagaatatgc tgggaagtaa atgtataatt gatggctaca atttgctcaa aattgcaata    2460
cgaataactg tctccgatca ttacaattaa agagtggcaa actgatgaaa atgtggtgga    2520
tgggttatag attttacttt gctaattcct ctaccaaatt cctagggggg aaatctacca    2580
gttgggaaac ttagtttctt atctttgtgg cctttttgtt ttggggaaaa cacattgcta    2640
aattcgaatg attttgggta tacctcggtg gattcaacag atacagcgaa tacaagagaa    2700
ttcgtgctgc tattgaccaa catgaaggtg gattggaagc attttctcgt ggttatgaaa    2760
agcttggatt tacccgcagg taaatttaaa gctttattat tatgaaacgc ctccactagt    2820
ctaattgcat atcttataag aaaatttata attcctgttt tcccctctct tttttccagt    2880
gctgaaggta tcgtctaatt gcatatctta taagaaaatt tatattcctg ttttccccta    2940
ttttccagtg ctgaaggtat cacttaccga gaatgggctc cctggagcgc atgttatgtt    3000
cttttaagtt ccttaacgag acaccttcca atttattgtt aatggtcact attcaccaac    3060
tagcttactg gacttacaaa ttagcttact gaatactgac cagttactat aaatttatga    3120
tctggctttt gcaccctgtt acagtctgca gcattagtag gtgacttcaa caattggaat    3180
ccaaatgcag atactatgac cagagtatgt ctacagcttg gcaattttcc acctttgctt    3240
cataactact gatacatcta tttgtattta tttagctgtt tgcacattcc ttaaagttga    3300
gcctcaacta catcatatca aaatggtata atttgtcagt gtcttaagct tcagcccaaa    3360
gattctactg aatttagtcc atctttttga gattgaaaat gagtatatta aggatgaatg    3420
aatacgtgca acactcccat ctgcattatg tgtgcttttc catctacaat gagcatattt    3480
ccatgctatc agtgaaggtt tgctcctatt gatgcagata tttgatatgg tcttttcagg    3540
atgattatgg tgtttgggag attttcctcc ctaacaacgc tgatggatcc tcagctattc    3600
ctcatggctc acgtgtaaag gtaagctggc caattattta gtcgaggatg tagcattttc    3660
gaactctgcc tactaagggt cccttttcct ctctgttttt tagatacgga tggatactcc    3720
atccggtgtg aaggattcaa tttctgcttg gatcaagttc tctgtgcagg ctccaggtga    3780
aatacctttc aatggcatat attatgatcc acctgaagag gtaagtatcg atctacatta    3840
cattattaaa tgaaatttcc agtgttacag ttttttaata cccacttctt actgacatgt    3900
gagtcaagac aatacttttg aatttggaag tgacatatgc attaattcac cttctaaggg    3960
ctaaggggca accaaccttg gtgatgtgtg tatgcttgtg tgtgacataa gatcttatag    4020
ctcttttatg tgttctctgt tggttaggat attccatttt ggccttttgt gaccatttac    4080
taaggatatt tacatgcaaa tgcaggagaa gtatgtcttc caacatctca actaaacgac    4140
cagagtcact aaggatttat gaatcacaca ttggaatgag cagcccggta tgtcaataag    4200
ttatttcacc tgtttctggt ctgatggttt attctatgga ttttctagtt ctgttatgta    4260
ctgttaacat attacatggt gcattcactt gacaacctcg attttatttt ctaatgtctt    4320
catattggca agtgcaaaac tttgcttcct ctttgtctgc ttgttctttt gtcttctgta    4380
agatttccat tgcatttgga ggcagtgggc atgtgaaagt catatctatt ttttttttgt    4440
cagagcatag ttatatgaat tccattgttg ttgcaatagc tcggtataat gtaaccatgt    4500
tactagctta agatttccca cttaggatgt aagaaatatt gcattggagc gtctccagca    4560
agccatttcc taccttatta atgagagaga gacaaggggg gggggggggg gggggttccc    4620
ttcattattc tgcgagcgat tcaaaaactt ccattgttct gaggtgtacg tactgcaggg    4680
atctcccatt atgaagagga tatagttaat tctttgtaac ctacttggaa acttgagtct    4740
tgaggcatcg ctaatatata ctatcatcac aatacttaga ggatgcatct gaanatttta    4800
gtgtgatctt gcacaggaac cgaagataaa ttcatatgct aattttaggg atgaggtgtt    4860
gccaagaatt aaaaggcttg gatacaatgc agtgcagata atggcaatcc aggagcattc    4920
atactatgca agctttgggt attcacacaa tccatttttt tctgtataca cntcttcacc    4980
catttggagc tattacatcc taatgcttca tgcacataaa atatttggat ataatccttt    5040
attagatata tagtacaact acacttagta ttctgannaa naagatcatt ttattgttgt    5100
tggcttgttc caggtaccat gttactaatt tttttgcacc aagtagccgt tttggaactc    5160
cagaggactt aaaatccttg atcgatagag cacatgagct tggtttgctt gttcttatgg    5220
atattgttca taggtaatta gtccaattta attttagctg ttttactgtt tatctggtat    5280
tctaaaggga aattcaggca attatgatac attgtcaaaa gctaagagtg gcgaaagtga    5340
aatgtcaaaa tctagagtgg cataaggaaa attggcaaaa actagagtgg caaaaataaa    5400
attttcccat cctaaatggc agggccctat cgccgaatat ttttccattc tatataattg    5460
tgctacgtga cttctttttt ctcagatgta ttaaaccagt tggacatgaa atgtatttgg    5520
tacatgtagt aaactgacag ttccatagaa tatcgttttg taatggcaac acaatttgat    5580
gccatagatg tggattgaga agttcagatg ctatcaatag aattaatcaa ctggccatgt    5640
actcgtggca ctacatatag tttgcaagtt ggaaaactga cagcaatacc tcactgataa    5700
gtggccaggc cccacttgcc agcttcatac tagatgttac ttccctgttg aattcatttg    5760
aacatattac ttaaagttct tcatttgtcc taagtcaaac ttctttaagt ttgaccaagt    5820
ctattggaaa atatatcaac atctacaaca ccaaattact ttgatcagat taacaatttt    5880
tattttatta tattagcaca tctttgatgt tgtagatatc agcacatttt tctatagact    5940
tggtcaaata tagagaagtt tgacttagga caaatctaga acttcaatca atttggatca    6000
gagggaacat caaataatat agatagatgt caacacttca acaaaaaaat cagaccttgt    6060
caccatatat gcatcagacc atctgtttgc tttagccact tgctttcata tttatgtgtt    6120
tgtacctaat ctacttttcc ttctacttgg tttggttgat tctatttcag ttgcattgct    6180
tcatcaatga ttttgtgtac cctgcagtca ttcgtcaaat aatacccttg acggtttgaa    6240
tggtttcgat ggcactgata cacattactt ccacggtggt ccacgcggcc atcattggat    6300
gtgggattct cgtctattca actatgggag ttgggaagta tgtagctctg acttctgtca    6360
ccatatttgg ctaactgttc ctgttaatct gttcttacac atgttgatat tctattctta    6420
tgcaggtatt gagattctta ctgtcaaacg cgagatggtg gcttgaagaa tataagtttg    6480
atggatttcg atttgatggg gtgacctcca tgatgtatac tcaccatgga ttacaagtaa    6540
gtcatcaagt ggtttcagta acttttttag ggcactgaaa caattgctat gcatcataac    6600
