ES2369774T3

ES2369774T3 - Trigo con actividad de enzima ramificante y almidón alterados y productos que contienen almidón derivados del mismo.

Info

Publication number: ES2369774T3
Application number: ES04737522T
Authority: ES
Inventors: Ahmed Regina; Sadequr Rahman; Matthew Kennedy Morell; Zhongyi Li
Original assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO; Limagrain Cereales Ingredients SA
Current assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO; Limagrain Cereales Ingredients SA
Priority date: 2003-06-30
Filing date: 2004-06-30
Publication date: 2011-12-05
Anticipated expiration: 2024-06-30
Also published as: UA88268C2; CN1875105A; ZA200510474B; CN1875105B

Abstract

Grano obtenido a partir de una planta del trigo, que comprende almidón, en el que la proporción de amilosa en el almidón del grano es de por lo menos 50%, comprendiendo dicho grano un nivel reducido de la proteína SBEIIa, actividad de enzima SBEIIa o ambos en el endospermo en comparación con el grano de tipo salvaje, y que comprende una variación genética que conduce a una reducción del nivel de expresión del gen SBEIIa, de la actividad del enzima SBEIIa en el endospermo, o de ambos, respecto al grano de tipo salvaje, comprendiendo dicha variación genética una mutación en un gen SBEIIa o un ácido nucleico introducido que codifica un inhibidor de la expresión del gen SBEIIa en el que dicho inhibidor es una molécula antisentido, cosupresora, ribozima o dúplex de ARN que presenta como diana el gen SBEIIa.

Description

Trigo con actividad de enzima ramificante y almidón alterados y productos que contienen almidón derivados del mismo.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una planta del trigo que presenta un grano de almidón con un contenido de amilosa relativamente elevado. Asimismo, la invención se refiere al trigo con una actividad reducida de enzima IIa ramificador del almidón (SBEIIa) en el endospermo y a los procedimientos para obtener estas plantas. La invención se refiere asimismo al grano y al almidón y a los productos alimenticios y no alimenticios obtenidos a partir de los mismos.

Antecedentes de la invención

En los cereales, el almidón constituye aproximadamente 45% a 65% del peso del grano maduro. El almidón está compuesto de dos tipos de molécula: la amilosa y la amilopectina. La amilosa es una molécula esencialmente lineal compuesta de cadenas glucosídicas unidas por enlaces α-1,4, mientras que la amilopectina es muy ramificada, con enlaces glucosídicos α-1,6 que unen cadenas lineales.

La síntesis del almidón en el endospermo de las plantas superiores la realiza un conjunto de enzimas que cataliza cuatro etapas clave. En primer lugar, la ADP-glucosa pirofosforilasa activa el monómero precursor del almidón a través de la síntesis de la ADP-glucosa a partir de G-1-P y ATP. En segundo lugar, el donador glucosilo activo, la ADP-glucosa, es transferida al extremo no reductor de un enlace α-1,4 preexistente por almidón sintasas. En tercer lugar, los enzimas ramificadores del almidón introducen puntos de ramificación mediante el corte de una región de glucano unido con enlaces α-1,4, seguido de la transferencia de la cadena cortada a una cadena aceptora, formando un nuevo enlace α-1,6. Los enzimas ramificadores del almidón son los únicos enzimas que pueden introducir enlaces α-1,6 en los α-poliglucanos y, por lo tanto, desempeñan un papel esencial en la formación de la amilopectina. Finalmente, los enzimas desramificadores del almidón eliminan algunos de los enlaces de ramas, aunque todavía no se ha determinado cuál es el mecanismo mediante el que actúan (Myers et al., 2000).

Aunque resulta claro que resultan necesarias por lo menos dichas cuatro actividades para la síntesis normal del gránulo de almidón en las plantas superiores, se encuentran múltiples isoformas de cada una de las cuatro actividades en el endospermo de las plantas superiores y se han propuesto funciones específicas para las isoformas individuales basándose en el análisis mutacional (Wang et al., 1998; Buleon et al., 1998) o mediante la modificación de los niveles de expresión génica utilizando enfoques transgénicos (Abel et al., 1996; Jobling et al., 1999; Schwall et al., 2000). Sin embargo, las contribuciones exactas de cada isoforma de cada actividad a la biosíntesis del almidón todavía no se conocen, y no se conoce si estas contribuciones difieren marcadamente entre especies. En el endospermo del cereal, se encuentran presentes dos isoformas de la ADP-glucosa pirofosforilasa, una forma dentro del amiloplasto, y una forma en el citoplasma (Denyer et al., 1996; Thorbjornsen et al., 1996). Cada forma está compuesta de dos tipos de subunidad. Los mutantes shrunken (sh2) y brittle (bt2) en el maíz representan lesiones en las subunidades grande y pequeña, respectivamente (Giroux y Hannah, 1994). Se encuentran cuatro clases de almidón sintasa en el endospermo del cereal, una isoforma localizada exclusivamente dentro del gránulo de almidón, la almidón sintasa unida al gránulo (GBSS), dos formas que se distribuyen entre el gránulo y la fracción soluble (SSI, Li et al., 1999a; SSII, Li et al., 1999b) y una cuarta forma que se encuentra enteramente localizada en la fracción soluble, SSIII (Cao et al., 2000; Li et al., 1999b; Li et al., 2000). Se ha demostrado que la GBSS resulta esencial para la síntesis de la amilosa (Shure et al., 1983), y las mutaciones en SSII y en SSIII se ha demostrado que alteran la estructura de la amilopectina (Gao et al., 1998; Craig et al., 1998). No se han descrito mutaciones que definan un papel para la actividad de SSI.

Se expresan tres formas de enzima ramificador en el endospermo del cereal, el enzima ramificador I (SBEI), el enzima ramificador IIa (SBEIIa) y el enzima ramificador IIb (SBEIIb) (Hedman y Boyer, 1982; Boyer y Preiss, 1978; Mizuno et al., 1992; Sun et al., 1997). Se han caracterizado secuencias genómicas y de ADNc para el arroz (Nakamura y Yamanouchi, 1992), el maíz (Baba et al., 1991; Fisher et al., 1993; Gao et al., 1997) y el trigo (Repellin et al., 1997; Nair et al., 1997; Rahman et al., 1997). La alineación de secuencias revela un grado elevado de similitud de secuencias a nivel tanto de nucleótidos como de aminoácidos y permite el agrupamiento en las clases SBEI, SBEIIa y SBEIIb. Las clases SBEIIa y SBEIIb generalmente muestran una identidad de secuencia de aproximadamente 80%, particularmente en las regiones centrales de los genes. SBEIIa y SBEIIb también pueden distinguirse por sus patrones de expresión. SBEIIb generalmente se expresa específicamente en el endospermo, mientras que SBEIIa se encuentra presente en todos los tejidos de la planta.

En el endospermo del trigo, se encuentra SBEI (Morell et al., 1997) exclusivamente en la fracción soluble, mientras que SBEIIa y SBEIIb se encuentran en las fracciones tanto soluble como asociada al gránulo de almidón (Rahman et al., 1995). En el maíz y el arroz se ha demostrado que los fenotipos de amilosa elevada resultan de lesiones en el gen SBEIIb, también conocido como el gen extensor de amilosa (ae) (Boyer y Preiss, 1981; Mizuno et al., 1993; Nishi et al., 2001). En estos mutantes de SBEIIb, los granos de almidón del endospermo mostraban una morfología

anormal, el contenido de amilosa se encontraba significativamente elevado y la frecuencia de ramificación de la amilopectina residual se encontraba reducida y la proporción de cadenas cortas (<DP17, especialmente DP8-12) era más baja. Además, la temperatura de gelatinización del almidón se encontraba incrementada. Además, existía un reservorio significativo de material que se definió como "intermedio" entre la amilosa y la amilopectina (Boyer et al., 1980; Takeda et al., 1993b). En contraste, plantas del maíz mutantes del gen SBEIIa debido a un elemento de inserción mutador (Mu) y que en consecuencia carecían de expresión de la proteína SBEIIa no podían distinguirse de las plantas de tipo salvaje en la ramificación del almidón del endospermo (Blauth et al., 2001), aunque presentaban alteraciones en el almidón de las hojas. De manera similar, las plantas del arroz deficientes en actividad de SBEIIa no mostraban ningún cambio significativo en el perfil de la cadena de amilopectina en el endospermo (Nakamura, 2002). Tanto en el maíz como en el arroz, los genes SBEIIa y SBEIIb no se encuentran ligados en el genoma.

En el maíz, la mutación dull1 reduce el contenido de almidón e incrementa los niveles de amilosa en el endospermo, dependiendo el grado del cambio del fondo genético, e incrementó el grado de ramificación en la amilopectina restante (Shannon y Garwood, 1984). El gen correspondiente a la mutación se identificó y se aisló mediante una estrategia de etiquetado con trasposones utilizando el mutador trasposón (Mu), y se demostró que codificaba el enzima denominado almidón sintasa II (SSII) (GAo et al., 1998). El enzima se reconoce entonces como un miembro de la familia SSIII en los cereales (Li et al., 2003). El endospermo mutante presentaba niveles reducidos de actividad de SBEIIa asociados a la mutación dull1. No se ha informado de ninguna mutación correspondiente en otros cereales. No se conoce si estos resultados son relevantes a otros cereales, por ejemplo al trigo.

El documento WO nº 94/09144 propone la utilización de genes de sentido y antisentido para alterar las proporciones naturales de la almidón sintasa (SS) y SBE en el maíz. Sin embargo, no se proporcionan datos que apoyen las estrategias moleculares propuestas y no se sugiere la reducción específica de la actividad de SBEIIa.

En la patata, la regulación negativa de SBEI por sí sola provoca efectos mínimos sobre la estructura del almidón (Filpse et al., 1996), aunque trabajos posteriores han identificado algunos cambios cualitativos (Safford et al., 1998). Sin embargo, en la patata, la regulación negativa de SBEII y SBEI en combinación incrementaron el contenido relativo de amilosa en mucho mayor grado que la regulación negativa de únicamente SBEII (Schwall et al., 2000).

En las plantas superiores se encuentran dos tipos de enzima desramificador, definidos basándose en sus especificidades de sustrato: los enzimas desramificadores de tipo isoamilasa y los enzimas desramificadores de tipo pululanasa (Myers et al., 2000). Las mutaciones Sugary-1 en el maíz y en el arroz se asocian a una deficiencia en ambos tipos de enzima desramificador (James et al., 1995; Kubo et al., 1999). Sin embargo, la mutación causal se localiza en el mismo sitio que el gen del enzima desramificador de tipo isoamilasa. Los genes representativos de la biosíntesis del almidón que han sido clonados a partir de cereales se presentan en la Tabla 1.

Tabla 1. Genes de enzima ramificador del almidón caracterizados a partir de cereales.

Especie: Isoforma de SBE Tipo de clon Nº de acceso Referencia

Maíz: SBEI ADNc U17897 Fisher et al., 1995

Genómico: AF072724 Kim et al., 1998a

SBEIIb: ADNc L08065 Fisher et al., 1993

Genómico: AF072725 Kim et al., 1998

SBEIIa: ADNc U65948 Gao et al., 1997

Trigo: SBEII ADNc Y11282 Nair et al., 1997

SBEI: ADNc y genómico AJ237897 (gen SBEI) AF002821 (pseudogén SBEI) AF076680 (gen SBEI) AF076679 (ADNc de SBEI) Baga et al., 1999 Rahman et al., 1997 Rahman et al., 1999

SBEI: ADNc Y12320 Repellin et al., 1997

SBEIIa: ADNc y genómico AF338432 (ADNc) AF338431 (gen) Rahman et al., 2001

SBEIIb: ADNc y genómico Documento WO nº 01/62934

SBEIIb: ADNc Documento WO nº 00/15810

Arroz: SBEI ADNc D10752 Nakamura y Yamanouchi, 1992

SBEI: Genómico D10838 Kawasaki et al., 1993

RBE3: ADNc D16201 Mizumo et al., 1993

Cebada: SBEIIa y SBEIIb ADNc y genómico AF064563 (gen SBEIIb) AF064561 (ADNc de SBEIIb) AF064562 (gen SBEIIa) AF064560 (ADNc de SBEIIa) Sun et al., 1998

El almidón es muy utilizado en las industrias alimenticia, papelera y química. La estructura química del almidón puede presentar un impacto importante sobre las propiedades nutricionales y de manipulación del almidón para productos alimenticios o no alimenticios o industriales. Determinadas características pueden utilizarse como indicación de la estructura del almidón, incluyendo la distribución de longitudes de cadena de la amilopectina, el grado y tipo de cristalinidad y propiedades tales como la temperatura de gelatinización, la viscosidad y el volumen de hinchado. Los cambios de longitud de la cadena de la amilopectina pueden indicar una cristalinidad, gelatinización o retrogradación alteradas de la amilopectina.

La composición del almidón, en particular la forma denominada almidón resistente que podría asociarse al contenido elevado de amilosa, presenta importantes implicaciones para la salud intestinal, en particular la salud del intestino grueso. De acuerdo con lo anterior, se han desarrollado almidones ricos en amilosa en determinados cereales tales como el maíz para la utilización en alimentos como medio de incrementar la salud intestinal. Los efectos beneficiosos del almidón resistente resultan de la provisión de un nutriente al intestino grueso en el que la microflora intestinal recibe una fuente energética que fermenta para formar, entre otros, ácidos grasos de cadena corta. Estos ácidos grasos de cadena corta proporcionan nutrientes para los colonocitos, incrementan la incorporación de determinados nutrientes a través del intestino grueso e incrementan la actividad fisiológica del colon. Generalmente, en el caso de que no se proporcionen almidones resistentes u otra fibra dietética, metabólicamente el colon es relativamente inactivo.

Aunque pueden utilizarse almidones modificados químicamente o de otro modo en alimentos que proporcionan funcionalidad no proporcionada normalmente por fuentes no modificadas, dichos procesamiento presenta una tendencia a alterar otros componentes o a percibirse como indeseable debido a los procedimientos implicados en la modificación. Por lo tanto, resulta preferido proporcionar fuentes de constituyentes que puedan utilizarse en forma no modificada en alimentos.

Se produce más trigo en el mundo cada año que cualquier otro cultivo de cereal. La variabilidad conocida en la estructura del almidón del trigo se limita a la variabilidad disponible en el maíz o en el arroz, en parte debido a que la eficiencia de transformación del trigo se ha incrementado más lentamente que la de otros cereales, y debido a la naturaleza hexaploide del trigo panificable. La presencia de tres genomas en Triticum aestivum presenta un efecto tamponador, al enmascarar mutaciones en los genomas individuales, en contraste con las mutaciones más fácilmente identificadas en las especies diploides. Los mutantes en SBEIIb, correspondientes a los fenotipos de extensor de amilosa en el maíz o en el arroz, no han sido caracterizados en el trigo. El fenotipo conferido por las mutaciones de SBEIIa o de SBEIIb en el trigo no es conocido. Son mutantes conocidos los del gen waxy (GBSS, Zhao y Sharp, 1998) y un mutante que carece completamente de la proteína SGP-1 (Yamamori et al., 2000), que se produjo cruzando líneas que no presentaban las formas específicas de genoma A, B y D de la proteína SGP-1 (SSII) sometidas a ensayo mediante electroforesis de proteínas. El examen de las semillas sin SSII demostró que la mutación resultaba en alteraciones en la estructura de la amilopectina, en gránulos de almidón deformados y en un contenido relativo de amilosa elevado hasta aproximadamente 30% a 37% del almidón, lo que era un incremento de aproximadamente 8% respecto al nivel de tipo salvaje (Yamamori et al., 2000). Se midió la amilosa mediante colorimetría, titulación amperométrica (ambas para la unión de yodo) y un procedimiento con concanavalina A. El almidón del mutante sin SSII mostraba una temperatura de gelatinización reducida en comparación con el almidón de una planta no mutante equivalente. Se redujo el contenido de almidón del 60% en el tipo salvaje hasta menos del 50% en el grano sin SSII.

El documento WO nº 99/14314 describe el aislamiento de un gen SBEIIa de Aegilops tauschii, una planta diploide relacionada con el trigo, pero no produjo trigo con almidón alterado.

El documento WO nº 00/15810 describe la clonación de ADNc de un gen SBEIIb del trigo. No obtuvieron plantas del trigo con niveles alterados de amilosa y no proporcionan ninguna enseñanza de trigo que presente almidón que comprenda por lo menos 50% de amilosa.

El documento WO nº 01/62934 también describe un gen SBEIIb del trigo y propone introducir inhibidores de la actividad del enzima ramificador en una planta del trigo, pero no proporciona ninguna enseñanza de trigo que presente almidón que comprenda por lo menos 50% de amilosa.

El documento WO nº 01/32886 caracterizó un ADNc codificante de una forma de SBEI en el endospermo del trigo. Se encontró que el polipéptido codificado se asociaba preferentemente a los gránulos de almidón de tipo A. No suprimía la actividad de SBEI ni mostraba una morfología alterada del gránulo de almidón ni un nivel elevado de amilosa en el trigo.

Por lo tanto, no se conoce trigo que presente almidón con una proporción de amilosa superior a aproximadamente 50%. Aunque se conocen variedades de maíz y de cebada ricas en amilosa, los productos de estos cereales presentan desventajas en comparación con un trigo de contenido muy alto en amilosa para productos en los que el trigo es el cereal preferido, por ejemplo en pan, pasta o fideos.

Aunque los almidones con niveles elevados de amilosa de dichos tipos resultan útiles, un almidón de trigo con un contenido más alto de amilosa resulta preferido, en particular en el caso de que se encuentre asociado con una síntesis mejorada del almidón y otras características, por ejemplo una menor necesidad de modificación posterior a la cosecha. Dichos productos de almidón también son relativamente resistentes a la digestión y proporcionan un mayor beneficio para la salud.

Parte general

En la totalidad de la presente memoria, a menos que el contexto indique lo contrario, el término "comprende" y variaciones tales como "comprenden" y "que comprende", se entiende que implican la inclusión de un número entero

: o etapa o grupo de números enteros o etapas indicado, pero no la exclusión de cualquier otro número entero o etapa

: o grupo de números enteros o etapas. La presente invención no debe considerarse limitada en su alcance a las formas de realización específicas descritas en la presente memoria, que se proporcionan meramente con fines de ejemplificación. Los productos funcionalmente equivalentes, composiciones y procedimientos se encuentran claramente comprendidos dentro del alcance de la invención, tal como se describe en la presente memoria.

Los datos bibliográficos de las publicaciones a las que hacen referencia en la presente memoria se recogen al final de la descripción. La referencia en la presente memoria a la técnica anterior, incluyendo cualquier documento o documentos de la técnica anterior, no debe considerarse un reconocimiento, o sugerencia, de que dicha técnica anterior es conocimiento general común en Australia o que forma una parte del conocimiento general común en Australia.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "derivado de" debe considerarse que indica que un número entero particular o grupo de números enteros se ha originado a partir de la especie indicada, pero que no ha sido obtenido necesariamente de modo directo a partir de la fuente indicada.

La designación de residuos nucleótidos a la que se hace referencia en la presente memoria es la recomendada por la IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission, en la que A representa adenina, C representa citosina, G representa guanina y T representa timidina.

Sumario de la invención

En un primer aspecto, la invención proporciona un grano obtenido a partir de una planta de trigo en la que la proporción de amilosa en el almidón del grano es de por lo menos 50%, comprendiendo dicho grano un nivel reducido de la proteína SBEIIa, actividad enzimática de SBEIIa o ambas en el endospermo respecto al grano de tipo salvaje, y que comprende una variación genética que conduce a una reducción del nivel de expresión génica de SBEIIa, de la actividad enzimática de SBEIIa en el endospermo o ambas respecto al grano de tipo salvaje, comprendiendo la variación genética una mutación de un gen SBEIIa o un ácido nucleico introducido que codifica un inhibidor del gen SBEIIa, en el que dicho inhibidor es una molécula antisentido, cosupresora, ribozima o dúplex de ARN que presenta como diana el gen SBEIIa. La planta del trigo puede presentar preferentemente un nivel reducido de expresión génica o actividad enzimática de tanto SBEIIa como SBEIIb, o ambos. Además, el grano puede comprender una variación genética similar en SBEI. El grano adicionalmente puede comprender un nivel alterado de proteína y/o de actividad enzimática seleccionada de entre el grupo que consiste de ADP glucosa pirofosforilasa, GBSS, SSI, SSII, SSIII, un enzima desramificador del tipo isoamilasa y un enzima desramificador del tipo pululanasa. El grano puede comprender un transgén que codifique una molécula antisentido, cosupresora, ribozima

o dúplex de ARN. El transgén preferentemente conduce a un nivel reducido de expresión de ARNm codificante de SBEIIa. El grano puede comprender una mutación en un gen SBEIIa y en una forma es una mutación nula del gen SBEIIa en por lo menos un genoma y puede ser una mutación nula en dos o tres de los genomas. La proporción de amilosa en el almidón del grano puede ser de por lo menos 50%, 55%, 60%, 70% ó 80%. En otra forma, por lo menos 50% de los gránulos de almidón dentro del grano presentan una apariencia no birrefringente al observarlos bajo luz polarizada. El grano puede ser no arrugado, y puede presentar un peso medio de por lo menos 36 ó 40 mg. En una forma alternativa, el contenido de almidón del grano en estado desnudo es de por lo menos 25% (p/p) o de por lo menos 35% (p/p), y puede ser de por lo menos 90% del contenido de almidón del grano de tipo salvaje. El grano puede ser grano entero, grano descascarillado, molido, partido, laminado, perlado, triturado o precocido.

En otra forma, el primer aspecto de la exposición proporciona un grano obtenido a partir de una planta de trigo, comprendiendo el grano almidón y una variación genética que conduce a una reducción del nivel de expresión del gen SBEIIa, de la actividad enzimática de SBEIIa en el endospermo o a ambas, respecto al grano de tipo salvaje, comprendiendo dicha variación genética una mutación de un gen SBEIIa o un ácido nucleico introducido que codifica un inhibidor de la expresión del gen SBEIIa, en el que la proporción de amilosa en el almidón del grano es de por lo menos 30%.

En un segundo aspecto, la invención proporciona un producto molido derivado de grano del primer aspecto, que comprende de manera no limitativa harina, harina integral, sémola o almidón obtenido a partir del grano de la invención, o productos alimenticios que incorporan dicha harina, harina integral, sémola o almidón, o productos laminados, en copos o extruidos del grano. El producto puede incluir harina, harina integral, sémola o almidón obtenidos del grano del primer aspecto de la invención mezclado con harina, harina integral, sémola o almidón de otra fuente.

En un tercer aspecto, la invención proporciona gránulos de almidón o almidón obtenido a partir de grano de la planta del trigo del primer aspecto. En una forma específico del tercer aspecto, la planta del trigo además presenta un nivel reducido de actividad enzimática de SBEIIa en el endospermo.

En un cuarto aspecto, la exposición podría considerarse que radica en una composición que comprende el almidón según el tercer aspecto de la invención y un ingrediente alimenticio o agua. Este aspecto incluye alimentos y composiciones no alimenticias y mezclas del almidón con otros almidones o productos que contienen almidón.

En un quinto aspecto, la invención proporciona una composición que comprende gránulos de almidón del cuarto aspecto de la invención mencionado anteriormente, y otro ingrediente alimenticio o agua.

En un sexto aspecto, la invención proporciona una planta del trigo que puede utilizarse para producir el grano o los gránulos de almidón o el almidón de los aspectos anteriores. La planta del trigo puede ser transgénica o no transgénica, al igual que el grano que produce.

En un séptimo aspecto, la invención proporciona un procedimiento para producir una planta del trigo capaz de producir grano, comprendiendo las etapas siguientes: (i) introducir una variación genética en una planta del trigo madre o semilla, conduciendo dicha variación genética a una reducción del nivel de expresión del gen SBEIIa, de la actividad enzimática de SBEIIa en el endospermo, o ambos, respecto al grano de tipo salvaje, comprendiendo la introducción de un ácido nucleico que codifica un inhibidor de la expresión del gen SBEIIa en una célula regenerable de trigo y la regeneración de una planta del trigo transgénica a partir de la célula transformada, en la que dicho inhibidor es una molécula antisentido, cosupresora, ribozima o dúplex de ARN que presenta como diana el gen SBEIIa, e ii) identificar una planta progenie o semilla de la planta del trigo madre o semilla que presenta un nivel reducido de expresión del gen SBEIIa, de actividad del enzima SBEIIa en el endospermo, o ambos, respecto a la planta o semilla de tipo salvaje, en el que el grano comprende almidón, en el que la proporción de amilosa en el almidón del grano es por lo menos de 50%.

En una cuarta forma del séptimo aspecto, la exposición proporciona un procedimiento de producción de una planta del trigo que presenta un contenido relativo de amilosa en el almidón de su grano de por lo menos 50%, preferentemente presentando una actividad reducida del enzima SBEIIa en el endospermo, comprendiendo el procedimiento: a) identificar una planta o grano del trigo que presenta una actividad reducida de SBEIIa expresada a partir del genoma A, B o D del trigo, y b) cruzar dicha planta del trigo o una planta del trigo producido a partir del grano de la etapa a), con una segunda planta del trigo que presenta una actividad reducida de SBEIIa, o c) cruzar una planta que presenta una actividad reducida del enzima SBEIIa con una planta que presenta una actividad reducida del enzima SBEIIb, e identificar una planta del trigo que presente una actividad reducida de tanto SBEIIa como de SBEIIb. Preferentemente, la planta del séptimo aspecto es Triticum aestivum ssp. aestivum.

En un octavo aspecto, la invención proporciona un procedimiento de preparar almidón alterado, que comprende alterar una planta mediante los procedimientos definidos anteriormente y extraer el almidón que presenta propiedades alteradas.

En un noveno aspecto, la exposición proporciona un procedimiento para identificar una planta o semilla del trigo para una mutación en un gen SBEIIa, o un gen SBEIIb, que comprende las etapas de cribar una población de plantas o semillas del trigo con un marcador molecular ligado al gen SBEIIb, o al gen SBEIIa, respectivamente, del trigo, e identificar la planta o semilla basándose en la presencia o ausencia del marcador molecular ligado.

En una segunda forma del noveno aspecto, la exposición proporciona un procedimiento para identificar una planta o semilla del trigo para una mutación en un gen SBEIIa, o en un gen SBEIIb, que comprende las etapas de cribar una población de plantas o semillas del trigo con un anticuerpo que es específico para la proteína SBEIIb, o para la proteína SBEIIa, del trigo, e identificar la planta o semilla basándose en la presencia o ausencia de la unión de anticuerpos.

En un décimo aspecto, la invención proporciona un grano de la invención obtenido a partir de una planta del trigo, que comprende una mutación en la que el gen SBEIIa se encuentra ausente del brazo largo del cromosoma 2A o en el que el gen SBEIIa en el brazo largo del cromosoma 2A comprende una mutación que conduce a una proteína SBEIIa reducida, una actividad reducida del enzima SBEIIa, o a ambos, en el endospermo de dicho grano respecto al grano de tipo salvaje. La mutación puede ser una mutación nula del gen SBEIIa o puede ser una deleción de por lo menos parte del gen SBEIIa. El grano puede comprender además una mutación en la que el gen SBEIIb se encuentra ausente del brazo largo del cromosoma 2A o en el que el gen SBEIIb en el brazo largo del cromosoma 2A comprenda una mutación que conduzca a una proteína SBEIIb reducida, una actividad reducida del enzima SBEIIb,

o a ambos, en el endospermo de dicho grano respecto al grano de tipo salvaje. La deleción podría interrumpir la expresión de tanto el gen SBEIIa como el gen SBEIIb en el brazo largo del cromosoma 2A.

