CN1249783A - 来自朝鲜蓟的编码具有果糖聚合酶活性的酶的核酸分子 - Google Patents

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Abstract

本发明描述的是编码具有果糖聚合酶活性的核酸分子。这些酶是蔗糖依赖的蔗糖果糖转移酶(SST)。进一步地,描述了包含这样的核酸分子的载体和宿主,尤其是转化的植物细胞和能从它们再生并表达所述SST的植物。另外描述了用所述宿主和/或由其产生的SST生产短链果糖多聚物的方法。

Description

来自朝鲜蓟的编码具有果糖聚合酶活性的酶的核酸分子
本发明涉及编码蔗糖依赖的蔗糖果糖转移酶(fructosyltransferase,SST)的核酸分子。进一步地,本发明涉及包含这样的核酸分子的载体和宿主,以及用所述核酸分子转化的植物细胞和植物。另外描述了制备由于编码来自朝鲜蓟(cynara scolymus)的SST的核酸分子的引入合成短链果糖多聚物(fructosyl polymer)的转基因植物。本发明也涉及制备用于在多种宿主生物内产生短链果糖多聚物的SST的方法以及SST,借助SST,可以用各种方法如发酵或其它生物技术方法制备短链果糖多聚物。
水溶性线型多聚物有多种用途,例如用于作为去污剂、悬浮剂提高水系统的粘度或用于加速沉淀过程并用于络合和结合水。以糖类为基础的多聚物如果糖多糖(fructosyl polysaccharide)因为它们是可生物降解的所以是特别引人注意的原材料。
除了它们作为用于工业生产和工艺的再生性原材料的应用外,果糖多聚物作为食品添加剂如作为人工增甜剂也令人关注。具有低聚合水平的多聚物特别适于此目的。
迄今为止,只有通过表达细菌来源的酶在植物中生产长链果聚糖多糖(fructane polysaccharide)的工艺及制备表达来自洋姜(Helianthus tuberosus)的果糖转移酶的转基因植物的工艺已得到描述。用于生产短链果糖多聚物的酶的生产工艺还未知。在PCT/USA89/02729的说明书中,描述了在转基因植物中尤其是在转基因植物果实中生产糖类多聚物尤其是葡聚糖或果聚糖的可能性。为了制备经这样修饰的植物,建议使用来自微生物,尤其是产果聚糖气杆菌、唾液链球菌和枯草杆菌的果聚糖蔗糖酶或来自肠膜明串珠菌的葡聚糖蔗糖酶。活性酶、果聚糖、葡聚糖及转基因植物的制备都未见描述。PCT/EP93/02110的说明书公开了制备表达来自革兰氏阴性菌解淀粉欧文氏菌的果聚糖蔗糖酶lsc基因的转基因植物的方法。在PCT/NL93/00279的说明书中,描述了带有包含来自枯草杆菌的sacB基因或突变链球菌ftf基因的嵌合基因的植物的转化。对于sacB基因推荐基因5’非翻译区的修饰以提高转基因植物中的表达水平。PCT/NL96/00012的说明书公开了编码合成糖类多聚物的酶的DNA序列以及借助这些序列的转基因植物的制备。公开的序列来自洋姜。根据PCT/NL96/00012,公开的序列不仅适于修饰例如矮牵牛和土豆的果聚糖(fructane)模式也适于修饰洋姜本身的果聚糖模式。因此PCT/NL96/00012的说明书尤其描述了表达来自洋姜的SST的转基因土豆。尽管可以检测到转基因植物中表达的SST的酶活性,但只能得到低水平的底物蔗糖向短链果糖多聚物的转化。这可能与多种因素如酶与其底物的低亲和力或者产生的产物对酶的可能抑制有关。
因此,本发明的问题是提供编码蔗糖依赖的蔗糖果糖转移酶(SST)的核酸分子,借助SST,有可能制备通过基因工程修饰能形成短链果糖多聚物的生物。
此问题通过提供权利要求书中所述的实施方案而得到解决。
因此,本发明涉及编码具有SST生物活性的蛋白的核酸分子,它们选自:
(a)编码包含SEQ ID No.2和SEQ ID No.4中所示氨基酸序列的蛋白的核酸分子;
(b)包含SEQ ID No.1中所示的核苷酸序列或相应核糖核苷酸序列的核酸分子;
(c)包含SEQ ID No.3中所示的核苷酸序列或相应核糖核苷酸序列的核酸分子;
(d)与(a)或(b)中所述的核酸分子杂交并编码其氨基酸与SEQ ID No.2中所示的氨基酸至少90%相同的SST的核酸分子;以及
(e)由于遗传密码简并,其核苷酸序列是从(a)、(b)或(c)中所述的序列衍生而来的核酸分子。
在本发明的上下文中,具有果糖聚合酶活性的酶应理解为能催化果糖单位之间β-2,1糖苷键或β-2,6糖苷键连接的蛋白。因此,要转移的果糖残基可来自蔗糖或果聚糖多聚物(fructan polymer)。
短链果糖多聚物应理解为包含至少两个但不多于100个由β-2,1糖苷键或β-2,6糖苷键连接的果糖残基的分子。果糖多聚物可在其末端携带通过葡萄糖的C-1羟基和果糖的C-2羟基连接的葡萄糖残基。在这种情况下,蔗糖分子包含于果糖多聚物中。
在优选的实施例中,本发明的核酸序列来自朝鲜蓟。
令人惊奇地发现,在本发明的核酸分子表达的过程中,产生了大量的果糖多聚物。
相反,与PCT/NL96/00012的说明书中所述的土豆相比,在使用本发明的核酸分子时得到大量的寡聚果糖(oligofructan),甚至比底物蔗糖的细胞含量更大。
本发明的核酸分子既可以是DNA,也可以是RNA分子。适当的DNA分子是例如基因组或cDNA分子。本发明的核酸分子可从天然来源,优选地朝鲜蓟分离到,或可以根据已知的方法合成。
通过常规的分子生物学方法(见如Sambrook等,1989,分子克隆,实验室手册,第二版,冷泉港实验室出版社,冷泉港,NY),可以将不同的突变引入本发明的核酸分子。结果,具有可能的修饰的生物学特性的蛋白质得到合成。一种可能性是缺失突变体的制备,其中核酸分子通过从编码DNA序列的5’或3’末端连续删除得到制备并且因此导致缩短蛋白的合成。通过核酸序列5’末端这样的删除,例如有可能鉴定负责酶在质体内转运的氨基酸序列(转运肽,transitionpeptide)。这使得酶的特异产生由于相应序列的去除而不再定位于液泡中而是细胞溶胶中或者由于添加了其它信号序列而定位于其它区室中。
另一种可能性是在氨基酸修饰影响例如酶活性或酶调节的位点引入单一点突变。通过这种方法可以制备突变体,例如具有经修饰的Km值或不再受细胞内正常存在的与别构调节或共价修饰有关的调节机制调节的突变体。
而且,可制备表现修饰的底物或产物特异性的突变体。同样可制备表现修饰的活性-温度模式的突变体。
对于通过遗传工程手段在原核细胞内的操作,本发明的核酸分子或其部分可以通过DNA序列重组导入质粒从而允许序列的诱变或修饰。通过常规的方法(参看,Sambrook等,1989,分子克隆:实验室手册,第二版,冷泉港实验室出版社,冷泉港,NY,USA),碱基可以交换并且可以加入天然或合成序列。为了使DNA片段互相连接,可以将衍接头或接头添加到片段上。而且,可进行提供适当切割位点或去除多余DNA或切割位点的操作。如果插入、删除或替代可能的话,可进行体外诱变、引物修补、限制性酶切或连接。对于分析方法,通常所用的是序列分析、限制性分析和其它生物化学或分子生物学方法。
术语“杂交”在本发明上下文中是指在常规杂交条件下,优选地如在Sambrook等,1989,分子克隆,实验室手册,第二版,冷泉港实验室出版社,冷泉港,NY所述的严格条件下的杂交。
与本发明的分子杂交的核酸分子可从例如从朝鲜蓟制备的基因组或cDNA文库得到分离。
为了鉴定和分离这样的核酸分子,可以使用本发明的核酸分子或这些分子的部分或这些分子的反向互补物,例如通过按照常规方法的杂交(见,如Sambrook等,1989,分子克隆,实验室手册,第二版,冷泉港实验室出版社,冷泉港,NY)。
作为杂交探针,可采用例如精确或基本上具有Seq ID No.1中所示核苷酸序列或这些序列的部分的探针核酸分子。用作杂交探针的片段可以是通过常规合成方法制备的合成片段并且其序列基本上与本发明的核酸分子序列一致。
与本发明核酸分子杂交的分子也包含上述的编码本发明蛋白的核酸分子的片段、衍生物和等位变体。“片段”应理解为足够长以编码所述蛋白之一的核酸分子的部分。术语“衍生物”在本文中是指这些分子的序列与上述核酸分子的序列在一个或多个位点不同但与这些序列有高水平同源性。此处的同源性是指至少40%的序列相同性,尤其是至少60%,优选地80%以上,特别优选地90%以上的相同性。由这些核酸分子编码的蛋白与SEQ ID No.2中所示的氨基酸序列有至少80%,优选地85%,特别优选地90%、95%、97%和98%以上的相同性。上述的核酸分子的偏差可通过删除、替换、插入或重组制备。
与上述分子同源并代表这些分子衍生物的核酸分子通常是代表具有相同生物学功能的修饰的这些分子的变异。它们可以是天然存在的变异,例如来自其它生物的序列或可以天然发生或通过特异诱变导入的突变。而且,变异可以是合成产生的序列。等位变体可以是天然存在的变体或合成产生的变体或通过重组DNA方法制备的变体。
由本发明核酸分子的各种变体编码的蛋白表现某些共同特征如酶活性、分子量、免疫反应性或构象或物理特征如电泳迁移率、层析行为、沉降系数、溶解性、光谱特征、稳定性、最佳pH值、最佳温度。
在另一优选实施方案中,本发明涉及与核酸分子的转录物特异杂交的核酸分子。这些核酸分子优选地是具有至少10个,尤其是至少15个,特别优选地至少50个核苷酸长度的寡核苷酸。本发明的核酸分子和寡核苷酸可用作例如PCR反应的引物。它们也可以是反义构建体或编码适当核酶的DNA分子的组成成分。
本发明进一步涉及包含本发明核酸分子的载体。优选地,它们是质粒、粘粒、病毒、噬菌体和其它通常用于遗传工程领域的载体。
优选地,本发明的核酸序列与本发明载体的保证原核和/或真核细胞中可翻译RNA转录和合成的调控元件可操作连接。
本发明的表达载体使得可以产生在各种宿主生物中合成短链果糖多聚物的酶。
编码的酶也可用于宿主生物外生产短链果糖多聚物。由此,可使用发酵和其它用于生产短链果糖多聚物的生物技术方法。例如,可以设想,通过固定化酶生产果糖多聚物。
根据本发明,patatin B33启动子的调控序列是优选的。其它优选的启动子是35S CaMV启动子和来自酿酒酵母的乙醇脱氢酶基因启动于。
本发明的载体可具有其它影响宿主生物中载体稳定的功能单位,如细菌复制起始子或用于酿酒酵母稳定目的的2-μDNA。而且,可以包含土壤杆菌T-DNA的“左边界”和“右边界”序列,由此使植物基因组中的稳定整合成为可能。
而且,本发明的载体可包含功能性终止子如来自土壤杆菌的章鱼碱合酶基因终止子。
在另一实施方案中,本发明的核酸分子通过编码功能性信号序列的核酸分子与本发明的载体连接,以将此酶转运到各种细胞区室中。这种修饰可以是例如任何N-末端信号序列的添加以分泌到高等植物的细胞膜间隙中,也可以是其它导致信号序列与本发明主题编码的果糖转移酶融合的修饰。
在特别优选的实施方案中,本发明涉及质粒pB33-cySST,其构建在实施例(图1)中描述。
本发明核酸分子在原核细胞如在大肠杆菌中的表达令人感兴趣,因为这种方法,有可能对这些分子编码的酶的活性进行较接近的定性。
在进一步的实施方案中,本发明涉及瞬时或稳定包含本发明的核酸分子或载体的宿主细胞。宿主细胞应理解为能体外摄入重组DNA并且如果是这样合成本发明的核酸分子编码的蛋白的生物。
优选地,这些细胞是原核或真核细胞。具体地,本发明涉及包含本发明载体系统或其衍生物或其部分的植物细胞。优选地,它们因为已摄入本发明的载体系统或其衍生物或其部分而能合成用于生产短链果糖多聚物的酶。本发明的细胞优选地特征在于导入的本发明的核酸分子相对于转化的细胞是异源的,即它不是这些细胞中天然存在的或者它位于与相应天然存在的序列不同的基因组位置中。