atgtatcatg atcaggactt gtgctacgga gtcttagata gttccctagt atgcttgtac    6660
aattttacct gatgagatca tggaagattg gaagtgatta ttatttattt tctttctaag    6720
tttgtttctt gttctagatg acatttactg ggaactatgg cgaatatttt ggatttgcta    6780
ctgatgttga tgcggtagtt tacttgatgc tggtcaacga tctaattcat ggactttatc    6840
ctgatgctgt atccattggt gaagatgtaa gtgcttacag tatttatgat ttttaactag    6900
ttaagtagtt ttattttggg gatcagtctg ttacactttt tgttaggggt aaaatctctc    6960
ttttcataac aatgctaatt tataccttgt atgataatgc atcacttang taatttgaaa    7020
agtgcaaggg cattcaagct tacgagcata ttttttgatg gctgtaattt atttgatagt    7080
atgcttgttt gggtttttca ataagtggga gtgtgtgact aatgttgtat tatttattta    7140
attgcggaag aaatgggcaa ccttgtcaat tgcttcagaa ggctaacttt gattccataa    7200
acgctttgga aatgagaggc tattcccaag gacatgaatt atacttcagt gtgttctgta    7260
catgtatttg taatagtggt ttaacttaaa ttcctgcact gctatggaat ctcactgtat    7320
gttgtnagtg tacacatcca caaacaagta atcctgagct ttcaactcat gagaaaatan    7380
gangtccgct tctgccagca ttaactgttc acagttctaa tttgtgtaac tgtgaaattg    7440
ttcaggtcag tggaatgcct acattttgca tccctgttcc agatggtggt gttggttttg    7500
actaccgcct gcatatggct gtagcagata aatggattga actcctcaag  taagtgcagg    7560
aatattggtg attacatgcg cacaatgatc tagattacat tttctaaatg gtaaaaagga    7620
aaatatgtat gtgaatatct agacatttgc ctgttatcag cttgaatacg agaagtcaaa    7680
tacatgattt aaatagcaaa tctcggaaat gtaatggcta gtgtctttat gctgggcagt    7740
gtacattgcg ctgtagcagg ccagtcaaca cagttagcaa tattttcaga aacaatatta    7800
tttatatccg tatatganga aagttagtat ataaactgtg gtcattaatt gtgttcacct    7860
tttgtcctgt ttaaggatgg gcagtaggta ataaatttag ccagataaaa taaatcgtta    7920
ttaggtttac aaaaggaata tacagggtca tgtagcatat ctagttgtaa ttaatgaaaa    7980
ggctgacaaa aggctcggta aaaaaaactt tatgatgatc cagatagata tgcaggaacg    8040
cgactaaagc tcaaatactt attgctacta cacagctgcc aatctgtcat gatctgtgtt    8100
ctgctttgtg ctatttagat ttaaatacta actcgataca ttggcaataa taaacttaac    8160
tattcaacca atttggtgga taccaganat ttctgccctc ttgttagtaa tgatgtgctc    8220
cctgctgctg ttctctgccg ttacaaaagc tgttttcagt tttttgcatc attatttttg    8280
tgtgtgagta gtttaagcat gttttttgaa gctgtgagct gttggtactt aatacattct    8340
tggaagtgtc caaatatgct gcagtgtaat ttagcatttc tttaacacag gcaaagtgac    8400
gaatcttgga aaatgggcga tattgtgcac accctaacaa atagaaggtg gcttgagaag    8460
tgtgtaactt atgcagaaag tcatgatcaa gcactagttg gtgacaagac tattgcattc    8520
tggttgatgg ataaggtact agctgttact tttggacaaa agaattactc cctcccgttc    8580
ctaaatataa gtctttgtag agattccact atggaccaca tagtatatag atgcatttta    8640
gagtgtagat tcactcattt tgcttcgtat gtagtccata gtgaaatctc tacagagact    8700
tatatttagg aacggaggga gtacataatt gatttgtctc atcagattgc tagtgttttc    8760
ttgtgataaa gattggctgc ctcacccatc accagctatt tcccaactgt tacttgagca    8820
gaatttgctg aaaacgtacc atgtggtact gtggcggctt gtgaactttg acagttatgt    8880
tgcaattttc tgttcttatt tatttgattg cttatgttac cgttcatttg ctcattcctt    8940
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ttttattaat aggctaaaat ccaacgaatt atttgcttga atttaaatat acagacgtat    9060
agtcacctgg ctctttctta gatgattacc atagtgcctg aaggctgaaa tagttttggt    9120
gtttcttgga tgccgcctaa aggagtgatt tttattggat agattcctgg ccgagtcttc    9180
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aaggctatct taacttcatg ggaaatgagt ttgggcatcc tggtcagtct ttacaacatt    9720
attgcattct gcatgattgt gatttactgt aatttgaacc atgcttttct ttcacattgt    9780
atgtattatg taatctgttg cttccaagga ggaagttaac ttctatttac ttggcagaat    9840
ggatagattt tccaagaggc ccacaaactc ttccaaccgg caaagttctc ccctggaaat    9900
aacaatagtt atgataaatg ccgccgtaga tttgatcttg taagttttag ctgtgctatt    9960
acattccctc actagatctt tattggccat ttatttcttg atgaaatcat aatgtttgtt    10020
aggaaagatc aacattgctt ttgtagtttt gtagacgtta acataagtat gtgttgagag    10080
ttgttgatca ttaaaaatat catgattttt tgcagggaga tgcagatttt cttagatatc    10140
gtggtatgca agagttcgat caggcaatgc agcatcttga ggaaaaatat ggggtatgtc    10200
actggtttgt ctttgttgca taacaagtca cagtttaacg tcagtctctt caagtggtaa    10260
aaaaagtgta gaattaattc ctgtaatgag atgaaaactg tgcaaaggcg gagctggaat    10320
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ccttttcatt gtccaccctt caccagtagg gttagtgggg gcttctacaa cttttaattc    10620
cacatggata gagtttgttg gtcgtgcagc tatcaatata aagaataggg taatttgtaa    10680
agaaaagaat ttgctcgagc tgttgtagcc ataggaaggt tgttcttaac agccccgaag    10740
cacataccat tcattcatat tatctactta agtgtttgtt tcaatcttta tgctcagttg    10800
gactcggtct aatactagaa ctattttccg aatctaccct aaccatccta gcagttttag    10860
agcagcccca tttggacaat tggctgggtt tttgttagtt gtgacagttt ctgctatttc    10920
ttaatcaggt ggccttggac tctgacgatg cactctttgg tggattcagc aggcttgatc    10980
atgatgtcga ctacttcaca accgtaagtc tgggctcaag cgtcacttga ctcgtcttga    11040
ctcaactgct tacaaatctg aatcaacttc ccaattgctg atgcccttgc aggaacatcc    11100
gcatgacaac aggccgcgct ctttctcggt gtacactccg agcagaactg cggtcgtgta    11160
tgcccttaca gagtaagaac cagcagcggc ttgttacaag gcaaagagag aactccagag    11220
agctcgtgga tcgtgagcga agcgacgggc aacggcgcga ggctgctcca agcgccatga    11280
ctgggagggg atcgtgcctc ttccccagat gccaggagga gcagatggat aggtagcttg    11340
ttggtgagcg ctcgaaagaa aatggacggg cctgggtgtt tgttgtgctg cactgaaccc    11400
