CN1705748A - 用于增加植物中总的油类水平的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物遗传学和生物化学领域。更准确地说，本发明涉及影响植物中油类水平和组成的基因。特别地，本发明指向用于增加植物和种子中油类水平的方法。另外，本发明包括并提供用于生产脂肪酸组成改变的植物并获得这种种子的方法。

Description

用于增加植物中总的油类水平的方法
本申请要求于8/12/2002提交的美国临时申请60/402,527的优先权，其在此全部引入作为参考。
                      发明领域
本发明属于植物遗传学和生物化学领域。更准确地说，本发明涉及植物中总的油类水平。特别地，本发明指向用于增加植物和种子中油类水平以及改变油类组成的方法。另外，本发明包括并提供用于生产具有增加的油类水平的植物并获得这种种子的方法。这种植物和种子也可显示出基本上未改变的蛋白质组成。
                       背景
植物油类具有广泛的各种应用。例如，大豆油类已经被用于各种沙拉和烹调油，甚至生物柴油和生物润滑油等应用。种子油类几乎全部是由三酰基甘油组成的，其中使脂肪酸酯化至甘油的3个羟基中的每一个。用作种子储备的三酰基甘油在有限的体积内使贮能的数量最大化，因为脂肪酸是高度还原形式的碳(Miquel and Browse，in  Seed Development and Germination，Galili et al.(eds.)，Marcel Dekker，New York，pp.169-193，1994)。在自然界中发现了大量不同的脂肪酸结构(Gunstone et al.， The Lipid Handbook，Chapman & Hall，London，1994；Hilditch and Williams， The Chemical Constituents of Natural Fats，Chapman & Hall，London，1964；Murphy， Designer Oil Crops，VCH，Weinheim，1994；van de Loo et al.，Proc.Natl Acad.Sci.USA，92：6743-6747，1993)，但是只有5种占所生产的商品化植物油的90％：棕榈酸(16∶0)、硬脂酸(18∶0)、油酸(18∶1)、亚油酸(18∶2)、α-亚麻酸(18∶3)。
控制植物或植物部分，例如种子的总的油类水平的因素是复杂的。因而，选择总油类增加的植物经常是费力的过程，并且所得到的植物经常显示出相当大的植物-与-植物间变异(Jensen，PlantBreeding Methodology，John Wiley & Sons，Inc.，USA，1988)。此外，对于总油类增加的选种经常导致种子蛋白质部份的减少。因此，需要用于生产总的油类增加的植物，特别是也产生蛋白水平基本上未改变的植物的方法。
                         发明概述
本发明包括并提供用于增加种子中总的油类水平的方法，包括：(A)用核酸构建体转化植物，该核酸构建体包括作为可操作地连接成分的启动子、能够调节FAD2 mRNA或FAD2蛋白质水平的结构性核酸序列；以及(B)使该植物生长。
本发明包括并提供用于增加种子中总的油类的方法，包括：(A)用核酸构建体转化植物，该核酸构建体包括作为可操作地连接成分的启动子、能够增加油酸水平的结构性核酸序列；以及(B)使该植物生长。
本发明包括并提供用于获得总的油类水平增加的种子的方法，包括：(A)使FAD2蛋白质或FAD2mRNA水平被调节的植物生长；以及(B)从该植物获得种子。
本发明包括并提供用于增加种子中总的油类百分比的方法，包括：(A)用核酸构建体转化植物，该核酸构建体包括作为可操作地连接成分的启动子、能够调节FAD2mRNA或FAD2蛋白质水平的结构性核酸序列；以及(B)使该植物生长。
本发明包括并提供用于生产总的油类百分比增加的植物的方法，包括：(A)使FAD2蛋白质或FAD2mRNA水平改变的第一植物与第二植物杂交以产生分离的群体；(B)筛选分离的群体获得总的油类百分数增加的成员；以及(C)选择所述的成员。
本发明包括并提供嵌合的基因，其包括可操作地连接的、编码δ-12脱氢酶的分离的核酸片段或任何功能等效的亚片段或这种片段或亚片段的反向互补序列，并且其中这种组合的表达导致总的油类的增加。
本发明也包括包含多种嵌合基因的植物及其植物部分、这种植物的种子、从这种植物的谷粒获得的油类、来源于这种谷粒加工的动物饲料、上述油类在食品中的用途、动物饲料、烹饪用油或工业应用、由这种油类的氢化作用、分级分离、酯交换或水解制备的产物以及用于改善动物尸体(carcass)质量的方法。
                       附图简述
图1描绘了构建体pMON67563。
图2描绘了pMON67563和pCGN9979对照品系中总的油类的百分比与油酸(18∶1)的相关性。
图3描绘了拟南芥属(Arabidopsis)种子中油酸(18∶1)水平与总的油类的百分比的对照。
图4描绘了来自表达FAD2 dsRNAi抑制构建体的转基因品系(右侧的)对照包含空载体的对照品系(左侧的)的T3种子中平均(SEM)的油类百分比。
图5描绘了构建体pMON67589。
图6描绘了构建体pMON67591。
图7描绘了构建体pMON67592。
图8描绘了构建体pMON68655。
图9描绘了构建体pMON68656。
                          发明详述
定义
如在此所使用的，″总的油类水平″是指总的脂肪酸聚集量，而不考虑脂肪酸的种类。
如在此所使用的，术语″基因″是用来指包括与基因产物表达相关的5′启动子区、任何内含子和外显子区以及与基因产物表达相关的3′非翻译区的核酸序列。
如在此所使用的，″FAD2″、″Δ12脱氢酶″或″ω-6脱氢酶″是能够催化使双键插入到从羧基端数起第12位的脂肪酰基部分中的酶。
术语″亚片段是功能等效的″和″功能等效的亚片段″在此是可互换使用的。这些术语是指保持改变基因表达或产生某一表型的能力的分离核酸片段的部分或亚序列，而无论该片段或亚片段是否编码活性的酶。例如，可使用该片段或亚片段来设计嵌合的基因以在转化的植物中产生所需要的表型。可通过连接核酸片段或其亚片段来设计嵌合的基因而用于共抑制或反义，不管它是否以相对于植物启动子序列为合适的方向而编码活性的酶。
术语″非编码的″是指不编码部分或全部的所表达蛋白质的核酸分子的序列。非编码的序列包括但不限于内含子、启动子区、3′非翻译区、和5′非翻译区。
如在此所使用的，术语″内含子″是指该术语的常规含义，如是指核酸分子，通常为DNA的片段，其不编码部分或全部的所表达蛋白质，并且在内源的条件下，被转录成RNA分子，但是在RNA被翻译成蛋白质前，其从内源RNA中剪接出来。
如在此所使用的，术语″外显子″是指该术语的常规含义，如是指核酸分子，通常为DNA的片段，其编码部分或全部的表达蛋白质。
如在此所使用的，当在此是指蛋白质和核酸时，使用普通的大写，例如″FAD2″表明是指酶、蛋白质、多肽、或肽，而使用斜体的大写，例如，″FAD2″是用来指核酸，包括但不限于基因、cDNAs、和mRNAs。
如在此所使用的，″可操作地连接″指一个或多个核酸序列的启动子能够驱动一个或多个核酸序列的表达，包括以多顺反子构型的方式排列的多重编码的或非编码的核酸序列。
如在此所使用的，术语核酸序列的互补序列是指伴随其全部长度的序列的互补序列。
如在此所使用的，除非另有说明，任何所列出的范围包括该范围的端点。
本领域的技术人员可参考用于详细描述在此所论述的已知技术或等同技术的综合性参考教科书。这些教科书包括Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Inc.，1995；Sambrook et al.Molecular Cloning，A Laboratory Manual(2d ed.)，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，New York，1989；Birren et al.Genome Analysis：A Laboratory Manual，volumes1 through 4，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NewYork，1997-1999；Plant Molecular Biology：A Laboratory Manual，Clark(ed.)，Springer，New York，1997；Richards et al.PlantBreeding Systems(2d ed.)，Chapman & Hall，The University Press，Cambridge，1997；和Maliga et al.，Methods in Plant MolecularBiology，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，New York，1995。当然在实施本发明时也可参考这些文献。
本发明包括并提供用于增加种子中总的油类水平的方法，包括：(A)用核酸构建体转化植物，该核酸构建体包括作为可操作地连接成分的启动子、能够调节FAD2 mRNA或FAD2蛋白质水平的结构性核酸序列；以及(B)使该植物生长。结构性的核酸序列可选自SEQ ID NOS：1、4、7-11、14、19、22、25或26或其反向互补序列、其任何功能等效的亚片段或所述片段或亚片段的反向互补序列。
本发明包括并提供用于增加种子中总的油类水平的方法。总的油类的增加可以是任何量的增加。总的油类的增加可能是改变增加油酸水平(18∶1)的任何酶或转录本的水平的结果。在优选的方面，总的油类增加是在种子或种子收集物中发现的总的油类和在第二代或后代的种子或种子收集物中测量的总的油类之间的百分比增加。如在此所使用的，以种子或种子收集物中发现的总的油类和在第二代或后代的种子或种子收集物中测量的总的油类之间的差异来计算增加的百分比。在特别优选的方面，相对于来自具有相似遗传背景，但缺乏能够影响油酸(18∶1)水平的结构性核酸序列的植株种子来测量总的油类的增加。在另一个特别优选的方面，相对于来自具有相似遗传背景，但缺乏能够调节FAD2mRNA或FAD2蛋白质水平的结构性核酸序列的植株种子来测量总的油类的增加。
当比较因子的水平时，优选在具有相似遗传背景的生物体之间进行这种比较。在优选的方面，相似的遗传背景是在该背景中待比较的生物体共用50％或更多的其核遗传物质。在更优选的方面，相似的遗传背景是在该背景中待比较的生物体共用75％或更多的，更优选为90％或更多的其核遗传物质。在另一个更优选的方面，相似的遗传背景是在该背景中待比较的生物体是植物，并且除了利用植物转化技术最初导入任何遗传物质外，该植物是等基因的。
在另一个方面，在通过使2种植物杂交而产生的植物种子中检测增加，并且相对于用来产生所述植物(即亲本)的一种或多种植物的一个或多个种子检测植物种子中的增加。
可通过任何合适的方法测量总的油类水平。例如，但不限于，经常用常规方法进行种子含油量的定量，例如近红外的分析(NIR)、核磁共振成像(NMR)、索格利特(soxhlet)萃取、加速的溶剂萃取(ASE)、微波提取、和超临界的流体提取。当令人感兴趣的样品接受这些技术的检验时，近红外的(NIR)分光术已经成为用于筛选种子样品的标准方法。研究的样品包括小麦、玉米、大豆、芸苔、水稻、苜蓿、燕麦等。