本发明进一步实施方案涉及由本发明核酸分子编码的蛋白以及它们的制备方法,由此,本发明的宿主细胞在使蛋白合成的条件下培养,随后蛋白从培养的细胞中和/或培养基分离。而且,本发明涉及由本发明的植物产生的SST。
通过提供本发明的核酸分子,目前有可能通过遗传工程在任何生物中生产短链果糖多聚物,然而迄今为止,还未能通过诸如育种的常规方法改造植物使其能够合成果糖多聚物。通过提高本发明蛋白的活性,例如通过过量表达适当的核酸分子或提供不再受细胞特异的调控机制和/或改变了活性温度依赖性的突变体,有可能通过遗传工程提高经改造的植物中的产量。
所以,本发明核酸分子在植物细胞中的表达以提高相应的SST的活性或将此酶导入正常不表达此酶的细胞成为可能。而且,可根据本领域技术人员已知的方法修饰本发明的核酸分子以得到本发明的不再受细胞特异的调控机制控制或改变了活性温度依赖性的或底物或产物特异性的SST。
当核酸分子在植物中表达时,合成的蛋白可定位于植物细胞的任何区室内。为了得到在特定区室的定位,保证液泡定位的序列必须被删除并且如果必须的话,剩余的编码序列必须与DNA序列连接以保证在特定区室的定位。这样的序列已知(见,如Braun等,欧洲分子生物学组织杂志,11(1992),3219-3227;Wolter等,美国国家科学院院报85(1988),846-850;Sonnewald等,植物杂志1(1991),95-106)。因此,本发明也涉及用本发明的一个或多个核苷酸分子转化的转基因植物细胞以及来自这样的转化细胞的转基因植物。这样的细胞包含一个或多个本发明的核酸分子,它/它们优选地与保证在植物细胞中转录的调控DNA元件连接,尤其是与启动子连接。借助于这些植物包含至少一个与本发明一致的这些细胞中不是天然存在的核酸分子的事实或这样的分子被整合到细胞基因组原来不存在的位置,即,具有另一个基因组起源的事实,这样的植物可以与天然发生的植物细胞区分开。
通过本领域技术人员已知的方法,转基因植物细胞可再生为整株植物。本发明的主题涉及通过本发明的转基因植物细胞的再生得到的植物。而且,本发明的主题涉及包含上述的转基因植物细胞的植物。此转基因植物基本上是任何植物物种的植物,即,单子叶植物和双子叶植物。优选地,它们是农作物,尤其是合成和/或贮存淀粉的植物如,小麦、大麦、水稻、玉米、甜菜、甘蔗或土豆。尤其优选的贮存蔗糖的植物。
本发明也涉及本发明植物的繁殖材料和收获产品,例如果实、种子、块茎、根状茎、幼苗、插条等。
由于本发明的至少一个核酸分子的表达或额外表达,本发明的转基因植物细胞和植物合成短链果糖多聚物。
所以,本发明的主题也涉及可从本发明的转基因植物细胞和植物以及繁殖材料和收获产品中得到的短链果糖多聚物。
根据本领域技术人员已知的方法,转基因植物细胞可被再生为整株植物。所以,本发明的主题也涉及包含本发明的转基因植物细胞的植物。这些植物优选地是农作物,尤其是合成和/或贮存淀粉的植物。尤其优选的是土豆。本发明也涉及本发明植物的繁殖材料,尤其是块茎。
为了在植物细胞中以正义或反义方向表达本发明的核酸分子,它们与保证在植物细胞中转录的调控DNA元件连接。它们尤其是启动子。在植物细胞中有活性的任何启动子基本上适于表达。
启动子的选择使表达组成型地进行或只在某个组织中、在植物发育的某个阶段或由外界刺激决定的某个时间点进行。启动子可与植物同源也可异源。适当的启动子是诸如花椰菜花叶病毒35S RNA启动子和玉米遍在蛋白启动子的适于组成型表达的启动子,特别优选的是适于在土豆块茎特异表达的patatin基因启动子B33(Rocha-Sosa等,欧洲分子生物学组织杂志8(1989),23-29)或只保证光合作用活跃组织中表达的启动子,例如ST-LS1启动子(Stockhaus等,美国国家科学院院报84(1987),7943-7947;Stockhaus等,欧洲分子生物学组织杂志8(1989),2445-2451)或来自小麦的胚乳特异表达的HMG启动子、USP启动子、菜豆蛋白启动子或来自玉米的玉米醇溶蛋白基因启动子。
而且,应该具有使转录正确终止的终止序列以及向转录物添加被认为具有稳定转录物功能的多聚腺苷酸A尾。这样的元件在文献中得到描述(参看,Gielen等欧洲分子生物学组织杂志8(1989),23-29)并且可任意交换。
为了为将外源基因转入高等植物做准备,可得到许多包含适合大肠杆菌的复制信号和选择转化细胞的标记基因的克隆载体。这样的载体的例子是pBR322、pUC系列、M13mp系列、pACYC184等。希望的序列可在适当的切割位点导入载体中。得到的质粒适合于大肠杆菌细胞的转化。转化的大肠杆菌在适当的培养基中培养,然后收获和裂解。重新制备质粒。通常,限制性分析、凝胶电泳和其它生化或分子生物学方法用作重新制备质粒鉴定的分析方法。经每次操作后,质粒可被切割并且产生的DNA片段与其它DNA序列连接。每一个质粒DNA序列可被克隆至同一个或其它质粒。
可得到许多将DNA导入植物宿主细胞的方法。这些方法包括用根瘤土壤杆菌或发根土壤杆菌转化具有T-DNA的植物细胞、原生质体融合、注射、DNA电穿孔、通过biolistic方法导入DNA以及进一步的可能性。
就植物细胞中的注射和DNA电穿孔而言,对所用的质粒没有特殊要求。可使用简单的质粒如pUC衍生物。如果从这样的转化细胞再生整株植物,需要可选择的标记。
依据将目的基因导入植物细胞所用的方法,可能需要进一步的DNA序列。例如,如果Ti或Ri质粒被用于植物细胞的转化,至少右边界序列,然而通常是Ti或Ri质粒T-DNA的右和左边界序列必须以侧翼序列与将要导入的基因相连接。
如果土壤杆菌用于转化,要导入的DNA必须克隆到特定的质粒中,或者到过渡载体中或者到双元载体中。通过与T-DNA中同源序列的同源重组,过渡载体可被整合到土壤杆菌Ti或Ri质粒中。Ti或Ri质粒进一步包含T-DNA转移需要的vir区域。过渡载体不能在土壤杆菌复制。借助于辅助质粒,过渡载体被转移至根瘤土壤杆菌中(接合作用)。双元载体可在大肠杆菌和土壤杆菌中复制。它们包含选择标记基因和位于右和左T-DNA边界序列框架内的接头或多接头。它们可被直接转化到土壤杆菌中(Holsters等,Mol.Gen.Genet.163(1978),181-187)。作为宿主细胞的土壤杆菌应包含携带有vir区域的质粒。vir区域是将T-DNA转移到植物细胞中必须的。也可具有额外的T-DNA。这样转化的土壤杆菌用于转化植物细胞。将T-DNA用于转化植物细胞已得到广泛地研究并描述于EP-A-120 516中;Hoekema:双元植物载体系统,Offsetdrukkerij kanters B.V.,Alblasserdam(1985),第V章,Fraley等,Crit.Rev.Plant.Sci.4,1-46和An等,欧洲分子生物学组织杂志4(1985),277-287。为了将DNA转移到植物细胞中,植物外植体可与根瘤土壤杆菌或发根土壤杆菌共培养。整株植物可在适当的、含有用于植物细胞选择的抗生素或biozides的培养基中从受侵染的植物材料(如叶片、茎节段、根以及悬浮培养的原生质体或植物细胞)再生。以这种方式得到的植物可通过被导入的DNA的存在检测。其它的用biolistic方法或通过原生质体转化的导入外源DNA的可能性是已知的(参看,Willmitzer,L.1993转基因植物在:生物技术,A Multi-Volume Comprehensive Treatise(H.J.Rehm,G.Reed,A.Puhler,P.Stadler编辑),第2卷,627-659,VCHWeinheim-New York-Basel-Cambridge)。
可选择的转化单子叶植物的系统是通过下列方法进行的转化:biolistic法、电或化学诱导的DNA导入原生质体、部分透化细胞的电穿孔、DNA显微注射到花中、DNA显微注射到小孢子和原胚中、DNA导入发芽花粉中以及通过膨胀将DNA导入胚中(综述:Potrykus,植物生理学(1990),269-273)。
在根瘤土壤杆菌的帮助下,通过Ti质粒载体系统的双子叶植物的转化已经很好地被建立,更为近期的研究工作表明单子叶植物也可借助于以土壤杆菌为基础的方法进行转化(Chan等,植物分子生物学22(1993),491-506;Hiei等,植物杂志6(1994),271-282;Bytebier等,美国国家科学院院报84(1987),5345-5349;Raineri等,生物/技术8(1990),33-38;Gould等,植物生理学95(1991),426-434;Mooney等,植物细胞、组织和器官培养25(1991),209-218;Li等,植物分子生物学20(1992),149-178)。
上述的三种转化系统可被建立用于多种谷物:在再生组织和细胞中进行的组织的电穿孔、原生质体的转化以及通过微粒轰击的DNA转移(见综述:Jahne等,Euphytica 85(1995),35-44)。
文献中多次描述了小麦的转化(见综述:Maheshwari等,植物科学评论14(2)(1995),149-178)。
本发明也涉及包含至少一个,优选地多个细胞的植物,此细胞包含本发明载体系统或其衍生物或其部分的并且,由于本发明的载体系统、载体系统衍生物或其部分的导入,能够合成生产短链果糖多聚物酶。本发明也提供了多个物种、属、科、目和纲的、由于载体系统或其衍生物或其部分的导入能够合成生产短链果糖多聚物酶的植物。由于已知的植物不能够产生短链果糖多聚物,很容易检测方法是否被成功地操作,例如通过含有果糖的糖的层析谱分析。它们与含有短链果糖多聚物的植物相比较有优势因为有确定的分子大小,即短链果糖多聚物的大小。而且,在各种细胞区室和各种器官中的定位以及表达比率的提高及随之而来的产量的提高都是有可能的。
在另一实施方案中,本发明涉及生产短链果糖多聚物的方法,包括:
(a)在允许向短链果糖多聚物转化的条件下,使蔗糖或相应底物与本发明的SST接触;并且
(b)得到通过这种方法产生的果糖多聚物。
产生的果糖多聚物的性质依赖于果糖转移酶的酶特异性。当使用本发明的SST时,优选地产生1-蔗果三糖,而且也产生霉菌赤藓醛糖和果糖霉菌赤藓醛糖。
而且,本发明涉及从本发明的植物细胞或植物或从本发明的植物或植物细胞的繁殖材料或收获产物或根据本发明的上述方法得到果糖多聚物。这些果糖多聚物可以优选地用于诸如烘烤食品或面食的食品的生产。优选地,这些果糖多聚物可用于作为去污剂、悬浮剂提高水系统的粘度或用于加速沉淀过程并用于络合和结合水。
附图表示:图1表示质粒pB33-cySST的构建。
载体:pBinB33(pBinl9的衍生物;Bevan,1984,核酸研究12:
      8711)
启动子:B33启动子(Rocha-Sosa等,1989,欧洲分子生物学
        组织杂志8:23-29)
供体(donor):马铃薯
编码区:来自朝鲜蓟的SST基因
方向:有义
终止子:来自根瘤土壤杆菌质粒pTiACH5的章鱼碱合酶基因的
        多聚腺苷酸化信号(Gielen等,1984。欧洲分子生物
        学组织杂志3:835-846)
供体(donator):根瘤土壤杆菌
抗性:卡那霉素图2表示用pB33-cySST载体系统制备的转基因植物块茎中可溶性糖的分析。由于遗传修饰被标记,得到短链果糖多聚物(尤其是1-蔗果三糖)。图3表示与野生型植物相比,分别用pB33-cySST和p35S-cySST载体系统制备的转基因植物块茎中可溶性糖的分析。
实施例1:来自朝鲜蓟的编码蔗糖依赖的蔗糖果糖转移酶的cDNA的鉴定、分离和定性
