CZ314099A3

CZ314099A3 - Molekuly nukleové kyseliny kódující enzymy, které mají fruktosylpolymerázovou aktivitu, a vektory, hostitelské buňky a transgenní rostliny obsahující tyto nukleové kyseliny

Info

Publication number: CZ314099A3
Application number: CZ19993140A
Authority: CZ
Inventors: Arnd G. Heyer; Elke Hellwege; Dominique Gritscher
Original assignee: Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e. V.
Priority date: 1997-03-04
Filing date: 1998-03-02
Publication date: 2000-01-12
Also published as: HU225800B1; CN1249783A; CZ299374B6; US20030138927A1; EP0977876B1; DE69836267D1; CA2283375C; US6515203B1; BR9808154A; BRPI9808154B1; ATE343637T1; ES2275302T3; ZA981762B; PL197151B1; WO1998039460A1; DE19708774A1; AU6825498A; CA2283375A1; AR010124A1; JP4101304B2

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká molekul nukleové kyseliny kódujících sacharózofruktosyltransferázy závislé na sacharóze (SST). Dále se tento vynález týká vektorů a hostitelů obsahujících takové molekuly nukleové kyseliny, jakož i rostlinných buněk a rostlin transformovaných popsanými molekulami nukleové kyseliny. Kromě toho jsou popsány způsoby produkce transgenních rostlin, které syntetizují fruktosylové polymery s krátkým řetězcem díky zavedení molekul DNA kódujícím SST z artyčoku. Předkládaný vynález se také týká způsobů přípravy SST pro produkci fruktosylových polymerů s krátkým řetězcem v různých hostitelských organismech, a také SST, s jejíž pomocí mohou být tvořeny fruktosylové polymery s krátkým řetězcem použitím různých metod, například fermentačních nebo jiných biotechnologických metod.

Dosavadní stav techniky

Lineární, ve vodě rozpustné polymery mají mnohé různé možnosti použití, například pro zvýšení viskozity vodných systémů, jako detergenty, jako suspendační činidla nebo pro urychlení sedimentačního procesu a pro komplexování, ale také pro vázání vody. Polymery na bázi sacharidů, například fruktosylové polysacharidy, jsou obzvláště zajímavé materiály, protože jsou biologicky odbouratelné.

Nezávisle na jejich použití jako regenerační suroviny pro průmyslovou produkci a zpracování, jsou fruktosylové polymery také zajímavé jako • ·

potravní aditiva, například jako umělá sladidla. Pro tento účel jsou obzvláště vhodné polymery mající nízký stupeň polymerizace.

Doposud byly popsány pouze způsoby produkce fruktanových polysacharidů s dlouhým řetězcem v rostlinách expresí enzymů bakteriálního původu, jakož i způsob produkce transgenních rostlin exprimujících fruktosyltransferázy z Helianthus tuberosus. Způsoby tvorby enzymů pro produkci fruktosylových polymerů s krátkým řetězcem nejsou známy. V popisu patentovépřihlášky PCT/USA89/02729 se popisuje možnost tvořit cukerné polymery, zejména dextran nebo polyfruktózu, v transgenních rostlinách, obzvláště v plodech transgenních rostlin. Pro přípravu takových modifikovaných rostlin se navrhuje použití levansacharózy z mikroorganismů, konkrétně z Aerobacter levanicum, Streptococcus salivarius a Bacillus subtilis, nebo dextransacharózy z Leuconostoc mesenteroid.es. Nepopisuje se ani produkce aktivních enzymů ani levanu či dextranu ani transgenních rostlin, patentová přihláška PCT/EP93/02110 popisuje způsob produkce transgenních rostlin exprimujících gen Isc levansacharózy z gram-negativní bakterie Erwinia amylovora. V patentové přihlášce PCT/NL93/00279 je popsána transformace rostlin majících chimérické geny, které obsahují gen sacB z Bacillus subtilis nebo gen ftf ze Streptococcus mutans. V případě genu sacB se doporučuje pro zvýšení hladiny exprese v transgenních rostlinách modifikace v 5'-netranslatované oblasti genu. Patentová přihláška PCT/NL96/00012 popisuje sekvence DNA kódující enzymy syntetizující cukerné polymery a produkci transgenních rostlin s pomocí těchto sekvencí DNA. Popisované sekvence pocházejí z Helianthus tuberosus. Podle dokumentu PCT/NL96/00012 jsou popsané sekvence vhodné nejenom k modifikaci fruktanového profilu například petúnie a brambory, ale také samotné Helianthus tuberosus. Proto přihláška PCT/NL96/00012 popisuje, kromě jiného, transgenní brambory exprimující SST z Helianthus tuberosus. Dokonce i když lze detekovat enzymatickou aktivitu SST exprimované

4 4 4 v transgenních rostlinách, může být dosaženo pouze nízké úrovně konverze substrátu sacharózy na fruktosylové polymery s krátkým řetězcem. To může mít vztah k různým faktorům, jako je nízká afinita enzymu k substrátu nebo případná inhibice enzymu tvořeným produktem.

Proto je předmětem předkládaného vynálezu poskytnout molekuly nukleové kyseliny kódující sacharózofruktosyltransferázu závislou na sacharóze (SST), s jejíž pomocí je možné připravit organismy modifikované metodami genetického inženýrství tak, že jsou schopné produkovat fruktosylové polymery s krátkým řetězcem.

Výše zmíněný problém je řešen předkládaným vynálezem, který je popsán pomocí následujících příkladů a definován patentovými nároky.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká molekul nukleové kyseliny kódujících proteiny, které mají biologickou aktivitu SST a jsou vybrány ze skupiny obsahující

a) molekuly nukleové kyseliny kódující protein, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci zobrazenou zde v sekvenci id. č. 2 a v sekvenci id. č. 4,

b) molekuly nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci zobrazenou v sekvenci id. č. 1 nebo odpovídající ribonukleotidovou sekvenci,

c) molekuly nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci zobrazenou v sekvenci id. č. 3 nebo odpovídající ribonukleotidovou sekvenci,

d) molekuly nukleové kyseliny hybridizující s molekulami nukleové kyseliny uvedenými v a) nebo b) a kódujícími SST, jejíž aminokyseliny jsou alespoň z 90 % identické s aminokyselinovou sekvencí zobrazenou v sekvenci id. č. 2, a

9 • · 9 · · ·

9 9999 9999

9999 999 9 999 999

99999 9 9 9

9999 99 99 99 99 99

e) molekuly nukleové kyseliny, jejichž nukleotidová sekvence se odchyluje od sekvence uvedené v a), b) nebo c) díky degeneraci genetického kódu.

Ve smyslu předkládaného vynálezu se rozumí, že enzym mající fruktosylpolymerázovou aktivitu je protein, který je schopný katalyzovat vznik β-2,1-glykosidické nebo p-2,6-glykosidické vazby mezi fruktózovými jednotkami. Fruktosylový zbytek, který má být přenesen, může takto pocházet ze sacharózy nebo fruktanového polymeru.

Fruktosylovým polymerem s krátkým řetězcem se rozumí molekula obsahující alespoň dva, ale ne více než 100 fruktosylových zbytků, které jsou spojeny buď β-2,1- nebo p-2,6-glykosidickou vazbou. Fruktosylový polymer může nést na svém konci glukózový zbytek, který je spojen prostřednictvím OH skupiny na atomu C-l glukózy a OH skupiny atomu C-2 fruktosylu. V tomto případě fruktosylový polymer obsahuje molekulu sacharózy.

Ve výhodném provedení pocházejí sekvence nukleové kyseliny vynálezu z artyčoku.

Překvapivě bylo zjištěno, že během exprese molekul nukleové kyseliny podle vynálezu se tvořila velká množství fruktosylových polymerů.

Když jsou použity molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu, získá se na rozdíl od brambor popsaných v patentové přihlášce PCT/NL96/00012 velké množství oligofruktanu, které je dokonce větší, než buněčný obsah substrátové sacharózy.

Molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu mohou být jak DNA, tak RNA molekuly. Vhodné molekuly DNA jsou například molekuly genomové DNA nebo cDNA. Molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu mohou být izolovány z přírodních zdrojů, výhodně artyčoku, nebo mohou být syntetizovány pomocí známých metod.

Prostřednictvím obvyklých molekulárně biologických metod je možné (viz např. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) • · · · e · * · · ···· ···· • ♦ · · · · · « · · • · · · · ··· · ··· ···

9 19 9 · · • · 9 1 11 9 1 19 1 1 9 1 zavést do molekul nukleové kyseliny vynálezu odlišné mutace. Výsledkem je, že takto je možné syntetizovat proteiny s modifikovanými biologickými vlastnostmi. Jedna možnost je tvorba delečních mutant, ve kterých se tvoří molekuly nukleové kyseliny neustálými delecemi od 5'- nebo 3'-konce kódující sekvence DNA, a to vede k syntéze proteinů, které jsou adekvátně zkráceny. Takovými delecemi na 5'-konci nukleotidové sekvence je například možné identifikovat aminokyselinové sekvence, které jsou odpovědné za translokaci enzymu v plastidech (transiční peptidy). To umožňuje specifickou produkci enzymů, které díky odstranění příslušných sekvencí nejsou již déle lokalizovány ve vakuolách, ale v cytosolu, nebo které jsou díky přidání dalších signálních sekvencí lokalizovány v jiných kompartmentech.

Další možností je zavedení bodové mutace na pozice, kde modifikace aminokyselinové sekvence ovlivňuje např. enzymovou aktivitu nebo regulaci enzymu. Tímto způsobem mohou být například tvořeny mutanty, které mají změněnou hodnotu K_m nebo které již nadále nepodléhají regulačním mechanismům, které normálně v buňce existuje vzhledem k alosterické regulaci nebo kovalentní modifikaci.

Kromě toho mohou být tvořeny mutanty, které vykazují změněnou specifitu pro substrát nebo produkt. Mohou být také tvořeny mutanty, které vykazují změněný profil aktivita-teplota.

Pro manipulaci v prokaryotických buňkách pomocí metod genetického inženýrství mohou být molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu nebo části těchto molekul zavedeny do plazmidů umožňujících mutagenezi nebo modifikaci sekvence rekombinací sekvence DNA. Prostřednictvím obvyklých metod (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) se mohou vyměňovat báze a mohou být přidány přirozené nebo syntetické sekvence. Aby se fragmenty DNA navzájem spojily, mohou k nim být přidány adaptéry nebo spojky (linkery). Mimoto se mohou provádět manipulace, které poskytují vhodná štěpná místa nebo které odstraňují přebytečnou DNA • 9 nebo štěpná místa. Jsou-li možné inzerce, delece nebo substituce, může se provádět in vitro mutageneze, náhrada pomocí primeru, restrikce nebo ligace. Jako metody analýzy se obvykle používají sekvenční analýza, restrikční analýza a další biochemické nebo molekulárně biologické metody.

Termín „hybridizace“ má ve smyslu tohoto vynálezu význam hybridizace za obvyklých hybridizačních podmínek, výhodně za stringentních podmínek, jak je například popsáno v Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. vydání, (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

Molekuly núkleóvé kyseliny, které hybridizují s molekulami podle vynálezu, mohou být izolovány např. z genomových nebo cDNA knihoven, které byly připraveny z artyčoku.

