CN1259168A - 用来修饰植物种子脂质组成的油质蛋白5′调控区 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及拟南芥菜属油质蛋白基因的5′调控区。该5′调控区在与异源基因编码序列或天然植物基因的互补序列操作性相连时,指导了所述编码序列或互补序列在植物种子中的表达。该调控区可用作转化植物的表达盒和表达载体。本发明还提供了调节异源基因(如脂肪酸合成或脂质代谢基因)水平的方法,该方法是用本发明的表达盒和表达载体转化植物。

Description

用来修饰植物种子脂质组成的油质蛋白5′调控区
发明背景
种子油含量在传统上是通过植物育种来加以改进的。使用重组DNA技术改变种子油组分可以加速这一过程，并能在某些情况下以单用育种无法实现的方法改变种子油。通过修饰大量脂质代谢基因的表达，芸苔属的油组成已经得到显著改变。改进种子油组分的这些操作注重于改变内源性组分脂肪酸的比例。例如，反义阻遏转基因油菜籽中的Δ12-去饱和酶基因已经导致油酸增加至高达83％。Topfer等人，1995年Science 268：681-686。
在修饰转基因植物种子油组分上，通过导入允许产生宿主植物以前不能合成的脂肪酸的新基因，已有一些成功的尝试。Van de Loo等人，(1995 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：6743-6747)已经能够将Δ12-羟化酶基因导入转基因烟草中，从而将新的脂肪酸—蓖麻油酸导入其种子油中。已报道携带构建物植物的油累积是中等程度的，其中羟化酶基因的转录在花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子的控制下。类似地，将烟草植物进行基因工程改造成为能通过芫荽酰基-ACP去饱和酶瑶表达来产生低含量的岩芹酸(Cahoon等人，1992 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：11184-11188)。
长链脂肪酸(C18和更长)作为营养学上和医学上重要的食物以及工业产品，具有显著的经济价值(Ohlrogge，J.B.1994 Plant Physiol.104：821-826)。亚油酸(18∶2Δ9，12)和α亚麻酸(18∶3 Δ9，12，15)是许多种子油中发现的基本脂肪酸。现已通过育种和生物技术来操纵油籽植物中这些脂肪酸的含量(Ohlrogge等人，1991 Biochim.Biophys.Acta 1082：1-26；Topfer等人，1995 Science 268：681-686)。另外，种子油中产生的新脂肪酸可广泛用于人类健康和工业用途。
现认为摄取富含γ亚麻酸(GLA)(18∶3 Δ6，9，12)的植物油可以缓解与冠心病易感性相关的高胆固醇血症和其它相关的临床疾病(Brenner R.R.1976 Adv.Exp.Med.Biol.83：85-101)。食用GLA的治疗效果可能是由于它起着前列腺素合成前体的作用(Weete，J.D.1980《真菌和其它生物体的脂质生物化学》Plenum Press编辑，New York，59-62页)。亚油酸(18∶2)(LA)通过酶Δ6-去饱和酶转化成γ亚麻酸(18∶3)(GLA)。
很少的种子油含有GLA，尽管含有高含量的前体—亚油酸。这是因为大多数植物中缺少Δ6-去饱和酶活性。例如，只有琉璃苣(Borago offcinalis)、月见草(Oenothera Biennis)和黑茶簏子(Ribes nigrum)产生相当数量的亚麻酸。在这三种植物中，只有月见草和琉璃苣作为GLA商品来源进行培育。如果通过引入异源Δ6-去饱和酶基因，将农业种子油基因工程改造成能产生大量GLA，那么将会获益。如果与脂肪酸合成和脂质代谢有关的其它表达产物也能在植物中产生足够高的水平，从而能进行特定表达产物的商品化生产，那么这也会获益。
如美国专利No.5,552,306中所公开的，最近分离获得了蓝藻目细菌Δ6-去饱和酶基因。这些蓝藻目细菌基因在转基因烟草中的表达产生了明显的但低水平的GLA累积。(Reddy等人，1996 Nature Biotech.14：639-642)。申请人的待批美国申请No.08,366,779公开了从植物琉璃苣分离获得Δ6-去饱和酶及其在CaMV35S启动子控制下在烟草中的表达。这些表达在种子内导致了明显的但低含量的GLA和十八碳四烯酸(ODTA或OTA)的累积。因此，需要有一种启动子，该启动子能在植物中起作用并能始终指导脂质代谢基因在转基因植物种子中高水平表达。
油质蛋白是与油体磷脂单层膜结合的丰富的种子蛋白。第一种油质蛋白基因L3是通过选择体外翻译产物被抗L3抗体识别的克隆从玉米中克隆出来的(Vance等人，1987 J.Biol.Chem.262：11275-11279)。随后，从不同植物如芸苔属、大豆、胡萝卜、松树和拟南芥菜属中克隆了油质蛋白基因的不同同种型(Huang，A.H.C.，1992，Ann.Reviews Plant Phys.and Plant Mol.Biol.43：177-200；Kirik等人，1996Plant Mol.Biol.31：413-417；Van Rooijen等人，1992 Plant Mol.Biol.18：1177-1179；Zou等人，Plant Mol.Biol.31：429-433)。从这些基因预测出的油质蛋白序列高度保守，尤其是中央疏水性结构域。所有这些油质蛋白具有的特征是三种不同的结构域。N端有40-60个氨基酸的两亲性结构域；68-74个氨基酸的完全疏水性结构域位于中心；以及30-44个氨基酸的两亲性α螺旋结构域位于C端(Huang，A.H.C.1992)。
本发明提供了油质蛋白基因的5′调控序列，该序列指导脂质代谢基因在转基因植物中高水平表达。本发明提供了嵌合构建物，该构建物包含的油质蛋白5′调控区与脂质代谢基因(如Δ6-去饱和酶基因)的编码序列操作性相连。包含本发明嵌合构建物的转基因植物产生GLA的水平接近天然产生GLA的少数几种植物种类(如月见草(Oenothera biennis))中所见的水平。
发明概述
本发明涉及拟南芥菜属油质蛋白基因的5′调控区。该5′调控区在与异源基因的编码序列或与天然植物基因互补的序列操作性相连时，指导了异源基因或互补序列在植物种子中的表达。
因此本发明提供了表达盒和表达载体，它们包含的油质蛋白5′调控区与异源基因或天然植物基因的互补序列操作性相连。
本发明还提供了含有该表达盒和表达载体的植物转化载体，和用这些载体转化的植物细胞，以及含有该载体的植物及其子代。
在本发明的一个实例中，异源基因或互补基因序列是脂肪酸合成基因或脂质代谢基因。
在本发明的另一个方面，提供了一种生产脂肪酸合成或脂质代谢基因产物水平增加的植物的方法。
特别是，提供了一种生产脂肪酸合成或脂质代谢基因水平增加的植物的方法，该方法是用本发明的表达盒和表达载体转化植物，该表达盒和表达载体包含油质蛋白5′调控区以及脂肪酸合成或脂质代谢基因的编码序列。
在本发明的另一个方面，提供了一种共同抑制天然脂肪酸合成或脂质代谢基因的方法，该方法是用本发明的表达盒和表达载体转化植物，该表达盒和表达载体包含油质蛋白5′调控区以及脂肪酸合成或脂质代谢基因的编码序列。
本发明的另一个方面提供了减少天然植物基因(如脂肪酸合成基因或脂质代谢基因)产生的方法，该方法是用表达载体转化植物，该表达载体包含的油质蛋白5′调控区与天然植物基因的互补核酸序列操作性相连。
本发明还提供了调节异源基因(如脂肪酸合成或脂质代谢基因)水平的方法，该方法是用本发明的表达盒和表达载体转化植物。
附图简述
图1显示了琉璃苣Δ6-去饱和酶基因(SEQ ID NO：1)的核苷酸序列和对应的氨基酸序列。细胞色素b5血红素结合基序用方框表示，推定的金属结合、富含组氨酸基序(HRM)用下划线表示。引物(PCR分析)识别的基序用下划虚线表示，即tgg aaa tgg aac cat aa；和gag cat cat ttg ttt cc。
图2是显示琉璃苣Δ6-去饱和酶与其它膜结合去饱和酶相似性的树状图。用Gene Works(IntelliGenetics)比较琉璃苣Δ6-去饱和酶与其它已知去饱和酶的氨基酸序列。数值与所比较的亚组之间的相对种系间距相关。
图3A提供了从野生型烟草′xanthi′的叶组织衍生的脂肪酸甲酯(FAMES)的气液色谱曲线。
图3B提供了从烟草植物叶组织获得的FAMES的气液色谱曲线，该植物用在CaMV 35S启动子控制下的琉璃苣Δ6-去饱和酶cDNA(pAN2)转化。图示的峰对应于亚油酸甲酯(18∶2)、γ-亚麻酸甲酯(18∶3γ)、α-亚麻酸甲酯(18∶3α)和十八碳四烯酸甲酯(18∶4)。
图4是油质蛋白AtS21 cDNA的核苷酸序列和对应的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)。
图5是DNA水准仪1.2产生的预计的AtS21蛋白的酸-碱性图谱。
图6是DNA水准仪1.2产生的预计的AtS21蛋白的Kyte-Doolittle曲线。
图7是从拟南芥菜属分离的油质蛋白的序列对比。用GeneWorks2.3对比公开或保藏在EMBL、BCM、NCBI数据库中的油质蛋白的序列。相同的残基用矩形框出。7个序列分成三组。第一组包括AtS21(SEQ ID NO：5)、X91918(SEQ ID NO：6)和Z29859(SEQ ID NO：7)。第二组包括X62352(SEQ ID NO：8)和Ato13(SEQ IDNO：9)。第三组包括X91956(SEQ ID NO：10)和L40954(SEQ ID NO：11)。同一组内氨基酸残基差别用阴影表示。Ato2/Z54164和Ats21相同。Ato13序列(EMBL数据库保藏号No.Z541654)实际上未公开在EMBL数据库中。Z54165保藏号指明Z54164的序列与Ato12相同。
图8A是AtS21基因的Northern分析。使含有10微克从拟南芥菜属花(F)、叶(L)、根(R)、发育的种子(Se)、和发育的长角果包膜(Si)抽提的总RNA的RNA凝胶印迹与从全长AtS21 cDNA制得的探针杂交。
图8B是AtS21基因的Southern分析。将含有10微克经BamHI(B)，EcorI(E)，HindIII(H)，SacI(S)和XbaI(X)消化的基因组DNA的DNA凝胶印迹与全长AtS21cDNA制得的探针进行杂交。
图9是AtS21基因组DNA的SacI片段的核苷酸序列(SEQ ID NO：12)。启动子和内含子序列用大写字母表示。对应于AtS21 cDNA序列的片段用小写字母表示。第一个ATG密码子和推定的TATA盒用阴影表示。与21P引物互补的用于PCR扩增的序列用框框出。推定的脱落酸效应元件(ABRE)和两个14bp的重复序列用下划线表示。
图10是AtS21启动子/GUS构建物(pAN5)的图谱。
图11A显示了拟南芥菜属金莲花(bolt)和叶中的AtS21/GUS基因表达。
图11B显示了拟南芥菜属长角果中的AtS21/GUS基因表达。
图11C显示了拟南芥菜属发育种子中的AtS21/GUS基因表达。
图11D至11J显示了拟南芥菜属发育胚体中的AtS21/GUS基因表达。
图11K显示了拟南芥菜属根和幼苗根毛中的AtS21/GUS基因表达。
图11L显示了拟南芥菜属子叶和幼苗5天苗端的AtS21/GUS基因表达。
图11M和11N显示了拟南芥菜属子叶和幼苗5-15天苗端的AtS21/GUS基因表达。
图12A显示了烟草胚体和胚乳中的AtS21/GUS基因表达。
图12B显示了发芽烟草种子中的AtS21/GUS基因表达。
图12C显示了烟草幼苗5天的AtS21/GUS基因表达。
图12D显示了烟草幼苗5-15天的AtS21/GUS基因表达。
图13A显示发育的野生型拟南芥菜属幼苗中AtS21 mRNA水平的Northern分析。泳道1加入发育种子的RNA，泳道2加入吸胀了24-48小时种子的RNA，泳道3：3天幼苗；泳道4：4天幼苗；泳道5：5天幼苗；泳道6：6天幼苗；泳道7：9天幼苗；泳道8：12天幼苗。探针是标记的AtS21 cDNA。-80℃暴光1小时。
图13B是图13A的同一印迹，只是-80℃暴光24小时。
图13C是图13A和13B所示同一印迹在形成条带并和拟南芥菜属微管蛋白基因探针杂交后的图。泳道1和2中的小条带是原先AtS21探针的残余物。-80℃暴光48小时。
图14比较了AtS21和35S启动子表达的GUS活性。发育的拟南芥菜属种子和叶中AtS21启动子表达的GUS活性和35S启动子表达的活性并排绘图在一起。AtS21启动子在烟草干种子和叶中表达的GUS活性绘在图的右侧。烟草叶中的GUS活性低得绘不出柱状图。＂G-H＂指球期至心期；＂H-T＂指心期至鱼雷期；＂T-C＂指鱼雷期至子叶期；＂Early C＂指子叶早期；＂Late C＂指子叶晚期。标准偏差列在表2中。
图15A是琉璃苣叶、根和12dpp胚体组织中分离的5微克RNA样品上进行RNA凝胶印迹分析，采用标记的琉璃苣Δ6-去饱和酶cDNA作为杂交探针。
图15B显示了对应于图15A所示实验的Northern分析结果。
图16A显示根据Northern印迹结果在发育的琉璃苣胚体中的相对豆球蛋白RNA累积。
图16B是根据Northern印迹结果显示在发育的琉璃苣胚体中的相对油质蛋白RNA累积。
图16C是根据Northern印迹结果显示在发育的琉璃苣胚体中的相对Δ6-去饱和酶RNA累积。
