JP2001519668A

JP2001519668A - 植物種子脂質組成の改変のためのオレオシン５’調節領域

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Publication number: JP2001519668A
Application number: JP54314198A
Authority: JP
Inventors: トーマス，テリイ・エル; リー，チヨンセン
Original assignee: ローヌ−プーラン・アグロ
Priority date: 1997-04-09
Filing date: 1998-04-09
Publication date: 2001-10-23
Also published as: EP0973920B1; CO4790116A1; WO1998045461A1; DK0973920T3; AR012399A1; CA2285687A1; EP1967589B1; US5977436A; ZA983047B; CN1259168A; EP1967589A3; AU739442B2; CA2285687C; PT973920E; ES2398603T3; ATE399870T1; AU7107198A; EP0973920A1; DE69839667D1; EP1967589A2

Abstract

(57)【要約】本発明は、シロイヌナズナオレオシン遺伝子の５’調節領域に関する。５’調節領域は、異種遺伝子のコード配列またはネイティブ植物遺伝子に相補的な配列のいずれかに機能的に結合した場合、植物種子においてコード配列または相補的配列の発現を指示する。調節領域は、発現カセットおよび発現ベクターにおいて植物の形質転換に有用である。また、植物を該発現カセットおよび発現ベクターで形質転換することにより、脂肪酸合成または脂質代謝遺伝子などの異種遺伝子のレベルを調節する方法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】植物種子脂質組成の改変のためのオレオシン５’調節領域発明の背景種子油含量は伝統的に植物交配により改変されてきた。種子油組成を変化させる組換えＤＮＡ技術の使用により、このプロセスは促進され、ある場合には交配のみでは達成できない程種子油を変化させる。アブラナ属の油脂組成は多くの脂質代謝遺伝子の発現を改変することにより顕著に変化する。かかる種子油組成の操作は、内因性成分の脂肪酸の比率を変化させることに焦点をおく。例えば、トランスジェニックナタネのΔ１２−デサチュラーゼ遺伝子のアンチセンス抑制によりオレイン酸が８３％まで増加する結果となった。Ｔｏｐｆｅｒら、１９９５Ｓｃｉｅｎｃｅ２６８：６８１−６８６。宿主植物が以前に合成できなかった脂肪酸の産生を可能とする新規な遺伝子を導入することにより、トランスジェニック植物の種子油の組成を改変した成功例がいくつかある。ＶａｎｄｅＬｏｏら（１９９５Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：６７４３−６７４７）は、トランスジェニックタバコにΔ１２−ヒドロキシラーゼ遺伝子を導入でき、その結果、新規脂肪酸であるリシノール酸がその種子油に導入された。報告された蓄積は、ヒドロキシラーゼ遺伝子の転写がカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーターの制御下にある構築物を有する植物では少量であった。同様に、タバコ植物を操作して、コエンドロ由来のアシル−ＡＣＰデサチュラーゼの発現により低レベルのペトロセリン酸を産生させた（Ｃａｈｏｏｎ、１９９２Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ８９：１１１８４−１１１８８）。長鎖脂肪酸（Ｃ１８およびそれより大）は、栄養的および医学的に重要な食物として並びに工業商品として大きな実用的価値がある（Ｏｈｌｒｏｇｇｅ，Ｊ．Ｂ．１９９４ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１０４：８２１−８２６）。リノール酸（１８：２ Δ９，１２）およびα−リノレン酸（１８：３ Δ９，１２，１５）は多くの種子油に見られる必須脂肪酸である。油種子穀物におけるこれらの脂肪酸レベルは、交配およびバイオテクノロジーにより操作されてきた（Ｏｈｌｒｏｇｇｅら、１９９１ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１０８２：１−２６；Ｔｏｐｆｅｒら、１９９５Ｓｃｉｅｎｃｅ２６８：６８１−６８６）。さらに、種子油における新規脂肪酸の産生は、ヒト健康および工業的な応用の両方に非常に有用である。 γ−リノレン酸（ＧＬＡ）（１８：３ Δ６，９，１２）が豊富である植物油の消費は、高コレステロール血症および虚血性心疾患罹病と関連した他の関連性疾患を軽減すると考えられている（ＢｒｅｎｎｅｒＲ．Ｒ．１９７６Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．８３：８５−１０１）。ＧＬＡ摂取の治療効果は、プロスタグランジン合成の前駆体としての役割に起因し得る（Ｗｅｅｔｅ，Ｊ．Ｄ．１９８０ＬｉｐｉｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆＦｕｎｇｉａｎｄＯｔｈｅｒＯｒｇａｎｉｓｍｓ，ｅｄｓ．ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ．ｐｐ．５９−６２）。リノール酸（１８：２）（ＬＡ）は酵素Δ６−デサチュラーゼによりγ−リノレン酸（１８：３）（ＧＬＡ）に変換される。前駆体のリノール酸含量は高いにもかかわらずＧＬＡを含む種子油はほとんどない。これはほとんどの植物にΔ６−デサチュラーゼ活性が欠失していることに起因する。例えば、ルリヂサ（Ｂｏｒａｇｏｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、マツヨイグサ（Ｏｅｎｏｔｈｅｒａｂｉｅｎｎｉｓ）およびスグリ（Ｒｉｂｅｓｎｉｇｒｕｍ）のみが、認め得る量のリノレン酸を産生する。これら３種の中で、マツヨイグサおよびルリヂサのみがＧＬＡの市販源として栽培されている。栽培種子油を操作して、異種Δ６−デサチュラーゼ遺伝子を導入することにより大量のＧＬＡを産生できれば有益であろう。また、脂肪酸合成および脂質代謝に関連した他の発現産物が、特定の発現産物の商業生産が可能となるような高いレベルで植物中に産生されれば有益であろう。米国特許出願第５，５５２，３０６号に開示されているように、シアノバクテリアΔ⁶−デサチュラーゼ遺伝子が近年単離された。このシアノバクテリア遺伝子のトランスジェニックタバコにおける発現では、ＧＬＡ蓄積レベルは有意ではあるが低い結果となった。（Ｒｅｄｄｙら、１９９６ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．１４：６３９−６４２）。出願人の同時係属出願中の米国出願番号０８，３６６，７７９号は、ルリヂサ植物から単離したΔ６−デサチュラーゼ遺伝子およびタバコにおけるＣａＭＶ３５Ｓプロモーター制御下でのその発現を開示する。この発現の結果、種子におけるＧＬＡおよびオクタデカテトラエン酸（ＯＤＴＡまたはＯＴＡ）蓄積レベルは有意ではあるが低かった。従って、植物で機能し、トランスジェニック植物種子において一貫して高い脂質代謝遺伝子発現レベルを指示するプロモーターの存在が必要となる。オレオシンは、油脂体のリン脂質単分子層膜に関連した豊富な種子タンパク質である。最初のオレオシン遺伝子Ｌ３は、そのインビトロの翻訳産物が抗−Ｌ３抗体により認識されるクローンを選択することによりトウモロコシからクローン化された（Ｖａｎｃｅら、１９８７Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１１２７５−１１２７９）。続いて、アブラナ属、大豆、ニンジン、マツ、およびシロイヌナズナなどの異なる種由来のオレオシン遺伝子の異なるアイソフォームがクローン化された（Ｈｕａｎｇ，Ａ．Ｈ．Ｃ．，１９９２，Ａｎｎ．ＲｅｖｉｅｗｓＰｌａｎｔＰｈｙｓ．およびＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．４３：１７７−２００；Ｋｉｒｉｋら、１９９６ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１：４１３−４１７；ＶａｎＲｏｏｉｊｅｎら、１９９２ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：１１７７−１１７９；Ｚｏｕら、ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１：４２９−４３３）。これらの遺伝子から予測されるオレオシンタンパク質配列は、特に中心疎水性ドメインが高度に保存されている。これらのオレオシンは全て、３つの特有のドメインの特徴的性質を有する。４０−６０アミノ酸の両極性ドメインは、Ｎ末端に存在し；６８−７４アミノ酸の全体的に疎水性のドメインは中心に位置し；および３３−４０アミノ酸の両極性α−ヘリカルドメインはＣ末端に位置する（Ｈｕａｎｇ，Ａ．Ｈ．Ｃ．１９９２）。本発明は、トランスジェニック植物において高いレベルの脂質代謝遺伝子発現を指示するオレオシン遺伝子由来の５’調節配列を提供する。本発明により、例えばΔ６−デサチュラーゼ遺伝子などの脂質代謝遺伝子のコード配列に機能的に結合したオレオシン５’調節領域を含むキメラ構築物が提供される。該キメラ構築物を含むトランスジェニック植物は、マツヨイグサなどの天然にＧＬＡを産生する数少ない植物種に見られるレベルに近いＧＬＡレベルを産生する（Ｏｅｎｏｔｈｅｒａｂｉｅｎｎｉｓ）。発明の要約本発明は、シロイヌナズナオレオシン遺伝子の５’調節領域に関する。５’調節領域は、異種遺伝子のコード配列またはネィティブ植物遺伝子に相補的な配列のいずれかに機能的に結合した場合、植物種子において異種遺伝子または相補的配列の発現を指示する。本発明は、従って、異種遺伝子またはネイティブ植物遺伝子に相補的な配列に機能的に結合したオレオシン５’調節領域を含む発現カセットおよび発現ベクターを提供する。発現カセットおよび発現ベクターを含む植物形質転換ベクターも提供され、植物細胞はこれらのベクターにより形質転換され、植物およびその後代はベクターを含む。本発明の１つの実施形態において、異種遺伝子または相補的遺伝子配列は脂肋酸合成遺伝子または脂質代謝遺伝子である。本発明の別の局面において、脂肪酸合成または脂質代謝遺伝子の産物レベルが増加した植物を産生する方法が提供される。特に、オレオシン５’調節領域および脂肪酸合成または脂質代謝遺伝子のコード配列を含む、該発現カセットおよび発現ベクターで植物を形質転換することにより、脂肪酸合成または脂質代謝遺伝子のレベルが増加した植物を産生する方法が提供される。本発明の別の局面において、オレオシン５’調節領域および脂肪酸合成または脂質代謝遺伝子のコード配列を含む、該発現カセットおよび発現ベクターで植物を形質転換することにより、天然脂肪酸合成または脂質代謝遺伝子を共抑制する方法が提供される。本発明のさらに別の態様において、ネイティブ植物遺伝子に相補的な核酸配列に機能的に結合したオレオシン５’調節領域を含む発現ベクターで植物を形質転換することにより、脂肪酸合成遺伝子または脂質代謝遺伝子などのネイティブ植物遺伝子の産生を減少させる方法が提供される。また、該発現カセットおよび発現ベクターで植物を形質転換することにより、脂肪酸合成または脂質代謝遺伝子などの異種遺伝子のレベルを調節する方法が提供される。図面の簡単な記載図１は、ルリヂサΔ６−デサチュラーゼ遺伝子のヌクレオチドおよび対応するアミノ酸配列を示す（配列番号：１）。チトクロムｂ５ヘム−結合モチーフは四角で囲み、推定金属結合ヒスチジン豊富モチーフ（ＨＲＭ）は下線で示す。プライマーにより認識されるモチーフ（ＰＣＲ解析）は、点線でアンダーラインを付ける、すなわちｔｇｇａａａｔｇｇａａｃｃａｔａａ；およびｇａｇｃａｔｃａｔｔｔｇｔｔｔｃｃ。図２は、他の膜結合デサチュラーゼに対するルリヂサΔ６−デサチュラーゼの類似性を示す系統図である。ルリヂサΔ６−デサチュラーゼのアミノ酸配列を、ジーンワーク（ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ）を用いて他の公知のデサチュラーゼと比較した。数値は、比較した亜群間の相対的系統発生距離に相関する。