PL205884B1

PL205884B1 - Sekwencje nukleotydowe, konstrukt kwasu nukleinowego, wektor ekspresyjny, sekwencja aminokwasowa, sposób transformowania rośliny, transgeniczna roślina, transgeniczna komórka roślinna i część rośliny transgenicznej

Info

Publication number: PL205884B1
Application number: PL346568A
Authority: PL
Inventors: Andrew Goldsbrough; Steve Colliver
Original assignee: Monsanto Uk Ltd
Priority date: 1998-09-10
Filing date: 1999-09-09
Publication date: 2010-06-30
Also published as: EP1117814B1; EP1117814A1; CZ2001759A3; HUP0103618A3; ATE458061T1; US6730825B1; PL346568A1; DE69942032D1; US7217857B2; US20040216188A1; AU767103B2; US20080064864A1; AU5872599A; US7465851B2; HUP0103618A2; WO2000015810A1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są sekwencje nukleotydowe kodujące enzymy sieciujące skrobię (SBE) z pszenicy, konstrukt kwasu nukleinowego zawierający taką sekwencję nukleotydową, wektor ekspresyjny zawierający taki konstrukt i sekwencja aminokwasowa kodowana przez taką sekwencję nukleotydową, sposób transformowania rośliny poprzez wprowadzanie do rośliny takich sekwencji nukleotydowych a także transgeniczna roślina i jej część oraz transgeniczna komórka roślinna.

W czasie ostatnich lat główny rozwój osiągnięty w nauce o zbożu koncentrował się na właściwościach podjednostek białkowych glutenu oraz ich roli w systemach piekarniczych. Było to w dużej mierze ułatwione dzięki dużej, naturalnej różnorodności białkowych podjednostek glutenu pochodzących z odmian uprawnych.

Pomimo, że komercyjnie dostępna mąka pszenna zawiera około 75-85% skrobi to jej rola nie została dostrzeżona, głównie z powodu trudności wynikających z różnic pomiarowych dotyczących budowy skrobi. Jednakże z powodu ograniczonych prac nad odmianami pszenicy wydaje się, że odczuwalny jest brak naturalnej różnorodności wśród uprawianych odmian pszenicy. Wraz z nadejściem technologii rekombinacji DNA oraz transferu genowego obecnie możliwe jest tworzenie nowych odmian roślin dlatego, modyfikacja składu skrobi w ziarnie pszenicy stała się realnie osiąganym celem.

Skrobia jest główną formą cukru zapasowego u roślin, stanowiącego 50% lub więcej suchej masy organów zapasowych, tj. bulw, ziaren zbóż. Skrobia ma szerokie zastosowanie zarówno spożywcze jak i przemysłowe. W wielu przypadkach w celu wytworzenia odmiennych właściwości odpowiadających wymaganiom odpowiednich zastosowań konieczna jest jednak modyfikacja pierwotnej skrobi metodami fizycznymi lub chemicznymi. Byłoby wysoce pożądanym, aby modyfikacji dokonywać już na poziomie rośliny tak, aby nie wykonywać innych zbędnych zabiegów. Aby uzyskać powyższy efekt drogą inżynierii genetycznej wymagana jest wiedza na temat szlaku metabolicznej biosyntezy skrobi. Obejmuje to właściwości genów oraz kodowanych produktów genowych, które katalizują syntezę skrobi. Wiedza na temat regulacji biosyntezy zwiększa możliwości „przeprogramowania” dróg biosyntezy w celu wytworzenia skrobi o nowych właściwościach skrobi, która będzie mogła mieć nowe zastosowania komercyjne.

Najbardziej znacząca właściwość skrobi wywodzi się ze zdolności utraty naturalnej, granulkowatej postaci i jednoczesnego pęcznienia oraz absorbowania wody w odpowiednich warunkach, nadając tym samym zmienioną lepkość oraz strukturę w procesie znanym jako żelifikacja. Żelifikacja skrobi została zdefiniowana jako (W A Atwell i wsp., 1988) „...zniszczenie (zakłócenie) cząsteczkowego porządku granulek skrobi, który objawia się w nieodwracalnych zmianach właściwości takich jak pęcznienie granulek, rozpuszczanie naturalnych kryształów, utracie dwójłomności, oraz solubilizacji skrobi. Punkt rozpoczęcia żelifikacji oraz zakres, w którym występuje, jest zależny od stężenia skrobi, sposobu obserwacji, rodzaju granulki, oraz heterogenności obserwowanej populacji granulek skrobi”.

Do pełnej żelifikacji skrobi potrzeba 14 cząsteczek wody na cząsteczkę bezwodnej glukozy, tj. minimum 75% wody (Donovan). Żelifikacja skrobi jest zwykle powodowana przez ciepło, ale może być także spowodowana przez fizyczne uszkodzenia a także przez pewne chaotropowe czynniki, głównie przez dimetylosulfotlenek (DMSO), mocznik, chlorek wapnia, silną zasadę i kwasy.

Różnorodność zjawisk zachodzących podczas żelifikacji można obserwować za pomocą wielu sposobów, łącznie z: dwójłomnością, dyfrakcją promieni rentgenowskich, różnicową kalorymetrią skaningową (DSC), ¹³C NMR. Pęcznienie może być obserwowane przy pomocy różnych sposobów, a zwł aszcza metod reologicznych.

Różnicowa kalorymetria skaningowa (DSC) jest sposobem destruktywnym, podczas której śledzi się zjawiska endotermiczne podgrzewanych granulek, głównie mierzy się temperaturę, a także energię endotermiczną (delta H) potrzebną do stopienia natywnych krystalitów. Temperatura żelifikacji skrobi nie zależy od zawartości wody, jeśli jest jej powyżej 75% (opisywane jako nadmiar wody), natomiast wzrasta, gdy ilość wody jest ograniczona (Donovan, 1979).

Stopień oraz rozmiar pęcznienia granulek skrobiowych w czasie podgrzewania decyduje o rodzaju lepkości wodnych roztworów skrobi w czasie podgrzewania. Pęcznienie jest więc bardzo istotne z punktu widzenia technologicznego. Konwencjonalnie wzrost lepkoś ci po ogrzaniu moż e być zmierzony za pomocą amylografu Brabendera (Brabender jest znakiem towarowym) (Kennedy i Cabalda, 1991) lub przy użyciu analizatora Rapid Visco (Rapid Visco jest znakiem towarowym Newport Scientific, Australia). Figura 1 jest typowym profilem wisko-amylografu skrobi pszenicznej w czasie trwania i po gotowaniu. Gdy granulki skrobi szybko pęcznieją pod wpływem wody w procesie zwanym kleikowaniem,

PL 205 884 B1 ich objętość wzrasta powodując wzrost lepkości. Początek kleikowania oznaczono za pomocą A na Figurze 1. Maksymalna lepkość, oznaczona za pomocą B, na Figurze 1 jest osiągnięta, gdy osiągnięto maksymalną objętość fazową. Ścinanie będzie przerywać/ powodować fragmentację pęczniejących granulek powodując, tym samym zmniejszenie lepkości. Całkowite rozproszenie jest oznaczone za pomocą C na Figurze 1. Potwierdzono to przez reologiczne badania oscylacyjne kleiku skrobiowego na różnych etapach profilu lepkości (Svenmark i Hermanson, 1990). Lepkość w danej temperaturze początkowej oraz maksimum lepkości wskazują, odpowiednio, początek oraz rozmiar kleikowania. Po ochłodzeniu rozpłynniona amyloza tworzy sieć w procesie reasocjacji cząsteczek, lub retrogradacji powodującej wzrost lepkości tak jak przedstawiono to na przykładzie D na Figurze 1. Retrogradacja (lub opóźnianie) lepkości wskazuje ilość rozpłynnionej amylozy z granulek.

Właściwości skrobi pszenicy są przydatne w wielu zastosowaniach, nie tylko związanych z przemysłem spożywczym, takich jak np. przemysł papierniczy, tekstylny, kleje. Jednakże, dla wielu zastosowań właściwości skrobi nie są optymalne i dlatego, w celu ich poprawy, przeprowadza się wiele modyfikacji chemicznych i fizycznych, dobrze znanych w dziedzinie. Przeprowadza się dwa rodzaje modyfikacji: kontrolowane zmiany temperatury żelifikacji i kleikowania oraz wytworzenie skrobi, która wykazuje mniejszą fragmentację granulek podczas kleikowania niż skrobia konwencjonalna.

Obecnie jedynymi sposobami zmiany temperatur żelifikacji oraz kleikowania skrobi są włączenia dodatków takich jak cukier, związki soli polihydroksylowych lub zastosowanie procesów chemicznych lub fizycznych. Redukcja fragmentacji granulek podczas kleikowania może być osiągnięta albo poprzez obszerną obróbkę wstępną metodami fizycznymi lub przez chemiczne usieciowanie. Procesy takie są kłopotliwe i mało skuteczne. Staje się zatem pożądanym otrzymanie roślin, które wytwarzają skrobię, która już wewnątrz rośliny posiada korzystne cechy wrodzone.

Skrobia składa się z dwóch głównych polisacharydów glukozowych: amylozy i amylopektyny. Amyloza jest liniowym polimerem składającym się z podjednostek glukozy połączonych wiązaniem α-1,4, podczas gdy amylopektyna jest wysoce rozgałęzionym polimerem zawierającym glukan, który w łańcuchu głównym połączony jest wiązaniem α-1,4, a w bocznym wiązaniem α-1,6. W bielmie pszenicy amylopektyna stanowi około 70% całkowitego składu skrobi, wyrażonej w zawartości amylozy. Amylopektyna jest syntetyzowana poprzez skoordynowane działanie kilku enzymów takich jak rozpuszczalna syntaza(syntetazy) skrobi (SSS), enzymy rozgałęziające skrobię (SBE), enzymy odgałęziające skrobię (DBE). Fizyczne właściwości skrobi są silnie zdeterminowane przez stosunkowo znaczną ilość amylozy i amylopektyny, a więc SSS, SBE i DBE odgrywają kluczową rolę, zarówno w ustalaniu składu jak i jakości skrobi. Tak więc, jednym z podejść do modyfikacji budowy skrobi mogłaby być, stosując metody transgeniczne, modyfikacja ekspresji enzymów zaangażowanych w biosyntezę skrobi w bielmie.

SBE katalizuje tworzenie wiązań α-1,6, tworząc miejsca rozgałęzień w tworzonej cząsteczce skrobi, poprzez hydrolizę wiązań α-1,4 a następnie ponowne przyłączenie uwolnionych łańcuchów glukonowych o wiązaniach α-1,4 do tego samego lub innego łańcucha glukozylowego. Reakcja ta dostarcza także nowego nieredukującego końca do dalszego wydłużenia pierwotnego łańcucha glukonowego α-1,4.

Dla wielu gatunków takich jak kukurydza (Boyer i Preiss, 1978), ryż (Nakamura i wsp., 1992), groch (Smitch, 1988), ziemniaki (Khoshnoodi i wsp., 1993) oraz pszenica (Morell i wsp., 1997) scharakteryzowano biochemicznie różne izoformy enzymów rozgałęziających skrobię. Ostatnio scharakteryzowano sekwencje genomowe oraz cDNA SBE dla kilku gatunków takich jak kukurydza (Baba i wsp., 1991; Fisher i wsp., 1993; Gao i wsp. 1997), groch (Burton i wsp., 1995), ziemniak (Kossmann i wsp., 1991), ryż (Nakamura i Yamanouchi, 1992; Mizuno i wsp., 1993), Arabidopsis (Fisher i wsp., 1996), maniok (Salehuzzaman i wsp., 1992) oraz pszenica (Rapellin i wsp., 1997, Nair i wsp., 1997, Rahman i wsp., 1997). Zestawienie sekwencji tych SBE ujawnia wysoki stopień konserwatywności sekwencji na poziomie aminokwasów oraz to, że SBE mogą być zgrupowane w dwie odrębne rodziny, znane jako SBEI oraz SBEII. Co więcej, analizy ujawniły, że w gatunkach występuje 50% homologia pomiędzy dwoma rodzinami SBEI oraz SBEII, a często nawet większa.

Kukurydza wyróżnia się tym, iż posiada kukurydzianą rodzinę SBEII składającą się z dwóch różnych członków, znanych jako SBEIIa oraz SBEIIb. Jeszcze do niedawna kontrowersyjne były domniemania czy SBEIIa oraz Ilb są w rzeczywistości a) kodowane przez geny w dwóch różnych loci i b) czy geny reprezentują różne allele jednego locus. Fisher i wsp. (1996) oraz Gao i wsp. (1997) dostarczyli dowodów na to, że SBEIIa oraz SBEIIb są kodowane przez niezależne geny. Jednakże nie ma niezbitych dowodów na to, że dwie izoformy istnieją jednocześnie w jednym genotypie kukurydzy.

PL 205 884 B1

Klony DNA dla dwóch opublikowanych sekwencji genowych, oczyszczono z różnych genotypów kukurydzy i dlatego też jest możliwe, iż reprezentują różne allele pojedynczego locus. Podsumowując, w kukurydzy zostały scharakteryzowane trzy różne geny SBE (Baba i wsp., 1991; Fisher i wsp., 1993, Gao i wsp., 1997). SBEI różni się od SBEIIa oraz SBEIIb składem aminokwasów, specyficznością do substratu, właściwościami kinetycznymi, reaktywnością immunologiczną, podczas gdy SBEIIa oraz SBEIIb są pod tym względem podobne (Guan i Preiss, 1993; Preiss 1991, Takeda i wsp., 1993). Na poziomie aminokwasów sekwencja wykazuje około 50% homologię z sekwencjami BEIIa oraz SBEIIb, podczas gdy SBEIIa oraz SBEIIb wykazują około 80% wzajemną homologię.

Przed niniejszym wynalazkiem, unikalną była kukurydza posiadająca enzymy typu SBEIIa oraz SBEIIb. Chociaż Arabidopsis posiada dwóch członków rodziny SBEII to podgrupa Arabidopsis nie wydaje się odpowiadać tym stwierdzonym u kukurydzy. Członkowie podrodziny Arabidopsis, niekoniecznie tak jak sekwencje kukurydzy należą do kategorii Ila oraz Ilb. Oba geny SBEII Arabidopsis mają podobny poziom homologii do obu genów SBEII kukurydzy - SBEIIa oraz SBEIIb ale podobieństwa nie są wystarczające, aby można było, jak dla kukurydzy, umiejscowić geny Arabidopsis w tych samych kategoriach co geny SBEIIa i SBEIIb. Naprawdę, dane sugerują, iż geny SBEII Arabidopsis, nie należą do tej samej kategorii genów kukurydzy Ila oraz Ilb.

Częściowo scharakteryzowano dwie formy jęczmiennego SBEII. Pomimo, że zostały nazwane SBEIIa oraz SBEIIb, to tylko niewielka ilość informacji o sekwencji została opublikowana (Sun i wsp., 1995) i nie można było wywnioskować, że formy te odpowiadają kategoriom Ila oraz Ilb kukurydzy. Faktycznie, na podstawie dostępnych informacji o sekwencji jęczmienia dwie sekwencje SBEII jęczmienia (SBEIIa oraz SBEIIb) wydają się wykazywać większą homologię do SBEIIa niż do SBEIIb kukurydzy.

Dla wszystkich innych gatunków roślin, dla których zidentyfikowano oraz opublikowano sekwencje SBEII, a więc dla ziemniaka, grochu, ryżu, manioku, pszenicy lub jęczmienia nie wyróżniono podgrup rodzin SBEII podobnych do podziału na SBEIIa oraz SBEIIb kukurydzy.

Badania nad oczyszczonym SBEI oraz SBEII wykazują, że izoformy te różnią się specyficznością wobec substratu pod względem zarówno długości jak i stopnia rozgałęzienia. W kukurydzy SBEI oraz SBEII wykazują wyraźną aktywność rozgałęziania in vitro, gdzie SBEI wykazuje wyższy stopień rozgałęziania substratu amylozowego w porównaniu do SBEII, podczas gdy, zarówno SBEIIa jak i lIb mają wyższy stopień rozgałęziania niż SBEI, gdy działają na substrat amylopektynowy (Guan i Preiss, 1993). Co więcej SBEI kukurydzy preferencyjnie przenosi dłuższe łańcuchy glukonowe (średnia długość łańcucha =24) niż SBEII (średnia długość łańcucha =21 (Ila) lub 22 (IIb)) (Takeda i wsp., 1993). Podobne obserwacje zostały przeprowadzone dla izoform SBEII oraz SBEII pszenicy oraz grochu (Morell i wsp., 1997; Smith, 1988). Badania mutacyjne kukurydzy, ryżu oraz grochu dowodzą, że mutanty z wysoką zawartością amylozy mają w każdym wypadku deficyt w aktywności analogów enzymów rozgałęziających w porównaniu do aktywności SBEII kukurydzy (Martin i Smith, 1995; Morell i wsp., 1995). Jednakż e, zwią zki pomię dzy obserwacjami biochemicznymi oraz dowodami genetycznymi sugerujące różnice w rolach enzymów pozostają niejasne.

Prezentowany wynalazek opiera się na nieoczekiwanym odkryciu nowej klasy genów SBEII pszenicy, nazywanej tutaj SBEII-1. Nowy gen SBEI-1 ma wysoką homologię do genu SBEIIb kukurydzy. Gen SBEII-1 pszenicy jest uważany za funkcjonalnie równoznaczny z genem SBEIIb kukurydzy i na podstawie tego uważ a się, że zmiana genu pszenicy SBEII-1 prawdopodobnie wpływa na właściwości skrobi, takie jak temperatura żelifikacji skrobi, w sposób analogiczny do zmiany genu SBEIIb opisanego w WO97/22703.

Podsumowując, mimo faktu znajomości dwóch różnych sekwencji genu SBEII kukurydzy, Arabidopsis oraz jęczmienia, tak jak to omówiono powyżej, przed niniejszym wynalazkiem, nie było powodu, żeby oczekiwać, że pszenica będzie posiadać podobne podgrupy genów SBEII jakie obserwuje się w kukurydzy. Dwa geny Arabidopsis wykazują różne podgrupy, a przed niniejszym wynalazkiem, nie było wystarczających dowodów na ustalenie czy dwie sekwencje SBEII jęczmienia należą do podgrupy typu kukurydzy. To znaczy przed niniejszym wynalazkiem nie było powodów, aby oczekiwać, iż pszenica posiada dwóch podobnych członków SBEII porównywalnych do tych występujących w kukurydzy. W następstwie niniejszego wynalazku Sun i wsp. (1998) przedstawili dane, które wskazują, że sekwencje jęczmienia, rzeczywiście, dzielą się na podgrupy w podobny sposób do sekwencji SBEIIa i Ilb kukurydzy oraz SBEII-2 i SBEII-1 pszenicy omawianej w tym dokumencie.

Twórcy wynalazku wykorzystali wysoki stopień konserwatywności sekwencji pomiędzy kilkoma sekwencjami genu SBE do zaprojektowania starterów oligonukleotydowych do motywów, które są

PL 205 884 B1 specyficzne albo dla rodziny SBEI albo dla SBEII oraz użyli tych starterów do powielenia sekwencji cDNA z rozwijającego się bielma pszenicy.

Gdy rozpoczęto pracę, doniesiono o pojedynczym klonie cDNA genu SBEII pszenicy o częściowej długości (Mousley, 1994). Wielokrotne zestawienie sekwencji z tą sekwencją SBE pszenicy wraz z innymi opublikowanymi sekwencjami SBE z wielu gatunków roślin ujawniło wiele motywów, które były wysoce konserwatywne. Startery oligonukleotydowe zaprojektowane tak, aby były komplementarne do tych motywów zostały użyte do sklonowania klonów o częściowej długości cDNA SBEII pszenicy. Zestawienie sekwencji cDNA klonu wykazało, iż klon może być podzielony na dwie klasy, które twórcy wynalazku oznaczyli jako SBEII-1 oraz SBEII-2, które pokazały większe niż 90% podobieństwo do członków klasy, ale tylko 60% podobieństwo pomiędzy klasami. Istotnie, porównanie pomiędzy reprezentatywnymi sekwencjami z każdej klasy z wcześniej zidentyfikowanymi klonami pszenicy SBEII, pWBE6 (Mousley, 1994) i SBEII (Nair i wsp., 1997) wykazało, że każdy wydaje się być homologiem do klasy SBEII-2. Nowe jest klonowanie cDNA SBEI-1 pszenicy.

Przedmiotem wynalazku jest sekwencja nukleotydowa, charakteryzująca się tym, że koduje sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID No:2.

Przedmiotem wynalazku jest też sekwencja nukleotydowa, charakteryzująca się tym, że stanowi sekwencję B2 przedstawioną jako SEQ ID No:3.

Przedmiotem wynalazku jest także sekwencja nukleotydowa, charakteryzująca się tym, że stanowi sekwencję B4 przedstawioną jako SEQ ID No:4.

Przedmiotem wynalazku jest również sekwencja nukleotydowa, charakteryzująca się tym, że stanowi sekwencję B10 przedstawioną jako SEQ ID No:5.

Przedmiotem wynalazku jest także sekwencja nukleotydowa, charakteryzująca się tym, że stanowi sekwencję B1 przedstawioną jako SEQ ID No:6.

Przedmiotem wynalazku jest również sekwencja nukleotydowa, charakteryzująca się tym, że koduje sekwencję aminokwasową B6 przedstawioną jako SEQ ID No:7.

Przedmiotem wynalazku jest także konstrukt kwasu nukleinowego, charakteryzujący się tym, że zawiera jedną z sekwencji nukleotydowych opisanych powyżej.

Korzystnie w konstrukcje tym sekwencja jest operacyjnie połączona, w orientacji sensownej lub antysensownej, z sekwencją promotora.

Przedmiotem wynalazku jest też wektor ekspresyjny, charakteryzujący się tym, że zawiera konstrukt określony powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest też sekwencja aminokwasowa, charakteryzująca się tym, że kodowana jest przez jedną z sekwencji nukleotydowych określonych powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób transformowania rośliny, polegający na tym, że wprowadza się do rośliny jedną z sekwencji nukleotydowych określonych powyżej, albo konstrukt, albo wektor określony powyżej, połączone operacyjnie z odpowiednim promotorem aktywnym w roślinie tak, aby spowodować ekspresję genu obecnego w roślinie.

Korzystnie wprowadza się sekwencję połączoną z promotorem w orientacji antysensownej.

Korzystnie jako roślinę stosuje się pszenicę.

Korzystnie zmienia się właściwości dotyczące zawartości skrobi i/lub składu skrobi rośliny.

Przedmiotem wynalazku jest także transgeniczna roślina, charakteryzująca się tym, że zawiera konstrukt określony powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest też transgeniczna komórka roślinna, charakteryzująca się tym, że zawiera konstrukt określony powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest również część rośliny transgenicznej, charakteryzująca się tym, że zawiera konstrukt określony powyżej.

Korzystnie transgeniczną rośliną lub jej częścią albo transgeniczną komórką roślinną jest pszenica.

W jednym aspekcie wynalazek dostarcza sekwencję nukleotydów kodują c ą sekwencję aminokwasową przedstawioną na Figurze 10 (SEQ ID No:2).

Funkcjonalny odpowiednik obejmuje sekwencje nukleotydowe, które różnią się swoim składem nukleotydowym w stosunku do tego pokazanego na Figurze 10 (SEQ ID No:1), ale które z racji degeneracji kodu genetycznego, kodują polipeptydy posiadające identyczne lub zasadniczo identyczne sekwencje aminokwasowe. Termin ten powinien zasadniczo odpowiadać sekwencjom, które są wystarczająco homologiczne do sekwencji opisanych w wynalazku, tak że mogą hybrydyzować do ich sekwencji komplementarnych w rygorystycznych warunkach hybrydyzacji (np. tak jak opisał Sambrook i wsp. 1989, tj. przemywanie 0,1X SSC, 0,5%SDS w temperaturze 68°C); lepiej jeśli takie odpowiedniki,

PL 205 884 B1 będą wykazywały co najmniej w 86%, jeszcze lepiej co najmniej w 90%, a najlepiej co najmniej w 95% homologię sekwencji (tj. podobieństwo sekwencji) do sekwencji opisanej w wynalazku. Homologia sekwencji jest odpowiednio określona przy użyciu programu „MEGALIGN” z pakietu programów DNAStar (MEGALIGN oraz DNAStar są znakami towarowymi). Oczywistym dla specjalistów z dziedziny będzie fakt, iż sekwencja nukleotydowa według wynalazku może znaleźć także użyteczne zastosowanie, gdy stanowi sekwencję „antysensowną”. W związku z tym funkcjonalne równoważniki sekwencji będą także obejmować te sekwencje, które mogą hybrydyzować w rygorystycznych warunkach hybrydyzacji, do sekwencji opisanej w wynalazku (zamiast do ich formy komplementarnej). Lepiej jeśli takie „antysensowne” równoważniki będą wykazywać co najmniej w 86%, jeszcze lepiej co najmniej w 90%, a najlepiej w 95% homologię sekwencji z komplementarną do skł adu sekwencją opisaną w wynalazku.

W innym aspekcie wynalazek dostarcza sekwencję nukleotydową, którą stanowi sekwencja B2 pokazana na Figurze 3 (SEQ ID No:3).

W dalszym aspekcie wynalazek dostarcza sekwencję nukleotydową, którą stanowi sekwencja B4 pokazana na Figurze 3 (SEQ ID No:4).

W dalszym aspekcie wynalazek dostarcza sekwencję nukleotydową, którą stanowi sekwencja B10 pokazana na Figurze 3 (SEQ ID No:5).

W jeszcze innym aspekcie wynalazek dostarcza sekwencję nukleotydową , którą stanowi sekwencja B1 pokazana na Figurze 3 (SEQ ID No:6).

W innym aspekcie wynalazek dostarcza sekwencję nukleotydową kodują c ą sekwencję B6 pokazaną na Figurze 4 (SEQ ID No:7).

Funkcjonalny odpowiednik, w tym kontekście, ma zasadniczo takie samo znaczenie jak przedstawiono powyżej, chociaż, lepiej jeśli odpowiedniki dla B2, B4, B10 i B6 będą wykazywać co najmniej w 90%, jeszcze lepiej co najmniej w 95% homologię sekwencji, w stosunku do sekwencji wedł ug wynalazku, podczas gdy lepiej jeśli odpowiednik B1 będzie zawierał co najmniej w 97% homologię sekwencji w stosunku do sekwencji według wynalazku.

Sekwencje według wynalazku są częścią nowych genów SBEII pszenicy, wraz z B1 będącą nową podklasą znanej klasy genów SBEII, tutaj opisywanej jako SBEII-2, wraz z nową podklasą nazwaną SBEII-2B. Pozostałe sekwencje nukleotydowe są w całości nową klasą genów SBEII pszenicy opisywanych tutaj jako SBEII-1. Sekwencje nukleotydowe zostały podzielone na trzy podklasy i opisane poniżej.

Nowe geny SBEII-1 pszenicy, które są przedmiotem tego wynalazku posiadają wysoką homologię sekwencji do genu SBEIIb kukurydzy. Uważa się, że geny SBEII-1 pszenicy posiadają podobne właściwości funkcjonalne do genu SBEIIb kukurydzy. Na tej podstawie oczekuje się, że przy pomocy manipulacji genetycznej genu SBEII-1 pszenicy będzie można, w sposób analogiczny do zmian genu SBEIIb kukurydzy opisanych w WO 97/22703 wpłynąć na właściwości skrobi wytwarzanej przez te rośliny, obejmujące temperaturę żelifikacji oraz właściwości reologiczne skrobi.

Chociaż, sekwencje kodujące nowych genów SBEII-1 pszenicy wykazują wysoką homologię sekwencji do genu SBEIIb kukurydzy, to cechuje je znaczna różnica występująca pomiędzy nie ulegającą translacji na końcu 3' sekwencją o maksymalnej homologii 31,8% a nie ulegającą translacji na końcu 3' sekwencją SBEII-1 pszenicy oraz SBEIIb kukurydzy, tak jak przedstawiono na Figurze 8.

Zgodnie z wynalazkiem opisano także sekwencję nukleotydową składającą się z sekwencji pokazanej na Figurze 5 (SEQ ID No:8), Figurze 6 (SEQ ID No:9) lub Figurze 7 (SEQ ID No:10).

Funkcjonalny odpowiednik, w tym kontekście, ma to samo ogólne znaczenie jak przedstawiono powyżej, ale lepiej z co najmniej 32%, jeszcze lepiej z co najmniej 40%, 50%, 60%, 70%, 80% lub 90% homologią sekwencji w stosunku do sekwencji na odpowiedniej Figurze.

Sekwencje mogą zawierać dalsze nukleotydy na końcu 5' lub 3'. Np. dla ułatwienia ekspresji pożądane sekwencje, zawierają w ramce odczytu, także kodon startowy ATG, a także mogą kodować sekwencję liderową.

Przedmiotem wynalazku jest też konstrukt kwasu nukleinowego zawierający sekwencję nukleotydową według wynalazku, dogodnie połączoną operacyjnie, w orientacji sensownej lub antysensownej, z sekwencją promotorową.

Wynalazek obejmuje także swoim zakresem sekwencje aminokwasowe kodowane przez dowolne sekwencje nukleotydowe według wynalazku.

Wynalazek dostarcza także wektory, szczególnie wektory ekspresyjne zawierające sekwencje nukleotydowe według wynalazku. Zazwyczaj, wektor będzie zawierał promotor oraz jedną lub większą ilość sygnałów regulatorowych, rodzaju dobrze znanego specjalistom danej dziedziny. Wynalazek

PL 205 884 B1 dostarcza także komórki transformowane (który to termin obejmuje transdukcję oraz transfekcję) zawierające wektor zawierający sekwencję nukleotydową według wynalazku.

Sekwencje nukleotydowe według wynalazku mogą być wprowadzone do roślin, szczególnie, lecz nie wyłącznie, do pszenicy, po to, aby wpływały na ekspresję SBE w roślinach i w związku z tym wywierały wpływ na właściwości skrobi wytwarzanej przez rośliny. W szczególności oczekuje się, że użycie sekwencji w orientacji antysensownej ma za zadanie zredukowanie lub supresję ekspresji enzymu. Dodatkowo, ostatnio w innych eksperymentach wykazano, że może istnieć także „supresja sensowna” (tj. ekspresja wprowadzonych sekwencji operacyjnie połączonych w orientacji sensownej może ingerować, przez jakieś nieznane mechanizmy, w ekspresję natywnych genów) tak jak opisał to Matzke & Matzke 1995. Jakikolwiek ze sposobów wspomnianych przez Matzke i Matzke może być, teoretycznie, zastosowany do wpływania na ekspresję homologicznych genów SBE gospodarza.

Uważa się, iż sposoby wprowadzania DNA w orientacji antysensownej są głównie operacyjne, poprzez wytwarzanie antysensownego mRNA, który hybrydyzuje do sensownego mRNA, zapobiegając translacji funkcjonalnego polipeptydu, prawdopodobnie powodując degradację zhybrydyzowanego RNA (np. Sheehy i wsp., 1988; Van der Krol i wsp.). Supresja sensowna wymaga także homologii pomiędzy wprowadzoną sekwencją i genem docelowym, ale jej dokładny mechanizm nie jest jasny. Jednak jest oczywiste, iż w stosunku do supresji antysensownej oraz sensownej, nie jest istotna ani pełna długość sekwencji nukleotydowej, ani sekwencja natywna. Lepiej aby „efektywna ilość” zastosowana w sposobie zawierała co najmniej jedną trzecią pełnej długości sekwencji ale można stwierdzić niewielkie niezgodności oraz błędy innych fragmentów (większych lub mniejszych), które mogą powodować zmiany we właściwościach rośliny.

Zatem, następny aspekt wynalazku dostarcza sposobu transformowania rośliny obejmującego wprowadzanie do rośliny efektywnej ilości sekwencji według wynalazku operacyjnie połączonej do właściwego promotora aktywnego w roślinie tak, aby wpłynąć na ekspresję genu obecnego w roślinie. Korzystnie jeśli sekwencja jest połączona z operatorem w orientacji antysensownej. Korzystnie rośliną jest pszenica. W korzystnym przypadku zmienione właściwości odnoszą się do zawartości skrobi i/lub składu skrobi rośliny (tj. ilość i/lub rodzaj skrobi obecnej w roślinie). Dogodnie sposób transformacji rośliny będzie może obejmować wprowadzanie oprócz efektywnej ilości sekwencji według wynalazku jednej lub większej ilości sekwencji nukleotydowych. Wprowadzona sekwencja według wynalazku oraz jedna lub większa ilość sekwencji nukleotydowych, które mogą być w orientacji sensownej lub antysensownej mogą być operacyjnie połączone z pojedynczym promotorem (który zapewniłby, że dwie sekwencje byłyby zasadniczo transkrybowane w tym samym czasie) lub mogą być operacyjnie połączone z oddzielnymi promotorami (które mogą być konieczne do optymalnej ekspresji). Oddzielne promotory mogą być identyczne lub różne. Odpowiednie promotory są dobrze znane specjalistom danej dziedziny i mogą należeć do typu konstytutywnego jak i sensownego. Przykłady zawierają promotor CaMV 35S (np. pojedyncze lub powtórzenia tandemowe) oraz promotor ubikwityny. Korzystniej jeśli promotor będzie specyficzny tkankowo. Pożądany jest promotor, który będzie powodował ekspresję sekwencji operacyjnie połączonej w pokaźnej ilości, tylko w tkankach roślin gdzie występuje synteza skrobi i/lub przechowywanie skrobi.

Sekwencje według wynalazku, oraz jedna lub większa ilość sekwencji nukleotydowych jeśli są pożądane, mogą być wprowadzone do rośliny za pomocą jednej z wielu dobrze znanych technik (np. transformacja wywołana przez Agrobacterium, lub przy zastosowaniu sposobów „biblistycznych”). Sekwencje mogą być najbardziej skuteczne w działaniu na aktywność SBE pszenicy, ale teoretycznie mogą być wprowadzane do dowolnej rośliny. Pożądane przykłady obejmują: groch, ziemniaki, kukurydzę, ryż, jęczmień, słodkie ziemniaki oraz maniok. Dogodnie rośliny będą zawierać naturalne geny kodujące cząsteczki SBE, które wykazują znaczącą homologię z wprowadzoną sekwencją kwasu nukleinowego opisanego w wynalazku.

W innym aspekcie, wynalazek dostarcza Transgeniczne komórki roślinne lub Transgeniczne rośliny, które zostały poddane transformacji sposobem opisanym powyżej. Potomstwo stransformowanych roślin może być uzyskane np. za pomocą wegetatywnej propagacji lub za pomocą krzyżowania stransformowanych roślin i zachowywaniu tak otrzymanych ziaren. Wynalazek dostarcza także części transgenicznych roślin. Dogodnie wynalazek dostarcza np. ziarno zawierające zmienioną skrobię, przy czym wspomniane ziarno uzyskane jest z transformowanych roślin lub ich potomstwa. Ziarno uzyskane z transformowanych roślin (lub ich potomstwa) będzie szczególnie przydatnym materiałem w pewnych zastosowaniach przemysłowych, a także w przygotowaniu i/lub procesach wytwarzania żywności np. w piekarnictwie.

PL 205 884 B1

W szczególności, odnosząc się do pszenicy wynalazek dostarcza pszenicy lub jej części, która w swoim typie dzikim posiada efektywny gen SBEII-1, ale która została stransformowana tak, że w komórkach co najmniej jednej części tej roś liny albo zredukowano, albo zwię kszono, albo wyłączono ekspresję polipeptydu SBEII-1. Roślina może być transformowana przy zastosowaniu sposobu przedstawionego powyżej lub może być wyselekcjonowana za pomocą konwencjonalnej hodowli, tak aby została pozbawiona genu SBEII-1, którego obecność lub brak mogą być z łatwością określone za pomocą skriningu próbek rośliny z sondą kwasu nukleinowego lub przy zastosowaniu specyficznych przeciwciał odpowiednio, dla genów pszenicy lub produktów genowych.

Skrobia może być wyekstrahowana ze stransformowanej rośliny lub potomstwa takiej rośliny, przy czym skrobia taka wykazuje zmienione właściwości w porównaniu do skrobi wyekstrahowanej z odpowiadają cych ale nie zmienionych ro ś lin.

Uważa się, iż zastosowanie sekwencji nukleotydowych według wynalazku umożliwi produkcję skrobi, szczególnie skrobi pszenicy wykazującej szeroki wachlarz nowych właściwości. Np. można przewidzieć, że na skutek transformacji rośliny w celu zmniejszenia aktywności SBEII powstanie skrobia ze stosunkowo większym stosunkiem amylozy i mniejszą ilością amylopektyny w porównaniu do niezmienionych roślin.