La planta puede ser una planta de trigo Durum que puede comprender además una variación genética que conduzca una actividad reducida de enzima ramificador del almidón codificado por el gen SBEIIa en el brazo largo del cromosoma 2B respecto al grano de tipo salvaje. La variación genética adicional puede comprender la ausencia del gen SBEIIa del brazo largo del cromosoma 2B o una mutación del gen SBEIIa del brazo largo del cromosoma 2B que conduzca a una actividad reducida del enzima SBEIIa en el endospermo de dicho grano respecto al grano de tipo salvaje.

La planta puede ser Triticum aestivum ssp. aestivum que adicionalmente puede comprender una variación genética que conduzca a una actividad reducida de enzima ramificador del almidón codificado por el gen SBEIIa en el brazo o brazos largos del cromosoma 2B, del cromosoma 2D o de ambos cromosomas, respecto al grano de tipo salvaje. La variación genética adicional comprende una ausencia del gen SBEIIa de por lo menos uno de dichos cromosomas o una mutación del gen SBEIIa de por lo menos uno de dichos cromosomas que conduzca a una actividad reducida del enzima SBEIIa en el endospermo de dicho grano respecto al grano de tipo salvaje.

La planta puede presentar el ácido nucleico introducido que codifica el inhibidor de la expresión, actividad o ambas del gen SBEIIa. El nivel de actividad del enzima SBEIIa puede reducir en por lo menos el 40% respecto al grano de tipo salvaje. La proporción de amilosa en el almidón del grano es de por lo menos 50%. El grano puede ser no arrugado y puede presentar un peso medio de por lo menos aproximadamente 36 mg. Por lo menos 50% de los gránulos de almidón del grano pueden presentar una apariencia birrefringente observados bajo luz polarizada. El contenido de almidón del grano en estado desnudo, en una forma de la invención, es de por lo menos 25% (p/p) o presenta un contenido de almidón que es por lo menos 90% del contenido de almidón del grano de tipo salvaje.

La amilopectina del grano de cualquiera de las formas de la presente invención puede presentar una proporción reducida de la fracción de longitud de cadena de 4 a 12 dp respecto a la amilopectina del grano de tipo salvaje, según la medición realizada después de la desramificación de la amilopectina por parte de la isoamilasa.

El grano puede comprender además un nivel reducido de la proteína SBEI, de actividad del enzima SBEI o ambos, y puede comprender además un nivel alterado de un enzima respecto al grano de tipo salvaje, en el que dicho enzima se selecciona de entre el grupo que consiste de ADP glucosa pirofosforilasa, GBSS, SSI, SSII, SSIII, un enzima desramificador de tipo isoamilasa, un enzima desramificador de tipo pululanasa y cualquier combinación de los mismos.

Las formas de dicho décimo aspecto de la invención comprenden grano, gránulos de almidón extraídos del grano, y un producto producido a partir del grano o su almidón, tal como, por ejemplo, harina, harina integral o sémola.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1.: Secuencia del gen ramificador Star Branching Enzyme IIa (wSBE II-D1) [SEC ID nº 1] de A. tauschii, correspondiente al gen SBEIIa del genoma D del trigo hexaploide (T. aestivum).

Figura 2.: Secuencia génica parcial de SBEIIb del trigo (wbe2b genómico) [SEC ID nº 2] de T. aestivum.

Figura 3.: Esquema de los constructos de dúplex de ARN. El orden de los elementos génicos utilizados fue: promotor, secuencia del gen SBEIIa o SBEIIb (exones 1, 2 y 3) en orientación de sentido, intrón (intrón 3), secuencia del gen SBEIIa o SBEIIb (exones 1, 2, 3 y 4) en orientación antisentido y secuencia de terminador de transcripción/poliadenilación. B. El transcrito de los genes SBEIIa-ds y SBEIIb-ds forma una estructura de ARN de "horquilla" con una región de doble cadena formada mediante hibridación entre las secuencias de sentido y antisentido. La secuencia del intrón limitada por los nucleótidos GT y AG se desempalmó y se extrajo.

Figura 4.: Gránulos de almidón vistos a través de un microscopio óptico, procedentes de: A) una semilla de trigo con gránulos de almidón de tipo salvaje procedentes de la línea transgénica 83.1b de SBEIIa-ds, B) una semilla de trigo con gránulos de almidón distorsionados procedentes de la línea transgénica 50.1b de SBEIIa-ds.

Figura 5. Birrefringencia de gránulos de almidón de una semilla de trigo, tal como en la figura 4, visualizada bajo luz polarizada.

Figura 6. Comparación entre las secuencias parciales de ADNc de SBEIIa. sbe9 corresponde a parte de AF338432.1. Se muestran secuencias parciales de las siguientes: Y11282 [SEC ID nº 3], sr997 [SEC ID nº 4], sr995 [SEC ID nº 5] y sbe9 [SEC ID nº 6].

Figura 7. Comparación de PILEUP de secuencias parciales de SBEIIa de trigo basadas en los primeros 63 aminoácidos. Se indica la probable localización genómica de los genes correspondientes a los clones.

Figura 8.: Comparación entre las secuencias de aminoácidos deducidas del polipéptido del genoma D (sr854) [SEC ID nº 7] y el producto del genoma A o B (y11282) [SEC ID nº 8]. La secuencia de tránsito (posiciones 1 a 54) se presenta en cursiva.

Figura 9.: Amplificación por PCR de una región de intrón 3 del gen SBEIIb de diversos números de acceso de trigo (carriles 1 a 11) utilizando los cebadores ARA19F y ARA23R seguido de la digestión con Rsa1. Las bandas correspondientes a los genomas A, B y D se indican con flechas. El carril 3 (Aus17340) y el carril 5 (Aus10103) no presentan el marcador específico del genoma D, mientras que el carril 8 (Aus12509) y el carril 9 (Aus12565) no presentan el marcador del genoma B.

Figura 10.: Hibridación southern de ADN digerido con HindIII de números de acceso de trigo utilizando una sonda de la región del intrón 3 de SBEIIb. Los carriles corresponden a: 1) Aus12565, 2) Aus12509, 3) Aus10103, 4) CSDT2DL-4, 5) Aus12530 (trigo Durum), 6) CSDT2BL-9, 7) Aus6323, 8) CSDT2DS, 9) Aus17340, 10) Aus12745, 11) CSDT2DL-4, 12) Aegilops tauschii.

Figura 11.: Cribado de la población F2 del cruce Aus17340a X Aus12509 mediante amplificación por PCR de la región del intrón 3 de SBEIIb utilizando los cebadores AR2b19cF y AR2b23cR seguido de la digestión con RsaI. El carril 8 no presentaba ni el marcador del genoma B ni el del genoma D, de manera que la línea BD54 representa una línea doble nulo BD.

Figura 12.: Hibridación southern de clones BAC digeridos con HindIII (carriles 1 a 4) y con EcoRI (carriles 5 a 8) utilizando una sonda de la región del intrón 3 de SBEIIb. Los carriles corresponden a: 1) BAC 4, 2) BAC 5, 3) BAC 9, 4) BAC 12, 5) BAC 4, 6) BAC 5, 7) BAC 9, 8) BAC 12.

Figura 13.: A) FISH utilizando una sonda wSBEII-DA1 y una sonda de secuencia repetida de ADN (pSc 119.2) de cromosomas de A. tauschii (fotografía principal e inserción inferior) y cromosomas del trigo (inserción superior). B) FISH de sonda de SBEIIb de cromosomas del trigo.

Figura 14.: Análisis de SDS-PAGE de proteínas unidas a gránulo en líneas de trigo Chinese Spring (CS) de tipo salvaje y nula para SGP-1 en varios estadios de desarrollo de las semillas (10, 15 y 25 días después de la antesis, M=madura), según se indica. Se midió la intensidad de las bandas de proteínas de la imagen del gel teñido con plata. Se normalizó a 100 la intensidad de las bandas de GBSS en semillas CS maduras y la cantidad de los demás enzimas en el estadio del desarrollo indicado se expresa como porcentaje de GBSS en CS maduras. a) GBSS, b) SSI, c) SBEII. Las columnas negras se refieren a nulo para SGP-1. Se muestra un electroforetograma en gel ejemplificativo para las proteínas unidas a gránulo procedentes de las líneas CS y nula para SGP-1.

Figura 15.: Cantidades relativas de SBEIIa y SBEIIb en la fracción soluble. Se escanearon los filtros inmunológicos del SDS-PAGE y se midió la intensidad de las bandas de proteínas de las imágenes. Se evaluaron las cantidades de proteínas a partir de las proteínas de fusión de SBEIIa y de SBEIIb utilizadas como estándares en los geles.

Figura 16.: A. Cromatografía de intercambio aniónico de las actividades del enzima ramificador del endospermo del trigo (cv Rosella). Se fraccionaron las proteínas solubles del endospermo con sulfato amónico y se cromatografiaron en una columna Sephacryl S-200 previamente a la aplicación a una columna de intercambio aniónico Resource Q. B) Análisis de inmunodetección utilizando un anticuerpo anti-WBE1 del SBEI del endospermo del trigo separado en un PAGE no desnaturalizante. Las bandas de proteína SBEI denominadas A y B son productos de los genomas A y B, respectivamente, y Di y Dii son los productos del genoma D. Los carriles correspondientes a los extractos de: 1. CS, carril 2. N7BT7A, carril 3. N7AT7B, carril 4. N7DT7A. C) Análisis de inmunodetección de fracciones purificadas que representan los picos activos en el cromatograma de intercambio aniónico utilizando el anticuerpo anti-WBE 1. Carril 1: extracto soluble crudo de endospermo; carril 2: fracciones que representan el pico 1; carril 3: fracción que representa el pico 2.

Figura 17.: Cribado de progenie haploide duplicada del cruce VC3.1.11 X CS7AL-15 para la segregación de las isoformas de SBEI mediante inmunodetección utilizando anticuerpo anti-WBE I. Los carriles 1 a 14 corresponden a líneas de progenie haploide duplicada. El carril 6 es una línea mutante de SBEI triple nula denominada A113, y el carril 7 es una línea normal para las isoformas de SBEI denominadas D28.

Figura 18.: Amplificación mediante PCR de ADN procedente de semillas mutantes inducidas con rayos gamma (carriles 1 a 6) del cruce Veery 3 X Gabo 1BL.1RS utilizando los cebadores AR2b19cF/AR2b23cR. El carril 2 representa la semilla mutante MLT2B8, y el carril 7 representa Chinese Spring.

Figura 19.: Amplificación mediante PCR de ADN procedente de líneas de trigo utilizando cebadores específicos para el genoma A para el gen SBEIIa del trigo, ARIIaAF/ARIIaAR. Los carriles en el orden de 1 a 5

son: CS, MLT2B8, MLT2D1, Dt2AS y BD219 (planta que es mutante nula para tanto SBEIIa como SBEIIb en los genomas tanto B como D).

Figura 20.: Cromatograma en gel de sefarosa CL 2B de almidón de líneas de trigo, a) Acc144008, y b) Acc 144087, realizado utilizando un kit de ensayo de almidón (Sigma).

Figura 21.: Comparación de perfiles de longitud de cadenas de almidones de líneas transgénicas de trigo con respecto al del control no transformado, NB1 (trigo). Se substrajo el porcentaje de la masa total de oligosacáridos individuales de almidones del control no transformado, de los valores correspondientes de almidones de líneas transgénicas. Las muestras eran: 085 (♦), 0,25 (▲), 008 (O).

Descripción detallada de la invención

Alteración de SBEIIa en el trigo

La invención se basa en el resultado de que una reducción de la actividad de SBEIIa en el endospermo del trigo resulta en una modificación de la producción del almidón, particularmente en niveles relativos elevados de amilosa en el grano del trigo. Este inesperado resultado contrasta con los resultados obtenidos con el maíz y el arroz, en los que la mutación de SBEIIa no alteró el perfil amilopectina/amilosa (Blanth et al., 2001; Nakamura, 2002). En una forma de realización adicional, existe una alteración en una o más actividades adicionales de enzima biosintético del almidón, tales como una reducción de la actividad de SBEIIb y de SBEIIa. La mutación de los genes codificantes de dichas dos actividades se encuentra apoyada por el resultado inesperado de que SBEIIa y SBEIIb están estrechamente ligadas en el trigo, en contraste con la falta de ligamiento en el maíz y en el arroz. Los presentes inventores también han encontrado, inesperadamente, que el grano de la planta del trigo que presenta niveles reducidos de actividad de SBEIIa y de SBEIIb es no arrugado.

Procedimiento de producción de una planta del trigo

En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento para producir una planta del trigo que presenta almidón alterado en su grano, en particular para incrementar la proporción de amilosa en el almidón hasta por lo menos 50%. Habitualmente, en los trigos hexaploide y duro, la proporción de amilosa en el almidón se encuentra comprendida entre aproximadamente 18% y aproximadamente 30%, en determinados mutantes (deficientes en SGP-1) hasta aproximadamente 35%. En una forma de realización, el procedimiento de la invención comprende la etapa de introducir la variación genética en una planta o semilla de trigo madre, con el fin de proporcionar plantas del trigo que producen grano que presenta almidón que comprende por lo menos 50% de amilosa. La proporción de amilosa en el almidón tal como se define en la presente memoria se proporciona en peso/peso (p/p), es decir, el peso de amilosa como porcentaje del peso de almidón del grano. En las formas de realización adicionales, la proporción de amilosa en el almidón es de por lo menos 50%, de por lo menos 55%, de por lo menos 60%, de por lo menos 65%, de por lo menos 70% o de por lo menos 75% (cada uno en p/p). En las formas de realización adicionales de la invención, el procedimiento proporciona una proporción de amilosa de por lo menos 80% o de por lo menos 90% (p/p).

En una forma de realización adicional, el procedimiento incluye alterar, preferentemente reducir, el nivel de proteína enzima ramificador IIa del almidón (SBEIIa), de la actividad enzimática o de ambas en el endospermo del trigo. Es decir, una variación genética que se introduce en la planta del trigo conduce, directa o indirectamente, al cambio del nivel de SBEIIa y en consecuencia a las modificaciones del almidón mencionadas en la presente memoria. En una forma de realización adicional no mutuamente excluyente respecto a la forma de realización adicional, el procedimiento comprende la alteración, preferentemente la reducción, del nivel de expresión del gen SBEIIa en el endospermo del trigo, o comprende la mutación de un gen SBEIIa en el trigo, de manera que se reduce la actividad de SBEIIa en el endospermo. Puede conseguirse una reducción del nivel de expresión del gen SBEIIa o de otros genes mediante la introducción de un ácido nucleico, por ejemplo un transgén, que codifique una molécula inhibidora que sea una molécula antisentido, cosupresora, ribozima o dúplex de ARN que presente como diana el gen SBEIIa.

Tal como se utiliza en la presente memoria, los términos "alterar", "incrementar", "incrementado", "reducir", "reducido", "inhibido" o similares se consideran términos relativos, es decir, en comparación con el estado de tipo salvaje o no alterado. El "nivel de una proteína" se refiere a la cantidad de una proteína particular, por ejemplo SBEIIa, que puede medirse mediante cualesquier medios conocidos en la técnica tal como, por ejemplo, el análisis de transferencia western u otro medio inmunológico. El "nivel de una actividad enzimática" se refiere a la cantidad de un enzima particular medido en un ensayo enzimático. Se aprecia que el nivel de actividad de un enzima puede alterarse en un mutante pero no el nivel de expresión (cantidad) de la proteína misma. A la inversa, podría alterarse la cantidad de proteína, pero la actividad permanece igual en el caso de que se produzca una proteína más o menos activa. Las reducciones de tanto la cantidad como la actividad también resultan posibles, tales como, por ejemplo, al inactivar un gen codificante del enzima. En determinadas formas de realización, la reducción del nivel de proteína o de actividad es de por lo menos 40% o de por lo menos 60% en comparación con el nivel de proteína o actividad en el endospermo del trigo no modificado, o de por lo menos 75%, de por lo menos 90% o de por lo menos 95%. La reducción del nivel de proteína o de actividad enzimática o de expresión génica puede producirse en cualquier estadio del desarrollo del grano, en particular durante el estadio de rellenado del grano, mientras se sintetiza el almidón en el endospermo en desarrollo, o en todos los estadios de desarrollo del grano hasta la madurez.

Se define "almidón" en la presente memoria como un polisacárido constituido esencialmente de unidades de αglucopiranosa. El almidón es el carbohidrato de reserva principal en el trigo; se sintetiza en los amiloplastos y se forma y se almacena en gránulos. Incluye amilosa, un polímero de α-1,4-D-glucopiranosa esencialmente lineal, y amilopectina, que presenta cadenas cortas de unidades α-D-glucopiranosa unidas principalmente por enlaces α-1,4 con ramas unidas mediante enlaces α-1,6. El almidón del trigo de las plantas de tipo salvaje comprende entre aproximadamente 20% y 30% de amilosa y entre aproximadamente 70% y 80% de amilopectina. Una diferencia significativa adicional entre las dos moléculas es su peso molecular. La amilosa presenta una conformación helicoidal con un peso molecular de entre 104 y 106 Da, mientras que la amilopectina presenta un peso molecular de entre aproximadamente 107 y 108 daltons. Algunos estudios recientes han demostrado la presencia de incluso aproximadamente 0,1% de sitios de ramificación α-1,6-glucosídica en la amilosa, por lo que se describe como "esencialmente lineal". La "amilosa" se define en la presente memoria como incluyendo moléculas esencialmente lineales compuestas de unidades glucosídicas (glucopiranosa) unidas mediante enlaces α-1,4 y amilopectina de cadena larga similar a amilosa (en ocasiones denominada "material intermedio" o "amilopectina similar a amilosa"; Takeda et al., 1993b; Fergason, 1994). El contenido de amilosa puede determinarse mediante cualquiera de los procedimientos conocidos de la técnica, incluyendo la HPLC de exclusión por tamaño, por ejemplo en DMSO al 90% (p/v), los procedimientos basados en la concanavalina A (Megazyme Int., Irlanda) o preferentemente los procedimientos yodométricos, por ejemplo tal como se describe en el Ejemplo 1. El procedimiento de HPLC puede implicar la desramificación del almidón (Batey y Curtin, 1996) o no implicar ninguna desramificación. A partir del peso del grano y del contenido de amilosa, puede calcularse la cantidad de amilosa depositada en cada grano y compararse en líneas transgénicas y de control.

En otra forma de realización, el procedimiento comprende la etapa que consiste en determinar la cantidad o la actividad de SBEIIa en el endospermo del trigo utilizando cualquier procedimiento conocido en la técnica. En una forma de realización determinada, se mide el nivel de la proteína, por ejemplo mediante procedimientos de inmunodetección tales como la transferencia western o los ensayos ELISA, o se mide el nivel del ARNm correspondiente mediante procedimientos bien conocidos de la técnica, tales como el análisis de hibridación northern o la transcriptasa inversa-reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR). En otra forma de realización, el procedimiento comprende la etapa de seleccionar o cribar para una planta o grano del trigo que presenta un nivel alterado de proteína o actividad enzimática de SBEIIa en su endospermo. La etapa de selección puede basarse en un nivel reducido de actividad o proteína SBEIIa, o puede basarse en el fenotipo del grano de la planta del trigo, tal como una proporción incrementada de amilosa o una proporción reducida de amilopectina, o un fenotipo visual, por ejemplo grano arrugado o alteración de las propiedades del gránulo de almidón.

Se apreciaría que la invención incluyese un procedimiento para identificar una planta del trigo con las propiedades alteradas del almidón en su grano utilizando cualquiera de los procedimientos indicados en la presente memoria, determinando directamente las propiedades del almidón, o indirectamente, por ejemplo, detectando la presencia de una variación genética en la planta o en su grano. La planta puede ser una planta en una población de plantas del trigo, tal como, por ejemplo, en el cultivo del trigo.

La actividad de SBE puede medirse directamente mediante ensayo enzimático, por ejemplo mediante el ensayo de estimulación de fosforilasa (Boyer y Preiss, 1978). Este ensayo mide la estimulación por parte de SBE de la incorporación de glucosa 1-fosfato en polímero (α-D-glucano) insoluble en metanol por parte de la fosforilasa a. La actividad de SBE puede medirse mediante el ensayo de tinción con yodo, que mide la reducción de la absorbancia de un complejo de glucano-poliyodo, resultando de la ramificación de los polímeros de glucano. La actividad de SBE también puede someterse a ensayo mediante el ensayo de unión de ramificaciones, que mide la generación de extremos reductores a partir de amilosa reducida como sustrato tras la digestión con isoamilasa (Takeda et al., 1993a). Preferentemente, la actividad se mide en ausencia de actividad de SBEI o SBEIIb. Las isoformas de SBE muestran diferentes especificidades de sustrato, por ejemplo SBEI muestra una actividad más alta en la amilosa ramificada, mientras que SBEIIa y SBEIIb muestran tasas de ramificación más altas con un sustrato amilopectina. Las isoformas también pueden distinguirse basándose en la longitud de la cadena de glucano que se transfiere. La proteína SBE también puede medirse mediante la utilización de anticuerpos específicos, tales como los indicados en la presente memoria. La actividad de SBEII puede medirse durante el desarrollo del grano en el endospermo en desarrollo, o alternativamente en el grano maduro, en el que la proteína todavía se encuentra presente en granos equivalentes, aunque no alterados, y puede someterse a ensayo mediante procedimientos inmunológicos.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un procedimiento para alterar, preferentemente para reducir, la actividad de múltiples enzimas de biosíntesis del almidón en el endospermo de trigo, en el que uno de los enzimas es SBEIIa, de manera que la proporción de amilosa en el almidón del grano sea de por lo menos 50%. En determinadas formas de realización, los niveles de las proteínas o actividades enzimáticas de SBEIIa y SBEIIb se encuentran reducidas o los niveles de la totalidad de los tres, SBEIIa, SBEIIb y SBEI, se encuentran reducidos. Otros enzimas de la biosíntesis del almidón que pueden alterarse en combinación con SBEIIa son: SSI, SSII y SSIII. También pueden alterarse los enzimas desramificadores del almidón, por ejemplo la actividad de la isoamilasa o de la pululanasa. También se proporciona cualquier combinación de los enzimas anteriormente indicados, con la condición de que SBEIIa se encuentre alterado. En una forma de realización adicional, se altera la actividad de uno

: o más enzimas de la biosíntesis del almidón en la planta en tejidos que no son el endospermo, por ejemplo puede incrementarse la actividad de SBEI o de SBEII en las hojas, para compensar cierta pérdida de actividad causada por un transgén codificante de una molécula inhibidora de SBEIIa destinada principalmente a la expresión en el endospermo. La alteración puede ser un incremento o una reducción de la cantidad, o una alteración en la temporización de la expresión, por ejemplo. Alternativamente, la síntesis del almidón puede mejorarse adicionalmente mediante la sobreexpresión de uno o más enzimas biosíntesis del almidón en combinación con una reducción de SBEIIa. Los genes codificantes de dichos enzimas pueden proceder de cualquiera de entre una diversidad de orígenes, por ejemplo de bacterias o de otras fuentes aparte del trigo, y pueden modificarse para alterar las propiedades catalíticas, por ejemplo para alterar la dependencia térmica de los enzimas (por ejemplo ver el documento WO nº 94/09144).

El fenotipo de elevado contenido en amilosa puede conseguirse mediante la inhibición parcial o total de la expresión del gen SBEIIa, o de los genes SBEIIa y SBEIIb. El grado de inhibición del gen o genes en cierto grado determinará las características del almidón fabricado en el grano de trigo. Cualquiera de entre un abanico de técnicas de electroforesis en gel utilizadas con las proteínas extraídas del endospermo modificado del trigo revelará la naturaleza y grado de la modificación de la actividad de SBEIIa y/o de SBEIIb. La modificación puede producirse como una reducción de la actividad de SBEIIa y/o de SBEIIb, como la anulación completa de la actividad enzimática,

: o como una alteración de la distribución de SBEIIb o de otros enzimas dentro del endospermo. Para llevar a cabo dichos ensayos, puede extraerse el almidón del endospermo del trigo y analizarse las proteínas en el mismo, por ejemplo tal como se describe en Rahman et al., 1995. Se llevan a cabo técnicas bien conocidas de la técnica, tales como SDS-PAGE e inmunotransferencia, en las fracciones soluble y de gránulos del almidón, y los resultados se utilizan para identificar las plantas o granos en los que se han producido modificaciones en los enzimas SBEIIa y/o SBEIIb.

Plantas del trigo

En un aspecto adicional, la invención proporciona una planta del trigo capaz de producir grano que presenta una proporción de amilosa en el almidón de por lo menos 50%. En una forma de realización adicional, la proporción de amilosa es de por lo menos 55%, de por lo menos 60%, de por lo menos 65%, de por lo menos 70% o de por lo menos 80%. En otra forma de realización, la planta del trigo cuyo grano comprende cualquier de dichos niveles de amilosa en su almidón, comprende una variación genética que conduce a una reducción del nivel de expresión del gen SBEIIa, de la actividad del enzima SBEIIa en el endospermo, o a ambos, respecto al grano de tipo salvaje. En una forma de realización preferida, la variación genética comprende una mutación de un gen SBEIIa o un ácido nucleico introducido que codifica un inhibidor de la expresión del gen SBEIIa. El inhibidor puede comprender un ARN antisentido, cosupresor, ribozima o dúplex de ARN que inhibe la expresión y/o actividad de SBEIIa.

Una planta del trigo se define en la presente memoria como cualquier planta de una especie del género Triticum, especie que se cultiva comercialmente, incluyendo, por ejemplo Triticum aestivum L. ssp. aestivum (trigo común o panificable), otras subespecies de Triticum aestivum, Triticum turgidum L. ssp. durum (trigo Durum, también conocido como trigo macaroni o trigo duro), Triticum monococcum L. ssp. monococcum (trigo einkorn o trigo espelta pequeña), Triticum timopheevi spp. timopheevi, Triticum turgidum L. ssp. dicoccon (trigo emmer cultivado) y otra subespecies de Triticum turgidum (Feldman). El trigo puede ser trigo hexaploide, que presenta un genoma de tipo AABBDD, o trigo tetraploide, con un genoma de tipo AABB. Debido a que la variación genética en el trigo según la invención puede transferirse a determinadas especies relacionadas, incluyendo el centeno y la cebada, mediante hibridación, la invención también incluye las especies híbridas formadas de esta manera, incluyendo el Triticale, que es un híbrido entre el trigo panificable y el centeno. En una forma de realización particular, la planta del trigo es de la especie Triticum aestivum, y preferentemente de la subespecie aestivum. Alternativamente, debido a que las mutaciones o transgenes pueden transferirse fácilmente del Triticum aestivum al trigo Durum, el trigo preferentemente es Triticum turgidum L. ssp. durum.