tcctcctatc ttgcacattc ccggttgttt ttgtacatat aactaataat tgcccgtgcg    11460
ctcaacgtga aaatcc                                                    11476
<210>2
<211>6520
<212>DNA
<213>普通小麦
<223>局部wSBEIIb基因
<400>2
aagctttgta gccttgcacg ggctccccaa caaactgcct cactcgattg tcaaaaaagt    60
aaaaatgatt gtagaaaaaa aaactgactc actcgtcact accctaccgt cctacatgac    120
acctggccgc aagacgacgc cgtcctcctg ccgcgcgcgt ccgcgatcac accaccgcaa    180
aaaccaaaac ctcttcgccg gtgcgtccca cgctaccatc catgcagccg tccgcccgcg    240
cgcgcgttgc ccgcaccacc cgctggcggc caccacgccg ccactctcgc gtgaaggctc    300
cgtccgcttc ctcctagttc cactctctct ccgtgctagc agtatatagc atccgccctc    360
cgccccctcc caatcttaga  acacccctc cctttgcctc ctcatttcgc tcgcgtgggtt   420
taagcaggag acgaggcggg gtcagttggg cagttaggtt ggatccgatc cggctgcggc    480
ggcggcgacg ggatggctgc gccggcattc gcagtttccg cggcggggct ggcccggccg    540
tcggctcctc gatccggcgg ggcagagcgg agggggcgcg gggtggagct gcagtcgcca    600
tcgctgctct tcggccgcaa caagggcacc cgttcacccc gtaattattt gcgccacctt    660
tctcactcac attctctcgt gtattctgtc gtgctcgccc ttcgccgacg acgcgtgccg    720
attccgtatc gggctgcggt gttcagcgat cttacgtcgg ttccctcctg gtgtggtgat    780
gtctgtaggt gccgtcggcg tcggaggttc tggatggcgc gtggtcatgc gcgcgggggg    840
gccgtccggg gaggtgatga tccctgacgg cggtagtggc ggaacaccgc cttccatcga    900
cggtcccgtt cagttcgatt ctgatgatct gaaggtagtt ttttttttgc atcgatctga    960
aggtacttga catatactac tgtattaccc tgagtaaata ctgccaccat atttttatgg    1020
ttcgcttgaa atacctgttt acttgctacg gttttcactt tcattgagac gtcggacgaa    1080
attcactgaa ttcctataat ttggtagaca ccgaaatata tactactcct tccgtcccat    1140
aatataagag cgtttttggc accttatatt atagggcgga gggagtacct tttaggtcaa    1200
aatattgtgg tagtttcaat tgtatacaag aattcaaata ttttttttaa aaaaaaatca    1260
actaattggt tgagtttcaa gtgaagcgtt ttggtccttt ggctgagatg taaaccgaaa    1320
tcactgaaat tcatagtagc cgaaacttta atagaactga aactcaaaat ctgctatccg    1380
gcgaaattct aaagatttgc ttatttcaca cgtaggttgc agtacaccct ctttctaatt    1440
tattggggaa ggggtattat tatcttgtta gtacctgcct gcatgacaat tgaaatctaa    1500
gacaaaacac catatgcgag gcctacacac ggtaggttgg tttacaacta tgtgtgccac    1560
agttcgtctg aactttttgt ccttcacatc gtgttaggtt ccattcattg atgatgaaac    1620
aagcctacag gatggaggtg aagatagtat ttggtcttca gagacaaatc aggttagtga    1680
agaaattgat gctgaagaca cgagcagaat ggacaaagaa tcatctacga gggagaaatt    1740
acgcattctg ccaccaccgg gaaatggaca gcaaatatac gagattgacc caacgctccg    1800
agactttaag taccatcttg agtatcggta tgcttcgctt ctattgtgtg cactttaaaa    1860
acaatttaca gtctttgata agatgtgaat ggctgcttgc tgtgacacga aactcttgaa    1920
gttcgtagtc actcttgtgt gttcatggtt ctgaggtaac atggtaaccg aacaaaaata    1980
ggaaagtggc aagcactgca atgtgagcta ctgataacca cccattgtaa ttgggtacac    2040
tgattaatat atatgtcttc atgggctcta ttttttttca atatctatgc caattgaaca    2100
acaatgcttt gtggacgggt gttcttttac cctcttcttc tatcaataga tgatatgcat    2160
actcatgcgt atcctacaaa aaattgaaca acaatgccac tttcccccgt gttgcttttg    2220
taaggatgaa acacatatgt ccagatcaaa ctatactagc agtctaactg tgccttaatg    2280
gatcaaaaac agatatagcc tatacaggag aatacgttca gacattgatg aacacgaagg    2340
aggcatggat gtattttccc gcggttacga gaagtttgga tttatgcgca ggtgaaattt    2400
cttgactaaa taactatgta tctacctttt ctttgtactc tatcaacatt cctcttccca    2460
tgcagcgctg aaggtatcac ttaccgagaa tgggctcctg gagcagatgt acgttcttct    2520
aaccatctga tcgtttacct gactatacta attctatctt tcaactaatt gtgaataatt    2580
actgctcatc agctatccta aggttgggga ttttgcacct cccagatgaa cagcatatta    2640
agtcgcacaa ctagcattat taagaactaa ctcctgcttc caattgcagt ctgcagcatt    2700
agttggcgac ttcaacaatt gggatccaaa tgcagaccat atgagcaaag tatgcatgta    2760
gtttcacaaa tatatcatat tttctttgta gatttttttt tttagatcgg cttatctatt    2820
acgttgagct gtaaatatag ttggaagtgt ttaggagtat taaattcact ggactctatt    2880
ctttcacttg cctgttgcac gagcccatta ctagatatca atgttgatga tgcttttgtt    2940
gtatgaggtc gaagtgaaac atgcatgtta cccttttata taagtaaggt tgcacatgta    3000
ttttttatga tctaaacatt atttactgat tttgttcttg caagacacta agcagtttta    3060
cataataatg gcgttggagc aggccgactg cacatctgaa ctgtagctcc atgtggttga    3120
tatagattac aaatgctcat attcaatgta actgttttca gaatgacctt ggtgtttggg    3180
agatttttct gccaaacaat gcagatggtt cgccaccaat tcctcacggc tcacgggtga    3240
aggttgtttt cttctccttg ccaacggtgt taggctcagg aacatgtcct gtattactca    3300
gaagctcttt tgaacatcta ggtgagaatg gatactccat ctgggataaa ggattcaatt    3360
cctgcttgga tcaagtactc cgtgcagact ccaggagata taccatacaa tggaatatat    3420
tatgatcctc ccgaagaggt attttacttc atcttctgtg cttttagatt tcagatattt    3480
ttattagaag aaaattatga ttttttccct cacgaacctt cccaattgct atttcaagct    3540
gtcctactta tttgctgctg gcatcttatt tttctattct ctaaccagtt atgaaattcc    3600
ttacatgcat atgcaggaga agtatgtatt caagcatcct caacctaaac gaccaaaatc    3660
attgcggata tatgaaacac atgttggcat gagtagcccg gtatttcatc tttaccatgt    3720
attccataaa tgaagttagc tatatgcagt tcaaatttat ttacaggttg ttacaatggt    3780
atttttgtgt tggtgccctt ctttcgtttt ataagtaaaa aacttatcat aaatttattt    3840
gttatgccgc ttggttaata caatctgaaa aatgtaactg tggacaatct agaactagat    3900
aatacaaatc tgaaaaaaca tgctggaata gtgtcatttc agtcaactag gatgttttga    3960
atgctcaaga gaagtactag tgtgtagcat caaaagctgg tgtccatttg ttcaaatgtt    4020