W szczególności wynalazek dostarcza: roślinę (zwłaszcza pszenicę) transformowaną za pomocą sposobu zdefiniowanego powyżej i zawierającą opisany powyżej wektor, zawierającą skrobię, która wyekstrahowana z rośliny wykazuje podwyższoną temperaturę początkową i/lub maksymalną żelifikacji, mierzoną za pomocą DSC, w porównaniu do skrobi ekstrahowanej z podobnych, lecz niezmienionych roślin; roślinę (szczególnie pszenicę) transformowaną za pomocą sposobu zdefiniowanego powyżej, zawierającą skrobię, która po wyekstrahowaniu z rośliny wykazuje podwyższoną początkową temperaturę żelifikacji (dogodnie podwyższoną o co najmniej 3°C, możliwe o co najmniej 7°C, co najmniej o 12°C lub nawet możliwe od 15°C do 25°C) zmierzoną za pomocą DSC w porównaniu do skrobi wyekstrahowanej z podobnej ale niezmienionej rośliny; roślinę (zwłaszcza pszenicę) transformowaną za pomocą zdefiniowanego powyżej sposobu, szczególnie w celu zmniejszenia ekspresji genu SBEII-1 polipeptydu, zawierającą skrobię, która wyekstrahowana z rośliny, ma w porównaniu do skrobi wyekstrahowanej z podobnej ale niezmienionej rośliny, wyższy stosunek amyloza : amylopektyna.

Wynalazek zostanie dalej opisany na zasadzie ilustracji w następujących przykładach i w odniesieniu do załączonych figur, w których:

Figura 1 jest wykresem zależności lepkości od czasu, pokazującym profil wiskoammylografu dla skrobi pszenicznej podczas oraz po gotowaniu.

Figura 2 przedstawia dopasowanie sekwencji aminokwasowej C końcowych części różnych znanych enzymów rozgałęziających skrobię (SEQ ID No:12 do 25), uzyskane z bazy danych European Molecular Biology Laboratory (EMBL) oraz nowej sekwencji SBEII-1 pszenicy według wynalazku (Osbell-1ALL) (SEQ ID No:11) z klonu 5A1 wraz z zaznaczonymi jednakowymi grupami bocznymi;

Figura 2a to tabela wag reszt aminokwasowych pokazująca odsetek podobieństwa oraz odmienności sekwencji pokazanych na Figurze 2;

Figura 3 przedstawia zestawienie sekwencji DNA dla różnych klonów rekombinacyjnych (B2, B4, B10, A2, B1, B11) (SEQ ID No: odpowiednio 3,4,5,26,6,27) zawierających geny enzymów rozgałęziających skrobię pszenicy, reprezentujących dwie klasy SBE: SBEII-1 oraz SBEII-2, każda zawierająca trzy podklasy A, B oraz C, wraz z zaznaczonymi grupami bocznymi różniącymi się od sekwencji konsensusowej (większości) (SEQ ID No:53);

Figura 3a to tabela wag reszt aminokwasowych pokazująca odsetek podobieństwa oraz odmienności sekwencji przedstawionych na Figurze 3;

Figura 4 przedstawia ułożenie sekwencji aminokwasowych klonów B6 (pszenny SBEII-1) (SEQ ID No:7) oraz B11 (pszenny SBEII-2) (SEQ ID No:28) w porównaniu do odpowiadających regionów SBEIIa kukurydzy (SEQ ID No:29) oraz sekwencji aminokwasowych SBEIIb (SEQ ID No:30) z grupami bocznymi różniącymi się od zaznaczonych w sekwencji SBEIIb kukurydzy.

Figura 4a to tabela wag reszt aminokwasowych przedstawiająca odsetek podobieństwa oraz rozbieżności względem sekwencji pokazanych na Figurze 4;

Figura 5 przedstawia nie ulegającą translacji sekwencję DNA klonu B2 na końcu 3' (SEQ ID No:8) (SBEII -1 pszenicy, podklasa A);

Figura 6 przedstawia nie ulegającą translacji sekwencję DNA klonu B10 na końcu 3' (SEQ ID No:9) (SBEII-1 pszenicy, podklasa B);

Figura 7 przedstawia nie ulegającą translacji sekwencję DNA klonu B4 na końcu 3' (SEQ ID No:10) (SBEII-1 pszenicy, podklasa C);

PL 205 884 B1

Figura 8 przedstawia dopasowaną sekwencję DNA dla nie ulegającego translacji regionu klonu B10 na końcu 3' (SEQ ID No:8), B2 (SEQ ID No:8) i B4 (SEQ ID No:10) oraz SBEIIb kukurydzy (ZMSBE2b) (SEQ ID No:31) wraz z resztami aminokwasowymi bocznymi różniącymi się od zaznaczonych z sekwencji B10.

Figura 8a to tabela wag reszt aminokwasowych przedstawiająca odsetek podobieństwa oraz odsetek rozbieżności sekwencji pokazanych na Figurze 8;

Figury 9a oraz 9b przedstawiają hybrydyzację odpowiednio klonu B1 (SBEII-2) oraz klonu B2 (SBEII-1) do trawionego enzymem HindIII genomowego DNA linii nullisomicznej-tetrasomicznej pszenicy Chinese Spring.

Figura 10 przedstawia DNA (SEQ ID No:1) oraz przewidziane sekwencje aminokwasowe (SEQ ID No:2) części klonu 5A1 SBEII-1;

Figura 11 przedstawia dane dopasowania sekwencji aminokwasów sekwencji genu SBEII-1 pszenicy według wynalazku, z klonu 5A1 (OsbelI-1ALL) (SEQ ID No:11), SBEI-D2 pszenicy (SEQ ID No:32) Rahman i inni 1997 (TASBEID2), SBEI1 pszenicy wg. Rapelin i wsp. 1997 (SEQ ID No:33) (TASBEI) oraz SBEII-2 pszenicy wg. Nair i wsp. 1997 (SEQ ID No:34) (SBEII-2 pszenicy) wraz z grupami bocznymi dokładnie pasującymi do zaznaczonej sekwencji konsensusowej (zgodnej) (SEQ ID No:54);

Figura 11a jest tabelą wag reszt aminokwasowych przedstawiającą odsetek podobieństwa i odsetek rozbieżności sekwencji przedstawionych na Figurze 11;

Figura 12 przedstawia analizę techniką 'northern blotting' ziaren pszenicy zebranych w różnych czasach po anthezie i hybrydyzowanych z fragmentami SBEII-1 oraz SBEII-2;

Figura 13 jest mapą restrykcyjną plazmidu pWxGS+;

Figura 13a przedstawia sekwencję (SEQ ID No:55) promotora (fragmentu HindIII-BamHl) w pWxGS+;

Figura 14 jest mapą restrykcyjną plazmidu pSRWXGUS1;

Figura 15 jest mapą restrykcyjną plazmidu pVTWXGUS2;

Figura 16 jest mapą restrykcyjną plazmidu pPBI-97-2;

Figura 17 jest mapą restrykcyjną plazmidu pSR97-26A-;

Figura 18 jest mapą restrykcyjną plazmidu pSR97-29A-;

Figura 19 jest mapą restrykcyjną plazmidu pSR97-50A-;

Figura 20 jest mapą restrykcyjną plazmidu pSR97-53A-;

Figura 21 jest mapą restrykcyjną plazmidu p97-2C;

Figura 22 jest mapą restrykcyjną plazmidu p97-2CWT1;

Figura 23 jest mapą restrykcyjną plazmidu pSC98-1;

Figura 24 jest mapą restrykcyjną plazmidu pSC98-2;

Figura 25 jest mapą restrykcyjną plazmidu pUNI;

Figura 26 pokazuje sekwencję DNA NaptII Sac1 fragmentu pUNI (SEQ ID No:35); a

Figura 27 jest mapą restrykcyjną plazmidu pUSN99-1;

Figura 28 jest mapą restrykcyjną plazmidu pUSN99-2;

Figura 29 jest częściową mapą restrykcyjną przewidywanej sekwencji (SEQ ID No:52) sklonowanego fragmentu p97-U3;

Figura 30 jest mapą restrykcyjną plazmidu pPBl96-36;

Figura 31 jest mapą restrykcyjną plazmidu p97-dUG1;

Figura 32 jest mapą restrykcyjną plazmidu p97-2BdUN1;

Figura 33 jest schematyczną ilustracją cząsteczkowej komory napromieniającej (nie w skali).

Figura 34 przedstawia histochemiczną lokalizację ekspresji Ubi-Gus w nasionach (ramka A), łodydze (ramka B), kwiecie (ramka C) oraz tkance liścia (ramka D) pszenicy transformowanej plazmidem pAHC25.

Figura 35 jest analizą „Southern blot 26 roślin potomnych transformantów BW119 transformowanych przez pAHC25.

Figura 36 przedstawia histochemiczną lokalizację ekspresji woxy-GUS w tkance bielma dwóch niezależnych transgenicznych lini pszenicy (w ramkach A oraz B) transformowanych plazmidem pWxGS+; i

Figura 37 jest analizą „Southern błot genomu DNA domniemanych pierwotnych transformantów ciętych przez Sac1 oraz hybrydyzowanych z sondą Sac SBEII-1 wielkości 1 kpz.

P r z y k ł a d y

Amplifikacja oraz charakterystyka cDNA dwóch klas klonów SBEII

Strategię klonowania opartą o PCR wymyślono dla izolacji rozgałęziających skrobię enzymów pszenicy stosując konserwowane domeny ze znanych sekwencji sklonowanych genów. Enzymy

PL 205 884 B1 rozgałęziające skrobi zostały sklonowane z wielu gatunków roślin, i Figura 2 przedstawia dane sekwencji aminokwasów uzyskane z European Molecular Biology Laboratory (EMBL), bazy danych nukletydów dla różnych znanych enzymów rozgałęziających skrobię:

SBEII-2 pszenicy dla Triticum aestivum (SEQ ID No:12)

ZM SBE2a (kukurydza) dla Zea mays (SEQ ID No:13)

ZM SBE2b (kukurydza) dla Zea mays (SEQ ID No:14) jęczmienny SBEIIa (SEQ ID No:15) jęczmienny SBEIIb (SEQ ID No:16)

RICBCE3 (ryżowy enzym typu SBEII) dla Oryza sativa (SEQ ID No:17)

RICESBE-1/97 (jak powyżej, zawiera sekwencje peptydu tranzytowego) (SEQ ID No:18) PSSBEIGEN (SBEI z grochu, który w rzeczywistości jest sekwencją typu SBEII) dla Pisum sativum (SEQ ID No:19)

STSBE (typ SBEI z ziemniaka) dla Solanum tuberosum (SEQ ID No:20)

TASBEI (SBEI-2 z pszenicy) dla Triticum aestivum (SEQ ID No:21)

TASBEI D2 (SEQ ID No:22)

ZMSBEI (SBEI z kukurydzy) dla Zea mays (SEQ ID No:23)

RICBEI (SBEI ryżowe) dla Oryza sativa (SEQ ID No:24)

PSSBEIIGN (SBEII z grochu, który w rzeczywistości jest sekwencją typu SBEI) dla Pisum sativum (SEQ ID No:25)

Figura 2 przedstawia również sekwencje nowego SBEII-1 z pszenicy, według wynalazku, zidentyfikowanego jako Osbell-1ALL (SEQ ID No:11).

Raport dopasowania z Figury 2 a także Figury 3, 4, 8 i 11 przygotowano stosując sposób Clustal, wraz z tablicą PAM 250 grup ważności dla sekwencji aminokwasów oraz tablicą ważności grup bocznych dla sekwencji DNA. Odległość par sekwencji wyrażona jako % podobieństwa przedstawiona na figurze 2A, 4A, 8A oraz 11A określono przy użyciu programu 'Megalign' z oprogramowania DNAStar i odpowiada procentowej homologii sekwencji.

Dopasowanie sekwencji przedstawiono na Figurze 2 ujawnia kilka domen, które są wysoce konserwowane. Jedna taka domena MDKDMYD (SEQ ID No:36), została niemal całkowicie konserwowana, co zostało uznane jako świadczące o tym, że ta domena będzie także obecna w genach kodujących enzymy rozgałęziające skrobię. Wzór ten został wybrany jako cel dla oligonukletydowego startera sensownego (SBEA). Przeprowadzono 3'RACE PCR na pierwszej nici cDNA bielma przy użyciu starterów Ro oraz SBEA.

Dwie populacje produktów PCR o przybliżonej wielkości 1 kpz oraz 1,2 kpz zostały wklonowane do wektora plazmidowego pT7Blue (Novagen). Oczyszczono plazmidowe DNA z domniemanych 36 zrekombinowanych klonów oraz oszacowano jego wielkość przy użyciu analizy restrykcyjnej. Do sekwencjonowania wyselekcjonowano piętnaście klonów zawierających inserty o długości pomiędzy około 1 kpz a 1,2 kpz.

Dopasowanie sekwencji uzyskane przy użyciu programu MEGALIGN z DNAStar wykazało, na podstawie stopnia homologii, że 15 wyselekcjonowanych klonów można podzielić na dwie różne klasy, które zostały nazwane SBEII-1 oraz SBEII-2. Co więcej, w oparciu o różnice sekwencji zarówno klasa SBEII-1 jak i SBEII-2 może być następnie podzielona na trzy podklasy (Tabela 1). Uważa się, że podział na trzy podklasy może ulec zmianie, ponieważ pszenica zawiera trzy homologiczne genomy.

T a b e l a 1

Klasa	Podklasa	Numer klonu
SBEII-1	A	B2, B5, B6, B7, B12
SBEII-1	B	B10
SBEII-1	C	A1, A13, B4
SBEII-2	A	B11
SBEII-2	B	B1, B9
SBEII-2	C	A2, C5

PL 205 884 B1

Porównanie pomiędzy sekwencjami należącymi zarówno do klasy SBEII-1 jak i SBEII-2 wykazało podobieństwo wynoszące od 90 do 96,8%. W przeciwieństwie do tego, podobieństwo sekwencji pomiędzy reprezentantami klasy SBEII-1 i SBEII-2 w porównywanym regionie wykazuje homologię wynoszącą tylko pomiędzy 58,8 a 60% (Figury 3 i 3a).

Co więcej, porównano reprezentatywne sekwencje klasy SBEII-1 oraz SBEII-2 z wcześniej opisywanymi klonami SBEII pszenicy, pWBE6 (Mousley, 1994) oraz ostatnio opublikowanym SBEII (Nair i wsp., 1997). Wyniki wykazały, że każdy z wcześniej wyizolowanych klonów SBEII wykazuje wysoką homologię (>90%) do klasy SBEII-2 (dane nie przedstawione). Co ważne, żadna z wcześniej opisywanych sekwencji pszenicy nie wykazywała wysokiej homologii sekwencji do SBEII-2 według wynalazku. Izolacja oraz właściwości trzech typów SBEII-1 (SBEII-1, podklasy A, B oraz C) uznano za nowe. Podklasa B SBEII-2 jest także nowa, jak również podklasy A i C odpowiadające sekwencjom wcześniej ujawnionym przez odpowiednio Mousley (1994) oraz Nair i wsp. (1997).

Dopasowanie przewidywanych sekwencji aminokwasowych reprezentujących klony B6 oraz B11 pszenicznych sekwencji (odpowiednio) SBEII-1 oraz SBEII-2 z odpowiadającymi im regionami sekwencji aminokwasów SBEIIa kukurydzy oraz SBEIIb (Figura 4 oraz 4a) wskazuje, iż sekwencja SBEII-1 (klon B6) jest bardziej podobna do sekwencji SBEIIb kukurydzy (88,7% podobieństwa) niż sekwencja SBEII-2 pszenicy oraz sekwencja SBEIIa kukurydzy (odpowiednio 82,2% oraz 82,6% podobieństwa) i podobnie, sekwencja SBEII-2 pszenicy jest bardziej podobna do sekwencji SBEIIa kukurydzy (86,9% podobieństwa) niż do sekwencji SBEII-1 pszenicy i sekwencji SBEIIb kukurydzy (odpowiednio 82,2% oraz 81,7% podobieństwa). Przypuszcza się, że gen SBEII-1 pszenicy jest spokrewniony filogenetycznie z genem SBEIIb kukurydzy, i że sekwencja SBEII-2 pszenicy jest filogenetycznie spokrewniona z sekwencją SBEIIa kukurydzy, a odpowiadające sekwencje pszenicy oraz kukurydzy prawdopodobnie wykazuję podobne funkcje.

Podczas gdy kodujące sekwencje klonów B2, B10 oraz B4 wykazują wysoką homologię sekwencji do genu SBEIIb kukurydzy, to równocześnie istnieje dużo większa rozbieżność w obrębie sekwencji nie ulegającej translacji na końcu 3'. Figura 5, 6 oraz 7 przedstawia odpowiednio, nie ulegające translacji sekwencje 3' klonów B2, B10, B4, a Figura 8 porównuje te sekwencje z odpowiadającymi im sekwencjami SBEIIb kukurydzy.

Rozważając kwestię bardziej dokładnie, przedstawiono następujące szczegóły doświadczenia.

Materiał roślinny

W celu uzyskania 16 godzinnego dnia z temperaturą 18 +/- 1°C odmianę Rialto gatunku Triticum aestivum uprawiano w szklarni z dodatkowym oświetleniem, kontrolą temperatury.

Manipulacje rekombinacyjne DNA oraz sekwencjonowanie

Zastosowano standardowe procedury według Sambrook i wsp. (1989). Sekwencjonowanie DNA przeprowadzono na sekwenserze automatycznym ABI, a sekwencje analizowano korzystając z oprogramowania DNASTAR dla Macintosh.

Izolacja RNA w celu zklonowania cDNA

RNA ekstrahowano z bielma Triticum aestivum odmiany Rialto, stosując zestaw do izolacji RNA Purescript (Flowagen) zasadniczo według instrukcji producenta. W skrócie, bielmo mrożono w płynnym azocie i rozdrabniano przez dwie minuty w dysmembranatorze do uzyskania proszku (Braun Biotech International). Przed ekstrakcją rozdrobnioną tkankę przechowywano w ciekłym azocie. Około 100 mg stałej tkanki przenoszono do probówek do mikrowirowania o pojemności 1,5 ml, przed mieszaniem przez obracanie i umieszczaniem w lodzie na 10 minut dodawano 1,2 ml buforu Lysis. Przed wirowaniem przy 13000 x g w temperaturze 4°C przez 20 minut wytrącano białko i DNA z lizatu komórkowego dodając 0,4 ml 'Protein-DNA Precipitation Solution' oraz mieszając przez obracanie. Supernatant rozdzielano do dwóch nowych probówek o pojemności 1,5 ml, z których każda zawierała 600 μl izo-propanolu. Z precypitatu RNA tworzono osad przez wirowanie przy 13000 g w temperaturze 4°C przez 10 minut, supernatant oddzielano a osad przemywano 70% etanolem przez kilkukrotne obracanie probówki. Przed rozpuszczeniem RNA w 7,5 ml 'RNA Hydration Solution' usuwano etanol i suszono osad powietrzem przez 15-20 minut.

Przygotowanie próbki cDNA bielma pszenicy

Próbkę cDNA bielma pszenicy przygotowywano z całkowitego RNA, ekstrahowano jak opisano powyżej, stosując odwrotną transkryptazę Superscript™ (Life Technologies), zasadniczo, według instrukcji producenta. W skrócie, pięć mikrogramów RNA, 10 pMol RoRidT17 [AAGGATCCGTCGACATCGATAATACGACTCACTATAGGGA(T17)] (SEQ ID No:37) oraz sterylną wodę destylowaną do objętości reakcji 12 μl w 500 μl probówce do mikrowirowania ogrzewano do 70°C

PL 205 884 B1 przez 10 minut przed szybkim schłodzeniem w lodzie. Zawartość probówki zbierano przez szybkie odwirowanie, zanim dodano 4 μl 5x First Strand Buffer, 2 μl 0,1 M DTT i 1 μl 10 mM dNTP i, po zmiksowaniu, inkubowano w 42°C przez 2 minuty. Dodawano 1 μl Superscript™, i po wymieszaniu inkubację kontynuowano przez 1 godzinę. Reakcję zatrzymywano przez ogrzewanie temperaturą do 70°C przez 15 minut. Do mieszaniny reakcyjnej dodawano 150 μl T₁₀E₁ a powstały cDNA używano jako matrycę do amplifikacji w reakcji PCR.

Powielanie sekwencji SBEII PCR-em z puli cDNA bielma

Powielono sekwencje SBEII z próbki cDNA bielma stosując startery Ro [AAGGATCCGTCGACATC] (SEQ ID No:38), które są komplementarne do regionu Ro startera RoRidT17 użytego do syntezy próbki cDNA oraz startera specyficznego dla SBEII, SBEA [ATGGACAAGGATATGTATGA] (SEQ ID No:39). SBEA zaprojektowano tak, aby był homologiczny do motywu MDKDMYD (SEQ ID No: 36), który jest usytuowany 1 kpz od końca 3' sekwencji kodującej dojrzałe białko. PCR przeprowadzano w 50 μl roztworu reakcyjnego, zawierającego 5 μl próbki cDNA, 25 pmol Ro, 50 pmol SBEA, 5 μl 5x buforu Taq, 4 μl 25 mM Mg²+, 0,5 μl 20 mM dNTPs oraz 1,25 u polimerazy Taq. Przed podgrzaniem do 94°C przez 7 minut, a następnie schłodzeniem do 75°C przez 5 minut zmieszano wszystkie składniki reakcyjne, z wyjątkiem polimerazy Taq. Podczas trzymania mieszaniny reakcyjnej w 75°C dodawano polimerazę Taq, po dokładnym wymieszaniu, reakcję prowadzono w termocyklerze: (94°C-30 sekund, 50°C-30 sekund, 72°C-1 min) 30 cykli, po których następował ostatni etap syntezy przez 10 min w temperaturze 72°C.

Przed ligacją z zastosowaniem pT7 Blue (Novagen) według zaleceń producenta, produkty PCR oczyszczano fenolem/chloroformem i przez ekstrakcję chloroformem. Domniemane klony SBE scharakteryzowano wstępnie za pomocą standardowego sposobu oczyszczania plazmidowego DNA i cięcia enzymami restrykcyjnymi. Do sekwencjonowania wyselekcjonowano reprezentatywne klony z insertami o różnych rozmiarach.

Lokalizacja genów SBE pszenicy na chromosomach

Do lokalizacji położenia sekwencji SBE na chromosomach użyto pszeniczne linie nullisomiczno-tetrasomiczne Chinese Spring (Chińska wiosna) opisane w Sears (1966). Linie ditelosomiczne (Sears, 1966) zostały użyte do określenia położenia sekwencji SBE na ramionach chromosomów. Dodatkowe linie ditelosomiczne jęczmienia Betzes w pszenicy zostały opisane w Islam (1983).

Lokalizację na chromosomach dwóch rodzin sekwencji SBEII (SBEII-1, SBEII-2) określono przez hybrydyzowanie z liniami pszenicznymi nulli-tetra i ditelsomicznymi z zastosowaniem oczyszczonych w żelu insertów różnych klonów. Figura 9a przedstawia hybrydyzację uzyskaną z sondą SBEII-2 (klon B1) z DNA ciętym Hindlll. Euploid Chinese Spring daje trzy prążki, w których jeden z kolei jest nieobecny w linii nullisomicznej chromosomu 2A, 2B i 2D. Ten sam blot był powtórnie hybrydyzowany z sondą specyficzną dla SBE-II (klon B2). Daje to całkiem inny profil hybrydyzacyjny (Figura 9b), przedstawiając specyficzność użytych sond. Znowu brak prążków w każdej z linii nullisomicznej 2A, 2B oraz 2D. Taki sam wzór prążków zaobserwowano przy użyciu klonów B2 oraz B4 SBEII-1. Tak więc podrodzina 1 oraz 2 sekwencji genowych SBEII leży w zespole drugiej grupy pszenicy na chromosomach homologicznych.

Użyto dodatkowych ditelosomicznych linii do zidentyfikowania położenia tych genów na ramionach chromosomów (dane nie przedstawione). Ujawniły one, iż obie sekwencje SBEII-1 oraz SBEII-2 są położone na długich ramionach homologicznej w zespole 2 grupy chromosomów pszenicy.

Do określenia czy sekwencje homologiczne są obecne w jęczmieniu zastosowano dodatkowe linie jęczmienia. Dzięki temu okazało się, iż sekwencje homologiczne do sekwencji SBEII-1 oraz SBEII-2 pszenicy są położone na długim ramieniu chromosomu jęczmienia 2H.

Izolacja RNA oraz analiza Northerna

Przed zmieleniem na proszek z użyciem urządzenia Braun Mikrodismembrator™ lub tłuczka albo moździerza, ziarna pszenicy zbierano w odpowiednich odstępach czasu i zamrażano w ciekłym azocie. Całkowity RNA wyizolowano stosując zestaw RNAqueus™ (Ambion Inc), według zaleceń producenta lub zgodnie z następującą metodą. Zamrożone sproszkowane ziarno mieszano z 10-cio krotną objętością 0,2 M TrisHCL, o pH 9, 0,4 M NaCl, 25 mM EDTA, 1% SDS, 1% PUPP, 0,25% Antifoam A i 0,2 M DTT. Mieszankę tę dwukrotnie ekstrahowano z taką samą objętością fenolu/chloroformu/alkoholu izoamylowego (25:24:1), kwasy nukleinowe wytrącano z fazy wodnej przez dodanie 0,8 objętości izopropanolu, a powstały osad rozpuszczano w wodzie. Następnie, RNA wytrącano selektywnie przez dodanie 1 objętości 4 M LiCl, inkubowano w temperaturze 4°C przez noc, a powstały osad rozpuszczano w sterylnej wodzie destylowanej H₂O. Rozdział elektroforetyczny 15 μg

PL 205 884 B1 całkowitego RNA przeprowadzano przez noc w 1% żelu agarozowym, 2,21 M formaldehyd, 40 mM MOPS o pH 7,0, 10 mM octan sodu, 1 mM żel EDTA, w 40 mM MOPS o pH 7,0, 10 mM octan sodu, 1 mM bufor EDTA przy 1 V/cm. Żele umieszczano w 50 ng/ml wodnego roztworu bromku etydydny na 30 minut, odbarwiano w wodzie przez dwie godziny a następnie uwidaczniano i fotografowano w świetle UV. Następnie żele przemywano krótko sterylną wodą, a następnie przenoszono na HyBond N⁺™ (Amersham International), według standardowych protokołów (Sambrook i wsp., 1989) w ciągu nocy. Membrany rozkładano i suszono na powietrzu przed utrwaleniem UV o 312 nm przez 2 minuty.

Izolacja sond oraz oczyszczanie

W celu uwolnienia fragmentów, odpowiednio, średnio 0,8 kpz (NptII) oraz 1 kpz (SBEII-1) 5-10 μg plazmidów pUNI i pSR98-29 cięto Sst1 (Life Technologies Ltd), według zaleceń producenta. W celu uzyskania SBEII-2 o średniej wielkości 1,2 kpz 5-10 μg plazmidu pVT96-54 cięto BamHl. Przeprowadzono elektroforezę pociętych fragmentów w 1% żelu agarozowym o niskiej temperaturze topnienia. Fragmenty specyficzne genowo wycięto, a DNA oczyszczono stosując Wizard™ Gel Purification Kit (Promega).

Znakowanie sond oraz hybrydyzacja

5 ng odpowiedniej sondy (Maize Waxy promotor, NptII, fragmenty pszenicznego genu SBEII-1 lub SBEII-2) znakowano radioaktywnie stosując system Rediprime 11™ (Amersham International) przy użyciu a³²PdCTP (Amersham International), według zaleceń producenta. Membrany hybrydyzowano przez noc w temperaturze 65°C w 0,6 M NaCl, 20 mM Pipes, 4 mM Na2EDTA2H2O, 0,2% żelatynie, 0,2% Ficolu 400, 0,2% PVP-360, 10 mM Na4P2O710H2O, 0,8% SDS, 0,5 mg/ml DNA denaturowanego nasienia łososia. Przemywanie po hybrydyzacji przeprowadzono stosując 30 mM NaCl, 2 mM NaH₂PO<2H₂O, 0,2 mM Na₂EDTA2H₂O, 0,1% SDS w temperaturze pokojowej przez 7 minut, a następnie w 65°C przez 10 minut. Filtry naświetlono na Kodak BioMax MR™ (Amersham International) w temperaturze -70°C. Bloty zostały zdjęte przez przemywanie w 15 mM NaCl, 1 mM NaH₂PO<2H₂O, 0,1 mM EDTA w temperaturze 90°C przez 10 minut lub dopóki nie pozostawały żadne ilości ponad tło.

Wydłużanie sekwencji SBEII-1 końca 3' w kierunku końca 5' końca dojrzałego peptydu

W celu zaprojektowania specyficznego startera Sb4 na końcu 3' wykorzystano rozbieżność sekwencji pomiędzy sekwencją SBEII-1 pszenicy a sekwencją SBEII-2. Starter ten został użyty w połączeniu ze specyficznym starterem SBEII końca 5' tak aby wydłużyć nową sekwencję SBEII-1 stosując metodę opartą na PCR.

W celu wydłużenia sekwencji SBEII-1 na końcu 3' w kierunku końca 5' dojrzałego peptydu zidentyfikowano drugą konserwowaną domenę i zaprojektowano oligonukleotydowy starter AGSBEI w orientacji sensownej. Powielanie techniką PCR puli cDNA z pierwszej nici bielma przeprowadzono za pomocą pary starterów AGSBEI-Sb4. Oddzielenie zamplifikowanych produktów przeprowadzono elektroforetycznie w 1% (wagowo) żelu agarozowym (dane nie załączone) wykazując tym samym, iż reakcja dała wyraźny prążek o przybliżonej długości 2,2 kpz. Zamplifikowane produkty 2,2 kpz zostały wycięte z żelu, zligowane z PT7Blue i transformowane do kompetentnych komórek Novablu E.coli. Po całonocnej hodowli, 9 domniemanych zrekombinowanych klonów oddzielono do dalszej analizy. Skrining każdego z wyselekcjonowanych klonów przy użyciu starterów specyficznych dla wektorów wykazał, iż klony 5A1, 5A2, 5A5 i 5A9 zawierają inserty o przewidywanych rozmiarach. Z tego powodu, do sekwencjonowania (Figura 10) wybrano klon 5A1 (który należy do podklasy C). Sekwencja aminokwasów z Figury 10 odpowiada sekwencji Osbell-1ALL z Figury 2. Pomimo niepełnej długości, przewidywana otwarta ramka odczytu zawiera nukleotydy 44 do 1823 i koduje 593-aminokwasowy peptyd. W oparciu o podobieństwo z genami kukurydzy, szacuje się, że sekwencji tej brakuje około 230 aminokwasów z przewidzianych 830 aminokwasów. Na tej podstawie można stwierdzić, że częściowa sekwencja reprezentuje około 70% sekwencji kodującej. Wielokrotne zestawienie sekwencji SBEII-1 z ostatnio opublikowanymi sekwencjami pszenicy: SBEII-2 (Nair i wsp., 1997), SBEI (Rapellin i wsp., 1997) oraz SBEI-D7 (Rahman i wsp., 1997) wskazuje na to, że sekwencja SBEII-1 wykazuje podobieństwo w 69,6%, 31,2% oraz 46,7% w stosunku do odpowiednio SBEII-2, SBEI oraz SBEI-D2 (Figura 11 oraz 11a). Uwidacznia to, że sekwencja SBEII-1 różni się od opublikowanych sekwencji SBE pszenicy i potwierdza wyniki zestawienia dotyczące sekwencji końca 3' (Figura 3). Wzrost względnej homologii w porównaniu do wartości uzyskanych po zestawieniu dotyczącym sekwencji końca 3' wynika z faktu, iż centralna domena SBE jest wysoce konserwowana (Burton i wsp., 1995, Gao i wsp., 1997). Jednakże oczywiste jest także, iż sklonowana sekwencja SBEII-1 pszenicy jest istotnie różna od wcześniej opublikowanych sekwencji SBE pszenicy i reprezentuje nową sekwencję.

PL 205 884 B1

Pełne dane dotyczące eksperymentu przedstawiają się następująco:

Sekwencje SBEII-1 wydłużono w kierunku końca 5' dojrzałego peptydu przez amplifikację puli cDNA bielma przy użyciu startera Sb4 [TTTTCTTCACAACGCCCTGGG] (SEQ ID No:40) SBEII-1 specyficznego do SBEII-1 w połączeniu ze starterem AGSBEI [TGTTTGGGAGATCTTCCTCCC] (SEQ ID NO:41). AGSBEI został zaprojektowany tak, aby był homologiczny do motywu GVWEIFLP (SEQ ID

No:42), który jest konserwowany w każdej znanej sekwencji SBE i jest usytuowany w stronę końca 5' sekwencji kodującej dojrzały peptyd. PCR przeprowadzono w 50 μΐ roztworu reakcyjnego złożonego z 5 μl próbki cDNA, 50 pmol Sb4, 50 pmol SBEA1,5 μl 5x buforu Taq, 4 μl 2 5 mM Mg²+, 0,5 μl 20 mM dNTP i 1,25 u polimerazy Taq. Wszystkie odczynniki zostały zmieszane przed reakcją PCR w termocyklerze (94°C-45s, 55°C-30s, 72°C 1 min 30s) 30 cykli, ostatni etap wydłużania trwał 10 min w 72°C. Amplifikowane produkty rozdzielono elektroforetycznie w 1% (wagowo) żelu agarozowym, a produkty o przewidzianych rozmiarach wycięto z żelu. Przed ligacją pT7 Blue (Novagen), DNA eluowano z żelu stosując zestaw do ekstrakcji QIAGEN według zaleceń producenta. Ligację przeprowadzono w objętości 10 μl mieszaniny reakcyjnej zawierającej 7,5 μl oczyszczonego produktu amplifikacji, 1 μl 10 x buforu do ligacji, 1 μl pT7Blue i 0,5 μl ligazy DNA T4 (Amersham). Składniki reakcyjne zmieszano dokładnie przed pozostawieniem na noc w temperaturze 4°C. Po całonocnej inkubacji, część mieszaniny reakcyjnej po przeprowadzonej ligacji użyto do transformacji komórek kompetentnych Novablue E.coli (Novagen). Dokonano posiewu transformowanych komórek na płytki LB uzupełnione X-gal (40 μgml^-1), IPTG (0,1 mM), karbenicyliną (100 μgml^-1) oraz tetracykliną (12,5 μgml^-1), i inkubowano w 37°C przez noc. Początkowo, klony, o których przypuszczano, że zrekombinowały poddawano badaniu przesiewowemu na obecność insertu za pomocą kolonijnego PCR stosując specyficzne dla wektorów startery T7B oraz U19. Następnie przed sekwencjonowaniem w celu określenia orientacji insertu w rejonie wielokrotnego klonowania klony z insertami poddawano skriningowi za pomocą starterów specyficznych dla insertów w połączeniu ze starterami T7B lub U19.

Analiza Southerna

Analizą Southerna membran w liniach nulli-tetra oraz ditelosmicznych przeprowadzono, zasadniczo, tak jak to opisano w Jack i wsp. (1994).

Klony SbEII-1, omawiane powyżej, zostały wbudowane do wektorów w celu transformowania pszenicy.

Analiza Northerna

Analizę techniką Northerna przygotowano z całkowitego RNA z rozwijających się ziaren pszenicy uprawianej Bobwhite. Figura 12 przedstawia membranę Northerna RNA ziaren pszenicy odmiany Bobwhite uprawianej w szklarni jak to opisano wcześniej i zbieranych pomiędzy 5 i 29 dniem po anthezie. Membrana była hybrydyzowana z fragmentem ciętym Sac1, genu SBEII-1, wielkości 1 kpz, a następnie (po oddzieleniu membran) wraz z fragmentami 1,2 kpz BamHl SBEII-2, oba fragmenty oczyszczano i znakowano tak, jak opisano. Na Figurze 12, ramka A przedstawia żel RNA barwiony bromkiem etydyny przed poddaniem analizie Northerna. Ramka B przedstawia wyniki sondowania sondą SBEII-1, a ramka C przedstawia wyniki sondowania sondą SBEII-2. Porównując, w obrębie i pomiędzy, ramki B i C można zaobserwować różnice względnej intensywności sygnałów w różnych punktach czasu. W 5 dniu obserwowano relatywnie silniejszy sygnał z sondą SBEII-2 w porównaniu z sondą SBEII-1 wskazując, że profile transkryptów SBEII-1 oraz SBEII-2 są różne, sugerując tym samym, że dwie rodziny genowe (SBEII-1 oraz SBEII-2) podczas rozwoju zboża ulegają ekspresji w odmienny sposób. Wielkość obserwowanych transkryptów SBEII-1 oraz SBEII-2 wynosi średnio 3,5 kpz. Jednakże transkrypt SBEII-2 jest troszkę mniejszy niż transkrypt SBEII-1.

Konstrukcie plazmidu

Do konstrukcji plazmidu zastosowano standardowe procedury biologii molekularnej (Sambrook i wsp., 1989).

pWxGS+ (Figura 13) zawierający fuzję genu syntazy związanej z granulkami skrobiowymi kukurydzy (Shure i wsp. 1983) z promotorem -GUS-Nos został otrzymany w prezencie od Sue Wessler z Unilever Research (University of Georgia, Athens, USA) i na próbę, może być uzyskany z tych źródeł. Promotor pWxGS+ posiada przybliżoną długość 1,5 kpz i przedstawia skróconą wersję podobnego, ale większego fragmentu promotora opisanego przez Russel & Fromm (1997). Sekwencja promotora (fragment HindIII-BamHl) pWxGS+ jest przedstawiona na Figurze 13A (SEQ ID No:55).

pSRWXGUS1 (Figura 14) otrzymano przez wstawienie linkera Sac1 do [d(pCGAGCTCG)0] (New England Biolabs[NEB]) (katalog NEB No 1044) w miejscu Smal w pWxGS+.