図３Ａは、野生型タバコ「キサンチ」の葉組織由来の脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥＳ）のガス液体クロマトグラフィープロフィールを提供する。図３Ｂは、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（ｐＡＮ２）の転写制御下、ルリヂサ Δ６−デサチュラーゼｃＤＮＡで形質転換したタバコ植物の葉組織由来のＦＡＭＥＳのガス液体クロマトグラフィープロフィールを提供する。リノール酸メチル（１８：２）、γ−リノレン酸メチル（１８：３γ）、α−リノレン酸メチル（１８：３α）、およびアクタデカンテトラエン酸メチル（１８：４）に対応するピークが示される。図４は、オレオシンＡｔＳ２１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列である（配列番号：３）。図５は、ＤＮＡストライダー１．２により得られた推定ＡｔＳ２１タンパク質の酸性塩基マップである。図６は、ＤＮＡストライダー１．２により得られた推定ＡｔＳ２１タンパク質のカイト−ドゥリトル（Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）プロットである。図７は、シロイヌナズナから単離したオレオシンの配列表である。刊行またはＥＭＢＬ、ＢＣＭ、ＮＣＢＩデータベースに寄託されたオレオシン配列を、ジーンワーク（登録商標）２．３を用いて互いに整列した。同一残基を、四角で囲んだ。７個の配列が３グループに分かれる。最初のグループは、ＡｔＳ２１（配列番号：５）、Ｘ９１９１８（配列番号：６）およびＺ２９８５９（配列番号：７）を含む。二番目のグループは、Ｘ６２３５２（配列番号：８）およびＡｔｏ１３（配列番号：９）を含む。三番目のグループは、Ｘ９１９５６（配列番号：１０）およびＬ４０９５４（配列番号：１１）を含む。同じグループ内のアミノ酸残基の違いは影で示す。Ａｔｏ２／Ｚ５４１６４はＡｔＳ２１と同一である。Ａｔｏ１３配列（ＥＭＢＬデータベースにおけるアクセス番号Ｚ５４１６５４）は実際ＥＭＢＬデータベースには開示されていない。Ｚ５４１６５アクセス番号は、Ａｔｏ１２であるＺ５４１６４と同じ配列を示す。図８Ａは、ＡｔＳ２１遺伝子のノーザン解析である。シロイヌナズナ花（Ｆ）、葉（Ｌ）、根（Ｒ）、成長種子（Ｓｅ）および成長長角果殻（Ｓｉ）から抽出した全ＲＮＡの１０μｇを含むＲＮＡゲルブロットを、全長ＡｔＳ２１ｃＤＮＡから作成したプローブとハイブリダイズさせた。図８Ｂは、ＡｔＳ２１遺伝子のサザン解析である。ＢａＭＨＩ（Ｂ）、ＥｃｏＲＩ（Ｅ）、ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｈ）、ＳａｃＩ（Ｓ）、およびＸｂａＩ（Ｘ）で消化した１０μｇのゲノムＤＮＡを含むＤＮＡゲルブロットを、全長ＡｔＳ２１ｃＤＮＡから作成したプローブとハイブリダイズさせた。図９は、ＡｔＳ２１ゲノムＤＮＡのＳａｃＩ断片のヌクレオチド配列である（配列番号：１２）。プロモーターおよびイントロン配列は大文字である。ＡｔＳ２１ｃＤＮＡ配列に対応する断片は小文字である。最初のＡＴＧコドンおよび推定ＴＡＴＡボックスに影を付けている。ＰＣＲ増幅で２１Ｐプライマーと相補的な配列は四角で囲んでいる。推定アブシジン酸応答エレメント（ＡＢＲＥ）および２つの１４ｂｐリピートは下線で示す。図１０はＡｔＳ２１プロモーター／ＧＵＳ構築物（ｐＡＮ５）の地図である。図１１Ａは、シロイヌナズナの茎および葉のＡｔＳ２１／ＧＵＳ遺伝子発現を示す。図１１Ｂは、シロイヌナズナ長角果のＡｔＳ２１ＧＵＳ遺伝子発現を示す。図１１Ｃは、シロイヌナズナ成長種子のＡｔＳ２１ＧＵＳ遺伝子発現を示す。図１１Ｄ−Ｊは、シロイヌナズナ成長胚のＡｔＳ２１ＧＵＳ遺伝子発現を示す。図１１Ｋは、稚苗のシロイヌナズナの根および根毛におけるＡｔＳ２１／ＧＵＳ遺伝子発現を示す。図１１Ｌは、５日目の実生のシロイヌナズナ子葉および茎項のＡｔＳ２１／ＧＵＳ遺伝子発現を示す。図１１Ｍおよび１１Ｎは、５−１５日目の実生のシロイヌナズナ子葉および茎項のＡｔＳ２１／ＧＵＳ遺伝子発現を示す。図１２Ａは、タバコ胚および胚乳のＡｔＳ２１／ＧＵＳ遺伝子発現を示す。図１２Ｂは、発芽タバコ種子のＡｔＳ２１／ＧＵＳ遺伝子発現を示す。図１２Ｃは、５日目のタバコ実生のＡｔＳ２１／ＧＵＳ遺伝子発現を示す。図１２Ｄは、５−１５日目のタバコ実生のＡｔＳ２１／ＧＵＳ遺伝子発現を示す。図１３Ａは、成長野生型シロイヌナズナ実生のＡｔＳ２１ｍＲＮＡレベルを示すノーザン解析である。レーン１は、成長種子由来のＲＮＡをのせ；レーン２は２４−４８時間吸収した種子由来のＲＮＡをのせ、レーン３は３日目の実生；レーン４は４日目の実生；レーン５は５日目の実生；レーン６は６日目の実生；レーン７は９日目の実生；レーン８は１２日目の実生である。プローブは標識ＡｔＳ２１ｃＤＮＡであった。−８０℃で１時間さらした。図１３Ｂは、図１３Ａと同じブロットであり、−８０℃で２４時間さらした。図１３Ｃは、ストリッピングし、シロイヌナズナチューブリン遺伝子プローブとハイブリダイズさせた後の、図１３Ａおよび１３Ｂで示される同じブロットである。レーン１および２の各々の小バンドは、前のＡｔＳ２１プローブの残りである。− ８０℃で４８時間さらした。図１４は、ＡｔＳ２１および３５Ｓプロモーターで発現されるＧＵＳ活性を比較したグラフである。成長シロイヌナズナ種子および葉においてＡｔＳ２１プロモーターにより発現されるＧＵＳ活性は、３５Ｓプロモーターにより発現されたものと並べてプロットする。タバコ乾燥種子および葉においてＡｔＳ２１プロモーターにより発現されるＧＵＳ活性は、図の右側にプロットする。タバコ葉におけるＧＵＳ活性は、大変低く全くカラムが現れない。「Ｇ−Ｈ」は、顆粒からから中心段階を示し；「Ｈ−Ｔ」は中心からトルペド（ｔｏｒｐｅｄｏ）段階を示し；「Ｔ−Ｃ」はトルペドから子葉段階を示し；「初期Ｃ」は初期子葉を示し；「後期Ｃ」は後期子葉を示す。標準偏差は表２に示す。図１５Ａは、ハイブリダイゼーションプローブとして標識ルリヂサΔ６−デサチュラーゼｃＤＮＡを用いて、ルリヂサ葉、根および１２ｄｐｐの胚組織から単離した５μｇのＲＮＡサンプルで行った、ＲＮＡゲルブロット解析である。図１５Ｂは、図１５Ａで示された実験のノーザン解析結果に対応するグラフを示す。図１６Ａは、ノーザンブロットの結果に基づき成長ルリヂサ胚における、相対レグミンＲＮＡ蓄積を示すグラフである。図１６Ｂは、ノーザンブロットの結果に基づき成長ルリヂサ胚における、相対オレオシンＲＮＡ蓄積を示すグラフである。図１６Ｃは、ノーザンブロットの結果に基づき成長ルリヂサ胚における、相対 Δ６−デサチュラーゼＲＮＡ蓄積を示すグラフである。図１７は、脂肪種子ナタネの形質転換植物におけるルリヂサΔ６−デサチュラーゼ遺伝子の存在を示すＰＣＲ解析である。レーン１、３および４に、オレオシン５’調節領域に結合したルリヂサΔ６− デサチュラーゼ遺伝子で形質転換した植物由来のＤＮＡで行ったＰＣＲ反応物をのせ；レーン２はアルブミン５’調節領域に結合したルリヂサΔ６−デサチュラーゼ遺伝子で形質転換した植物由来のＤＮＡ；レーン５および６は非形質転換植物由来のＤＮＡ；レーン７は分子量マーカー（１ｋｂラダー、ＧｉｂｃｏＢＲＬ）；レーン８はテンプレートＤＮＡを添加しないＰＣＲ；レーン９はプラスミドｐＡＮ３（すなわち、オレオシン５’調節領域に結合したルリヂサΔ６−デサチュラーゼ遺伝子）を含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＥＨＡ１０５由来のＤＮＡでの対照をのせた。発明の詳細な説明本発明は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）オレオシン遺伝子由来の５’制御領域をコードする単離された核酸を提供する。本発明によれば、主題の５’制御領域は、異種遺伝子のコーディング配列またはネイティブ植物遺伝子に相補的な配列のいずれかと機能的に結合したとき、植物種子内でコーディング配列または相補的な配列の発現を行う。本発明のオレオシン５’制御領域は、５ ’から３’の方向に、主題のオレオシン５’制御領域と、制御配列の調節下にある異種遺伝子またはネイティブ植物遺伝子に相補的な配列と、３’末端配列とを含む発現カセットの構築において有用である。そのような発現カセットは、発現ベクターを構築するため、様々な自律複製ベクターに組み込まれうる。驚くべきことに、本発明の発現ベクターで形質転換された植物は、マツヨイグサ（オエノテラ・ビエニス（Ｏｅｎｏｔｈｅｒａｂｉｅｎｎｉｓ））のような天然にＧＬＡを産生する少数の植物種で見出されるレベルとほぼ同等のレベルのＧＬＡを産生することが見出された。本明細書において使用されるように、「カセット」なる語は、特定の遺伝子がヌクレオチド配列中の一つまたは複数の制御領域に機能的に結合するよう挿入されたとき、該遺伝子を発現することができるヌクレオチド配列をさす。従って、例えば、発現カセットは、植物種子内で発現することが望まれる異種コーディング配列を含んでいてもよい。従って、本発明の発現カセットおよび発現ベクターは、任意の数の異種遺伝子の種子特異的発現を行うために有用である。本明細書において使用されるように、「種子特異的発現」なる語は、内乳および胚のような、植物種子の様々な部分における発現をさす。オレオシン遺伝子由来の５’制御領域をコードする単離された核酸は、以下のようにして提供されうる。オレオシンｍＲＮＡのｃＤＮＡ（またはその一部）を用いて稙物ゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、オレオシン組換えゲノム・クローンを単離する。多数の異なるオレオシンｃＤＮＡが単離されている。そのようなｃＤＮＡならびにヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列を単離するために使用される方法は、Ｋｉｒｉｋら、１９８６ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１：４１３−４１７、Ｚｏｕら、ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１：４２９−４３３、ＶａｎＲｏｏｉｇｅｎら、１９９２ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：１１７７−１１７９に公表されている。ランダム・プライム・ポリメラーゼ鎖（ＲＰ−ＰＣＲ）ｃＤＮＡプローブを用いた、組織特異的ライブラリーのバーチャル・サブトラクション・スクリーニングは、植物ゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために有用なオレオシンｃＤＮＡを得るためのもう一つの方法である。バーチャル・サブトラクション・スクリーニングとは、標的組織からｃＤＮＡライブラリーを構築し、個々のｃＤＮＡクローンが容易に分離されうるよう低密度で表示する、方法をさす。これらのｃＤＮＡクローンは、標的組織以外の一つまたは複数の組織（即ち、ドライバー組織）から作製された、ドライバー量（即ち、ハイブリダイゼーション反応を動力学的にドライブするＤＮＡ濃度）のｃＤＮＡプローブを用いて、引き算的にスクリーニングされる。ハイブリダイズしたプラークは、標的組織とドライバー組織の両方において発現する遺伝子を表す。ハイブリダイズしないプラークは、ドライバーｃＤＮＡプローブにより検出され得ない組織特異的な、または存在量の少ない遺伝子を表す。ハイブリダイズしないｃＤＮＡは、推定標的組織特異的遺伝子として選択され、ワン・パス配列決定（ｏｎｅ−ｐａｓｓｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）およびノーザン・ハイブリダイゼーションによりさらに分析される。ランダム・プライムＰＣＲ（ＲＰ−ＰＣＲ）は、大量のｃＤＮＡプローブの微量のｃＤＮＡ鋳型からの合成に関する。この方法は、ＰＣＲの増幅力をランダム・プライミングの表示と組み合わせ、単一試験官反応において二本鎖ｃＤＮＡを同時に増幅し標識するものである。オレオシン・ゲノム組換えＤＮＡを得るために有用であると考えられる方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９，ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ、または広く入手可能な組換えＤＮＡ技術に関する多数の実験マニュアルに提供されている。