可使用单个种子的近红外分析(参见Velasco et al.，″Estimationof Seed Weight，Oil Content and Fatty Acid Composition in IntactSingle Seeds of Rapeseed(Brassica napus L.)by Near-InfraredReflectance Spectroscopy，″Euphytica，Vol.106，1999，pp.79-85；Delwiche，″Single Wheat Kernel Analysis by Near-InfraredTransmittance：Protein Content，″Analytical Techniques andInstrumentation，Vol.72，1995，pp.11-16；Dowell，″AutomatedColor Classification of Single Wheat Kernels Using Visible andNearInfrared Reflectance，″Vol.75(1)，1998，pp.142-144；Dowell et al.，″Automated Single Wheat Kernel Quality MeasurementUsing Near-Infrared Reflectance，″ASAE Annual InternationalMeeting，1997，paper number 973022，其所有内容在此全部引入作为参考)。也已经使用NMR来分析种子中的含油量(参见，例如，Robertson and Morrison，″Analysis of Oil Content of SunflowerSeed by Wide-Line NMR，″Journal of the American Oil ChemistsSociety，1979，Vol.56，1979，pp.961-964，其在此全部引入作为参考)。
其他的技术，包括索格利特萃取，加速的溶剂萃取(ASE)、微波提取、和超临界的流体提取可用于确定含油量。一些技术使用重量分析法作为最终的测量步骤(参见，例如，Taylor et al.，″Determination of Oil Content in Oilseeds by AnalyticalSupercritical FluidExtraction，″Vol.70(No.4)，1993，pp.437-439，其在此全部引入作为参考)。然而重量分析法不适用于小的样品，包括小的种子和含油量小的种子，因为这些样品中的油类水平低于该技术的最小灵敏度水平。此外，重量分析法的使用是耗时的，并且不适于高通量的自动控制。
本发明的方法可用于增加任何种子中总的油类水平。在优选的实施方案中，种子包括胚乳或胚胎。在优选的实施方案中，种子包括胚乳和胚胎。种子可来自于双子叶植物或单子叶植物。在优选的实施方案中，种子可选自拟南芥属种子、芸苔属种子、Canola(canola)种子、玉米种子、油棕种子、油菜籽、花生种子、菜籽种子、红花籽、大豆种子、和向日葵籽，而拟南芥属种子、芸苔属种子、Canola种子、玉米种子、和大豆种子是特别优选的。
对植物的转化可能受到导致将构建体导入植物的任何方式的影响。用于将所需要的多核苷酸序列导入植物细胞的多种方法是可利用的并且对于本领域的技术人员是公知的，这些方法包括但不限于：(1)物理方法，例如微注射、电穿孔、和微粒介导的递送(生物导弹或基因枪技术)；(2)病毒介导的递送方法；以及(3)土壤杆菌介导的转化方法。
用于转化植物细胞的最通常使用的方法是土壤杆菌介导的DNA转移过程以及生物导弹或微粒轰击介导的方法(即，基因枪)。一般地，核转移是合乎需要的，但是其中需要特异性转化的质体，例如叶绿体或淀粉体，可利用微粒介导递送所需要的多核苷酸来转化植物质体。
通过使用遗传工程化的属于土壤杆菌属(Agrobacterium)的土壤细菌来获得土壤杆菌-介导的转化。可使用具有Ti或Ri质粒的根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)和发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的许多野生型和卸甲(disarmed)菌株用于将基因转移到植物中。通过将可被遗传工程化地携带任何所需要的DNA片段、称为″T-DNA″的特异DNA转移到许多植物品种中而进行基因转移。
对植物的土壤杆菌-介导的基因转化包括几个步骤。第一步通称为″接种″，其中首次将有毒性的土壤杆菌与植物细胞相互接触。接种后，允许土壤杆菌和植物细胞/组织在适于生长和T-DNA转移的条件下在一起生长几个小时至几天以上的一段时期。该步骤称为″共培养″。共培养和T-DNA递送后，用灭菌剂或抑菌剂处理植物细胞以杀死与外植体保持接触或包含外植体的容器中的土壤杆菌。如果在缺乏任何选择性因子促进转基因植物细胞对照非转基因植物细胞优先生长的情况下进行该步骤，则这一般被称为″延迟″步骤。如果在存在选择压力帮助转基因植物细胞生长的情况下进行该步骤，则其被称为″选择″步骤。当使用″延迟″时，一般其后是一个或多个″选择″步骤。
就微粒轰击而言(美国专利号5,550,318；美国专利号5,538,880；美国专利号5,610,042；以及PCT公开WO 95/06128；其每个在此全部具体地引入作为参考)，颗粒用核酸包涂并通过推进力递送到细胞中。例证性的颗粒包括由钨、铂以及优选黄金组成的颗粒。
通过加速递送DNA到植物细胞中的方法的例证性实施方案是生物导弹微粒输送系统(BioRad，Hercules，CA)，其可用于推进涂有DNA的微粒或细胞经过例如不锈钢或Nytex的筛子，到达覆盖悬浮培养的植物细胞的过滤表面上。
微粒轰击技术是广泛适用的，并且可用来转化几乎任何的植物品种。已经通过微粒轰击转化的种属的实施例包括单子叶植物种属，例如玉米(PCT公开WO 95/06128)、大麦、小麦(美国专利号5,563,055，其在此全部具体地引入作为参考)、水稻、燕麦、黑麦、甘蔗、和高粱；以及许多双子叶植物包括烟草、大豆(美国专利号5,322,783，其在此全部具体地引入作为参考)、向日葵、花生、棉花、番茄、和一般的豆类(美国专利号5,563,055，其在此全部具体地引入作为参考)。
为了选择或记录转化的植物细胞而不考虑其转化方法，导入细胞的DNA可包含在可再生的植物组织中起作用的基因以产生赋予植物组织对其他有毒化合物的抗性的化合物。用作可选择的、可筛选的、或可记录的标记的令人感兴趣的基因包括但不限于GUS、绿色荧光蛋白(GFP)、荧光素酶(LUX)、抗生素或除草剂耐受性基因。抗生素抗性基因的实例包括青霉素、卡那霉素(和新霉素、G418、博来霉素)；氨甲蝶呤(和三甲氧苄氨嘧啶)；氯霉素；卡那霉素和四环素。
对来自多种转化外植体的植株的再生、发育、和栽培在本领域中是已有文献记录。这个再生和生长过程一般包括选择转化细胞和培养个别细胞经过胚胎发育的通常阶段到生根幼苗阶段的步骤。
类似地再生转基因的胚胎和种子。其后将所得到的转基因的生根枝条种植在合适的植物生长培养基，例如土壤中。当暴露于选择性的因子时仍然存活的细胞、或已经在筛选分析中记录为阳性的细胞，可在支持植物再生的培养基中培养。将发育的幼苗在转入用于成熟的温室或生长箱之前转入较少土壤的植物生长混合物，并茁壮生长。
本发明可用于任何可变化的细胞或组织。通过如在此所使用的，可变化的是指细胞或组织能够进一步地繁殖而产生植株。本领域的技术人员可以认识到许多植物细胞或组织是可变化的，其中在插入外源DNA后，以及在合适的培养条件下该植物细胞或组织可形成分化的植株。适用于这些目的的组织可包括但不限于未成熟的胚胎、角质鳞片组织、悬浮的细胞培养物、未成熟的花序、芽分生组织、结节的外植体、愈伤组织、胚轴组织、子叶、根和叶片。
可使用任何合适的植物栽培培养基。合适的培养基的实例包括但不限于基于MS的培养基(Murashige and Skoog，Physiol.Plant，15：473-497，1962)或基于N6的培养基(Chu et al.，Scientia Sinica18：659，1975)，其中补充附加的植物生长调节剂，包括但不限于茁长素、细胞分裂素、ABA和赤霉素。本领域的技术人员熟知当对哪些品种的组织培养基进行适当地补充时，其可支持植物组织的生长发育，并且适合于植物的转化和再生。可作为商品化的制剂购买，或常规制备以及改进这些组织培养基。本领域的技术人员可认识到培养基和培养基补充物，例如用于转化和再生的养分和生长调节剂，以及其它培养条件，例如培养期间的光照强度、pH、和催青温度可针对特定的目标品种而进行优化。
构建体或载体可包括植物启动子以表达所选择的核酸分子。在优选的实施方案中，在此所描述的任何核酸分子能够可操作地与在植物细胞中起作用以促使产生mRNA分子的启动子区相连。例如，可使用在植物细胞中起作用以促使产生mRNA分子的任何启动子，例如在此所描述的启动子但不只限于此。在优选的实施方案中，该启动子是植物启动子。
在文献中已经描述了许多在植物细胞中有活性的启动子。这些启动子包括但不限于胭脂碱合酶(NOS)启动子(Ebert et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)84：5745-5749，1987)、章鱼碱合酶(OCS)启动子(其被携带在根瘤土壤杆菌的肿瘤诱导的质粒上)、花椰菜花叶病毒启动子，例如花椰菜花叶病毒(CaMV)19S启动子(Lawton et al.，plant Mol，Biol，9：315-324，1987)和CaMV 35S启动子(Odell etal.，Nature 313：810-812，1985)、玄参花叶病毒35S-启动子(美国专利号5,378,619)、来自核酮糖-1，5-双-磷酸酯羧化酶小亚基(ssRUBISCO)的光可诱导的启动子、Adh启动子(Walker et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)84：6624-6628，1987)、蔗糖合酶启动子(Yang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)87：4144-4148，1990)、R基因复合体启动子(Chandler et al.，The Plant Cell1：1175-1183，1989)和叶绿素a/b结合蛋白基因启动子。这些启动子已经用于产生在植物中表达的DNA构建体；参见例如PCT公开WO84/02913。优选CaMV 35S启动子用于植物。已知的或发现导致植物细胞中DNA转录的启动子可被用于本发明。
其他的启动子也可用来在特异的组织，例如种子或果实中表达多肽。实际上，在优选的实施方案中，所使用的启动子是种子特异性的启动子。这种启动子的实例包括来自下列基因的5′调节区，如napin(Kridl et al.，Seed Sci.Res.1：209：219，1991)、菜豆蛋白(Bustos et al.，Plant Cell，1(9)：839-853，1989)、大豆胰蛋白酶抑制物(Riggs et al.，Plant Cell 1(6)：609-621，1989)、ACP(Baerson et al.，Plant Mol.Biol.，22(2)：255-267，1993)、硬脂酰-ACP脱氢酶(Slocombe et al.，Plant Physio.104(4)：167-176，1994)、β-伴大豆球蛋白的大豆a′亚基(P-Gm7S，参见例如，Chen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.83：8560-8564，1986)、蚕豆(Vicia faba)USP(P-Vf.Usp，参见例如，美国专利申请10/429,516中的SEQ ID NO：1、2、和3)和玉米L3油质蛋白启动子(P-Zm.L3，参见例如，Hong et al.，Plant Mol.Biol.，34(3)：549-555，1997)。也包括玉米醇溶蛋白，其是在谷类胚乳中发现的一组储存蛋白质。已经分离了玉米醇溶蛋白基因的基因组克隆(Pedersen et al.，Cell 29：1015-1026，1982；and Russell et al.，Transgenic Res.6(2)：157-168)，并且也可使用来自这些克隆的启动子，包括15kD、16kD、19kD、22kD、27kD和基因。公知在例如谷类中起作用的其他启动子包括下列基因的启动子：waxy(蜡样)、Brittle(脆化)、Shrunken(皱缩)2、分支酶I和II、淀粉合酶、脱支酶、油质蛋白、谷蛋白和蔗糖合酶。用于谷类胚乳表达的特别优选的启动子是来自水稻的谷蛋白基因的启动子，更特别的是Osgt-1启动子(Zhenget al.，Mol.Cell Biol.13：5829-5842，1993)。适于在小麦中表达的启动子的实例包括ADP葡萄糖焦合酶(ADPGPP)亚基、颗粒结合的淀粉合酶和其他淀粉合酶、分支酶和脱支酶、胚胎发生-充足的蛋白质、麦醇溶蛋白和麦谷蛋白的启动子。水稻中这种启动子的实例包括ADPGPP亚基、颗粒结合淀粉合酶和其他淀粉合酶、分支酶、脱支酶、蔗糖合酶和谷蛋白的启动子。特别优选的启动子是水稻谷蛋白，Osgt-1的启动子。大麦中这种启动子的实例包括ADPGPP亚基、颗粒结合淀粉合酶、和其他淀粉合酶、分支酶、脱支酶、蔗糖合酶、大麦醇溶蛋白、胚胎球蛋白和糊粉特异蛋白质的启动子。用于在种子中表达的优选启动子是napin启动子、在此指P-Br.Snap2。另一个用于表达的优选启动子是Arcelin5启动子(美国专利公开2003/0046727)。另一优选的启动子是大豆7S启动子(P-Gm.7S)和大豆7Sα′β伴大豆球蛋白启动子(P-Gm.Sphasl)。
