ES2380362T3 - Cebada con una actividad reducida en SSII y productos que contienen almidón con un contenido reducido de amilopectina - Google Patents
Cebada con una actividad reducida en SSII y productos que contienen almidón con un contenido reducido de amilopectina Download PDFInfo
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Abstract
Un grano de una planta de cebada que comprende un gen SSII mutado, de manera que la actividad SSII codificada por dicho gen SSII mutado está suprimida y el contenido total de almidón de dicho grano tiene un contenido relativo de amilosa de al menos un 50% (p/p), determinado por HPLC, y que a) la proporción de cadenas de amilopectina contenidas en el almidón de dicho grano que tienen una longitud comprendida en el intervalo de 6 a 11 residuos es de al menos un 30%, y b) la proporción de cadenas de amilopectina contenidas en el almidón de dicho grano que tienen una longitud comprendida en el intervalo de 12 a 30 residuos es inferior a un 65%, y c) la proporción de cadenas de amilopectina contenidas en el almidón de dicho grano que tienen una longitud comprendida en el intervalo de 31 a 60 residuos es inferior a un 10%.
Description
Cebada con una actividad reducida de SSII y productos que contienen almidón con un contenido reducido de amilopectina
Esta invención se refiere a una planta de cebada con una actividad reducida de la enzima SSII que produce un almidón con un contenido reducido de amilopectina. La invención también se refiere al almidón, los granos y los productos alimentarios obtenidos a partir de dicha planta.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Un descubrimiento de las ciencias de la nutrición consiste en que el almidón resistente tiene importantes repercusiones sobre el estado de la salud intestinal, en particular la salud del intestino grueso. Los efectos beneficiosos del almidón resistente provienen del hecho de que este proporciona un nutriente al intestino grueso, que supone una fuente de energía para la microflora intestinal que se fermenta para formar ácidos grasos de cadena corta, entre otros. Estos ácidos grasos de cadena corta proporcionan nutrientes para los colonocitos, potencian la captación de ciertos nutrientes a través del intestino grueso y propician la actividad fisiológica del colon. En general, si no se proporcionan almidones resistentes u otras fibras dietéticas, el colon se vuelve relativamente inactivo desde el punto de vista metabólico.
En los últimos años, se han dirigido esfuerzos a obtener almidones resistentes a partir de varias fuentes para resolver el problema de la salud intestinal. Por consiguiente, se han desarrollado almidones con un contenido elevado de amilosa en ciertos granos tales como el maíz, para ser empleados en alimentos con el fin de favorecer la salud intestinal.
La estructura física del almidón puede tener una gran repercusión sobre las propiedades nutricionales y de manipulación del almidón para productos alimentarios. Ciertas características se pueden interpretar como una indicación de la estructura del almidón, incluidas la distribución de longitudes de cadena de la amilopectina, el grado de cristalinidad y la presencia de formas cristalinas tales como la forma de tipo complejo V del almidón cristalino. Las formas de estas características también se pueden interpretar como indicadores de las propiedades nutricionales y de manipulación de los alimentos que contienen estos almidones. De este modo, una longitud de cadena de la amilopectina corta puede ser un indicador de una cristalinidad baja y una gelatinización baja, y también se cree que presenta una correlación con una retrogradación reducida de la amilopectina. De forma adicional, se cree que una distribución de longitudes de cadena de amilopectina más cortas refleja las propiedades organolépticas del alimento en el que el almidón está incluido en cantidades significativas. Una cristalinidad reducida de un almidón también puede ser indicativa de una temperatura de gelatinización reducida del almidón y se cree, además, que está asociada con unas propiedades organolépticas mejoradas. La presencia de la cristalinidad del complejo V u otro lípido asociado con el almidón potenciará el nivel de almidón resistente y, de este modo, la fibra dietética.
En el pasado se han identificado líneas de cebada que contienen almidón con un contenido elevado de amilosa. Estas líneas solamente han proporcionado aumentos relativamente modestos del contenido de amilosa hasta un máximo de aproximadamente un 45% del almidón total, como en la variedad de cebada conocida como glaciar de elevado contenido de amilosa (AC38). Aunque los almidones con un contenido elevado de amilosa de este tipo son útiles, se prefiere un almidón con un contenido de amilosa todavía más elevado, y se cultivan otras especies de grano determinadas para que tengan almidones con un contenido más elevado de amilosa, con niveles en el intervalo del 90 por ciento. Estos almidones son muy resistentes a la digestión y proporcionan un beneficio mayor para la salud.
La obtención de almidones con un contenido elevado de amilosa conlleva un problema, porque los almidones con un contenido elevado de amilosa conocidos también presentan una temperatura de gelatinización elevada. La temperatura de gelatinización refleja la energía de conminución necesaria para procesar los alimentos de este tipo. De esta manera, normalmente se requieren temperaturas más elevadas para procesar grano o harina con el fin de producir alimentos a partir de dichos granos o almidones. De este modo, en general los productos que contienen almidones con un contenido elevado de amilosa son más caros. De forma similar, desde el punto de vista del consumidor, pueden ser necesarios tiempos más prolongados y temperaturas más elevadas para preparar los productos fabricados o para obtener alimentos a partir de harina que contiene almidones con un contenido elevado de amilosa. De este modo, el hecho de incorporar almidones con un contenido elevado de amilosa en los alimentos supone una desventaja significativa.
Otro componente nutritivo de los granos y, en particular, de la cebada son los �-glucanos. Los �-glucanos están constituidos por unidades de glucosa enlazadas mediante uniones glicosídicas � (1-4) y/o � (1-3) que no se degradan por la acción de las enzimas digestivas humanas, lo que los hace adecuados como fuentes de fibra dietética. Los �-glucanos pueden ser parcialmente digeridos por bacterias endógenas del colon, cuyo proceso de fermentación genera ácidos grasos de cadena corta (principalmente acetato, propionato y butirato), los cuales son beneficiosos para las células de la mucosa que revisten el intestino y el colon (Sakata y Engelhard Comp. Biochem Physiol. 74a:459-462 (1983)).
La ingesta de �-glucano también tiene como efecto el aumento de la excreción de ácido bílico, lo que provoca una reducción de las lipoproteínas de baja densidad (LDL) y el colesterol totales en suero, con una reducción del riesgo de enfermedades coronarias. De forma similar, los �-glucanos actúan atenuando las oscilaciones de la concentración de glucosa posprandial en sangre. Se cree que estos dos efectos se basan en el aumento de la viscosidad del contenido del estómago y los intestinos.
La composición de los alimentos que contienen almidones y la estrecha relación de estos almidones con otros nutrientes u otros componentes pueden tener repercusiones significativas sobre el valor nutricional de estos alimentos o sobre las características funcionales de estos componentes en la preparación o la estructura de los alimentos.
Aunque los almidones o �-glucanos modificados, por ejemplo, se pueden emplear en alimentos que proporcionan una funcionalidad que no se puede conseguir normalmente con fuentes no modificadas, el procesamiento de este tipo tiene tendencia a alterar otros componentes de valor o a asociarse con la percepción de que es indeseable debido a los procesos implicados en la modificación. Por consiguiente, es preferible proporcionar fuentes de constituyentes que se puedan emplear en los alimentos en su forma no modificada.
La variedad de cebada MK6827 se puede obtener de la colección de germoplasma de cebada (centro de investigación nacional de germoplasma de granos pequeños USDA-ARS, Aberdeen, Idaho 831290 EE. UU.). El grano de MK6827 está encogido y presenta una cáscara muy coloreada y una forma alargada; según los inventores, es muy difícil procesar este grano, entre otras cosas, porque es muy resistente a la molienda. Las propiedades del grano MK6827 no han sido caracterizadas anteriormente, no se ha determinado la naturaleza de la mutación ni tampoco se considera adecuado para producir alimentos.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
Esta invención se basa en el aislamiento y la caracterización de plantas de cebada con SSII mutante, cuyo grano se ha descubierto que contiene almidón con un contenido reducido de amilopectina y, por consiguiente, niveles relativos elevados de amilosa y, por consiguiente, contiene niveles elevados de fibra dietética.
El grano del mutante y el grano de los cruces entre ciertos códigos genéticos contienen además un nivel elevado de
�-glucano. Los inventores creen que la combinación de un nivel elevado de �-glucano y almidón resistente que contribuye a un contenido elevado de fibra dietética es única de la presente invención.
De forma adicional, al menos para algunos códigos genéticos, se ha descubierto que el grano de dichos mutantes contiene almidón con niveles relativos elevados de amilosa y presenta además temperaturas de gelatinización bajas. Las características de hinchamiento reducido del almidón de este tipo durante y tras la gelatinización también presentan ventajas en ciertas aplicaciones dietéticas y de procesamiento de alimentos.
Además, se ha descubierto que el grano de dichos mutantes contiene almidón con niveles relativos elevados de amilosa; los niveles de amilosa determinados son superiores a un 50% del contenido de almidón, que representa un nivel que no se había detectado nunca anteriormente en el almidón no modificado procedente de la cebada.
El almidón de los mutantes y las líneas retrocruzadas derivadas de los mutantes (hasta el punto que los retrocruces se han evaluado) muestran un almidón resistente, con una estructura alterada que se manifiesta mediante unas características físicas específicas, que incluyen una o más del grupo que comprende la presencia de un contenido relativo elevado de amilosa, una inaccesibilidad física por tener un contenido elevado de �-glucano, una morfología alterada del gránulo y la presencia de lípidos asociados al almidón; y manifestándose la estructura alterada mediante una característica seleccionada entre una o más del grupo que comprende una cristalinidad baja, una distribución de longitudes de cadena de amilopectina reducida y una presencia de lípidos asociados al almidón apreciables.
De forma adicional, hasta ahora el grano derivado de las plantas mutantes de cebada se puede emplear fácilmente en procedimientos de procesamiento de alimentos.
En un aspecto, la invención se refiere a un grano de una planta de cebada que comprende un gen SSII mutado, de manera que la actividad SSII codificada por dicho gen SSII mutado está suprimida y el contenido total de almidón de dicho grano tiene un contenido relativo de amilosa de al menos un 50% (p/p), y que a) la proporción de cadenas de amilopectina contenidas en el almidón de dicho grano que tienen una longitud comprendida en el intervalo de 6 a 11 residuos es de al menos un 30%, y b) la proporción de cadenas de amilopectina contenidas en el almidón de dicho grano que tienen una longitud comprendida en el intervalo de 12 a 30 residuos es inferior a un 65%, y c) la proporción de cadenas de amilopectina contenidas en el almidón de dicho grano que tienen una longitud comprendida en el intervalo de 31 a 60 residuos es inferior a un 10%. En otro aspecto, la invención se refiere a una planta capaz de producir un grano de acuerdo con la invención. En un aspecto adicional, la invención se refiere al almidón de una planta de cebada, donde dicho almidón tiene un contenido relativo de amilosa de al menos un 50% (p/p) y donde a) la proporción de cadenas de amilopectina contenidas en el almidón que tienen una longitud
comprendida en el intervalo de 6 a 11 residuos es de al menos un 30%, y b) la proporción de cadenas de amilopectina contenidas en el almidón que tienen una longitud comprendida en el intervalo de 12 a 30 residuos es inferior a un 65%, y c) la proporción de cadenas de amilopectina contenidas en el almidón de dicho grano que tienen una longitud comprendida en el intervalo de 31 a 80 residuos es inferior a un 10%.
La invención también se refiere al uso de un constructo de ADN para reducir la expresión del gen SSII en una planta de cebada, de manera que el almidón del grano obtenido de dicha planta tiene un contenido relativo de amilosa de al menos un 50% (p/p) y que a) la proporción de cadenas de amilopectina contenidas en el almidón de dicho grano que tienen una longitud comprendida en el intervalo de 6 a 11 residuos es de al menos un 30%, y b) la proporción de cadenas de amilopectina contenidas en el almidón de dicho grano que tienen una longitud comprendida en el intervalo de 12 a 30 residuos es inferior a un 65%, y c) la proporción de cadenas de amilopectina contenidas en el almidón de dicho grano que tienen una longitud comprendida en el intervalo de 31 a 60 residuos es inferior a un 10%; donde dicho constructo de ADN comprende una secuencia que codifica a) una molécula de ARN antisentido capaz de interferir en la transcripción o el procesamiento de la enzima SSII, b) una ribozima, c) una copia adicional en la misma orientación que el gen que codifica la enzima SSII, d) una molécula de ARN bicatenaria o e) un constructo de horquilla diseñado para producir una molécula de ARN bicatenaria capaz de suprimir la actividad SSII endógena.
La invención también se refiere al uso de a) una molécula de ARN antisentido capaz de interferir en la transcripción
o el procesamiento de la enzima SSII, b) una ribozima, c) una copia adicional en la misma orientación que el gen que codifica la enzima SSII, d) una molécula de ARN bicatenaria o e) un constructo de horquilla diseñado para producir una molécula de ARN bicatenaria capaz de suprimir la actividad SSII endógena para reducir la expresión del gen SSII en una planta de cebada, de manera que el almidón del grano obtenido de dicha planta tiene un contenido relativo de amilosa de al menos un 50% (p/p) y que a) la proporción de cadenas de amilopectina contenidas en el almidón de dicho grano que tienen una longitud comprendida en el intervalo de 6 a 11 residuos es de al menos un 30%, y b) la proporción de cadenas de amilopectina contenidas en el almidón de dicho grano que tienen una longitud comprendida en el intervalo de 12 a 30 residuos es inferior a un 65%, y c) la proporción de cadenas de amilopectina contenidas en el almidón de dicho grano que tienen una longitud comprendida en el intervalo de 31 a 60 residuos es inferior a un 10%.
En un aspecto, se puede afirmar que esta descripción se refiere al almidón obtenido del grano de una planta de cebada, teniendo la planta de cebada un nivel reducido de actividad SSII y teniendo dichos gránulos de almidón un contenido elevado de amilosa debido a un contenido reducido de amilopectina.
En otro aspecto, se puede afirmar en términos generales que la descripción se refiere a un grano útil para la producción de alimentos obtenido de una planta de cebada, teniendo la planta de cebada un nivel reducido de actividad SSII y teniendo el almidón de dicho grano un contenido elevado de amilosa debido a un contenido reducido de amilopectina.
En un aspecto adicional más, se podría afirmar en términos generales que la descripción se refiere a una planta de cebada con un nivel reducido de actividad SSII, siendo dicha planta de cebada capaz de albergar un grano, teniendo el almidón de dicho grano un contenido elevado de amilosa debido a un contenido reducido de amilopectina y siendo dicho grano adecuado para la producción de alimentos.
Como alternativa, se podría afirmar que la descripción se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proteína SSU de cebada, siendo dicho ácido nucleico capaz de hibridarse en condiciones rigurosas con SEQ ID NO 1, o a una célula que contiene un vector recombinante replicable que contiene dicha molécula de ácido nucleico. En una forma adicional más, la invención podría referirse a una molécula de ácido nucleico aislada capaz de hibridarse específicamente con SEQ ID NO 1.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Para una mejor comprensión, la invención se describirá a continuación haciendo referencia a una serie de ejemplos.
Figura 1 Análisis de la distribución de tamaños moleculares del almidón, determinado mediante la separación por HPLC del almidón en DMSO al 90%. (a) Himalaya, (b) AC38, (c) 342, (d) 292.
Figura 2 Fotografías que muestran la morfología del grano de las líneas mutantes y parentales. (a) Himalaya,
(b) AC38, (c) 292, (d) Waxiro, (e) 342, (f) Tantangara, (g) MK6827, (h) Sloop. Las dimensiones de longitud (L), ancho (A) y grosor (G) del grano se ilustran en el panel (a).
Figura 3 Análisis de la distribución de longitudes de cadena de varios almidones mutantes y naturales
empleando FACE. (a) Distribución normalizada de longitudes de cadena, (b) comparación de las
distribuciones de longitudes de cadena mediante un gráfico de la diferencia. Las muestras eran 342
) e Himalaya (+).
ٟ ), MK6827 ((.), 292 (e), Tantangara (s), AC38 (
ٟ ), MK6827 ((.), 292 (e), Tantangara (s), AC38 (
- Figura 4
- Análisis RVA de las muestras de almidón de la cebada. Las muestras eran Himalaya ( ), Namoi (L), AC38 (0), 342 (\), 292 (.) y MK6827 (.). El perfil de temperatura empleado durante el perfil se indica mediante la línea continua.
- Figura 5
- Datos de difracción de rayos X para las líneas mutantes y naturales.
- Figura 6
- Micrografías electrónicas de barrido de almidones de cebada aislados. (a) Himalaya, (b) Waxiro, (c) AC38, (d) 292, (e) 342, (f) MK6827.
- Figura 7
- Loci del cromosoma 7H de la cebada que muestra la proximidad de los loci nud1 y sex6. Diagrama obtenido a partir de GrainGenes (http://wheat.pw.usda.govn, Genes morfológicos de la cebada, mapa de 7H, autor: Franckowiak JD).
- Figura 8
- Correlaciones entre las dimensiones de las semillas y la distribución de longitudes de cadena del almidón para las líneas haploides dobles de 292 x Tantangara. Las líneas indicadas con (+) representan el patrón de PCR para Himalaya y las líneas indicadas con (0) representan el resultado de PCR para 292. Panel (A): representación del cociente de la longitud entre el grosor de las semillas frente al porcentaje de cadenas de almidón con DP entre 6 y 11; Panel (B): representación del peso de las semillas frente al porcentaje de cadenas de almidón con DP entre 6 y 11.
- Figura 9
- Secuencia del ADNc de SSII de cebada (SEQ ID NO 1) de la variedad cultivada Himalaya.
- Figura 10
- Estructura de los genes SSII de (1) T. tauschii (trigo diploide), (2) variedad cultivada de cebada Morex. Las líneas gruesas representan exones y las líneas delgadas, intrones. La línea recta debajo de cada ejemplo indica la región de las secuencias genéticas. La línea de puntos representa una región del gen SSII de cebada, desde el intrón 7, cuya secuencia no se ha determinado, pero se ha establecido mediante análisis de PCR que tiene una longitud de aproximadamente 3 kb.
- Figura 11
- Comparaciones de los ADNc de SSII pronosticados para MK6827 (SEQ ID NO 2), Morex (SEQ ID NO 3) y 292 (SEQ ID NO 4), y una secuencia de ADNc de Himalaya (SEQ ID NO 1). Las secuencias pronosticadas se generaron identificando las regiones de las secuencias genómicas presentes en el ADNc de SSII de Himalaya. Se indican el codón de inicio ATG y el codón de parada natural, así como los codones de parada adicionales presentes en MK6827 (#) y 292 (&), respectivamente.
- Figura 12
- Comparación de las secuencias de aminoácidos deducidas a partir de los genes que codifican SSII de las líneas de cebada 292 (SEQ ID NO 7), Morex (SEQ ID NO 5), MK6827 (SEQ ID NO 8), Himalaya (SEQ ID NO 8). Los codones de parada adicionales en 292 y MK6827 se indican con los símbolos (&) y (#), respectivamente.
- Figura 13
- Posición de las mutaciones en MK6827 (SEQ ID NO 2) y 292 (SEQ ID NO 4) en el gen SSII de la cebada.