PL 205 884 B1 pVTWXGUS2 (Figura 15) otrzymano przez wstawienie linkera BamH1 do [d(pCGGGATCCCG)] (SEQ ID No:43) (katalog NEB No 1044) w miejscu Ecll36II (izoschizomer Sac1, który daje tępe końce) miejsce pWxGS+.

Linker Sac1 wstawiono w miejscu Xbal (tępe końce utworzono stosując polimerazę Klenowa + dNTps) klonu B6 SBEII-1 w plazmidzie pT7Blue, w celu uzyskania klonu pośredniego. Sekwencja SBE była następnie oczyszczana z tego pośredniego klonu jako fragment Sac1 i ligowana do miejsca Sac1 pSRWXGUS1, zastępując sekwencję genu GUS, dając plazmidy pSR96-26 i pSR96-29 reprezentujące odpowiednio, sensowną i antysensowną orientację sekwencji SBEII-1 poniżej promotora Waxy.

W pT7Blue, w celu wyprodukowania klonu pośredniego linker BamH1 wstawiano w miejscu Xbal (tępe końce utworzono stosując polimerazę Klenowa + dNTps) klonu B11 SBEII-2. Sekwencję SBE czyszczono z tych pośrednich fragmentów jako fragment BamH1 i ustawiano w miejscach BamH1 pVTWXGUS2, zastępując sekwencję genu GUS, wytwarzając plazmidy pVT96-50 oraz pVT96-53 reprezentujące, poniżej sekwencji promotora Waxy odpowiednio, orientację sensowną oraz antysensowną SBEII-2.

pVT96-54. W celu uzyskania klonu pośredniego linker BamH1 wstawiano w miejscu Xba1 (którego tępe końce otrzymywano przy użyciu polimerazy Klenowa + dNTPs) klonu B9 SBEII-2 (odpowiednik klonu B1) do pT7Blue. Sekwencję SBEII-2 oczyszczano z tych pośrednich klonów jako fragment BamH1 i żeby otrzymać plazmid pVT96-54 wstawiano w miejsca BamH1 pVTWXGUS2, zastępując sekwencję genu GUS.

Sekwencje Waxy-SBE-NOS plazmidów pSR96-26 i pSR96-29 i pVT96-50 i pVT96-53 oczyszczano jako fragmenty Hindlll/EcoRI i wstawiano w miejscach EcoRl/Hindlll plazmidu pPBI-97-2 (znane także jako p97-2) (Figura 16). Plazmid pPBI-97-2 opisano w Europejskim Zgłoszeniu Patentowym Nr 97305694.8 (opublikowanym jako WO 99/06570). Po usunięciu pozostałości genu markerowego oporności na ampicylinę, powstałe plazmidy oznaczono jako pSR97-26A- (klon B6 (SBEII-1, podklasa A) w orientacji antysensownej), pSR97-29A- (klon B6 w orientacji sensownej) oraz pSR97-50A- (klon B11 (SBEII-2, podklasa A) w orientacji antysensownej) oraz pSR97-53A- (klon B11 w orientacji sensownej), jak przedstawiono, odpowiednio na Figurach 17, 18, 19 oraz 20.

p97-2C (Figura 21) uzyskano przez cięcie w miejscach polilinkerów Ecl136 II do Smal plazmidu pPBI97-2 (Figura 16), ligację oraz selekcję rekombinantów, w których region polilinkerów Smal do Ecl136 II został powtórnie insertowany w odwrotnej orientacji.

W celu utworzenia plazmidu p97-2CWT1 (Figura 22) sekwencje Waxy-NOS w pSRWXGUS1 przeniesiono jako fragment Hindlll/EcoRI w miejsca Hindlll/EcoRI plazmidu p97-2C.

pSC98-1 oraz pSC98-2. Wydłużony na końcu 5' klon 5A1 SBEII1 w pT7Blue (zawierający sekwencje SBE od współrzędnej 43 do 2003 pz na Figurze 10) cięto EcoRI oraz Xbal, a następnie, używając polimerazy Klenowa i dNTPs wypełniano nawisy. Powstałe fragmenty SBE zawierające tępe końce oczyszczono na żelu i ligowano z p97-2CWT1 (Figura 22), które cięto Ecl136ll i defosforylowano za pomocą jelitowej fosfatazy cielęcej. Powstałe rekombinanty poddawano screeningowi za pomocą analizy cięcia enzymami restrykcyjnymi, i identyfikowano klony zawierające dwie orientacje sekwencji SBE (w stosunku do promotora waxy). pSC98-1 (Figura 23) jest antysensowną wersją, a pSC98-2 (Figura 24) jest wersją sensowną. Po usunięciu genów markerowych oporności na ampicylinę, powstałe plazmidy zostały oznaczone odpowiednio, jako pSC98-1A- oraz pSC98-2A-.

Selekcja konstruktu promotor Ubikwityna-NptII: pUN1 pUN1 został utworzony w następujący sposób:

W celu utworzenia plazmidu pośredniego linker Sacl wstawiano w miejscu Smal plazmidu pAHC25 (Christen i Quail 1996). Żeby otrzymać pPBl95-9 z tego pośredniego plazmidu usunięto gen GUS poprzez cięcie Sacl, a następnie przez samoligację oraz identyfikację zrekombinowanych cząsteczek nie posiadających sekwencji GUS. pPBI95-9 cięto EcoRI, a następnie zidentyfikowano zrekombinowane cząsteczki nie posiadające sekwencji Ubi-BAR, które uległy samoligacji. Powstały plazmid oznaczono jako pPBI96-23. Sekwencję NptII amplifikowano za pomocą PCR z użyciem starterów AG95-7: 5'GATGAGCTCCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGG (SEQ ID No:44) oraz AG95- 8: 5'GTCGAGCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC (SEQ ID No:45) stosując pPBIBAG3 (GoldsBrough i wsp. 1994) jako matrycę dla sekwencji NptII). Produkt amplifikacji klonowano w miejscu Sstl z pBluescript (Stratagene), a następnie sekwencjonowano. Sekwencjonowanie ujawniło, iż sekwencja NptII była raczej odmianą form mutanta niż, jak wcześniej oczekiwano była typu dzikiego. Forma zmutowana ma zmienioną jedną zasadę, która jest flankowana przez unikatowe miejsca Nco1 oraz Sph1. W celu

PL 205 884 B1 usunięcia regionu zawierającego zmienioną zasadę klon pBluescript cięto Nco1 oraz Sph1. Następnie dwa oligonukleotydy (Nptl: CCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACC (SEQ ID No:46) oraz Npt2: CATGGGTCACGACGAGATCCTCGCCGTCGGGCATG) (SEQ ID No:47) łączono, żeby otrzymać fragment Nco1/Sph1. Został on sklonowany do klonu Bluescript/Npt11 ciętego Nco1/Sph1 i powstały klon sekwencjonowano, aby potwierdzić, że teraz gen miał formę typu dzikiego.

Następnie w celu utworzenia pUNI (Figura 25) sekwencje NptII oczyszczano jako fragment Sacl i wklejano do miejsca Sac1 pPBI96-23. pUN1 zawiera promotor typu dzikiego ubikwityny (promotor Ubi), który jest także opisywany jako ubikwitynowy system regulacyjny (skrót URS). Orientację sekwencji NptII w pUNl określano przez analizę cięcia enzymami restrykcyjnymi. Sekwencję fragmentu NptII Sac1 przedstawiono na Figurze 26 (SEQ ID No:35).

pUSN99-1 oraz pUSN99-2. Sekwencję SBEII-1 (klon B6) oczyszczono jako fragment Sac1 z plazmidu pSR96-26 i insertowano w rejonie Sac1 pPBI96-23 w celu wytworzenia plazmidów pUSN99-1 i pUSN99-2 (Figura 27 oraz 28) reprezentujących, odpowiednio, sensowną oraz antysensowną orientację sekwencji SBEII-1.

pPBI97-2BdUN1. PBI92-2BdUN1 (czasami także opisywane jako p97-2BdUN1) zawiera zrekonstruowany ubikwitynowy system regulacyjny (opisywany także jako zmodyfikowany promotor ubikwityny lub jako zmodyfikowany system regulacyjny ubikwityny (mURS), który pozbawiony jest on dwóch zachodzących na siebie 'elementów konsensusowych szoku cieplnego' opisywanych w EP 0342926 oraz US 5614399. Zmodyfikowany promotor ubikwityny przygotowywano przez powielenie techniką PCR dwóch fragmentów DNA przy użyciu, jako matrycy genomowego DNA kukurydzy, a następnie poddaniu ligacji dwóch fragmentów w celu uzyskania pojedynczego fragmentu pozbawionego konsensusowych elementów szoku cieplnego (HS). Miejsce restrykcyjne Kpn1 zostało umieszczone w miejscu elementów HS. Użyte startery zostały zaprojektowane na podstawie informacji o sekwencjach publikowanej przez Liu i wsp. 1995 (EMBL DNA dostęp do bazy danych ZMU29159). W celu usunięcia elementów HS i zastąpienia diagnostycznym miejscem Kpn1, promotor ubikwityny oraz sekwencje intronowe zamplifikowano jako dwa fragmenty używając do tego celu kombinacji starterów Hs1 + Ubi3-3 oraz HS2 + Ubi5-2, których sekwencje są podane poniżej. Startery Ubi5-2 oraz Ubi3-3 są homologiczne do sekwencji opublikowanych przez Lieu i wsp. 1995. Startery HS1 oraz HS2 są homologiczne do sekwencji umiejscowionych, odpowiednio, tuż przy końcu 3' oraz 5', na dwóch zachodzących elementach HS promotora ubikwityny, jak opisano w EP 0342926 i US 5361399. Oba startery posiadają ogon Kpn1 na ich końcach 5'.

Startery

HS1:5-ATTAGGTACCGGACTTGGCTCCGCTGTCGGC-3 (SEQ ID No:48)

HS2:5-TATAGGTACCGAGGCAGCGACAGAGATGCC-3 (SEQ ID No:49)

Ubi5-2:5-AGCTGAATCCGGCGGCATGGC-3 (SEQ ID No:50)

Ubi3-3:5-TGATAGTCTTGCCAGTCAGGG-3 (SEQ ID No:51)

W celu uzyskania plazmidów p97-U1 oraz p97-U2 amplifikowane produkty subklonowano do pGEM TEazy (Promega). Pełną długość (około 2 kpz) zmodyfikowanego promotora ubikwityny odtworzono przez subklonowanie fragmentu Kpn1-Sac1 z p97-U1 w miejscach Kpn1/Sac1 z p97-U2, żeby utworzyć p97-U3. Częściową mapę restrykcyjną przewidywanej sekwencji (SEQ ID No:52) klonowanego fragmentu do p97-U3 przedstawiono na Figurze 29. (Zmodyfikowany promotor ubikwityny (lub mURS) jest przedmiotem jednoczesnego Europejskiego Zgłoszenia Patentowego wniesionego przez niniejszych zgłaszających tego samego dnia co niniejszy wynalazek, pod oznaczeniem C1235,01/M). Zmodyfikowany promotor ubikwityny przeniesiono jako fragment Pstl z p97-U3 do plazmidu pPBI96-36. Plazmid pBI96-36 (Figura 30) zawiera połączenie genu reporterowego GUS-Nos pod kontrolą promotora ubikwityny typu dzikiego (otrzymanego z pAHC25) w plazmidowym szkielecie pUC. Promotor zastąpił regulacyjny system ubikwityny typu dzikiego w pPBI96-36, żeby utworzyć pośredni plazmid p97-dUG1 (Figura 31).

Konstruowanie pPBI97-2BdUN1

W celu uzyskania plazmidu p97-2BUbiNos, sekwencje Ubi-Nos w pPBI96-23 przeniesiono jako fragment EcoRI-Hindlll do EcoRI i miejsc cięcia Hindlll p97-2B (plazmid p97-2B opisano w Europejskim Zgłoszeniu Patentowym oznaczonym numerem 97305694.8 opublikowanym jako WO 99/06570). Żeby utworzyć p97-2BUbiNos zmodyfikowany promotor ubikwityny oczyszczono jako fragment HindllI/SacI z p97-dUG1 (Figura 31) i umieszczono w miejscach cięcia Hindlll oraz Sac1 p97-2BdUbiNos, zastępując promotor ubikwityny typu dzikiego. Żeby utworzyć pPBI97-2BdUN1 (Figura 32) sekwencję NptII w pUN1 oczyszczono jako fragment Sac1 i umieszczono w miejscu Sac1 p97-2BdUbiNos. Po usunięciu

PL 205 884 B1 markera oporności na ampicylinę, przy użyciu metody opisanej w WO 99/06570, powstały plazmid określony jako p97-2BdUN1A-, stosowano do transformacji pszenicy.

pCaineo pCaineo zawiera gen NptII kontrolowany przez promotor CaMV35S oraz intron Adhl z kukurydzy. Plazmid został opisany przez Fromm i wsp. 1986.

Transformacja pszenicy

Następującą kombinację (mikrowstrzeliwanie) użyto do transformacji pszenicy:

T a b e l a 2. Kombinacja plazmidów użyta w doświadczeniach transformacji pszenicy.

Konstrukt/konstrukty genu skrobi	Konstrukt markera selekcyjnego
	pAHC25
pWXGS+	pUN1
pSR97-26A-antysensowny	pUN1 lub p97-2BdUN1
pSR97-29A-sensowny	p97-2BdUN1 lub pCaiNeo
pSC98-1A-antysensowny	p97-2BdUN1
pUSN-1 sensowny	p97-2BdUN1
pUSN-2 antysensowny	p97-2BdUN1
pUSN-1 sensowny i pUSN-2 antysensowny	pUN1
pSC98-2A- sensowny	p97-2BdUN1

Stosowane metody transformacji pszenicy, opisane tutaj, w dużym stopniu, oparte są na opisanych przez Barcelo i Lazzeri, 1995.

Zarodki pszenicy jarej odmiany Bobwhite oraz ozimej odmiany Florida hodowano w szklarni przez 16 dni przy naświetleniu o minimalnej intensywności 500 umol m ^-2s^-1 z 0,5 M ponad warstwą liści. W dzień temperaturę szklarni utrzymywano na poziomie 19°C+/-1°C,a w nocy na poziomie

14°C+/-1°C.

Niedojrzałe zarodki pszenicy zbierano z rozwijających się ziaren. Ziarna zbierano i zarodki hodowano przez około 12 dni po antezie, do uzyskania zarodków o długości co najmniej 1 mm. Ziarna przemywano 70% etanolem przez 5 minut, a następnie przez 15 minut sterylizowano w 10% roztworze wybielacza Domestos (Domestos jest znakiem towarowym), a następnie przemywano 6 razy sterylną wodą destylowaną. Po usunięciu osi zarodka, zarodki układano powierzchnią osi na dół na żelu agarozowym (nr katalogowy Sigma A-3301) pożywką MM1. Ogólny przepis na MM1 jest podany w dodatku 1, a przepisy na różne inne składniki w dodatku 2. Przed napromieniowaniem zarodki utrzymywano w ciemności przez jeden lub dwa dni w temperaturze 24°C+/-1°C.

Plazmidy pAHC25, pCAiNeo, pUN1 oraz p97-2BdUN1 stosowano do dostarczenia markerów selekcyjnych w połączeniu z konstruktami genów skrobi, jak przedstawiono to w Tabeli 2. pAHC25 (Christansen i Quail 1996) zawiera chimeryczny gen Ubi-BAR, który dostarcza selekcji transformantów dla fosfonotrycyny, aktywnego składnika w herbicydach BASTA™ oraz Bialophos (patrz Block, M.de i wsp. 1987). Plazmidy pCAiNeo (Fromm i wsp., 1986), pUN1 oraz p97-2BdUN1 zawierają fuzję genu chimerycznego promotor-NptII oraz umożliwiają selekcyjnych transformantów przeciwko szeregowi antybiotyków aminoglikozydowych obejmując kanamycynę, neomycynę, genetycynę oraz paromycynę.

Mikrobombardowanie zastosowano do wprowadzenia plazmidów do komórek roślinnych. Do wytrącenia DNA plazmidu na 0,6 μg cząsteczkach złota (BIO-RAD numer katalogowy 165-2262) zastosowano następujący sposób: całkowitą ilość 5 μg DNA plazmidu dodano do 50 μl sonifikowanej przez jedną minutę zawiesiny cząsteczek złota (10 mg/ml) i w 1,5 ml probówce do mikrowirowania. Po krótkim wytrząsaniu przez 3 sekundy z drugiej strony wieczka probówki dodawano 50 μl 0,5 M roztworu chlorku wapnia i 20 μl 0,05 M zasady wolnej od spermidyny. Zawartość probówki mieszano poprzez zamknięcie wieczka i umieszczanie pukaniem w probówkę chlorku wapnia oraz spermidyny na dnie probówki. Po wytrząsaniu przez 3 sekundy, zawiesinę odwirowywano przy 13000 rpm przez 5 sekund. Supernatant usuwano, a osad rozpuszczano ponownie w 150 μl absolutnego etanolu. Wymaga to zeskrobania cząstek złota z wewnętrznych ścian probówki przy użyciu końcówki pipety. Po dalszym trzy sekundowym wytrząsaniu próbkę ponownie wirowano, a osad rozpuszczano ponownie w 85 μl

PL 205 884 B1 absolutnego etanolu. Cząsteczki krótko wytrząsano i sonifikowano przez 5 sekund sonifikatorem Camlab Trisonic T310 w łaźni wodnej aby uzyskać drobną dyspersję. Podwielokrotność 5 μl cząstek złota opłaszczonych DNA umieszczano w centrum makronośnika (BIO-RAD nr katalogowy 115-2335) i pozostawiono do wysuszenia przez 30 minut. Mikrobombardowanie cząsteczkami przeprowadzono przy użyciu komory Biolistic™ PDS-1000/He (BIO-RAD Instruments, Hercules CA), co przedstawiono schematycznie na Figurze 33, stosując ciśnienie helu 650 do 900 psi (membrana bezpieczeństwa: BIO-RAD nr katalogowy 165-2327 oraz odpowiednio 165-2328).

Na figurze 33 przedstawiono komorę próżniową składającą się z obudowy 10, wewnętrznych ścian bocznych, które zawierają szereg wgłębień 12 do podtrzymywania półek, takich jak półka na próbki 14 pokazana na 4 poziomie licząc od góry obudowy. Membrana bezpieczeństwa 16 jest podtrzymywana w rurze uderzeniowej 18, ciśnieniem helu w pobliżu góry obudowy. Podpora 20 znajdująca się w drugim zestawie wgłębień 12 licząc od góry obudowy utrzymuje jednostkę 22, obejmując ekran zatrzymujący oraz wiele pierścieni 24 z 11 pierścieniami poniżej podpory 20 i 3-4 pierścieniami powyżej podpory 20. Makronośnik 26 jest umiejscowiony na szczycie jednostki 22. Przybliżona odległość od membrany bezpieczeństwa 16 do makronośnika 26 wynosi 25 mm, z przybliżoną odległością od makronośnika 26 do zatrzymującego ekranu wynoszącą 7 mm, i przybliżoną odległością od ekranu zatrzymującego do półki na próbki 14 wynoszącą 67 mm. Szczyt jednostki 22 jest odległy około 21 mm od dna rury uderzeniowej 18, a dno jednostki 22 jest około 31 mm od szczytu półki na próbki 14.

Niedojrzałe zarodki poddawano mikrobombardowaniu pomiędzy 1 a drugim dniem po hodowli. Do zabiegu, niedojrzałe zarodki grupowano w okrąg średnicy w przybliżeniu około 1 cm, zawierający 20-100 zarodków, ułożonych osiową stroną do dołu na pożywce MM1. Płytkę Petri'ego (nie pokazano) zawierająca tkankę umiejscowiono w komorze na półce 14, na poziomie czwartej półki licząc od góry jak pokazano na Figurze 33. Następnie usunięto powietrze z komory, do osiągnięcia wynoszącej 28,5 cala Hg próżni. Makronośnik 26 przyspieszono uderzeniową falą helu stosując błony bezpieczeństwa, które pękają, gdy ciśnienie He w rurze uderzeniowej 18 osiąga 650 lub 900 psi. W ciągu jednej godziny po promieniowaniu, napromieniowane zarodki położono na pożywce MM1 w ilości 10 zarodków na 9 cm płytce Petri'ego, a następnie trzymano w całkowitej ciemności przez 2-3 tygodnie, w temperaturze 24°C. W tym okresie w napromieniowanych zarodkach zostaje wytworzony somatyczny callus zarodkowy.

Po 2-3 tygodniach zarodki przeniesiono na wzmocnioną agarem pożywkę regenerującą, znaną jako pożywka R, i inkubowano przez 16 godzin, przy świetle dziennym, w temperaturze 24°C. Ogólny przepis na pożywkę R jest podany w dodatku 1. Zarodki przenoszono na świeże płytki w 2-3 tygodniowych odstępach. Skład pożywki regenerującej różni się w zależności od stosowanego systemu selekcyjnego. Dla napromieniowanych transformantów z genem BAR, pominięto roztwór 3 amino, a do selekcji użyto PPT (fosfofinotrycyna) w ilości 1 mg/l do 3 mg/l przez okres trzech 2-3 tygodniowych transferów. Do selekcji transformantów z genem NptII użyto trzy różne systemy: 1) Genetycynę (GIBCO-BRL nr katalogu 10131-019) włączono (w ilości 50 mg/l) bezpośrednio po przeniesieniu do pożywki regenerującej i utrzymywano na poziomie 50 mg/l po następujących przeniesieniach pożywki regenerującej. 2) i 3) najpierw zarodki przeniesiono do pożywki regenerującej bez selekcji, odpowiednio, na 12 dni i 2-3 tygodnie, a następnie przeniesiono do środka zwierającego Genetycynę w 50 mg/l. Po 2-3 pasażach w pożywkach regenerujących, zregenerowane kiełki przeniesiono do probówek hodowlanych zawierających 15 ml pożywki regenerującej o połowicznej sile jonowej z selekcją 3 mg/l PPt lub 35 mg/l genetycyny w zależności od tego, czy w pierwotnych mikrobombardowaniach użyto gen BAR genu NptII. Po wytworzeniu korzeni, zregenerowane rośliny przeniesiono do ziemi w szklarni.

Izolacja genomowego DNA oraz analiza Southerna

Analizę Southerna pierwotnych transformantów oraz materiału pochodzącego od potomstwa przeprowadzono następująco: zamrożone, wysuszone suche tkanki liścia rozdrabniano szybko w tłuczku Kontes™ i moździerzu, a genomowe DNA ekstrahowano jak opisano w Fulton i wsp., 1995. 5 μg DNA cięto odpowiednim enzymem restrykcyjnym, według zaleceń producenta oraz przeprowadzano elektroforezę przez noc w 1% żelu agarozowym, który następnie fotografowano, przemywano przenoszono na Hybond N+™ (Amersham International) według sposobu analizy Southerna, stosując standardowe procedury (Sambrook i wsp. 1989). Po przeniesieniu membrany suszono na powietrzu, ogrzewano w temperaturze 65°C przez 1-2 godziny i poddawano działaniu UV przy 312 nm przez minuty.

Znakowanie sondy do analizy Southerna transformowanego materiału przeprowadzono tak jak opisano powyżej.

PL 205 884 B1

Histochemię GUS zasadniczo przeprowadzono, jak opisano u Jeffersona (1987).

Ocena promotora ubikwityny w konstytutywnej ekspresji powiązanych transgenów

Plazmid pAHC25 (Christensen i Quail, 1996) transformowano do pszenicy, jak opisano we wcześniejszych paragrafach. Transformanty selekcjonowano na podstawie oporności na fosfinotrycynę. Analizę Southerna przeprowadzono na pierwotnych transformantach w celu potwierdzenia integracji sekwencji plazmidu (dane nie przedstawione). Przeprowadzono także analizę histochemiczną GUS i wykazano, iż promotor ubikwityny jest zdolny do wywoływania ekspresji GUS na wysokim poziomie w zakresie tkanek pszenicy. Figury 34 A, B, C oraz D przedstawiają histochemiczną lokalizację ekspresji GUS odpowiednio w tkankach ziaren, łodyg, kwiatów i liści. Analizy Southerna oraz histochemiczna GUS przeprowadzono również na własnych potomkach pochodzących od pierwotnych transformantów, żeby potwierdzić, że stosowany system transformacji jest zdolny do wytworzenia roślin transgenicznych, które stabilnie przenoszą zintegrowane sekwencje plazmidowe do roślin potomnych. Figura 35 przedstawia analizę Southerna 26 roślin potomnych transformanta BW119, który był transformowany pAHC25. W tym, przykładzie DNA genomowy roślin potomnych cięto enzymem restrykcyjnym Sac1, a membranę hybrydyzowano z sekwencją kodującą genu GUS. Wyniki analizy Southerna sugerują na obecność dwóch niezależnie segregujących loci integracyjnych, z których każde zawiera konkatamery plazmidowej sekwencji pAHC25.

Ocena promotora waxy kukurydzy do ekspresji specyficznych dla bielma transgenów skojarzonych

Plazmidy pWxGS+ oraz pUN1 kotransformowano wspólnie do pszenicy, jak opisano to we wcześniejszych paragrafach. Transformanty wyselekcjonowano na podstawie oporności na genetycyny. W celu potwierdzenia integracji sekwencji plazmidowych (wyniki nie przedstawione) analizę Southerna przeprowadzono na pierwotnych transformantach. Przeprowadzono także analizy histochemiczne, w celu określenia profilu ekspresji wywołanej przez promotor waxy kukurydzy. Większość transformantów, w których zachodziła ekspresja GUS wykazywała ekspresję specyficznie w tkankach bielma, co świadczy o przydatności tego promotora do wywoływania ekspresji transgenów skojarzonych w bielmie. Figury 36 A oraz B przedstawiają specyficzną dla bielma ekspresję GUS w ziarnach dwóch niezależnych transformantów. Nie zaobserwowaliśmy ekspresji GUS w pyłku kwiatowym zbóż tak, jak zauważyli to Russell i Fromm (1997). Jednakże stosowali oni także konstrukt, który miał wprowadzony intron hsp70 kukurydzy, który niewykluczone, że mógł mieć jakościowy i ilościowy wpływ na ekspresję.

Transformacja pszenicy konstruktami genów skrobi

Różne kombinacje konstruktów wyszczególnionych w Tabeli 2 łącznie transformowano do pszenicy stosując procedury opisane we wcześniejszych paragrafach. Transformanty selekcjonowano na podstawie oporności na genetycynę. Pierwotne transformanty potwierdzono przez analizę Southerna. Membrany były sekwencyjnie hybrydyzowane sondą sekwencji kodującej NptII oraz sondą regionu kodującego SBE. Figura 37 przedstawia przykład analizy Southerna, który zawiera 22 domniemane transformanty, które zostały wprowadzone techniką łączonego mikrobombardowania wraz z pSR97 29A- lub pSR97-26A-oraz pUN1 lub p97-2BdUN1. Genomowe DNA na tej membranie cięto Sac1. Najpierw membranę hybrydyzowano z sondą NptII. Linie oznaczone gwiazdką odpowiadają transformantom, które dały pozytywny sygnał z sondą NptII. Membranę pokazaną na Figurze 37 hybrydyzowano fragmentem SBEII-1 wielkości 1 kpz ciętym Sac1. Oczekuje się, że cięcie Sac1 uwalnia prążek hybrydyzujący SBEII-1, wielkości 1 kpz z sekwencji plazmidowych zarówno pSR97-29Ai pSR97-26A-, a intensywność tego prążka będzie różnić się w zależności od liczby kopii wstawionych sekwencji plazmidowych. Jak można zobaczyć na Figurze 37, zaobserwowano także kilka dodatkowych prążków hybrydyzacyjnych SBEII-1. Pięć z tych prążków jest obecnych we wszystkich liniach i wynika z hybrydyzacji do endogennych sekwencji SBEII-1 pszenicy. Dodatkowe prążki różnych rozmiarów, obserwowane w większości ścieżek, przedstawiają hybrydyzujący prążek wielkości 1 kpz najprawdopodobniej powstający na skutek integracji, w czasie której, przed integracją, jedna lub więcej kopii plazmidu została zlinearyzowana w sekwencji SBEII-1 wielkości 1 kpz. W przykładzie przedstawionym na Figurze 37, z 20 roślin pozytywnych na NptII, uznano, że 16 było transformowanych łącznie z sekwencjami SBEII-1, świadcząc o wydajności łącznej transformacji na poziomie 80%.

Skaningowa kalorymetria różnicowa (DSC)

Podgrzany wodny roztwór skrobi, w nadmiarze wody ulega, jak opisano wyżej wspólnej endotermicznej przemianie znanej jako żelifikacja, która powoduje topnienie stalitów skrobi. Skaningowa kalorymetria różnicowa (DSC) mierzy ilość energii (ciepła) absorbowanej lub uwolnionej przez próbkę,

PL 205 884 B1 gdy jest ona podgrzewana, schładzana lub przetrzymywana w stałej (izotermicznej) temperaturze. DSC było szeroko stosowane do badania żelifikacji oraz retrogradacji skrobi.

Analizę DSC przeprowadzono na pojedynczych ziarnach lub grupie pięciu ziaren pierwotnych transformantów wytworzonych przez transformację stosując każdą z kombinacji konstruktów genowych wyszczególnionych w Tabeli 2.

Stosowano dwa różne sposoby przygotowywania próbki i metodologii DSC.

Sposób 1

Pojedyncze próbki ziaren rozkruszano i rozdrabniano przy użyciu tłuczka i moździerza. Następnie powstałe otręby oddzielano a próbki odważano do 50 μτη aluminiowych pojemników do DSC. Do próbek dodano wodę w ilości trzykrotnie większej wagowo, i pojemniki z próbkami zaplombowano. Analizę przeprowadzono stosując system Perkin-Elmer DSC-7 Robotic™ wyposażony w Inetrcooler II™, w warunkach poniżej temperatury otoczenia. Próbki ogrzewano od 25°C do 80°C z szybkością ogrzewania 5°C na minutę. Rejestrowano entalpię żelifikacji, temperaturą początkową, maksymalną i końcową. Termogramy analizowano stosując oprogramowanie Perkin-Elmer (Thermal Analysis Software 7). Entalpię żelifikacji wyrażono w dżulach (J)/gram(g) próbki.

Sposób 2 ziaren pojedynczego pierwotnego transformanta lub pojedyncze nasiona pierwotnych transformantów zmielono w Camotec 1090™ Sample Mill. Następnie zmieloną próbkę przesiewano na sicie 250 mikronowym, żeby oddzielić otręby od bielma. Około 5 mg przesianych próbek dokładnie odważono do 50 μl pojemników aluminiowych DSC. Wodę w ilości trzykrotnie większej, wagowo, dodawano do pojemników na próbki i plombowano. Analizę przeprowadzono stosując system PerkinElmer DSC-7 Robotic™ wyposażony w Inetrcooler II™ oraz autosampler. Próbki ogrzewano od 40°C do 85°C z prędkością 10°C na minutę. Termogramy zanalizowano stosując oprogramowanie PerkinElmer (Pyris Software dla Windows v 3,5). Rejestrowano entalpię żelifikacji, temperaturę początkową, maksymalną oraz końcową.

Przy zastosowaniu sposobu 1, analizę DSC przeprowadzono na pojedynczych dojrzałych ziarnach pierwotnych transformantów, transformowanych kombinacjami plazmidów pSR97-26A-/pUN1, pSR97-26A-/p97-2BdUN1 i pSR97-29A-/p97-2BdUN1. Uzyskane dane porównywano z danymi materiału kontrolnego, który transformowano jednym z plazmidów NptII zawierających markery do selekcji, ale nie zawierających żadnych plazmidów „skrobiowych”. W Tabeli 3 podsumowane są wartości średnie temperatury początkowej, maksymalnej i końcowej oraz wartości entalpii dla wyselekcjonowanego materiału. Większości próbek wykazano wartości podobne do materiału kontrolnego. Jednakże, jak można odczytać z Tabeli 3 temperatura początkowa, maksymalna oraz końcowa była dla wielu transgenicznych próbek wyższa w porównaniu do wartości otrzymanych dla materiału kontrolnego. Np. transformant BW 326 wykazuje wzrost 6,7°C, 4,9°C oraz 4,6°C, odpowiednio, dla temperatury początkowej, maksymalnej oraz końcowej w porównaniu do wartości próbki kontrolnej.

Stosując sposób 2, przeprowadzono dalsze serie analiz DSC w grupach składających się z 5 ziaren pierwotnych transformantów, transformowanych kombinacjami plazmidów pSC98-1A-/p97-2BdUN1, pUSN-1/p97-2BdUN1, pUSN-2/p97-2BdUN1 i pUSN-1/pUSN-2/pUN1. Uzyskane dane porównano z danymi otrzymanymi dla materiału kontrolnego, który był transformowany jednym z plazmidów NptII, które zawierały markery do selekcji, ale nie zawierały żadnych plazmidów „skrobiowych”. W Tabeli 4 podsumowano średnią temperaturę początkową, maksymalną i końcową oraz wartości entalpii dla wyselekcjonowanych grup próbek. W wielu przypadkach istnieją dowody, iż temperatura początkowa, maksymalna i końcowa dla skrobiowego materiału transgenicznego była wyższa w porównaniu z wartościami otrzymanymi dla materiału kontrolnego. Np. transformant BW 727 wykazuje wzrost 9,8°C, 8,7°C i 9,1°C, odpowiednio, dla temperatury początkowej, maksymalnej i końcowej, w porównaniu do próbki kontrolnej BW nr 3 oraz wzrost 7,6°C, 6,8°C oraz 7,8°C, odpowiednio, dla temperatury początkowej, maksymalnej i końcowej, w porównaniu do próbki kontrolnej BW nr 2.

PL 205 884 B1

T a b e l a 3. Wyniki analizy DSC dla pojedynczych ziaren przy zastosowaniu sposobu 1. Przedstawione dane są średnimi dla 2 do 6 próbek z pojedynczych ziaren (T0, Tp, i Tf są, odpowiednio, temperaturą początkową, maksymalną i końcową).

