Patents
Search within
Search within the title, abstract, claims, or full patent document: You can restrict your search to a specific field using field names.
Use TI= to search in the title, AB= for the abstract, CL= for the claims, or TAC= for all three. For example, TI=(safety belt).
Search by Cooperative Patent Classifications (CPCs): These are commonly used to represent ideas in place of keywords, and can also be entered in a search term box. If you're searching forseat belts, you could also search for B60R22/00 to retrieve documents that mention safety belts or body harnesses. CPC=B60R22 will match documents with exactly this CPC, CPC=B60R22/low matches documents with this CPC or a child classification of this CPC.
Learn More
Title
Abstract
Claims
Full Document
Find patents
Keywords and boolean syntax (USPTO or EPO format): seat belt searches these two words, or their plurals and close synonyms. "seat belt" searches this exact phrase, in order. -seat -belt searches for documents not containing either word.
For searches using boolean logic, the default operator is AND with left associativity. Note: this means safety OR seat belt is searched as (safety OR seat) AND belt. Each word automatically includes plurals and close synonyms. Adjacent words that are implicitly ANDed together, such as (safety belt), are treated as a phrase when generating synonyms.
Learn More
Search by
Chemistry searches match terms (trade names, IUPAC names, etc. extracted from the entire document, and processed from .MOL files.)
Substructure (use SSS=) and similarity (use ~) searches are limited to one per search at the top-level AND condition. Exact searches can be used multiple times throughout the search query.
Searching by SMILES or InChi key requires no special syntax. To search by SMARTS, use SMARTS=.
To search for multiple molecules, select "Batch" in the "Type" menu. Enter multiple molecules separated by whitespace or by comma.
Learn More
Patent numbers
Search specific patents by importing a CSV or list of patent publication or application numbers.
Molekuly nukleové kyseliny kódující sacharózofruktosyltransferázu závislou na sacharóze (SST), vektor, hostitelská bunka, zpusob prípravy SST, SST, transgenní rostlinná bunka, rostlina, rostlinný rozmnožovací materiál a zpusob prípravy 1-kestózy, nys
CZ299374B6
Czechia
- Other languages
English - Inventor
G. Heyer@Arnd Hellwege@Elke Gritscher@Dominique
Description
translated from
(54) Název vynálezu:
Molekuly nukleové kyseliny kódující sacharózofruktosyltransferázu závislou na sacharóze (SST), vektor, hostitelská buňka, způsob přípravy SST, SST, transgenní rostlinná buňka, rostlina, rostlinný rozmnožovací materiál a způsob přípravy 1-kestózy, nystózy a/nebo fruktosylnystózy (57) Anotace:
Molekula nukleové kyseliny kódující sacharózofruktosyltransferázu závislou na sacharóze (SST), která je vybrána ze skupiny zahrnující (a) molekuly nukleové kyseliny kódující protein, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou jako sekvenci identifikačního čísla 2 a 4, (b) molekuly nukleové kyseliny, které obsahují nukleotidovou sekvenci uvedenou jako sekvenci identifikačního čísla 1 nebo odpovídající ribonukleotidovou sekvenci, (c) molekuly nukleové kyseliny, které obsahují nukleotidovou sekvenci uvedenou jako sekvenci identifikačního čísla 3 nebo odpovídající ribonukleotidovou sekvenci, a (d) molekuly nukleové kyseliny, které obsahují fragment molekul nukleové kyseliny uvedených v (a) až (c) kódující protein, který je schopen katalyzovat vytvoření β-2,1 -glykosidických nebo P-2,6-glykosidických vazeb mezi fruktózovými jednotkami. Molekula nukleové kyseliny, vektor obsahující molekulu nukleové kyseliny, hostitelská buňka, která je transformovaná molekulou nukleové kyseliny, způsob přípravy SST a SST, která je kódována molekulou nukleové kyseliny, transgenní rostlinná buňka, která je transformovaná molekulou nukleové kyseliny, rostlina obsahující tyto buňky, rostlinný rozmnožovací materiál a způsob přípravy 1-kestózy, nystózy
299 374 (13) Druh dokumentu: B6 (51) Int. Cl.:
C12N15/82 Cl 2N 9/10 C12Q 1/68 C12P19/04 A01H 5/00 a/nebo fruktosylnystózy.
EcoRI (Sac!)
Kpnl (2006.01) (2006.01) (2006.01) (2006.01) (2006.01)
Sal!(Pstl Sphl) Notl /Smál Híndlll
| B33 í | cySST | jocs iTerm |
| 1500 bp | 2200 bp | 215 bp |
| p8in19 | .............> |
Molekuly nukleové kyseliny kódující sacharózofruktosyltransferázu závislou na sacharóze (SST), vektor, hostitelská buňka, způsob přípravy SST, SST, transgenní rostlinná buňka, rostlina, rostlinný rozmnožovací materiál a způsob přípravy 1-kestózy, nystózy a/nebo fruktosylnystózy
Oblast techniky
Vynález se týká molekul nukleové kyseliny kódujících sacharózofruktosyltransferázy závislé na sacharóze (SST), které mají fruktosylpolymerázovou aktivitu, způsobu přípravy sacharózofruktosyltransferázy závislé na sacharóze a této SST, která je kódována molekulou nukleové kyseliny, s jejíž pomocí mohou být tvořeny fruktosylové polymery s krátkým řetězcem, 1-kestóza, nystóza a/nebo fruktosylnystóza, použitím různých metod, například fermentačních nebo jiných biotechnologických metod. Dále se tento vynález týká vektorů a hostitelských buněk obsahujících takové molekuly nukleové kyseliny, jakož i rostlinných buněk, rostlin transformovaných popsanými molekulami nukleové kyseliny a rostlinného rozmnožovacího materiálu obsahující tyto rostlinné buňky. Kromě toho jsou popsány způsoby produkce transgenních rostlin, které syntetizují 1-kestózu, nystózu a/nebo fruktosylnystózu díky zavedení molekul DNA kódujícím SST z artyčoku. Postup přípravy SST slouží k produkci 1-kestózy, nystózy a/nebo fruktosylnystózy (neboli fruktosylových polymerů s krátkým řetězcem) v různých hostitelských organismech.
Dosavadní stav techniky
Lineární, ve vodě rozpustné polymery mají mnohé různé možnosti použití, například pro zvýšení viskozity vodných systémů, jako detergenty, jako suspendační činidla nebo pro urychlení sedimentačního procesu a pro komplexování, ale také pro vázání vody. Polymery na bázi sacharidů, například fruktosylové polysacharidy, jsou obzvláště zajímavé materiály, protože jsou biologicky odbouratelné.
Nezávisle na jejich použití jako regenerační suroviny pro průmyslovou produkci a zpracování, jsou fruktosylové polymery také zajímavé jako potravní aditiva, například jako umělá sladidla. Pro tento účel jsou obzvláště vhodné polymery mající nízký stupeň polymerizace.
Doposud byly popsány pouze způsoby produkce fruktanových polysacharidů s dlouhým řetězcem v rostlinách expresí enzymů bakteriálního původu, jakož i způsob produkce transgenních rostlin exprimujících fruktosyltransferázy z Helianthus tuberosus. Způsoby tvorby enzymů pro produkci fruktosylových polymerů s krátkým řetězcem nejsou známy. V popisu patentové přihlášky PCT/USA89/02729 se popisuje možnost tvořit cukerné polymery, zejména dextran nebo poly40 fruktózu, v transgenních rostlinách, obzvláště v plodech transgenních rostlin. Pro přípravu takových modifikovaných rostlin se navrhuje použití levansacharózy z mikroorganismů, konkrétně zAerobacter levanicum, Streptococcus salivarius a Bacillus subtilis, nebo dextransacharózy τ Leuconostoc mesenteroides. Nepopisuje se ani produkce aktivních enzymů ani levanu či dextranu ani transgenních rostlin. Patentová přihláška PCT/EP93/02110 popisuje způsob pro45 dukce transgenních rostlin exprimujících gen Isc levansacharózy z gram-negativní bakterie Erwinia amylovora. V patentové přihlášce PCT/NL93/00279 je popsána transformace rostlin majících chimérické geny, které obsahují gen sacB τ Bacillus subtilis nebo gen ftf ze Streptococcus mutans. V případě genu sacB se doporučuje pro zvýšení hladiny exprese v transgenních rostlinách modifikace v 5'-netranslatované oblasti genu. Patentová přihláška PCT/NL96/00012 popisuje sekvence DNA kódující enzymy syntetizující cukerné polymery a produkci transgenních rostlin s pomocí těchto sekvencí DNA. Popisované sekvence pocházejí z Helianthus tuberosus. Podle dokumentu PCT/NL96/00012 jsou popsané sekvence vhodné nejenom k modifikaci fruktanového profilu například petúnie a brambory, ale také samotné Helianthus tuberosus. Proto přihláška PCT/NL96/00012 popisuje, kromě jiného, transgenní brambory exprimující SST z Helianthus tuuberosus. Dokonce i když lze detekovat enzymatickou aktivitu SST exprimované
- 1 CZ 299374 B6 v transgenních rostlinách, může být dosaženo pouze nízké úrovně konverze substrátu sacharózy na fruktosylové polymery s krátkým řetězcem. To může mít vztah k různým faktorům, jako je nízká afinita enzymu k substrátu nebo případná inhibice enzymu tvořeným produktem.
Proto je předmětem předkládaného vynálezu poskytnout molekuly nukleové kyseliny kódující sacharózofruktosyltransferázu závislou na sacharóze (SST), s jejíž pomocí je možné připravit organismy modifikované metodami genetického inženýrství tak, že jsou schopné produkovat fruktosylové polymery s krátkým řetězcem.
Výše zmíněný problém je řešen předkládaným vynálezem, který je popsán pomocí následujících příkladů a definován patentovými nároky.
Podstata vynálezu
Předmětný vynález se týká molekuly nukleové kyseliny kódující sacharózofruktosyltransferázu závislou na sacharóze (SST), která je vybrána ze skupiny zahrnující:
a) molekuly nukleové kyseliny kódující protein, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou jako sekvenci identifikačního čísla 2 a 4,
b) molekuly nukleové kyseliny, které obsahují nukleotidovou sekvenci uvedenou jako sekvenci identifikačního čísla 1 nebo odpovídající ribonukleotidovou sekvenci,
c) molekuly nukleové kyseliny, které obsahují nukleotidovou sekvenci uvedenou jako sekvenci identifikačního čísla 3 nebo odpovídající ribonukleotidovou sekvenci, a
d) molekuly nukleové kyseliny, které obsahují fragment molekul nukleové kyseliny uvedených v a) až c) kódující protein, který je schopen katalyzovat vytvoření P-2,l-glykosidických nebo
3_2,6-glykosidických vazeb mezi fruktózovými jednotkami.
Ve výhodném provedení podle předmětného vynálezu je touto molekulou nukleové kyseliny molekula DNA. Výhodně je molekulou DNA molekula cDNA.
Podle dalšího výhodného provedení podle předmětného vynálezu je touto molekulou nukleové kyseliny molekula RNA.
Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží vektor, který obsahuje libovolnou výše speci35 Ukovanou molekulu nukleové kyseliny.
Ve výhodném provedení tohoto vektoru je molekula nukleové kyseliny operativně spojena s regulačním prvkem, který dovoluje transkripci a syntézu translatovatelné RNA v prokaryotických a/nebo eukaryotických buňkách. Výhodně je v případě tohoto vektoru regulační prvek odvozen z patatinového promotoru B33.
Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží hostitelská buňka, která je transformovaná libovolnou výše specifikovanou molekulou nukleové kyseliny nebo libovolným výše specifikovaným vektorem, nebo buňka, která prochází z takové buňky a obsahuje libovolnou výše speci45 fikovanou molekulu nukleové kyseliny nebo libovolný výše specifikovaný vektor.
Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží způsob přípravy SST, jehož podstata spočívá v tom, že se výše specifikovaný hostitelská buňka kultivuje v podmínkách, které dovolují syntézu SST a SST se izoluje z kultivovaných buněk a/nebo kultivačního média.
Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží SST, která je kódována molekulou libovolné výše specifikované nukleové kyseliny, nebo která je připravena výše specifikovaným způsobem.
-2CZ 299374 B6
Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží transgenní rostlinná buňka, která je transformovaná libovolnou výše specifikovanou molekulou nukleové kyseliny nebo libovolným výše specifikovaným vektorem nebo která prochází z takové buňky, přičemž molekula nukleové kyseliny kódující SST zartyčoku je řízena regulačním prvkem, který umožňuje transkripci translato5 vatelné RNA v rostlinných buňkách.
Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží rostlina, která obsahuje výše specifikované rostlinné buňky.
Ve výhodném provedení je touto rostlinou rostlina pšenice, ječmene, rýže, kukuřice, řepy cukrové nebo cukrové třtiny. Podle dalšího výhodného provedení je touto rostlinou rostlina bramboru.
Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží rostlinný rozmnožovací materiál z libovolné výše specifikované rostliny, který obsahuje výše specifikované rostlinné buňky.
Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží způsob přípravy 1-kestózy, nystózy a/nebo fruktosylnystózy, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje:
a) kultivaci výše specifikované hostitelské buňky v podmínkách, které dovolují produkci SST a konverzi, pokud je to třeba, externě přidané sacharózy nebo ekvivalentního substrátu na 120 kestózu, nystózu a/nebo fruktosylnystózu, a
b) získání tímto způsobem tvořené 1-kestózy, nystózy a/nebo fruktosylnystózy zkultivovaných buněk nebo média.
Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží způsob přípravy 1-kestózy, nystózy a/nebo 25 fruktosylnystózy, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje:
a) působení výše specifikované SST na sacharózu nebo ekvivalentní substrát v podmínkách dovolujících konverzi na 1-kestózu, nystózu a/nebo fruktosylnystózu, a
b) získání takto tvořené 1-kestózy, nystózy a/nebo fruktosylnystózy.
Do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží způsob přípravy 1-kestózy, nystózy a/nebo fruktosylnystózy, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje:
a) kultivaci libovolné výše specifikované rostliny, a
b) získání 1-kestózy, nystózy a/nebo fruktosylnystózy z těchto rostlin nebo jejich výše specifikovaného rozmnožovacího materiálu.
Pokud se týče předmětného vynálezu, potom je třeba uvést, že enzymem majícím fruktosylpolymerázovou aktivitu se míní protein, který je schopný katalyzovat vznik β-2,1-glykosidické nebo β-2,6-glykosidické vazby mezi fruktózovými jednotkami. Fruktosylový zbytek, který má být přenesen, může takto pocházet ze sacharózy nebo fruktanového polymeru.
Fruktosylovým polymerem s krátkým řetězcem se rozumí molekula obsahující alespoň dva, ale ne více než 100 fruktosylových zbytků, které jsou spojeny buď β-2,1-nebo fi-2,6-glykosidickou vazbou. Fruktosylový polymer může nést na svém konci glukózový zbytek, který je spojen prostřednictvím OH skupiny na atomu C-l glukózy a OH skupiny atomu C-2 fruktosylu.
V tomto případě fruktosylový polymer obsahuje molekulu sacharózy.
Ve výhodném provedení pocházejí sekvence nukleové kyseliny vynálezu z artyčoku.
Podle předmětného vynálezu bylo překvapivě zjištěno, že během exprese molekul nukleové 50 kyseliny se tvořila velká množství fruktosylových polymerů.
-3 CZ 299374 B6
Při použití molekul nukleové kyseliny podle vynálezu se získá na rozdíl od brambor popsaných v patentové přihlášce PCT/NL96/00012 velké množství oligofruktanu, které je dokonce větší, než buněčný obsah substrátové sacharózy.
Molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu mohou být jak DNA, tak RNA molekuly. Vhodné molekuly DNA jsou například molekuly genomové DNA nebo cDNA. Molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu mohou být izolovány z přírodních zdrojů, výhodně artyěoku, nebo mohou být syntetizovány pomocí známých metod.
Prostřednictvím obvyklých molekulárně biologických metod je možné (viz např. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) zavést do molekul nukleové kyseliny vynálezu odlišné mutace. Výsledkem je, že takto je možné syntetizovat proteiny s modifikovanými biologickými vlastnostmi. Jedna možnost je tvorba delečních mutant, ve kterých se tvoří molekuly nukleové kyseliny neustálými delecemi od 5'- nebo 3'-konce kódující sekvence DNA, a to vede k syntéze proteinů, které jsou adekvátně zkráceny. Takovými delecemi na 5'-konci nukleotidové sekvence je například možné identifikovat aminokyselinové sekvence, které jsou odpovědné za translokaci enzymu v plastidech (transiční peptidy). To umožňuje specifickou produkci enzymů, které díky odstranění příslušných sekvencí nejsou již déle lokalizovány ve vakuolách, ale v cytosolu, nebo které jsou diky přidání dalších signálních sekvencí lokalizovány v jiných kompartmentech.
Další možností je zavedení bodové mutace na pozice, kde modifikace aminokyselinové sekvence ovlivňuje např. enzymovou aktivitu nebo regulaci enzymu. Tímto způsobem mohou být například tvořeny mutanty, které mají změněnou hodnotu Km nebo které již nadále nepodléhají regulačním mechanismům, které normálně v buňce existuje vzhledem k alosterické regulaci nebo kovalentní modifikaci.
Kromě toho mohou být tvořeny mutanty, které vykazují změněnou specifitu pro substrát nebo produkt. Mohou být také tvořeny mutanty, které vykazují změněný profil aktivita-teplota.
Pro manipulaci v prokaryotických buňkách pomocí metod genetického inženýrství mohou být molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu nebo části těchto molekul zavedeny do plazmidů umožňujících mutagenezi nebo modifikaci sekvence rekombinací sekvence DNA. Prostřednictvím obvyklých metod {Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual,
2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NNY) se mohou vyměňovat báze a mohou být přidány přirozené nebo syntetické sekvence. Aby se fragmenty DNA navzájem spojily, mohou knim být přidány adaptéry nebo spojky (linkery). Mimoto se mohou provádět manipulace, které poskytují vhodná štěpná místa nebo které odstraňují přebytečnou DNA nebo štěpná místa. Jsou-li možné inzerce, delece nebo substituce, může se provádět in vitro mutageneze, náhrada pomocí primeru, restrikce nebo ligace. Jako metody analýzy se obvykle používají sekvenční analýza, restrikční analýza a další biochemické nebo molekulárně biologické metody.
Termín „hybridizace“ má ve smyslu tohoto vynálezu význam hybridizace za obvyklých hybridi45 začních podmínek, výhodně za stringentních podmínek, jak je například popsáno v Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. vydání, (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
Molekuly nukleové kyseliny, které hybridizují s molekulami podle vynálezu, mohou být izolo50 vány např. z genomových nebo cDNA knihoven, které byly připraveny z artyěoku.
Aby se identifikovaly a izolovaly takové molekuly nukleové kyseliny, mohou být použity molekuly podle vynálezu nebo části těchto molekul nebo reverzní komplementy těchto molekul, například prostřednictvím hybridizace podle obvyklých metod (viz např. Sambrook et al., 1989,
-4CZ 299374 B6
Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. vydání Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).
Jako hybridizační sonda mohou být například použity molekuly nukleové kyseliny, jejichž nukle5 otidová sekvence je zcela shodná nebo podstatně podobná sekvenci zobrazené zde jako sekvenci id. č. 1, nebo části těchto sekvencí. Fragmenty použité jako hybridizační sonda mohou být syntetické fragmenty, které byly vytvořeny prostřednictvím obvyklých způsobů syntézy, a jejichž sekvence v podstatě souhlasí se sekvencí molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu.
Molekuly hybridizující s molekulami nukleové kyseliny podle vynálezu také zahrnují fragmenty, deriváty a alelické varianty molekul nukleové kyseliny popsaných výše kódujících protein podle vynálezu. Termínem „fragmenty“ se rozumí části molekul nukleové kyseliny, které jsou dostatečně dlouhé, aby kódovaly jeden z popisovaných proteinů. Termín „derivát“ v tomto smyslu znamená, že se sekvence těchto molekul liší od sekvencí molekul nukleové kyseliny popsaných výše v jedné nebo několika pozicích, ale s těmito sekvencemi mají vysoký stupeň homologie. Homologie takto znamená sekvence identické alespoň ve 40 %, zejména identické alespoň v 60 %, výhodně ve více než 80 % a zejména výhodně ve více než 90 %. Tyto proteiny kódované molekulami nukleové kyseliny mají sekvenci identickou s aminokyselinovou sekvencí zobrazenou v sekvenci id. č. 2 alespoň v 80 %, výhodně v 85 % a zejména výhodně ve více než 90 %,
95 %, 97 % a 99 %. Odchylky od výše popsaných molekul nukleové kyseliny mohou být tvořeny deleci, substitucí, inzercí nebo rekombinací.
Molekuly nukleové kyseliny, které jsou homologní svýše popsanými molekulami a které představují deriváty těchto molekul jsou obvykle varianty těchto molekul, které představují modi25 fikace mající tutéž biologickou funkci. Mohou to být přirozeně se vyskytující varianty, například sekvence zjiných organismů nebo mutace, které mohou nastat buď přirozeně, nebo které byly vneseny specifickou mutagenezí. Kromě toho mohou být tyto varianty synteticky vytvořené sekvence. Alelické varianty mohou být buď přirozeně se vyskytující varianty nebo synteticky vytvořené varianty nebo varianty vytvořené metodami rekombinantní DNA.
Proteiny kódované různými variantami molekul nukleové kyseliny podle vynálezu vykazují určité společné vlastnosti, jako je enzymová aktivita, molekulová hmotnost, imunologická reaktivita nebo konformace nebo fyzikální vlastnosti, jako je elektroforetická pohyblivost, chování při chromatografií, sedimentační koeficienty, rozpustnost, spektroskopické vlastnosti, stabilita, opti35 mální pH, optimální teplota.
Ve výhodném provedení se vynález týká molekul nukleové kyseliny, které specificky hybridizují s transkripty molekul nukleové kyseliny. Tyto molekuly nukleové kyseliny jsou výhodně oligonukleotidy, které jsou dlouhé alespoň 10, zejména alespoň 15 a obzvláště výhodně alespoň
5 0 nukleotidů. Molekuly nukleové kyseliny a oligonukleotidy vynálezu mohou být použity například jako primery pro reakci PCR (polymerázová řetězová reakce). Mohou být také složky „antisense“ konstruktů (konstruktů s opačnou orientací) nebo molekul DNA kódujících vhodné ribozymy.
Jak již bylo uvedeno, do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží vektory obsahujících molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu. Výhodně jsou plazmidy, kosmidy, viry, bakteriofágy a další vektory obvykle používané na poli genetického inženýrství.
Sekvence nukleové kyseliny podle vynálezu je výhodně operativně spojena s regulačními prvky ve vektoru podle vynálezu, což zaručuje transkripci a syntézu RNA v prokaryotických a/nebo eukaryotických buňkách, která může být translatována.
Expresní vektory podle vynálezu umožňují produkci enzymů syntetizujících fruktosylové polymery s krátkým řetězcem v různých hostitelských organismech.
-5CZ 299374 B6
Kódované enzymy mohou být použity pro produkci fruktosylových polymerů s krátkým řetězcem také mimo hostitelské organismy. Takto mohou být použity pro produkci fruktosylových polymerů s krátkým řetězcem fermentační a další biotechnologické metody. Například je také představitelné, že fruktosylové polymery budou produkovány prostřednictvím imobil izo váných enzymů.
Podle vynálezu jsou výhodné regulační prvky promotoru patatinu B33. Další výhodné promotory jsou promotor 35S CaMV a promotor genu alkoholdehydrogenázy ze Saccharomyces cerevisiae.
Vektory podle vynálezu mohou mít další funkční jednotky ovlivňující stabilizaci vektoru v hostitelském organismu, jako je bakteriální počátek replikace nebo 2-μ DNA pro účel stabilizace v Sacharomyces cerevisiae. Mimoto mohou být obsaženy sekvence „levé hranice“ a „pravé hranice“ T-DNA z Agrobacterium, čímž se umožní stabilní integrace do genomu rostlin.
Navíc vektory podle vynálezu mohou obsahovat funkční terminátory, jako je terminátor genu oktopinsyntetázy z Agrobacterium.
Aby se enzym transportoval do různých buněčných kompartmentů, je v dalším provedení molekula nukleově kyseliny vynálezu spojena s vektorem vynálezu molekulou nukleově kyseliny kódující funkční signální sekvenci. Touto modifikací může být například přidání N-koncové signální sekvence pro sekreci do prostoru buněčné membrány vyšších rostlin, ale předmětem vynálezu může být také každá další modifikace, která vede k fúzi signální sekvence s kódovanou fruktosyltransferázou.
V obzvláště výhodném provedení se vynález týká plazmidu pB33-cySST, jehož konstrukce je popsána v příkladech (obr. 1).