- Figura 14
- Desarrollo y uso de un ensayo de PCR para la mutación 292. (a) Representación esquemática de una región de SSII de Himalaya amplificada por los cebadores ZLSS2P4 y ZLBSSIIP5, (b) representación de la región amplificada del gen SSII de 292 empleando ZLSS2P4 y ZLBSSIIP5, que muestra la ausencia de un sitio NIaIV, (c) electroforesis en gel de agarosa de productos digeridos con NIaIV de la cebada; Línea M: escalera de marcador de ADN; línea 1: MK6827; línea 2: Himalaya; línea 3: Tantangara; línea 4: 292; línea 5: 342.
- Figura 15
- Representación esquemática de constructos de ADN diseñados para reducir la expresión de SSII tras la transformación estable de la cebada. (1) El gen SSII, de los nucleótidos 1 a 2972 (remítase a la Figura 9 para consultar la secuencia), se inserta entre el promotor y el terminador en la orientación sentido. (2) El gen SSII se inserta entre el promotor y el terminador en la orientación antisentido de los nucleótidos 2972 a 1 (remítase a la Figura 9 para consultar la secuencia). (3) Constructo dúplex en el que el intrón 3 del gen SSII de la cebada (entre los nucleótidos 1559 y 2851) de la secuencia genómica de SSII de Morex se inserta entre los exones 2 y 3 del ADNc de SSII de la cebada de Himalaya (nucleótidos 363 a 1157 de la Figura 9).
- Figura 16
- Electroforesis SDS-PAGE de proteínas unidas a gránulos del almidón. Panel (A): gel para SDS-PAGE de acrilamida (Acril/Bis 37.5:1) al 8%, sometido al ensayo de Western blot y analizado con una sonda de anticuerpos contra SSII producidos contra la proteína SSII unida a gránulo purificada a partir del trigo. (B) acrilamida (Acril/Bis 30:0.135) al 12.5%, teñida con plata. Las migraciones de los estándares de pesos moleculares de masas definidas (las unidades son kd) se indican a cada lado de la figura.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Definiciones
�?ndice glucémico. Consiste en una comparación del efecto de un alimento de prueba, tal como pan blanco o glucosa, sobre las oscilaciones de la concentración de glucosa en sangre. El índice glucémico representa una medida del efecto probable del alimento en cuestión sobre la concentración de glucosa en suero posprandial y la demanda de insulina para conseguir la homeostasis de glucosa en sangre.
Almidón resistente. La suma del almidón y los productos de la digestión del almidón que no se absorben en el intestino delgado de humanos sanos pero que entran en el intestino grueso. De este modo, el almidón resistente excluye los productos digeridos y absorbidos en el intestino delgado.
Los almidones resistentes se pueden clasificar en cuatro grupos.
Almidón físicamente inaccesible RS1. Los ejemplos de esta forma de almidón se generan cuando el almidón está atrapado en una proteína o una matriz similar o en una pared celular vegetal, o se pueden generar debido a la molienda parcial del grano o en legumbres tras su enfriamiento.
Gránulos resistentes RS2. Son generalmente almidones crudos tales como los que se generan a partir de la patata cruda o la banana verde, algunas legumbres y almidones con elevado contenido de almidón.
Almidones retrogradados RS3. Se generan por tratamiento térmico/de humedad del almidón o alimentos con almidón, como sucede con los copos de maíz, el pan y las patatas cocinadas y enfriadas.
Químicamente modificados RS4. Se generan mediante modificaciones químicas tales como la sustitución o reticulación. Esta forma del almidón se suele emplear en alimentos procesados.
Fibra dietética. En esta memoria descriptiva, es la suma de los carbohidratos y los productos de la digestión de carbohidratos que no se absorben en el intestino delgado de humanos sanos, pero que entran en el intestino grueso. Esto incluye almidón resistente, �-glucano y otros polímeros carbohidratados solubles e insolubles. Se pretende que incluya la porción de carbohidratos que pueden ser fermentados, al menos parcialmente, en el intestino grueso por la microflora residente.
La gelatinización consiste en el colapso (alteración) del orden molecular dentro del gránulo de almidón con cambios concomitantes e irreversibles de las propiedades, tales como el hinchamiento de los granos, la fusión de los cristales, pérdida de birrefringencia, desarrollo de viscosidad y solubilización del almidón.
Esta invención se basa en el aislamiento y la caracterización de plantas de cebada con SSII mutante, cuyo grano se ha descubierto que contiene almidón con un contenido reducido de amilopectina y, por consiguiente, niveles relativos elevados de amilosa y, por consiguiente, contiene niveles elevados de fibra dietética.
Se ha descubierto que dichos mutantes tienen una serie de características bastante deseables y se ha demostrado que los cruces entre otros códigos genéticos diferentes mantienen al menos algunas de esas características.
El grano del mutante y el grano de los cruces entre ciertos códigos genéticos contienen además un nivel elevado de
�-glucano. Los inventores creen que la combinación de un nivel elevado de �-glucano y un contenido elevado de fibra dietética es única de la presente invención.
De forma adicional, al menos para algunos códigos genéticos, se ha descubierto que el grano de dichos mutantes contiene almidón con niveles relativos elevados de amilosa y presenta además temperaturas de gelatinización bajas. Las características de hinchamiento de la gelatinización del almidón de este tipo también presentan la ventaja de ser un hinchamiento reducido, lo que tiene ventajas en ciertas aplicaciones dietéticas y de procesamiento de alimentos.
Además, se ha descubierto que el grano de dichos mutantes contiene almidón con niveles relativos elevados de amilosa; los niveles de amilosa determinados son superiores a un 50% del contenido de almidón, que representa un nivel que no se había detectado nunca anteriormente en el almidón no modificado procedente de la cebada.
El almidón de los mutantes, y hasta el punto que los retrocruces se han evaluado, muestra un almidón resistente, con una estructura alterada que se manifiesta mediante unas características físicas específicas, que incluyen una o más del grupo que comprende la presencia de un contenido relativo elevado de amilosa, una inaccesibilidad física por tener un contenido elevado de �-glucano, una morfología alterada del gránulo y la presencia de lípidos asociados al almidón; y manifestándose la estructura alterada mediante una característica seleccionada entre una o más del grupo que comprende una cristalinidad baja, una distribución de longitudes de cadena de amilopectina reducida y una presencia de lípidos asociados al almidón apreciables.
De forma adicional, hasta ahora el grano derivado de las plantas mutantes de cebada se puede emplear fácilmente en procedimientos de procesamiento de alimentos.
El grano de dichos mutantes en una forma contiene preferentemente almidón con niveles relativos elevados de fibra dietética, más concretamente amilosa, así como un nivel elevado de �-glucano. Los inventores creen que la combinación de un nivel elevado de �-glucano y un nivel elevado de amilosa es única de la presente invención, y esta proporciona una fuente única de una combinación de �-glucano y almidón resistente que no requiere, al menos en las formas más generales de la invención, la mezcla del �-glucano y la fibra dietética soluble ni la modificación de las partes componentes.
Al mejor saber y entender de los inventores, la planta de cebada de la presente invención representa el primer caso de un grano de cebada con niveles relativos elevados de fibra dietética en forma de almidón resistente con un nivel elevado de amilosa, que también posee niveles elevados de �-glucano, los cuales se encuentran en el extremo superior de los niveles habituales de �-glucano o están por encima de este nivel. Los granos con un contenido de glucano todavía superior son del fenotipo ceroso y, por consiguiente, presentan niveles bajos de amilosa.
Es bien sabido que existe una gran variación de los niveles de �-glucano en la cebada, que oscila en el intervalo de aproximadamente un 4% a aproximadamente un 18% en peso de la cebada, pero más habitualmente de un 4% a aproximadamente un 8% (Izydorcyk et al., (2000) Journal of Agricultural and Food Chemistry 48, 982-989; Zheng et al., (2000) Cereal Chemistry 77, 140-144; Elfverson et al., (1999) Cereal Chemistry 76, 434-438; Andersson et al., (1999) Journal of the Science of Foods and Agriculture 79, 979-986; Oscarsson et al., (1996) J Cereal Science 24, 161-170; Fastnaught et al., (1996) Crop Science 36, 941-946). Se han desarrollado cepas de cebada mejoradas, por ejemplo, Prowashonupana, que contiene entre aproximadamente un 15% y aproximadamente un 18% en peso de glucano pero tiene un fenotipo ceroso. Esta se vende comercialmente con el nombre Sustagrain™, (ConAgra™ Specially Grain Products Company, Omaha, Neb., EE. UU.).
Los niveles de �-glucano que se contemplan en esta invención pueden depender del código genético en el que se reduce la actividad de la enzima que sintetiza la amilopectina. Sin embargo, se propone que la reducción de la actividad de la síntesis de amilopectina tendrá como efecto el aumento del nivel relativo de fibra dietética que, en parte, adopta la forma de amilosa, y al mismo tiempo el aumento del nivel de �-glucano. Una explicación para el aumento concomitante del �-glucano con niveles relativos elevados de amilosa es que dicho aumento podría ser el resultado de un efecto de concentración por el hecho de tener un endospermo reducido y se podría aumentar adicionalmente a través del desvío de carbono de la síntesis de almidón a la síntesis de �-glucano.
De este modo, el grano de la planta de cebada posee un contenido de �-glucano preferentemente superior a un 6% del peso total del grano sin cáscara o, más preferentemente, superior a un 7% y, de forma más preferida, superior a un 8%; sin embargo, se han determinado niveles de �-glucano en un mutante ceroso de incluso un 15%-18% y la presente invención puede contemplar niveles tan elevados como estos o incluso más elevados.
En una segunda forma preferida, el grano de la planta de cebada presenta una temperatura de gelatinización reducida (determinada por calorimetría diferencial de barrido), además del contenido relativamente elevado de amilosa. A partir de los datos mostrados para la cebada a modo de ejemplo, se observa que esta temperatura de gelatinización reducida no solo es reducida cuando se compara con el almidón producido por cebada con un contenido en cierta manera elevado de amilosa, sino también cuando se compara con el almidón producido a partir de cebada con almidón que posee niveles normales de amilosa. De este modo, aunque la invención contempla temperaturas de gelatinización reducidas con relación a un almidón correspondiente con un contenido elevado de amilosa, también puede contemplar una temperatura de gelatinización reducida con relación a la de un almidón con niveles normales de amilosa.
De forma adicional, en los códigos genéticos evaluados hasta la fecha, el almidón también se caracteriza por un hinchamiento en agua caliente en exceso menor que el hinchamiento de otros almidones evaluados.
El almidón de la invención posee niveles de amilosa superiores a un 50% del contenido de almidón, que representa un nivel que no se había detectado nunca anteriormente en el almidón no modificado procedente de la cebada.
El almidón de la planta de cebada de la presente posee un contenido relativo elevado de amilosa y mucho más elevado de lo que cabría esperar para una mutación en el gen SSII u otro gen de la almidón-sintasa. De este modo, en mutantes de trigo en SSII se obtienen niveles relativos de amilosa de aproximadamente un 35% del almidón. Se puede considerar que el contenido de amilosa del almidón es elevado cuando el contenido es significativamente superior a un 25%, aproximadamente, presente en el grano de cebada normal, y por consiguiente puede ser superior a aproximadamente un 30% p/p del almidón total. Las plantas de cebada conocidas que se considera que poseen un contenido elevado de amilosa tienen un contenido de un 35-45%. Sin embargo, la presente invención proporciona cebada con un contenido de amilosa superior a un 50%, que representa un nivel que no se había detectado nunca anteriormente en el almidón no modificado procedente de la cebada.
El contenido relativo de amilosa puede ser superior a un 60% y, más preferentemente, aún superior a un 70%. Podría ser deseable tener niveles incluso superiores y, de este modo, se han podido alcanzar niveles incluso superiores en otras plantas cultivándolas con mutaciones únicas, dichos niveles se acercan a un 90%. Por consiguiente, la invención puede englobar niveles de amilosa superiores a un 80% o superiores a un 90%.
En una cuarta forma preferida, el almidón presenta además una estructura alterada que genera el almidón resistente. Este puede proceder del contenido elevado de amilosa. El almidón resistente también se puede generar porque el �-glucano está presente en niveles elevados y este posiblemente ejerce efectos protectores debido a la asociación del �-glucano con el gránulo de almidón; la cercanía de la asociación proporciona potencialmente un efecto protector para el almidón, lo que proporciona de este modo una resistencia que se puede caracterizar como una forma RS1, la cual resulta inaccesible en cierta manera para la digestión. De forma similar, también es probable que la presencia de una asociación almidón-lípido, determinada por la cristalinidad del complejo V, contribuya al nivel de resistencia del almidón. En este caso, es probable que la resistencia se genere por causa de la inaccesibilidad física del almidón debida a la presencia del lípido y, por consiguiente, este se puede considerar como un almidón RS1. Es bien sabido que el almidón retrogradado que adopta la configuración de complejo V es altamente resistente a la digestión y, por consiguiente, se prevé que la amilopectina que forma parte de la estructura cristalina del complejo V también sea resistente a la digestión. El almidón de la planta de cebada a modo de ejemplo puede ser resistente a la digestión debido a la estructura del gránulo de almidón y, por consiguiente, puede tener un almidón RS2. Cada una de estas características puede estar presente de forma separada o como una combinación de dos o más de estas características.
El contenido elevado de fibra dietética puede adoptar la forma, al menos en parte, de almidón resistente, que se puede caracterizar por un contenido elevado de amilosa de los gránulos de almidón, según se ha mencionado previamente.
El contenido relativo de amilosa puede ser superior a un 60% y, más preferentemente, superior a un 70%. Podría ser deseable tener niveles incluso superiores y, de este modo, se han podido alcanzar niveles incluso superiores en otras plantas cultivándolas con mutaciones únicas, dichos niveles se acercan a un 90%. Por consiguiente, la invención puede englobar niveles de amilosa superiores a un 80% o superiores a un 90%.
Podría ser deseable que la planta de cebada exprese adicionalmente un nivel alterado de la actividad de una o más enzimas diferentes implicadas en la síntesis de la amilosa o de otras enzimas, para elevar más el nivel relativo de amilosa. De este modo, la planta de cebada puede poseer otra mutación que reduzca o altere adicionalmente la biosíntesis de amilopectina, o una mutación o código genético que aumente la biosíntesis de amilosa. Por ejemplo, la planta de cebada puede mostrar un genotipo extensor de amilosa, tal como una planta de cebada que contiene la mutación amo1. Un ejemplo de una planta de este tipo es la variedad conocida como AC38 (también conocida como glaciar de elevado contenido de amilosa).
Se sobreentenderá que el nivel relativo de amilosa al que se hace referencia se expresa en función del contenido de almidón total y, de este modo, el resto de almidón puede ser predominantemente un tipo intermedio de almidón o puede ser predominantemente amilopectina o una mezcla de ambos. En la cebada analizada, el nivel elevado de amilosa proviene de niveles reducidos de amilopectina y, por consiguiente, el nivel relativo de amilosa no proviene de una mayor síntesis de amilosa.
Es bien sabido que el �-glucano provoca como efecto el enlentecimiento de la digestión en el intestino delgado simplemente debido a su presencia, cuando se encuentra junto con otro componente alimentario. De forma similar, es bien sabido que las moléculas resistentes yuxtapuestas cerca de los gránulos de almidón permiten enmascarar el almidón y contribuyen a su resistencia haciéndolo físicamente inaccesible. Por consiguiente, los niveles elevados de amilosa y otras formas de almidón que se pueden generar a partir de la asociación con un lípido, se verán aumentados adicionalmente por la presencia y la yuxtaposición física a los gránulos de almidón. Por lo tanto, se proporciona un aumento significativo de los efectos del almidón resistente, así como otros efectos beneficiosos, que proceden de los niveles elevados de �-glucano.
De forma adicional, es bien sabido que existe una respuesta a la dosis en cuanto a los efectos beneficiosos del almidón resistente y el �-glucano. Por consiguiente, se propone que el nivel aumentado de �-glucano, junto con los niveles aumentados de almidón resistente, proporcionarán mayores beneficios para la salud.
La combinación de los niveles de �-glucano y almidón resistente de al menos las formas preferidas de esta invención no se ha detectado anteriormente y definitivamente no se ha detectado en ninguna fuente que no contenga cierto grado de modificación o purificación y, por lo tanto, las formas de la presente invención proporcionan una fuente única y práctica para obtener estos beneficios.
Otro aspecto preferido del almidón es que, a pesar del contenido relativo elevado de amilosa, también presenta una temperatura de gelatinización baja, determinada por calorimetría diferencial de barrido. Esto contrasta con la conclusión general de que los almidones con un contenido elevado de amilosa tienen tendencia a presentar una
mayor temperatura de gelatinización, lo que introduce limitaciones en el modo en que se pueden emplear los almidones con un contenido elevado de amilosa. A partir de los datos mostrados para la cebada a modo de ejemplo, se observa que esta temperatura de gelatinización reducida no solo es reducida cuando se compara con el almidón producido por líneas con un contenido en cierta manera elevado de amilosa, sino también cuando se compara con el almidón producido a partir de cebada con almidón que posee niveles normales de amilosa. De este modo, aunque un aspecto preferido de la invención contempla temperaturas de gelatinización reducidas con relación a un almidón correspondiente con un contenido elevado de amilosa, también puede contemplar una temperatura de gelatinización reducida con relación a la de un almidón con niveles normales de amilosa. Para almidones con un contenido elevado de amilosa, ciertos aspectos del procesamiento requieren temperaturas más elevadas y, por consiguiente, requieren inherentemente una entrada de energía más elevada, lo que resulta caro y puede destruir la funcionalidad de otros componentes alimentarios. De forma similar, desde el punto de vista del consumidor final, los alimentos que contienen almidón con un contenido elevado de amilosa pueden resultar menos adecuados, debido a que requieren una temperatura más elevada y un tiempo más prolongado para su preparación. De este modo, por ejemplo, en esta forma preferida de la invención, ahora resulta posible obtener un producto, tal como los fideos, que requiere la adición de agua hirviendo o caliente a un recipiente, tal como una taza, y no requiere un calentamiento durante un periodo prolongado de tiempo, a la vez que se consigue el suministro de los almidones resistentes y otros constituyentes de valor nutricional al intestino grueso.
Un efecto destacado de las bajas temperaturas de gelatinización de estos almidones son las menores exigencias en cuanto a la temperatura y, por lo tanto, la menor exigencia en cuanto a la energía de trituración del alimento. Un corolario consiste también en que cuando la mezcla tiene lugar a temperatura ambiente y a continuación se calienta la mezcla, como suele ser el caso para ciertos procesamientos de alimentos, la baja temperatura de gelatinización también reduce el tiempo necesario para lograr la gelatinización. De forma adicional, para un intervalo de temperaturas por debajo de la temperatura necesaria para obtener una gelatinización completa del almidón normal, se producirá más gelatinización completa del almidón de la presente invención que del almidón normal.
Una medida de la capacidad de gelatinización se refleja en las propiedades térmicas determinadas por DSC (calorimetría diferencial de barrido). El inicio del primer pico (pico de gelatinización) de DSC puede estar a menos de 53 °C, más preferentemente a menos de 50°C y, de forma más preferida, a menos de aproximadamente 47°C. El inicio del primer pico se puede considerar como el inicio de la gelatinización. El almidón producido a partir del grano de la cebada puede presentar un primer pico a menos de aproximadamente 60 °C, más preferentemente a menos de 55 °C y, de forma más preferida, a menos de 52 °C. La LH (entalpía) del primer pico puede ser inferior a aproximadamente 3.5, más preferentemente inferior a aproximadamente 1.0 y, de forma más preferida, inferior a aproximadamente 0.5.