Kombinacja plazmidów	Oznaczenie linii	T0 (°C)	Tp (°C)	Tf (°C)	ΔΗ (J/g)
Próbka kontrolna BW1		55.2	59.7	66.5	4.66
pSR97-26A-/pUN1	BW283	57.1	60.4	65.0	2.12
	BW135	57.2	62.1	68.6	4.86
	BW324	57.8	62.1	69.1	5.33
	BW325	58.4	61.8	68.7	3.90
	BW326	61.9	64.6	71.1	2.46
	BW348	60.7	63.4	69.7	3.76
pSR97-26A-/p97-2BdUN1	F227	57.4	61.4	67.3	2.65
pSR97-29A-/p97-2BdUN1	F310	62.1	63.7	69.2	6.75
	F312	59.0	62.3	66.8	1.16
	BW335	56.2	60.8	69.1	4.63
	BW353	59.5	62.7	70.8	3.21
	BW354	55.4	61.7	68.9	4.28
	BW355	57.9	61.5	68.0	3.95
	BW357	55.3	60.6	68.0	3.74
	BW363	56.7	62.5	67.9	1.13
	BW367	59.0	62.5	68.2	2.17
	BW369	57.9	60.9	65.9	1.04
	BW370	53.7	59.4	67.5	6.00
	BW375	57.2	61.5	70.0	4.14
	BW376	54.0	58.1	68.0	3.39
	BW377	53.4	60.9	69.2	2.60
	BW380	54.6	61.6	67.6	2.16
	BW390	56.8	61.2	68.5	1.29
	BW399	57.4	62.7	67.9	1.77
	BW400	60.6	63.6	68.1	0.64
	BW341	51.6	59.0	66.4	1.97

T a b e l a 4: Wyniki analizy DSC próbek 5 zbóż przy zastosowaniu sposobu 2. T0, Tp i Tf odpowiednio przedstawiają temperaturę początkową, temperaturę maksymalną oraz temperaturę końcową

Kombinacja plazmidów	Oznaczenie linii	T0 (°C)	Tp (°C)	Tf (°C)	ΔΗ (J/g)
1	2	3	4	5	6
Próbka kontrolna F 1		60.1	63.9	68.0	6.30
Próbka kontrolna BW 2		59.3	64.0	68.4	5.94
Próbka kontrolna BW 3		57.08	62.09	67.08	4.28

PL 205 884 B1 cd tabeli 4

1	2	3	4	5	6
pSC98-1A-/p97-2BdUN1	BW449	59.3	62.9	67.9	3.95
	BW477	57.7	63.6	70.6	8.30
	F492	62.3	66.4	70.2	7.60
	F494	63.6	67.3	71.0	5.73
	BW511	59.6	63.8	67.2	0.98
	BW518	60.2	64.9	69.2	3.57
	BW519	58.4	63.6	68.5	4.13
	BW527	58.7	63.7	69.0	6.38
	BW549	59.9	64.8	69.3	4.48
	BW550	60.2	64.6	68.9	5.06
	BW552	60.8	62.9	67.9	3.74
	BW553	59.5	63.9	67.5	3.60
	BW555	61.0	66.1	68.2	5.43
	BW557	62.7	66.9	71.0	5.08
	BW559	61.6	65.9	70.8	5.08
	BW563	61.4	65.1	69.4	1.90
	BW564	59.4	64.5	73.2	7.08
	BW576	61.8	65.6	69.3	2.65
	BW587	61.3	65.4	69.4	5.36
	BW614	63.9	67.9	71.8	5.83
	BW618	61.3	65.6	69.7	3.54
	BW583a	58.9	63.7	68.0	3.54
	BW631	61.5	65.6	69.7	4.52
	BW633	61.9	66.0	70.2	5.12
	BW634a	60.8	64.9	70.2	5.10
	BW637a	62.8	67.2	72.0	5.16
	BW639	61.8	65.1	68.9	2.15
	BW640a	62.2	66.7	71.0	3.23
	BW642	63.2	67.2	70.9	4.90
	BW698	62.9	67.0	70.9	4.48
	BW700a	63.8	67.6	71.2	3.41
	BE524a	59.4	64.3	68.9	4.05

pUSN-1/p97-2BdUN1	BW622	59.0	64.1	68.7	4.32
	BW628	56.2	63.3	66.0	6.09
	BW645	57.5	65.6	69.5	5.97
	BW646	61.6	66.4	67.7	3.99

PL 205 884 B1 cd tabeli 4

1	2	3	4	5	6
	BW647	61.3	65.4	69.0	3.47
	BW648	59.8	64.4	68.8	4.65
	BW649	61.3	65.6	70.1	5.07
	BW656	59.9	64.6	69.2	5.38
	BW660	62.0	67.3	71.0	4.23
	BW661	61.5	65.8	69.6	3.88
	BW664	61.1	66.1	70.8	4.81
	BW665	61.6	66.5	69.4	5.25
	BW667	63.0	67.1	70.8	3.91
	BW672	63.0	68.1	71.9	5.43
	BW673A	63.1	67.7	71.6	4.83
	BW675	62.1	66.4	71.3	10.97
	BW676	59.8	67.3	71.2	4.21
	BW678	63.0	66.3	69.3	1.20
	BW680	60.8	65.3	70.1	4.94
	BW701	62.3	67.5	72.2	4.70
	BW706	63.0	67.3	71.3	4.94
	BW707	60.9	65.8	70.0	4.77
	BW708	61.7	65.5	68.8	6.11
	BW726	62.6	67.5	71.3	5.44
	BW755	60.8	65.8	70.6	5.18
	BW702	61.9	67.0	71.0	4.44
-	BW756	62.3	66.1	69.7	4.83

pUSN-2/p97-2BdUN1	BW625	62.7	68.2	73.8	4.27
	BW653	60.4	65.3	70.1	6.52
	BW704	60.9	66.2	70.2	4.19
	BW718	61.3	66.9	71.2	4.15
	BW719	62.2	67.2	71.7	5.32
	BW722	64.8	67.5	70.0	2.14
	BW740	63.4	67.9	72.3	5.67
	BW741	62.6	66.9	70.5	5.30
	BW742	64.6	67.9	72.0	6.66
	BW752	62.3	66.3	70.0	4.63

pUSN-1/pUSN-2/pUN1	BW685	62.6	65.5	69.0	2.60
	BW686A	61.9	66.3	70.2	4.45

PL 205 884 B1 cd tabeli 4

1	2	3	4	5	6
	BW714	63.0	67.6	71.3	3.53
	BW727	66.9	70.8	76.2	5.19
	BW728	62.0	66.3	70.4	5.70
	BW731	63.3	67.9	73.0	4.90

Dodatek 1

Przepis na 2x stężoną pożywkę MM1

Składniki	Objętość roztworu podstawowego na litr 2X stężonego środka
Makrosole MS (10 x roztwór podstawowy)	200 ml
Mikrosole L (100 x roztwór podstawowy) [nr kat. Sigma F-0518]	2 ml
FeNaEDTA MS (100 x roztwór podstawowy) [Katalog Sigma F-0518]	20 ml
Zmodyfikowane witaminy (x 1000)	1 ml
3 aminokwasowy roztwór (25 x roztwór podstawowy)	40 ml
Mioinozytol (nr katalogowy Sigma I-3011)	0,2 g
Sacharoza	180 g
AgNO3 (20 mg/ml roztworu podstawowego) dodany po sterylizacji przez filtry	1 ml
Picloram (1 m/ml roztworu podstawowego) dodany po sterylizacji przez filtry	4 ml

Sterylizować przez filtry i dodać do równej objętości roztopionego 2x żelu agarazowego (10 g/l) Przepis dla 2x stężonych pożywek R

Składniki	Objętość roztworu podstawowego na litr 2X stężonego środka
Macrosole L7 (10 x roztwór podstawowy)	200 ml
Mikrosole L (100 x roztwór podstawowy)	2 ml
FeNaEDTA MS (100 x roztwór podstawowy)	20 ml
Witaminy/Inozytol L2 (x 200)	10 ml
Roztwór 3 aminokwasów (25 x roztwór podstawowy)	40 ml
Maltoza	60 g
2,4-D (1 mg/ml r-ru podstawowego) dodany po sterylizacji filtrowej	200 pl
Mieszanka izomerów cis trans Zeatyny (nr kat. Melford Z-0917) (5 mg/ml r-ru podstawowego) dodany po sterylizacji przez filtry	2 ml

Sterylizować filtracyjnie i dodać do równej objętości łatwo topliwego 2x żelu agarazowego (16 g/l)

PL 205 884 B1

Dodatek 2

Przepisy na składniki MM1 i pożywki R. Mikrosole L (1000x r-r podstawowy)

	na 100 ml
MnSO4x7H2O	1,34 g
H3BO3	0,5 g
ZnSO4x7H2O	0,75 g
KI	75 mg
Na₂MoO₄x2H₂O	25 mg
CuSO₄x5H₂O	2,5 mg
CoCl2x6H2O	2,5 mg

Sterylizować przez filtr membranowy 22 μm. Przechowywać w 4°C

Makrosole MS (10X roztwór podstawowy)

	na litr
NH4NO3	16,5 g
KNO3	19,0 g
KH2PO4	1,7 g
MgSO4x7H2O	3,7 g
CaCl2x2H2O	4,4 g

NB.: CaCl2 rozpuścić przed zmieszaniem z innymi składnikami NB.: KH2PO4 przyrządzić osobno w sterylnej wodzie i dodać na końcu Roztwór należy przechowywać w 4°C po wyjęciu z autoklawu. Zmodyfikowane witaminy MS (1000x roztwór podstawowy)

	na 100 ml
Tiamina HCl	10 mg
Pirodyksyna HCl	50 mg
Kwas nikotynowy	50 mg

Roztwór należy przechowywać w podwielokrotnościach 10 ml w temperaturze -20°C Roztwór 3 aminokwasów (25x roztwór podstawowy)

	na litr
L-Glutamina	18,75 g
L-Prolina	3,75 g
L-Asparagina	2,5 g

Roztwór należy przechowywać w podwielokrotnościach 40 ml w temperaturze -20°C

PL 205 884 B1

Makrosole L7 (10X roztwór podstawowy)

	na litr
NH4NO3	2,5 g
KNO3	15,0 g
KH2PO4	2,0 g
MgSO4x7H2O	3,5 g
CaCl2x2H2O	4,5 g

nb.: CaCl2 rozpuścić przed zmieszaniem z innymi składnikami nb.: KH2PO4 przyrządzić osobno w sterylnej wodzie i dodać na końcu Roztwór należy przechowywać w 4°C po wyjęciu z autoklawu. Witaminy/ Inozytol (200x roztwór podstawowy)

200x r-r podstawowy	na 100 ml
Inozytol	4,0 g
Tiamina HCl	0,2 g
Pirodyksyna HCl	0,02 g
Kwas nikotynowy	0,02 g
Pantotenian Ca	0,02 g
Kwas askorbinowy	0,02 g

Atwell, W.A., Hood, L.F., Lineback, D.R., Varriano-Marston, E., and Zobel, H.F. (1988). The terminology and methodology associated with basic starch penomena. Cereal Foods World 33, 306-311.

Baba, T., Kimura, K., Mizuno, K., Etoh, H., Ishida, Y., Shida, O., and Arai, Y. (1991). Sequence conservation of the catalytic regions of amylolytic enzymes in maize branching enzyme-I. Biochem. Biophys. Res. Comm. 181(1): 87-94.

Barcelo P., and Lazzeri, P. (1995). Transformation of cereals by microprojectile bombardment of immature inflorescence and scutellum tissues. Methods in Molecular Biology - Plant Gene Transfer and Expression Protocols (vol 49), 113-123. Jones H [ed] Humana Press Inc., Totowa, NJ.

Block, M.de et al. (1987). EMBO J 6:2513-2518

Boyer, CD. and Priess, J. (1978). Multiple forms of (1-4)-a-D-Glucan, (1-4)-a-D-Glucan 6-glycosyl transferase from developing Zea mays L. kernals. Carbohydrate Res 61:321-334.

Burton, R.A., Bewley; J.D., Smith, A.M., Bhattacharyya, M.K., Tatge, H., Ring, S., Bull, V., Hamilton, W.D.O., and Martin, C. (1995). Starch branching enzymes belonging to distinct enzyme families are differentially expressed during pea embryo development. Plant J 7:1-13

Christensen, A.H., and Quail, P.H. (1996). Transgenic research, 5:213-218.

Donovan, J. W. (1979). Phase transitions of the starch-water system. Biopolym. 18, 263-275.

Fisher, D.K., Boyer, C.D., and Hannah, L.C. (1993). Starch branching enzyme II from maize endosperm. Plant Physiol. 102:1045-1046.

Fisher, D.K., Gao, M., Kim, K-N., Boyer, C.D., and Guiltinan, M.J. (1996). Two closely related cDNAs encoding starch branching enzyme from Arabidopis thaliana. Plant Mol. Biol. 30:97-108

Fromm ME, Taylor LP & Walbot V. (1986). Stable transformation of maize after gene transfer by electroporation. Nature 319: 791-793,

Fulton, T.M., Chunwongse, J., and Tanksley, S.D. (1995). Miniprep Protocol for Extraction of DNA from Tomato and other Herbaceous Plants, Plant Molecular Biology Reporter, 13 (3), pages 225-227.

PL 205 884 B1

Gao, M., Fisher, D.K., Kim, K-N., Shannon, J.C., and Guiltinan, M.J. (1997). Independent genetic control of maize starch-branching enzymes Ila and IIb: Isolation and characterisation of a Sbe2a cDNA. Plant Physiol. 114: 69-78.

Gaun, H.P., and Preiss, J. (1993). Differentiation of the properties of the branching isoenzymes from maize (Zea mays). Plant Physiol. 102: 1269-1273.

Goldsbrough AP, Belzile F, Yoder JI (1994). Complementation of the tomato anthocyanin without (aw) mutant using the dihydroflavonol 4-reductase gene. Plant Physiology 105, 491-496.

Islam, A.K.M.R. (1983). Ditelosomic additions of barley chromosomes to wheat. In Proc. 6th Int. Wheat Genet. Symp. 233-238. Kyoto, Japan.

Iack, P.L., Dimitrijevic, T.A.F., and Mayes S. (1994). Assessment of nuclear, nitochondrial and chloroplast RFLP markers in oil palm (Elaeis guineensis Jacq.) Theor. Appl. Genet. 90:643-649.

Jefferson RA (1987). Assaying chimaeric genes in plants: The GUS gene fusion system. Plant Molecular Biology Reporter 5 (4) 387-405.

Kennedy, J.F. and Cabalda, V.M.B. (1991). Bioactive carbohydrates in food. Chemistry in Britain, November, 1017-1019, 1026.

Khoshnoodi, J., Ek, B., Rask, L., and Larsson, H. (1993). Characterisation of the 97 and 103kDa forms of starch branching enzyme from potato tubers. FEBS 332 (1,2): 132-138.

Kossmann, J., Visser, R.G.F., Muller-Rober, B., Willmitzer, L., and Sonnewald, U. (1991).

Cloning and expression anaylsis of a potato cDNA that encodes branching enzyme: evidence for co-expression of starch biosynthetic genes. Mol. Gren. Genet 230: 39-44.

Liu et al (1995). Biochem Cell Biol 73: 19-30.

Martin, C., and Smith, A.M. (1995). Starch biosynthesis. Plant Cell 7:971-985.

Matzke & Matzke (1995). Plant Physiol. 107, 679-685.

Mizuno, K., Kawasaki, T., Shimada, H., Satoh, H., Kobayashi, E., Okumura, S., Arai, Y., and Baba, T. (1993). Alteration of the structural properties of starch components by the lack of an isoform of starch branching enzyme in rice seeds. J. Biol. Chem. 268(25): 19084-19091.

Morell, M.K., Rahman, S., Abrahams, S.L., and Appels, R. (1995). The biochemistry and molecular biology of starch synthesis in cereals. Auist. J. Plant Physiol. 22: 647-660.

Morell, M., Blennow, A., Kosar-Hashemi, B., and Samuel, M.S. (1997). Differential expression and properties of starch branching enzyme isoforms in developing wheat endosperm. Plant Physiol. 113:201-208.

Mousley, C.G. (1994). PhD Thesis, Wye College, University of London.

Nair, R.B., Baga, M., Scoles, G.J., Kartha, K.K., and Chibbar, R.N. (1997). Isolation, characterisation and expression analysis of a starch branching enzyme II cDNA from wheat. Plant Sci. 122:153-163.

Nakamura, Y., Takeichi, T., Kawaguchi, K., and Yamanouchi, H. (1992). Purification-of two forms of starch branching enzyme (Q-enzyme) from developing rice endosperm. Physiol. Plant 84: 329-335.

Nakamura, Y., and Yamanouchi, H. (1992). Nucleotide sequence of a cDNA encoding starch-branching enzyme, or Q-enzyme I, from rice endosperm. Plant Physiol. 99:1265-1266.

Preiss, J. (1991). Biology and molecular biology of starch synthesis and regulation. In Oxford Surveys Plant Mol. Cell Biol. 7:59-114.

Rahman, S., Abrahams, S., Abbott, D., Mukai, Y., Samuel, M., Morrell, M., and Appels, R. (1997). A complex arrangement of genes at a starch branching enzyme I locus in the D-genome donor of wheat. Genome 40:465-474.

Rapellin, A et al.1997. Isolation of a starch branching enzyme I cDNA from a wheat endosperm library. EMBL database accession Y12320.

Russell, D.A. and Fromm, M.E. (1977). Tissue-specific expression in transgenic maize of four endosperm promoters from maize and rice. Transgenic Research 6: 157-168.

Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY.

Salehuzzaman, S.N.I.M., Jacobsen, E., and Visser, R.G.F. (1992). Cloning, partial sequencing and expression of a cDNA coding for branching enzyme in cassava. Plant Mol. Biol. 20:809-819.

Sears, E.R. (1966). In Chromosome manipulations and plant genetics Edited by R. Riley and K.R. Lavis, Oliver and Boyd, Edinburgh. pp29-45.

Sheeny et al (1988). PNAS 85, 9905-8809.

PL 205 884 B1

Smith, A.M. (1988). Major differences in isoforms of starch-branching enzyme between developing embryos of round- and wrinkled-seeded peas (Pisum sativum L.). Planta 175:270-279.

Shure, M et al 1983. Cell 35: 225-233.

Sun, C., Sathish, P., Deiber, A., and Jansson, C. (1995). Multiple starch branching enzymes in barley endosperm. In Photosynthesis from light to biosphere. P. Mathis (ed.) Vol. V:317-320.

Sun, C., Sathish, P., Ahlandsberg, S., and Jansson, C. (1998). The two genes encoding starch-branching enzymes IIa and lIb are differentially expressed in Barley. Plant Physiol. 118:37-49 (earliest electronic publication date 10th September 1998).

Svegmark, K. and Hermansson, A-M. (1990). Shear induced changes in the viscoelastic behaviour of heat treated potato starch dispersions. Carboyd. Polym. 13, 29-45.

Takeda, Y., Gaun, H.P., and Preiss, J. (1993). Branching of amylose by the branching isoenzymes of maize endosperm. Carbohydrate Res. 240:252-263.

Van der Krol et al, Mol Gen. Genet. 220, 204-212.

PL 205 884 B1

Lista sekwencji <110> Monsanto UK Ltd.

<120> Sekwencje nukleotydowe, konstrukt kwasu nukleinowego, wektor ekspresyjny, sekwencja aminokwasowa, sposób transformowania rośliny, transgeniczna roślina, transgeniczna komórka roślinna i część rośliny transgenicznej <130> C397.01/U <140>

<141>

<150>EP 98307337.0 <151> 1998-09-10 <160> 55 < 170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 2307 <212> DNA <213> Triticum aestivum <400> 1

catygacggc	cagtgacttc	gagctcggta	cccggggatc	cgatttggtg	tgtgggagat	60
gttcttgcca	aacaatgcag	atggttcgcc	accaattcct	cacggctcac	gggtgaaggt	120
gagaatggat	actccatctg	ggataaagga	ttcaattcct	gcttggatca	agtactccgt	180
gcagactcca	ggagatatac	catacaatgg	aatatattat	gatcctcccg	aagaggagaa	240
gtatgtattc	aagcatcctc	aacctaaacg	accaaaatca	ttgcggatat	atgaaacaca	300
tgttggcatg	agtagcccgg	aaccaaagat	caacacatat	gcaaacttca	gggatgaggt	360
gcttccaaga ·	attaaaagac	ttggatacaa	tgcagtgcaa	ataatggcaa	tccaggagca	420
ctcatactat	ggaagctttg	ggtaccatgt	taccaatttc	tttgcaccaa	gtagccgttt	480
tgggtcccca	gaagatttaa	aatctttgat	tgatagagct	cacgagcttg	gcttggttgt	540
cctcatggat	gttgttcaca	gtcacgcgtc	aaataatacc	ttggacgggt	tgaatggttt	600
tgatggcacg	gatacacatt	acttccatgg	cggttcacgg	ggccatcact	ggatgtggga	660
ttcccgtgtg	tttaactatg	ggaataagga	agttataagg	tttctacttt	ccaatgcaag	720
atggtggcta	gaggagtata	agtttgatgg	tttccgattc	gatggcgcga	cctccatgat	780
gtatacccat	catggattac	aagtaacctt	tacaggaagc	taccatgaat	attttggctt	840
tgccactgat	gtagatgcgg	tcgtttactt	gatgctgatg	aatgatctaa	ttcatgggtt	900
ttatcctgaa	gccgtaacta	tcggtgaaga	tgttagtgga	atgcctacat	ttgcccttcc	960
tgttcaagtt	ggtggggttg	gttttgacta	tcgcttacat	atggctgttg	ccgacaaatg	1020
gattgaactt	ctcaaaggaa	acgatgaagc	ttgggagatg	ggtaatattg	tgcacacact	1080
aacaaacaga	aggtggccgg	aaaagtgtgt	tacttatgct	gaaagtcacg	atcaagcact	1140
ggttggagac	aagactattg	cattctggtt	gatggacaag	gatatgtatg	atttcatggc	1200
tctgaacgga	ccttcgacac	ctagtattga	tcgtggaata	gcactgcata	aaatgattag	1260
acttatcaca	atgggtttag	gaggagaggg	ttatcttaac	tttatgggaa	atgagttcgg	1320
gcatcctgaa	tggatagact	ttccaagagg	cccacaagta	cttccaactg	gtaagttcat	1380
cccaggaaac	aacaacagtt	acgacaaatg	ccgtcgaaga	tttgaccagg	gtgatgcaga	1440

PL 205 884 B1

atttcttagg	taccatggta	tgcagcagtt	tgatcaggcg	atgcagcacc	ttgaggaaaa	1500
atatggcttt	a^gacatcag	accaccagta	cgtatctcgg	aaacatgagg	aagataaggt	1560
gatcgtgttt	gs.&aaaggęg	acttggtatt	tgtgttcaac	ttccactgga	gtaatagcta	1620
tttcgactac	cgggttggct	gtttaaagcc	tgggaagtac	aagęttgtct	tagactcaga	1630
cgccggactc	ttrggtggat	ttggtaggat	ccatcacact	gcagagcac-	tcacttctęa	1740
ctgccaacat	gacaacaggc	cccattcctt	cccagcgcac	actcctacca	gaacctgtgt	1800
tgtctatgct	ccaatgaact-	aaacagcaaa	gtgcagcata	cgcatgcacg	ctgttgttgc	1860
taacactagc	aagaaaaaat	cgtatggtca	atacaaccag	gtgcaaggtt	taataagggt	1920
ttccttcaac	gag~cctgga	tagacaagac	aacatcarga	tgtgctctgt	gctcccaaat	1980
tcccagggcg	ttgcggagaa	aaaatgctca	tctgtgztac	tttatggatc	agggangaaa	2040
cctcccccaa	anaccccctt	tttttttgaa	aggnggarag	gcccccggtn	tctgcatntg	2100
gatgcctcct	taaatntttg	tagccataaa	ccattgczag	tgtcctntaa	attgacagtt	2160
tagaatagng	gt^ntactcr	tgtattttnt	ttttgacact	tagactgtat	tcctcaaata	2220
atccacatgt	tgtztac^cg	aagntgagaa	ataaaarcag	agattgnagn	aaaaaaaaaa	2280
aaaaaaaaaa	aaaaaaaaaa	aaaaaaa				2307

<2±0> 2 <211> 758 ;

<212> PRT <213> Triticun aestivum

<400> 2

Ile

Arg

Phe

Gly 15

Val

Ile 1

Asp

Gly

Gin

Leu 5

Arg

Ala

Arg

Tyr

Pro 10

Gly

Tr?

Glu

Ket

Phe 20

Leu

Pro

Asn

Ala 25

Asp

Gly

Ser

Pro

Pro 30

Ile

Pro

His

Gly

Ser 35

Arg

Val

Lys

Val

A.rg 40

Met

Asp

Thr

Pro

Ser 45

Gly

Ile

Lys

Asp

Ser 50

Ile

Pro

Ala

Trp

Ile 55

Lys

Tyr

Ser

Val

Gin 60

Thr

Pro

Gly

Asp

Ile 65

Pro

Tyr

Asn

Gly

Ile 70

Tyr

Asp

Pro

Pro 75

Glu

Lys

Tyr 80

Val

Phe

Lys

His

Pro 85

Gin

Pro

Lys

Arg

Pro 50

Lys

Ser

Leu

Arg

Ile 95

Tyr

Glu

Thr

His

Val 100

Gly

Met

Ser

Pro 105

Glu

Pro

Lys

Ile

Asn 110

Thr

Tyr

Ala

Asn

Phe 115

Arg

Asp

Glu

Val

Leu 120

Pro

Arg

7 1 λ

Lys

Arg 125

Leu

Gly

Tyr

Asn

Ala 130

Val

Gin

Ile

Met

Ala 135

Ile

Gin

Glu

His

Ser 140

Tyr

Gly

Ser

PL 205 884 B1

Phe 145

Gly

Tyr

His

Val

Thr 150

Asn

Phe

Ala

Pro 155

Ser

Arg Phe

G1 y 160

Ser

Pro

Glu

Asp

Leu 165

Lys

Ser

Leu

Ile

Asp 170

Arg

Ala

His

Glu Leu 175

Gly

Leu

Val

Leu 180

Met

Asp

Val

His 185

Ser

His

Al a

Ser

Asn Asn 190

Thr

Leu

Asp

Gly 195

Leu

Asn

Gly

Phe

Asp 200

Gly

Thr

Asp

Thr

His 205

Tyr Phe

His

Gly

Gly 210

Ser

Arg

Gly

His

His 215

Trp

Met

Trp

Asp

Ser 220

Arg

Val Phe

Asn

Tyr 225

Gly

Asn

Lys

Glu

Val 230

Ile

Arg

Phe

Leu

Leu 235

Ser

Asn

Ala Arg

Trp 240

Trp

Leu

Glu

Tyr 245

Lys

Phe

Asp

Gly

Phe 250

Arg

Phe

Asp

Gly Ala 255

Thr

Ser

Met

Tyr 260

Thr

His

Gly

Leu 265

Gin

Val

Thr

Phe

Thr Gly 270

Ser

Tyr

His

Glu 275

Tyr

Phe

Gly

Phe

Ala 280

Thr

Asp

Val

Asp

Ala 285

Vai Val

Tyr

Leu

Met 2S0

Leu

Met

Asn

Asp

Leu 295

Ile

His

Gly

Phe

Tyr 300

Pro

Glu Ala

Val

Thr 305

Ile

Gly

Glu

Asp

Val 310

Ser

Gly

Met

Pro

Thr 315

Phe

Ala

Leu Pro

Val 320

Gin

Val

Gly

Val 325

Gly

Phe

Asp

Tyr

Arg 330

Leu

His

Met

Ala Val 335

Ala

Asp

Lys

Trp

Ile 340

Glu

Leu

Lys

Gly 345

A.sn

Asp

Glu

Ala

Trp Glu 350

Met

Gly

Asn

Ile 355

Val

His

Thr

Leu

Thr 360

Asn

Arg

Trp

Pro 365

Glu Lys

Cys

Val

Thr 370

Tyr

Ala

Glu

Ser

His 375

Asp

Gin

Ala

Leu

Val 380

Gly

Asp Lys

Thr

Ile

Ala

Phe

Trp

Leu

Met

Asp

Lys

Asp

Met

Tyr

Asp

Phe

Met Ala

Leu

385 390 395 400

PL 205 884 B1

Asn Gly Pro Ser Thr Pro Ser Ile Asp Arg Gly Ile Ala Leu His Lys 405 4io ₄₁₅

Met Ile Arg Leu Ile Thr Met Gly Leu Gly Gly Glu Gly Tyr Leu Asn

420

425

430

Phe

Met

Gly

Asn

Glu

Phe

Gly

His

Pro

C-iu

Trp

Ile

Asp Phe Pro

Arg

435

440

445

Gly

Pro

Gin

Vai

Leu

Pro

Thr

Gly

Lys

Phe

Ile

Pro

Gly Asn Asn

Asn

450

455

460

Ser

Tyr

Asp

Lys

Cys

Arg

Phe

Asp

Gin

Gly

Asp Ala Glu

Phe

465

470

475

4B0

Leu

Arg

Tyr

His

Gly

Met

Gin

Phe

Asp

Gin

Ala

Met Gin His

Leu

485

490

495

Glu

Lys

Tyr

Gly

Phe

Met

Thr

Ser

As.p

His

Giń

Tyr Val Ser

Arg

500

505

510

Lys

His

Glu

Asp

Lys

Val

Ile

Val

Phe

Glu

Lys

Gly Asp Leu

Val

515

520

525

Phe

Val

Phe

Asn

Phe

His

Trp

Ser

Asn

Ser

Tyr

Phe

Asp Tyr Arg

Val

530

535

540

Gly

Cys

Leu

Lys

Pro

Gly

Lys

Tyr

Lys

Val

Vai

Leu

Asp Ser Asp

Ala

545

550

555

560

Gly

Leu

Phe

Gly

Phe

Gly

Arg

Ile

His

Thr

Ala Glu His

Phe

565

570

575

Thr

Ser

Asp

Cys

Gin

His

Asp

Asn

Arg

Pro

His

Ser

Phe Ser Val

Tyr

580

585

590

Thr

Pro

Ser

Arg

Thr

Cys

Val

Vai

Tyr

Ala

Pro

Met

Asn Thr Ala

Lys

595

600

605

Cys

Ser

Ile

Arg

Met

His

Ala

Val

Ala

Ser

Thr

Ser Lys Lys

Lys

610

615

620

Ser

Tyr

Gly

Gin

Tyr

Asn

Gin

Val

Gin

Gly

Leu

Ile

Arg Val Cys

Phe

625

630

635

640

Asn

Glu

Ser

Trp

Ile

Asp

Lys

Thr

Cys

Ala

Leu

Cys Ser Gin

Ile

645

650

655

PL 205 884 B1

Pro

Arg

Ala

Leu 660

Trp

Arg

Lys

Asn

Ala 665

His

Leu

Cys

Tyr

Phe 670

Met

Asp

Gin

Gly

Xaa

Asn

Leu

Pro

Gin

Xaa

Pro

Leu

Phe

Leu

Lys

Gly

675

680

685

Ala

Pro

Gly

Xaa

Cys

Xaa

Trp

Met

Pro

Xaa

Phe

Val

Ala

Ile

Asn

690

695

700

His

Cys

Pro

Xaa

Asn

Gin

Phe

Arg

Ile

Xaa

Val

Xaa

Leu

Tyr

705

710

715

720

Phe

Xaa

Phe

Asp

Ser

Thr

Val

Phe

Leu

Lys

Ser

Thr

Cys

Leu

725

730

735

Glu

Xaa

Glu

Lys

Asn

Gin

Arg

Leu

Xaa

Lys

740

745

750

Lys

Asn

755 <210> 3 <211> 1036 <212> DNA <213> Triticum aestivum <400> 3 atgtatgatt tcatggctct gaacggacct tcgacgccta atattgatcg tggaatagca 60 ctgcataaaa tgattanact tatcacaatg ggtttaggcg gagagggtta tcttaacttt 120 atgggaaatg agttcgggca tcctgaatgg atagactttc caagaggccc acaagtactt 180 ccaagtggta agttcatccc aggaaacagc aacagttacg acaaatgccg Łcaaagattt 240 gacctgggtg atgcagaatt tcttaggtat catggtatgc agcagtttga tcaggcaatg 300 cagcatcttg aggaaaaata tggttttatg acatcagacc accagtacgt atctcggaaa 350 cacgaggaag ataaggtgat cgtgtttgaa aaaggggact tggtatttgt gttcaacttc 420 cactggagta atagctattt cgactaccgg gtcggctgtt taaagcctgg gaagtacaag 480 gtggtcttag actcagacgc tggactcttt ggtggatttg gtaggatcca tcacactgca 540 gagcacttca cttctgaccg ccaacatgac aacaggcccc attcgttctc agtgtacact 600 cctagcagaa cctgtgttgt ctatgctcca atgaactaac agcaaggtgc agcatacgcg 660 tgcgcgctgt tgttgctagt agcaagaaaa atcgtacggt caatacagcc aggtgcaagg 720 tttaataagg attttttgct tcaacgagtc ctggatagac aagacaacat gatgttgtgg 780 cgtgtgctcc caatccccag ggcgttgtga agaaaacatg ctcatctgtg ttatgatttt 840 atggatcagc qacgaaactt cccccaaata cecatgcctc cttaaatctt tgtggccgta 900 aaccattgct agtgtcctct aaattgacag tttagcatag aggttttact tttgtatctt 960 ctttttgaca gttagacttt attcctcaaa taatcgacca gtcgtttact cgaaaaaaaa 1020 aaaaaaaaaa aaaaan 1036

PL 205 884 B1 <210> 4 <211> 1087 <212> DNA <213> Triticum aestivum <400> 4

atgtatgatt	tcatggctct	gaacggacct	tcgacaccta	atattgatcg	”2uć32ęC2	60
ctgcataaaa	tgattagact	tatcacaatg	ggtttaggag	gagagggtta	tcttaacttt	120
atgggaaatg	agctcgggca	tcctgaatgg	atagactttc	caagaggccc	acaagcactt	180
ccaactggta	agttcatccc	nngaaacaac	aacagttacg	acaaatgccg	tcęaaaattt	240
gacctgggtg	atgcagaatt	tcttaggtat	catggtatgc	agcagtttga	tcaggcgatg	300
cagcatcttg	aggaaaaata	tggctttatg	acatcagacc	accagtacgt	atctcgaaaa	360
catgaggaag	ataaggtgat	cgtgtttgaa	aaaggggact	tggtatttgt	gttcaacttc	420
cactggagta	atagctattt	cggctaccgg	gttggctgtt	taaagcctgg	gaagcacaag	480
gttgtcttag	actcagacgc	cggactcttt	ggtggatttg	gtaggatcca	tcacactgca	540
gagcacttca	cttctgactg	ccaacatgac	aacaggcccc	attcgttctc	agtgtacact	600
cctagcagaa	cctgtgttgt	ctatgctcca	atgaactaaa	cagcaaagtg	cagcatacgc	660
atgcacgctg	ttgttgctag	cactagcaag	aaaaaatcgt	atggtcaata	caaccaggtg	720
caaggtttaa	taagggtttt	tgcttcaacg	agtcctggat	agacaagaca	acatgatgat	780
gtgctctgtg	ctcccaaatt	cccagggcgt	tgngnggaaa	acatgctcat	ctgtgttatc	840
attttatgga	tcagngngga	aacctccccc	aaatacccat	gcctccttaa	acttttgtgg	900
tcctaaacca	tggctactat	cctctaaatt	ggcagtttag	catagaggtt	ttacttttgt-	960
aaattttttt	tgacagttaa	tagactctat	tcctcaaata	attgacatgt	cctttacaag	1020
aagatgagaa	ataaaatcag	ggattgaaga	atccc.aaaag	ctaaaaaaaa	aaaaaaaaaa	1080
aaaaaaa						1087

<210> 5 <211> 1120 <212> DNA <213> Triticum aestivum <400 5

atgtatgatt	tcatggcgct	gaacggacct	tcgacgccta	atattgatcg	tggaatagca	60
ctgcataaaa	tgattagact	tatcacaatg	•ggtctaggag	gagagggtta	tcttaacttt	120
atgggaaatg	agttcgggca	tcctgaatgg	atagactttc	caagaggccc	acaagtactt	180
ccaagtggta	agttcatccc	aggaaacaac	aacagttacg	acaaatgccg	tcgaagattt	240
gacctgggtg	atgcagaatt	tcttaggtat	catggtatgc	agcagtttga	tcaggcaatg	300
cagcatcttg	aggaaaaata	tggttttatg	acatcagacc	accagtacgt	ttcccggaaa	360
catgaggaag	ataaggtgat	cgtgtttgaa	aaaggggact	tggtatttgt	gttcaacttc	420
cactggagta	gcagctattt	cgactaccgg	gtcggctgtt	taaagcctgg	gaagtacaag	480
gtggtcttag	actcggacgc	cggactcttt	ggtggatttg	gtaggatcca	tcacactgca	540
gagcacttca	cttctgactg	ccaacatgac	aacaggcccc	attcattctc	agtgtacact	600
cctagcagaa	cctgtgttgt	ctatgctcca	atgaactaac	agcaaagtgc	agcatacgcg	660
tgcgcgctgt	tgttgctagt	agcaagaaaa	atcgtatggt	caatacaacc	aggtgcaagg	720
tttaataagg	atttttgctt	caacgagtcc	tggatagaca	agacaacatg	atgttgtgct	780
gtgtgctccc	aatccccagg	gngttgtgaa	gaaaacatgc	tcatctgtgt	tattttatgg	840
atcagggang	aaacctcccc	caaanacccc	tttttttttt	gaaaggngga	taggcccccg	900
gtntctgcat	ntggatgcct	ccttaaatnt	ttgtagccat	aaaccattgc	tagtgtcctn	960

PL 205 884 B1

taaatŁgaca tattcctcaa aęnaaaaaaa	gtttagaata acaazcgaca aaaaaaaaaa	gnggttntac tgttgtttac aaaaaaaaaa	ttttgtattt tcgaagntga aaaaaaaaaa	tntttttgac gaaataaaat	agttagactg cagagattgn	1020 1080 1120
<210> 6
<211> 979
<212> DNA
<213> Triticum aestivum
<400 6
atatgtatga	tttcatggct	ctggataggc	cttcaactcc	tegeattgat	cgtggcatag	60
cattacataa	aatgatcagg	cttgtcacca	tgggtttagg	tggtgaaggc	tatcttaact	120
tcatgggaaa	tgagtttggg	catcctgaat	ggatagattt	tccaagaggc	ccacaaactc	180
ttccaaccgg	caaagttctc	cctggaaata	acaatagtta	tgataaatgc	cgccatagat	240
ttgatcttgg	agatgcagat	tttcttagat	atcgtggtat	gcaagagttc	gatcaggcaa	300
tgcagcatct	tgaggaaaaa	tatgggttta	tgacatctga	gcaccagtat	gtttcacgga	360
aacatg-agga	agataaggtg	atcttcttcg	aaagaggaga	tttggtattt	gttttcaact	420
tccactggag	caatagcttt	tttgactacc	gtgttgggtg	ttccaagcct	gggaagtaca	480
aggtggcctt	ggactccgac	gatgcactct	ttggtggatt	cagcaggctt	gateatgatg	540
tcgactactt	cacaaccgaa	catccgcatg	acaacaggcc	gcactctttc	tcggtgtaca	600
ctccgagcag	aactgcggtc	gtgtatgccc	ttacagagta	agaaccagca	gcggcttgtt	660
acaaggcaaa	gagagaactc	cagagagctc	gtggatcgtg	agcgaagcga	cgggcaacgg	720
cgcgaggctg	ctccaagcgc	catgactggg	aggggatcgt	gcntcttccc	cagatgccag	780
gaggagcaga	tggataggta	gcttgttggt	gagegetega	aagaaaatgg	acgggcctgg	840
gtgtttgttg	tgctgcactg	aaccctcctc	etatettgea	cattcccggt	tgtttttgta	900
catataacta	ataattgccc	gtgcgcttca	acatgaacat	ataaatattc	taataggtta	960
aaaaaaaaaa	aaaaaaaaa					979