图17是显示琉璃苣Δ6-去饱和酶基因存在于油籽油菜转化植物中的PCR分析。泳道1、3和4中加入和植物DNA进行的PCR反应物，该植物被与油质蛋白5′调控区相连的琉璃苣Δ6-去饱和酶基因转化；泳道2：连接白蛋白5′调控区的琉璃苣Δ6-去饱和酶基因转化的植物的DNA；泳道5和6：未转化植物的DNA；泳道7：分子量标记(1kb序列梯，Gibco BRL)；泳道8：PCR没有加入模板DNA；泳道9：根癌农杆菌EHA105的DNA对照，含有质粒pAN3(即琉璃苣Δ6-去饱和酶基因与油质蛋白5′调控区相连)。
发明详述
本发明提供了编码拟南芥菜属油质蛋白基因5′调控区的核酸。根据本发明，该5′调控区在与异源基因编码序列或天然植物基因的互补序列操作性相连时，指导编码序列或互补序列在植物种子中表达。本发明的油质蛋白5′调控区可用来构建表达盒，该表达盒从5′到3′方向包括本发明的油质蛋白5′调控区、在该调控区控制下的异源基因或与天然植物基因互补的序列，以及3′终止序列。该表达盒可以插入各种自主复制的载体，从而构建一个表达载体。
已经惊奇地发现，转化了本发明表达载体的植物产生的GLA水平接近在天然产生GLA的少数植物种类(如月见草(Oenothera biennis))中所见的水平。
本文所用的术语“盒(cassette)”指能表达特定基因的核苷酸序列，如果所述基因的插入与核苷酸序列中存在的一个或多个调控区操作性相连的话。因此，例如，表达盒可包含希望在植物种子内表达的异源编码序列。因此，本发明的表达盒和表达载体可用来指导任何数量的异源基因的种子特异性表达。本文所用的术语“种子特异性表达”指在植物种子不同部位(如胚乳和胚体)中表达。
编码油质蛋白基因5′调控区的分离的核酸可按下述方式提供。用代表油质蛋白mRNA的cDNA(或其部分)筛选植物基因组DNA文库，分离获得油质蛋白重组基因组克隆。已经分离出许多不同的油质蛋白cDNA。用来分离这些cDNA和核苷酸的方法以及对应的氨基酸序列已公开在Kirik等人，1986，Plant Mol.Biol.31：413-417；Zou等人，Plant Mol.Biol.31：429-433；Van Rooigen等人，1992 PlantMol.Biol.18：1177-1 179中。
用随机引导的聚合酶链反应(RP-PCR)有效扣除筛选(virtual subtractionscreening)组织特异性文库是获得用于筛选植物基因组DNA文库的油质蛋白cDNA的另一种方法。有效扣除筛选方法是从靶组织构建cDNA文库，并以低密度展示，这样就可容易地分离出单个cDNA克隆。这些cDNA克隆用非靶组织(即驱动组织)的其它组织制得的cDNA探针的驱动(driver)量(即在动力学上驱动杂交反应的DNA浓度)来作扣除性筛选。杂交的噬斑代表在靶组织和驱动组织中均表达的基因；未杂交的噬斑代表了可能是靶组织特异性的或不能被驱动cDNA探针检测到的低丰度基因。选出未杂交的cDNA作为推定的靶组织特异性基因，用一次通过(one-pass)测序和Northern杂交进一步分析。
随机引导PCR(RP-PCR)涉及从痕量cDNA模板合成大量cDNA探针。该方法将PCR的扩增能力以及随机引导的表现度结合在一起，以便在单试管反应中同时扩增和标记双链cDNA。
例如，在Sambrook等人1989年在《分子克隆实验手册》(Cold Spring Harbor，NY)中或许多关于重组DNA技术的试验手册中提供了认为可用以获得油质蛋白基因组重组DNA的方法，已广泛用于测定核苷酸序列，本领域普通技术人员可采用并知道多种技术。例如，含有油质蛋白调控区的限制性片段可被亚克隆到测序载体(如pBluescript(Stratagene))的多接头位点中。然后，可以用双链双脱氧法(Chen和Seeburg，1985，DNA 4：165)对这些pBluescript亚克隆测序。
在一个较佳的实例中，油质蛋白调控区包含图9的核苷酸1至1267(SEQ IDNO：12)。对SEQ ID NO：12所示油质蛋白调控区的修饰(维持指导种子特异性表达特性)在本发明范围内。这些修饰包括一个或多个核苷酸的插入、缺失和替代。
本发明的5′调控区可从限制性内切酶或外切酶消化油质蛋白基因组克隆来获得。因此，例如，将分离的油质蛋白基因编码区的已知核苷酸或氨基酸序列(如图7)与分离的油质蛋白基因组克隆的核酸或推定的氨基酸序列以及分离的油质蛋白基因组克隆5′侧接序列(即编码区翻译起始密码子上游序列)作序列对比。
SEQ ID NO：12所示油质蛋白5′调控区(图9的核苷酸1至1267)可以从具有越过5′侧接序列或编码序列的基因组克隆通过外切核酸酶III介导的缺失来产生。这通过用外切核酸酶III(exoIII)消化合适制备的DNA并在消化期间在时间间隔渐增中除去各个等份来实现。可对连续获得的较小的DNA片段进行测序，以确定缺失的确切端点。现有几种商品化系统采用外切核酸酶III(exoIII)来产生这种缺失系列，例如Promega Biotech、“Erase-A-Base”系统。另外，可确定PCR引物来直接扩增本发明的5′调控区。
采用同一方法学，普通技术人员可产生SEQ ID NO：12所示核苷酸1-1267的一个或多个缺失片段。包含SEQ ID NO：12所示核苷酸毗邻部分并保留指导种子特异性表达能力的任一和所有缺失片段均是本发明所考虑的。
指导种子特异性表达、包含SEQ ID NO：12的核苷酸1-1267的油质蛋白5′调控序列及其修饰或缺失片段的鉴定可以这样来达成：使特异性序列与异源基因的编码序列转录融合，将该嵌合基因转移到合适宿主中，并检测异源基因的表达。用来检测表达的试验取决于异源序列的特征。例如，通常用报道基因(典型的是氯霉素乙酰转移酶和β-葡糖醛酸酶(GUS))来评价嵌合构建物的转录和翻译能力。可用标准试验来灵敏地检测转基因生物体中的报道酶。β-葡糖醛酸酶(GUS)基因可用作转基因植物中的启动子活性的报道物，因为该酶在植物细胞中高度稳定，高等植物中没有内在的β-葡糖醛酸酶活性，并可利用定量荧光试验和组织化学定位技术。Jerfferson等人(1987 EMBO J 6：3901)已经建立了检测植物组织中GUS活性的生物化学和组织化学标准程序。生物化学试验这样进行：混合植物组织裂解液与4-甲基伞形基(umberlliferyl)-β-D-葡糖苷酸(GUS的荧光底物)，37℃培育1小时，然后测定所得4-甲基伞形酮的荧光。GUS活性的组织化学定位这样来测得：将植物组织样品培育在5-溴-4-氯-3-吲哚基-葡糖苷酸(X-Gluc)中37℃约18小时，观察X-Gluc的染色图形。这些嵌合基因的构建能确定特异性调控序列，并证明这些序列能指导异源基因以种子特异性方式表达。
本发明的另一个方面涉及表达盒和表达载体(本文也称为嵌合植物基因)，它包含指导种子特异性表达的油质蛋白基因5′调控区，该调控区与异源基因的编码序列操作性相连，从而使调控元件能控制异源基因编码产物的表达。异源基因可以是除油质蛋白外的其它任何基因。如果需要，嵌合构建物中可包括其它调控元件、或是足以导致产生有效量异源基因编码多肽表达的这些元件的部分。
因此，本发明提供了嵌合基因，该基因包含的油质蛋白5′调控区序列赋予了种子特异性表达，并与异源基因(如脂质代谢酶)编码序列操作性相连。用于实施本发明的脂质代谢基因的例子包括脂质去饱和酶，如Δ6-去饱和酶、Δ12-去饱和酶、Δ15-去饱和酶和其它相关去饱和酶，如硬脂酰-ACP去饱和酶、酰基载体蛋白(ACP)、硫酯酶、乙酰转酰酶、乙酰辅酶A羧化酶、酮酯酰合成酶、丙二酰转酰酶和延伸酶(elongase)。这些脂质代谢基因已从许多不同种类的细菌和植物中分离出和鉴定。它们的核苷酸编码序列以及分离这些编码序列的方法公开在出版的文献中，并且是本领域那些技术人员能广泛获得的。
特别是，美国专利No.5,552,306和申请人待批美国申请No.08/366,779(1994年12月30日提交，纳入本文作参考)中公开的Δ6-去饱和酶基因被认为是特别适用于实施本发明的脂质代谢基因。
本发明的嵌合基因通过连接油质蛋白基因组DNA的5′调控区和异源基因的编码序列来构建。这些序列的并置可通过各种方式来实现。在一个较佳的实例中，序列顺序(从5′到3′)是油质蛋白5′调控区(包括启动子)、编码序列、包括聚腺苷酸化位点的终止序列。
构建这些嵌合基因的标准技术是本领域普通技术人员所熟知的，并可在诸如Sambrook等人(1989年)的参考文献中找到。可采用各种策略来连接DNA片段，策略的选择取决于DNA片段末端的性质。本领域普通技术人员知道，为了使异源基因表达，构建物需要启动子元件和使转录物有效聚腺苷酸化的信号。因此，可将含有共有启动子序列(称为TATA盒)的油质蛋白5′调控区与无启动子异源编码序列直接连接。
将含有油质蛋白TATA盒的限制性或缺失片段正向连接于无启动子的异源基因(如β-葡糖醛酸(GUS)的编码序列)。本领域技术人员知道，本发明的油质蛋白5′调控区可以其它方式提供，例如化学法或酶法合成。异源编码序列的3′末端可任选地连接于一个终止序列，该终止序列包含一个聚腺苷酸化位点，典型的是(但不局限于)胭脂氨酸合成酶聚腺苷酸化位点、或章鱼氨酸T-DNA基因7聚腺苷酸化位点。或者，聚腺苷酸位点可以由异源基因提供。
本发明还提供了增加植物种子中异源基因水平的方法。根据这些方法，将本发明的表达盒和表达载体导入植物中，以实现异源基因的有效表达。例如，提供了一种脂肪酸合成酶或脂质代谢基因产物水平有所增加的植物的生产方法，此方法是用表达载体转化植物细胞，该表达载体含有的油质蛋白5′调控区与脂肪酸合成或脂质代谢基因操作性相连，重新产生所述脂肪酸合成或脂质代谢基因产物水平有所增加的植物。
本发明另一方面提供了减少植物天然基因产物水平的方法，该方法包括用表达载体转化植物细胞，该载体包含的本发明油质蛋白调控区与该天然植物基因互补性核酸序列操作性相连。这样，天然植物基因的内源性产物水平通过称为反义调节的机制而减少。因此，例如通过用表达载体(该载体包含的本发明油质蛋白5′调控区和编码脂肪酸合成的核酸序列或脂质代谢基因互补的核酸序列操作性相连)转化植物，减少了脂肪酸合成基因或脂质代谢基因产物的水平。
本发明还提供了协同抑制植物中天然存在的基因的方法，该方法包括用表达载体转化植物细胞，该载体包含的本发明油质蛋白调控区与编码天然植物基因的核酸序列操作性相连。这样，天然植物基因内源性产物的水平通过称为协同抑制的机制而减少。因此，例如，通过用一表达载体(该载体所含本发明油质蛋白5′调控区与编码植物天然脂肪酸合成或脂质代谢基因的核酸序列操作性相连)转化植物，就可减少脂肪酸合成基因或脂质代谢基因的产物水平。尽管对协同抑制的确切机理还不完全了解，但本领域技术人员对于报道的协同抑制试验条件和结果的公开研究工作(Napoli等人，1990 The Plant Cell 2：270-298；Van der Krol 1990The Plant Cell 2：291-299)是熟知的。
为了调节异源或天然基因的表达，用本发明的嵌合基因构建物转化植物。基因转移的方法是本领域中熟知的。可通过叶圆片转化-再生程序(如Horsch等人(1985)Science 227：1229所述)将嵌合基因导入植物内。也可采用其它转化方法，如原生质体培育(Horsch等人，1984，Scienc 223：496，DeBlock等人，1984 EMBO J.2：2143，Barton等人，1983，Cell 32：1033)，这也在本发明范围内。在一个较佳的实例中，用例如Klett等人(1987)Annu.Rev.Plant Physiol.38：467中描述的农杆菌衍生载体转化植物。还可用其它熟知的方法将本发明的嵌合基因插入植物细胞内。这些替换方法包括生物分解方法(Klein等人，1987 Nature 327：70)、电穿孔、化学诱导的DNA摄取和用病毒或花粉作为载体。
当需要转化方法时，本发明的嵌合基因可以插入植物转化载体中，例如Bevan，M.1984 Nucl.Acids Res.12：8711-8721中描述的双元载体中。植物转化载体可通过修饰根癌农杆菌的天然基因转移系统获得。该天然系统包括大的Ti(肿瘤诱导)质粒，该质粒含有转移到转化植物中的称为T-DNA的大节段。Ti质粒的另一节段vir区域起转移T-DNA的作用。T-DNA区域的边界是末端重复序列。在修饰的双元载体中，已经删除了肿瘤诱导基因，并利用vir区域的功能来转移以T-DNA边界序列为边界的外来DNA。T区域还含有可选择抗生素抗性标记，和用来插入转移序列的多个克隆位点。这些经工程改造的菌株称为“缺臂(disarmed)”根癌农杆菌株，它允许将以T区域为界的序列有效地转移到植物细胞核基因组中。
用含有外源DNA的“缺臂”根癌农杆菌接种表面灭菌的叶圆片或其它易感组织，培育数天，然后转移到含抗生素培养基中。然后，在含有合适抗生素的培养基中生根后，选择转化的芽，转移到土壤中。对转基因植物授粉，收集这些植物的种子并在抗生素培养基上生长。
可用免疫学、组织化学或活性试验，监测发育的种子、幼苗和成熟植物中异源基因或报道基因的表达。如本文所讨论的，测定嵌合基因表达的试验的选择取决于异源编码区的特征。例如，如果有合适的核苷酸探针，则可用Northen分析来评价转录。如果能获得抗异源基因编码多肽的抗体，则可用Western分析和免疫组织化学定位法来评价多肽的生产和位置。根据异源基因，可以采用合适的生物化学试验。例如，通过测定标准底物的乙酰化可以检测乙酰转移酶。通过分析脂肪酸甲酯(FAME)可以测定脂质去饱和酶基因的表达。
本发明另一方面提供了含有本发明的嵌合基因的转基因植物或这些植物的后代。单子叶和双子叶植物均被考虑在内。利用上述任一植物转化方法用嵌合基因来转化植物细胞。转化的植物细胞通常是愈伤组织培养物、叶圆片、移植物或整个植物的形式(通过Bechtold等人，1993 C.R.Acad.Sci.Paris，316：1194-1199所述的真空渗入方法)，利用本领域普通技术人员熟知的方法(例如Horsh等人，1985Science 227：1129)将细胞再生成完整的转基因植物。在一个较佳的实例中，转基因植物是向日葵、棉花、油籽油菜、玉米、烟草、拟南芥菜属、花生或大豆。由于转化植物的子代遗传继承了嵌合基因，因此用转化植物的种子或插条来维持转基因系。