Otro descubrimiento acerca de la gelatinización de las harinas que contienen los almidones de esta invención es que muestran un hinchamiento reducido. El volumen de hinchamiento se determina habitualmente mezclando un almidón
o harina con exceso de agua y calentando hasta temperaturas elevadas, normalmente superiores a 90 °C. A continuación la muestra se separa por centrifugación y el volumen de hinchamiento se expresa como la masa del material sedimentado dividida entre el peso seco de la muestra. Se ha determinado que los volúmenes de hinchamiento de las harinas de almidones de cebadas normales y cerosas son superiores a aproximadamente 5.5. Los volúmenes de hinchamiento de las harinas hechas a partir de un grano con un contenido elevado de amilosa (AC38) son de aproximadamente 3.75, mientras que para los granos de los mutantes y los cruces examinados son inferiores a 3.2, preferentemente inferiores a 3.0, pero generalmente superiores a aproximadamente 2.
Esta característica de gelatinización con poco hinchamiento es particularmente útil cuando se desea aumentar el contenido de almidón de un preparado alimentario, en particular un preparado alimentario hidratado. En el caso de la presente, podría ser deseable aumentar el contenido de fibra dietética de una solución coloidal u otro preparado líquido, donde de otra manera se produciría una restricción en cuanto al suministro del preparado alimentario.
Esta característica, junto con la temperatura de gelatinización reducida que exhibe el almidón de la presente, proporciona la posibilidad de aumentar significativamente los beneficios nutricionales de los alimentos cuando se requiere una preparación rápida, como en sopas instantáneas y fideos instantáneos.
Se postula que los efectos de la temperatura de gelatinización son el resultado de una estructura alterada de la amilopectina en el endospermo de su grano, y una medida de esta estructura es la distribución de las longitudes de cadena (grados de polimerización) de las moléculas de almidón tras la desrramificación por acción de la isoamilasa. Un análisis de las longitudes de cadena del contenido de amilopectina del almidón de los mutantes SSII a modo de ejemplo mostró que, tras la desrramificación, presentan una distribución de longitudes de cadena en el intervalo de 5 a 60, que es más corta que la distribución del almidón obtenido a partir de las líneas no mutantes tras la desrramificación. El almidón con longitudes de cadena más cortas también presentará un aumento proporcional de la frecuencia de ramificación. De este modo, el almidón también puede presentar una distribución de longitudes de cadena más cortas de amilopectina. La proporción de cadenas de almidón con un grado de polimerización comprendido en el intervalo de 6 a 11 residuos es superior a un 30% y, más preferentemente, superior a un 35%. La proporción de cadenas de almidón con un grado de polimerización comprendido en el intervalo de 12-30 residuos es inferior a un 65%, más preferentemente inferior a un 60% y, de forma más preferida, inferior a aproximadamente un 55%. La proporción de cadenas de almidón con un grado de polimerización comprendido en el intervalo de 31-60 residuos es inferior a aproximadamente un 10%, más preferentemente inferior a aproximadamente un 8%, pero también preferentemente superior a aproximadamente un 5% y, más preferentemente, superior a aproximadamente un 6%. La combinación de las proporciones de los tres intervalos de longitudes de cadena se considera como un indicador de que un almidón es del tipo conforme con la presente invención.
Es probable que la reducción de la distribución de longitudes de cadena contribuya a la obtención de temperaturas de gelatinización más bajas. También se cree que la longitud de cadena reducida potencia las propiedades organolépticas del almidón, en particular la textura en boca, lo que quizás contribuye de este modo a la obtención de un producto placentero. De forma adicional, se ha postulado que la longitud de cadena reducida de la amilopectina puede reducir el nivel de degradación de la amilopectina, lo que repercute sobre la calidad del alimento, por ejemplo, se cree que es importante en el envejecimiento del pan.
De forma adicional, se ha demostrado que la estructura del almidón en el almidón a modo de ejemplo difiere en que el grado de cristalinidad es menor en comparación con el almidón normal aislado de la cebada. Cuando se combina con una distribución de longitudes de cadena de amilopectina reducida, la cristalinidad granular reducida podría indicar que la temperatura de gelatinización será menor. También se cree que la cristalinidad reducida de un almidón se asocia con unas propiedades organolépticas mejoradas y, cuando se combina con longitudes de cadena más cortas de la amilopectina, contribuye a una textura en boca más placentera. De este modo, el almidón puede exhibir de forma adicional una cristalinidad reducida, que procede de niveles reducidos de la actividad de una o más enzimas implicadas en la síntesis de amilopectina. La proporción de almidón que exhibe cristalinidad puede ser inferior a aproximadamente un 20% y, preferentemente, inferior a aproximadamente un 15%.
Una medición adicional de las propiedades del almidón de la presente se realiza midiendo la viscosidad. Empleando un viscosímetro rápido (RVA, por sus siglas en inglés) se ha descubierto que la viscosidad máxima del almidón de esta invención es significativamente diferente que la de los almidones normales y cerosos y los almidones con un contenido elevado de amilosa obtenidos a partir de la cebada. Las mediciones se realizaron en productos integrales, sin embargo, las propiedades del almidón serán predominantes en estas mediciones. Los almidones normales y cerosos presentan una viscosidad máxima de entre aproximadamente 900 y aproximadamente 500 unidades de RVA, el almidón con un contenido elevado de amilosa conocido presenta una viscosidad máxima superior a 200, mientras que las plantas de cebada de acuerdo con la presente invención presentan una viscosidad máxima inferior a 100, siendo para la mayoría inferior a aproximadamente 50 y en algunas plantas de incluso aproximadamente 10 unidades de RVA. Un experto en la materia sobreentenderá que las unidades empíricas citadas para los parámetros y los resultados citados pretenden indicar las propiedades relativas de estos almidones en instrumentos RVA o instrumentos similares tales como el amilógrafo.
Además de la cristalinidad reducida mencionada previamente, el almidón de la presente se puede caracterizar por la presencia de la forma de tipo complejo V del almidón. Los inventores creen que esta es la primera ocasión en que se ha observado esta forma del almidón en cantidades apreciables en los gránulos de almidón de un grano. Esta forma de almidón se asocia normalmente con el almidón retrogradado, en particular cuando ha estado en contacto con lípidos. En el caso de la presente invención, se postula que la estructura del almidón permite la formación de una relación íntima entre los lípidos de la planta y el almidón, que proporciona la estructura del complejo V. Se cree que esta forma del almidón puede presentar beneficios para la salud, porque manifiesta una digestibilidad reducida y, por consiguiente, puede contribuir a aumentar el almidón resistente.
También se pueden obtener otras formas de estructura de la interacción lípido-almidón e incluyen complejos de lípido-almidón no cristalinos. De este modo, también se puede considerar que la invención se refiere a una planta de cebada que exhibe cantidades apreciables de complejos de almidón-lípido en el contenido de almidón del endospermo de su grano, como resultado de los niveles reducidos de la actividad de una o más enzimas implicadas en la síntesis de amilopectina. Los almidones que contienen complejos de almidón-lípido, incluidos los que presentan una estructura de complejo V, también son normalmente resistentes a la digestión y, por consiguiente, contribuyen a aumentar los niveles de fibra dietética. Preferentemente, la proporción de almidón cristalino que exhibe una forma de cristalinidad característica de un complejo de almidón-lípido es superior a aproximadamente un 50% y, más preferentemente, superior a aproximadamente un 80%.
Además de la presencia de la forma de tipo complejo V del almidón, dicho almidón también puede exhibir cantidades no apreciables de las formas de tipo complejo A del almidón. La ausencia del complejo A se puede considerar como una indicación de la presencia de un almidón de esta invención.
También se ha descubierto que la temperatura de pastificación de los almidones y productos hechos a partir del grano de esta invención es considerablemente elevada. La temperatura de pastificación en almidones conocidos es inferior a 70 °C, tanto para almidones normales como para almidones con un contenido elevado de amilosa. Sin embargo, los almidones de la presente invención exhiben preferentemente temperaturas de pastificación superiores a aproximadamente 75 °C o, más preferentemente, superiores a aproximadamente 80 °C. Cabe destacar que estas son medidas empíricas y se deben interpretar como relativas a las mediciones de los otros almidones.
Se ha determinado que el almidón de la planta de cebada a modo de ejemplo contiene cantidades significativas de fibra dietética y almidón resistente; supuestamente este aumento es el resultado, al menos en parte, del nivel relativo elevado de amilosa; sin embargo, también puede existir una contribución de la fibra dietética debido a los complejos de almidón-lípido, incluido el complejo V, o debido a la asociación íntima de la amilosa o la amilopectina con el glucano. De forma similar, el nivel elevado de �-glucano también puede suponer una contribución significativa al aumento de la fibra dietética.
Los niveles relativos elevados de amilosa en el endospermo de la planta de cebada a modo de ejemplo proceden muy probablemente de la producción alterada de amilopectina, como resultado de una reducción del nivel de actividad de la enzima SSII.
Cabe esperar que las mutaciones en el gen que codifica esta enzima exhiban un mayor contenido de amilosa y/o una reducción del nivel de amilopectina. Cuando solo se reduce la síntesis de amilopectina, el almidón exhibe un mayor nivel relativo de amilosa.
Se puede lograr la supresión de la actividad de la enzima implicada en la síntesis de amilopectina mediante las mutaciones adecuadas en un gen respectivo o secuencias reguladoras del gen. Las mutaciones a modo de ejemplo de esta invención, por ser mutaciones SSII en la cebada, son mutantes de truncamiento y es bien sabido que estos tienen una repercusión significativa sobre la naturaleza del almidón. También pueden resultar eficaces otras reordenaciones cromosómicas, que pueden incluir deleciones, inversiones, duplicación o mutaciones puntuales.
Dichas mutaciones se pueden introducir en códigos genéticos deseables tanto mutagenizando las variedades de interés, como, de forma más fiable, cruzando el mutante con una planta que contiene el código genético deseado y realizando un número adecuado de retrocruces para eliminar el código inicial originalmente indeseado. Se puede conseguir el aislamiento de las mutaciones realizando una criba de las plantas mutagenizadas.
Se puede adoptar una estrategia de biología molecular como alternativa a los métodos convencionales. En esta memoria descriptiva se presenta la secuencia SSII. Los vectores que contienen las mutaciones deseadas y un marcador seleccionable se pueden introducir en plantas de cultivo de tejido o en sistemas vegetales adecuados tales como los protoplastos. Las plantas en las que se ha integrado una mutación en un cromosoma para reemplazar un alelo natural existente se pueden someter a una criba, por ejemplo, empleando una sonda de ácidos nucleicos adecuada específica para la mutación y observación fenotípica. En la materia existe constancia de métodos para transformar plantas monocotiledóneas, tales como la cebada, y para regenerar plantas a partir de protoplastos o embriones de plantas inmaduros; remítase, por ejemplo, a la solicitud de patente canadiense 2092588 de Nehra, la solicitud de patente australiana N.o 6178194 del Consejo Nacional de Investigación de Canadá, la patente australiana N.o 667939 de Japan Tobacco Inc., la solicitud de patente internacional WO 97/48814 de Monsanto Company, la patente de los EE. UU. 5589617 y otros métodos expuestos en la memoria descriptiva de la patente WO99/14314.
También se pueden adoptar otras estrategias conocidas para alterar la actividad de la enzima implicada en la síntesis de la amilopectina que no sean el uso de mutaciones. De este modo, por ejemplo, esto se podría realizar mediante la expresión de moléculas antisentido adecuadas que interfieran con la transcripción o el procesamiento del gen o los genes que codifican la enzima implicada en la síntesis de la amilopectina. Estas se pueden basar en la secuencia de ADN que se elucida en la presente para el gen SSII de la cebada. Estas secuencias antisentido pueden ser para los genes estructurales o para secuencias que ejercen un control sobre la expresión genética o el evento de corte y empalme. Se ha hecho referencia a estas secuencias previamente. Los métodos para elaborar secuencias antisentido son de uso común en la materia y se pueden encontrar ejemplos de estos en, por ejemplo, la patente de los EE. UU. 5190131, la memoria descriptiva de la patente europea 0467349 AI, la memoria descriptiva de la patente europea 0223399 AI y la memoria descriptiva de la patente europea 0240208. Los métodos para introducir y mantener dichas secuencias en plantas también están publicados y son conocidos.
Una variación de la técnica antisentido consiste en emplear ribozimas. Las ribozimas son moléculas de ARN con función enzimática que pueden escindir otras moléculas de ARN en sitios específicos definidos por una secuencia antisentido. La escisión del ARN bloquea la expresión del gen diana. Se hace referencia a la memoria descriptiva de la patente europea 0321201 y a la memoria descriptiva WO 97/45545.
Otra estrategia de biología molecular que también se puede emplear consiste en la cosupresión. No se conoce plenamente el mecanismo de cosupresión, pero se sabe que implica la introducción de una copia adicional de un gen en una planta en la orientación normal. En algunos casos la copia adicional del gen interfiere con la expresión del gen diana de la planta. Remítase a la memoria descriptiva de la patente WO 97/20936 y a la memoria descriptiva de la patente europea 0465572 para consultar métodos de implementación de las estrategias de cosupresión.
Un método adicional que se puede emplear utilizando las secuencias de ADN consiste en la supresión genética mediada por ARN bicatenario o dúplex. En este método, se emplea un ADN que dirige la síntesis de un producto de ARN bicatenario. La presencia de la molécula bicatenaria desencadena una respuesta del sistema de defensa de la planta que destruye tanto el ARN bicatenario como el ARN procedente del gen diana de la planta, lo que reduce o
elimina eficazmente la actividad del gen diana. Remítase a la memoria descriptiva de la patente australiana 99/292514-A y a la memoria descriptiva de la patente WO 99/53050 para consultar métodos de implementación de esta técnica.
Se sobreentenderá que la invención puede surgir como resultado de la reducción de los niveles de actividad de dos
o más de los genes anteriores empleando una estrategia de biología molecular.
Un producto importante que se podría contemplar en particular como resultado del contenido elevado de amilosa y el contenido elevado de �-glucano es un producto bajo en calorías con un índice glucémico reducido. Un producto bajo en calorías se puede basar en la incorporación de harina producida a partir de grano molido. Sin embargo, puede ser deseable descascarillar en primer lugar el grano, para eliminar quizás un 10% o 20% en peso del grano, de manera que se elimine la capa de aleurona y, para una mayor reducción, se elimine también el germen. El efecto del paso de descascarillado es reducir el contenido de lípidos y, por consiguiente, reducir el valor calórico del alimento. Los alimentos de este tipo tendrán el efecto de saciar, potenciar la salud del intestino, reducir la concentración de lípidos y glucosa en suero posprandial, a la vez que proporcionan un producto alimentario bajo en calorías. El uso del producto descascarillado provocaría una reducción de los beneficios nutricionales proporcionados por la capa de aleurona y el germen. Es probable que la harina producida a partir del producto descascarillado tenga un aspecto mejorado, porque un producto producido de este modo tiene tendencia a ser más blanco.
Algunos aspectos de esta invención también se refieren a la combinación de la capa de aleurona y el germen con niveles elevados de fibra dietética. Concretamente, esto se refiere a los niveles relativos en cierta manera más elevados de aleurona o germen presentes en el grano a modo de ejemplo. En primer lugar, la cebada presenta una capa de aleurona significativamente más grande que otros granos comerciales, como resultado de tener una capa de aleurona de tres células. En segundo lugar, el grano de cebada a modo de ejemplo está además encogido, lo que significa que el endospermo está presente en cantidades reducidas; un corolario de esto es que la capa de aleurona y el germen están presentes en cantidades relativas elevadas. De este modo, la cebada presenta un nivel relativamente elevado de ciertos elementos beneficiosos o vitaminas combinados en un sistema de suministro de almidón resistente; dichos elementos incluyen cationes divalentes, tales como el Ca++ biodisponible, y vitaminas, tales como el folato, o antioxidantes, tales como los tocoferoles y tocotrienoles. De este modo, el calcio se ha establecido como suministro de material para el crecimiento y la deposición de los huesos y otros tejidos calcificados y para reducir el riesgo de sufrir osteoporosis en edades más avanzadas. Se ha descubierto que el ácido fólico ejerce un efecto protector contra los defectos del tubo neuronal cuando se consume periconceptualmente y reduce el riesgo de sufrir enfermedades cardiovasculares, de manera que potencia los efectos de la combinación de almidón resistente y �-glucano. También se cree que el ácido fólico tiene como efecto la reducción del riesgo de sufrir ciertos tipos de cáncer. El tocoferol y los tocotrienoles presentan los beneficios de los antioxidantes y se cree que reducen el riesgo de sufrir cáncer y enfermedades cardiovasculares; también tienen como efecto la reducción de los efectos indeseables de la oxidación de los componentes de un alimento tales como los ácidos grasos, que pueden provocar ranciedad. Cuando estos componentes de esta forma preferida de grano de cebada o productos hechos a partir de este constituyen un envase adecuado con el grano único, una forma específica de producto molido puede ser aquella en la que la capa de aleurona se incluya en el producto molido. Se pueden llevar a cabo procesos de molienda particulares para aumentar la cantidad de la capa de aleurona en el producto molido. Se hace referencia a este método en Fenech et al., (1999) J Nutr 129: 1114-1119. Por lo tanto, cualquier producto derivado de grano molido o procesado para incluir la capa de aleurona y el germen poseerá beneficios nutricionales adicionales y no será necesario añadir estos elementos de fuentes diferentes.
Se sobreentenderá que la planta de cebada de la presente invención es preferentemente una que contenga un grano útil para la producción de alimentos y, en particular, para la producción de alimentos comerciales. Una producción de este tipo puede incluir la producción de harina u otro producto que puede constituir un ingrediente de la producción de alimentos comerciales. Un contenido de almidón superior a aproximadamente un 12% o quizás superior a aproximadamente un 15% tendría un menor grado de utilidad. O de forma similar, esto puede incluir la capacidad de moler el grano; de este modo, aunque la cebada descascarillada se puede producir a partir de la mayoría de formas de grano, ciertas configuraciones de grano son particularmente resistentes a la molienda. Otra característica que puede tener una repercusión sobre el hecho de que una variedad produzca un grano que se pueda emplear comercialmente es la decoloración del producto producido. De este modo, cuando la cáscara u otra porción del grano exhiben una coloración significativa, por ejemplo, violeta, esta se mantendrá en el producto y limitará sus aplicaciones comerciales a aplicaciones muy concretas, tales como ser un componente de un pan que contenga granos troceados o enteros de color. Generalmente, también es más adecuado que las plantas de cebada sean gimnospermas, porque la presencia de cáscaras en los granos de cebada aumenta la dificultad del procesamiento del grano. Otro aspecto que puede aumentar el valor de una planta de cebada se basa en la extracción de almidón a partir del grano, siendo más útiles las mayores proporciones de extracción. La forma del grano también es otra característica que puede repercutir sobre la utilidad comercial de una planta, de esta manera la forma del grano puede repercutir sobre la facilidad con que se puede moler el grano, de esta manera, por ejemplo, el grano de cebada de la planta MK6827 presenta una morfología del grano excepcionalmente muy alargada, que hace que sea difícil de moler y procesar. Una medida adecuada de esta forma alargada y de la utilidad es el cociente de dos características morfológicas: la longitud del grano entre el grosor del grano (cociente L/G). Este cociente suele venir dictado por la naturaleza del almidón. Los inventores han descubierto que MK6827 presenta un cociente
L/G superior a 6. Las plantas de cebada sometidas a una criba de este modo, que contienen el gen SSII mutante, presentan un cociente L/G que oscila entre aproximadamente 4 y aproximadamente 5, aunque se prevé que se puede extender hasta un intervalo más amplio y seguir siendo útil, quizás siendo inferior a aproximadamente 5.8 o al menos de 5.5.