可利用的附加启动子在例如美国专利5,378,619；5,391,725；5,428,147；5,447,858；5,608,144；5,608,144；5,614,399；5,633,441；5,633,435；和4,633,436中有描述。此外，可使用组织特异性的增强子。
构建体或载体也可包括利用目标区域，以全部或部分发挥终止那些区域转录的作用的核酸序列。已经分离了许多这种序列，包括Tr73′序列和NOS 3′序列(Ingelbrecht et al.，The Plant Cell 1：671-680，1989；Bevan et al.，Nucleic AcidsRes.11：369-385，1983)。在本发明的植物表达构建体中也可提供调节转录终止的区域。可通过编码目标基因DNA序列或来源于不同基因源的适当转录终止区域来提供转录终止区域，例如与转录起始区域天然相关的转录终止区域。熟练的技术人员将认识到能够在植物细胞中终止转录的任何适当的转录终止区域可用于本发明的构建体。
载体或构建体也可包括调节元件。其实例包括Adh内含子1(Calliset al.，Genes and Develop.1：1183-1200，1987)，蔗糖合酶内含子(Vasil et al.，Plant Physiol..91：1575-1579，1989)和TMVΩ元件(Gallie et al.，The Plant Cell 1：301-311，1989)。适当的时候可包括这些和其他的调节元件。
可以理解可利用单个构建体将本发明的两个或多个核酸分子导入植物，所述构建体包含一个或多个启动子。在设计构建体表达2个核酸分子的实施方案中，优选这2个启动子是(i)2个组成性的启动子、(ii)2个种子特异性的启动子、或(iii)一个组成性的启动子和一个种子特异性的启动子。优选的种子特异性的启动子是7S、napin、和玉米球蛋白-1基因启动子。优选的组成性启动子是CaMV启动子。进一步可理解可利用单个启动子，优选为种子特异性的或组成性的启动子来物理地连接和表达两个或多个核分子。
在本发明优选的实施方案中，可在植物中通过转化其反义或共抑制的构建体来诱导转录后的基因沉默。特别地，通过Smith et al.(Nature 407：319-320，2000)的方法构建的构建体可用来获得优良的效果。其他的构建方法对于本领域的技术人员是众所周知的并且已有评述。
能够降低FAD2mRNA或FAD2蛋白质水平的结构性的核酸序列，包括与FAD2基因具有足够同源性的任何核酸序列。例证性的核酸包括在US6,372,965、US 6,342,658、US 6,333,448、US 6,291,741、US 6,063,947、WO01/14538 A3、US PAP 2002/20058340、和US PAP 2002/0045232中阐明的核酸。
本发明包括并提供用于生产与第一或第二植物中的至少一种相比，总的油类水平提高的植物的方法，包括：(A)使FAD2蛋白质或FAD2mRNA水平改变的第一植物与第二植物杂交以产生分离的群体；(B)筛选分离的群体以获得总的油类增加的成员；以及(C)选择所述的成员。
本发明包括并提供用于生产总的油类百分比增加的植物的方法，包括：(A)使FAD2蛋白质或FAD2mRNA水平改变的第一植物与第二植物杂交以产生分离的群体；(B)筛选分离的群体以获得总的油类增加的成员；以及(C)选择所述的成员。
本发明包括并提供用于生产总的油类百分比增加的植物的方法，包括：(A)使油酸水平增加而亚油酸水平降低的第一植物与第二植物杂交以产生分离的群体；(B)筛选分离的群体以获得油酸水平增加而亚油酸水平降低的成员；以及(C)选择所述的成员。
本发明的植物可以是育种方案的部分或产生自育种方案。繁殖方法的选择取决于植物繁殖的模式、待改善性状的遗传性、和商业上使用的栽培品种的类型(例如F1杂交体栽培种、纯化品系的栽培品种等)。如下阐明本发明的用于繁殖植物的非限制性的选择方法。可利用帮助任何杂交子代选择的标记来提高繁殖方案。进一步可理解在育种方案中可利用任何商品化的和非商业性的栽培品种。例如出现茁壮长势、营养势、胁迫耐受性、疾病抗性、分枝、开花、种子定形、种子大小、籽粒密度、直立性、和可脱粒性等因素一般将决定选择。
对于高度可遗传的性状，在单个位置评估优良单株植物的选择可能是有效的，而对于低遗传性的性状，应该根据从相关植物种类的重复评估获得的平均值来进行选择。通用的选择法通常包括谱系选择、改进的谱系选择、混合选择、和循环选择。在优选的实施方案中，进行回交或循环的育种方案。
遗传的复杂性影响了繁殖方法的选择。回交育种可用于将高度可遗传性状的一个或几个有利的基因转移到合乎需要的栽培品种中。这些方法已经广泛地用于繁殖抗病的栽培品种。使用多种循环选择技术来改善由许多基因控制的数量遗传性状。自我授粉的农作物中对循环选择的利用取决于授粉的简易性、来自每次授粉的成功杂种的频率、以及来自每次成功杂交的杂种后代的数目。
可测试繁殖品系并且与代表商业化目标区域的环境中的相当标准物比较两代或更多代。最好的品系是新的商业栽培品种的候选物；仍然缺乏性状的品系可被用作亲本以产生用于进一步选择的新群体。
鉴定优良植物的一个方法是观察其相对于其他实验性植株和广泛栽培的标准栽培品种的性能。如果单一观察是不确定的，重复观察可提供其遗传学价值的最佳评估。育种者可以进行选择并且将两个或多个亲本品系杂交，然后重复自体授精和选择，以产生许多新的遗传组合。
新栽培种的发育需要品种的发育和选择、这些品种的杂交以及优良杂交的选择。可通过在选择的雄性可育亲本之间进行人工杂交或利用雄性不育系统产生杂种种子。通过特定单个基因性状，例如荚色、花色、种子产量、柔毛颜色、或除草剂抗性对杂交体进行选择，这些性状表明种子是真正杂种的。亲本品种的其他数据以及杂种的表型影响了育种者决定是否继续特异的杂种杂交。
谱系育种和轮回选择繁殖方法可用于从繁殖种群开发栽培品种。通过自花授精和选择所需要的表型，育种方案将来自两个或多个栽培品种或多种包含广泛来源的合乎需要的性状组合到开发栽培品种的繁殖库中。可评估新的栽培品种以定哪些具有商业化的潜力。
通常使用谱系育种用于改良自我授粉的农作物。使具有有利的、互补性状的2个亲本杂交以产生F1。通过使F1的一个或几个自花受粉而产生F2群体：从最好的种类选择最好的个体。可在F4代中开始系列的重复试验以增加低遗传性的性状的选择有效性。在近交的进一步阶段(即，F6和F4)，检测表型相似品系的最好品系或混合物的释放潜力以获得新的载培品种。
回交育种法已经用于将简单继承的、高度可遗传的性状的基因转移到所需要的纯合栽培品种或回交亲本的近交系中。待转移的性状的来源被称为供体亲本。预期所得到的植株具有回交亲本(例如，栽培品种)的特征和从供体亲本转移的所需要的性状。在最初的杂交后，选择具有供体亲本表型的个体并且与回交亲本重复地杂交。预期所得到的亲本具有回交亲本(例如，栽培品种)的特征和从供体亲本转移的所需要的性状。
严格地说单种子传代方法是指种植分离的群体、收获每个植株的一个种子样品、并且利用唯一的种子样品种植下一代。当群体已经从F2进行到所需要的近交水平时，衍生品系的植株每个都将追踪到不同F3个体。由于一些种子不能发芽或一些植株不能产生至少一个种子，群体中植株的数目每代都会减退。因而，当完成传代时，不是群体中最初取样的所有F2植株都可由子代表示。
在多种子的方法中，育种者通常从群体中的每个植株收获一个或多个荚果并且使它们一起脱粒以形成批量。使用部分批量种植下一代而将部分作为储备。该方法已经称为改进的单种子传代法或荚果-批量技术。多种子的方法已经在收获中被用于节约劳动力。用机器脱粒荚果比单个种子法的从每个荚果手工移出种子是更加快速的。多种子法也使种植每个近交代群体的相同数目的种子成为可能。
可在几个参考书中发现关于通常用于不同性状和农作物的其他繁殖方法的说明(例如，Fehr，Principles of Cultivar Development，Vol.1，1987)。
也可利用单性生殖再生本发明的转基因植株。单性生殖是植物中再生的遗传控制方法，其中没有融合卵子和精子而形成胚胎。单性生殖在经济学上是很重要的，特别是在转基因的植株中，因为它导致任何基因型传代，无论其是如何杂合的。因此，在重复的生命循环中，单性生殖再生的、杂合的转基因植株可保持它们的遗传学保真性。用于生产单性生殖植物的方法是本领域已知的。参见例如，美国专利号5,811,636。
在此引用的所有文章、专利、和专利申请全部引入作为参考。
下列实施例是例证性的而不是意图以任何方式加以限制。
                        实施例
实施例1
为了通过转录后的基因沉默(PTGS)减少拟南芥属中FAD2的表达，根据Smith等人的方法产生基因沉默构建体。(Smith et al.，Nature407：319-320，2000)。利用napin启动子驱动以有义(SEQ ID NO：1)和反义方向侧接内含子的方式、包含FAD2的120个核苷酸的3′-非翻译区(SEQ ID NO：1)的发夹RNA(hpRNA)表达来构建构建体(pMON67563，图1)。通过土壤杆菌介导的转化，用pMON67563转化拟南芥属植株。也通过土壤杆菌-介导的转化，将空的napin载体(pCGN9979)转化入拟南芥属植株而作为对照。
实施例2
通过气相色谱法(GC)和近红外的分光术(NIR)分析来自转化的拟南芥属植株种子的脂肪酸图谱和总的含油量。GC分析表明用pMON67563转化的拟南芥属植株相对于对照，其油酸(18∶1)的比例增加，而亚油酸(18∶1)的比例降低。转化的品系67563-1至67563-13相对于未转化的对照品系9979-11至9979-15，显示油酸(18∶1)的比例增加，而亚油酸(18∶2)的比例降低。以与对照品系9979-11至9979-15的百分数(w/w)的方式测量油酸和亚油酸的相对数量，显示油酸水平在大约14％(w/w)和大约18％(w/w)范围之间，而亚油酸水平在大约30％(w/w)和大约32％(w/w)范围之间。转化的品系67563-1至67563-3以及67563-5至67563-15显示油酸水平在大约34％(w/w)和大约50％(w/w)范围之间，而亚油酸水平在大约7％(w/w)和大约18％(w/w)范围之间。NIR分析表明用pMON67563转化的植物与对照植物相比，显示总的油类水平增加而蛋白水平基本上相同。对照品系9979-11至9979-15显示总的油类百分比在大约33.5％和大约36.8％范围之间。与对照品系相比，转化品系67563-1至67563-3以及67563-5至67563-15显示总的油类百分比增加，并且其范围为大约35.5％至大约38.9％。如图2所说明的，当对对照和转化品系进行作图以比较总的油类％(X-轴)对照油酸％(18∶1)，油酸含量增加与总的含油量增加相关。
实施例3
使用pMON67563转化的拟南芥属植株(图1)生长到T3种子代。收获T3种子并进行分析。使用气相色谱法(GC)和近红外的(NIR)分析分别确定脂肪酸图谱和总的含油量。GC分析的结果表明100％的转化植物的后代油酸(18∶1)水平增加，这与在亲本植株中所观察到的相似。
植物子代也显示总的油类增加。图3提供了油酸(18∶1)水平与总的油类百分比的比较。
如图4中所说明的，与包含空载体的对照种子相比，来自转基因品系的T2和T3种子的平均油类百分比增加。在T3代种子中明显的油酸百分数增加和总的油类百分数增加之间的相关性似乎是基因可遗传的。
如图3所说明的，当对对照和转化品系进行作图以比较总的油类百分数(X-轴)与油酸(18∶1)百分数，转基因的拟南芥属T3种子中油酸含量增加与总的含油量增加相关。
实施例4
Canola FAD-2构建体