总RNA从朝鲜蓟的花盘得到分离(Sambrook等,见上文)。用mRNA分离体系PolyATtract(Promega公司,Madison,WI,USA)分离Poly(A)+mRNA。根据厂商说明,用Stratagene的ZAp-cDNA合成试剂盒从5μg此RNA制备互补DNA(cDNA)。得到了2×108个独立的重组噬菌斑。扩增的cDNA文库用32P标记的并对应于6-SFT cDNA(Sprenger等,美国国家科学院院报92(1995),11652)3’末端的长392bp的DNA片段通过常规方法筛选。以来自光-诱导(72小时)的大麦初生叶为基质,通过RT-PCR(RT-PCR试剂盒,Stratagene,Heidelberg,德国)从完全RNA得到此片段。阳性克隆进一步得到鉴定。实施例2:质粒pCy21中cDNA插入的序列分析
质粒DNA从克隆pCy21得到分离。通过双脱氧法(Sanger等,美国国家科学院院报74(1977),5463-5467)用常规的方法测定cDNA插入的序列。
pCy21克隆的插入物是2055bp DNA。其核苷酸序列示于Seq IDNo.1。相应的氨基酸序列示于Seq ID No.2。
序列分析及与已发表序列的比较表明示于Seq ID No.1的序列是新的并包含与来自其它生物的SST有同源性的编码序列。实施例3:质粒pB33-cySST的制备及此质粒向土豆基因组中的导入
质粒pB33-cySST包含双元载体pBinl9中的三个片段A,B和C(Bevan,1984,核酸研究12:8711,根据Becker,1990。核酸研究18:203进行了修饰)(参看图1)。片段A包含土豆的patatin基因b33的B33启动子。它包含patatin基因B33的Dra I片段(位置-1512-+14)(Rocha-Sosa等,1989,欧洲分子生物学组织杂志8:23-29),它插在pBinl9-Hyg的多接头的EcoR I和Sac I之间。片段B包含示于Seq ID No.1的序列的编码区域。片段B是从载体pBluescript SK中以具有平末端的Not I片段得到的,它通过EcoR I/Not I接头序列插入到EcoR I切割位点。片段C包含Ti质粒pTiACH5的T-DNA基因3的多聚腺苷酸化信号核苷酸11749-11939(Gielen等(1984);欧洲分子生物学组织杂志3:835-846),它是从从质粒pAGV40(Herrera-Estrella等(1983)自然303,209-213)中以PvuII-HindIII片段分离到的,在向PvuII切割位点添加Sph I接头后被克隆到pBin19-Hyg的多接头的Sph I和Hind III之间。质粒pB33-cySST的大小约为14kb。此质粒被导入土壤杆菌中(Hofgen和Willmitzer,核酸研究16(1988),9877)。
根据上述常规方法,通过由土壤杆菌诱导的基因转移,将质粒pB33-cySST导入土豆。完整的植物从转化的细胞再生。从再生植物得到酶提取物并检测果糖多聚物的存在。分析根据Rober(Planta 199,528-536)中所述的进行。对一系列用此载体转化的转化植物的块茎的分析清楚地表明短链果糖多聚物,尤其是1-蔗果三糖的存在,这可归因于本发明SST基因的表达(参见图2)。实施例4:野生型和含有SST的转基因植物中可溶性糖的分析
根据实施例3所述制备含有载体pB33-cySST和p35S-cySST(含有在35S启动子控制下的Seq ID No.1的编码区域)。从转基因植物和野生型植物中得到提取液并检测其中果糖多聚物的存在;见实施例3。示于图3的HPAEC分析表明寡聚果糖的产生。这些结果概括于下面的表1。
表1野生型和转基因植物中的可溶性糖(蔗糖和寡聚果糖)品系              蔗糖   1-蔗果三糖  霉菌赤藓醛糖   F-霉菌赤藓醛糖WT1(Desiree)      2,09        -            -              -WT2(Desiree)      1,67        -            -              -B33-cySST6        2,26        3,58         1,60           -B33-cySST54       5,13        3,06         2,90           0,2335S-cySST18       4,08        4,05         1,51           0,1235S-cySST22       4,80        4,14         2,19           <0,1数值为g碳水化合物/kg鲜重
从上文的图3和表1中显而易见,果糖多聚物,尤其是1-蔗果三糖的含量超过了蔗糖的含量。因此,根据本发明进行的实验表明本发明的核酸分子可用于在转基因植物中生产果糖多聚物。
                             序列表(1)基本信息
(i)申请人:
    (A)名称:Max-Planck-Gesellschaft Zur Foerderung derWissenschaften e.V.
    (B)街道:none
    (C)城市:Berlin
    (E)国家:DE
(ii)发明名称:来自朝鲜蓟编码具有果糖聚合酶活性的酶的核酸分子
(iii)序列数:4
(iv)计算机可读形式:
    (A)介质类型:软盘
    (B)计算机:IBM PC兼容机
    (C)操作系统:PC-DOS/MS-DOS
    (D)软件:Patentln Release#1.0,版本#1.30(EPA)(2)关于SEQ ID NO:1的信息:
(i)序列特征
    (A)长度:2226个碱基对
    (B)类型:核酸
    (C)链型:单链
    (D)拓扑结构:线型
(ii)分子类型:cDNA
(vi)中间来源:
    (A)生物:朝鲜蓟
(ix)特征:
    (A)名称/关键:CDS
    (B)位置:8..1918
(xi)序列描述:SEQ ID NO:1:CCACCAC ATG GCT TCC TCT ACC ACC ACC CCA CTC CTC CCT CAC CAC CAC           49
    Met Ala Ser Ser Thr Thr Thr Pro Leu Leu Pro His His His
      1               5                  10CTT CAG AAC CCG CAA CAA CTC GCC GGA TCT CCG GCA GCT CAT CGT CTA           97Leu Gln Asn Pro Gln Gln Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ala His Arg Leu15                  20                  25                  30TCC CGA CCC ACA CTC CTT TCT GGG ATC CTT GTT TCG GTC CTA GTC ATC          145Ser Arg Pro Thr Leu Leu Ser Gly Ile Leu Val Ser Val Leu Val Ile
             35                  40                  45TGT GCT CTC GTT GCT GTA ATC CAC AAC CAA TCA CAG CAA CCC TAC CAT          193Cys Ala Leu Val Ala Val Ile His Asn Gln Ser Gln Gln Pro Tyr His
         50                  55                  60GAC GGC GGA GCT AAA CCC TCC TCC TCC GCC GCT ACC ACC ACC TTC CCA          241Asp Gly Gly Ala Lys Pro Ser Ser Ser Ala Ala Thr Thr Thr Phe Pro
     65                  70                  75ACA GCG TCG CCA GAA GCT GGT TTG AAA CGG TTT CCC ATT GAG TTG AAA          289Thr Ala Ser Pro Glu Ala Gly Leu Lys Arg Phe Pro Ile Glu Leu Lys
 80                  85                  90ACG AAT GCT GAG GTT GAG TGG CAA CGC TCG GCT TAC CAT TTT CAG CCC          337Thr Asn Ala Glu Val Glu Trp Gln Arg Ser Ala Tyr His Phe Gln Pro95                 100                 105                 110GAT AAG AAC TAC ATT AGC GAT CCT GAT GGC CCA ATG TAT CAC ATG GGG          385Asp Lys Asn Tyr Ile Ser Asp Pro Asp Gly Pro Met Tyr His Met Gly
            115                 120                 125TGG TAT CAT CTC TTC TAT CAG TAC AAT CCA GAG TCT GCC ATC TGG GGG          433Trp Tyr His Leu Phe Tyr Gln Tyr Asn Pro Glu Ser Ala Ile Trp Gly
        130                 135                 140AAC ATC ACA TGG GGC CAC TCC GTA TCC AAA GAC ATG ATC AAC TGG TTC          481Asn Ile Thr Trp Gly His Ser Val Ser Lys Asp Met Ile Asn Trp Phe
    145                 150                 155CAT CTC CCC TTC GCC ATG GTC CCT GAC CAA TGG TAC GAT ATC GAA GGT          529His Leu Pro Phe Ala Met Val Pro Asp Gln Trp Tyr Asp Ile Glu Gly
160                 165                 170GTC ATG ACC GGC TCC GCC ACC GTC CTC CCT GAC GGT CAG ATC ATC ATG          577Val Met Thr Gly Ser Ala Thr Val Leu Pro Asp Gly Gln Ile Ile Met175                 180                 185                 190CTC TAC ACC GGC AAC GCG TAC GAT CTC TCG CAA CTG CAA TGC TTA GCA          625Leu Tyr Thr Gly Asn Ala Tyr Asp Leu Ser Gln Leu Gln Cys Leu Ala