La invención proporciona asimismo plantas del trigo con un nivel reducido en el endospermo de proteína SBEIIa, de actividad enzimática o de ambas, siendo capaz la planta del trigo de producir grano de la invención, presentando almidón que comprende una proporción incrementada de amilosa en comparación con el almidón extraído de las plantas de tipo salvaje. El nivel reducido de SBEIIa puede producirse durante por lo menos parte del proceso de desarrollo del grano, o durante todo el proceso hasta la madurez. En una forma de realización adicional, se reduce el nivel de SBEIIa en el endospermo en por lo menos el 50%, en por lo menos el 75%, en por lo menos el 90% o en por lo menos 95%, en comparación con el tipo salvaje. La expresión "tipo salvaje" presenta su significado normal del campo de la genética e incluye cultivares o genotipos de trigo que no han sido modificados tal como se enseña en la presente memoria.

La invención también proporciona plantas y grano progenie que presentan las características deseadas de las plantas de trigo madres, de genotipo y/o de fenotipo. La invención también se extiende a cualquier material de propagación de las plantas del trigo que pueda utilizarse para producir las plantas con las características deseadas, tales como tejido o células cultivadas.

La invención también comprende plantas del trigo que presentan niveles alterados, preferentemente reducidos, de SBEIIb o de otros enzimas biosintéticos del almidón además de una actividad reducida de SBEIIa. Las plantas que presentan actividades reducidas de SBEIIa y de SBEIIb pueden producirse mediante el cruce de una planta con nivel reducido de SBEIIa con una planta con nivel reducido de SBEIIb, o mediante la introducción de un transgén codificante de una molécula que inhibe la expresión de tanto el gen SBEIIa como del gen SBEIIb. Debido al estrecho ligamiento de los genes SBEIIa y SBEIIb en el trigo, tal como se da a conocer en la presente memoria, las plantas que presentan niveles reducidos de ambas actividades también pueden producirse mediante la identificación de variedades que no presenten las isoformas de SBEIIa y SBEIIb codificadas por uno de los genomas del trigo, y el cruce de dichas variedades para producir una planta con un nivel reducido de las isoformas codificadas por como mínimo dos genomas.

La invención también comprende la variación o variaciones genéticas o mutaciones en otros fondos genéticos o en otras especies que pueden hibridarse con la planta del trigo tal como se ha indicado anteriormente. Las plantas alteradas (mutantes) pueden cruzarse con plantas que contengan un fondo genético más deseable. Tras el cruce inicial, puede llevarse a cabo un número adecuado de retrocruces para eliminar el fondo menos deseable. El fondo genético deseado puede incluir una combinación adecuada de genes que proporcionen un rendimiento comercial, y otras características tales como el rendimiento agronómico o la resistencia al estrés abiótico. El fondo genético también podría incluir otros genes alterados de biosíntesis o modificación del almidón, por ejemplo genes de otras líneas de trigo que presenten un endospermo arrugado en los que el gen causal sea desconocido.

Las plantas pueden ser transgénicas o no transgénicas.

La invención también proporciona plantas del trigo que comprenden una mutación en la que se encuentra ausente el gen SBEIIa del brazo largo del cromosoma 2A (2AL) o en la que el gen SBEIIa en el brazo largo del cromosoma 2A comprende una mutación que conduce a un nivel reducido de actividad del enzima SBEIIa en el endospermo de dicho grano respecto al grano de tipo salvaje. A pesar de un cribado extensivo de 2.400 números de acceso de trigo, los inventores no encontraron plantas de este tipo que fuesen naturales, sugiriendo que la selección para la retención del gen SBEIIa funcional en 2AL podría estar produciéndose en la naturaleza. Sin embargo, pudieron producirse estas plantas e identificarse tras la mutagénesis. Estas plantas son no transgénicas, lo que resulta deseable en algunos mercados. Estas plantas pueden ser trigo panificable, trigo Durum u otro tipo de trigo. En una forma de realización preferida, la planta del trigo comprende una deleción de por lo menos parte del gen SBEIIa, que puede extenderse a por lo menos parte del gen SBEIIb, en el cromosoma 2AL. Tal como se entiende en la técnica, los trigos hexaploides tales como el trigo panificable comprenden tres genomas que se denominan comúnmente genomas A, B y D, mientras que los trigos tetraploides tales como el trigo Durum comprenden dos genomas denominados comúnmente genomas A y B. Cada genoma comprende 7 pares de cromosomas que pueden observarse mediante procedimientos citológicos durante la meiosis. Los cromosomas se denominan comúnmente en orden según su tamaño de más grande a más pequeño, siendo el cromosoma-2, por lo tanto, el segundo cromosoma más grande en cada genoma. Cada cromosoma presenta un centrómero, que en el cromosoma 2 se encuentra situado asimétricamente; por lo tanto, los dos brazos del cromosoma 2 se denominan "corto" y "largo". El "brazo largo del cromosoma 2A" se define en la presente memoria como la región de dicho cromosoma entre el centrómero y la punta a lo largo del brazo largo, según el significado estándar del término. Las expresiones "brazo largo del cromosoma 2B" y "brazo largo del cromosoma 2D" se definen del mismo modo, excepto en que se refieren al cromosoma 2 de los genomas B o D del trigo, respectivamente.

Los presentes inventores han descubierto que los genes SBEIIa y SBEIIb se encuentran estrechamente ligados en el cromosoma 2 del trigo. En una forma de realización particular, la planta del trigo comprende la mayoría (>50%) de 2AL, comprendiendo este brazo cromosómico una mutación de por lo menos el gen SBEIIa. Es decir, el cromosoma 2AL se encuentra esencialmente presente, comprendiendo una mutación en por lo menos el gen SBEIIa del genoma

A. La presencia de 2AL puede determinarse mediante técnicas citológicas tales como, por ejemplo, las técnicas de hibridación in situ (ver el Ejemplo 9) o mediante la utilización de marcadores moleculares específicos de 2AL. En una forma de realización preferida, la planta del trigo es homocigótico para dicha mutación. La mutación puede ser una mutación nula. La mutación puede ser una deleción.

En una forma de realización particular, el alelo con deleción se deriva de las plantas MLT2B8 ó MLT2D1. Debido a que los alelos mutantes de SBEIIa en estas plantas se encuentra en el cromosoma 2AL, estos alelos pueden introducirse en variedades de trigo panificable o trigo Durum mediante cruce, y la invención por lo tanto incluye planta y grano y productos de almidón obtenidos a partir de los mismos. Estos alelos pueden combinarse con otros genes o alelos de biosíntesis del almidón útiles, o con otros rasgos genéticos útiles.

La invención comprende procedimientos para producir o identificar dichas plantas del trigo o al grano producido por dichas plantas.

Grano

La invención también proporciona grano de trigo que comprende un almidón alterado en comparación con almidón extraído del grano de trigo de tipo salvaje. Se define el grano en la presente memoria como grano esencialmente maduro. Lo anterior incluye grano tal como se recolecta en un contexto comercial. En una forma de realización, el almidón alterado es por lo menos parcialmente una consecuencia de una actividad reducida de SBEIIa durante el desarrollo del endospermo del grano de trigo. En una forma de realización adicional, que no es mutuamente excluyente con la forma de realización anterior, el grano comprende una proporción incrementada de amilosa (en porcentaje del total de almidón). Lo anterior puede determinarse como proporción reducida de amilopectina en el almidón en comparación con grano de una planta de tipo salvaje. El almidón del trigo de tipo salvaje presenta aproximadamente 20% a 30% de amilosa y 70% a 80% de amilopectina. El grano de la invención comprende almidón que comprende por lo menos 50% (p/p) de amilosa. En una forma de realización adicional, se encuentran reducidas las actividades tanto de SBEIIa como de SBEIIb durante el desarrollo del endospermo. En una forma de realización adicional, también se reduce la actividad de SBEI. En formas de realización adicionales, la proporción de amilosa, medida mediante procedimientos bien conocidos de la técnica, es de por lo menos 55%, de por lo menos 60%, de por lo menos 65%, de por lo menos 70%, de por lo menos 75%, de por lo menos 80% o de por lo menos 90% (cada uno en p/p) del almidón del grano. Los niveles incrementados de amilosa pueden ponerse de manifiesto por una morfología anormal de los gránulos de almidón o una pérdida de birrefringencia de los gránulos observados bajo un microscopio óptico u otro procedimiento conocido en la técnica. En una forma de realización particular, se mide la proporción de amilosa mediante un procedimiento yodométrico, que puede ser un procedimiento espectrofotométrico tal como, por ejemplo, el procedimiento de Morrison y Laignelet (1983) o mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC, por ejemplo Batey y Curtin, 1996).

En formas de realización adicionales, el grano de trigo comprende almidón que presenta características físicas alteradas, tales como, por ejemplo, una temperatura de gelatinización incrementada o reducida, características de hinchado alteradas durante o después de la gelatinización, viscosidad alterada, una distribución alterada de longitudes de cadena en la amilopectina, o cualquier combinación de los mismos. La temperatura incrementada o reducida de gelatinización puede referirse al primer pico de gelatinización, el segundo pico, o ambos. Una o más propiedades del almidón, tales como, por ejemplo, la entalpia de gelatinización, puede no encontrarse alteradas. La temperatura del primer pico (ápex) de gelatinización medida mediante calorimetría de barrido diferencial puede incrementar en por lo menos 3ºC ó 5ºC, preferentemente en por lo menos 7ºC ó 8ºC, y más preferentemente en por lo menos 10ºC en comparación con la temperatura del primer pico para el almidón correspondiente del grano de tipo salvaje. En una forma de realización particular, el incremento se encuentra comprendido en el intervalo de 3ºC a 12ºC.

El grano puede ser arrugado ("shrunken") o no arrugado presentando preferentemente un fenotipo no arrugado. La expresión "no arrugado" tal como se utiliza en la presente memoria se define como el caso en que la mayoría de los granos, preferentemente por lo menos 90% de los granos individuales, muestra un fenotipo carnoso o totalmente lleno. Éste habitualmente se asocia a un nivel normal o prácticamente normal de acumulación de almidón. En contraste, un fenotipo "arrugado" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a que la mayoría de granos, en particular a que por lo menos 90% de los granos, presente una acumulación reducida de almidón. El grano ligeramente arrugado se refiere a una reducción del contenido medio de almidón de por lo menos 30%, el grano moderadamente arrugado se refiere a una reducción del contenido medio de almidón de por lo menos 50%, el grano altamente arrugado se refiere a una reducción del contenido medio de almidón de por lo menos 70%, cada uno respecto al grano de tipo salvaje. El grado de "rugosidad" también puede medirse a partir del contenido relativo de almidón, como porcentaje del peso del grano maduro. El grano de trigo cultivado en el campo no alterado presenta un contenido de almidón de aproximadamente 65%, mientras que en el grano arrugado éste se ha reducido a menos del 50%.

En formas de realización adicionales, el grano presenta un peso medio de por lo menos 36 ó 40 mg. El peso medio del grano se determina mediante medición del peso de un número conocido de granos, siendo una muestra representativa del lote de grano, y dividiendo el peso total por el número de granos. Se aprecia que las características del grano, tales como el contenido de almidón, el peso medio y un fenotipo no arrugado, a niveles prácticamente de tipo salvaje resultarían deseables para la producción comercial del grano.

La invención también proporciona harina, harina integral, masa u otros productos producidos a partir del grano o utilizando el grano. Estos pueden ser no tratados o tratados, por ejemplo mediante fraccionamiento o blanqueado. La invención proporciona además grano de trigo que resulta útil para la producción de alimentos obtenidos de la planta del trigo de la invención. Además, la invención comprende grano que ha sido tratado de otras maneras, de manera que el grano puede haber sido molido, triturado, laminado, perlado, tronzado o partido, o precocido (polenta), por ejemplo como el cuscús.

Almidón

En otro aspecto, la invención proporciona almidón obtenido a partir del grano de las plantas del trigo tal como se describe en la presente memoria, presentando el almidón una proporción incrementada de amilosa y una proporción reducida de amilopectina. En una forma de realización preferida, el almidón se obtiene a partir del grano de una planta del trigo que presenta un nivel reducido de la proteína SBEIIa, de actividad del enzima SBEIIa en el endospermo, o de ambas, respecto al trigo de tipo salvaje. En una forma de realización adicional, se reduce tanto la actividad de SBEIIa como de SBEIIb, o se reduce la totalidad de las tres actividades, SBEIIa, SBEIIb y SBEI, respecto al trigo de tipo salvaje.

En un aspecto adicional, la invención proporciona almidón obtenido del grano de las plantas del trigo tal como se describe en la presente memoria, que comprende por lo menos 50%, por lo menos 55%, por lo menos 60%, por lo menos 65%, por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80% o por lo menos 90% de amilosa. El almidón ha sido por lo menos parcialmente purificado, es decir, ha sido separado de por lo menos otro componente del grano. El almidón purificado puede obtenerse del grano mediante un procedimiento de molienda, por ejemplo un procedimiento de molienda en húmedo, que implica la separación del almidón de las proteínas, aceite y fibra. El producto inicial del procedimiento de molienda es una mezcla o composición de gránulos de almidón, y la invención, por lo tanto, comprende dichos gránulos, que comprenden el almidón modificado tal como se describe en la presente memoria.

El almidón puede presentar una temperatura de gelatinización incrementada o reducida, preferentemente una temperatura de gelatinización incrementada. En formas de realización particulares, por lo menos una de entre la temperatura al inicio del primer pico o la temperatura en el ápex del primer pico se incrementa en por lo menos 3ºC, en por lo menos 5ºC, en por lo menos 7ºC o en por lo menos 10ºC según mediciones de DSC en comparación con el almidón extraído del grano de trigo de tipo salvaje. En una forma de realización particular, el incremento se encuentra comprendido en el intervalo de entre 3ºC y 12ºC. Cabe destacar que la temperatura de gelatinización puede presentar una temperatura reducida al inicio del primer pico en combinación con una temperatura incrementa en el ápex del pico. En otra forma de realización que no es mutuamente excluyente con la anterior, el almidón presenta una temperatura de gelatinización alterada del primer pico pero muestra una temperatura sustancialmente inalterada en el segundo pico, que corresponde a la disociación amilosa-lípido, según se determina mediante DSC. En una forma de realización adicional, el almidón muestra una entalpía reducida durante la gelatinización, tal como, por ejemplo, una reducción de por lo menos 25% o de por lo menos 40% en comparación con la correspondiente al almidón de trigo de tipo salvaje.

En otra forma de realización, el almidón comprende un nivel elevado de almidón resistente, con una estructura alterada indicada por características físicas específicas. Dichas características pueden incluir la inaccesibilidad física a los enzimas digestivos, lo que puede producirse por presentar una morfología alterada de los gránulos de almidón, la presencia de cantidades apreciables de lípidos asociados al almidón, una cristalinidad alterada, una distribución alterada de la longitud de cadena de la amilopectina, o cualquier combinación de los mismos. La elevada proporción de amilosa también contribuye al nivel de almidón resistente.

La invención también proporciona almidón de grano de la planta del trigo ejemplificada que comprende cantidades incrementadas de fibra dietética, preferentemente en combinación con un nivel elevado de almidón resistente. Este incremento también es, en parte, resultado del nivel relativo elevado de amilosa.

La invención comprende procedimientos para producir el almidón de trigo indicado en la presente memoria. En una forma de realización, el procedimiento comprende las etapas que consisten en obtener grano de trigo tal como se indica en la presente memoria y extraer el almidón del grano. El grano de trigo puede obtenerse mediante cultivo de plantas del trigo indicadas en la presente memoria y la recolección del grano, o de un producto del grano o de un importador del grano.

Procedimientos para reducir la actividad génica

La expresión y/o actividad de SBEIIa, SBEIIb o de otros genes de biosíntesis o modificación del almidón pueden alterarse mediante la introducción de una o más variaciones genéticas en la planta del trigo. Tal como se utiliza en la presente memoria, "variación genética" se refiere a cualquier alteración heredable en el genoma de la planta del trigo que, en el presente contexto, afecte a la expresión o actividad del gen de interés. Entre las variaciones genéticas se incluyen mutaciones tales como las mutaciones puntuales, las inserciones, las sustituciones, las inversiones, las duplicaciones, las traslocaciones y preferentemente las deleciones, y la introducción de uno o más transgenes en el genoma.

Las expresiones "molécula de ácidos nucleicos" y "secuencia de ácidos nucleicos" tal como se utilizan en la presente memoria se refieren a un polímero de nucleótidos, que puede ser de una sola cadena o de doble cadena. Puede comprender ADN tal como, por ejemplo, ADN genómico o ADNc, o ARN, ARNm o cualquier combinación de los mismos. Para la introducción en células del trigo, puede modificarse químicamente una molécula de ácidos nucleicos para mejorar su administración o estabilidad, o protegerse como parte de un vector, tal como un vector vírico. La molécula de ácidos nucleicos puede obtenerse mediante técnicas de clonación o sintetizarse mediante técnicas bien conocidas de la técnica. La molécula de ácidos nucleicos puede comprender una cadena codificante o no codificante (antisentido) o una combinación de ellas, tal como, por ejemplo, en constructos de repeticiones invertidas. En referencia a las secuencias de ácidos nucleicos que "corresponden" a un gen, el término "corresponden" se refiere a una relación entre secuencias de nucleótidos, de manera que la secuencia de nucleótidos presenta una secuencia de nucleótidos que es igual al gen de referencia o a una parte indicada del mismo, o que presenta una secuencia de nucleótidos que es exactamente complementaria en el apareamiento de bases normal de Watson-Crick, o es un equivalente de ARN de dicha secuencia, por ejemplo un ARNm, o es un ADNc derivado a partir de un ARNm del gen.

Las secuencias de nucleótidos se presentan en la presente memoria mediante una secuencia de una sola cadena en la dirección 5' a 3', utilizando las abreviaturas estándares de una letra para los nucléotidos. El término "complementario" se refiere a la relación entre dos moléculas o secuencias de una sola cadena de ácidos nucleicos que se hibridan mediante apareamiento de bases. Por ejemplo, 5'-GACT-3' se aparea con su complemento, 5'-AGTC-3'. El término "homología" u "homólogo" se refiere a la similitud o identidad de secuencia entre dos o más secuencias de nucleótidos o entre dos o más secuencias polipeptídicas, según el contexto. La expresión "porcentaje de identidad" tal como se aplica a secuencias de nucleótidos se refiere al porcentaje de correspondencias de nucleótidos entre dos secuencias de nucleótidos alineadas utilizando un algoritmo estandarizado tal como, por ejemplo, el algoritmo CLUSTAL V o los programas de secuenciación Blastn o BLAST 2 disponibles del National Center for Biotechnology Information, disponible en Internet en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/, y preferentemente ajustado en parámetros por defecto. De manera similar, "porcentaje de identidad" puede referirse a secuencias de polipéptidos.

La referencia en la presente memoria a un "gen", incluyendo un gen SBEIIa, SBEIIb u otro gen biosintético del almidón, o genes codificantes de moléculas de ARN antisentido, cosupresor, ribozima o dúplex o similares, debe interpretarse en su contexto más amplio, e incluye un gen genómico clásico que presenta una región transcrita asociada a regiones reguladoras, tales como promotores y secuencias de terminador de transcripciónpoliadenilación. La región transcrita incluye secuencias transcritas pero no traducidas (secuencias no traducidas, UTR) y opcionalmente puede incluir una región codificante de proteína o intrón, que se desempalman y extraen formando un ARN maduro, o cualquier combinación de ellos. Un "gen" incluye formas obtenidas a partir de ADNc, correspondientes a exones, y genes de ARN tales como los presentes en genomas de ARN. El término "gen" también se utiliza para describir moléculas sintéticas o de fusión codificantes de la totalidad o parte de un producto funcional.

En el caso de que se encuentre presente en una célula, preferentemente en una célula de trigo, un "gen" dirige la "expresión" de una molécula "biológicamente activa" o "producto génico", que puede ser ARN o un polipéptido. Este procedimiento se produce más comúnmente mediante transcripción para producir ARN y mediante traducción para producir proteína. Dicho producto puede modificarse posteriormente en la célula. El ARN puede modificarse mediante, por ejemplo, poliadenilación, corte y empalme, adición de caperuza, fragmentación en fragmentos de 21 a 23 nucleótidos, o exportación del núcleo o mediante interacciones covalentes o no covalentes con proteínas. Las proteínas pueden modificarse mediante, por ejemplo, fosforilación, glucosilación o lipidación. Todos estos procedimientos se encuentran comprendidos en la expresión "expresión de un gen" o similar tal como se utiliza en la presente memoria.

Tal como se utilizan en la presente memoria, las expresiones "gen SBEIIa del trigo" y "gen SBEIIb del trigo" y expresiones relacionadas se refieren a los genes que han sido identificados del trigo que codifican los enzimas SBEIIa o SBEIIB, respectivamente, y genes homólogos presentes en otras variedades del trigo. Entre ellas se incluyen, aunque sin limitación, las secuencias génicas listadas en la Tabla 1. Se entiende que existe variación natural en las secuencias de los genes SBEIIa y SBEIIb de diferentes variedades de trigo. Los genes homólogos son fácilmente reconocibles por el experto en la materia. El grado de identidad de secuencia entre genes SBEIIa homólogos o las proteínas se cree que es de por lo menos 90%, de manera similar a los genes o proteínas SBEIIb.

Los genes para la utilización en la invención pueden derivarse a partir de un SBEIIa, SBEIIb u otro gen biosintético del almidón natural mediante técnicas de recombinación estándares. Una "molécula de ácidos nucleicos recombinante" o expresión similar tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una secuencia que no es natural o que presenta una secuencia construida mediante una combinación artificial de dos o más segmentos de secuencia de otro modo separados. Esta combinación artificial puede formarse mediante síntesis química o, más comúnmente, mediante la manipulación artificial de segmentos aislados de ácidos nucleicos, por ejemplo mediante técnicas de ingeniería genética bien conocidas de la técnica. El término "recombinante" incluye ácidos nucleicos que han sido alterados únicamente mediante adición, sustitución o deleción de una parte del ácido nucleico. Con frecuencia, un ácido nucleico recombinante puede incluir una secuencia de ácidos nucleicos operablemente ligada a una secuencia de promotor. Dicho ácido nucleico recombinante puede ser parte de un vector que se utiliza, por ejemplo, para transformar una célula.

Generalmente, un gen puede someterse a mutagénesis para producir sustituciones, deleciones y/o adiciones individuales o múltiples de nucleótidos, por ejemplo la modificación de codones. Entre los derivados por inserción de nucleótidos de dichos genes se incluyen las fusiones 5' y 3'-terminales, así como las inserciones intrasecuencia de nucleótidos individuales o múltiples. Las variantes de secuencia por inserción de nucleótidos son aquéllas en las que se introducen uno o más nucleótidos en un sitio predeterminado en la secuencia de nucleótidos, aunque también resulta posible la inserción aleatoria con el cribado adecuado del producto resultante. Las variantes por deleción se caracterizan por la eliminación de uno o más nucleótidos de la secuencia. Las variantes por sustitución de nucleótidos son aquéllas en las que por lo menos un nucleótido en la secuencia ha sido eliminado y se ha insertado un nucleótido diferente en su sitio. Dicha sustitución puede ser "silenciosa" en el sentido de que la sustitución no

cambia el aminoácido definido por el codón. Alternativamente, se diseñan sustituyentes conservadores para alterar un aminoácido por otro aminoácido de acción similar. Las sustituciones típicas son las realizadas según lo siguiente: Residuos adecuados para las sustituciones conservadoras de aminoácidos

Sustituciones

Residuo original: ejemplificativas

Ala: Ser

Arg: Lys

Asn: Gln, His

Asp: Glu

Cys: Ser

Gln: Asn

Glu: Asp

Gly: Ala

His: Asn, Gln

Ile: Leu, Val

Leu: Ile, Val

Lys: Arg, Gln, Glu

Met: Leu, Ile

Phe: Met, Leu, Tyr

Ser: Thr

Thr: Ser

Trp: Tyr

Tyr: Trp, Phe

Val: Ile, Leu

Transgenes

La expresión y/o actividad de SBEIIa, SBEIIb u otros genes de biosíntesis o modificación del almidón pueden alterarse mediante la introducción de uno o más transgenes en la planta del trigo. El término "transgén" tal como se utiliza en la presente memoria presenta el significado normal de la técnica de la biotecnología e incluye una secuencia genética que ha sido producida o alterada mediante tecnología de ADN o ARN recombinante y que ha sido introducida en el organismo o célula, preferentemente célula de trigo, de interés. El transgén puede incluir secuencias genéticas derivadas del organismo o célula, por ejemplo una secuencia antisentido. El transgén típicamente incluye un ácido nucleico exógeno que no se deriva de dicho organismo o célula. El término "transgénico" se refiere al organismo o célula que contiene un transgén. La expresión "no transgénico" se refiere a la ausencia de cualquier transgén en el genoma. Un transgén preferentemente se integra en el genoma del organismo

o célula, para su herencia estable.

El experto en la materia apreciará que la expresión de un gen, o de una secuencia complementaria al mismo, en una célula, requiere que dicho gen se sitúe en relación operable con una secuencia de promotor. La elección de promotor para el presente objetivo puede variar dependiendo del nivel de expresión necesario y/o del tejido, órgano y especie en el que debe producirse la expresión, en particular los promotores específicos del endospermo.

La situación de una molécula de ácidos nucleicos bajo el control regulador de una secuencia de promotor implica situar dicha molécula de manera que la expresión se encuentre contlaminada por la secuencia de promotor. Un promotor habitualmente, aunque no necesariamente, se encuentra situado cadena arriba, o en el extremo 5', de la molécula de ácidos nucleicos que regula. Además, los elementos reguladores que comprenden un promotor habitualmente se sitúan a menos de 2 kb del sitio de inicio de transcripción del gen. Durante la construcción de las combinaciones heterólogas de promotor/gen estructural, generalmente resulta preferente situar el promotor a una distancia del sitio de inicio de transcripción del gen que sea aproximadamente la misma que la distancia entre el promotor y el gen que controla en su contexto natural (es decir, el gen a partir del que se deriva el promotor). Tal como es conocido en la técnica, existe cierta flexibilidad en la variación de esta distancia sin pérdida de función del promotor. De manera similar, el posicionamiento preferido de un elemento de secuencia reguladora con respecto a un gen heterólogo que deba situarse bajo su control se define por la situación del elemento en su contexto natural (es decir, el gen del que se deriva). Nuevamente, tal como es conocido en la técnica, también puede darse cierta variación en la distancia.

Entre los ejemplos de promotores adecuados para la utilización en constructos génicos de la presente invención se incluyen promotores derivados de genes de virus, levaduras, mohos, bacterias, insectos, aves, mamíferos y plantas, preferentemente los que pueden funcionar en las células vegetales, más preferentemente los que pueden expresarse en el endospermo del trigo. El promotor puede regular la expresión constitutivamente, o diferencialmente, con respecto al tejido en el que se produce la expresión. Alternativamente, la expresión puede ser diferencial con respecto al estadio de desarrollo en el que se produce la expresión, o en respuesta a estímulos externos tales como tensiones fisiológicas o la temperatura.