taattaacac tatagtgaaa acaagtaatt gcacaaagaa acaagtaatt gcccaagttc    4080
atatgttttt tcactatatt acatgtttca tcaacaattt aattaacctc attccttaca    4140
aacatttgta tttacatttg ttcctacata tatagttatt ttatatatca actttataaa    4200
tcatgactgt tataattaaa accgatggta tatcaacgat tgagataatt tggcatatgt    4260
ggatgaattt tgtggcttgt tatgctcttg ttttaataac ataataaata gattatgctt    4320
gttggtagcc tttttacatt aacacatggg caattacttg tttctttgtg caaccaggaa    4380
ccaaagatcg acacatatgc aaacttcagg gatgaggtgc ttccaagaat taaaagactt    4440
ggatacaatg cagtgcaaat aatggcaatc caagagcact catactatgg aagctttggg    4500
tagttctctg ggtcgatttc tggttctttt agttatcttt tgtccataga acatatttca    4560
actttagcaa ctatactatt atattaactt ttcagctatt gtcttncttt ttcttatgtg    4620
agagactgct gcntcttgct acttcctgtg ttctcattca gagtanacat cttatganta    4680
gacaactcta tgtngacatt ccggaagtat ncactggctg attcggtcta aaataacata    4740
ctgctcagat agccacataa cagtacgatt acacacataa tgaccatgtt tgcatagagt    4800
ggcggtagta tgttcctcac catactagca taatgacttg ttatataaga gtatatcata    4860
ttaacttctt ttccaatgac atggaagctg taacaacttt caaatcattt ttgtctttta    4920
agtgctgctt ttttcctgtt tgacaattaa tacaatacca cttttatgtg tttttacttc    4980
tattgcaggt accatgttac caatttcttt gcaccaagta gccgttttgg gtccccagaa    5040
gatttaaaat ctttgattga tagagctcac gagcttggct tggttgtcct catggatgtt    5100
gttcacaggt acttaatgta atttgaggtt ggcgtgttaa gttcacatta atcttaattc    5160
tttatttcaa ttcctatggc ctctctccta gattggaaca gtaaaagcat catccagttt    5220
gtataaattg ctaaaagaac attttacatg ttaagtattt tcaattacta tgaaacatat    5280
aaatttacat acttattgat tttacgacag aagtaccgat ctcacaagat gaacaattgg    5340
ttgatcacat atcatttcat actacaatac aagaaaatga atagagaacg agttaatatt    5400
agccttggta aaatcagcaa cttgtttgga aataaagtat agtgatgcca gtgcaaanaa    5460
caaggcatca agttggtttc agctcccacg gtcggtgcta gctgtcaagg gtaatttgca    5520
cgtagtcgca catagatttg tgtgggagtg gaaagtaacc acagattgtc cgaggaacac    5580
gggacacacg tcttagccac aggtttgggc tccccttgat gcgggtagta gctttactcc    5640
ttatatgaaa ttatctcaag atagatttca atttggggtt acacttanga actcancaag    5700
ttaaggatca actcnctgag ttctatacga ctgatctttg accgagatat cttgatcagg    5760
ctaagtanca aaatccaggc cttgagatgt tgaacatgtc cttcattttg ggctgggtgc    5820
ccttgggcat aaggtgtngt ccttccttca tgtgcttctt gcagcgtatg acataaacnt    5880
cctctgagtt ggtanatgca cggttccctt tgaggaaatc aggggtagtc gcatctnggg    5940
aaagttggtc acccangcat ggatcctcng cgcacaccgg gcaaacacgg tgaaaccact    6000
tctcctcgac actagctaac ttgacattca agcaaactaa gaatataact ttatntctaa    6060
atgaaccgga caccctcctt gtgcctgcac ctacagagta caatgccagt tttggactga    6120
actcttgtgt tcatgtatgt gctaatnaca taggttctaa ccatgattct aaatagcgcg    6180
ttataactcc actatagtaa tgctatagcg tttanaagat cccgcactaa gggaccttag    6240
tccaaataca tgatcaaaca ttttacatag cgcgctatag ctatttaaaa ctatggtcac    6300
ccgctaagag gcataactcg ctatttaaaa ctatggttct aacttttaat ctattttatg    6360
tcttggtcca aagccccttt ttgttctata gctttacctt tgggttgaga tcacccttaa    6420
cccattggta atcctggttg atttactcca tcctttcttg cgtagcttta cttttggttt    6480
tttgtttctc acagtcacgc gtcaaataat accttggacg                          6520
<210>3
<211>420
<212>DNA
<213>普通小麦
<223>来自A和B基因组的局部wSBEIIa基因
<400>3
y11282
cgccagcttc cacccccgcc gcacacgttg ctcccccttc tcatcgcttc tcaattaata    60
tctccatcac tcgggttccg cgctgcattt cggccggcgg gttgagtgag atctgggcca    120
ctgaccgact cactcgctcg ctgcgcgggg atggcgacgt tcgcggtgtc cggcgcgacc    180
ctcggtgtgg cgcggcccgc cggcgccggc ggcggactgc tgccgcgatc cggctcggag    240
cggaggggcg gggtggacct gccgtcgctg ctcctcagga agaaggactc ctctcgcgcc    320
gtcctgagcc gcgcggcctc tccagggaag gtcctggtgc ctgacggtga gagcgacgac    380
ttggcaagtc cggcgcaacc tgaagaatta cagatacctg                          420
<210>4
<211>419
<212>DNA
<213>普通小麦
<223>来自A和B基因组的局部wSBEIIa基因
<400>4
sr997
gccactgacc gactcactcg ctcgctgcgc ggggatggcg acgtttgcgg tgtccggcgc    60
gaccctcggt gtggcgcggc ccgccggcgc cggcggcgga ctgctgccgc gatccggctc    120
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cgccgtcctg agccgcgcgg cctctccagg gaaggtcctg gtgcctgacg gtgagagcga    240
cgacttggca agtccggcgc aacctgaaga attacagat                           419
<210>5
<211>413
<212>DNA
<213>普通小麦
<223>来自D基因组的局部wSBEIIa基因
<400>5
sr995
ggcgggttga gtgagatctg ggcgactggc tgactcaatc actacgcggg gatggcgacg    60
ttcgcggtgt ccggcgcgac tctcggtgtg gcgcgggccg gcgtcggagt ggcgcgggcc    120
ggctcggagc ggaggggcgg ggcggacttg ccgtcgctgc tcctcaggaa gaaggactcc    180
tctcgcgccg tcctgagccg cgcggcctct ccagggaagg tcctggtgcc tgacggcgag    240
agcgacgact tgcaagtccg gcgcaacctg aag                                 413
<210>6
<211>408
<212>DNA
<213>普通小麦
<223>来自A和B基因组的局部wSBEIIa基因
<400>6
sbe9
acgttgctcc cccttctcat cgcttctcaa ttaatatctc catcactcgg ttccgcgctg    60
catttcggcc ggcgggttga gtgagatctg ggccactgac cgactcactc gctcgctgcg    120
gggatggcga cgttcgcggt gtccggcgcg accctcggtg tggcgcggcc gccggcggcg    180
gcgcaacctg aagaattaca gatacctg                                       408
<210>7
<211>818
<212>PRT
<213>普通小麦
<223>来自A和B基因组的局部wSBEIIa蛋白
<400>7
sr854
Met Ala Thr Phe Ala Val Ser Gly Ala Thr Leu Gly Val Ala Arg
1               5                   10                  15
Ala Gly Val Gly Val Ala Arg Ala Gly Ser Glu Arg Arg Gly Gly