            195                 200                 205TAT GCC GTC AAC TCG TCT GAT CCC CTC CTC CTC GAT TGG AAA AAG TAC          673Tyr Ala Val Asn Ser Ser Asp Pro Leu Leu Leu Asp Trp Lys Lys Tyr
        210                 215                 220GAG GGA AAT CCC ATC TTG TTC CCA CCT CCT GGG GTG GGA TAC AAG GAT         721Glu Gly Asn Pro Ile Leu Phe Pro Pro Pro Gly Val Gly Tyr Lys Asp
    225                 230                 235TTT CGG GAC CCA TCT ACA CTG TGG TTG GGT CCC GAT GGT GAA TAC AGA         769Phe Arg Asp Pro Ser Thr Leu Trp Leu Gly Pro Asp Gly Glu Tyr Arg
240                 245                 250ATG GTA ATG GGG TCC AAG CAT AAC GAG ACC ATC GGT TGT GCC TTG ATT         817Met Val Met Gly Ser Lys His Asn Glu Thr Ile Gly Cys Ala Leu Ile255                 260                 265                 270TAC CAT ACC ACT AAT TTT ACG CAT TTC GAG CTC AAG GAA GAG GTG CTT         865Tyr His Thr Thr Asn Phe Thr His Phe Glu Leu Lys Glu Glu Val Leu
            275                 280                 285CAC GCC GTT CCC CAC ACG GGT ATG TGG GAA TGT GTG GAT CTT TAT CCG         913His Ala Val Pro His Thr Gly Met Trp Glu Cys Val Asp Leu Tyr Pro
        290                 295                 300GTA TCC ACC ACG CAC ACA AAC GGG TTG GAC ATG GTG GAT AAC GGG CCG         961Val Ser Thr Thr His Thr Asn Gly Leu Asp Met Val Asp Asn Gly Pro
    305                 310                 315AAT GTG AAG CAT GTG TTG AAA CAA AGT GGG GAT GAA GAT CGA CAT GAT        1009Asn Val Lys His Val Leu Lys Gln Ser Gly Asp Glu Asp Arg His Asp
320                 325                 330TGG TAT GCG CTC GGG ACT TAT GAC GTC GTG AAT GAT AAG TGG TAT CCA        1057Trp Tyr Ala Leu Gly Thr Tyr Asp Val Val Asn Asp Lys Trp Tyr Pro335                 340                 345                 350GAT GAC CCT GAA AAC GAT GTG GGT ATC GGG TTA AGA TAC GAT TTC GGA        1105Asp Asp Pro Glu Asn Asp Val Gly Ile Gly Leu Arg Tyr Asp Phe Gly
            355                 360                 365AAG TTT TAT GCG TCA AAG ACG TTC TAC GAC CAA CAT AAG AAG AGA CGG        1153Lys Phe Tyr Ala Ser Lys Thr Phe Tyr Asp Gln His Lys Lys Arg Arg
        370                 375                 380GTC CTT TGG GGT TAC GTT GGA GAA ACC GAT CCC CCT AAA TAC GAC GTT        1201Val Leu Trp Gly Tyr Val Gly Glu Thr Asp Pro Pro Lys Tyr Asp Val
    385                 390                 395TAC AAG GGA TGG GCT AAC ATT TTG AAC ATT CCA AGG ACC ATA GTT TTG        1249Tyr Lys Gly Trp Ala Asn Ile Leu Asn Ile Pro Arg Thr Ile Val Leu
400                 405                 410GAC ACG AAA ACG AAT ACC AAT TTG ATT CAA TGG CCA ATT GCG GAA GTC        1297Asp Thr Lys Thr Asn Thr Asn Leu Ile Gln Trp Pro Ile Ala Glu Val415                 420                 425                 430GAA AAC TTG AGA TCG AAT AAA TAC AAT GAA TTC AAA GAC GTG GAG CTG        1345Glu Asn Leu Arg Ser Asn Lys Tyr Asn Glu Phe Lys Asp Val Glu Leu
            435                 440                 445AAA CCG GGA TCA CTG ATT CCG CTC GAG ATA GGC ACA GCA ACA CAG TTG        1393Lys Pro Gly Ser Leu Ile Pro Leu Glu Ile Gly Thr Ala Thr Gln Leu
        450                 455                 460GAT ATA ACT GCG ACA TTC GAA GTT GAT CAA ACG ATG TTG GAA TCG ACG        1441Asp Ile Thr Ala Thr Phe Glu Val Asp Gln Thr Met Leu Glu Ser Thr
    465                 470                 475CTT GAA GCC GAT GTT TTG TTC AAT TGT ACG ACC AGT GAA GGT TCA GCC        1489Leu Glu Ala Asp Val Leu Phe Asn Cys Thr Thr Ser Glu Gly Ser Ala
480                 485                 490GGG AGA GGG GTG TTG GGG CCA TTT GGA CTG GTG GTT CTA GCT GAT GCC        1537Gly Arg Gly Val Leu Gly Pro Phe Gly Leu Val Val Leu Ala Asp Ala495                 500                 505                 510GAA CGA TCT GAG CAA CTT CCT GTG TAT TTC TAT ATA GCA AAA GAC ACC        1585Glu Arg Ser Glu Gln Leu Pro Val Tyr Phe Tyr Ile Ala Lys Asp Thr
            515                 520                 525GAT GGA TCC TCA AAA ACT TAC TTC TGT GCC GAT GAA TCA AGA TCA TCG        1633Asp Gly Ser Ser Lys Thr Tyr Phe Cys Ala Asp Glu Ser Arg Ser Ser
        530                 535                 540AAC GAT GTA GAC ATA GGG AAA TGG GTG TAC GGA AGC AGT GTT CCT GTT        1681Asn Asp Val Asp Ile Gly Lys Trp Val Tyr Gly Ser Ser Val Pro Val
    545                 550                 555CTA GAA GGC GAA AAA TTC AAC ATG AGG TTG CTG GTG GAT CAT TCA ATT        1729Leu Glu Gly Glu Lys Phe Asn Met Arg Leu Leu Val Asp His Ser Ile
560                 565                  570GTC GAA GGC TTC GCA CAA GGA GGC AGA ACG GTG GTG ACA TCA AGA GTG        1777Val Glu Gly Phe Ala Gln Gly Gly Arg Thr Val Val Thr Ser Arg Val575                 580                 585                 590TAT CCG GCG AAG GCG ATC TAC GGC GCT GCA AAG TTA TTT TTG TTC AAC        1825Tyr Pro Ala Lys Ala Ile Tyr Gly Ala Ala Lys Leu Phe Leu Phe Asn
            595                 600                 605AAC GCC ACC GGA ATC AGC GTG AAG GCA TCT CTC AAG ATC TGG AAA ATG        1873Asn Ala Thr G1y Ile Ser Val Lys Ala Ser Leu Lys Ile Trp Lys Met