El procedimiento para reducir la actividad de SBEIIa o de otro gen biosintético del almidón puede comprender la etapa de introducir un transgén en una célula regenerable de trigo y regenerar una planta de trigo transgénica a partir de la célula transformada. Entre los enzimas ramificadores implicados en la síntesis de la amilopectina se incluyen SBEI, SBEIIa y SBEIIb, y la invención comprende una expresión reducida de SBEIIa solo o en combinación con la alteración de la expresión de SBEIIb o de SBEI. Por lo tanto, el transgén o transgenes pueden inactivar más de uno de estos genes. Además, la inactivación de SBEIIb y/o de SBEI puede ser directa, en el aspecto de que el transgén (por ejepmlo codificante de ARN dúplex, antisentido o ARN ribozima, ver posteriormente) presenta como diana directa la expresión del gen SBEIIb o SBEI, o puede resultar indirectamente en la alteración de la expresión de SBEIIb o de SBEI. Por ejemplo, el transgén de ARN puede presentar como diana únicamente el gen SBEIIa/ARN en términos de identidad de secuencia o apareamiento de bases, aunque resultar también en la reducción de la actividad de SBEIIb o de SBEI al alterar la estabilidad o distribución de las proteínas en el endospermo. Además, algunas formas de la presente invención residen en la combinación de una actividad alterada de SBEIIa y una alteración de otro u otros enzimas de síntesis de la amilopectina, entre los que pueden incluirse SSI, SSII, SSIII y enzimas desramificadores tales como la isoamilasa o la pululanasa. La expresión de cualquiera de ellos, o de la totalidad de ellos, podría resultar alterada por la introducción de un transgén.

Se conocen varias secuencias de ADN de los genes de síntesis de la amilopectina en el trigo, cualquiera de las cuales podría ser la base para el diseño de transgenes para inactivar los genes en el trigo. Entre ellas se incluyen SBEIIa (números de acceso de GenBank Y11282, AF338431 y AF338432) y SBEIIb (documentos WO 00/15810 y 01/62934). El gen SBEI del trigo se describe en Rahman et al. (1997) y en Rahman et al. (1999). La secuencia de SBEI de Triticum tauschii, que es altamente homóloga respecto al gen SBEI del genoma D del trigo, puede encontrarse en la memoria de patente publicada WO 99/14314. Puede accederse a una secuencia de ADNc para el SBEI del trigo en la base de datos GenBank bajo el número de acceso AF076679. También pueden utilizarse homólogos de otros genes de síntesis de la amilopectina procedentes de la cebada o de otras especies estrechamente relacionadas, para modificar los niveles de expresión génica en el trigo. Dichos genes o fragmentos de los mismos pueden obtenerse mediante procedimientos bien conocidos de la técnica, incluyendo la amplificación por PCR o la hibridación con sondas marcadas.

La expresión de "condiciones astringentes de hibridación" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a que la hibridación generalmente se produce en el caso de que exista una identidad de secuencia de por lo menos 90% y preferentemente de por lo menos 95%, entre la sonda y la secuencia diana. Son ejemplos de condiciones astringentes de hibridación la incubación durante la noche en una solución que comprende formamida al 50%, 5xSSC (1xSSC=NaCl 150 mM, citrato trisódico 15 mM), fosfato sódico 50 mM (pH 7,6), 5x solución de Denhardt, dextrán sulfato al 10% y 20 µg/l de ADN portador fragmento y desnaturalizado, tal como ADN de esperma de salmón, seguido del lavado del soporte de hibridación en 0,1 x SSC a aproximadamente 65ºC. Otras condiciones de hibridación y lavado son bien conocidas y se ejemplifican en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor, NY, 1989, en particular el capítulo 11.

La región o regiones de los homólogos utilizadas para preparar el constructo de transgén debería presentar una identidad de por lo menos 85% con el gen del trigo correspondiente, preferentemente por lo menos 90% y todavía más preferentemente una identidad de 95% a 100% en la región apropiada. También resulta preferente que el transgén con diana específicamente en los genes de síntesis de la amilopectina expresados en el endospermo del trigo y presenta un efecto menor o mínimo sobre la síntesis de la amilopectina en otros sitios de la planta. Lo anterior puede conseguirse mediante la utilización de secuencias reguladoras adecuadas tales como promotores específicos del endospermo en el transgén.

Antisentido

Los enfoques a la ingeniería genética para alterar, en particular específicamente reducir, la actividad génica en plantas tales como el trigo son bien conocidos de la técnica. Entre estos procedimientos se incluyen la introducción de constructos génicos para la expresión de una molécula antisentido adecuada que es complementaria al ARN del gen diana y puede hibridarse con el mismo. Se cree que las moléculas antisentido interfieren con la traducción o procesamiento o estabilidad del ARNm del gen diana, inactivando de esta manera la expresión del gen. Los procedimientos para diseñar secuencias antisentido son bien conocidos de la técnica y pueden encontrarse ejemplos de ellos en la patente estadounidese nº 5190313, la memoria de patente europea 0467349-A1, la memoria de patente europea nº 0223399-A1 y la memoria de patente europea nº 0240208, que se incorporan como referencia en la presente memoria. La utilización de procedimientos con secuencias antisentido en plantas ha sido revisada en Bourque (1995) y Senior (1998). Bourque lista un gran número de ejemplos de inactivación génica utilizando secuencias antisentido en sistemas vegetales. También afirma que alcanzar una inhibición del 100% de una actividad enzimática puede no resultar necesario, debido a que la inhibición parcial resultará más probablemente en un cambio medible en el sistema. Senior (1998) indica que los procedimientos que utilizan secuencias antisentido en la actualidad son técnicas muy bien establecidas para manipular la expresión génica en plantas.

Las moléculas antisentido para SBEIIa, SBEIIb y SBEI del trigo o para otros genes de biosíntesis o modificación del almidón pueden basarse en las secuencias de ARNm del trigo o derivarse a partir de secuencias homólogas de ADN o ARNm obtenidas de otras especies, por ejemplo de la cebada. Las secuencias antisentido pueden correspondiente a la totalidad o parte de los transcritos de cualquiera de estos genes o a secuencias que controlan su expresión, por ejemplo su corte y empalme. La secuencia de antisentido puede corresponder a una región codificante diana de SBEIIa del trigo u otro gen, o la región 5' no traducida (UTR) o la UTR 3' o una combinación de ellas. Puede ser complementaria en parte respecto a secuencias de intrón, que pueden cortarse y empalmarse durante o después de la transcripción, preferentemente sólo respecto a secuencias de exón del gen diana. En vista de la divergencia generalmente mayor de las UTRs, utilizar como diana estas regiones proporciona una mayor especificidad de inhibición génica. En las formas de realización particulares, la longitud de la secuencia antisentido es de por lo menos 19 nucleótidos contiguos, por lo menos 50, por lo menos 100, por lo menos 200, por lo menos 500 ó por lo menos 1.000 nucleótidos, correspondiente al complemento de la secuencia de ARN del gen. Puede utilizarse la secuencia de longitud completa complementaria del transcrito entero del gen. En una forma de realización particular, la longitud de la secuencia antisentido es de entre 100 y 2.000 nucleótidos. En las formas de realización adicionales, el grado de identidad de secuencia de la secuencia antisentido respecto al complemento del transcrito diana es de por lo menos 85%, de por lo menos 90% o de entre 95% y 100%. La molécula de ARN antisentido puede evidentemente comprender secuencias no relacionadas que pueden funcionar estabilizando la molécula.

Cosupresión

Otro enfoque biológico molecular que puede utilizarse es la cosupresión. El mecanismo de cosupresión no se entiende bien pero se cree que implica el silenciamiento génico post-transcripcional (PTGS) y que, en este aspecto, podría ser muy similar a muchos ejemplos de supresión con secuencias antisentido. Implica introducir una copia adicional de un gen o un fragmento del mismo en una planta en la orientación de sentido con respecto a un promotor para su expresión. El tamaño del fragmento de sentido, su correspondencia con las regiones génicas diana, y su grado de identidad de secuencia con el gen diana son equivalentes a los de las secuencias antisentido indicadas anteriormente. En algunos casos, la copia adicional de la secuencia génica interfiere con la expresión del gen vegetal diana. Se hace referencia a la memoria de patente WO 97/20936 y a la memoria de patente europea 0465572 para procedimientos para implementarla los enfoques de cosupresión.

Silenciamiento génico mediado por ARN de doble cadena

Un procedimiento adicional que puede utilizarse para introducir variación genética en la planta del trigo es el silenciamiento génico mediado por ARN dúplex o de doble cadena. Este procedimiento también implica el PTGS. En este procedimiento, se introduce un ADN que dirige la síntesis de uno o más productos de ARN por lo menos parcialmente de doble cadena con homología con el gen diana que debe inactivarse. Por lo tanto, el ADN comprende secuencias tanto de sentido como antisentido que, al transcribirse en ARN, pueden hibridarse para formar la región de ARN de doble cadena. En una forma de realización preferida, las secuencias de sentido y antisentido se encuentran separadas por una región espaciadora que comprende un intrón que, al transcribirse en ARN, se desempalma. SE ha demostrado que esta disposición resulta en una eficiencia más alta del silenciamiento génico. La región de doble cadena puede comprender una o dos molécula de ARN, transcritas a partir de una o dos regiones del ADN. La presencia de la molécula de doble cadena induce una respuesta de un sistema endógeno de la planta que destruye tanto el ARN de doble cadena como también el transcrito de ARN homólogo del gen vegetal diana, reduciendo o eliminando eficientemente la actividad del gen diana. Se hace referencia a la memoria de patente australiana 99/29514-A y a la memoria de patente WO 99/53050 para procedimientos de implementación de esta técnica. En formas de realización particulares, la longitud de las secuencias de sentido y antisentido que se hibridan es de por lo menos 19 nucleótidos contiguos, de por lo menos 30, de por lo menos 50, de por lo menos 100, de por lo menos 200, de por lo menos 500 ó de por lo menos 1.000 nucleótidos. Puede utilizarse la secuencia de longitud completa correspondiente al transcrito entero del gen. En una forma de realización particular, las longitudes se encuentran comprendidas en el intervalo de entre 100 y 2.000 nucleótidos. En formas de realización adicionales, el grado de identidad de secuencia de las secuencias de sentido y antisentido respecto al transcrito diana es de por lo menos 85%, de por lo menos 90% o de entre 95% y 100%. La molécula de ARN evidentemente puede comprender secuencias no relacionadas que pueden funcionar estabilizando la molécula. La molécula de ARN puede expresarse bajo el control de un promotor de ARN polimerasa II o ARN polimerasa III. Entre los ejemplos de estos últimos se incluyen los promotores de ARNt o de ARNsn. La molécula de ARN de doble cadena también puede comprender secuencias de más de un gen unidas entre sí y de esta manera presentar como diana múltiples genes.

Ribozimas

La variación genética responsable de la inactivación deseada de la expresión génica en el trigo puede comprender una molécula de ácidos nucleicos codificante de uno o más ribozimas. Los ribozimas son moléculas de ARN con función enzimática o catalítica que pueden cortar otras moléculas de ARN en sitios específicos definidos por una o con frecuencia dos secuencias hibridantes. El corte del ARN inactiva la expresión del gen diana. Los ribozimas también pueden actuar como una molécula antisentido, lo que podría contribuir a la inactivación génica. Los ribozimas contienen uno o más dominios catalíticos, preferentemente del tipo cabeza de martillo o del tipo horquilla, entre las secuencias hibridantes. Pueden utilizarse otros motivos ribozima, incluyendo ARNasaP, intrones de grupo I

o II y tipos de virus de la hepatitis delta. Se hace referencia a la memoria de patente europea nº 0321201 y a la patente US nº 6.221.661. La utilización de ribozimas para inactivar genes en plantas transgénicas ha sido demostrado, por ejemplo, por Wegener et al., 1994.

Constructos/vectores génicos

La invención también proporciona moléculas aisladas de ácidos nucleicos que comprenden ARN o ADN, preferentemente ADN, que codifican la molécula inhibidora de gen. En determinadas formas de realización, las moléculas de ácidos nucleicos codificante moléculas de ARN o ribozima antisentido, de sentido (cosupresoras) de doble cadena que presentan como diana la secuencia del gen SBEIIa del trigo y que inactivan su expresión en el endospermo del grano del trigo. La invención también proporciona constructos génicos que comprenden o codifican la molécula aislada de ácidos nucleicos, que comprenden uno o más elementos reguladores, tales como promotores, intensificadores y secuencias de terminación de transcripción o de poliadenilación. Dichos elementos son bien conocidos de la técnica. Los constructos genéticos también pueden comprender secuencias de intrón que ayudan a la expresión del transgén en las plantas, particularmente en plantas monocotiledóneas tales como el trigo. El término "intrón" se utiliza en su sentido normal como referido a un segmento genético que se transcribe pero que no codifica una proteína y que se desempalma de un ARN antes de la traducción. Pueden incorporarse intrones en una región UTR 5' o en una región codificante en el caso de que el transgén codifique un producto traducido, o en cualquier sitio en la región transcrita en el caso de que no lo haga.

La invención proporciona además vectores, por ejemplo vectores plásmidos, que comprenden los constructos genéticos. El término "vector" incluye un vector de expresión, que es capaz de expresión in vitro o in vivo, y un vector de transformación, que es capaz de ser transferido de una célula u organismo a otro. Los vectores comprenden secuencias que proporcionan la replicación en las células, por ejemplo en células procarióticas tales como E. coli o Agrobacterium. En una forma de realización particular, el vector es un vector binario que comprende una secuencia de ADN-T, definida por, como mínimo, una secuencia de límite de ADN-T, que puede introducirse en células de trigo. La invención proporciona además células que comprenden los vectores, por ejemplo células de Agrobacterium

o de trigo, que pueden ser células regenerables tales como las células del escutelo de los embriones inmaduros. Alternativamente, las células pueden ser células de trigo transformadas que comprenden el transgén.

Promotores/terminadores

En otra forma de realización, el transgén u otro constructo genético de la invención incluye una región de inicio de transcripción (promotor) que puede proporcionar la expresión regulada o constitutiva en el endospermo del trigo. El promotor puede ser específico del tejido, confiriendo la expresión selectiva o exclusivamente en el endospermo. El promotor puede seleccionarse de entre promotores específicos del endospermo (tales como el promotor de glutenina de alto peso molecular, el promotor SSI del trigo, el promotor SBEII del trigo y el promotor GBSS del trigo)

o promotores no específicos del endospermo (tales como el promotor ubiquitina o los promotores CaMV35S ó 35S intensificado). El promotor puede ser modulado por factores tales como la temperatura, la luz o el estrés. Habitualmente, el promotor se proporciona en el lado 5' de la secuencia genética que debe expresarse. El constructo también puede contener otros elementos que intensifican la transcripción, tales como las regiones de poliadenilación nos 3' ó ocs 3' o los terminadores de transcripción. Las regiones del ADN ilustradas se incorporan en vectores que contienen secuencias de gen marcador seleccionable adecuadas y otros elementos, o en vectores que se han cotransformado con vectores que contienen dichas secuencias.

Procedimientos de transformación para el trigo

Los procedimientos de transformación de plantas monocotiledóneas tales como el trigo, es decir, para introducir variación genética en la planta mediante la introducción de un ácido nucleico exógeno, y para la regeneración de plantas de protoplastos o embriones vegetales inmaduros son bien conocidos de la técnica; ver, por ejemplo, Becker et al., 1994; Cheng et al., 1997; He et al., 1994; Hess et al., 1990; Nehra et al., 1994; Vasil et al., 1992; Vasil et al., 1993; Weeks et al., 1993; Weir et al., 2001; solicitud de patente australiana nº AU 7546094, solicitud de patente europea nº 709462, publicaciones de patente internacional WO nº 93/04178, nº 89/12012, nº 94/13822 y nº 99/14314. Los vectores que portan la secuencia de nucleótidos o constructo genético deseado y un marcador seleccionable pueden introducirse en células regenerables de trigo de plantas cultivadas a partir de tejidos o explantes, o sistemas vegetales adecuados, tales como protoplastos. El gen marcador seleccionable puede proporcionar resistencia a antibióticos o a herbicidas a las células de trigo, o permitir la utilización de sustratos tales como la manosa. El marcador seleccionable preferentemente confiere resistencia al asulam, a la geneticina o a la higromicina a las células de trigo. Las células de trigo regenerables proceden preferentemente del escutelo de embriones inmaduros, de embriones maduros, de callos derivados de estos, o del tejido meristemático.

La planta transformada puede contener un gen marcador seleccionable, o dicho gen puede eliminarse durante o después de la regeneración, por ejemplo mediante extracción del marcador seleccionable fuera del genoma o mediante segregación del gen marcador seleccionable respecto del transgén inhibidor de SBEIIa.

Las plantas en las que el transgén o la mutación han sido integrados en un cromosoma pueden seleccionarse mediante cribado mediante, por ejemplo, la utilización de una sonda de ácidos nucleicos adecuada específica para el transgén o la observación fenotípica. Puede utilizarse cualquiera de entre varios procedimientos para determinar la presencia de una planta transformada. Por ejemplo, puede utilizarse la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar secuencias que son únicas de la planta transformada, con detección de los productos amplificados mediante electroforesis en gel u otros procedimientos. Puede extraerse ADN de las plantas utilizando procedimientos convencionales y llevarse a cabo la reacción de PCR utilizando cebadores que distingan las plantas transformadas de las no transformadas. Por ejemplo, pueden diseñarse cebadores que amplifiquen una región de ADN del vector de transformación leyendo en el interior del constructo y el cebador inverso diseñado a partir del gen de interés. Estos cebadores únicamente amplifican un fragmento en el caso de que la planta haya sido transformada con éxito. Un procedimiento alternativo para confirmar un transformante positivo es mediante hibridación southern, que es bien conocida de la técnica. Las plantas que han sido transformadas o son mutantes también pueden identificarse, es decir distinguirse de las plantas no transformadas o de tipo salvaje, a partir de su fenotipo, por ejemplo conferido por la presencia de un gen marcador seleccionable, o la presencia de una proteína particular mediante procedimientos inmunológicos, o a partir de la ausencia de una proteína, por ejemplo la ausencia de la proteína SBEIIa en el endospermo según detección mediante ensayo ELISA o análisis de transferencia western. Una indicación utilizada en el cribado de dichas plantas también puede ser la observación de los rasgos fenotípicos del grano, por ejemplo mediante inspección visual o medición del grano arrugado, o el ensayo para un contenido elevado de amilosa, o la comprobación microscópica de la presencia de birrefringencia.

Mutación

La introducción de variación genética que conduzca a una actividad reducida del enzima SBEIIa o de otro enzima biosintético del almidón en el endospermo del trigo también puede conseguirse con las mutaciones apropiadas dentro del gen respectivo o secuencias reguladoras del gen. En el contexto de la presente solicitud, una "mutación inducida" es una variación genética inducida artificialmente que puede ser el resultado de la mutagénesis química, por radiación o basada biológicamente, por ejemplo la inserción de un trasposón o de ADN-T. El grado en el que el gen resulta inhibido determinará en cierto grado las características del almidón fabricado. Las mutaciones pueden ser por truncado o mutaciones nulas y es conocido que estas mutaciones presentan un impacto significativo sobre la naturaleza del almidón; sin embargo, una estructura alterada del almidón también resultará de una mutación parcial que reduzca suficientemente la actividad del enzima de síntesis de la amilopectina proporcionando la característica de interés en el almidón o grano del trigo. Otras reorganizaciones cromosómicas también pueden resultar efectivas y entre ellas pueden incluirse mutaciones por inserción, por deleción, por inversión, por duplicación o puntuales. Una "mutación nula" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una mutación que resulta en la pérdida completa o prácticamente completa de la actividad del gen de interés, tal como, por ejemplo, en el caso de que ya no se detecte la actividad del gen.

El gen SBEIIa se encuentra situado en el brazo largo del cromosoma 2. Resulta preferido que las mutaciones del gen o de otros genes, particularmente las mutaciones por deleción, se localicen en el gen de interés, por ejemplo el gen SBEIIa, o quizás extenderse al gen SBEIIb ligado, en el caso de un mutante doble. Un gen en el presente contexto incluye la región promotora y las señales de terminación de transcripción/poliadenilación, así como la región transcrita. La región transcrita incluye la región o regiones codificantes de proteína y las regiones 5' y 3' no traducidas del ARNm, así como cualquier región de intrón que pueda encontrarse presente. Las mutaciones del gen pueden encontrarse en cualquier región del gen o en una combinación de regiones, y podrían extenderse desde la alteración de únicamente un nucleótido, por ejemplo una mutación de desplazamiento de marco en la región codificante, a la deleción del gen completo. Las plantas que son homocigóticas para la variación genética resultan preferidas.

Las deleciones pueden ser de tamaño restringido, del orden de una o unos cuantos cientos, quizá 500, kilobases. En determinadas formas de realización, la deleción se extiende menos de unos cuantos miles de kilobases, o menos de 5 mil kilobases. Aunque la invención puede comprender deleciones más grandes, incluyendo una gran parte del brazo largo del cromosoma 2 del genoma respectivo, éstas no resultan preferidas debido a que el brazo largo del cromosoma 2 presenta algunos otros genes localizados en el mismo que presentan un impacto sobre el vigor de la planta del trigo. De acuerdo con lo anterior, en el caso de que se produzcan deleciones grandes, éstas impactan negativamente sobre el vigor de la planta y por lo tanto sobre su viabilidad comercial y se desea que se encuentre presente por lo menos una mayoría del brazo largo del cromosoma 2. En una forma de realización preferida, la mayoría del brazo largo del cromosoma 2A se encuentra presente.

Puede conseguirse la mutagénesis por medios químicos o de radiación, por ejemplo mediante el tratamiento de las semillas con EMS o azida sódica (Zwar y Chandler, 1995), o con irradiación gamma. El aislamiento de los mutantes puede conseguirse mediante el cribado de plantas o semillas mutagenizadas. Por ejemplo, puede cribarse una población mutagenizada de trigo para un contenido elevado de amilosa en el grano y/o una distribución de longitudes de cadena de la amilopectina más larga de lo normal, o la pérdida de la proteína SBEIIa mediante ELISA,

o para alteraciones de la morfología del grano (Green et al., 1997). El cribado preferentemente se realiza en un genotipo del trigo que ya carezca de una de las actividades de SBE, por ejemplo en un fondo negativo para SBEIIb. A continuación, pueden introducirse dichas mutaciones en fondos genéticos deseables mediante cruce del mutante con una planta del fondo genético deseado y realizando un número adecuado de retrocruzamientos para eliminar el fondo madre originalmente no deseado.

En otra forma de realización, la mutación afecta a la expresión o actividad de tanto el gen SBEIIa como el gen SBEIIb en el trigo. La identificación de dicha mutación es favorecida por el inesperado resultado de que los dos genes se encuentran estrechamente ligados en el trigo, en contraste con el maíz o el arroz. Las deleciones en un gen pueden extenderse fácilmente al otro gen, proporcionando un alelo nulo (mutación nula) para ambos genes. Este conocimiento también ayuda al cribado de variantes naturales que sean mutantes en ambos genes en por lo menos un genoma de trigo, y permite un cribado más sencillo para producir trigo con mutaciones combinadas en ambos genes en dos o tres genomas. Dicho trigo proporciona una fuente no transgénica rica en amilosa de grano de trigo y productos del mismo.

Las mutaciones en los genes codificantes de SBEIIa o de otros enzimas implicados en la síntesis de la amilopectina generalmente provocarán una proporción incrementada de contenido de amilosa. La cantidad de amilosa por grano individual puede incrementarse como consecuencia del desvío del flujo de carbono desde la amilopectina a la amilosa, o puede reducirse en el caso de que se produzca una reducción significativa de la producción de almidón por grano. En cualquier caso, se incrementa el nivel relativo de amilosa como porcentaje del almidón.

Las semillas con gránulos de almidón que presentan una forma distorsionada se han informado en la cebada rica en amilosa (Morell et al., 2003) y en maíz bajo en amilopectina (LAPS) que presenta aproximadamente 90% de amilosa en el almidón (Sidebottom et al., 1998).

La birrenfrigencia es la capacidad de una sustancia de refractar luz en dos direcciones; esto produce una cruz negra denominada "cruz maltesa" en cada gránulo de almidón al observarlo con un microscopio de luz polarizada. La birrefringencia es un indicador del grado de organización estructural ordenada de los polímeros dentro de los gránulos (Thomas y Atwell, 1999). La pérdida de birrefringencia en los gránulos del almidón se correlaciona generalmente bien con un contenido incrementado de amilosa.

Adecuado para la producción de alimentos

En otro aspecto, la invención proporciona trigo que resulta útil para la producción de alimentos, presentando el grano almidón que comprende un contenido relativamente alto de amilosa y un contenido reducido de amilopectina. Preferentemente, la planta del trigo a partir de la que se obtiene el grano presenta un nivel reducido de actividad de SBEIIa en el endospermo durante el desarrollo. La planta de trigo de la presente invención resulta útil para la producción de alimentos y en particular para la producción comercial de alimentos. Dicha producción de alimentos podría incluir la preparación de harina, masa u otros productos que podrían ser un ingrediente en la producción comercial de alimentos.

El fondo genético deseado del trigo incluye consideraciones de rendimiento agronómico y otras características. Entre dichas características puede incluirse si se desea un tipo invernal o primaveral de trigo, el rendimiento agronómico, la resistencia a enfermedades y la resistencia al estrés abiótico. En Australia, puede resultar deseable cruzar el rasgo alterado del almidón en cultivos del trigo tales como Baxter, Kennedy, Janz, Frame, Rosella, Cadoux, Diamondbird u otras variedades cultivadas comúnmente. Los ejemplos proporcionados son específicos de una región de producción de Australia, y otras variedades resultarán adecuadas para otras regiones de cultivo. Resulta preferido que la variedad de trigo de la invención proporcione un rendimiento no inferior a 80% del correspondiente a la variedad de tipo salvaje en por lo menos algunas regiones de cultivo, más preferentemente no inferior a 90%, y todavía más preferentemente no inferior a 95%. El rendimiento puede medirse fácilmente en ensayos de campo contlaminados.

En formas de realización adicionales, el contenido de almidón del grano es de por lo menos aproximadamente 25%, 35%, 45% ó 55% a 65% (p/p). El trigo de tipo salvaje cultivado comercialmente presenta un contenido de almidón habitualmente comprendido en el intervalo de entre 55% y 65%, dependiendo en parte en el cultivar que se cultive. Alternativamente, el grano de la invención presenta un contenido de almidón de por lo menos 90% del de grano procedente de un trigo equivalente aunque no alterado. Los contenidos de almidón más bajos que los del tipo salvaje probablemente son una consecuencia de los niveles reducidos de amilopectina. Incluso con un menor contenido de almidón, el grano todavía podría resultar útil para la producción comercial de alimentos debido al valor relativamente elevado de los productos ricos en amilosa. Entre otras características deseables se incluyen la capacidad de moler el grano, en particular la dureza del mismo. Otro aspecto que podría incrementar el valor de una planta de trigo es el grado de extracción del almidón del grano, resultando más útiles las tasas más altas de extracción. El tamaño del grano también es otra característica que podría impactar sobre la utilidad comercial de una planta; de esta manera, el tamaño del grano puede presentar un impacto sobre la facilidad u otro aspecto con el que puede molerse el grano. Por ejemplo, una morfología alargada del grano puede dificultar la molienda y el procesamiento.