Zajímavá je exprese molekul nukleové kyseliny podle vynálezu v prokaryotických buňkách, například v Escherichia coli, protože tímto způsobem je možné přesněji charakterizovat enzymatické aktivity enzymů kódujících tyto molekuly.
Jak již bylo výše specifikováno, vynález se rovněž týká hostitelských buněk přechodně nebo stabilně obsahujících molekuly nukleové kyseliny nebo vektory podle vynálezu. Hostitelskou buňkou se rozumí organismus, který je schopný zavedení in vitro rekombinantní DNA a pak eventuálně syntetizovat proteiny kódované molekulami nukleové kyseliny podle vynálezu.
Výhodně jsou těmito buňkami prokaryotické nebo eukaryotické buňky. Vynález se zejména týká rostlinných buněk obsahujících vektorové systémy podle vynálezu nebo jejich deriváty či části. Výhodně jsou schopné syntetizovat enzymy pro produkci fruktosylových polymerů s krátkým řetězcem díky faktu, že do nich byly vneseny vektorové systémy podle vynálezu, jejich deriváty nebo části. Buňky podle vynálezu jsou výhodně charakterizovány faktem, že zavedená molekula nukleové kyseliny vynálezu je buď heterologní vzhledem k transformované buňce, tj. v těchto buňkách se přirozeně nevyskytuje, neboje v genomu lokalizována na jiném místě, než příslušná přirozeně se vyskytující sekvence.
Molekulami podle předmětného vynálezu je možno kódovat proteiny a rovněž tak je možno navrhnout způsoby jejich přípravy, kterými se hostitelská buňka podle vynálezu pěstuje za podmínek umožňujících syntézu proteinu, a protein je pak izolován z pěstovaných buněk a/nebo kultivačního média. Kromě toho se vynález týká SST, které mohou být produkovány rostlinami podle vynálezu.
Poskytnutím molekul nukleové kyseliny podle vynálezu je nyní možné produkovat fruktosylové polymery s krátkým řetězcem v každém organismu prostřednictvím genetického inženýrství, zatímco až dosud nebylo možné rostliny modifikovat konvenčními metodami, například kříže55 ním, tak, aby byly schopné syntetizovat fruktosylové polymery. Zvýšením aktivity proteinů
-6CZ 299374 B6 vynálezu, například nadměrnou expresí („overexpresí“) vhodných molekul nukleové kyseliny nebo poskytnutím mutant, které již nadále nepodléhají buněčné specifickým regulačním mechanismům a/nebo které mají změněné teplotní závislosti vzhledem k jejich aktivitě, je možné zvýšit výtěžek v rostlinách modifikovaných genetickým inženýrstvím.
Podle předmětného vynálezu je tudíž možná exprese molekul nukleové kyseliny podle vynálezu v rostlinných buňkách, aby se zvýšila aktivita příslušné SST nebo aby se SST zavedla do buněk, které normálně tento enzym neexprimují. Nadto je možné modifikovat molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu metodami odborníkovi známými, aby se získaly SST podle vynálezu, které již nadále nepodléhají buněčně specifickým regulačním mechanismům nebo které mají změněnou teplotní závislost nebo specifičnost k substrátu či produktu.
Když jsou molekuly nukleové kyseliny exprimovány v rostlinách, může být syntetizovaný protein lokalizovaný v jakémkoliv kompartmentu rostlinné buňky. Aby se dosáhlo lokalizace ve specifickém kompartmentu, musí být odstraněna sekvence zaručující lokalizaci ve vakuole, a je-li to nutné, zbylá kódující oblast musí být spojena se sekvencemi DNA zaručujícími lokalizaci ve specifickém kompartmentu. Takové sekvence jsou známy (viz např. Braun et al., EMBO J, 11, 1992, 2219- 3227; Wolter et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 85, 1988, 846-850; Sonnewald et al., Planí J., 1, 1991, 95-106).
Do rozsahu předmětného vynálezu tudíž také patří transgenní rostlinné buňky, které byly transformovány jednou nebo několika molekulami nukleové kyseliny podle vynálezu, a také transgenní rostlinné buňky pocházejících z takových transformovaných buněk. Takové buňky obsahují jednu nebo několik molekul nukleové kyseliny podle vynálezu, které jsou výhodně spojeny s regulačními DNA prvky zaručujícími transkripci v rostlinných buňkách, zejména s promotorem. Takové rostlinné buňky se odlišují od přirozeně se vyskytujících rostlinných buněk tím, že obsahují alespoň jednu molekulu nukleové kyseliny podle vynálezu, která se v těchto buňkách přirozeně nevyskytuje, nebo tím, že molekula je zavedena do genomu buňky na místo, kde se přirozeně nevyskytuje, tj. do jiné genomové oblasti.
Z transgenních rostlinných buněk mohou být regenerovány celé rostliny použitím metod odborníkům známým. Do rozsahu předmětného vynálezu tudíž rovněž náleží rostliny, které lze získat regenerací transgenních rostlinných buněk podle vynálezu.
Dalším aspektem předmětného vynálezu jsou rostliny obsahující transgenní rostlinné buňky popsané výše. Transgenní rostliny mohou být v podstatě rostliny jakéhokoli rostlinného druhu, tj. jak jednoděložné, tak dvouděložné. Výhodně jsou to plodiny, zejména rostliny, které syntetizují a/nebo ukládají škrob, jako jsou pšenice, ječmen, rýže, kukuřice, řepa cukrovka, cukrová třtina nebo brambory. Zejména výhodné jsou rostliny ukládající sacharózu.
Jak již bylo uvedeno, do rozsahu předmětného vynálezu rovněž náleží rozmnožovací materiál a produkty sklizně rostlin podle vynálezu, například ovoce, semena, hlízy, podnoží, sadby, řízky apod.
Transgenní rostlinné buňky a rostliny podle vynálezu syntetizují fruktosylové polymery s krátkým řetězcem díky expresi nebo dodatečné expresi alespoň jedné molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu.
Vynález se tedy také týká fruktosylových polymerů s krátkým řetězcem získatelných z transgenních rostlinných buněk a rostlin podle vynálezu, jakož i z rozmnožovacího materiálu a produktů sklizně.
Transgenní rostlinné buňky podle vynálezu mohou být regenerovány na celé rostliny metodami odborníkovi známými. Proto se předmět vynálezu také týká rostlin obsahujících transgenní rostlinné buňky podle vynálezu. Tyto rostliny jsou výhodně plodiny, zejména rostliny, které synte-7CZ 299374 B6 tizují a/nebo ukládají sacharózu a/nebo škrob. Zejména výhodná je brambora. Vynález se také týká rozmnožovacího materiálu rostlin podle vynálezu, obzvláště hlíz.
Aby se v rostlinných buňkách exprimovaly molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu v „sen5 se“ (tj. souhlasně s normálním smyslem transkripce) nebo „antisense“ (tj. proti směru normální transkripce) orientaci, jsou spojeny s regulačními DNA prvky, které zaručují transkripci v rostlinných buňkách. To jsou zejména promotory. V podstatě je pro expresi vhodný jakýkoliv promotor aktivní v rostlinných buňkách.
Promotor může být vybrán tak, že se exprese uskuteční konstitutivně nebo pouze v určitém pletivu, na určitém stupni vývoje rostliny nebo v určité době určené vnějšími podněty. Vzhledem k rostlině může být promotor homologní nebo heterologní. Vhodné promotory jsou například promotor 35S RNA z viru mozaiky květáku a ubichitinový promotor z kukuřice pro konstitutivní expresi, zejména výhodný je promotor genu patatinu B33 (Rocha-Sosa et al., EMBO J., 8, 1989,
23-29) pro expresi specifickou pro hlízu u brambor nebo promotor zaručující pouze expresi ve fotosynteticky aktivním pletivu, například promotor ST-LS1 (Slockhaus et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 84, 1987, 7943-7947; Stockhaus et al., EMBO J, 8, 1989, 2445-2451), nebo expresi specifickou pro endosperm promotory HMG ze pšenice, promotor USP, promotor faseolinu nebo promotory zeinových genů z kukuřice.
Kromě toho zde může být terminační sekvence sloužící pro správné ukončení transkripce, a také připojení konce poly-A k transkriptů, což je funkce nutná pro stabilizaci transkriptů. Tyto prvky jsou popsány v odborné literatuře (viz. Gielen et al., EMBO J, 8, 1989, 23-29) a mohou být libovolně zaměňovány.
Pro zavádění cizích genů do vyšších rostlin existuje velký počet dostupných klonovacích vektorů obsahujících replikační signál pro E. coli a genový markér pro selekci transformovaných bakteriálních buněk. Příklady těchto vektorů jsou pBR322, vektory řádu pUC, řady M13mp, pACYC184 apod. Požadovaná sekvence může být vložena do vektoru ve vhodném štěpném místě. Získaný plazmid je vhodný pro transformaci buněk E. coli. Transformované buňky E. coli jsou pak pěstovány ve vhodném médiu, poté jsou sklizeny a lyžovány. Plazmid je regenerován. Jako analytické metody pro charakterizaci regenerované plazmidové DNA se obvykle používají restrikční analýzy, gelové elektroforézy a další biochemické nebo molekulárně biologické metody. Po každé manipulaci může být plazmidová DNA štěpena a regenerované fragmenty DNA spojeny s dalšími sekvencemi DNA. Každá plazmidová DNA sekvence může být klonována do téhož nebo jiného plazmidů.
Pro zavedení DNA do rostlinné hostitelské buňky je dostupný velký počet metod. Tyto metody zahrnují transformaci rostlinných buněk s T-DNA pomocí Agrobacterium tumefaciens nebo
Agrobacterium rhizogenes jako prostředků transformace, fúzi protoplastů, injekci, elektroporaci DNA, zavedení DNA prostřednictvím biolistických metod, jakož i další možnosti.
Pro injekci a elektroporaci DNA do rostlinných buněk nejsou na použité plazmidy žádné specifické požadavky. Mohou být použity jednoduché plazmidy, jako jsou deriváty pUC. Jestli mají být z takto transformovaných buněk regenerovány celé rostliny, měl by se použít markér pro selekci.
V závislosti na metodě pro zavedení požadovaných genů do rostlinné buňky mohou být nezbytné další sekvence DNA. Jestliže je například pro transformaci rostlinné buňky použit plazmid Ti nebo Ri, alespoň pravý hraniční úsek, ale často pravý a levý hraniční úsek T-DNA plazmidů Ti a
Ri musí být připojen jako hraniční úsek ke genům, které mají být do buňky zavedeny.
Jestliže se pro transformaci použije Agrobacterium, musí být zaváděná DNA klonována do specifických plazmidů, a sice buďto do intermediámího, nebo do binárního vektoru. Intermediární vektory mohou být integrovány homologní rekombinací do plazmidů Ti nebo Ri v Agro-8CZ 299374 B6 bacterium díky sekvencím, které jsou homologní k sekvencím v T-DNA. Plazmid Ti nebo Ri dále obsahuje úsek vir nezbytný pro přenos T-DNA. Intermediámí vektory se nemohou replikovat v Agrobacterium. Prostřednictvím pomocného (helper) plazmidů může být intermediámí vektor přenesen do Agrobacterium tumefaciens (konjugací). Binární vektory se mohou replikovat jak v E. coli, tak i Agrobacterium. Obsahují markerový gen pro selekci a linker nebo polylinker (klonovací nebo mnohočetné klonovací místo) ohraničený pravým a levým T-DNA hraničním úsekem. Mohou být transformovány přímo do Agrobacterium (Holsters et al., Mol. Gen. Genet., 163, 1978, 181-187). Agrobacterium sloužící jako hostitelská buňka by mělo obsahovat plazmid nesoucí úsek vir. Usek vir je nezbytný pro přenos T-DNA do rostlinné buňky.
Může zde být i další T-DNA. Agrobacterium takto transformované se pak použije pro transformaci rostlinných buněk. Použití T-DNA pro transformaci rostlinných buněk bylo rozsáhle zkoumáno a popsáno v dokumentech EP-A-120 516; Hoekema: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters Β. V., Alblasserdam, 1985, Chapter V, Fraley et al., Crit. Rev. Plant. Sci., 4, 1-46, aAn et al., EMBOJ., 4, 1985, 277-287.
