BR112014015921A2 - processos para produzir lipídeos - Google Patents

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James Robertson Petrie
Anna El Tahchy
Surinder Pal Singh
Qing Liu
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Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation
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Abstract

processos para produzir lipídeos a presente invenção refere-se a métodos de produzir lipídeos. em particular, a presente invenção refere-se a métodos para aumentar o nível de um ou mais lipídeos não polares e/ou o teor de lipídeo não polar total em uma parte de planta vegetativa ou um organismo transgênico ou parte do mesmo.

Description

·K processos para produzir lipÍdeos campo da invençÃo
[1] A presente invenção refere-se a métodos de produção de lipídeos. Em particular, a presente invenção refere-se a métodos para aumentar o nível de um ou mais lipídeos não polares e/ou o teor de lipídeos não polares totais, em um organismo transgênico ou parte do mesmo. Em uma modalidade particular, a presente invenção se refere a qualquer combinação de uma ou mais monoacilglicerol aciltransferases (MGATS), diacilglicerol aciltransferases (DGATS), glicerol-3-fosfato aciltransferaases (GPATS), proteínas de corpo de óleo e/ou fatores de transcrição regulando biossíntese de lipídeo embora silenciando etapas enzimáticas chaves na biossíntese de amido e vias de dessaturação de ácido graxo para aumentar o nível de um ou mais lipídeos não polares e/ou o teor de lipídeo não polar total e/ou teor de ácido graxo monossaturado em plantas ou qualquer parte dos mesmos incluindo semente de planta e/ou folhas, algas e fungos. Wt,e,ceden,t,e.s_da invençÃO
[2] A rriaioria da energia mundial, particularmente para transporte, é fornecida por combustíveis derivados de petróleo os quais têm uma fonte finita. Fontes alternativas as quais são renováveis são necessárias, tal como de óleos biologicamente produzidos. Biossíntese de triacilglicerol
[3] Triacliglicerois {TAG) constituem a forma principal de lipídeos em sementes e consistem em três cadeias acil esterificadas para uma espinha dorsal de glicerol. Os ácidos graxos são sintetizados no plastídeo como intermediários de" proteína transportadora acil-acil (ACP) quando eles podem sofrer uma primeira dessaturação catalisada. Esta reação é catalisada pela estearoil-ACP desaturase e rende ácido oléico (C18:1l\9).
Subsequentemente, as cadeias acil são transportadas para o citosol e retículo endoplasmático (ER) como acil-Coenzima (COA)
ésteres. Antes de entrarem na principal via de biossíntese de TAG, também conhecida como a via Kennedy ou glicerol-3-fosfato (G3P), as cadeias acil são tipicamente integradas em fosfolipídeos da membrada do ER onde elas podem sofrer mais dessaturação. Duas enzimas chaves na produção de ácidos graxos poli-insaturados são as FAD2 e FAD3 desaturases ligadas a membrana as quais produzem ácido linoleico (C18:2l\9,12) and cl- linolênico (C18:3l\9,12,15) respectivamente.
[4] Biossíntese TAG através da via Kennedy consiste em uma série de acilações subsequentes, cada uma delas utilizando ésteres de acil-CoA redutase como o dador acil. A primeira etapa de acilação ocorre normalmente na posição snl da estrutura G3P e é catalisada pela aciltransferase de glicerol-3-fosfato (snl- GPAT). O produto, ácido snl-lisofosfatídico (sn1-LPA) serve como um substrato para a aciltransferase de ácido lisofosfatídico (LPAAT) que acopla uma segunda cadeia acil na posição sn2 para formar ácido fosfatídico. PA é ainda desfosforilado de diacilglicerol (DAG) por a fosfatase ácida fosfatídico (PAP), proporcionando assim o substrato para a última etapa de acilação. Finalmente, uma terceira cadeia acil é esterificada para a posição sn3 de DAG, em uma reação catalisada pela diacilglicerol aciltransferase (DGAT) para formar TAG que se acumula nos corpos oleosos. Uma segunda reação enzimática, fosfatidil glicerol aciltransferase (PDAT), também resulta na conversão da DAG para TAG. Essa reação não tem relação com DGAT e usa fosfolipídeos como os acil-doadores.
[5] Para maximizar o rendimento para a produção comercial de lipídeos, existe uma necessidade de meios adicionais para aumentar os níveis de lipídeos, em particular lipídeos apolares, como DAG e TAG, em organismos transgênicos ou suas partes, como plantas, sementes, folhas, algas e fungos. As tentativas de aumentar a produção de lipídeos neutros em plantas têm se centrado principalmente em etapas enzimáticas críticas individuais envolvidas na biossíntese de ácidos graxos ou rnontagem de TAG. Essas estratégias, no entanto, resultaram em modesto aumento em teor de óleo de semente ou folha. Recentes trabalhos de engenharia metabólica na levedura oleaginosa Yarrowia lipolytica demonstrou que uma abordagem combinada para aumentar a produção de glicerol-3-fosfato e prevenir quebra de tag via j3-oxidação resultou em aumentos cumulativos no teor de lipídeos totais (Dulermo et al., 2011).
[6] Lipídeos de plantas como triacilglicerois de óleo de semente (TAGs) têm muitos usos, por exemplo, usos culinários (reduções, textura, sabor), usos industriais (em sabonetes, velas, perfumes, cosméticos, adequados como agentes de secagem, isoladores, lubrificantes) e fornecem valor nutricional. Há também um interesse crescente no uso de lipídeos vegetais para a produção de biocombustível.
[7] Para maximizar o rendimento para a produção comercial de lipídeos, existe uma necessidade de meios adicionais para aumentar os níveis de lipídeos, em particular lipídeos apolares, como DAG e TAG, em organismos transgênicos ou suas partes, como plantas, sementes, folhas, algas e fungos.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[8] Os inventores presentes demonstraram um aumento significativo no conteúdo lipídico de organismos, particularinente nas partes vegetativas e sementes de plantas, por manipulação de ambas as vias de biossíntese de ácido graxo e montagem de lipídeo. Várias combinações de genes foram usadas para alcançar aumentos substanciais no teor de óleo, o que é de grande importância para produção de biocombustíveis e outros produtos industriais derivados de óleo.
[9] Em um primeiro aspecto, a invenção fornece um processo para produzir um produto industrial de uma parte de planta vegetativa ou organismo não humano ou parte do mesmo compreendendo altos níveis de lipídeos não polares.
[10] Em uma modalidade, a invenção fornece um processo para produzir um produto industrial, o processo compreendendo as etapas de: i) obter uma parte de planta vegetativa tendo um teor total de lipídeos não polares de pelo menos cerca de 3%, de preferência pelo menos cerca de 5% ou menos cerca de 7% (p/p peso seco), ii) converter pelo menos alguns dos lipídeos in situ na parte de planta vegetativa para o produto industrial por meios térmicos, químicos ou enzimáticos, ou qualquer combinação dos mesmos, e iii) recuperar o produto industrial, desse modo produzindo o produto industrial.
[11] Em outra modalidade, o processo para produzir um produto industrial compreende as etapas de: i) obter uma parte de planta vegetativa tendo um teor total de lipídeos não polares de pelo menos cerca de 3%, de preferência pelo menos cerca de 5% ou pelo menos cerca de 7% (p/p peso seco), ii) processar fisicamente a parte de planta vegetativa da etapa i), iii) converter pelo menos alguns dos lipídeos na parte de planta vegetativa processada para o produto industrial aplicando ineios térmicos, químicos ou enzimáticos, ou qualquer combinação dos mesmos, ao lipídeo na parte de planta vegetativa processada, e iv) recuperar o produto industrial, desse modo produzindo o produto industrial.
[12] Em outra modalidade, o processo para produzir urn produto industrial compreende as etapas de: i) obter um organismo não humano ou uma parte do mesmo que compreende um ou mais polinucleotídeos exógenos, em que cada um dos um ou mais polinucleotídeos exógenos estão ligados operativamente a um promotor que é capaz de dirigir a expressão do polinucleotídeo em um organismo não humano ou uma parte do mesmo, e em que o organismo não humano ou parte do mesmo tem um aumento do nível de um ou mais lipídeos apolares em relação a um organismo não hurnano correspondente ou uma parte do mesrno desprovido de um ou mais polinucleotídeos exógenos, e ii) converter pelo menos alguns dos lipídeos in situ no organismo não humano ou parte do mesmo para o produto industrial por meios térmicos, químicos ou enzimáticos, ou qualquer combinação dos mesmos, e iii) recuperar o produto industrial, produzindo assirn o produto industrial.
[13] Em outra modalidade, o processo para produzir um produto industrial, compreende as etapas de: i) obter um organisrno não humano ou uma parte do mesmo compreendendo um ou mais polinucleotídeos exógenos, em que o organismo não humano ou parte do mesmo tem um aumento do nível de urri ou mais lipídeos apolares em relação a um organismo não hurnano correspondente ou uma parte do mesmo desprovido de urn ou mais polinucleotídeos exógenos, ii) processar fisicamente o organismo não humano ou parte do mesrno da etapa i), iii) converter pelo menos alguns dos lipídeos no organismo não humano transformado ou parte do mesmo para o produto industrial através da aplicação de rneio térmico, químico, ou enzimático, ou qualquer combinação dos mesmos, para o lipídio no organismo não humano ou parte do mesmo transformado, e iv) recuperar o produto industrial, produzindo assim o produto industrial.
[14] Em cada uma das modalidades anteriores, seria compreendido por um especialista na técnica que a etapa de conversão pode ser realizada em simultâneo com ou subsequentemente à etapa de processamento físico.
[15] Em cada uma das modalidades anteriores, o teor de lipídeos apolares total da parte da planta vegetativa, ou organismo não humano ou parte do mesmo, preferencialmente, uma folha da planta ou parte da mesma, caule ou tubérculo, é, pelo menos, cerca de 3°5, mais preferencialmente pelo menos cerca de 5°5, preferencialmente pelo menos cerca de 7%, rnais preferencialmente pelo menos cerca de 10%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 11°o, mais preferencialmente pelo menos cerca de 12%, rnais preferencialmente pelo menos cerca de 13%, mais preferencialrnente pelo menos cerca 14°õ, ou mais preferencialmente pelo menos cerca de 15% (p/p de peso seco). Em outra modalidade preferencial, o conteúdo total de lipídeos apolar é entre 5% e 25%, entre 7% e 25%, entre 10% e 25%, entre 12% e 25%, entre 15% e 25%, entre 7% e 20%, entre 10% e 20%, entre 10% e 15%, entre 15% e 20%, entre 20% e 25%, cerca de 10%, cerca de 11%, cerca de 12%, cerca de 13%, cerca de 14%, cerca de 15%, cerca de 16%, cerca de 17%, cerca de 18%, cerca de 20%, ou cerca de 22%, cada um, como uma percentagem do peso seco. Em uma modalidade particularmente preferencial, a parte da planta vegetativa é uma folha (ou folhas) ou uma porção da mesma. Em uma modalidade mais preferencial, a parte da planta vegetativa é uma porção de folha tendo uma área de superfície de pelo menos 1 cm2.
[16] Além disso, em cada uma das modalidades acima, o teor total de TAG da parte de planta vegetativa, ou organismo não hurnano ou parte do mesmo, preferencialmente, uma folha da planta ou parte da mesma, caule ou tubérculo, é, pelo menos, cerca de 3°5, rnais preferencialmente pelo menos cerca de 5%, preferencialmente pelo menos cerca de 7°5, mais preferencialmente pelo menos cerca de 10%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 11%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 12%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 13%, mais preferencialmente pelo rnenos cerca de 14 %, mais preferencialrnente pelo menos cerca de 15%, ou mais preferencialmente pelo rnenos cerca de 17% {p/p de peso seco). Em outra modalidade preferencial, o conteúdo total de TAG é entre
5% e 30%, entre 7% e 30%, entre 10% e 30%, entre 12% e 30%, entre 15% e 3Ó°5, entre 7% e 30%, entre 10% e 30%, entre 20% e 28%, entre 18% e 25%, entre 22% e 30%, cerca de 10%, cerca de 11%, cerca de 12°s, cerca de 13%, cerca de 14%, cerca de 15 °0, cerca de 16%, cerca de 17%, cerca de 18%, cerca de 20%, ou cerca de 22%, cada um, como uma percentagem do peso seco. Em uma rnodalidade particularmente preferencial, a parte da planta vegetativa é uma folha (ou folhas) ou uma porção da mesma. Em uma modalidade mais preferencial, a parte da planta vegetativa é uma porção de folha tendo uma área de superfície de pelo menos 1 cm2.
Além di"so, em cada uma das modalidades acima, o conteúdo total de lipídeos de parte da planta vegetativa, ou organismo não humano ou parte do mesmo, preferencialmente, uma folha da planta ou parte da mesma, caule ou tubérculo, é, pelo menos, cerca de 3%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 5%, preferencialmente pelo menos cerca de 7°)", mais preferencialmente pelo menos cerca de 10%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 11%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 12%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 13%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 14 %, mais preferencialmente pelo menos cerca de 15%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 17% (p/p de peso seco), mais preferencialínente pelo menos cerca de 20%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 25%. Em outra modalidade preferencial, o conteúdo total de lipídeos se situar entre 5% e 35%, entre 7% e 35%, entre 10% e 35%, entre 12% e 35%, entre 15% e 35%, entre 7% e 35%, entre 10% e 20%, entre 18% e 28%, entre 20% e 28°ó, entre 22% e 28%, cerca de 10%, cerca de 11%, cerca de 12%, cerca de 13%, cerca de 14%, cerca de 15%, cerca de 16%, cerca de 17%, cerca de 18%, cerca de 20%, cerca de 22°õ, ou cerca de 25%, cada um, como uma percentagem do peso seco. Tipicamente, o teor total de lipídeos de parte da planta vegetativa, ou organismo não humano ou uma parte do mesmo é de cerca de 2-3%
mais elevado do que o teor de lipídeos apolares. Em uma modalidade particularmente preferencial, a parte da planta vegetativa é uma folha {ou folhas) ou uma porção da mesma. Ern uma modalidade mais preferencial, a parte da planta vegetativa é uma porção de folha tendo uma área de superfície de pelo menos 1 cm2.
O produto industrial pode ser um produto de hidrocarboneto, como os ésteres de ácidos graxos, preferencialmente ésteres de metil de ácidos graxos e/ou ésteres etílicos de ácidos graxos, um alcano, como o metano, etano ou um alcano de cadeia mais longa, uma mistura de alcanos de cadeia mais longa, um alqueno, biocombustível, monóxido de carbono e/ou de gás hidrogênio, um bioálcool, como etanol, propanol, ou butanol, biocarvão, ou uma combinação de monóxido de carbono, hidrogênio e biocarvão. O produto industrial pode ser uma mistura de qualquer um destes componentes, como uma mistura de alcanos, alquenos ou alcanos e, preferencialmente, uma mistura que é predominantemente (> 50%) alcanos C4-C8, ou predominantemente C6 a ClO alcanos, ou predominantemente C6 a C8 alcanos. O produto industrial não é o dióxido de carbono e não água, embora estas moléculas possam ser produzidas em combinação com o produto industrial. O produto industrial pode ser um gás em pressão atmosférica/temperatura arnbiente, ou, preferencialmente, um líquido, ou um sólido como biocarvão, ou o processo pode produzir uma combinação de um componente de gás, um componente líquido e um componeríte sólido, como o monóxido de carbono, gás hidrogênio, alcanos e biocarvão, que podem subsequentemente ser separados. Em uma modalidade, o produto de hidrocarboneto é predominantemente ésteres metílicos de ácidos graxos. Em uma modalidade alternativa, o produto de hidrocarboneto é um produto diferente dos ésteres metílicos dos ácidos graxos.
[17] O produto industrial pode ser um produto intermediário, por exemplo, um produto que compreende os ácidos graxos, que podem posteriormente ser convertidos, por exemplo,
biocombustível, por exemplo, transesterificação de ésteres de ácidos graxos.