                20                  25                  30
Ala Asp Leu Pro Ser Leu Leu Leu Arg Lys Lys Asp Ser Ser Arg
                35                  40                  45
Ala Val Leu Ser Arg Ala Ala Ser Pro Gly Lys Val Leu Val Pro
                50                  55                  60
Asp Gly Glu Ser Asp Asp Leu Ala Ser Pro Ala Gln Pro Glu Glu
                65                  70                  75
Leu Gln Ile Pro Glu Asp Ile Glu Glu Gln Thr Ala Glu Val Asn
                80                  85                  90
Met Thr Gly Gly Thr Ala Glu Lys Leu Gln Ser Ser Glu Pro Thr
                95                  100                 105
Gln Gly Ile Val Glu Thr Ile Thr Asp Gly Val Thr Lys Gly Val
                110                 115                 120
Lys Glu Leu Val Val Gly Glu Lys Pro Arg Val Val Pro Lys Pro
                125                 130                 135
Gly Asp Gly Gln Lys Ile Tyr Glu Ile Asp Pro Thr Leu Lys Asp
                140                 145                 150
Phe Arg Ser His Leu Asp Tyr Arg Tyr Ser Glu Tyr Lys Arg Ile
                155                 160                 160
Arg Ala Ala Ile Asp Gln His Glu Gly Gly Leu Glu Ala Phe Ser
                165                 170                 175
Arg Gly Tyr Glu Lys Leu Gly Phe Thr Arg Ser Ala Glu Gly Ile
                180                 185                 190
Thr Tyr Arg Glu Trp Ala Pro Gly Ala His Ser Ala Ala Leu Val
                195                 200                 205
Gly Asp Phe Asn Asn Trp Asn Pro Asn Ala Asp Thr Met Thr Arg
                210                 215                 220
Asp Asp Tyr Gly Val Trp Glu Ile Phe Leu Pro Asn Asn Ala Asp
                225                 230                 230
Gly Ser Ser Ala Ile Pro His Gly Ser Arg Val Lys Ile Arg Met
                235                 240                 245
Asp Thr Pro Ser Gly Val Lys Asp Ser Ile Ser Ala Trp Ile Lys
                250                 255                 260
Phe Ser Val Gln Ala Pro Gly Glu Ile Pro Phe Asn Gly Ile Tyr
                265                 270                 275
Tyr Asp Pro Pro Glu Glu Lys Tyr Val Phe Gln His Pro Gln Arg
                280                 285                 290
Lys Arg Pro Glu Ser Leu Arg Ile Tyr Glu Ser His Ile Gly Met
                295                 300                 305
Ser Ser Pro Glu Pro Lys Ile Asn Ser Tyr Ala Asn Phe Arg Asp
                310                 315                 320
Glu Val Leu Pro Arg Ile Lys Arg Leu Gly Tyr Asn Ala Val Gln
                325                 330                 335
Ile Met Ala Ile Gln Glu His Ser Tyr Tyr Ala Ser Phe Gly Tyr
                340                 345                 350
His Val Thr Asn Phe Phe Ala Pro Ser Ser Arg Phe Gly Thr Pro
                355                 360                 365
Glu Asp Leu Lys Ser Leu Ile Asp Arg Ala His Glu Leu Gly Leu
                370                 375                 380
Leu Val Leu Met Asp Ile Val His Ser His Ser Ser Asn Asn Thr
                385                 390                 395
Leu Asp Gly Leu Asn Gly Phe Asp Gly Thr Asp Thr His Tyr Phe
                400                 405                 410
His Gly Gly Pro Arg Gly His His Trp Met Trp Asp Ser Arg Leu
                415                 420                 425
Phe Asn Tyr Gly Ser Trp Glu Val Leu Arg Phe Leu Leu Ser Asn
                430                 435                 440
Ala Arg Trp Trp Leu Glu Glu Tyr Lys Phe Asp Gly Phe Arg Phe
                445                 450                 455
Asp Gly Val Thr Ser Met Met Tyr Thr His His Gly Leu Gln Met
                460                 465                 470
Thr Phe Thr Gly Asn Tyr Gly Glu Tyr Phe Gly Phe Ala Thr Asp
                475                 480                 485
Val Asp Ala Val Val Tyr Leu Met Leu Val Asn Asp Leu Ile His
                490                 495                 500
Gly Leu Tyr Pro Asp Ala Val Ser Ile Gly Glu Asp Val Ser Gly
                505                 510                 515
Met Pro Thr Phe Cys Ile Pro Val Pro Asp Gly Gly Val Gly Phe
                520                 525                 530
Asp Tyr Arg Leu His Met Ala Val Ala Asp Lys TrpIle Glu Leu
                535                 540                 545
Leu Lys Gln Ser Asp Glu Ser Trp Lys Met Gly Asp Ile Val His
                550                 555                 560
Thr Leu Thr Asn Arg Arg Trp Leu Glu Lys Cys Val Thr Tyr Ala
                565                 570                 575
Glu Ser His Asp Gln Ala Leu Val Gly Asp Lys Thr Ile Ala Phe
                580                 585                 590
Trp Leu Met Asp Lys Asp Met Tyr Asp Phe Met Ala Leu Asp Arg
                595                 600                 605
Pro Ser Thr Leu Arg Ile Asp Arg Gly Ile Ala Leu His Lys Met
                610                 615                 620
Ile Arg Leu Val Thr Met Gly Leu Gly Gly Glu Gly Tyr Leu Asn
                625                 630                 635
Phe Met Gly Asn Glu Phe Gly His Pro Glu Trp Ile Asp Phe Pro
                640                 645                 650
Arg Gly Pro Gln Thr Leu Pro Thr Gly Lys Val Leu Pro Gly Asn