下列实施例进一步描述了本发明。
                          实施例1
       膜结合多核糖体RNA的分离和琉璃苣cDNA文库的构建
用Larkins和Davies(1975 Plant Phys.55：749-756)针对豌豆建立的方法，在琉璃苣种子授粉后12天(12DPP)分离获得膜结合多核糖体。如Mechler(1987，Methods in Enzymology 152：241-248，Academic Press)所述的那样，从多核糖体抽提出RNA。用Oligotex-dTTM珠粒(Qiagen)从膜结合多核糖体RNA中分离出Poly-A+RNA。
用Stratagene的ZAP cDNA合成试剂盒制备对应的cDNA。用λZAP II试剂盒将cDNA文库构建到λZAP II载体中。用Gigapack II Gold包装抽提物(Stratagene)包装原代文库。
                       实施例2
             从琉璃苣分离Δ6-去饱和酶cDNA
杂交程序
以低密度(150mm Petri皿上500pfu)接种扩增的琉璃苣cDNA文库。通过筛选对应的cDNA，减少高含量的种子储藏蛋白cDNA(从总cDNA中减去)。
用Ausubel等人(1994，Current Protocols in Molecular Biology，WileyInterscience，N.Y.)描述的随机引导DNA合成技术产生用来筛选琉璃苣cDNA文库的杂交探针，并与以前已经鉴定的丰富表达的种子储藏蛋白cDNA对应。用G-50旋转柱(Boehringer Manheim)除去未结合的核苷酸。通过在水浴中沸腾5分钟，使杂交探针变性，然后在冰上迅速冷却。携带固定的重组噬菌体的硝酸纤维素滤膜在杂交溶液[4X SET(600mM NaCl，80mM Tris-HCl，4mM Na2EDTA；pH7.8)，5X Denhardt′s试剂(0.1％牛血清白蛋白，0.1％Ficoll，和0.1％聚乙烯吡咯烷酮)，100μg/ml变性的鲑精DNA，50μg/ml聚腺嘌呤和10μg/ml聚胞苷]中60℃预杂交2-4小时。用加入变性放射活性探针(2ng/ml杂交溶液)的新鲜杂交溶液代替该溶液。60℃培育滤膜搅拌过夜。随后用4X、2X和1X SET(150mM NaCl，20mMTris-HCl，1mM Na2EDTA；pH7.8)于60℃依次洗滤膜15分钟。空气干燥滤膜，然后用增感屏于-80℃暴光X射线胶片24小时。
用Stratagene的切除方法和试剂切除未杂交的噬斑。用所得细菌菌落接种液体培养基，并人工或用ABI自动测序仪测序。
琉璃苣种子12(DPP)膜结合名核糖体文库的cDNA的随机测序
将对应于未杂交噬斑的每个cDNA测序一次，从200-300碱基对产生一个序列标记。所有测序用循环测序法(Epicentre)进行。产生了超过300个表达的序列标记(EST)。用BLAST算法(Altschul等人，1990 J.Mol.Biol.215：403-410)将每个序列标记与GenBank数据库比较。鉴定出许多脂质代谢基因，包括Δ6-去饱和酶。
用BLASTX搜索GenBank数据库，带有cDNA克隆mbp-65数据库搜索结果与以前分离的集胞藻属Δ6-去饱和酶明显匹配。然而，测得mbp-65并不是全长cDNA。用mbp-65分离出全长cDNA，以筛选琉璃苣膜结合多核糖体文库。所得克隆命名为pAN1，用循环测序法对pAN1的cDNA插入物测序。用Geneworks(IntelligGenetics)蛋白序列比较程序将由开放读框(图1，SEQ ID NO：1)推导出的氨基酸序列与其它已知的去饱和酶进行比较。序列对比表明，pAN1的cDNA插入物是琉璃苣Δ6-去饱和酶基因。
所得树状图(图2)显示Δ15-去饱和酶和Δ12-去饱和酶包含两组。新分离出的琉璃苣序列和以前分离出的集胞藻属Δ6-去饱和酶(美国专利No.5,552,306)形成了第三个明显不同的组。去饱和酶常见的氨基酸基序与被认为参与催化金属结合的氨基酸基序的比较表明，琉璃苣基因编码的蛋白与通常的去饱和酶尤其是集胞藻属Δ6-去饱和酶整体相似(表1)。同时，比较表1的基序表明，该蛋白和其它植物去饱和酶间有明显不同。而且，琉璃苣序列也与已知的植物膜结合脂肪酸去饱和酶明显不同，其在细胞色素b5蛋白内存在保守的血红素结合基序(Schmidt等人，1994Plant Mol.Biol.26：631-642)(图1)。因此，尽管这些结果明显说明分离的cDNA是琉璃苣Δ6-去饱和酶基因，但还需要进一步的确认。为了确认琉璃苣Δ6-去饱和酶cDNA的身份，将pAN1的cDNA插入物克隆到表达盒内稳定表达。制备载体pBI121(Jefferson等人，1987 EMBO J.6：3901-3907)用于连接，方法是通过BamHI和EcoICR I(SacI的一种同裂酶，它产生平头；从Promega获得)消化切除GUS编码区留下完整的35S启动子和NOS终止子。通过BamHI和XhoI消化从重组质粒(pAN1)中切除琉璃苣Δ6去饱和酶cDNA。进行DNA聚合酶的I Klenow片段催化的补平反应将XhoI末端变平。然后将该片段克隆到pBI121.1的BamHI/EcoICRI位点中，产生质粒pAN2。
                         表1
         膜结合去饱和酶中常见氨基酸基序的比较
去饱和酶                  脂质盒             金属盒1             金属盒2
琉璃苣Δ6                WIGHDAGH           HNAHH               FQIEHH
                         (SEQ ID NO：15)    (SEQ ID NO：21)     (SEQ ID NO：29)
集胞藻属Δ6              NVGHDANH           HNYLHH              HQVTHH
                         (SEQ ID NO：16)    (SEQ ID NO：22)     (SEQ ID NO：30)
拟南芥菜属                VLGHDCGH           HRTHH               HVIHH
叶绿体Δ15              (SEQ ID NO：17)    (SEQ ID NO：23)     (SEQ ID NO：31)
水稻Δ15                 VLGHDCGH           HRTHH               HVIHH
                         (SEQ ID NO：17)    (SEQ ID NO：23)     (SEQ ID NO：31)
甘氨酸叶绿体Δ15         VLGHDCGH           HRTHH               HVIHH
                         (SEQ ID NO：17)    (SEQ ID NO：23)     (SEQ ID NO：31)
拟南芥菜属                VLGHDCGH           HRTHH               HVIHH
fad3(Δ15)              (SEQ ID NO：17)    (SEQ ID NO：23)     (SEQ ID NO：31)
芸苔属fad3(Δ15          VLGHDCGH           HRTHH               HVIHH
                         (SEQ ID NO：17)    (SEQ ID NO：23)     (SEQ ID NO：31)
琉璃苣Δ12(P1-81)*      VIAHECGH           HRRHH               HVAHH
                         (SEQ IDNO：18)     (SEQ ID NO：24)     (SEQ ID NO：32)
拟南芥菜属                VIAHECGH           HRRHH               HVAHH
fad2(Δ12)              (SEQ ID NO：18)    (SEQ ID NO：24)     (SEQ ID NO：32)
拟南芥菜属                VIGHDCAH           HDRHH               HIPHH
叶绿体Δ12              (SEQ ID NO：19)    (SEQ ID NO：25)     (SEQ ID NO：33)
甘氨酸质体Δ12           VIGHDCAH           HDRHH               HIPHH
                         (SEQ ID NO：19)    (SEQ ID NO：25)     (SEQ ID NO：33)
菠菜质体                  VIGHDCAH           HDQHH               HIPHH
(plastidial)n-6          (SEQ ID NO：19)    (SEQ ID NO：26)     (SEQ ID NO：33)
集胞藻属Δ12             VVGHDCGH           HDHHH               HIPHH
                         (SEQ ID NO：20)    (SEQ ID NO：27)     (SEQ ID NO：33)
鱼腥藻属Δ12             VLGHDCGH           HNHHH               HVPHH
                         (SEQ ID NO：17)    (SEQ ID NO：28)     (SEQ ID NO：34)
*P1-81是全长cDNA，由EST分析鉴定，表现出与拟南芥菜属Δ12去饱和酶(fad2)非常类似。
                          实施例3
      转基因植物的产生以及脂肪酸甲酯(FAME)的制备和分析
根据标准程序(Horsch等人，1985 Science 227：1229-1231；Bogue等人，1990Mol.Gen.Genet.221：49-57)，通过根癌农杆菌用表达质粒pAN2转化烟草(Nicotiana tabacum cv.xanthi)，只是在100微克/毫升卡那霉素上选择最初的转化体。
在液氮中冷冻转基因植物组织并冻干过夜。FAME的制备如Dahmer等人，(1989)J.Amer.Oil.Chem.Soc.66：543-548中所述。在某些情况下，再次蒸发溶剂，将FAME重悬于乙酸乙酯中，用去离子水抽提一次，以除去所有水溶性污染物。如前所述(Reddy等人，1996 Nature Biotech.14：639-642)，用Tracor-560气液色谱分析FAME。
如图3所示，含有琉璃苣cDNA的转基因烟草叶产生了GLA和十八碳四烯酸(OTA)(18∶4 Δ6，9，12，15)。因此，这些结果证明分离的cDNA编码了琉璃苣Δ6-去饱和酶。
                           实施例4
               Δ6-去饱和酶在琉璃苣中的表达
用Northern试验分析琉璃苣组织中获得的RNA，检查Δ6-去饱和酶的天然表达。按照Chang等人1993 Plant Mol.Biol.Rep.11：113-116中的方法，从发育的琉璃苣胚体中分离出RNA。按照标准方法(Brown T.，1996，《现代分子生物学方法》Auselbel等人编辑，[Greene Publishing and Wiley-Interscience，NewYork]4.9.1-4.9.14页)，在甲醛琼脂糖凝胶上电泳分离RNA，通过毛细管转移印迹到尼龙膜上，并80℃烘培固定30分钟。滤膜预先在42℃含有50％去离子甲酰胺、5X Denhardt′s试剂、5X SSPE(900mM氯化钠；50mM磷酸钠，pH7.7；5mMEDTA)、0.1％SDS和200微克/毫升变性鲑精DNA的溶液中培育。2小时后，将滤膜加入组成相同并加入了变性放射活性杂交探针的新鲜溶液中。在此例中，所用探针为琉璃苣豆球蛋白cDNA(图16A)、琉璃苣油质蛋白cDNA(图16B)和琉璃苣Δ6-去饱和酶cDNA(pAN1，实施例2)(图16C)。用EST克隆分离琉璃苣豆球蛋白和油质蛋白cDNA，并用实施例2所述的BLAST算法与GenBank数据库比较来鉴定。通过标准化至琉璃苣EF1αmRNA水平来校正加样偏差。通过与实施例2所述EST分析获得的对应cDNA相关连，鉴定EF1αmRNA。使滤膜于42℃杂交12-20小时，然后如上所述洗涤(只是温度为65℃)、空气干燥并暴光X-射线胶片。