通过PCR扩增分离欧洲油菜(Brassica napus)FAD2基因的片段。用引物对17942 5′-GCGGCCGCGCGTCCTAACCGGCGTCTGGGTC-3′
(SEQ ID NO：2)和17944 5′-
CCATGGGAGACCGTAGCAGACGGCGAGG-3′(SEQ ID NO：3)，从欧洲油菜(cv.乌檀木(Ebony))基因组DNA扩增FAD2编码序列的碱基对284-781。向片段的5′末端加入NotI位点，向3′末端加入NcoI位点以便于克隆。将所得到的PCR片段克隆到pCR2.1 Topo中。获得完整的双链序列。
通过用NotI和NcoI消化除去包含CR-BN.BnFad2-0的444bp片段(SEQ ID NO：4)。将该片段连接到已经用NotI和NcoI消化的欧洲油菜启动子和拟南芥属FAD2基因(At3g12120)的第一内含子之间。所得到的质粒被命名为pMON67589(图5)。利用已知的方法确定核酸序列并且确认克隆接合点的完整性。
通过PCR扩增分离欧洲油菜FAD2基因的片段。用引物对17943 5′-CCCGGGGCGTCCTAACCGGCGTCTGGGTC-3′(SEQ ID NO：5)和17945 5′-GGTACCGAGACCGTAGCAGACGGCGAGG-3′(SEQ ID NO：6)，从欧洲油菜(cv.乌檀木)基因组DNA扩增FAD2编码序列的碱基对284-781。向片段的3′末端加入KpnI位点，向5′末端加入SmaI位点以便于克隆。将所得到的PCR片段克隆到pCR2.1 Topo中。获得完整的双链序列。
通过用KpnI和SmaI消化除去包含AS-BN.BnFad2-0的455bp片段(SEQ ID NO：7)。将该片段连接到已经用SmaI和KpnI消化的拟南芥属FAD2基因(At3g12120)的第一内含子和pMON67589中的napin 3′UTR之间。所得到的质粒被命名为pMON67591(图6)。利用已知的方法确定核酸序列并且确认克隆接合点的完整性。
通过用NotI和SmaI消化从pMON67591去除包含CR-BN.BnFad2-0后接拟南芥属FAD2基因(At3g12120)的第一内含子和AS-BN.BnFad2-0的2030bp片段。将该片段连接到已经用NotI和HindIII消化的质粒中(在连接前HindIII位点是平末端)。所得到的质粒被命名为pMON67592(图7)。利用已知的方法确定核酸序列并且确认克隆接合点的完整性。将该载体随后用于转化Canola，这是通过土壤杆菌介导的转化而进行的。
实施例5
分析来自用pMON67592转化的R2 Canola植株的种子以确定总的油类、油酸含量和蛋白质含量。如可在表1中所看到的，纯合的阳性和无效的分离体之间的差异是，总的油类为1.7-2.5％，以及油酸为20.4-25.6％。蛋白水平保持相同。表2显示来自所有事件的综合结果。
表1.来源于5个单独转化体的R2 Canola种子中平均的总的油类和油酸水平。
事件      N         ％总的油类              ％油酸
   纯合的平均   标准误差  无效的分离体平均  标准误差    纯合的平均  标准误差  无效的分离体平均  标准误差
BN_G1258  29  46.2    0.44  44.5    0.30  84.1   0.52  59.4   0.35
BN_G1260  29  43.3    0.34  40.8    0.25  85.8   0.57  65.5   0.41
BN_G1262  27  47.0    0.32  45.2    0.21  85.3   0.42  59.8   0.27
BN_G1291  23  47.4    0.65  45.4    0.39  86.5   0.58  63.7   0.34
BN_G1333  26  47.9    0.95  45.6    0.64  85.9   0.42  64.0   0.28
以JMP版本：4.0.4(SAS Institute)计算平均数和标准误差。纯合阳性和无效分离体的5个事件中每一个的总的油类和油酸平均数之间的差异是统计上显著的(p＜.0001)。
表2.用pMON65792转化的R2 Canola种子中平均的总的油类和油酸水平
接合性     ％总的油类N      平均     StDev          ％油酸N       平均      StDev
纯合的 94     44.93    2.74   51      85.16     1.52
无效的分离体 178    42.98    2.33   123     63.72     3.39
差异        1.95           21.4
以JMP版本：4.0.4(SAS Institute)计算平均数和标准偏差。植物来源于5个独立的转化体。纯合的阳性和无效的分离体的平均数之间的差异是统计上显著的(p＜.0001)
实施例6
根据拟南芥属、大豆和玉米δ-12脱氢酶(FAD2)的序列相似性，在专有的玉米单基因数据库中鉴定了4个基因。其已经被命名为FAD2-1、FAD2-2、FAD2-3和FAD2-4。Zm.FAD2-1的全长cDNA序列如SEQID NO：8所示。它编码387个氨基酸的多肽(翻译读框：核苷酸182-1342)。Zm.FAD2-2的全长cDNA序列如SEQ ID NO：9所示。它编码390个氨基酸的多肽(翻译读框：核苷酸266-1435)。Zm.FAD3-3的全长cDNA序列如SEQ ID NO：10所示。它编码382个氨基酸的多肽(翻译读框：核苷酸170-1315)。Zm.FAD 2-4的部分序列如SEQ ID NO：11所示。它编码252个氨基酸的部分多肽(翻译读框：核苷酸1-256)。
3个基因的编码区享有显著的序列同一性。FAD2-1与FAD2-2在核苷酸水平享有91％的同一性，在氨基酸水平享有88％的同一性。FAD2-1与FAD2-3在核苷酸水平享有85％的同一性，在氨基酸水平享有68％的同一性。FAD2-1与FAD2-4在核苷酸水平享有82％的同一性，在氨基酸水平享有68％的同一性。FAD2-3与FAD2-4在核苷酸水平享有80％的同一性，在氨基酸水平享有65％的同一性。
使用有效的northern来确定4个基因中哪些存在于玉米的种子组织中。FAD2-1和FAD2-2存在于在不同的种子发育时期收集的完整的种子、胚组织和胚胎组织中。FAD2-3和FAD2-4都不存在于种子组织中，但是都在叶片组织中被检测到。
来自FAD2-1和FAD2-2的3′UTR融合的RNAi构建体
构建的表达构建体包括玉米L3启动子、启动子3′端和RNAi元件5′端为水稻-肌动蛋白内含子，RNAi元件后是位于RNAi元件3′端的球蛋白3′末端。RNAi元件由通过BamH1位点与Zm.FAD2-2 3′UTR片段连接的Zm.FAD2-1 3′UTR的片段组成，两个片段以有义的方向通过包含内含子剪接位点的HSP70内含子与反义方向的2个相同FAD2 3′UTR片段连接。使HSP70内含子以相对于启动子为有义的方向放置。3′UTR片段有义和反义的顺序不是重要的，只要每个片段(FAD2-1和FAD2-2)在中心内含子的一侧是有义的，而在另一侧是反义的。构建体适于通过微粒轰击或通过土壤杆菌-介导的转化而转化到玉米中。
使用PCR来获得5′末端上有Bsp120I以及3′末端上有Stul位点的HSP70内含子。使用特异于HSP70内含子序列的引物(SEQ ID NOS：12和13)来克隆内含子。
将820个碱基对的Bsp120I和StuI片段PCR产物(SEQ ID NO：14)克隆到包含具有NOS 3′的花椰菜花叶病毒启动子驱动的nptII和后接水稻肌动蛋白内含子和球蛋白3′的玉米L3启动子的turbo双元的相同位点中，以制备中间构建体。
通过PCR获得Zm.FAD2-1和FAD2-2 3′UTRs的片段。使用Monsanto文库克隆作为模板，利用特异于FAD2-1的引物(SEQ ID NO：15，包含附加的克隆位点Sse83871和Sacl；以及SEQ ID NO：16，包含附加的克隆位点BamH1)或特异于FAD2-2的引物(SEQ ID NOS：17，包含附加的克隆位点BamH1 ；以及SEQ ID NO：18，包含附加的位点Bsp120I和EcoRV)。
为了连接2个PCR产物，每个用BamHI消化、经凝胶纯化、连接，使用连接产物作为模板，并利用引物SEQ ID NOS：15和18。得到447个碱基对的片段(SEQ ID NO：19)。
将SEQ ID NO：19的Sacl/Bsp120I片段克隆到中间构建体的相同位点中，而将SEQ ID NO：19的Sse8387I/EcoRV片段克隆到中间构建体的Sse83871/Stul位点中以产生pMON56855(图8)。
实施例7
来自FAD2-1和FAD2-2的内含子融合的RNAi构建体
构建的表达构建体包括玉米L3启动子、启动子的3′端和RNAi元件的5′端为谷类水稻-肌动蛋白内含子，RNAi元件后是位于RNAi元件3′端的球蛋白3′末端。RNAi元件由通过BamH1位点与Zm.FAD2-2内含子部分连接的Zm.FAD2-1内含子的部分组成，两个部分以有义的方向通过包含内含子剪接位点的HSP70内含子与反义方向的2个相同FAD2内含子连接。使HSP70内含子以相对于启动子为有义的方向放置。内含子片段有义和反义的顺序不是重要的，只要每个片段(FAD2-1和FAD2-2)在中心内含子的一侧是有义的，而在另一侧是反义的。构建体适于通过微粒轰击或通过土壤杆菌-介导的转化而转化到玉米中。
使用PCR来获得如上述实施例所描述的HSP70内含子。
通过PCR从来自Zm.FAD2-1和FAD2-2基因的内含子获得片段。将利用Dellaporta等人的方法(Dellaporta et al.(1983)A plant DNAminipreparation：version II.Plant Mol Biol Rep 1：19-21)从玉米品种LH59的叶片制备的基因组DNA用作模板。对于FAD2-1，使用特异的引物(SEQ ID NO：20，具有附加的克隆位点Sse83871和Sacl；和SEQ ID NO：21)来产生267个碱基对的产物(SEQ ID NO：22)。对于FAD2-2，使用特异的引物(SEQ ID NO：23，其包括与SEQ ID NO：22的3′序列重叠的21个碱基；和SEQ ID NO：24，包含附加的位点Bsp120I和EcoRV)来产生260个碱基对的产物(SEQ ID NO：25)。
为了连接2个PCR产物(SEQ ID NOS：22和25)，在一个PCR反应中，将它们都用作模板，利用引物SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：24以产生506个碱基对的融合体(SEQ ID NO：26)。凝胶纯化来自SEQ IDNO：26的Sacl和Bsp120I片段，然后克隆到相同的位点中以产生pMON68656(图9)。
序列表
<110>SHEWMAKER，CHRISTINE K
     VAN EENENNAAM，ALISON
     HAWKINS，DEBRA T
     SANDERS，RICK
<120>用于增加植物中总的油类水平的方法
<130>MONS：052CN
<140>PCT/US2003/025751
<141>2003-08-12
<150>US 60/402,527
<151>2002-08-12
<160>26
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>120
<212>DNA
<213>拟南芥
<400>1
gcatgatggt gaagaaattg tcgacctttc tcttgtctgt ttgtcttttg ttaaagaagc     60
tatgcttcgt tttaataatc ttattgtcca ttttgttgtg ttatgacatt ttggctgctc    120
<210>2
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>2