Aby se identifikovaly a izolovaly takové molekuly núkleóvé kyseliny, mohou být použity molekuly vynálezu nebo části těchto molekul nebo reverzní komplementy těchto molekul, například prostřednictvím hybridizace podle obvyklých metod (viz např. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Jako hybridizační sonda mohou být například použity molekuly núkleóvé kyseliny, jejichž nukleotidová sekvence je zcela shodná nebo podstatně podobná sekvenci zobrazené zde jako sekvence id. č. 1, nebo části těchto sekvencí. Fragmenty použité jako hybridizační sonda mohou být syntetické fragmenty, které byly vytvořeny prostřednictvím obvyklých způsobů syntézy, a jejichž sekvence v podstatě souhlasí se sekvencí molekuly núkleóvé kyseliny podle vynálezu.

Molekuly hybridizující s molekulami núkleóvé kyseliny podle vynálezu také zahrnují fragmenty, deriváty a alelické varianty molekul núkleóvé kyseliny popsaných výše kódujících protein podle vynálezu. Termínem „fragmenty“ se rozumí části molekul núkleóvé kyseliny, které jsou dostatečně dlouhé, aby kódovaly jeden z popisovaných proteinů. Termín „derivát“ • · · ·

9

99 9 v tomto smyslu znamená, že se sekvence těchto molekul liší od sekvencí molekul nukleové kyseliny popsaných výše v jedné nebo několika pozicích, ale s těmito sekvencemi mají vysoký stupeň homologie. Homologie takto znamená sekvence identické alespoň ve 40 %, zejména identické alespoň v 60 %, výhodně ve více než 80 % a zejména výhodně ve více než 90 %. Tyto proteiny kódované molekulami nukleové kyseliny mají sekvenci identickou s aminokyselinovou sekvencí zobrazenou v sekvenci id. č. 2 alespoň v 80 %, výhodně v 85 % a zejména výhodně ve více než 90 %, 95 %, 97 % a 99 %. Odchylky od výše popsaných molekul nukleové kyseliny mohou být tvořeny deleci, substitucí, inzercí nebo rekombinací.

Molekuly nukleové kyseliny, které jsou homologní s výše popsanými molekulami a které představují deriváty těchto molekul jsou obvykle varianty těchto molekul, které představují modifikace mající tutéž biologickou funkci. Mohou to být přirozeně se vyskytující varianty, například sekvence z jiných organismů nebo mutace, které mohou nastat buď přirozeně nebo které byly vneseny specifickou mutagenezí. Kromě toho mohou být tyto varianty synteticky vytvořené sekvence. Alelické varianty mohou být buď přirozeně se vyskytující varianty nebo synteticky vytvořené varianty nebo varianty vytvořené metodami rekombinantní DNA.

Proteiny kódované různými variantami molekul nukleové kyseliny podle vynálezu vykazují určité společné vlastnosti, jako je enzymová aktivita, molekulová hmotnost, imunologická reaktivita nebo konformace nebo fyzikální vlastnosti, jako je elektroforetická pohyblivost, chování při chromatografií, sedimentační koeficienty, rozpustnost, spektroskopické vlastnosti, stabilita, optimální pH, optimální teplota.

V dalším výhodném provedení se vynález týká molekul nukleové kyseliny, které specificky hybridizují s transkripty molekul nukleové kyseliny. Tyto molekuly nukleové kyseliny jsou výhodně oligonukleotidy, které jsou dlouhé alespoň 10, zejména alespoň 15 a obzvláště výhodně alespoň 50 nukleotidů. Molekuly nukleové kyseliny a oligonukleotidy ♦ · · « · · vynálezu mohou být použity například jako primery pro reakci PCR (polymerázová řetězová reakce). Mohou být také složky antisense konstruktů (konstruktů s opačnou orientací) nebo molekul DNA kódujících vhodné ribozymy.

Vynález se dále týká vektorů obsahujících molekuly nukleové kyseliny vynálezu. Výhodně jsou plazmidy, kosmidy, viry, bakteriofágy a další vektory obvykle používané na poli genetického inženýrství.

Sekvence nukleové kyseliny podle vynálezu je výhodně operativně spojena s regulačními prvky ve vektoru podle vynálezu, což zaručuje transkripci a syntézu RNA v prokaryotických a/nebo eukaryotických buňkách, která může být translatována.

Expresní vektory podle vynálezu umožňují produkci enzymů syntetizujících fruktosylové polymery s krátkým řetězcem v různých hostitelských organismech.

Kódované enzymy mohou být použity pro produkci fruktosylových polymerů s krátkým řetězcem také mimo hostitelské organismy. Takto mohou být použity pro produkci fruktosylových polymerů s krátkým řetězcem fermentační a další biotechnologické metody. Například je také představitelné, že fruktosylové polymery budou produkovány prostřednictvím mobilizovaných enzymů.

Podle vynálezu jsou výhodné regulační prvky promotoru patatinu B33. Další výhodné promotory jsou promotor 35S CaMV a promotor genu alkoholdehydrogenázy ze Saccharomyces cerevisiae.

Vektory podle vynálezu mohou mít další funkční jednotky ovlivňující stabilizaci vektoru v hostitelském organismu, jako je bakteriální počátek replikace nebo 2-μ DNA pro účel stabilizace v Saccharomyces cerevisiae. Mimoto mohou být obsaženy sekvence „levé hranice“ a „pravé hranice“ T-DNA z Agrobacterium, čímž se umožní stabilní integrace do genomu rostlin.

Navíc vektory podle vynálezu mohou obsahovat funkční terminátory, jako je terminátor genu oktopinsyntetázy z Agrobacterium.

• · «999 « · • 9 9 · * · 9 « 9«· 999 • 9 • 9 9 9

Aby se enzym transportoval do různých buněčných kompartmentů, je v dalším provedení molekula nukleové kyseliny vynálezu spojena s vektorem vynálezu molekulou nukleové kyseliny kódující funkční signální sekvenci. Touto modifikací může být například přidání N-koncové signální sekvence pro sekreci do prostoru buněčné membrány vyšších rostlin, ale předmětem vynálezu může být také každá další modifikace, která vede k fúzi signální sekvence s kódovanou fruktosyltransferázou.

V obzvláště výhodném provedení se vynález týká plazmidu pB33-cySST, jehož konstrukce je popsána v příkladech (obr. 1).

Exprese molekul nukleové kyseliny podle vynálezu v prokaryotických buňkách, například v Escherichia coli, je zajímavá, protože tímto způsobem je možné přesněji charakterizovat enzymatické aktivity enzymů kódujících tyto molekuly.

V dalším provedení se vynález týká hostitelských buněk přechodně nebo stabilně obsahujících molekuly nukleové kyseliny nebo vektoiy vynálezu. Hostitelskou buňkou se rozumí organismus, který je schopný zavedení in vitro rekombinantní DNA a pak eventuálně syntetizovat proteiny kódované molekulami nukleové kyseliny podle vynálezu.

Výhodně jsou tyto buňky prokaryotické nebo eukaryotické buňky. Vynález se zejména týká rostlinných buněk obsahujících vektorové systémy podle vynálezu nebo jejich deriváty či části. Výhodně jsou schopné syntetizovat enzymy pro produkci fruktosylových polymerů s krátkým řetězcem díky faktu, že do nich byly vneseny vektorové systémy podle vynálezu, jejich deriváty nebo části. Buňky vynálezu jsou výhodně charakterizovány faktem, že zavedená molekula nukleové kyseliny vynálezu je buď heterologní vzhledem k transformované buňce, tj. v těchto buňkách se přirozeně nevyskytuje, nebo je v genomu lokalizována na jiném místě, než příslušná přirozeně se vyskytující sekvence.

Další provedení vynálezu se týká proteinů kódovaných molekulami nukleové kyseliny podle vynálezu, a také způsobů jejich přípravy, kterými se • · · · * ·

99 9

9 9 9 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9 9 9

999 9 9999 99 9 99 9

9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 hostitelská buňka vynálezu pěstuje za podmínek umožňujících syntézu proteinu, a protein je pak izolován z pěstovaných buněk a/nebo kultivačního média. Kromě toho se vynález týká SST, které mohou být produkovány rostlinami podle vynálezu.

Poskytnutím molekul nukleové kyseliny podle vynálezu je nyní možné produkovat fruktosylové polymery s krátkým řetězcem v každém organismu prostřednictvím genetického inženýrství, zatímco až dosud nebylo možné rostliny modifikovat konvenčními metodami, například křížením, tak, aby byly schopné syntetizovat fruktosylové polymery. Zvýšením aktivity proteinů vynálezu, například nadměrnou expresí (overexpresí) vhodných molekul nukleové kyseliny nebo poskytnutím mutant, které již nadále nepodléhají buněčně specifickým regulačním mechanismům a/nebo které mají změněné teplotní závislosti vzhledem k jejich aktivitě, je možné zvýšit výtěžek v rostlinách modifikovaných genetickým inženýrstvím.

Nyní je tudíž možná exprese molekul nukleové kyseliny podle vynálezu v rostlinných buňkách, aby se zvýšila aktivita příslušné SST nebo aby se SST zavedla do buněk, které normálně tento enzym neexprimují. Nadto je možné modifikovat molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu metodami odborníkovi známými, aby se získaly SST podle vynálezu, které již nadále nepodléhají buněčně specifickým regulačním mechanismům nebo které mají změněnou teplotní závislost nebo specifičnost k substrátu či produktu.

Když jsou molekuly nukleové kyseliny exprimovány v rostlinách, může být syntetizovaný protein lokalizovaný v jakémkoliv kompartmentu rostlinné buňky. Aby se dosáhlo lokalizace ve specifickém kompartmentu, musí být odstraněna sekvence zaručující lokalizaci ve vakuole, a je-li nutné, zbylá kódující oblast musí být spojena se sekvencemi DNA zaručujícími lokalizaci ve specifickém kompartmentu. Takové sekvence jsou známy (viz např. Braun et al., EMBO J., 11, 1992, 3219-3227; Wolter et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 85, 1988, 846-850; Sonnewald et al., Plant J., 1, 1991, 95-106).

• · to♦ ·to *· to· ·· toto ·· · ···· ···· • · ···· ···· • · to · · ··· · ♦·· ··· to····· ·· totototo ·· ·· ·

Předkládaný vynález se tudíž také týká transgenních rostlinných buněk, které byly transformovány jednou nebo několika molekulami nukleové kyseliny podle vynálezu, a také transgenních rostlinných buněk pocházejících z takových transformovaných buněk. Takové buňky obsahují jednu nebo několik molekul nukleové kyseliny podle vynálezu, které jsou výhodně spojeny s regulačními DNA prvky zaručujícími transkripci v rostlinných buňkách, zejména s promotorem. Takové rostlinné buňky se odlišují od přirozeně se vyskytujících rostlinných buněk tím, že obsahují alespoň jednu molekulu nukleové kyseliny podle vynálezu, která se v těchto buňkách přirozeně nevyskytuje, nebo tím, že tato molekula je zavedena do genomu buňky na místo, kde se přirozeně nevyskytuje, tj. do jiné genomové oblasti.