如图15A和15B所示，Δ6-去饱和酶主要在琉璃苣种子中表达。琉璃苣种子在授粉后(dpp)18-20天之间达到成熟。整个收集时间(8-20dpp)内均有Δ6-去饱和酶mRNA表达，但是在授粉后10-16天出现最大值。该表达曲线与琉璃苣油质蛋白和12S种子储藏蛋白mRNA所见曲线类似(图16A、16B和16C)。
                          实施例5
            新的油质蛋白cDNA的分离和特性分析
用从根组织衍生获得的随机引导聚合酶链反应(RP-PCR)cDNA探针，用有效扣除筛选拟南芥菜属发育种子cDNA文库，分离出油质蛋白(AtS21)cDNA。
RNA制备
使鼠耳芥(Arabidopsis thaliana Landsberg erecta)植物在室温(22℃)下在蛭石/土壤混合物中持续照明下生长。开花后2-5天解剖长角果，以分开收集发育的种子和长角果外壳。还收集含有最初花芽的花序以及全开花、叶和开花后1或3天的全长角果。从已经在Gamborg B5液体培养基(GIBCO BRL)中生长两周的幼苗获得根。用于根培养的种子先用50％漂白剂灭菌5分钟，然后用水彻底清洗。将所有组织液氮冷冻并-80℃保藏备用。按照热苯酚/SDS抽提和LiCl沉淀方法(Harris等人，1978 Biochem.17：3251-3256；Galau等人，1981 J.Biol.Chem.256：2551-2560)分离总RNA。按照生产商说明书(PHARMACIA或STRATAGENE)用寡聚dT柱层析或用oligotex-dT乳胶颗粒(QIAGEN)分离多聚A+RNA。
组织特异性cDNA文库的构建
用ZAP cDNA合成试剂盒(Sratagene)从5微克多聚A+RN各自构建花、一天后长角果、三天后长角果、叶、根和发育种子的cDNA文库。将cDNA有方向地克隆到λ-ZAPII载体中pBluescript SK(-)的EcoRI和XhoI位点中(Short等人，1988 Nucleic Acids Res.16：7583-7600)。通过含有X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃糖苷)和IPTG(异丙基-1-硫代-β-D-半乳糖吡喃糖苷)的NZY板上产生蓝色来鉴别非重组噬斑。花、一天后长角果、三天后长角果、叶、根和发育种子cDNA文库的非重组背景分别为2.8％，2％m，3.3％，6.5％，2.5％和1.9％。
随机引导DNA标记
用EcoRI/XhoI双消化切下分离的克隆的cDNA插入物，并凝胶纯化用于随机引导标记。Klenow反应混合物含有50ng DNA模板、10mM Tris-HCl、pH7.5，5mM MgCl2、7.5mM DTT、dCTP，dGTP和dTTP各50μM、10μM六聚随机引物(Boehringer Mannheim)、50μCiα-32P-dATP、3000Ci/毫摩尔、10mCi/毫升(DuPont)和5单位的DNA聚合酶I Klenow片段(New England Biolabs)。反应于37℃进行1小时。取等份的稀释反应混合物用于TCA沉淀和碱性变性凝胶分析。杂交探针只用Klenow DNA聚合酶标记，用Sephadex RG-50旋转柱(Boehringer Mannheim)除去未掺入的dNTP。
随机引导PCR
用cDNA合成系统(GIBCO BRL)以寡聚dt12-18为引物，从分离自拟南芥菜属根组织的多聚A+RNA合成双链cDNA。用Sephacryl S-400柱层析(Stratagene)富集长度高于300bp的cDNA。分级的cDNA用作RP-PCR标记的模板。反应物含有10mM Tris-HCl，pH9.0，50mM KCl，0.1％Triton X-100，2mM MgCl2，5单位Taq DNA聚合酶(PROMEGA)，200μM dCTP，cGTP和dTTP，以及不同浓度的六聚随机引物α-32P dATP，800mCi/毫摩尔，10mCi/毫升(DuPont)，和冷dATP，最终体积为25微升。在最初95℃ 5分钟后，通过不同程序进行不同反应，以优化RP-PCR cDNA条件。除非另有所述，下列程序用于大多数RP-PCR cDNA探针标记：95℃/5分钟，然后40轮的95℃ 30秒，18℃ 1秒，以0.1℃/秒的速度升至30℃，72℃ 1分钟。用苯酚/氯仿抽提RP-PCR产物，乙醇沉淀或通过Sephadex G-50旋转柱(Boehringer Mannheim)纯化。
克隆印迹有效扣除
使文库的重组噬菌体和ExAssist辅助噬菌体(STRATAGENE)共感染XL1-Blue MRF′宿主细胞，进行λ-ZAP cDNA文库的质量切除(mass excision)。用SOLR细胞挽救切除的噬菌粒。用沸腾微量制备方法(Holmes等人，1981 Anal.Biochem.114：193-197)从随机分离的克隆制备质粒DNA。通过EcorI和XhoI双消化切下cDNA插入物，重新溶解在1％琼脂糖凝胶中。使DNA在0.5N NaOH和1.5m NaCl中变性45分钟，在0.5M Tris-HCl，pH8.0和1.5M NaCl中中和45分钟，然后转移印迹到10X SSC中的尼龙膜(Micron Separations，Inc.)上过夜。预先于65℃杂交1小时后，将根RP-cDNA探针加入含有1％牛白蛋白级分V(Sigma)、1mM EDTA，0.5M NaHPO4，pH7.2，7％SDS的相同杂交缓冲液中。继续在65℃杂交24小时。室温下用0.5％牛白蛋白，1mM EDTA，40mM NaHPO4，pH7.2，5％SDS洗涤滤膜10分钟，然后于65℃用1mM EDTA，40mM NaHPO4，pH7.2，1％SDS洗涤10分钟(3次)。-80℃下暴光X-射线胶片(Kodak)2-5天进行放射自显影。
所得印迹与根RP-PCR探针“有效扣除”种子cDNA的杂交共同具有根mRNA群。其余种子cDNA代表了推定的种子特异性cDNA，包括编码油质蛋白的那些，用循环测序法进行测序，从而鉴定出AtS21作为油质蛋白cDNA克隆。
AtS21的序列分析
油质蛋白cDNA长834bp，包括18bp长的多聚A尾(图4，SEQ ID NO：2)。它与拟南芥菜属以及其它植物的其它油质蛋白基因高度同源。最近，已经报道了相同的油质蛋白基因(Zou等人，1996，Plant Mol.Biol.31：429-433)。预计的蛋白质长191个氨基酸，其中间高度疏水性结构域每侧连接了亲水性结构域。上游存在两个读框内终止密码子以及与其它油质蛋白基因的相似性表明该cDNA是全长的。由于紧靠第一个ATG上游有两个读框内终止密码子，所以认为该cDNA是全长cDNA(图4，SEQ ID NO：2)。预计的蛋白质有三个不同的结构域(根据其氨基酸残基的分布)。N端和C端结构域均富含带电荷残基，而中央结构域是完全疏水性(图5)。在中央结构域内有多达20个亮氨酸残基，呈重复排列，每7-10个残基中有一个亮氨酸。其它非极性氨基酸残基也簇集在中央结构域中，从而使得该结构域呈完全疏水性(图6)。
用AtS21 cDNA及其预计蛋白质序列广泛搜寻不同数据库，鉴定来自胡萝卜、玉米、棉花、油菜籽、拟南芥菜属和其它植物种类的油质蛋白。同源性主要局限于中央疏水性结构域中。发现了7个拟南芥菜属油质蛋白序列。AtS21代表与Z54164相同的基因，该基因的5′非翻译区有更多的碱基。对目前现有的拟南芥菜属油质蛋白序列相互作序列对比(图7)。结果表明，7个序列分为3组。第一组包括AtS21(SEQ ID NO：5)，X91918(SEQ ID NO：6)和Z29859(SEQ ID NO：7)部分序列。由于X91918(SEQ ID NO：6)仅有最后一个残基与AtS21(SEQ ID NO：5)不同，而Z29859(SEQ ID NO：7)只有3个氨基酸残基与AtS21(SEQ ID NO：5)不同，因此所有三个序列可能代表相同的基因。第二组的两个序列X62352(SEQ IDNO：8)和Atol3(SEQ ID NO：9)的序列和长度均不同。因此，毫无疑问它们代表两个独立的基因。象第一组一样，第三组的两个序列X91956(SEQ ID NO：10)和L40954(SEQ ID NO：11)也仅有三个差异的残基(可能由于测序误差引起)。因此X91956(SEQ ID NO：10)和L40954(SEQ ID NO：11)可能代表了相同的基因。与从cDNA序列预计的所有其它油质蛋白的序列不同，X62352(SEQ ID NO：8)从基因组序列推导出(Van Rooigen等人，1992 Plant Mol.Biol.18：1177-1179)。总之，目前已经鉴定出四种不同的拟南芥菜属油质蛋白基因，它们只在疏水性结构域中间保守。
Northern分析
为了对天然AtS21基因的表达方式作特性分析，如实施例4所述进行Norhter分析，只是探针是用32P-dATP标记至比活为5×108cpm/μg的AtS21 cDNA(pAN1插入物)。
结果表明AtS21基因在发育种子中强表达，而在长角果外壳中弱表达(图8A)。在发育种子RNA中还检测到长得多的转录物，它可能代表未经加工的AtS21mRNA前体。在花、叶、根(图8A)或一天长角果RNA中也没有检测到AtS21。不同的Northern分析揭示AtS21也在吸胀发芽种子中强表达(图13A和13B)。
                          实施例6
      油质蛋白基因组克隆的特性分析和油质蛋白启动子的分离
用全长cDNA(AtS21)作为探针筛选拟南芥菜属基因组DNA文库，分离出基因组克隆。用限制性酶消化作两个基因组克隆的图谱，然后用SacI切割的cDNA5′一半作为探针进行Southern杂交。亚克隆2kb SacI片段并测序(图9，SEQ ID NO：35)。基因组克隆的两个区域与cDNA序列相同。395bp的内含子将此两个区域分开。
进行基因组DNA Southern杂交，然后用酶BamHI，EcoRI，HindIII，SacI和XbaI消化，用全长cDNA为探针(图8B)，测定AtS21基因在拟南芥菜属基因组中的拷贝数。除SacI消化的泳道检测到两条条带外，所有泳道内检测到单一条带。由于cDNA探针有一个内部SacI位点，这些结果表明AtS21在拟南芥菜属基因组中是单拷贝基因。由于已经知道拟南芥菜属基因组含有不同的油质蛋白基因同种型，该Southern分析也证明了拟南芥菜属不同油质蛋白同种型在DNA序列水平是趋异的。
由395bp内含子分开的基因组DNA片段的两个区域与AtS21 cDNA序列相同。用AtS21 cDNA序列上游5′启动子序列进行数据库搜寻，没有鉴定出具有显著同源性的序列。另外，比较AtS21启动子序列和另一个以前已经分离的拟南芥菜属油质蛋白启动子(Van Rooigen等人，1992)，也揭示几乎没有相似性。AtS21启动子序列富含A/T碱基，并含有多达44个10-14bp范围内只允许一个错配的同向重复序列。图9中两个14bp同向重复序列和推定的ABA效应元件用下划线表示。
                          实施例7
        AtS21启动子/GUS基因表达盒的构建以及在转基
             因拟南芥菜属和烟草中的表达方式
AtS21启动子/GUS基因表达盒的构建
用PCR扩增从基因组DNA片段ATG密码子上游第一个G开始的1267bp启动子片段，并与GUS报道基因融合，以分析其活性。用与第一ATG密码子上游5′非翻译区互补的T7引物GTAATA CGACTC ACTAT AGGGC(SEQ ID NO：13)和21P引物GGGGAT CCTAT ACTAA AACTA TAGAG TAAAGG(SEQ ID NO：14)(图9)扩增AtS21基因组克隆的启动子片段。21P引物引入一个BamHI克隆位点。将扩增片段克隆到pBluescript KS(Stratagene)的BamHI和SacI位点中。对个别克隆测序以检查可能的PCR突变以及其插入物的方向。用BamHI和HindIII消化正确的克隆，将切下的启动子片段(1.3kb)克隆到pBI101.1(Jefferson，R.A.1987a，Plant Mol.Biol.Rep.5：387-405；Jefferson等人，1987b，EMBO J.6：3901-3907)中GUS基因上游的对应位点中。所得质粒命名为pAN5(图10)。按照Bechtold等人(1993)C.R.Acad.Sci.Paris，316：1194-1199中所述的真空渗入方法将AtS21启动子/GUS构建物(pAN5)导入烟草(用叶圆片方法，Horsch等人，1985；Bogue等人，1990 Mol.Gen.Gen.221：49-57)和拟南芥菜属哥伦比亚生态型中。对种子灭菌并在含50微克/毫升卡那霉素和500微克/毫升羧苄青霉素的培养基上选择。
GUS活性试验：
用组织化学染色显示GUS报道基因的表达方式(Jefferson等人，1987a，PlantMol.Biol.Rep.5：387-405)。使不同组织在含有2毫克/毫升5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸(X-Gluc)(Research Organics，Inc.)、0.5mM亚铁氰化钾和0.5mM铁氰化钾(50mM磷酸钠缓冲液pH7.0配)的底物溶液中37℃染色过夜，然后依次在20％、40％和80％乙醇中脱水(Jefferson等人，1987)。用Axiophot(Zeiss)复合显微镜或Olympus SZH10解剖显微镜拍照。用Spring/Scan 35LE玻片扫描仪(Polaroid)将玻片转变成数字图像，用Adobe PhotoshopTM3.0.5版和CanvasTM3.5版编辑。