[18] O calor pode ser aplicado no processo, como por pirólise de combustão, gaseificação, ou juntamente com a digestão enzimática (incluindo a digestão anaeróbia, compostagem, a fermentação). Baixa temperatura de gaseificação ocorre, por exemplo, entre cerca de 700°C a cerca de 1OOO°C. Temperatura de gaseificação superior ocorre, por exemplo, entre cerca de 1200°C a cerca de 1600°C. Baixa temperatura de pirólise (pirólise lenta) ocorre, por exemplo, em cerca de 400°C, enquanto a temperatura de pirólise mais elevada ocorre em, por exemplo, cerca de 500°C. Digestão mesofílica ocorre entre, por exemplo, cerca de 20°C e cerca de 40°C. Digestão termofílica ocorre a partir de, por exemplo, cerca de 50°C a cerca de 65°C.
[19] Meios químicos incluem, entre outros, craqueamento catalítico, digestão anaeróbica, fermentação, compostagem e transesterificação. Em uma modalidade, um meio químico usa uin catalisador ou mistura de catalisadores, que podem ser aplicadas em conjunto com o calor. O processo pode utilizar um catalisador homogêneo, um catalisador heterogêneo e/ou um catalisador enzimático. Em uma modalidade, o catalisador é um catalisador de metal de transição, um catalisador do tipo peneira molecular, um catalisador de alumina ativada ou carbonato de sódio. Os catalisadores incluem catalisadores ácidos como ácido sulfúrico, ou catalisadores alcalinos como hidróxido potássio ou sódio ou outros hidróxidos. Os meios químicos podern compreender transesterificação de ácidos graxos no lipídio, processo que pode utilizar um catalisador homogêneo, um catalisador heterogêneo e/ou um catalisador enzimático. A conversão pode compreender pirólise, que se aplica calor e pode ser aplicada de meios químicos, e pode utilizar um catalisador de metal de transição, urn catalisador do tipo peneira molecular, urn catalisador de alumina ativada e/ou carbonato de sódio.
[20] Meios enzimáticos incluem, entre outros, digestão por micro-organismos, por exemplo, a digestão anaeróbica, fermentação ou de compostagem, ou por proteínas enzimáticas recombinantes.
[21] O lipídeo que é convertido para um produto industrial, neste aspecto da invenção, pode haver algum, ou a totalidade, do lipídeo apolar na parte da planta vegetativa ou organismo não humano ou uma parte do mesmo, ou preferencialmente, a conversão é de pelo menos alguns dos lipídeos apolares e, pelo menos, alguns dos lipídeos polares, e mais preferencialmente, essencialmente todo o lipídeo (ambos polares e apolares), na parte da planta vegetativa ou organismo não humano ou uma parte do mesmo é convertido para O(S) produto(s) industrial(is).
[22] Em uma modalidade, a conversão do lipídeo para o produto industrial ocorre in situ, sem interrupção física da parte de planta vegetativa ou organismo não humano ou parte do mesmo. Nesta modalidade, a parte da planta vegetativa ou organismo não humano ou parte do mesmo pode ser primeiramente seca, por exemplo, pela aplicação de calor, ou a parte de planta vegetativa ou organismo não humano ou parte do mesmo pode ser utilizada essencialmente como colhida, sem secagem. Em uma modalidade alternativa, o processo compreende uma etapa de processar fisicamente parte da planta vegetativa, ou o organismo não humano ou parte do mesmo. O processamento físico pode compreender um ou mais de laminação, prensagem, como descamação, trituração ou moagem a parte da planta vegetativa, organismo não humano ou parte do mesmo, que pode ser combinada com a secagem da parte vegetativa, ou o organismo não humano ou parte do mesrno. Por exemplo, a parte da planta vegetativa, ou organismo não humano ou parte do mesmo pode ser primeiramente substancialmente seca e depois moída a um material mais fino, para facilidade de processamento subsequente.
[23] Em uma modalidade, o peso da parte da planta vegetativa, ou o organismo não humano ou uma parte do mesmo utilizado no processo é de pelo menos 1 kg ou, preferencialmente, pelo menos, 1 tonelada (peso seco) de partes vegetativas reunidas, ou o organismos não humanos ou partes dos mesmos. Os processos podem ainda compreender uma primeira etapa de partes de plantas de colheita vegetativa, por exemplo, a partir de, pelo menos, 100 ou 1000 plantas cultivadas em um carnpo, para proporcionar um conjunto de, pelo menos, 1000 ditas partes vegetativas, isto é, que são essencialmente idênticas. Preferencialmente, as partes vegetativas são colhidas no momento em que o rendimento de lipídeos apolares são os mais elevados. Em uma modalidade, as partes vegetativas são colhidas sobre o tempo de floração. Em outra modalidade, as partes vegetativas são colhidas a partir de cerca de, no momento da floração até cerca de início da senescência. Em outra modalidade, as partes vegetativas são colhidas quando as plantas têm, pelo menos, cerca de 1 mês de idade.
[24] O processo pode ou não compreender ainda extrair algum do teor de lipídeos apolares da parte da planta vegetativa, ou o organismo não humano ou parte do mesmo, antes da conversão de uma etapa. Em uma modalidade, o processo compreende ainda os etapas de: (a) extrair pelo menos uma parte do teor de lipídeos apolares da parte de planta vegetativa ou o organismo não humano ou parte do mesmo, como lipídeo apolar, e (b) recuperar o lipídeo apolar extraído, em que os etapas (a) e (b) são realizadas antes da etapa de conversão de, pelo menos, alguns dos lipídeos na parte de planta vegetativa, ou o organismo não humano ou uma parte do rnesmo para o produto industrial. A proporção de lipídeo apolar que é extraída em primeiro lugar pode ser inferior a 50%, ou rnais do que 50%, ou, preferencialmente, pelo menos, 75% de lipídeo apolar total da parte da planta vegetativa, ou organismo não humano ou parte do mesmo. Nesta modalidade, o lipídeo apolar extraído compreende triacilgliceróis, em que os triacilgliceróis compreendem pelo menos 90%, preferencialrnente pelo menos 95% do lipídeo extraído. O lipídeo extraído em si pode ser convertido para um produto industrial que não seja o próprio lipídeo, por exemplo, por transesterificação de ésteres de ácidos graxos
[25] Em um segundo aspecto, a invenção proporciona um processo para a produção de lipídeo extraído a partir de um organismo não humano ou uma parte do mesmo.
[26] Em urna modalidade, a invenção proporciona urn processo para a produção de lipídeos extraídos, o processo compreendendo as etapas de: i) obter um organismo não hurnano ou uma parte do mesmo que compreende um ou mais polinucleotídeos exógenos e um aumento do nível de um ou mais lipídeos apolares em relação a um organisrno não humano correspondente ou uma parte do mesmo, respectivamente, desprovido de um ou mais polinucleotídeos exógenos, ii) extrair lipídeos do organismo não humano ou parte do mesrno, e iii) recuperar o lipídeo extraído, produzindo, assim, o lipídeo extraído, em que cada um dos um ou mais polinucleotídeos exógenos estão operativamente ligados a um promotor que é capaz de dirigir a expressão do polinucleotídeo em um organismo não hurnano ou parte do mesmo, e em que uma ou mais ou todas as seguintes características se aplicam: (a) o um ou mais polinucleotídeos exógenos compreendem um primeiro polinucleotídeo exógeno que codifica um fator de transcrição de RNA ou polipeptídeo que aumenta a expressão de urn ou mais genes da biossíntese do ácido graxo ou glicolítico em um organismo não humano ou uma parte do mesmo, e um segundo polinucleotídeo exógeno que codifica para um RNA ou um polipeptídeo envolvido na biossíntese de um ou rnais lipídeos apolares, (b) se o organismo não humano é uma planta, uma parte da planta vegetativa tem um conteúdo de lipídeos apolares total de pelo menos cerca de 3°0, mais preferencialmente pelo menos cerca de 5%, preferencialmente pelo menos cerca de 7%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 10%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 11%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 12%, rnais preferencialmente pelo menos cerca de 13%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 14%, ou mais preferencialmente pelo menos cerca de 15% (p/p de peso seco), (C) o organismo não humano é uma alga selecionada a partir do grupo que consiste em diatomáceas (bacillariofitas), algas verdes (clorófitas), algas azuis-verdes (cianofíceas), algas castanho-dourado (crisofitas), haptofitas, algas castanhas e algas heterokont, (d) os um ou mais de lipídeos apolares compreendem um ácido graxo que compreende um grupo hidroxil, um grupo epoxi, um grupo ciclopropano, uma ligação dupla carbono-carbono, uma ligação tripla carbono-carbono, ligações duplas conjugadas, uma cadeia ramificada, como uma cadeia ramificada metilada ou hidroxilada, ou uma combinação de dois ou mais destes, ou quaisquer um dos dois, três, quatro, cinco ou seis dos grupos acima referidos, ligações ou cadeias ramificadas, {e) o teor total de ácidos graxos em lipídeos apolares compreende, pelo menos, 2% mais ácido oleico e/ou, pelo menos, 2% menos ácido palmítico do que os lipídeos apolares no correspondente organismo não humano ou parte do mesmo desprovido de um ou mais polinucleotídeos exógenos, (f) os lipídeos apolares compreendem um nível de modificação de esteróis totais, preferencialrnente livres de esteróis (não- esterificados), ésteres de esteroil, glicosídeos de esteroil, em relação aos lipídeos apolares no correspondente organismo não humano ou parte do mesmo desprovido de urn ou mais polinucleotídeos exógenos, (g) os lipídeos apolares compreendem ceras e/ou de ésteres de cera, (h) o organismo não humano ou parte do mesmo é um membro de uma população agrupada ou coleção de, pelo menos, 1000 de tais organismos não humanos ou partes dos mesmos, respectivamente, a partir do qual o lipídeo é extraído.
[27] Em uma modalidade de (b) acima, o teor total de lipídeo apolar é entre 5°5 e 25%, entre 7% e 25%, entre 10% e 25%, entre 12% e 25%, entre 15% e 25%, entre 7% e 20%, entre 10% e 20%, cerca de 10%, cerca de 11%, cerca de 12%, cerca de 13%, cerca de 14%, cerca de 15%, cerca de 16%, cerca de 17%, cerca 18%, cerca de 20%, ou cerca de 22%, cada um, corrio uma percentagem do peso seco.
[28] Em uma modalidade, o organismo não humano é uma alga, ou urn organismo adequado para a fermentação, como um fungo, ou preferencialmente uma planta. A parte do organismo não humano pode ser uma semente, fruto, ou uma parte vegetativa de uma planta. Em uma modalidade preferencial, a parte da planta é uma parte de folha tendo uma área de superfície de pelo menos 1 cm2.
Em outra modalidade preferencial, o organisrno não humano é uina planta, a parte da planta é uma semente e o lipídeo extraído é óleo de semente. Em uma modalidade mais preferencial, a planta é de uma espécie de sementes oleaginosas, que é utilizada comercialmente ou podern ser utilizadas comercialrnente para a produção de óleo. As espécies podem ser selecionadas a partir de uín grupo que consiste em Acrocomia aculeata (palma de macaúba), Arabidopsis thaliana, Aracinis hypogaea (amendoim), Astrocaryum murumuru (murumuru), Astrocaryum vulgare (tucumã), Attalea geraensis (Indaiá-rateiro), Attalea humilis (palma americana), Attalea oleifera (andaiá), Attalea phalerata (uricuri), Attalea speciosa (babaçu), Avena sativa (aveias), Beta vulgaris {beterraba), Brassica sp. como Brassica carinata, Brassica juncea, Brassica napobrassica, Brassica napus (canola), Camelina sativa (falso linho), Cannabis sativa (cânhamo), Carthamus tinctorius (açafrão), Caryocar brasiliense (pequi), Cocos nucifera (COCo), Crambe abyssinica (couve abissinia), Cucumis melo (melão), Elaeis guineensis (palma africana), Glycine max (soja), Gossypium hirsutum (algodão), Helianthus sp. como Helianthus annuus (girassol), Hordeum vulgare (cevada), Jatropha curcas (pinhão manso), joannesia princeps (arvore arara), Lemna sp. (lentilha d'água) como Lemna aequinoctialis, Lemna disperma, Lemna ecuadoriensis, Lemna gibba (lentilha d'água inchada), Lemna japonica, Lemna minor, Lemna minuta, Lemna obscura, Lemna paucicostata, Lemna perpusilla, Lemna tenera, Lemna trisulca,
Lemna turionifera, Lemna valdiviana, Lemna yungensis, Licania rigida (oiticica), Linum usitatissimum (linho), Lupinus angustifolius (tremoço), Mauritia flexuosa (palma de buriti), Maximiliana maripa (palma de inaja), Miscanthus sp. como Miscanthus x giganteus e Miscanthus sinensis, Nicotiana sp. (tabaco) como Nicotiana tabacum ou Nicotiana benthamiana, Oenocarpus bacaba (bacaba-do-azeite), Oenocarpus bataua (patauã), Oenocarpus distichus (bacaba-de-leque), Oryza sp. (arroz) como Oryza sativa e Oryza glaberrima, Panicum virgatum (switchgrass), Paraqueiba paraensis (rriari), Persea amencana (abacate), Pongamia pinnata (Faia indiana), Populus trichocarpa, Ricinus communis (rícino), Saccharum sp. (cana de açúcar), Sesamum indicum (gergelim), Solanum tuberosum (batata), Sorghum sp. como Sorghum bicolor, Sorghum vulgare, Theobroma grandiforum (cupuaçu), Trifolium sp., Trithrinax brasiliensis (palma brasileira), Triticum sp. (trigo) como Triticum aestivum e Zea mays (milho). Em uma modalidade, a planta Brassica napus é da variedade Westar.
Em uma modalidade alternativa, se a planta é Brassica napus, é de uma variedade ou cultivar que não Westar.
Em uma modalidade, a planta é de uma espécie diferente de Arabidopsis thaliana.
Em outra modalidade, a planta é de uma espécie além de Nicotiana tabacum.
Em outra modalidade, a planta é de uma espécie além de Nicotiana benthamiana.
Em uma rnodalidade, a planta é uma planta perene, por exemplo, switchgrass.
Cada uma das características descritas para o segundo aspecto da planta pode ser aplicada mutatis mutandis pa"ra a parte da planta vegetativa do primeiro aspecto.
[29] Em uma modalidade, o organismo não humano é um fungo oleaginoso como uma levedura oleaginosa.
[30] Em uma modalidade preferencial, o lipídeo é extraído sern secagem do organismo não humano ou parte do mesmo, antes da extração. O lipídeo extraído pode, posteriormente, ser seco ou fracionado para reduzir o seu teor de umidade.
[31] Em outras modalidades deste aspecto, a invenção proporciona um processo para a produção de lipídeos extraídos de plantas oleaginosas específicas. Em uma modalidade, a invenção proporciona um processo para a produção de óleo de canola extraído, o processo compreendendo as etapas de: i) obter sementes de canola que compreende, pelo menos, 45% de óleo de semente em uma base em peso, ii) extrair óleo de semente de canola, e iii) recuperar o óleo, em que o óleo recuperado compreende, pelo menos, 90% (p/p) triacilgliceróis (TAG), produzindo, assim, o óleo de canola. Em uma modalidade preferencial, a semente de canola tem um teor de óleo em urna base de peso de pelo menos 46%, pelo menos 47%, pelo menos 48%, pelo menos 49%, pelo menos 50%, pelo menos 51%, pelo menos 52 %, pelo menos 53%, pelo menos 54%, pelo menos 55% ou pelo menos 56%. O teor de óleo é determinável por medição da quantidade de óleo que é extraído a partir da semente, que é a semente descascada como comumente colhida, e calculada como urna percentagem do peso da semente, ou seja, % (p/p). O teor de umidade da semente de canola é entre 5% e 15%, e é preferencialmente cerca de 8,5%. Em uma modalidade, o teor de ácido oleico situa-se entre cerca de 58% e 62% do total de ácidos graxos no óleo de canola, preferencialmente pelo menos 63%, e o teor de ácido palmítico é de cerca de 4% a cerca de 6% dos ácidos graxos totais em óleo de canola. O óleo de canola preferencial tem um valor de iodo de 110-120 e um nível de clorofila inferior a 30 ppm.