Z transgenních rostlinných buněk mohou být regenerovány celé rostliny použitím metod odborníkům známým. Předmět předkládaného vynálezu se týká rostlin, které lze získat regenerací transgenních rostlinných buněk podle vynálezu.

Dále se předmět vynálezu týká rostlin obsahujících transgenní rostlinné buňky popsané výše. Transgenní rostliny mohou být v podstatě rostliny jakéhokoli rostlinného druhu, tj. jak jednoděložné, tak dvouděložné. Výhodně jsou to plodiny, zejména rostliny, které syntetizují a/nebo ukládají škrob, jako jsou pšenice, ječmen, rýže, kukuřice, řepa cukrovka, cukrová třtina nebo brambory. Zejména výhodné jsou rostliny ukládající sacharózu.

Vynález se také týká rozmnožovacího materiálu a produktů sklizně rostlin podle vynálezu, například ovoce, semen, hlíz, podnoží, sadby, řízků apod.

Transgenní rostlinné buňky a rostliny vynálezu syntetizují fruktosylové polymery s krátkým řetězcem díky expresi nebo dodatečné expresi alespoň jedné molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu.

0 0*0* « 0 0

0 0 0 · 00 00 00 0 0000 0000

0000 0000

0*0 0 000« 000 000 0 * · 0 0 0 • 00 ·· «0 0«

Předmět vynálezu se proto také týká fruktosylových polymerů s krátkým řetězcem získatelných z transgenních rostlinných buněk a rostlin podle vynálezu, jakož i z rozmnožovacího materiálu a produktů sklizně.

Transgenní rostlinné buňky podle vynálezu mohou být regenerovány na celé rostliny metodami odborníkovi známými. Proto se předmět vynálezu také týká rostlin obsahujících transgenní rostlinné buňky podle vynálezu. Tyto rostliny jsou výhodně plodiny, zejména rostliny, které syntetizují a/nebo ukládají sacharózu a/nebo škrob. Zejména výhodná je brambora. Vynález se také týká rozmnožovacího materiálu rostlin podle vynálezu, obzvláště hlíz.

Aby se v rostlinných buňkách exprimovaly molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu v sense (tj. souhlasně s normálním smyslem transkripce) nebo antisense (tj. proti směru normální transkripce) orientaci, jsou spojeny s regulačními DNA prvky, které zaručují transkripci v rostlinných buňkách. To jsou zejména promotory. V podstatě je pro expresi vhodný jakýkoliv promotor aktivní v rostlinných buňkách.

Promotor může být vybrán tak, že exprese se uskuteční konstitutivně nebo pouze v určitém pletivu, na určitém stupni vývoje rostliny nebo v určité době určené vnějšími podněty. Vzhledem k rostlině může být promotor homologní nebo heterologní. Vhodné promotory jsou například promotor 35S RNA z viru mozaiky květáku a ubichitinový promotor z kukuřice pro konstitutivní expresi, zejména výhodný je promotor genu patatinu B33 (Rocha-Sosa et al., EMBO J., 8, 1989, 23-29) pro expresi specifickou pro hlízu u brambor nebo promotor zaručující pouze expresi ve fotosynteticky aktivním pletivu, například promotor ST-LS1 (Stockhaus et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 84, 1987, 7943-7947; Stockhaus et al., EMBO J„ 8, 1989, 2445-2451), nebo expresi specifickou pro endosperm promotory HMG ze pšenice, promotor USP, promotor faseolinu nebo promotory zeinových genů z kukuřice.

φφ φφφφ φ φ · · φφ φφ φφ φ φφφφ Φφφφ φ φ φφφφ φφφφ φ φφφφ φφφ φ φφφ φφφ φ φφφ φ φ φ φ φφφφ φφ φφ φφ φφ φφ

Kromě toho zde může být terminační sekvence sloužící pro správné ukončení transkripce, a také připojení konce poly-A k transkriptů, což je funkce nutná pro stabilizaci transkriptů. Tyto prvky jsou popsány v odborné literatuře (srov. Gielen et al., EMBO J., 8, 1989, 23-29) a mohou být libovolně zaměňovány.

Pro zavádění cizích genů do vyšších rostlin existuje velký počet dostupných klonovacích vektorů obsahujících replikační signál pro E. coli a genový markér pro selekci transformovaných bakteriálních buněk. Příklady těchto vektorů jsou pBR322, vektory řady pUC, řady M13mp, pACYC184 apod. Požadovaná sekvence může být vložena do vektoru ve vhodném štěpném místě. Získaný plazmid je vhodný pro transformaci buněk E. coli. Transformované buňky E. coli jsou pak pěstovány ve vhodném médiu, poté jsou sklizeny a lyžovány. Plazmid je regenerován. Jako analytické metody pro charakterizaci regenerované plazmidové DNA se obvykle používají restrikční analýzy, gelové elektroforézy a další biochemické nebo molekulárně biologické metody. Po každé manipulaci může být plazmidová DNA štěpena a regenerované fragmenty DNA spojeny s dalšími sekvencemi DNA. Každá plazmidová DNA sekvence může být klonována do téhož nebo jiného plazmidu.

Pro zavedení DNA do rostlinné hostitelské buňky je dostupný velký počet metod. Tyto metody zahrnují transformaci rostlinných buněk s T-DNA pomocí Agrobacterium tumefaciens nebo Agrobacterium rhizogenes jako prostředků transformace, fúzi protoplastů, injekci, elektroporaci DNA, zavedení DNA prostřednictvím biolistických metod, jakož i další možnosti.

Pro injekci a elektroporaci DNA do rostlinných buněk nejsou na použité plazmidy žádné specifické požadavky. Mohou být použity jednoduché plazmidy, jako jsou deriváty pUC. Jestli mají být z takto transformovaných buněk regenerovány celé rostliny, měl by se použít markér pro selekci.

V závislosti na metodě pro zavedení požadovaných genů do rostlinné buňky mohou být nezbytné další sekvence DNA. Jestliže je například pro · 4·44

4

44

4 4 4

444 444

4

44 transformaci rostlinné buňky použit plazmid Ti nebo Ri, alespoň pravý hraniční úsek, ale často pravý a levý hraniční úsek T-DNA plazmidu Ti a Ri musí být připojen jako hraniční úsek ke genům, které mají být do buňky zavedeny.

Jestliže se pro transformaci použije Agrobacterium, musí být zaváděná DNA klonována do specifických plazmidů, a sice buďto do intermediárního nebo do binárního vektoru. Intermediární vektory mohou být integrovány homologní rekombinaci do plazmidu Ti nebo Ri v Agrobacterium díky sekvencím, které jsou homologní k sekvencím v T-DNA. Plazmid Ti nebo Ri dále obsahuje úsek vir nezbytný pro přenos T-DNA. Intermediární vektory se nemohou replikovat v Agrobacterium. Prostřednictvím pomocného (helper) plazmidu může být intermediární vektor přenesen do Agrobacterium tumefaciens (konjugací). Binární vektory se mohou replikovat jak v E. coli, tak i v Agrobacterium. Obsahují markerový gen pro selekci a linker nebo polylinker (klonovací nebo mnohočetné klonovací místo) ohraničený pravým a levým T-DNA hraničním úsekem. Mohou být transformovány přímo do Agrobacterium (Holsters et al., Mol. Gen. Genet., 163, 1978, 181-187). Agrobacterium sloužící jako hostitelská buňka by mělo obsahovat plazmid nesoucí úsek vir. Úsek vir je nezbytný pro přenos T-DNA do rostlinné buňky. Může zde být i další T-DNA. Agrobacterium takto transformované se pak použije pro transformaci rostlinných buněk. Použití T-DNA pro transformaci rostlinných buněk bylo rozsáhle zkoumáno a popsáno v dokumentech EP-A-120 516; Hoekema: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam, 1985, Chapter V, Fraley et al., Crit. Rev. Plant. Sci., 4, 1-46, a An et al./EMBO J., 4, 1985, 277-287.

Pro přenos DNA do rostlinných buněk se rostlinné explantáty kultivují společně s Agrobacterium tumefaciens nebo Agrobacterium rhizogenes. Z infikovaného rostlinného materiálu (jako jsou např. kousky listů, části stonku, kořeny, ale také protoplasty nebo rostlinné buňky kultivované v suspenzi) mohou být regenerovány celé rostliny ve vhodném médiu, které • · ···· • · φ φφφφ φ φ φ * • φ φφφφ φφφφ φ φφφφ φφφ φ φφφ φφφ φφφφφφ φφ φφφφ φφ φφ φφ φφ φφ může obsahovat antibiotika nebo biocidní látky pro selekci transformovaných buněk. Rostliny získané tímto způsobem mohou být testovány na přítomnost zavedené DNA. Jsou známy další možnosti zavádění cizorodé DNA za použití biolistických metod nebo transformací protoplastů (srov. např. Willmitzer, L., 1993, Transgenic plants. In: Biotechnology,

A Multi-Volume Comprehensive Treatise (H.J. Rehm, G. Reed, A. Půhler,

P. Stadler, eds.), Vol. 2, 627-659, VCH Weinheim-New York-BaselCambridge).

Alternativní systémy pro transformaci jednoděložných rostlin jsou transformace pomoci biolistického přístupu, elektricky nebo chemicky vyvolané zavedení DNA do protoplastů, elektroporace částečně permeabilizovaných buněk, makroinjekce DNA do květů, mikroinjekce DNA do mikrospór a proembryí, introdukce DNA do klíčících pylových zrn a zavedení DNA do embryí bobtnáním (přehled viz: Potrykus, Physiol. Plant, 1990, 269-273).

Zatímco transformace dvouděložných rostlin prostřednictvím vektorového systému plazmidu Ti s pomocí Agrobacterium tumefaciens je dobře zavedena, novější výzkumné práce naznačují, že také jednoděložné rostliny jsou přístupné pro transformaci prostřednictvím vektorů založených na Agrobacterium (Chán et al., Plant Mol. Biol., 22, 1993, 491-506; Hiei et al., Plant J., 6, 1994, 271-282; Bytebier et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 84, 1987, 5345-5349; Raineri et al., Bio/Technology, 8, 1990, 33-38; Gould et al., Plant Physiol., 95, 1991, 426-434; Mooney et al., Plant, Cell Tiss. & Org. Cult., 25, 1991, 209-218; Li et al., Plant Mol. Biol., 20, 1992, 1037-1048).

Tři z výše uvedených transformačních systémů mohou být použity také pro různé obilniny: elektroporace tkání, transformace protoplastů a přenos DNA ostřelováním regenerativní tkáně a buněk částicemi (přehled viz: Jáhne et al., Euphytica, 85, 1995, 35-44).

9999 • · 9 9 9 ♦ 9 9 9

9 · 9 9

9 9 9 9

9999 99 99

994 · · 9

9 9 9

999 999 • 9

99

V odborné literatuře byla také často popisována transformace pšenice (přehled viz: Maheshwari et al., Critical Reviews in Plant Science, 14(2), 1995, 149-178).