gcggccgcgc gtcctaaccg gcgtctgggt c                                    31
<210>3
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>3
ccatgggaga ccgtagcaga cggcgagg                                        28
<210>4
<211>440
<212>DNA
<213>欧洲油菜
<400>4
gcgcgtccta accggcgtct gggtcatagc ccacgagtgc ggccaccacg ccttcagcga     60
ctaccagtgg cttgacgaca ccgtcggtct catcttccac tccttcctcc tcgtccctta    120
cttctcctgg aagtacagtc atcgacgcca ccattccaac actggctccc tcgagagaga    180
cgaagtgttt gtccccaaga agaagtcaga catcaagtgg tacggcaagt acctcaacaa    240
ccctttggga cgcaccgtga tgttaacggt tcagttcact ctcggctggc cgttgtactt    300
agccttcaac gtctcgggaa gaccttacga cggcggcttc gcttgccatt tccaccccaa    360
cgctcccatc tacaacgacc gcgagcgtct ccagatatac atctccgacg ctggcatcct    420
cgccgtctgc tacggtctcc                                                440
<210>5
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>5
cccggggcgt cctaaccggc gtctgggtc                                       29
<210>6
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>6
ggtaccgaga ccgtagcaga cggcgagg                                        28
<210>7
<211>441
<212>DNA
<213>欧洲油菜
<400>7
cgagaccgta gcagacggcg aggatgccag cgtcggagat gtatatctgg agacgctcgc     60
ggtcgttgta gatgggagcg ttggggtgga aatggcaagc gaagccgccg tcgtaaggtc    120
ttcccgagac gttgaaggct aagtacaacg gccagccgag agtgaactga accgttaaca    180
tcacggtgcg tcccaaaggg ttgttgaggt acttgccgta ccacttgatg tctgacttct    240
tcttggggac aaacacttcg tctctctcga gggagccagt gttggaatgg tggcgtcgat    300
gactgtactt ccaggagaag taagggacga ggaggaagga gtggaagatg agaccgacgg    360
tgtcgtcaag ccactggtag tcgctgaagg cgtggtggcc gcactcgtgg gctatgaccc    420
agacgccggt taggacgccc c                                              441
<210>8
<211>1729
<212>DNA
<213>玉米
<400>8
ctgcagacac caccgctcgt ttttctctcc gggacaggag aaaaggggag agagaggtga     60
ggcgcggtgt ccgcccgatc tgctctgccc cgacgcagct gttacgacct cctcagtctc    120
agtcaggagc aagatgggtg ccggcggcag gatgaccgag aaggagcggg agaagcagga    180
gcagctcgcc cgagctaccg gtggcgccgc gatgcagcgg tcgccggtgg agaagcctcc    240
gttcactctg ggtcagatca agaaggccat cccgccacac tgcttcgagc gctcggtgct    300
caagtccttc tcgtacgtgg tccacgacct ggtgatcgcc gcggcgctcc tctacttcgc    360
gctggccatc ataccggcgc tcccaagccc gctccgctac gccgcctggc cgctgtactg    420
gatcgcgcag gggtgcgtgt gcaccggcgt gtgggtcatc gcgcacgagt gcggccacca    480
cgccttctcg gactactcgc tcctggacga cgtggtcggc ctggtgctgc actcgtcgct    540
catggtgccc tacttctcgt ggaagtacag ccaccggcgc caccactcca acacggggtc    600
cctggagcgc gacgaggtgt tcgtgcccaa gaagaaggag gcgctgccgt ggtacacccc    660
gtacgtgtac aacaacccgg tcggccgggt ggtgcacatc gtggtgcagc tcaccctcgg    720
gtggccgctg tacctggcga ccaacgcgtc ggggcggccg tacccgcgct tcgcctgcca    780
cttcgacccc tacggcccca tctacaacga ccgggagcgc gcccagatct tcgtctcgga    840
cgccggcgtc gtggccgtgg cgttcgggct gtacaagctg gcggcggcgt tcggggtctg    900
gtgggtggtg cgcgtgtacg ccgtgccgct gctgatcgtg aacgcgtggc tggtgctcat    960
cacctacctg cagcacaccc acccgtcgct cccccactac gactcgagcg agtgggactg   1020
gctgcgcggc gcgctggcca ccatggaccg cgactacggc atcctcaacc gcgtgttcca   1080
caacatcacg gacacgcacg tcgcgcacca cctcttctcc accatgccgc actaccacgc   1140
catggaggcc accaaggcga tcaggcccat cctcggggac tactaccact tcgacccgac   1200
ccctgttgcc aaggcgacct ggcgcgaggc cagggagtgc atctacgtcg agcccgagga   1260
ccgcaagggc gtcttctggt acaacaagaa gttctagccg ccgccgctcg cagagctgag   1320
aggacgctac cataggaatg ggagcaggaa ccaggaggag gagacggtac tcgccccaaa   1380
gtctccgtca acctatctaa tcgttagtcg tcagtctttt agacgggaag agagatcatt   1440
tgggcacaga gacgaaggct tactgcagtg ccatcgctag agctgccatc aagtacaagt   1500
aggcaaattc gtcaacttag tgtgtcccat gttgtttttc ttagtcgtcc gctgctgtag   1560
gctttccggc ggcggtcgtt tgtgtggttg gcatccgtgg ccatgcctgt gcgtgcgtgg   1620
ccgcgcttgt cgtgtgcgtc tgtcgtcgcg ttggcgtcgt ctcttcgtgc tccccgtgtg   1680
ttgttgtaaa acaagaagat gttttctggt gtctttggcg gaataaaaa               1729
<210>9
<211>1804
<212>DNA
<213>玉米
<400>9
ccgaaccgag gcggccaggc tccctcctcc ctcctcctcc ctgcaaatcg ccaaatcctg     60
caggcaccac cgctcgtttt cctgtgcggg gaacaggaga gaaggggaga gaccgagaga    120
gggggaggcg cggcgtccgc cggatctgct ccgacccccg acgcagcctg tcacgccgtc    180
ctcactctca gccagcgaaa atgggtgccg gaggcaggat gaccgagaag gagcgggagg    240
agcaggagca agtcgcccgt gctaccggcg gtggcgcggc agtgcagcgg tcgccggtgg    300
agaagccgcc gttcacgttg gggcagatca agaaggcgat cccgccgcac tgcttcgagc    360
gctccgtgct gaggtccttc tcctacgtgg cccacgacct ggcgaccgcc gcggcgctcc    420
tctacctcgc ggtggccgtg ataccggcgc tacccagccc gctccgctac gcggcctggc    480
cgctgtactg ggtggcccag gggtgcgtgt gcacgggcgt gtgggtgatc gcgcacgagt    540
gcggccacca cgccttctcc gaccacgcgc tcctggacga cgccgtcggc ctggcgctgc    600
actcggcgct gctggtgccc tacttctcgt ggaagtacag ccaccggcgc caccactcca    660
acacggggtc cctggagcgc gacgaggtgt tcgtgccgag gaccaaggag gcgctgccgt    720
ggtacgcccc gtacgtgcac ggcagccccg cgggccggct ggcgcacgtc gccgtgcagc    780
tcaccctggg ctggccgctg tacctggcca ccaacgcgtc gggccgcccg tacccgcgct    840
tcgcctgcca cttcgacccc tacggcccga tctacggcga ccgggagcgc gcccagatct    900
tcgtctcgga cgccggcgtc gcggccgtgg cgttcgggct gtacaagctg gcggcggcgt    960
tcgggctctg gtgggtggtg cgcgtgtacg ccgtgccgct gctgatcgtc aacgcgtggc   1020
tggtgctcat cacgtacctg cagcacaccc acccggcgct gccccactac gactcgggcg   1080
agtgggactg gctgcgcggc gcgctcgcca ccgtcgaccg cgactacggc gtcctcaacc   1140