El código genético deseado incluirá consideraciones de rendimiento comercial y otras características. Dichas características pueden incluir las siguientes: si se desea disponer de un tipo de cebada de invierno o de primavera, las características agronómicas, la resistencia a enfermedades y la resistencia al estrés abiótico. En Australia podría ser deseable cruzar cultivos de cebada tales como Sloop, Schooner, Chebec, Franklin, Arapiles, Tantangara, Galleon, Gairdner o Picola. Los ejemplos proporcionados son específicos para una región de producción en Australia y otras variedades serán adecuadas para otras regiones de cultivo.
Puede ser deseable un grano más lleno para lograr mayores rendimientos y se pueden conseguir ciertos beneficios de la invención, como la producción de almidón con niveles elevados de amilosa o, como alternativa, almidón con distribuciones alteradas de las longitudes de cadena. Sin embargo, otros aspectos de la invención se pueden conseguir mejor con un grano que esté menos lleno. De este modo, la proporción de la capa de aleurona o germen frente al almidón puede ser más elevada en un grano menos lleno, lo que proporciona una harina de cebada u otro producto con un contenido más elevado de los constituyentes beneficiosos de la capa de aleurona. De este modo, el producto de la capa de aleurona puede tener un contenido más elevado de ciertas vitaminas tales como el folato, o puede tener un contenido más elevado de ciertos minerales tales como el calcio, y esto combinado con niveles más elevados de almidón resistente y/o niveles más elevados de �-glucano puede proporcionar efectos sinérgicos, como la obtención de una mayor recaptación de minerales en el intestino grueso.
Para maximizar la cantidad de amilosa puede ser deseable que la planta de cebada también tenga otras características fenotípicas, además de una actividad reducida de una o más enzimas que sintetizan amilopectina. Por consiguiente, el código genético puede incluir adicionalmente un fenotipo con un contenido elevado de amilosa, por ejemplo, la mutación amo1 en AC38 (gen causal desconocido) y la mutación cerosa (que se encuentra, por ejemplo, en la variedad Waxiro). De forma adicional, puede resultar deseable realizar mutaciones dobles en otros mutantes de cebada disponibles con endospermos encogidos en los que se desconoce el gen causal.
En un aspecto adicional, se podría afirmar que la descripción se refiere al grano producido por una planta de cebada, según se menciona en esta memoria descriptiva.
También se sobreentenderá que la invención engloba un grano procesado, que incluye un grano molido, triturado, troceado, descascarillado o enrollado, o un producto obtenido a partir del grano procesado o entero de la planta de cebada de la invención, incluida la harina. A continuación, estos productos se pueden emplear en varios productos alimentarios, por ejemplo, en productos a base de harina, tales como el pan, pasteles, galletas y análogos, o en aditivos alimentarios, tales como espesantes, o para obtener bebidas de cebada malteada u otras bebidas de cebada, fideos y sopas instantáneas.
Como alternativa, la invención engloba almidón aislado a partir del grano de la planta de cebada de la invención. El almidón se puede aislar empleando técnicas conocidas.
Se sobreentenderá que un beneficio de la presente invención consiste en que proporciona uno o más productos con un beneficio nutricional particular y, además, esto se consigue sin necesidad de modificar el almidón u otros constituyentes del grano de cebada.
Sin embargo, puede resultar deseable realizar modificaciones en el almidón, el �-glucano u otro constituyente del grano, y la invención engloba dicho constituyente modificado.
El método de modificación puede ser cualquiera de los conocidos, e incluye la extracción del almidón o �-glucano u otro constituyente mediante métodos convencionales y la modificación de los almidones para formar la forma resistente deseada.
De este modo, el almidón o el �-glucano se pueden modificar tanto de forma única como múltiple mediante el uso de un tratamiento seleccionado del grupo que incluye, sin carácter limitante, calentamiento y/o humedad, hidrólisis por métodos físicos (por ejemplo, molino de bolas), hidrólisis por métodos enzimáticos (empleando, por ejemplo, a- o �- amilasa, pululanasa o análogos), hidrólisis por métodos químicos (húmeda o seca, empleando reactivos líquidos o gaseosos), oxidación, enlaces cruzados con reactivos difuncionales (por ejemplo, trimetafosfato de sodio, oxicloruro de fósforo) o carboximetilación.
El contenido de fibra dietética del grano de cebada a modo de ejemplo no procede solamente del mayor contenido relativo de amilosa endospermal. Un motivo principal es que el �-glucano está presente en niveles elevados y contribuye de forma significativa a aumentar el nivel de la fibra dietética. También es probable que existan efectos protectores debido a la asociación del �-glucano con el gránulo de almidón; la cercanía de la asociación proporciona potencialmente un efecto protector para el almidón, lo que proporciona de este modo una resistencia que se puede
caracterizar como una forma RS1, la cual resulta inaccesible en cierta manera para la digestión. De forma similar, también es probable que la presencia de una asociación almidón-lípido, determinada por la cristalinidad del complejo V, contribuya al nivel de resistencia del carbohidrato. En este caso, es probable que la resistencia se genere por causa de la inaccesibilidad física debida a la presencia del lípido y, por consiguiente, este se puede considerar como un almidón RS1. De este modo, es bien sabido que el almidón retrogradado que adopta la configuración de complejo V es altamente resistente a la digestión y, por consiguiente, se prevé que la amilopectina que forma parte del gránulo de almidón con la estructura cristalina del complejo V presente una mayor resistencia a la digestión. En tercer lugar, el almidón de la planta de cebada a modo de ejemplo puede ser resistente a la digestión debido a la estructura del gránulo de almidón y, por consiguiente, puede tener un almidón RS2.
Se sobreentenderá que, aunque se hayan proporcionado varias indicaciones como aspectos de la presente invención, la invención puede referirse a combinaciones de dos o más aspectos de la presente invención.
EJEMPLO 1
Antecedentes
La síntesis de almidón en el endospermo de plantas superiores se lleva a cabo por la acción de un conjunto de enzimas que catalizan cuatro pasos clave. En primer lugar, la ADP-glucosa-pirofosforilasa activa el monómero precursor del almidón a través de la síntesis de ADP-glucosa a partir de G-1-P y ATP. En segundo lugar, el dador de glucosilo activado, la ADP-glucosa, es transferido al extremo no reductor de una unión a-1,4 preexistente por almidón-sintasas. En tercer lugar, las enzimas ramificantes del almidón introducen puntos de ramificación a través de la escisión de una región de glucano unido por un enlace a-1,4, a continuación se transfiere la cadena escindida a una cadena aceptora, formando una nueva unión a-1,6. Finalmente, los estudios genéticos demuestran que las enzimas que desrramifican el almidón son esenciales para la síntesis de cantidades normales de almidón en plantas superiores, sin embargo, el mecanismo a través del cual operan las enzimas desrramificantes no está elucidado (Myers et al., 2000).
Aunque es evidente que al menos estas cuatro actividades son necesarias para la síntesis normal del gránulo de almidón en plantas superiores, se han encontrado múltiples isoformas de cada una de las cuatro actividades en el endospermo de plantas superiores y se han propuesto funciones específicas para las isoformas individuales, basadas en análisis mutacionales (Wang et al., 1998, Buleon et al., 1998) o mediante la modificación de los niveles de expresión genética empleando estrategias transgénicas (Abel et al., 1996, Jobling et al., 1999, Scwall et al., 2000). Sin embargo, todavía no se conocen las contribuciones exactas de cada isoforma de cada actividad en la biosíntesis del almidón, ni tampoco se sabe si estas contribuciones difieren notoriamente entre las especies. En el endospermo de los cereales, existen dos isoformas de la ADP-glucosa-pirofosforilasa: una forma en el amiloplasto y una forma en el citoplasmo (Denyer et al., 1996, Thorbjornsen et al., 1996). Cada forma se compone de dos tipos de subunidades. Los mutantes encogidos (sh2) y frágiles (bt2) del maíz representan lesiones en subunidades grandes y pequeñas, respectivamente (Girouz y Hannah, 1994). Existen cuatro clases de almidón-sintasa en el endospermo del cereal: una isoforma localizada exclusivamente en el gránulo de almidón, la almidón-sintasa unida al gránulo (GBSS, por sus siglas en inglés), dos formas que están repartidas entre el gránulo y la fracción soluble (SSI, Li et al., 1999a, SSU, Li et al., 1999b) y una cuarta forma que está localizada completamente en la fracción soluble, SSIII (Cao et al., 2000, Li et al., 1999b, Li et al., 2000). Se ha demostrado que la GBSS es esencial para la síntesis de amilosa (Shure et al., 1983) y se ha demostrado que las mutaciones en SSII y SSIII modifican la estructura de la amilopectina (Gao et al., 1998, Craig et al., 1998). No se han descrito mutaciones que definan una función para la actividad de SSI.
En el endospermo del cereal se expresan tres formas de enzimas ramificantes: la enzima ramificante I (BEI, por sus siglas en inglés), la enzima ramificante IIa (BEIIa) y la enzima ramificante IIb (BEIIb) (Hedman y Boyer, 1982, Boyer y Preiss, 1978, Mizuno et al., 1992, Sun et al., 1997). Se ha demostrado que en el maíz y el arroz los fenotipos con un contenido elevado de amilosa proceden de lesiones en el gen BEIIb (Boyer y Preiss, 1981, Mizuno et al., 1993). En estos mutantes, el contenido de amilosa es significativamente elevado y la frecuencia de ramificación de la amilopectina residual es reducida. Además, existe una fuente significativa de material que se define como “intermedio” entre la amilosa y la amilopectina (Boyer et al., 1980, Takeda, et al., 1993). Todavía no se han descrito las mutaciones que definen las funciones de BEIIa y BEI, aunque la reducción de BEI en la patata por sí sola provoca efectos mínimos sobre la estructura del almidón (Filpse et al., 1996). Sin embargo, la combinación de la reducción de BEII y BEI en la patata proporciona un contenido de amilosa mucho más elevado que la reducción de BEII por sí sola (Schwall et al., 2000). Existen dos tipos de enzimas desrramificantes en plantas superiores y se definen en función de las especificidades de su substrato: enzimas desrramificantes de tipo isoamilasa y enzimas desrramificantes de tipo pululanasa (Myers et al., 2000). Las mutaciones en sugary-1 del maíz y el arroz se asocian con una deficiencia de ambas enzimas desrramificantes (James et al., 1995, Kubo et al., 1999), sin embargo, la mutación causal se localiza en la misma posición que el gen de la enzima desrramificante de tipo isoamilasa. En el mutante sta-7 de Chlamydomonas (Mouille et al., 1996), el análogo de la mutación en sugary-1 del maíz, se reduce la actividad de la isoamilasa solamente.
La variación conocida de la estructura del almidón en la cebada es limitada, en comparación con la variación disponible en el maíz. Las mutaciones mejor caracterizadas son cerosas y una mutación con un contenido elevado de amilosa identificada como AC38. También se han construido y analizado mutantes dobles (Schondelmaier et al., 1992, Fujita et al, 1999). Se han descrito una amplia gama de características de la variación de la estructura y las propiedades del almidón (Czuchajowska et al., 1992; Schondelmaier et al., 1992; Vasanthan y Bhatty, 1995; Morrison et al., 1984; Gerring y DeHaas, 1974; Bankes et al., 1971; Persson y Chrisierson, 1997;. Vasunthan y Bhatty, 1998; Czuchajowska et al., 1998; Song y Jane, 2000; Andreev et al., 1999; Yoshimoto et al., 2000) y las propiedades del grano (Swantson 1992, Ahokas 1979; Oscarsson et al, 1997; Oscarsson et al., 1998; Andersson et al., 1999; Elfverson et al., 1999; Bhatty 1999; Zheng et al., 2000; Izydorczyk et al., 2000; Andersson et al., 2000) y se ha investigado la utilidad de los mutantes en ensayos de alimentación animal (Xue et al., 1996; Newman et al., 1978; Calvert et al., 1976; Wilson et al., 1975; Sundberg et al., 1998; Bergh et al., 1999), en alimentos humanos (Swanston et al., 1995; Fastnaught et al., 1996; Persson et al., 1996; Pomeranz et al., 1972) y en nutrición humana (Pomeranz 1992; Granfeldt et al., 1994; Oscarsson et al., 1996; Akerberg et al., 1998).
En el presente ejemplo, se ha aislado una clase novedosa de mutante con un contenido elevado de amilosa de la cebada. Las líneas mutantes presentan contenidos de amilosa (65-70%) superiores a los conocidos para el mutante glaciar de elevado contenido de amilosa (AC38) (45-48%) (Walker et al., 1968), que está bien caracterizado, y contienen almidón con una estructura de amilopectina que presenta un aumento de la frecuencia de ramificación del almidón; esto se contrapone con la frecuencia de ramificación reducida asociada con el mutante extensor de la amilosa en el maíz (Takeda, et al., 1993).
Las características del grano y el almidón del mutante de la presente se han investigado con detalle y se ha determinado el mapa genético de la mutación causal. Las mutaciones aisladas son alélicas al mutante encogido previo conocido de la cebada, sex6, y se ha demostrado que la mutación causal está situada en el gen de la almidón-sintasa II. Los efectos de esta mutación han aportado más información sobre el proceso de la biosíntesis del almidón e ilustran cómo las mutaciones en genes específicos pueden tener repercusiones diferentes sobre la estructura del almidón de una especie a otra.
Mutagénesis y criba
La variedad de cebada sin cáscara “Himalaya” se mutagenizó empleando azida sódica de acuerdo con Zwar y Chandler (1995). La selección de las variantes con una morfología alterada del grano se realizó de acuerdo con Green et al. (1997). Se identificaron y mantuvieron un total de 75 líneas con fenotipos de endospermo encogido de acuerdo con Green et al. (1997).
Aislamiento del almidón
El almidón se aisló a partir del grano de cebada empleando el método de Schulman et al. (1991).
Métodos para determinar la amilosa
Las determinaciones de la proporción de amilosa/amilopectina mediante un método de HPLC para separar los almidones desrramificados y un método de unión de yodo se realizaron según describen Batey y Curtin (1996). El análisis de la proporción de amilosa/amilopectina mediante el análisis de los almidones no desrramificados se realizó de acuerdo con Case et al. (1998).
Medida del contenido de almidón
El almidón se determinó empleando el kit de análisis de almidón total suministrado por Megazyme (Bray, Co Wicklow, República de Irlanda).
Contenido proteico
El nitrógeno se determinó mediante el método Kjeldahl y los contenidos proteicos se calcularon empleando un factor de 5.7.
Niveles de f-glucano
El �-glucano se determinó empleando el kit suministrado por Megazyme (Bray, Co Wicklow, República de Irlanda).
Distribución de longitudes de cadena del almidón
Se desrramificaron los almidones y se analizaron las distribuciones de longitudes de cadena empleando electroforesis de carbohidratos asistida por fluoróforos (FACE), utilizando una electroforesis capilar de acuerdo con Morell et al. (1998).
DSC
La gelatinización se determinó en un calorímetro diferencial de barrido Pyris 1 (Perkin Elmer, Norwalk CT, EE. UU.). El almidón se mezcló con agua en una proporción de 2 partes de agua : 1 parte de almidón, y esta mezcla (40-50 mg, pesada con precisión) se introdujo en una cápsula de acero inoxidable y se selló. La muestra se escaneó a 10 °C por minuto desde 20 °C hasta 140 °C, empleando una cápsula de acero inoxidable vacía como referencia. Se determinaron las temperaturas de gelatinización y la entalpía empleando el software Pyris.
Análisis RVA
La viscosidad se evaluó en un viscosímetro rápido (RVA, Newport Scientific Pty Ltd, Warriewood, Sidney), empleando las condiciones descritas por Batey et al., 1997 para harinas integrales. Para inhibir las a-amilasas, se añadió nitrato de plata en todos los ensayos con una concentración de 12 mM. Los parámetros evaluados fueron la viscosidad máxima (la viscosidad máxima de la pasta caliente), fuerza de sujeción, viscosidad final y temperatura de pastificación. Además, se calcularon la fragilidad (viscosidad máxima menos fuerza de sujeción) y el asentamiento (viscosidad final menos fuerza de sujeción).
Hinchamiento de la harina
Se determinó el volumen de hinchamiento de la harina de acuerdo con el método de Konik-Rose et al. (2001).
Datos de rayos X
Los datos de difracción de rayos X se registraron empleando técnicas estándar (Buleon et al., 1998).
Microscopía electrónica de barrido
La microscopía electrónica de barrido se realizó en un instrumento Joel JSM 35C. Los almidones purificados se recubrieron catódicamente con oro y se escanearon a 15 kV a temperatura ambiente.
Producción de haploides dobles
Los haploides dobles fueron producidos a partir de plantas F1 derivadas de cruces entre 292 y Hordeum vulgare cv Tantangara, y entre 342 y H. vulgare cv Tantangara por el Dr. P. Davies, Waite Institute, Adelaida, Australia.
Análisis de vínculos
Los datos de los vínculos genéticos se calcularon empleando MapManager.
Construcción de una genoteca de ADNc de la cebada
Para la síntesis de ADNc, se emplearon 5 mg de poliA + ARNm de los días 10, 12 y 15 después de la ántesis de los tejidos de endospermo de cebada de acuerdo con los protocolos (Life Technology). Para la síntesis de la primera hebra de ADNc, se empleó el cebador NotI-(dT)18 (Pharmacia Biotech). Los ADNc bicatenarios se ligaron con un adaptador SalI-XhoI (Stratagene) y se clonaron en los extremos SalI-NotI de ZipLox (Life Technology) tras la digestión de los ADNc con NotI seguida de fraccionamiento granulométrico (columna de centrifugación SizeSep 400 de Pharmacia Biotech). Los ADN ligados se empaquetaron con el extracto de empaquetamiento Gigapack III Gold (Stratagene). La valoración de la genoteca se realizó con una concentración de 2x106 pfu de la cepa Y1090(ZL) de E.coli.
Clonación de regiones de ADNc específicas de la almidón-sintasa II de la cebada empleando PCR
El clon de ADNc, wSSIIp1, se empleó para la criba de una genoteca de ADNc de cebada. El clon de ADNc, wSSIIp1, se generó por PCR empleando los cebadores ssIIa (TGTTGAGGTTCC ATGGCACGTTC SEQ.ID. NO 9) y ssIIb (AGTCGTTCTGCCGTATGATGTCG SEQ. ID. NO 10), y ampliando la región entre las posiciones de los nucleótidos 1435 y 1835 de wSSIIA (n.o de acceso de GenBank: AF 155217).
La amplificación se realizó empleando un secuenciador térmico FTS-1 (Corbett, Australia) con 1 ciclo de 95 °C durante 2 minutos; 35 ciclos de 95 °C durante 30 segundos, 60 °C durante 1 minuto, 72 °C durante 2 minutos y 1 ciclo de 25 °C durante 1 minuto. El fragmento wSSIIp1 se clonó en un vector pGEM-T (Promega).