ヌクレオチド配列を決定するためには、多数の技術が利用可能であり、当業者に知られている。例えば、オレオシン制御領域を含む制限断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ(ストラタジーン(Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ)) のような配列決定用ベクターのポリリンカー部位にサブクローニングすることができる。次に、これらのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔサブクローンを二本鎖ジデオキシ法により配列決定することができる（ＣｈｅｎａｎｄＳｅｅｂｕｒｇ，１９８５，ＤＮＡ４：１６５）。好ましい実施態様において、オレオシン制御領域は、図９のヌクレオチド１− １２６７（配列番号：１２）を含む。種子特異的発現を行うという特徴的性質を維持している、配列番号：１２に記載のオレオシン制御領域に対する改変は、本発明の範囲内に含まれる。そのような改変には、一つまたは複数のヌクレオチドの挿入、欠失および置換が含まれる。本発明の５’制御領域は、オレオシン・ゲノム・クローンの制限エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼによる分解によっても得られる。従って、例えば、単離されたオレオシン遺伝子のコーディング領域の既知のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列（例えば、図７）を、単離されたオレオシン・ゲノム・クローンおよび単離されたオレオシン・ゲノム・クローンの５’隣接配列（即ち、コーディング領域の翻訳開始コドンの上流配列）の核酸配列または推定アミノ酸配列と整列させる。配列番号：１２（図９のヌクレオチド１−１２６７）に記載のオレオシン５’ 制御領域は、エキソヌクレアーゼＩＩＩによる欠失により、過剰の５’隣接配列またはコーディング配列のいずれかまたは両方を有するゲノム・クローンから作製されうる。これは、適当に調製されたＤＮＡをエキソヌクレアーゼIII（ｅｘｏＩＩＩ）で分解し、分解の時間間隔を増大させながら一部を取り出すことにより達成される。得られた連続的に小さくなるＤＮＡ断片を、欠失の正確な終点を決定するため配列決定することができる。プロメガ・バイオテク（ＰｒｏｍｅｇａＢｉｏｔｅｃｈ）の「イレースＡベース（Ｅｒａｓｅ−Ａ−Ｂａｓｅ）」システムなど、そのような欠失系列を作製するためエキソヌクレアーゼＩＩＩ（ｅｘｏＩＩＩ）を使用する、商業的に入手可能なシステムがいくつか存在する。または、主題の５’制御領域を直接的に増幅するためＰＣＲプライマーを決定してもよい。同様の方法を用いて、当業者は、配列番号：１２に記載のヌクレオチド１−１２６７の一つまたは複数の欠失断片を作製することができる。配列番号：１２に記載のヌクレオチドの隣接部分を含み、種子特異的発現を行う能力を保持している欠失断片は、全て、いずれも、本発明により考慮される。配列番号：１２のヌクレオチド１−１２６７を含み、種子特異的発現を行うオレオシン５’制御領域、およびそれらの改変体または欠失断片の同定は、特異的配列を異種遺伝子のコーディング配列と転写的に融合させ、キメラ遺伝子を適当な宿主へ導入し、異種遺伝子の発現を検出することにより達成することできる。発現を検出するために用いられるアッセイは、異種配列の性質により異なる。例えば、クロラムフェニコール・アセチル・トランスフェラーゼおよびβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）のようなレポーター遺伝子が、キメラ構築物の転写および翻訳の能力を調べるために通常使用される。標準的なアッセイがトランスジェニック生物中のレポーター酵素を高感度に検出するために利用可能である。β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子は、植物細胞内で酵素の安定性が高く、高等植物には内在β−グルクロニダーゼ活性が存在せず、定量的蛍光定量アッセイおよび組織化学的位置決定法が利用可能であることから、トランスジェニック植物におけるプロモーター活性のレポーターとして有用である。Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら（１９８７ＥＭＢＯＪ６：３９０１）は、植物組織内のＧＵＳ活性の生化学的検出および組織化学的検出のための標準的な方法を確立した。生化学的アッセイは、植物組織溶解物をＧＵＳの蛍光定量基質である４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニドと混合し、３７℃で一時間インキュベートし、次に得られた４−メチル−ウンベリフェロンの蛍光を測定することにより行われる。ＧＵＳ活性の組織化学的位置決定は、植物組織サンプルを５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）中で３７℃で約１８時間インキュベートし、Ｘ−Ｇｌｕｃの染色パターンを観察することにより決定される。そのようなキメラ遺伝子の構築は、特異的制御配列の決定を可能にし、これらの配列が種子特異的に異種遺伝子の発現を行いうることを証明する。本発明のもう一つの局面は、制御因子が異種遺伝子によりコードされる産物の発現を調節することができるよう、異種遺伝子のコーディング配列と機能的に結合した、種子特異的発現を行うオレオシン遺伝子由来の５’制御領域を含む発現カセットおよび発現ベクター（本明細書において「キメラ遺伝子」とも呼ばれる）に関する。異種遺伝子は、オレオシン以外のいかなる遺伝子であってもよい。必要に応じて、異種遺伝子によりコードされるポリペプチドが有効量産生されるような発現を引き起こすために充分な、付加的な制御因子またはこれらの因子の一部がキメラ構築物に含まれる。従って、本発明は、脂質代謝酵素のような異種遺伝子をコードする配列と機能的に結合した、種子特異的発現を与えるオレオシン５’制御領域の配列を含むキメラ遺伝子を提供する。本発明を実施するために有用な脂質代謝遺伝子の例は、 Δ６−デサチュラーゼ、Δ１２−デサチュラーゼ、Δ１５−デサチュラーゼ、ならびにその他の関連デサチュラーゼ、例えばステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ、アシルキャリアータンパク質（ＡＣＰ）、チオエステラーゼ、アセチルトランスアシラーゼ、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ、ケトアシル合成酵素、マロニルトランスアシラーゼ、およびエロンガーゼを含む。そのような脂質代謝遺伝子は、多数の異なる細菌種および植物種から単離され特徴決定されている。それらのヌクレオチド・コーディング配列およびそのようなコーディング配列を単離する方法は、公表された文献に開示されており、当業者に広く利用可能となっている。特に、米国特許第５，５５２，３０６号および本明細書に参照として組み込まれる１９９４年１２月３０日出願の本出願人らの同時係属中の米国特許出願第０８／３６６，７７９号に開示されたΔ６−デサチュラーゼ遺伝子は、本発明の実施において特に有用な脂質代謝遺伝子として考慮される。本発明のキメラ遺伝子は、オレオシン・ゲノムＤＮＡの５’制御領域を異種遺伝子のコーディング配列にライゲートすることにより構築される。これらの配列の並置は、様々な方法で達成されうる。好ましい実施態様において、配列の順序は、５’から３’へ、オレオシン制御領域（プロモーターを含む）、コーディング配列、そしてポリアデニル化部位を含む末端配列である。そのようなキメラ遺伝子の構築のための標準的な方法は当業者に周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）のような参照に見出される。ＤＮＡ断片のライゲーションには様々な方法が利用可能であり、その選択は、ＤＮＡ断片の末端の性質による。当業者は、異種遺伝子を発現させるためには、構築物にプロモーター因子および転写物の充分なポリアデニル化のためのシグナルが必要であることを認識する。従って、ＴＡＴＡボックスとして知られるコンセンサス・プロモーター配列を含むオレオシン５’制御領域が、プロモーターを含まない異種コーディング配列に直接ライゲートされうる。オレオシンＴＡＴＡボックスを含む制限断片または欠失断片が、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）のコーディング配列のようなプロモーターを含まない異種遺伝子に順方向でライゲートされる。当業者であれば、主題のオレオシン５’制御領域が他の方法、例えば化学合成または酵素合成によっても提供されうることを認識するであろう。任意に、異種コーディング配列の３’末端が、ポリアデニル化部位を含む末端配列にライゲートされてもよい。ポリアデニル化部位の例としては、ノパリン合成酵素ポリアデニル化部位、またはオクトピンＴ−ＤＮＡ遺伝子７ポリアデニル化部位が挙げられるが、これらに限定されない。または、ポリアデニル化部位は異種遺伝子により提供されてもよい。本発明はまた、植物種子内の異種遺伝子のレベルを増加させる方法を提供する。そのような方法によれば、異種遺伝子を発現させるため、主題の発現カセットおよび発現ベクターが植物に導入される。例えば、脂肪酸合成または脂質代謝の遺伝子の産物のレベルが増加した植物を作製する方法は、脂肪酸合成または脂質代謝の遺伝子と機能的に結合したオレオシン５’制御領域を含む発現ベクターで植物細胞を形質転換し、脂肋酸合成または脂質代謝の遺伝子の産物のレベルが増加した植物を再生させることにより提供される。本発明のもう一つの局面は、ネイティブ植物遺伝子と相補的な核酸配列と機能的に結合した主題のオレオシン制御領域を含む発現ベクターで植物細胞を形質転換することを含む、植物にネイティブな遺伝子の産物のレベルを減少させる方法を提供する。この方法において、内因性のネイティブ植物遺伝子産物のレベルは、アンチセンス制御として知られる機構により減少する。従って、例えば、脂肪酸合成遺伝子または脂質代謝遺伝子の産物のレベルは、ネイティブな脂肪酸合成または脂質代謝の遺伝子をコードする核酸配列と相補的な核酸配列と機能的に結合した主題のオレオシン５’制御領域を含む発現ベクターで植物を形質転換することにより減少する。本発明はまた、ネイティブ植物遺伝子をコードする核酸配列と機能的に結合した主題のオレオシン５’制御領域を含む発現ベクターで植物細胞を形質転換することを含む、植物にネイティブな遺伝子を共抑制する方法を提供する。この方法においては、共抑制として知られる機構により、内因性のネイティブ植物遺伝子産物のレベルが減少する。従って、例えば、脂肪酸合成または脂質代謝の遺伝子の産物のレベルが、植物にネイティブな脂肋酸合成または脂質代謝の遺伝子をコードする核酸配列と機能的に結合した主題のオレオシン５’制御領域を含む発現ベクターで植物を形質転換することにより減少する。共抑制の正確な機構は完全には理解されていないが、共抑制に関連した実験条件および結果を報告した公表された研究が、当業者に周知である（Ｎａｐｏｌｉら、１９９０ＴｈｅＰｌａｎｔＣｅｌｌ２：２７０−２８９；ＶａｎｄｅｒＫｒｏｌ１９９０ＴｈｅＰｌａｎｔＣｅｌｌ２：２９１−２９９）。異種遺伝子またはネイティブ遺伝子の制御された発現を提供するため、植物は本発明のキメラ遺伝子構築物で形質転換される。遺伝子導入の方法は当分野において周知である。キメラ遺伝子は、Ｈｏｒｓｃｈら、１９８５Ｓｃｉｅｎｃｅ２２７：１２２９により記述されたリーフ・ディスク形質転換・再生法により植物に導入されうる。プロトブラスト培養（Ｈｏｒｓｃｈら、１９８４Ｓｃｉｅｎｃｅ２２３：４９６，ＤｅＢｌｏｃｋら、１９８４ＥＭＢＯＪ．２：２１４３，Ｂａｒｔｏｎら、１９８３，Ｃｅｌｌ３２：１０３３）のようなその他の形質転換法も使用することができ、本発明の範囲内に含まれる。好ましい実施態様において、植物は、Ｋｌｅｔｔら（１９８７）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．３８：４６７に記述されたもののような、アグロバクテリウム由来ベクターで形質転換される。その他の周知の方法が、本発明のキメラ遺伝子を植物細胞に挿入するために利用可能である。そのような代替法には、バイオリスティック法（Ｋｌｅｉｎら、１９８７Ｎａｔｕｒｅ３２７：７０）、エレクトロポレーション、化学的なＤＮＡ取り込みの誘導、およびベクターとしてのウイルスまたは花粉の使用が含まれる。形質転換法に必要であれば、本発明のキメラ遺伝子は植物形質転換ベクター、例えばＢｅｖａｎ，Ｍ．