gcgtgttcca ccacatcacg gacacgcacg tcgcgcacca cctcttctcc accatgccgc   1200
actaccacgc cgtggaggcc accagggcga tcaggcccgt cctcggcgac tactaccagt   1260
tcgacccgac ccctgtcgcc aaggccacct ggcgcgaggc cagggagtgc atctacgtcg   1320
agcctgagat ccgcaacagc aagggcgtct tctggtacaa cagcaagttc tagccgccgc   1380
ttgctttttc cctaggaatg ggaggagaaa tcaggatgag aagatggtaa tgtctccatc   1440
tacctgtcta atggttagtc accagtcttt agacaggaag agagcatttg ggcttcagaa   1500
aaggaggctt actgcactac tgcagtgcca tcgctagatc taggcaaatt cagtgtgtct   1560
gtgcccatgg ctgtgagctt tgggtactct caagtagtca agttctcttg tttttgtttt   1620
tagtcgtcgc tgttgtaggc ttgccggcgg cggccgttgc gtggccgcgc cttgtcgtgt   1680
gcgtcttgct tttgtgtgcg ttcgtgctcc cttgtttttg tgtgcgttcg tgctcccttc   1740
gtgttgttgt aaaacactag tctggtgtct ttggcggaat aactaacaga tcgtcgaacg   1800
aaaa                                                                1804
<210>10
<211>1543
<212>DNA
<213>玉米
<400>10
cctgcaggta ccggtccgga attcccgggt cgacccacgc gtccgcatcc tcaaagcctc     60
cggttgcccg aagcagtcgc atctgctctt cgtggcaccg aactcttgga gcaatcaact    120
tttgaatcgt cgacaggaca gccgcgcgcg tcgtggcgaa ggctgcagga tggagcagca    180
gacgaagacg acgacacagc aagagggcaa aggcctcgcc accatggagc ggtcgatcgt    240
ggacaagccg ccattcacgc tagcggacct caggaaggcc atcccgccgc actgcttcca    300
gcgctcgctc atcaggtcct gctcctacct cgcccacgac ctcgccatcg ccgcggggct    360
cctgtacttg gctctggccg tcatccccgc cctcccgggc gtcctcctcc gcgccgccgc    420
ctggccgctc tactgggcgg cgcagggcag catcatgttc ggcgtgtggg tgatcgcgca    480
cgagtgcggg cacagcagct tctcccgcta cggcctcctc aacgacgccc tcggcctggt    540
gctgcactcg tgcctcttcg cgccctactt ctcgtggaag tacagccacc agcgccacca    600
cgccaacacc gcgtccctgg agcgcgacga ggtgttcgtg cccaagcaga ggcccgagat    660
gccgtggtac tccccgctcg tgtacaagcg cgacaacccc gtcgcccggc tggtcctcct    720
cgccgtgcag ctcaccgtcg gctggcccat gtacctggcg ttcaacacct ggggccgccg    780
ctactcccgc ttcgcgtgcc acttcgaccc ctacagcccc atctacggcg accgggagcg    840
cgcccagatc gccgtctccg acgccggcgt cctggccgtg tcgttcgcgc tgtacaggct    900
cgccgcggcc cacgggctct ggcccgtggt cagcgtctac ggcgtgccgc tgctggtgac    960
gaacgcctgg ctcgtggtgg tcacgtacct gcaccacacg caccgcgcgc tcccgcacta   1020
cgactccagc gagtgggact ggatgcgcgg ggcgctcgcc accgtcgacc gcgactacgg   1080
cgtcctcaac cgcgtgttcc accacatcgc cgacacgcat atcgctcacc atctcttccc   1140
ggccattccg cactaccacg ccatggaggc caccagagcg atccgtcctg tcctcggcga   1200
ctactaccgc tccgatagca cgcccatagc cgaggcgctc tggcgcgagg ctaaagagtg   1260
catctacgtc cagcgcgacg accagaaggg cgtattttgg tacaagaacg tgttctagct   1320
gcagagctgc tggacgacgc aaaccccgag cggagccata ggggcacaga aataatatta   1380
tttgtggtct tgtacatttt gttatatatt taccttgcac atgtcacaaa taaaaaactg   1440
gcatatatat ataacaaaat gtatactata cgtatatata tgtatcatct tgtgttatat   1500
gttaaatgtt taagatgttt taaatgccaa aaaaaaaaaa aaa                     1543
<210>11
<211>774
<212>DNA
<213>玉米
<400>11
ctgcaggtac cggtccggaa ttcccgggtc gacccacgcg tccgagcctc tcgctgtgca     60
ttgaccagcg cagagacaag tagagcaggg agggaagccc atcgtgtgtt tctcagtccc    120
agtcagcagc atggctgccg gcgtcgcaac ggcggaggag atcaggaaga agagccactc    180
gggcggtgtg cggcggtcgc cggtggacag gccgccgttc acgctggggg acatcaagag    240
ggccatcccg ccgcactgct tccagcgctc ggcgctcagg tccttctcgt acctcctcca    300
cgacctcgcc atcgcggccg ggctcctgta cctggccgtg gcgggcatcc cggcgctccc    360
gagcgccgcg ctccgccgct tcgtggcgtg gccgctctac tgggcggcgc agggcagcgt    420
gctgacgggc gtctgggtca tcgggcacga gtgcggccac cacgccttct ccgactaccc    480
gctcctggac aacgccgtcg gcttcgtgct ccactccgcg ctgctcacgc ccttcttcgc    540
ctggaagtac agccaccggc gccaccacgc caacaccggc tccatggaga acgacgaggt    600
gtacgtggcc aagacccggg acgcgctgcg gtggtacacg ccgctcgtgt tcggcaaccc    660
ggtcggccgg ctggtgtaca tcgcgctgca gctcaccctc gcgtggccgc tctacctggc    720
gttcaacctc tcagggcaga actacggcgg ccgctctaga ggatccaagc ttac          774
<210>12
<211>29
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>12
ttgggcccac cgtcttcggt acgcgctca                                       29
<210>13
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>13
gcaggcctcc gcttggtatc tgcattac                                        28
<210>14
<211>820
<212>DNA
<213>玉米
<400>14
ttgggcccac cgtcttcggt acgcgctcac tccgccctct gcctttgtta ctgccacgtt     60
tctctgaatg ctctcttgtg tggtgattgc tgagagtggt ttagctggat ctagaattac    120
actctgaaat cgtgttctgc ctgtgctgat tacttgccgt cctttgtagc agcaaaatat    180
agggacatgg tagtacgaaa cgaagataga acctacacag caatacgaga aatgtgtaat    240
ttggtgctta gcggtattta tttaagcaca tgttggtgtt atagggcact tggattcaga    300
agtttgctgt taatttaggc acaggcttca tactacatgg gtcaatagta tagggattca    360
tattataggc gatactataa taatttgttc gtctgcagag cttattattt gccaaaatta    420
gatattccta ttctgttttt gtttgtgtgc tgttaaattg ttaacgcctg aaggaataaa    480
tataaatgac gaaattttga tgtttatctc tgctccttta ttgtgaccat aagtcaagat    540
cagatgcact tgttttaaat attgttgtct gaagaaataa gtactgacag tattttgatg    600
cattgatctg cttgtttgtt gtaacaaaat ttaaaaataa agagtttcct ttttgttgct    660
ctccttacct cctgatggta tctagtatct accaactgac actatattgc ttctctttac    720
atacgtatct tgctcgatgc cttctcccta gtgttgacca gtgttactca catagtcttt    780
gctcatttca ttgtaatgca gataccaagc ggaggcctgc                          820
<210>15
<211>34
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>15
cctgcaggag ctcagagctg agaggacgct acca                                 34