                655                 670                 675
Asn Asn Ser Tyr Asp Lys Cys Arg Arg Arg Phe Asp Leu Val Asn
                680                 685                 690
Ala Asp Phe Leu Arg Tyr Arg Gly Met Gln Glu Phe Asp Gln Ala
                695                 700                 705
Met Gln His Leu Glu Glu Lys Tyr Gly Phe Met Thr Ser Glu His
                710                 715                 720
Gln Tyr Val Ser Arg Lys His Glu Glu Asp Lys Val  IleIle Leu
                725                 730                 735
Lys Arg Gly Asp Leu Val Phe Val Phe Asn Phe His Trp Ser Asn
                740                 745                 750
Ser Phe Phe Asp Tyr Arg Val Gly Cys Ser Lys Pro Gly Lys Tyr
                755                 760                 765
Lys Val Ala Leu Asp Ser Asp Asp Ala Leu Phe Gly Gly Phe Ser
                770                 775                 780
Arg Leu Asp His Asp Val Asp Tyr Phe Thr Thr Glu His Pro His
                785                 790                 795
Asp Asn Arg Pro Arg Ser Phe Ser Val Tyr Thr Pro Ser Arg Thr
                800                 805                 810
Ala Val Val Tyr Ala Leu Thr Glu
                815
<210>8
<211>833
<212>PRT
<213>普通小麦
<223>来自D基因组的wSBEIIa蛋白
<400>8
y11282
Met Ala Thr Phe Ala Val Ser Gly Ala Thr Leu Gly Val Ala Arg
                5                   10                  15
Pro Ala Gly Ala Gly Gly Gly Leu Leu Pro Arg Ser Gly Ser Glu
                20                  25                  30
Arg Arg Gly Gly Val Asp Leu Pro Ser Leu Leu Leu Arg Lys Lys
                35                  40                  45
Asp Ser Ser Arg Ala Val Leu Ser Arg Ala Ala Ser Pro Gly Lys
                50                  55                  60
Val Leu Val Pro Asp Gly Glu Ser Asp Asp Leu Ala Ser Pro Ala
                65                  70                  75
Gln Pro Glu Glu Leu Gln Ile Pro Glu Asp Ile Glu Glu Gln Thr
                80                  85                  90
Ala Glu Val Asn Met Thr Gly Gly Thr Ala Glu Lys Leu Glu Ser
                95                  100                 105
Ser Glu Pro Thr Gln Gly Ile Val Glu Thr Ile Thr Asp Gly Val
                110                 115                 120
Thr Lys Gly Val Lys Glu Leu Val Val Gly Glu Lys Pro Arg Val
                125                 130                 135
Val Pro Lys Pro Gly Asp Gly Gln Lys Ile Tyr Glu Ile Asp Pro
                140                 145                 150
Thr Leu Lys Asp Phe Arg Ser His Leu Asp Tyr Arg Tyr Ser Glu
                155                 160                 165
Tyr Arg Arg Ile Arg Ala Ala Ile Asp Gln His Glu Gly Gly Leu
                170                 175                 180
Glu Ala Phe Ser Arg Gly Tyr Glu Lys Leu Gly Phe Thr Arg Ser
                185                 190                 195
Ala Glu Gly Ile Thr Tyr Arg Glu Trp Ala Pro Gly Ala His Ser
                200                 205                 210
Ala Ala Leu Val Gly Asp Phe Asn Asn Trp Asn Pro Asn Ala Asp
                215                 220                 225
Thr Met Thr Arg Asp Asp Tyr Gly Val Trp Glu Ile Phe Leu Pro
                230                 235                 240
Asn Asn Ala Asp Gly Ser Pro Ala Ile Pro His Gly Ser Arg Val
                245                 250                 255
Lys Ile Arg Met Asp Thr Pro Ser Gly Val Lys Asp Ser Ile Ser
                260                 265                 270
Ala Trp Ile Lys Phe Ser Val Gln Ala Pro Gly Glu Ile Pro Phe
                275                 280                 285
Asn Gly Ile Tyr Tyr Asp Pro Pro Glu Glu Glu Lys Tyr Val Phe
                290                 295                 300
Gln His Pro Gln Pro Lys Arg Pro Glu Ser Leu Arg Ile Tyr Glu
                305                 310                 315
Ser His Ile Gly Met Ser Ser Pro Glu Pro Lys Ile Asn Ser Tyr
                320                 325                 330
Ala Asn Phe Arg Asp Glu Val Leu Pro Arg Ile Lys Arg Leu Gly
                335                 340                 345
Tyr Asn Ala Val Gln Ile Met Ala Ile Gln Glu His Ser Tyr Tyr
                350                 355                 360
Ala Ser Phe Gly Tyr His Val Thr Asn Phe Phe Ala Pro Ser Ser
                365                 370                 375
Arg Phe Gly Thr Pro Glu Asp Leu Lys Ser Leu Ile Asp Arg Ala
                380                 385                 390
His Glu Leu Gly Leu Leu Val Leu Met Asp Ile Val His Ser His
                395                 400                 405
Ser Ser Asn Asn Thr Leu Asp Gly Leu Asn Gly Phe Asp Gly Thr
                410                 415                 420
Asp Thr His Tyr Phe His Gly Gly Pro Arg Gly His His Trp Met
                425                 430                 435
Trp Asp Ser Arg Leu Phe Asn Tyr Gly Ser Trp Glu Val Leu Arg
                440                 445                 450
Phe Leu Leu Ser Asn Ala Arg Trp Trp Leu Glu Glu Tyr Lys Phe
                455                 460                 465
Asp Gly Phe Arg Phe Asp Gly Val Thr Ser Met Met Tyr Thr His
                470                 475                 480
His Gly Leu Gln Met Thr Phe Thr Gly Asn Tyr Gly Glu Tyr Phe