[32] Em outra modalidade, a invenção proporciona um processo para a produção de óleo de milho extraído, o processo compreendendo as etapas de: i) obter sementes de milho que compreendem, pelo menos, 5% de óleo de semente em uma base em peso, ii) extrair óleo de semente de milho, e iii) recuperar o óleo, em que o óleo recuperado compreende pelo menos 80°ó, preferencialmente pelo menos 85% ou, pelo menos, 90% (p/p) triacilgliceróis (TAG), produzi-ndo, assim, o óleo de semente de milho. Em uma modalidade preferencial, a semente de rnilho tem um conteúdo de óleo com base no peso das sementes (p/p) de pelo menos 6%, pelo menos 7%, pelo menos 8°5, pelo menos 9°5, pelo menos 10%, pelo menos 11%, pelo menos 12% ou pelo menos 13%. O conteúdo do umidade de semente de milho é de cerca de 13% a cerca de 17%, preferencialmente cerca de 15%. Óleo de milho preferencial compreende cerca de 0,1% de tocoferóis.
[33] Em outra modalidade, a invenção proporciona um processo para a produção de óleo de soja extraído, o processo compreendendo as etapas de: i) obter sementes de soja que compreendem, pelo menos, 20% de óleo de semente em uma base em peso, ii) extrair óleo de semente de soja, e iii) recuperar o óleo, em que o óleo recuperado compreende, pelo menos, 90% (p/p) triacilgliceróis (TAG), produzindo, assim, o óleo de soja. Em uma modalidade preferencial, a semente de soja tem um teor de óleo com base no peso das sementes (p/p) de pelo menos 21%, pelo menos 22%, pelo menos 23%, pelo menos 24%, pelo menos 25%, pelo menos 26%, pelo menos 27%, pelo menos 28%; pelo menos 29%, pelo menos 30%, ou, pelo menos, 31%. Em uma modalidade, o teor de ácido oleico situa-se entre cerca de 20% e cerca de 25% do total de ácidos graxos no óleo de soja, preferencialmente pelo menos 30%, o teor em ácido linoleico se situa entre cerca de 45% e cerca de 57%, preferencialmente menos do que 45%, e o teor de ácido palmítico é de cerca de 10% a cerca de 15% do total dos ácidos graxos no óleo de soja, preferencialmente menos do que 10%. Preferencialmente a semente de soja tem um teor de proteína de cerca de 40% em uma base de peso seco, e o teor de umidade da semente de soja, é de cerca de 10% a cerca de 16%, preferencialmente cerca de 13%.
[34] Em outra modalidade, a invenção proporciona um processo para a produção de óleo de tremoço extraído, o processo compreendendo as etapas de: i) obter sementes de tremoço, compreendendo, pelo menos, 10% óleo de semente em uma base em peso, ii) extrair óleo das sementes de tremoço, e iii) recuperar o óleo, em que o óleo recuperado compreende, pelo menos, 90% (p/p) triacilgliceróis (TAG), produzindo assim o óleo de tremoço. Em uma modalidade preferencial, a semente de tremoço tem um teor de óleo com base no peso das sementes (p/p) de pelo menos 11%, pelo menos 12%, pelo menos 13%, pelo menos 14°ó, pelo menos 15%, ou pelo menos 16%.
[35] Em outra modalidade, a invenção proporciona um processo para a produção de óleo de amendoim extraído, o processo compreendendo as etapas de: i) obter amendoim, compreendendo, pelo menos, 50% óleo de semente em uma base em peso, ii) extrair óleo a partir de amendoins, e iii) recuperar o óleo, em que o óleo recuperado compreende, pelo menos, 90% (p/p) triacilgliceróis (TAG), produzindo, assim, o óleo de amendoim. Em uma modalidade preferencial, a semente de arnendoim (amendoim) têm um teor de óleo com base no peso das sementes (p/p) de pelo menos 51%, pelo menos 52%, pelo menos 53%, pelo menos 54%, pelo rnenos 55% ou,
pelo menos, 56%. Em uma modalidade, o teor de ácido oleico situa-se entre cerca de 38% e 59% do total de ácidos graxos no óleo de amendoim, preferencialmente pelo menos 60%, e o teor de ácido palmítico é de cerca de 9% a cerca de 13% dos ácidos graxos totais no óleo de amendoim, preferencialmente, inferior a 9°0,
[36] Em outra modalidade, a invenção proporciona um processo para a produção de óleo de girassol extraído, o processo compreendendo as etapas de: i) obter sementes de girassol, compreendendo, pelo menos, 50% Óleo de semente em uma base em peso, ii) extrair óleo de semente de girassol, e iii) recuperar o óleo, em que o óleo recuperado compreende, pelo menos, 90% (p/p) triacilgliceróis (TAG), produzindo, assim, o óleo de girassol. Em uma modalidade preferencial, a semente de girassol tern um teor de óleo com base no peso das sementes (p/p) de pelo menos 51%, pelo menos 52%, pelo menos 53%, pelo menos 54%, ou, pelo menos, 55%.
[37] Em outra modalidade, a invenção proporciona um processo para a produção de óleo de semente de algodão extraído, o processo compreendendo as etapas de: i) obter sementes de algodão que compreende, pelo menos, 41% óleo de semente em uma base em peso, ii) extrair óleo de semente de algodão, e iii) recuperar o óleo, em que o óleo recuperado compreende, pelo menos, 90% (p/p) triacilgliceróis (TAG), produzindo, assim, o óleo de semente de algodão. Em uma modalidade pré-fixada, a semente de algodão têm um teor de óleo com base no peso das sementes (p/p) de pelo menos 42%, pelo menos 43%, pelo menos 44%, pelo menos 45%, pelo menos 46%, pelo menos 47%, pelo rnenos 48%, pelo menos 49%, ou, pelo menos, 50%. Em uma modalidade, o teor de ácido oleico situa-se entre cerca de 15% e 22% do total de ácidos graxos no óleo de algodão, preferencialrnente pelo menos 22%, o teor em ácido linoleico se situa entre cerca de 45% e cerca de 57%, preferencialmente menos do que 45 %, e o teor de ácido palmítico é de cerca de 20% a cerca de 26% do total dos ácidos graxos no óleo de semente de algodão, preferencialmente menos do que 18%. Em uma modalidade, o óleo de semente de algodão também contem ácidos graxos como ácidos ciclopropanados esterculico e malvalico, e podem conter pequenas quantidades de gossipol.
i) obter sementes de cártamo, compreendendo, pelo menos, 35% óleo de semente em uma base em peso, ii) extrair óleo de semente de cártamo, e iii) recuperar o óleo, em que o óleo recuperado compreende, pelo menos, 9Ô°5 (p/p) triacilgliceróis (TAG), produzindo, assim, o óleo de cártamo. Em uma modalidade preferencial, a semente de cártamo têm um teor de óleo com base no peso das sementes (p/p) de pelo menos 36%, pelo menos 37%, pelo menos 38%, pelo menos 39%, pelo menos 40%, pelo menos 41%, pelo menos 42%, pelo menos 43%, pelo menos 44%, ou, pelo menos, 45%.
[38] Em outra modalidade, a invenção proporciona urn processo para a produção de óleo de semente de linho extraído, o processo compreendendo as etapas de: i) obter sementes de linho que compreende, pelo menos, 36% óleo de semente em uma base em peso, ii) extrair óleo de semente de linho, e iii) recuperar o óleo, em que o óleo recuperado compreende, pelo menos, 90% (p/p) triacilgliceróis (TAG), produzindo, assim, o óleo de semente de linho. Ern uma modalidade preferencial, a semente de linho tem um teor de óleo com base no peso das sementes (p/p) de pelo menos 37%, pelo menos 38%, pelo menos 39%, ou, pelo menos, 40%.
[39] Em outra modalidade, a invenção proporcior.a um processo para a produção de óleo de camelina extraída, o processo compreendendo as etapas de: i) obter sementes de Camelina sativa que compreende, pelo menos, 36% óleo de semente em uma base de peso, ii) extrair óleo de semente de Camelina sativa, e iii) recuperar o óleo, em que o óleo recuperado compreende, pelo menos, 90% (p/p) triacilgliceróis (TAG), produzindo, assim, o óleo de Camelina. Ern uma modalidade preferencial, a semente de Camelina sativa tem um teor de óleo com base no peso das sementes (p/p) de pelo menos 37%, pelo menos 38%, pelo menos 39%, pelo menos 40%, pelo menos 41%, em menos 42%, pelo rnenos 43%, pelo menos 44%, ou, pelo menos, 45%.
[40] O processo do segundo aspecto também pode compreender rnedir o teor de óleo e/ou proteína da semente por espectroscopia de refletância de infravermelho próximo, como descrito em Hom et al. (2007).
[41] Em uma rnodalidade, o processo do segundo aspecto da invenção compreende a secagem parcial ou completamente a parte da planta vegetativa, ou o organismo não humano, ou parte do mesmo, ou a semente, e/ou um ou mais de larninação, prensagem, como descamação, trituração ou moagem da parte da planta vegetativa, ou o organismo não humano ou parte do rnesmo, ou a semente, ou qualquer combinação destes métodos, no processo de extração. O processo pode utilizar um solvente orgânico (por exemplo, hexano, como n-hexano ou uma combinação de n-hexano corn iso-hexano, ou butano isoladamente ou em combinação com hexano) no processo de extração para extrair o lipídeo ou o óleo, ou para aumentar a eficiência do processo de extração, particularmente em combinação com um processo de secagem antes de reduzir o teor de umidade.
[42] Em uma modalidade, o processo compreende recuperar o lipídeo ou de óleo extraído, recolhendo este em um recipiente, e/ou purificação do lipídeo extraído ou óleo de semente, como, por exemplo, por desgomagem, desodorização, descoloração, secagem e/ou fracionamento de lipídeo extraído ou óleo, e/ou a remoção de pelo menos alguns, preferencialrnente substancíalmente todos, ceras e/ou de ésteres de cera de lipídeo ou de óleo extraído. O processo pode compreender a análise da composição de ácido graxo do lipídeo ou de óleo extraído, como, por exemplo, através da conversão dos ácidos graxos no lipídeo extraído ou óleo de ésteres metílicos de ácidos graxos e analisar estes usando GC para deterrninar a composição de ácidos graxos. A composição de ácidos graxos de lipídeo ou de óleo é determinada antes de qualquer fracionamento do lipídeo ou óleo, que altera a sua composição de ácidos graxos. O lipídeo ou óleo extraído pode compreender uma mistura de tipos de lipídeos e/ou um ou mais derivados de lipídeos, como ácidos graxos livres.
[43] Em uma modalidade, o processo do segundo aspecto da invenção, resulta em quantidades substanciais de lipídeo ou de óleo extraído. Em uma modalidade, o volume do lipídeo ou óleo extraído é, pelo menos, 1 litro, preferencialmente pelo menos 10 litros. Em uma modalidade preferencial, o lipídeo ou o óleo extraído é embalado pronto para transporte e venda.
[44] Em uma modalidade, o lipídeo ou o óleo extraído compreende pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95% ou pelo menos 96% TAG em uma base de peso. O lipídeo ou óleo extraído pode compreender fosfolipídio, como urn componente menor, até cerca de 8%, em peso, preferencialmente menos do que 5% em peso, e rnais preferencialmente menos do que 3% ern peso.
[45] Em uma modalidade, o processo resulta em lipídeo ou óleo extraído em que um ou mais ou todas as seguintes características aplicam-se: (i) triacilgliceróis compreendem pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 95% ou 96%, do lipídeo ou o óleo extraído, (ii) o lipídeo ou o óleo extraído compreende esteróis livres, ésteres esteroil, glicosídeos esteroil, ceras ou ésteres de cera, ou qualquer combinação dos mesmos, e {iii) o teor total de esterol e/ou composição do lipídeo ou o óleo extraído é significativamente diferente para o teor de esterol e/ou a composição do lipídeo extraído ou óleo produzido a partir de um organismo correspondente não humano ou parte do mesmo, ou sementes.
[46] Em uma modalidade, o processo compreende ainda a conversão do lipídeo ou óleo extraído para um produto industrial. Isto é, o lipídeo ou o óleo extraído é convertido após extrair outra forma química que é um produto industrial. Preferencialmente, o produto é um produto industrial de hidrocarbonetos, como ésteres de ácidos graxos, preferencialmente ésteres metil de ácidos graxos e/ou ésteres etílicos de ácidos graxos, um alcano como metano, etano ou um alcano de cadeia mais longa, uma mistura de alcanos de cadeia mais longa, um alqueno, biocombustível, monóxido de carbono e/ou gás hidrogênio, um bioálcool, como etanol, propanol, ou butanol, biocarvão, ou uma combinação de monóxido de carbono, hidrogênio e biocarvão.
[47] No processo do primeiro ou do segundo aspectos da invenção, a parte da planta vegetativa, ou a parte do organismo não humano pode ser uma parte da planta aérea ou uma parte da planta verde, como urna folha da planta ou haste, uma parte lenhosa como um tronco, ramo ou tronco, ou uma raiz ou tubérculo. Freferencialmente, as plantas são cultivadas em um campo e as partes como as sementes colhidas a partir de plantas no campo.
[48] Em uma modalidade, o processo compreende ainda uma etapa de colheita da parte da planta vegetativa, organismo não humano ou parte do mesrno, preferencialmente, com uma ceifeira mecânica.
[49] Preferencialmente, as partes vegetativas são colhidas no momento em que o rendimento de lipídeos apolares são os mais elevados. Em uma modalidade, as partes vegetativas são colhidas sobre o tempo de floração. Em outra modalidade, as partes vegetativas são colhidas a partir de cerca de, no momento da floração até cerca de início da senescência. Em outra modalidade, as partes vegetativas são colhidas quando as plantas são, pelo menos, cerca de 1 mês de idade.
[50] Se o organismo é um organisíno de algas ou de fungos, as células podem ser cultivadas em um recipiente fechado, ou em um sistema de ar livre, corrio um tanque. Os organismos resultantes compreendendo o lipídeo apolar podem ser colhidos, como, por exemplo, por um processo que compreende a filtração, centrifugação, sedimentação, flotação ou floculação dos organismos de algas ou de fungos, como por ajustarnento do pH do meio. A sedimentação é menos preferencial.
[51] No processo do segundo aspecto da invenção, o teor de lipídeos apolares total do organismo não humano ou parte do mesmo, uma parte da planta vegetativa ou semente, é aumentado em relação a uma parte de planta vegetativa correspondente, organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente.
[52] Em uma modalidade, a parte da planta vegetativa, ou organisíno não humano ou parte do mesmo, ou as sementes das primeiro e segundo aspectos da invenção é ainda definida por três características, nomeadamente Característica (i), Característica (ii) e Característica (iii), isoladamente ou em combinação:
[53] Característica (i) quantifica a extensão do aumento do nível de um ou mais lipídeos apolares ou o teor de lipídeos apolares total da parte da planta vegetativa, ou organismo não humano ou parte do mesmo, ou de sementes que pode ser expresso como o grau de aumento em relação ao peso (base de peso seco, ou com base no peso da semente), ou como o aumento relativo em comparação com o nível da parte de planta vegetativa correspondente, ou organismo não humano ou parte do mesrno, ou sementes. Característica (ii) especifica o gênero ou espécie vegetal, ou a fungos ou espécies de algas, ou outro tipo de célula, e Característica (iii) especifica um ou mais lipídeos específicos que são aumentados no teor de lipídeos apolares.
{54] Para Característica (i), em uma modalidade, a extensão do aumento de um ou mais lipídeos apolares é de pelo menos 0,5%, pelo menos 1°5, pelo menos 2°5, pelo menos 3°0, pelo menos 4°5, pelo menos 5%, pelo menos 6%, pelo menos 7%, pelo menos 8%, pelo menos 9°5, pelo menos 1O°ó, pelo menos 11%, pelo menos 12%, pelo menos 13%, pelo menos 14%, pelo menos 15%, pelo menos 16%, pelo menos 17%, pelo menos 18%, pelo menos 19%, pelo menos 20%, pelo menos 21%, pelo menos 22%, pelo menos 23%, pelo menos 24%, pelo menos 25% ou pelo menos 26% maior, em peso ou semente com base no peso seco do que a parte da planta vegetativa correspondente, ou organismo não humano ou parte do mesmo.