Criba de la genoteca de ADNc de cebada
Se realizó una criba de una genoteca de ADNc, construida a partir de ARN del endospermo de la cebada cv Himalaya, con un fragmento de 347 pares de bases de ADNc, wSSIIp1, en las condiciones de hibridación descritas previamente (Rahman et al., 1998). La hibridación se llevó a cabo en un 50% de formamida, 6 x SSPE, 0.5% de SDS, 5 x solución de Denhardt y 1.7 μg/mL de ADN de esperma de salmón a 42 °C durante 16 h, a continuación se lavó 3 x con 2 x SSC que contenía un 0.1% de SDS a 65 °C durante 1 h por lavado.
Criba de una biblioteca genómica de cebada
Se construyó una biblioteca genómica de cebada (cebada cv Morex) y se realizó una criba esencialmente como describieron Gubler et al. (2000) empleando el ADNc de SSII de la cebada como una sonda.
Determinación de la secuencia de los clones genómicos
El gen SSII de Morex se subclonó en vectores plasmídicos y se determinó su secuencia. Se determinó la secuencia de los genes de 292 y MK6827 mediante amplificación por PCR de las regiones solapadas del gen, empleando cebadores diseñados en función de la secuencia de Morex. Se determinó la secuencia de los fragmentos de PCR directamente o bien se subclonaron dichos fragmentos y se determinó su secuencia a partir de los plásmidos.
Identificación de las regiones expresadas
Las regiones de las secuencias genómicas de 292 y MK6827, cuya presencia en los ADNc se había predicho, se definieron por referencia a la secuencia de ADNc de Himalaya y la secuencia genómica de Morex.
Análisis de PCR de la mutación de G a A en el gen SSII
Los cebadores de PCR se diseñaron de manera que amplificaran la región que contenía la mutación de transición de G a A identificada en 292. Las secuencias de los cebadores son: ZLSS2P4 (CCTGGAACACTTCAGACTGTACG SEQ ID NO 11) y ZLBSSII5 (CTTCAGGGAGAAGTTGGTGTAGC SEQ ID NO 12). La amplificación se llevó a cabo empleando un secuenciador térmico FTS-1 (Corbett, Australia) con 1 ciclo de 95 °C durante 2 minutos; 35 ciclos de 95 °C durante 30 segundos, 60 °C durante 1 minuto, 72 °C durante 2 minutos y 1 ciclo de 25 °C durante 1 minuto.
Análisis de SDS-PAGE de las proteínas del endospermo de la cebada
El almidón se preparó a partir del endospermo maduro y en desarrollo de la cebada y el trigo, y las proteínas de superficie se eliminaron por acción de la proteinasa K, según está descrito (Rahman et al., 1995). Las proteínas del gránulo de almidón se extrajeron a partir de 20 mg de almidón en peso seco, empleando 0.5 mL de una solución amortiguadora de extracción que contenía Tris 50 mM de pH 6.8, 10% de SDS y 10% de 2-mercaptoetanol. Tras la gelatinización al hervir durante 10 min, y la separación del almidón por centrifugación, se colocaron 15 microlitros del sobrenadante en cada carril.
Producción del haploide doble
Los haploides dobles fueron producidos a partir de plantas F1 derivadas de cruces entre 292 y Hordeum vulgare cv Tantangara, y entre 342 y H. vulgare cv Tantangara por el Dr. P. Davies, Waite Institute, Adelaida, Australia.
Estrategia de retrocruzamiento
Se realizaron cruces entre 292 y Hordeum vulgare cv Sloop para generar las semillas F1. Las plantas derivadas de las semillas F1 se autosembraron para generar una población de semillas F2. Las plantas cultivadas a partir de estas semillas F2 se analizaron empleando un ensayo de PCR y las plantas homocigotas para la mutación 292 se retrocruzaron con Sloop (BC1). Las plantas F1 obtenidas a partir de BC1 se volvieron a analizar por PCR y las plantas heterocigotas para la mutación 292 se seleccionaron y se retrocruzaron con Sloop (BC2). Las plantas F1 derivadas de BC2 se volvieron a analizar por PCR y se seleccionaron las plantas heterocigotas para la mutación
292. Estas plantas se autosembraron para generar una población BC2F2, o bien se volvieron a cruzar con Sloop (BC3). Las plantas F1 derivadas de BC3 se volvieron a analizar por PCR y se seleccionaron las plantas heterocigotas para la mutación 292. Estas plantas se autosembraron para generar una población BC3F2. Las plantas derivadas de esta semilla se analizaron por PCR y las plantas homocigotas para la mutación 292 se seleccionaron para la descendencia de semilla única y la mejora de la semilla.
Selección de mutantes
La identificación de una serie de mutantes en la variedad de cebada sin cáscara o gimnosperma “Himalaya” inducida por un tratamiento con azida sódica ha sido descrita previamente por Zwar y Chandler (1995). Los inventores han identificado un grupo de 75 mutantes de grano encogido y han determinado el contenido de amilosa del almidón de la semilla encogida por HPLC (Figura 1). Se ha determinado que dos líneas, 292 y 342, presentaron contenidos de amilosa de un 71% y un 62.5%, respectivamente (Tabla 1). Los contenidos de amilosa de 292 y 342 fueron sustancialmente superiores a los de la línea AC38, caracterizada debidamente con anterioridad (47% de amilosa, remítase a la Tabla 1). Este estudio define la base genética del fenotipo novedoso con un contenido elevado de amilosa representado por 292 y 342, y describe los efectos de la mutación causal sobre la estructura y la funcionalidad del almidón y el grano.
Características del grano
Tamaño y morfología del grano:
Los efectos de la mutación sobre el peso y la morfología del grano son significativos (Tabla 2). El peso del grano se ha reducido desde 51 mg para la línea original Himalaya, hasta 32 mg para 292 y 35 mg para 342. Los mutantes conservan la longitud y el ancho del grano natural, pero en comparación están más aplanados (desde un grosor medio de 2.82 mm en Himalaya hasta 1.58 y 1.75 mm en 292 y 342, respectivamente) y presentan una región central básicamente vacía. La Figura 2 muestra fotografías del grano natural y mutante. Las dimensiones del grano se midieron de forma rutinaria; la longitud del grano (L), el ancho del grano en el punto más ancho (A) y el grosor (G), según se indica en la Figura 2. El cociente de la longitud (L) entre el grosor (G) del grano constituye un diagnóstico útil para la mutación; normalmente las semillas que contienen las mutaciones 292 o 342 presentan valores > 3.5 y las cebadas sin mutantes presentan valores < 3.5.
Composición del grano
El contenido de almidón de las líneas mutantes se ha reducido desde un 49.0% para Himalaya hasta un 17.7% y un 21.9% para 292 y 342, respectivamente (remítase a la Tabla 1). Al restar el peso de almidón del peso total del grano para obtener el contenido total del grano que no es almidón, se observó que la pérdida de contenido de almidón se correspondía con la pérdida de peso del grano, con pesos del contenido del grano que no es almidón de 26.0, 26.3 y
27.3 mg para Himalaya, 292 y 342, respectivamente.
El contenido proteico de 292 y 342 ha aumentado con relación a la línea original Himalaya (Tabla 1), sin embargo, este efecto es debido a la pérdida de almidón del grano y no es debido a ningún aumento de la síntesis de proteínas por cariopsis.
Los niveles de �-glucano de los mutantes 292 y 342 también han aumentado, y son más elevados de lo que cabría esperar a partir del efecto de la reducción del contenido de almidón (Tabla 1). En ambos casos, el contenido de glucano ha aumentado aproximadamente un 20% por cariopsis, lo que posiblemente representa una desviación de una pequeña proporción del carbono de entrada de la síntesis de almidón hacia la síntesis de �-glucano.
Composición y funcionalidad del almidón
Contenido de amilosa y amilopectina
El contenido de amilosa se determinó empleando dos técnicas, en primer lugar, la HPLC de exclusión por tamaños en un 90% (v/v) DMSO y, en segundo lugar, el valor del yodo azul. Los contenidos de amilosa determinados con cada método fueron similares y los datos de HPLC se muestran en la Tabla 1.
A partir de los datos del peso del grano y el contenido de amilosa para las líneas naturales y mutantes, se pueden realizar cálculos de la cantidad de amilosa depositada por grano. Este análisis muestra que se ha producido una reducción de la cantidad de amilosa por grano desde 6.2 mg/cariopsis en Himalaya hasta 4.0 mg/cariopsis en 292 y
4.8 mg/cariopsis en 342. Por el contrario, se ha producido una reducción pronunciada de la síntesis de amilopectina por cariopsis desde 18.7 mg en Himalaya hasta 1.6 mg en 292 y 2.9 mg en 342.
Distribución de longitudes de cadena
La distribución de longitudes de cadena del almidón tras la desrramificación de la isoamilasa se realizó empleando electroforesis de carbohidratos asistida por fluoróforos (FACE). En la Figura 3a se muestra la distribución de longitudes de cadena de los mutantes 292 y 342, y de Himalaya. La Figura 3b muestra un gráfico de la diferencia, en el que las distribuciones de longitudes de cadena normalizadas para los mutantes 292 y 342 se restan de la
distribución normalizada para Himalaya. Se han calculado los porcentajes de longitudes de cadena para DP 6-11, DP 12-30 y DP 31-65, y se presentan en la Tabla 3. Se puede observar un desplazamiento significativo en la distribución de longitudes de cadena de los mutantes 292 y 342, de manera que existe un porcentaje más elevado de cadenas en la región de DP6-11 en comparación con DP 12-30.
Calorimetría diferencial de barrido
Se investigó la temperatura de gelatinización de los mutantes empleando calorimetría diferencial de barrido y los datos se muestran en la Tabla 4. Tanto 292 como 342 proporcionan almidones con temperaturas de gelatinización significativamente menores que los almidones de Himalaya, con relación a las temperaturas de inicio, máximas y finales para el pico de gelatinización. La entalpía del pico de gelatinización para los mutantes 292 y 342 también se ha reducido dramáticamente en comparación con el almidón natural. La temperatura de inicio del pico amilosa/lípido también se ha reducido para los mutantes 292 y 342, sin embargo, la entalpía ha aumentado, lo cual es coherente con el mayor contenido de amilosa de los mutantes.
Viscosidad del almidón por RVA
Se realizó un análisis de RVA de las muestras integrales de cebada para examinar su viscosidad de pastificación. Algunos estudios previos han demostrado que el análisis de muestras integrales se correlaciona estrechamente con el análisis de los almidones aislados (Batey et al., 1997). El análisis mostró que existen grandes diferencias entre los genotipos de cebada estudiados (remítase a la Tabla 5 y la Figura 4). Dos variedades de cebada que contenían almidón natural, Himalaya y Namoi, presentaron perfiles típicos de RVA, en los que se observó una viscosidad máxima destacada, seguida de una reducción de la viscosidad hasta la fuerza de sujeción, seguida de un aumento de la viscosidad a medida que la temperatura se reduce hasta obtener una viscosidad final. Como se observa generalmente para los almidones de cebada, las viscosidades finales para los almidones naturales fueron equivalentes a las viscosidades máximas, o inferiores a estas (Tabla 5). Para AC38, se obtuvo una viscosidad máxima destacada, sin embargo, debido al elevado contenido de amilosa de esta línea, la viscosidad final obtenida fue más elevada que la viscosidad máxima. Sin embargo, en 292, 342 y MK6827 se obtuvo un perfil muy diferente. No se obtuvo ningún aumento inicial destacado de la viscosidad correspondiente a la viscosidad máxima para otros almidones de cebada y, por consiguiente, no se pudo calcular el valor para la fragilidad. Los valores para la viscosidad máxima mostrados en la Tabla 5 para 292, 342 y MK6927 son las viscosidades registradas en el momento en que se alcanzó la viscosidad máxima para Himalaya. En 292, 342 y MK6927 la viscosidad aumentó a lo largo del análisis hasta alcanzar una viscosidad final comparable a la de las otras muestras integrales. Cuando se normalizaron según el contenido de almidón, los almidones de 292 y 342 presentaron unas viscosidades finales muy elevadas (remítase a la Tabla 5).
El volumen de hinchamiento representa un método para determinar las propiedades de la harina o el almidón, que examina el comportamiento del material al exponerlo a calentamiento y exceso de agua. El aumento de la recaptación de agua se determina pesando la muestra antes y después de mezclar la muestra con agua a unas temperaturas definidas y tras la obtención del material gelatinizado. El análisis mostró que las muestras de control, Himalaya y Tantangara, se hincharon hasta 6-8 veces su peso seco, por el contrario, 292 y 342 se hincharon hasta solo 2-3 veces su peso seco (Tabla 9).
Cristalinidad
La estructura de los almidones se investigó adicionalmente mediante cristalografía de rayos X (remítase a la Tabla 6 y la Figura 5). Himalaya mostró el patrón esperado para un almidón de cereal, con una cristalinidad de tipo “A” predominante, y tanto AC38 como Waxiro mostraron patrones de difracción de rayos X muy similares, aunque los niveles de cristalinidad fueron menores para AC38 y mayores para Waxiro. Para los mutantes 292 y 342, el patrón de difracción de rayos X cambió y se obtuvo una mezcla de patrón B y V. Además del cambio del patrón de difracción, la cantidad de cristalinidad se redujo considerablemente en los mutantes 292 y 342, hasta un 9% y un 12%, respectivamente. Este resultado es coherente con el bajo contenido de amilopectina de los almidones 292 y
342.
Morfología del gránulo
Se investigó la morfología del gránulo de almidón empleando microscopía electrónica de barrido (Figura 6). El tamaño y la forma de los gránulos de Himalaya (Figura 6, panel a), cebada cerosa (Waxiro, Figura 6, panel b) y AC38 (Figura 6, panel c) fueron coherentes con las observaciones publicadas previamente para gránulos de almidón en líneas de cebada normal. La morfología de los gránulos de almidón de tipo “A” en las líneas mutantes 292 (Figura 6, panel d), 342 (Figura 6, panel e) y MK6827 (Figura 6, panel f) está claramente alterada, presentando los gránulos una superficie rugosa en comparación con la forma lenticular lisa de las cebadas normales.
Fibra dietética
El análisis de la fibra dietética se llevó a cabo de acuerdo con el procedimiento AOAC y mostró que se produjo un aumento de la fibra dietética en 292 y 342, y que este aumento de la fibra dietética era debido a un aumento de la fibra dietética insoluble y no de la fibra dietética soluble (Tabla 1), lo que resulta coherente con el hecho de que los componentes de la fibra dietética sean el almidón resistente y el �-glucano. Cabe destacar que esta medición de la fibra dietética es una medición determinada químicamente, que es bastante diferente de la medición fisiológica que resulta relevante desde un punto de vista nutricional.
Base genética de la mutación
Proporción de segregación
El hecho de que el cruce de la mutación con las variedades de cebada no presentara el fenotipo de endospermo encogido de 292 o 342 demuestra que la mutación es una mutación recesiva clara, que presenta una proporción de 3 normales : 1 encogida para las semillas F2 de las poblaciones cruzadas, y una proporción de 1 normal : 1 encogida en las semillas de una población haploide doble desarrollada siguiendo un cruce único (remítase a la Tabla 6). Se define “normal” como una semilla con un cociente L/G < 3.5 y se define una semilla encogida como una semilla con un cociente L/G > 3.5.
Naturaleza alélica de los mutantes
Se determinó que las mutaciones 292 y 342 eran alélicas a lo largo del análisis de progenie de los cruces de 292 y
342. Todas las semillas F1 derivadas de cruces recíprocos presentaron fenotipos de morfología del grano y peso del grano dentro del intervalo de tamaños y formas observado para las líneas originales 292 y 342, y fuera del intervalo de tamaños y formas de semilla determinado para la línea original Himalaya. Además, todas las semillas F2 derivadas de las plantas F1 de 292 x 342 presentaron el fenotipo de semilla encogida habitual de los mutantes 292 y
342.
El análisis de la morfología del grano y las características del almidón de una serie de mutantes de grano encogido adquiridos de la colección de germoplasma de cebada (centro de investigación nacional de germoplasma de granos pequeños USDA-ARS, Aberdeen, Idaho 83210 EE. UU.) sugirió que la línea MK6827 (BGS31, también denominada GSHO 2476), que contenía la mutación sex6, presentaba un conjunto de características del grano y del almidón muy similar al de las mutaciones 292 y 342. Se realizaron cruces entre 292 y MK6827, y todos los granos F1 presentaron el fenotipo habitual de 292 con relación al peso del grano y el fenotipo de semilla encogida. Todas las semillas F2 derivadas de las plantas F1 de 292 x MK6827 mostraron el fenotipo de endospermo encogido, con cocientes L/G >
4. Por el contrario, las semillas F2 de un cruce entre 292 y el cultivar de cebada comercial Sloop proporcionaron una distribución bimodal, que presentó una proporción de segregación de 3:1 entre las semillas encogidas y rellenas (Tabla 6). Todas las semillas F1 generadas a partir de los cruces de 292 y 5 líneas diferentes con fenotipos de endospermo encogido (BGS 380, endospermo encogido 4, 7HL (Jarvi et al., 1975); BGS 381, endospermo encogido 5, 7HS (Jarvi et al., 1975); BGS 382, sex1, 6HL (Eslick y Ries 1976); BGS 396, endospermo encogido 6, 3HL (Ramage y Eslick 1975); BGS 397, endospermo encogido 7, no mapeado, (Ramage y Eslick 1975) proporcionaron granos con una morfología de semilla rellena. Basándose en esto, se considera que las mutaciones 292, 342 y MK6827 son alélicas y, basándose en las localizaciones del mapa publicadas previamente para el locus de sex6, se podría predecir que las mutaciones 292 y 342 se situarán en el brazo corto del cromosoma 7H de la cebada, aproximadamente a 4 cM del centrómero (Netsvetaev, 1990, Netsvetaev y Krestinkov, 1993, Biyashev et al., 1986, Netsvetaev, 1992).
Análisis de vínculos
Se generó una población haploide doble a partir de un cruce entre 292 y la variedad de cebada de malta comercial, Tantangara, que contenía 90 líneas de progenie (Tabla 8).
Las líneas se clasificaron con relación a la morfología de la semilla (semilla rellena frente a semilla encogida), distribución de longitudes de cadena por FACE (porcentaje de cadenas con DP de 6 a 11), cubierta de la semilla (con o sin cáscara) y el marcador de PCR (ver más adelante). Estos datos se muestran en la Tabla 8. El carácter de semilla encogida y la distribución por FACE de 292 se cosegregaron exactamente en esta población, como cabría esperar si el tamaño y la forma del grano alterado fueran consecuencia de la deposición alterada del almidón. La cosegregación de los caracteres se ilustra en la Figura 8. El panel A muestra la correlación entre la longitud de cadena del almidón (representada por el porcentaje de cadenas con un DP entre 6 y 11) y el cociente de la longitud entre el grosor. Los círculos en blanco indican líneas que tienen el marcador de PCR para la mutación 292 y las cruces indican líneas que contienen el marcador de PCR natural. Existe una definición clara entre los dos grupos de líneas. El panel B de la Figura 8 muestra la correlación entre la longitud de cadena del almidón y el peso de la semilla, y muestra que el peso de la semilla representa un peor diagnóstico para la mutación que el cociente de la longitud entre el grosor.
En la cebada, la presencia o ausencia de cáscara está controlada por el locus nud situado en el cromosoma 7H y, debido a que Tantangara es una cebada con cáscara y 292 es un tipo sin cáscara, se podría evaluar este carácter en la progenie haploide doble. El análisis del vínculo entre el carácter con/sin cáscara y los datos de FACE mostró que en este cruce la mutación 292 se localizó en el mapa genético a 16.3 cM del locus nud. Esta posición es coherente con los datos previos del mapa para la mutación alélica sex6 (Netsvetaev, 1990, Netsvetaev y Krestinkov, 1993, Biyashev et al., 1986, Netsvetaev, 1992).