        610                 615                 620AAG GAA GCA CAA CTG GAT CCA TTC CCT CTT TCT GGA TGG AGT TCT            1918Lys Glu Ala Gln Leu Asp Pro Phe Pro Leu Ser Gly Trp Ser Ser
    625                 630                 635TGATGATGAT GATGATTAAG AACTCATTTC ATGAAGATGA TGATTAAGAA CTCATTTCAT      1978GATGATGATG ATGATTCCAG TTTATATGCG TACCCTGTTC CCTTTACCTG TATGTGGTGG      2038TGGTGGTGAA ATATGGTTAG CATGATTCCG GGTTGGCGAG GGCAATATGG TAATTTACTA      2098TCGCTGTAGT AGTACTCCAC TTGTGAGATT ATATTTCATA AATTCAATTA TTATTCCTGT      2158TTACAACCTT TTTCATTGTA TCATACCACC CATTGAATCC CATCATGTTC AATTAGTGTT  2218GCAAAAAA                                                           2226(2)关于SEQ ID NO:2的信息:
(i)序列特征
    (A)长度:637个氨基酸
    (B)类型:氨基酸
    (D)拓扑结构:线型
(ii)分子类型:蛋白质
(xi)序列描述:SEQ ID NO:2:
Met Ala Ser Ser Thr Thr Thr Pro Leu Leu Pro His His His Leu Gln
  1               5                  10                  15
Asn Pro Gln Gln Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ala His Arg Leu Ser Arg
             20                  25                  30
Pro Thr Leu Leu Ser Gly Ile Leu Val Ser Val Leu Val Ile Cys Ala
         35                  40                  45
Leu Val Ala Val Ile His Asn Gln Ser Gln Gln Pro Tyr His Asp Gly
     50                  55                  60
Gly Ala Lys Pro Ser Ser Ser Ala Ala Thr Thr Thr Phe Pro Thr Ala
 65                  70                  75                  80
Ser Pro Glu Ala Gly Leu Lys Arg Phe Pro Ile Glu Leu Lys Thr Asn
                 85                  90                  95
Ala Glu Val Glu Trp Gln Arg Ser Ala Tyr His Phe Gln Pro Asp Lys
            100                 105                 110
Asn Tyr Ile Ser Asp Pro Asp Gly Pro Met Tyr His Met Gly Trp Tyr
        115                 120                 125
His Leu Phe Tyr Gln Tyr Asn Pro Glu Ser Ala Ile Trp Gly Asn Ile
    130                 135                 140
Thr Trp Gly His Ser Val Ser Lys Asp Met Ile Asn Trp Phe His Leu
145                 150                 155                 160
Pro Phe Ala Met Val Pro Asp Gln Trp Tyr Asp Ile Glu Gly Val Met
                165                 170                 175
Thr Gly Ser Ala Thr Val Leu Pro Asp Gly Gln Ile Ile Met Leu Tyr
            180                 185                 190
Thr Gly Asn Ala Tyr Asp Leu Ser Gln Leu Gln Cys Leu Ala Tyr Ala
        195                 200                 205Val Asn Ser Ser Asp Pro Leu Leu Leu Asp Trp Lys Lys Tyr Glu Gly
210                 215                 220Asn Pro Ile Leu Phe Pro Pro Pro Gly Val Gly Tyr Lys Asp Phe Arg225                 230                 235                 240Asp Pro Ser Thr Leu Trp Leu Gly Pro Asp Gly Glu Tyr Arg Met Val
            245                 250                 255Met Gly Ser Lys His Asn Glu Thr Ile Gly Cys Ala Leu Ile Tyr His
        260                 265                 270Thr Thr Asn Phe Thr His Phe Glu Leu Lys Glu Glu Val Leu His Ala
    275                 280                 285Val Pro His Thr Gly Met Trp Glu Cys Val Asp Leu Tyr Pro Val Ser
290                 295                 300Thr Thr His Thr Asn Gly Leu Asp Met Val Asp Asn Gly Pro Asn Val305                 310                 315                 320Lys His Val Leu Lys Gln Ser Gly Asp Glu Asp Arg His Asp Trp Tyr
            325                 330                 335Ala Leu Gly Thr Tyr Asp Val Val Asn Asp Lys Trp Tyr Pro Asp Asp
        340                 345                 350Pro Glu Asn Asp Val Gly Ile Gly Leu Arg Tyr Asp Phe Gly Lys Phe
    355                 360                 365Tyr Ala Ser Lys Thr Phe Tyr Asp Gln His Lys Lys Arg Arg Val Leu
370                 375                 380Trp Gly Tyr Val Gly Glu Thr Asp Pro Pro Lys Tyr Asp Val Tyr Lys385                 390                 395                 400Gly Trp Ala Asn Ile Leu Asn Ile Pro Arg Thr Ile Val Leu Asp Thr
            405                 410                 415Lys Thr Asn Thr Asn Leu Ile Gln Trp Pro Ile Ala Glu Val Glu Asn
        420                 425                 430Leu Arg Ser Asn Lys Tyr Asn Glu Phe Lys Asp Val Glu Leu Lys Pro
    435                 440                 445Gly Ser Leu Ile Pro Leu Glu Ile Gly Thr Ala Thr Gln Leu Asp Ile
450                 455                 460Thr Ala Thr Phe Glu Val Asp Gln Thr Met Leu Glu Ser Thr Leu Glu465                 470                 475                 480Ala Asp Val Leu Phe Asn Cys Thr Thr Ser Glu Gly Ser Ala Gly Arg
            485                 490                 495Gly Val Leu Gly Pro Phe Gly Leu Val Val Leu Ala Asp Ala Glu Arg
        500                 505                 510Ser Glu Gln Leu Pro Val Tyr Phe Tyr Ile Ala Lys Asp Thr Asp Gly
    515                 520                 525Ser Ser Lys Thr Tyr Phe Cys Ala Asp Glu Ser Arg Ser Ser Asn Asp
530                 535                 540Val Asp Ile Gly Lys Trp Val Tyr Gly Ser Ser Val Pro Val Leu Glu545                 550                 555                 560Gly Glu Lys Phe Asn Met Arg Leu Leu Val Asp His Ser Ila Val Glu