[55] Também para a Característica (i), em uma modalidade preferencial, o teor total de lipídeos apolares da parte da planta vegetativa, ou organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente é aumentado quando comparado com a parte da planta vegetativa correspondente, ou organisnio não humano ou parte do mesmo, ou semente. Em uma modalidade, o conteúdo total de lipídeos apolar é aumentado em pelo menos 0,5%, pelo menos 1%, pelo menos 2%, pelo menos 3°:, pelo menos 4°)", pelo menos 5%, pelo menos 6%, em pelo menos 7%, pelo menos 8%, pelo menos 9°5, pelo menos 10%, pelo menos 11%, pelo menos 12%, pelo menos 13%, pelo menos 14°s, pelo menos 15%, pelo menos 16%, em menos 17'%, pelo menos 18%, pelo menos 19%,/pelo menos 20%, pelo menos 21%, pelo menos 22%, pelo menos 23%, pelo menos 24%, pelo menos 25% ou pelo menos 26% maior em um peso ou semente base seca do que a correspondente parte da planta vegetativa, ou organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente.
[56] Além disso, para a Característica (i), em uma modalidade, o nível de um ou mais lipídeos apolares e/ou o teor total de lipídeo apolar é de pelo menos 1%, pelo menos 2%, pelo menos 3%, em pelo menos 4%, pelo menos 5%, pelo menos 6°0, pelo menos 7%, pelo menos 8%, pelo menos 9°5, pelo menos 10%, pelo menos 11%, pelo menos 12%, pelo menos 13%, errí menos 14%, pelo menos 15%, pelo menos 16%, pelo menos 17%, pelo menos 18°s, pelo menos 19%, pelo menos 20%, pelo menos 21%, pelo rnenos 22%, pelo menos 23%, em menos 24%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, em menos 90%, ou pelo menos 100% maior em uma base relativa do que a correspondente parte da planta vegetativa, ou organismo não humano ou parte do mesmo, ou sementes.
[57] Também para a Característica (i), a extensão do aumento do nível de um ou mais lipídeos apolares e/ou o teor total de lipídeo apolar pode ser, pelo menos, 2 vezes, pelo menos, 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 6 vezes, pelo menos 7 vezes, pelo menos 8 vezes, pelo menos 9 vezes maior, pelo menos 10 vezes maior, ou pelo menos 12 vezes, preferencialmente pelo menos cerca 13 vezes, ou, pelo menos, cerca de 15 vezes maior em termos relativos do que a parte vegetativa correspondente, ou organismo não humano ou parte do mesmo, ou sementes.
[58] Como resultado do aumento do nível de um ou mais lipídeos apolares e/ou o teor de lipídeos apolares totais, como definido na Característica (i), o teor de lipídeos apolares total da parte da planta vegetativa, ou organismo não humano ou parte do rnesmo, ou semente é preferencialmente entre 5% e 25%, entre 7°5 e 25%, entre 10% e 25%, entre 12°s e 25%, entre 15% e 25%, entre 7% e 20%, entre 10% e 20%, cerca de 10%, cerca de 11%, cerca de 12%, cerca de 13%, cerca de 14%, cerca de 15%, cerca de 16%, cerca de 17%, cerca de 18%, cerca de 20%, ou cerca de 22%, cada um, como uma percentagem de peso seco ou no peso da semente.
[59] Para Característica (ii), em uma modalidade, o organismo não humano é uma planta, uma alga, ou um organismo adequado para a fermentação, como uma levedura ou outros fungos, preferencialmente, um fungo oleaginoso como uma levedura oleaginosa. A planta pode ser, ou a parte de planta vegetativa pode ser de, por exemplo, uma planta que é Acrocomia aculeata (palma de macaúba), Arabidopsis thaliana, .Aracinis hypogaea
(amendoim) , Astrocaryum murumuru (murumuru) , Astrocaryum vulgare (tucumã) , A'ttalea geraensis (Indaiá-rateiro) , Attalea humilis (Palma de óleo americano) , Attalea oleifera (andaiá) , Attalea phalerata (uricuri) , Attalea speciosa (babaçu) , Avena sativa (aveias) , Beta vulgaris (beterraba) , Brassica sp. como BrasSica carina ta, Brassica juncea, Brassica napobrassica, Brassica napus (canola) , Camelina sativa (linho falso) , Cannabis sativa (cânhamo) , Carthamus tinctorius (cártamo) , Caryocar brasiliense (pequi) , Cocos nucifera (Coconut) , Crambe abyssinica (Abyssinian kale) , Cucumis melo (melão) , Elaeis guineensis (palma africana) , Glycine max (soja) , Gossypium hirsutum (algodão) , Helianthus sp.
como Helianthus annuus (girassol), Hordeum vulgare (cevada) , ja tropha curcas (pinhão manso) , joannesia princeps (nogueira de arara) , Lemna sp . (lentilha) como Lemna aequinoctialis, Lemna disperma, Lemna ecuadoriensis, Lemna gibba (lentilha inchada) , Lemna japonica, Lemna minor, Lemna minuta, Lemna obscura, Lemna paucicostata, Lemna perpusilla, Lemna tenera, Lemna trist'lca, Lemna turionifera, Lemna valdiviana, Lemna yungensis, Licania rigida (oiticica) , Linum usitatissimum (linhaça) , Lupinus angustifolius (tremoço) , Mauritia flexuosa (palma de buriti) , Maximiliana maripa (palma ina j a) , Miscanthus sp. como Miscanthus x giganteus e Miscanthus sinensis, Nicotiana sp. (tabaco) como Nicotiana tabacum ou Nicotiana benthamiana, Oenocarpus ba caba (bacaba-do-azeite) , Oenocarpus bataua (patauã) , Oenocarpus distichus (bacaba-de-leque) , Oryza sp. (arroz) como Oryza sa tiva e Oryza gla'berrima, Panicum vi rga t um (switchgrass) , Paraqueiba paraensis (mari) , Persea amencana (abacate) , Pongamia pinna ta (Faia indiana) , Populus trichocarpa, Ricinus communis (rícino) , Saccharum sp. (cana de açúcar) , Sesamum indicum (gergelim) , Solanum tuberosum (batata) , Sorghum sp. como Sorghum bicolor, Sorghum vulgare, Theobroma grandiforum ( cupuaçu) , Trifolium sp. , Trithrinax brasiliensis (palma brasileira) , Triticum sp. (trigo) como Triticum aestivum e Zea mays {milho) . Em uma modalidade, a planta Brassica napus é de uma variedade Westar. Em uma modalidade alternativa, se a planta é Brassica napus, esta é uma variedade de cultivar além de Westar. Em uma modalidade, a planta é de uma espécie além de Arabidopsis thaliana. Em outra modalidade, a planta é de uma espécie além de Nicotiana tabacum. Em outra modalidade, a planta é de uma espécie além de Nicotiana tabacum. Em uma modalidade, a planta é um perene, por exemplo, switchgrass. Cada uma das características descritas para a planta do segundo aspecto pode ser aplicada mutatis mutandis à parte de planta vegetativa do primeiro aspecto.
[60] Para Característica (iii), TAG, DAG, TAG e dag, MAG, total de ácido graxo poli-insaturado (PUFA), ou um PUFA específico, como ácido eicosadienoico (EDA), ácido araquidônico (ARA), ácido alfa-linolênico (ALA), ácido estearidonico (SDA), ácido eicosatrienoico (ETE), ácido eicosatetraenoico (ETA), ácido eicosapentaenoico (EPA), ácido docosapentaenoico (DPA), ácido docosahexaenoico (DHA), ou um ácido graxo que compreende um grupo hidroxil, um grupo epoxi, um grupo ciclopropano, uma ligação dupla carbono-carbono, uma ligação tripla carbono- carbono, ligações duplas conjugadas, uma cadeia ramificada, como uma cadeia ramificada metilada ou hidroxilada, ou uma combinação de dois ou mais dos rnesmos, ou qualquer de dois, três, quatro, cinco ou seis dos grupos acima referidos, ligações ou cadeias ramificadas, é/São aumentados ou diminuídos. A extensão do aumento de TAG, DAG, TAG e DAG, MAG, PUFA, PUFA específica, ou ácido graxo, é o definido na Característica (i) acima. Em uma modalidade preferencial, o MAG é 2-MAG. Preferencialmente, DAG e/ou TAG, preferencialmente o total de DAG e TAG, ou MAG e TAG, são aumentadas. Em uma modalidade, os níveis de TAG são aumentados sem aumentar o teor de MAG e/ou DAG.
[61] Também para a Característica (iii), em uma modalidade, o conteúdo total de ácidos graxos e/ou teor de TAG do total compreende o conteúdo lipídeo apolar (a) pelo menos 2%, mais, preferencialmente pelo menos 5°5 mais, mais preferencialmente pelo menos 7°5 mais, mais preferencialrriente, pelo menos, 10%
mais, pelo menos, 15% mais, pelo menos, 20% mais, o ácido oleico, pelo menos, 25% mais, ou, pelo menos, 30% mais em relação aos lipídeos apolares na correspondente parte da planta vegeta.tiva, ou organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente desprovida de um ou mais polinucleotídeos exógenos.
Em uma modalidade, o conteúdo total de ácidos graxos nos lipídeos apolares compreende (b), pelo menos, 2% menos, preferencialmente, pelo menos, 4% menos, mais preferencialmente, pelo menos, 7°5 menos, pelo menos 10% menos, pelo menos 15%
menos, ou pelo menos 20% menos, de ácido palmítico em relação aos lipídeos apolares na parte de planta vegetativa correspondente, ou organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente desprovida de um ou mais polinucleotídeos exógenos.
Em uma modalidade, o teor de ácido graxo total do teor de lipídeos apolares totais compreende (C) pelo menos 2% menos, preferencialmente, pelo menos, 4°: menos, mais preferencialmente, pelo menos, 7°5 menos, pelo menos 10% menos, ou em menos 15% de ALA em relação aos lipídeos apolares na parte de planta vegetativa correspondente, ou organismo não humano ou parte do mesmo, ou sementes desprovidas de um ou mais polinucleotídeos exógenos.
Em uma modalidade, o teor de ácido graxo total do teor de íipideos apolares totais compreende (d) pelo menos 2% a mais, preferencialmente pelo menos 5% mais, mais preferencialmente pelo menos 7'°5 mais, mais preferencialmente, pelo menos, 10% mais, ou, pelo menos, 15% mais, LA, em relação aos lipídeos apolares na parte de planta vegetativa correspondente, ou organismo não humano ou parte do mesmo, ou sementes desprovidas de um ou mais polinucleotídeos exógenos.
Mais preferencialmente, o total de ácidos graxos e/ou teor de TAG, do conteúdo total de lipídeos apolares tem um nível de ácido oleico aumentado de acordo com um valor definido em (a) e um teor em ácido palmítico diminuído de acordo com uma figura definida em (b). Em uma rnodalidade, o teor total de esterol é aumentado de pelo menos 10% em relação ao óleo de semente partir de uma semente correspondente. Em uma modalidade, o lipídeo ou o óleo extraído compreende pelo menos 10 ppm de clorofila, preferencialmente pelo menos 30 ppm de clorofila. A clorofila pode posteriormente ser removida por descoloramento do lipídeo ou óleo extraído.
[62] Em modalidades preferenciais, um ou mais lipídeos apolares e/ou o teor total de lipídeo apolar é definido pela combinação das Características (i), (ii) e (iii), ou Características (i) e (ii) ou Características (i) e (iii) ou Características (ii) e (iii).
[63] O processo do segundo aspecto da invenção proporciona, em uma modalidade, que pelo menos uma ou todas as seguintes características aplicam-se: (i) o nível de um ou mais lipídeos apolares na parte de planta vegetativa, ou organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente é, pelo menos, 0,5% superior em relação ao peso do que o nível de uma parte da planta vegetativa correspondente, organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente, respectivamente, desprovida de um ou mais polinucleotídeos exógenos, ou preferencialmente, como adicionalmente definido na Característica (i), (ii) o nível de um ou mais lipídeos apolares na parte da planta vegetativa, organismo não humano ou parte do mesmo, ou seínente é de pelo menos 1% superior em uma base relativa do que em uma parte da planta vegetativa correspondente, organismo não humano ou parte do mesmo, ou de sementes, respectivamente, desprovida de um ou mais polinucleotídeos exógenos, ou preferencialmente, como adicionalmente definido na Característica (i), (iii) o teor de lipídeos apolares total na parte da planta vegetativa, organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente é, pelo menos, 0,5% superior em relação ao peso do que o nível de uma correspondente parte vegetativa, organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente, respectivarnente, desprovida de um ou mais polinucleotídeos exógenos, ou preferencialmente, como adicionalmente definido na Característica (i), (iv) o teor de lipídeos apolares total na parte da planta vegetativa, organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente é de pelo menos 1°5 maior em uma base relativa do que em uma parte da planta vegetativa correspondente, organismo não humano ou parte do mesmo, ou de sementes, respectivamente, desprovido de um ou mais polinucleotídeos exógenos, ou preferencialmente, como adicionalmente definido na Característica (i), (v) o nível de um ou mais lipídeos apolares e/ou o teor total de lipídeos apolares da parte da planta vegetativa, organismo não humano ou parte do mesmo, ou de sementes, é, pelo menos, 0,5% superior em base de peso e/ou pelo menos 1% maior em uma base relativa de uma parte de planta vegetativa correspondente, organismo não humano ou uma parte do mesmo, ou de sementes, respectivamente, desprovidos de um ou mais polinucleotídeos exógenos e que compreende um polinucleotídeo exógeno que codifica um DGATI Arabidopsis thaliana ou, preferencialmente, conforme disposto na Característica (i), (vi) o teor de TAG, DAG, TAG e DAG, ou MAG no lipídeos na parte da planta vegetativa, organismo não humano ou parte do mesmo, ou sementes, e/ou no lipídeo extraído destes, é de pelo menos 10% maior em termos relativos do que o teor de TAG, DAG, TAG e DAG, ou MAG no lipídeo em uma parte correspondente da planta vegetativa, organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente, desprovidos de um ou mais polinucleotídeos exógenos, ou um lipídeo extraído correspondente dos mesmos, respectivamente,
ou, preferencialmente, como adicionalmente definido na Característica (i), e (vii) o teor total de ácidos graxos poli-insaturados (PUFA) ern lipídeo na parte da planta vegetativa, organismo não hurnano ou parte do mesmo, ou de sementes e/ou o lipídeo extraído destes, é aumentado (por exemplo, na presença de um MGAT) ou diminuído (por exemplo, na ausência de um MGAT) em relação ao teor total de PUFA no lipídeo em uma parte da planta vegetativa correspondente, organismo não humano ou parte do mesrno, ou semente desprovidos de um ou mais polinucleotídeos exógenos, ou um lipídeo extraído correspondente destes, respectivamente, ou preferencialmente, conforme disposto na (i) ou Característica (iii).
[64] Em uma modalidade, o nível de um PUFA na parte da planta vegetativa, organismo não humano ou parte do mesmo, ou sementes e/ou o lipídeo extraído destes, é aumentado em relação ao nível do PUFA de uma parte da planta vegetativa correspondente, organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente, ou um lipídeo extraído do mesmo, respectivamente, em que o ácido graxo poli-insaturado é o ácido eicosadienoico, ácido araquidônico (ARA), o ácido alfa-linolênico (ALA), o ácido estearidônico (SDA), ácido eicosatrienoico (ETE), ácido eicosatetraenoico (ETA), ácido eicosapentaenoico (EPA), ácido docosapentaenoico (DPA), ácido docosahexaenoico (DHA), ou uma combinação de dois ou mais dos mesmos. Preferencialmente, a extensão do aumento é como definido na Característica (i).
[65] Em uma modalidade do segundo aspecto, a parte da planta vegetativa correspondente, ou organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente é uma parte não transgênica da planta vegetativa, ou organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente, respectivamente. Em uma modalidade preferencial, a correspondente parte da planta vegetativa, ou organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente é do mesmo cultivar, cepa ou variedade, mas desprovido de um ou mais polinucleotídeos exógenos. Em outra modalidade preferencial, a correspondente parte da planta vegetativa, ou organismo não hurnano ou parte do mesmo, ou de sementes está no mesmo estágio de desenvolvimento, por exemplo, a floração, como a parte da planta vegetativa, ou organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente. Em outra modalidade, as partes vegetati-vas são colhidas a partir de cerca de, no niomento da floração até cerca de início da senescência.
Em outra modalidade, a semente é colhida quando as plantas têm,
pelo menos, cerca de 1 ríiês de idade.