                485                 490                 495
Gly Phe Ala Thr Asp Val Asp Ala Val Val Tyr Leu Met Leu Val
                500                 505                 510
Asn Asp Leu Ile His Gly Leu His Pro Asp Ala Val Ser Ile Gly
                515                 520                 525
Glu Asp Val Ser Gly Met Pro Thr Phe Cys Ile Pro Val Pro Asp
                530                 535                 540
Gly Gly Val Gly Leu Asp Tyr Arg Leu His Met Ala Val Ala Asp
                545                 550                 555
Lys Trp Ile Glu Leu Leu Lys Gln Ser Asp Glu Ser Trp Lys Met
                560                 565                 570
Gly Asp Ile Val His Thr Leu Thr Asn Arg Arg Trp Leu Glu Lys
                575                 580                 590
Cys Val Thr Tyr Ala Glu Ser His Asp Gln Ala Leu Val Gly Asp
                595                 600                 605
Lys Thr Ile Ala Phe Trp Leu Met Asp Lys Asp Met Tyr Asp Phe
                610                 615                 620
Met Ala Leu Asp Arg Pro Ser Thr Pro Arg Ile Asp Arg Gly Ile
                625                 630                 635
Ala Leu His Lys Met Ile Arg Leu Val Thr Met Gly Leu Gly Gly
                640                 645                 650
Glu Gly Tyr Leu Asn Phe Met Gly Asn Glu Phe Gly His Pro Glu
                655                 660                 665
Trp Ile Asp Phe Pro Arg Gly Pro Gln Thr Leu Pro Thr Gly Lys
                670                 680                 685
Val Leu Pro Gly Asn Asn Asn Ser Tyr Asp Lys Cys Arg Arg Arg
                690                 695                 700
Phe Asp Leu Gly Asp Ala Asp Phe Leu Arg Tyr His Gly Met Gln
                705                 710                 715
Glu Phe Asp Gln Ala Met Gln His Leu Glu Glu Lys Tyr Gly Phe
                720                 725                 730
Met Thr Ser Glu His Gln Tyr Val Ser Arg Lys His Glu Glu Asp
                735                 740                 745
Lys Val Ile Ile Phe Glu Arg Gly Asp Leu Val Phe Val Phe Asn
                750                 755                 760
Phe His Trp Ser Asn Ser Phe Phe Asp Tyr Arg Val Gly Cys Ser
                765                 770                 775
Arg Pro Gly Lys Tyr Lys Val Ala Leu Asp Ser Asp Asp Ala Leu
                780                 785                 790
Phe Gly Gly Phe Ser Arg Leu Asp His Asp Val Asp Tyr Phe Thr
                795                 800                 805
Thr Glu His Pro His Asp Asn Arg Pro Arg Ser Phe Ser Val Tyr
                810                 815                 820
Thr Pro Ser Arg Thr Ala Val Val Tyr Ala Leu Thr Glu
                825                 830
<210>9
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<223>引物
<400>9
cccgctgctt tcgctcattt tg     22
<210>10
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<223>引物
<400>10
gactaccgga gctcccacc ttc     23
<210>11
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<223>引物
<400>11
agatgtgaat ggctgcttgc tg    22
<210>12
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<223>引物
<400>12
caggtcgacc atatgggaga gc                     22
<210>13
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<223>合成肽
<400>13
Ala Ala Ser Pro Gly Lys Val Leu Val Pro Asp Glu Ser Asp Asp
                5                   10                  15
Leu Gly Cys
<210>14
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
<223>合成肽
<400>14
Ala Gly Gly Pro Ser Gly Glu Val Met Ile Gly Cys
                5                   10
<210>15
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<223>引物
<400>15
atcacttacc gagaatggg                     19
<210>16
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<223>引物
<400>16
ctgcatttgg attccaattg                    20
<210>17
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<223>引物
<400>17
cacccattgt aattgggtac actg               24
<210>18
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<223>引物
<400>18
tccatgcctc cttcgtgttc atca               24
<210>19
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<223>引物
<400>19
ctgcgcataa atccaaactt ctcg               24
<210>20
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<223>引物
<400>20
ctatgccaat tgaacaacaa tgc               23
<210>21
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<223>引物
<400>21
cgtgttcatc aatgtctgaa cg                     22
<210>22
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<223>引物
<400>22
ggatatgtat gatttcatgg                       20
<210>23
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<223>引物
<400>23
ccataaagtt aagataaccc                       20
<210>24
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<223>引物
<400>24
gacatcagac caccagtacg                       20
<210>25
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<223>引物
<400>25
cttcccaggc tttaaacagc                       20
<210>26
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<223>引物
<400>26
ggtaccgcag aaaatatacg agattgaccc            30
<210>27
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<223>引物
<400>27
atcacttacc gagaatggg                        19
<210>28
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<223>引物