用2mM 4-MUG(4-甲基伞形基-β-D葡糖醛酸)作为底物，用荧光计定量测定GUS活性(Jefferson等人，1987)。根据种子颜色对发育的拟南芥菜属种子分期，收集其它植物组织并-80℃保藏备用。在含50mM磷酸钠pH7.0，10mM EDTA，10mMβ-巯基乙醇，0.1％Triton X-100和0.1％月桂基肌氨酸钠的抽提缓冲液中研磨植物组织。用微型离心机离心5分钟除去组织碎片。等分上清液，与底物混合并于37℃培育1小时。每个样品作一式三份测定。加入4体积0.2M碳酸钠终止反应。用TKO-100 DNA荧光计(Hoefer Scientific Instruments)读取荧光值。用Bradford方法(Bio Rad)测定抽提物的蛋白浓度。
Ats21启动子/GUS在转基因拟南芥菜属和烟草中的表达方式
在拟南芥菜属中，在绿色种子以及长角果、茎生叶和枝条连接花序杆连接的结节区域处检测到GUS活性(图11A和11B)。在叶、根、花、长角果外壳或花序杆节间区域没有检测到GUS活性。详细研究发育种子中的GUS表达结果表明，AtS21启动子只在胚体已经发育超过心期(图11C和11G)的绿色种子中有活性。组织化学染色可检测到GUS活性的最年幼的胚体处于鱼雷早期。令人感兴趣的是，染色只局限于胚体的下部，包括下轴胚和胚基。在幼小子叶中没有检测到染色(图11D和11E)。当胚体处于鱼雷晚期或甚至是子叶早期时，子叶开始被染色(图11F和11H)。后来，整个胚体被染色，并且随着胚体成熟染色变得更强。还观察到，GUS基因表达局限于胚体。种子外壳和年幼胚乳没有被染色(图11C)。
在发育幼苗中也检测到GU活性。3-5日龄的幼苗全部被染色。尽管靠近下轴胚的一些根毛被染色(图11K)，但是大多数新形成的结构(如根毛、侧根原基和苗端)没有被染色(图11L和11N)。后来，当侧根从延伸的胚体根中长出时，染色局限于子叶和下轴胚。胚体根上的染色消失。在新形成的侧根、真叶以及真叶上的毛状体上没有发现染色(图11M和11N)。
Ats21启动子/GUS在烟草中的表达方式基本上与拟南芥菜属中的相同。GUS活性仅在晚期种子和成熟植物的不同结节区检测到。在发芽种子中，在胚体从吸胀种子中解剖出后1小时整个胚体内均检测到强染色。成熟胚乳(拟南芥菜属种子没有)而不是种子外壳也被染色(图12A)。一个转基因系的一些幼苗的根尖没有被染色(图12B)。另外，发育烟草幼苗中的GUS表达方式与拟南芥菜属幼苗中所见相同(图12B、12C和12D)。新形成的结构如侧根和真叶没有被染色。
发育幼苗中的AtS21 mRNA水平
由于在拟南芥菜属和烟草幼苗中观察到的AtS21启动子/GUS强活性与油质蛋白基因的种子特异性表达不相符，进行了Norhtern分析以确定AtS21 mRNA是否存在于GUS活性如此强的发育幼苗中。制备从24小时至12天的不同期幼苗的RNA，用AtS21 cDNA作为探针进行Northern杂交。令人惊奇的是，检测到的AtS21 mRNA高水平相当于24-48小时吸胀种子中发育种子中的水平。当幼苗于74小时首次出土时，mRNA水平显著下降(图13A和13B)。在96小时较大幼苗中，即使暴光更长时间也没有检测到信号(图13B)。使同一印迹与微管蛋白基因探针(图13C)(如实施例2所述分离并用EST分析鉴定)杂交，检查RNA样品的加样。由于种子AtS21 mRNA如此丰富，残余AtS21探针即使在充分剩去后仍在印迹上。这些结果表明在吸胀种子和极年幼的幼苗中检测到的AtS21 mRNA是干种子AtS21 mRNA的遗留物。最近已经报道，油质蛋白Ato12 mRNA(与AtS21相同)在干种子中最为丰富(Kirik等人，1996 Plant Mol.Biol.31(2)：413-417)。同样，幼苗中的强GUS活性很可能是由于β-葡糖醛酸酶蛋白以及干种子期遗留的mRNA从头合成的β-葡糖醛酸酶的遗留所致。
                        实施例8
        AtS21启动子和35S启动子之间的活性比较
比较构建物pBI221中AtS21启动子和35S启动子在拟南芥菜属发育种子中表达的GUS活性(Jefferson等人，EMBO J.6：3901-3907)。种子根据其颜色分期(表2)。最早期为从球期到心晚期，此时种子仍为白色，但已大得足以从长角果上切下。在此期测得AtS21启动子活性的水平比35S启动子低大约3倍。35S启动子活性在整个胚体发育过程中保持同一低水平。相反，AtS21启动子活性随着胚体通过鱼雷期迅速增加并在成熟期达到最高水平25.25皮摩尔4-MU/分钟·微克蛋白(图5-8)。AtS21启动子的峰值活性比其在球期至心期时的最低活性高210倍，比同期35S启动子活性高近100倍(表2)。AtS21启动子的活性水平与另一拟南芥菜属油质蛋白启动子在欧洲油菜(Brassica napus)中表达的活性相似(Plant等人，1994，Plant mol.Biol.25：193-205)。在叶子中背景水平下也检测到AtS21启动子活性。高于平均值本身的高的标准偏差表明，只在一些株系的叶中采检测到GUS活性(表2)。另一方面，叶子中的35S启动子活性比种子中的活性高20倍以上。AtS21启动子和35S启动子之间的活性并排比较显示在图14中。
尽管AtS21启动子在烟草干种子中的活性比在拟南芥菜属干种子中低大约3倍，但是其GUS活性绝对值仍要高于35S启动子在拟南芥菜属叶中表达的GUS活性(表2)。在烟草叶中没见有可检测的AtS21启动子活性(图14)。
AtS21启动子对35S启动子的比较揭示，后者并不是在发育种子中高水平表达基因的好的启动子。由于35S启动子在整个胚体发育期间始终保持低的活性，因此它可用来持续低水平表达靶基因。另一方面，AtS21启动子是非常强的启动子，它可用来表达从心期胚体开始的基因并累积直到脂质干种子期。而35S启动子在心期前胚体中表达基因优于AtS21启动子(尽管并不有效)。
                             表2
            AtS21和35S启动子/GUS构建物的GUS活性颜色期    白色      白色/黄色     黄色       浅绿         深绿          绿色/黄色/   棕色          叶
      G-H          H-T        T-C        C早期        C晚期           棕色       干种子
                                                                     成熟期AtS21  0.12±0.17  1.35±1.57  6.77±1.25  18.99±3.75  21.85±4.45  25.25±4.64  24.38±10.85  0.08±0.35S    0.30±0.06  0.25±0.08  0.29±0.04  0.28±0.03   0.33±0.06   0.26±0.04   0.31±0.02    6.56±0.AtS1   (在烟草中)                                                                 8.81±0.21    0.01±0.
缩写：G，球期；H，心期；T，鱼雷期；C，子叶期。
GUS活性单位为皮摩尔4-MU/微克蛋白分钟。对于AtS21启动子，数值为5个独立株系的平均值和标准偏差。每一株系重复测定三次。对于35S启动子，数值是同一株系的三次重复测定值平均值和标准偏差。
                        实施例9
    Δ6-去饱和酶基因在AtS21启动子控制下的表达以及
        与在CaMV 35S启动子控制下的表达的比较
为了产生用AtS21启动子驱动琉璃苣Δ6去饱和酶基因的表达构建物，用SmaI和EcoICR I消化除去pAN5的GUS编码片段。然后首先用XhoI消化(如上所述填平残留的突出端)，然后用SamI消化，切除pAN1的cDNA插入物(实施例2)。用所得片段代替pAN5的切除部分，获得pAN3。
在用实施例7的方法转化烟草和拟南芥菜属后，用实施例3所述方法测定其反应产物对应的脂肪酸甲酯(γ-亚麻酸(GLA)和十八碳四烯酸(OTA))，监测Δ6-去饱和酶活性水平。转基因种子中的GLA和OTA水平(表3)范围分别为C18脂肪酸的6.7％(平均为3.1％)和2.8％(平均为1.1％)。在这些植物的叶子上没有检测到GLA或OTA。相比，CaMV 35S启动子/Δ6-去饱和酶转基因植物在种子中产生了C18脂肪酸3.1％的GLA水平(平均为1.3％)，而在种子中没有可检测的OTA。
                                          表2
                      琉璃苣Δ6-去饱和酶在转基因植物中的表达
  启动子  植物              种子             叶
GLA*   范围    OTA*  范围 GLA   范围     OTA  范围
花椰菜花叶病毒35S  烟草 1.3    0.7-.31      n.d. 20    19-22    9.7  8-11
拟南芥菜属油质蛋白  拟南芥菜属 3.1    0-6.7   1.1    0-2.8    n.d.          n.d.
*平均值表示成C18脂肪酸的百分数；n.d.，未测定
                         实施例10
       用包含连接了琉璃苣Δ6-去饱和酶基因的油质蛋白
               5′调控区的表达盒转化油籽油菜
用含有质粒pAN3(即在拟南芥菜属油质蛋白启动子控制下的琉璃苣Δ6-去饱和酶—实施例9)的根癌农杆菌株EHA105转化油籽油菜(cv.Wester)。
使Westar的末端节间与诱导的根癌农杆菌株EHA105共培育2-3天(Alt-Moerbe等人，1988 Mol.Gen.Genet.213：1-8；James等人，1993 Plant Cell Reports12：559-563)，然后转移到再生培养基中(Boulter等人，1990 Plant Science 70：91-99；Fry等人，1987 Plant Cell Reports 6：321-325)。将新生芽转移到生长培养基中(Pelletier等人，1983 Mol.Gen.Genet.191：244-250)，在叶子片段上进行聚合酶链反应(PCR)试验，以评价基因的存在。
按照K.M.Haymes等人，(1996)Plant Molecular Biology Reporter，14(3)：280-284所述的方法从叶中分离出DNA，重悬于100微升水中，不用RNA酶处理。用5微升抽提物进行PCR反应，最终体积为50微升。反应在Perkin-Elmer 9600热循环仪上进行下列循环：
1轮：95℃，5分钟
30轮：95℃，45秒；52℃，45秒
      72℃，1分钟
1轮：72℃，5分钟采用下列引物(从金属盒区域附近序列衍生获得，如图1和SEQ ID NO：1所示)：
5′TGG AAA TGG AAC CAT AA 3′
5′GGA AAC AAA TGA TGC TC 3′
DNA的扩增揭示了预计的549碱基对的PCR片段(图17)。
将阳性根苗转移到延伸培养基中，然后转移到生根培养基中(DeBlock等人，1989 Plant Physiol.91：694-701)。将根系统发育良好的嫩枝转移到温室内。当植物发育完善时，收集叶子进行Southern分析以便评价基因拷贝数。
按照Bouchez等人(1996)Plant Molecular Biology Reporter14：115-123中的方法抽提基因组DNA，用限制性酶BglI和/或ClaI消化，在琼脂糖凝胶上电泳分离(Maniatis等人，1982，《分子克隆实验手册》Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor/NY)，按照生产商说明书制备，用于转移到尼龙膜(Nytran膜，Schleicher & Schuell)上。然后用20XSSC通过毛细管作用过夜将DNA转移到膜上(Maniatis等人，1982)。转移后用UV(Stratagene)使膜交联30秒，在65℃杂交烘箱(Appligene)中在玻璃管中含6XSSC、0.5％SDS和2.25％w/w脱水脱脂奶的15毫升溶液中预杂交1小时。使膜在含有变性杂交探针的相同溶液中杂交过夜，该探针用随机引物方法以32P放射性标记至比活为108cpm/微克(用从Pharmacia获得的Ready-To-Go试剂盒)。此探针代表了琉璃苣Δ6-去饱和酶基因的PCR片段(用上述条件和引物获得)。杂交后，于65℃用2XSSC、0.1％SDS洗滤膜15分钟，用0.2XSSC、0.1％SDS洗15分钟。然后将膜包在Saran-Wrap中，在-70℃、不透光的盒中用增感屏暴光Kodak XAR胶片。暴光时间通常为3天。
获得的结果确认了基因的存在。根据基因构建物，BglI或ClaI消化的每一DNA泳道中的条带数量代表了植物基因组DNA中存在的Δ6-去饱和酶基因数。BglI和ClaI的消化共同产生了3435bp的片段。
术语“包含”或“包括”定义成权利要求中所述的特征、整体、步骤或组分，但是不排除一个或多个其它特征、整体、步骤或组分或其组合的存在或增加。
            序列表(1)一般信息：
(i)申请人：Rhone Poulenc Agro
           Thomas.Terry L.