[66] Em uma modalidade, uma parte do organismo não humano é a semente e o conteúdo total de óleo, ou o teor total em ácidos graxos, da semente é, pelo menos, 0,5% a 25%, ou, pelo menos, 1,0% a 24%, maior em uma base de peso do que uma semente correspondente desprovido de um ou mais polinucleotídeos exógenos.
[67] Ern uma modalidade, o conteúdo relativo de DAG de óleo de semente é pelo menos 10%, pelo menos 10,5%, pelo menos 11%, pelo menos 11,5%, pelo menos 12%, pelo menos 12,5%, pelo menos 13%, pelo menos 13,5 %, pelo menos 14%, pelo menos 14,5%, pelo menos 15%, pelo menos 15,5%, pelo menos 16%, pelo menos 16,5%, pelo menos 17%, pelo menos 17,5%, pelo menos 18%, pelo menos 18,5 %, pelo menos 19%, pelo menos 19,5%, pelo menos 20% maior em uma base relativa do que de óleo de uma semente correspondente. Em uma modalidade, o teor de DAG da semente é aumentado por uma quantidade, como definido na Característica (i) e a semente é de um gênero e/ou espécie, como definido na Característica (ii).
[68] Em uma modalidade, o teor de TAG relativo da semente é, pelo menos, 5%, pelo menos 5,5%, pelo menos 6%, pelo menos 6,5%, pelo menos 7°5, pelo menos 7,5°s, pelo menos 8°5, pelo rnenos 8,'í%, pelo rnenos 9%, pelo menos 9,5%, pelo menos 10%, ou pelo menos 11% rnaior em termos absolutos em relação à uma semente correspondente. Em uma modalidade, o teor de TAG da semente é aumentado por uma quantidade, como definido na Característica (i) e a semente é de um gênero e/ou espécie, como definido na Característica {ii).
[69] Em outra modalidade, a parte do organismo não humano é uma parte da planta vegetativa e o teor de TAG, DAG, TAG e DAG, ou MAG da parte da planta vegetativa é pelo menos 10%, pelo menos 11%, pelo menos 12%, pelo menos 13%, pelo menos 14%, pelo menos 15%, pelo menos 16%, pelo menos 17%, pelo menos 18%, pelo menos 19%, pelo menos 20%, pelo menos 21%, pelo menos 22°s, pelo menos 23%, pelo menos 24%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, ou pelo menos 100% maior em uma base relativa do que teor de TAG, DAG, TAG e DAG, ou MAG de uma parte da planta vegetativa correspondente desprovido de um ou mais polinucleotídeos exógenos. Em uma modalidade preferencial, o MAG é 2-MAG. Em uma modalidade, o teor de TAG, DAG, TAG e DAG, ou MAG da parte da planta vegetativa é determinado a partir da quantidade destes componentes lipídicos no lipídeo extraível da parte de planta vegetativa. Em outra modalidade, o teor de TAG, DAG, TAG e DAG, ou MAG da parte da planta vegetativa transgênica é aumentado em uma quantidade, conforme definido na Característica (i).
[70] Em uma modalidade, pelo menos, 20% (% mol), pelo menos, 22% (% mol), pelo menos, 30% (% mol), pelo menos, 40% (% mol), pelo menos, 50°õ (% mol) ou em menos, 60°ó (°; mol), preferencialmente, pelo menos, 65% (°5 mol), mais preferencialmente, pelo menos, 66% (% mol), pelo menos, 67% (% mol), pelo menos, 68% (% mol), de pelo menos 69% (% mol) ou, pelo menos, 70% (% mol) do teor de ácidos graxos do teor total de lipídeos apolares da parte da planta vegetativa, organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente, ou do lipídeo ou óleo extraído destes, preferencialrnente da fração TAG, é o ácido oleico. Esses elevados teores de ácido oleico são preferenciais para utilização em aplicações de biodiesel.
[71] Em outra modalidade, o teor de PUFA da parte da planta vegetativa, ou organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente é aumentado (por exemplo, na presença de um MGAT) ou diminuído (por exemplo, na ausência de um MGAT) quando comparado para a correspondente parte da planta vegetativa, ou organismo não humano ou parte do mesmo, ou sementes. Neste contexto, o teor de PUFA inclui tanto PUFA esterificados (incluindo TAG, DAG, etc) e PUFA não esterificados. Em uma modalidade, o teor de PUFA da parte da planta vegetativa, ou organismo não humano ou parte do mesmo, ou as sementes são preferencialmente determinados a partir da quantidade de PUFA no lipídeo extraível da parte de planta vegetativa, ou organismo não humano ou parte do mesmo ou semente. A extensão do aumento de teor de PUFA pode ser como definida na Característica (i). O teor de PUFA pode compreender EDA, ARA, ALA, SDA, ETE, ETA, EPA, DPA, DHA, ou uma combinação de dois de mais destes.
[72] Em outra modalidade, o nível de um PUFA na parte da planta vegetativa, organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente, ou o lipídeo ou o óleo extraído destes é aumentado ou diminuído, quando comparado com a parte da planta vegetativa correspondente, organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente, ou lipídeo ou óleo extraído dos mesmos. O PUFA pode ser EDA, ARA, ALA, SDA, ETE, ETA, EPA, DPA, DHA, ou uma combinação de dois de mais destes. A extensão do aumento de PUFA pode ser como definida na Característica (i).
[73] Em outra modalidade, o nível de um ácido graxo no lipídeo ou óleo extraído é aumentado quando comparada com o lipídeo extraído a partir da parte de planta vegetativa correspondente, ou organismo não humano ou parte do mesmo, ou de seínentes e em que o ácido graxo compreende um grupo hidroxil, um grupo epóxi, um grupo ciclopropano, uma dupla ligação carbono- carbono, uma ligação tripla carbono-carbono, ligações duplas conjugadas, uma cadeia ramificada como uma cadeia ramificada metilada ou hidroxilada, ou uma combinação de dois ou mais dos mesmos, ou qualquer de dois, três, quatro, cinco ou seis dos grupos acima mencionados, ligações ou cadeias ramificadas. A extensão do aumento de ácido graxo pode ser como definida na Característica (i).
[74] Em uma modalidade, o nível de urn ou mais lipídeos apolares (como TAG, DAG, TAG e DAG, MAG, PUFA, ou um PUFA específico, ou um ácido graxo específico) e/ou o teor total de lipídeo apolar é determinável por meio de análise por cromatografia gasosa de ésteres metílicos de ácidos graxos obtidos a partir do lipídeo extraído. Métodos alternativos para a determinação de qualquer um destes conteúdos são conhecidos na técnica, e incluem métodos que não requerem extrair lipídeos a partir do organismo ou parte do mesmo, por exemplo, por análise de infravermelho próximo (NIR) ou por ressonância magnética nuclear (NMR).
[75] Em outra modalidade, o nível de um ou mais lipídeos apolares e/ou o teor de lipídeos apolares total da parte da planta vegetativa, ou organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente é, pelo menos, 0,5°õ superior em uma base de peso seco, ou no peso da semente e/ou pelo menos 1°5 maior em termos relativos, preferencialmente, pelo menos, 1°5 ou 2"0 maior em uma base de peso seco ou no peso da semente, de uma parte da planta vegetativa correspondente, ou organismo não humano ou uma parte do mesmo, ou semente desprovidos de um ou mais polinucleotídeos exógenos, mas cornpreendendo um polinucleotídeo exógeno que codifica um DGATI de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 83).
[76] Ainda em outra modalidade, a parte da planta vegetativa ou o organismo não humano ou parte do mesmo, ou sementes que compreende ainda (i) uma ou mais mutações introduzidas, e/ou (ii) um polinucleotídeo exógeno que regula negativamente a produção e/ou a atividade de uma enzima endógena da parte de planta vegetativa ou o organismo não humano ou parte do mesmo, a enzima endógena sendo selecionada a partir de um aciltransferase ácido graxo como DGAT, snl glicerol-3-fosfato aciltransferase (sn-l GPAT), 1-acil-glicerol-3-fosfato aciltransferase (LPAAT), acil-CoA: lisofosfatidilcolina aciltransferase (LPCAT), fosfatase de ácido fosfatídico (PAP), um enzima envolvida na biossíntese de amido, como (PzDP)-glicose pirofosforilase (AGPase), uma dessaturase de ácido graxo, como uma dessaturase de ácido graxo LJ12 (FAD2), um polipeptídeo envolvido na degradação de lipídeos e/ou que reduz o teor de lipídeos, como uma lipase, como polipeptídeo CGi58 ou triacilglicerol lipase dependente de açúcar, ou urn combinação de dois ou mais destes. Em uma modalidade alternativa, a parte da planta vegetativa ou o organismo não humano ou parte do mesmo não compreendem (i) acima, ou não compreendem {ii) acirna, ou não compreendem (i) acima e não compreendem (ii) acima. Em uma modalidade, o polinucleotídeo exógeno que regula negativamente a produção de AGPase não é o polinucleotídeo descrito em Sanjaya et al. (2011). Em uma modalidade, os polinucleotídeos exógenos na parte da planta vegetativa ou organismo não humano ou parte do rnesmo, ou semente não consistem de um polinucleotídeo exógeno que codifica uni WRII e um polinucleotídeo exógeno que codifica para uma molécula de RNA que inibe a expressão de um gene que codifica uma AGPase.
[77] No processo do primeiro ou segundo aspectos, a parte da planta vegetativa, ou organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente, ou o lipídeo ou o óleo extraído, é ainda definido nas modalidades preferenciais. Portanto, em uma modalidade uma ou mais ou todas as seguintes características se aplicam: (i) ácido oleico compreende, pelo menos, 20% (% mol), pelo menos, 22% (°5 mol), pelo menos, 30% {°5 mol), pelo menos, 40% (°5 mol), pelo menos, 50% (°0 mol), ou, pelo menos, 60% (°5 mol), preferencialmente, pelo menos, 65°: (°0 mol) ou, pelo menos, 66% (% mol) do teor total de ácidos graxos no lipídeo apolar ou óleo na parte de planta vegetativa, organismo não humano ou parte do mesmo, ou sernentes, (ii) ácido oleico compreende, pelo menos, 20% (% mol), pelo menos, 22°ó (°5 mol), pelo rnenos, 30% (°5 mol), pelo menos, 40°õ (°5 mol ), pelo menos, 50% (°5 mol), ou, pelo menos, 60°õ (°5 mol), preferencialmente, pelo menos, 65% (°5 mol) ou, pelo menos, 66% (% mol) do teor total de ácidos graxos no lipídeo ou óleo extraído, (iii) o lipídeo apolar ou Óleo na parte da planta vegetativa, organismo não humano ou parte do rnesmo, ou semente compreende um ácido graxo que compreende urrí grupo hidroxil, um grupo epoxi, um grupo ciclopropano, uma ligação dupla carbono-
carbono, uma ligação tripla carbono-carbono, ligações duplas conjugadas, uma cadeia ramificada, como uma cadeia ramificada metilada ou hidroxilada, ou uma combinação de dois ou rnais dos mesmos, ou qualquer de dois, três, quatro, cinco ou seis dos grupos acima rnencionados, ligações ou cadeias ramificadas, e (iv) o lipídeo ou o óleo extraído compreende um ácido graxo que compreende um grupo hidroxil, um grupo epoxi, um grupo ciclopropano, uma ligação dupla carbono-carbono, uma ligação tripla carbono-carbono, ligações duplas conjugadas, uma cadeia ramificada, como uma cadeia ramificada metilada ou hidroxilada, ou uma combinação de dois ou mais dos mesmos, ou qualquer de dois, três, quatro, cinco ou seis dos grupos acima mencionados, ligações ou cadeias ramificadas. A composição em ácidos graxos nesta modalidade é medida antes de qualquer modificação da composição de ácidos graxos, como, por exemplo, por fracionamento do lipídeo ou óleo extraído para alterar a composição de ácidos graxos. Em modalidades preferenciais, a extensão do aumento é como definido na Característica (i).
[78] Em uma modalidade, o nível de um lipídeo na parte da planta vegetativa, organismo não humano ou parte do mesmo, ou de sementes e/ou no lipídeo ou o óleo extraído é determinável por meio de análise por cromatografia gasosa de ésteres metílicos de ácidos graxos preparados a partir do lipídeo ou óleo extraído. O método de análise é, preferencialmente, como descrito no Exemplo 1 neste documento.
[79] Novamente no que diz respeito ao primeiro ou segundo aspectos, a invenção proporciona um ou mais polinucleotídeos exógenos na parte de planta vegetativa, ou organismo não humano ou parte do mesmo, ou sementes utilizadas no processo. Portanto, em uma modalidade, a parte da planta vegetativa, ou o organisrno não humano ou parte do mesmo, ou a semente compreende um primeiro polinucleotídeo exógeno que codifica para um RNA ou, preferencialmente um fator de transcrição de polipeptídeo que aumenta a expressão de urn ou mais genes da biossíntese do ácido graxo ou glicolítico em uma parte da planta vegetativa, ou um organismo não humano ou uma parte do mesmo, ou de urna semente, respectivamente, e um segundo polinucleotídeo exógeno que codifica para um RNA ou um polipeptídeo envolvidos na biossíntese de um ou mais lipídeos apolares, em que os primeiro e segundo polinucleotídeos exógenos são cada operativamente ligado a um promotor que é capaz de dirigir a expressão do polinucleotídeo em uma parte da planta vegetativa, ou um organismo não humano ou uma parte do mesmo, ou de uma semente, respectivamente. Isto é, os primeiro e segundo polinucleotídeos exógenos codificam diferentes fatores que juntos proporcionam o aumento do teor de lipídeos apolares na parte de planta vegetativa, ou o organismo não humano ou parte do mesmo, ou a semente.
[80] O aumento é, preferencialmente aditivo, mais preferencialmente sinérgica, em relação à presença do primeiro ou segundo polinucleotídeo exógeno sozinho. Os fatores codificados pelo primeiro e segundo polinucleotídeos operam por diferentes mecanismos. Preferencialmente, o fator de transcrição de polipeptídeo aumenta a disponibilidade de substratos para a síntese de lipídeos apolares, como, por exemplo, aumentando a glicerol-3-fos£ato e/ou ácidos graxos, preferencialmente na forma de acil-CoA, através do aumento da expressão de genes, por exemplo, pelo menos 5 ou, pelo menos, 8 genes envolvidos na biossíntese de ácidos graxos ou glicólise (como, entre outros, um ou mais dos ACCase, transportadores de sacarose (SuSy, invertases de parede celular), sintase de cetoacil (KAS), fosfofrutoquinase (PFK), piruvato quinase (PK) (por exemplo, (At5g52920, At3g22960), piruvato desidrogenase, transportadores de hexoses (por exemplo, GPT2 e PPTl), frutoquinase citossólica, citosólica fosfoglicerato mutase, enoil-ACP redutase {At2g05990), e fosfoglicerato mutase (At1g22170)), preferencialmente mais do que um gene para cada categoria. Em uma modalidade, o primeiro polinucleotídeo exógeno codifica um
-fator de transcrição Wrinkled 1 (WRII), urn fator de transcrição de cotilédone f.rondosa 1 (Lecl), um fator de transcrição de cotilédone frondosa 2 (LEC2), um fator de transcrição Fus3, um fator de transcrição ABI3, um fator de transcrição Dof4, um fator de transcrição BABY BOOM (BBM), ou um fator de transcrição Dofll. Ern uma modalidade, o LEC2 não é uma LEC2 de Arabidopsis.
Como parte desta modalidade, ou em separado, o segundo polinucleotídeo exógeno pode codificar um polipeptídeo tendo uma atividade de aciltransferase de ácido graxo, por exemplo, atividade de monoacilglicerol aciltransferase (MGAT) e/ou atividade de diacilglicerol aciltransferase (DGAT), ou atividade de glicerol-3-fosfato aciltransferase (GPAT). Em uma modalidade, o DGAT não é DGAT de Arabidopsis.
[81] Em uma modalidade preferencial, a parte da planta vegetativa, ou organismo não humano ou uma parte do mesmo, ou a semente, dos primeiro e segundo aspectos da invenção compreendem dois ou mais polinucleotídeos exógenos, um dos quais codifica um fator de transcrição de polipeptídeo que aumenta a expressão de um ou mais genes da biossíntese de ácido graxos ou glicolíticas na parte da planta vegetativa, ou organismo não humano ou uma parte do mesmo, ou sementes, como um fator de transcrição Wrinkled 1 (WRII), e um segundo dos quais codificam um polipeptídeo envolvido na biossíntese de um ou mais lipídeos apolares, como uma DGAT.