Pro přenos DNA do rostlinných buněk se rostlinné explantáty kultivují společně s Agrobacterium tumefaciens nebo Agrobacterium rhizogenes. Z infikovaného rostlinného materiálu (jako jsou např. kousky listů, části stonku, kořeny, ale také protoplasty nebo rostlinné buňky kultivované v suspenzi) mohou být regenerovány celé rostliny ve vhodném médiu, které může obsahovat antibiotika nebo biocidní látky pro selekci transformovaných buněk. Rostliny získané tímto způsobem mohou být testovány na přítomnost zavedené DNA. Jsou známy další možnosti zavádění cizorodé DNA za použití biolistických metod nebo transformací protoplastů (viz. např. Willmitzer, L., 1993, Transgenic plants. In: Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise (H. J. Rehm, G. Reed, A. Piihler, P. Stadler, eds.), Vol. 2, 627-659, VCH Weinheim25 New York-Basel-Cambridge).
Alternativní systémy pro transformaci jednoděložných rostlin jsou transformace pomoci biolistického přístupu, elektricky nebo chemicky vyvolané zavedení DNA do protoplastů, elektroporace částečně permeabilizovaných buněk, makroinjekce DNA do květů, mikroinjekce DNA do mikrospór a proembryí, introdukce DNA do klíčících pylových zrn a zavedení DNA do embryí bobtnáním (přehled viz: Potrykus, Physiol. Plant, 1990, 269-273).
Zatímco transformace dvouděložných rostlin prostřednictvím vektorového systému plazmidů Ti s pomocí Agrobacterium tumefaciens je dobře zavedena, novější výzkumné práce naznačují, že také jednoděložné rostliny jsou přístupné pro transformaci prostřednictvím vektorů založených na
Agrobacterium {Chán et al., Plant Mol. Biol, 22, 1993, 491-506; Iliei et al., Plant J, 6, 1994, 271-282; Bytebier et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 84, 1987, 5345-5349; Raineri et al., Bio/Technology, 8, 1990, 33-38; Gould et al., Plant Physiol., 95, 1991, 426-434; Mooney et al., Plant, Cell Tiss. & Org. Cult, 25, 1991, 209-218; Li et al., Plant Mol. Biol., 20, 1992, 103740 1048).
Tři zvýše uvedených transformačních systémů mohou být použity také pro různé obilniny: elektroporace tkání, transformace protoplastů a přenos DNA ostřelováním regenerativní tkáně a buněk částicemi (přehled viz: Jáhne et al., Euphytica, 85, 1995, 35-44).
V odborné literatuře byla také často popisována transformace pšenice (přehled viz: Maheshwari et al., Critical Reviews in Plant Science, 14(2), 1995, 149-178).
Vynález se také týká rostlin obsahujících alespoň jednu, ale výhodně velké množství buněk, obsahujících vektorové systémy podle vynálezu nebo deriváty či jejich části, které jsou schopny syntetizovat enzymy pro produkci fruktosylových polymerů s krátkým řetězcem díky zavedení vektorových systémů, derivátů nebo částí vektorových systémů podle vynálezu. Vynález také poskytuje rostliny mnoha různých druhů, rodů, čeledí, řádů a tříd, které jsou schopné syntetizovat enzymy pro produkci fruktosylových polymerů s krátkým řetězcem díky zavedeným vektorovým systémům nebo derivátům nebo jejich částem. Protože známé rostliny nejsou schopny produ-9CZ 299374 B6 kovat fruktosylové polymery s krátkým řetězcem, je snadné kontrolovat, zda byla metoda úspěšně provedena, například chromatografickou analýzou cukrů obsahujících fruktózu. Naproti tomu je výhodné, že několik málo rostlin obsahuje fruktosylové polymery, protože tím jsou definované molekulové hmotnosti, tj. velikost fruktosylového polymeru s krátkým řetězcem.
Nadto je možná lokalizace v různých buněčných kompartmentech a různých orgánech, jakož i zvýšení exprese, a tedy i výtěžku.
Fruktosylové polymery s krátkým řetězcem je možno připravit postupem zahrnujícím:
a) kontakt sacharózy nebo ekvivalentního substrátu s SST podle vynálezu za podmínek umožňu10 jících konverzi na fruktosylové polymery s krátkým řetězcem, a
b) získání fruktosylových polymerů tvořených tímto způsobem.
Povaha vytvořených fruktosylových polymerů závisí na enzymové specifitě fruktosyltransferázy. Když je použita SST podle vynálezu, tvoří se nejspíš kestóza, ale také nystóza a fruktosylnystóza.
Kromě toho se vynález týká fruktosylových polymerů produkovaných rostlinou buňkou nebo rostlinou podle vynálezu nebo získaných z rozmnožovacího materiálu nebo produktů sklizně rostlin nebo rostlinných buněk podle vynálezu nebo získaných výše popsaným způsobem podle vynálezu. Tyto fruktosylové polymery mohou být výhodně použity pro produkci potravin, jako je pečivo nebo těstoviny. Výhodně mohou být tyto fruktosylové polymery použity pro zvýšení viskozity vodných systémů, jako detergenty, jako suspendující činidla nebo pro urychlení sedimentačního procesu a komplexování, ale také pro vázání vody.
Přehled obrázků
Obrázek 1: ukazuje konstrukci plazmidu pB33-cySST.
Vektor: pBinB33 (derivát pBinI9; Bevan, 1984, Nucl. Acids Res., 12:8711) promotor: promotor B33 (Rocha-Sosa et al., 1989, EMBO J., 8: 23-29) donor: Solanum tuberosum kódující úsek: gen SST z Cynars scolymus orientace: sense terminátor: polyadenylační signál z genu oktopinsyntetázy z A.tumefaciens, plazmid pTiACH5 (Gielen et al., 1984, EMBO J., 3: 835-846) donátor: Agrobacterium tumefaciens rezistence: kanamycin
Obrázek 2: ukazuje analýzu rozpustných cukrů v hlízách transgenních rostlin, které byly tvořeny za použití vektorového systému pB33-cySST. Fruktosylové polymery s krátkým řetězcem (zejména 1-kestóza) vytvořené díky genetické modifikaci jsou označeny.
Obrázek 3: ukazuje analýzu rozpustných cukrů v transgenních rostlinách, které byly tvořeny za použití vektorového systému pB33-cySST a p35S-cySST, ve srovnání s rostlinami divokého typu.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Identifikace, izolace a charakterizace cDNA kódující sacharózofruktosyltransferázu závislou na sacharóze z artyčoku (Cynare scolymus)
Z květních disků artyčoku byla izolována celková RNA (Sambrook et al., viz výše). Poly(A)+ mRNA se izolovala za použití mRNA izolačního systému PolyATtract (Promega Corporation,
Madison, WI, USA). Komplementární DNA (cDNA) se syntetizovala z 5 pg této RNA pomocí soupravy pro syntézu „ZAp-cDNA synthesis kit“ od firmy Stratagene podle instrukcí výrobce.
-10CZ 299374 B6
Získalo se 2x106 nezávislých rekombinantních fágů. Amplifikovaná cDNA knihovna se testovala obvyklými metodami pomocí fragmentu DNA značeného 32P a odpovídajícího 3'-konci z 6-SFT cDNA (Sprenger et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 92, 1995, 11652) o délce 392 bp. Tento fragment se získal pomocí RT-PCR (užitím soupravy „RT-PCR Kit“, Stratagene, Heidelberg,
Germany) z kompletní RNA z primárních listů ječmene indukovaných světlem (72 hodin). Pozitivní klony se dále analyzovaly.
Příklad 2
Sekvenční analýza inzertu cDNA plazmidů pCy21
Plazmidová DNA byla izolována z klonu pCy21. Sekvence inzertu cDNA se určovala obvyklými metodami pomocí dideoxynukleotidové metody (Sanger et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 74, 1977, 5463-5467).
Inzert klonu pCy21 je DNA o délce 2055 bp. Nukleotidová sekvence je uvedena v sekvenci id. č. 1. Odpovídající aminokyselinová sekvence je uvedena v sekvenci id. č. 2.
Sekvenční analýza a srovnání sjiž publikovanými sekvencemi ukázaly, že sekvence uvedená v sekvenci id. č. 1 je nová a zahrnuje kódující úsek vykazující homologie s SST z jiných organismů.
Příklad 3
Příprava plazmidů pB33-cySST a zavedení plazmidů do genomu brambory
Plazmid pB33-cySST obsahuje tři fragmenty A, B a C v binárním vektoru pBinl9 (Bevan, 1984, Nucl. Acids. Res., 12: 8711, modifikováno podle Becker, 1990, Nucl. Acids Res., 18: 203) (srov. obr. 1). Fragment A obsahuje promotor B33 patatinového genu b33 z brambory. Obsahuje fragment Dral (pozice -1512 až pozice +14) patatinového genu B33 (Rocha-Sosa et al., 1989, EMBO J., 8:23-29), který je vložen mezi štěpná místa EcoRI a Sací polylinkeru z pBinl9-Hyg.
Fragment B obsahuje kódující úsek sekvence uvedené v sekvenci id. č. 1. Fragment B byl získán jako fragment Notl s tupými konci z vektoru pBluescript SK, ve kterém je vložen do štěpného místa EcoRI prostřednictvím EcoRI/Notl sekvence linkeru. Fragment C obsahuje polyadenylační signál genu 3 zT-DNA Ti plasmidu pTi ACH 5 (Gielen et al., 1984; EMBO J., 3, 835-846), nukleotidy 11749 - 11939, který byl izolován jako fragment Pvu II-Hind III z plazmidů pAGV
40 (Herrera-Estrella et al., 1983, Nátuře, 303, 209 - 213) a klonován mezi štěpná místa Sphl a
Hind III polylinkeru zpBinl9-Hyg po přidání linkerů Sph I ke štěpnému místu PvuII. Plazmid pB33-cySST má velikost přibližně 14 kb. Tento plazmid byl zaveden do Agrobacterium (Hófgen and Willmitzer, Nucleic, Acids Res., 16, 1988, 9877).
Plazmid pB33-cySST byl zaveden do rostlin brambor prostřednictvím genového přenosu vyvolaného Agrobacterium užitím výše popsaných obvyklých metod. Celé rostliny byly regenerovány z transformovaných buněk. Z regenerovaných rostlin byly získány enzymové extrakty a ty byly testovány na přítomnost fruktosylových polymerů. Analýza se prováděla jak popisuje Róber (Planta, 199, 528-536). Analýza hlíz velkého počtu transformovaných rostlin transformovaných tímto vektorem jasně ukázala výskyt fruktosylových polymerů s krátkým řetězcem, zejména 1-kestózy, který může být přisouzen expresí genu SST podle vynálezu (srov. obr. 2).
Příklad 4
Analýza rozpustných cukrů u rostlin divokého typu a transgenních rostlin obsahujících SST
Byly připraveny transgenní rostliny obsahující vektory pB33-cySST a 35S-cySST (mající kódující úsek sekvence id. č. 1 pod kontrolou promotoru 35S) tak, jak je popsáno v příkladu 3.
- 11 CZ 299374 B6
Z transgenních rostlin a z rostlin divokého typu se získaly extrakty a vyšetřovaly se na přítomnost fruktosylových polymerů, viz příklad 3. Analýza HPAEC ukázaná na obrázku 3 dokazuje produkci oligofruktanů. Výsledky jsou shrnuty v následující tabulce 1.
Tabulka 1
Rozpustné cukry (sacharóza a oligofruktan) u rostlin divokého typu (WT) a transgenních rostlin
| Unie | sacharóza | 1-kestóza | nystóza | F-nystóza |
| WT 1 (Désirée) | 2,09 | - | - | - |
| WT 2 (Désirée) | 1,67 | - | - | - |
| B33-cySST 6 | 2,26 | 3,58 | 1,60 | - |
| B33-cySST 54 | 5,13 | 3,06 | 2,90 | 0,23 |
| 35S-cySST 18 | 4,08 | 4,05 | 1,51 | 0,12 |
| 35S-cySST 22 | 4,80 | 4,14 | 2,19 | < 0,1 |
Hodnoty uvedeny v g cukru na kg čerstvé hmotnosti
Jakje zjevné z obrázku 3 a tabulky 1, obsah fruktosylových polymerů, zejména 1-kestózy, převyšuje obsah sacharózy. Tedy pokusy provedené podle předkládaného vynálezu dokazují použi15 telnost molekul nukleové kyseliny vynálezu pro produkci fruktosylových polymerů v transgenních rostlinách.