           Li，ZhongSen
(ii)发明名称：用来修饰植物种子脂质组成的油质蛋白5′调控区
(iii)序列数目：35
(iv)通信地址：
    (A)收件人：Scully，Scott，Murphy & Presser
    (B)街道：400 Garden City Plaza
    (C)城市：Garden City
    (D)州：New York
    (E)国家：USA
    (F)邮编：11530
(v)计算机可读形式：
    (A)记录介质类型：软盘
    (B)计算机：IBM PC兼容型
    (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
    (D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.30
(vi)本申请资料：
    (A)申请号：08/831,575
    (B)申请日：1997年4月9日
    (C)分类：
(viii)律师/代理人信息：
    (A)姓名：DiGiglio，Frank S.
    (B)登记号：31，346
    (C)参考/案卷号：10203
(ix)通讯信息：
    (A)电话：(516)742-4343
    (B)电传：(516)743-4366(2)SEQ ID NO：l的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：1684碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：双链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(ix)特征：
    (A)名称/关键：CDS
    (B)位置：43..1387
(xi)序列描述：SEQ ID NO：l：ATATCTGCCT ACCCTCCCAA AGAGAGTAGT CATTTTTCAT CA ATG GCT GCT CAA          54
                                           Met Ala Ala Gln
                                             1ATC AAG AAA TAC ATT ACC TCA GAT GAA CTC AAG AAC CAC GAT AAA CCC        102Ile Lys Lys Tyr Ile Thr Ser Asp Glu Leu Lys Asn His Asp Lys Pro5                  10                  15                  20GGA GAT CTA TGG ATC TCG ATT CAA GGG AAA GCC TAT GAT GTT TCG GAT        150Gly Asp Leu Trp Ile Ser Ile Gln Gly Lys Ala Tyr Asp Val Ser Asp
             25                  30                  35TGG GTG AAA GAC CAT CCA GGT GGC AGC TTT CCC TTG AAG AGT CTT GCT        198Trp Val Lys Asp His Pro Gly Gly Ser Phe Pro Leu Lys Ser Leu Ala
         40                  45                  50GGT CAA GAG GTA ACT GAT GCA TTT GTT GCA TTC CAT CCT GCC TCT ACA        246Gly Gln Glu Val Thr Asp Ala Phe Val Ala Phe His Pro Ala Ser Thr
     55                  60                  65TGG AAG AAT CTT GAT AAG TTT TTC ACT GGG TAT TAT CTT AAA GAT TAC        294Trp Lys Asn Leu Asp Lys Phe Phe Thr Gly Tyr Tyr Leu Lys Asp Tyr
 70                  75                  80TCT GTT TCT GAG GTT TCT AAA GAT TAT AGG AAG CTT GTG TTT GAG TTT        342Ser Val Ser Glu Val Ser Lys Asp Tyr Arg Lys Leu Val Phe Glu Phe85                  90                  95                 100TCT AAA ATG GGT TTG TAT GAC AAA AAA GGT CAT ATT ATG TTT GCA ACT        390Ser Lys Met Gly Leu Tyr Asp Lys Lys Gly His Ile Met Phe Ala Thr
            105                 110                 115TTG TGC TTT ATA GCA ATG CTG TTT GCT ATG AGT GTT TAT GGG GTT TTG        438Leu Cys Phe Ile Ala Met Leu Phe Ala Met Ser Val Tyr Gly Val Leu
        120                 125                 130TTT TGT GAG GGT GTT TTG GTA CAT TTG TTT TCT GGG TGT TTG ATG GGG        486Phe Cys Glu Gly Val Leu Val His Leu Phe Ser Gly Cys Leu Met Gly
    135                 140                 145TTT CTT TGG ATT CAG AGT GGT TGG ATT GGA CAT GAT GCT GGG CAT TAT        534Phe Leu Trp Ile Gln Ser Gly Trp Ile Gly His Asp Ala Gly His Tyr
150                 155                 160ATG GTA GTG TCT GAT TCA AGG CTT AAT AAG TTT ATG GGT ATT TTT GCT        582Met Val Val Ser Asp Ser Arg Leu Asn Lys Phe Met Gly Ile Phe Ala165                 170                 175                 180GCA AAT TGT CTT TCA GGA ATA AGT ATT GGT TGG TGG AAA TGG AAC CAT        630Ala Asn Cys Leu Ser Gly Ile Ser Ile Gly Trp Trp Lys Trp Asn His
            185                 190                 195AAT GCA CAT CAC ATT GCC TGT AAT AGC CTT GAA TAT GAC CCT GAT TTA      678Asn Ala His His Ile Ala Cys Asn Ser Leu Glu Tyr Asp Pro Asp Leu
        200                 205                 210CAA TAT ATA CCA TTC CTT GTT GTG TCT TCC AAG TTT TTT GGT TCA CTC      726Gln Tyr Ile Pro Phe Leu Val Val Ser Ser Lys Phe Phe Gly Ser Leu
    215                 220                 225ACC TCT CAT TTC TAT GAG AAA AGG TTG ACT TTT GAC TCT TTA TCA AGA      774Thr Ser His Phe Tyr Glu Lys Arg Leu Thr Phe Asp Ser Leu Ser Arg
230                 235                 240TTC TTT GTA AGT TAT CAA CAT TGG ACA TTT TAC CCT ATT ATG TGT GCT      822Phe Phe Val Ser Tyr Gln His Trp Thr Phe Tyr Pro Ile Met Cys Ala245                 250                 255                 260GCT AGG CTC AAT ATG TAT GTA CAA TCT CTC ATA ATG TTG TTG ACC AAG      870Ala Arg Leu Asn Met Tyr Val Gln Ser Leu Ile Met Leu Leu Thr Lys
            265                 270                 275AGA AAT GTG TCC TAT CGA GCT CAG GAA CTC TTG GGA TGC CTA GTG TTC      918Arg Asn Val Ser Tyr Arg Ala Gln Glu Leu Leu Gly Cys Leu Val Phe
        280                 285                 290TCG ATT TGG TAC CCG TTG CTT GTT TCT TGT TTG CCT AAT TGG GGT GAA      966Ser Ile Trp Tyr Pro Leu Leu Val Ser Cys Leu Pro Asn Trp Gly Glu
    295                 300                 305AGA ATT ATG TTT GTT ATT GCA AGT TTA TCA GTG ACT GGA ATG CAA CAA     1014Arg Ile Met Phe Val Ile Ala Ser Leu Ser Val Thr Gly Met Gln Gln
310                 315                 320GTT CAG TTC TCC TTG AAC CAC TTC TCT TCA AGT GTT TAT GTT GGA AAG     1062Val Gln Phe Ser Leu Asn His Phe Ser Ser Ser Val Tyr Val Gly Lys325                 330                 335                 340CCT AAA GGG AAT AAT TGG TTT GAG AAA CAA ACG GAT GGG ACA CTT GAC     1110Pro Lys Gly Asn Asn Trp Phe Glu Lys Gln Thr Asp Gly Thr Leu Asp
            345                 350                 355ATT TCT TGT CCT CCT TGG ATG GAT TGG TTT CAT GGT GGA TTG CAA TTC     1158Ile Ser Cys Pro Pro Trp Met Asp Trp Phe His Gly Gly Leu Gln Phe
        360                 365                 370CAA ATT GAG CAT CAT TTG TTT CCC AAG ATG CCT AGA TGC AAC CTT AGG     1206Gln Ile Glu His His Leu Phe Pro Lys Met Pro Arg Cys Asn Leu Arg
    375                 380                 385AAA ATC TCG CCC TAC GTG ATC GAG TTA TGC AAG AAA CAT AAT TTG CCT     1254Lys Ile Ser Pro Tyr Val Ile Glu Leu Cys Lys Lys His Asn Leu Pro
390                 395                 400TAC AAT TAT GCA TCT TTC TCC AAG GCC AAT GAA ATG ACA CTC AGA ACA     1302Tyr Asn Tyr Ala Ser Phe Ser Lys Ala Asn Glu Met Thr Leu Arg Thr405                 410                 415                 420TTG AGG AAC ACA GCA TTG CAG GCT AGG GAT ATA ACC AAG CCG CTC CCG       1350Leu Arg Asn Thr Ala Leu Gln Ala Arg Asp Ile Thr Lys Pro Leu Pro
            425                 430                 435AAG AAT TTG GTA TGG GAA GCT CTT CAC ACT CAT GGT T AAAATTACCC          1397Lys Asn Leu Val Trp Glu Ala Leu His Thr His Gly
        440                 445TTAGTTCATG TAATAATTTG AGATTATGTA TCTCCTATGT TTGTGTCTTG TCTTGGTTCT     1457ACTTGTTGGA GTCATTGCAA CTTGTCTTTT ATGGTTTATT AGATGTTTTT TAATATATTT     1517TAGAGGTTTT GCTTTCATCT CCATTATTGA TGAATAAGGA GTTGCATATT GTCAATTGTT     1577GTGCTCAATA TCTGATATTT TGGAATGTAC TTTGTACCAC GTGGTTTTCA GTTGAAGCTC     1637ATGTGTACTT CTATAGACTT TGTTTAAATG GTTATGTCAT GTTATTT                   1684(2)SEQ ID NO：2的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：135氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：Met Ala Ala Gln Ile Lys Lys Tyr Ile Thr Ser Asp Glu Leu Lys Asn1               5                  10                  15His Asp Lys Pro Gly Asp Leu Trp Ile Ser Ile Gln Gly Lys Ala Tyr
         20                  25                  30Asp Val Ser Asp Trp Val Lys Asp His Pro Gly Gly Ser Phe Pro Leu
     35                  40                  45Lys Ser Leu Ala Gly Gln Glu Val Thr Asp Ala Phe Val Ala Phe His
 50                  55                  60Pro Ala Ser Thr Trp Lys Asn Leu Asp Lys Phe Phe Thr Gly Tyr Tyr65                  70                  75                  80Leu Lys Asp Tyr Ser Val Ser Glu Val Ser Lys Asp Tyr Arg Lys Leu
             85                  90                  95Val Phe Glu Phe Ser Lys Met Gly Leu Tyr Asp Lys Lys Gly His Ile
        100                 105                 110Met Phe Ala Thr Leu Cys Phe Ile Ala Met Leu Phe Ala Met Ser Val
    115                 120                 125Tyr Gly Val Leu Phe Cys Glu
130                 135(2)SEQ ID NO：3的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：834碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：双链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(ix)特征：
    (A)名称/关键：CDS
    (B)位置：31..603
(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：TTAGCCTTTA CTCTATAGTT TTAGATAGAC ATG GCG AAT GTG GAT CGT GAT CGG        54
                             Met Ala Asn Val Asp Arg Asp Arg
                                             140CGT GTG CAT GTA GAC CGT ACT GAC AAA CGT GTT CAT CAG CCA AAC TAC        102Arg Val His Val Asp Arg Thr Asp Lys Arg Val His Gln Pro Asn Tyr
145                 150                 155GAA GAT GAT GTC GGT TTT GGT GGC TAT GGC GGT TAT GGT GCT GGT TCT        150Glu Asp Asp Val Gly Phe Gly Gly Tyr Gly Gly Tyr Gly Ala Gly Ser160                 165                 170                 175GAT TAT AAG AGT CGC GGC CCC TCC ACT AAC CAA ATC TTG GCA CTT ATA        198Asp Tyr Lys Ser Arg Gly Pro Ser Thr Asn Gln Ile Leu Ala Leu Ile
            180                 185                 190GCA GGA GTT CCC ATT GGT GGC ACA CTG CTA ACC CTA GCT GGA CTC ACT        246Ala Gly Val Pro Ile Gly Gly Thr Leu Leu Thr Leu Ala Gly Leu Thr
        195                 200                 205CTA GCC GGT TCG GTG ATC GGC TTG CTA GTC TCC ATA CCC CTC TTC CTC        294Leu Ala Gly Ser Val Ile Gly Leu Leu Val Ser Ile Pro Leu Phe Leu
    210                 215                 220CTC TTC AGT CCG GTG ATA GTC CCG GCG GCT CTC ACT ATT GGG CTT GCT        342Leu Phe Ser Pro Val Ile Val Pro Ala Ala Leu Thr Ile Gly Leu Ala
225                 230                 235GTG ACG GGA ATC TTG GCT TCT GGT TTG TTT GGG TTG ACG GGT CTG AGC        390Val Thr Gly Ile Leu Ala Ser Gly Leu Phe Gly Leu Thr Gly Leu Ser240                 245                 250                 255TCG GTC TCG TGG GTC CTC AAC TAC CTC CGT GGG ACG AGT GAT ACA GTG        438Ser Val Ser Trp Val Leu Asn Tyr Leu Arg Gly Thr Ser Asp Thr Val
            260                 265                 270CCA GAG CAA TTG GAC TAC GCT AAA CGG CGT ATG GCT GAT GCG GTA GGC          486Pro Glu Gln Leu Asp Tyr Ala Lys Arg Arg Met Ala Asp Ala Val Gly
        275                 280                 285TAT GCT GGT ATG AAG GGA AAA GAG ATG GGT CAG TAT GTG CAA GAT AAG          534Tyr Ala Gly Met Lys Gly Lys Glu Met Gly Gln Tyr Val Gln Asp Lys
    290                 295                 300GCT CAT GAG GCT CGT GAG ACT GAG TTC ATG ACT GAG ACC CAT GAG CCG          582Ala His Glu Ala Arg Glu Thr Glu Phe Met Thr Glu Thr His Glu Pro