[82] Em uma modalidade, a parte da planta vegetativa, organismo não humano ou uma parte do mesmo, ou a semente dos primeiro ou segundo aspectos da invenção podem ainda compreender uin terceiro, ou mais, polinucleotídeos exógenos. O terceiro, ou mais polinucleotídeos exógenos podem codificar uma ou mais, ou qualquer combinação de: i) um outro RNA ou fator de transcrição de polipeptídeo que aumenta a expressão de um ou mais genes da biossíntese de ácido graxos ou glicolítico em um organismo não humano ou uma parte do mesmo (por exemplo, se o primeiro polinucleotídeo exógeno codifica um fator de transcrição wrinkled 1 (WRII), o terceiro polinucleotídeo exógeno pode codificar um fator de transcrição de LEC2 ou BBM (preferencialmente, expressão de LEC2 ou BBM controlada por um promotor induzível ou um promotor que não resulta em níveis de expressão do transgene elevado), ii) um outro RNA ou polipeptídeo envolvido na biossíntese de um ou mais lipídeos apolares (por exemplo, se o segundo polinucleotídeo exógeno codifica um DGAT, o terceiro polinucleotídeo exógeno pode codificar um MGAT ou GPAT, ou dois outros polinucleotídeos exógenos podem estar presentes que codificam um MGAT e um GPAT), iii) um polipeptídeo que estabiliza os urn ou mais lipídeos apolares, preferencialmente, uma oleosina, como um polioleosin ou uma caleosin, mais preferencialrnente uma polioleosina, iv) uma molécula de RNA que inibe a expressão de um gene que codifica um polipeptídeo envolvido na biossíntese de amido, como um polipeptídeo AGPase, v) uma molécula de RNA que inibe a expressão de um gene que codifica um polipeptídeo envolvido na degradação de lipídeos e/ou que reduz o teor de lipídeos, como uma lipase, corno CGi58 polipeptídeo ou triacilglicerol lipase dependente de açúcar 1, ou vi) um polipeptídeo supressor de silenciamento, em que o terceiro, ou mais polinucleotídeos exógenos está ligado operativamente a um promotor que é capaz de dirigir a expressão dos polinucleotídeos em uma parte da planta vegetativa, ou um organismo não humano ou uma parte do mesmo, ou uma semente, respectivamente.
[83] Um determinado número de combinações específicas de genes é mostrado aqui para ser eficaz para aumentar o teor de lipídeos apolares. Por conseguinte, em relação ao processo do primeiro ou segundo aspectos da invenção, em uma modalidade, a parte da planta vegetativa, ou o organismo não humano ou parte do mesmo, ou a semente compreende um ou mais polinucleotídeos exógenos que codificam: i) um fator de transcrição wrinkled 1 (WRII) e um DGAT, ii) um fator de transcrição WRII e um DGAT e uma oleosina, iii) um fator de transcrição WRII, um DGAT, um MGAT e uma oleosina, iv) uma monoacilglicerol aciltransferase (MGAT), v) um diacilglicerol aciltransferase 2 (DGAT2), vi) um MGAT e um aciltransferase de glicerol-3-fosfato (GPAT), vii) um MGAT e um DGAT, viii) um MGAT, um GPAT e um DGAT, ix) um fator de transcrição WRII e uma MGAT, x) um fator de transcrição WRII, um DGAT e um MGAT, xi) um fator de transcrição WRII, um DGAT, um MGAT, uma oleosina e GPAT, xii) um DGAT e uma oleosina, ou xiii) um MGAT e uma oleosina, e xiv) opcionalmente, um polipeptídeo supressor de silenciamento,
em que cada um dos um ou mais polinucleotídeos exógenos estão ligados operativamente a um promotor que é capaz de dirigir a expressão do polinucleotídeo em uma parte da planta vegetativa, ou um organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente, respectivamente.
Preferencialmente, o um ou mais polinucleotídeos exógenos são integrados de forma estável no genoma da parte da planta vegetativa, ou o organismo não humano ou parte do mesmo, ou a semente, e mais preferencialmente estão presentes em um estado homozigótico.
O polinucleotídeo pode codificar uma enzima que possui uma sequência de aminoácidos que é a mesma que uma sequência de uína enzima naturalmente ocorrendo, por exemplo, de origem vegetal, de levedura ou animais.
Além disso, o polinucleotídeo pode codificar uma enzima tendo uma ou mais mutações conservadas, quando comparadas com a enzima ocorrendo naturalmente.
[84] Em uma modalidade, (i) GPAT tambéin possui atividade de fosfatase para produzir MAG, como um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácidos de GPAT4 ou GPAT6 Arabidopsis, e/ou (ii) O DGAT é um DGATI ou um DGAT2, e/ou (iii) o MGAT é um MGATI ou um MGAT2.
[85] Em uma modalidade preferencial, a parte da planta vegetativa, o organismo não humano ou parte do mesmo, ou a semente compreende um primeiro polinucleotídeo exógeno que codifica um WRII e um segundo polinucleotídeo exógeno que codifica um DGAT, preferencialmente um DGATI.
[86] Em outra modalidade preferencial, a parte da planta vegetativa, o organismo não humano ou parte do mesmo, ou a semente compreende um primeiro polinucleotídeo exógeno que codifica um WRII e um segundo polinucleotídeo exógeno que codifica um DGAT, preferencialmente um DGATI e um terceiro polinucleotídeo exógeno que codifica uma oleosina.
[87] Em outra modalidade, a parte da planta vegetativa, o organismo não humano ou parte do mesmo, ou a semente compreende um primeiro polinucleotídeo exógeno que codifica um WRII, um segundo polinucleotídeo exógeno que codifica urn DGAT, preferencialmente um DGATI, um terceiro polinucleotídeo exógeno que codifica uma oleosina, e um quarto polinucleotídeo exógeno que codifica um MGAT, preferencialmente um MGAT2.
[88] Em outra modalidade, a parte da planta vegetativa, o organismo não humano ou parte do mesmo, ou a semente compreende urri primeiro polinucleotídeo exógeno que codifica um WRII, um segundo polinucleotídeo exógeno que codifica um DGAT, preferencialmente um DGATI, um terceiro polinucleotídeo exógeno que codifica uma oleosina, e um quarto polinucleotídeo exógeno que codifica LEC2 ou BBM.
[89] Em outra modalidade, a parte da planta vegetativa, o organismo não humano ou parte do mesmo, ou a semente compreende um primeiro polinucleotídeo exógeno que codifica um WRII, um segundo polinucleotídeo exógeno que codifica um DGAT, preferencialmente um DGATI, um terceiro polinucleotídeo exógeno que codifica uma oleosina, quarto polinucleotídeo exógeno que codifica um MGAT, preferencialmente um MGAT2, e um quinto polinucleotídeo exógeno que codifica LEC2 ou BBM.
[90] Em outra modalidade, a parte da planta vegetativa, o organismo não humano ou parte do mesmo, ou a sernente compreende um primeiro polinucleotídeo exógeno que codifica um WRII, um segundo polinucleotídeo exógeno que codifica um DGAT, preferencialmente um DGATI, um terceiro polinucleotídeo exógeno que codifica uma oleosina, e um quarto polinucleotídeo exógeno que codifica para uma molécula de RNA que inibe a expressão de urri gene que codifica para uma lipase como polipeptídeo CGi58.
[91] Em outra modalidade, a parte da planta vegetativa, o organismo não humano ou parte do mesmo, ou a semente compreende um primeiro polinucleotídeo exógeno que codifica um WRII, um segundo polinucleotídeo exógeno que codifica um DGAT, preferencialmente um DGATI, um terceiro polinucleotídeo exógeno que codifica uma oleosina, quarto polinucleotídeo exógeno que codifica para uma molécula de RNA que inibe a expressão de um gene que codifica para uma lipase, corno um polipeptídeo CGi58, e um quinto polinucleotídeo exógeno que codifica LEC2 ou BBM.
[92] Em outra modalidade, a parte da planta vegetativa, o organismo não humano ou parte do mesmo, ou a semente compreende um primeiro polinucleotídeo exógeno que codifica um WRII, um segundo polinucleotídeo exógeno que codifica um DGAT, preferencialmente um DGATI, um terceiro polinucleotídeo exógeno que codifica uma oleosina, quarto polinucleotídeo exógeno que codifica para uma molécula de RNA que inibe a expressão de um gene que codifica para uma lipase como um polipeptídeo CGi58, e um quinto polinucleotídeo exógeno que codifica um MGAT, preferencialmente um MGAT2.
[93] Em outra modalidade, a parte da planta vegetativa, o organismo não humano ou parte do mesmo, ou a semente compreende um primeiro polinucleotídeo exógeno que codifica um WRII, um segundo polinucleotídeo exógeno que codifica um DGAT, preferencialmente um DGAT 1, um terceiro polinucleotídeo exógeno que codifica uma oleosina, um quarto polinucleotídeo exógeno que codifica para uma molécula de RNA que inibe a expressão de um gene que codifica para uma lipase, como um polipeptídeo CGi58, um quinto polinucleotídeo exógeno que codifica um MGAT, preferencialmente um MGAT2, e um sexto polinucleotídeo exógeno que codifica LEC2 ou BBM.
[94] Em uma modalidade, a semente compreende um primeiro polinucleotídeo exógeno que codifica um WRII, um segundo polinucleotídeo exógeno que codifica um DGAT, preferencialmente um DGATI, um terceiro polinucleotídeo exógeno que codifica uma oleosina, e um quarto polinucleotídeo exógeno que codifica um MGAT, preferencialmente um MGAT2. Preferencialmente, a seníente compreende ainda um quinto polinucleotídeo exógeno que codifica um GPAT.
[95] Onde relevante, em vez de um polinucleotídeo que codifica uma molécula de RNA que inibe a expressão de um gene que codifica para uma lipase, como um polipeptídeo CGi58, a parte de planta vegetativa, o organismo não hurnano ou parte do mesmo, ou a semente tem uma ou mais mutações introduzidas no gene da lipase, como um gene CGi58 que confere níveis reduzidos do polipeptídeo de lipase, quando comparado com uma parte de planta vegetativa correspondente, organismo não humanos ou parte do mesmo, ou as sementes desprovidas de mutação.
[96] Em uma modalidade preferencial, os polinucleotídeos exógenos que codificam para o DGAT e oleosina estão operacionalmente ligados a um promotor constitutivo, ou um promotor ativo em tecidos verdes de uma planta, pelo menos, antes e até floração, o qual é capaz de dirigir a expressão dos polinucleotídeos na parte da planta vegetativa, o organismo não humano ou parte do mesmo, ou a semente. Em outra modalidade preferencial, o polinucleotídeo exógena codificando WRII, e a molécula de RNA que inibe a expressão de um gene que codifica para uma lipase, corno um polipeptídeo CGi58, está operativamente ligado a um promotor constitutivo, um promotor ativo em tecidos verdes de uma planta, pelo menos, antes e até floração, ou um promotor induzível, que é capaz de dirigir a expressão dos polinucleotídeos na parte da planta vegetativa, o organismo não humano ou parte do mesmo, ou a semente. Ainda em outra modalidade preferencial, os polinucleotídeos exógenos que codificam LEC2, BBM e/ou MGAT2 estão operativamente ligados a um promotor induzível, que é capaz de dirigir a expressão dos polinucleotídeos na parte de planta vegetativa, o organismo não humano ou parte do mesmo, ou a semente.
[97] Em cada uma das modalidades anteriores, os polinucleotídeos podem ser fornecidos como moléculas separadas ou podem ser fornecidos como uma única molécula contígua, como em uma molécula de T-DNA única. Em uma modalidade, a orientação de transcrição de pelo menos um gene na molécula de T-DNA é oposta à orientação da transcrição de pelo menos outro gene da molécula de T-DNA.
[98] Em cada uma das modalidades anteriores, o teor de lipídeos apolares total da parte da planta vegetativa, ou organismo não humano ou parte do mesmo, ou a semente, preferencialmente uma folha da planta ou parte da mesma, caule ou tubérculo, é, pelo menos, cerca de 3 %, mais preferencialmente pelo menos cerca de 5%, preferencialmente pelo menos cerca de 7%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 10%, rnais preferencialmente pelo menos cerca de 11%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 12%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 13°s, mais preferencialmente pelo menos cerca de 14%, ou mais preferencialmente pelo menos cerca de 15% (p/p de peso seco). Ern outra modalidade preferencial, o conteúdo total de lipídeos apolares é entre 5% e 25%, entre 7% e 25%, entre 10% e 25%, entre 12% e 25%, entre 15% e 25%, entre 7% e 20%, entre 10% e
20%, entre 10% e 15%, entre 15% e 20%, entre 20% e 25%, cerca de 10%, cerca de 11%, cerca de 12%, cerca de 13%, cerca de 14%, cerca de 15%, cerca de 16%, cerca de 17%, cerca de 18°ó, cerca de 20%, ou cerca de 22%, cada um como uma percentagem de peso seco ou peso da semente. Em uma modalidade particularmente preferencial, a parte da planta vegetativa é uma folha (ou folhas) ou uma porção da mesma. Em uma modalidade mais preferencial, a parte da planta vegetativa é uma porção de folha tendo uma área de superfície de pelo menos 1 cm2.
[99] Além disso, em cada uma das modalidades acima, o teor total de TAG da parte de planta vegetativa, ou organismo não humano ou parte do mesmo, ou a semente, preferencialmente uma folha da planta ou parte da mesma, caule ou tubérculo, é, pelo menos, cerca de 3%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 5°5, preferencialmente pelo menos cerca de 7%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 10%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 11%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 12%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 13%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 14%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 15%, ou mais preferencialmente pelo menos cerca de 17% (p/p de peso seco). Em outra modalidade preferencial, o conteúdo total de TAG é entre 5% e 30%, entre 7% e 30%, entre 10% e 30%, entre 12% e 30%, entre 15% e 30%, entre 7% e 30%, entre 10% e 30%, entre 20% e 28%, entre 18% e 25%, entre 22% e 30%, cerca de 10%, cerca de 11%, cerca de 12%, cerca de 13%, cerca de 14%, cerca de 15%, cerca de 16%, cerca de 17%, cerca de 18%, cerca de 20%, ou cerca de 22%, cada um como uma percentagem de peso seco ou peso da semente. Em uma modalidade particularmente preferencial, a parte da planta vegetativa é uma folha (ou folhas) ou uma porção da mesma. Em uma modalidade mais preferencial, a parte da planta vegetativa á uma porção de folha tendo uma área de superfície de pelo menos 1 cm2.
[1OO]Alérn disso, em cada uma das modalidades acima, o conteúdo total de lipídeos de parte da planta vegetativa, ou organismo não humano ou parte do mesmo, ou a semente, preferencialmente uma folha da planta ou parte da mesma, caule ou tubérculo, é, pelo menos, cerca de 3%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 5%, preferencialmente pelo menos cerca de 7%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 10%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 11%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 12%, rnais preferencialmente pelo menos cerca de 13%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 1%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 15%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 17% (p/p peso seco), mais preferencialmente pelo menos cerca de 20%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 25%. Em outra modalidade preferencial, o conteúdo total de lipídeos está entre 5°0 e 35°õ, entre 7°5 e 35°s, entre 10% e 35°s, entre 12% e 35°ó, entre 15% e 35%, entre 7% e 35%, entre 10% e 20%, entre 18% e 28%, entre 20% e 28%, entre 22% e 28%, cerca de 10%, cerca de 11%, cerca de 12%, cerca de 13%, cerca de 14%, cerca de 15%, cerca de 16°s, cerca de 17°s, cerca de 18%, cerca de 20%, cerca de 22%, ou cerca de 25%, cada urrí como uma percentagern do peso seco. Tipicamente, o teor total de lipídeos de parte da planta vegetativa, ou organismo não humano ou uma parte do mesmo é de cerca de 2-3% mais elevado do que o teor de lipídeos apolares.
Em uma modalidade particularmente preferencial, a parte da planta vegetativa é uma folha (ou folhas) ou uma porção da mesma. Em uma modalidade mais preferencial, a parte da planta vegetativa é uma porção de folha tendo uma área de superfície de pelo menos 1 cm2.