SEZNAM SEKVENCÍ (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 2226 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: Cynara Scolymus (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 8..1918 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:
- 12CZ 299374 B6
| CCACCAC ATG Met | GCT TCC | TCT ACC ACC ACC CCA CTC CTC CCT CAC CAC CAC | ||||||||||
| Ala | Ser | Ser | Thr 5 | Thr | Thr | Pro Leu Leu 10 | Pro | His | His | His | ||
| 1 | ||||||||||||
| CTT CAG | AAC | CCG | CAA | CAA | CTC | GCC | GGA | TCT CCG GCA | GCT | CAT | CGT | CTA |
| Leu Gin 15 | Asn | Pro | Gin | Gin 20 | Leu | Ala | Gly | Ser Pro Ala 25 | Ala | His | Arg | Leu 30 |
| TCC CGA | CCC | ACA | CTC | CTT | TCT | GGG | ATC | CTT GTT TCG | GTC | CTA | GTC | ATC |
| Ser Arg | Pro | Thr | Leu 35 | Leu | Ser | Gly | Ile | Leu Val Ser 40 | Val | Leu | Val 45 | Ile |
| TGT GCT | CTC | GTT | GCT | GTA | ATC | CAC | AAC | CAA TCA CAG | CAA | CCC | TAC | CAT |
| Cys Ala | Leu | Val 50 | Ala | Val | Ile | His | Asn 55 | Gin Ser Gin | Gin | Pro 60 | Tyr | His |
| GAC GGC | GGA | GCT | AAA | CCC | TCC | TCC | TCC | GCC GCT ACC | ACC | ACC | TTC | CCA |
| Asp Gly | Gly 65 | Ala | Lys | Pro | Ser | Ser 70 | Ser | Ala Ala Thr | Thr 75 | Thr | Phe | Pro |
| ACA GCG | TCG | CCA | GAA | GCT | GGT | TTG | AAA | CGG TTT CCC | ATT | GAG | TTG | AAA |
| Thr Ala 80 | Ser | Pro | Glu | Ala | Gly 85 | Leu | Lys | Arg Phe Pro 90 | Ile | Glu | Leu | Lys |
| ACG AAT | GCT | GAG | GTT | GAG | TGG | CAA | CGC | TCG GCT TAC | CAT | TTT | CAG | CCC |
| Thr Asn 95 | Ala | Glu | Val | Glu 100 | Trp | Gin | Arg | Ser Ala Tyr 105 | His | Phe | Gin | Pro 110 |
| GAT AAG | AAC | TAC | ATT | AGC | GAT | CCT | GAT | GGC CCA ATG | TAT | CAC | ATG | GGG |
| Asp Lys | Asn | Tyr | Ile 115 | Ser | Asp | Pro | Asp | Gly Pro Met 120 | Tyr | His | Met 125 | Gly |
| TGG TAT | CAT | CTC | TTC | TAT | CAG | TAC | AAT | CCA GAG TCT | GCC | ATC | TGG | GGG |
| Trp Tyr | His | Leu 130 | Phe | Tyr | Gin | Tyr | Asn 135 | Pro Glu Ser | Ala | Ile 140 | Trp | Gly |
| AAC ATC | ACA | TGG | GGC | CAC | TCC | GTA | TCC | AAA GAC ATG | ATC | AAC | TGG | TTC |
| Asn Ile | Thr 145 | Trp | cly | His | Ser | Val 150 | Ser | Lys Asp Met | Ile 155 | Asn | Trp | Phe |
| CAT CTC | CCC | TTC | GCC | ATG | GTC | CCT | GAC | CAA TGG TAC | GAT | ATC | GAA | GGT |
| His Leu 160 | Pro | Phe | Ala | Met | Val 165 | Pro | Asp | Gin Trp Tyr 170 | Asp | Ile | Glu | Gly |
| GTC ATG | ACC | GGC | TCC | GCC | ACC | GTC | CTC | CCT GAC GGT | CAG | ATC | ATC | ATG |
| Val Met 175 | Thr | Gly | Ser | Ala 180 | Thr | Val | Leu | Pro Asp Gly 185 | Gin | Ile | Ile | Met 190 |
| CTC TAC | ACC | GGC | AAC | GCG | TAC | GAT | CTC | TCG CAA CTG | CAA | TGC | TTA | GCA |
| Leu Tyr | Thr | Gly | Asn 195 | Ala | Tyr | Asp | Leu | Ser Gin Leu 200 | Gin | Cys | Leu 205 | Ala |
| TAT GCC | GTC | AAC | TCG | TCT | GAT | CCC | CTC | CTC CTC GAT | TGG | AAA | AAG | TAC |
| Tyr Ala | Val | Asn 210 | Ser | Ser | Asp | Pro | Leu 215 | Leu Leu Asp | Trp | Lys 220 | Lys | Tyr |
| GAG GGA | AAT | CCC | ATC | TTG | TTC | CCA | CCT | CCT GGG GTG | GGA | TAC | AAG | GAT |
| Glu Gly | Asn 225 | Pro | Ile | Leu | Phe | Pro 230 | Pro | Pro Gly Val | Gly 235 | Tyr | Lys | Asp |
| TTT CGG | GAC | CCA | TCT | ACA | CTG | TGG | TTG | GGT CCC GAT | GGT | GAA | TAC | AGA |
| Phe Arg | Asp | Pro | Ser | Thr | Leu | Trp | Leu | Gly Pro Asp | Gly | Glu | Tyr | Arg |
240 245 250
145
193
241
289
337
385
433
481
529
577
625 €73
721
769
- 13 CZ 299374 B6
| ATG GTA Met Val 255 | ATG GGG | TCC Ser | AAG CAT AAC GAG ACC ATC Lys His Asn Glu Thr Ile | GGT TGT Gly Cys | GCC Ala | TTG ATT Leu Ile 270 | 817 | |||||||||
| Met | Gly | |||||||||||||||
| 260 | 265 | |||||||||||||||
| TAC | CAT | ACC | ACT | AAT | TTT | ACG | CAT | TTC | GAG | CTC | AAG | GAA | GAG | GTG | CTT | 865 |
| Tyr | His | Thr | Thr | Asn | Phe | Thr | His | Phe | Glu | Leu | Lys | Glu | Glu | Val | Leu | |
| 275 | 280 | 285 | ||||||||||||||
| CAC | GCC | GTT | ccc | CAC | ACG | GGT | ATG | TGG | GAA | TGT | GTG | GAT | CTT | TAT | CCG | 913 |
| His | Ala | Val | Pro | His | Thr | Gly | Met | Trp | Glu | Cys | Val | Asp | Leu | Tyr | Pro | |
| 290 | 295 | 300 | ||||||||||||||
| GTA | TCC | ACC | ACG | CAC | ACA | AAC | GGG | TTG | GAC | ATG | GTG | GAT | AAC | GGG | CCG | 961 |
| Val | Ser | Thr | Thr | His | Thr | Asn | Gly | Leu | Asp | Met | Val | Asp | Asn | Gly | Pro | |
| 305 | 310 | 315 | ||||||||||||||
| AAT | GTG | AAG | CAT | GTG | TTG | AAA | CAA | AGT | GGG | GAT | GAA | GAT | CGA | CAT | GAT | 1009 |
| Asn | Val | Lys | His | Val | Leu | Lys | Gin | Ser | Gly | Asp | Glu | Asp | Arg | His | Asp | |
| 320 | 325 | 330 | ||||||||||||||
| TGG | TAT | GCG | CTC | GGG | ACT | TAT | GAC | GTC | GTG | AAT | GAT | AAG | TGG | TAT | CCA | 1057 |
| Trp | Tyr | Ala | Leu | Gly | Thr | Tyr | Asp | Val | Val | Asn | Asp | Lys | Trp | Tyr | Pro | |
| 335 | 340 | 345 | 350 | |||||||||||||
| GAT | GAC | CCT | GAA | AAC | GAT | GTG | GGT | ATC | GGG | TTA | AGA | TAC | GAT | TTC | GGA | 1105 |
| Asp | Asp | Pro | Glu | Asn | Asp | Val | Gly | Ile | Gly | Leu | Arg | Tyr | Asp | Phe | Gly | |
| 355 | 360 | 365 | ||||||||||||||
| AAG | TTT | TAT | GCG | TCA | AAG | ACG | TTC | TAC | GAC | CAA | CAT | AAG | AAG | AGA | CGG | 1153 |
| Lys | Phe | Tyr | Ala | Ser | Lys | Thr | Phe | Tyr | Asp | Gin | His | Lys | Lys | Arg | Arg | |
| 370 | 375 | 380 | ||||||||||||||
| GTC | CTT | TGG | GGT | TAC | GTT | GGA | GAA | ACC | GAT | CCC | CCT | AAA | TAC | GAC | GTT | 1201 |
| Val | Leu | Trp | Gly | Tyr | Val | Gly | Glu | Thr | Asp | Pro | Pro | Lys | Tyr | Asp | Val | |
| 385 | 390 | 395 | ||||||||||||||
| TAC | AAG | GGA | TGG | GCT | AAC | ATT | TTG | AAC | ATT | CCA | AGG | ACC | ATA | GTT | TTG | 1249 |
| Tyr | Lys | Gly | Trp | Ala | Asn | Ile | Leu | Asn | Ile | Pro | Arg | Thr | Ile | Val | Leu | |
| 400 | 405 | 410 | ||||||||||||||
| GAC | ACG | AAA | ACG | AAT | ACC | AAT | TTG | ATT | CAA | TGG | CCA | ATT | GCG | GAA | GTC | 1297 |
| Asp | Thr | Lys | Thr | Asn | Thr | Asn | Leu | Ile | Gin | Trp | Pro | Ile | Ala | Glu | Val | |
| 415 | 420 | 425 | 430 | |||||||||||||
| GAA | AAC | TTG | AGA | TCG | AAT | AAA | TAC | AAT | GAA | TTC | AAA | GAC | GTG | GAG | CTG | 1345 |
| Glu | Asn | Leu | Arg | Ser | Asn | Lys | Tyr | Asn | Glu | Phe | Lys | Asp | Val | Glu | Leu | |
| 435 | 440 | 445 | ||||||||||||||
| AAA | CCG | GGA | TCA | CTG | ATT | CCG | CTC | GAG | ATA | GGC | ACA | GCA | ACA | CAG | TTG | 1393 |
| Lys | Pro | Gly | Ser | Leu | Ile | Pro | Leu | Glu | Ile | Gly | Thr | Ala | Thr | Gin | Leu | |
| 450 | 455 | 460 | ||||||||||||||
| GAT | ATA | ACT | GCG | ACA | TTC | GAA | GTT | GAT | CAA | ACG | ATG | TTG | GAA | TCG | ACG | 1441 |
| Asp | Ile | Thr | Ala | Thr | Phe | Glu | Val | Asp | Gin | Thr | Met | Leu | Glu | Ser | Thr | |
| 465 | 470 | 475 | ||||||||||||||
| CTT | GAA | GCC | GAT | GTT | TTG | TTC | AAT | TGT | ACG | ACC | AGT | GAA | GGT | TCA | GCC | 1489 |
| Leu | Glu . | Ala , | Asp | Val | Leu | Phe | Asn | Cys | Thr | Thr | Ser | Glu | Gly | Ser | Ala | |
| 480 | 485 | 490 | ||||||||||||||
| GGG , | AGA · | GGG | GTG | TTG | GGG | CCA | TTT | GGA | CTG | GTG | GTT | CTA | GCT | GAT | GCC | 1537 |
| Gly Arg | Gly ' | Val | Leu | Gly | Pro | Phe | Gly | Leu | Val | Val | Leu | Ala | Asp | Ala | ||
| 495 | 500 | 505 | 510 |
14CZ 299374 B6
| GAA Glu | CGA TCT GAG | CAA CTT CCT GTG | TAT TTC TAT ATA GCA AAA GAC ACC | 1585 | ||||||||||||
| Arg | Ser Glu | Gin 515 | Leu | Pro Val | Tyr | Phe 520 | Tyr Ile | Tkla | Lys | Asp Thr 525 | ||||||
| GAT | GGA | TCC | TCA | AAA | ACT | TAC | TTC | TGT | GCC | GAT | GAA | TCA | AGA | TCA | TCG | 1633 |
| Asp | Gly | Ser | Ser | Lys | Thr | Ťyr | Phe | Cys | Ala | Asp | Glu | Ser | Arg | Ser | Ser | |
| 530 | 535 | 540 | ||||||||||||||
| AAC | GAT | GTA | GAC | ATA | GGG | AAA | TGG | GTG | TAC | GGA | AGC | AGT | GTT | CCT | GTT | 1681 |
| Asn | Asp | Val | Asp | Xle | Gly | Lys | Trp | Val | Tyr | Gly | Ser | Ser | Val | Pro | Val | |
| 545 | 550 | 555 | ||||||||||||||
| CTA | GAA | GGC | GAA | AAA | TTC | AAC | ATG | AGG | TTG | CTG | GTG | GAT | CAT | TCA | ATT | 1729 |
| Leu | Glu | Gly | Glu | Lys | Phe | Asn | Met | Arg | Leu | Leu | Val | Asp | His | Ser | Ile | |