305                 310                 315GGT AAG GCC AGG AGA GGC TCA TAAGCTAATA TAAATTGCGG GAGTCAGTTG             633Gly Lys Ala Arg Arg Gly Ser320                 325GAAACGCGAT AAATGTAGTT TTACTTTTAT GTCCCAGTTT CTTTCCTCTT TTAAGAATAT        693CTTTGTCTAT ATATGTGTTC GTTCGTTTTG TCTTGTCCAA ATAAAAATCC TTGTTAGTGA        753AATAAGAAAT GAAATAAATA TGTTTTCTTT TTTGAGATAA CCAGAAATCT CATACTATTT        813TCTAAAAAAA AAAAAAAAAA A                                                  834(2)SEQ ID NO：4的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：191氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：Met Ala Asn Val Asp Arg Asp Arg Arg Val His Val Asp Arg Thr Asp1               5                  10                  15Lys Arg Val His Gln Pro Asn Tyr Glu Asp Asp Val Gly Phe Gly Gly
         20                  25                  30Tyr Gly Gly Tyr Gly Ala Gly Ser Asp Tyr Lys Ser Arg Gly Pro Ser
     35                  40                  45Thr Asn Gln Ile Leu Ala Leu Ile Ala Gly Val Pro Ile Gly Gly Thr
 50                  55                  60Leu Leu Thr Leu Ala Gly Leu Thr Leu Ala Gly Ser Val Ile Gly Leu65                  70                  75                  80Leu Val Ser Ile Pro Leu Phe Leu Leu Phe Ser Pro Val Ile Val Pro
             85                  90                  95Ala Ala Leu Thr Ile Gly Leu Ala Val Thr Gly Ile Leu Ala Ser Gly
        100                 105                 110Leu Phe Gly Leu Thr Gly Leu Ser Ser Val Ser Trp Val Leu Asn Tyr
    115                 120                 125Leu Arg Gly Thr Ser Asp Thr Val Pro Glu Gln Leu Asp Tyr Ala Lys
130                 135                 140Arg Arg Met Ala Asp Ala Val Gly Tyr Ala Gly Met Lys Gly Lys Glu145                 150                 155                 160Met Gly Gln Tyr Val Gln Asp Lys Ala His Glu Ala Arg Glu Thr Glu
            165                 170                 175Phe Met Thr Glu Thr His Glu Pro Gly Lys Ala Arg Arg Gly Ser
        180                 185                 190(2)SEQ ID NO：5的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：191氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：Met Ala Asn Val Asp Arg Asp Arg Arg Val His Val Asp Arg Thr Asp1               5                   10                  15Lys Arg Val His Gln Pro Asn Tyr Glu Asp Asp Val Gly Phe Gly Gly
        20                  25                  30Thr Gly Gly Thr Gly Ala Gly Ser Asp Tyr Lys Ser Arg Gly Pro Ser
    35                  40                  45Thr Asn Gln Ile Leu Ala Leu Ile Ala Gly Val Pro Ile Gly Gly Thr
50                  55                  60Leu Ile Thr Leu Ala Gly Leu Thr Leu Ala Gly Ser Val Ile Gly Leu65                  70                  75                  80Leu Val Ser Ile Pro Leu Phe Leu Ile Phe Ser Pro Val Ile Val Pro
            85                  90                  95Ala Ala Leu Thr Ile Gly Leu Ala Val Thr Gly Ile Leu Ala Ser Gly
        100                 105                 110Leu Phe Gly Leu Thr Gly Leu Ser Ser Val Ser Trp Val Leu Asn Tyr
    115                 120                 125Leu Arg Gly Thr Ser Asp Thr Val Pro Glu Gln Leu Asp Tyr Ala Lys
130                 135                 140Arg Arg Met Ala Asp Ala Val Gly Tyr Ala Gly Met Lys Gly Lys Glu145                 150                 155                 160Met Gly Gln Tyr Val Gln Asp Lys Ala His Glu Ala Arg Glu Thr Glu
            165                 170                 175Phe Met Thr Glu Thr His Glu Pro Gly Lys Ala Arg Arg Gly Ser
        180                 185                 190(2)SEQ ID NO：6的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：191氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：Met Ala Asn Val Asp Arg Asp Arg Arg Val His Val Asp Arg Thr Asp1               5                   10                  15Lys Arg Val His Gln Pro Asn Tyr Glu Asp Asp Val Gly Phe Gly Gly
        20                  25                  30Thr Gly Gly Thr Gly Ala Gly Ser Asp Tyr Lys Ser Arg Gly Pro Ser
    35                  40                  45Thr Asn Gln Ile Leu Ala Leu Ile Ala Gly Val Pro Ile Gly Gly Thr
50                  55                  60Leu Ile Thr Leu Ala Gly Leu Thr Leu Ala Gly Ser Val Ile Gly Leu65                  70                  75                  80Leu Val Ser Ile Pro Leu Phe Leu Ile Phe Ser Pro Val Ile Val Pro
            85                  90                  95Ala Ala Leu Thr Ile Gly Leu Ala Val Thr Gly Ile Leu Ala Ser Gly
        100                 105                 110Leu Phe Gly Leu Thr Gly Leu Ser Ser Val Ser Trp Val Leu Asn Tyr
    115                 120                 125Leu Arg Gly Thr Ser Asp Thr Val Pro Glu Gln Leu Asp Tyr Ala Lys
130                 135                 140Arg Arg Met Ala Asp Ala Val Gly Tyr Ala Gly Met Lys Gly Lys Glu145                 150                 155                 160Met Gly Gln Tyr Val Gln Asp Lys Ala His Glu Ala Arg Glu Thr Glu
            165                 170                 175Phe Met Thr Glu Thr His Glu Pro Gly Lys Ala Arg Arg Gly Pro
        180                 185                 190(2)SEQ ID NO：7的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：78氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：Phe Gly Leu Thr Gly Leu Ser Ser Val Ser Trp Val Leu Gln Leu Pro1               5                   10                  15Pro Trp Ala Ser Asp Thr Val Pro Glu Gln Val Asp Tyr Ala Lys Arg
        20                  25                  30Arg Met Ala Asp Ala Val Gly Tyr Ala Gly Met Lys Gly Lys Glu Met
    35                  40                  45Gly Gln Tyr Val Gln Asp Lys Ala His Glu Ala Arg Glu Thr Glu Phe
50                  55                  60Met Thr Glu Thr His Glu Pro Gly Lys Ala Arg Arg Gly Ser65                  70                  75(2)SEQ ID NO：8的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：173氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：Met Ala Asp Thr Ala Arg Gly Thr His His Asp Ile Ile Gly Arg Asp1               5                   10                  15Gln Tyr Pro Met Met Gly Arg Asp Arg Asp Gln Tyr Gln Met Ser Gly
        20                  25                  30Arg Gly Ser Asp Tyr Ser Lys Ser Arg Gln Ile Ala Lys Ala Ala Thr
    35                  40                  45Ala Val Thr Ala Gly Gly Ser Leu Leu Val Leu Ser Ser Leu Thr Leu
50                  55                  60Val Gly Thr Val Leu Ala Leu Thr Val Ala Thr Pro Leu Leu Val Leu65                  70                  75                  80Phe Ser Pro Ile Leu Val Pro Ala Leu Ile Thr Val Ala Leu Leu Ile
            85                  90                  95Thr Gly Phe Leu Ser Ser Gly Gly Phe Gly Ile Ala Ala Ile Thr Val
        100                 105                 110Phe Ser Trp Ile Tyr Lys Tyr Ala Thr Gly Glu His Pro Gln Gly Ser
    115                 120                 125Asp Lys Leu Asp Ser Ala Arg Met Lys Leu Gly Ser Lys Ala Gln Asp
130                 135                 140Leu Lys Asp Arg Ala Gln Tyr Tyr Gly Gln Gln His Thr Gly Gly Glu145                 150                 155                 160His Asp Arg Asp Arg Thr Arg Gly Gly Gln His Thr Thr
            165                 170(2)SEQ ID NO：9的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：141氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：Met Ala Asp Gln Thr Arg Thr His His Glu Met Ile Ser Arg Asp Ser1               5                   10                  15Thr Gln Glu Ala His Pro Lys Ala Arg Gln Trp Val Lys Ala Ala Thr
        20                  25                  30Ala Val Thr Ala Gly Gly Ser Leu Leu Val Leu Ser Gln Leu Thr Leu
    35                  40                  45Ala Gly Thr Val Ile Ala Leu Thr Val Ala Thr Pro Leu Leu Val Ile
50                  55                  60Phe Ser Pro Val Leu Val Pro Ala Val Val Thr Val Ala Leu Ile Ile65                  70                  75                  80Thr Gly Phe Leu Ala Ser Gly Gly Phe Gly Ile Ala Ala Ile Thr Ala
            85                  90                  95Phe Ser Trp Leu Tyr Arg His Trp Thr Gly Ser Gly Ser Asp Lys Ile
        100                 105                 110Glu Trp Ala Arg Met Lys Val Gly Ser Arg Val Gln Asp Thr Lys Tyr
    115                 120                 125Gly Gln His Trp Ile Gly Val Gln His Gln Gln Val Ser
130                 135                 140(2)SEQ ID NO：10的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：199氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：Met Ala Asp Thr His Arg Val Asp Arg Thr Asp Arg His Phe Gln Phe1               5                   10                  15Gln Ser Pro Tyr Glu Gly Gly Arg Gly Gln Gly Gln Tyr Glu Gly Asp
        20                  25                  30Arg Gly Tyr Gly Gly Gly Gly Tyr Lys Ser Met Met Pro Glu Ser Gly
    35                  40                  45Pro Ser Ser Thr Gln Val Leu Ser Leu Leu Ile Gly Val Pro Val Val
50                  55                  60Gly Ser Leu Ile Ala Leu Ala Gly Leu Leu Leu Ala Gly Ser Val Ile65                  70                  75                  80Gly Leu Met Val Ala Leu Pro Leu Phe Leu Ile Phe Ser Pro Val Ile
            85                  90                  95Val Pro Ala Gly Leu Thr Ile Gly Leu Ala Met Thr Gly Phe Leu Ala
        100                 105                 110Ser Gly Met Phe Gly Leu Thr Gly Leu Ser Ser Ile Ser Trp Val Met
    115                 120                 125Asn Tyr Leu Arg Gly Thr Ala Arg Thr Val Pro Glu Gln Leu Glu Tyr
130                 135                 140Ala Lys Arg Arg Met Ala Asp Ala Val Gly Tyr Ala Gly Gln Lys Gly145                 150                 155                 160Lys Glu Met Gly Gln His Val Gln Asn Lys Ala Gln Asp Val Lys Gln
            165                 170                 175Tyr Asp Ile Ser Lys Pro His Asp Thr Thr Thr Lys Gly His Glu Thr
        180                 185                 190Gln Gly Gly Thr Thr Ala Ala
    195(2)SEQ ID NO：11的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：199氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：Met Ala Asp Thr His Arg Val Asp Arg Thr Asp Arg His Phe Gln Phe1               5                   10                  15Gln Ser Pro Tyr Glu Gly Gly Arg Gly Gln Gly Gln Tyr Glu Gly Asp
        20                  25                  30Arg Gly Tyr Gly Gly Gly Gly Tyr Lys Ser Met Met Pro Glu Ser Gly
    35                  40                  45Pro Ser Ser Thr Gln Val Leu Ser Leu Leu Ile Gly Val Pro Val Val
50                  55                  60Gly Ser Leu Ile Ala Leu Ala Gly Leu Leu Ile Ala Gly Ser Val Ile65                  70                  75                  80Gly Leu Met Val Ala Leu Pro Leu Phe Leu Ile Phe Ser Pro Val Ile
            85                  90                  95Val Pro Ala Ala Leu Thr Ile Gly Leu Ala Met Thr Gly Phe Leu Ala
        100                 105                 110Ser Gly Met Phe Gly Leu Thr Gly Leu Ser Ser Ile Ser Trp Val Met
    115                 120                 125Asn Tyr Leu Arg Gly Thr Arg Arg Thr Val Pro Glu Gln Leu Glu Tyr