[1O1]Em urna modalidade, a parte da planta vegetativa, o organismo não humano ou parte do mesmo, ou a semente, preferencialmente, a parte da planta vegetativa, compreende urn primeiro polinucleotídeo exógeno que codifica um WRII, um segundo polinucleotídeo exógeno que codifica um DGAT,
preferencialmente um DGATI, um terceiro polinucleotídeo exógeno que codifica um MGAT, preferencialrnente um MGAT2, e um quarto polinucleotídeo exógeno que codifica uma oleosina, em que a parte da planta vegetativa, organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente tem uma ou mais ou todas as seguintes características: i) um teor total em lipídeos de pelo menos 8%, pelo menos 10%, pelo menos 12%, pelo menos 14%, ou pelo menos 15,5% (% de peso), ii) pelo menos 3 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos, 7 vezes, pelo menos 8 vezes, ou pelo menos 10 vezes, em teor total de lipídeos maior na parte de planta vegetativa ou organismo não humano em relação a uma correspondente parte da planta vegetativa ou organismo não humano desprovidos de polinucleotídeos exógenos, iii) um teor total de TAG de, pelo menos, 5%, pelo menos 6%, pelo menos 6,5%, ou pelo menos 7% (°0 em peso de peso seco ou no peso da semente), iv) pelo menos 40 vezes, pelo menos, 50 vezes, pelo menos, 60 vezes, ou, pelo menos, 70 vezes, ou, pelo menos, 100 vezes, maior teor total de TAG em relação a uma parte de planta vegetativa correspondente ou organismo não humano desprovidos de polinucleotídeos exógenos, v) ácido oleico compreende pelo menos 15%, pelo menos 19% ou pelo menos 22% (em peso%) dos ácidos graxos em TAG, vi) pelo menos 10 vezes, pelo menos, 15 vezes, ou, pelo menos, 17 vezes maior nível de ácido oleico ern TAG em relação a uma parte de planta vegetativa correspondente ou organismo não humano desprovidos de polinucleotídeos exógenos, vii) ácido palmítico compreende pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30% ou pelo menos 33% (em peso%) dos ácidos graxos em TAG, viii) pelo menos 1,5 vezes mais elevada de um nível de ácido palmítico em TAG em relação a uma parte de planta vegetativa correspondente ou organismo não humano desprovido dos polinucleotídeos exógenos, ix) ácido linoleico compreende pelo menos 22%, pelo menos 25%, pelo menos 30% ou pelo menos 34% (% de peso) dos ácidos graxos em TAG, x) ácido a-linolênico compreende menos do que 20%, menos do que 15%, menos do que 11% ou menos de 8% (%em peso) dos ácidos graxos em TAG, e xi) pelo menos um de 5 vezes, ou pelo menos 8 vezes, menor nível de ácido a-linolênico na TAG em relação a uma parte de planta vegetativa correspondente ou organismo não humano desprovido dos polinucleotídeos exógenos. Nesta modalidade, preferencialmente, a parte da planta vegetativa, pelo menos, tem as características, i), ii) iii), iv), i) e ii), i) e iii), i) e iv), i) a iii ), i), iii) e iv), i) a iv), ii) e iii), ii) e iv), ii) a iv), ou iii) e iv). Em uma modalidade, % de peso seco é % em peso seco da folha. {102]Em outra modalidade, a parte da planta vegetativa, o organismo não humano ou parte do mesmo, ou a semente, preferencialmente, a parte da planta vegetativa, compreende um primeiro polinucleotídeo exógeno que codifica um WRII, um segundo polinucleotídeo exógeno que codifica um DGAT, preferencialmente um DGATI, um terceiro polinucleotídeo exógeno que codifica uma oleosina, em que a parte da planta vegetativa, organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente tem uma ou mais ou todas as seguintes características: i) um teor total de TAG de, pelo menos, 10%, pelo menos
12.5%, pelo menos 15°ó, ou pelo menos 17% (% em peso de peso seco ou no peso da semente), ii) pelo menos 40 vezes, pelo menos 50 vezes, pelo menos, 60 vezes, pelo menos 70 vezes, ou pelo menos 100 vezes, em teor total de TAG maior na parte de planta vegetativa ou organismo não humano em relação a uma correspondente parte da planta vegetativa ou organismo não humano desprovidos de polinucleotídeos exógenos, iii) ácido oleico compreende pelo menos 19% ou pelo menos 22% ou pelo menos 25% (em peso%) dos ácidos graxos em TAG, iv) pelo menos, 10 vezes, pelo menos, 15 vezes, pelo menos, 17 vezes, ou, pelo menos, 19 vezes, nível mais elevado de ácido oleico em TAG na parte de planta vegetativa ou organismo não humano em relação a uma planta vegetativa correspondente parte ou organismo não humano desprovido dos polinucleotídeos exógenos, v) ácido palmítico compreende pelo menos 20%, pelo menos 25%, ou, pelo menos, 28% (% em peso) dos ácidos graxos ern TAG, vi) pelo menos 1,25 vezes superior do nível de ácido palmítico na TAG na parte de planta vegetativa ou organismo não humano em relação a uma parte de planta vegetativa correspondente ou organismo não hurnano desprovido dos polinucleotídeos exógenos, vii) ácido linoleico compreende pelo menos 15%, ou, pelo menos, 20%, (% em peso) dos ácidos graxos errí TAG, viii) ácido a-linolênico compreende menos do que 15%, menos do que 11% ou menos de 8% (% em peso) dos ácidos graxos em TAG, e ix) pelo menos um de 5 vezes, ou pelo menos 8 vezes, menor nível de ácido a-linolênico em TAG na parte de planta vegetativa ou organismo não humano em relação a uma parte de planta vegetativa correspondente ou organismo não humano desprovido dos polinucleotídeos exógenos. Nesta modalidade, preferencialmente, a parte da planta vegetativa, pelo menos, tem as características, i), ii), ou i) e ii). Em uma modalidade, °5 de peso seco é % em peso seco da folha.
[103]Preferencialmente, as características definidas para as duas modalidades acima são como na fase de floração da planta.
[104]Em uma modalidade alternativa, a parte da planta vegetativa, o organismo não humano ou parte do mesmo, ou quando a semente consiste em um ou mais polinucleotídeos exógenos que codificam urn DGATI e um LEC2.
[105]Em uma modalidade preferencial, o polinucleotídeo exógeno que codifica WRII compreende uma ou mais das seguintes características: i) nucleotídeos, cuja sequência é apresentada como qualquer uma de SEQ ID NOS: 231 a 278, ii) nucleotídeos que codificam um polipeptídeo que compreende os aminoácidos cuja sequência é apresentada como qualquer uma de SEQ ID NOs: 279 a 337, ou um fragmento biologicamente ativo da mesma, iii) nucleotídeos cuja sequência de é pelo menos 30% idêntica à i) ou ii), e iv) nucleotídeos que hibridam com qualquer um de i) a iii) sob condições rigorosas.
[106]Em uma modalidade preferencial, o polinucleotídeo exógeno que codifica DGAT compreende uma ou mais das seguintes características: i) nucleotídeos, cuja sequência é apresentada como qualquer uma de SEQ ID NOS: 204 a 211, 338 a 346, ii) nucleotídeos que codificam um polipeptídeo que compreende os aminoácidos cuja sequência é apresentada como qualquer uma de SEQ ID NOS: 83, 212 a 219, 347 a 355, ou um fragmento biologicamente ativo das mesmas, iii) nucleotídeos cuja sequência de é pelo menos 30% idêntica à i) ou ii), e iv) urri polinucleotídeo que hibridiza com qualquer uma das i) a iii) sob condições rigorosas.
[107]Em outra modalidade preferencial, o polinucleotídeo exógeno que codifica MGAT compreende um ou mais dos seguintes: i) nucleotídeos, cuja sequência é apresentada como qualquer uma de SEQ ID NOS: 1 a 44, ii) nucleotídeos que codificam urn polipeptídeo que compreende os aminoácidos cuja sequência é apresentada como qualquer uma de SEQ ID NOS: 45 a 82, ou um fragmento biologicamente ativo da mesma, iii) nucleotídeos cuja sequência de é pelo menos 30% idêntica à i) ou ii), e iv) um polinucleotídeo que hibridiza com qualquer urna das i) a iii) sob condições rigorosas.
[108]Ein outra modalidade preferencial, o polinucleotídeo exógeno que codifica a GPAT compreende um ou mais dos seguintes: i) nucleotídeos, cuja sequência é apresentada como qualquer uma de SEQ ID NOs: 84 a 143, ii) nucleotídeos que codificam um polipeptídeo que compreende os aminoácidos cuja sequência é apresentada como qualquer uma de SEQ ID NOs: 144 a 203, ou um fragmento biologicamente ativo da mesma, iii) nucleotídeos cuja sequência de é pelo rnenos 30% idêntica à i) ou ii), e iv) um polinucleotídeo que hibridiza com qualquer uma das i) a iii) sob condições rigorosas.
[109]Em outra modalidade preferencial, o polinucleotídeo exógeno que codifica DGAT2 compreende uma ou mais das seguintes características: i) nucleotídeos, cuja sequência é apresentada como qualquer uma de SEQ ID NOS: 204 a 211, ii) nucleotídeos que codificarn um polipeptídeo que compreende os aminoácidos cuja sequência é apresentada como qualquer uma de SEQ ID NOS: 212 a 219, ou um fragmento biologicamente ativo da mesma, iii) nucleotídeos cuja sequência de é pelo menos 30% idêntica à i) ou ii), e iv) um polinucleotídeo que hibridiza com qualquer uma das i) a iii) sob condições rigorosas.
[11O]Em outra modalidade preferencial, o polinucleotídeo exógeno que codifica uma oleosina compreende uma ou mais das seguintes características:
i) nucleotídeos, cuja sequência é apresentada como qualquer uma de SEQ ID NOS: 389 a 408, ii) nucleotídeos que codificam um polipeptídeo que compreende os aminoácidos cuja sequência é apresentada como qualquer uma de SEQ ID NOS: 362 a 388, ou um fragmento biologicamente ativo da mesma, iii) nucleotídeos cuja sequência de é pelo menos 30% idêntica à i) ou ii), e iv) uma sequência de nucleotídeos que hibridiza com qualquer uma das i) a iii) sob condições rigorosas.
[111]Em uma modalidade, o polipeptídeo CGi58 compreende um ou mais dos seguintes: i) nucleotídeos, cuja sequência é apresentada como qualquer uma de SEQ ID NOs: 422 a 428, ii) nucleotídeos que codificam um polipeptídeo que compreende os aminoácidos cuja sequência é apresentada como qualquer uma de SEQ ID NOS: 429 a 436, ou um fragmento biologicamente ativo da mesma, iii) nucleotídeos cuja sequência de é pelo menos 30% idêntica à i) ou ii), e iv) uma sequência de nucleotídeos que hibridiza com qualquer uma das i) a iii) sob condições rigorosas.
[112]Em outra modalidade, o polinucleotídeo exógeno que codifica LEC2 compreende uma ou mais das seguintes características: i) nucleotídeos, cuja sequência é apresentada como qualquer uma de SEQ ID NOS: 437 a 439, ii) nucleotídeos que codificam um polipeptídeo que compreende os aminoácidos cuja sequência é apresentada como qualquer uma de SEQ ID NOS: 442 a 444, ou urri fragrnento biologicamente ativo da mesma, iii) nucleotídeos cuja sequência de é pelo rnenos 30°s idêntica à i) ou ii), e iv) uma sequência de nucleotídeos que hibridiza com qualquer uma das i) a iii) sob condições rigorosas.
[113]Em outra modalidade, o polinucleotídeo exógeno que codifica BBM compreende um ou mais dos seguintes procedimentos: i) nucleotídeos, cuja sequência é apresentada corno qualquer uma de SEQ ID NOS: 440 ou 441, ii) nucleotídeos que codificam um polipeptídeo que compreende os aminoácidos cuja sequência é apresentada como qualquer uma de SEQ ID NOS: 445 ou 446, ou um fragmento biologicamente ativo da mesma, iii) nucleotídeos cuja sequência de é pelo menos 30% idêntica à i) ou ii), e iv) uma sequência de nucleotídeos que hibridiza com qualquer uma das i) a iii) sob condições rigorosas.
[114]Claramente, as sequências preferenciais de uma modalidade podem ser comibinadas com as sequências preferenciais de outra modalidade e mais vantajosamente ainda combinadas com uma sequência preferencial ainda de outra modalidade.
[115]Em uma modalidade, o um ou mais polinucleotídeos exógenos que codificarn um MGAT e/ou DGAT e/ou GPAT mutantes. Por exemplo, um ou mais polinucleotídeos exógenos podem codificar um MGAT e/ou DGAT e/ou GPAT tendo uma, ou mais do que uma, substituições de aminoácidos conservadas, como exemplificado na Tabela 1 relativamente a um MGAT e/ou DGAT e/ou GPAT tipo selvagem, como definido por uma SEQ ID NO aqui.
Preferencialmente, o polipeptídeo rnutante tem uma atividade equivalente ou maior em relação ao polipeptídeo não mutante.
[116]Em uma modalidade, a parte da planta vegetativa, o organismo não humano ou parte do mesmo, ou a semente cornpreende um primeiro polinucleotídeo exógeno que codifica um MGAT e um segundo polinucleotídeo exógeno que codifica um DGAT. Os primeiro e segundo polinucleotídeos podem ser fornecidos como moléculas separadas ou podem ser fornecidos como uma única rnolécula contígua, como em uma molécula de T- única DNA única.
Em uma modalidade, a orientação de transcrição de pelo rnenos um gene na molécula de T-DNA é oposta à orientação da transcrição de pelo menos outro gene da molécula de T-DNA. Em uma modalidade preferencial, GPAT é um GPAT tendo atividade de fosfatase, como uma GPAT4 ou GPAT6 de Arabidopsis. O GPAT tendo atividade de fosfatase atua para catalisar a formação de MAG de G-3-P (ou seja, G-3-P acila para formar o LPA e subsequentemente remove um grupo fosfato para formar MAG) no organismo não humano ou parte do mesmo. O MGAT depois atua para catalisar a formação de DAG no organismo não humano ou parte do mesmo por acilação do MAG com um grupo acil derivado de acil-CoA graxo. O MGAT como MGATI de A. thaliana pode também atuar para catalisar a formação de TAG no organismo não humano ou parte do mesmo, se ele também tem atividade DGAT.
[117]A parte da planta vegetativa, organismo não humano ou parte do mesmo, ou as sementes podem compreender um terceiro polinucleotídeo exógeno que codifica, por exemplo, um DGAT. Os primeiro, segundo e terceiro polinucleotídeos podem ser fornecidos como moléculas separadas ou podem ser fornecidos como uma única molécula contígua, como em uma única molécula de T- DNA. O DGAT atua para catalisar a formação de TAG na parte da planta vegetativa transgênica, organismo não humano ou parte do mesmo, ou sementes por acilação do DAG (preferencialmente produzidos pela via MGAT) com um grupo acil derivado de acil-CoA graxo. Em uma modalidade, a orientação de transcrição de pelo menos um gene na molécula de T-DNA é oposta à orientação da transcrição de pelo menos outro gene da molécula de T-DNA.
[118]Em outra modalidade, a parte da planta vegetativa, organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente compreende um primeiro polinucleotídeo exógeno que codifica um MGAT e um segundo polinucleotídeo exógeno que codifica um DGAT. Os primeiro e segundo polinucleotídeos podem ser fornecidos como moléculas separadas ou podem ser fornecidos como uma única molécula contígua, como em uma molécula de T- única DNA única.
Em uma modalidade, a orientação de transcrição de pelo menos um gene na molécula de T-DNA é oposta à orientação da transcrição de pelo menos outro gene da molécula de T-DNA. A parte da planta vegetativa, organisrno não humano ou parte do mesmo, ou sementes pode compreender um terceiro polinucleotídeo exógena que codifica, por exemplo, um GPAT, preferencialmente um GPAT tendo atividade de fosfatase, como um GPAT4 ou GPAT6 de Arabidopsis. Os primeiro, segundo e terceiro polinucleotídeos podem ser fornecidos como moléculas separadas ou podem ser fornecidos como uma única molécula contígua.