| 560 | 565 | 570 | ||||||||||||||
| GTC | GAA | GGC | TTC | GCA | CAA | GGA | GGC | AGA | ACG | GTG | GTG | ACA | TCA | AGA | GTG | 1777 |
| Val | Glu | Gly | Phe | Ala | Gin | Gly | Gly | Arg | Thr | Val | Val | Thr | Ser | Arg | Val | |
| 575 | 580 | 585 | 590 | |||||||||||||
| TAT | CCG | GCG | AAG | GCG | ATC | TAC | GGC | GCT | GCA | AAG | TTA | TTT | TTG | TTC | AAC | 1825 |
| Tyr | Pro | Ala | Lys | Ala | Ile | Tyr | Gly | Ala | Ala | Lys | Leu | Phe | Leu | Phe | Asn | |
| 595 | 600 | 605 | ||||||||||||||
| AAC | GCC | ACC | GGA | ATC | AGC | GTG | AAG | GCA | TCT | CTC | AAG | ATC | TGG | AAA | ATG | 1873 |
| Asn | Ala | Thr | Gly | Ile | Ser | Val | Lys | Ala | Ser | Leu | Lys | Ile | Trp | Lys | Met | |
| 610 | 615 | 620 | ||||||||||||||
| AAG | GAA | GCA | CAA | CTG | GAT | CCA | TTC | CCT | CTT | TCT | GGA | TGG | AGT | TCT | 1918 | |
| Lys | Glu | Ala | Gin | Leu | Asp | Pro | Phe | Pro | Leu | Ser | Gly | Trp | Ser | Ser |
625 630 635
| TGATGATGAT | GATGATTAAG | AACTCATTTC | ATGAAGATGA | TGATTAAGAA | CTCATTTCAT | 1978 |
| GATGATGATG | ATGATTCCAG | TTTATATGCG | TACCCTGTTC | CCTTTACCTG | TATGTGGTGG | 2038 |
| TGGTGGTGAA | ATATGGTTAG | CATGATTCCG | GGTTGGCGAG | GGCAATATGG | TAATTTACTA | 2098 |
| TCGCTGTAGT | AGTACTCCAC | TTGTGAGATT | ATATTTCATA | AATTCAATTA | TTATTCCTGT | 2158 |
| TTACAACCTT | TTTCATTGTA | TCATACCACC | CATTGAATCC | CATCATGTTC | AATTAGTGTT | 2218 |
GCAAAAAA 2226 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 637 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:
| Met | Ala | ser | Ser | Thr | Thr | Thr | Pro | Leu | Leu | Pro | His | His | His | Leu | Gin |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Asn | Pro | Gin | Gin | Leu | Ala | Gly | Ser | Pro | Ala | Ala | His | Arg | Leu | Ser | Arg |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Pro | Thr | Leu | Leu | Ser | Gly | Ile | Leu | Val | Ser | Val | Leu | Val | Ile | Cys | Ala |
40 45
- 15CZ 299374 B6
| Leu | Val 50 | Ala | Val | Ile | His | Asn 55 | Gin | Ser | Gin | Gin | Pro 60 | Tyr | His | Asp | Gly |
| Gly 65 | Ala | Lys | Pro | Ser | Ser 70 | Ser | Ala | Ala | Thr | Thr 75 | Thr | Phe | Pro | Thr | Ala 80 |
| Ser | Pro | Glu | Ala | Gly 85 | Leu | Lys | Arg | Phe | Pro 90 | Ile | Glu | Leu | Lys | Thr 95 | Asn |
| Ala | Glu | Val | Glu 100 | Trp | Gin | Arg | Ser | Ala 105 | Tyr | His | Phe | Gin | Pro 110 | Asp | Lys |
| Asn | Tyr | Ile 115 | Ser | Asp | Pro | Asp | Gly 120 | Pro | Met | Tyr | His | Met 125 | Gly | Trp | Tyr |
| His | Leu 130 | Phe | Tyr | Gin | Tyr | Asn 135 | Pro | Glu | Ser | Ala | Ile 140 | Trp | Gly | Asn | Ile |
| Thr 145 | Trp | Gly | His | Ser | Val 150 | Ser | Lys | Asp | Met | Ile 155 | Asn | Trp | Phe | His | Leu 160 |
| Pro | Phe | Ala | Met | Val 165 | Pro | Asp | Gin | Trp | Tyr 170 | Asp | Ile | Glu | Gly | Val 175 | Met |
| Thr | Gly | Ser | Ala 180 | Thr | Val | Leu | Pro | Asp 185 | Gly | Gin | Ile | Ile | Met 190 | Leu | Tyr |
| Thr | Gly | Asn 195 | Ala | Tyr | Asp | Leu | Ser 200 | Gin | Leu | Gin | cys | Leu 205 | Ala | Tyr | Ala |
| Val | Asn 210 | Ser | Ser | Asp | Pro | Leu 215 | Leu | Leu | Asp | Trp | Lys 220 | Lys | Tyr | Glu | Gly |
| Asn 225 | Pro | Ile | Leu | Phe | Pro 230 | Pro | Pro | Gly | Val | Gly 235 | Tyr | Lys | Asp | Phe | Arg 240 |
| Asp | Pro | Ser | Thr | Leu 245 | Trp | Leu | Gly | Pro | Asp 250 | Gly | Glu | Tyr | Arg | Met 255 | Val |
| Met | Gly | Ser | Lys 260 | His | Asn | Glu | Thr | Ile 265 | Gly | Cys | Ala | Leu | Ile 270 | Tyr | His |
| Thr | Thr | Asn 275 | Phe | Thr | His | Phe | Glu 280 | Leu | Lys | Glu | Glu | Val 285 | Leu | His | Ala |
| Val | Pro 290 | His | Thr | Gly | Met | Trp 295 | Glu | Cys | Val | Asp | Leu 300 | Tyr | Pro | Val | Ser |
| Thr 305 | Thr | His | Thr | Asn | Gly 310 | Leu | Asp | Met | Val | Asp 315 | Asn | Gly | Pro | Asn | Val 320 |
| Lys | His | Val | Leu | Lys | Gin | Ser | Gly | Asp | Glu | Asp | Arg | His | Asp | Trp | Tyr |
- 16CZ 299374 B6
325
330
335
| Ala Leu Gly Thr | Tyr | Asp | Val Val Asn Asp Lys Trp Tyr Pro Asp Asp | ||||||||||||
| 340 | 345 | 35 0 | |||||||||||||
| Pro | Glu | Asn | Asp | Val | Gly | Ile | Gly | Leu | Arg | Tyr | Asp | Phe | Gly | Lys | Phe |
| 355 | 360 | 365 | |||||||||||||
| Tyr | Ala | Ser | Lys | Thr | Phe | Tyr | Asp | Gin | His | Lys | Lys | Arg | Arg | Val | Leu |
| 370 | 375 | 380 | |||||||||||||
| Trp | Gly | Tyr | Val | Gly | Glu | Thr | Asp | Pro | Pro | Lys | Tyr | Asp | Val | Tyr | Lys |
| 385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
| Gly | Trp | Ala | Asn | Ile | Leu | Asn | Ile | Pro | Arg | Thr | Ile | Val | Leu | Asp | Thr |
| 405 | 410 | 415 | |||||||||||||
| Lys | Thr | Asn | Thr | Asn | Leu | Ile | Gin | Trp | Pro | Ile | Ala | Glu | Val | Glu | Asn |
| 420 | 425 | 430 | |||||||||||||
| Leu | Arg | Ser | Asn | Lys | Tyr | Asn | Glu | Phe | Lys | Asp | Val | Glu | Leu | Lys | Pro |
| 435 | 440 | 445 | |||||||||||||
| Gly | Ser | Leu | Ile | Pro | Leu | Glu | Ile | Gly | Thr | Ala | Thr | Gin | Leu | Asp | Ile |
| 450 | 455 | 460 | |||||||||||||
| Thr | Ala | Thr | Phe | Glu | Val | Asp | Gin | Thr | Met | Leu | Glu | Ser | Thr | Leu | Glu |
| 465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
| Ala | Asp | Val | Leu | Phe | Asn | Cys | Thr | Thr | Ser | Glu | Gly | Ser | Ala | Gly Arg | |
| 485 | 490 | 495 | |||||||||||||
| Gly | Val | Leu | Gly | Pro | Phe | Gly | Leu | Val | Val | Leu | Ala | Asp | Ala | Glu | Arg |
| 500 | 505 | 510 | |||||||||||||
| Ser | Glu | Gin | Leu | Pro | Val | Tyr | Phe | Tyr | Ile | Ala | Lys | Asp | Thr | Asp | Gly |
| 515 | 520 | 525 | |||||||||||||
| Ser | Ser | Lys | Thr | Tyr | Phe | Cys | Ala | Asp | Glu | Ser | Arg | Ser | Ser | Asn | Asp |
| 530 | 535 | 540 | |||||||||||||
| Val | Asp | Ile | Gly | Lys | Trp | Val | Tyr | Gly | Ser | Ser | Val | Pro | Val | Leu | Glu |
| 545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
| Gly | Glu | Lys | Phe | Asn | Met | Arg | Leu | Leu | Val | Asp | His | Ser | Ile | Val | Glu |
| 565 | 570 | 575 | |||||||||||||
| Gly | Phe | Ala | Gin | Gly | Gly | Arg | Thr | Val | Val | Thr | Ser | Arg | Val | Tyr | Pro |
| 580 | 585 | 590 | |||||||||||||
| Ala | Lys | Ala | Ile | Tyr | Gly | Ala | Ala | Lys | Leu | Phe | Leu | Phe | Asn | Asn | Ala |
| 595 | 600 | 605 | |||||||||||||
| Thr | Gly | Ile | Ser | Val | Lys | Ala | Ser | Leu | Lys | Ile | Trp | Lys | Met | Lys | Glu |
| 610 | 615 | 620 | |||||||||||||
| Ala | Gin | Leu | Asp | Pro | Phe | Pro | Leu | Ser | Gly | Trp | Ser | Ser |
625 630 635
17CZ 299374 B6 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1911 párů bází (B) TYP: nukleotid (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární io (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /popis = „syntetická DNA“ (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS 15 (B) POZICE: 1..1911 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:
| ATG GCA AGC TCT ACG Met Ala Ser Ser Thr | ACT Thr | ACA CCG TTG TTA CCG CAC | CAC His 650 | CAT His | TTG Leu | CAG Gin | 48 | |||||||||
| Thr | Pro 645 | Leu | Leu Pro | His | ||||||||||||
| 640 | ||||||||||||||||
| AAT | CCT | CAG | CAG | TTG | GCT | GGA | AGT | CCA | GCT | GCA | CAC | AGG | TTG | AGT | CGT | 56 |
| Asn | Pro | Gin | Gin | Leu | Ala | Gly | Ser | Pro | Ala | Ala | His | Arg | Leu | Ser | Arg | |
| 655 | 660 | 665 | ||||||||||||||
| CCT | ACT | CTT | TTG | AGT | GGT | ATA | TTG | GTA | AGT | GTA | CTG | GTC | ATC | TGC | GCA | 144 |
| Pro | Thr | Leu | Leu | Ser | Gly | Ile | Leu | Val | Ser | Val | Leu | Val | Ile | Cys | Ala | |
| 670 | 675 | 680 | 685 | |||||||||||||
| TTG | GTC | GCA | GTT | ATA | CAT | .AAT | CAG | TCT | CAA | CAG | CCA | TAC | CAT | GAT | GGT | 152 |
| Leu | Val | Ala | Val | Ile | His | Asn | Gin | Ser | Gin | Gin | Pro | Tyr | His | Asp | Gly | |
| 690 | 695 | 700 | ||||||||||||||
| GGT | GCC | AAG | CCT | AGC | TCT | AGC | GCT | GCC | ACG | ACT | ACT | TTT | CCT | ACA | GCC | 240 |
| Gly | Ala | Lys | Pro | Ser | Ser | Ser | Ala | Ala | Thr | Thr | Thr | Phe | Pro | Thr | Ala | |
| 705 | 710 | 715 | ||||||||||||||
| AGC | CCT | GAA | GCA | GGA | TTG | AAA | AGA | TTC | CCT | ATC | GAA | CTC | AAG | ACC | AAC | 288 |
| Ser | Pro | Glu | Ala | Gly | Leu | Lys | Arg | Phe | Pro | Ile | Glu | Leu | Lys | Thr | Asn | |