Un grano más lleno puede resultar más deseable en términos de alcanzar rendimientos mayores y de poder conseguir determinados beneficios de la invención, tales como la producción de almidón con niveles elevados de amilosa, o en el almidón alternativo, con una distribución alterada de las longitudes de cadena. De esta manera, el grano preferentemente presenta un fenotipo no-arrugado. Sin embargo, pueden conseguirse mejor otros aspectos de la invención con un grano menos lleno. De esta manera, la proporción de la capa de aleurona o germen o proteína a almidón puede ser más alta en el grano menos lleno, proporcionando de esta manera una harina de trigo u otro producto con un mayor contenido de los constituyentes beneficiosos de la capa de aleurona o de proteínas. El producto de capa de aleurona rica en constituyentes puede ser, de esta manera, más rico en determinadas vitaminas tales como folato, o puede ser más rico en determinados minerales tales como calcio, lo que combinado con niveles más altos de resistencia del almidón podría proporcionar efectos sinérgicos tales como proporcionar una incorporación incrementada de minerales en el intestino grueso.

El almidón se aísla fácilmente a partir del grano del trigo utilizando procedimientos estándares, por ejemplo el procedimiento de Schulman et al., 1991. A escala industrial puede utilizarse la molienda en húmedo o en seco. El tamaño del gránulo de almidón resulta importante en la industria del procesamiento del almidón, en donde se separan los gránulos A, más grandes, de los gránulos B, más pequeños. El almidón obtenido del grano de la planta del trigo de la invención presenta un contenido relativo alto de amilosa.

Características físicas del almidón alterado

La gelatinización es el colapso (ruptura) inducido por calor del orden molecular dentro del gránulo de almidón en exceso de agua, con cambios concomitantes irreversibles de propiedades tales como el hinchado granular, la fusión de cristalita, la pérdida de birrefringencia, el desarrollo de viscosidad y la solubilización del almidón. El almidón rico en amilosa de mutantes ae (extensor de amilosa) del maíz muestran una temperatura de gelatinización más alta que el maíz normal (Fuwa et al., 1999; Krueger et al., 1987). Por otra parte, el almidón procedente de los mutantes sex6 de la cebada que carecen de actividad de almidón sintasa IIa presentaban temperaturas de gelatinización más bajas y la entalpía del pico de gelatinización era más bajo que el de las plantas de control (Morell et al., 2003).

En otro aspecto de la invención, el almidón presenta una temperatura alterada de gelatinización según medición mediante calorimetría de barrido diferencial. Ésta puede encontrarse incrementada o reducida en comparación con el almidón de las plantas de tipo salvaje. La temperatura alterada de gelatinización puede encontrarse adicionalmente al contenido relativamente alto de amilosa. La temperatura de gelatinización del almidón de trigo de tipo salvaje típicamente es de aproximadamente 61ºC (Rahman et al., 2000) para la temperatura del primer pico, definido como la temperatura de inicio, medida mediante calorimetría de barrido diferencial.

El almidón también puede caracterizarse a partir de su tasa de hinchado en agua en exceso caliente en comparación con el almidón de tipo salvaje. El volumen de hinchado típicamente se mide mezclando un almidón o harina con un exceso de agua y calentando hasta temperaturas elevadas, típicamente superiores a 90ºC. A continuación, se recoge la muestra mediante centrifugación y se expresa el volumen de hinchado como masa de material sedimentado dividido por el peso seco de la muestra. Una característica de hinchado reducido resulta útil en el caso de que se desee incrementar el contenido de almidón de una preparación alimenticia, en particular de una preparación alimenticia hidratada.

La estructura del almidón del trigo de formas seleccionadas de la presente invención también puede diferir en el aspecto de que el grado de cristalinidad es menor en comparación con el almidón normal aislado del trigo. La cristalinidad reducida de un almidón también se cree que se asocia a propiedades organolépticas mejoradas y que contribuye a una sensación en boca más suave. De esta manera, el almidón adicionalmente puede mostrar una cristalinidad reducida, resultando de niveles reducidos de actividad de uno o más enzimas de síntesis de la amilopectina. La cristalinidad típicamente se investiga mediante cristalografía de rayos X.

Una medida de una estructura alterada de la amilopectina es la distribución de longitudes de cadena, o el grado de polimerización, del almidón. La distribución de las longitudes de cadena puede determinarse mediante la utilización de electroforesis de carbohidratos asistida por fluoróforos (FACE) tras la desramificación de la isoamilasa. La amilopectina del almidón de la invención puede presentar una distribución de longitudes de cadena comprendida en el intervalo de entre 5 y 60, que es mayor que la distribución del almidón de plantas de tipo salvaje tras la desramificación. El almidón con longitudes de cadenas mayores también presentará una reducción correspondiente de la frecuencia de ramificación. De esta manera, el almidón también puede presentar una distribución de longitudes de cadena más largas de la amilopectina en la amilopectina todavía presente.

Características de los alimentos

El almidón es la fuente principal de carbohidratos en la dieta humana, y el grano de la invención y los productos derivados a partir del mismo pueden utilizarse para preparar alimentos. Los alimentos pueden ser consumidos por el ser humano o por animales, por ejemplo en la producción de ganado o los alimentos para mascotas. El grano derivado de la planta del trigo alterada puede utilizarse fácilmente en procedimientos de procesamiento de alimentos, y por lo tanto la invención incluye grano molido, triturado, tronzado, perlado o laminado, o productos obtenidos a partir del grano tratado o integral de la planta del trigo a la que se ha hecho referencia anteriormente, incluyendo la harina. Estos productos seguidamente pueden utilizarse en diversos productos alimenticios, por ejemplo productos farináceos tales como panes, pasteles, galletas y similares, o aditivos alimenticios tales como espesantes o agentes ligantes, o para preparar bebidas, fideos, pasta o sopas rápidas. El grano o productos derivados a partir del grano de la invención resultan particularmente deseado en cereales para el desayuno o como productos extruidos. Los almidones ricos en amilosa de la invención también pueden utilizarse para formar geles de alta resistencia que resultan útiles en la industria pastelera, o que permiten tiempos más bajos de moldeo y curado. También pueden utilizarse como recubrimiento, por ejemplo para reducir la absorción de aceite en las patatas fritas

o en otros alimentos.

Fiebra dietética

La fibra dietética, en la presente memoria, es el carbohidrato, y los productos de digestión de los carbohidratos que no son absorbidos en el intestino delgado de las personas sanas entran en el intestino gruso. Entre estos productos se incluyen el almidón resistente, los β-glucanos y otros polímeros de carbohidrato solubles e insolubles. Se pretende que comprende aquella parte de los carbohidratos que es fermentable, por lo menos parcialmente, en el intestino grueso por parte de la microflora residente.

El almidón de la invención preferentemente contiene niveles relativamente altos de fibra dietética, más particularmente amilosa. El contenido de fibra dietética del grano de la presente invención puede resultar o no únicamente del contenido relativo incrementado de amilosa en el endospermo.

También surgen aspectos de la presente invención a partir de la combinación de la capa de aleurona y el germen en combinación con los niveles elevados de fibra dietética. Concretamente, lo anterior puede surgir en el caso de que se encuentren niveles relativos más altos de aleurona o de germen en el grano. En el caso de que el grano del trigo se encuentre ligeramente arrugado, el endospermo se encuentra presente en cantidades reducidas y la capa de aleurona y germen se encuentran presentes en cantidades relativamente elevadas. De esta manera, el trigo presenta un nivel relativamente alto de determinados elementos beneficiosos o vitaminas en combinación con un contenido elevado de almidón resistente, incluyendo dichos elementos cationes divalentes, Ca++ biodisponible y vitaminas tales como folato o antioxidantes tales como tocoferoles o tocotrienoles. Una forma específica de producto molido podría ser en la que la capa de aleurona se encuentra incluida en el producto molido. Puede llevarse a cabo un procedimiento particular de molienda para incrementar la cantidad de capa de aleurona en el producto molido. De esta manera, cualquier producto derivado del grano molido o tratado de otro modo para que incluya la capa de aleurona y el germen presentará beneficios nutricionales adicionales, sin necesidad de añadir estos elementos de fuentes separadas.

Almidón resistente

Se define el almidón resistente como la suma del almidón y los productos de digestión del almidón no absorbidos en el intestino delgado de seres humanos sanos pero que entra en el intestino grueso. De esta manera, el almidón resistente excluye los productos digeridos y absorbidos en el intestino delgado. Entre los almidones resistentes se incluyen el almidón físicamente inaccesible (forma RS1), los gránulos resistentes (RS2), los almidones retrogradados (RS3) y los almidones químicamente modificados (RS4). La estructura alterada del almidón y en particular los niveles altos de amilosa del almidón de la invención dan lugar a un incremento del almidón resistente al consumirlo en los alimentos. El almidón puede encontrarse en forma RS1, siendo parcialmente inaccesible a la digestión. La asociación de almidón-lípido medida por la cristalinidad del complejo V también es probable que contribuya al nivel de almidón resistente.

Se entiende que un beneficio de la presente invención es que proporciona productos que son de beneficio nutricional particular y además lleva a cabo lo anterior sin necesidad de modificar el almidón ni otros constituyentes del grano del trigo. Sin embargo, puede desearse realizar modificaciones en el almidón o en otro constituyente del grano, y la invención comprende dicho constituyente modificado. Los procedimientos de modificación son bien conocidos y entre ellos se incluyen la extracción del almidón o de otro constituyente mediante procedimientos convencionales y la modificación de los almidones para incrementar la forma resistente. El almidón puede modificarse mediante tratamiento con calor y/o humedad, físicamente (por ejemplo la molienda con bolas), enzimáticamente (utilizando, por ejemplo, la α-amilasa o la β-amilasa, la pululanasa o similares), la hidrólisis química (húmeda o seca utilizando reactivos líquidos o gaseosos), la oxidación, el enlace cruzado con reactivos difuncionales (por ejemplo trimetafosfato sódico, oxiclcouror fosforoso) o la carboximetilación.

Índice glucémico

El índice glucémico (GI) se refiere a la tasa de digestión de los alimentos que comprenden almidón y es una comparación entre el efecto de un alimento de ensayo y el efecto del pan blanco o la glucosa sobre las excursiones de concentración de la glucosa en sangre. El índice glucémico es una medida del efecto probable del alimento en cuestión sobre la concentración sérica post-prandial de glucosa y la demanda de insulina para la homeostasis de la glucosa en sangre. Una característica importante proporcionada por los alimentos del a invención es un índice glucémico reducido. Además, los alimentos pueden presentar un nivel bajo de digestión final y en consecuencia ser relativamente hipocalóricos. Un producto de bajo contenido calorífico puede basarse en la inclusión de harina producida a partir de grano de trigo molido. Dichos alimentos pueden presentar el efecto de ser saciantes, mejorar la salud intestinal, reducir la glucosa sérica postprandial y la concentración de lípidos, así como proporcionar un producto alimenticio de bajo contenido calorífico.

Aplicaciones no alimenticias

La presente invención proporciona almidones modificados o mejorados que presentan niveles elevados de amilosa o niveles reducidos de amilopectina, cuyas propiedades satisfacen cualquiera de entre diversos requisitos industriales. El almidón se utiliza ampliamente en industrias no alimenticias, entre ellas las industrias de películas, papel, textiles, corrugados y adhesivos (Young, 1984), por ejemplo como agente encolante. El almidón de trigo puede utilizarse como sustrato para la producción de jarabes de glucosa o para la producción de etanol. Las propiedades físicas del almidón no modificado limita su utilidad en algunas aplicaciones y con frecuencia impone un requisito de modificación química que puede ser caro o presentar otras desventajas. La invención proporciona almidón para el que pueden resultar necesarias menos modificaciones posrecolección, en particular debido al contenido reducido de amilopectina, en combinación con otras propiedades físicas. Por ejemplo, puede alterarse la temperatura de gelatinización, la resistencia a tensiones de cizalla, la resistencia de la película y/o la resistencia al agua de los almidones y de los productos preparados a partir del grano de la presente invención. El almidón también puede utilizarse para preparar un material de empaquetamiento de relleno suelto biodegradable que puede utilizarse como sustituto del poliestireno o de otros materiales de empaquetamiento.

Se entenderá que, aunque se proporcionan diversas indicaciones respecto a aspectos de la presente invención, la invención puede residir en combinaciones de dos o más aspectos de la presente invención.

Ejemplos

Ejemplo 1. Materiales y procedimientos

Determinación y análisis de carbohidratos

Se aisló almidón a partir de grano de trigo utilizando el procedimiento de Schulman et al. (1991). Se determinó el contenido de almidón utilizando el kit de análisis del almidón total suministrado por Megazyme (Bray, Co., Wicklow, República de Irlanda). A continuación, se comparó el contenido de almidón con el de las plantas de control. La substracción del peso de almidón del peso total del grano, proporcionando un contenido total no almidón del grano, determina si la reducción de peso total se debe a una reducción del contenido de almidón.

Se determinó el contenido de amilosa de muestras de almidón mediante el procedimiento colorimétrico (yodométrico) de Morrison y Laignelet (1983) con ligeras modificaciones, del modo siguiente. Se introdujeron aproximadamente 2 mg de almidón (con precisión de 0,1 mg) en 2 ml un tubo de tapa enroscable con una arandela de goma en la tapa. Para eliminar los lípidos, se mezcló 1 ml de metanol al 85% (v/v) con el almidón y se calentó el tubo en un baño de agua a 65ºC durante 1 hora con agitación con vórtex ocasional. Tras centrifugar a 13.000g durante 5 minutos, se separó cuidadosamente el sobrenadante y se repitieron las etapas de extracción. A continuación, se secó el almidón a 65ºC durante 1 hora y se disolvió en solución de urea-dimetilsulfóxido (UDMSO; 9 volúmenes de dimetilsulfóxido por cada volumen de urea 6 M), utilizando 1 ml de UDMSO por cada 2 mg de almidón (pesados tal como anteriormente). Inmediatamente, la mezcla se agitó con vórtex vigorosamente y se incubó en un baño de agua a 95ºC durante 1 hora con agitación con vórtex intermitente para la disolución completa del almidón. Se trató una alícuota de la solución de almidón-UDMSO (50 µl) con 20 µl de reactivo I2-KI que contenía 2 mg de yodo y 20 mg de yoduro potásico por ml de agua. La mezcla se enrasó a 1 ml con agua. Se midió la absorbancia de la mezcla a 650 nm mediante la transferencia de 200 µl a la microplaca y leyendo la absorbancia utilizando un lector de microplacas de precisión Emax (Molecular Devices, USA). Se prepararon muestras estándares que contenían 0 a 100% de amilosa y 100% a 0% de amilopecitna a partir de amilosa de patata y amilopectina de maíz (o de patata) (Sigma) y se trataron al igual que las muestras de ensayo. Se determinó el contenido de amilosa (porcentaje de amilosa) a partir de los valores de absorbancia utilizando una ecuación de regresión derivada de las absorbancias de las muestras estándares. También se llevó a cabo el análisis de la proporción amilosa/amilopectina de los almidones no desramificados, según Case et al. (1998) o mediante un procedimiento de HPLC para separar almidones desramificados tal como describen Batey y Curtin (1996).

La distribución de las longitudes de cadena en el almidón puede analizarse mediante electroforesis de carbohidratos asistida por fluoróforos (FACE) utilizando una unidad de electroforesis capilar según Morell et al. (1998), tras la desramificación de las muestras de almidón. Los perfiles de la temperatura de gelatinización de las muestras de almidón pueden medirse en un calorímetro de barrido diferencial Pyris 1 (Perkin Elmer, Norwalk CT, USA). La viscosidad de las soluciones de almidón puede medirse en un analizador Rapid-Visco-Analyser (RVA, Newport Scientific Pty Ltd., Warriewood, Sydney), por ejemplo utilizando las condiciones informadas por Batey et al., 1997. Entre los parámetros que pueden medirse se incluyen la viscosidad pico (la viscosidad máxima de la pasta caliente), la fuerza de agarre, la viscosidad final y la temperatura de gelatinización. El volumen de hinchado de la harina o el almidón puede determinarse según el procedimiento de Konik-Rose et al. (2001). La incorporación de agua se mide pesando la muestra antes y después de mezclar la muestra de harina o almidón en agua a temperaturas definidas y tras la recolección del material gelatinizado.

Los niveles de β-glucanos pueden determinarse utilizando el kit suministrado por Megazyme (Bray, Co., Wicklow, República de Irlanda).

Análisis de la expresión de proteínas en el endospermo.

Se analizó la expresión específica de proteínas mediante procedimientos de transferencia western. Se diseccionó y extrajo el endospermo separándolo de todos los teijdos maternales y se homogenizaron muestras de aproximadamente 0,2 mg en 600 µl de tampón KPi 50 mM (K2HPO4 42 mM y KH2PO4 8 mM), pH 7,5, que contenía EDTA 5 mM, glicerol al 20%, DTT 5 mM y Pefabloc 1 mM. Las muestras molidas se centrifugaron durante 10 minutos a 13.000 g y el sobrenadante se dividió en alícuotas y se congeló a -80ºC hasta la utilización. Para la estimación del total de proteínas, se construyó una curva estándar utilizando las alícuotas de 0, 20, 40, 60, 80 y 100 µl de estándar BSA 0,25 mg/ml. Las muestras (3 µl) se enrasaron a 100 µl con agua destilada y se añadió a cada una 1 ml de reactivo Coomassie Plus Protein. Se leyó la absorbancia tras 5 minutos a 595 nm, utilizando la muestra cero de BSA de la curva estándar como el blanco, y se determinaron los niveles de proteínas en las muestras. Las muestras que contenían 20 µg de proteínas totales de cada endospermo se corrieron en un gel de poliacrilamida no desnaturalizante al 8% que contenía Tris-HCl 0,34 M (pH 8,8), acrilamida (8,0%), persulfato amónico (0,06%) y TEMED (0,1%). Tras la electroforesis, las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa según Morell et al. (1997) y se sometieron a reacción inmunológica con anticuerpos específicos para SBEIIa o SBEIIb.

Ejemplo 2. Constructos genéticos para la alteración de la expresión de SBEIIa y SBEIIb del trigo

Se prepararon constructos de ARN dúplex (ARNdc) para reducir la expresión de los genes SBEIIa o SBEIIb del trigo. En estos constructos, la secuencia deseada de ácidos nucleicos correspondiente a parte de los genes SBEIIa o SBEIIb se observó en las orientaciones tanto de sentido como antisentido respecto al promotor, de manera que el ARN expresado comprendía regiones complementarias que podían aparearse para formar un ARN dúplex o de doble cadena. Una región espaciadora entre las secuencias de sentido y antisentido comprendía una secuencia de intrón que, al transcribirla como parte del ARN en la planta transformada, se desempalmaría para formar una estructura dúplex "de horquilla" apretada. Se ha encontrado que la inclusión de un intrón incrementa la eficiencia del silenciamiento génico proporcionado por los constructos de ARN dúplex (Smith et al., 2000). El ácido nucleico deseado se ligó a una secuencia de promotor de glutenina de alto peso molecular (HMWG) (promotor del gen de la subunidad Dx5, nº de acceso X12928, Anderson et al., 1989) y a la secuencia de terminador del gen de la nopalina sintasa de Agrobacterium (nos3'). Esto proporcionó una expresión específica del endospermo de las secuencias de ARNdc.

El constructo de ARN dúplex de SBEIIa contenía 1.536 pb de secuencia de nucleótidos amplificado mediante PCR del gen SBEIIa del trigo (número de acceso GenBank AF338431, ver la figura 1). Lo anterior incluía: una secuencia de 468 pb que comprendía la totalidad de los exones 1 y 2 y parte del exón 3 (posiciones nucleótidas 1.508 a 1.336,

1.664 a 1.761 y 2.038 a 2.219 en la figura 1), con los sitios de restricción EcoRI y KpnI en ambos lados (fragmento 1), una secuencia de 512 pb que consistía de parte de los exones 3 y 4 y la totalidad del intrón 3 de SBEIIa (posiciones nucleótidas 2.220 a 2.731 en la figura 1) con los sitios KpnI y SacI en ambos lados (fragmento 2) y un fragmento de 528 pb que consistía de los exones completos 1, 2 y 3 de SBEIIa (posiciones nucleótidas 1.508 a 1.336, 1.664 a 1.761 y 2.038 a 2.279 en la figura 1) con los sitios BamHI y SacI en ambos lados (fragmento 3). A continuación, se ligaron los fragmentos 1, 2 y 3 de manera que la secuencia del fragmento 3 se encontraba ligada al fragmento 2 en orientación antisentido respecto al fragmento 1. Se generaron inicialmente los constructos de ARN dúplex en el vector pDVO3000 que contenía la secuencia de promotor HMWG y el terminador nos3'. El constructo génico en el vector pDVO3000 se denominó pDVO3-IIa y el gen de ARN dúplex se denominó SBEIIa-dc.

La estrategia para el constructo de ARN dúplex de SBEIIb fue similar. El constructo de SBEIIb contenía un fragmento de 1.607 pb amplificado mediante PCR del gen SBEIIb del trigo (la secuencia se indica de manera general en la figura 2). Ésta incluía una secuencia de 471 pb que comprendía la totalidad de los exones 1 y 2 y parte del exón 3 (posiciones nucleótidas 489 a 640, 789 a 934 y 1.598 a 1.769 en la figura 2), con los sitios de restricción EcoRI y KpnI en ambos lados (fragmento 1), una secuencia de 589 pb que consistía de parte de los exones 3 y 4 y la totalidad del intrón 3 de SBEIIb (posiciones nucleótidas 1.770 a 2.364 en la figura 2) con los sitios KpnI y SacI en ambos lados (fragmento 2) y un fragmento de 528 pb que consistía de los exones completos 1, 2 y 3 de SBEIIb (posiciones nucleótidas 489 a 640, 789 a 934 y 1.598 a 1.827 en la figura 2) con los sitios BamHI y SacI en ambos lados (fragmento 3). A continuación, se ligaron los fragmentos 1, 2 y 3 de manera que la secuencia del fragmento 3 se encontrase ligada el fragmento 2 en orientación antisentido respecto al fragmento 1. El constructo del gen de ARN dúplex de SBEIIb en el vector pDVO3000 se denominó pDVO3-IIb y el gen de ARN dúplex se denominó SBEIIb-dc. Se muestran esquemáticamente los constructos en la figura 3.

Cada uno de los casetes de expresión de ARNdc se recortó a continuación con el enzima de restricción XhoI y se insertó en los vectores binarios de transformación pGB53 y pBIOS340. Se creó pGB53 a partir de pSB11 (Komari et al., 1996) mediante la introducción del gen codificante de resistencia a asulam (sul) regulado por el promotor actina del arroz, dejando un sitio XhoI único contiguo al límite derecho del ADN-T para la introducción de un gen de interés. De manera similar, se creó pBIOS340 a partir de pSB1 (Komari et al., 1996) mediante la introducción de un gen nptII codificante de resistencia a canamicina y a geneticina, contlaminado por el promotor de actina del arroz, nuevamente dejando un sitio XhoI único contiguo al límite derecho. Los constructos de SBEIIa en pGB53 y pBIOS340 se denominaron pCL51 y pCL59, respectivamente; y los constructos de SBEIIb en pGB53 y pBIOS340 se denominaron pCL54 y pCL60, respectivamente.

Ejemplo 3. Transformación del trigo.

Se introdujeron constructos genéticos para la transformación del trigo mediante electroporación en la cepa desarmada de Agrobacterium tumefaciens cepa LBA4404 que portaba el plásmido pAL4404 y pSB1 de vir, con posterior selección en medio con espectinomicina. Las cepas transformadas de Agrobacterium se incubaron en medio YEP solidificado a 27ºC durante 2 días. A continuación, se recogieron las bacterias y se resuspendieron en TSIM1 (medio MS con 100 mg/l de mioinositol, 10 g/l de glucosa, 50 mg/l de tampón MES, pH 5,5) que contenía acetosiringona 400 mM hasta una densidad óptica de 2,4 a 650 nm para la inoculación del trigo.

Se cultivaron plantas del trigo (diversidad NB1, una variedad de trigo Spring obtenida de Nickerson seeds Ltd., Rothwell, Lincs.) en un invernadero a 22ºC/15ºC temperatura diurna/nocturna con suplementación de luz para proporcionar un día de 16 horas. Los retoños se recolectaron aproximadamente 14 días después de la antesis (embriones de aproximadamente 1 mm de largo) incluyendo 50 cm de tallo de los mismos. A continuación, se quitaron todas las hojas de los retoños excepto la hoja bandera, que se limpió para eliminar las esporas fúngicas contaminantes. Seguidamente, se retiraron las glumas de cada espiguilla y las lemas de los primeros dos ramilletes, con el fin de descubrir la semilla inmadura. Generalmente se descubrieron sólo estas dos semillas de cada espiguilla. Se llevó a cabo este procedimiento a lo largo de la longitud completa de la inflorescencia. A continuación, se pulverizaron las espigas con IMS al 70% a modo de breve esterilización superficial.

Se inocularon suspensiones de Agrobacterium (1 µl) utilizando una jeringa de Hamilton de 10 µl en la semilla inmadura aproximadamente en la posición de la interfaz escutelo:endospermo, de manera que se inoculasen todas las semillas descubiertas. A continuación, se introdujeron los retoños en agua, se cubrieron con una bolsa de plástico traslúcido para evitar la deshidratación de las semillas y se introdujeron en un incubador iluminado durante 3 días a 23ºC, 16 horas de día, 45 Em-2 s-1 PAR. Tras 3 días de cocultivo, las semillas inmaduras inoculadas se sacaron y se esterilizaron superficialmente con etanol al 70% (30 segundos), y después con lejía al 20% (Domestos, 20 minutos), seguido de un lavado intenso en agua destilada estéril. Los embriones inmaduros se aislaron asépticamente y se introdujeron en medio W3 (MS suplementado con 20 g/l de sacarosa y 2 mg/l de 2,4-D y se solidificaron con 6 g/l de agarosa de tipo I, Sigma) con la adición de 150 mg/l de timentina (W3T) y con el escutelo en la parte más superior (20 embriones en cada placa). Se sometieron los cultivos a 25ºC a la luz (día de 16 horas, 80 Em-2 s-1 PAR). Se evaluó el desarrollo del eje embrionario de los embriones aproximadamente 5 días después del aislamiento y se extrajo el eje en caso necesario para mejorar la producción de callo. Se mantuvieron los embriones en W3T durante 4 semanas, con una transferencia a medio fresco 2 semanas después del aislamiento y se evaluaron para su capacidad embrionaria.

Tras 4 semanas de crecimiento, los callos derivados de los embriones inoculados eran muy similares a los callos de control obtenidos de embriones no inoculados sembrados en medio W3T. La presencia de bacterianas aparentemente no redujo sustancialmente la capacidad embrionaria de los callos derivados de los embriones inoculados. Los callos embrionarios se transfirieron a medio W3 con 2 mg/l de Asulam (en el que se utilizaron derivados de pGB53) o geneticina a 25 mg/l (derivados de pBIOS340) y 150 mg/l de timentina (W32AT). Los callos se mantuvieron en este medio durante 2 semanas adicionales y después se dividió cada callo en trozos de 2 mm de tamaño y se sembraron nuevamente en W32AT. Los embriones de control derivados de inoculaciones con LBA4404 sin constructos de vector binario no produjeron callos transformados en los medios de selección.