<210>16
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>16
gtggatccac taagttgacg aatttgcc                                        28
<210>17
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>17
gtggatccgt gtgtctgtgc ccatggctgt                                      30
<210>18
<211>35
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>18
cgatatcggg cccgtgtttt acaacaacac gaagg                                35
<210>19
<211>447
<212>DNA
<213>玉米
<400>19
cctgcaggag ctcagagctg agaggacgct accataggaa tgggagcagg aaccaggagg     60
aggagacggt actcgcccca aagtctccgt caacctatct aatcgttagt cgtcagtctt    120
ttagacggga agagagatca tttgggcaca gagacgaagg cttactgcag tgccatcgct    180
agagctgcca tcaagtacaa gtaggcaaat tcgtcaactt agtggatccg tgtgtctgtg    240
cccatggctg tgagctttgg gtactctcaa gtagtcaagt tctcttgttt ttgtttttag    300
tcgtcgctgt tgtaggcttg ccggcggcgg ccgttgcgtg gccgcgcctt gtcgtgtgcg    360
tcttgctttt gtgtgcgttc gtgctccctt gtttttgtgt gcgttcgtgc tcccttcgtg    420
ttgttgtaaa acacgggccc gatatcg                                        447
<210>20
<211>32
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>20
cctgcaggag ctctgtgatc cccaacttgc tg                                   32
<210>21
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>21
ctgacacaaa cgaggaagta cgct                                            24
<210>22
<211>267
<212>DNA
<213>玉米
<400>22
cctgcaggag ctctgtgatc cccaacttgc tgtggcgtgg tagttggatc gtgtttaggc     60
aagaaagtaa atgcgatcat gcacggcata tttgccacct tcctgggaga cgccccctcg    120
tgccgtgatc tgttttactt tggttgattg gtggcctttc tcgtggttca cgtgacagct    180
tttctgatgg gatgagatca ctgtaatgtt gttgcttgat tcacgctcgc ttgatcttac    240
tgtagcgtac ttcctcgttt gtgtcag                                        267
<210>23
<211>36
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>23
gtacttcctc gtttgtgtca ggcaagaaag tgatgc                               36
<210>24
<211>32
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>24
cgatatcggg cccattttcg ctggttgctg gc                                   32
<210>25
<211>260
<212>DNA
<213>玉米
<400>25
gtacttcctc gtttgtgtca ggcaagaaag tgatgcggtc gtgcacggca catgccagct     60
ttgtgggagc cgcccctaac cctcgctgaa tcagtcagta gtgccaactt gctagagttt    120
tttttcttct tgttttggtt cactcgacag atttttgttt ggatgagatc gctgcaacat    180
tgttcttgat ccacacttgc ctgatcttac cgtctcgttc gtgttcgtgc cagcaaccag    240
cgaaaatggg cccgatatcg                                                260
<210>26
<211>506
<212>DNA
<213>玉米
<400>26
cctgcaggag ctctgtgatc cccaacttgc tgtggcgtgg tagttggatc gtgtttaggc     60
aagaaagtaa atgcgatcat gcacggcata tttgccacct tcctgggaga cgccccctcg    120
tgccgtgatc tgttttactt tggttgattg gtggcctttc tcgtggttca cgtgacagct    180
tttctgatgg gatgagatca ctgtaatgtt gttgcttgat tcacgctcgc ttgatcttac    240
tgtagcgtac ttcctcgttt gtgtcaggca agaaagtgat gcggtcgtgc acggcacatg    300
ccagctttgt gggagccgcc cctaaccctc gctgaatcag tcagtagtgc caacttgcta    360
gagttttttt tcttcttgtt ttggttcact cgacagattt ttgtttggat gagatcgctg    420
caacattgtt cttgatccac acttgcctga tcttaccgtc tcgttcgtgt tcgtgccagc    480
aaccagcgaa aatgggcccg atatcg                                         506

Claims (20)

1.一种用于增加种子中总的油类水平的方法，包括：
(A)用核酸构建体转化植物，该核酸构建体包括作为可操作地连接成分的启动子、能够调节FAD2 mRNA或FAD2蛋白质水平的结构性核酸序列；以及
(B)使所述的植物生长。
2.根据权利要求1的用于增加种子中总的油类水平的方法，其中所述的植物是拟南芥属。
3.根据权利要求1的用于增加种子中总的油类水平的方法，其中所述的植物是玉米。
4.根据权利要求1的用于增加种子中总的油类水平的方法，其中所述的植物是Canola。
5.根据权利要求1的用于增加种子中总的油类水平的方法，其中所述的启动子是种子特异性的启动子。
6.根据权利要求5的用于增加种子中总的油类水平的方法，其中所述的种子特异性启动子选自napin启动子、大豆胰蛋白酶抑制剂启动子、ACP启动子、硬脂酰-ACP脱氢酶启动子、b-伴大豆球蛋白的大豆a′亚基启动子、油质蛋白启动子、β-伴大豆球蛋白启动子、玉米球蛋白-1基因启动子、和玉米醇溶蛋白启动子。
7.根据权利要求1的增加种子中总的油类水平的方法，其中与来自缺乏所述的核酸构建体的第二植物的种子相比，所述种子中总蛋白的水平保持基本上不变。
8.根据权利要求1的增加种子中总的油类水平的方法，其中与来自缺乏所述的核酸构建体的第二植物的种子相比，所述种子中油酸的水平增加而亚油酸的水平降低。
9.根据权利要求1的增加种子中总的油类水平的方法，其中与来自缺乏所述的核酸构建体的第二植物的种子相比，所述种子中总的油类的百分比增加。
10.一种用于增加种子中总的油类的方法，包括：
(A)用核酸构建体转化植物，该核酸构建体包括作为可操作地连接成分的启动子、能够增加油酸水平的结构性核酸序列；以及
(B)使所述的植物生长。
11.一种包括核酸片段的嵌合基因，该核酸片段选自SEQ ID NOS：1、4、7-11、14、19、22、25和26或其反向互补序列、其任何功能等效的亚片段或所述片段或亚片段的反向互补序列，其中所述的片段是可操作地连接的，并且进一步地其中嵌合基因的表达导致总的油类增加。
12.一种用于增加种子中总的油类水平的方法，包括：
(A)用核酸构建体转化植物，所述核酸构建体包括作为可操作地连接成分的启动子和序列，该序列选自SEQ ID NOS：1、4、7-11、14、19、22、25和26或其反向互补序列、其任何功能等效的亚片段或所述片段或亚片段的反向互补序列；以及
(B)使所述的植物生长。
13.根据权利要求12的用于增加种子中总的油类水平的方法，其中所述的植物是拟南芥属。
14.根据权利要求12的用于增加种子中总的油类水平的方法，其中所述的植物是玉米。
15.根据权利要求12的用于增加种子中总的油类水平的方法，其中所述的植物是canola。
16.根据权利要求12的用于增加种子中总的油类水平的方法，其中所述的启动子是种子特异性的启动子。
17.根据权利要求16的增加种子中总的油类水平的方法，其中所述的种子特异性启动子选自napin启动子、大豆胰蛋白酶抑制剂启动子、ACP启动子、硬脂酰-ACP脱氢酶启动子、b-伴大豆球蛋白的大豆a′亚基启动子、油质蛋白启动子、β-伴大豆球蛋白启动子、玉米球蛋白-1基因启动子、和玉米醇溶蛋白启动子。
18.根据权利要求12的增加种子中总的油类水平的方法，其中与来自缺乏所述的核酸构建体的第二植物相比，所述种子中总蛋白的水平保持基本上不变。
19.根据权利要求12的增加种子中总的油类水平的方法，其中与来自缺乏所述的核酸构建体的第二植物的种子相比，所述种子中油酸的水平增加而亚油酸的水平降低。
20.根据权利要求12的增加种子中总的油类水平的方法，其中与来自缺乏所述的核酸构建体的第二植物的种子相比，所述种子中总的油类的百分比增加。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102786587A (zh) * 2012-06-18 2012-11-21 中国农业大学 一种提高植物种子脂肪酸含量的转录因子及其应用
CN105123532B (zh) * 2006-07-14 2018-12-18 联邦科学技术研究组织 改变水稻的脂肪酸组成

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR0309017B1 (pt) * 2002-04-04 2015-02-18 Monsanto Technology Llc Máquina automática para manusear e manipular peças individuais de material particulado
WO2005031367A2 (en) * 2003-09-23 2005-04-07 Monsanto Technology Llc High throughput automated seed analysis system