１９８４ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１２：８７１１−８７２１により記述されたバイナリー・ベクターに挿入されうる。植物形質転換ベクターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｓｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の天然の遺伝子導入システムを改変することにより得られうる。天然のシステムには、形質転換された植物に導入される、Ｔ−ＤＮＡとして知られる大きなセグメントを含むラージＴｉ（腫瘍誘導性）プラスミドが含まれる。Ｔｉプラスミドのもう一つのセグメント、ｖｉｒ領域は、Ｔ−ＤＮＡの導入に必要なものである。Ｔ−ＤＮＡ領域の両端には、末端反復配列が存在する。改変されたバイナリー・ベクターにおいては、腫瘍誘導遺伝子が欠失しており、ｖｉｒ領域の機能がＴ−ＤＮＡ両端配列が両端に存在する外来ＤＮＡを導入するために利用される。Ｔ−領域はまた、抗生物質耐性のための選択マーカー、および導入したい配列を挿入するためのマルチプル・クローニング部位を含む。そのように組み換えられた鎖は、「安全化された（ｄｉｓａｒｍｅｄ）」Ａ．ツメファシエンス鎖として知られており、Ｔ−領域が両端に存在する配列を植物の核ゲノムへ効率的に導入することを可能にする。表面滅菌されたリーフ・ディスクおよびその他の感受性のある組織に、多くの日数にわたり培養された「安全化された（ｄｉｓａｒｍｅｄ）」外来ＤＮＡ含有Ａ．ツメファシエンスが接種され、次に、抗生物質含有培地に移される。形質転換された苗条は、次に、適当な抗生物質を含む培地で根付かせた後、選択され、土壌に移される。トランスジェニック植物は、受粉され、これらの植物由来の種子が収集され抗生物質含有培地で成長させられる。発達途中の種子、幼い実生および成熟した植物における異種遺伝子またはレポーター遺伝子の発現は、免疫学的アッセイ、化学組織学的アッセイまたは活性アッセイによりモニターできる。本明細書に記載のように、キメラ遺伝子の発現のためのアッセイの選択は、異種コーディング配列の性質による。例えば、適当なヌクレオチド・プローブが利用可能であれば、ノーザン解析が転写を調べるために使用されうる。異種遺伝子によりコードされるポリペプチドに対する抗体が利用可能であるならば、ポリペプチドの産生および位置決定を調べるために、ウェスタン解析および免疫組織化学的位置決定が使用されうる。異種遺伝子によっては、適当な生化学的アッセイが使用されうる。例えば、標準基質のアセチル化を測定することによりアセチルトランスフェラーゼが検出される。脂質デサチュラーゼ遺伝子の発現は、脂肋酸メチルエステル（ＦＡＭＥＳ）の分析によりアッセイされうる。本発明のもう一つの局面は、本発明のキメラ遺伝子を含有するトランスジェニック植物またはこれらの植物の子孫を提供する。単子葉植物と双子葉植物の両方が考慮される。植物細胞は、上述の植物形質転換法のいずれかによりキメラ遺伝子で形質転換される。通常、カルス培養物、リーフ・ディスク、外植体または完全な植物体（Ｂｅｃｈｔｏｌｄら、１９９３Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ａｃｉ．Ｐａｒｉｓ，３１６：１１９４− １１９９の真空浸透法による）の形態である、形質転換された植物細胞は、当業者に周知の方法（例えば、Ｈｏｒｓｃｈら、１９８５Ｓｃｉｅｎｃｅ２２７：１１２９）により、完全なトランスジェニック稙物（ｃｏｍｐｌｅｔｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔ）へと再生される。好ましい実施態様において、トランスジェニック植物は、ヒマワリ、綿、オイル・シード・レープ、トウモロコシ、タバコ、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、落花生または大豆である。形質転換された植物の子孫はキメラ遺伝子を受け継いでいるため、形質転換された植物由来の種子または挿木は、トランスジェニック系統を維持するために使用される。以下の実施例により本発明をさらに説明する。実施例１膜結合ポリゾームＲＮＡの単離及びそのルリヂサｃＤＮＡライブラリーの構成受粉から１２日後（１２ＤＰＰ）のルリヂサの種子から、ラーキンス（Ｌａｒｋｉｎｓ）およびデービース（Ｄａｖｉｅｓ）によって豆類に関し確立されたプロトコル（１９７５年、「植物生理学（ＰｌａｎｔＰｈｙｓ．）」５５：７４９〜７５６）を用いて、膜結合ポリゾームを単離した。ＲＮＡを、メクラー（Ｍｅｃｈｌｅｒ）が説明しているように（１９８７年、「酵素学における諸方法（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」１５２：２４１〜２４８）、アカデミック・プレス（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ）ポリゾームから抽出した。ポリ−Ａ⁺ＲＮＡを、オリゴテックス（Ｏｌｉｇｏｔｅｘ）−ｄＴ（商標）ビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて膜結合ポリゾームＲＮＡから単離した。対応するｃＤＮＡを、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社のＺＡＰｃＤＮＡ合成キットを用いて作成した。ｃＤＮＡのライブラリーは、ラムダＺＡＰＩＩキットを用いてラムダＺＡＰＩＩベクター（ストラタジーン社）で作成した。主要なライブラリーは、ギガパックＩＩゴールドパッケージング抽出物（ＧｉｇａｐａｃｋＩＩＧｏｌｄｐａｃｋａｇｉｎｇｅｘｔｒａｃｔ）（ストラタジーン社）でパッケージされた。実施例２ルリヂサからのΔ−６デサチュラーゼｃＤＮＡの単離ハイブリダイゼーションプロトコル増幅されたルリヂサｃＤＮＡライブラリーが、低密度（１５０ｍｍのペトリ皿に５００ｐｆｕ）で平板培養された。ごく一般的な種子保存タンパク質ｃＤＮＡを、対応するｃＤＮＡでスクリーニングすることにより分離した（全体のｃＤＮＡから取り除いた）。ルリヂサｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのハイブリダイゼーションプローブは、オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）らによって説明されたように（１９９４年、「分子生物学における現在の諸プロトコル（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ）」，ＷｉｌｅｙＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．参照）ランダム・プライムド（ｒａｎｄｏｍｐｒｉｍｅｄ）ＤＮＡ合成を用いて生成され、これを既に同定済みの豊富に発現された種子保存タンパク質ｃＤＮＡに対応させた。取り込まれなかったヌクレオチドを、Ｇ−５０スピンカラム（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｈｅｉｍ）によって除去した。プローブは水浴で５分間煮沸することによりハイブリダイゼーションのための変性を施され、その後、氷の上で急速に冷やされた。固定された組換えバクテリオファージを担持するニトロセルロース製フィルターを、ハイブリダイゼーション溶液［（ＮａＣｌ６００ｍＭ，トリス−ＨＣｌ８０ｍＭ,Ｎａ₂ＥＤＴＡ４ｍＭ；ｐＨ７.８）を４セット、デンハルト試薬（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓｒｅａｇｅｎｔ）すなわち（０．１％ウシ血清アルブミン，０．１％ファイコール（Ｆｉｃｏｌｌ），０．１％ポリビニルピロリドン）を５セット、変性したサケ（鮭）精子ＤＮＡ１００ μｇ／ｍｌ、ポリアデニン５０μｇ／ｍｌ、およびポリシチジン１０μｇ／ｍｌ］内で２〜４時間６０℃で予備ハイブリダイゼーションした。また、このハイブリダイゼーション溶液を新しいハイブリダイゼーション溶液に取り換え、これに変性された放射性プローブを加えた（ハイブリダイゼーション溶液１ｍｌ当たり２ｎｇ）。フィルターは攪拌されながら６０℃で一晩培養された。フィルターは、（ＮａＣｌ１５０ｍＭ，トリス−ＨＣｌ２０ｍＭ，Ｎａ₂ＥＤＴＡ１ｍＭ，ｐＨ７．８）の４セット、２セット、１セットをこの順で用いて各々６０℃ で１５分間洗浄した。フィルターは、空気乾燥された後、−８０℃で集中スクリーンと共に２４時間Ｘ線フィルムに露出された。ストラタジーン社の切除プロトコルおよび試薬を用いたが、ハイブリダイゼーションプラークは全く切除されなかった。結果として得られたバクテリアのコロニーは、液体培養基に接種するために用いられ、手作業もしくはＡＢＩ自動配列装置で配列決定された。ルリヂサ種子１２（ＤＰＰ）の膜結合ポリゾームライブラリーからのｃＤＮＡのランダム配列非ハイブリダイゼーションプラークに対応する各ｃＤＮＡがいったん配列決定され、２００〜３００個の塩基対から配列タグが作成された。全ての配列は、サイクル配列（エピセンター、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）によって行われた。３００個以上の発現された配列タグ（ＥＳＴ）が作成された。各配列タグは、ブラスト（ＢＬＡＳＴ）アルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９０年，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０参照）を用いてジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）データベースと比較された。Δ６−デサチュラーゼを含む数多くの脂質代謝遺伝子が同定された。ジェンバンクデータベースと共に「ＢＬＡＳＴＸ」を用いて、ｍｂｐ−６５と表されたｃＤＮＡクローンをデータベースサーチした結果、以前に単離されたシネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）Δ６−デサチュラーゼに顕著に適合した。しかし、ｍｂｐ−６５が完全な長さを有するｃＤＮＡでないことが判明した。ルリヂサ膜結合ポリゾームライブラリーをスクリーンニングすべく、ｍｂｐ−６５を用いて完全な長さのｃＤＮＡが単離された。結果として得られたクローンはｐＡＮ１と表され、ｐＡＮ１のｃＤＮＡインサートが、サイクル配列法で配列決定された。オープン・リーディング・フレームから類推されたアミノ酸配列（図１、配列番号：１）は、ジェノワークス（Ｇｅｎｏｗｏｒｋｓ）（ＩｎｔｅｌｌｉｇＧｅｎｅｔｉｃｓ）タンパク質整列プログラムを用いて、他の既知のデサチュラーゼと比較した。この整列により、ｐＡＮ１のｃＤＮＡインサートがルリヂサのΔ６−デサチュラーゼ遺伝子であることが示された。結果として得られたデンドログラム（図２）は、Δ¹⁵−デサチュラーゼおよび Δ¹²−デサチュラーゼが二つのグループを構成することを示している。新しく単離されたルリヂサ配列および以前に単離されたシネコシスティスのΔ⁶−デサチュラーゼ（米国特許第５，５５２，３０６号）が、第三の別のグループを形成する。デサチュラーゼにおいて普通に見出され且つ金属結合において触媒的に関与していると考えられるアミノ酸モチーフを比較すると、ルリヂサ遺伝子によってデサチュラーゼに一般にコードされたタンパク質と、特にシネコシスティスのΔ⁶−デサチュラーゼとの、全体としての類似性が示されている（表１）。同時に、表１のモチーフを比較すれば、このタンパク質と他の植物のデサチュラーゼとの差異も明白である。さらに、ルリヂサの配列は、チトクロームｂ５タンパク質の中に維持されているヘム結合モチーフの存在によっても、既知の植物の膜に付随した脂肪酸デサチュラーゼから区別される（シュミット（Ｓｃｈｍｉｄｔ）ら、１９９４年、ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６：６３１〜６４２）（図１）。よって、単離されたｃＤＮＡがルリヂサのΔ⁶−デサチュラーゼ遺伝子であることがこれらの結果により明確に示される一方で、一層の確認が必要であった。ルリヂサのΔ６−デサチュラーゼｃＤＮＡの同一性を確かめるため、ｐＡＮ１からのｃＤＮＡインサートが、安定した発現を得るべく発現カセット内にクローン化された。