| 720 | 725 | 730 | ||||||||||||||
| GCA | GAA | GTC | GAG | TGG | CAG | AGA | AGT | GCA | TAC | CAC | TTC | CAG | CCA | GAT | AAG | 336 |
| Ala | Glu | Val | Glu | Trp | Gin | Arg | Ser | Ala | Tyr | His | Phe | Gin | Pro | Asp | Lys | |
| 735 | 740 | 745 | ||||||||||||||
| AAC | TAT | ATC | TCA | GAC | CCA | GAC | GGG | CCT | ATG | TAC | CAT | ATG | GGT | TGG | TAC | 384 |
| Asn | Tyr | Ile | Ser | Asp | Pro | Asp | Gly | Pro | Met | Tyr | His | Met | Gly | Trp | Tyr | |
| 750 | 755 | 760 | 765 | |||||||||||||
| CAC | TTA | TTC | TAC | CAA | TAT | AAT | CCA | GAG | AGT | GCA | ATA | TGG | GGA | AAT | ATA | 432 |
| His | Leu | Phe | Tyr | Gin | Tyr | Asn | Pro | Glu | Ser | Ala | Ile | Trp | Gly | Asn | Ile | |
| 770 | 775 | 780 | ||||||||||||||
| ACT | TGG | GGT | CAT | AGC | GTT | AGC | AAG | GAT | ATG | ATT | AAT | TGG | TTT | CAC | TTG | 480 |
| Thr | Trp | Gly | His | Ser | Val | Ser | Lys | Asp | Met | Ile | Asn | Trp | Phe | His | Leu | |
| 795 | 790 | 795 | ||||||||||||||
| CCA | TTT | GCG | ATG | GTC | CCA | GAT | CAA | TGG | TAT | GAT | ATT | GAG | GGC | GTT | ATG | 528 |
| Pro | Phe | Ala | Met | Val | Pro | Asp | Gin | Trp | Tyr | Asp | Ile | Glu | Gly | Val | Met | |
| 900 | 905 | 810 |
18CZ 299374 B6
| ACT Thr | GGA Gly 815 | AGC Ser | GCA Ala | ACT Thr | GTT Val | TTG CCA GAC GGA CAG ATC ATT ATG TTG TAT | 576 | ||||||||
| Leu 820 | Pro | Asp | Gly Gin | Ile 825 | Ile | Met | Leu | Tyr | |||||||
| ACC | GGT | AAT | GCA | TAC | GAC | TTG | AGT | CAG | TTG CAG | TGT | CTC | GCC | TAT | GCC | 624 |
| Thr 830 | Gly | Asn | Ala | Tyr | Asp 835 | Leu | Ser | Gin | Leu Gin 840 | Cys | Leu | Ala | Tyr | Ala 845 | |
| GTT | AAT | AGC | AGC | GAC | CCC | TTG | TTG | ctc | GAT TGG | AAG | AAG | TAC | GAG | GGC | 672 |
| Val | Asn | Ser | Ser | Asp 850 | Pro | Leu | Leu | Leu | Asp Trp 855 | Lys | Lys | Tyr | Glu 860 | Gly | |
| AAT | CCG | ATT | CTC | TTT | CCG | CCT | CCT | GGC | GTC GGA | TAT | AAA | GAT | TTC | AGA | 720 |
| Asn | Pro | Ile | Leu 865 | Phe | Pro | Pro | Pro | Gly 870 | Val Gly | Tyr | Lys | Asp 875 | Phe | Arg | |
| GAT | CCC | AGT | ACT | CTC | TGG | CTC | GGT | CCA | GAC GGA | GAG | TAC | CGT | ATG | GTC | 768 |
| Asp | Pro | Ser 880 | Thr | Leu | Trp | Leu | Gly 885 | Pro | Asp Gly | Glu | Tyr 890 | Arg | Met | Val | |
| ATG | GGC | AGC | AAA | CAC | AAT | GAA | ACA | ATC | GGG TGC | GCA | CTC | ATC | TAT | CAC | 816 |
| Met | Gly 895 | Ser | Lys | His | Asn | Glu 900 | Thr | Ile | Gly Cys | Ala 905 | Leu | Ile | Tyr | His | |
| ACG | ACA | AAC | TTC | ACG | CAC | TTC | GAG | CTC | AAG GAA | GAA | GTC | TTA | CAC | GCT | 864 |
| Thr 910 | Thr | Asn | Phe | Thr | His 915 | Phe | Glu | Leu | Lys Glu 920 | Glu | Val | Leu | His | Ala 925 | |
| GTT | CCT | CAC | ACA | GGA | ATG | TGG | GAG | TGC | GTC GAC | TTA | TAT | CCC | GTC | AGT | 912 |
| Val | Pro | His | Thr | Gly 930 | Met | Trp | Glu | Cys | Val Asp 935 | Leu | Tyr | Pro | Val 940 | Ser | |
| ACT | ACT | CAT | ACG | AAT | GGC | TTG | GAT | ATG | GTC GAC | AAT | GGT | CCC | AAC | GTC | 960 |
| Thr | Thr | His | Thr 945 | Asn | Gly | Leu | Asp | Met 950 | Val Asp | Asn | Gly | Pro 955 | Asn | Val | |
| AAA | CAT | GTC | CTC | AAG | CAG | TCC | GGC | GAC | GAG GAC | AGG | CAC | GAC | TGG | TAC | 1008 |
| Lys | His | Val 960 | Leu | Lys | Gin | Ser | Gly Asp 965 | Glu Asp | Arg | His 970 | Asp | Trp | Tyr | ||
| GCT | TTA | GGT | ACA | TAT | GAC | GTC | GTC | AAC | GAC AAA | TGG | TAT | CCC | GAC | GAT | 1056 |
| Ala | Leu 975 | Gly | Thr | Tyr | Asp | Val 980 | Val | Asn | Asp Lys | Trp 985 | Tyr | Pro | Asp | Asp | |
| CCC | GAG | AAC | GAC | GTC | GGA | ATT | GGC | CTT | CGT TAC | GAC | TTC | GGC | Aa.G | TTC | 1104 |
| Pro 990 | Glu | Asn | Asp | Val | Gly 995 | Ile | Gly | Leu | Arg Tyr Asp 1000 | Phe | Gly | Lys | Phe 1005 | ||
| TAC | GCC | AGT | AAA | ACA | TTC | TAC | GAT | CAG | CAC AAA | AAA | CGT | CGT | GTT | TTA | 1152 |
| Tyr | Ala | Ser | Lys | Thr Phe 1010 | Tyr | Asp | Gin | His Lys 1015 | Lys | Arg | Arg | Val Leu 1020 | |||
| TGG | GGA | TAC | GTC | GGC | GAG | ACG | GAC | CCG | CCC AAA | TAC | GAT | GTC | TAC | AAA | 1200 |
| Trp | Gly | Tyr | Val Gly 1025 | Glu | Thr | Asp | Pro Pro Lys 1030 | Tyr | Asp | Val Tyr 1035 | Lys | ||||
| GGT | TGG | GCA | AAT | ATC | CTC | AAC | ATA | CCT | CGC ACT | ATT | GTC | CTC | GAT | ACG | 1248 |
| Gly | Trp | Ala Asn 1040 | Ile | Leu | Asn | Ile Pro 1045 | Arg Thr | Ile | Val Leu 1050 | Asp | Thr | ||||
| AAG | ACA | AAC | ACG | AAC | CTC | ATA | CAG | TGG | CCT ATT | GCC | GAG | GTG | GAG | AAT | 1296 |
| Lys | Thr Asn 1055 | Thr | Asn | Leu | Tle Gin 1060 | Trp | Pro Ile | Ala 1065 | Glu | Val | Glu | Asn |
19CZ 299374 B6
| TTA CGT AGC AAC AAA | TAC AAC GAG | TTC AAG GAT GTG GAA TTG AAG CCT | 1344 | ||||||||
| Leu Arg 1070 | Ser Asn Lys | Tyr Asn 1075 | Glu | Phe | Lys | Asp Val 1080 | Glu | Leu | Lys | Pro 1085 | |
| GGA AGT | TTG ATT CCG | TTA GAA | ATC | GGT | ACT | GCT ACT | CAA | CTC | GAC | ATC | 1392 |
| Gly Ser | Leu Ile Pro | Leu Glu | Ile | Gly | Thr | Ala Thr | Gin | Leu | Asp | Ile | |
| 1090 | 1095 | 1100 | |||||||||
| ACC GCT | ACT TTT GAG | GTC GAT | CAG | ACC | ATG | CTC GAG | AGT | ACC | TTA | GAA | 1440 |
| Thr Ala | Thr Phe Glu | Val Asp | Gin | Thr | Met | Leu Glu | Ser | Thr | Leu | Glu | |
| 1105 | 1110 | 1115 | |||||||||
| GCG GAC | GTA TTA TTT | AAC TGT | ACC | ACA | TCC | GAG GGG | AGC | GCA | GGT | CGC | 1488 |
| Ala Asp | Val Leu Phe | Asn Cys | Thr | Thr | Ser | Glu Gly | Ser | Ala | Gly Arg | ||
| 1120 | 1125 | 1130 | |||||||||
| GGA GTC | CTT GGT CCA | TTC GGA | CTT | GTC | GTC | TTA GCG | GAC | GCA | GAA | AGA | 1536 |
| Gly Val | Leu Gly Pro | Phe Gly | Leu | Val | Val | Leu Ala | Asp | Ala | Glu | Arg | |
| 1135 | 1140 | 1145 | |||||||||
| AGC GAG | CAG TTG CCC | GTC TAT | TTT | TAC | ATT | GCC AAG | GAC | ACC | GAC | GGT | 1584 |
| Ser Glu | Gin Leu Pro | Val Tyr | Phe | Tyr | Ile | Ala Lys | Asp | Thr | Asp | Gly | |
| 1150 | 1155 | 1160 | 1165 | ||||||||
| TCC AGC | AAG ACA TAC | TTC TGC | GCA | GAT | GAG | TCC CGC | AGC | AGC | AAC | GAC | 1632 |
| Ser Ser | Lys Thr Tyr | Phe Cys | Ala | Asp | Glu | Ser Arg | Ser | Ser | Asn | Asp | |
| 1170 | 1175 | 1180 | |||||||||
| GTC GAT | ATC GGC AAG | TGG GTC | TAT | GGT | TCG | TCA GTC | CCA | GTG | TTG | GAG | 1680 |
| Val Asp | Ile Gly Lys | Trp Val | Tyr | Gly | Ser | Ser Val | Pro | Val | Leu | Glu | |
| 1185 | 1190 | 1195 | |||||||||
| GGA GAG | AAA TTT AAC | ATG CGC | CTG | CTT | GTC | GAC CAC | AGC | ATC | GTC | GAA | 1728 |
| Gly Glu | Lys Phe Asn | Met Arg | Leu | Leu | Val | Asp His | Ser | Ile | Val | Glu | |
| 1200 | 1205 | 1210 | |||||||||
| GGC TTC | GCT CAG GGT | GGC CGT | ACT | GTC | GTA | ACC AGT | CGT | GTC | TAC | CCT | 1776 |
| Gly Phe | Ala Gin Gly | Gly Arg | Thr | Val | Val | Thr Ser | Arg | Val | Tyr | Pro | |
| 1215 | 1220 | 1225 | |||||||||
| GCT AAA | GCC ΑΤΑ TAT | GGG GCA | GCC | AAA | CTC | TTC CTC | TTT | AAT | AAT | GCC | 1824 |
| Ala Lys | Ala Ile Tyr | Gly Ala | Ala | Lys | Leu | Phe Leu | Phe | Asn | Asn | Ala | |
| 1230 | 1235 | 1240 | 1245 | ||||||||
| ACA GGC | ATA TCA GTC | AAA GCC | AGC | TTA | AAA | ATT TGG | AAA | ATG | AAA | GAG | 1872 |
| Thr Gly | Ile Ser Val | Lys Ala | Ser | Leu | Lys | Ile Trp | Lys | Met | Lys | Glu | |
| 1250 | 1255 | 1260 | |||||||||
| GCT CAG | TTG GAC CCG | TTT CCA | TTA | AGC | GGC | TGG TCT | AGC | 1911 | |||
| Ala Gin | Leu Asp Pro | Phe Pro | Leu | Ser | Gly Trp Ser | Ser |
1265 1270 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 637 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:
-20CZ 299374 B6
| Met 1 | Ala | Ser | Ser | Thr 5 | Thr | Thr | Pro | Leu | Leu 10 | Pro | His | His | His | Leu 15 | Gin |
| Asn | Pro | Gin | Gin 20 | Leu | Ala | Gly | Ser | Pro 25 | Ala | Ala | His | Arg | Leu 30 | Ser | Arg |
| Pro | Thr | Leu 35 | Leu | Ser | Gly | Ile | Leu 40 | Val | Ser | Val | Leu | Val 45 | Ile | Cys | Ala |
| Leu | Val 50 | Ala | Val | Ile | His | Asn 55 | Gin | Ser | Gin | Gin | Pro 60 | Tyr | His | Asp | Gly |
| Gly 65 | Ala | Lys | Pro | Ser | Ser 70 | Ser | Ala | Ala | Thr | Thr 75 | Thr | Phe | Pro | Thr | Ala 80 |
| Ser | Pro | Glu | Ala | Gly 85 | Leu | Lys | Arg | Phe | Pro 90 | Ile | Glu | Leu | Lys | Thr 95 | Asn |