US7703238B2 (en) 2004-08-26 2010-04-27 Monsanto Technology Llc Methods of seed breeding using high throughput nondestructive seed sampling
MX2007002307A (es) * 2004-08-26 2007-04-16 Monsanto Technology Llc Prueba automatizada de semillas.
EP1897434A3 (en) 2004-08-26 2009-01-28 Monsanto Technology, LLC Automated seed sampler and methods of sampling, testing and bulking seeds
AU2005323136A1 (en) * 2004-12-20 2006-07-13 Basf Plant Science Gmbh Nucleic acid molecules encoding fatty acid desaturase genes from plants and methods of use
CN100339481C (zh) * 2005-03-17 2007-09-26 东北师范大学 应用基因沉默技术提高大豆和花生的种子油酸含量的方法
US8097768B2 (en) * 2005-06-09 2012-01-17 University Of North Texas Method of enhancing quality factors in cotton
US8028469B2 (en) 2006-03-02 2011-10-04 Monsanto Technology Llc Automated high-throughput seed sampler and methods of sampling, testing and bulking seeds
CA2656676C (en) 2006-06-28 2016-04-26 Monsanto Technology Llc Small object sorting system and method
WO2008043849A2 (en) 2006-10-13 2008-04-17 Basf Plant Science Gmbh Plants with increased yield
BRPI0811990A2 (pt) 2007-05-31 2014-09-23 Monsanto Technology Llc Separador de semente
US20090075325A1 (en) * 2007-09-19 2009-03-19 Monsanto Technology Llc Systems and methods for analyzing agricultural products
AU2009273754B2 (en) 2008-07-21 2016-07-14 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Improved cottonseed oil and uses
AU2009273755A1 (en) * 2008-07-21 2010-01-28 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Improved vegetable oils and uses therefor
US9842252B2 (en) 2009-05-29 2017-12-12 Monsanto Technology Llc Systems and methods for use in characterizing agricultural products
US20110126319A1 (en) * 2009-11-24 2011-05-26 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Plants Having Increased Oil, Oleic Acid Content and Digestibility and Methods of Producing Same
WO2012000026A1 (en) 2010-06-28 2012-01-05 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Methods of producing lipids
BR112013001330B1 (pt) 2010-07-20 2019-04-02 Monsanto Technology Llc Sistemas de retirada de amostra de semente e método automatizado para remover amostras de tecido de sementes
JP6258208B2 (ja) * 2011-10-21 2018-01-10 ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー エンドポイントｐｃｒを使用して、キャノーラにおいてｆａｄ２遺伝子の接合性を決定する方法
CN104271743B (zh) 2011-12-27 2019-11-05 联邦科学技术研究组织 产生脂质的方法
US8809026B2 (en) 2011-12-27 2014-08-19 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Processes for producing lipids
US11639507B2 (en) 2011-12-27 2023-05-02 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Processes for producing lipids
WO2013159149A1 (en) 2012-04-25 2013-10-31 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation High oleic acid oils
EP2861059B1 (en) 2012-06-15 2017-05-03 Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation Production of long chain polyunsaturated fatty acids in plant cells
NZ721036A (en) 2013-12-18 2023-07-28 Grains Res & Dev Corp Lipid comprising long chain polyunsaturated fatty acids
CN105219789B (zh) 2014-06-27 2023-04-07 联邦科学技术研究组织 包含二十二碳五烯酸的提取的植物脂质
JP6882160B2 (ja) 2014-07-07 2021-06-02 コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガナイゼーション 植物脂質から工業製品を製造する工程
BR112019004530A2 (pt) 2016-09-02 2019-10-22 Commw Scient Ind Res Org plantas com traços modificados

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6372965B1 (en) * 1992-11-17 2002-04-16 E.I. Du Pont De Nemours And Company Genes for microsomal delta-12 fatty acid desaturases and hydroxylases from plants
GB9401780D0 (en) * 1994-01-31 1994-03-23 Nickerson Biocem Ltd Modified plants
CA2557769A1 (en) * 1995-12-14 1997-06-19 Cargill, Incorporated Plants having mutant sequences that confer altered fatty acid profiles
US6342658B1 (en) * 1995-12-14 2002-01-29 Cargill, Incorporated Fatty acid desaturases and mutant sequences thereof
ATE347604T1 (de) * 1996-06-14 2006-12-15 Du Pont Suppressi0n spezifischer klassen von soja- sojasamenproteingenen
US5850026A (en) * 1996-07-03 1998-12-15 Cargill, Incorporated Canola oil having increased oleic acid and decreased linolenic acid content
US6534261B1 (en) * 1999-01-12 2003-03-18 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US7067722B2 (en) * 1999-08-26 2006-06-27 Monsanto Technology Llc Nucleic acid sequences and methods of use for the production of plants with modified polyunsaturated fatty acids
US7531718B2 (en) * 1999-08-26 2009-05-12 Monsanto Technology, L.L.C. Nucleic acid sequences and methods of use for the production of plants with modified polyunsaturated fatty acids
AU5016301A (en) * 2000-04-18 2001-10-30 Commw Scient Ind Res Org Method of modifying the content of cottonseed oil
CA2408357A1 (en) * 2000-05-09 2001-11-15 Bioriginal Food & Science Corp. Production of conjugated linoleic and linolenic acids in plants
AU2001281024A1 (en) * 2000-08-02 2002-02-13 The Board Of Regents Of The University Of Nebraska Down-regulation of single genes and simultaneous down-regulation of multiple genes by nuclear localization of rna transcripts

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105123532B (zh) * 2006-07-14 2018-12-18 联邦科学技术研究组织 改变水稻的脂肪酸组成
CN102786587A (zh) * 2012-06-18 2012-11-21 中国农业大学 一种提高植物种子脂肪酸含量的转录因子及其应用
CN102786587B (zh) * 2012-06-18 2014-01-01 中国农业大学 一种提高植物种子脂肪酸含量的转录因子及其应用

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