130                 135                 140Ala Lys Arg Arg Met Ala Asp Ala Val Gly Tyr Ala Gly Gln Lys Gly145                 150                 155                 160Lys Glu Met Gly Gln His Val Gln Asn Lys Ala Gln Asp Val Lys Gln
            165                 170                 175Tyr Asp Ile Ser Lys Pro His Asp Thr Thr Thr Lys Gly His Glu Thr
        180                 185                 190Gln Gly Arg Thr Thr Ala Ala
    195(2)SEQ ID NO：12的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：1267碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：双链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：GAGCTCGATC ACACAAAGAA AACGTCAAAT GGATCATACT GGGCCCATTT TGCAGACCAA         60GAGAAAGTGA GAGAGAGTTG TCCTCTCGTT ATCAAGTAAC AGTAGACCAC CACTAAACCG        120CCAATAGCTT ATAATCAAAA TAGAAAGGTC TAATAACAGA AACAAATGAA AAAGCCTTGT        180TCCATGGACT GCCTACCCGA ATTGATTGAT TCGACTAGTT TTTCTTCTTC TTTGATTAAG        240ACCTCCGTAA GAAAAATGGT ACTACTAAAG CCACTCGCTA CCAAAACTAA ACCATTCCAG        300ACTGTAACTG GACCAATATT TCTAAACTGT AACCAGATCT CAAACATATA AACTAATTAA        360GAACTATAAC CATTAACCGT AAAAATAAAT TTACTACAGT AAAAAATTAT ACTAATTTCA        420GCTATGATGG AATTTCAGCT CTTAAGAGTT GTGGAAATCA AGTAAACCTA AAATCCTAAT        480AATATTCTTC ATCCTTATTT TTGTTTCACA TGCATGCTGT CCAATCTGTT ATTAGCATTT        540GAAAGCCTAA AATTCTATAT ACAGTACAAT AAATCTAATT AATTTTCATT ACTAATAAAA        600TGCTTCATAT ATACTCTTGT ATTTATAAAT CATCCGTTAT CGTTACTATA CCTTTATACA        660TCATCCTACA TTCATACCTA AGCTAGCAAA GCAAACTACT AAAAGGGTCG TCAACGCAAG        720TTATTTGCTA GTTGGTGCAT ACTACACACG GCTACGGCAA CATTAAGTAA CACATTAAGA        780GGTGTTTTCT TAATGTAGTA TGGTAATTAT ATTTATTTCA AAACTTGGAT TAGATATAAA        840GGTACAGGTA GATGAAAAAT ATTTGGTTAG CGGGTTGAGA TTAAGCGGAT ATAGGAGGCA        900TATATACAGC TGTGAGAAGA AGAGGGATAA ATACAAAAAG GGAAGGATGT TTTTGCCGAC        960AGAGAAAGGT AGATTAAGTA GGCATCGAGA GGAGAGCAAT TGTAAAATGG ATGATTTGTT       1020TGGTTTTGTA CGGTGGAGAG AAGAACGAAA AGATGATCAG GTAAAAAATG AAACTTGGAA       1080ATCATGCAAA GCCACACCTC TCCCTTCAAC ACAGTCTTAC GTGTCGTCTT CTCTTCACTC       1140CATATCTCCT TTTTATTACC AAGAAATATA TGTCAATCCC ATTTATATGT ACGTTCTCTT       1200AGACTTATCT CTATATACCC CCTTTTAATT TGTGTGCTCT TAGCCTTTAC TCTATAGTTT       1260TAGATAG                                                                 1267(2)SEQ ID NO：13的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：22碱基对
    (B)类型：核酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：DNA(基因组)
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：13：GTAATACGAC TCACTATAGG GC                                    22
(2)SEQ ID NO：14的信息：
    (i)序列特征：
        (A)长度：32碱基对
        (B)类型：核酸
        (C)链型：单链
        (D)拓扑结构：线性
    (ii)分子类型：DNA(基因组)
    (xi)序列描述：SEQ ID NO：14：GGGGATCCTA TACTAAAACT ATAGAGTAAA GG                         32(2)SEQ ID NO：15的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：8氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：Trp Ile Gly His Asp Ala Gly His1               5(2)SEQ ID NO：16的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：8氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：16：Asn Val Gly His Asp Ala Asn His1               5(2)SEQ ID NO：17的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：8氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：17：Val Leu Gly His Asp Cys Gly His1               5(2)SEQ ID NO：18的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：8氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：18：Val Ile Ala His Glu Cys Gly His1               5(2)SEQ ID NO：19的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：8氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：19：Val Ile Gly His Asp Cys Ala His1               5(2)SEQ ID NO：20的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：8氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：20：Val Val Gly His Asp Cys Gly His1               5(2)SEQ ID NO：21的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：5氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：21：His Asn Ala His His1               5(2)SEQ ID NO：22的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：6氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：22：His Asn Tyr Leu His His1               5(2)SEQ ID NO：23的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：5氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：23：His Arg Thr His His1               5(2)SEQ ID NO：24的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：5氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：24：His Arg Arg His His1               5(2)SEQ ID NO：25的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：5氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：25：His Asp Arg His His1               5(2)SEQ ID NO：26的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：5氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：26：His Asp Gln His His1               5(2)SEQ ID NO：27的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：5氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：27：His Asp His His His1               5(2)SEQ ID NO：28的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：5氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：28：His Asn His His His1               5(2)SEQ ID NO：29的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：6氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：29Phe Gln Ile Glu His His1               5(2)SEQ ID NO：30的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：6氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：30His Gln Val Thr His His1               5(2)SEQ ID NO：31的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：5氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：31His Val Ile His His1               5(2)SEQ ID NO：32的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：5氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：32His Val Ala His His1               5(2)SEQ ID NO：33的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：5氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：33：His Ile Pro His His1               5(2)SEQ ID NO：34的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：5氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：34：His Val Pro His His1               5(2)SEQ ID NO：35的信息：
(i)序列特征：
    (A)长度：1941氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链型：单链
    (D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：35：GAGCTCGATC ACACAAAGAA AACGTCAAAT GGATCATACT GGGCCCATTT TGCAGACCAA           60GAGAAAGTGA GAGAGAGTTG TCCTCTCGTT ATCAAGTAAC AGTAGACCAC CACTAAACCG          120CCAATAGCTT ATAATCAAAA TAGAAAGGTC TAATAACAGA AACAAATGAA AAAGCCTTGT          180TCCATGGACT GCCTACCCGA ATTGATTGAT TCGACTAGTT TTTCTTCTTC TTTGATTAAG          240ACCTCCGTAA GAAAAATGGT ACTACTAAAG CCACTCGCTA CCAAAACTAA ACCATTCCAG          300ACTGTAACTG GACCAATATT TCTAAACTGT AACCAGATCT CAAACATATA AACTAATTAA          360GAACTATAAC CATTAACCGT AAAAATAAAT TTACTACAGT AAAAAATTAT ACTAATTTCA          420GCTATGATGG AATTTCAGCT CTTAAGAGTT GTGGAAATCA AGTAAACCTA AAATCCTAAT          480AATATTCTTC ATCCTTATTT TTGTTTCACA TGCATGCTGT CCAATCTGTT ATTAGCATTT          540GAAAGCCTAA AATTCTATAT ACAGTACAAT AAATCTAATT AATTTTCATT ACTAATAAAA          600TGCTTCATAT ATACTCTTGT ATTTATAAAT CATCCGTTAT CGTTACTATA CCTTTATACA          660TCATCCTACA TTCATACCTA AGCTAGCAAA GCAAACTACT AAAAGGGTCG TCAACGCAAG          720TTATTTGCTA GTTGGTGCAT ACTACACACG GCTACGGCAA CATTAAGTAA CACATTAAGA          780GGTGTTTTCT TAATGTAGTA TGGTAATTAT ATTTATTTCA AAACTTGGAT TAGATATAAA          840GGTACAGGTA GATGAAAAAT ATTTGGTTAG CGGGTTGAGA TTAAGCGGAT ATAGGAGGCA          900TATATACAGC TGTGAGAAGA AGAGGGATAA ATACAAAAAG GGAAGGATGT TTTTGCCGAC          960AGAGAAAGGT AGATTAAGTA GGCATCGAGA GGAGAGCAAT TGTAAAATGG ATGATTTGTT         1020TGGTTTTGTA CGGTGGAGAG AAGAACGAAA AGATGATCAG GTAAAAAATG AAACTTGGAA         1080ATCATGCAAA GCCACACCTC TCCCTTCAAC ACAGTCTTAC GTGTCGTCTT CTCTTCACTC         1140CATATCTCCT TTTTATTACC AAGAAATATA TGTCAATCCC ATTTATATGT ACGTTCTCTT         1200AGACTTATCT CTATATACCC CCTTTTAATT TGTGTGCTCT TAGCCTTTAC TCTATAGTTT         1260TAGATAGACA TGGCGAATGT GGATCGTGAT CGGCGTGTGC ATGTAGACCG TACTGACAAA         1320CGTGTTCATC AGCCAAACTA CGAAGATGAT GTCGGTTTTG GTGGCTATGG CGGTTATGGT         1380GCTGGTTCTG ATTATAAGAG TCGCGGCCCC TCCACTAACC AAGTATTTTT GTGGTCTCTT         1440TAGTTTTTCT TGTGTTTTCC TATGATCACG CTCTCCAAAC TATTTGAAGA TTTTCTGTAA         1500ATTCATTTTA AACAGAAAGA TAAATAAAAT AGTGAAGAAC CATAGGAATC GTACGTTACG         1560TTAATTATTT CCTTTTAGTT CTTAAGTCCT AATTAGGATT CCTTTAAAAG TTGCAACAAT         1620CTAATTGTTC ACAAAATGAG TAAAGTTTGA AACAGATTTT TATACACCAC TTGCATATGT         1680TTATCATGGT GATGCATGCT TGTTAGATAA ACTCGATATA ATCAATACAT GCAGATCTTG         1740GCACTTATAG CAGGAGTTCC CATTGGTGGC ACACTGCTAA CCCTAGCTGG ACTCACTCTA         1800GCCGGTTCGG TGATCGGCTT GCTAGTCTCC ATACCCCTCT TCCTCCTCTT CAGTCCGGTG         1860ATAGTCCCGG CGGCTCTCAC TATTGGGCTT GCTGTGACGG GAATCTTGGC TTCTGGTTTG         1920TTTGGGTTGA CGGGTCTGAG C                                                   1941

Claims (25)

1.一种分离的核酸，它编码指导种子特异性表达的油质蛋白5′调控区，它选自SEQ ID NO：12所示核苷酸序列，有一个或多个核苷酸的插入、缺失或替代的SEQ ID NO：12所示核苷酸序列，或SEQ ID NO：12所示核苷酸序列的毗邻片段。
2.一种表达盒，它包含权利要求1所述的油质蛋白5′调控区，该调控区与编码异源基因的核酸或编码天然植物基因互补序列的核酸中的至少一种操作性相连。
3.根据权利要求2所述的表达盒，其中异源基因是脂肪酸合成基因或脂质代谢基因中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的表达盒，其中异源基因选自乙酰辅酶A羧化酶基因、酮酯酰合成酶基因、丙二酰转酰酶基因、脂质去饱和酶基因、酰基载体蛋白ACP基因、硫酯酶基因、乙酰转酰酶基因或延伸酶基因。
5.根据权利要求4所述的表达盒，其中脂质去饱和酶选自Δ6-去饱和酶基因、Δ12-去饱和酶基因和Δ15-去饱和酶基因。
6.一种表达载体，它包含权利要求2-5任一所述的表达盒。
7.一种包含权利要求2-5任一所述的表达盒的细胞。
8.一种包含权利要求6所述的表达载体的细胞。
9.根据权利要求7所述的细胞，其中所述细胞是细菌细胞或植物细胞。
10.根据权利要求8所述的细胞，其中所述细胞是细菌细胞或植物细胞。
11.一种转基因植物，它包含权利要求2-5任一所述的表达盒。
12.一种转基因植物，它包含权利要求6所述的表达载体。
13.一种植物，它从权利要求9所述的植物细胞再生获得。
14.一种植物，它从权利要求10所述的植物细胞再生获得。
15.根据权利要求12或13所述的植物，其中所述植物是向日葵、大豆、玉米、棉花、烟草、花生、油籽油菜或拟南芥菜属植物中的至少一种。
16.权利要求11或12所述的植物的后代。
17.权利要求11或12所述的植物的种子。
18.一种生产脂肪酸合成基因或脂质代谢基因产物水平增加的植物的方法，该方法包括：
(a)用一个表达载体转化植物细胞，该表达载体包含的权利要求1所述的分离的核酸与编码脂肪酸合成基因或脂质代谢基因的分离的核酸中至少一种操作性相连；和
(b)从所述植物细胞再生出所述脂肪酸合成基因或所述脂质代谢基因产物水平增加的植物。
19.一种生产γ亚麻酸GLA含量水平增加的植物的方法，该方法包括：
(a)用一个表达载体转化植物细胞，该表达载体包含的权利要求1所述的分离的核酸与Δ6-去饱和酶基因操作性相连；和
(b)从所述植物细胞再生出GLA水平增加的植物。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述Δ6-去饱和酶基因是蓝藻目细菌Δ6-去饱和酶基因或琉璃苣Δ6-去饱和酶基因中的至少一种。
21.根据权利要求18至20任一所述的方法，其中所述植物是向日葵、大豆、玉米、烟草、棉花、花生、油籽油菜或拟南芥菜属植物。
22.根据权利要求18所述的方法，其中所述脂肪酸合成基因或所述脂质代谢基因是脂质去饱和酶、酰基载体蛋白ACP基因、硫酯酶基因、延伸酶基因、乙酰转酰酶基因、乙酰辅酶A羧化酶基因、酮酯酰合成酶基因、或丙二酰转酰酶基因中的至少一种。
23.一种诱导在GLA缺陷或缺失植物中产生γ亚麻酸GLA或十八碳四烯酸OTA的至少一种的方法，该方法包括用一个表达载体转化所述植物，该表达载体包含的权利要求1所述的分离的核酸与Δ6-去饱和酶基因操作性相连，并再生出GLA或OTA至少一种水平增加的植物。
24.一种减少植物中脂肪酸合成或脂质代谢基因产生的方法，该方法包括：
(a)用一个表达载体转化植物细胞，该表达载体包含的权利要求1所述分离的核酸与脂肪酸合成或脂质代谢基因互补的核酸序列操作性相连；和
(b)再生出所述脂肪酸合成或所述脂质代谢基因产生减少的植物。
25.一种协同抑制植物中天然脂肪酸合成或脂质代谢基因的方法，该方法包括：
(a)用一个表达载体转化植物细胞，该表达载体包含的权利要求1所述的分离的核酸与编码植物天然的脂肪酸合成或脂质代谢基因的核酸序列操作性相连；和
(b)再生出所述脂肪酸合成或所述脂质代谢基因产生减少的植物。
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