Vynález se také týká rostlin obsahujících alespoň jednu, ale výhodně velké množství buněk, obsahujících vektorové systémy podle vynálezu nebo deriváty či jejich části, které jsou schopny syntetizovat enzymy pro produkci fruktosylových polymerů s krátkým řetězcem díky zavedení vektorových systémů, derivátů nebo částí vektorových systémů podle vynálezu. Vynález také poskytuje rostliny mnoha různých druhů, rodů, čeledí, řádů a tříd, které jsou schopné syntetizovat enzymy pro produkci fruktosylových polymerů s krátkým řetězcem díky zavedeným vektorovým systémům nebo derivátům nebo jejich částem. Protože známé rostliny nejsou schopny produkovat fruktosylové polymery s krátkým řetězcem, je snadné kontrolovat, zda byla metoda úspěšně provedena, například chromatografickou analýzou cukrů obsahujících fruktózu. Naproti tomu je výhodné, že několik málo rostlin obsahuje fruktosylové polymery, protože tím jsou definované molekulové hmotnosti, tj. velikost fruktosylového polymeru s krátkým řetězcem. Nadto je možná lokalizace v různých buněčných kompartmentech a různých orgánech, jakož i zvýšení exprese, a tedy i výtěžku.

V dalším provedení se vynález týká metod produkce fruktosylových polymerů s krátkým řetězcem zahrnujících:

a) kontakt sacharózy nebo ekvivalentního substrátu s SST podle vynálezu za podmínek umožňujících konverzi na fruktosylové polymery s krátkým řetězcem, a

b) získání fruktosylových polymerů tvořených tímto způsobem.

Povaha vytvořených fruktosylových polymerů závisí na enzymové specifitě fruktosyltransferázy. Když je použita SST podle vynálezu, tvoří se nejspíš kestóza, ale také nystóza a fruktosylnystóza.

99 ·· ·· • · 9 9 9 9 • · · · 9

999 999

9 9 9 9

9999 99 99 99

999 999

9

99

Kromě toho se vynález týká fruktosylových polymerů produkovaných rostlinnou buňkou nebo rostlinou podle vynálezu nebo získaných rozmnožovacího materiálu nebo produktů sklizně rostlin nebo rostlinných buněk podle vynálezu nebo získaných výše popsaným způsobem podle vynálezu. Tyto fruktosylové polymery mohu být výhodně použity pro produkci potravin, jako je pečivo nebo těstoviny. Výhodně mohou být tyto fruktosylové polymery použity pro zvýšení viskozity vodných systémů, jako detergenty, jako suspendující činidla nebo pro urychlení sedimentačního procesu a komplexování, ale také pro vázání vody.

Přehled obrázků

Obrázek 1: ukazuje konstrukci plazmidu pB33-cySST.

Vektor: pBinB33 (derivát pBinl9; Bevan, 1984, Nucl. Acids Res., 12:

8711) promotor: promotor B33 (Rocha-Sosa et al., 1989, EMBO J., 8: 23-29) donor: Solanum tuberosum kódující úsek: gen SST z Cynars scolymus orientace: sense terminátor: polyadenylační signál z genu oktopinsyntetázy z A. tumefaciens, plazmid pTiACH5 (Gielen et al., 1984, EMBO J., 3: 835-846) donátor: Agrobacterium tumefaciens rezistence: kanamycin

Obrázek 2: ukazuje analýzu rozpustných cukrů v hlízách transgenních rostlin, které byly tvořeny za použití vektorového systému pB33-cySST. Fruktosylové polymery s krátkým řetězcem (zejména 1-kestóza) vytvořené díky genetické modifikaci jsou označeny.

·· 9944

99 99 99 • · · · 9 9 9 9 9 9 9 • 9 9999 9999

9999 999 9 999 999

9 · 9 · 9 9 9

9999 99 99 99 99 99

Obrázek 3: ukazuje analýzu rozpustných cukrů v transgenních rostlinách, které byly tvořeny za použití vektorového systému pB33-cySST a p35ScySST, ve srovnání s rostlinami divokého typu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Identifikace, izolace a charakterizace cDNA kódující sacharózofruktosyltransferázu závislou na sacharóze z artyčoku (Cynare scolymus]

Z květních disků artyčoku byla izolována celková RNA (Sambrook et al., viz výše). Poly(A)⁺ mRNA se izolovala za použití mRNA izolačního systému PolyATtract (Promega Corporation, Madison, WI, USA). Komplementární DNA (cDNA) se syntetizovala z 5 pg této RNA pomocí soupravy pro syntézu ZAp-cDNA synthesis kiť od firmy Stratagene podle instrukcí výrobce. Získalo se 2x10⁶ nezávislých rekombinantních fágů. Amplifikovaná cDNA knihovna se testovala obvyklými metodami pomocí fragmentu DNA značeného ³²P a odpovídajícího 3'-konci z 6-SFT cDNA (Sprenger et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 92, 1995, 11652) o délce 392 bp. Tento fragment se získal pomocí RT-PCR (užitím soupravy RT-PCR Kiť, Stratagene, Heidelberg, Germany) z kompletní RNA z primárních listů ječmene indukovaných světlem (72 hodin). Pozitivní klony se dále analyzovaly.

• to *··· • to ·· toto ·· • · to to to to to totototo to ♦ ···<· ···· • ··« · ···· ··· ··· ····· · · · ···« ·· ·· ·· ·· ··

Příklad 2

Sekvenční analýza inzertu cDNA plazmidu pCy21

Plazmidová DNA byla izolována z klonu pCy21. Sekvence inzertu cDNA se určovala obvyklými metodami pomocí dideoxynukleotidové metody (Sanger et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 74, 1977, 5463-5467).

Inzert klonu pCy21 je DNA o délce 2055 bp. Nukleotidová sekvence je uvedena v sekvenci id. č. 1. Odpovídající aminokyselinová sekvence je uvedena v sekvenci id. č. 2.

Sekvenční analýza a srovnání s již publikovanými sekvencemi ukázaly, že sekvence uvedená v sekvenci id. č. 1 je nová a zahrnuje kódující úsek vykazující homologie s SST z jiných organismů.

Příklad 3

Příprava plazmidu pB33-cySST a zavedení plazmidu do genomu brambory

Plazmid pB33-cySST obsahuje tři fragmenty A, B a C v binárním vektoru pBinl9 (Bevan, 1984, Nucl. Acids Res., 12; 8711, modifikováno podle Becker, 1990, Nucl. Acids Res., 18: 203) (srov. obr. 1). Fragment A obsahuje promotor B33 patatinového genu b33 z brambory. Obsahuje fragment Dral (pozice -1512 až pozice +14) patatinového genu B33 (RochaSosa et al., 1989, EMBÓ J., 8:23-29), který je vložen mezi štěpná místa EcoRl a Sací polylinkeru z pBinl9-Hyg. Fragment B obsahuje kódující úsek sekvence uvedené v sekvenci id. č. 1. Fragment B byl získán jako fragment Notl s tupými konci z vektoru pBluescript SK, ve kterém je vložen do štěpného místa EcoRl prostřednictvím EcoRl/Notl sekvence linkeru. Fragment C obsahuje polyadenylační signál genu 3 z T-DNA Ti plasmidu pTi «♦ ···· *· ·9 *» ··

Φ · # «··· t> « « « • # ···· · « · · • · · · ♦ «·· « ··· ··» ·*···· · « • 1 ·« rin «· (· f » 9«

ACH 5 (Gielen et al., 1984; EMBO J., 3, 835-846), nukleotidy 11749 11939, který byl izolován jako fragment Pvu II-Hind III z plazmidu pAGV 40 (Herrera-Estrella et al., 1983, Nátuře, 303, 209 - 213) a klonován mezi štěpná místa Sphl a Hind III polylinkeru z pBinl9-Hyg po přidání linkerů Sph I ke štěpnému místu PvuII. Plazmid pB33-cySST má velikost přibližně 14 kb. Tento plazmid byl zaveden do Agrobacterium (Hófgen and Willmitzer, Nucleic Acids Res., 16, 1988, 9877).

Plazmid pB33-cySST byl zaveden do rostlin brambor prostřednictvím genového přenosu vyvolaného Agrobacterium užitím výše popsaných obvyklých metod. Celé rostliny byly regenerovány z transformovaných buněk. Z regenerovaných rostlin byly získány enzymové extrakty a ty byly testovány na přítomnost fruktosylových polymerů. Analýza se prováděla jak popisuje Róber (Planta, 199, 528-536). Analýza hlíz velkého počtu transformovaných rostlin transformovaných tímto vektorem jasně ukázala výskyt fruktosylových polymerů s krátkým řetězcem, zejména 1-kestózy, který může být přisouzen expresi genu SST podle vynálezu (srov. obr. 2).

Příklad 4

Analýza rozpustných cukrů u rostlin divokého typu a transgenních rostlin obsahujících SST

Byly připraveny transgenní rostliny obsahující vektory pB33-cySST a 35S-cySST (mající kódující úsek sekvence id. č. 1 pod kontrolou promotoru 35S) tak, jak je popsáno v příkladu 3. Z transgenních rostlin a z rostlin divokého typu se získaly extrakty a vyšetřovaly se na přítomnost fruktosylových polymerů, viz příklad 3. Analýza HPAEC ukázaná na obrázku 3 dokazuje produkci oligofruktanů. Výsledky jsou shrnuty v následující tabulce 1.

• · • · · · • · · · ·· · ··· • · • » · ·

Tabulka 1

Rozpustné cukry (sacharóza a oligofruktan) u rostlin divokého typu (WT) a transgenních rostlin

linie	sacharóza	1-kestóza	nystóza	F-nystóza
WT 1 (Désirée)	2,09	-	-	-
WT 2 (Désirée)	1,67	-	-	-
B33-cySST 6	2,26	3,58	1,60	-
B33-cySST 54	5,13	3,06	2,90	0,23
35S-cySST 18	4,08	4,05	1,51	0,12
35S-cySST 22	4,80	4,14	2,19	< 0,1

Hodnoty uvedeny v g cukru na kg čerstvé hmotnosti

Jak je zjevné z obrázku 3 a tabulky 1, obsah fruktosylových polymerů, zejména 1-kestózy, převyšuje obsah sacharózy. Tedy pokusy provedené podle předkládaného vynálezu dokazují použitelnost molekul nukleové kyseliny vynálezu pro produkci fruktosylových polymerů v transgenních rostlinách.