Tras 2 semanas adicionales de cultivo, se evaluaron todos los tejidos para el desarrollo de callos embrionarios: cualquier callo que mostrase indicios de desarrollo continuo tras 4 semanas de selección se transfirió a medio de regeneración (RMT -MS con 40 g/l de maltosa y 150 mg/l de timetina, pH 5,8, solidificado con 6 g/l de agarosa, Sigma tipo I). Los brotes se regeneraron dentro de las 4 semanas en este medio y después se transfirieron a MS30 con 150 mg/l de timentina para la elongación y enraizamiento de los brotes. A continuación, se transfirieron las plantas juveniles a tierra mixta y se dejaron en un banco de humidificación durante dos semanas y finalmente se transfirieron a un invernadero.

Se trató mediante este procedimiento un total de 3.217 embriones utilizando pCL54 y pCL60 (SBEIIb-dc) y 2.010 embriones utilizando pCL51 ó pCL59 (SBEIIa-dc) y 61 plantas se regeneraron a partir de callos para la transformación de IIb y 31 plantas se regeneraron a partir de callos para la transformación de IIa. La supervivencia en medio de selección sugería que se habían transformado con éxito con el constructo génico. Una gran mayoría de las plantas, aunque no todas, transformadas con el gen marcador seleccionable se esperaría que integrasen el gen inhibidor de SBEIIa o SBEIIb; estos pudieron distinguirse fácilmente tal como se describe en los ejemplos siguientes.

La recuperación de múltiples sucesos de integración estable con buen potencial de regeneración de los experimentos indicaba que el procedimiento de transformación mediante inoculación en semillas utilizado en la presente memoria era tan eficiente como otros procedimientos informados para el trigo. También pueden utilizarse en el procedimiento cepas alternativas de Agrobacterium, tal como la cepa AGL1 o marcadores seleccionables tales como genes codificantes de resistencia a la higromicina.

Ejemplo 4. Análisis de transformantes del trigo.

5 Se determinó la transformación mediante uno o más de los procedimientos siguientes:

análisis de PCR para uno o más de los transgenes. El análisis de PCR se llevó a cabo en ADN genómico extraído de 1 a 2 cm2 de material foliar fresco utilizando el procedimiento miniprep descrito por Stacey e Isaac (1994). Las

10 reacciones de PCR se llevaron a cabo, por ejemplo, utilizando los cebadores SBEIIa-For: 5'-CCCGCTGCTTTCGCTCATTTTG-3' [SEC ID nº 9] y SBEIIa-Rev: 5'-GACTACCGGAGCTCCCACCTTC-3' [SEC ID nº 10], diseñados para amplificar un fragmento (462 pb) del gen SBEIIa, o SBEIIb-DupFor: 5'-AGATGTGAATGGCTGCTTGCTG-3' [SEC ID nº 11] y SBEIIb-DupRev 5'-CAGGTCGACCATATGGGAGAGC-3' [SEC ID nº 12] para SBEIIb (505 pb). Las condiciones de reacción fueron las siguientes: "inicio en caliente" (94ºC, 3

15 minutos), seguido de 30 ciclos de desnaturalización (95ºC, 30 segundos), hibridación (55ºC, 30 s), extensión (73ºC, 2 minutos), seguido de 1 ciclo a 73ºC (5 minutos).

Se llevó a cabo un análisis de hibridación southern en ADN de una extracción a escala mayor (9 ml) procedente de tejido molido liofilizado (Stacey e Isaac, 1994). Se ajustaron las muestras de ADN a 0,2 mg/ml y se digirieron con

20 enzimas de restricción tales como HindIII, EcoRI y KpnI. La digestión con enzimas de restricción, la electroforesis en gel y la transferencia al vacío se llevaron a cabo tal como describen Stacy e Isaac (1994). Las sondas marcadas con digoxigenina que incluían la región del intrón 3 de los constructos SBEII-dc se produjeron mediante PCR según el procedimiento de McCreery y Helentjaris (1994). La hibridación de las sondas con el filtro southern y la detección mediante quimioluminiscencia se llevaron a cabo según el procedimiento de McCreery y Helentjaris (1994).

25 Los resultados de los análisis de PCR se resumen en la Tabla 2. Las plantas positivas para los transgenes tal como se muestra mediante PCR incluían 27 sucesos independientes de transformación para SBEIIa-dc y 61 sucesos independientes para SBEIIb-dc.

30 Tabla 2. Transformación de trigo con constructos de ARN dúplex de SBEIIa y de SBEIIb

Experimento nº: Nº de embriones inoculados Nº de líneas regeneradas Líneas positivas en la PCR

Constructo de SBEIIa-dc

44: 242 1 1

50: 169 3 3

52: 158 3 3

58: 163 2 2

61: 195 1 1

72: 185 1 0

83: 241 1 1

84: 242 1 1

85: 153 5 5

109: 262 13 10

Total: 2010 31 27

Constructo de SBEIIb-dc

48: 291 1 1

51: 166 1 0

53: 194 1 0

55: 261 1 1

59: 253 1 0

60: 175 4 2

62: 199 1 0

70: 152 1 0

73: 238 2 2

75: 151 2 2

76: 150 1 0

77: 150 2 2

81: 134 1 1

87: 230 5 3

92: 233 8 5

110: 240 29 16

Total: 3217 61 35

Ejemplo 5. Análisis de granos procedentes de plantas transformadas con constructos de ARN dúplex

Morfología de los gránulos de almidón

5 La morfología de los gránulos de almidón de semillas T1 maduras obtenidas de las plantas del trigo transformadas T0 se observó mediante microscopía óptica. Se analizaron diez granos individuales de cada una de 25 plantas T0 independientemente transformadas con SBEIIa-dc y 12 plantas independientemente transformadas con SBEIIb-dc. Se aplastó suavemente cada endospermo para liberar los gránulos de almidón, que se dispersaron en agua y se visualizaron bajo un microscopio óptico. De las 25 líneas de SBEIIa-dc analizadas, 12 presentaban granos con

10 gránulos distorsionados (por ejemplo ver la figura 4), aunque la observación visual reveló niveles variables de distorsión en diferentes semillas. En contraste, ninguna de las 12 líneas de SBEIIb-dc mostró ninguna distorsión significativa de los gránulos de almidón en el endospermo al observarlas bajo microscopía óptica. Se resumen los resultados en las Tablas 3 y 4.

15 Tabla 3. Morfología de los gránulos de almidón de semillas T1 de líneas de trigo transgénico de SBEIIa-dc

Preparación nº: Línea nº Morfología de los gránulos*

1: 44,1a +

2: 50,1b -

3: 50,2b +

4: 50,3x -

5: 52,1a +

6: 52,2a +

7: 52,3a +/

8: 58,1a -

9: 58,2a -

10: 61,2a -

11: 83,1b +

12: 84,1a +/

13: 85,1a +/

14: 85,2c -

15: 85,3a -

16: 85,4b +

17: 85,5a -

18: 109,1a -

19: 109,2c +

20: 109,3b +

21: 109,4e -

22: 109,7b -

23: 109,8c -

24: 109,10a +

25: 109,11x +

*Se observó la morfología de los gránulos de almidón de 10 semillas de cada línea. La morfología se indica con '+' en el caso de que la totalidad de las diez semillas presentase una morfología normal de los gránulos; '-' en el caso de la presencia de semillas severamente distorsionadas, y '+/-' en el caso de la presencia de alguna anormalidad, es decir, por lo menos algunas semillas con alguna distorsión pero ninguna con distorsión severa.

Tabla 4. Morfología de los gránulos de almidón de semillas T1 de líneas de trigo transgénico de SBEIIb-dc

Preparación nº: Líneas Morfología de los gránulos

1: 48,1a +

2: 55,1a +

3: 60,1a +

4: 60,4a +

5: 73,1f +

6: 75,1c +

7: 75,3x +

8: 77,1c +

(continuación)

9: 77,2c +

26: 110,16b +

27: 110,17b +

28: 110,18a +

'+' indica que la totalidad de la diez semillas de cada línea presentaba una morfología normal de los gránulos de almidón

5 La observación de los gránulos de almidón bajo luz polarizada reveló una reducción significativa de la birrefringencia en los gránulos distorsionados (figura 5) para el grano SBEIIa-dc. Se observó la pérdida de birrefringencia en 94% de los gránulos en semillas de la línea 50.1b, correlacionándose con su fenotipo distorsionado, mientras que los gránulos normales de otra semilla de la misma línea mostraban birrefringencia completa (Tabla 5). Se cree que la

10 semilla con gránulos normales es un segregante que no presenta el transgén y que por lo tanto es fenotípicamente normal.

Tabla 5. Birrefringencia de gránulos de almidón de semillas T1 de la línea 50.1b de trigo transgénico de SBEIIa-dc

Semillas de la línea 50.1b: Campo de microscopía Nº de gránulos que no mostraba BF Nº de gránulos que mostraba BF parcial Nº de gránulos que mostraba BF completa

Semillas con gránulos distorsionados: 1 55 2 1

2: 73 1 0

3: 44 1 0

4: 92 3 2

5: 46 2 7

6: 46 2 3

Total: 356 (93,7% ) 11 (2,9%) 13 (3,4%)

Semillas con gránulos normales: 1 1 3 110

2: 1 1 38

3
3: 4 90

4: 0 3 61

5: 3 3 59

6: 1 0 30

Total: 9 (2,2%) 14 (3,4%) 388 (94,4%)

15 Los resultados de microscopía óptica fueron confirmados mediante microscopía electrónica de barrido (SEM) de los gránulos de almidón. Para ello, se bombardeó el almidón purificado con oro y se escaneó a 15 kV a temperatura ambiente.

20 Peso del grano.

Se pesaron granos individuales de plantas transformadas con SBEIIa-dc, cultivadas bajo condiciones equivalentes en el invernadero (Tabla 6). Los granos que presentaban gránulos severamente distorsionados de las plantas 50.1b, 58.2a, 61.2a y 109 no presentaban un peso medio significativamente reducido en comparación con los granos de

25 plantas de tipo salvaje cultivadas bajo las mismas condiciones. Por lo tanto, la producción de almidón aparentemente no resultó reducida sustancialmente incluso en las semillas con gránulos de almidón altamente distorsionados. Estos datos también sugieren que el rendimiento de trigo cultivado en el campo con actividad reducida de SBEIIa en el endospermo puede considerarse normal.

30 Tabla 6. Peso de los granos de semillas T1 procedentes de líneas de trigo transgénico SBEIIa-dc

Línea transgénica: Semilla nº Peso de la semilla (mg) Morfología de los gránulos de almidón* Línea transgénica Semilla nº Peso de la semilla (mg) Morfología de los gránulos de almidón*

50,1b: 1 16,9 + 61,2a 1 50,7 +

2: 49,8 + 2 49,0 +/

3: 46,9 - 3 49,8 -

4: 50,0 - 4 47,0 -

5: 45,4 - 5 48,6 -

6: 42,6 - 6 46,2 -

(continuación)

7: 39,9 +/ 7 42,2 +

8: 41,0 + 8 50,4 -

9: 39,5 - 9 39,7 -

10: 37,0 +/ 10 46,3 -

58,2a: 1 44,0 - 109,7b 1 40,1 -

2: 37,4 + 2 34,6 -

3: 48,8 - 3 43,7 -

4: 43,2 + 4 38,8 -

5: 46,2 - 5 33,8 +/

6: 42,1 + 6 31,1 +/

7: 43,5 +/ 7 35,9 +

8: 45,7 - 8 44,3 +/

9: 38,8 - 9 37,7 -

10: 38,1 +/ 10 41,4 -

'+' gránulos de almidón normales, '-' gránulos muy deformados, +/-deformación suave de los gránulos

Análisis de proteínas SBEIIa y SBEIIb en endospermo de trigo transgénico T2

5 Se analizaron las semillas (T2) de 13 plantas T1 transformadas con SBEIIa-dc, que representaban 5 líneas transformadas independientemente, y de 9 plantas transformadas con SBEIIa-dc, que representaban 3 líneas transformadas independientemente, para la expresión de las proteínas SBEIIa y SBEIIb en el endospermo mediante PAGE no desnaturalizante y transferencia western. Las plantas SBEIIa-dc eran todas de líneas que presentaban una morfología anormal de los gránulos de almidón, mientras que las líneas SBEIIb-dc todas presentaban una

10 morfología normal de los gránulos, tal como se ha indicado anteriormente. El anticuerpo utilizado para la detección de SBEIIa fue 3KLH, de conejos, que había sido cultivado contra el péptido sintético que presentaba la secuenciad e aminoácidos AASPGKVLVPDESDDLGC [SEC ID nº 13], correspondiente a la secuencia del extremo N-terminal del SBEIIa maduro, y se diluyó 1:5.000 para la utilización. El anticuerpo utilizado para la detección de SBEIIb era R6, cultivado contra el péptido sintético que presenta la secuencia de aminoácidos AGGPSGEVMIGC [SEC ID nº 14],

15 correspondiente a la secuencia deducida del extremo N-terminal del SBEIIb maduro y diluido 1:6.000 antes de la utilización. El anticuerpo secundario utilizado fue el conjugado GAR-peroxidasa de rábano picante (dilución 1:3.000). Se revelaron las bandas inmunorreactivas utilizando un sistema de detección Amersham ECL.

Se analizaron los endospermos de cada uno de siete granos en desarrollo (15 días después de la antesis) de cada

20 una de 22 plantas T2, ya que se esperaba que algunas de las plantas serían heterocigóticas para el transgén. Doce de las 13 plantas SBEIIa-dc produjeron progenie T2 que mostraba niveles reducidos de proteína SBEIIa en el endospermo. La totalidad de las siete semillas de una línea (50.3x9) aparentemente no presentaba SBEIIa en absoluto, mientras que la totalidad de las siete semillas de otras cuatro plantas mostró una expresión evidentemente reducida de SBEIIa (Tabla 7). Éstas podrían representan líneas que eran homocigóticas para el transgén. Siete

25 líneas eran segregantes por la ausencia de SBEIIa o los niveles reducidos de SBEIIa, o en algunos casos ninguna reducción aparente de la proteína, y estas líneas probablemente representan heterocigotos para el transgén. La decimotercera línea (50.3x6) era homocigótica para la expresión de tipo salvaje (Tabla 7).

Tabla 7. Análisis de transferencia western de proteínas del endospermo de líneas T2 de trigo transgénico de SBEIIa30 dc

Línea transgénica: Gen diana Morfología de los gránulos T1 Segregación de la banda de proteína SBEII en los granos T2

50,3x,6: SBEIIa + Uniforme para la expresión de tipo salvaje (+)

58,1a,3: " - Segregante para +/-y

58,1a,7: " - Segregante para +, +/-y

58,1a,9: " - Segregante para +, +/-y

50,1b,3: " - Uniforme para +/

50,1b,4: " - Segregante para +/-y

50,1b,5: " - Uniforme para +/

50,1b,9: " - Segregante para + y +/

50,3x,9: " - Uniforme para

61,2a,8: " - Uniforme para +/

(continuación)

61,2a,9: " - Segregante para +/-y

61,2a,10: " - Uniforme para +/

85,2c,2: " - Segregante para +/-y

110,16b,14: SBEIIb + Uniforme para la expresión de tipo salvaje (+)

110,16b,2: " + Uniforme para

110,16b,17: " + Uniforme para +

110,16b,5: " + Uniforme para

110,16b,19: " + Uniforme para

110,17b,3: " + Segregante para +/-y

110,17b,6: " + Segregante para + y +/

110,18a,9: " + Segregante para +/-y

110,18a,17: " + Segregante para +, +/-y -

De las nueve líneas transgénicas de SBEIIb-dc sometidas a ensayo, tres (110.16b.2, 110.16b.5 y 110.16b.19) mostraron uniformemente la falta de expresión de SBEIIb en cada una de las siete semillas progenie, mientras que

5 dos eran uniformes para la expresión de tipo salvaje y las cuatro restantes eran segregantes para la falta de expresión, la expresión reducida o de tipo salvaje (Tabla 7). Se cultivaron embriones de las semillas (rescate de embriones) para producir plantas T2 y semillas T3 que se cribaron mediante PCR y el análisis de la expresión de proteínas con el fin de confirmar el estado genético de las semillas T2 con respecto al transgén.

10 Estos datos indican que los constructos de ARN dúplex resultan efectivos para reducir la expresión de los genes SBEIIa y SBEIIb en el endospermo del trigo. Los datos también indican que la reducción de la expresión de SBEIIb por sí sola no alteró sustancialmente la morfología de los gránulos de almidón.

La expresión del gen SBEIIb en semillas transgénicas que contenían el transgén SBEIIa-dc y que carecían de

15 proteína SBEIIa y la expresión del gen SBEIIa en semillas que contenían SBEIIb-dc también se analizaron mediante el procedimiento de la transferencia western. Inesperadamente, las semillas transgénicas que comprendían SBEIIadc presentaban niveles muy reducidos de SBEIIb. Sin embargo, no se observó el efecto inverto en semillas transgénicas para SBEIIb-dc. La expresión de SBEIIa no se vio alterada en semillas en las que SBEIIb fue completamente silenciada por SBEIIb-dc. Posiblemente la expresión de SBEIIb resultó suprimida por el constructo

20 de SBEIIa-dc debido a la homología de secuencias entre los genes en la región utilizada para el constructo dúplex, y también resulta posible que la actividad de SBEIIb se viese reducida por el transgén SBEIIa-dc por algún otro mecanismo.

Los niveles de expresión de los genes SBEIIa y SBEIIb también pueden determinarse específicamente al nivel de

25 ARNm mediante técnicas estándares tales como la hibridación northern o los procedimientos de RT-PCR, por ejemplo mediante la utilización de sondas procedentes de regiones no conservadas o parejas de cebadores que se hibridan con sitios únicos en uno de los genes pero no en el otro, pro ejemplo en las regiones 3' no traducidas. Dichas regiones o sitios pueden identificarse fácilmente mediante la comparación de las dos secuencias génicas.

30 Ejemplo 6. Análisis del almidón de trigo transformado.

Niveles de amilosa y de amilopectina en grano de trigo transgénico.

Se determinó el contenido de amilosa de almidones de seis muestras de semillas T1 agrupadas, tal como se

35 describe en el Ejemplo 1. Las muestras de semillas agrupadas se obtuvieron de líneas de trigo transgénico del modo siguiente:

grupo 1 -semillas que presentaban gránulos de almidón distorsionados procedentes de la línea transgénica 85.2c de SBEIIa-dc,

40 grupo 2 -semillas que presentaban gránulos normales procedentes de la línea transgénica 85.1a de SBEIIa-dc,

grupo 3 -semillas que presentaban gránulos normales procedentes de la línea transgénica 110.18a de SBEIIb-dc,

45 grupo 4 -semillas que presentaban gránulos distorsionados de las líneas transgénicas 58.1a, 58.2a y 61.2a de SBEIIa-dc, agrupados,

grupo 5 -semillas que presentaban gránulos normales de la línea transgénica 83.1b de SBEIIa-dc,

50 grupo 6 -semillas que presentaban gránulos normales de la línea transgénica 75.3x de SBEIIb-dc.

Se realizó cada análisis utilizando cuatro réplicas de las muestras de almidón. La ecuación de regresión utilizada para convertir la absorbancia en contenido de amilosa para dichos análisis fue: Y=57,548x-8,793, en la que Y es el contenido de amilosa (%) y x es la absorbancia.

5 Se proporcionan los resultados en la Tabla 8. La presencia de gránulos de almidón distorsionados se asociaba claramente a un contenido incrementado de amilosa. El almidón procedente de granos con gránulos distorsionados de las líneas transgénicas de SBEIIa-dc (grupos 1 y 4) presentaba un contenido de amilosa superior a 50%, mientras que los demás grupos de almidón, derivados de granos con gránulos de almidón normales, presentaban un

10 contenido de amilosa de entre 21% y 26%. Lo anterior incluye almidón de la línea IIb 110.18a que presentaba una expresión reducida de SBEIIb (Tabla 8), lo que sugiere que la inactivación de SBEIIb por sí solo en el trigo no incrementa sustancialmente los niveles de amilosas en el almidón de los granos.

Tabla 8. Contenido de amilosa estimado mediante el procedimiento yodométrico de las líneas de trigo transgénico 15

Muestra de almidón: Línea transgénica Contenido de amilosa (%)

Réplica 1
Réplica 1
Réplica 1: Promedio

Grupo 1: 85.2c 65,7 54,2 53,2 57,7

Grupo 2: 85.1a 23,7 22,5 26,7 24,3

Grupo 3: 110.18a 22,3 21,0 21,5 21,6

Grupo 4: 58.1, 58.2a, 61.2a 53,9 52,8 58,5 55,1

Grupo 5: 83.1b 26,5 25,3 24,8 25,6

Grupo 6: 75.3x 24,3 20,6 19,5 21,5

Se realizó un segundo conjunto de análisis mediante el procedimiento yodométrico utilizando una muestra del grupo 4 y almidón de trigo que era defectivo en SSII (Yamamori et al., 2000) y de la cebada línea M292, que es mutante en SSIIa. El contenido de amilosa determinado para el almidón de semillas de trigo del grupo 4 (líneas transgénicas de

20 SBEIIa-dc) era considerablemente más alto que el del almidón de mutantes de SSII del trigo y de la cebada.

Lo anterior implica que el contenido de amilopectina en el almidón de estos granos se encuentra considerablemente reducido, entre aproximadamente 75% en el tipo salvaje y menos de 50% o incluso menos de 20%.

25 Se generaron líneas que contenían transgenes tanto SBEIIa-dc como SBEIIb-dc mediante el cruce de las plantas transgénicas anteriormente indicadas. El contenido de amilosa en el almidón del grano de dicha progenie se encontraba elevado por encima del almidón de plantas que contenían únicamente SBEIIa-dc, por ejemplo 75% a 80%, mostrando que la inhibición de SBEIIb además de SBEIIa incrementa adicionalmente los niveles de amilosa.

30 Ejemplo 7. Comparación de SBEIIa de los genomas A, B y D.

Construcción de bibliotecas de ADNc y genómicas del trigo.

Se prepararon bibliotecas de ADNc y genómicas a partir del endospermo del trigo mediante procedimientos

35 estándares en vectores fagos (Sambrook et al., 1989). Se prepararon dos bibliotecas de ADNc, una de ARN del cultivar Rosella (Rahman et al., 1999) y la otra del cultivar Wyuna (Rahman et al., 2001). La biblioteca de Rosella se preparó en el vector ZAPII y se utilizaron los cebadores EcoRI y NotI, mientras que la biblioteca de Wyuna se preparó en el vector ZipLox (Life Technology) siguiendo los protocolos suministrados con los reactivos. Los títulos de las bibliotecas eran de 2x106 pfu, sometidos a ensayo en la cepa Y1090(ZL) de E. coli. Se preparó una biblioteca

40 genómica a partir de ADN de A. tauschii variedad 10097. Se digirió el ADN con Sau3A y se ligó al vector lambdaGEM12 parcialmente rellenado (Promega). Los fragmentos clonados pudieron liberarse con la digestión con SacI o XhoI. Las bibliotecas genómicas del ADN de T. aestivum fueron las descritas por Tuner et al., 1999.

Aislamiento de secuencias de ADNc de SBEIIa

45 Mediante la utilización de una sonda de secuencia génica de SBEI del trigo a baja astringencia (Rahman et al., 2001), se aislaron ADNc a partir de la biblioteca preparada a partir del cultivar Rosella. El clon más largo obtenido, denominado sbe9, se secuenció y se observó que codificaba una secuencia de tipo SBEIIa (GenBank AF338432.1). A continuación, se aislaron tres clones de la biblioteca de ADNc del endospermo preparada a partir del cultivar

50 Wyuna (Rahman et al., 2001) utilizando una sonda correspondiente a las posiciones 536 a 890 de sbe9. Las condiciones para el cribado de la biblioteca fueron la hibridación con formamida al 25%, 5xSSC, SDS al 0,1%, 10x solución de Denhard, 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón a 42ºC durante 16 horas, seguido del lavado con 2xSSC, SDS al 0,1% a 65ºC durante 3x1 hora (astringencia intermedia). Se obtuvieron tres secuencias diferentes mediante secuenciación de los clones y estos se representan posteriormente como sr995 y sr997 (figura 6).

55 La investigación de dichas secuencias de ADNc indicó que las diferentes secuencias se expresaban en el endospermo del trigo y que éstas probablemente correspondían a transcritos de SBEIIa procedentes de diferentes genomas de trigo. Una comparación mediante PILEUP de las secuencias con otras secuencias de ADNc de SBEIIa de trigo conocidas demostró que las secuencias sr995 y sr996 se encontraban agrupadas con la secuencia de ARNm derivada de la secuencia de genoma D wSBE-D1 (sr854) (figura 7), sugiriendo que sr995 y sr996 representan transcritos de SBEIIa del genoma D. Sr997 se encontraba próximo a la secuencia Y11282 (Nair et al., 1997), indicando que probablemente proceden del mismo genoma, el genoma A o B. El sbe9 anteriormente indicado (AF338432.1) probablemente es el mismo genoma que Y11282, aunque representa un suceso de procesamiento alternativo, consistente con el desempalme de un exón próximo al extremo 5'.

Diferenciación de los genes SBEIIa de los genomas A, B y D del trigo T. aestivum

Las diferencias en las secuencias de genes o de transcritos de ARN pueden utilizarse como base para diseñar cebadores específicos de los genomas A, B o D para el cribado mutacional a nivel génico o a nivel del ARN. Por ejemplo, la figura 6 compara las secuencias de nucleótidos de SBEIIa de los ADNc, incluyendo el nº de acceso de Genbank Y11282, y las secuencias parciales de ADNc sbe9 (AF338432.1), sr997 y sr995. Las secuencias genómicas se encuentran disponibles para los genes SBEIIa de T. aestivum, por ejemplo ver la Tabla 1. Se han atribuido secuencias genómicas a los genomas A, B y D. La comparación muestra polimorfismos, cualquiera de los cuales puede utilizarse para distinguir las secuencias por medios moleculares.

Un cebador directo basado en una región del exón 5 (5'-ATCACTTACCGAGAATGGG-3') [SEC ID nº 15] y un cebador inverso basado en una secuencia en el exón 6 (5'-CTGCATTTGGATTCCAATTG-3') [SEC ID nº 16] han sido utilizados para distinguir entre los productos de los genomas A, B y D. Dichos cebadores pueden utilizarse en reacciones de PCR para cribar para qué variedades o nº de acceso son mutantes en uno o más de los genes SBEIIa de los genomas A, B y D (ver posteriormente).

También se han desarrollado marcadores basados en la PCR para distinguir los genes SBEIIb de los genomas A, B y D del trigo. Por ejemplo, las reacciones de PCR con la pareja de cebadores ARA19F (5'-CACCCATTGTAATTGGGTACACTG-3') [SEC ID nº 17] y ARA15R (5'-TCCATGCCTCCTTCGTGTTCATCA-3') [SEC ID nº 18] seguido de la digestión de los productos de amplificación con el enzima de restricción RsaI podría distinguir los genes SBEIIa de los tres genomas.