<210> 7 <211> 212 <212> PRT <213> Triticum aestivum

<400 7

Ala

Leu

Asn

Gly

Pro 10

Ser

Thr

Pro

Asn

Ile 15

Asp

Met 1

Tyr

Asp

Phe

Met 5

Arg

Gly

Ile

Ala 20

Leu

His

Lys

Met

Ile 25

Arg

Leu

Ile

Thr

Met 30

Gly

Leu

Gly

Glu 35

Gly

Tyr

Leu

Asn

Phe 40

Met

Gly

Asn

Glu

Phe 45

Gly

His

Pro

Glu

Trp 50

Ile

Asp

Phe

Pro

Arg 55

Gly

Pro

Gin

Val

Leu 60

Pro

Ser

Gly

Lys

Phe 65

Ile

Pro

Gly

Asn

Ser 70

Asn

Ser

Tyr

A.sp

Lys 75

Cys

Arg

Phe BO

PL 205 884 B1

Asp

Leu

Gly

Asp

Ala 85

Glu

Phe

Leu

Arg

Tyr 20

His

Gly

Met

Gin

Gir. 95

Phe

Asp

Gin

Ala

Met

Gin

His

Leu

Glu

Lys

Tyr

Gly

Phe

Met

Thr

Ser

100

105

110

Asp

His

Gin

Tyr

Val

Ser

Arg

Lys

His

Glu

Asp

Lys

Val

Ile

Val

115

120

125

Phe

Glu

Lys

Gly

Asp

Leu

Val

Phe

Val

Phe

Asn

Phe

His

Trp

Ser

Asn

130

13S

140

Ser

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Arg

val

Gly

Cys

Leu

Lys

Pro

Gly

Lys

Tyr

Lys

145

150

155

160

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Ala

Gly

Leu

Phe

Gly

Phe

Gly

Arg

Ile

-

165

170

175

His

Thr

Ala

Glu

His

Phe

Thr

Ser

Asp

Cys

Gin

His

Asp

Asn

Arg

180

185

190

Pro

His

Ser

Phe

Ser

val

Tyr

Thr

Pro

Ser

Arg

Thr

Cys

Val

Tyr

195

200

205

Ala

Pro

Met

Asn

210 <210> 8 <211> 378 <212> DNA <213> Triticum aestivum <400> 8 actaacagca aggtgcagca tacgcgtgcg cgctgttgtt gctagtagca agaaaaatcg 60 tacggtcaat acagccaggt gcaaggttta ataaggattt tttgcttcaa cgagtcctgg 120 atagacaaga caacatgatg ttgtggcgtg tgctcccaat ccccagggcg ttatgaagaa 180 aacatgctca tctgtgttat gattttatgg atcagcgacg aaacttcccc caaataccca 240 tgcctcctta aatctttgtg gccgtaaacc attgctagtg tcctctaaat tgacagttta 300 gcatagaggt tttacttttg Łatcttcttt ttgacagtta gactttattc ctcaaataat 360 cgaccagtcg tttactcg 378 <210> 9 <211> 449 <212> DNA <213> Triticum aestivum

PL 205 884 B1

<400> 9
aactaacagc	aaagtgcagc	atacgcgtgc	gcgctgttgt	tgctagtagc	aaaaaaaatc	60
gtatggtcaa	tacaaccagg	tgcaaggttt	aataaggatt	tttgcttcaa	cgagtcctgg	120
atagacaaga	caacatgatg	ttgtgctgtg	tgctcccaat	ccccagggng	ttgtgaagaa	180
aacatgctca	tctgrgttat	tttatggatc	agggangaaa	cctcccccaa	anaccccttt	240
tttttttgaa	aggnggatag	gcccccggtn	tctgcatntg	gatgcctcct	taaatntttg	300
tagccataaa	ccarrgctag	tgtccrntaa	attgacagtt	tagaatagr.ę	gttntacttt	360
tgtattttnt	ttttgacagt	tagactgtat	tcctcaaata	atcgacatgt	tgtttactcg	420
aagntgagaa	ataaaatcag	agattgnag				449

<210> 10 <211> 428 <212> DNA <213> Triticum aestivum

<400> 10
actaaacagc	aaagtgcagc	atacgcatgc	acgctgttgt	tgctagcacc	agcaagaaaa	60
aatcgtatgg	tcaatacaac	caggtccaag	gtttaataag	ggtttttgcr	tcaacgagtc	120
ctggatagac	aagacaacat	gatgatgtgc	tctgtgctcc	caaattccca	ggęcgttgng	180
nggaaaacat	gcrcatctgt	gttatcattt	tatggatcag	ngnggaaacc	tcccccaaat	240
acccatgcct	ccttaaactt	ttgtggtcct	aaaccatggc	tactatcctc	taaattggca	300
gtttagcata	gaggttttac	ttttgtaaat	tttttttgac	agttaataga	ctctattcct	360
caaataattg	acargtcctt	tacaagaaga	tgagaaataa	aatcagggat	tgaagaatcc	420

caaaagct 428 <210> 11 <211> 592 <212> PRT <213> Triticum aestivum <400> 11

Phe 1

Gly

Val

Trp

Glu 5

Met

Phe

Leu

Pro

A.sn 10

Asn

Ala

Asp

Gly

Ser 15

Pro

Ile

Pro

His 20

Gly

Ser

Arg

Val

Lys 25

Val

Arg

Met

Asp

Thr 30

Pro

Ser

Gly

Ile

Lys 35

Asp

Ser

Ile

Pro

Ala 40

Trp

Ile

Lys

Tyr

Ser 45

Val

Gin

Thr

Pro

Gly 50

Asp

Ile

Pro

Tyr

Asn 55

Gly

Ile

Tyr

Asp 60

Pro

Glu

Glu 65

Lys

Tyr

Val

Phe

Lys 70

His

Pro

Gin

Pro

Lys 75

Arg

Pro

Lys

Ser

Leu 80

Arg

Ile

Tyr

Glu

Thr

His

Val

Gly

Met

Ser

Pro

Glu

Pro

Lys

Ile

90 95

PL 205 884 B1

Asn Thr Tyr Ala Asn Phe Arg Asp Glu Val Leu Pro Arg Ile Lys Arg 100 105 110

Leu Gly Tyr Asn Ala Val Gin Ile Met Ala Ile Gin Glu His Ser Tyr 115 120 125

Tyr Gly Ser Phe Gly Tyr His Val Thr Asn Phe Phe Ala Pro Ser Ser 130 135 140

Arg Phe Gly Ser Pro Glu Asp Leu Lys Ser Leu Ile Asp Arg Ala His

145 150 155 ISO

Glu Leu Gly Leu Val Val Leu Met Asp Val Val His Ser His Ala Ser

165 170 175

Asn Ast Thr Leu Asp Gly Leu Asn Gly Phe Asp Gly Thr Asp Thr His 180 185 190

Tyr Phe His Gly Gly Ser Arg Gly His His Trp Met Trp Asp Ser Arg 195 200 205

Val Phe Asn Tyr Gly Asn Lys Glu Val Ile Arg Phe Leu Leu Ser Asn 210 215 220

Ala Arg Trp Trp Leu Glu Glu Tyr Lys Phe Asp Gly Phe Arg Phe Asp '225 230 235 240

Gly Ala Thr Ser Met Met Tyr Thr His His Gly Leu Gin Val Thr Phe

245 250 255

Thr Gly Ser Tyr His Glu Tyr Phe Gly Phe Ala Thr Asp Val Asp Ala 260 265 270

Val Val Tyr Leu Met Leu Met Asn Asp Leu Ile His Gly Phe Tyr Pro 275 280 285

Glu Ala Val Thr Ile Gly Glu Asp Val Ser Gly Met Pro Thr Phe Ala 290 295 300

Leu Pro Vai Gin Val Gly Gly Val Gly Phe Asp Tyr Arg Leu His Met

30S 310 315 320

Ala Val Ala Asp Lys Trp Ile Glu Leu Leu Lys Gly Asn Asp Glu Ala

325 330 335

Trp Glu Met Gly Asn Ile Val His Thr Leu Thr Asn Arg Arg Trp Pro 340 345 350

PL 205 884 B1

G1 u

Lys

Cys 255

Val

Thr

Tyr

Ala

Glu 360

Ser

His

Asp

Gin

Ala 365

Leu

Val

Gly

Asp

Lys

Thr

Ile

AJ a

Phe

Trp

Leu

Met

Asp

Lys

Asp

Met

Tyr

f.sp

Phe

370

375

380

Met

Ala

Leu

Asn

Gly

Pro

Ser

Thr

Pro

Ser

Ile

Asp

Arg

Gly

Ile

Ala

385

290

395

400

Leu

His

Lys

Met

Ile

Arg

Leu

Ile

Thr

Met

Gly

Leu

Gly

Glu

Gly

405

410

415

Tyr

Leu

Asn

Phe

Met

Gly

Asn

Glu

Phe

Gly

His

Pro

Glu

Trp

Ile

Asp

420

425

430

Phe

Pr.o

Arg

Gly

Pro

Gin

Val

Leu

Pro

Thr

Gly

Lys

Phe

Ile

Pro

Gly

435

-

440

445

Asn

Ser

Tyr

Asp

Lys

Cys

Arg

Phe

Asp

Gin

Gly

Asp

450

455

460

Ala

Glu

Phe

Leu

Arg

Tyr

His

Gly

Met

Gin

Phe

Asp

Gin

Ala

Met

465

470

475

480

Gin

His

Leu

Glu

Lys

Tyr

Gly

Phe

Met

Thr

Ser

Asp

His

Gin

Tyr

485

490

495

Val

Ser

Arg

Lys

His

Glu

Asp

Lys

Val

Ile

Val

Phe

Glu

Lys

Gly

500

505

510

Asp

Leu

Val

Phe

Val

Phe

Asn

Phe

His

Trp

Ser

Asn

Ser

Tyr

Phe

Asp

515

520

525

Tyr

Arg

Val

Gly

Cys

Leu

Lys

Pro

Gly

Lys

Tyr

Lys

Val

Leu

Asp

530

535

540

Ser

Asp

Ala

Gly

Leu

Phe

Gly

Phe

Gly

Arg

Ile

His

Thr

Ala

545

550

555

560

Glu

His

Phe

Thr

Ser

Asp

Cys

Gin

His

Asp

Asn

Arg

Pro

His

Ser

Phe

565

570

575

Ser

Val

Tyr

Thr

Pro

Ser

Arg

Thr

cys

Val

Tyr

Ala

Pro

Met

Asn

580

585

590

PL 205 884 B1 <210> 12 <211> 771 <212> PRT <213> Triticum aestivum <400> 12

Ser

Arg

Ala

Ser

Pro

Gly

Lys

Val

Leu

Val

Pro

Asp

Gly

Glu

Ser

1

5

10

15

Asp

Leu

A-l a

Ser

Pro

Ma

Gin

Pro

Glu

Leu

Gin

Ile

Pro

Glu

20

25

30

Asp

Ile

Glu

Gin

Thr

Ala

Glu

Val

Asn

Met

Thr

Gly

Thr

Ala

35

40

45

Glu

Lys

Leu

Glu

Ser

Glu

Pro

Thr

Gin

Gly

Ile

Val

Glu

Thr

Ile

50

55

60

Thr

Asp

Gly

Val

Thr

Lys

Gly

Val

Lys

Glu

Leu

Val

Gly

Glu

Lys

65

70

75

30

Pro

Arg

Val

Vai

Pro

Lys

Pro

Gly

Asp

Gly

Gin

Lys

Ile

Tyr

Glu

Ile

85

90

95

Asp

Pro

Thr

Leu

Lys

Asp

Phe

A.rg

Ser

His

Leu

Asp

Tyr

Arg

Tyr

Ser

100

105

110

Glu

Tyr

Arg

Ile

Arg

Ala

Ile

Asp

Gin

His

Glu

Gly

Leu

115

120

125

Glu

Ala

Phe

Ser

Arg

G1 y

Tyr

Glu

Lys

Leu

Gly

Phe

Thr

Arg

Ser

Ala

130

135

140

Glu

Gly

Ile

Thr

Tyr

Arg

Glu

Trp

Ala

Pro

Gly

Ala

His

Ser

Ala

145

150

155

160

Leu

Val

Gly

Asp

Phe

Asn

Trp

Asn

Pro

Asn

Ala

Asp

Thr

Met

Thr

165

170

175

Arg

Asp

Tyr

Gly

Val

Trp

Glu

Ile

Phe

Leu

Pro

Asn

Ala

Asp

130

185

190

Gly

Ser

Pro

Ala

Ile

Pro

His

Gly

Ser

Arg

Val

Lys

Ile

Arg

Met

Asp

195

200

205

Thr

Pro

Ser

Gly

Val

Lys

Asp

Ser

Ile

Ser

Ala

Trp

Ile

Lys

Phe

Ser

PL 205 884 B1

210

215

220

Val

Gin

A.1 a

Pro

Gly

Glu

Ile

Pro

Phe

Asn

Gly

Ile

Tyr

Aso

Pro

225

230

235

240

Pro

Glu

Lys

Tyr

Val

Phe

Gin

His

Pro

Gin

Pro

Lys

Arg

Pro

245

250

255

Giu

Ser

Leu

Arg

Ile

Tyr

Glu

Ser

His

Ile

Gly

Met

Ser

Pro

Glu

250

265

270

Pro

Lys

Ile

A.sn

Ser

Tyr

Ala

Asn

Phe

Arg

Asp

Glu

Val

Leu

Pro

A.rg

275

280

285

Ile

Lys

Arg

Leu

Gly

Tyr

Asn

Ala

Val

Gin

Ile

Met

Ala

Ile

Gin

Glu

290

295

300

His

Ser

Tyr

Tvr

Ala

Ser

Phe

Gly

Tyr

His

Val

Thr

Asn

Phe

Ala

305

310

315

320

Pro

Ser

Arg

Phe

Gly

Thr

Pro

Glu

Asp

Leu

Lys

ser

Leu

Ile

Asp

325

330

335

Arg

Ala

His

Glu

Leu

Gly

Leu

Ile

Val

Leu

Met

Asp

Ile

Val

His

Ser

340

345

350

His

Ser

Asn

Thr

Leu

Asp

Gly

Leu

Asn

Gly

Phe

Asp

Gly

Thr

355

360

365

Asp

Thr

His

Tyr

Phe

His

Gly

Pro

Aro

Gly

His

Trp

Met

Trp

370

375

380

Asp

Ser

Arg

Leu

Phe

Asn

Tyr

Gly

Ser

Trp

Glu

Val

Leu

Arg

Phe

Leu

385

390

395

400

Leu

Ser

Asn

Ala

Arg

Trp

Leu

Glu

Tyr

Lys

Phe

Asp

Gly

Phe

405

410

415

Arg

Phe

Asp

Gly

Val

Thr

Ser

Met

Tyr

Thr

His

Gly

Leu

Gin

420

425

430

Met

Thr

Phe

Thr

Gly

Asn

Tyr

Gly

Glu

Tyr

Phe

Gly

Phe

Ala

Thr

Asp

435

440

445

val

Asp

Ala

Val

Tyr

Leu

Met

Leu

Val

Asn

Asp

Leu

Ile

His

Gly

450

455

460

Leu

His

Pro

Asp

Ala

val

Ser

Ile

Gly

Glu

Asp

Val

Ser

Gly

Met

Pro

PL 205 884 B1

465

470

475

430

Thr Phe Cys Ile Pro Val Pro Asp Gly Gly Val Gly Leu As? Tyr Arg 435 450 495

Leu His Met Ala Val Ala Asp Lys Trp Ile Glu Leu Leu Lys Gin Ser 500 505 510

A.sp Glu Ser Trp Lys Met Gly Asp Ile Val His Thr Leu Thr Asn Arg 515 520 525

Arg Trp Leu Glu Lys Cys Val Thr Tyr Ala Glu Ser His Asp Gin ila 530 535 540

Leu Val Gly Asp Lys Thr Ile Ma Phe Trp Leu Met Asp Lys Asp Met 545 550 555 560

Tyr Asp Phe Met Ala Leu Asp Arg Pro Ser Thr Pro Arg Ile Asp Arg . 565 570 575

Gly Ile Ala Leu His Lys Met Ile Arg Leu Val Thr Met Gly Leu Gly

580 585 5 = 0

Gly Glu Gly Tyr Leu Asn Phe Met Gly Asn Glu Phe Gly His Pro Glu 595 600 605

Trp Ile Asp Phe Pro Arg Gly Pro Gin Thr Leu Pro Thr Gly Lys Val 610 615 620

Leu Pro Gly Asn Asn Asn Ser Tyr Asp Lys Cys Arg Arg Arg Phe Asp

525 630 635 640

Leu Gly Asp Ala Asp Phe Leu Arg Tyr His Gly Met Gin Glu Phe Asp

645 650 655

Gin Ala Met Gin His Leu Glu Glu Lys Tyr Gly Phe Met Thr Ser Glu 660 665 670

His Gin Tyr Val Ser Arg Lys His Glu Glu Asp Lys Val Ile Ile Phe 675 680 685

Glu Arg Gly Asp Leu Val Phe Val Phe Asn Phe His Trp Ser Asn Ser 690 695 700

Phe Phe Asp Tyr Arg Val Gly Cys Ser Arg Pro Gly Lys Tyr Lys Val 705 710 715 720

Ala Leu Asp Ser Asp Asp Ala Leu Phe Gly Gly Phe Ser Arg Leu Asp

PL 205 884 B1

725

73C

725

His Asp Val A.sp

Tyr

Phe

Thr

Glu

His

Pro

His

Asp

A.sn

Arg

Pro

740

745

750

A.rg Ser Phe Ser

Val

Tyr

Thr

Pro

Ser

Arg

Thr

Ala

Val

Tyr

Ala

755

760

765

Leu Thr Glu

770

<210> 13

<211> 797

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 12 ·

Ser Cys Ala Gly

Ala

Pro

Gly

Lys

Val

Leu

Val

Pro

Gly

Ser

1

5

15

Asp Asp Leu Leu

Ser

Ala

Glu

Pro

Val

Asp

Thr

Gin

Pro

Glu

20

25

30

Glu Leu Gin Ile

Pro

Glu

Ala

Glu

Leu

Thr

Val

Glu

Lys

Thr

Ser

ser

35

40

45

Ser Pro Thr Gin

Thr

Ser

Al a

Val

A.la

Glu

Ala

Ser

Gly

Val

50

55

60

Glu Ala Glu Glu

Arg

Pro

Glu

Leu

Ser

Glu

Val

Ile

Gly

val

Gly

65

70

75

80

Gly Thr Gly Gly

Thr

Lys

Ile

Asp

Gly

Ala

Gly

Ile

Lys

Ala

Lys

Ala

85

90

95

Pro Leu Val Glu

Glu

Lys

Pro

Arg

Val

Ile

Pro

Gly

Asp

Gly

100

105

110

Gin Arg Ile Tyr

Glu

Ile

A.sp

Pro

Mer

Leu

Glu

Gly

Phe

Arg

Gly

His

115

120

125

Leu Asp Tyr Arg

Tyr

Ser

Glu

Tyr

Lys

A.rg

Leu

Arg

Ala

Ile

Asp

130

135

140

Gin His Glu Gly

Gly

Leu

Asp

Ala

Phe

Ser

Arg

Gly

Tyr

Glu

Lys

Leu

145

150

155

160

PL 205 884 B1

Gly

Phe

Thr

Arg

Ser 165

Ala

Glu

Gly

Ile

Thr 170

Tyr

A.rg

Glu

Trp

Ala 175

Pro

Gly

Ala

Tyr

Ser

Ala

Leu

Val

Gly

Asp

Phe

Asn

Tr?

Asn

Pro

180

135

190

Asn

Ala

Asp

Ala

Met

Ala

A.rg

Asn

Glu

Tyr

Gly

Val

Trp

Glu

Ile

Phe

195

200

205

Leu

Pro

Asn

Ala

Asp

Gly

Ser

Pro

Ala

Ile

Pro

His

Gly

Ser

Arg

210

215

220

Val

Lys

Ile

Arg

Met

Asp

Thr

Pro

Ser

Gly

Val

Lys

Asp

Ser

Ile

Pro

225

230

235

240

Ala

Trp

Ile

Lys

Phe

Ser

Val

Gin

Ala

Pro

Gly

Glu

Ile

Pro

Tyr

Asn

245

250

255

Gly

Ile

Tyr

Asp

Pro

Glu

Lys

Tyr

Val

Phe

Lys

His

260

255

270

Pro

Gin

Pro

Lys

Arg

Pro

Lys

Ser

Leu

Arg

Ile

Tyr

Glu

Ser

His

Val

275

280

285

Gly

Met

Ser

Pro

Glu

Pro

Lys

Ile

Asn

Thr

Tyr

Ala

A.sr.

Phe

Arg

290

295

300

Asp

Glu

Val

Leu

Pro

Arg

Ile

Lys

Leu

Gly

Tyr

Asn

Ala

Val

Gin

305

310

315

320

Ile

Met

Ala

Ile

Gin

Glu

His

Ser

Tvt

Tyr

Ala

Ser

Phe

Gly

Tyr

His

325

330

335

Val

Thr

Asn

Phe

Ala

Pro

Ser

Arg

Phe

Gly

Thr

Pro

Glu

Asp

340

345

350

Leu

Lys

Ser

Leu

Ile

Asp

Lys

Ala

His

Glu

Leu

Gly

Leu

Val

Leu

355

360

365

Met

Asp

Ile

Val

His

Ser

His

Ser

Asn

Thr

Leu

Asp

Gl y

Leu

370

375

380

Asn

Gly

Phe

Asp

Gly

Thr

A.sp

Thr

HAS

Tyr

Phe

His

Gly

Pro

Arg

385

390

395

400

Gly

His

Trp

Met

Trp

Asp

Ser

Arg

Leu

Phe

Asn

Tyr

Gly

Ser

Trp

405

410

415

PL 205 884 B1

Glu

val

Leu

Arg 420

Phe

Leu

Ser

Asn 425

Ala

Arg

Trp

Leu 430

C-iu

Glu

Tyr

Lys

Phe 435

Asp

Gly

Phe

Arg

Phe 440

Asp

Gly

Val

Thr

Ser 445

Met

Tyr

Thr

His 450

His

Gly

Leu

Gir.

Val 455

Thr

Phe

Thr

Gly

Asn 460

Tyr

Gly

Glu

Tyr

Phe 4 65

Gly

Phe

Ala

Thr

Asp 470

Val

Asp

Ala

Val

Val 475

Tyr

Leu

Met

Leu

Val 480

Asn

Asp

Leu

Ile

Arg 485

Gly

Leu

Tyr

Pro

Glu 490

Ala

Val

Ser

Ile

C-ly 495

Glu

Asp

Val

Ser

Gly 500

Met

Pro

Thr

Phe

Cys 505

Ile

Pro

Val

Gin

Asp 510

Gly

Val

Gly

Phe 515

Asp

Tyr

Arg

Leu

His 520

Met

Ala

Val

Pro

Asp 525

i»ys

Trp

Ile

Glu

Leu 530

Leu

Lys

Gin

Ser

Asp 535

Glu

Tyr

Trp

Glu

Met 540

Gly

Asp

Ile

Val

His 545

Thr

Leu

Thr

Asn

Arg 550

Arg

Trp

Leu

Glu

Lys 555

Cys

Val

Thr

Tyr

Cys 560

Glu

Ser

His

Asp

Gin 565

Ala

Leu

Val

Gly

Asp 570

Lys

Thr

Ile

Ala

Phe 575

Trp

Leu

Met

Asp

Lys 590

Asp

Met

Tyr

Asp

Phe 585

Met

Ala

Leu

Asp

Arg 590

Pro

Ser

Thr

Pro

Arg 595

Ile

Asp

Arg

Gly

Ile 600

Ala

Leu

His

Lys

Met 605

Ile

Arg

Leu

Val

Thr 610

Met

Gly

Leu

Gly

Gly 615

Glu

Gly

Tyr

Leu

Asn 620

Phe

Met

Gly

Asn

Glu 625

Phe

Gly

His

Pro

Glu 630

Trp

Ile

Asp

Phe

Pro 635

Arg

Gly

Pro

Gin

Ser 540

Leu

Pro

Asn

Gly

Ser 645

Val

Ile

Pro

Gly

Asn 650

Asn

Ser

Phe

Asp 655

Lys

Cys

Arg

Phe

Asp

Leu

Gly

Asp

Ma

Asp

Tyr

Leu

Arg

Tyr

Arg

6S0 665 670

PL 205 884 B1

Gly

Met

Gin

Glu

Phe

Asp

Gin

Ala

Met

C-in

His

Leu

Glu

Gly

Lys

Tyr

675

680

685

Glu

Phe

Met

Thr

Ser

Asp

His

Ser

m,. —

Vai

Ser

Arg

Lys

His

Glu

690

695

700

Asp

Lys

Val

Ile

Phe

Glu

Arg

Gly

Asp

Leu

Val

Phe

Val

Phe

Asn

705

710

715

720

Phe

His

Trp

Ser

Asn

Ser

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Arg

Val

Gly

Cys

Phe

Lys

725

730

735

Pro

Gly

Lys

Tvr

Lys

Ile

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

Leu

Phe

Gly

740

745

750

Gly

Phe

Ser

Arg

Leu

Asp

His

Asp

Ala

Glu

Tyr

Phe

Thr

Ala

Asp

Trp

755

760

765

Pro

His

Asp

Asn

Arg

Pro

Cys

Ser

Phe

Ser

Vai

Tyr

Ala

Pro

Ser

Arg

770

775

7 8 0'

Thr

Ala

Val

Tyr

Ala

Pro

Ala

Gly

Al a

Glu

Asp

Glu

7Β5 790 795 <210> 14 <211> 747 <212> PRT <213> Zea mays <400> 14

Ala

Arg

Lys

Ala

Val

Met

Val

Pro

Glu

Gly

Glu

Asn

1

5

10

15

Asp

Gly

Leu

Ala

Ser

Arg

Ala

Asp

Ser

Ala

Gin

Phe

Gin

Ser

Asp

Glu

20

25

30

Leu

Glu

Val

Pro

Asp

Ile

Ser

Glu

Thr

Cys

Gly

-Ala

Gly

Val

35

40

45

Ala

Asp

Ala

Gin

Ala

Leu

Asn

Arg

Val

Arg

Val

Pro

Ser

50

55

60

Asp

Gly

Gin

Lys

Ile

Phe

Gin

Ile

Asp

Pro

Met

Leu

Gin

Gly

Tyr

Lys

65

70

75

80

Tyr

His

Leu

Glu

Tyr

Arg

Tyr

Ser

Leu

Tyr

Arg

Ile

Arg

Ser

Asp

90 95

PL 205 884 B1

Ile Asp Glu His Glu Gly Gly Leu 100

Lys Phe Gly Phe Asn Ala Ser Ala 115 120

Ala Pro Gly Ala Phe Ser Ala Ala 130 135

Asp Pro Asn Ala Asp Arg Met Ser 145 150

Ile Phe Leu Pro Asn Asn Ala Asp 165

Ser Arg Val Lys Val Arg Met Asp 180

Ile Pro Ala Trp Ile Lys Tyr Ser 195 200

Tyr Asp Gly Ile Tyr Tyr Asp Pro 210 215

Arg His ?i= Gin Pro Lys Arg Pro 225 230

His Val Gly Met Ser Ser Pro Glu 245

Phe Arg Asp Glu Val Leu Pro Arg 260

Val Gin Ile Met Ala Ile Gin Glu 275 280

Tyr His Val Thr Asn Phe Phe Ala 290 295

Glu Asp Leu Lys Ser Leu Ile Asp 305 310

Val Leu Met Asp Val Val His Ser 325

Gly Leu Asn Gly Phe Asp Gly Thr 340

Glu Ala Phe Ser Arg Ser Tyr Glu 105 110

Glu Gly Ile Thr Tyr Arg Glu Trp 125

Leu Val Gly Asp Val Asn Asn Trp 140

Lys Asn Glu Phe Gly Val Trp Glu 155 160

Gly Thr. Ser Pro Ile Pro His Gly 170 175

Thr Pro Ser Gly Ile Lys Asp Ser 185 190

Val Gin Ala Pro Gly Glu Ile Pro 205

Pro Glu Glu Val Lys Tyr Val Phe 220

Lys Ser Leu Arg Ile Tyr Glu Thr 235 . 240

Pro Lys Ile Asn Thr Tyr Val Asn 250 255

Ile Lys Lys Leu Gly Tyr Asn Ala 26S 270

His Ser Tyr Tyr Gly Ser Phe Gly 235

Pro Ser Ser Arg Phe Gly Thr Pro 300

Arg Ala His Glu Leu Gly Leu Leu 315 320

His Ala Ser Ser Asn Thr Leu Asp 330 335

Asp Thr His Tyr Phe His Ser Gly 345 350

PL 205 884 B1

Pro Arg Gly His His Trp Met Trp Asp Ser Arg Leu Phe Asn Tyr Gly 355 360 365

Asn Trp Glu Val Leu Arg Phe Leu Leu Ser Asn Ala Arg Trp Trp Leu 370 375 380

Glu Glu Tyr Lys Phe Asp Gly Phe Arg Phe Asp Gly Val Thr Ser Met

385 390 395 400

Met Tyr Thr His His Gly Leu Gin Val Thr Phe Thr Gly Asn Phe Asn

405 410 415

Glu Tyr Phe Gly Phe Ala Thr A.sp Val Asp Ala Val Val Tyr Leu Met 420 425 430

Leu Val Asn A.sp Leu Ile His Gly Leu Tyr Pro Glu Ala Val Thr Ile 435_: 440 445

Gly Glu Asp Val Ser Gly Met Pro Thr Phe Ala Leu' Pro Val His Asp 450 455 460

Gly Gly Val Gly Phe Asp Tyr Arg Met His Met Ala Val Ala Asp Lys

465 470 475 480

Trp Ile Asp Leu Leu Lys Gin Ser Asp Glu Thr Trp Lys Met Gly Asp

485 490 495

Ile Val His Thr Leu Thr Asn Arg Arg Trp Leu Glu Lys Cys Val Thr 500 505 510

Tyr Ala Glu Ser His Asp Gin Ala Leu Val Gly Asp Lys Thr Ile Ala 515 520 525

Phe Trp Leu Met Asp Lys Asp Met Tyr A.sp Phe Met Ala Leu Asp Arg 530 535 540

Pro Ser Thr Pro Thr Ile Asp A.rg Gly Ile Ala Leu His Lys Met Ile

545 550 555 560

Arg Leu Ile Thr Met Gly Leu Gly Gly Glu Gly Tyr Leu Asn Phe Met

565 570 575

Gly Asn Glu Phe Gly His Pro Glu Trp Ile Asp Phe Pro Arg Gly Pro 580 585 590

Gin Arg Leu Pro Ser Gly Lys Phe Ile Pro Gly Asn Asn Asn Ser Tyr 595 600 605

PL 205 884 B1

Asp

Lys 610

Cys

Arg

Phe 615

Asp

Leu

G1 y

Asp

Ala 62 0

Asp

Tyr

Leu

Arg

Tyr

His

Gly

Met

Gin

Glu

Phe

Asp

Gin

Ala

Met

Gin

His

Leu

Glu

C-ln

625

630

635

640

Lys

Tyr

Glu

Phe

Met

Thr

Ser

Asp

His

Gin

Tyr

Ile

Ser

Arg

Lys

His

645

650

655

Glu

Asp

Lys

Val

Ile

Vai

Phe

Glu

Lys

Gly

Asp

Leu

y&i

Phe

Val

660

665

670

Phe

Asn

Phe

His

Cys

Asn

Ser

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Arg

lis

Gly

Cys

675

680

685

Arg

Lys

Pro

Gly

Val

Tyr

Lys

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Ala

Gly

Leu

690

695

700

Phe

Gly

Phe

Ser

Arg

Ile

His

Al a

Ma

G1U

His

Phe

Thr

Ma

705

710

715

720

Asp

Cys

Ser

His

Asp

Asn

Arg

Pro

Tyr

Ser

Phe

Ser

Val

Tvr

Thr

Pro

725

730

735

Ser

Arg

Thr

Cys

Vai

Val

Tyr

Ala

Pro

Vai

Glu

740 745 <210> 15 <211> 50 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <400> 15

Asn

Asp

Leu

Gly

Ile

Trp

Glu

Ile

Phe

Leu

Pro

Asn

Ma

Asp

Gly

1

5

10

15

Ser

Pro

Ile

Pro

His

Gly

Ser

Arg

Val

Lys

Val

Arg

Met

Asp

Thr

20

25

30

Pro

Ser

Gly

Thr

Lys

Asp

Ser

Ile

Pro

Ma

Trp

Ile

Lys

Phe

Ser

Val

35

40

45

Gin Ala 50

PL 205 884 B1 <210> 16 <211> 50 <212> PRT <213> Hordeum vulgare

<400> 16

Asn

Ala

Asp 15

Gly

As? 1

Asp Tyr

Gly Val 5

Trp

Glu

Ile

Phe

Leu 10

Pro

Asn

Ser

Pro Ala

Ile

Pro

His

Gly

Ser

Arg

Val

Lys

Ile

Arg

Met

Asp

Thr

20

25

30

Pro

Ser Gly

Val

Lys

Asp

Ser

Ile

Ser

.Ala

Trp

Ile

Lys

Phe

Ser

Val

40 45

Gin Ala 50 <210> 17 <211> 760 <212> PRT

<213> 0ry2a <400> 17

sati

,va

Ala 1

Ala

Gly

Ala

Ser 5

Gly

Glu

Val

Met

Ile 10

Pro

Glu

Gly

Glu

Ser 15

Asp

Gly

Met

Pro

val 20

ser

Ala

Gly

Ser

Asp 25

Asp

Leu

Gin

Leu

Pro 30

Ala

Leu

Asp

Glu 35

Leu

Ser

Thr

Glu

Val 40

Gly

Ala

Glu

Val

Glu 45

Ile

Glu

Ser

Gly 50

Ala

Ser

Asp

val

Glu 55

Gly

Val

Lys

Arg

Val 60

Val

Glu

Leu

Ala 65

Ala

Glu

Gin

Lys

Pro 70

Arg

Val

Pro

Pro 75

Thr

Gly

Asp

Gly

Gin 80

Lys

Ile

Phe

Gin

Met 85

Asp

ser

Met

Leu

Asn 50

Gly

Tyr

Lys

Tyr

His 95

Leu

Glu

Tyr

Arg

Tyr 100

Ser

Leu

Tyr

Arg

Arg 105

Leu

Arg

Ser

Asp

Ile 110

Asp

Gin

Tyr

Glu

Gly 115

Gly

Leu

Glu

Thr

Phe 120

Ser

Arg

Gly

Tyr

Glu 125

Lys

Phe

Gly

PL 205 884 B1

Phe

Asn 130

His

Ser Ala

Glu

Gly Vai Thr 135

Tyr

Arg

Glu 140

Trp

Al a

Pro

Gly

Ala 145

His

Ser

Ala Ala

Leu 150

Val Gly Asp

Fhe

Asn 155

Asn

Trp

Asn

Pro

Asn 160

Ala

Asp

Arę

Met Ser 165

Lys

Asn Glu Phe

Gly 170

Val

Trp

Glu

Ile

Phe 175

Leu

Pro

Asn

Ala Asp 180

Gly

Ser Ser Pro 185

Ile

Pro

His

Gly

Ser 190

Arg

Val

Lys

Val

Arg 195

Met Glu

Thr

Pro Ser Gly 200

Ile

Lys

Asp

Ser 205

Ile

Pro

Ma

Trp

Ile 210

Lys

Tyr Ser

Val

Gin Ala Ala 215

Gly

Glu

Ile 220

Pro

Tyr

Asn

Gly

Ile 225

Tyr

Asp Pro

Pro 230

Glu Glu Glu

Lys

Tyr 235

Ile

Phe

Lys

His

Pro 240

Gir.