<400>28
ctgcatttgg attccaattg                       20
<210>29
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<223>引物
<400>29
ccaagtacca gtggtgaacg c                      21
<210>30
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<223>引物
<400>30
cggtgggatc caacggccc                     19
<210>31
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<223>引物
<400>31
catgtgagct agctttcgcc c                  21
<210>32
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<223>引物
<400>32
gggcaaacgg aatctgatcc                    20
<210>32
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<223>引物
<400>32
gggcaaacgg aatctgatcc                    20
<210>33
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<223>引物
<400>33
ccagatcgta tatcggaagg tcg                23
<210>34
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<223>引物
<400>34
gcaaaagcca gatcataaat ttagagc            27
<210>35
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<223>引物
<400>35
cttccaattc attgttaatg gtcacac            27

Claims (56)

1.一种从小麦作物上获取的麦粒，所述小麦作物具有引入的遗传变种，该遗传变种导致了胚乳中SBEIIa基因表达水平和/或SBEIIa酶活性相对于野生麦粒的降低，该遗传变种中包含有SBEIIa基因的突变，或引入对SBEIIa基因表达的抑制体进行编码的核酸，其特征在于，该麦粒的淀粉中，直链淀粉的比例至少是50％，其中所述麦粒是碾磨过的或是煮半熟的麦粒。
2.根据权利要求1所述的麦粒，其特征在于，其中包含至少一个SBEIIa基因上的无效变异。
3.根据权利要求2所述的麦粒，其特征在于，所述的作物是六倍体的，且所述麦粒中含有两个或三个SBEIIa基因上的无效变异。
4.根据权利要求1所述的麦粒，其特征在于，其中包含对SBEIIa基因表达的抑制体进行编码的核酸。
5.根据权利要求4所述的麦粒，其特征在于，所述核酸对非官能、共抑制、核酶或双RNA分子进行编码。
6.根据权利要求1或4所述的麦粒，其特征在于，所述麦粒中还含有相对于野生麦粒降低了蛋白水平的SBEIIb蛋白和/或降低了活性的SBEIIb蛋白酶。
7.根据权利要求1或4所述的麦粒，其特征在于，所述麦粒进一步具有相对于野生麦粒降低了蛋白水平的SBEI蛋白和/或降低了活性的SBEI蛋白酶。
8.根据权利要求1或4所述的麦粒，相对于野生麦粒，所述麦粒进一步具有至少一种活性被改变的酶，其特征在于，所述酶是选自ADP葡萄糖焦磷酸化酶、GBSS、SSI、SSII、SSIII、异淀粉酶类脱麸酶、普鲁兰酶类脱麸酶中的至少一种。
9.根据权利要求1或4所述的麦粒，其特征在于，所述麦粒是不缩水的和/或麦粒的平均重量至少是36mg。
10.根据权利要求1或4所述的麦粒，其特征在于，在偏振光下观测该麦粒，其中至少50％的淀粉颗粒不具有双折射特性。
11.根据权利要求1或4所述的麦粒，其特征在于，在脱壳之后，所述麦粒中淀粉的重量含量比例至少是25％和/或相当于野生麦粒脱壳后的淀粉重量含量的至少90％。
12.根据权利要求1所述的麦粒，其特征在于，麦粒是磨碎的、珍珠状小粒的、滚圆的、破碎成块。
13.一种淀粉颗粒，其特征在于，所述淀粉颗粒是提取自权利要求1-12中任意一项所述的麦粒。
14.根据权利要求13所述的淀粉颗粒，其中含有淀粉，其特征在于，所述淀粉中直链淀粉的比例至少是50％。
15.一种淀粉，其特征在于，所述淀粉是提取自权利要求1-12中任意一项所述的麦粒。
16.一种食品，其特征在于，包含权利要求1～12中任意一项所述的麦粒，或从权利要求1～12中任意一项所述麦粒所得的淀粉。
17.一种面粉产品，其特征在于，从权利要求1～12中任意一项所述麦粒所得的面粉。
18.一种粗粉产品，其特征在于，从权利要求1～12中任意一项所述麦粒所得的粗粉。
19.一种粗粒小麦粉产品，其特征在于，从权利要求1～12中任意一项所述麦粒所得的粗粒小麦粉。
20.根据权利要求16所述的食品，其特征在于，所述淀粉与来自其它来源的淀粉相混合。
21.一种组合物，其特征在于，其中含有权利要求15所述的淀粉以及另一种食品成分或水。
22.一种生产能够产出麦粒的小麦作物的方法，其特征在于，包含如下步骤：
1)把编码SBEIIa基因表达的抑制体的核酸引入到小麦作物的母体或种子中；以及
2)鉴别出相对于野生小麦麦粒，后代作物或种子的胚乳中SBEIIa基因表达水平和/或SBEIIa酶活性降低了的小麦作物母体或种子；
其中，所述麦粒中含有淀粉，所述淀粉中直链淀粉的比例至少是50％。
23.一种产出改良小麦淀粉的方法，其特征在于，包含从权利要求1～12中任意一项所述麦粒中提取淀粉的步骤。
24.一种鉴别出具有SBEIIa基因突变的小麦作物或种子的方法，其特征在于，包含以下步骤：筛选出具有分子标记的小麦作物或种子，所述的分子标记分别链接到SBEIIa；根据所述的链接分子标记是否存在，鉴别出所述作物或种子，并进一步对所述鉴别出的作物进行检测并确定种子所含的淀粉中直链淀粉的比例是否至少是50％。
25.一种鉴别出具有SBEIIa基因突变的小麦作物或种子的方法，其特征在于，包含以下步骤：筛选出分别具有小麦SBEIIa蛋白抗体的小麦作物或种子；根据抗体结合是否存在，鉴别出所述作物或种子，并进一步对所述鉴别出的作物进行检测并确定种子所含的淀粉中直链淀粉的比例是否至少是50％。
26.一种从小麦作物获取的麦粒，该麦粒具有引入的突变，其特征在于，染色体2A的长臂上缺失SBEIIa基因，或者染色体2A长臂上的SBEIIa基因存在着相对于野生麦粒导致胚乳中SBEIIa蛋白和/或SBEIIa酶活性降低的突变，并且其中所述麦粒中含有淀粉，所述淀粉中直链淀粉的比例至少是50％，所述麦粒是碾磨过的或是煮半熟的麦粒。
27.根据权利要求26所述的麦粒，其特征在于，所述突变是SBEIIa基因的无效突变。
28.根据权利要求26所述的麦粒，其特征在于，所述突变至少是SBEIIa基因的部分缺失。
29.根据权利要求26所述的麦粒，该麦粒具有突变，其特征在于，染色体2A的长臂上缺失SBEIIb基因，或者染色体2A长臂上的SBEIIb基因存在着相对于野生麦粒，导致胚乳中SBEIIb蛋白和/或SBEIIb酶活性降低的突变。
30.根据权利要求26所述的麦粒，其特征在于，所述缺失破坏了染色体2A长臂上SBEIIa和SBEIIb基因的表达。
31.根据权利要求26所述的麦粒，其特征在于，所述作物是硬质小麦作物。
32.根据权利要求31所述的麦粒，其中还包含遗传变种，其特征在于，相对于野生麦粒，该遗传变种导致了染色体2B上被SBEIIa基因编码的淀粉分支酶活性的降低。
33.根据权利要求31所述的麦粒，其特征在于，所述的遗传变种包括染色体2B长臂上SBEIIa基因的缺失，或者染色体2B长臂上的SBEIIa基因存在着相对于野生麦粒，导致胚乳中SBEIIa蛋白质降低了的突变。
34.根据权利要求26所述的麦粒，其特征在于，所述小麦作物是温带小麦。
35.根据权利要求34所述的麦粒，其中包含遗传变种，其特征在于，相对于野生麦粒，该遗传变种导致了染色体2B和/或染色体2D上被SBEIIa基因编码的淀粉分支酶活性的降低。
36.根据权利要求35所述的麦粒，其特征在于，所述遗传变体在至少一种所述的染色体上缺失SBEIIa基因，或在至少一种所述的染色体上存在SBEIIa基因突变，该SBEIIa基因突变导致所述麦粒相对于野生麦粒，胚乳中SBEIIa蛋白和/或SBEIIa酶活性的降低。
37.根据权利要求32所述的麦粒，其特征在于，所述遗传变种中包含引入对SBEIIa基因表达和/或酶活性的抑制体进行编码的核酸。
38.根据权利要求1～12、26～37中任意一项所述的麦粒，其特征在于，经对支链淀粉进行异淀粉酶脱麸后测量，相对于野生麦粒，所述麦粒的支链淀粉中4-12dp链长的比例降低了。
39.根据权利要求1或26所述的麦粒，其特征在于，所述麦粒是不缩水的。
40.根据权利要求26所述的麦粒，其特征在于，所述麦粒的平均重量至少是36mg。
41.根据权利要求1或26所述的麦粒，其特征在于，在偏振光观测下，所述麦粒中至少有50％的淀粉颗粒不具有双折射性。
42.根据权利要求1或26所述的麦粒，其特征在于，所述麦粒脱麸之后，淀粉的重量百分含量至少是28％；或者，淀粉的重量百分含量至少相当于野生麦粒中淀粉含量的90％。
43.根据权利要求42所述的麦粒，其特征在于，所述麦粒是磨碎的、珍珠状小粒的或破碎成块的。
44.根据权利要求26所述的麦粒，其特征在于，所述麦粒中，SBEI蛋白质水平和/或SBEI酶活性降低了。
45.根据权利要求26所述的麦粒，相对于野生麦粒，所述麦粒还包含至少一种活性被改变的酶，其特征在于，所述酶是选自ADP葡萄糖焦磷酸化酶、GBSS、SSI、SSII、SSIII、异淀粉酶类脱麸酶、普鲁兰酶类脱麸酶中的至少一种。
46.一种淀粉颗粒，其特征在于，所述淀粉颗粒是提取自权利要求26-45中任意一项所述的麦粒。
47.一种淀粉，其特征在于，所述淀粉是提取自权利要求26-45中任意一项所述的麦粒。
48.一种食品，其特征在于包含权利要求26-45中任意一项所述的麦粒，或从权利要求26-45中任意一项所述麦粒所得的淀粉。
49.一种面粉产品，其特征在于，从权利要求26-45中任意一项所述麦粒所得的面粉。
50.一种粗粉产品，其特征在于，从权利要求26-45中任意一项所述麦粒所得的粗粉。
51.一种粗粒小麦粉产品，其特征在于，从权利要求26-45中任意一项所述麦粒所得的粗粒小麦粉。
52.根据权利要求48所述的食品，其特征在于，所述淀粉与来自其它来源的淀粉相混合。
53.一种组合物，其特征在于，其中含有权利要求47所述的淀粉以及另一种食品成分或水。
54.一种产出麦粒的方法，其特征在于，包含如下步骤：
1)栽培小麦作物，所述小麦作物具有突变，其中，染色体2A的长臂上缺失SBEIIa基因，或者染色体2A长臂上的SBEIIa基因存在着相对于野生小麦导致胚乳中SBEIIa酶活性降低的突变；
2)收割所述小麦作物的麦粒，并且其中所述麦粒中含有淀粉，所述淀粉中直链淀粉的比例至少是50％。
55.一种生产淀粉的方法，其特征在于，包含如下步骤：
1)获取权利要求26-45中任意一项所述的麦粒；
2)从所述麦粒中提取淀粉。
56.一种产出权利要求1-12、权利要求26-45中任意一项所述麦粒的方法，其特征在于，包含如下步骤：
1)栽培小麦作物，所述小麦作物包括导致相对于野生小麦SBEIIa基因表达降低和/或胚乳中SBEIIa酶活性降低的引入基因变异，该基因变异包括SBEIIa基因的突变或编码SBEIIa基因表达的抑制体的核酸突变；
2)收割所述小麦作物的麦粒。
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