Las diferencias en la secuencia de ADNc se reflejan en las secuencias deducidas de la proteína. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos de longitud completa deducidas para el genoma D (sr854) y los polipéptidos del genoma A o B (Y11282) se comparan en la figura 8. Resultan evidentes diferencias significativas en las regiones 688 a 698 y 735-6 que podrían utilizarse para producir anticuerpos específicos de genoma contra las proteínas SBEIIa, con el fin de cribar para las variedades de trigo que no presentan una o más actividades específicas de un genoma. Otras diferencias se observan en las secuencias peptídicas de tránsito que corresponden a las posiciones aminoácidas 1 a 54 de la figura 8.

Ejemplo 8. Identificación de variedades del trigo mutantes en uno o más genes SBEII

Identificación de mutaciones SBEIIb nulas en los genomas B y D

Se cribó un total de 1.500 números de acceso de trigo, incluyendo 300 variedades de trigo australiano, 900 números de acceso de trigo procedentes del Australian Winter Cereal Collection (AWCC, Tamworth, NSW Australia) y 300 razas terrestres de trigo, mediante amplificación de PCR de un marcador de SBEIIb correspondiente a una región polimórfica del intrón 3, utilizando los cebadores ARA19F (ver anteriormente) y ARA23R (5'-CTGCGCATAAATCCAAACTTCTCG-3') [SEC ID nº 19]. La amplificación por PCR utilizó las condiciones indicadas anteriormente. Los productos de amplificación se digirieron con el enzima de restricción RsaI y se sometieron a electroforesis en geles de poliacrilamida. Tres líneas (Aus12745, Aus17340 y Aus10103) no presentaban el marcador del genoma D y dos líneas (Aus12509 y Aus12565) no presentaban el marcador del genoma B (figura 9). Estas líneas representan mutantes nulos inferidos en los genes SBEIIb para los genomas B o D.

Se llevó a cabo un análisis de hibridación de transferencia southern en ADN procedente de líneas mutantes nulas para confirmar los resultados de la PCR. El ADN digerido con HindIII, preparado a partir de plantas mediante procedimientos estándares, se sometió a electroforesis en geles de agarosa al 1% y se transfirió a una membrana de nilón Hybond N+ (Amersham). Se generaron sondas marcadas radioactivamente a partir de la región del intrón 3 del gen SBEIIb (posiciones 2.019 a 2.39.1, ver la figura 2) utilizando el sistema de marcaje de ADN Megaprime (Amersham Pharmacia Biotech UK Ltd.) y se utilizaron para la hibridación bajo condiciones astringentes. No se encontraron Aus17340 ni Aus10103 en la banda ~4,8 kB del genoma D, y no se encontraron Aus12509 ni Aus12565 en la banda ~3,4 kB del genoma B (figura 10). Por lo tanto, se confirmó que estas líneas son mutantes nulos para los genes SBEIIb del genoma D o B, respectivamente.

Generación de dobles mutantes nulos B+D

Se llevaron a cabo los cruces siguientes:

Aus17340a x Aus12509

5 Aus17340b x Aus12509

Aus17340a x Aus12565

Aus17340b x Aus12565

10 Aus12745 x Aus12509

Aus12745 x Aus12565

15 Aus17340a y Aus17340b son dos biotipos diferentes del mismo cultivar Aus17340; se confirmó que ambos eran nulos para el marcador del gen SBEIIb del genoma D. Se autofecundaron las plantas F1 y se cribó la progenie F2 mediante el procedimiento de PCR para plantas que eran mutantes de los genes SBEIIb tanto de genoma B como D (dobles mutantes nulos). La segregación de las mutaciones de SBEIIb se observó mediante amplificación por PCR utilizando la pareja de cebadores Ar2b19cF (5'-CTATGCCAATTGAACAACAATGC-3') [SEC ID nº 20] y AR2b23cR

20 (5'-CGTGTTCATCAATGTCTGAACG-3') [SEC ID nº 21] (que amplifica la misma región que ARA19F/ARA23R), seguido de la digestión con el enzima de restricción RsaI. Se muestra en la figura 11 un patrón de segregación típico. El análisis de chi cuadrado reveló que el patrón de segregación de los cruces Aus17340a y Aus12509 y de Aus17340a y Aus12565 se ajustaba a la proporción esperada de 9:3:3:1 (Tabla 9). La segregación se encontraba altamente distorsionada en los demás cruces.

25 Tabla 9. Análisis de chi cuadrado de la población F2 de cruces entre mutantes nulos de SBEIIb en los subgenomas B yD

Cruce/Fenotipos: 17340a x 12509 17340b x 12509 1734a x 12565 17340 x 12565 12745 x 12509 12745 x 12565

Normal: 85 63 56 72 95 21

B nulo: 38 39 25 35 11 2

D nulo: 23 29 11 11 57 16

BD nulo: 6 10 4 6 3 0

Total: 152 141 96, 124 166 39

χ 2 (9:3:3:1): 5,52 9,73 6,19 12,91 39,79 16,66

30 Valor tabulado de χ 2 (9:3:3:1) (0,05), df 3=7,81

Se detectaron plantas albinas en todos los cruces, con independencia de las líneas madres, indicando que un gen mutante relacionado con la clorofila también se segregaba en las poblaciones. De las 24 plantas albinas analizadas, 23 eran dobles mutantes nulas B+D y una aparentemente era de tipo salvaje. Se identificaron cinco plantas verdes 35 de apariencia normal con mutaciones dobles mutantes B+D a partir de las 718 líneas sometidas a ensayo. Tres de ellas procedían del cruce Aus17340b x Aus12509 (BD219, BD303, BD341), una del cruce Aus17340a x Aus12509 (BD54) y una de Aus17340b x Aus12565 (BD636). Los resultados revelan que las mutaciones en los genes SBEIIb en los genomas B y D se encuentran estrechamente ligados a una mutación en un gen relacionado con la clorofila que proporcionaba el fenotipo albino al reunirse los dos loci mutantes. Sin embargo, se identificaron sucesos de

40 recombinación entre el gen SBEIIb y el gen relacionado con la clorofila, dando lugar a líneas normales doble mutantes nulas B+D, aunque a una frecuencia muy baja. Lo anterior indica que los dos genes se encuentran estrechamente ligados, pero que pueden separarse.

Ejemplo 9. SBEIIa y SBEIIb se encuentran ligados en el trigo.

Aislamiento de clones de BAC

Una biblioteca de cósmidos (BAC) de inserciones grandes de cósmido binario construida a partir de A. tauschii variedad meyeri (Moullet et al., 1999) se sondeó con la región del intrón 3 del gen SBEIIb (posiciones 2.019 a 2.391, 50 figura 2) con el fin de aislar BACs que contuviesen el gen SBEIIb. Se aislaron cuatro clones positivos y se denominaron BAC-4, BAC-5, BAC-9 y BAC-12. Para confirmar que contenían el gen SBEIIb, se extrajó el ADN de estos clones, se digirió con HindIII o EcoRI y se llevó a cabo una hibridación southern utilizando la misma sonda (figura 12). El clon BAC-5 mostraba una banda de hibridación fuerte de tamaño ~7,5 kB con EcoRI y cuatro bandas de tamaños ~6,1, 3,6, 2,3 y 1,7 con HindIII (figura 12). Lo anterior demostró la presencia de SBEIIb en BAC-5. Para 55 someter a ensayo la presencia de la región 3' del gen en BAC-5, se llevaron a cabo amplificaciones por PCR en este clon utilizando cebadores específicos diseñados para amplificar los exones 17 (AR2b3pr2F, 5'-GGATATGTATGATTTCATGG-3' [SEC ID nº 22], y AR2b3pr2R, 5'-CCATAAAGTTAAGATAACCC-3') [SEC ID nº 23]

y 20 (AR2b3pr1F, 5'-GACATCAGACCACCAGTACG-3' [SEC ID nº 24] y AR2b3pr1R, 5'-CTTCCCAGGCTTTAAACAGC-3') [SEC ID nº 25], basados en la secuencia de ADNc de SBEIIb. Ambos conjuntos de cebadores amplificaron los productos esperados de tamaños, 128 pb para el exón 17 y de 145 pb para el exón 20, indicando que BAC-5 contenía el extremo 3' de SBEIIb. Se confirmó adicionalmente lo anterior mediante secuenciación del producto de PCR del exón 20.

También se sometió a ensayo BAC-5 para la presencia del gen SBEIIa además de SBEIIb. Las reacciones de secuenciación de nucleótidos utilizando el cebador AR2akpnIF 5'-GGTACCGCAGAAAATATACGAGATTGACCC-3' [SEC ID nº 26] rindieron la secuencia correspondiente a la región del intrón 3 del gen SBEIIa, siendo igual a la secuencia entre las posiciones 2.265 y 2.478 (figura 1) de wSBEII-D1. Este resultado sugiere que SBEIIa también se encontraba presente en BAC-5, e implica que SBEIIa y SBEIIb probablemente se encontraban estrechamente ligados en el trigo.

Hibridación fluorescente in situ (FISH)

Se llevó a cabo la hibridación in situ con F2 del clon genómico wSBEII-D1 (Rahman et al., 2001) y un clon wSBEII-D2 (Rahman et al., 2001) en aplastamientos cromosómicos de Aegilops tauschii y trigo tal como describen Turner et al. (1999). Se verificó la identidad del cromosoma hibridado mediante doble marcaje con pSc119.2, una secuencia repetitiva utilizada para la identificación de cromosomas (Mukai et al., 1990). Ambos clones de wSBEII se hibridaban a la región proximal del cromosoma 2 (figura 13), indicando la proximidad de los dos genes SBEII en el trigo.

Los mutantes nulos de SBEIIb del trigo también son mutantes para SBEIIa

Los mutantes nulos de SBEIIb identificados tal como se ha indicado anteriormente se cribaron para mutaciones en el gen SBEIIa utilizando los cebadores Sr913F (5'-ATCACTTACCGAGAATGGG-3') [SEC ID nº 27] y E6R (5'-CTGCATTTGGATTCCAATTG-3') [SEC ID nº 28]. Se diseñaron estos cebadores para amplificar la región del intrón 5 de wSBEII-D1 y para distinguir los genes SBEIIa en los genomas A, B y D.

Se encontró que los mutantes nulos de genoma D de SBEIIb Aus12565 y Aus12509 también eran mutantes nulos de genoma B del gen SBEIIa. De manera similar, los mutantes nulos de genoma D de SBEIIb Aus17340 y Aus10103 también eran mutantes nulos de genoma D de SBEIIa. Además, las líneas de doble mutante nulo B+D de SBEIIb, BD341 y BD636, también eran dobles mutantes nulos de genoma B+D del gen SBEIIa. Los datos demuestran que SBEIIa y SBEIIb se encuentran estrechamente ligados en el trigo, en contraste con el arroz y el maíz, e indican que las mutaciones para las copias de los genomas B y D de los genes indicados anteriormente presentan mutaciones por deleción.

Triples mutantes nulos de SBEIIa del trigo

Los procedimientos descritos anteriormente pueden utilizarse para aislar mutantes de genoma A de SBEIIa y/o de SBEIIb. Por ejemplo, se utilizan regiones de BAC-5 estrechamente ligadas a SBEIIa y/o a SBEIIb como sondas o para el diseño de cebadores de PCR para el cribado de mutaciones de genoma A de los genes. Los mutantes de genoma A se cruzan con las líneas de doble mutante nulo B+D para producir una línea triple mutante nula A+B+D. Alternativamente, se lleva a cabo la mutagénesis de los doble mutantes nulos de genoma B+D mediante irradiación u otros medios y se identifica un triple mutante nulo que carece totalmente de actividad de SBEIIa y opcionalmente también de actividad de SBEIIb. De esta manera se proporciona una variedad de trigo no transgénica con niveles de amilosa muy elevados.

Ejemplo 10. Mutación del gen SBEIIa en el trigo

Puede conseguirse una mutación del gen SBEIIa en el trigo que conduce a una actividad reducida de SBEIIa mediante irradiación con rayos gamma o mediante mutagénesis química, por ejemplo con sulfonato de etilmetano (EMS). Para las mutaciones inducidas por rayos gamma, se irradian semillas a una dosis de entre 20 y 50 kR de una fuente de 60Co (Zikiryaeva y Kasimov, 1972). Se llevó a cabo la mutagénesis de EMS mediante tratamiento de las semillas con EMS (al 0,03%, v/v) según Mullins et al. (1999). En un fondo de doble mutante nulo B+D, se identificaron granos mutantes basándose en un contenido incrementado de amilosa o una morfología alterada de los gránulos de almidón, y se confirmaron mediante los procedimientos indicados anteriormente. Los mutantes de SBEIIa que conservaban la actividad de SBEIIb puede remutagenizarse y la progenie cribarse para la pérdida de actividad de SBEIIb además de SBEIIa, o el mutante de SBEIIa puede cruzarse con un mutante de SBEIIb para combinar las mutaciones y producir una variedad no transgénica de trigo que carezca sustancialmente de actividad de SBEIIb en el endospermo.

Ejemplo 11. Mutantes SGP-1 del trigo presentan una actividad reducida de SBEIIa y de SBEIIb.

Los genes de la almidón sintasa II (SSII) de los genomas A, B y D del trigo (Triticum aestivum) codifican polipéptidos de 100 a 105 kDa que también se conocen como proteínas 1 de los gránulos del almidón (SGP-1). La SSII (SGP-1) consiste de tres polipéptidos de masas moleculares aproximadas de 100, 104 y 105 kDa que se encuentran codificados por un conjunto homólogo de genes en el brazo corto de los cromosomas 7B, 7A y 7D, respectivamente (Denyer et al., 1995; Yamamori y Endo, 1996). Yamamori et al. (2000) produjeron un mutante nulo de SGP-1 mediante el cruce de las líneas que no presentaban las formas específicas del genoma A, B y D de la proteína SGP1 según ensayo mediante electroforesis de proteínas. El examen de las semillas nulas para SGP-1 demostró que la mutación resultaba en alteraciones en la estructura de la amilopectina, un contenido elevado de amilosa y gránulos de almidón deformados (Yamamori et al., 2000). Además, los experimentos electroforéticos con granos maduros revelaron que los niveles de SBEII unidos a gránulo (SGP-2) y de SSI (SGP-3) se reducían considerablemente. No se conoce cuál es la explicación molecular de la mutación o mutaciones que conducen a la línea nula para SGP-1.

Los presentes inventores llevaron a cabo experimentos para caracterizar adicionalmente una línea del trigo que no carecía por completo de SGP-1 en los gránulos de almidón del grano maduro. Para determinar si los genes SSII se encontraban presentes en cada uno de los genomas A, B y D de la línea nula para SGP-1 del trigo, se extrajo el ADN de la línea nula para SGP-1 del trigo y de trigo de tipo salvaje (de control) cv Chinese Spring y se analizó mediante PCR utilizando las combinaciones de cebadores ssIIa (5'-CCAAGTACCAGTGGTGAACGC-3') [SEC ID nº 29] y ssIIb (5'-CGGTGGGATCCAACGGCCC-3') [SEC ID nº 30] para el genoma B, o ssIIa y ssIIc (5'-CATGTGAGCTAGCTTTCGCCC-3') [SEC ID nº 31] para los genomas A y D. La región amplificada se encontraba entre las posiciones 2.472 y 2.821 pb de wSSIIA (GenBank nº de acceso AF155217) o las regiones correspondientes de wSSIIB o wSSIID. La región amplificada constituía una parte del exón 8 y se seleccionó debido a que permitía discriminar claramente entre los productos de los genomas A, B y D. La amplificación se llevó a cabo utilizando 35 ciclos a 94ºC durante 30 segundos, 60ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 2 minutos. Los fragmentos de PCR producidos a partir de los genomas A, B y D del trigo nulo para SGP-1 presentaban el mismo tamaño que los fragmentos correspondientes producidos a partir de Chinese Spring. La amplificación por PCR de los segmentos génicos de los genes isoamilasa y SSII, que son los genes biosintéticos del almidón situados más estrechamente próximos entre sí, pudieron amplificarse a partir de los genomas A, B y D del trigo nulo para SGP-1. Por lo tanto, el fenotipo nulo para SGP-1 no estaba causado por la deleción de cualquiera de dichos genes en el brazo corto del cromosoma 7.

En el examen mediante microscopía electrónica de barrido, se observó que los gránulos de almidón de semillas nulas para SGP-1 en desarrollo, en el periodo entre los 10 días posteriores a la antesis y la madurez, se encontraban claramente deformados. La distribución de longitudes de cadena del almidón desramificado en el mutante mostraba un incremento de la proporción de cadenas más cortas (hasta DP 8) y una reducción de la proporción de DP 9-22 en el examen mediante electroforesis capilar.

Expresión de almidón sintasas y enzimas ramificadores en el endospermo SGP-1

Se investigó la expresión de las almidón sintasas y de los enzimas ramificadores en los gránulos del almidón en la línea nula para SGP-1 y se comparó con la del cultivar de tipo salvaje Chinese Spring. Con independencia del estadio de desarrollo de las semillas, se producía una reducción significativa de aproximadamente 90% a 96% de las cantidades de SBEII y SSI en los gránulos en la línea nula para SGP-1, además de la ausencia de SSII (figura 14). La utilización de anticuerpos específicos demostró que la banda de SBEII obtenida de los gránulos estaba compuesta de SBEIIa y SBEIIb en una proporción aproximada de 1:3 en Chinese Spring. En el mutante nulo para SGP-1, la cantidad era tan reducida que no pudieron determinarse las proporciones relativas utilizando los anticuerpos. También se produjo una reducción del nivel de GBSS I desde un estadio temprano de desarrollo del grano. Resulta evidente que en el mutante de SGP-1 el nivel de polipéptidos asociados al gránulo de almidón, incluyendo SBEIIa y SBEIIb, es reducido. No se observó reducción del nivel de polipéptidos asociados a gránulo (SBEII y SSI) en los granos de las líneas de trigo utilizadas para producir la línea nula para SGP-1 (Yamamori et al., 2000), lo que sugiere que el efecto está provocado específicamente por la ausencia de SSII.

Los enzimas ramificadores y las almidón sintasas también se analizaron en la fase soluble del endospermo en desarrollo. Mientras que la cantidad relativa de SBEIIb soluble era similar en la línea Chines Spring y en la línea nula para SGP-1, se observó una reducción de la cantidad de SBEIIa en la fase soluble del mutante (figura 15). Sin embargo, lo anterior podría haberse debido en parte a la genealogía de la línea nula para SGP-1.

Dichos datos demuestran que la actividad de SBEIIa puede reducirse pleiotrópicamente mediante mutación del gen SSII. Aunque la mutación de SSII por sí sola condujo a niveles relativos de amilosa en el almidón inferior a 50%, sugiere que las mutaciones en genes aparte de SBEIIa podría combinarse con mutaciones de SBEII para incrementar los niveles de amilosa y para producir almidones alterados.

Ejemplo 12. Inactivación de múltiples isoformas de SBEI

La purificación de enzimas ramificadores de almidón del trigo mediante cromatografía de intercambio aniónico resolvió tres picos de actividad (figura 16, Morell et al., 1997). Los extractos de endospermo del cultivar Chinese Spring (CS) revelaron la presencia de cuatro polipéptidos SBEI en un PAGE no desnaturalizante utilizando un anticuerpo policlonal, anti-WBE-1, cultivado contra un péptido sintético con la secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia N-terminal de la proteína del pico 1 (figura 16B). El análisis de las líneas nulisómicas-tetrasómicas de CS reveló que estos polipéptidos se encontraban codificados en el cromosoma 7; las bandas en la transferencia inmunológica se asignaron a los genomas A (banda A), B (banda B) y D (bandas Di y Dii) y las actividades se denominaron actividades A-major, B-major y D-major, respectivamente. El análisis de transferencia inmunológica de las fracciones purificadas que representaban los picos activos obtenidos mediante cromatografía de intercambio aniónico reveló que el primer pico contenía las actividades de SBEI A-major y D-major, y que el segundo pico contenía la actividad de SBEI B-major (figura 16C).

La localización del gen codificante de la actividad principal de SBEI en el cromosoma 7 es consistente con la localización determinada de tres genes bien caracterizados y relacionados, wSBEI-D2, wSBEI-D3 y wSBEI-D4. La secuencia deducida de la proteína SBEI-mayor muestra que se encuentra codificada por el último de dichos genes, wSBEI-D4 (Rahman et al., 1997; Suzuki et al., 2003). La presencia de un cuarto gen SBEI se sugiere a partir de los datos de hibridación southern (Suzuki et al., 2003).

Identificación de mutaciones nulas de SBEI-major

Con el fin de identificar las mutaciones nulas que no presentaban expresión de una o más isoformas de SBEI, se cribaron colecciones de plasma germinal de trigo mediante detección de transferencia inmunológica de SBEI-major tras electroforesis en gel no desnaturalizante. Se utilizó el anticuerpo anti-wSBEI indicado anteriormente. De los 182 números de acceso de trigo hexaploide australiano, se identificaron 13 líneas que no expresaban SBEI-D major, 16 que no presentaban SBEI-B major, 10 que no presentaban SBEI-A y dos (Bindawarra y Vectis) que no presentaban ni la isoforma A ni la B. Se consideró que estás líneas presentaban mutaciones nulas de los genes SBEI del genoma respectivo. La frecuencia de mutaciones nulas en el gen SBEI-major (~23%) era similar a la del gen GBSS (22%) (Boggini et al., 2001).

Generación de línea triple nula para SBE I-major

A partir del análisis de transferencia inmunológica, resultó evidente que los cultivares Bindwarra y Vectis no presentaban las actividades de SBEI A-major y B-major y se identificó que el cultivar Cadoux no presentaba la actividad D-major. Se cribó mediante inmunotransferencia una población progenie F2 de 185 líneas obtenida del cruce Vectis x Cadoux. Sin embargo, no se obtuvieron líneas que no presentasen ninguna de las tres actividades, sugiriendo que este tipo de progenie presenta una viabilidad reducida o que existe algún tipo de interacción entre los genomas. Por lo tanto, se cruzó la línea de progenie VC3.1.11 que no presentaba las actividades B-major y D-major con una línea Chinese Spring con manipulación cromosómica (CS7AL-15) que no presentaba la actividad A-major. Se cribaron líneas haploides duplicadas mediante PCR utilizando los cebadores ARBE1CF (5'-GGGCAAACGGAATCTGATCC-3') [SEC ID nº 32] y ARA9R (5'-CCAGATCGTATATCGGAAGGTCG-3') [SEC ID nº 33] y mediante transferencia inmunológica, y se encontró que 2 líneas (A113 y D13) de entre 160 no presentaban actividad de SBEI-major en absoluto, según inmunotransferencia en geles no desnaturalizantes. La figura 17 muestra un patrón de segregación representativo de líneas haploides duplicadas que incluye A113 (carril 6).

Se examinó el endospermo de la línea A113 para actividad residual de SBE. Una variedad de trigo de tipo salvaje, D28, mostraba dos picos de actividad de SBEI. En contraste, los extractos de A113 proporcionaron el primer pico pero el segundo pico de actividad faltaba por completo. Las secuencias de aminoácidos obtenidas de la fracción purificada que comprendía dicha actividad indicaban la presencia de una proteína de tipo SBEI en A113. Sin embargo, esta fracción no mostró ninguna reacción con anticuerpos anti-WBEI en un gel no desnaturalizante. La actividad ramificadora en A113 correspondía a una proteína de ~80 kDa que puede ser un enzima de tipo SBEII, debido a que presentaba reactividad cruzada con los anticuerpos de SBE de la patata y de SBEII del maíz.

Estos datos demuestran que pueden generarse líneas mutantes de SBEI en el trigo. La combinación de mutaciones de SBEI con mutaciones de SBEIIa y opcionalmente de SBEIIb produce plantas del trigo que presentan niveles muy altos de amilosa en el almidón del grano.

Ejemplo 13. Identificación de líneas mutantes del trigo que comprenden cromosoma 2A con una mutación en un gen SBEII

En un intento de identificación de una línea de trigo que presentase una mutación en un gen SBEIIa o SBEIIb, se cribaron 2.400 números de acceso hexaploides de trigo para mutaciones nulas de SBEIIb en los genomas A, B o D. Se utilizaron los cebadores AR2b19cF/AR2b23cR en reacciones de PCR en muestras de ADN genómico de plantas del trigo de cada línea, seguido de la digestión de los productos de amplificación con RsaI y la electroforesis en gel. Este marcador amplificó la región del intrón 3 (posiciones nucleótidas 2.085 a 2.336 en el gen SBEIIb del trigo, figura 2) y era específico para SBEIIb. Este cribado resultó en la identificación de tres mutantes nulos para SBEII de genoma D y en dos mutantes nulos para SBEII de genoma B, tal como se ha indicado en los Ejemplos, anteriormente. No se detectaron líneas mutantes que no presentasen la banda del genoma A correspondiente a SBEIIb. Esto sugiere que las líneas de trigo que comprenden el cromosoma 2A con un gen SBEIIb mutante no existen en la naturaleza.

Se utilizó una población de trigo mutante inducida con rayos gamma (fuente: 60Co) generada por Tony Prior y Rohit Mago (CSIRO) para cribar para mutaciones inducidas en SBEII de trigo. Se generó la población de trigo a partir de la progenie F2 de un cruce Gabo 1BL.1RS x Veery 3. Se cribó un total de 2.694 semillas mutantes de esta población, tal como se ha indicado anteriormente, en reacciones de PCR con los cebadores AR2b19cF y AR2b23cR. Se identificaron dos semillas, denominadas MLT2B8 y MLT2D1, procedentes de una planta, que no presentaban el alelo SBEIIb de genoma A (figura 18). No se identificaron semillas en la población que contuviesen mutaciones nulas de SBEIIb en los genomas B o D.

Tal como se muestra en los Ejemplos, anteriormente, los genes SBEIIa y SBEIIb se encuentran estrechamente ligados en el trigo, en el brazo largo del cromosoma 2. De acuerdo con lo anterior, los presentes inventores sometieron a ensayo el ADN de estas semillas para la presencia o ausencia del gen SBEIIa de genoma A utilizando reacciones de PCR con los cebadores Sr913F/E6R. Estos cebadores amplifican la región del intrón 5 de wSBEII-D1 (posiciones nucleótidas 2.959 a 3.189, figura 1 [SEC ID nº 1]). Tras la amplificación, los productos se sometieron a electroforesis en un gel de secuenciación al 5% (ABI Prism, secuenciador de ADN). Los productos marcados fluorescentemente se analizaron utilizando el programa Genescan. Los perfiles del barrido mostraron que los productos de amplificación para las semillas mutantes MLT2B8 y MLT2D1 no presentaban el producto correspondiente al gen SBEIIa de genoma A, indicando que ambas semillas presentaban alelos nulos para SBEIIa de genoma A además de SBEIIb.