ＧＵＳコーディング域を切除すると共に３５ＳプロモーターおよびＮＯＳターミネーターを無傷で残すＢａｍＨＩおよびＥｃｏＩＣＲＩ（短い端を残すＳａｃＩのイソシゾマー（ｉｓｏｓｃｈｉｚｏｍｅｒ）、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社より入手可能）を用いた消化による結紮のために、ベクター（ｐＢＩ１２１（ジェファーソン（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ）ら、１９８７年、ＥＭＢＯＪ．６：３９０１−３９０７）が準備された。ルリヂサのΔ⁶−デサチュラーゼｃＤＮＡが、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩを用いた消化により組換えプラスミド（ｐＡＮ１）から切除された。ＤＮＡポリメラーゼＩのクレナウ断片（Ｋｌｅｎｏｗｆｒａｇｍｅｎｔ）によって触発されたフィル・イン（ｆｉｌｌ −ｉｎ）反応を行うことによって、ＸｈｏＩ端が短くされた。この断片がｐＢＩ１２１．１のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＩＣＲのＩ部位にクローン化され、プラスミドｐＡＮ２が得られた。実施例３トランスジェニック植物の製造および脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）の調製と分析タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍｃｖ．ｘａｎｔｈｉ）を、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を介して、最初の形質転換株が１００μｇ／ｍｌのカナマイシン上で選別された点以外は標準的な手順（ホルシュ（Ｈｏｒｓｃｈ）ら、１９８５年、Ｓｃｉｅｎｃｅ２２７：１２２９〜１２３１；ボーグ（Ｂｏｇｕｅ）ら、１９９０年、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２１：４９〜５７）に従って形質転換するために、プラスミドｐＡＮ２が用いられた。トランスジェニック植物から採取された組織は、液体窒素中で凍結され、一晩凍結乾燥された。ＦＡＭＥが、ダーマー（Ｄａｈｍｅｒ）らによって説明されたように（１９８９年、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｏｉｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．６６：５４３〜５４８）準備された。幾つかの場合において、溶剤は再び蒸発され、ＦＡＭＥは酢酸エチルの中で再懸濁された後に、脱イオンされた水で一度抽出されて、一切の水溶性の汚染物質が除去された。ＦＡＭＥは、トラコール（Ｔｒａｃｏｒ）−５６０気液クロマトグラフィーを用い、既知の方法（レディー（Ｒｅｄｄｙ）ら、１９９６年、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．１４：６３９〜６４２）で分析された。図３に示されるように、トランスジェニックタバコの葉（ルリヂサのｃＤＮＡを含む）は、ＧＬＡおよびオクタデカテトラエノイン酸（ＯＴＡ）の両方を生成した（１８：４ Δ６，９，１２，１５）。従って、この結果は、単離されたｃＤＮＡがルリヂサのΔ６−デサチュラーゼをコードすることを示す。実施例４ルリヂサにおけるΔ６−デサチュラーゼの発現ルリヂサ組織に由来するＲＮＡのノーザン分析により、Δ６−デサチュラーゼの元来の発現が調べられた。ＲＮＡは、チャン（Ｃｈａｎｇ）らの方法（１９９３年、ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．１１：１１３〜１１６参照）に従い、生長しているルリヂサの胚から単離された。ＲＮＡは、標準的なプロトコル（１９９６年、オーセルベル（Ａｕｓｅｌｂｅｌ）ら編集の「分子生物学における現在の諸プロトコル」［ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇおよびＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮｅｗＹｏｒｋ］４．９．１〜４．９．１４ページにおけるブラウンＴ．を参照）に従い、ホルムアルデヒド−アガロースゲル上に電気泳動的に分離され、毛細管による移送によりナイロン膜に付着させられ、８０℃で３０分間加熱することで固定された。フィルターは、５０％の脱イオン後ホルムアミド、デンハルト試薬５セット、ＳＳＰＥ（ＮＡＣｌ９００ｍＭ，リン酸ナトリウム５０ｍＭ，ｐＨ７．７；およびＥＤＴＡ５ｍＭ）５セット、０．１％のＳＤＳ、２００μｇ／ｍｌの変性されたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、４２℃ で予備培養された。２時間後、フィルターは上記と同じ組成の新しい溶液に入れられ、且つ変性された放射活性ハイブリダイゼーションプローブが加えられた。本例において、使用されたプローブは、ルリヂサのレグミン（ｌｅｇｕｍｉｎ）ｃＤＮＡ（図１６Ａ）、ルリヂサのオレオシン（ｏｌｅｏｓｉｎ）ｃＤＮＡ（図１６Ｂ）、およびルリヂサのΔ６−デサチュラーゼｃＤＮＡ（ｐＡＮ１，実施例２）（図１６Ｃ）であった。ルリヂサのレグミンｃＤＮＡおよびオレオシンｃＤＮＡはＥＳＴクローニングによって単離され、実施例２で説明したようにブラストアルゴリズムを用いてジェンバンクデータベースと比較することにより同定された。負荷変動は、ルリヂサＥＦ１α ｍＲＮＡのレベルに標準化することにより補正された。ＥＦ１α ｍＲＮＡは、実施例２で説明したＥＳＴ分析によって得られた対応するｃＤＮＡと相関させることにより同定された。フィルターは、４２℃で１２〜２０時間ハイブリダイゼーションされ、その後、上述のように洗浄され（ただし、温度が６５℃であることを除く）、空気乾燥されてからＸ線フィルムに露出された。図１５Ａおよび図１５Ｂに示されているように、Δ６−デサチュラーゼがルリヂサの種子において顕著に発現されている。ルリヂサの種子は受粉後日数（ｄｐｐ）１８日から２０日の間で成熟する。Δ６ −デサチュラーゼｍＲＮＡの発現は、収集された各時点を通して（８〜２０ｄｐｐ）起こったが、受粉後日数１０〜１６日から最大となったと思われる。この発現プロフィールは、ルリヂサのオレオシンおよび１２ｓ種子保存タンパク質ｍＲＮＡに関して観察されたものに類似している（図１６Ａ、図１６Ｂおよび図１６Ｃ）。実施例５新規なオレオシンｃＤＮＡの単離および特徴付け根組織に由来するランダム・プライムド・ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＰ−ＰＣＲ）ｃＤＮＡプローブを用い、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の生長中の種子のｃＤＮＡライブラリーを実質的に抽出スクリーニングすることによって、オレオシンｃＤＮＡ（ＡｔＳ２１）が単離された。ＲＮＡの調製シロイヌナズナ・タリアナ・ランズベルク・エレクタ（ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａＬａｎｄｓｂｅｒｇｅｒｅｃｔａ）植物を、バーミキュライト／土の混合物において光を連続的に照射しながら、常温（２２℃）で栽培した。開花から２〜５日後の長角果を切開し、生長中の種子および長角果皮を分離した。初期の花蕾および充分に開いた花を含む花部、葉、開花から１〜３日後の長角果全部も集められた。ガンボルグ（Ｇａｍｂｏｒｇ）Ｂ₅液状媒体（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）で二週間栽培された実生苗から根が採取された。この根部培養用の種子は、５０％の漂白剤で５分間消毒した後、水で充分にすすいだ。全組織は液体窒素中で凍結され、使用時まで−８０℃で保存された。全てのＲＮＡは、加熱されたフェノール／ＳＤＳ抽出およびＬｉＣｌ沈殿プロトコル（ハリス（Ｈａｒｒｉｓ）ら、１９７８年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７：３２５１〜３２５６；ガラウ（Ｇａｌａｕ）ら、１９８１年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：２５５１〜２５６０）に従って単離された。ポリＡ＋ＲＮＡは、製造者のプロトコル（ファーマシア（ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ）もしくはストラタジーン）に基づくオリゴｄＴカラムクロマトグラフィーを用いて、あるいはオリゴテックス−ｄＴラテックス粒子（ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴｌａｔｅｘｐａｒｔｉｃｌｅｓ）（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて単離された。組織特定ｃＤＮＡライブラリーの構成花、１日長角果、３日長角果、葉、根および生長中の種子ｃＤＮＡライブラリーを、ＺＡＰｃＤＮＡ合成キット（ストラタジーン）を用いて５μｇのポリＡ＋ＲＮＡから構成した。ｃＤＮＡは、λ−ＺＡＰＩＩベクターにおけるｐブルースクリプト（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）ＳＫ（−）のＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ部位に方向付けてクローン化された（ショート（Ｓｈｏｒｔ）ら、１９８８年、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１６：７５８３−７６００参照）。非組換えファージプラークは、Ｘ−ガル（ｇａｌ）（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）およびＩＰＴＧ（イソプロピル−１− チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を含んだＮＺＹプレート上での青色展開（ｂｌｕｅｃｏｌｏｒｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）によって確認された。花、１日長角果、３日長角果、葉、根および生長中の種子ｃＤＮＡライブラリーの非組換えバックグラウンドは、各々２．８％、２％（ｍ）、３．３％、６．５％、２．５％および１．９％であった。ランダムプライミングＤＮＡラベリング単離されたクローン（ハイブリダイゼーションされていないｃＤＮＡ）のｃＤＮＡインサートは、ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ二重消化によって切除され、ランダムプライミングラベリングのためにゲル精製された。クレナウ（Ｋｌｅｎｏｗ）反応混合物は、ＤＮＡテンプレートを５０ｎｇ、トリス−ＨＣｌを１０ｍＭ、ｐＨ７．５、ＭｇＣｌ₂を５ｍＭ、ＤＴＴを７．５ｍＭ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰならびにｄＴＴＰを各５０μＭ、ヘキサマーランダムプライマー（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）を１０μＭ、α−３２Ｐ−ｄＡＴＰを５０μＣｉ、３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ、１０ｍＣｉ／ｍｌ（デュポン）、および５ユニットのＤＮＡポリメラーゼＩクレナウ断片（ニューイングランド・バイオラブズ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を含んでいた。反応は１時間、３７℃で行われた。希釈された反応混合物を等分し、ＴＣＡ沈殿およびアルカリ変性ゲル分析のために用いた。ハイブリダイゼーションプローブはクレナウＤＮＡポリメラーゼのみでラベリングされ、取り込まれなかったｄＮＴＰはセファデックス(Ｓｅｐｈａｄｅｘ)ＲＧ−５０スピンカラム（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）を用いて除去された。ランダム・プライムドＰＣＲｃＤＮＡ合成システム（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）をプライマーとしてのオリゴｄＴ１２−１８と共に用いて、シロイヌナズナの根組織から分離されたポリＡ＋ＲＮＡから、二重らせん構造のｃＤＮＡを合成した。