Pro

Lys

Arg Pro 245

Lys

Ser Leu Arg

Ile 250

Tyr

Glu

Thr

His

Val 255

Gly

Met

Ser

Thr Glu 260

Pro

Lys Ile Asn 255

Thr

Tyr

Ala

Asn

Phe 270

Arg

Asp

Glu

Val

Leu 275

Pro Arg

Ile

Lys Lys Leu 280

Gly

Tyr

Asn

Ala 285

Val

Gin

Ile

Met

Ala 290

Ile

Gin Glu

His

Ala Tyr Tyr 295

Gly

Ser

Phe 300

Gly

Tyr

His

Val

Thr 305

Asn

Phe

Phe Ala

Pro 310

Ser Ser Arg

Phe

Gly 315

Thr

Pro

Glu

Asp

Leu 320

Lys

Ser

Leu

Ile Asp 325

Lys

Ala His Glu

Leu 330

Gly

Leu

Val

Leu 335

Met

Asp

Val

His Ser 340

His

Ala Ser Asn 345

Asn

Thr

Leu

Asp

Gly 350

Leu

Asn

Gly

Phe

Asp 355

Gly Thr

Asp

Thr His Tyr 360

Phe

His

Ser

Gly 365

Ser

Arg

Gly

His

Trp

Met Trp

Asp

Ser Arg Leu

Phe

Asn

Tyr

Gly

Asn

Trp

Glu

370 375 380

PL 205 884 B1

Val Leu Arg Phe Leu Leu Ser Asn Ala Arg Trp Trp Leu Glu Glu Tyr

385 390 395 400

Lys Phe Asp Gly Phe Arg Phe Asp Gly Val Thr Ser Met Met Tyr Thr

405 410 415

His His Gly Leu Gin Val Ala Phe Thr Gly Asn Tyr Ser Glu Tyr Phe 420 425 430

Gly Phe Ala Thr Asp Ala Asp Ala Val Val Tyr Leu Met Leu Val Asn 435 440 445

Asp Leu Ile His Gly Leu Tyr Pro Glu Ala Ile Thr Ile Gly Glu Asp 450 455 460

Val Ser Gly Met Pro Thr Phe Ala Leu Pro Val Gin Asp Gly Gly Val

465 . 470 475 480

Gly Phe Asp Tyr Arg Leu His Met Ala Val Pro Asp Lys Trp Ile Glu

485 490 495

Leu Leu Lys Gin Ser Asp Glu Ser Trp Lys Met Gly Asp Ile Val His 500 505 510

Thr Leu Thr Asn Arg Arg Trp Ser Glu Lys Cys Val Thr Tyr Ala Glu 515 520 525

Ser His Asp Gin Ala Leu Val Gly Asp Lys Thr Ile Ala Phe Trp Leu 530 535 540

Met Asp Lys Asp Met Tyr Asp Phe Met Ala Leu Asp Arg Pro Ala Thr

545 550 555 560

Pro Ser Ile Asp Arg Gly Ile Ala Leu His Lys Met Ile Arg Leu Ile

565 570 575

Thr Met Gly Leu Gly Gly Glu Gly Tyr Leu Asn Phe Met Gly Asn Glu 580 585 590

Phe Gly His Pro Glu Trp Ile Asp Phe Pro Arg Ala Pro Gin Val Leu 595 600 605

Pro Asn Gly Lys Phe Ile Pro Gly Asn Asn Asn Ser Tyr Asp Lys Cys 610 615 620

Arg Arg Arg Phe Asp Leu Gly Asp Ala Asp Tyr Leu Arg Tyr Arg Gly 625 630 635 640

PL 205 884 B1

Met	Leu	Glu	Phe	Asp 645	Arg	Ala	Met
Phe	Met	Thr	Ser 660	Asp	His	Gin	Tyr
Lys	Met	Ile 675	Ile	Phe	Glu	Lys	Gly 680
His	Trp 690	Ser	Asn	Ser	Tyr	Phe 695	A.sp
Gly 705	Lys	Tyr	Lys	Val	Val 710	Leu	Asp
Phe	Gly	Arg	Ile	His 725	His	Thr	Ala
His	Asp	Asn	Arg 740	Pro	Tyr	Ser	Phe
Cys	Val	Val	Tyr	Ala	Pro	Ala	Glu

155 160

Gin	Ser 65 0	Leu	Glu	Glu	Lys	Tyr 655	Gly
Ile 665	Ser	Arg	Lys	His	Glu 670	Glu	Asp
A.sp	Leu	Val	Phe	Val 685	Phe	Asn	Phe
Tyr	Arg	Val	Gly 700	Cys	Leu	Lys	Pro
Ser	Asp	Ala 715	Gly	Leu	Phe	Gly	Gly 720
Glu	His 730	Phe	Thr	Ala	A.sp	Cys 735	Ser
Ser 745	Val	Tyr	Ser	Pro	Ser 750	Arg	Thr

<210> 18 <211> 844 <212> PRT

<213	!> Oryra	sativa
<400> 18 Val Glu 1	1 Ala	Glu	Arg 5	Gly	Gly	Cys
Ala	Gly	Glu	Met 20	Ala	Ala	Pro	Ala
Gly	Leu	Aj?g 35	.Ala	Gly	Ala	Val	Arg 40
Ser	Trp 50	Arg	Ala	Ala	Ala	Glu 55	Leu
Gly 65	Arg	Arg	Phe	Pro	Gly 70	Ala	Val
Val	Ala	Val	Arg	Ala	Ala	Gly	Ala

Arg Gly Ile Arg Ser Gly Cys Gly 10 15

Ser Ala Val Pro Gly Ser .Ala Ala 25 30

Phe Pro Val Pro Ala Gly Ala Arg 45

Pro Thr Ser Arg Ser Leu Leu Ser SO

Arg Val Gly Gly Ser Gly Gly Arg 75 80

Ser Gly Glu Val Met Ile Pro Glu

PL 205 884 B1

85

90

55

Gly

Glu

Ser

Asp

Gly

Met

Pro

Val

Ser

Ala

Gly

Ser

Asp

Leu

Gin

100

105

110

Leu

Pro

Ala

Leu

Asp

Glu

Leu

Ser

Thr

Glu

val

Gly

Ala

Glu

Val

115

120

125

Glu

Ile

Glu

Ser

Gly

Ala

Ser

Asp

Val

Glu

Gly

Val

Lys

Arg

Val

130

135

140

Val

Glu

Leu

Ala

Glu

Gin

Lys

Pro

Arg

Val

Pro

Thr

145

150

155

150

Gly

Asp

Gly

Gin

Lys

Ile

Phe

Gin

Met

Asp

Ser

Met

Leu

Asn

Gly

Tyr

165

170

175

Lys

Tyr

His

leu

Glu

Tyr

Arg

Tyr

Ser

Leu

Tyr

Arg

Leu

Arg

Ser

180

185

190

Asp

Ile

Asp

Gin

Tyr

Glu

Gly

Leu

Glu

Thr

Phe

Ser

Arg

Gly

Tyr

195

200

205

Glu

Lys

Phe

Gly

Phe

Asn

His

Ser

Ala

Glu

Gly

Val

Thr

Tyr

Arg

Glu

210

215

220

Trp

Ala

Pro

Gly

A-L a

His

Ser

Ala

Leu

Val

Gly

Asp

Phe

Asn

225

230

235

240

Trp

Asn

Pro

Asn

Ala

Asp

Arg

Met

Ser

Lys

Asn

Glu

Phe

Gly

Val

Trp

245

250

255

Glu

Ile

Phe

Leu

Pro

Asn

Ala

Asp

Gly

Ser

Pro

Ile

Pro

His

260

265

270

Gly

Ser

Arg

Val

Lys

Val

Arg

Met

Glu

Thr

Pro

Ser

Gly

Ile

Lys

Asp

275

230

285

Ser

Ile

Pro

Ala

Trp

Ile

Lys

Tyr

Ser

Val

Gin

Ala

Gly

Glu

Ile

290

295

300

Pro

Tyr

Asn

Gly

Ile

Tyr

Asp

Pro

Glu

Lys

Tyr

Ile

305

310

315

320

Phe

Lys

His

Pro

Gin

Pro

Lys

Arg

Pro

Lys

Ser

Leu

Arg

Ile

Tyr

Glu

325

330

335

Thr

His

val

Gly

Met

Ser

Thr

Glu

Pro

Lys

Ile

Asn

Thr

Tyr

Ala

PL 205 884 B1

340

345

250

Asn

Phe

Arg

Asp

Glu

fal

Leu

Pro

Arg Ile Lys

Lys

Leu Gly

Tyr

Asn

355

360

365

Ala

fal

Gin

Ile

Met

Ala

Ile

Gin

Glu His Ala

Tyr

Tyr Gly

Ser

Phe

370

375

380

Gly

Tyr

His

fal

Thr

Asn

Phe

?la Pro Ser

Ser

Arg Phe

Gly

Thr

385

390

395

400

Pro

Glu

Asp

Leu

Lys

Ser

Leu

Ile

Asp Lys Ala

His

Glu Leu

Gly

Leu

405

410

415

fal

Leu

Met

Asp

Val

fal

His

Ser His Ala

Ser

Asn Asn

Thr

Leu

420

425

430

Asp

Gly

Leu .Asn

Gly

Phe

Asp

Gly

Thr Asp Thr

His

Tyr Phe

His

Ser

435

440

445

Gly

Ser

Arg

Gly

His

Trp

Met

Trp Asp Ser

Arg

Leu Phe

Asn

Tyr

450

455

460

Gly

Asn

Trp

Glu

fal

Leu

Arg

Phe

Leu Leu Ser

Asn

Ala Arg

Trp

465

470

475

480

Leu

Glu

Tyr

Lys

Phe

Asp

Gly

Phe Arg Phe

Asp

Gly fal

Thr

Ser

485

490

495

Met

Tyr

Thr

His

Gly

Leu

Gin fal Ala

Phe

Thr Gly

Asn

Tyr

500

505

510

Ser

Glu

Tyr

Phe

Gly

Phe

Ala

Thr

Asp Ala Asp

Ala

fal fal

Tyr

Leu

515

520

525

Met

Leu

Val

Asn

Asp

Leu

Ile

His

Gly Leu Tyr

Pro

Glu Ala

Ile

Thr

530

535

540

Ile

Gly

Glu

Asp

Val

Ser

Gly

Met

Pro Thr Phe

Ala

Leu Pro

fal

Gin

545

550

555

560

Asp

Gly

fal

Gly

Phe

Asp

Tyr

Arg Leu His

Met

Ala fal

Pro

Asp

565

570

575

Lys

Trp

Ile

Glu

Leu

Lys

Gin

Ser Asp Glu

Ser

Trp Lys

Met

Gly

580

585

590

Asp

Ile

fal

His

Thr

Leu

Thr

Asn

Arg Arg Trp

Ser

Glu Lys

Cys

fal

PL 205 884 B1

595

600

605

Thr

Tyr

Ala

Glu

Ser

His

Asp

Gin

Ala

Leu

Val

Gly

Asp

Lys

Thr

Ile

610

615

620

Ala

Phe

Trp

Leu

Met

Asp

Lys

Asp

Met

ΓΤ». » r-

Asp

Phe

Met

Ala

Leu

Asp

525

630

53 5

640

Arg

Pro

Ala

Thr

Pro

Ser

Ile

Asp

Arg

Gly

Ile

Ala

Leu

His

Lys

Met

645

650

655

Ile

Arg

Leu

Ile

Thr

Met

Gly

Leu

Gly

Glu

Gly

Tyr

Leu

Asn

Phe

660

665

670

Met

Gly

Asn

Glu

Phe

Gly

His

Pro

Glu

Trp

Ile

Asp

Phe

Pro

Arg

Ala

675

680

685

Pro

Gin

Val

.Leu

Pro

Asn

Gly

Lys

Phe

7 1 λ

Pro

Gly

Asn

Ser

690

695

700

Tyr

Asp

Lys

Cys

Arg

Phe

Asp

Leu

Gly

Asp

Ala

Asp

Tyr

Leu

705

710

715

720

Arg

Tyr

Arg

Gly

Met

Leu

Glu

Phe

Asp

Arg

Ala

Met

Gin

Ser

Leu

Glu

725

730

735

Glu

Lys

Tyr

Gly

Phe

Met

Thr

Ser

Asp

His

Gin

Tyr

Ile

Ser

Arg

Lys

740

745

750

His

Glu

Asp

Lys

Met

Ile

Phe

Glu

Lys

Gly

Asp

Leu

Val

Phe

755

7 60

765

Val

Phe

Asn

Phe

His

Trp

Ser

Asn

Ser

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Arg

Val

Gly

770

775

780

Cys

Leu

Lys

Pro

Gly

Lys

Tyr

Lys

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Ala

Gly

785

790

795

800

Leu

Phe

Gly

Phe

Gly

Arg

Ile

His

Thr

Ala

Glu

His

Phe

Thr

805

310

815

Ala

Asp

Cys

Ser

His

Asp

Asn

Arg

Pro

Tyr

Ser

Phe

Ser

Val

Tyr

Ser

820

825

330

Pro

Ser

Arg

Thr

Cys

Val

Tyr

Ala

Pro

Ala

Glu

835

840

PL 205 884 B1 <210> 19 <211> 857 <212> PRT <213> Pisum sativum <400> 19

Lys Val Leu Ile Pro Glu Asp Gin Asp Asn Ser Val Ser Leu Ala Asp 15 10 15

Gin Leu Glu A.sn Pro Asp Ile Thr Ser Glu Asp Ala Gin Asn Leu Glu 20 25 30

Asp Leu Thr Met. Lys Asp Gly Asn Lys Tyr Asn Ile Asp Glu Ser Thr 35 40 45

Ser Ser Tyr Arg Glu Val Gly A.sp Glu Lys Gly Ser Val Thr Ser Ser 50 55 60

Ser Leu Val Asp Val A.sn Thr Asp Thr Gin Ala Lys Lys Thr Ser Val 65 70 . 75 80

His Ser Asp Lys Lys Val Lys Val Asp Lys Pro Lys Ile Ile Pro Pro 85 90 95

Pro Gly Thr Gly Gin Lys Ile Tyr Glu Ile Asp Pro Leu Leu Gin Ala 100 105 110

His Arg Gin His Leu Asp Phe Arg Tyr Gly Gin Tyr Lys Arg Ile Arg 115 120 125

Glu Glu Ile Asp Lys Tyr Glu Gly Gly Leu Asp Ala Phe Ser Arg Gly 130 135 140

Tyr Glu Lys Phe Gly Phe Thr Arg Ser Ala Thr Gly Ile Thr Tyr Arg

145 150 155 160

Glu Trp Ala Pro Gly Ala Lys Ser Ala Ala Leu Val Gly A.sp Phe A.sn

165 170 175

Asn Trp Asn Pro Asn Ala Asp Val Met Thr Lys Asp Ala Phe Gly Val 180 185 190

Trp Glu Ile Phe Leu Pro Asn Asn Ala A.sp Gly Ser Pro Pro Ile Pro 195 200 205

His Gly Ser Arg Val Lys Ile His Met A.sp Thr Pro Ser Gly Ile Lys 210 215 220

PL 205 884 B1

Asp 225

Ser

Ile

Pro

Ma

Trp 230

Ile

Lys

Phe

Ser

Val 235

Gin

Ala

Pro

Gly

Glu 240

Ile

Pro

Tyr

Asn

Gly

Ile

Tyr

Asp

Pro

Glu

Lys

Tyr

245

250

255

Val

Phe

Lys

His

Pro

Gin

Pro

Lys

Arg

Pro

Gin

Ser

Ile

Arg

Ile

Tyr

2S0

265

270

Glu

Ser

His

Ile

Gly

Met

Ser

Pro

Glu

Pro

Lys

Ile

Asn

Thr

Tyr

275

280

285

Ala

Asn

Phe

Arg

Asp

Val

Leu

Pro

Arg

Ile

Lys

Leu

Gly

Tyr

290

295

300

Asn

Ala

Val

Gin

Ile

Met

Ma

Ile

Gin

Glu

His

Ser

Tyr

Ma

Ser

305

310

315

320

Phe

Gly

Tyr

His

Val

Thr

Asn

Phe

Ala

Pro

Ser

Arg

Phe

Gly

325

330

335

Thr

Pro

Glu

Asp

Leu

Lys

Ser

Leu

Ile

A.sp

Arg

Ala

His

Glu

Leu

Gly

340

345

350

Leu

Val

Leu

Met

Asp

Ile

Val

His

Ser

His

Ser

Asn

Thr

355

360

365

Leu

Asp

Gly

Leu

Asn

Met

Phe

Asp

Gly

Thr

Asp

Gly

His

Tyr

Phe

His

370

375

380

Pro

Gly

Ser

Arg

Gly

Tyr

His

Trp

Met

Trp

Asp

Ser

Arg

Leu

Phe

Asn

385

390

395

400

Tyr

Gly

Ser

Trp

Glu

Val

Leu

Arg

Tyr

Leu

Ser

Asn

Ma

Arg

Trp

405

410

415

Trp

Leu

Asp

Glu

Tyr

Lys

Phe

Asp

Gly

Phe

Arg

Phe

Asp

Gly

Val

Thr

420

425

430

Ser

Met

Tyr

Thr

His

Gly

Leu

Gin

Val

Ser

Phe

Thr

Gly

Asn

435

440

445

Tyr

Ser

Glu

Tyr

Phe

Gly

Leu

Ma

Thr

Asp

Val

Glu

Ala

Val

Vai

Tyr

450

455

460

Met

Leu

Val

Asn

Asp

Leu

Ile

Hrs

Gly

Leu

Phe

Pro

Glu

Ala

Val

455

470

475

480

PL 205 884 B1

Ser

Ile

Gly

Glu

Asp 485

Val

Ser

C-ly

Met

Pro 490

Thr

Phe

Cys

Leu Pro 495

Thr

Gin

A.sp

Gly

Gly 500

Ile

Gly

Phe

Asn

Tyr 505

Arg

Leu

His

Met

Ala 7al 510

Ala

Asp

Lys

Trp 515

Ile

Glu

Leu

Lys 520

Lys

Gin

Asp

Glu

Asp 525

Trp Arg

Met

Gly

Asp 530

Ile

Val

His

Thr

Leu 535

Thr

Asn

Arg

Trp 540

Leu

Glu Lys

Cys

Val 545

Val

Tyr

Ala

Glu

Ser 550

His

Asp

Gin

Ala

Leu 555

Val

Gly

Asp Lys

Thr 560

Leu

Ala

Phe

Trp

Leu 565

Met

Asp

Lys

Asp

Met 570

Tyr

Asp

Phe

Met Ala 575

Leu

Asp

Arg

Pro

Ser 580

Thr

Pro

Leu

Ile

Asp 585

Arg

Gly

Ile

Ala

Leu His 590

Lys

Met

Ile

Arg 595

Leu

Ile

Thr

Met

Gly 600

Leu

Gly

Glu

Gly 605

Tyr Leu

Aisn

Phe

Met 610

Gly

Asn

Glu

Phe

Gly 615

His

Pro

Glu

Trp

Ile 620

Asp

Phe Pro

Arg

Gly 625

Glu

Gin

His

Leu

Pro 630

Asn

Gly

Lys

Ile

Val 635

Pro

Gly

A.sn A.sn

Asn 640

Ser

Tyr

Asp

Lys

Cys 645

Arg

Phe

Asp 650

Leu

Gly

Asp

Ala Asp 655

Tyr

Leu

Airg

Tyr

His 660

Gly

Met

Gin

Glu

Phe 665

Asp

Arg

Ala

Met

Gin His 6* o

Leu

Glu

Arg 675

Tyr

Gly

Phe

Met

Thr 630

Ser

Glu

His

Gin

Tyr 685

Ile Ser

Arg

Lys

Asn 690

Glu

Gly

Asp

Arg

Val 695

Ile

Phe

Glu

Arg 700

Asp

A.sn Leu

Val

Phe 705

Val

Phe

Asn

Phe

His 710

Trp

Thr

Asn

Ser

Tyr 715

Ser

Asp

Tyr Lys

Val 720

Gly

Cys

Leu

Lys

Pro 725

Gly

Lys

Tyr

Lys

Ile 730

Val

Leu

Asp

Ser Asp 735

Asp

PL 205 884 B1

Thr

Leu

Phe

Gly 740

Gly

Phe

Asn

Arg

Leu 745

Asn

His

Thr

Ala

Glu 750

Tyr

Phe

Thr

Ser

Glu

Gly

Trp

Tyr

Asp

Arg

Pro

Arg

Ser

Phe

Leu

Val

Tyr

755

760

765

Ala

Pro

Ser

Aro

Thr

Ma

Val

Tyr

Ma

Leu

Ma

Asp

Gly

Val

Glu

770

775

780

Ser

Glu

Pro

Ile

Glu

Leu

Ser

Asp

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

Pro

Ile

Glu

785

790

795

800

Leu

Ser

Val

Gly

Val

Glu

Ser

Glu

Pro

Ile

Glu

Leu

Ser

V al

Glu

805

810

315

Ala

Glu

Ser

Glu

Pro

Ile

Glu

Arg

Ser

Val

Glu

Val

Glu

Ser

Glu

320

825

830

Thr

Gin

Ser

Val

Glu

Val

Glu

Ser

Glu

Thr

Gin

Ser

835

340

845

Val

Glu

Val

Glu

Ser

Glu

Thr

Gin

850 855 <210> 20 <211> 779 <212> PRT <213> Solanum tuberosum <400> 20

Thr 1

Met

Ma

Pro

Leu 5

Glu

Asp

Val

Lys 10

Thr

Glu

Asn

Ile

Gly 15

Leu

Asn

Leu

Asp 20

Pro

Thr

Leu

Glu

Pro 25

Tyr

Leu

Asp

His

Phe 30

Arg

His

Arg

Met

Lys 35

Arg

Tyr

Val

Asp

Gin 40

Lys

Met

Leu

Ile

Glu 45

Lys

Tyr

Glu

Gly

Pro 50

Leu

Glu

Phe

Ala 55

Gin

G1 y

Tyr

Leu

Lys 60

Phe

Gly

Phe

Asn

Arg 65

Glu

Asp

Gly

Cys

Ile 70

Val

Tyr

Arg

C-lu

Trp 75

Ma

Pro

Ma

Ala

Gin 80

Glu

Asp

Glu

Val

Ile 85

Gly

Asp

Phe

Asn

Gly 90

Trp

Asn

Gly

Ser

Asn 95

His

PL 205 884 B1

Leu Tyr Val His His Gly Ile Asn Met Gly Phe Thr Gly Asn Tyr A.sn 355 360 365

Glu Tyr Phe Ser Glu Ala Thr Asp Val Asp .Ala Val Val Tyr Leu Met 370 375 380

Leu Ala Asn Asn Leu Ile His Lys Ile Phe Pro Asp Ala Thr Val Ile

385 390 395 400

Ala Glu Asp Val Ser Gly Met Pro Gly Leu Gly Arg Pro Val Ser Glu

405 410 415

Gly Gly Ile Gly Phe Asp Tyr Arg Leu .Ala Met Ala Ile Pro Asp Lys 420 425 430

Trp Ile Asp Tyr Leu Lys Asn Lys Asn Asp Glu Asp Trp Ser Met Lys 435 . 440 445

Glu Val Thr Ser Ser Leu Thr Asn Arg A.rg Tyr Thr Glu Lys Cys Ile 450 455 460

Ala Tyr Ala Glu Ser His Asp Gin Ser Ile Val Gly Asp Lys Thr Ile

465 470 475 480

Ala Phe Leu Leu Met Asp Lys Glu Met Tyr Ser Gly Met Sar Cys Leu

485 490 495

Thr Asp Ala Ser Pro Val Val Asp Arg Gly Ile Ala Leu His Lys Met 500 505 510

Ile His Phe Phe Thr Met Ala Leu Gly Gly Glu Gly Tyr Leu Asn Phe 515 520 525

Met Gly Asn Glu Phe Gly His Pro Glu Trp Ile Asp Phe Pro Arg Glu 530 535 540

Gly Asn Asn Trp Ser Tyr Asp Lys Cys A.rg Arg Gin Trp Asn Leu Ala

545 550 555 560

Asp Ser Glu His Leu Arg Tyr Lys Phe Met Asn Ala Phe Asp .Arg Ala

565 570 575

Met Asn Ser Leu Asp Glu Lys Phe Ser Phe Leu Ala Ser Gly Lys Gin 580 585 590

Ile Val Ser Ser Met Asp Asp Asp Asn Lys Val Val Val Phe Glu Arg 595 600 605

PL 205 884 B1

Gly

Asp 610

Leu

Val

Phe

Val

Phe 615

Asn

Phe

His

Prc

Lys 620

Asn

Thr

Tyr

Glu

Gly

Tyr

Lys

Val

Gly

Cys

Asp

Leu

Pro

G1V

Lys

Tyr

Arg

Val

?la

Leu

625

630

635

540

Asp

Ser

Asp

Ala

Trp

Glu

Phe

Gly

His

Giy

Arg

Thr

Gly

His

Asp

645

650

655

Val

Asp

His

Phe

Thr

Ser

Pro

Glu

Gly

Ile

?ro

Gly

Val

Pro

Glu

Thr

660

665

670

Asn

Phe

Asn

Gly

Arg

Gin

Ile

Pro

Ser

Lys

Cys

Leu

Arg

Glu

675

680

685

His

Val

Trp

Leu

Ile

Thr

Glu

Leu

Met

Asn

Ala

Cys

Gin

Lys

Leu

Lys

690

695

700

Ile

Thr

Arg

Gin

Thr

Phe

Val

Ser

Tvr

Tv~

Gin

Pro

Ile

Ser

705

710

715

720

Arg

Val

Thr

Arg

Asn

Leu

Lys

Ile

Arg

Tyr

Leu

Gin

Ile

Ser

Val

725

730

735

Thr

Leu

Thr

Asn

Ala

Cys

Gin

Lys

Leu

Lys

Phe

Thr

Arg

Gin

Thr

Phe

740

745

750

Leu

Val

Ser

Tyr

Gin

Pro

Ile

Leu

Arg

Val

Thr

Arg

Lys

755

760

765

Leu

Lys

Asp

Ser

Leu

Ser

Thr

Asn

Ile

Ser

Thr

770

775

<210> 21 <211> 762 <212> PRT <213> Triticum aestivum <400> 21

Thr Met Ala Thr Ala

Glu

Asp

Gly Val

Gly Asp 10

Leu

Pro

Ile Tyr 15

Asp

1

5

Leu Asp

Pro

Lys

Phe

Ala

Gly

Phe

Lys

Glu His

Phe

Ser

Tyr

Arg

Met

20

25

30

PL 205 884 B1

Lys

Tyr 35

Leu

Asp

Gin

Lys

His 40

Ser

Ile

Glu

Lys

His 45

Glu

Gly

Leu

Glu

Phe

Ser

Lys

Gly

Tyr

Leu

Lys

Phe

Gly

Ile

Asn

Thr

Glu

50

55

60

Asn

Asp

Ala

Thr

Val

Tyr

Arg

Glu

Trp

Ma

Pro

Ma

Al a

Met

Asp

Ma

65

70

75

80

Gin

Leu

Ile

Gly

Asp

Phe

Asn

Trp

Asn

Gly

Ser

Gly

His

Arg

Met

B5

90

95

Thr

Lys

Asp

Asn

Tyr

Gly

Val

Trp

Ser

Ile

Arg

Ile

Ser

His

Val

Asn

100

105

110

Gly

Lys

Pro

Ala

Ile

Pro

His

Asn

Ser

Lys

Val

Lys

Phe

Arg

Phe

His

115

120

125

Arg

Gly

Asp

Gly

Leu

Trp

Val

Asp

Arg

Val

Pro

Ma

Trp

Ile

Arg

Tyr

130

135

140

Ala

Thr

Phe

Asp

Ala

Ser

Lys

Phe

Gly

Ala

Pro

Tyr

Asp

Gly

Val

His

145

150

155

160

Trp

Asp

Pro

Ser

Gly

Glu

Arg

Tyr

Val

Phe

Lys

His

Pro

Arg

Pro

165

170

175

Arg

Lys

Pro

Asp

Ala

Pro

Arg

Ile

Tyr

Glu

Ma

His

Val

Gly

Met

Ser

180

185

190

Gly

Glu

Lys

Pro

Glu

Vai

Ser

Thr

Tyr

Arg

Glu

Phe

Ma

Asp

Asn

Val

195

200

205

Leu

Pro

Arg

Ile

Lys

Ala

Asn

Tyr

Asn

Thr

Val

Gin

Leu

Met

Ma

210

215

220

Ile

Met

Glu

His

Ser

Tyr

Ala

Ser

Phe

Gly

Tyr

His

Val

Thr

Asn

225

230

235

240

Phe

Ala

Val

Ser

Arg

Ser

Gly

Thr

Pro

Glu

Asp

Leu

Lys

Tyr

²⁴⁵

250

255

Leu

Val

Asp

Lys

Ala

His

Ser

Leu

Gly

Leu

Arg

Val

Leu

Met

Asp

Val

260

265

270

Val

His

Ser

His

Ala

Ser

Asn

Lys

Thr

Asp

Gly

Leu

Asn

Gly

Tyr

275

280

285

PL 205 884 B1

Asp Val Gly Gin Asn Thr Gin Glu Ser Tyr Phe His Thr Gly Glu Arg 290 295 300

Gly Tyr His Lys Leu Trp Asp Ser Arg Leu Phe Asn Tyr Ala Asn Trp

305 310 315 320

Glu Val Leu Arg Phe Leu Leu Ser A.sn Leu Arg Tyr Trp Met Asp Glu

325 330 335

Phe Met Phe Asp Gly Phe Arg Phe Asp Gly Val Thr Ser Met Leu Tyr 340 345 350

Asn His His Gly Ile A.sn Met Ser Phe Ala Gly Ser Tyr Lys Glu Tyr 355 360 365

Phe Gly Leu Asp Thr Asp Val Asp Ala Val Val Tyr Leu Met Leu Ala 370 375 380

Asn 385

His

Leu

Met

His

Lys 390

Leu

Pro

Glu

Ala 395

Thr

Val

Ala

Glu 400

Asp

Val

Ser

Gly

Met 405

Pro

Val

Leu

Cys

A.rg 410

Ser

Val

Asp

Glu

Gly 415

Gly

Val

Gly

Phe

Asp 420

Tyr

Arg

Leu

Ala

Met 425

Ala

Ile

Pro

Asp

Arg 430

Trp

Ile

AlSD

Tyr

Leu 435

Lys

Asn

Lys

Asp

Asp 440

Leu

Glu

Trp

Ser

Met 445

Ser

Gly

Ile

Ala

His 450

Thr

Leu

Thr

Asn

Arg 455

Arg

Tyr

Thr

Glu

Lys 460

Cys

Ile

Ala

Tyr

Ala 465

Glu

Ser

His

Asp

Gin 470

Ser

Ile

Val

Gly

Asp 475

Lys

Thr

Met

Ala

Phe 480

Leu

Met

Asp

Lys 485

Glu

Met

Tyr

Thr

G1 y 490

Met

Ser

Asp

Leu

Gin 495

Pro

Ala

Ser

Pro

Thr 500

Ile

Asp

Arg

Gly

Ile 505

Ala

Leu

Gin

Lys

Met 510

Ile

His

Phe

Ile

Thr 515

Met

Ala

Leu

Gly

Gly 520

Asp

Gly

Tyr

Leu

Asn 525

Phe

Met

Gly

Asn

Glu 530

Phe

Gly

His

Pro

Glu 535

Trp

Ile

A.sp

Phe

Pro 540

Arg

Glu

Gly

Asn

PL 205 884 B1

Asn 545

Trp

Ser Tyr

Asp

Lys 550

Cys

Arg

Gin

Trp 555

Ser

Leu

Ala

Asp

Ile 560

Asp

His

Leu

Arg

Tyr

Lys

Tyr

Met

Asn

Ala

Phe

Asp

Gin

Ala

Met

Asn

565

570

575

Ala

Leu

Asp

Lys

Phe

Ser

Phe

Leu

Ser

Lys

Gin

Ile

Val

580

585

590

Ser

Asp

Met

Asn

Glu

Lys

Ile

Val

Phe

Glu

Arg

Gly

Asp

595

600

605

Leu

Val

Phe

Val

Phe

Asn

Phe

His

Pro

Ser

Lys

Thr

Tyr

Asp

Gly

Tyr

610

615

620

Lys

Val

Gly

Cys

Asp

Leu

Pro

Gly

Lys

Tyr

Lys

Val

Ala

Leu

Asp

Ser

625

630

635

640

Asp

Ala

Leu

Met

Phe

Gly

His

Gly

Arg

Val

Ala

His

Asp

Asn

Asp

645

650

655

His

Phe

Thr

Ser

Pro

Glu

Gly

Val

Pro

Gly

Val

Pro

Glu

Thr

Asn

Phe

660

665

670

Asn

Arg

Pro

Asn

Ser

Phe

Lys

Ile

Leu

Ser

Pro

Ser

Arg

Thr

Cys

675

680

685

Val

Ala

Tyr

Arg

Val

Glu

Lys

Ala

Glu

Lys

Pro

Lys

Asp

Glu

690

695

700

Gly

Ala

Ser

Trp

Gly

Lys

Thr

Ala

Leu

Gly

Tyr

Ile

Asp

Val

Glu

705

710

•

715

720

Ala

Thr

Gly

Val

Lys

Asp

Ala

Asp

Gly

Glu

Ala

Thr

Ser

Gly

Ser

725

730

735

Glu

Lys

Ala

Ser

Thr

Gly

Asp

Ser

Lys

G1 y

Ile

Asn

Phe

740

745

750

Val

Phe

Leu

Ser

Pro

Asp

Lys

Asp

Asn

Lys

755 760 <210> 22 <211> 703 <212> PRT <213> Triticum aestivum

PL 205 884 B1 <400> 22

Ser Pro Pro Thr Leu Thr Ser Pro 1 5

Thr Met Leu Cys Leu Ser Ser Ser 20

Ala Asp Arg Pro Leu Pro Gly Ile 35 40

Arg Leu Ser Val Val Pro Ser Val 50 . 55

Pro Arg Lys Ala Lys Ser Lys Ser 65 70

Asn Lys Ile Ala Ala Thr Thr Gly i ³⁵

Tyr Asp Leu Asp Leu Lys Leu Ala 100

Thr Arg Asn Arg Tyr Ile Glu Gin 115 120

Gly Ser Leu Glu Glu Phe Ser Lys 130 135

Thr Glu His Gly Ala Ser Val Tyr 145 - 150

Glu Ala Gin Leu Val Gly Asp Phe 165

Lys Met Ala Lys Asp Asn Phe Gly 180

Val Asn Gly Lys Pro Ala Ile Pro 195 200

Phe Arg His His Gly Val Trp Val 210 215

Tyr Ala Thr Val Thr Ala Ser Glu 225 230

His Trp Asp Pro Pro Ser Ser Glu 245

Pro Pro Ser Ala Val Pro Ser Thr 10 15

Leu Leu Pro Arg Pro Ser Ala Ala 25 30

Ile Ala Gly Gly Gly Gly Gly Lys 45

Pro Phe Leu Leu Arg Trp Leu Trp 60

Phe Val Ser Val Thr Ma Arg Gly 75 80

Tyr Gly Ser Asp His Leu Pro Ile 90 95

Glu Phe Lys ASp His Phe Asp Tyr 105 110

Lys His Leu Ile Glu Lys His Glu 125

Gly Tyr Leu Lys Phe Gly Ile Asn 140

Arg Glu Trp Ma Pro Ma Ma Glu 155 160

Asn. Asn Trp Asn Gly Ser Gly His 170 175

Val Trp Ser Ile Arg Ile Ser His 185 190

His Asn Ser Lys Val Lys Phe Arg 205

Glu Gin Ile Pro Ma Trp Ile Arg 220

Ser Gly Ala Pro Tyr Asp Gly Leu 235 240

Arg Tyr Val Phe Asn His Pro Arg 250 255

PL 205 884 B1

Pro

Lys

Pro

Asp

Val

Pro

Arg

Ile

Tyr

Glu

Ala

His Val

Gly

Val

260

265

270

Ser

Gly

Lys

Leu

Glu

Ala

Gly

Thr

Tyr

Arg

Glu

Phe Pro

Asp

Asn

275

280

285

Val

Leu

Pro

Cys

Leu

Arg

Ala

Thr

Asn

Tyr

Asn

Thr

Val Gin

Leu

Met

290

295

300

Gly

Ile

Met

Glu

His

Ser

Asp

Ser

Ala

Ser

Phe

Gly

Tyr His

Val

Thr

305

310

315

320

Asn

Phe

Ala

Val

Ser

Arg

Ser

Gly

Thr

Pro

Glu Asp

Leu

Lys

325

330

335

Tyr

Leu

Ile

Asp

Lys

Ala

His

Ser

Leu

Gly

Leu

Arg

Val Leu

Met

Asp

340

345

350

Val

Vai

His

Ser

His

Ala

Ser

Asn

Val

Ile

Asp'

Gly Leu

Asn

Gly

355

360

365

Tyr

Asp

Val

Gly

Gin

Ser

Ala

His

Glu

Ser

Tyr

Phe

Tyr Thr

Gly

Asp

370

375

380

Lys

Gly

Tyr

Asn

Lvs

Met

Trp

Asn

Gly

Arg

Met

Phe

Asn Tyr

Ala

Asn

385

390

395

400

Trp

Glu

Val

Leu

Arg

Phe

Leu

Ser

Asn

Leu

Arg

Tyr Trp

Met

Asp

405

410

415

Glu

Phe

Met

Phe

Asp

Gly

Phe

Arg

Phe

Val

Gly

Val

Thr Ser

Met

Leu

420

425

430

Tyr

Asn

His

Asn

Gly

Ile

Asn

Met

Ser

Phe

Asn

Gly

Asn Tyr

Lys

Asp

435

440

445

Tyr

Ile

Gly

Leu

Asp

Thr

Asn

Val

Asp

Ala

Phe

Val

Tyr Met

Met

Leu

450

455

460

Ala

Asn

His

Leu

Met

His

Lys

Leu

Phe

Pro

Glu

Ala

Ile Val

Val

Ala

465

470

475

480

Val

Asp

Val

Ser

Gly

Met

Pro

Val

Leu

Cys

Trp

Pro

Val Asp

Glu

Gly

4S5

490

495

Gly

Leu

Gly

Phe

Asp

Tyr

Arg

Gin

Ala

Met

Thr

Ile

Pro Asp

Arg

Trp

500

505

510

PL 205 884 B1

Ile

Asp

Tyr 515

Leu

Glu

Asn

Lys

Gly 520

Asp

Gin

Trp

Ser 525

Met

Ser

Val

Ile

Ser

Gin

Thr

Leu

Thr

Asn

Arg

Tyr

Pro

Glu

Lys

Phe

Ile

530

535

540

Ala

Tyr

Ala

Glu

Arg

Gin

Asn

His

Ser

Ile

Gly

Ser

Lys

Thr

Met

545

550

555

560

Ala

Phe

Leu

Met

Glu

Trp

Glu

Thr

Tyr

Ser

Gly

Met

Ser

Ma

Met

565

570

575

Asp

Pro

Asp

Ser

Pro

Thr

Ile

Asp

Arg

Ala

Ile

Ala

Leu

Gin

Lys

Met

580

585

590

Ile

His

Phe

Ile

Thr

Met

Ala

Phe

Gly

Asp

Ser

Tyr

Leu

Lys

Phe

595

-

600

605

Met

Gly

Asn

Glu

Tyr

Met

Asn

Ala

Phe

Val

Gin

Ala

Vai

Asp

Thr

Pro

610

615

620

Ser

Asp

Lys

Cys

Ser

Phe

Leu

Ser

Asn

Gin

Thr

Ma

Ser

His

625

630

535

640

Met

Asn

Glu

Lys

Gly

Ser

Ala

Leu

Thr

Lys

Gly

Tyr

Thr

His

645

650

655

Leu

Arg

Ser

Gly

Cys

Phe

Asp

Pro

Ser

Leu

Pro

Ser

Thr

Ser

Cys

650

665

570

Ala

Phe

Leu

Gly

Pro

Ser

Asn

Gin

Ser

Pro

Phe

Ser

Lys

Pro

Phe

Ile

675

680

685

Gly

Phe

Pro

Gly

Cys

Ile

Phe

Cys

Gly

Leu

Phe

Lys

Gly

Glu

690 695 700 <210> 23 <211> 752 <212> PRT <213> Zea mays <400> 23

Thr

Met

Ma

Thr

Ma

Lys

Gly

Asp

Val

Asp

His

Leu

Pro

Ile Tyr

Asp

1

5

10

15

Leu

Asp

Pro

Lys

Leu

Glu

Ile

Phe

Lys

Asp

Has

Phe

Arg

Tyr Arg

Met

PL 205 884 B1

20

25

30

Lys

Arg

Phe

Leu Glu

Gin

Lys

Gly

Ser

Ile

Glu

Asn Glu Gly

Ser

35

40

45

Leu

Glu

Ser

Phe Ser

Lys

Gly

Tyr

Leu

Lys

Phe

Gly

Ile Asn Thr

Asn

50

55

60

Glu

Asp

Gly

Thr Val

Tyr

Arg

Glu

Trp

Ala

Pro

Ala

Ala Gin Glu

Ala

65

70

75

80

Glu

Leu

Ile

Gly Asp

Phe

Asn

Asp

Trp

Asn

Gly

Ala

Asn His Lys

Met

85

90

95

Glu

Lys

Asp

Lys Phe

Gly

Val

Trp

Ser

Ile

Lys

Ile

Asp His Val

Lys

100

105

110

Gly

Lys

Pro

Ala Ile

Pro

His

Asn

Ser

Lys

Val

Lys

Phe Arg Phe

Leu

115

120

125

His

Gly

Val Trp

Val

Asp

Arg

Ile

Pro

Ala

Leu

Ile Arg Tyr

Ala

130

135

140

Thr

Val

Asp

Ala Ser

Lys

Phe

Gly

Ala

Pro

Tyr

Asp

Gly Val His

Trp

145

150

155

160

Asp

Pro

Ala Ser

Glu

Arg

Tyr

Thr

Phe

Lys

His

Pro Arg Pro

Ser

165

170

175

Lys

Pro

Ala

Ala Pro

Arg

Ile

Tyr

Glu

Ala

His

Val

Gly Met Ser

Gly

180

185

190

Glu

Lys

Pro

Ala Val

Ser

Thr

Tyr

Arg

Glu

Phe

Ala

Asp Asn Val

Leu

195

200

205

Pro

Arg

Ile

Arg Ala

Asn

Tyr

Asn

Thr

Val

Gin

Leu Met Ala

Val

210

215

220

Met

Glu

His

Ser Tyr

Tyr

Ala

Ser

Phe

Gly

Tyr

His

Val Thr Asn

Phe

225

230

235

240

Phe

Ala

Val

Ser Ser

Arg

Ser

Gly

Thr

Pro

Glu

Asp

Leu Lys Tyr

Leu

245

250

255

Val

Asp

Lys

Ala His

Ser

Leu

Gly

Leu

Arg

Val

Leu

Met Asp Val

Val

260

265

270

His

Ser

His

Ala Ser

Asn

Val

Thr

Asp

Gly

Leu

Asn Gly Tyr

Asp

PL 205 884 B1

275

280

285

Val

Gly

Gin

Ser

Thr

Gin

Glu

Ser

Tyr

Phe

His

Ala

Gly

A.sp

Arg

Gly

290

295

300

Tyr

His

Lys

Leu

Trp

Asp

Ser

A.rg

Leu

Phe

Asn

Tyr

Ala

A.sn

X -.