Las mutaciones nulas en estas semillas se confirmaron adicionalmente mediante la utilización de un marcador específico del genoma A para SBEIIa, ARIIaAF (5'-GCAAAAGCCAGATCATAAATTTAGAGC-3') [SEC ID nº 34] y ARIIaAR (5'-CTTCCAATTCATTGTTAATGGTCACAC-3') [SEC ID nº 35] que amplifican únicamente el producto del gen SBEIIa de genoma A (posiciones nucleótidas 3.024 a 3.131 de wSBE II-DA1, figura 1). Aunque esta pareja de cebadores amplificó un producto de 110 pb del material vegetal procedente de la variedad Chinese Spring, este producto se encontraba claramente ausente de las dos semillas putativamente mutantes. Ocurre igualmente en el control negativo dt2AS, que es una línea con cromosoma manipulado de Chinese Spring que carece del brazo largo del cromosoma 2A. Debido a que los genes SBEIIa y SBEIIb se encuentran situados en el brazo largo del cromosoma 2, esta línea no presenta el alelo del genoma A de ambos genes indicados y por lo tanto podría utilizarse como control negativo (figura 19).

Se cultivaron los embriones procedentes de las semillas mutantes MLT2B8 y MLT2D1, que se identificó que eran mutantes de genoma A de SBEIIa y SBEIIb, hasta producir plantas. El almidón obtenido de las semillas de estas plantas se analizó para su contenido de amilosa, longitud de cadena y otras propiedades con el fin de determinar si las mutaciones nulas de tanto SBEIIa como SBEIIb en el genoma A afectaban a las propiedades del almidón.

Tal como se ha indicado anteriormente, se generaron cinco líneas que presentaban una mutación en los genes tanto SBEIIa como SBEIIb de los genomas B y D. De éstas, se cultivaron las líneas BD 219 y BD 636 en un invernadero y se cruzaron con las líneas mutantes nulas de A denominadas MLT2B8 y MLT2D1. Se generó una población haploide duplicada a partir de las semillas F1 de estos cruces, proporcionando plantas triple mutantes nulas homocigóticas. Estas plantas triple mutantes nulas deberían aparecer en las población haploides duplicadas con una frecuencia de 1 en 8. Las mutaciones nulas de genoma A pueden combinarse con las mutaciones de genoma B o con las mutaciones de genoma D mediante cruces similares. En cruces adicionales, puede introducirse cualquiera de los alelos nulos en cualquier fondo genético adecuado para características agronómicas u otras.

Se llevaron a cabo los cruces siguientes para producir trigo Durum (tal como, por ejemplo, la variedad Wollaroi) que presentase mutaciones en SBEIIa y SBEIIb de genoma A:

1) Wollaroi x MLT2B8 ó MLT2D1, produciendo trigo Durum nulo para SBEIIa/SBEIIb de genoma A en fondo de Wollaroi,

2) trigo Durum nulo de genoma A (Wollaroi) x línea de trigo nulo para SBEIIa/SBEIIb de genoma B, produciendo trigo Durum doble nulo SBEIIa/SBEIIb de genoma AB (Wollaroi).

Alternativamente,

1) Wollaroi x línea de trigo nulo de genoma B, produciendo trigo Durum nulo de genoma B (Wollaroi)

2) trigo Wollaroi nulo de genoma B x línea de trigo nulo de genoma A, produciendo trigo Durum doble nulo SBEIIa/SBEIIb de genoma AB

Estos cruces resultaron en la generación de trigo Durum de alto contenido en amilosa que presentaba usos finales específicos con beneficios de salud similares a los del trigo hexaploide de alto contenido en amilosa.

Ejemplo 14. Confirmación del alto contenido de amilosa en el grano mediante procedimientos de separación en columna de sefarosa 2B

Se determinó el contenido de amilosa del almidón en el grano de plantas de trigo transgénico que contenían constructos genéticos inhibidores de SBEIIa/SBEIIb mediante un procedimiento de separación en columna de

sefarosa. En este procedimiento, se separaron las moléculas de almidón en la columna basándose en su peso molecular. A continuación, las fracciones separadas se sometieron a ensayo utilizando el kit de ensayo de almidón (Sigma) según las instrucciones del proveedor.

Se disolvieron aproximadamente 10 mg de almidón en 3,0 ml de NaOH 1 N (desgasificado) mediante incubación a 37ºC durante 30 minutos. La solución de almidón se centrifugó durante 15 minutos para peletizar los componentes no disueltos. Se cargó el sobrenadante en una columna de sefarosa CL2B a una velocidad de bombeo de 1 ml/minuto. Se utilizó la columna con NaOH 10 mM como tampón y se recogieron cincuenta fracciones de 2,5 ml. El pH de las fracciones 9 a 50 se ajustó a 4,5 con 35 µl de HCl 1 M. Se transfirió una alícuota (250 µl) de c ada muestra a un tubo, seguido de la adición de 250 µl de reactivo de almidón (kit de ensayo de almidón, Sigma). Los controles incluían: un blanco de reactivo de ensayo de almidón que contenía únicamente reactivo de almidón (250 µl) y agua (250 µl), un blanco de reactivo de ensayo de glucosa que contenía únicamente 500 µl de agua, un blanco de muestra que contenía únicamente 250 µl de muestra de almidón y 250 µl de agua y una muestra de ensayo que contenía únicamente 250 µl de reactivo de almidón y 250 µl de muestra de almidón. Las muestras y los controles se incubaron a 60ºC durante 60 minutos y después se transfirieron 200 µl de cada una a un tubo nuevo seguido de la adición de 1 ml de reactivo de glucosa (kit de ensayo de almidón, Sigma) y la incubación a 37ºC durante 30 minutos. Se utilizó la absorbancia a 340 nm para determinar la cantidad de almidón (mg) en cada fracción según las instrucciones proporcionadas por el kit.

El cromatograma de las muestras de almidón reveló dos picos eluídos de la columna de sefarosa. Se calculó el contenido de amilosa (segundo pico) de cada muestra como porcentaje de la cantidad total de almidón en ambos picos.

Utilizando dicho procedimiento se calculó que el contenido de amilosa de la línea transgénica SBEIIa-dc nº de acceso 144087, que se demostró que era homocigótica para el transgén, era de 78%, mientras que el de la línea transgénica de SBEIIb-dc nº de acceso 144008 (línea transgénica homocigótica del suceso IIb 110.16b) era de 23% (figura 20). A título comparativo, el procedimiento yodométrico proporcionó un contenido de amilosa para dichas líneas de 88,47% y 27,29%, respectivamente (Tabla 10).

Se analizaron las propiedades funcionales, tales como la temperatura de gelatinización, la viscosidad de la pasta y el volumen de hinchado del almidón mediante calorimetría de barrido diferencial (DSC), analizador Rapid Visco (RVA) y ensayo de poder de hinchamiento del almidón, respectivamente. La estructura de estos almidones se analizó mediante cristalografía de rayos X y análisis del tamaño de partícula.

Tabla 10. Contenido de amilosa de lineas de trigo transgénico estimado mediante el procedimiento yodométrico

Línea: Enzima diana Nº de suceso Contenido de amilosa (%)

NB1: No transformado - 31,8

1144008: SBE IIb IIb 110,16b 27,3

144087: SBE IIa IIa 85,3a 88,5

144025: SBE IIa IIa 50,1b 75,8

LSD: - - 7,7

Ejemplo 15. Análisis de distribución de longitudes de cadena.

Se determinó la distribución de las longitudes de cadena de muestras de almidón mediante electroforesis de carbohidratos asistida por fluoróforos (FACE) tras la desramificación de isoamilasa del almidón. En la Tabla 11 se presentan los porcentajes de longitud de cadena de DP 6-11, DP 12-30 y DP 31-60 en el almidón de semillas transgénicas en comparación con controles no transgénicos. En la figura 21 se muestran gráficos de diferencia molar en los que se restaron las distribuciones normalizadas de longitudes de cadena de almidón procedente de líneas transgénicas de alto contenido en amilosa, de la distribución normalizada de almidón procedente de controles no transformados isogénicos.

Tabla 11. Distribución de longitudes de cadena de almidones desramificados con isoamilasa procedentes de líneas transgénicas de trigo

Línea: Gene diana Nº de suceso DP4-12 DP13-24 DP24-36 >36

NB1: Control no transformado - 57,39 37,38 3,83 1,40

144087: SBEIIa IIa 85,3a 47,40 42,27 6,16 4,17

144025: SBEIIa IIa 50,1b 49,99 44,40 5,60 -

144008: SBEIIb IIb 110,16b 57,98 37,65 4,37 -

Se observó una proporción significativamente menor de longitudes de cadena de DP 4-12 en almidón procedente de semillas transgénicas para SBEIIa-dc en comparación con el almidón procedente de semillas no transformadas o de semillas transgénicas para SBEIIb-dc. La proporción de longitudes de cadena >13 era más alta en las semillas transgénicas para SBEIIa-dc que en las otras. Estos resultados sugieren la posibilidad de que SBEIIa se encuentre selectivamente implicado en la síntesis de cadenas más cortas, de DP 4-12, en el almidón del trigo. Sin embargo, en el almidón del mutante de SSIIa, se observó un incremento de la proporción de longitudes de cadena más cortas en la amilosa.

Ejemplo 16. Propiedades del almidón de trigo transgénico.

Se analizaron las propiedades físicas de líneas transgénicas para SBEIIa-dc y SBEIIb-dc, incluyendo la temperatura de gelatinización, utilizando un calorímetro de barrido diferencial Diamond de Perkin Elmer. Se mezclaron

10 aproximadamente 20 mg de cada almidón con agua en una proporción 1:2, es decir, con una contenido de humedad de 66,7% y se sellaron en una cápsula de DSC. Se aplicó una tasa de calentamiento de 10ºC por minuto para calentar las muestras de ensayo y de referencia de 0ºC a 150ºC. Los datos se analizaron utilizando el programa disponible en el instrumento.

15 Se observaron dos picos endotérmicos en la curva de DSC del termograma para cada almidón. El primer pico representa la descomposición de la estructura cristalina durante la gelatinización del almidón. El segundo pico representa la endoterma de disociación de amilosa-lípido. La temperatura del pico de gelatinización del almidón procedente de líneas transgénicas para SBEIIa-dc mostró un incremento de aproximadamente 7 a 10ºC en comparación con l temperatura de pico para un almidón de control no transformado, y un incremento de

20 aproximadamente 3 a 7ºC en comparación con el almidón procedente de una línea transgénica para SBEIIb-dc.

Tabla 12. Propiedades térmicas del almidón de trigo transgénico medidas mediante calorimetría de barrido diferencial (DSC)

Líneas: Enzima diana Pico 1 (Gelatinización) Pico 2 (disociación amilosa-lípido)

Inicio: Pico Final Área □ H Inicio Pico Final □ H

008: SBE IIb 58,8 63,7 70,8 234,8 4,5 93,2 103,5 110,3 0,7

012: SBE IIb 59,0 64,1 70,8 262,6 4,3 94,5 103,1 109,7 0,6

121: SBE IIa 53,7 67,5 86,9 156,4 2,6 92,4 102,9 108,9 0,7

087: SBE IIa 53,1 71,9 85,9 142,6 2,4 95,7 102,7 108,9 0,7

114: SBE IIa 53,0 68,1 88,0 125,2 2,1 92,8 102,5 109,6 0,8

109c: Control * 55,9 60,7 68,8 234,3 3,9 97,2 104,6 109,9 0,4

25 Se apreció un marcado incremento de la temperatura de final de gelatinización (primer pico), de aproximadamente 16 a 19ºC, en estas líneas en comparación con tanto el control no transformado como las líneas transgénicas para SBEIIb-dc. La temperatura de inicio de gelatinización se presentó aparentemente antes en las líneas transgénicas para SBEIIa-dc que en las líneas transgénicas para SBEIIb-dc. Ng et al. (1997) informaron de una temperatura de

30 inicio de la gelatinización del almidón de maíz extensor de amilosa (ae) similar al del almidón de maíz normal, aunque se producía un incremento significativo de la temperatura del pico de gelatinización en el almidón ae en comparación con el almidón normal. La entalpía de gelatinización del almidón procedente de líneas transgénicas para SBEIIa-dc era significativamente inferior a la de tanto el control como las líneas de SBEIIb-dc. Lo anterior aparentemente refleja el área significativamente menor del pico de gelatinización, lo que representa una cantidad

35 reducida de amilopectina en las líneas transgénicas para SBEIIa-dc. No se observó ninguna alteración significativa del pico de disociación amilosa-lípido en ninguna de las líneas transgénicas. Por lo tanto, se ha obtenido almidón con este nuevo conjunto de propiedades.

Referencias

40 Abel et al., (1996). The Plant Journal 10, 981-991.

Anderson et al., (1989). Nucl Acids Res 17, 461462.

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Listado de secuencias

<110> Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation Biogemma S.A.S GF Group Services Pty Ltd

<120> Trigo con alteraciones de la actividad de enzima ramificador y del almidón, y productos que contienen almidón derivados a partir del mismo

<160> 35

<210> 1

<211> 11476

<212> ADN

<213> Aegilops tauschii

<223> wSBEII-D1 gen

<400> 1

<210> 2

<211> 6520

<212> ADN

<213> Tritium aestivum

<223> gen parcial wSBEIIb

<210> 3

<211> 420

<212> ADN <213> Triticum aestivum

<223> gen parcial wSBEIIa del genoma A o B

<400> 3 y11282

<210> 4

<211> 419 10 <212> ADN

<213> Triticum aestivum

<223> gen parcial wSBEIIa del genoma A o B

<210> 5

<211> 413

<212> ARN 20 <213> Triticum aestivum

<223> gen parcial wSBEIIa de genoma D

<400> 5

<210> 6

<211> 408

<212> ADN

<213> Tritium aestivum 30 <223> gen parcial wSBEIIa del genoma A o B

<400> 6

35 <210> 7

<211> 818

<212> PRT

<213> Triticum aestivum

<223> proteína wSBEIIa del genoma A o B 40

<400> 7

<210> 8

<211> 833

<212> PRT

<213> Triticum aestivum

<223> proteína wSBEIla del genoma D

<400> 8

<210> 9 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia artificial <223> Cedabor

<400> 9 cccgctgctt tcgctcattt tg: 22

<210> 10 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial <223> Cebador

<400> 10 gactaccgga gctcccacc ttc: 23

<210> 11 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia artificial <223> Cebador

<400> 11 agatgtgaat ggctgcttgc tg: 22

<210> 12 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia artificial <223> Cebador

<400> 12 caggtcgacc atatgggaga gc: 22

<210> 13 <211> 18 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<223> péptido sintético

<400> 13

<210> 14

<211> 12

<212> PRT

<213> Secuencia artifical

<223> péptido sintético

<400> 14

<210> 15 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia artificial <223> Cebador

<400> 15 atcacttacc gagaatggg: 19

<210> 16 <211> 20 <212> ARN <213> Secuencia artificial <223> Cebador

<400> 16 ctgcatttgg attccaattg: 20

<210> 17 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial <223> Cebador

<400> 17 cacccattgt aattgggtac actg: 24

<210> 18 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial <223> Cebador

<400> 18 tccatgcctc cttcgtgttc atca: 24

<210> 19 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial <223> Cebador

<400> 19 ctgcgcataa atccaaactt ctcg: 24

<210> 20

<211> 23 <212> ARN <213> Secuencia artificial <223> Cebador

<400> 20 ctatgccaat tgaacaacaa tgc: 23

<210> 21 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia artificial <223> Cebador <400> 21 cgtgttcatc aatgtctgaa cg: 22

<210> 22 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial <223> Cebador

<400> 22 ggatatgtat gatttcatgg: 20

<210> 23 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial <223> Cebador

<400> 23 ccataaagtt aagataaccc: 20

<210> 24 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial <223> Cebador

<400> 24 gacatcagac caccagtacg: 20

<210> 25 <211> 20 <212> ARN <213> Secuencia artificial <223> Cebador

<400> 25 cttcccaggc tttaaacagc: 20

<210> 26 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial <223> Cebador

<400> 26 ggtaccgcag aaaatatacg agattgaccc: 30

<210> 27 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<223> Cebador

<400> 27 atcacttacc gagaatggg: 19

<210> 28 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial <223> P Cebador

<400> 28 ctgcatttgg attccaattg: 20

<210> 29 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial <223> Cebador

<400> 29 ccaagtacca gtggtgaacg c: 21

<210> 30 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia artificial <223> Cebador

<400> 30 cggtgggatc caacggccc: 19

<210> 31 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial <223> Cebador

<400> 31 catgtgagct agctttcgcc c: 21

<210> 32 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial <223> Cebador <400> 32 gggcaaacgg aatctgatcc: 20

<210> 32 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial <223> Cebador

<400> 32 gggcaaacgg aatctgatcc: 20

<210> 33 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial <223> Cebador

<400> 33 ccagatcgta tatcggaagg tcg: 23

5: <210> 34 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial <223> Cebador

10 15: <400> 34 gcaaaagcca gatcataaat ttagagc <210> 35 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia artificial <223> Cebador 27

<400> 35 cttccaattc attgttaatg gtcacac: 27

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Grano obtenido a partir de una planta del trigo, que comprende almidón, en el que la proporción de amilosa en el almidón del grano es de por lo menos 50%, comprendiendo dicho grano un nivel reducido de la proteína SBEIIa, actividad de enzima SBEIIa o ambos en el endospermo en comparación con el grano de tipo salvaje, y que comprende una variación genética que conduce a una reducción del nivel de expresión del gen SBEIIa, de la actividad del enzima SBEIIa en el endospermo, o de ambos, respecto al grano de tipo salvaje, comprendiendo dicha variación genética una mutación en un gen SBEIIa o un ácido nucleico introducido que codifica un inhibidor de la expresión del gen SBEIIa en el que dicho inhibidor es una molécula antisentido, cosupresora, ribozima o dúplex de ARN que presenta como diana el gen SBEIIa.
2.

Grano según la reivindicación 1, en el que el nivel de la proteína SBEIIa, de actividad del enzima SBEIIa o de ambas en el endospermo se encuentra reducido en por lo menos 50% respecto al grano de tipo salvaje.
3.

Grano según la reivindicación 1 ó 2, en el que la variación genética comprende una mutación en un gen SBEIIa que conduce a un nivel reducido de la proteína SBEIIa, de actividad del enzima SBEIIa o de ambos en el endospermo respecto al grano de tipo salvaje.
4.

Grano según la reivindicación 1, 2 ó 3, que comprende una mutación nula en por lo menos un gen SBEIIa.
5.

Grano según la reivindicación 4, en el que la planta es hexaploide y el grano comprende mutaciones nulas en dos o tres genes SBEIIa.
6.

Grano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende además un nivel reducido de la proteína SBEIIb, de actividad enzimática o de ambas respecto al grano de tipo salvaje.
7.

Grano según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, que comprende una mutación en el que el gen SBEIIa se encuentra ausente del brazo largo del cromosoma 2A o en el que el gen SBEIIa en el brazo largo del cromosoma 2A comprende una mutación que conduce a unas proteína SBEIIa, actividad del enzima SBEIIa reducidas o a ambas, en el endospermo de dicho grano respecto al grano de tipo salvaje.
8.

Grano según la reivindicación 7, en el que la mutación es una mutación nula del gen SBEIIa.
9.

Grano según la reivindicación 7 ó 8, en el que el gen SBEIIa en el brazo largo del cromosoma 2A comprende una mutación que conduce a unas proteína SBEIIa, actividad del enzima SBEIIa reducidas, o a ambas, en el endospermo de dicho grano respecto al grano de tipo salvaje, y en el que dicha mutación es una deleción de parte del gen SBEIIa.
10.

Grano según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, que comprende además una mutación en el que el gen SBEIIb se encuentra ausente del brazo largo del cromosoma 2A o en el que el gen SBEIIb en el brazo largo del cromosoma 2A comprende una mutación que conduce a unas proteína SBEIIb, actividad del enzima SBEIIb reducidas, o a ambas, en el endospermo de dicho grano respecto al grano de tipo salvaje.
11.

Grano según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el que la deleción interrumpe la expresión de tanto el gen SBEIIa como el gen SBEIIb en el brazo largo del cromosoma 2A.
12.

Grano según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el que la planta es una planta de trigo durum.
13.

Grano según la reivindicación 12, que comprende además una variación genética que conduce a una actividad de enzima ramificador del almidón reducida codificada por el gen SBEIIa en el brazo largo del cromosoma 2B respecto al grano de tipo salvaje, en el que dicha variación genética comprende una ausencia de gen SBEIIa del brazo largo del cromosoma 2B o una mutación del gen SBEIIa del brazo largo del cromosoma 2B que conduce a una actividad del enzima SBEIIa reducida en el endospermo de dicho grano respecto al grano de tipo salvaje.
14.

Grano según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el que la planta es Triticum aestivum ssp aestivum.
15.

Grano según la reivindicación 14, que comprende una variación genética que conduce a una actividad de enzima ramificador del almidón reducida codificada por el gen SBEIIa en el(los) brazo(s) largo(s) del cromosoma 2B, del cromosoma 2D o ambos cromosomas, respecto al grano de tipo salvaje, en el que dicha variación genética comprende una ausencia de gen SBEIIa de por lo menos uno de dichos cromosomas o una mutación del gen SBEIIa de por lo menos uno de dichos cromosomas que conduce a una actividad reducida del enzima SBEIIa en el endospermo de dicho grano respecto al grano de tipo salvaje.
16.

Grano según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 15, en el que el nivel de actividad del enzima SBEIIa es reducido en por lo menos 40% respecto al grano de tipo salvaje.
17.

Grano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que la amilopectina del grano presenta una proporción reducida de la fracción de longitud de cadena de 4 a 12 dp respecto a la amilopectina del grano de tipo salvaje, medida tras la desramificación con isoamilasa de la amilopectina.
18.

Grano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 que es no arrugado.
19.

Grano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 que presenta un peso medio de por lo menos 36 mg.
20.

Grano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en el que por lo menos 50% de los gránulos de almidón del grano presentan una apariencia no birrefringente al observarlas bajo luz polarizada.
21.

Grano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en el que el contenido de almidón del grano en el caso de que esté desnudo es de por lo menos 25% (p/p) o que presenta un contenido de almidón que es por lo menos 90% del contenido de almidón del grano de tipo salvaje.
22.

Grano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 que es un grano integral o molido, pulverizado, perlado, laminado, triturado o precocido.
23.

Grano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, que comprende además un nivel reducido de la proteína SBEI, de actividad del enzima SBEI o de ambos.
24.

Grano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23, que comprende además un nivel alterado de un enzima en comparación con el grano de tipo salvaje, en el que dicho enzima se selecciona de entre el grupo constituido por ADP glucosa pirofosforilasa, GBSS, SSI, SSII, SSIII, un enzima desramificador de tipo isoamilasa, un enzima desramificador de tipo pululanasa y cualquier combinación de los mismos.
25.

Planta del trigo que puede producir el grano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24.
26.

Planta del trigo según la reivindicación 25 que es Triticum Aestivum ssp. aestivum o Triticum turgidum L. ssp. durum.
27.

Gránulos de almidón extraídos del grano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, en los que la proporción de amilosa en el almidón de los gránulos es de por lo menos 50%.
28.

Almidón extraído del grano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, en el que la proporción de amilosa en dicho almidón de los gránulos es de por lo menos 50%.
29.

Producto que comprende el grano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, o harina, harina integral, sémola o almidón producido(a) a partir del grano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, o cualquier combinación de los mismos.
30.

Producto según la reivindicación 29, en el que la harina, harina integral, sémola o almidón se combina con harina, harina integral, sémola o almidón procedente de otra fuente.
31.

Producto según la reivindicación 29 que es un producto no alimenticio.
32.

Composición que comprende el almidón según la reivindicación 28 y otro ingrediente alimenticio o agua.
33.

Procedimiento para producir una planta del trigo que puede producir grano que comprende las etapas siguientes:

i) introducir una variación genética en una planta o semilla madre de trigo, conduciendo dicha variación genética a una reducción del nivel de expresión del gen SBEIIa, de la actividad del enzima SBEIIa en el endospermo, o a ambos, con respecto al grano de tipo salvaje, que comprende la introducción de un ácido nucleico que codifica un inhibidor de la expresión del gen SBEIIa en una célula regenerable de trigo y regenerar una planta de trigo transgénico a partir de la célula transformada, en el que dicho inhibidor es una molécula antisentido, cosupresora, ribozima o dúplex de ARN que presenta como diana el gen SBEIIa,e

ii) identificar una planta o semilla progenie de la planta o semilla madre de trigo, que presenta un nivel reducido de expresión del gen SBEIIa, de actividad del enzima SBEIIa en el endospermo, o ambas, con respecto al grano de tipo salvaje,

en el que el grano comprende almidón y en el que la proporción de amilosa en el almidón del grano es de por lo menos 50%.
34.

Procedimiento de producción de almidón, que comprende: (i) obtener grano según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, e (ii) extraer el almidón de dicho grano.
35.

Procedimiento de producción de una planta del trigo que puede producir grano, que comprende las etapas siguientes:

i) introducir una variación genética en una planta o semilla madre de trigo, conduciendo dicha variación genética a una reducción del nivel de la expresión del gen SBEIIa, de la actividad del enzima SBEIIa en el endospermo, o a ambas, con respecto al grano de tipo salvaje, que comprende:

o inducir artificialmente una mutación en la semilla o planta madre de trigo con un agente químico o radiación,

o identificar una planta o semilla del trigo que presenta una mutación en un gen SBEIIa o un gen SBEIIb, que comprende las etapas que consisten en cribar una población de plantas o semillas del trigo con un marcador molecular que se encuentra ligado al gen SBEIIb, o al gen SBEIIa, respectivamente, del trigo; e identificar la planta o semilla basándose en la presencia o ausencia del marcador molecular ligado, e

ii) identificar una planta o semilla progenie de la planta o semilla madre del trigo, que presenta un nivel reducido de expresión del gen SBEIIa, de actividad del enzima SBEIIa en el endospermo, o ambas, respecto al grano de tipo salvaje;

en el que el grano comprende almidón y en el que la proporción de amilosa en el almidón del grano es de por lo menos 50%.
36. Procedimiento de producción de una planta del trigo que puede producir grano que comprende las etapas siguientes:

i) introducir una variación genética en una planta o semilla madre del trigo, conduciendo dicha variación genética a una reducción del nivel de expresión del gen SBEIIa, de la actividad del enzima SBEIIa en el endospermo, o a ambas, con respecto al grano de tipo salvaje, que comprende:

o inducir artificialmente una mutación en una semilla o planta madre del trigo con un agente químico o radiación,

o identificar una planta o semilla del trigo que presenta una mutación en un gen SBEIIa, o un gen SBEIIb, que comprende las etapas que consisten en cribar una población de plantas o semillas del trigo con un anticuerpo que es específico para la proteína SBEIIb o la proteína SBEIIa, respectivamente, del trigo, e identificar la planta o semilla basándose en la presencia o ausencia de unión del anticuerpo, e

ii) identificar una planta o semilla progenie de la planta o semilla madre del trigo, que presenta un nivel reducido de expresión del gen SBEIIa, de actividad del enzima SBEIIa en el endospermo, o ambas, con respecto al grano de tipo salvaje,

en el que el grano comprende almidón y en el que la proporción de amilosa en el almidón del grano es de por lo menos 50%.