３００ｂｐよりも長いｃＤＮＡは、セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）Ｓ−４００カラムクロマトグラフィー（ストラタジーン）によって濃縮された。断片となったｃＤＮＡは、ＲＰ−ＰＣＲラベリング用のテンプレートとして用いられた。反応物は、トリス−ＨＣｌを１０ｍＭ、ｐＨ９．０、ＫＣｌを５０ｍＭ、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００を０．１％、ＭｇＣｌ₂を２ｍＭ、ＴａｑＤＮＡポリメラス（ｐｏｌｙｍｅｒａｓ）（ＰＲＯＭＥＧＡ）を５ユニット、２００μＭのｄＣＴＰ、ｃＧＴＰ、ｄＴＴＰ、また、異なる濃度のヘキサマーランダムプライマーα−３２ＰｄＡＴＰ、８００ｍＣｉ／ｍｍｏｌｅ、１０ｍＣｉ／ｍｌ（デュポン）、冷却されたｄＡＴＰを含み、最終的な容積が２５μｌであった。最初９５℃で５分間加熱した後、ＲＰ−ＰＣＲｃＤＮＡの条件を最適化すべく、異なるプログラムを通して異なる反応が行われた。特に示さない限り、以下のプログラムが大部分のＲＰ−ＰＣＲｃＤＮＡプローブラベリングのために用いられた。プログラムは、９５℃／５分間、次に９５℃で３０秒を４０サイクル、１８℃／１秒、０．１℃／秒の速度で３０℃までの勾配、７２℃／１分であった。ＲＰ−ＰＣＲ生成物は、フェノール／クロロホルム抽出され、エタノール沈殿されるか、もしくはセファデックスＧ−５０スピンカラム（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）を通過させて精製された。クローンブロットの実質的な除去 λ−ＺＡＰｃＤＮＡライブラリーの大量切除（ｍａｓｓｅｘｃｉｓｉｏｎ）が、ＸＬ１−ブル−ＭＲＦ’宿主細胞を上記ライブラリーおよびＥｘアシストヘルパー（ＥｘＡｓｓｉｓｔｈｅｌｐｅｒ）ファージ（ストラタジーン）からの組換えファージに相互感染させることにより行われた。切除されたファージミドは、ＳＯＬＲ細胞によって救助・回収された。プラスミドＤＮＡは、ランダムに単離されたクローンから煮沸ミニプレップ法（ｂｏｉｌｉｎｇｍｉｎｉ− ｐｒｅｐｍｅｔｈｏｄ）（ホームズ（Ｈｏｌｍｅｓ）ら、１９８１年、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１４：１９３〜１９７）によって調製された。ｃＤＮＡインサートは、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ二重消化によって切除され、１％アガロースゲル上で分析された。ＤＮＡは０．５ＮのＮａＯＨおよび１．５ｍのＮａＣｌで４５分間変性され、０．５Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、および１．５ＭのＮａＣｌで４５分間中和され、その後、１０セットのＳＳＣ中で一晩かけてナイロン膜（マイクロン・セパレーションズ（ＭｉｃｒｏｎＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）社）にブロット（ｂｌｏｔ）された。６５℃で１時間予備ハイブリダイゼーションした後、根のＲＰ−ｃＤＮＡプローブは、１％のウシアルブミン画分Ｖ（ｂｏｖｉｎｅａｌｂｕｍｉｎｆｒａｃｔｉｏｎＶ）（シグマ）（Ｓｉｇｍａ）、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ＭのＮａＨＰＯ₄、ｐＨ７．２、７％ＳＤＳを含む同じハイブリダイゼーション緩衝剤に加えられた。ハイブリダイゼーションは６５℃で２４時間継続した。フィルターは、０．５％ウシアルブミン、１ｍＭのＥＤＴＡ、４０ｍＭのＮａＨＰＯ₄、ｐＨ７．２、５％ＳＤＳで１０分間室温で洗浄され、次に１ｍＭのＥＤＴＡ、４０ｍＭのＮａＨＰＯ₄、ｐＨ７．２，１％ＳＤＳで、６５℃で各１０分間３回洗浄された。放射能写真が、２〜５日間−８０℃でＸ線フィルム（コダック）に露出された。結果として得られたブロットを根のＲＰ−ＰＣＲプローブとハイブリダイゼーションすることにより、根のｍＲＮＡ集団と共有の種子ｃＤＮＡは、「実質的に削除された」。上記コード化オレオシンを含む、種子特定ｃＤＮＡ（推定）を表す残りの種子ｃＤＮＡが、サイクル配列法によって配列決定され、よって、ＡｔＳ２１がオレオシンｃＤＮＡクローンとして同定された。ＡｔＳ２１の配列分析オレオシンｃＤＮＡは長さが８３４ｂｐであり、長さ１８ｂｐのポリＡテール（ｔａｉｌ）を含む（図４、配列番号：２）。上記のオレオシンｃＤＮＡは、シロイヌナズナならびに他種からの他のオレオシン遺伝子に対して極めて相同である。近年、同一のオレオシン遺伝子も報告されている（ザウ（Ｚｏｕ）ら、１９９６年、ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１：４２９〜４３３）。予想されるタンパク質はアミノ酸１９１個の長さであり、高い疎水性を有する中央領域と、中央領域の各側部に位置する親水性を有する領域とを備える。フレームストップコドンに二つのアップストリームが存在すること、および他のオレオシン遺伝子に類似していることは、このｃＤＮＡが完全な長さを有することを示唆する。フレームストップコドンにおいて最初のＡＴＧのちようどアップストリームに二つ存在するので、このｃＤＮＡは完全な長さのｃＤＮＡと考えられる（図４、配列番号：２）。予想されるタンパク質は、そのアミノ酸残基の分配に基づき三つの明確な領域を有する。Ｎ末端およびＣ末端の両領域には帯電した残基が豊富であり、一方、中央領域は完全に疎水性である（図５）。２０個程のロイシン残基が中央領域に位置し、残基７〜１０個ごとに１個のロイシンが存在する反復として構成されている。他の極性を有さないアミノ酸残基も中央領域に束状に存在し、同領域に完全な疎水性をもたらす（図６）。ＡｔＳ２１ｃＤＮＡおよびその予想されるタンパク質配列の両方を用いて異なるデータベースを広範囲に検索することにより、ニンジン、トウモロコシ、綿、菜種、シロイヌナズナおよび他種の植物からオレオシンが同定された。その相同性については、主に中央の疎水性領域に制限される。７つのシロイヌナズナオレオシン配列が発見された。ＡｔＳ２１は、５’非翻訳領域に塩基を何個か多く有するＺ５４１６４と同じ遺伝子を表す。現在利用可能な７つのシロイヌナズナオレオシン配列は、互いに整合している（図７）。この結果は、７つの配列が三つのグループにわかれることを示唆している。最初のグループは、ＡｔＳ２１（配列番号：５）、Ｘ９１９１８（配列番号：６）および部分配列Ｚ２９８５９（配列番号：７）を含む。Ｘ９１９１８は（配列番号：６）はＡｔＳ２１（配列番号：５）と比較して最後の残基が異なっているだけであり、Ｚ２９８５９(配列番号：７)においては３個のアミノ酸残基がＡｔＳ２１（配列番号：５）と異なっているだけなので、３つの配列は全て同じ遺伝子を表している可能性が高い。第２のグループの２つの配列、Ｘ６２３５２（配列番号：８）およびＡｔｏ１３（配列番号：９）は、配列および長さの両方において異なっている。よって、それらが２つの別々の遺伝子を表すことには疑いがない。第１のグループと同様、第３のグループの２つの配列すなわち、Ｘ９１９５６（配列番号：１０）及びＬ４０９５４（配列番号：１１）は、３個の残基が食い違っているだけであり、これは配列エラーのためかもしれない。よって、Ｘ９１９５６（配列番号：１０）およびＬ４０９５４（配列番号：１１）は、同一の遺伝子を表す可能性が高い。ｃＤＮＡ配列から予想された他の全てのオレオシン配列と異なり、Ｘ６２３５２（配列番号：８）はゲノム配列から類推された（バン・ルーイゲン（ＶａｎＲｏｏｉｇｅｎ）ら、１９９２年、ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：１１７７〜１１７９）。結論として、これまでに４つの異なるシロイヌナズナオレオシン遺伝子が確認され、これらの遺伝子は疎水性を有する領域の真中においてのみ維持されている。ノーザン分析天然状態のＡｔＳ２１遺伝子の発現パターンを特徴付けるため、プローブが³² Ｐ−ｄＡＴＰで５ｘ１０⁸ｃｐｍ／μｇという特異的活性にラベリングされたＡｔＳ２１ｃＤＮＡ（ｐＡＮ１インサート）であること以外は、実施例４で説明されたのと同様に、ノーザン分析を行った。その結果は、ＡｔＳ２１遺伝子が生長中の種子においては強く発現し、長角果被膜においては弱く発現することを示している（図８Ａ）。また、未処理のＡｔＳ２１プレ−ｍＲＮＡを表しうる、ずっと大型のトランスクリプトも生長中の種子ＲＮＡにおいて検出された。ＡｔＳ２１は、花、葉、根（図８Ａ）もしくは１日長角果ＲＮＡにおいては検出されなかった。別のノーザン分析により、ＡｔＳ２１は、水分を吸収し発芽中の種子（ｉｍｂｉｂｅｄｇｅｒｍｉｎａｔｉｎｇｓｅｅｄｓ）においても強く発現することが明らかになった（図１３Ａおよび図１３Ｂ）。実施例６オレオシンのゲノムクローンの特徴付けおよびオレオシンプロモーターの単離完全な長さのｃＤＮＡ（ＡｔＳ２１）をプローブとして用いてシロイヌナズナゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、ゲノムクローンが単離された。２つのゲノムクローンが制限酵素消化によってマッピングされ、続いてＳａｃＩによって開裂されたｃＤＮＡの５’半片をプローブとして用いてサザンハイブリダイゼーションが行われた。２ｋｂＳａｃＩ断片をサブクローン化し、配列決定した（図９、配列番号：３５）。ゲノムクローンの二つの領域は、ｃＤＮＡ配列と同一である。３９５ｂｐイントロンが上記二つの領域を分割する。シロイヌナズナゲノムにおけるＡｔＳ２１遺伝子のコピー番号が、完全な長さのｃＤＮＡをプローブとして用いた、ゲノムＤＮＡサザンハイブリダイゼーションおよびこれに続く酵素ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｃＩおよびＸｂａＩによる消化によって決定された（図８Ｂ）。二本のバンドが検出されたＳａｃＩ消化を除く全てのレーンにおいて、一本のバンドが検出された。ｃＤＮＡプローブは内部のＳａｃＩ部位を有するため、これらの結果は、ＡｔＳ２１がシロイヌナズナゲノムにおいて単一のコピー遺伝子であることを示している。シロイヌナズナがオレオシン遺伝子の異なるアイソフォームを含むことは既知であるから、このサザン分析は、シロイヌナズナの異なるオレオシンイソ形態がＤＮＡ配列レベルで分かれていることも示している。ゲノムＤＮＡ断片の２つの領域（３９５ｂｐイントロンによって分割されている）は、ＡｔＳ２１のｃＤＮＡ配列と同一である。ＡｔＳ２１のｃＤＮＡ配列のアップストリームの５’プロモーター配列を用いてデータベース検索を行ったが、顕著な相同を示す配列は全く同定されなかった。また、ＡｔＳ２１プロモーター配列を、既に単離されている別のシロイヌナズナオレオシンプロモーター（ＶａｎＲｏｏｉｊｅｎら、１９９２）と比較しても、類似性はほとんど見出されなかった。ＡｔＳ２１プロモーター配列はＡ／Ｔ塩基に富み、１０ｂｐから１４ｂｐにわたる４４個もの直接反復（ミスマッチは一つしかない）を含む。２つの１４ｂｐ直接反復、およびＡＢＡ反応要素（推定）が図９において下線を施されている。実施例７ＡｔＳ２１プロモーター／ＧＵＳ遺伝子発現カセットの構成およびトランスジェニックシロイヌナズナならびにタバコにおける発現パターンＡｔＳ２１プロモーター／ＧＵＳ遺伝子発現カセットの構成ゲノムＤＮＡ断片のＡＴＧコドンの第１のアップストリームから始まる１２６７ｂｐプロモーター断片が、ＰＣＲを用いて増幅され、その活性を分析するためにＧＵＳリポーター遺伝子に接合された。ＡｔＳ２１ゲノムクローンのプロモーター断片が、第１のＡＴＧコドンの５’非翻訳領域アップストリームに対して補完的な形状のＴ７プライマーＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＣＣ（配列番号：１３）および２１ＰプライマーＧＧＧＧＡＴＣＣＴＡＴＡＣＴＡＡＡＡＣＴＡＴＡＧＡＧＴＡＡＡＧＧ（配列番号：１４）を用いて、ＰＣＲによって増幅された（図９）。ＢａｍＨＩクローニング部位は、２１Ｐプライマーによって導入された。増幅された断片は、ｐブルースクリプトＫＳ（ストラタジーン）のＢａｍＨＩおよびＳａｃＩ部位にクローン化された。個々のクローンは、発生することの有り得るＰＣＲ変異ならびにそれらのインサートの方向性をチェックするために配列決定された。正しいクローンはＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化され、切除されたプロモーター断片（１．