Identificación del gen causal
Se ha demostrado que el gen nud está localizado en la cebada en el cromosoma 7H (Figura 8, Fedak et al., 1972). En el trigo, existen tres almidón-sintasas (GBSS, SSI y SSII) y una enzima desrramificante de tipo isoamilasa (S. Rahman, comunicación personal) localizadas en el brazo corto del cromosoma 7, el cromosoma homólogo (Yamamori y Endo, 1996, Li et al., 1999a, Li et al., 1999b, Li et al., 2000). El vínculo cercano al locus nud sugirió que el gen candidato más probable era el gen SSII. Se ha clonado el gen SSII del trigo a nivel de ADNc (Li et al, 1999b;
N.o de acceso en GenBank AF155217) y a nivel genómico (Li et al., comunicación personal), y se ha aislado y clonado un ADNc de cebada (Figura 9). La secuencia de la cebada y las secuencias genómicas de SSII del trigo muestran que los genes presentan unas estructuras de exones/intrones muy similares, sin embargo, las longitudes de las regiones de los intrones difieren entre las secuencias (Figura 10). La comparación de la secuencia genómica de Morex y la secuencia de un ADNc de Himalaya (Figura 9) llevó a la identificación de las secuencias de ADNc deducidas de Morex, 292 y MK2827.
Se detectó un mutante de transición de G a A en el gen SSII de 292 en una posición que se corresponde con 1862 de la alineación mostrada en la Figura 11. Esta mutación introduce un codón de parada en el marco abierto de lectura de SSII en 292 (Figura 12). El análisis de la secuencia de Tantangara e Himalaya mostró que ambos genes naturales eran idénticos en esta región y que tanto 292 como 342 contenían la misma mutación de transición de G a
A. El codón de parada introducido truncaría el producto genético, de manera que la totalidad del dominio catalítico Cterminal del gen de la almidón-sintasa II no se traduciría y, por consiguiente, sería muy probable que la actividad de SSII se suprimiera totalmente debido a esta mutación.
También había una transición de G a A presente en MK6827, en la posición 242 de la alineación mostrada en la Figura 11 y la secuencia de ADNc de Himalaya en la Figura 9. Esta mutación también introduce un codón de parada en el marco abierto de lectura de SSII en 292 (Figura 12) y evitaría la traducción de más de un 90% del gen SSII, lo que suprimiría la actividad SSII codificada por este gen.
La mutación de transición de G a A en 292 alteró un sitio de restricción (NlaIV) en el gen SSII de la cebada. La posición del sitio NlaIV para diagnóstico se muestra en los paneles (a) y (b) de la Figura 14. La Figura 14c muestra la electroforesis en gel de agarosa de los productos digeridos de NlaIV de la cebada, la cual indica que el patrón de diagnóstico para la mutación 292 se encuentra en 292 y 342 pero no en MK6827, Himalaya ni Tantangara.
Se evaluó el marcador de PCR para la transición de G a A en las 90 líneas de la población haploide doble de 292 x Tantanagara y se determinó que se cosegregaron exactamente con los fenotipos de semilla encogida y de la distribución de longitudes de cadena por FACE, lo que indica que la mutación 292 está completamente vinculada a este fenotipo de almidón y que es muy probable que esta mutación sea la mutación causal subyacente al fenotipo
292. La Figura 14d muestra el análisis de las líneas de la población haploide doble de 292 x Tantangara.
Datos bioquímicos que ponen de manifiesto la pérdida de actividad SSII
Se investigó la composición de las enzimas implicadas en la biosíntesis del almidón en las líneas de cebada normal y mutante, empleando una serie de técnicas de electroforesis en gel. El análisis de la fracción soluble del endospermo en desarrollo demostró que todas las líneas contenían BEI, BEIIa, BEIIb, SSI y SSIII, y que el contenido de estas isoformas de BE y SS, respectivamente, no se vio alterado significativamente. Sin embargo, el análisis del gránulo de almidón indicó que faltaban varias bandas. En primer lugar, el análisis de SDS-PAGE (Figura 16, panel A) mostró que una banda de 90 kD, que estaba presente en Himalaya, Tantangara y AC38, no estaba presente en 292, 342 ni MK6827. Mediante un ensayo de Western blot, se demostró que esta banda contenía SSII (Figura 16, panel B), BEIIa y BEIIb. El descubrimiento de que BEIIa y BEIIb están presentes en la fracción soluble pero no en el gránulo indica que se ha producido una alteración de la distribución de estas enzimas en los mutantes 292, 342 y MK6827, en lugar de una mutación que suprime la expresión. Por el contrario, no se detectó ningún indicio de expresión de SSII en la fracción soluble ni en la fracción del gránulo (Figura 16, paneles A y B), lo que resulta coherente con las pruebas genéticas que vinculan directamente la mutación SSII con los fenotipos observados en 292, 342 y MK6827.
Cultivo de las líneas que contienen la mutación 292
Se emplearon dos estrategias para transferir la mutación 292 a genotipos de cebada alternativos.
En el primer ejemplo, se generaron líneas haploides dobles a partir de un cruce entre 292 y Tantangara. En la Tabla 8 se muestran los datos referentes a la cubierta de la semilla, peso de la semilla, cociente L/G, distribución de longitudes de cadena y estado del marcador de ADN para SSII. En la Tabla 9 se muestra un análisis más exhaustivo de la composición de estas líneas, que incluye el análisis de RVA, el contenido de �-glucano y el volumen de hinchamiento de la harina. Los datos muestran que las líneas que contienen la mutación 292 presentan unos parámetros de RVA significativamente diferentes (según pone de manifiesto el cociente de viscosidad máxima/final), un mayor contenido de �-glucano y unos volúmenes alterados de hinchamiento de la harina.
En el segundo ejemplo, la mutación se transfirió realizando dos retrocruces de 292 a un cultivar con propiedades normales del almidón (cv Sloop). Se recogieron las semillas F2 de tres plantas F1 con 2 retrocruces para analizarlas. Las semillas F2 se clasificaron en semillas con un cociente L/G > 3.5 y semillas con un cociente L/G < 3.5. La distribución de las semillas entre estas clases resultó ser coherente con la que cabría esperar para un gen recesivo único. Los datos del volumen de hinchamiento de la harina para las categorías de semillas derivadas de cada planta se muestran en la Figura 10 y ponen de manifiesto que el rasgo de hinchamiento del almidón se transfirió claramente a lo largo del proceso de cultivo a las líneas con un promedio de un 75% de código Sloop.
Se describe el aislamiento de mutantes novedosos, 292 y 342, en la cebada que presentan un fenotipo de endospermo encogido. El análisis de la composición del grano demuestra que el fenotipo encogido es debido a una reducción significativa del contenido de almidón, y el análisis de la composición del almidón muestra que esta reducción se pone de manifiesto en forma de un fenotipo con un contenido elevado de amilosa como consecuencia de una reducción de la síntesis de amilopectina.
Los mutantes 292 y 342 poseen una combinación única de propiedades del grano y del almidón, en cuanto a que ambos contienen niveles más elevados de �-glucano y almidón resistente. Los niveles de �-glucano de las líneas son aproximadamente un 15% más elevados de lo que cabría esperar debido al efecto del contenido reducido de almidón, lo que sugiere que el carbono que no se puede convertir en almidón se desvía hacia la síntesis de glucano. Las determinaciones de los niveles de fibra dietética demuestran que el grano de los mutantes posee niveles más elevados de fibra dietética, y que este aumento es debido a un aumento de la fibra dietética insoluble.
Esta combinación de propiedades indica que estos mutantes podrían tener una aplicación potencial muy interesante como componentes de la dieta humana. En primer lugar, los niveles elevados de �-glucano sugieren que las líneas podrían ser útiles para reducir el colesterol mediante la acción ya establecida del �-glucano en la reducción de los niveles de colesterol. En segundo lugar, la presencia de almidón resistente indica que las líneas podrían ser beneficiosas desde el punto de vista de la salud intestinal, debido a la capacidad ya establecida de los almidones resistentes para facilitar la fermentación colónica (Topping el al., 1997, Topping 1999). En tercer lugar, la composición del grano indica que las líneas tendrán una densidad energética baja y que se podrían digerir lentamente, lo que indica que podrían contribuir a la formulación de alimentos con un índice glucémico reducido.
Las propiedades del almidón de las líneas a modo de ejemplo también son únicas por el hecho de que combinan un almidón con un contenido elevado de amilosa que también presenta una temperatura de gelatinización baja. Esto contrasta con las mutaciones con un contenido elevado de amilosa obtenidas a partir de mutaciones en la enzima ramificante IIb, en las que habitualmente la temperatura de gelatinización aumenta, tales como la mutación extensora de la amilosa en el maíz (Ng et al., 1997, Katz et al., 1993, Krueger et al., 1987, Fuwa et al., 1999). Aunque el contenido de amilosa de 292 es comparable al de las líneas extendidas de amilosa, la estructura del componente amilopectínico de los almidones difiere dramáticamente (Wang et al., 1993). En 292 y 342, la distribución de longitudes de cadena de la amilopectina se desplaza hacia un grado de polimerización más bajo, mientras que en el extensor de amilosa, la distribución de longitudes de cadena se desplaza hacia un grado de polimerización más elevado. Esto sugiere que el contenido de amilopectina es el factor determinante principal de la temperatura de gelatinización, en lugar del contenido de amilosa, y que este efecto está controlado mediante la fuerza de la interacción entre las cadenas externas de la molécula de amilopectina. Jane et al., 1999, observaron efectos similares para una serie de almidones.
Los datos de viscosidad del análisis de RVA indican que el almidón de las líneas de SSII mutante está marcado de forma diferente que para las cebadas normales y AC38. Las cebadas con SSII mutante no tienen esencialmente ningún pico de viscosidad, que habitualmente se suele observar cuando se aumenta la temperatura hasta 95 °C al principio de un perfil de temperatura de RVA. En su lugar, en estos mutantes, la viscosidad aumenta progresivamente hasta obtener una viscosidad final, en el caso de que la haya. Estos datos son coherentes con el bajo contenido de amilopectina de los gránulos, el bajo nivel de cristalinidad de la amilopectina en el gránulo y la baja temperatura de gelatinización y entalpía observadas en el calorímetro diferencial de barrido. Se alcanza una viscosidad final elevada una vez que la amilosa se ha liberado del gránulo mediante calentamiento en exceso de agua y agitación. Estas características de RVA son únicas para un almidón de cereal y proporcionan una fuente novedosa de almidón para aplicaciones alimentarias e industriales en las que se requiere una viscosidad de pastificación baja y a la vez una viscosidad final elevada.
Las observaciones hechas sobre la temperatura de gelatinización en el DSC se reflejan en los resultados de los estudios de difracción de rayos X. Los gránulos de 292 y 342 presentan niveles reducidos de cristalinidad y la forma cristalina varía del tipo A, habitual para los almidones de cereales, a una mezcla de tipos V y B. El tipo V es habitual para la amilosa y refleja que el componente de amilosa del almidón está complejado con ácidos grasos, mientras que la forma B deriva de la amilopectina y presuntamente refleja el contenido residual de amilopectina del almidón (Buleon et al., 1998).
El análisis de la base genética de las mutaciones 292 y 342 demuestra que las mutaciones son mutaciones recesivas simples que generan las proporciones mendelianas típicas en experimentos de cruzamiento. Los estudios de cruzamiento demostraron que 292 y 342 son alélicos. Los análisis adicionales de la interacción entre 292 y otras mutaciones de endospermo encogido en experimentos de cruzamiento demostraron que las mutaciones 292/342 también eran alélicas con la mutación sex6 en la línea MK6827. Esta mutación se ha localizado previamente en el mapa genético y se ha mostrado que está situada a menos de 3 cM del centrómero en el brazo corto del cromosoma 7H (Netsvetaev, 1990, Netsvetaev y Krestinkov, 1993, Biyashev et al., 1986, Netsvetaev, 1992).
Se estableció una población haploide doble entre la cebada con cáscara Tantangara y el mutante sin cáscara 292 y la mutación de endospermo encogido se mapeó en el brazo corto del cromosoma 7HS, a menos de 16 cM del gen nud, una localización coherente con la localización en el mapa de la mutación sex6.
La localización del gen en la región adyacente al centrómero en el brazo corto del cromosoma 7HS demuestra que la mutación causal (sex6) está en un gen diferente al de la mutación que provoca el fenotipo de un contenido elevado de amilosa en AC38 (amo1), que se ha localizado en el mapa del cromosoma 1H (Schondelmeier et al. 1992). La localización en el mapa sugirió que un candidato para el gen alterado en la mutación sex6/292 era la almidón-sintasa II, que se sabe que está localizada en el trigo en la misma región del cromosoma (Yamamori y Endo 1996, Li et al., 1999b). El análisis de la secuencia de los mutantes 292 y 342 mostró que había una mutación de transición de G a A en el gen, la cual provocaría el truncamiento del gen, de manera que la región C-terminal que contiene el sitio activo de la enzima no se traduciría, lo que presuntamente conduciría a la síntesis de una proteína totalmente inactiva. Además, la determinación de la secuencia del gen SSII de MK6827 mostró una mutación de transición de G a A en la posición 242, que también provocaría un truncamiento del gen. Este resultado confirma la naturaleza alélica de las mutaciones 292 y MK6827.
La identificación de las mutaciones en el gen SSII permitió el desarrollo de un diagnóstico del marcador de PCR para la mutación en 292. Se evaluó este marcador de PCR para las 91 progenies de la población de 292 x Tantangara y mostró un 100% de cosegregación con el fenotipo de endospermo encogido y el fenotipo de distribución de longitudes de cadena reducida para el almidón. El descubrimiento de mutaciones alélicas en los genes SSII de cebadas de diferentes códigos genéticos (292 y MK6827), que proporcionaron fenotipos similares, y el vínculo perfecto de la mutación con el fenotipo de grano encogido proporcionan un elevado grado de certeza de que las mutaciones presentes en los genes SSII de 292, 342 y MK6827 son las mutaciones causales que proporcionan el carácter de endospermo encogido.
El fenotipo observado en la presente para la mutación SSII en la cebada es similar a los fenotipos de las mutaciones SSII en otras plantas en algunos aspectos, sin embargo, las mutaciones SSII no permiten obtener contenidos de amilosa tan elevados como los que se encuentran en 292/342. Se conocen mutantes SSII en guisantes (rug5, Craig et al., 1998) y Chlamydomonas (Fontaine et al., 1993) y proporcionan amilopectinas con distribuciones de longitudes de cadena reducidas, como se ha observado en la presente. También existen datos que sugieren que la mutación Shrunken-2 en el maíz procede de la mutación del gen SSII, aunque esto todavía no se ha demostrado de forma concluyente (Ham et al., 1998, Knight et al., 1998). En el maíz, la mutación Shrunken-2 proporciona almidones con temperaturas de gelatinización reducidas (Campbell et al., 1994). En el trigo, Yamamori ha desarrollado una línea con tres mutaciones anuladoras que carece de la proteína Sgp-1 (Yamamori 1998), que ha resultado ser el producto del gen SSII, según han demostrado Li et al. (Li et al., 1999b). En el trigo, el contenido de amilosa aumenta hasta aproximadamente un 35% y se observan gránulos de almidón anormales, una cristalinidad alterada y una temperatura de gelatinización alterada (Yamamori 1998). Las diferencias entre las propiedades de los mutantes SSII de la cebada y los mutantes SSII de otras especies son bastante inesperadas.
Se ha demostrado que la mutación SSII se puede transferir de un código genético a otro mediante cultivo y que permite obtener una composición y morfología del grano diagnóstico típicas de los 292, 342 y MK6827 originales. En la Tabla 9, los datos de las líneas haploides dobles de 292 x Tantangara para el cociente L/G, contenido de glucano, distribución de longitudes de cadena, parámetros de RVA y del volumen de hinchamiento de la harina demuestran que las líneas que contienen la mutación 292 presentan fenotipos típicos del 292 original. En una demostración adicional, la segregación de semillas de la progenie autosembrada de un segundo retrocruce de 292 con Sloop presentó una proporción de segregación coherente con una segregación de 3:1 para el fenotipo normal (74 semillas con un cociente L/G < 3.5) y el fenotipo encogido (21 semillas con un cociente L/G > 3.5).
La disponibilidad de la secuencia del gen SSII y de sistemas de transformación de la cebada proporciona las herramientas necesarias para suprimir el gen SSII empleando tecnologías de supresión genética, para producir un fenotipo comparable al de las mutaciones SSII. Una estrategia muy eficaz desarrollada recientemente consiste en producir un constructo de horquilla diseñado para producir un ARN bicatenario, que suprimiría la actividad SSII endógena. Aunque los mutantes de supresión completa análogos a las mutaciones descritas en la presente serían de interés, el uso de constructos de ADN con diferentes promotores y la recuperación de transgenes con diferentes
5 niveles de expresión del constructo de horquilla permitirían evaluar el impacto de la valoración de la expresión del gen desde niveles normales hasta niveles de supresión completa.
Se ha demostrado que se pueden transferir las mutaciones de 292 a códigos genéticos alternativos de cebada, a la vez que se mantienen las características esenciales de la mutación 292 original. En las Tablas 9 y 10 se muestran 10 los datos fenotípicos para la progenie haploide doble de 292 x Tantangara, y las semillas de un segundo retrocruce con Sloop, e indican que los fenotipos se transfieren a través del proceso de cultivo.
Tabla 1
- Composición del grano de cebada
- Contenido de almidón (%)a
- Contenido de amilosa por HPLC (%)b Contenido de amilosa por unión a yodo (%) Contenido proteico (%)a �-glucano (%)a Fibra dietética totala (%) Fibra dietética insoluble' (%) Fibra dietética solublea (%)
- Glaciar
- n.d. 31.0 n.d. 11.5 4.3 21.6 16.6 5
- AC38
- 47 47.4 60.6 10.4 5.8 24.9 28.8 6.1
- Himalaya
- 49 25 25.4 10.0 4.8 27.1 18.1 9
- 292
- 17.7 71 68.9 15.0 9.5 30.3 21.4 8.9
- 342
- 21.9 62.5 71.7 15.7 8.3 28.3 19.4 8.9
- MK6827
- 10.2 n.d. 44.4 21.3 n.d. n.d. n.d. n.d.
- Waxiro
- 42.8 n.d. 5.0 14.6 n.d. 19.8 12.7 7.1.
- Tantangara
- 51.6 n.d. 29.5 14.6 n.d. 17.2 12.7 4.5.