            565                 570                 575Gly Phe Ala Gln Gly Gly Arg Thr Val Val Thr Ser Arg Val Tyr Pro
        580                 585                 590Ala Lys Ala Ile Tyr Gly Ala Ala Lys Leu Phe Leu Phe Asn Asn Ala
    595                 600                 605Thr Gly Ile Ser Val Lys Ala Ser Leu Lys Ile Trp Lys Met Lys Glu
610                 615                 620Ala Gln Leu Asp Pro Phe Pro Leu Ser Gly Trp Ser Sar625                 630                 635(2)关于SEQ ID NO:3的信息:
(i)序列特征
    (A)长度:1911个碱基对
    (B)类型:核苷酸
    (C)链型:单链
    (D)拓扑结构:线型
(ii)分子类型:其它核酸
    (A)描述:/desc=“合成DNA”
(ix)特征:
    (A)名称/关键:CDS
    (B)位置:1..1911
(xi)序列描述:SEQ ID NO:3:ATG GCA AGC TCT ACG ACT ACA CCG TTG TTA CCG CAC CAC CAT TTG CAG            48Met Ala Ser Ser Thr Thr Thr Pro Leu Leu Pro His His His Leu Gln
    640                 645                 650AAT CCT CAG CAG TTG GCT GGA AGT CCA GCT GCA CAC AGG TTG AGT CGT            96Asn Pro Gln Gln Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ala His Arg Leu Ser Arg
655                 660                 665CCT ACT CTT TTG AGT GGT ATA TTG GTA AGT GTA CTG GTC ATC TGC GCA           144Pro Thr Leu Leu Ser Gly Ile Leu Val Ser Val Leu Val Ile Cys Ala670                 675                 680                 685TTG GTC GCA GTT ATA CAT AAT CAG TCT CAA CAG CCA TAC CAT GAT GGT           192Leu Val Ala Val Ile His Asn Gln Ser Gln Gln Pro Tyr His Asp Gly
            690                 695                 700GGT GCC AAG CCT AGC TCT AGC GCT GCC ACG ACT ACT TTT CCT ACA GCC           240Gly Ala Lys Pro Ser Ser Ser Ala Ala Thr Thr Thr Phe Pro Thr Ala
        705                 710                 715AGC CCT GAA GCA GGA TTG AAA AGA TTC CCT ATC GAA CTC AAG ACC AAC           288Ser Pro Glu Ala Gly Leu Lys Arg Phe Pro Ile Glu Leu Lys Thr Asn
    720                 725                 730GCA GAA GTC GAG TGG CAG AGA AGT GCA TAC CAC TTC CAG CCA GAT AAG           336Ala Glu Val Glu Trp Gln Arg Ser Ala Tyr His Phe Gln Pro Asp Lys
735                 740                 745AAC TAT ATC TCA GAC CCA GAC GGG CCT ATG TAC CAT ATG GGT TGG TAC           384Asn Tyr Ile Ser Asp Pro Asp Gly Pro Met Tyr His Met Gly Trp Tyr750                 755                 760                 765CAC TTA TTC TAC CAA TAT AAT CCA GAG AGT GCA ATA TGG GGA AAT ATA           432His Leu Phe Tyr Gln Tyr Asn Pro Glu Ser Ala Ile Trp Gly Asn Ile
            770                 775                 780ACT TGG GGT CAT AGC GTT AGC AAG GAT ATG ATT AAT TGG TTT CAC TTG           480Thr Trp Gly His Ser Val Ser Lys Asp Met Ile Asn Trp Phe His Leu
        785                 790                 795CCA TTT GCG ATG GTC CCA GAT CAA TGG TAT GAT ATT GAG GGC GTT ATG           528Pro Phe Ala Met Val Pro Asp Gln Trp Tyr Asp Ile Glu Gly Val Met
    800                 805                 810ACT GGA AGC GCA ACT GTT TTG CCA GAC GGA CAG ATC ATT ATG TTG TAT           576Thr Gly Ser Ala Thr Val Leu Pro Asp Gly Gln Ile Ile Met Leu Tyr
815                 820                 825ACC GGT AAT GCA TAC GAC TTG AGT CAG TTG CAG TGT CTC GCC TAT GCC           624Thr Gly Asn Ala Tyr Asp Leu Ser Gln Leu Gln Cys Leu Ala Tyr Ala830                 835                 840                 845GTT AAT AGC AGC GAC CCC TTG TTG CTC GAT TGG AAG AAG TAC GAG GGC           672Val Asn Ser Ser Asp Pro Leu Leu Leu Asp Trp Lys Lys Tyr Glu Gly
            850                 855                 860AAT CCG ATT CTC TTT CCG CCT CCT GGC GTC GGA TAT AAA GAT TTC AGA           720Asn Pro Ile Leu Phe Pro Pro Pro Gly Val Gly Tyr Lys Asp Phe Arg
        865                 870                 875GAT CCC AGT ACT CTC TGG CTC GGT CCA GAC GGA GAG TAC CGT ATG GTC           768Asp Pro Ser Thr Leu Trp Leu Gly Pro Asp Gly Glu Tyr Arg Met Val
    880                 885                 890ATG GGC AGC AAA CAC AAT GAA ACA ATC GGG TGC GCA CTC ATC TAT CAC           816Met Gly Ser Lys His Asn Glu Thr Ile Gly Cys Ala Leu Ile Tyr His
895                 900                 905ACG ACA AAC TTC ACG CAC TTC GAG CTC AAG GAA GAA GTC TTA CAC GCT           864Thr Thr Asn Phe Thr His Phe Glu Leu Lys Glu Glu Val Leu His Ala910                 915                 920                 925GTT CCT CAC ACA GGA ATG TGG GAG TGC GTC GAC TTA TAT CCC GTC AGT           912Val Pro His Thr Gly Met Trp Glu Cys Val Asp Leu Tyr Pro Val Ser
            930                 935                 940ACT ACT CAT ACG AAT GGC TTG GAT ATG GTC GAC AAT GGT CCC AAC GTC           960Thr Thr His Thr Asn Gly Leu Asp Met Val Asp Asn Gly Pro Asn Val
        945                 950                 955AAA CAT GTC CTC AAG CAG TCC GGC GAC GAG GAC AGG CAC GAC TGG TAC          1008Lys His Val Leu Lys Gln Sar Gly Asp Glu Asp Arg His Asp Trp Tyr
    960                 965                 970GCT TTA GGT ACA TAT GAC GTC GTC AAC GAC AAA TGG TAT CCC GAC GAT          1056Ala Leu Gly Thr Tyr Asp Val Val Asn Asp Lys Trp Tyr Pro Asp Asp