３ｋｂ）は、ＧＵＳ遺伝子のアップストリームのｐＢＩ１０１．１の対応する部位（ジェファーソン（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ），Ｒ．Ａ．，１９８７ａ，ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．５：３８７−４０５；ジェファーソンら、１９８７ｂ，ＥＭＢＯＪ．６：３９０１−３９０７）にクローン化された。結果として得られたプラスミドは、ｐＡＮ５（図１０）と表された。ＡｔＳ２１プロモーター／ＧＵＳ構成（ｐＡＮ５）が、タバコ（リーフ・デイスク法（ｌｅａｆｄｉｓｃｍｅｔｈｏｄ）による、ホルシュ（Ｈｏｒｓｃｈ）ら、１９８５年；ボーグ（Ｂｏｇｕｅ）ら、１９９０年、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎ．２２１：４９〜５７）ならびにシロイヌナズナ・コロンビア・エコタイプ（ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＣｏｌｏｍｂｉａｅｃｏｔｙｐｅ）の両方に、ベックトールド（Ｂｅｃｈｔｏｌｄ）らによって説明されているように（１９９３年、Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．パリ、３１６：１１９４〜１１９９参照）真空浸潤（ｖａｃｕｕｍｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を介して導入された。種子は滅菌され、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン、５００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含む媒体上で選別された。ＧＵＳ活性分析：リポーターＧＵＳ遺伝子の発現パターンが、組織化学的染色によって明かにされた（ジェファーソンら，１９８７ａ,ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．５：３８７〜４０５）。異なる組織を、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝剤中に２ｍｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β −Ｄ−グルクロン酸(Ｘ−Ｇｌｕｃ)（リサーチ・オーガニクス（ＲｅｓｅａｒｃｈＯｒｇａｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．）、０．５ｍＭのフェロシアン化カリウム、および０．５ｍＭのフェリシアン化カリウムを含む基質溶液で、ｐＨ７．０、３７℃で一晩染色し、その後、２０％、４０％、および８０％のエタノールで連続して脱水した（ジェファーソンら、１９８７年）。アキシオフォト（Ａｘｉｏｐｈｏｔ）（ツァイス）化合物顕微鏡もしくはオリンパスＳＺＨ１０解剖顕微鏡を用いて写真がとられた。スプリング／スキャン３５ＬＥスライドスキャナー（ポラロイド）を用いてスライドをデジタル画像に変換し、さらにアドベ・フォトショップ（ＡｄｏｂｅＰｈｏｔｏｓｈｏｐ）（商標）３．０．５およびカンバス（Ｃａｎｖａｓ）（商標）３．５を用いてコンパイルされた。ＧＵＳ活性は、２ｍＭの４−ＭＵＧ（４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ− グルクロニド）を基質として用い、蛍光比色法により数量的に計測された(ジェファーソンら、１９８７年)。生長中のシロイヌナズナの種子は、その色に応じて段階分けされ、他の植物組織は採集後、使用時まで−８０℃で保存された。植物組織は、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのβ−メルカプトエタノール、０．１％のトリトンＸ−１００および０．１％のラウリルサルコシンナトリウムを含む抽出緩衝剤中ですり潰された。マイクロフュージで５分間遠心分離することにより、組織のかすを除去した。上澄み液を等分して上記の基質と混合し、３７℃で１時間培養した。各サンプルについて３つの複製を分析した。０．２Ｍの炭酸ナトリウムを４容量を加えることにより、反応を停止させた。ＴＫＯ−１００ＤＮＡ蛍光計（ホーファー・サイエンティフィック・インストルメンツ）（ＨｏｅｆｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、蛍光を読み取った。抽出物のタンパク質濃度は、ブラッドフォード法（Ｂｒａｄｆｏｒｄｍｅｔｈｏｄ）（バイオ・ラド）（ＢｉｏＲａｄ）によって決定された。トランスジェニックシロイヌナズナおよびタバコにおけるＡｔＳ２１プロモーター／ＧＵＳの発現パターンシロイヌナズナにおいて、ＧＵＳ活性は、長角果、茎上葉および枝が花部茎と接続している節領域、および未成熟の種子において検出された（図１１Ａおよび１１Ｂ）。葉、根、花、長角果皮、あるいは花部茎の節領域において、ＧＵＳ活性は全く検出されなかった。生長中の種子におけるＧＵＳ発現を詳しく研究した結果、ＡｔＳ２１プロモーターは、胚が既にハート段階（ｈｅａｒｔｓｔａｇｅ）を超えて生長していた未成熟種子においてのみ活性を有していたことが明かとなった（図１１Ｃおよび図１１Ｇ）。組織化学的な染色によって検出可能なＧＵＳ活性を示す最も早期の胚は、初期トルペド段階（ｔｏｒｐｅｄｏｓｔａｇｅ）のものであった。興味深いことに、染色は、胚軸および胚基を含む胚の下部にのみ限定されていた。幼い子葉において染色は全く検出されなかった（図１１Ｄおよび１１Ｅ）。胚が後期トルペド期のとき、あるいは早期子葉段階になって初めて、子葉は染色され始めた。それより後では、胚全体が染色され、また胚が成熟するにつれ染色は一層強くなった（図１１Ｉおよび図１１Ｊ）。ＧＵＳ遺伝子の発現が胚に限定されていることも観察された。種皮および内胚乳は染色されなかった（図１１Ｃ）。ＧＵＳ活性は、生長中の苗においても検出された。３〜５日の幼い苗は、全体にわたり染色された。胚軸に近い根毛には染色されたものもあったが（図１１Ｋ）、根毛、横方向の根原基および茎頂などの新しく形成された構造の大部分は染色されなかった（図１１Ｌおよび図１１Ｎ）。これより後になると、横方向の根が細長い胚根から伸びた場合、染色は子葉および胚軸に限定される。胚根における染色は消滅した。新しく形成された横方向の根、真葉あるいは真葉上の突起状構造物（ｔｒｉｃｈｏｍｅｓ）において、染色は全く観察されなかった（図１１Ｍおよび図１１Ｎ）。タバコにおけるＡｔＳ２１プロモーター／ＧＵＳ発現パターンは、基本的にシロイヌナズナにおける発現パターンと同様であった。ＧＵＳ活性は、後期の種子および成熟した植物の異なる節間域においてのみ検出された。発芽中の種子において、水を吸収した種子から切り開かれて１時間経つとすぐに胚全体を通じて強度の染色が検出された。シロイヌナズナの種子が有さない成熟した内胚乳も染色されたが、種皮は染色されなかった（図１２Ａ）。トランスジェニックラインの若い苗の一部の根端は、染色されなかった（図１２Ｂ）。それ以外について、生長中のタバコの苗におけるＧＵＳ発現パターンは、シロイヌナズナの苗と同様であった(図１２Ｂ、図１２Ｃおよび図１２Ｄ)。横方向の根および真葉などの新しく形成された構造は、染色されなかった。生長中の苗におけるＡｔＳ２１ｍＲＮＡレベルシロイヌナズナおよびタバコの苗で観察されたＡｔＳ２１プロモーター／ＧＵＳの活発な活性は、オレオシン遺伝子の種子特定発現と一貫しないので、ＧＵＳ活性がかくも活発である生長中の苗にＡｔＳ２１ｍＲＮＡが存在するのかどうか確かめるべく、ノーザン分析が行われた。２４時間から１２日までの異なった段階における実生苗から調製されたＲＮＡが、ＡｔＳ２１ｃＤＮＡをプローブとして用いてノーザンハイブリダイゼーションによって分析された。驚くべきことに、２４〜４８時間水を吸収した種子において、生長中の種子におけるＡｔＳ２１ｍＲＮＡに匹敵する高いレベルのＡｔＳ２１ｍＲＮＡが検出された。このｍＲＮＡレベルは、７４時間で幼い苗が最初に発芽したとき劇的に低下した（図１３Ａおよび図１３Ｂ）。９６時間以上経過した苗では、より長く露出しても何の兆候（ｓｉｇｎａｌ）も検出されなかった。ＲＮＡサンプルの負荷は、実施例２で説明されたようにＥＳＴ分析により分離・確認されたチューブリン遺伝子プローブ（図１３Ｃ）を用いて同じブロットをハイブリダイゼーションすることによりチェックされた。ＡｔＳ２１ｍＲＮＡは種子において非常に豊富なので、集中的にストリッピングを行った後でさえ、残りのＡｔＳ２１プローブがブロットに残った。これらの結果は、水を吸収した種子および非常に幼い苗において検出されたＡｔＳｍＲＮＡが、乾燥種子から持ち越されてきたＡｔＳ２１ｍＲＮＡであることを示している。オレオシンＡｔｏ１２ｍＲＮＡ（ＡｔＳ２１と同一である）は乾燥種子に一番多く含まれることが近年報告されている（キリック（Ｋｉｒｉｋ）他、１９９６年、ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１（２）：４１３〜４１７．）。同様に、実生苗における活発なＧＵＳ活性は、乾燥種子から持ち越されてきたβ− グルクロニダーゼタンパク質と、同じく持ち越されてきたｍＲＮＡから新たに合成されたβ−グルクロニダーゼの両方が原因となっている可能性が非常に高い。実施例８ＡｔＳ２１プロモーターと３５Ｓプロモーターの活性比較トランスジェニックシロイヌナズナの生長中の種子におけるＧＵＳ活性（ＡｔＳ２１プロモーターによって発現されたもの）が、３５Ｓプロモーターによって構成ｐＢＩ２２１において発現されたＧＵＳ活性（ジェファーソン他、ＥＭＢＯＪ．６：３９０１〜３９０７）と比較された。種子は、それらの色に応じて段階分けされた（表２）。最も早期の段階は、球形段階から後期ハート形段階にかけての、種子はまだ白いが長角果から切開する上で充分な大きさを有する時期である。検出されたＡｔＳ２１プロモーター活性は、この段階での３５Ｓプロモーター活性の約三分の一のレベルであった。３５Ｓプロモーターの活性は、胚の生長全体を通して同じ低いレベルに留まった。対照的に、ＡｔＳ２１プロモーターの活性は、胚がトルペド段階を過ぎるにつれ急速に増大し、成熟段階では２５．２５ピコモル４−ＭＵ／分．μｇタンパク質(ｐｍｏｌｅ４−ＭＵ／ｍｉｎ．μｇｐｒｏｔｅｉｎ)という高いレベルに達する(図５〜図８)。ＡｔＳ２１プロモーターのピーク時の活性は、球形段階からハート形段階での最低レベルの活性の２１０倍ほどにもなり、同じ段階の３５Ｓプロモーターの活性の１００倍近くに達する（表２）。ＡｔＳ２１プロモータの活性レベルは、ブラッシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ）において発現された別のシロイヌナズナオレオシンプロモーターのＡｔＳ２１プロモータ活性レベルに類似している（プラント（Ｐｌａｎｔ）ら、１９９４年、Ｐｌａｎｔｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５：１９３〜２０５）。ＡｔＳ２１プロモーターの活性は、葉においてもバックグラウンドレベルで検出された。標準偏差が高いことは（自身の平均よりも高い）、ＧＵＳ活性が幾つかのラインの葉においてのみ検出されたことを示している（表２）。一方、３５Ｓプロモーターの葉における活性は、種子におけるそれよりも２０倍以上高い。ＡｔＳ２１プロモーターと３５Ｓプロモーターの活性を並行に比較したものが、図１４に示されている。タバコの乾燥種子におけるＡｔＳ２１プロモーター活性は、シロイヌナズナの乾燥種子におけるそれの約三分の一であるが、ＧＵＳ活性の絶対量は、シロイヌナズナの葉において３５Ｓプロモーターによって発現されたＧＵＳ活性の絶対量よりもまだ高い（表２）。タバコの葉において、検出し得るほどのＡｔＳ２１プロモーターの活性は観察されなかった（図１４）。ＡｔＳ２１プロモーターを３５Ｓプロモーターと比較した結果、後者は、生長している種子において高レベルで遺伝子を発現する上で良いプロモーターではないことが分かった。胚の生長期間全体を通じ３５Ｓプロモーターの活性は低レベルで一貫しているので、３５Ｓプロモーターは、対象となる遺伝子を低いレベルで一貫して発現するのには有効である。一方、ＡｔＳ２１プロモーターは、ハート形段階の胚から始まり乾燥種子段階まで蓄積する遺伝子を発現するために使用可能な、非常に強力なプロモーターである。３５Ｓプロモーターは、充分ではないにしろ、ハート形段階より前の段階では胚内に遺伝子を発現する上でＡｔＳ２１プロモーターよりも優れている。