- a % del grano en peso, 14% de humedadb % del contenido total de almidón n.d. no determinado
Tabla 2
- Dimensiones del grano
- Peso del grano (mg)
- Longitud del grano (mm) Ancho del grano (mm) Grosor del grano (mm) Cociente L/G
- Himalaya
- 51.01 ± 6.63a 7.01 ± 0.51 3.58 ± 0.34 2.82 ± 0.36 2.48
- Tantangara
- 50.40 ± 6.51a 7.22 ± 0.98 3.60 ± 0.25 2.73 ± 0.21 2.64
- Waxiro
- 45.71 ± 5.21 7.54 ± 0.47 3.40 ± 0.20 2.67 ± 0.19 2.82
- AC38
- 50.79 ± 8.22 7.62 ± 0.65 3.35 ± 0.27 2.64 ± 0.25 2.89
- 292
- 32.13 ± 4.67 7.05 ± 0.49 3.63 ± 0.55 1.58 ± 0.20 4.46
- 342
- 35.45 ± 6.01 7.28 ± 0.55 3.76 ± 0.38 1.75 ± 0.18 4.16
- MK6827
- 44.89 ± 3.78 11.20 ± 0.58 3.63 ± 0.27 1.77 ± 0.33 6.33
- N=50, excepto cuando se indica con a, n=200
Tabla 3
- Distribución de longitudes de cadena de almidones desrramificados por isoamilasas
- DPa
- Himalaya %b Tantangara %b AC38 %b 342 %b 292 %b MK6827 %b
- DP 6-11
- 24.15 22.40 26.33 38.18 38.96 37.98
- DP 12-30
- 69.12 67.59 67.12 54.14 53.42 55.60
- DP 31-60
- 6.73 10.01 6.05 7.68 7.62 6.42
- a grado de polimerización b porcentaje de distribución de oligosacáridos expresado en base molar
Tabla 4
- Propiedades térmicas del almidón de cebada evaluadas por DSC
- Pico 1
- Pico 2
- Inicio
- Máximo Final LH Inicio Máximo Final LH
- Glaciar
- 55.4 59.3 65.3 4.2 93.9 101.4 107.7 0.87
- AC38
- 55.0 62.2 68.2 3.9 89.3 100.1 106.9 1.195
- Himalaya
- 56.8 60.9 68.0 4.5 93.1 101.8 108.3 0.78
- 292
- 46.0 51.2 58.1 0.29 88.7 97.7 104.9 1.34
- 342
- 45.2 50.4 56.8 0.47 86.5 97.0 105.0 1.59
Tabla 5
- Parámetros de RVA para almidones de cebada
- Viscosidad máxima
- Fragilidad Fuerza de sujeción Asentamiento Viscosidad final Viscosidad final normalizada* Temp. de pastificación (OC)
- Himalaya
- 871.5 653.1 218.4 235.8 454.2 926 64.9
- Namoi
- 621.7 367.5 254.2 375.3 629.5 1284 65.9
- AC38
- 226.7 87.3 139.4 188.4 327.8 697 68.9
- 292
- 92.1** *** 133.9 230 363.9 2055 89.5
- 342
- 110.9** *** 144.9 264.5 409.4 1869 87.9
- MK6827
- 18.2** *** 25.7 43.3 69 676 n.d.
- * Viscosidad final dividida por el contenido de almidón del grano integral ** Valor registrado en el momento en que se alcanzó la viscosidad máxima para Himalaya *** Valor inferior a cero n.d. no determinado
Tabla 6
- Datos de cristalinidad del almidón
- Muestra
- % H2O (W.B) Cristalinidad %* % de A* % de B* % de V*
- 292
- 29.6 9 - 13 87
- 342
- 35.8 12 - 18 81
- AC38
- 26.1 19 93 7 (trazas)
- Himalaya
- 27.7 27 93 7 (trazas)
- Waxiro
- 29.7 41 94 6 -
- (*_ ± 5%)
10 Tabla 7
- Análisis de progenie
- Cruce
- Encogido Relleno Valor calculado para X2 c
- 292 x Sloopa
- 45 155 X2(3:1) = 1.0
- 292 x Tantangarab
- 45 46 X2 (1:1) = 0.01
- a progenie de cruce estándarb progenie haploide doble c en cada caso, X2 (0.05), df=1 = 3.84, por lo tanto, la población de 292 x Sloop se corresponde con una segregación 3:1 y la población haploide doble de 292 x Tantangara se corresponde con una segregación 1:1
Tabla 8
- Clasificación de las líneas haploides dobles de 292 x Tantangara
- Número de líneaa
- Cáscarab Peso de la semilla (mg) Cociente L/Gc DP 6-11 (%)d Contenido de amilosae PCRf
- 1
- S 26 3.8 35.87 50.2 292
- Clasificación de las líneas haploides dobles de 292 x Tantangara
- Número de líneaa
- Cáscarab Peso de la semilla (mg) Cociente L/Gc DP 6-11 (%)d Contenido de amilosae PCRf
- 2
- S 24 4.21 36.87 56.2 292
- 3
- C 43 3.32 25.45 18.3 Wt
- 5
- S 40 4.58 39.47 55.5 292
- 7
- S 34 4.28 19.63 43.0 292
- 8
- C 48 3.02 21.6 46.7 Wt
- 9
- S 31 2.76 22.89 25.9 Wt
- S
- 26 3.02 27.56 21.1 Wt
- 11
- S 34 3.55 37.90 44.7 292
- 12
- C 50 2.94 26.37 32.8 Wt
- 13
- S 27 4.29 38.68 48.4 292
- 14
- C 56 3.07 22.98 20.8 Wt
- 15
- C 46 2.74 24.88 22.9 Wt
- 16
- C 43 2.78 25.40 18.3 Wt
- 17
- S 31 3.8 37.37 54.2 292
- 18
- S 31 4.51 37.46 57.5 292
- 19
- C 26 3.1 29.57 22.7 Wt
- C
- 53 3.04 25.42 23.8 Wt
- 21
- S 31 4.5 38.51 59.1 292
- 22
- S 27 4.63 37.25 27.2 292
- 23
- C 47 2.73 24.11 21.2 Wt
- 24
- S 27 4.58 36.89 42.0 292
- 26
- C 35 3.57 19.50 15.1 Wt
- 27
- C 22 4.3 36.81 48.6 292
- 28
- S 31 4.34 38.88 37.0 292
- S
- 30 4.04 38.05 48.4 292
- 31
- S 23 4.25 37.07 51.7 292
- 32
- C 48 2.62 20.67 13.0 Wt
- 33
- S 25 4.92 35.68 33.3 292
- 34
- S 31 4.01 38.34 46.1 292
- 35
- C 43 3.16 20.07 23.6 Wt
- 36
- S 26 4.33 36.93 29.7 292
- 38
- C 38 3.01 21.11 9.1 Wt
- 39
- C 33 2.92 20.49 23.5 Wt
- C
- 36 2.99 19.57 2.2 Wt
- 41
- S 30 4.05 37.82 40.9 292
- 42
- C 47 2.95 20.80 11.9 Wt
- 43
- S 40 3.24 21.97 18.1 Wt
- 45
- C 52 2.78 19.97 14.5 Wt
- 46
- S 29 4.44 35.87 32.1 292
- 47
- S 35 3.69 36.34 92.9 292
- 48
- C 31 2.54 20.27 13.4 Wt
- 49
- C 54 2.94 22.29 19.3 Wt
- C
- 50 2.94 21.92 20.6 Wt
- 51
- C 43 3.73 20.59 18.1 Wt
- 53
- S 31 4.12 36.52 55.3 292
- 54
- S 34 4.02 35.17 57.1 292
- 55
- C 32 4.19 41.35 60.4 292
- 56
- S 29 3.17 21.48 18.1 Wt
- Clasificación de las líneas haploides dobles de 292 x Tantangara
- Número de líneaa
- Cáscarab Peso de la semilla (mg) Cociente L/Gc DP 6-11 (%)d Contenido de amilosae PCRf
- 57
- C 30 4.85 36.66 46.3 292
- 58
- S 32 2.97 23.83 13.8 Wt
- 59
- S 46 2.91 24.15 9.2 Wt
- 60
- C 44 2.74 22.39 13.5 Wt
- 61
- S 31 4.47 35.67 61.3 292
- 63
- S 32 4.3 36.94 39.4 292
- 64
- C 39 2.93 21.95 20.5 Wt
- 65
- S 26 3.87 37.51 20.7 292
- 66
- S 30 4.03 36.89 48.7 292
- 67
- C 36 3.17 20.24 14.4 Wt
- 68
- S 43 2.65 22.53 8.4 Wt
- 69
- S 32 3.93 36.34 54.7 292
- 70
- C 43 2.77 22.28 17.6 Wt
- 71
- S 29 3.73 38.73 31.5 292
- 72
- C 47 2.65 22.00 20.8 Wt
- 73
- S 36 4.09 39.58 49.0 292
- 74
- S 24 4.18 36.15 47.8 292
- 75
- C 34 2.99 24.42 14.2 Wt
- 76
- S 31 4.35 35.95 49.9 292
- 77
- C 49 3.19 21.22 17.0 Wt
- 78
- C 33 2.78 21.27 15.6 Wt
- 79
- C 31 2.85 23.04 21.2 Wt
- 80
- C 38 3.18 19.88 18.9 Wt
- 81
- C 37 2.84 24.22 16.2 Wt
- 82
- C 33 4.64 39.99 45.3 292
- 84
- S 28 3.62 36.98 28.9 292
- 85
- S 26 6.44 44.43 41.3 292
- 86
- C 32 2.87 30.73 16.1 Wt
- 88
- S 26 4.62 46.12 39.3 292
- 89
- C 38 2.88 31.25 16.3 Wt
- 90
- C 32 3.19 31.11 13.8 Wt
- 91
- S 31 4.17 42.86 37.3 292
- 92
- S 27 3.99 45.30 44.6 292
- 93
- C 37 2.99 30.77 12.5 Wt
- 94
- C 43 3.67 29.46 21.9 Wt
- 96
- S 33 5.69 47.34 52.2 292
- 97
- S 23 3.41 31.36 17.1 Wt
- 98
- S 32 5.95 45.27 52.4 292
- 99
- S 19 3.68 38.36 1.7 292
- 100
- C 36 3.1 31.92 15.4 Wt
- 101
- S 58 3.29 24.71 2.9 Wt
- a Línea haploide doble de 292 x Tantangara b Fenotipo de la cáscara. S: sin cáscara; C: con cáscara c Cociente L/G: cociente entre longitud y grosor d Porcentaje de cadenas del almidón desrramificado con un DP entre 6 y 11, calculado en base molar como el porcentaje de cadenas que se eluyen entre DP6 y DP65 e Contenido de amilosa determinado mediante el valor del yodo azul f Clasificación de PCR. 292: la reacción de PCR proporciona una banda que contiene una banda de 169 pares de bases más 103 pares de bases en la digestión de NIaIV; Wt: la reacción de PCR proporciona una banda que contiene 111 pares de bases, 103 pares de bases y una banda de 57 pares de bases en la digestión de NIaIV
Tabla 9
- Análisis detallado de las líneas haploides dobles
- Línea
- Cociente L/G FACE Viscosidad máxima de RVA (unidades de RVA) Viscosidad final de RVA (unidades de RVA) Cociente de viscosidad máxima/final Contenido de l-glucano (%) Volumen de hinchamiento de la harina
- Control
- Sloop
- 2.78 23.5 535.8 483.5 1.11 2.3 7.54
- Tantangara
- 2.64 22.4 507 395.1 1.28 5.16 5.97
- Himalaya
- 2.48 24.2 873.9 449.3 1.94 8.53 8.18
- AC38
- 2.89 26.33 226.7 327.8 0.69 5.8 3.75
- 292
- 4.46 38.9 92.1 363.9 0.25 13.09 2.00
- MK6827
- 6.33 37.98 18.2 69 0.26 n.d. 2.11
- Línea haploide doble
- Natural
- 8
- 3.02 21.6 527.9 431.3 1.22 8.9 6.47
- 43
- 3.24 25.4 566.6 527.4 1.07 7.77 6.04
- 56
- 3.17 24.9 703.1 523.5 1.34 7.81 6.95
- 58
- 2.97 27.9 726.8 588.8 1.23 9.65 6.23
- 59
- 2.91 27.0 655 435.8 1.50 7.16 7.21
- 68
- 2.65 22.5 876.3 465.5 1.88 8.87 8.63
- 101
- 3.29 34.71 471.3 410.3 1.15 6.54 6.26
- SSII mutante
- 5
- 4.58 39.5 68.7 316.6 0.217 9.87 2.55
- 11
- 3.55 48.2 51.5 240.8 0.21 8.36 2.58
- 13
- 4.29 38.7 43.7 265.5 0.16 11.13 2.92
- 27
- 4.30 36.8 20.3 96.6 0.21 13.11 2.71
- 30
- 4.04 38.05 57.3 251.1 0.23 10.56 2.27
- 31
- 4.25 37.1 17.6 124.5 0.14 11.35 2.48
- 33
- 4.92 35.7 11.7 83.5 0.14 7.22 2.13
- 36
- 4.33 36.9 14.5 93.6 0.15 7.20 2.20
- 46
- 4.44 35.9 31.3 175.8 0.18 10.02 2.32
- 91
- 4.17 42.9 35.8 189.5 0.19 11.3 2.43
- n.d. no determinado
Tabla 10
- Datos de hinchamiento de la harina para las semillas BC2F2
- Línea
- Volumen de hinchamiento
- C5/1 Planta 1 L/G > 3.5
- 2.118
- C5/1 Planta 1 L/G < 3.5
- 6.913
- 65/2 Planta 1 L/G > 3.5
- 2.382
- 65/2 Planta 1 L/G < 3.5
- 7.565
- 65/2 Planta 2 L/G > 3.5
- 2.409
- 5/2 Planta 2 L/G < 3.5
- 6.707
EJEMPLO 2
Diseño y construcción de vectores
Las regiones del gen SSII de la cebada (según se han definido en la Figura 15) se clonaron en vectores para su transformación. Se prepararon tres constructos para cada gen diana, abordando las estrategias de supresión genética: (1) cosupresión en sentido, (2) supresión en antisentido y (3) supresión mediada por dúplex.
La Figura 16 ilustra la configuración de las secuencias en los constructos de ADN diseñada para suprimir la expresión del gen diana endógeno. El promotor se puede seleccionar entre un promotor específico de endospermo (tal como el promotor de glutenina de elevado peso molecular, el promotor SSI del trigo, el promotor BEII del trigo) o promotores no específicos para el endosperrmo (tales como ubiquitina o 35S). El constructo también puede contener otros elementos que faciliten la transcripción tales como el elemento nos 3 de OCS. Las regiones de ADN ilustradas se incorporarán en vectores que contienen secuencias de genes marcadores seleccionables adecuadas y otros elementos, o en vectores que se transforman conjuntamente con vectores que contienen estas secuencias.
Transformación del cereal
Se han descrito métodos para la transformación de la cebada (Tingay et al., 1997; Wan et al, 1994), la avena (Somers et al., 1992, 1994; Gless et al., 1998; Zhang et al., 1999, Cho et al., 1999) y el centeno (Castillo et al., 1994; Pena et al., 1984), y estos métodos se pueden emplear para transferir constructos de ADN y generar de este modo plantas transgénicas.
Análisis de las plantas transgénicas
La identificación de las plantas transgénicas se llevó a cabo mediante la identificación del ADN del constructo de ADN por PCR o hibridación de Southern. Los niveles de la expresión de los genes biosintéticos del almidón de cebada individuales se evaluaron tanto en el ARNm como a niveles de proteínas mediante técnicas estándar tales como la hibridación de Northern y el ensayo de Western blot, respectivamente. El contenido y la composición del grano y el almidón se evaluaron empleando técnicas estándar tales como las mostradas en el Ejemplo 1.
Abel et al., (1996). The Plant Journal 10, 981-991.
Ahokas, (1979). Barley Genetics Newsletter 9, 7-9
Akerberg et al., (1998). Journal of Cereal Science 28, 71-80.
Andersson et al., (2000). Cereal Chemistry 77, 463-467
Andersson et al., (1999). Journal of the science of food and agriculture. 79, 979-986.
Andreev et al., (1999). StarchStarke. 51, 422-429.
Banks et al., (1971). Starch. 23, 12-15.
Batey y Curtin. (1997). Starch 48, 338-344.
Batey et al., (1997). Cereal Chemistry 74, 497-501.
Bergh et al., (1999). Animal Feed Science and Technology 78, 215-226.
Bhatty (1999). Cereal Chemistry 76, 589-599.
Biyashev et al., (1986). Soviet Genetics 22, 296-303.
Boyer y Preiss, (1978). Carbohydrate Research 61, 321-334.
Boyer y Preiss, (1981). Plant Physiology 67, 1141-1145.
Boye et al., (1980). Starch 32, 217-222.
Buleon et al., (1998). International Journal of Biological Macromolecules 23, 85-112.
Calvert et al., (1976). Nutrition Reports. International 14, 55-61.
Campbell et al.,(1994). Cereal Chemistry 71, 464-468.
Cao et al., (2000). Archives. of Biochemistry and Biophysics. 373, 135-146.
Case et al., (1998). Journal of Cereal Science 27, 301-314.
Castillo, et al., (1994). Bioltechnology 12, 1366-1371.
Cho, et al. (1999). Plant Science (Limerick) 148, 9-17.
Craig et al., (1998). Plant Cell 10, 413-426.
Czuchajowska et al., (1998). Cereal Chemistry 75, 747-754.
Czuchajowska et al., (1992). Cereal Chemistry 69, 413-418.
Denyer et al., (1996). Plant Physiology 112, 779-785.
Elfverson et al., (1999). Cereal Chemistry 76, 434-438.
Eslick y Ries, (1976). Barley Genetics Newsletter 6, 21-22.
Fastnaught et al., (1996). Crop Science 36, 941-946.
Fedak et al., (1972). Canadian Journal of Genetics and Cytology 14, 949-957.
Filpse et al., (1996). Planta 198, 340.
Fontaine et al., (1993). Journal of Biological Chemistry 268, 16223-16230.
Fujita et al., (1999) Breeding. Science 49, 217-219.
Fuwa et al., (1999). Starch/Starke. 51, 147-151.
Gao et al.,(1998). Plant Cell 10, 399-412.
Giroux y Hannah. (1994). Molecular and General Genetics 243, 400-408.
Gless et al., (1998). Journal of Plant Physiology 152, 151-157.
Goering y DeHaas, (1974). Cereal Chemistry 51, 573-578.
Granfeldt et al., (1994). American Journal of Clinical Nutrition 59, 1075-1082.
Green et al., (1997). Plant Physiology 114, 203-212.
Gubler et al., (2000) Plant Physiology 122, 1457
Hedman y Boyer, (1982). Biochemical Genetics 20, 483-492.
Izydorczyk et al., (2000). Journal of Agricultural and Food Chemistry 48, 982-989.
James et al., (1995). Plant Cell 7, 417-429.
Jane et al., (1999). Cereal Chemistry 76, 629-637.
Jarvi y Eslick, R. F. (1975). Crop Science 15, 363-366.
Jobling et al., (1999). Plant Journal 18, 163-171.
Katz et al., (1993). Carbohydrate polymers 21, 133-136.
Knight et al., (1998). Plant Journal 14, 613-622.
Konik-Rose et al., (2001). Starch 53, 14-20
Krueger et al., (1987). Cereal Chemistry 64, 187-190.
Kubo et al., (1999). Plant physiology. 121, 399-409.
Li et al., (1999). Plant physiology. 120, 1147-1155.
Li et al., (2000). Plant Physiology 123, 613-624.
Li et al., (1999). Theoretical and Applied Genetics 98, 1208-1216.
Mizuno et al., (1993). Journal of Biological Chemistry 268, 19084-19091.
Mizuno et al., (1992). Journal of Biochemistry 112, 643-651.
Morell et al., (1997). Plant Physiology 113, 201-208.
Morell et al., (1998). Electrophoresis 19, 2603-2611.
Morrison et al., (1984). Journal of Cereal Science 2, 257-271.
Mouille et al., (1996). The Plant Cell. 8, 1353-1366.
Myers et al., (2000). Plant Physiology 122, 989-997.