9 9 9 » · · ·

I · · ·

999 999 ·· ··

9 9

I · · · • · · · • ·

99 tl

SEZNAM SEKVENCÍ (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 2226 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Cynara Scolymus (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 8..1918 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:

CCACCAC

ATG Met 1

GCT Ala

TCC Ser

TCT ACC ACC

ACC Thr

CCA CTC

CTC Leu 10

CCT Pro

CAC His

49

Ser

Thr 5

Thr

Pro

Leu

CTT CAG

AAC

CCG

CAA

CTC

GCC

GGA

TCT

CCG

GCA

GCT

CAT

CGT

CTA

97

Leu Gin

Asn

Pro

Gin

Leu

Ala

Gly

Ser

Pro

Ala

His

Arg

Leu

15

20

25

30

TCC CGA

CCC

ACA

CTC

CTT

TCT

GGG

ATC

CTT

GTT

TCG

GTC

CTA

GTC

ATC

145

Ser Arg

Pro

Thr

Leu

Ser

Gly

Ile

Leu

Val

Ser

Val

Leu

Val

Ile

35

40

45

TGT GCT

CTC

GTT

GCT

GTA

ATC

CAC

AAC

CAA

TCA

CAG

CAA

CCC

TAC

CAT

193

Cys Ala

Leu

Val

Ala

Val

Ile

His

Asn

Gin

Ser

Gin

Pro

Tyr

His

50

55

60

GAC GGC

GGA

GCT

AAA

CCC

TCC

GCC

GCT

ACC

TTC

CCA

241

Asp Gly

Gly

Ala

Lys

Pro

Ser

Ala

Thr

Phe

Pro

65

70

75

ACA GCG

TCG

CCA

GAA

GCT

.GGT

TTG

AAA

CGG

TTT

CCC

ATT

GAG

TTG

AAA

289

Thr Ala

Ser

Pro

Glu

Ala

Gly

Leu

Lys

Arg

Phe

Pro

Ile

Glu

Leu

Lys

80

85

90

ACG AAT

GCT

GAG

GTT

GAG

TGG

CAA

CGC

TCG

GCT

TAC

CAT

TTT

CAG

CCC

337

Thr Asn

Ala

Glu

Val

Glu

Trp

Gin

Arg

Ser

Ala

Tyr

His

Phe

Gin

Pro

95

100

105

110

GAT AAG

AAC

TAC

ATT

AGC

GAT

CCT

GAT

GGC

CCA

ATG

TAT

CAC

ATG

GGG

385

Asp Lys

Asn

Tyr

Ile

Ser

Asp

Pro

Asp

Gly

Pro

Met

Tyr

His

Met

Gly

115

120

125

• · • ··· · · ·· · · aa • · ···· 0 0** • 9 · · · · *0*0 • · · * · ··· 0 ·00 *00 • · 0 0 · 0 * •0*0 ·0 00 0« 0 0 00

TGG Trp

TAT Tyr

CAT His

CTC Leu 130

TTC Phe

TAT Tyr

CAG Gin

TAC Tyr

AAT Asn 135

CCA Pro

GAG Glu

TCT Ser

GCC Ala

ATC Ile 140

TGG Trp

GGG Gly

433

AAC

ATC

ACA

TGG

GGC

CAC

TCC

GTA

TCC

AAA

GAC

ATG

ATC

AAC

TGG

TTC

481

Asn

Ile

Thr 145

Trp

Gly

His

Ser

Val 150

Ser

Lys

Asp

Met

Ile 155

Asn

Trp

Phe

CAT

CTC

CCC

TTC

GCC

ATG

GTC

CCT

GAC

CAA

TGG

TAC

GAT

ATC

GAA

GGT

529

His

Leu 160

Pro

Phe

Ala

Met

Val 165

Pro

Asp

Gin

Trp

Tyr 170

Asp

Ile

Glu

Gly

GTC

ATG

ACC

GGC

TCC

GCC

ACC

GTC

CTC

CCT

GAC

GGT

CAG

ATC

ATG

577

Val 175

Met

Thr

Gly

Ser

Ala 180

Thr

Val

Leu

Pro

Asp 185

Gly

Gin

Ile

Met 190

CTC

TAC

ACC

GGC

AAC

GCG

TAC

GAT

CTC

TCG

CAA

CTG

CAA

TGC

TTA

GCA

625

Leu

Tyr

Thr

Gly

Asn 195

Ala

Tyr

Asp

Leu

Ser 200

Gin

Leu

Gin

Cys

Leu 205

Ala

TAT

GCC

GTC

AAC

TCG

TCT

GAT

CCC

CTC

GAT

TGG

AAA

AAG

TAC

673

Tyr

Ala

Val

Asn 210

Ser

Asp

Pro

Leu 215

Leu

Asp

Trp

Lys 220

Lys

Tyr

GAG

GGA

AAT

CCC

ATC

TTG

TTC

CCA

CCT

GGG

GTG

GGA

TAC

AAG

GAT

721

Glu

Gly

Asn 225

Pro

Ile

Leu

Phe

Pro 230

Pro

Gly

Val

Gly 235

Tyr

Lys

Asp

TTT

CGG

GAC

CCA

TCT

ACA

CTG

TGG

TTG

GGT

CCC

GAT

GGT

GAA

TAC

AGA

769

Phe

Arg 240

Asp

Pro

Ser

Thr

Leu 245

Trp

Leu

Gly

Pro

Asp 250

Gly

Glu

Tyr

Arg

ATG

GTA

ATG

GGG

TCC

AAG

CAT

AAC

GAG

ACC

ATC

GGT

TGT

GCC

TTG

ATT

817

Met 255

Val

Met

Gly

Ser

Lys 260

His

Asn

Glu

Thr

Ile 265

Gly

Cys

Ala

Leu

Ile 270

TAC

CAT

ACC

ACT

AAT

TTT

ACG

CAT

TTC

GAG

CTC

AAG

GAA

GAG

GTG

CTT

865

Tyr

His

Thr

Asn 275

Phe

Thr

His

Phe

Glu 280

Leu

Lys

Glu

Val 285

Leu

CAC

GCC

GTT

CCC

CAC

ACG

GGT

ATG

TGG

GAA

TGT

GTG

GAT

CTT

TAT

CCG

913

His

Ala

Val

Pro 290

His

Thr

Gly

Met

Trp 295

Glu

Cys

Val

Asp

Leu 300

Tyr

Pro

GTA

TCC

ACC

ACG

CAC

ACA

AAC

GGG

TTG

GAC

ATG

GTG

GAT

AAC

GGG

CCG

961

Val

Ser

Thr 305

Thr

His

Thr

Asn

Gly 310

Leu

Asp

Met

Val

Asp 315

Asn

Gly

Pro

AAT

GTG

AAG

CAT

GTG

TTG

AAA

CAA

AGT

GGG

GAT

GAA

GAT

CGA

CAT

GAT

1009

Asn

Val 320

Lys

His

Val

Leu

Lys 325

Gin

Ser

Gly

Asp

Glu 330

Asp

Arg

His

Asp

TGG

TAT

GCG

CTC

GGG

ACT

TAT

GAC

GTC

GTG

AAT

GAT

AAG

TGG

TAT

CCA

1057

Trp 335

Tyr

Ala

Leu

Gly

Thr 340

Tyr

Asp

Val

Asn 345

Asp

Lys

Trp

Tyr

Pro 350

• · · 9

9999 99 ·· *· · · · * • · * · · · · • · · · · · · • ··· * ··· ··· • * · « • · ·.· ·» ««