実施例９ＡｔＳ２１プロモーターの制御下のルリヂサのΔ⁶−デサチュラーゼ遺伝子の発現およびＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの制御下の発現との比較ルリヂサのΔ⁶−デサチュラーゼ遺伝子の発現を駆動するＡｔＳ２１プロモーターを用いて発現構築物を作製するために、ｐＡＮ５由来のＧＵＳコーディング断片を、ＳａｍＩおよびＥｃｏＲＩで消化させることによって除去した。その後、ｐＡＮ１（実施例２）のｃＤＮＡ挿入物を、ＸｈｏＩでの一次消化させること（そして上述のとおり残渣のオーバーハングに充填させること）、そしてその後ＳｍａＩで消化させることによって切除した。生じた断片を、ｐＡＮ５の切除部分を交換するのに使用して、ｐＡＮ３が得られた。実施例７の方法に従ってタバコおよびシロイヌナズナを形質転換させた後、Δ⁶ −デサチュラーゼ活性のレベルを、実施例３で言及される方法を用いて、その反応産物の対応する脂肪酸メチルエステル、γ−リノレン酸（ＧＬＡ）およびオクタデカテトラエノン酸（ＯＴＡ）を分析することによって監視した。トランスジェニック種のＧＬＡおよびＯＴＡレベル（表３）は、それぞれ、Ｃ１８脂肋酸の６．７％（平均＝３．１％）および２．８％（平均＝１．１％）までの範囲であった。これらの植物の葉では、ＧＬＡまたはＯＴＡは、検出されなかった。対照的に、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター／Δ⁶−デサチュラーゼ・トランスジェニック植物は、種子において、Ｃ１８脂肪酸の３.１％まで（平均＝１．３％）の範囲にあるＧＬＡレベルを産生し、そして種子ではＯＴＡは測定不能であった。実施例１０ルリヂサのデルタ６−デサチュラーゼ遺伝子に連結されたオレオシン５’調節領域を比較する発現カセットとのアブラナの形質転換アブラナＣｖウエスターを、プラスミドｐＡＮ３を含むアグロバクテリウム・ツメファシエンスＥＨＡ１０５の株（すなわち、シロイヌナズナ・オレオシンプロモーターの制御下でのルリヂサのΔ⁶−デサチュラーゼ遺伝子、実施例９）で形質転換させた。ウエスターの末端結節間部を、誘導アグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＥＨＡ１０５（Ａｌｔ−Ｍｏｅｒｂｅら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ、２１３巻：１−８頁、１９８８年；Ｊａｍｅｓら、ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓ１２巻：５５９−５６３頁、１９９３年）と２から３日間共培養し、その後再生培地（Ｂｏｕｌｔｅｒら、ＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ７０巻：９１− ９９頁、１９９０年；Ｆｒｙら、ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓ６巻：３２１−３２５頁、１９８７年）に移した。再生若苗を、育成培地（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ、１９１巻：２４４ −２５０頁、１９８３年）に移し、そして葉断片上でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）試験を行って、遺伝子の存在を評価した。ＫＭＨａｙｍｅｓら（１９９６年）ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＲｅｐｏｒｔｅｒ１４（３）巻：２８０−２８４頁のプロトコールに従って、ＤＮＡを葉から単離し、そしてＲＮａｓｅ処理なしに、１００μｌの水に再懸濁させた。５μｌの抽出物を、最終容量５０μｌでＰＣＲ反応に使用した。以下のサイクル：１サイクル：９５℃で５分３０サイクル：９５℃で４５秒；５２℃で４５秒、７２℃で１分１サイクル：７２℃で５分、そして以下のプライマー（図１に示されるとおり、メタルボックス領域付近から由来した、配列番号：１）でパーキン−エルマー９６００サーモサイクラーで反応を行った。ＤＮＡの増幅は、予測の５４９塩基対ＰＣＲ断片を現わした（図１７）。負の若苗を、伸長培地、その後発根培地（ＤｅＢｌｏｃｋら、ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．９１巻：６９４−７０１頁、１９８９年）に移した。十分に発育した根を有する若苗を、温室に移した。植物を十分に発育させたときに、遺伝子コピー数を評価するために、サザン分析のために葉を収集した。Ｂｏｕｃｈｅｚら（１９９６年）ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＲｅｐｏｒｔｅｒ１４巻：１１５−１２３頁の手順に従って、ゲノムＤＮＡを抽出し、制限酵素ＢｇｌＩおよび／またはＣｌａＩで消化させ、アガロースゲル（Ｍａｎｉａｔｉｓら、分子クローニング；実験室マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ／ＮＹ）、１９８２年）上で電気泳動的に分離し、そして製造業者の指示に従ってナイロン膜(ナイトラン膜、ＳｈｌｅｉｃｈｅｒおよびＳｃｈｕｅｌｌ)に移行させる準備をした。その後、ＤＮＡを、２０×ＳＳＣを用いた毛管作用によって一晩かけて膜に移行させた（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２年）。移行に続いて、３０秒間のＵＶ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））によって、膜を架橋させ、そしてハイブリダイゼーション用オーブン（アプリジェン（Ａｐｐｌｉｇｅｎｅ））中のガラス製バイアル中で、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳおよび２．２５％ｗ／ｗ脱水スキムミルクを含む１５ｍｌの溶液中で、６５℃で１時間予備ハイブリッダイズさせた。その膜を、ランダムプライマー法（ファルマシア（Ｐａｒｍａｃｉａ）から得たレディー・ツー・ゴー・キットを用いて）によって、１０⁶ｃｐｍ／μｇの特異的活性に³²Ｐで放射性標識した変性ハイブリダイゼーションプローブを含む同じ溶液中で一晩ハイブリダイゼーションを行った。プローブは、ルリヂサのデルタ６−デサチュラーゼ遺伝子（上で詳述した条件と、プローブを用いて得た）のＰＣＲ断片を表す。ハイブリダイゼーション後、フィルターを、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで１５分間、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで１５分間、６５℃ で洗浄した。その後、膜をサランラップで被覆し、そして光防護カセット中で− ７０℃で強化スクリーンを用いて、コダックＸＡＲフィルムに照射させた。照射時間は、おおむね、３日であった。得られた結果により、その遺伝子の存在が確認される。遺伝子構築物によって、ＢｇｌＩまたはＣｌａＩによって消化されたＤＮＡの各レーンでのバンドの数は、その植物のゲノムＤＮＡに存在するデルタ６−デサチュラーゼ遺伝子の数を表す。ＢｇｌＩおよびＣｌａＩを一緒に消化すると、３４３５ｂｐの断片を生成した。用語「包含する」または「包含している」は、請求項に規定されたとおりの安定した特性、完全体、段階または成分の存在を特定するものとして定義されるが、１つまたはそれ以上の特性、完全体、段階、成分またはそれらの群の存在および追加を妨げるものではない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．配列番号：１２で示されるヌクレオチド配列、１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を有する配列番号：１２で示されるヌクレオチド配列、または配列番号：１２で示されるヌクレオチド配列の隣接断片からなる群から選択された、種子特異的発現を指示するオレオシン５’調節領域をコードする単離核酸。２．異種遺伝子をコードする核酸またはネイティブ植物遺伝子に相補的な配列をコードする核酸の少なくとも１つと機能的に結合された請求項１のオレオシン５ ’調節領域を含む発現カセット。３．異種遺伝子が脂肪酸合成遺伝子または脂質代謝遺伝子の少なくとも１つである、請求項２の発現カセット。４．異種遺伝子を、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子、ケトアシルシンターゼ遺伝子、マロニルトランスアシラーゼ遺伝子、脂質デサチュラーゼ遺伝子、アシルキャリヤータンパク質（ＡＣＰ）遺伝子、チオエステラーゼ遺伝子、アセチルトランスアシラーゼ遺伝子、または伸長遺伝子からなる群から選択される、請求項３の発現カセット。５．脂質デサチュラーゼ遺伝子を、Δ６−デサチュラーゼ遺伝子、Δ１２−デサチュラーゼ遺伝子、およびΔ１５−デサチュラーゼ遺伝子からなる群から選択される、請求項４の発現カセット。６．請求項２〜５のいずれか１項の発現カセットを含む発現ベクター。７．請求項２から５のいずれか１項の発現カセットを含む細胞。８．請求項６の発現ベクターを含む細胞。９．該細胞は細菌細胞または植物細胞である、請求項７の細胞。１０．該細胞は細菌細胞または植物細胞である、請求項８の細胞。１１．請求項２〜５のいずれか１項の発現カセットを含むトランスジェニック植物。１２．請求項６の発現ベクターを含むトランスジェニック植物。１３．請求項９の植物細胞から再生した植物。１４．請求項１０の植物細胞から再生した植物。１５．該植物は、ひまわり、大豆、トウモロコシ、綿、タバコ、ピーナッツ、脂肪種子ナタネまたはシロイヌナズナ植物の少なくとも１つである、請求項１２または１３の植物。１６．請求項１１または１２の植物の後代。１７．請求項１１または１２の植物の種子。１８．（ａ）脂肪酸合成遺伝子または脂質代謝遺伝子をコードする単離核酸の少なくとも１つに機能的に結合された、請求項１の単離核酸を含む発現ベクターで植物細胞を形質転換し、（ｂ）該植物細胞から、該脂肪酸合成または該脂質代謝遺伝子の産物のレベルが増加した植物を再生することを含む、脂肪酸合成遺伝子または脂質代謝遺伝子の産物のレベルが増加した植物を産生する方法。１９．（ａ）Δ６−デサチュラーゼ遺伝子に機能的に結合した請求項１の単離核酸を含む発現ベクターで、植物細胞を形質転換し、（ｂ）該植物細胞からＧＬＡレベルの増加した植物を再生することを含む、 γリノレン酸（ＧＬＡ）含量のレベルが増加した植物を産生する方法。２０．該Δ６−デサチュラーゼ遺伝子は、シアノバクテリアΔ６−デサチュラーゼ遺伝子またはルリヂサΔ６−デサチュラーゼ遺伝子の少なくとも１つである、請求項１９の方法。２１．該植物は、ひまわり、大豆、トウモロコシ、タバコ、綿、ピーナッツ、脂肪種子ナタネまたはシロイヌナズナ植物である、請求項１８〜２０のいずれか１項の方法。２２．該脂肪酸合成遺伝子または該脂質代謝遺伝子は、脂質デサチュラーゼ、アシルキャリヤータンパク質（ＡＣＰ）遺伝子、チオエステラーゼ遺伝子、伸長遺伝子、アセチルトランスアシラーゼ遺伝子、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子、ケトアシルシンターゼ遺伝子、またはマロニルトランスアシラーゼ遺伝子の少なくとも１つである、請求項１８の方法。２３．該植物を、Δ６−デサチュラーゼ遺伝子に機能的に結合した請求項１の単離核酸を含む発現ベクターで形質転換し、ＧＬＡまたはＯＴＡの少なくとも１つのレベルが増加した植物を再生することを含む、ＧＬＡが欠失または欠乏している植物においてγリノレン酸（ＧＬＡ）またはオクタデカテトラエン酸（ＯＴＡ）の少なくとも１つの産生を誘導する方法。２４．（ａ）脂肪酸合成または脂質代謝遺伝子に相補的な核酸配列に機能的に結合した請求項１の単離核酸を含む発現ベクターで植物細胞を形質転換し、（ｂ）該脂肪酸合成または該脂質代謝遺伝子の産生が減少した植物を再生することを含む、植物における脂肪酸合成または脂質代謝遺伝子の産生を減少させる方法。２５．（ａ）植物の生来の脂肪酸合成または脂質代謝遺伝子をコードする核酸配列に機能的に結合した請求項１の単離核酸を含む発現ベクターで植物細胞を形質転換し；および（ｂ）該脂肪酸合成または該脂質代謝遺伝子の産生が減少した植物を再生することを含む、植物における天然脂肪酸合成または脂質代謝遺伝子を共抑制する方法。