Netsvetaev, (1990). Nauchno-Tekh. Bull' VSGI, Odessa. N.o175, 31-35.
Netsvetaev, (1992). Cytology and Genetics (Kiev) 26, 26-30.
Netsvetaev y Krestinkov. (1993). Barley Genetics Newsletter 22, 44-45.
Newman et al., (1978). Journal of Animal Science 47, 448-455.
Ng et al., (1997). Cereal Chemistry 74, 288-288.
Oscarsson et al., (1998). Journal of the science of food and agriculture 78, 359-366.
Oscarsson et al., (1996). Journal of Cereal Science 24, 161-170.
Oscarsson et al., (1997). Journal of Cereal Science 26, 259-264.
Pena et al., (1987). Nature, UK 325, 274-276.
Persson y Christerson, (1997). Sveriges. Utsadesforenings. Tidskrift. 107, 141-153.
Persson et al., (1996). Sveriges. Utsadesforenings. Tidskrift. 106, 79-86.
Pomeranz, (1992). European Journal of Clinical Nutrition 46, S63-S68.
Porneranz et al., (1972). Cereal Chemistry 49, 629-635.
Rahman et al., (1995). Australian Journal of Plant Physiology 22, 793-803.
Ramage y Eslick, (1975). Barley Genetics Newsletter 5, 114.
Ramage y Eslick, (1975). Barley Genetics Newsletter 6, 115.
Schondelmaier et al., (1992). Plant Breeding 109, 274-280.
Schulman y Kammiovirta, (1991). Starch 43, 387-389.
Schwall et al., (2000). Nature Biotechnology 18, 551-554.
Shure et al., (1983). Cell 35, 225-233.
Somers et al., (1992). Fertile, transgenic oat plants. Bio/technology 10, 1589-1594.
Somers, et al. (1994). Genetic engineering of oat. 37-46.
Song y Jane, (2000). Carbohydrate polymers 41, 365-377.
Sun et al., (1997). The New Phytologist 137 , 215-215.
Sundberg et al., (1998). Journal of the Science of Food and Agriculture 76, 457-463.
Swanston, (1992). Barley Genetics Newsletter 22, 66-67.
Swanston et al., (1995). Journal of Cereal Science 22, 265-273.
Takeda et al., (1993). Carbohydrate Research 246, 273-281.
Thorbjornsen et al., (1996). Plant Journal 10, 243-250.
Tingay et al., (1997). Plant Journal 11, 1369-1376.
Topping, (1999). Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition 8, S22-S26.
Topping et al., (1997). The Journal of Nutrition 127, 615-615.
Vasanthan y Bhatty, (1995). Cereal Chemistry 72, 379-384.
Vasanthan y Bhatty, (1998). Starch-Starke. 50, 286-291.
Walker y Merritt, (1968). Nature 221, 482-484.
Wan y Lemaux, (1994). Plant Physiology 104, 37-48.
Wang et al., (1998). Journal of Experimental Botany 49, 481-502.
Wang et al., (1993). Cereal Chemistry 70, 521-525.
Wilson y McNab, (1975). British Poultry Science 16, 497-504.
Xue et al., (1996). Cereal Chemistry 73, 588-592.
Yamamori, (1998). (Anon.), págs. 300-302. University Extension Press, University of Saskatchewan, Saskatoon.
Yamamori y Endo, (1996). Theoretical and Applied Genetics 93, 275-281.
Yoshimoto et al., (2000). Cereal Chemistry 77, 279-285.
Zhang et al., (1999). Plant Cell Reports 18, 959-966.
Zheng et al., (2000). Cereal Chemistry 77, 140-144.
Zwar y Chandler, (1995). Planta 197, 39-48.
LISTA DE SECUENCIAS
<110> Organización para la Investigación Científica e Industrial de la Mancomunidad Australiana (CSIRO)
<120> Cebada con una actividad reducida de SSII y almidón y productos que contienen almidón con un contenido reducido de amilopectina
<130> B07473
<140> EP01983291
<141> 2001-11-09
<160> 12
<210> 1
<211> 2920
<212> ADN
<213> Hordeum vulgare
<220>
<223> ADNc de SSII
<400> 1
<210> 2
5 <211> 2950
<212> ADN
<213> Hordeum vulgare
<220> 10 <221> mutación
<222> 235
<223> ADNc del gen SSII de la línea de cebada MK6827
15 <400> 2
<210> 3
5 <211> 2951
<212> ADN
<213> Hordeum vulgare 10 <220>
<223> ADNc del gen SSII del cultivar Morex de cebada
<400> 3
<210> 4
5 <211> 2946
<212> ADN
<213> Hordeum vulgare
<220> 10 <221> mutación
<222> 1855
<223> ADNc del gen SSII de la línea 292 de cebada
<400> 4 15
<210> 5
5 <211> 802
<212> PRT
<213> Hordeum vulgare
<220> 10 <223> Secuencia de aminoácidos deducida para SSII del cultivar Morex de la cebada
<400> 5
<210> 6
<211> 802
5 <212> PRT
<213> Hordeum vulgare
<220>
<223> Secuencia de aminoácidos deducida para SSII del cultivar Himalaya de cebada 10
<400> 6
5 <210> 7
<211> 571
<212> PRT
<213> Hordeum vulgare
10 <220>
<221> SITIO
<222> 583
<223> Secuencia de aminoácidos deducida para SSII de la línea 292 de la cebada con terminación prematura
<400> 7
<210> 8
5 <211> 43
<212> PRT
<213> Hordeum vulgare
<220> 10 <221> SITIO
<222> 42
<223> Secuencia de aminoácidos deducida para SSII de la línea MK6827 de la cebada con terminación prematura
<400> 8 15
<210> 9
<211> 23 20 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador de PCR ssIIa
<400> 9 tgttgaggtt ccatggcacg ttc 23
<210> 10
<211> 23
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador de PCR ssIIb
<400> 10 agtcgttctg ccgtatgatg tcg 23
<210> 11
<211> 23
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador de PCR ZLSS2P4
<400> 11 cctggaacac ttcagactgt acg 23
<210> 12
<211> 23
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador de PCR ZLBSSIIS
<400> 12 cttcagggag aagttggtgt agc 23
Claims (28)
- REIVINDICACIONES1. Un grano de una planta de cebada que comprende un gen SSII mutado, de manera que la actividad SSII codificada por dicho gen SSII mutado está suprimida y el contenido total de almidón de dicho grano tiene un contenido relativo de amilosa de al menos un 50% (p/p), determinado por HPLC, y quea) la proporción de cadenas de amilopectina contenidas en el almidón de dicho grano que tienen una longitud comprendida en el intervalo de 6 a 11 residuos es de al menos un 30%, yb) la proporción de cadenas de amilopectina contenidas en el almidón de dicho grano que tienen una longitud comprendida en el intervalo de 12 a 30 residuos es inferior a un 65%, yc) la proporción de cadenas de amilopectina contenidas en el almidón de dicho grano que tienen una longitud comprendida en el intervalo de 31 a 60 residuos es inferior a un 10%.
-
- 2.
- El grano de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho gen SSII contiene la secuencia representada en SEQ ID NO 1 y la mutación se selecciona entre un mutante de truncamiento, o comprende una deleción, inversión, duplicación o mutación puntual.
-
- 3.
- El grano de acuerdo con la reivindicación 2, donde dicho gen SSII mutado es un mutante de truncamiento, de manera que el dominio catalítico C-terminal del gen SSII mutado no se traduce.
-
- 4.
- El grano de acuerdo con la reivindicación 1, donde la secuencia del ADNc de dicho gen SSII mutado es la representada en la SEQ ID NO 4.
-
- 5.
- El grano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde
a) la proporción de cadenas de amilopectina contenidas en el almidón de dicho grano que tienen una longitud comprendida en el intervalo de 6 a 11 residuos es de al menos un 35%, yb) la proporción de cadenas de amilopectina contenidas en el almidón de dicho grano que tienen una longitud comprendida en el intervalo de 12 a 30 residuos es inferior a un 60%, yc) la proporción de cadenas de amilopectina contenidas en el almidón de dicho grano que tienen una longitud comprendida en el intervalo de 31 a 60 residuos es inferior a un 8%. -
- 6.
- El grano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde la harina o el producto integral obtenidos a partir del grano presentan un volumen de hinchamiento inferior a 3.2.
-
- 7.
- El grano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde la harina obtenida a partir del grano presenta un volumen de hinchamiento de al menos 2.
-
- 8.
- El grano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde dicho grano comprende al menos un 6% de �-glucano como porcentaje del peso total del grano sin cáscara.
-
- 9.
- El grano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde dicho grano presenta una característica seleccionada del grupo constituido por: tener un contenido de almidón superior a un 12% del grano sin cáscara, ser gimnospermo y tener un cociente de la longitud entre el grosor inferior a 5.8.
-
- 10.
- El grano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde dicho grano tiene un cociente de la longitud entre el grosor inferior a 5.5.
-
- 11.
- El grano de acuerdo con la reivindicación 10, donde dicho grano tiene un cociente de la longitud entre el grosor comprendido en el intervalo de 4 a 5.
-
- 12.
- El grano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde el almidón de dicho grano se caracteriza por que presenta al menos una de las siguientes propiedades:
a) el inicio del primer pico de gelatinización detectado por calorimetría diferencial de barrido es inferior a 53 °C,b) el primer pico de gelatinización detectado por calorimetría diferencial de barrido es inferior a 60 °C, yc) la entalpía (LH) del primer pico de gelatinización detectado por calorimetría diferencial de barrido es inferior a 3.5. -
- 13.
- El grano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde el almidón de dicho grano presenta una temperatura de pastificación superior a 75 °C.
-
- 14.
- El grano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, donde la proporción de almidón de dicho grano que exhibe cristalinidad es inferior a un 20%.
-
- 15.
- El grano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, donde la proporción del almidón cristalino contenido en el almidón de dicho grano que exhibe una forma cristalina característica de un complejo de almidónlípido es superior a un 50%.
-
- 16.
- El grano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, donde el contenido total de almidón de dicho grano comprende al menos un 60% (p/p) de amilosa, determinado por HPLC.
-
- 17.
- El grano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, donde la proporción de cadenas de amilopectina contenidas en el almidón de dicho grano que tienen una longitud comprendida en el intervalo de 31 a 60 residuos es superior a un 5%.
-
- 18.
- Una planta capaz de producir un grano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17.
-
- 19.
- El almidón de una planta de cebada, donde dicho almidón tiene un contenido relativo de amilosa de al menos un 50% (p/p), determinado por HPLC, y donde
a) la proporción de cadenas de amilopectina contenidas en el almidón que tienen una longitud comprendida en el intervalo de 6 a 11 residuos es de al menos un 30%, yb) la proporción de cadenas de amilopectina contenidas en el almidón que tienen una longitud comprendida en el intervalo de 12 a 30 residuos es inferior a un 65%, yc) la proporción de cadenas de amilopectina contenidas en el almidón de dicho grano que tienen una longitud comprendida en el intervalo de 31 a 60 residuos es inferior a un 10%. - 20. El almidón de acuerdo con la reivindicación 19, dondea) la proporción de cadenas de amilopectina contenidas en el almidón que tienen una longitud comprendida en el intervalo de 6 a 11 residuos es de al menos un 35%, yb) la proporción de cadenas de amilopectina contenidas en el almidón que tienen una longitud comprendida en el intervalo de 12 a 30 residuos es inferior a un 60%, yc) la proporción de cadenas de amilopectina contenidas en el almidón que tienen una longitud comprendida en el intervalo de 31 a 60 residuos es inferior a un 8%.
-
- 21.
- El almidón de acuerdo con la reivindicación 19 o 20, que comprende un lípido asociado al almidón, donde el almidón con el lípido asociado exhibe una forma cristalina de tipo complejo V, donde la forma cristalina de tipo complejo V representa al menos un 10% del almidón cristalino.
-
- 22.
- El grano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, donde dicho grano está molido, triturado, troceado, descascarillado o enrollado.
-
- 23.
- Un producto alimentario o aditivo alimentario que comprende el almidón de acuerdo con la reivindicación 19, 20
o 21 o un grano de acuerdo con la reivindicación 22. -
- 24.
- El producto alimentario o aditivo alimentario de acuerdo con la reivindicación 23, donde dicho producto o aditivo alimentario se selecciona del grupo constituido por harina, pan, pasteles, galletas, espesantes, bebidas malteadas, bebidas de cebada, fideos o sopas instantáneas.
-
- 25.
- El uso del almidón de acuerdo con la reivindicación 19, 20 o 21 o un grano de acuerdo con la reivindicación 22 para preparar un producto alimentario.
-
- 26.
- El uso de una planta de cebada que comprende un gen SSII mutado, de manera que la actividad SSII codificada por dicho gen SSII mutado está suprimida y el contenido total de almidón del grano obtenido de dicha planta tiene un contenido relativo de amilosa de al menos un 50% (p/p), determinado por HPLC, y que
a) la proporción de cadenas de amilopectina contenidas en el almidón de dicho grano que tienen una longitud comprendida en el intervalo de 6 a 11 residuos es de al menos un 30%, yb) la proporción de cadenas de amilopectina contenidas en el almidón de dicho grano que tienen una longitud comprendida en el intervalo de 12 a 30 residuos es inferior a un 65%, yc) la proporción de cadenas de amilopectina contenidas en el almidón de dicho grano que tienen una longitud comprendida en el intervalo de 31 a 60 residuos es inferior a un 10%,para producir un grano de cebada, teniendo el contenido total de almidón de dicho grano un contenido relativo de amilosa de al menos un 50% (p/p), determinado por HPLC. - 27. El uso de un constructo de ADN para reducir la expresión del gen SSII en una planta de cebada, de manera que el almidón del grano obtenido de dicha planta tiene un contenido relativo de amilosa de al menos un 50% (p/p), determinado por HPLC, y quea) la proporción de cadenas de amilopectina contenidas en el almidón de dicho grano que tienen una longitud comprendida en el intervalo de 6 a 11 residuos es de al menos un 30%, yb) la proporción de cadenas de amilopectina contenidas en el almidón de dicho grano que tienen una longitud comprendida en el intervalo de 12 a 30 residuos es inferior a un 65%, yc) la proporción de cadenas de amilopectina contenidas en el almidón de dicho grano que tienen una longitud comprendida en el intervalo de 31 a 60 residuos es inferior a un 10%,donde dicho constructo de ADN comprende una secuencia que codificaa) una molécula de ARN antisentido capaz de interferir en la transcripción o el procesamiento de la enzima SSII, ob) una ribozima, oc) una copia adicional en la misma orientación que el gen que codifica la enzima SSII, od) una molécula de ARN bicatenaria, oe) un constructo de horquilla diseñado para producir una molécula de ARN bicatenaria capaz de suprimir la actividad SSII endógena.
- 28. El uso dea) una molécula de ARN antisentido capaz de interferir en la transcripción o el procesamiento de la enzima SSII, ob) una ribozima, oc) una copia adicional en la misma orientación que el gen que codifica la enzima SSII, od) una molécula de ARN bicatenaria, oe) un constructo de horquilla diseñado para producir una molécula de ARN bicatenaria capaz de suprimir la actividad SSII endógena,para reducir la expresión del gen SSII en una planta de cebada, de manera que el almidón del grano obtenido de dicha planta tiene un contenido relativo de amilosa de al menos un 50% (p/p), determinado por HPLC, y quea) la proporción de cadenas de amilopectina contenidas en el almidón de dicho grano que tienen una longitud comprendida en el intervalo de 6 a 11 residuos es de al menos un 30%, yb) la proporción de cadenas de amilopectina contenidas en el almidón de dicho grano que tienen una longitud comprendida en el intervalo de 12 a 30 residuos es inferior a un 65%, yc) la proporción de cadenas de amilopectina contenidas en el almidón de dicho grano que tienen una longitud comprendida en el intervalo de 31 a 60 residuos es inferior a un 10%.
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Family Cites Families (40)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3690896A (en) | 1970-05-15 | 1972-09-12 | Gen Mills Inc | Process for forming a multi-colored food product |
| DE3486053T3 (de) | 1983-10-20 | 2004-01-08 | The Research Foundation Of State University Of New York | Regulierung von Gen-Expression durch Translationshemmung unter Verwendung von m-RNS hinderndem Komplementär-RNS. |
| US6617496B1 (en) | 1985-10-16 | 2003-09-09 | Monsanto Company | Effecting virus resistance in plants through the use of negative strand RNAs |
| IL81737A (en) | 1986-03-28 | 1992-11-15 | Calgene Inc | Regulation of gene expression in plant cells |
| US4770710A (en) * | 1987-07-02 | 1988-09-13 | American Maize-Products Company | Novel starch and products produced therefrom |
| ATE115999T1 (de) | 1987-12-15 | 1995-01-15 | Gene Shears Pty Ltd | Ribozyme. |
| US5792920A (en) | 1988-11-10 | 1998-08-11 | Imperial Chemical Industries Plc | Plants with altered ability to synthesize starch and process for obtaining them |
| US5034323A (en) | 1989-03-30 | 1991-07-23 | Dna Plant Technology Corporation | Genetic engineering of novel plant phenotypes |
| US6013861A (en) | 1989-05-26 | 2000-01-11 | Zeneca Limited | Plants and processes for obtaining them |
| US5051271A (en) | 1989-11-22 | 1991-09-24 | Opta Food Ingredients, Inc. | Starch-derived, food-grade, insoluble bulking agent |
| JP2819340B2 (ja) * | 1990-04-13 | 1998-10-30 | 王子製紙株式会社 | アミロースとアミロペクチンとの分離方法 |
| JP2576962Y2 (ja) | 1990-11-09 | 1998-07-23 | アイシン精機株式会社 | 粘性流体継手装置 |
| JP3249125B2 (ja) * | 1992-12-24 | 2002-01-21 | グッドマン、フィールダー、リミテッド | 耐性澱粉を含む食品組成物 |
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| WO1997022703A2 (en) | 1995-12-20 | 1997-06-26 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Novel starches via modification of expression of starch biosynthetic enzyme genes |
| CA2256461C (en) | 1996-05-29 | 2012-07-24 | Hoechst Schering Agrevo Gmbh | Nucleic acid molecules encoding enzymes from wheat which are involved in starch synthesis |
| BR9808647A (pt) | 1997-02-21 | 2000-05-23 | Danisco | Inibição de ìntron anti-sentido de enzima de expressão de ramificação de amido |
| EP1012250B1 (en) * | 1997-09-12 | 2008-12-17 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Regulation of gene expression in plants |
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| US6083547A (en) * | 1999-01-14 | 2000-07-04 | Conagra, Inc. | Method for obtaining a high beta-glucan barley fraction |
| AUPQ005299A0 (en) | 1999-04-29 | 1999-05-27 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Novel genes encoding wheat starch synthases and uses therefor |
| CA2273673A1 (en) | 1999-06-04 | 2000-12-04 | Makoto Yamamori | High amylose wheat starch and wheat containing the same |
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| US7009092B1 (en) | 2001-06-04 | 2006-03-07 | Iowa State University Research Foundation | Transgenic corn plants having seeds with modified cornstarch characteristics and method of making the transgenic corn plants |
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| KR101274849B1 (ko) | 2003-10-27 | 2013-06-13 | 코몬웰스 싸이언티픽 엔드 인더스트리얼 리서치 오가니제이션 | 아밀로스 비율이 증가된 전분을 갖는 쌀 및 이의 생성물 |
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