GAT

GAC

CCT

GAA

AAC

GAT

GTG

GGT

ATC

GGG

TTA

AGA

TAC

GAT

TTC

GGA

Asp

Pro

Glu

Asn 355

Asp

Val

Gly

Ile

Gly 360

Leu

Arg

Tyr

Asp

Phe 365

Gly

AAG

TTT

TAT

GCG

TCA

AAG

ACG

TTC

TAC

GAC

CAA

CAT

AAG

AGA

CGG

Lys

Phe

Tyr

Ala 370

Ser

Lys

Thr

Phe

Tyr 375

Asp

Gin

His

Lys

Lys 380

Arg

GTC

CTT

TGG

GGT

TAC

GTT

GGA

GAA

ACC

GAT

CCC

CCT

AAA

TAC

GAC

GTT

Val

Leu

Trp 385

Gly

Tyr

Val

Gly

Glu 390

Thr

Asp

Pro

Lys 395

Tyr

Asp

Val

TAC

AAG

GGA

TGG

GCT

AAC

ATT

TTG

AAC

ATT

CCA

AGG

ACC

ATA

GTT

TTG

Tyr

Lys 400

Gly

Trp

Ala

Asn

Ile 405

Leu

Asn

Ile

Pro

Arg 410

Thr

Ile

Val

Leu

GAC

ACG

AAA

ACG

AAT

ACC

AAT

TTG

ATT

CAA

TGG

CCA

ATT

GCG

GAA

GTC

Asp 415

Thr

Lys

Thr

Asn

Thr 420

Asn

Leu

Ile

Gin

Trp 425

Pro

Ile

Ala

Glu

Val 430

GAA

AAC

TTG

AGA

TCG

AAT

AAA

TAC

AAT

GAA

TTC

AAA

GAC

GTG

GAG

CTG

Glu

Asn

Leu

Arg

Ser 435

Asn

Lys

Tyr

Asn

Glu 440

Phe

Lys

Asp

Val

Glu 445

Leu

AAA

CCG

GGA

TCA

CTG

ATT

CCG

CTC

GAG

ATA

GGC

ACA

GCA

ACA

CAG

TTG

Lys

Pro

Gly

Ser 450

Leu

Ile

Pro

Leu

Glu 455

Ile

Gly

Thr

Ala

Thr 460

Gin

Leu

GAT

ATA

ACT

GCG

ACA

TTC

GAA

GTT

GAT

CAA

ACG

ATG

TTG

GAA

TCG

ACG

Asp

Ile

Thr 465

Ala

Thr

Phe

Glu

Val 470

Asp

Gin

Thr

Met

Leu 475

Glu

Ser

Thr

CTT

GAA

GCC

GAT

GTT

TTG

TTC

AAT

TGT

ACG

ACC

AGT

GAA

GGT

TCA

GCC

Leu

Glu 480

Ala

Asp

Val

Leu

Phe 485

Asn

Cys

Thr

Ser 490

Glu

Gly

Ser

Ala

GGG

AGA

GGG

GTG

TTG

GGG

CCA

TTT

GGA

CTG

GTG

GTT

CTA

GCT

GAT

GCC

Gly 495

Arg

Gly

Val

Leu

Gly 500

Pro

Phe

Gly

Leu

Val 505

Val

Leu

Ala

Asp

Ala 510

GAA

CGA

TCT

GAG

CAA

CTT

CCT

GTG

TAT

TTC

TAT

ATA

GCA

AAA

GAC

ACC

Glu

Arg

Ser

Glu

Gin 515

Leu

Pro

Val

Tyr

Phe 520

Tyr

Ile

Ala

Lys

Asp 525

Thr

GAT

GGA

TCC

TCA

AAA

ACT

TAC

TTC

TGT

GCC

GAT

GAA

TCA

AGA

TCA

TCG

Asp

Gly

Ser

Ser 530

Lys

Thr

Ťyr

Phe

Cys 535

Ala

Asp

Glu

Ser

Arg 540

Ser

AAC

GAT

GTA

GAC

ATA

GGG

AAA

TGG

GTG

TAC

GGA

AGC

AGT

GTT

CCT

GTT

Asn

Asp

Val 545

Asp

Ile

Gly

Lys

Trp 550

Val

Tyr

Gly

Ser

Ser 555

Val

Pro

Val

CTA

GAA

GGC

GAA

AAA

TTC

AAC

ATG

AGG

TTG

CTG

GTG

GAT

CAT

TCA

ATT

Leu

Glu 560

Gly

Glu

Lys

Phe

Asn 565

Met

Arg

Leu

Val 570

Asp

His

Ser

Ile

1105

1153

1201

1249

1297

1345

1393

1441

1489

1537

1585

1633

1681

1729 • · • · • · · · » · · · « · · · · · • · · tt

GTC Val 575

GAA Glu

GGC Gly

TTC Phe

GCA CAA GGA

GGC Gly

AGA ACG

GTG Val 585

GTG Val

ACA Thr

TCA Ser

AGA Arg

GTG Val 590

1777

Ala

Gin 580

Gly

Arg

Thr

TAT

CCG

GCG

AAG

GCG

ATC

TAC

GGC

GCT

GCA

AAG

TTA

TTT

TTG

TTC

AAC

1825

Tyr

Pro

Ala

Lys

Ala

Ile

Tyr

Gly

Ala

Lys

Leu

Phe

Leu

Phe

Asn

595

600

605

AAC

GCC

ACC

GGA

ATC

AGC

GTG

AAG

GCA

TCT

CTC

AAG

ATC

TGG

AAA

ATG

1873

Asn

Ala

Thr

Gly

Tle

Ser

Val

Lys

Ala

Ser

Leu

Lys

Ile

Trp

Lys

Met

610

615

620

AAG

GAA

GCA

CAA

CTG

GAT

CCA

TTC

CCT

CTT

TCT

GGA

TGG

AGT

TCT

1918

Lys

Glu

Ala

Gin

Leu

Asp

Pro

Phe

Pro

Leu

Ser

Gly

Trp

Ser

625 630 635

T GAT GAT GAT	GATGATTAAG	AACTCATTTC	ATGAAGATGA	TGATTAAGAA	CTCATTTCAT	1978
GAT GAT GAT G	ATGATTCCAG	TTTATATGCG	TACCCTGTTC	CCTTTACCTG	TATGTGGTGG	2038
TGGTGGTGAA	ATATGGTTAG	CATGATTCCG	GGTTGGCGAG	GGCAATATGG	TAATTTACTA	2098
TCGCTGTAGT	AGTACTCCAC	TTGTGAGATT	ATATTTCATA	AATTCAATTA	TTATTCCTGT	2158
TTACAACCTT	TTTCATTGTA	TCATACCACC	CATTGAATCC	CATCATGTTC	AATTAGTGTT	2218
GCAAAAAA						2226

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 637 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein

(Xi) POPIS	SEKVENCE:	SEKVENCE S	IDENTIFIKAČNÍM	ČÍSLEM	2 :
Met Ala Ser 1	Ser Thr Thr 5	Thr Pro Leu	Leu Pro His His 10	His Leu 15	Gin
Asn Pro Gin	Gin Leu Ala 20	Gly Ser Pro 25	Ala Ala His Arg	Leu Ser 30	Arg
Pro Thr Leu 35	Leu Ser Gly	Ile Leu Val 40	Ser Val Leu Val 45	Ile Cys	Ala

• · « · • · · · · · · · « • · · · · · · · · · · · ·· 0 II* 000 • · * 0 ♦ ·

Leu Val Ala 50

Val

Ile

His

Asn 55

Gin

Ser

Gin

Pro 60

Tyr

His

Asp

Gly

Ala

Lys

Pro

Ser

Ala

Thr

Phe

Pro

Thr

Ala

65

70

75

80

Ser

Pro

Glu

Ala

Gly

Leu

Lys

Arg

Phe

Pro

Ile

Glu

Leu

Lys

Thr

Asn

85

90

95

Ala

Glu

Val

Glu

Trp

Gin

Arg

Ser

Ala

Tyr

His

Phe

Gin

Pro

Asp

Lys

100

105

110

Asn

Tyr

Ile

Ser

Asp

Pro

Asp

Gly

Pro

Met

Tyr

His

Met

Gly

Trp

Tyr

115

120

125

His

Leu

Phe

Tyr

Gin

Tyr

Asn

Pro

Glu

Ser

Ala

Ile

Trp

Gly

Asn

Ile

130

135

140

Thr

Trp

Gly

His

Ser

Val

Ser

Lys

Asp

Met

Ile

Asn

Trp

Phe

His

Leu

145

150

155

160

Pro

Phe

Ala

Met

Val

Pro

Asp

Gin

Trp

Tyr

Asp

Ile

Glu

Gly

Va.l

Met

165

170

175

Thr

Gly

Ser

Ala

Thr

Val

Leu

Pro

Asp

Gly

Gin

Ile

Met

Leu

Tyr

180

185

190

Thr

Gly

Asn

Ala

Tyr

Asp

Leu

Ser

Gin

Leu

Gin

Cys

Leu

Ala

Tyr

Ala

195

200

205

Val

Asn

Ser

Asp

Pro

Leu

Asp

Trp

Lys

Tyr

Glu

Gly

210

215

220

Asn

Pro

Ile

Leu

Phe

Pro

Gly

Val

Gly

Tyr

Lys

Asp

Phe

Arg

225

230

235

240

Asp

Pro

Ser

Thr

Leu

Trp

Leu

Gly

Pro

Asp

Gly

Glu

Tyr

Arg

Met

Val

245

250

255

Met

Gly

Ser

Lys

His

Asn

Glu

Thr

Ile

Gly

Cys

Ala

Leu

Ile

Tyr

His

260

265

270

Thr

Asn

Phe

Thr

His

Phe

Glu

Leu

Lys

Glu

Val

Leu

His

Ala

275

280

285

Val

Pro

His

Thr

Gly

Met

Trp

Glu

Cys

Val

Asp

Leu

Tyr

Pro

Val

Ser

290

295

300

Thr

His

Thr

Asn

Gly

Leu

Asp

Met

Val

Asp

Asn

Gly

Pro

Asn

Val

305

310

315

320

Lys His Val Leu Lys Gin Ser Gly Asp Glu Asp Arg His Asp Trp Tyr • · · · · · · · · tt • ·>· · ··· # ··· ··· ······ · · ···· ·· ·· ·· ·· ··

325 330 335

Ala Leu Gly Thr Tyr Asp Val Val Asn Asp Lys Trp Tyr Pro Asp Asp 340 345 350

Pro Glu Asn Asp Val Gly Ile Gly Leu Arg Tyr Asp Phe Gly Lys Phe 355 360 365

Tyr Ala Ser Lys Thr Phe Tyr Asp Gin His Lys Lys Arg Arg Val Leu 370 375 380

Trp Gly Tyr Val Gly Glu Thr Asp Pro Pro Lys Tyr Asp Val Tyr Lys

385 390 395 400

Gly Trp Ala Asn Ile Leu Asn Ile Pro Arg Thr Ile Val Leu Asp Thr

405 410 415

Lys Thr Asn Thr Asn Leu Ile Gin Trp Pro Ile Ala Glu Val Glu Asn 420 425 430

Leu Arg Ser Asn Lys Tyr Asn Glu Phe Lys Asp Val Glu Leu Lys Pro 435 440 445

Gly Ser Leu Ile Pro Leu Glu Ile Gly Thr Ala Thr Gin Leu Asp Ile 450 455 460

Thr Ala Thr Phe Glu Val Asp Gin Thr Met Leu Glu Ser Thr Leu Glu

465 470 475 480

Ala Asp Val Leu Phe Asn Cys Thr Thr Ser Glu Gly Ser Ala Gly Arg

485 490 495

Gly Val Leu Gly Pro Phe Gly Leu Val Val Leu Ala Asp Ala Glu Arg 500 505 510

Ser Glu Gin Leu Pro Val Tyr Phe Tyr Ile Ala Lys Asp Thr Asp Gly 515 520 525

Ser Ser Lys Thr Tyr Phe Cys Ala Asp Glu Ser Arg Ser Ser Asn Asp 530 535 540

Val Asp Ile Gly Lys Trp Val Tyr Gly Ser Ser Val Pro Val Leu Glu

545 550 555 560

Gly Glu Lys Phe Asn Met Arg Leu Leu Val Asp His Ser Ile Val Glu

565 570 575

Gly Phe Ala Gin Gly Gly Arg Thr Val Val Thr Ser Arg Val Tyr Pro 580 585 590

Ala Lys Ala Ile Tyr Gly Ala Ala Lys Leu Phe Leu Phe Asn Asn Ala 595 600 605 • · ··« · • · • · · · · · · · · · • · t · · ···· ··· ··· • * * · · · · · • · · · ·· ·9 · · ·· ««

Thr	Gly 610	Ile	Ser	Val	Lys	Ala 615	Ser	Leu	Lys Ile	Trp 620	Lys Met Lys Glu
Ala	Gin	Leu	Asp	Pro	Phe	Pro	Leu	Ser	Gly Trp	Ser	Ser

625 630 635 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1911 párů baží (B) TYP: nukleotid (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis = „syntetická DNA (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 1..1911 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:

ATG Met

GCA Ala

AGC Ser 640

TCT Ser

ACG Thr

ACT Thr

ACA Thr

CCG Pro 645

TTG Leu

TTA Leu

CCG Pro

CAC His

CAC His 650

CAT His

TTG Leu

CAG Gin

48

AAT

CCT

CAG

TTG

GCT

GGA

AGT

CCA

GCT

GCA

CAC

AGG

TTG

AGT

CGT

96

Asn

Pro 655

Gin

Leu

Ala

Gly 660

Ser

Pro

Ala

His 665

Arg

Leu

Ser

Arg

CCT

ACT

CTT

TTG

AGT

GGT

ATA

TTG

GTA

AGT

GTA

CTG

GTC

ATC

TGC

GCA

144

Pro 670

Thr

Leu

Ser

Gly 675

Ile

Leu

Val

Ser

Val 680

Leu

Val

Ile

Cys

Ala 685

TTG

GTC

GCA

GTT

ATA

CAT

AAT

CAG

TCT

CAA

CAG

CCA

TAC

CAT

GAT

GGT

192

Leu

Val

Ala

Val

Ile 690

His

Asn

Gin

Ser

Gin 695

Gin

Pro

Tyr

His

Asp 700

Gly

GGT

GCC

AAG

CCT

AGC

TCT

AGC

GCT

GCC

ACG

ACT

TTT

CCT

ACA

GCC

240

Gly

Ala

Lys

Pro 705

Ser

Ala

Ala 710

Thr

Phe

Pro 715

Thr

Ala

AGC

CCT

GAA

GCA

GGA

TTG

AAA

AGA

TTC

CCT

ATC

GAA

CTC

AAG

ACC

AAC

288

Ser

Pro

Glu 720

Ala

Gly

Leu

Lys

Arg 725

Phe

Pro

Ile

Glu

Leu 730

Lys

Thr

Asn

« » • · · * # · * « • · · · « » · · ♦ , « · · • · · · • ·» · • * · · «· · · · · • ·