| Ala | Glu | Val | Glu 100 | Trp | Gin | Arg | Ser | Ala 105 | Tyr | His | Phe | Gin | Pro 110 | Asp | Lys |
| Asn | Tyr | Ile 115 | Ser | Asp | Pro | Asp | Gly 120 | Pro | Met | Tyr | His | Met 125 | Gly | Trp | Tyr |
| His | Leu 130 | Phe | Tyr | Gin | Tyr | Asn 135 | Pro | Glu | Ser | Ala | Ile 140 | Trp | Gly | Asn | Ile |
| Thr 145 | Trp | Gly | His | Ser | Val 150 | Ser | Lys | Asp | Met | Ile 155 | Asn | Trp | Phe | His | Leu 160 |
| Pro | Phe | Ala | Met | Val 165 | Pro | Asp | Gin | Trp | Tyr 170 | Asp | Ile | Glu | Gly | Val 175 | Met |
| Thr | Gly | Ser | Ala 180 | Thr | Val | Leu | Pro | Asp 185 | Gly | Gin | Ile | Ile | Met 190 | Leu | Tyr |
| Thr | Gly | Asn 195 | Ala | Tyr | Asp | Leu | Ser 200 | Gin | Leu | Gin | Cys | Leu 205 | Ala | Tyr | Ala |
| Val | Asn 210 | Ser | Ser | Asp | Pro | Leu 215 | Leu | Leu | Asp | Trp | lys 220 | Lys | Tyr | Glu | Gly |
| Asn 225 | Pro | Ile | Leu | Phe | Pro 230 | Pro | Pro | Gly | Val | Gly 235 | Tyr | Lys | Asp | Phe | Arg 240 |
| Asp | Pro | Ser | Thr | Leu 245 | Trp | Leu | Gly | Pro | Asp 250 | Gly | Glu | Tyr | Arg | Met 255 | Val |
| Met | Gly | Ser | Lys 260 | His | Asn | Glu | Thr | Ile 265 | Gly | Cys | Ala | Leu | Ile 270 | Tyr | His |
| Thr | Thr | Asn 275 | Phe | Thr | His | Phe | Glu 280 | Leu | Lys | Glu | Glu | Val 285 | Leu | His | Ala |
| Val | Pro 290 | His | Thr | Gly | Met | Trp 295 | Glu | Cys | Val | Asp | Leu 300 | Tyr | Pro | Val | Ser |
-21 CZ 299374 B6
| Thr 305 | Thr | His | Thr | Asn | Gly 310 | Leu | Asp | Met | Val | Asp 315 | Asn | Gly | Pro | Asn | Val 320 |
| Lys | His | Val | Leu | Lys 325 | Gin | Ser | Gly | Asp | Glu 330 | Asp | Arg | His | Asp | Trp 335 | Tyr |
| Ala | Leu | Gly | Thr 340 | Tyr | Asp | Val | Val | Asn 345 | Asp | Lys | Trp | Tyr | Pro 350 | Asp | Asp |
| Pro | Glu | Asn 355 | Asp | Val | Gly | Ile | Gly 360 | Leu | Arg | Tyr | Asp | Phe 365 | Gly | Lys | Phe |
| Tyr | Ala 370 | Ser | Lys | Thr | Phe | Tyr 375 | Asp | Gin | His | Lys | Lys 380 | Arg | Arg | Val | Leu |
| Trp 385 | Gly | Tyr | Val | Gly | Glu 390 | Thr | Asp | Pro | Pro | Lys 395 | Tyr | Asp | Val | Tyr | Lys 400 |
| Gly | Trp | Ala | Asn | Ile 405 | Leu | Asn | Ile | Pro | Arg 410 | Thr | Ile | Val | Leu | Asp 415 | Thr |
| Lys | Thr | Asn | Thr 420 | Asn | Leu | Ile | Gin | Trp 425 | Pro | Ile | Ala | Glu | Val 430 | Glu | Asn |
| Leu | Arg | Ser 435 | Asn | Lys | Tyr | Asn | Glu 440 | Phe | Lys | Asp | Val | Glu 445 | Leu | Lys | Pro |
| Gly | Ser 450 | Leu | Ile | Pro | Leu | Glu 455 | Ile | Gly | Thr | Ala | Thr 460 | Gin | Leu | Asp | Ile |
| Thr 465 | Ala | Thr | Phe | Glu | Val 470 | Asp | Gin | Thr | Met | Leu 475 | Glu | Ser | Thr | Leu | Glu 480 |
| Ala | Asp | Val | Leu | Phe 485 | Asn | cys | Thr | Thr | Ser 490 | Glu | Gly | Ser | Ala | Gly 495 | Arg |
| Gly | Val | Leu | Gly 500 | Pro | Phe | Gly | Leu | Val 505 | Val | Leu | Ala | Asp | Ala 510 | Glu | Arg |
| Ser | Glu | Gin 515 | Leu | Pro | Val | Tyr | Phe 520 | Tyr | Ile | Ala | Lys | Asp 525 | Thr | Asp | Gly |
| Ser | Ser 530 | Lys | Thr | Tyr | Phe | Cys 535 | Ala | Asp | Glu | Ser | Arg 540 | Ser | Ser | Asn | Asp |
| Val 545 | Asp | Ile | Gly | Lys | Trp 550 | Val | Tyr | Gly | Ser | Ser 555 | Val | Pro | Val | Leu | Glu 560 |
| Gly | Glu | Lys | Phe | Asn 565 | Met | Arg | Leu | Leu | Val 570 | Asp | His | Ser | Ile | Val 575 | Glu |
| Gly | Phe | Ala | Gin 580 | Gly | Gly | Arg | Thr | Val 585 | Val | Thr | Ser | Arg | Val 590 | Tyr | Pro |
| Ala | Lys | Ala 595 | Ile | Tyr | Gly | Ala | Ala 600 | Lys | Leu | Phe | Leu | Phe 605 | Asn | Asn | Ala |
| Thr | Gly | Ile | Ser | Val | Lys | Ala | Ser | Leu | Lys | Ile | Trp | Lys | Met | Lys | Glu |
610 615 620
-22CZ 299374 B6
Ala Gin Leu Asp Pro Phe Pro Leu Ser Gly Trp Ser Ser 625 630 635
PATENTOVÉ NÁROKY
1. Molekula nukleové kyseliny kódující sacharózofruktosyltransferázu závislou na sacharóze
Claims (4)
Hide Dependent
translated from
Claims (4)
Hide Dependent
translated from
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Molekula nukleové kyseliny kódující sacharózofruktosyltransferázu závislou na sacharóze ío (SST), která je vybrána ze skupiny obsahující:a) molekuly nukleové kyseliny kódující protein, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou jako sekvenci identifikačního čísla 2 a 4,b) molekuly nukleové kyseliny, které obsahují nukleotidovou sekvenci uvedenou jako sekvenci identifikačního čísla 1 nebo odpovídající ribonukleotidovou sekvenci,15 c) molekuly nukleové kyseliny, které obsahují nukleotidovou sekvenci uvedenou jako sekvenci identifikačního čísla 3 nebo odpovídající ribonukleotidovou sekvenci, ad) molekuly nukleové kyseliny, které obsahují fragment molekul nukleové kyseliny uvedených v a) až c) kódující protein, který je schopen katalyzovat vytvoření β-2,1-glykosidických nebo 3-2,6-glykosidických vazeb mezi fruktózovými jednotkami.
- 2. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 1, která je molekula DNA.
- 3. Molekula DNA podle nároku 2, která je molekula cDNA.25 4. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 1, která je molekula RNA.5. Vektor, který obsahuje molekulu nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4.6. Vektor podle nároku 5, kde molekula nukleové kyseliny je operativně spojena s regulačním30 prvkem, který dovoluje transkripci a syntézu translatovatelné RNA v prokaryotických a/nebo eukaryotických buňkách.7. Vektor podle nároku 6, kde regulační prvek je odvozen z patatinového promotoru B33.35 8. Hostitelská buňka, která je transformovaná molekulou nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 nebo vektorem podle kteréhokoliv z nároků 6 nebo 7, nebo buňka, která pochází z takové buňky a obsahuje molekulu nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 nebo vektor podle kteréhokoliv z nároků 6 nebo 7.40 9. Způsob přípravy SST, vyznačující se tím, že hostitelská buňka podle nároku 8 se kultivuje v podmínkách, které dovolují syntézu SST a SST se izoluje z kultivovaných buněk a/nebo kultivačního média.10. SST, která je kódována molekulou nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4,45 nebo která je připravena způsobem podle nároku 9.11. Transgenní rostlinná buňka, která je transformovaná molekulou nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 nebo vektorem podle kteréhokoliv z nároků 6 nebo 7, nebo která pochází z takové buňky, přičemž molekula nukleové kyseliny kódující SST z artyčoku je řízena50 regulačním prvkem, který umožňuje transkripci translatovatelné RNA v rostlinných buňkách.-23CZ 299374 B612. Rostlina, která obsahuje rostlinné buňky podle nároku 11.13. Rostlina podle nároku 12, kterou je rostlina pšenice, ječmene, rýže, kukuřice, řepy cukrové nebo cukrové třtiny.14. Rostlina podle nároku 12, kterou je rostlina bramboru.15. Rostlinný rozmnožovací materiál z rostliny podle kteréhokoliv z nároků 12 až 14, který obsahuje rostlinné buňky podle nároku 11.16. Způsob přípravy 1-kestózy, nystózy a/nebo fruktosylnystózy, vyznačující se tím, že obsahujea) kultivaci hostitelské buňky podle nároku 8 nebo rostlinné buňky podle nároku 11 v podmínkách, které dovolují produkci SST a konverzi, pokud je to třeba, externě přidané sacharózy nebo15 ekvivalentního substrátu na 1-kestózu, nystózu a/nebo fruktosylnystózu, ab) získání tímto způsobem tvořené 1-kestózy, nystózy a/nebo fruktosylnystózy zkultivovaných buněk nebo média.17. Způsob přípravy 1-kestózy, nystózy a/nebo fruktosylnystózy, vyznačující se tím, 20 že obsahujea) působení SST podle nároku 10 na sacharózu nebo ekvivalentní substrát v podmínkách dovolujících konverzi na 1-kestózu, nystózu a/nebo fruktosylnystózu, ab) získání takto tvořené 1-kestózy, nystózy a/nebo fruktosylnystózy.25 18. Způsob přípravy 1-kestózy, nystózy a/nebo fruktosylnystózy, vy z n a č uj í c í se tím, že obsahujea) kultivaci rostliny podle kteréhokoliv z nároků 12 až 14, ab) získání 1-kestózy, nystózy a/nebo fruktosylnystózy z těchto rostlin nebo jejich rozmnožovacího materiálu podle nároku 15.
- 4 výkresy-24CZ 299374 B6Sall(Pstl Sphl) HindllllEcoRI (Sací)1500 bp2200 bp 215 bp pBinl 9Obr. 1-25CZ 299374 B6
3 3 x· »< »< Φ W tn w r* <·+ θ’ O’ O’ N N N w w 0) o ar C a> 3Γ r* O' O< N N 0) 0) Std.WT1Cy 6Cy 51Cy 54Cy 11Cy 42Cy 27WT2Obr. 2