Glu

305

310

315

320

Val

Leu

Arg

Phe

Leu

Ser

Asn

Leu

Arg

Tyr

Trp

Leu

A.sp

C-lu

Phe

325

330

335

Met

Phe

Asp

Gly

Phe

Arg

Phe

Asp

Gly

Val

Thr

Ser

Met

Leu

Tyr

His

340

345

350

His

Gly

Ile

Asn

Val

Gly

Phe

Thr

Gly

Asn

Tyr

Gin

Glu

Tyr

Phe

355

360

365

Ser

Leu

Asp

Thr

Ala

Val

Asp

Ala

Val

Tyr

Met

Leu

Ala

Asn

370

375

380

His

Leu

Met

His

Lys

Leu

Pro

Glu

Ala

Thr

Val

Ala

Glu

Asp

385

390

395

400

Val

Ser

Gly

Met

Pro

Val

Leu

Cys

Arg

Pro

Val

Asp

Glu

Gly

Val

405

410

415

Gly

Phe

Asp

Ty z

Arg

Leu

Ala

Met

Ala

Ile

Pro

Asp

Arg

Trp

Ile

Asp

420

425

430

Tyr

Leu

Lys

Asn

Lys

Asp

Ser

Glu

Trp

Ser

Met

Gly

Glu

Ile

Ala

435

440

445

His

Thr

Leu

Thr

Asn

Arg

A.rg

Tyr

Thr

Glu

Lys

Cys

Ile

Ala

Tyr

Ala

450

455

460

Glu

Ser

His

Asp

Gin

Ser

Ile

Val

Gly

Asp

Lys

Thr

Ile

Ala

Phe

Leu

465

470

475

480

Leu

Met

Asp

Lys

Glu

Met

Tyr

Thr

Gly

Met

Ser

Asp

Leu

Gin

Pro

Ala

485

490

495

Ser

Pro

Thr

Ile

Asp

Arg

Gly

Ile

Ala

Leu

Gin

Lys

Met

Ile

His

Phe

500

505

510

Ile

Thr

Met

Ala

Leu

Gly

Asp

Gly

Tyr

Leu

Asn

Phe

Met

Gly

Asn

515

520

525

Glu

Phe

Gly

His

Pro

Glu

Trp

Ile

Asp

Phe

Pro

Arg

Glu

Gly

Asn

PL 205 884 B1

530 535

Trp Ser Tyr Asp Lys Cys Arg Arg 545 550

His Leu Arg Tyr Lys Tyr Met Asn 565

Leu Asp Glu Arg Phe Ser Phe Leu 580

Asp Met Asn Asp Glu Glu Lys Val 595 600

Val Phe Val Phe Asn Phe His Pro 610 615

Val Gly Cys Asp Leu Pro Gly Lys 625 630

Ala Leu Val Phe Gly Gly His Gly 645

Phe Thr Ser Pro Glu Gly Val Pro 660

Asn Arg Pro Asn Ser Phe Lys Val 675 680

Ala Tyr Tyr Arg Vai Asp Glu Ala 690 695

Lys Ala Glu Thr Gly Lys Thr Ser 705 710

Ala Ser Arg Ala Ser Ser Lys Giu 725

Lys Lys Gly Trp Lys Phe Ala Arg 740

540

Gin Trp Ser Leu Val Asp Thr Asp 555 560

Ala Phe Asp Gin Ala Met Asn Ala 570 575

Ser Ser Ser Lys Gin Ile Val Ser 585 590

Ile Val Phe Glu Arg Gly Asp Leu 605'

Lys Lys Thr Tyr Glu Gly Tyr Lys 620

Tyr Arg Val Ala Leu Asp Ser Asp 635 640

Arg Val Gly His Asp Vai Asp His 650 655

Gly Val Pro Glu Thr Asn Phe Asn 665 670

Leu Ser Pro Pro Arg Thr Cys Val 685

Gly Ala Gly Arg Arg Leu His Ala 700

Pro Ala Glu Ser Ile Asp Val Lys - 715 720

Asp Lys Glu Ala Thr Ala Gly Gly 730 735

Gin Pro Ser Asp Gin Asp Thr Lys 745 750 <210> 24 <211> 756 <212> PRT

PL 205 884 B1 <213> Oryza sativa <400> 24

Thr 1

Met

Val

Thr

Val 5

Val

Glu

Val

Asp 10

His

Leu

Pro

Ile

Tyr 15

Asp

Leu

Asp

Pro

Lys 20

Leu

Glu

Phe

Lys 25

Asp

His

Phe

Asn

Tyr 30

Arg

Ile

Lys

Arg

Tyr 35

Leu

Asp

Gin

Lys

Cys 40

Leu

Ile

Glu

Lys

His 45

Glu

Gly

Leu

Glu 50

C-lu

Phe

Ser

Lys

Gly 55

Tyr

Leu

Lys

Phe

Gly 60

Ile

Asn

Thr

Val

Asp 65

Gly

Ala

Thr

Ile

Tyr 70

Arg

Glu

Trp

Ala

Pro 75

Ala

Gin

Glu

Ala 80

Gin

Leu

Ile

Gly

Glu 85

Phe

Asn

Trp

Asn 90

Gly

Ala

Lys

His

Lys 95

Met

Glu

Lys

Asp

Lys 100

Phe

Gly

Ile

Trp

Ser 105

Ile

Lys

Ile

Ser

His 110

Val

Asn

Gly

Lys

Pro 115

Ala

Ile

Pro

His

Asn 120

Ser

Lys

Val

Lys

Phe 125

Arg

Phe

Arg

His

Gly 130

Gly

Ala

Trp

Val 135

Asp

Arg

Ile

Pro

Ala 140

Trp

Ile

Arg

Tyr

Ala 145

Thr

Phe

Asp

Ala

Ser 150

Lys

Phe

Gly

Ala

Pro 155

Tyr

Asp

Gly

Val

His 160

Trp

Asp

Pro

Ala 165

Cys

Glu

Arg

Tyr

Val 170

Phe

Lys

His

Pro

Arg 175

Pro

Lys

Pro

Asp 180

Ala

Pro

Arg

Ile

Tyr 185

Glu

Ala

His

Val

Gly 190

Met

Ser

Gly

Glu

Glu 195

Pro

Glu

Val

Ser

Thr 200

Tyr

Glu

Phe

Ala 205

Asp

Asn

Val

Leu

Pro 210

Arg

Ile_

Arg

Ala

Asn 215

Asn

Tyr

Asn

Thr

Val 220

Gin

Leu

Met

Ala

Ile 225

Met

Glu

His

Ser

Tyr 230

Tyr

Ala

Ser

Phe

Gly 235

Tyr

His

Val

Thr

Asn 240

PL 205 884 B1

Phe Phe Ala Val Ser Ser Arg Ser Gly Thr Pro Glu Asp Leu Lys Tyr 245 250 255

Leu Val Asp Lys Ala His Ser Leu Gly Leu Arg Val Leu Met Asp Val 2S0 265 270

Val His Ser His Ala Ser Asn Asn Val Thr Asp Gly Leu Asn Gly Tyr 275 280 285

Asp Val Gly Gin Asn Thr His Glu Ser Tyr Phe His Thr Gly Asp Arg 290 295 300

Gly Tyr His Lys Leu Trp Asp Ser Arę Leu Phe Asn Tyr Ala Asn Trp 305 310 315 320

Glu Val Leu A.rg Phe Leu Leu Ser Asn Leu Arg Tyr Trp Met Asp Glu . 325 330 335

Phe Met Phe Asp Gly Phe Arg Phe Asp Gly Val Thr Ser Met Leu Tyr

340 345 . · ^; 350

His His His Gly Ile Asn Lys Gly Phe Thr Gly Asn Tyr Lys Glu Tyr 355 360 365

Phe Ser Leu Asp Thr Asp Val Asp Ala Ile Val Tyr Met Met Leu Ala 370 375 380

Asn His Leu Met His Lys Leu Leu Pro Glu Ala Thr Ile Val Ala Glu

385 390 395 400

Asp Val Ser Gly Met Pro Val Leu Cys Arg Pro Val Asp Glu Gly Gly

405 410 415

Val Gly Phe Asp Phe Arg Leu Ala Met Ala Ile Pro Asp Arg Trp Ile 420 425 430

Asp Tyr Leu Lys Asn Lys Glu Asp Arg Lys Trp Ser Met Ser Glu Ile 435 440 445

Val Gin Thr Leu Thr Asn Arg Arg Tyr Thr Glu Lys Cys Ile Ala Tyr 450 455 460

Ala Glu Ser His Asp Gin Ser Ile Val Gly Asp Lys Thr Ile Ala Phe

465 470 475 480

Leu Leu Met Asp Lys Glu Met Tyr Thr Gly Met Ser Asp Leu Gin Pro

485 490 495

PL 205 884 B1

Glu Asp Cys Lys 755 <210> 25 <211> 762 <212> PRT <213> Pisum sativum <400> 25

Thr 1

Met

Pro

Ser Val 5

Glu Glu Asp

Phe

Glu 10

Asn

Ile

Gly

Ile

Leu 15

Asn

Val

Asp

Ser

Leu

Glu

Pro

Phe

Lys

Asp

His

Phe

Lys

Tyr

Arg

Leu

20

25

30

Lys

Arg

Tyr

Leu

His

Gin

Lys

Leu

Ile

Glu

Tyr

Glu

Gly

35

-

40

45

Lau

Gin

Glu

Phe

Ala

Lys

Gly

Tyr

Leu

Lys

Phe

Gly

Phe

Asn

Arg

Glu

50

55

60

Glu

Asp

Gly

Ile

Ser

Tyr

Arg

Glu

Trp

Ala

Pro

Ala

Gin

Glu

Ala

65

70

75

80

Gin

Ile

Gly

Asp

Phe

Asn

Gly

Trp

Asn

Gly

Ser

Asn

Leu

His

Met

85

90

95

Glu

Lys

Asp

Gin

Phe

Gly

Val

Trp

Ser

Ile

Gin

Ile

Pro

Asp

Ala

Asp

100

105

110

Gly

Asn

Pro

Ala

Ile

Pro

His

Asn

Ser

Arg

Val

Lys

Phe

Arg

Phe

Lys

115

120

125

His

Ser

Asp

Gly

Val

Trp

Val

Asp

Arg

Ile

Pro

Ala

Trp

Ile

Lys

Tyr

130

135

140

Ala

Thr

Val

Asp

Pro

Thr

Arg

Phe

Ala

Pro

Tyr

Asp

Gly

Val

Tyr

145

150

155

ISO

Trp

Asp

Pro

Leu

Ser

Glu

Arg

Tyr

Gin

Phe

Lys

His

Pro

Arg

Pro

165

170

175

Pro

Lys

Pro

Lys

Ala

Pro

Arg

Ile

Tyr

Glu

Ala

His

Val

Gly

Met

Ser

180

185

190

Ser

Glu

Pro

Arg

Ile

Asn

Ser

Tyr

Arg

Glu

Phe

Ala

Asp

Val

195

200

205

PL 205 884 B1

Leu

Pro 210

Arg

Ile

Arg

Glu

Asn 215

Asn

Tyr

Asn

Thr

Val 220

Gin

Leu

Met

PI a

Val 225

Met

Glu

His

Ser

Tyr 230

Tyr

Ala

Ser

Phe

Trp 235

Tyr

His

Val

Thr

Lys 240

Pro

Phe

Al a

Val 245

Ser

Arg

Ser

Gly 250

Ser

Pro

Glu

Asp

Leu 255

Lys

Tyr

Leu

Ile

Asp 260

Lys

Ala

His

Ser.

Leu 265

Gly

Leu

Asn

Val

Leu 270

Met

Asp

Val

Ile

His 275

Ser

His

Ala

Ser

Asn 280

Asn

Val

Thr

Asp

Gly 285

Leu

Asn

Gly

Phe

Asp 290

Val

Gly

Gin

Ser

Ser 295

Gin

Ser

Tyr

Phe 300

His

Ala

Gly

Asp

Arg 305

Gly

Tyr

His

Lys

Leu 310

Trp

Asp

Ser

Arg

Leu 315

Phe’

Asn

Tyr

Asn 320

Trp

Lys

Ser

Phe 325

Leu

Ser

Asn

Leu 330

Arg

Trp

Leu

Glu 335

Glu

Tyr

Lys

Phe

Asp 340

Gly

Phe

Arg

Phe

Asp 345

Gly

Val

Thr

Ser

Met 350

Leu

Tyr

His

His 355

Gly

Ile

Asn

Met

Ala 360

Phe

Thr

Gly

Asp

Tyr 365

Asn

Glu

Tyr

Phe

Ser 370

Glu

Thr

Asp

Val 375

Asp

Ala

Val

Tyr 380

Leu

Met

Leu

Ala

Asn 385

Ser

Leu

Val

His

Asp 390

Ile

Leu

Pro

Asp

Ala 395

Thr

Asp

Ile

Ala

Glu 400

Asp

Val

Ser

Gly

Met 405

Pro

Gly

Leu

Gly

Arg 410

Pro

Val

Ser

Glu

Val 415

Gly

Ile

Gly

Phe

Asp 420

Tyr

Arg

Leu

Ala

Met 425

Ala

Ile

Pro

Asp

Lys 430

Trp

Ile

Asp

Tyr

Leu 435

Lys

Asn

Lys

Asp 440

Ser

Glu

Trp

Ser

Met 445

Lys

Glu

Ile

Ser

Leu 450

Asn

Leu

Thr

Asn

Arg 455

Arg

Tyr

Thr

Glu

Lys 460

Cys

Val

Ser

Tyr

PL 205 884 B1

Ala Glu Ser His Asp Gin Ser Ile 465 470

Leu Leu Met Asp Glu Glu Met Tyr 435

Leu Ser Pro Thr Ile Glu Arg Gly 500

Phe Ile Thr Leu Ala Leu Gly Gly 515 520

Asn Glu Phe Gly His Pro Glu Trp

530 535

Gly Trp Ser Tyr Glu Lys Cys Arg

545 _ 550

Thr Asn His Leu Arg Tyr Lys Phe

565

Asn Leu Leu Asp Asp Lys Phe Ser 580

Val Ser Ser Thr Asn Asn Glu Asp 595 600

Asp Leu Val Phe Val Phe Asn Phe 610 615

Tyr Lys Val Gly Cys Asp Leu Pro 625 630

Ser Asp Ala Thr Glu Phe Gly Gly 645

Asp Gin Phe Thr Ser Pro Glu Gly 660

Phe Asn Asn A.rg Pro Asn Ser Phe 675 680

Cys Val Val Tyr Tyr Arg Val Asp 690 695

Pro Asn Leu Gly Ser Val Glu Glu 705 710

Val Gly Asp Lys Thr Ile Ala Phe 475 430

Ser Ser Met Ser Cys Leu Thr Met 490 495

Ile Ser Leu His Lys Met Ile His 505 510

Glu Gly Tyr Leu Asn Phe Met Gly 525

Ile Asp Phe Pro Arg Glu Gly Asn 540

Leu Thr Gin Trp Asn Leu Val Asp 555 560

Met Asn. Ala Phe'Asp Arg Ala Met 570 575

Ile Leu Ala Ser Thr Lys Gin Ile 585 590

Lys Val Ile Val Phe Glu Arg Gly 605

His Pro Glu Asn Thr Tyr Glu Gly 620

Gly Lys Tyr Arg Val Ala Leu Asp . 635 640

His Gly Arg Val Gly His Asp Ala 650 655

Ile Pro Gly Ile Pro Glu Thr Asn 665 670

Lys Val Leu Ser Pro Pro His Thr 685

Glu Arg Gin Glu Glu Ser Asn Asn 700

Thr Phe Ala Ala Ala Asp Thr Asp 715 720

PL 205 884 B1

Val

AJ. 3

Arg

Ile

Pro 725

Asp

Val

Ser

Met

Glu 730

Ser

Glu

Asp

Ser

Asn 735

Leu

Asp

Arg

Ile

Glu

Asp

Asn

Ser

Glu

Asp

Ala

Val

Asp

Ala

Gly

Ile

Leu

740

745

750

Lys

Val

Glu

Arg

Glu

Val

C-ly

Asp

Asn

755 760 !

<210> 26 <211> 984 <212> DNA <213> Triticum aestivum <400> 26

atatgtatga	tttcatggct	ctggatagac	cttcaactcc	tcgcattgat	cgtggcatag	60
cattacataa	aatgatcagg	cttgtcacca	tgggtttagg	tggcgaagcc	tatcttaact	120
tcatgggaaa	tgagtttggg	catcctgaat	ggatągattt	tccaagaggt	ccgcaaactc	180
ttccaaccgg	caaagttctc	cctggaaata	acaatagtta	tgataaatgc	cgccgtagat	240
ttgatcttgg	agatgcagat	tttcttagat	atcgtggtat	gcaagagtcc	gaccaggoaa	300
tgcagcatct	tgaggaaaaa	tatgggttta	tgacatctga	gcaccagtat	gtttcacgga	360
aacatgagga	agataaggtg	atcatcttcg	aaagaggaga	tttggtattc	gttttcaact	420
tccaccggag	caatagcttt	tttgactacc	gtgttgggtg	ttccaggcct	gggaagtaoa	480
aggtggcctt	agactccgac	gatgcactct	ttggtggatt	cagcaggctt	gatcatgatg	540
tcgactactt	cacaaccgaa	catccgcatg	aoaacaggcc	gcgctctttc	tcggtgtaca	600
ctccgagcag	aactgcggto	gtgtatgccc	ttacagagta	agaaccagca	gctgcttgtt	660
acaaggcaaa	gagagaactc	cagagagctc	gtggatcgtg	agcgaagcga	ogggcaacgg	720
cgcgaggccg	ctctaagcgc	catgactggg	aggggatcgt	gcctcttccc	cagatgccag	730
gaggagcaga	tggataggta	gcttgttggt	gagcgctcga	aagaaaatgg	acgggcctgg	840
gtgtttgtcg	tgctgcacta	ccctcctcct	atcttgcaca	ttcccggttg	totttgtaca	900
tataactaat	aattgcccgt	gcgctcaacg	taaacatata	aatattctaa	taataggtta	960
tcccgtgaaa	aaaaaaaaaa	aaaa				984

<210> 27 <211> 977 <212> DNA <213> Triticum aestivum <400> 27

atatgtatga	tttcatggct	ctggatagac	cttcaactcc	tcgcattgat	cgtggcatag	60
cattacataa	aatgatcagg	cttgtcacca	tgggtttagg	tggcgaaggc	tatcttaact	120
tcatgggaaa	tgagtttggg	catcctgaat	ggatagattt	tccaagaggt	ccgcaaactc	180
ttccaaccgg	caaagttctc	cctggaaata	acaatagtta	tgataaatgc	cgccgtagat	240
ttgatcttgg	agatgcagat	tttcttagat	atcgtggtat	gcaagagttc	gaccaggoaa	300
tgcagcatct	tgaggaaaaa	tatgggttta	tgacatctga	gcaccagtat	gtttcacgga	360
aacatgagga	agataaggtg	atcatcttcg	aaagaggaga	tttggtattt	gttttcaact	420

PL 205 884 B1

tccactggag	caatagcttt	Łttgactacc	gtgttgggtg	ttccaagoct	gggaagtaca	480
aggtggcctt	agactccgac	gatgoactct	ttggtggatt	cagcaggctt	gatcatgatg	540
tcgactactt	cacaaccgaa	catccgoatg	acaataggcc	gcgctctttc	ttggtgraca	600
crcctagcag	aactgcggtc	gtgtatgccc	ttacagagta	agaaccagca	gcggcttgtt	6 60
acaaggcaaa	gagagaactc	cagggagctc	gtggattgtg	agcgaagcga	cgggcaactg	720
cgogaggctg	ctctaagcgc	catgactggg	acgggatcgt	gcctcttcoc	otgatgccag	780
gaggatcaga	tggataggta	gcttgttggt	gagcgctcga	aagaaaatgg	aogggcctgg	840
gtgtttgtcg	tgctgcactt	aaccctcctc	ctatgttgca	cattccccgg	tgtttttgta	900
catataacta	ataattgccc	gtgcgcttca	acatgaacat	ataaatattc	tatataaaaa	960
aaaaaaaaaa	aaaaaaa					977

<210> 23 <211> 212 <212> PRT <213> Triticum aestivum <400> .28 ·

Met Tyr Asp_Phe Met Ala Leu Asp Arg Pro Ser Thr Pro Arg Ile .Asp 15 10 15

Arg Gly Ile Ala Leu His Lys Met Ile Arg Leu Val Thr Met Gly Leu 20 25 30

Gly Gly Glu Gly Tyr Leu Asn Phe Met Gly Asn Glu Phe Gly His Pro 35 40 45

Glu Trp Ile Asp Phe Pro Arg Gly Pro Gin Thr Leu Pro Thr Gly Lys 50 55 60

Val Leu Pro Gly Asn Asn Asn Ser Tyr Asp Lys Cys Arg Arg Arg Phe 65 70 75 80

Asp Leu Gly Asp Ala Asp Phe Leu Arg Tyr Arg Gly Met Gin Glu Phe

90 95

Asp Gin Ala Met Gin His Leu Glu Glu Lys Tyr Gly Phe Met Thr Ser

100 105 110

Glu His Gin Tyr Val Ser Arg Lys His Glu Glu Asp Lys Val Ile Ile 115 120 125

Phe Glu Arg Gly Asp Leu Val Phe Val Phe Asn Phe His Trp Ser Asn 130 135 140

Ser Phe Phe Asp Tyr Arg Val Gly Cys Ser Lys Pro Gly Lys Tyr Lys

145 150 155 160

Val Ala Leu Asp Ser Asp Asp Ala Leu Phe Gly Gly Phe Ser Arg Leu

PL 205 884 B1

165 170 175

Asp

His

Asp

Val 180

Asp

Tyr

Phe

Thr

Thr 1S5

Glu

His

Pro

His

Asp 190

Asn

Arg

Pro

Arg

Ser

Phe

Leu

Val

Tyr

Thr

Pro

Ser

Arg

Thr

Ala

Val

Tyr

195

200

205

Ala

Leu

Thr

Glu

210 <210> 29 <211> 212 <212> PRT <213> Zea mays

<400> 29

Phe

Met 5

Ala

Leu Asp Arg

Pro 10

Ser

Thr

Pro

Thr

Ile 15

Asp

Met 1

Tyr

Asp

Arg

Gly

Ile

Ala 20

Leu

His

Lys Met Ile 25

A.rg

Leu

Ile

Thr

Met 30

Gly

Leu

Gly

Glu 35

Gly

Tyr

Leu

Asn Phe Met 40

Gly

Asn

Glu

Phe 45

Gly

His

Pro

Glu

Trp 50

Ile

Asp

Phe

Pro

Arg Gly Pro 55

Gin

Arg

Leu 60

Pro

Ser

Gly

Lys

Phe 65

Ile

Pro

Gly

Asn

Asn 70

Asn Ser Tyr

Asp

Lys 75

Cys

Arg

Phe 80

Asp

Leu

Gly

Asp

Ala 85

Asp

Tyr Leu Arg

Tyr 90

His

Gly

Met

Gin

Glu 95

Phe

Asp

Gin

Ala

Met 100

Gin

His

Leu Glu Gin 105

Lys

Tyr

Glu

Phe

Met 110

Thr

Ser

Asp

His

Gin 115

Tyr

Ile

Ser

Arg Lys His 120

Glu

Asp

Lys 125

Val

Ile

Val

Phe

Glu 130

Lys

Gly

Asp

Leu

Val Phe Val 135

Phe

Asn

Phe 140

His

Cys

Asn

Ser

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Arg

Ile Gly Cys

Arg

Lys

Pro

Gly

Val

Tyr

Lys

145 150 155 160

PL 205 884 B1

Vai

Val

Leu

Asp

Ser 165

Asp

Ala

C-ly

Leu

Phe 170

Gly

Phe

Ser

Arg 175

Ile

His

Kis

Ala

Ala 130

Glu

His

Phe

Thr

Ala 185

Asp

Cys

Ser

His

Asp 190

Asn

Arg

Pro

Tyr

Ser 155

Phe

Ser

Val

Tyr

Thr 200

Pro

Ser

Arg

Thr

Cys 205

Val

Tyr

A_L 3

Pro

Val

Glu

210 <210> 30 <211> 216 <212> PRT <213> Zea mays

<400> 30

Met

Tyr

Asp

Phe

Met

Ala

Leu

Asp

Arg

Pro

Ser

Thr

Pro Arg

Ile

Asp

1

5

10

15

Arg

Gly

Ile

Ala

Leu

His

Lys

Met

Ile

Arg

Leu

Val

Thr Met

Gly

Leu

20

25

30

Gly

Glu

Gly

Tyr

Leu

Asn

Phe

Met

Gly

Asn

Glu

Phe Gly

His

Pro

35

40

45

Glu

Trp

Ile

Asp

Phe

Pro

Arg

Gly

Pro

Gin

Ser

Leu

Pro Asn

Gly

Ser

50

55

60

Val

Ile

Pro

Gly

Asn

ser

Phe

As p

Lys

Cys

Arg Arg

Arg

Phe

65

70

75

80

Asp

Leu

Gly

Asp

Ala

Asp

Tyr

Leu

Arg

Tyr

Arg

Gly

Met Gin

Glu

Phe

85

90

95

Asp

Gin

Ala

Met

Gin

His

Leu

Glu

Gly

Lys

Tyr

Glu

Phe Met

Thr

Ser

100

105

110

Asp

Kis

Ser

Tyr

Phe

Ser

Arg

Lys

His

Glu

Asp

Lys Val

Ile

115

120

125

Phe

Glu

Arg

Gly

Asp

Leu

Val

Phe

Val

Phe

Asn

Phe

His Trp

Ser

Asn

130

135

140

Ser

Tyr

Phe

Asp

Tyr

Arg

Val

Gly

Cys

Phe

Lys

Pro

Gly Lys

Tyr

Lys

145 150 155 160

PL 205 884 B1

Ile Val Leu Asp Ser Asp Asp Gly Leu Phe Gly Gly Phe Ser Arg Leu 165 170 175

Asp His Asp Ala Glu Tyr Phe Thr Ala Asp Trp Pro His Asp Asn A.rg 180 185 150

Pro Cys Ser Phe Ser Val Tyr Ala Pro Ser A.rg Thr Ala 7al Val Tyr 195 200 205

Ala Pro Ala Gly Ala Glu Asp Glu 210 215 <210> 31 <211> 217 <212> DNA <213> Zea mays <400> 31

tagcggggta	ctcgttgctg	cgcggcatgt	gtggcgctgt	cgatgtgagg	aaaaaccttc	60
ttccaaaacc	ggcagatgca	tgcatgcatg	ctacaataag	gttctgatac	trtaatcgat	120
gctggaaagc	ccatgcatct	cgctgcgttg	tcctctctat	atatataaga	ccttcaaggt	180
gtoaattaaa	catagagttt	tcgtttttcg	ctttcct			217

<210> 32 <211> 686 <212> PRT <213> Triticum aestivum <400> 32

Met

Leu

Cys

Leu

Ser

Leu

Pro

Arg

Pro

Ser Ala Ala

Ala

1

5

10

15

Asp

Arg

Pro

Leu

Pro

Gly

Ile

Ala

Gly

Gly Gly Lys

Arg

20

25

30

Leu Ser Val Val Pro Ser Val Pro Phe Leu Leu Arg Trp Leu Trp Pro 35 40 45

Arg Lys Ala Lys Ser Lys Ser Phe Val Ser Val Thr Ala A.rg Gly Asn 50 55 60

Lys Ile Ala Ala Thr Thr Gly Tyr Gly Ser A.sp His Leu Pro Ile Tyr 65 70 75 80

Asp Leu Asp Leu Lys Leu Ala Glu Phe Lvs Asp His Phe Asd Tyr Thr ' 85 50 95

PL 205 884 B1

Arg

Asn

Ara

Tyr 100

Ile

Glu

Gin

Lys

His 105

Leu

Ile

Glu

Lys

His 110

Glu

Gly

Ser

Leu

Glu

Phe

Ser

Lys

Gly

Tyr

Leu

Lys

Phe

Gly

Ile

Asn

Thr

115

120

125

Glu

His

Gly

Ala

Ser

Val

Tyr

Arg

Glu

Trp

.Ala

Pro

Ala

Glu

130

135

140

Ala

Gin

Leu

Val

Gly

Asp

Phe

Asn

Trp

Asn

Gly

Ser

Gly

His

Lys

145

150

155

160

Met

Ala

Lys

Asp

Asn

Phe

Gly

Val

Trp

Ser

Ile

Arg

Ile

Ser

His

Val

165

170

175

Asn

Gly

Lys

Pro

Ala

Ile

Pro

His

Asn

Ser

Lys

Vai

Lys

Phe

Arg

Phe

•180

185

190

Arg

His

Gly

Val

Trp

val

Glu

Gin

Ile

Pro

Ala'

Trp

Ile

Arg

Tyr

195

200

205

Ala

Thr

Val

Thr

Ala

Ser

Glu

Ser

Gly

Ala

Pro

Tyr

Asp

Gly

Leu

His

210

215

220

Trp

Asp

Pro

Ser

Glu

Arg

Tyr

val

Phe

Asn

His

Pro

Arg

Pro

225

230

235

240

Pro

Lys

Pro

Asp

Val

Pro

Arg

Ile

Tyr

Glu

Ala

His

Val

Gly

Val

Ser

245

250

255

Gly

Lys

Leu

Glu

Ala

Gly

Thr

Tyr

Arg

Glu

Phe

Pro

Asp

Asn

Val

260

265

270

Leu

Pro

Cys

Leu

Arg

Ala

Thr

Asn

Tyr

Asn

Thr

Val

Gin

Leu

Met

Gly

275

280

285

Ile

Met

Glu

His

Ser

Asp

Ser

Ala

Ser

Phe

Gly

Tyr

His

Val

Thr

Asn

290

295

300

Phe

Ala

Val

Ser

Arg

Ser

Gly

Thr

Pro

Glu

Asp

Leu

Lys

Tyr

305

310

315

320

Leu

Ile

Asp

Lys

Ala

His

Ser

Leu

Gly

Leu

Arg

Val

Leu

Met

Asp

Val

325

330

335

Val

His

Ser

His

Ala

Ser

Asn

Val

Ile

Asp

Gly

Leu

Asn

Gly

Tyr

340

345

350

PL 205 884 B1

Asp

Val

Gly 355

Gin

Ser

Ala

His

Glu 360

Ser

Tyr

Phe

Tyr

Thr 365

Gly

Asp Lys

Gly

Tyr 370

Asn

Lys

Met

Trp

Asn 375

Gly

Arg

Met

Phe

Asn 380

Tyr

Ma

Asn Trp

Glu 385

Val

Leu

Arg

Phe

Leu 390

Leu

Ser

Asn

Leu

Arg 395

Tyr

Trp

Met

Asp Glu 400

Phe

Met

Phe

Asp

Gly 405

Phe

Arg

Phe

Val

Gly 410

Val

Thr

Ser

Met

Leu Tyr 415

Asn

His

Asn

Gly 420

Ile

Asn

Met

Ser

Phe 425

Asn

Gly

Asn

Tyr

Lys 430

Asp Tyr

Ile

Gly

Leu 435

Asp

Thr

Asn

Val

Asp 440

Ala

Phe

Val

Tyr

Met 445

Met

Leu Ala

Asn

His 450

Leu

Met

His

Lys

Leu 455

Phe

Pro

Glu

Ala

Ile’ 460

Val

Ma Val

Asp 465

Val

Ser

Gly

Met

Pro 470

Val

Leu

Cys

Trp

Pro 475

Val

Asp

Glu

Gly Gly 480

Leu

Gly

Phe

Asp

Tyr 485

Arg

Gin

Ala

Met

Thr 490

Ile

Pro

Asp

Arg

Tr? Ile 495

Asp

Tyr

Leu

Glu 500

Asn

Lys

Gly

Asp

Gin 505

Gin

Trp

Ser

Met

Ser 510

Ser Val

Ile

Ser

Gin 515

Thr

Leu

Thr

Asn

Arg 520

Arg

Tyr

Pro

Glu

Lys 525

Phe

Ile Ma

Tyr

Ala 530

Glu

Arg

Gin

Asn

His 535

Ser

Ile

Gly

Ser 540

Lys

Thr

Met Ma

Phe 545

Leu

Met

Glu

Trp 550

Glu.