975                 980                 985CCC GAG AAC GAC GTC GGA ATT GGC CTT CGT TAC GAC TTC GGC AAG TTC          1104Pro Glu Asn Asp Val Gly Ile Gly Leu Arg Tyr Asp Phe Gly Lys Phe990                 995                 1000                1005TAC GCC AGT AAA ACA TTC TAC GAT CAG CAC AAA AAA CGT CGT GTT TTA          1152Tyr Ala Ser Lys Thr Phe Tyr Asp Gln His Lys Lys Arg Arg Val Leu
            1010                1015                1020TGG GGA TAC GTC GGC GAG ACG GAC CCG CCC AAA TAC GAT GTC TAC AAA          1200Trp Gly Tyr Val Gly Glu Thr Asp Pro Pro Lys Tyr Asp Val Tyr Lys
        1025                1030                1035GGT TGG GCA AAT ATC CTC AAC ATA CCT CGC ACT ATT GTC CTC GAT ACG          1248Gly Trp Ala Asn Ile Leu Asn Ile Pro Arg Thr Ile Val Leu Asp Thr
    1040                1045                1050AAG ACA AAC ACG AAC CTC ATA CAG TGG CCT ATT GCC GAG GTG GAG AAT          1296Lys Thr Asn Thr Asn Leu Ile Gln Trp Pro Ile Ala Glu Val Glu Asn
1055                1060                1065TTA CGT AGC AAC AAA TAC AAC GAG TTC AAG GAT GTG GAA TTG AAG CCT          1344Leu Arg Ser Asn Lys Tyr Asn Glu Phe Lys Asp Val Glu Leu Lys Pro1070                1075                1080                1085GGA AGT TTG ATT CCG TTA GAA ATC GGT ACT GCT ACT CAA CTC GAC ATC          1392Gly Ser Leu Ile Pro Leu Glu Ile Gly Thr Ala Thr Gln Leu Asp Ile
            1090                1095                1100ACC GCT ACT TTT GAG GTC GAT CAG ACC ATG CTC GAG AGT ACC TTA GAA          1440Thr Ala Thr Phe Glu Val Asp Gln Thr Met Leu Glu Ser Thr Leu Glu
        1105                1110                1115GCG GAC GTA TTA TTT AAC TGT ACC ACA TCC GAG GGG AGC GCA GGT CGC          1488Ala Asp Val Leu Phe Asn Cys Thr Thr Ser Glu Gly Ser Ala Gly Arg
    1120                1125                1130GGA GTC CTT GGT CCA TTC GGA CTT GTC GTC TTA GCG GAC GCA GAA AGA          1536Gly Val Leu Gly Pro Phe Gly Leu Val Val Leu Ala Asp Ala Glu Arg
1135                1140                1145AGC GAG CAG TTG CCC GTC TAT TTT TAC ATT GCC AAG GAC ACC GAC GGT          1584Ser Glu Gln Leu Pro Val Tyr Phe Tyr Ile Ala Lys Asp Thr Asp Gly1150                1155                1160                1165TCC AGC AAG ACA TAC TTC TGC GCA GAT GAG TCC CGC AGC AGC AAC GAC         1632Ser Ser Lys Thr Tyr Phe Cys Ala Asp Glu Ser Arg Ser Ser Asn Asp
            1170                1175                1180GTC GAT ATC GGC AAG TGG GTC TAT GGT TCG TCA GTC CCA GTG TTG GAG         1680Val Asp Ile Gly Lys Trp Val Tyr Gly Ser Ser Val Pro Val Leu Glu
        1185                1190                1195GGA GAG AAA TTT AAC ATG CGC CTG CTT GTC GAC CAC AGC ATC GTC GAA         1728Gly Glu Lys Phe Asn Met Arg Leu Leu Val Asp His Ser Ile Val Glu
    1200                1205                1210GGC TTC GCT CAG GGT GGC CGT ACT GTC GTA ACC AGT CGT GTC TAC CCT         1776Gly Phe Ala Gln Gly Gly Arg Thr Val Val Thr Ser Arg Val Tyr Pro
1215                1220                1225GCT AAA GCC ATA TAT GGG GCA GCC AAA CTC TTC CTC TTT AAT AAT GCC         1824Ala Lys Ala Ile Tyr Gly Ala Ala Lys Leu Phe Leu Phe Asn Asn Ala1230                1235                1240                1245ACA GGC ATA TCA GTC AAA GCC AGC TTA AAA ATT TGG AAA ATG AAA GAG         1872Thr Gly Ile Ser Val Lys Ala Ser Leu Lys Ile Trp Lys Met Lys Glu
            1250                1255                1260GCT CAG TTG GAC CCG TTT CCA TTA AGC GGC TGG TCT AGC                     1911Ala Gln Leu Asp Pro Phe Pro Leu Ser Gly Trp Ser Ser
        1265                1270(2)关于SEQ ID NO:4的信息:
(i)序列特征
    (A)长度:637个氨基酸
    (B)类型:氨基酸
    (C)链型:单链
    (D)拓扑结构:线型
(ii)分子类型:蛋白质
(xi)序列描述:SEQ ID NO:4:
Met Ala Ser Ser Thr Thr Thr Pro Leu Leu Pro His His His Leu Gln
  1               5                  10                  15
Asn Pro Gln Gln Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ala His Arg Leu Ser Arg
             20                  25                  30
Pro Thr Leu Leu Ser Gly Ile Leu Val Ser Val Leu Val Ile Cys Ala
         35                  40                  45
Leu Val Ala Val Ile His Asn Gln Ser Gln Gln Pro Tyr His Asp Gly
     50                  55                  60Gly Ala Lys Pro Ser Ser Ser Ala Ala Thr Thr Thr Phe Pro Thr Ala65                  70                 75                   80Ser Pro Glu Ala Gly Leu Lys Arg Phe Pro Ile Glu Leu Lys Thr Asn
             85                  90                  95Ala Glu Val Glu Trp Gln Arg Ser Ala Tyr His Phe Gln Pro Asp Lys
        100                 105                 110Asn Tyr Ile Ser Asp Pro Asp Gly Pro Met Tyr His Met Gly Trp Tyr
    115                 120                 125His Leu Phe Tyr Gln Tyr Asn Pro Glu Ser Ala Ile Trp Gly Asn Ile
130                 135                 140Thr Trp Gly His Ser Val Ser Lys Asp Met Ile Asn Trp Phe His Leu145                 150                 155                 160Pro Phe Ala Met Val Pro Asp Gln Trp Tyr Asp Ile Glu Gly Val Met