GCA

GAA

GTC

GAG

TGG

CAG

AGA

AGT

GCA

TAC

CAC

TTC

CAG

CCA

GAT

AAG

Ala

Glu 735

Val

Glu

Trp

Gin

Arg 740

Ser

Ala

Tyr

His

Phe 745

Gin

Pro

Asp

Lys

AAC

TAT

ATC

TCA

GAC

CCA

GAC

GGG

CCT

ATG

TAC

CAT

ATG

GGT

TGG

TAC

Asn 750

Tyr

Ile

Ser

Asp

Pro 755

Asp

Gly

Pro

Met

Tyr 760

His

Met

Gly

Trp

Tyr 765

CAC

TTA

TTC

TAC

CAA

TAT

AAT

CCA

GAG

AGT

GCA

ATA

TGG

GGA

AAT

ATA

His

Leu

Phe

Tyr

Gin 770

Tyr

Asn

Pro

Glu

Ser 775

Ala

Ile

Trp

Gly

Asn 780

Ile

ACT

TGG

GGT

CAT

AGC

GTT

AGC

AAG

GAT

ATG

ATT

AAT

TGG

TTT

CAC

TTG

Thr

Trp

Gly

His 785

Ser

Val

Ser

Lys

Asp 790

Met

Ile

Asn

Trp

Phe 795

His

Leu

CCA

TTT

GCG

ATG

GTC

CCA

GAT

CAA

TGG

TAT

GAT

ATT

GAG

GGC

GTT

ATG

Pro

Phe

Ala 800

Met

Val

Pro

Asp

Gin 805

Trp

Tyr

Asp

Ile

Glu 810

Gly

Val

Met

ACT

GGA

AGC

GCA

ACT

GTT

TTG

CCA

GAC

GGA

CAG

ATC

ATT

ATG

TTG

TAT

Thr

Gly 815

Ser

Ala

Thr

Val

Leu 820

Pro

Asp

Gly

Gin

Ile 825

Ile

Met

Leu

Tyr

ACC

GGT

AAT

GCA

TAC

GAC

TTG

AGT

CAG

TTG

CAG

TGT

CTC

GCC

TAT

GCC

Thr 830

Gly

Asn

Ala

Tyr

Asp 835

Leu

Ser

Gin

Leu

Gin 840

Cys

Leu

Ala

Tyr

Ala 845

GTT

AAT

AGC

GAC

CCC

TTG

CTC

GAT

TGG

AAG

TAC

GAG

GGC

Val

Asn

Ser

Asp 850

Pro

Leu

Asp 855

Trp

Lys

Tyr

Glu 860

Gly

AAT

CCG

ATT

CTC

TTT

CCG

CCT

GGC

GTC

GGA

TAT

AAA

GAT

TTC

AGA

Asn

Pro

Ile

Leu 865

Phe

Pro

Gly 870

Val

Gly

Tyr

Lys

Asp 875

Phe

Arg

GAT

CCC

AGT

ACT

CTC

TGG

CTC

GGT

CCA

GAC

GGA

GAG

TAC

CGT

ATG

GTC

Asp

Pro

Ser 880

Thr

Leu

Trp

Leu

Gly 885

Pro

Asp

Gly

Glu

Tyr 890

Arg

Met

Val

ATG

GGC

AGC

AAA

CAC

AAT

GAA

ACA

ATC

GGG

TGC

GCA

CTC

ATC

TAT

CAC

Met

Gly 895

Ser

Lys

His

Asn

Glu 900

Thr

Ile

Gly

cys

Ala 905

Leu

Ile

Tyr

His

ACG

ACA

AAC

TTC

ACG

CAC

TTC

GAG

CTC

AAG

GAA

GTC

TTA

CAC

GCT

Thr 910

Thr

Asn

Phe

Thr

His 915

Phe

Glu

Leu

Lys

Glu 920

Glu

Val

Leu

His

Ala 925

GTT

CCT

CAC

ACA

GGA

ATG

TGG

GAG

TGC

GTC

GAC

TTA

TAT

CCC

GTC

AGT

Val

Pro

His

Thr

Gly 930

Met

Trp

Glu

Cys

Val 935

Asp

Leu

Tyr

Pro

Val 940

Ser

ACT

CAT

ACG

AAT

GGC

TTG

GAT

ATG

GTC

GAC

AAT

GGT

CCC

AAC

GTC

Thr

His

Thr 945

Asn

Gly

Leu

Asp

Met 950

Val

Asp

Asn

Gly

Pro 955

Asn

Val

336

384

432

480

528

576

624

672

720

768

816

864

912

960

9··9

9 • · · 999« 9999 • 9 »999 9999 • 999 9 9999 999 999 • •999 9 9 9

9999 9» 9» 99 99 99

ΑΛΑ. Lys

CAT His

GTC Val 960

CTC AAG

CAG Gin

TCC Ser

GGC Gly 965

GAC Asp

GAG Glu

GAC AGG

CAC His 970

GAC Asp

TGG Trp

TAC Tyr

1008

Leu

Lys

Asp

Arg

GCT

TTA

GGT

ACA

TAT

GAC

GTC

AAC

GAC

AAA

TGG

TAT

CCC

GAC

GAT

1056

Ala

Leu 975

Gly

Thr

Tyr

Asp

Val 980

Val

Asn

Asp

Lys

Trp 985

Tyr

Pro

Asp

CCC

GAG

AAC

GAC

GTC

GGA

ATT

GGC

CTT

CGT

TAC

GAC

TTC

GGC

AAG

TTC

1104

Pro 990

Glu

Asn

Asp

Val

Gly 995

Ile

Gly

Leu

Arg

Tyr Asp 1000

Phe

Gly

Lys

Phe 1005

TAC

GCC

AGT

AAA

ACA

TTC

TAC

GAT

CAG

CAC

AAA

CGT

GTT

TTA

1152

Tyr

Ala

Ser

Lys

Thr Phe 1010

Tyr

Asp

Gin

His Lys 1015

Lys

Arg

Val Leu 1020

TGG

GGA

TAC

GTC

GGC

GAG

ACG

GAC

CCG

CCC

AAA

TAC

GAT

GTC

TAC

AAA

1200

Trp

Gly

Tyr

Val Gly 1025

Glu

Thr

Asp

Pro Pro 1030

Lys

Tyr

Asp

Val Tyr 1035

Lys

GGT

TGG

GCA

AAT

ATC

CTC

AAC

ATA

CCT

CGC

ACT

ATT

GTC

CTC

GAT

ACG

1248

Gly

Trp

Ala Asn 1040

Ile

Leu

Asn

Ile Pro 1045

Arg

Thr

Ile

Val Leu 1050

Asp

Thr

AAG

ACA

AAC

ACG

AAC

CTC

ATA

CAG

TGG

CCT

ATT

GCC

GAG

GTG

GAG

AAT

1296

Lys

Thr Asn 1055

Thr

Asn

Leu

Ile Gin 1060

Trp

Pro

Ile

Ala Glu 1065

Val

Glu

Asn

TTA

CGT

AGC

AAC

AAA

TAC

AAC

GAG

TTC

AAG

GAT

GTG

GAA

TTG

AAG

CCT

1344

Leu Arg 1070

Ser

Asn

Lys

Tyr Asn 1075

Glu

Phe

Lys

Asp Val 1080

Glu

Leu

Lys

Pro 1085

GGA

AGT

TTG

ATT

CCG

TTA

GAA

ATC

GGT

ACT

GCT

ACT

CAA

CTC

GAC

ATC

1392

Gly

Ser

Leu

Ile

Pro Leu 1090

Glu

Ile

Gly

Thr Ala 1095

Thr

Gin

Leu

Asp Ile 1100

ACC

GCT

ACT

TTT

GAG

GTC

GAT

CAG

ACC

ATG

CTC

GAG

AGT

ACC

TTA

GAA

1440

Thr

Ala

Thr

Phe Glu 1105

Val

Asp

Gin

Thr Met 1110

Leu

Glu

Ser

Thr Leu 1115

Glu

GCG

GAC

GTA

TTA

TTT

AAC

TGT

ACC

ACA

TCC

GAG

GGG

AGC

GCA

GGT

CGC

1488

Ala

Asp

Val Leu 1120

Phe

Asn

Cys

Thr 1125

Thr

Ser

Glu

Gly

Ser Ala 1130

Gly

Arg

GGA

GTC

CTT

GGT

CCA

TTC

GGA

CTT

GTC

TTA

GCG

GAC

GCA

GAA

AGA

1536

Gly

Val 1135

Leu

Gly

Pro

Phe

Gly 114C

Leu 1

Val

Leu

Ala 1145

Asp

Ala

Glu

Arg

AGC

GAG

CAG

TTG

CCC

GTC

TAT

TTT

TAC

ATT

GCC

AAG

GAC

ACC

GAC

GGT

1584

Ser 115C

Glu 1

Gin

Leu

Pro

Val 1155

Tyr

Phe

Tyr

Ile

Ala 116C

Lys 1

Asp

Thr

Asp

Gly 1165

TCC

AGC

AAG

ACA

TAC

TTC

TGC

GCA

GAT

GAG

TCC

CGC

AGC

AAC

GAC

1632

Ser

Lys

Thr

Tyr

Phe

Cys

Ala

Asp

Glu

Ser

Arg

Ser

Asn

Asp

1170 1175 1180 • * · » · ·

9990 99 • · 99

9 8 0 0

9 9 9 0 *908 990 900

GTC Val

GAT Asp

ATC Ile

GGC AAG Gly Lys 1185

TGG Trp

GTC Val

TAT Tyr

GGT TCG Gly Ser 1190

TCA Ser

GTC Val

CCA Pro

GTG Val 119!

TTG Leu

GAG Glu

1680

GGA

GAG

AAA

TTT AAC

ATG

CGC

CTG

CTT GTC

GAC

CAC

AGC

ATC

GTC

GAA

1728

Gly

Glu

Lys

Phe Asn

Met

Arg

Leu

Leu Val

Asp

His

Ser

Ile

Val

Glu

1200

1205

1210

GGC

TTC

GCT

CAG GGT

GGC

CGT

ACT

GTC GTA

ACC

AGT

CGT

GTC

TAC

CCT

1776

Gly

Phe

Ala

Gin Gly

Gly

Arg

Thr

Val Val

Thr

Ser

Arg

Val

Tyr

Pro

1215

1220

1225

GCT

AAA

GCC

ATA TAT

GGG

GCA

GCC

AAA CTC

TTC

CTC

TTT

AAT

GCC

1824

Ala

Lys

Ala

Ile Tyr

Gly

Ala

Lys Leu

Phe

Leu

Phe

Asn

Ala

1230

1235

1240

1245

ACA

GGC

ATA

TCA GTC

AAA

GCC

AGC

TTA AAA

ATT

TGG

AAA

ATG

AAA

GAG

1872

Thr

Gly

Ile

Ser Val

Lys

Ala

Ser

Leu Lys

Ile

Trp

Lys

Met

Lys

Glu

1250

1255

1260

GCT

CAG

TTG

GAC CCG

TTT

CCA

TTA

AGC GGC

TGG

TCT

AGC

1911

Ala

Gin

Leu

Asp Pro

Phe

Pro

Leu

Ser Gly

Trp

Ser

1265

1270

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 637 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE

Met Ala Ser Ser Thr Thr Thr Pro 1 5

Asn Pro Gin Gin Leu Ala Gly Ser 20

Pro Thr Leu Leu Ser Gly Ile Leu 35 40

Leu Val Ala Val Ile His Asn Gin 50 55

Gly Ala Lys Pro Ser Ser Ser Ala 65 70

S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:

Leu Leu Pro His His His Leu Gin

15

Pro Ala Ala His Arg Leu Ser Arg 25 30

Val Ser Val Leu Val Ile Cys Ala 45

Ser Gin Gin Pro Tyr His Asp Gly 60

Ala Thr Thr Thr Phe Pro Thr Ala 75 80 • · «φφ» «Φ·· • · · φ φ « · · φ · • ΦΦΦΦ φφφ * φφφ φφφ • · · · Β Φ φ ·* Φ* ΦΦ ΦΦ φφ φφ

Ser

Pro

Glu

Ala

Gly 85

Leu

Lys

Arg

Phe

Pro 90

Ile

Glu

Leu

Lys

Thr 95

Asn

Ala

Glu

Val

Glu

Trp

Gin

Arg

Ser

Ala

Tyr

His

Phe

Gin

Pro

Asp

Lys

100

105

110

Asn

Tyr

Ile

Ser

Asp

Pro

Asp

Gly

Pro

Met

Tyr

His

Met

Gly

Trp

Tyr

115

120

125

His

Leu

Phe

Tyr

Gin

Tyr

Asn

Pro

Glu

Ser

Ala

Ile

Trp

Gly

Asn

Ile

130

135

140

Thr

Trp

Gly

His

Ser

Val

Ser

Lys

Asp

Met

Ile

Asn

Trp

Phe

His

Leu

145

150

155

160

Pro

Phe

Ala

Met

Val

Pro

Asp

Gin

Trp

Tyr

Asp

Ile

Glu

Gly

Val

Met

165

170

175

Thr

Gly

Ser

Ala

Thr

Val

Leu

Pro

Asp

Gly

Gin

Ile

Met

Leu

Tyr

180

185

190

Thr

Gly

Asn

Ala

Tyr

Asp

Leu

Ser

Gin

Leu

Gin

Cys

Leu

Ala

Tyr

Ala

195

200

205

Val

Asn

Ser

Asp

Pro

Leu

Asp

Trp

Lys

Tyr

Glu

Gly

210

215

220

Asn

Pro

Ile

Leu

Phe

Pro

Gly

Val

Gly

Tyr

Lys

Asp

Phe

Arg

225

230

235

240

Asp

Pro

Ser

Thr

Leu

Trp

Leu

Gly

Pro

Asp

Gly

Glu

Tyr

Arg

Met

Val

245

250

255

Met

Gly

Ser

Lys

His

Asn

Glu

Thr

Ile

Gly

Cys

Ala

Leu

Ile

Tyr

His

260

265

270

Thr

Asn

Phe

Thr

His

Phe

Glu

Leu

Lys

Glu

Val

Leu

His

Ala

275

280

285

Val

Pro

His

Thr

Gly

Met

Trp

Glu

Cys

Val

Asp

Leu

Tyr

Pro

Val

Ser

290

-

295

300

Thr

His

Thr

Asn

Gly

Leu

Asp

Met

Val

Asp

Asn

Gly

Pro

Asn

Val

305

310

315

320

Lys

His

Val

Leu

Lys

Gin

Ser

Gly

Asp

Glu

Asp

Arg

His

Asp

Trp

Tyr

325

330

335

Ala

Leu

Gly

Thr

Tyr

Asp

Val

Asn

Asp

Lys

Trp

Tyr

Pro

Asp

340 345 350 • · *·

99

9 9 9 • 9 9 9

999 999

9

9 9 9

9

Lys Phe

Arg Tyr Asp

Pro Glu

Tyr Ala 370

Trp Gly 385

Gly Trp

Lys Thr

Leu Arg

Gly Ser 450

Thr Ala 465

Ala Asp

Gly Val

Ser Glu

Ser Ser 530

Val Asp 545

Gly Glu

Gly Phe

Ala Lys

Thr Gly 610

Asn Asp 355

Ser Lys

Tyr Val

Ala Asn

Asn Thr 420

Ser Asn 435

Leu Ile

Thr Phe

Val Leu

Leu Gly 500

Gin Leu 515

Lys Thr

Ile Gly

Lys Phe

Ala Gin 580

Ala Ile 595

Ile Ser

Val

Thr

Gly

Ile

405

Asn

Lys

Pro

Glu

Phe

485

Pro

Tyr

Lys

Asn

565

Gly

Tyr

Val

Gly Ile

Phe Tyr 375

Glu Thr 390

Leu Asn

Leu Ile

Tyr Asn

Leu Glu 455

Val Asp 470

Asn Cys

Phe Gly

Val Tyr

Phe Cys 535

Trp Val 550

Met Arg

Gly Arg

Gly Ala

Lys Ala 615

Gly Leu 360

Asp Gin

Asp Pro

Ile Pro

Gin Trp 425

Glu Phe 440

Ile Gly

Gin Thr

Thr Thr

Leu Val 505

Phe Tyr 520

Ala Asp

Tyr Gly

Leu Leu

Thr Val 585

Ala Lys 600

Ser Leu

His Lys Lys 380

Pro Lys Tyr 395

Arg Thr Ile 410

Pro Ile Ala

Lys Asp Val

Thr Ala Thr 460

Met Leu Glu 475

Ser Glu Gly 490

Val Leu Ala

Ile Ala Lys

Glu Ser Arg 540

Ser Ser Val 555

Val Asp His 570

Val Thr Ser

Leu Phe Leu

Lys Ile Trp 620

Phe Gly 365

Arg Arg

Asp Val

Val Leu

Glu Val 430

Glu Leu 445

Gin Leu

Ser Thr

Val Leu

Tyr Lys 400

Asp Thr 415

Glu Asn

Lys Pro

Asp Ile

Ser Ala

Asp Ala 510

Asp Thr 525

Ser Ser

Pro Val

Ser Ile

Arg Val 590

Phe Asn 605

Lys Met

Leu Glu 480

Gly Arg 495

Glu Arg

Asp Gly

Asn Asp

Leu Glu 560

Val Glu 575

Tyr Pro

Asn Ala

Lys Glu

444

4 ·«·· · 4 • · · 4 4 4 • 4 4 4 4 • 4 4 4 4

4*4 « « •444 «4 ·· 99

44 • *4 4

4 4 4

444 44 *

4

44

Ala Gin Leu Asp Pro Phe Pro Leu Ser Gly Trp Ser Ser 625 630 635 • to

99 • · · · • ·· to ··· ··· • · ·· ·♦

99 9 99

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

9 9

9 9

9

9

ΤΙ/^ΐΥν35

1. Molekula nukleové kyseliny kódující sacharózofruktosyltransferázu závislou na sacharóze (SST), která je vybrána ze skupiny obsahující :

a) molekuly nukleové kyseliny kódující protein, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou jako sekvenci identifikačního čísla 2 a 4,

b) molekuly nukleové kyseliny, které obsahují nukleotidovou sekvenci uvedenou jako sekvenci identifikačního čísla 1 nebo odpovídající ribonukleotidovou sekvenci,

c) molekuly nukleové kyseliny, které obsahují nukleotidovou sekvenci uvedenou jako sekvenci identifikačního čísla 3 nebo odpovídající ribonukleotidovou sekvenci, a

d) molekuly nukleové kyseliny, které obsahují fragment molekul nukleové kyseliny uvedených v a) až c) kódující protein, který je schopen katalyzovat vytvoření p-2,l-glykosidických nebo β-2,6glykosidických vazeb mezi fruktózovými jednotkami.
2. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 1, která je molekula DNA.
3. Molekula DNA podle nároku 2, která je molekula cDNA.
4. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 1, která je molekula RNA.
5. Vektor, který obsahuje molekulu nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4.

♦*·« • · • 4

4 4

4444 44 *4 4 4

4 4

4 4

444

4 4

4 4

44 • 4 4 4

4 4 4

444 444

4

44
6. Vektor podle nároku 5, kde molekula nukleové kyseliny je operativně spojena s regulačním prvkem, který dovoluje transkripci a syntézu translatovatelné RNA v prokaryotických a/nebo eukaryotických buňkách.
7. Vektor podle nároku 6, kde regulační prvek je odvozen z patatinového promotoru B33.
8. Hostitelská buňka, která je transformovaná molekulou nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 nebo vektorem podle kteréhokoliv z nároků 6 nebo 7, nebo buňka, která pochází z takové buňky.
9. Způsob přípravy SST vyznačující se t i m, že hostitelská buňka podle nároku 8 se kultivuje v podmínkách, které dovolují syntézu SST a SST se izoluje z kultivovaných buněk a/nebo kultivačního média.
10. SST, která je kódována molekulou nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, nebo která je připravena způsobem podle nároku 9.
11. Transgenní rostlinná buňka, která je transformovaná molekulou nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 nebo vektorem podle kteréhokoliv z nároků 6 nebo 7, nebo která pochází z takové buňky, přičemž molekula nukleové kyseliny kódující SST z artyčoku je řízena regulačním prvkem, který umožňuje transkripci translatovatelné RNA v rostlinných buňkách.
12. Rostlina, která obsahuje rostlinné buňky podle nároku 11.

·· ·««· * · » 9

9 · • · · ··· ··· • · ·· ··
13. Rostlina podle nároku 12, která je užitkovou rostlinou.
14. Rostlina podle nároku 13, která je rostlinou akumulující sacharózu nebo rostlinou akumulující škrob.
15. Rostlina podle nároku 15, kterou je rostlina bramboru.
16. Rostlinný rozmnožovací materiál z rostliny podle kteréhokoliv z nároků 12 až 15, který obsahuje rostlinné buňky podle nároku 11.
17. Sklizňové produkty z rostlin podle kteréhokoliv z nároků 12 až 15, které obsahují rostlinné buňky podle nároku 11.
18. Způsob přípravy fruktosylových polymerů s krátkým řetězcem vyznačující se tím, že obsahuje

a) kultivaci hostitelské buňky podle nároku 8 nebo rostlinné buňky podle nároku 11 v podmínkách, které dovolují produkci SST a konverzi, pokud je to třeba, externě přidané sacharózy nebo ekvivalentního substrátu na fruktosylové polymery s krátkým řetězcem, a

b) získání tímto způsobem tvořených fruktosylových polymerů z kultivovaných buněk nebo média.
19. Způsob přípravy fruktosylových polymerů s krátkým řetězcem vyznačující se t i m, že obsahuje

a) působení SST podle nároku 10 na sacharózu nebo ekvivalentní substrát v podmínkách dovolujících konverzi na fruktosylové polymery s krátkým řetězcem, a

b) získání takto tvořených fruktosylových polymerů.

·· ·»·« ·»·» ·· *· ·· ·» ·· • · · · · r · « • · · · ···· • · ··· · ··· ··· • · · 9 9 ·· ·9 99 99 vy z
20. Způsob přípravy fruktosylových polymerů s krátkým řetězcem i a č u j í c í se t í m, že obsahuje

a) kultivaci rostliny podle kteréhokoliv z nároků 12 a|fl5, a

b) získání fruktosylových polymerů z těchto rostlin nebo jejich rozmnožovacího materiálu podle nároku 16 nebo ze sklizňových produktů podle nároku 17.

•φ φφφφ φφφφ φ· ·· φφ φφ • φφφφ • φφφφ ··· φ φφφ φφφ • φ φ