Thr

Tyr

Ser

Gly 555

Met

Ser

.-Li 3

Met Asp 560

Pro

Asp

Ser

Pro

Thr 565

Ile

Asp

Arg

Ala

Ile 570

Ala

Leu

Gin

Lys

Met Ile 575

His

Phe

Ile

Thr 580

Met

Ala

Phe

Gly

Gly 585

Asp

Ser

Tyr

Leu

Lys 590

Phe Met

Gly.

Asn

Glu

Tyr

Met

Asn

Ala

Phe

Val

Gin

Ala

val

Asp

Thr

Pro Ser

595 600 605

PL 205 884 B1

Asp

Lys 610

Cys

Ser

Phe

Leu

Ser 615

Ser

Asn

Gin

Thr 620

Ala

Ser

His

Met

Asn 625

Glu

Lys

Gly 630

Ser

Al s

Leu

Thr

Lys 635

C-ly

Tyr

Thr

His

Leu 640

Arg

Ser

Gly

Cys

Phe S45

Asp

Pro

Ser

Leu

Pro 650

Ser

Thr

Ser

Cys 655

Ala

Phe

Leu

Gly

Pro 660

Ser

Asn

Gin

Ser

Pro 665

Phe

Ser

Lys

Pro

Phe 67 0

Ile

Gly

Phe

Pro

Gly

Cys

Ile

Phe

Cys

Gly

Leu

Phe

Lys

Gly

Glu

675 680 685 <210> 33 · <211> 830 <212> PRT <213> Triticum aestiwum <400> 33

Met 1

Leu

Cys

Leu

Thr 5

Ala

Pro

Ser

Cys

Ser 10

Pro

Ser

Leu

Pro

Pro 15

Arg

Pro

Ser

Arg

Pro 20

Ala

Asp

Arg

Pro 25

Gly

Pro

Gly

Ile

Ser 30

Gly

Asn

Val 35

Arg

Leu

Ser

Ala

Val 40

Pro

Ala

Pro

Ser

Ser 45

Leu

Arg

Trp

Ser

Trp 50

Pro

Arg

Lys

Ala

Lys 55

Ser

Lys

Phe

Ser

Val 60

Pro

Val

Ser

Ala

Pro 65

Arg

Asp

Tyr

Thr

Met 70

Ala

Thr

Ala

Glu

Asp 75

Gly

Val

Gly

Asp

Leu 80

Pro

Ile

Tyr

Asp

Leu 85

Asp

Pro

Lys

Phe

Ala 90

Gly

Phe

Lys

Glu

His 95

Phe

Ser

Tyr

Arg

Met 100

Lys

Tyr

Leu

Asp 105

Gin

Lys

His

Ser

Ile 110

Glu

Lys

His

Glu

Gly 115

Gly

Leu

Glu

Phe 120

Ser

Lys

Gly

Tyr

Leu 125

Lys

Phe

Gly

Ile

Asn

Thr

Glu

Asn

Asp

Ala

Thr

Val

Tyr

Arg

Glu

Trp

Ala

Pro

Ala

PL 205 884 B1

130

135

140

Ala Met Asp Ala Gin Leu Ile Gly Asp Phe Asn Asn Trp Asn Gly Ser

145 150 155 160

Gly Eis Arg Met Thr Lys Asp Asn Tyr Gly Val Trp Ser Ile Arg Ile

165 170 175

Ser His Val Asn Gly Lys Pro Ala Ile Pro His Asn Ser Lys Vai Lys 180 185 ISO

Phe Arg Phe His Arg Gly Asp Gly Leu Trp Val Asp Arg Val Pro Ala 195 200 205

Trp Ile Arg Tyr Ala Thr Phe Asp Ala Ser Lys Phe Gly Ala Pro Tyr 210 215 220

Asp Gly Val .His Trp Asp Pro Pro Ser Gly Glu Arg Tyr Val Phe Lys

225 230 235 240

His Pro Arg Pro Arg Lys Pro Asp Ala Pro Arg Ile Tyr Glu Ala His

245 250 255

Val Gly Met Ser Gly Glu Lys Pro Glu Val Ser Thr Tyr Arg Glu Phe 260 265 270

Ala Asp Asn Val Leu Pro Arg Ile Lys Ala Asn Asn Tyr Asn Thr Val 275 280 285

Gin Leu Met Ala Ile Met Glu His Ser Tyr Tyr Ala Ser Phe Gly Tyr 290 295 300

His Val Thr Asn Phe Phe Ala Val Ser Ser Arg Ser Gly Thr Pro Glu

305 310 ' 315 320

Asp Leu Lys Tyr Leu Val Asp Lys Ala His Ser Leu Gly Leu Arg Val

325 330 335

Leu Met Asp Val Val His Ser His Ala Ser Ser Asn Lys Thr Asp Gly 340 345 350

Leu Asn Gly Tyr Asp Val Gly Gin Asn Thr Gin Glu Ser Tyr Phe His 355 360 365

Thr Gly Glu Arg Gly Tyr His Lys Leu Trp Asp Ser Arg Leu Phe Asn 370 375 380

Tyr Ala Asn Trp Glu Val Leu Arg Phe Leu Leu Ser Asn Leu Arg Tyr

PL 205 884 B1

645

6 5 0

65 5

Lys

Gin

Ile

Val

Ser

Asp

MeC

Asn

Glu

Lys

Ile

Val

Phe

660

665

670

Glu

Arg

Gly

Asp

Leu

Val

Phe

Val

Phe

Asn

Phe

His

Pro

Ser

Lys

Thr

675

680

685

Tyr

Asp

Gly

Tyr

Lys

Val

Gly

cys

Asp

Leu

Pro

Gly

Lys

Τ’, r . - J

Lys

Val

690

695

700

Ala

Leu

Asp

Ser

Asp

AL a

Leu

Met

Phe

Gly

His

Gly

Arg

Val

Ala

705

710

715

720

His

Asp

Asn

Asp

His

Phe

Thr

Ser

Pro

Glu

Gly

Val

Pro

Gly

Val

Pro

725

730

735

Glu

Thr

Asn

.Phe

Asn

Arg

Pro

Asn

Ser

Phe

Lys

Ile

Leu

Ser

Pro

740

745

750

ser

Arg

Thr

Cys

Val

Al a

Tyr

Arg

Val

Glu

Lys

Ala

Glu

Lys

755

760

765

Pro

Lys

Asp

Glu

Gly

Ala

Ser

Trp

Gly

Lys

Thr

Ala

Leu

Gly

Tyr

770

775

780

Ile

Asp

Val

Glu

Ala

Thr

Gly

Val

Lys

Asp

AL a

Ala

Asp

Gly

Glu

Ala

785

790

795

800

Thr

Ser

Gly

Ser

Glu

Lys

Ala

Ser

Thr

Gly

Asp

Ser

Lys

805

810

815

Gly

Ile

Asn

Phe

Val

Phe

Leu

Ser

Pro

Asp

Lys

Asp

Asn

Lys

320 325 830 <210> 34 <211> 818 <212> PRT

<213> Triticum aestivum
<400> 34
Met Ala Thr	Phe Ala Val Ser	Gly Trp Thr	Leu	Gly	Val	Ala	Arg	Pro
1	5	10					15
Ala Gly Ala	Gly Gly Gly Leu	Leu Pro Arg	Ser	Gly	Ser	Glu	Arg	Arg
	20	25				30

PL 205 884 B1

Gly

Val 3 ^c

Asp

Leu

Pro

Ser

Leu 40

Leu

Arg

Lys

Lys 45

Asp

Ser

Arg

Ala

Ser

Pro

Gly

Lys

Val

Leu

Val

Pro

Asp

Gly

Glu

Ser

Asp

50

55

50

Asp

Leu

Ala

Ser

Pro

Ala

Gin

Pro

Glu

Leu

Gin

Ile

Pro

Glu

Asp

65

70

75

80

Ile

Glu

Gin

Thr

Ala

Glu

Val

Asn

Met

Thr

Gly

Thr

Aia

Glu

85

90

95

Lys

Leu

Glu

Ser

Glu

Pro

Thr

Gin

Gly

Ile

Val

Glu

Thr

Ile

Thr

100

105

110

Asp

Gly

Val

Thr

Lys

Gly

Val

Lys

Glu

Leu

Val

Gly

Glu

Lys

Pro

115

120

125

Arg

Val

Pro

Lys

Pro

Gly

Asp

Gly

Gin

Lys

Ile

Tyr

Glu

Ile

Asp

130

135

140'

Pro

Thr

Leu

Lys

Asp

Phe

Arg

Ser

His

Leu

Asp

Tyr

Arg

Tyr

Ser

Glu

145

150

155

160

Tyr

Arg

Ile

Arg

Ala

Ile

Asp

Gin

His

Glu

Gly

Leu

Glu

165

170

175

Al a

Phe

Ser

Arg

Gly

Tyr

Glu

Lys

Leu

Gly

Phe

Thr

Arg

Ser

Ala

Glu

180

135

190

Gly

Ile

Thr

Tyr

Arg

Glu

Trp

Ala

Pro

Gly

Ala

His

Ser

Ala

Ma

Leu

195

200

205

Val

Gly

Asp

Phe

Asn

Trp

Asn

Pro

Asn

Ala

Asp

Thr

Met

Thr

Arg

210

215

220

Asp

Tyr

Gly

Val

Trp

Glu

Ile

Phe

Leu

Pro

Asn

Ala

Asp

Gly

225

230

235

240

Ser

Pro

Ala

Ile

Pro

His

Gly

Ser

Arg

Val

Lys

Ile

Arg

Met

Asp

Thr

245

250

255

Pro

Ser

Gly

Val

Lys

Asp

Ser

Ile

Ser

Ala

Trp

Ile

Lys

Phe

Ser

Val

260

265

270

Gin

Ala

Pro

Gly

Glu

Ile

Pro

Phe

Asn

Gly

Ile

Tyr

Asp

Pro

275

280

285

PL 205 884 B1

Glu

Glu 290

Glu

Lys

Tyr

Val

Phe 295

Gin

His

Pro

Gin

Pro 300

Lys

Arg

Pro

Glu

Ser 305

Leu

Arg

Ile

Tyr

Glu 310

Ser

His

Ile

Gly

Met 315

Ser

Pro

Glu

Pro 320

Lys

Ile

Asn

Ser

Tyr 325

Ala

Asn

Phe

Arg

Asp 330

Glu

Val

Leu

Pro

Arg 335

Ile

Lys

Arg

Leu

Gly 340

Tyr

Asn

Ala

Val

Gin 345

Ile

Met

Ala

Ile

Gin 350

Glu

His

Ser

Tyr

Tyr 355

Ala

ser

Phe

Gly

Tyr 360

His

val

Thr

Asn

Phe 365

Phe

Ala

Pro

Ser

Ser 370

Arg

Phe

Gly

Thr

Pro 375

Glu

Asp

Leu

Lys

Ser 380

Leu

Ile

Asp

Arg

Ala 385

His

Glu

Leu

Gly

Leu 390

Ile

Val

Leu

Met

Asp 395

Ile

Val

His

Ser

His 400

Ser

Asn

Thr 405

Leu

Asp

Gly

Leu

Asn 410

Gly

Phe

Asp

Gly

Thr 415

Asp

Thr

His

Tyr

Phe 420

His

Gly

Pro

Arg 425

Gly

His

Trp

Met 430

Trp

Asp

Ser

Arg

Leu 435

Phe

Asn

Tyr

Giy

Ser 440

Trp

Glu

Val

Leu

Arg 445

Phe

Leu

Ser

Asn 450

Ala

Arg

Trp

Leu 455

Glu

Tyr

Lys

Phe 460

Asp

Gly

Phe

Arg

Phe 465

Asp

Gly

Val

Thr

Ser 470

Met

Tyr

Thr

His 475

His

Gly

Leu

Gin

Met 480

Thr

Phe

Thr

Giy

Asn 485

Tyr

Gly

Glu

Tyr

Phe 490

Gly

Phe

Ala

Thr

Asp 495

Val

Asp

Ala

Val

Val 500

Tyr

Leu

Met

Leu

Val 505

Asn

Asp

Leu

Ile

His 510

Gly

Leu

His

Pro

Asp 515

Ala

Val

Ser

Ile

Gly 520

Glu

A.sp

Val

Ser

Gly 525

Met

Pro

Thr

Phe

Cys

Ile

Pro

Val

Pro

Asp

Gly

Val

Gly

Leu

Asp

Tyr

Arg

Leu

530 535 540

PL 205 884 B1

His 545

Met

Ala

Val

PI a

Asp 550

Lys

Trp

Ile

Glu

Leu 555

Leu

Lys

Gin

Ser

Asp 560

Glu

Ser

Trp

Lys

Met 565

Gly

Asp

Ile

Val

His 570

Thr

Leu

Thr

Asn

Arg 575

Arg

Trp

Leu

Glu

Lys 580

Cys

Val

Thr

Tyr

Ala 585

Glu

Ser

His

Asp

Gin 590

fla

Leu

Val

Gly

Asp 595

Lys

Thr

Ile

Ala

Phe 600

Trp

Leu

Met

Asp

Lys 605

Asp

Met

Tyr

Asp

Phe 610

Met

Ala

Leu

Asp

Arg 615

Pro

Ser

Thr

Pro

Arg 620

Ile

Asp

Arg

Gly

Ile 525

Ala

Leu

His

Lys

Met 630

Ile

Arg

Leu

val

Thr 635

Met

Gly

Leu

Gly

Gly 640

Glu

Gly

Tyr

Leu

Asn 645

Phe

Met

Gly

Asn

Glu 650·

Phe

Gly

His

Pro

Glu 655

Trp

Ile

Asp

Phe

Pro 660

Arg

Gly

Pro

Gin

Thr 665

Leu

Pro

Thr

Gly

Lys 570

Val

Leu

Pro

Gly

Asn 675

Asn

Ser

Tyr

Asp 680

Lys

Cys

Arg

Arg 685

Phe

Asp

Leu

Gly

Asp 690

Ala

Asp

Phe

Leu

Arg 695

Tyr

His

Gly

Met

Gin 700

Glu

Phe

Asp

Gin

Ala 705

Met

Gin

His

Leu

Glu 710

Glu

Lys

Tyr

Gly

Phe 715

Met

Thr

ser

Glu

His 720

Gin

Tyr

Val

Ser

Arg 725

Lys

His

Glu

Asp 730

Lys

Val

Ile

Phe 735

Glu

Arg

Gly

Asp

Leu 740

Val

Phe

Val

Phe

Asn 745

Phe

His

Trp

Ser

Asn 750

Ser

Phe

Asp

Tyr 755

Arg

Val

Gly

Cys

Ser 760

Arg

Pro

Gly

Lys

Tyr 765

Lys

Val

Ala

Leu

Asp 770

Ser

Asp

Ala

Leu 775

Phe

Gly

Phe

Ser 780

Arg

Leu

Asp

His

Asp 785

Val

Asp

Tyr

Phe

Thr 790

Thr

Glu

His

Pro

His 795

Asp

Asn

Arg

Pro

Arg 800

PL 205 884 B1

Ser Phe Ser Val Tyr Thr Pro Ser Arg Thr Ala Val Val Tyr Ala Leu 805 810 315

Thr Glu <210> 35 <211> 813 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 35 gagctccgtt tcgcatgatt gaacaagatg gattgcacgc aggttctccg cccgcttggg 60 tggagaggct attcggctat gactgggcac aacagacaat cggctgctct gatgccgccg 120 tgttccggct gtcagcgcag gggcgcccgg ttctttttgt caagaccgac ctctccggtg 180 ccctgaatga actgcaggac gaggcagcgc ggctatcgtg gctggccacg acgggcgttc 240 cttgcgcagc t.gtgctogac gttgtcactg aagcgggaag ggactggctg ctattgggcg 300 aagtgccggg gcaggatctc ctgtcatctc accttgctcc tgccgagaaa gtatccatca 360 tggctgatgc aatgcggcgg ctgcatacgc ttgatccggc tacctgccca ttcgaccacc 420 aagcgaaaca tcgcatcgag cgagcacgta ctcggatgga agecggtctt grcgatcagg 480 atgatctgga cgaagagcat caggggctcg cgccagccga actgttcgcc aggctcaagg 540 cgcgcatgcc cgacggcgag gatctcgtcg tgacccatgg cgatgcctgc ttgccgaata 600 tcatggtgga aaatggccgc ttttctggat tcatcgactg tggccggctg ggtgtggcgg 660 accgctatca ggacatagcg ttggctaccc gtgatattgc tgaagagctt ggcggcgaat 720 gggctgaccg cttcctcgtg ctttacggta tcgccgctcc cgattcgcag cgcatcgcct 780 tctatcgcct tcttgacgag ttcttctgag ctc 813 <210> 35 <211> 7 <212> PRT <213> Triticum aestivum <400> 36 '

Met Asp Lys Asp Met Tyr Asp 1 5 <210> 37 <211> 40 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: synetyczny oligonukleotyd <4O0> 37

PL 205 884 B1 aaggatccgt cgacatccat aatacgactc actataggga 40 <210> 38 <211> 17 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

< 2 2 3 > Qpj_s sztucznej sekwencj i: synetyczny ol igonukleotyd <400> jd aaggatccgt cgacatc 17 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: synetyczny oligonukleotyd <400> 39 atggacaagg atatgtatga 20 <210> 40 <211> 21 <212> DNA < 213 > Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: synetyczny oligonukleotyd <400> 40 ttttcttcac aaccccctgg g 21 <210> 41 <211> 21 <212> DNA < 213 > Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: synetyczny oligonukleotyd

PL 205 884 B1 <400> 41 tgtttgggag atcttcctcc c 21 <210> 42 <211> 8 <212> PRT <213> Triticum aestivum <400> 42

Gly Val Trp Glu Ile Phe Leu Pro 1 5 <210> 43 <211> 10 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220 <223> Opis sztucznej sekwencji: synetyczny oligonukleotyd <400> 43 cgggatcccg <210> 44 <211> 34 <212> DNA .

<213> Sztuczna sekwencja <223> Opis sztucznej sekwencji: synetyczny oligonukleotyd <400 44 gatgagctcc gtttcgcatg attgaacaag atgg <210> 45 <211> 30 <212> DNA .

_{< 2 χ 3 >} Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: synetyczny oligonukleotyd <400> 45 gtcgagctca gaagaactcg tcaagaaggc

PL 205 884 B1

PL 205 884 B1 <210> 50 <211> 21 <212> DNA < 213 > Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opi_s sztucznej sekwencji: synetyczny oligonukleotyd <400 50 agctgaatcc ggcggcatgg c 21 <210> 51 <211> 21 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220 <223> Opis sztucznej sekwencji: synetyczny oligonukleotyd <400 51 tgatagtctt gccagtcagg g 21 <210> 52 <211> 2037 <212> DNA <213> Zea mays <400> 52

ttagctgaat	ccggcggcat	ggcaaggtag	actgcagtgc	agcgtgaccc	ggtcgtgccc	60
ctctctagag	ataatgagca	ttgcatgtct	aagttataaa	aaattaccac	atattttttt	120
tgtcacactt	gtttgaagtg	cagtttatcf	atctttatac	atatatttaa	actttactct	180
acgaataata	taatctatag	tactacaata	atatcagtgt	tttagagaat	catataaatg	240
aacagttaga	catggtctaa	aggacaattg	gtattttgac	aacaggactc	tacagtttta	300
tctttttagt	gtgcatgtgt	tctccttttt	ttctttgcaa	atagcttcac	ctatataata	360
cttcacccat	tttattagta	catccattta	gggtttaggg	ttaatggttt	ttatagacta	420
atttttttag	tacatctatt	ttattctatt	ttagcctcta	aattaagaaa	actaaaactc.	480
tattttagtt	tttttattta	ataatttaga	tataaaatag	aataaaataa	agtgactaaa	540
aattaaacaa	atacccttta	agaaattaaa	aaaactaagg	aaacattttt	cttgtttcga	600
gtagataatg	ccagcctgtt	aaacgccgtc	gacgcagtct	aacggacacc	aaccagcgaa	660
ccagcagcgt	cgcgtcgggc	caagcgaagc	agacggcacg	gcatctctgt	cgctgcctcg	720
gtaccggact	tcgtccgctg	tcggcatcca	gaaattgcgt	ggcggagcgg	cagacgtgag	780
ccggcacggc	aggcggcctc	ctcctcctct	cacggcaccg	gcagctacgg	gggattcctt	840
tcccaccgct	ccttcgcttt	cccttcctcg	cccgccgtaa	taaatagaca	ccccctccac	900
accctctttc	cccaacctcg	tgttgttcgg	agcgcacaca	cacacaacca	gatctccccc	960
aaatccaccc	gtcggcacct	ccgcttcaag	gtacgccgct	cgtcctccc:	ccccctctct	1020

PL 205 884 B1

accttctcta	gatcggcgtt	ccgctccatg	gttagggccc	ggtagttcta	cttctgttca	1080
tgtttgtgtt	agatccgtgt	ttgtgttaga	tccgtgctgc	tagcgttcgt	acacggatgc	1140
gacctgtacg	tcagacacgt	tctgattgct	aacttgccag	tgtttctctt	tggggaatcc	1200
tgggatggct	ctagccgttc	cgcagacggg	atcgatttca	tgattttttt	tgtttcgttg	1260
catagggttt	ggtttgccct	tttcctttat	ttcaatatat	gccgtgcact	tgtttgtcgg	1320
gtcatctttt	catgcttttt	tttgtcttgg	ttgtgatgat	gtggtctggt	tgggcggtcg	1380
ttctagatcg	gagtagaatt	ctgtttcaaa	ctacctggtg	gatttattaa	ttttggatct	1440
gtatgtgtgt	gccatacata	ttcatagtta	cgaattgaag	atgatggatg	gaaatatcga	1500
tctaggatag	gtatacatgt	tgatgcgggt	tttactgatg	catatacaga	gatgcttttg	1560
ttcgcttggt	tgtgatgatg	tggtgtggtt	ccgcggtcgt	tcattcgttc	tagatcggag	1620
tagaatactg	tttcaaacta	cctggtgtat	ttatraattt	tggaactgta	tgtgtgtgtc	1680
atacatcttc	atagttacga	gtttaagatg	gatggaaata	tcgatctagg	ataggtatac	1740
atgttgatgt	gggttttact	gatgcatata	catgatggca	tatgcagcat	ctattcatat	1800
gctctaacct	tgagtaccta	tctattataa	taaacaagta	tgttttataa	ttattttgat	1860
cttgatatac	ttggatgatg	gcatatgcag	cagctatatg	tggatttttt	tagccctgcc	1920
ttcatacgct	atttatttgc	ttggtactgt	ttettttgtc	gatgctcacc	ctgttgtttg	1980
gtgttacttc	tgcagatgca	gatctttgtg	aaaaccctga	ctggcaagac	tatcacc	2037

<210> 53 <211> 1085 <212> DNA <213> Triticum aestivum

<400> 53
atatgtatga	tttcatggct	ctggatggac	cttcgactcc	tgctattgat	cctggcatag	60
cattgcataa	aatgattagg	cttgtcacca	tgggtttagg	tggagagggt	tatcttaact	120
ttatgggaaa	tgagtttggg	catcctgaat	ggatagattt	tccaagaggc	ccacaagttc	180
ttccaactgg	taagtttctc	cctggaaata	acaatagtta	tgataaatgc	cctcgtagat	240
ttgatcttgg	tgatgcagat	tttcttaggt	atcgtcgtat	gcaggagttt	gatcaggcaa	300
tgcagcatct	tgaggaaaaa	tatgggttta	tgacatctga	gcaccagtat	gtttctcgga	360
aacatgagga	agataaggtg	atcgtgtttg	aaagagggga	tttggtattt	gttttcaact	420
tccactggag	taatagcttt	tttcactacc	gtgttgggtg	tttcaagcct	gggaagtaca	430
aggtggtctt	agactccgac	gctggactct	ttggtggatt	tggtaggctt	gatcatgctg	540
tcgagtactt	cacttctgac	tgtccgcatg	acaacaggcc	gcattctttc	tcggtgtaca	600
ctcctagcag	aacttgtgtt	gtgtatgctc	ttatggagta	agcagcaagt	gcagcatacg	660
ctgccgctgt	tgttgctagt	agcaaggaga	gatcgtaggt	cactacacca	ggtgcagggt	720
ttgatatgga	tttttgcttg	agcgagtcct	ggatgggcaa	gacagcgtga	tgctgtgtgt	780
gctcccaaat	cgccatggcg	ttgggagggg	atcgtgcttc	tttgtgttat	gctttgtgca	840
tcaggatgga	actcccctag	gtagccttgt	tggtgagcgc	tcgaaagaaa	atggacgggc	900
ctgggtgttt	gcttaaattt	tgttgcccta	aaccctcgct	cctatcttgt	acattgccgg	960
tttagatagg	gtttgttttt	gtacattttt	ttgatagtta	atagacttat	tgct.cgr.gtg	1020
cttgacgttt	tacatgaaca	tataaatatt	ctaaataggt	taaaaaaaaa	aaaaaaaaaa	1080

aaaaa 1085 <210> 54 <211> 888 <212> PRT <213> Triticum aestivum

PL 205 884 B1 <400> 54

Met Leu Cys Leu Ser Xaa Ser Leu 1 5

Ala A.sp Arg Pro Zaa Leu Pro Gly 20

Leu Ser Ala Val Pro Ala Pro Xaa 25 40

Lys Ala Lys Ser Lys Ser Ser Val 50 55

Ile Xaa Ala Thr Xaa Xaa Xaa Gly 65 70

Leu Asp Pro Lys Leu Ala Xaa Phe 85

Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Gin Lys His 100

Leu Glu Glu Phe Ser Lys Gly Tyr 115 120

Xaa Xaa Ala Xaa Val Tyr Arg Glu 130 135

Gin Leu Val Gly Asp Phe Asn Asn 145 150

Thr Lys Asp Asn Phe Gly Val Trp 165

Asp Gly Ser Pro Ala Ile Pro His ISO

Asp Thr Pro Ser Gly Val Trp Val 195 200

Tyr Ala Val Gin Thr Ala Gly Glu 210 215

His Tyr Asp Pro Pro Ser Glu Glu 225 230

Pro Lys Lys Pro Asp Ser Leu Arg

Leu Pro Arg Pro Ser Arg Ala Ala 10 15

Ile Xaa Gly Gly Gly Zaa Xaa Arg 25 30

Xaa Leu Arg Trp Xaa Trp Pro Arg 45

Pro Val Xaa Ala Xaa Zaa Xaa Xaa 60

Val Xaa Xaa Leu Pro Ile Tyr Asp 75 80

Lys Xaa His Phe Asp Tyr Arg Xaa 90 95

Xaa Ile Glu Lys His Glu Gly Gly 105 110

Leu Lys Phe Gly Ile Asn Thr Glu 125

Trp Ala Pro Ala Ala Xaa Xaa Ala 140

Trp Asn Gly Ser Gly His Xaa Met 155 160

Ser Ile Arg Leu Ser Asn Asn Ala 170 175

Gly Ser Lys Val Lys Phe Arg Phe 1B5 190

Asp Ser Ile Pro Ala Trp Ile Lys 205

Ile Gly Ala Pro Tyr Asp Gly Ile 220

Lys Tyr Val Phe Lys His Pro Gin 235 240

Ile Tyr Glu Ala His Val Gly Met

100

PL 205 884 B1

245

250

255

Ser

Gly

Pro

Glu

Pro

Glu

Ile

Asn

Thr

Tyr

Ala

Glu

Phe

Arg

Asp

Glu

260

265

270

Val

Leu

Pro

Arg

Ile

Lys

Ala

Leu

Gly

Tyr

Asn

Ala

Val

Gin

Leu

Met

275

280

285

Ala

Ile

Gin

G1 u

His

Ser

Tyr

Ala

Ser

Phe

Gly

Tyr

His

Val

Thr

290

295

300

Asn

Phe

Phe'

Ala

Val

Ser

Arg

Ser

Gly

Thr

Pro

Glu

Asp

Leu

Lys

305

310

315

320

Ser

Leu

Ile

Asp

Lys

Ala

His

Ser

Leu

Gly

Leu

Arg

Val

Leu

Met

Asp

325

330

335

Val

His

_Ser

His

Ala

Ser

Asn

Thr

Leu

Asp

Gly

Leu

Asn

Gly

340

345

350

Phe

Asp

Val

Gly

Gin

Gly

Thr

Asp

Thr

Ser

Tyr

Phe

His

Gly

Xaa

355

360

365

Arg

Gly

His

Lys

Met

Trp

Asp

Ser

Arg

Leu

Phe

Asn

Tyr

Gly

Asn

370

375

380

Trp

Glu

Val

Leu

Arg

Phe

Leu

Ser

Asn

Ala

Arg

Tyr

Trp

Leu

Asp

385

390

395

400

Glu

Phe

Lys

Phe

Asp

Gly

Phe

Arg

Phe

Asp

Gly

Val

Thr

Ser

Met

Leu

405

410

415

Tyr

Thr

His

Gly

Leu

Asn

Met

Ser

Phe

Thr

Gly

Ser

Tyr

Lys

Glu

420

425

430

Tyr

Phe

Gly

Leu

Ala

Thr

Asp

Val

Asp

Ala

Val

Tyr

Leu

Met

Leu

435

440

445

Ala

Asn

Asp

Leu

Ile

His

Gly

Leu

Xaa

Pro

Glu

Ala

Val

Gly

450

455

460

Glu

Asp

Val

Ser

Gly

Met

Pro

Val

Leu

Cys

Xaa

Pro

Val

Asp

Glu

Gly

465

470

475

480

Gly

Val

Gly

Phe

Asp

Tyr

Arg

Leu

Ala

Met

Ala

Val

Ala

Asp

Lys

Trp

485

490

495

Ile

Asp

Leu

Lys

Asn

Lys

Asp

Xa a

Trp

Ser

Met

Gly

Xaa

Ile

PL 205 884 B1

101

102

PL 205 884 B1

755

760

765

Xaa

Zaa

Leu

Zaa

Arg

Xaa

Zaa

Gly

Zaa

770

775

780

Zaa

Phe

Leu

Zaa

Pro

Xaa

Lys

Zaa

Xaa

Zaa

Leu

785

790

795

800

Xaa

Zaa

Pro

Zaa

Pro

Xaa

Ile

Xaa

Phe

Xaa

805

810

815

Zaa

Xaa

Gly

Xaa

Zaa

Xaa

Zaa

Xaa

Zaa

Lys

Xaa

820

825

830

Xaa

Ala

Val

Xaa

Zaa

Xaa

Ser

Xaa

Zaa

835

B40

845

Xaa

Ile

Leu

Zaa

Leu

Zaa

Ile

Xaa

Zaa

Xaa

850

855

860

Xaa

Leu

Xaa

Zaa

Xaa

Zaa

865

870

875

880

Lys

885 <210> 55 <211> 1488 <212> DNA <213> Zea mavs <400> 55

aagcttgcat	gcctgcaggt	cgactctaga	ccaaatttca	tggtagttgg	gagcctaccc	60
agatttcatg	attaactgtg	ctattgaatt	gttgaaaatg	gttgtgtctg	tcgtatccga	120
cggataacgg	aaacccgtcc	gaaattcaat	gggcatgggc	atagatatag	atttgtaccc	180
actactagta	tggtcgcagg	cggatattgg	ttgcaaccgc	agatatagtt	tcggggaaaa	240
ggattaggct	cagctccatc	cctagacccc	acttgtgtgt	gtgggggggt	ctacccttca	300
aaaggaaaaa	aaactacaca	cagtgcatat	aagaagatga	atattccaaa	attcagcagt	360
caagaagccc	tgataaactg	tctggcatag	ctagtacttt	atacacttca	agaccaaaaa	420
aaatcactaa	gtacagattt	tagtgactcg	taagtacaga	tatcatctta	caaggcccag	430
cccagcgacc	tattacacag	cccgctcggg	cccgcgacgt	cgggacacat	cttcttcccc	540
cttttggtga	agctctgctc	gcagctgtcc	ggctgcttgg	acgttcgtgt	ggcagattca	600
tctgtcgtct	cgtctcctgt	gcttcctggg	tagcttgtgc	agtggagctg	acatggtctg	660
agcaggctta	aaatttgctc	gtagacgagg	agtaccagca	cagcacgttg	cggatttctc	720
tgcctgtgaa	gtgcaacgtc	taggattgtc	acacgccttg	gtcgcgtcga	tgcggtggtg	780
agcagagcag	caacagctgg	gcggcccaaa	gttggcttcc	gtgtcttcgt	cgtacgtacg	840
cgcgcgccgg	ggacacgcag	agagcggaga	gcgagccgtg	cacgggggag	gtggtgtgca	900

PL 205 884 B1

103

agrgcagccg	cgcgcccgcg	cccęcgcccg	gtgggcaacc	caaaaagtac	ccacgacaag	960
cgaaggcgcc	aaagcgatcc	aagctccgga	acacatcagc	cacaagcagc	cgagaaccga	1020
accggtgggc	gacgcgtcgt	gggacggacg	cgggcgacgc	ttccaaacgc	ggccacgtac	1080
gccggcgtgt	gcgtgcgtgc	gtgcagacga	caagccaagg	cgaggcagcc	cccgatcggg_	1140
aaagcgtttt	gggcgcgagc	gctgccgtgc	gggtcagtcg	ctggtgcgca	gtgccggggg	1200
gaacgggtat	cgtgggaggc	acggcggaga	agagcgtggc	gaggccgaga	gcagcgcgcg	1260
gccgggtcac	gcaacgcgcc	ccacgtactg	ccctccccct	ccgcgcgcgc	tagaaatacc	1320
gaggcctgga	ccgggggccc	ccccctcaca	tccatccatc	gaccgatcga	tcgccacagc	1380
caacaccacc	cgccgaggcg	acgcgacagc	cgccaggagg	aaggaataaa	ctcactgcca	1440
gccagtgaag	ggggagaagt	gtactgctcc	gtcgactcta	gaggatcc		1488

Zastrzeżenia patentowe

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sekwencja nukleotydowa, znamienna tym, ż e koduje sekwencję aminokwasow ą przedstawioną jako SEQ ID No:2.
2. Sekwencja nukleotydowa, znamienna tym, że stanowi sekwencję B2 przedstawioną jako

SEQ ID No:3.
3. Sekwencja nukleotydowa, znamienna tym, ż e stanowi sekwencję B4 przedstawioną jako

SEQ ID No:4.
4. Sekwencja nukleotydowa, znamienna tym, że stanowi sekwencję B10 przedstawioną jako

SEQ ID No:5.
5. Sekwencja nukleotydowa, znamienna tym, ż e stanowi sekwencję B1 przedstawioną jako

SEQ ID No:6.
6. Sekwencja nukleotydowa, znamienna tym, że koduje sekwencję aminokwasową B6 przedstawioną jako SEQ ID No:7.
7. Konstrukt kwasu nukleinowego, znamienny tym, że zawiera sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową przedstawioną jako SEQ ID No:2, albo sekwencję nukleotydową, którą stanowi sekwencja B2 przedstawiona jako SEQ ID No:3, albo sekwencję nukleotydową, którą stanowi sekwencja B4 przedstawiona jako SEQ ID No:4, albo sekwencję nukleotydową, którą stanowi sekwencja B10 przedstawiona jako SEQ ID No:5, albo sekwencję nukleotydową, którą stanowi sekwencja B1 przedstawiona jako SEQ ID No:6, albo sekwencję nukleotydową kodującą sekwencję aminokwasową B6 przedstawioną jako SEQ ID No:7.
8. Konstrukt według zastrz. 7, znamienny tym, że sekwencja jest operacyjnie połączona, w orientacji sensownej lub antysensownej, z sekwencją promotora.
9. Wektor ekspresyjny, znamienny tym, że zawiera konstrukt określony w zastrz. 7 albo 8.
10. Sekwencja aminokwasowa, znamienna tym, że kodowana jest przez sekwencję nukleotydową określoną w zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6.
11. Sposób transformowania rośliny, znamienny tym, że wprowadza się do rośliny sekwencję określoną w zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, albo 8, albo 9, połączoną operacyjnie z odpowiednim promotorem aktywnym w roślinie tak, aby spowodować ekspresję genu obecnego w roś linie.
12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że wprowadza się sekwencję połączoną z promotorem w orientacji antysensownej.
13. Sposób według zastrz. 11 albo 12, znamienny tym, że jako roślinę stosuje się pszenicę.
14. Sposób według zastrz. 11 albo 12, albo 13, znamienny tym, że zmienia się właściwości dotyczące zawartości skrobi i/lub składu skrobi rośliny.
15. Transgeniczna roślina, znamienna tym, że zawiera konstrukt określony w zastrz. 7 albo 8.
16. Transgeniczna komórka roślinna, znamienna tym, że zawiera konstrukt określony w zastrz. 7 albo 8.
17. Część rośliny transgenicznej, znamienna tym, że zawiera konstrukt określony w zastrz. 7 albo 8.
18. Transgeniczna roślina, komórka roślinna lub część rośliny według zastrz. 15 albo 16, albo 17, znamienna tym, że rośliną jest pszenica.