            165                 170                 175Thr Gly Ser Ala Thr Val Leu Pro Asp Gly Gln Ile Ile Met Leu Tyr
        180                 185                 190Thr Gly Asn Ala Tyr Asp Leu Ser Gln Leu Gln Cys Leu Ala Tyr Ala
    195                 200                 205Val Asn Ser Ser Asp Pro Leu Leu Leu Asp Trp Lys Lys Tyr Glu Gly
210                 215                 220Asn Pro Ile Leu Phe Pro Pro Pro Gly Val Gly Tyr Lys Asp Phe Arg225                 230                 235                 240Asp Pro Ser Thr Leu Trp Leu Gly Pro Asp Gly Glu Tyr Arg Met Val
            245                 250                 255Met Gly Ser Lys His Asn Glu Thr Ile Gly Cys Ala Leu Ile Tyr His
        260                 265                 270Thr Thr Asn Phe Thr His Phe Glu Leu Lys Glu Glu Val Leu His Ala
    275                 280                 285Val Pro His Thr Gly Met Trp Glu Cys Val Asp Leu Tyr Pro Val Ser
290                 295                 300Thr Thr His Thr Asn Gly Leu Asp Met Val Asp Asn Gly Pro Asn Val305                 310                 315                 320Lys His Val Leu Lys Gln Ser Gly Asp Glu Asp Arg His Asp Trp Tyr
            325                 330                 335Ala Leu Gly Thr Tyr Asp Val Val Asn Asp Lys Trp Tyr Pro Asp Asp
        340                 345                 350Pro Glu Asn Asp Val Gly Ile Gly Leu Arg Tyr Asp Phe Gly Lys Phe
    355                 360                 365Tyr Ala Ser Lys Thr Phe Tyr Asp Gln His Lys Lys Arg Arg Val Leu
370                 375                 380Trp Gly Tyr Val Gly Glu Thr Asp Pro Pro Lys Tyr Asp Val Tyr Lys385                 390                 395                 400Gly Trp Ala Asn Ile Leu Asn Ile Pro Arg Thr Ile Val Leu Asp Thr
            405                 410                 415Lys Thr Asn Thr Asn Leu Ile Gln Trp Pro Ile Ala Glu Val Glu Asn
        420                 425                 430Leu Arg Ser Asn Lys Tyr Asn Glu Phe Lys Asp Val Glu Leu Lys Pro
    435                 440                 445Gly Ser Leu Ile Pro Leu Glu Ile Gly Thr Ala Thr Gln Leu Asp Ile
450                 455                 460Thr Ala Thr Phe Glu Val Asp Gln Thr Met Leu Glu Ser Thr Leu Glu465                 470                 475                 480Ala Asp Val Leu Phe Asn Cys Thr Thr Ser Glu Gly Ser Ala Gly Arg
            485                 490                 495Gly Val Leu Gly Pro Phe Gly Leu Val Val Leu Ala Asp Ala Glu Arg
        500                 505                 510Ser Glu Gln Leu Pro Val Tyr Phe Tyr Ile Ala Lys Asp Thr Asp Gly
    515                 520                 525Ser Ser Lys Thr Tyr Phe Cys Ala Asp Glu Ser Arg Ser Ser Asn Asp
530                 535                 540Val Asp Ile Gly Lys Trp Val Tyr Gly Ser Ser Val Pro Val Leu Glu545                 550                 555                 560Gly Glu Lys Phe Asn Met Arg Leu Leu Val Asp His Ser Ile Val Glu
            565                 570                 575Gly Phe Ala Gln Gly Gly Arg Thr Val Val Thr Ser Arg Val Tyr Pro
        580                 585                 590Ala Lys Ala Ile Tyr Gly Ala Ala Lys Leu Phe Leu Phe Asn Asn Ala
    595                 600                 605Thr Gly Ile Ser Val Lys Ala Ser Leu Lys Ile Trp Lys Met Lys Glu
610                 615                 620Ala Gln Leu Asp Pro Phe Pro Leu Ser Gly Trp Ser Ser625                 630                 635

Claims (23)

1.编码蔗糖依赖的蔗糖果糖转移酶(SST)的核酸分子,选自:
(a)编码包含SEQ ID No.2和SEQ ID No.4中所示氨基酸
   序列的蛋白的核酸分子;
(b)包含SEQ ID No.1中所示的核苷酸序列或相应核糖核
   苷酸序列的核酸分子;
(c)包含SEQ ID No.3中所示的核苷酸序列或相应核糖核
   苷酸序列的核酸分子;以及
(d)包含(a)或(b)中所述的编码能催化果糖单位之间β-2,1
   糖苷键或β-2,6糖苷键连接的蛋白的核酸分子片段的
   核酸分子。
2.根据权利要求1所述的核酸分子,是DNA分子。
3.根据权利要求2所述的DNA分子,是cDNA分子。
4.根据权利要求1所述的核酸分子,是RNA分子。
5.包含根据权利要求1-4中的任意一项所述的核酸分子的载体。
6.根据权利要求5所述的载体,其中核酸分子与保证原核和/或真核细胞中可翻译RNA转录和合成的调控元件可操作连接。
7.根据权利要求6所述的载体,其中调控元件来自patatin B33启动子。
8.用根据权利要求1-4中的任意一项所述的核酸分子或根据权利要求6或7所述的载体转化的宿主细胞或从这样的细胞衍生的宿主细胞。
9.生产SST的方法,其中根据权利要求8所述的宿主细胞在使SST合成的条件下培养并且从培养的细胞中和/或培养基中分离SST。
10.由根据权利要求1-4中的任意一项所述的核酸分子编码的或根据权利要求9所述的方法制备的SST。
11.用根据权利要求1-4中的任意一项所述的核酸分子或根据权利要求6或7所述的载体转化的转基因植物细胞或从这样的细胞衍生的转基因植物细胞,其中编码来自朝鲜蓟的SST的核酸分子受允许植物细胞中可翻译mRNA转录的调控元件控制。
12.包含根据权利要求11所述的植物细胞的植物。
13.根据权利要求12所述的植物,是有用的植物。
14.根据权利要求13所述的植物,是贮存蔗糖或淀粉的植物。
15.根据权利要求14所述的植物,是土豆植物。
16.根据权利要求12-15中的任意一项所述的植物繁殖材料,包含根据权利要求11所述的植物细胞。
17.根据权利要求12-15中的任意一项所述的植物收获产物,包含根据权利要求11所述的植物细胞。
18.生产短链果糖多聚物的方法,包括:
(a)在允许SST产生和如果需要,允许外加蔗糖或相应底物向短链果糖多聚物转化的条件下,培养根据权利要求8所述的宿主细胞或根据权利要求11所述的植物细胞;并且
(b)从培养细胞或培养基得到通过这种方法产生的果糖多聚物。
19.生产短链果糖多聚物的方法,包括:
(a)在允许向短链果糖多聚物转化的条件下,使蔗糖或相应底物与根据权利要求10所述的SST接触;并且
(b)得到这样产生的果糖多聚物。
20.生产短链果糖多聚物的方法,包括:
(a)培养根据权利要求12-15中的任意一项所述的植物;并且
(b)从这些植物或其根据权利要求16所述的繁殖材料或根据权利要求17所述的收获产物得到果糖多聚物。
21.可从根据权利要求11所述的植物细胞、根据权利要求12-15中的任意一项所述的植物、根据权利要求16所述的繁殖材料或根据权利要求17所述的收获产物得到的或按照根据权利要求18-20中的任意一项所述的方法生产的果糖多聚物的用途,用于食品的生产。
22.根据权利要求21所述的用途,其中的食品是烘烤食品或面食。
23.与根据权利要求1-4中的任意一项所述的任意一种核酸分子特异杂交的寡核苷酸。
CNB988030861A 1997-03-04 1998-03-02 编码蔗糖依赖性蔗糖果糖基转移酶的核酸分子及生产短链果糖基多聚物的方法 Expired - Lifetime CN1163612C (zh)

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