[119]Além disso, uma atividade de gene endógeno na planta, parte da planta vegetativa, ou o organismo não humano ou parte do mesmo, ou a semente pode ser para regulada para baixo. Portanto, em uma modalidade, a parte da planta vegetativa, o organismo não humano ou parte do mesmo, ou a semente compreende um ou mais dos seguintes: (i) uma ou mais mutações introduzidas em um gene que codifica uma enzima endógena da planta, parte da planta vegetativa, organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente, respectivamente, ou {ii) um polinucleotídeo exógeno que regula para .baixo a produção e/ou atividade de uma enzima endógena da planta, parte da planta vegetativa, organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente, respectivamente, em que cada enzima endógena é selecionada a partir do grupo que consiste em uma aciltransferase de ácido graxo como DGAT, um sn-l glicerol-3-fosfato aciltransferase (sn-l GPAT), uma aciltransferase de l-acil-glicerol-3-fosfato (LPAAT), uma acil- CoA:lisofosfatidilcolina aciltransferase (LPCAT), uma fosfatase de ácido fosfatídico (PAP), um enzima envolvida na biossíntese de amido, como (ADP) pirofosforilase-glicose (AGPase), uma dessaturase de ácido graxo, como uma dessaturase de ácido graxo A12 (FAD2 ), um polipeptídeo envolvido na degradação de lipídeos e/ou que reduz o teor de lipídeos, como uma lipase, como um polipeptídeo CGi58 ou triacilglicerol lipase dependente de açúcar, ou uma combinação de duas ou mais das mesmas. Em uma modalidade, o polinucleotídeo exógeno é selecionado a partir do grupo que consiste em um polinucleotídeo antissenso, um polinucleotídeo senso, um polinucleotídeo catalítico, um microRNA, um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que se liga à enzima endógena, uma molécula de RNA de cadeia dupla ou uma moiécula de RNA processada derivada destas. Em uma modalidade, o polinucleotídeo exógeno que regula negativamente a produção de AGPase não é o polinucleotídeo descrito em Sanjaya et al. (2011). Em uma modalidade, os polinucleotídeos exógenos na pajrte da planta vegetativa ou organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente não consistem de um polinucleotídeo exógeno que codifica um WRII e um polinucleotídeo exógeno que codifica para uma molécula de RNA que inibe a expressão de um gene que codifica uma AGPase.
[120]Aumentando o nível de lipídeos apolares é importante para as aplicações que envolvem ácidos graxos particulares. Portanto, em uma modalidade, o lipídeo apolar total, o lipídeo ou o óleo extraído compreende: (i) lipídeo apolar que é TAG, DAG, TAG e DAG, ou MAG, e (ii) um PUFA específica que é a EDA, ARA, SDA, ETE, ETA, EPA, DPA, o DHA, o PUFA específico estando em um nível de pelo menos 1% do conteúdo total de ácidos graxos no lipídeo apolar, ou uma combinação de dois ou mais dos PUFA específicos, ou (iii) um ácido graxo, que está presente em um nível de pelo menos 1% do conteúdo total de ácidos graxos no lipídeo apolar e o qual compreende um grupo hidroxil, um grupo epoxi, um grupo ciclopropano, uma ligação dupla carbono-carbono, uma ligação tripla carbono-carbono, ligações duplas conjugadas, uma cadeia ramificada, como uma cadeia ramificada metilada ou hidroxilada, ou uma combinação de dois ou mais dos mesmos, ou qualquer de dois, três, quatro, cinco ou seis dos grupos acima referidos, ligações ou cadeias ramificadas.
[121]Em um terceiro aspecto, a invenção proporciona organismos não humanos, preferencialmente plantas, ou partes, como partes vegetativas ou de sementes, que são úteis em processos do primeiro e do segundo aspectos ou em outros aspectos descritos a seguir. Cada uma das características das modalidades descritas para o primeiro e segundo aspectos pode ser aplicada mutatis mutandis para os organismos não humanos, preferencialmente plantas, ou partes dos mesmos, como partes de plantas ou de sementes vegetativas do terceiro aspecto. As modalidades particulares estão indicadas da seguinte maneira.
[122]Em uma modalidade do terceiro aspecto, a invenção proporciona uma planta compreendendo uma parte vegetativa, ou a parte vegetativa da mesma, em que a parte vegetativa tem um teor de lipídeos apolares total de pelo menos cerca de 3%, rnais preferencialmente pelo menos cerca de 5%, preferencialmente pelo menos cerca de 7°5, mais preferencialmente pelo menos cerca de 10%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 11%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 12%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 13%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 14%, ou mais preferencialmente pelo menos cerca de 15% (p/p de peso seco). Em outra modalidade preferencial, o conteúdo total de lipídeos apolar é entre 5% e 25%, entre 7% e ' 25%, entre 10% e 25%, entre 12% e 25%, entre 15% e 25%, entre 7% e 20%, entre 10% e 20%, cerca de 10%, cerca de 11%, cerca de 12%, cerca de 13%, cerca de 14%, cerca de 15%, cerca de 16%, cerca de 17%, cerca de 18%, cerca de 20%, ou cerca de 22%, cada um como uma percentagem do peso seco. Em uma modalidade particularmente preferencial, a parte da planta vegetativa é uma folha (ou folhas) ou uma porção da mesma. Em uma modalidade mais preferencial, a parte da planta vegetativa é uma porção de folha tendo uma área de superfície de pelo menos 1 cm2. Em outra modalidade, o lipídeo apolar compreende, pelo menos, 90% de triacilgliceróis (TAG). Preferencialmente, a planta é fértil, morfologicamente normal, e/ou agronomicamente útil. Semente da planta preferencialmente germina a uma taxa substancialmente igual para uma planta de tipo selvagem correspondente. Preferencialmente, a parte vegetativa é uma folha ou um caule, ou uma combinação dos dois, ou uma raiz ou tubérculo, como, por exemplo, tubérculos de batata.
[123]Em outra rnodalidade, o organismo não humano, preferencialmente plantas, ou parte da mesma, como parte da planta vegetativa ou semente compreende um ou mais polinucleotídeos exógenos como aqui definido, e tem um aumento do nível de um ou mais lipídeos apolares e/ou o teor de lipídeos apolares total que é, pelo menos, 2 vezes, pelo menos, 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 6 vezes, pelo menos 7 vezes, pelo menos 8 vezes, pelo menos 9 vezes, pelo menos 10 vezes, ou pelo menos 12 vezes, preferencialrnente pelo menos cerca de 13 vezes, ou pelo menos cerca de 15 vezes maior em termos relativos do que um correspondente organismo não humano, preferencialmente planta, ou parte da mesma, como parte da planta vegetativa ou semente desprovida de um ou mais polinucleotídeos exógenos.
[124]Em uma modalidade, a invenção proporciona uma planta de canola que compreende semente de canola, cujo teor de óleo é de pelo menos 45% em uma base de peso. Preferencialmente, a planta de canola ou sua semente tem características como descritas no primeiro e segundo aspectos da invenção.
[125]Em uma modalidade, a invenção proporciona urrta planta de milho que compreende semente de milho, cujo teor de óleo é de pelo menos 5% em uma base de peso. Preferencialmente, a planta de milho ou sua semente tem características como descritas no primeiro e segundo aspectos da invenção.
[126]Em uma modalidade, a invenção proporciona uma planta de soja que compreende semente de soja, cujo teor de óleo é de pelo menos 20% erri uma base de peso. Preferencialmente, a planta de soja ou sua semente tem características como descritas no primeiro e segundo aspectos da invenção.
[127]Em uma modalidade, a invenção proporciona uma planta de tremoço que compreende semente de tremoço, cujo teor de óleo é de pelo menos 10% em uma base de peso. Preferencialmente, a planta de tremoço ou sua semente tem características como descritas no primeiro e segundo aspectos da invenção.
[128]Em uma modalidade, a invenção proporciona uma planta de amendoim que compreende amendoim, cujo teor de óleo é de pelo menos 50% em uma base de peso. Preferencialmente, a planta de amendoim ou sua semente tem características como descritas no primeiro e segundo aspectos da invenção.
[129]Em uma modalidade, a invenção proporciona uma planta de girassol que compreende semente de girassol, cujo teor de Óleo é de pelo menos 50% em uma base de peso. Preferencialmente, a planta de girassol ou sua semente tem características como descritas no primeiro e segundo aspectos da invenção.
[130]Em uma modalidade, a invenção proporciona uma planta de algodão que compreende semente de algodão, cujo teor de óleo é de pelo menos 41% em uma base de peso. Preferencialmente, a planta de algodão ou sua semente tem características como descritas no primeiro e segundo aspectos da invenção.
[131]Em uma modalidade, a invenção proporciona uma planta de cártamo que compreende semente de cártamo, cujo teor de óleo é de pelo menos 35% em uma base de peso. Preferencialmente, a planta de cártamo ou sua seíriente tem características como descritas no primeiro e segundo aspectos da invenção.
[132]Em uma modalidade, a invenção proporciona uma planta de linhaça que compreende semente de linhaça, cujo teor de óleo é de pelo menos 36% em uma base de peso. Preferencialmente, a planta de linhaça ou sua semente tem características como descritas no primeiro e segundo aspectos da invenção.
[133]Em uma modalidade, a invenção proporciona uma planta de Camelina sativa que compreende semente de Camelina sativa, cujo teor de óleo é de pelo menos 36% em uma base de peso. Preferencialmente, a planta de Camelina sativa ou sua semente tem características como descritas no primeiro e segundo aspectos da invenção.
[134]Em modalidades, as plantas podem ser ainda definido por características (i), (ii) e (iii) como descrito aqui anteriormente. Em uma modalidade preferencial, a planta ou a parte vegetativa compreende uma ou mais ou todas as seguintes características: (i) ácido oleico em uma parte vegetativa ou semente da planta, o ácido oleico sendo em uma forma esterificada ou não esterificada, em que, pelo menos, 20% (% mol), pelo menos, 22% {% mol), pelo menos 30 % (% mol), pelo menos, 40% (% mol), pelo menos, 50% (°5 mol), ou, pelo menos, 60% (°0 mcl), preferencialmente, pelo menos, 65% (% mol) ou, pelo menos, 66% (mol %) dos ácidos graxos totais no teor de lipídeos da parte vegetativa ou semente é o ácido oleico, (ii) ácido oleico em uma parte vegetativa ou a semente da planta, o ácido oleico, sendo em uma forma esterificada em lipídeos apolares, em que pelo menos 20% (% mol), pelo menos, 22% (°5 mol), pelo menos 30% (% mol), pelo menos, 40% (% mol), pelo menos, 50% (°5 mol), ou, pelo menos, 60% (°5 mol), preferencialmente, pelo menos, 65% ("5 mol) ou, pelo menos, 66% (% mol) dos ácidos graxos totais no teor de lipídeos apolares da parte vegetativa ou semente é o ácido oleico, (iii) um ácido graxo modificado de uma parte vegetativa ou a semente da planta, o ácido graxo modificado estando na forma esterificada ou não esterificada, preferencialmente, em uma forma esterificada em lipídeos apolares da parte vegetativo ou de semente, em que o ácido graxo modificado coinpreende um grupo hidroxil, um grupo epoxi, um grupo ciclopropano, uma ligação dupla carbono-carbono, uma ligação tripla carbono-carbono, ligações duplas conjugadas, uma cadeia rarnificada, coiro uma cadeia ramificada metilada ou hidroxilada, ou uma combinação de dois ou mais dos mesmos, ou qualquer de dois, três, quatro, cinco ou seis dos grupos acima mencionados, ligações ou cadeias ramificadas, e (iv) ceras e/ou de ésteres de cera em lipídeo apolar da parte vegetativa ou a semente da planta.
[135]Em uma modalidade, a planta ou a parte de planta vegetativa é um membro de uma população ou a coleta de, pelo menos, cerca de 1000 tais plantas ou partes. Isto é, cada planta ou parte da planta na população ou coleção tem essencialmente as mesmas propriedades ou compreendem os mesmos ácidos nucléicos exógenos que os outros membros da população ou coleção. Preferencialmente, as plantas são homozigóticas para os polinucleotídeos exógenos, o que proporciona um grau de uniformidade. Preferencialmente, as plantas estão crescendo em um campo. A coleção de partes de plantas vegetativas foram colhidas preferencialmente a partir de plantas que crescem em um campo. Preferencialmente, as partes de plantas vegetativas foram colhidas no momento em que o rendimento de lipídeos apolares são os mais elevados. Em uma modalidade, as partes de plantas vegetativas foram colhidas sobre o tempo de floração. Em outra modalidade, as partes vegetativas são colhidas quando as plantas são, pelo menos, cerca de 1 mês de idade. Em outra modalidade, as partes vegetativas são colhidas a partir de cerca de, no momento da floração até cerca de início da senescência. Em outra modalidade, as partes de plantas vegetativas são colhidas pelo menos cerca de 1 mês após a indução da expressão de genes induzíveis.
[136]Em outra modalidade do terceiro aspecto, a invenção proporciona uma parte de planta vegetativa, organismo não humano ou uma parte do mesmo, ou sementes, compreendendo um ou mais polinucleotídeos exógenos e um aumento do nível de um ou mais lipídeos apolares em relação a uma correspondente parte de planta vegetativa, organismo não humano ou uma parte do mesmo, ou semente desprovidos de um ou mais polinucleotídeos exógenos, em que cada um dos um ou mais polinucleotídeos exógenos estão operativamente ligados a um promotor que é capaz de dirigir a expressão do polinucleotídeo em uma parte da planta vegetativa,
organismo não humano ou parte do mesmo, ou de sementes e em que um ou mais cu todas as seguintes características a'olicam-se: (i) o um ou mais polinucleotídeos exógenos compreendem uni primeiro polinucleotídeo exógeno que codifica um fator de transcrição de RNA ou polipeptídeo que aumenta a expressão de um ou mais genes da biossíntese do ácido graxo ou glicolítico ou uma parte da planta vegetativa, organismo não humano ou uma parte do mesmo, ou sementes, e um segundo polinucleotídeo exógeno que codifica para um RNA ou um polipeptídeo envolvido na biossíntese de um ou mais lipídeos apolares, (ii) se o organismo não humano é uma planta, uma parte da planta vegetativa tem um teor de lipídeos apolares total de pelo menos cerca de 3°)", rnais preferencialmente pelo menos cerca de 5%, preferencialmente pelo menos cerca de 7°0, mais preferencialmente pelo menos cerca de 10%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 11%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 12%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 13%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 14%, ou mais preferencialmente pelo menos cerca de 15% (p/p peso seco),
(iii) o organismo não humano é uma alga selecionada a partir do grupo que consiste em diatomáceas (bacillariofitas), algas verdes (clorCfitas), algas azuis-verdes (cianofíceas), algas castanho-dourado (crisofitas), haptofitas, algas castanhas e algas heterokont,
' (iv) os lipídeos apolares compreendem um ácido graxo que compreende um grupo hidroxil, um grupo epoxi, um grupo ciclopropano, uma ligação dupla carbono-carbono, uma ligação tripla carbono-carbono, ligações duplas conjugadas, uma cadeia ramificada, como uma cadeia ramificada metilada ou hidroxilada, ou uma combinação de dois ou mais dos mesmos, ou qualquer de dois, três, quatro, cinco ou seis dos grupos acima mencionados, ligações ou cadeias ramificadas.
(v) a parte da planta vegetativa, organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente compreende ácido oleico erri uma forma esterificada ou não esterificadoa em seu lipídeo, em que, pelo menos, 20% {% mol), pelo menos, 22% (% mol ), pelo menos, 30% (°5 mol), pelo menos, 40% (% mol), pelo menos, 50% (% mol), ou, pelo rnenos, 60% (% mol), preferencialmente, pelo menos, 65% (°5 mol) ou em pelo menos 66% (% mol) dos ácidos graxos totais no lipídeo da parte da planta vegetativa, organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente é o ácido oleico, (vi) a parte da planta vegetativa, organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente compreende ácido oleico em uma forma esterificada em seu lipídeo apolar, em que pelo menos 20% (% mol), pelo menos, 22% (% mol), pelo menos, 30% (°5 mol), pelo menos, 40% (% mol), pelo menos, 50% (% mol), ou, pelo menos, 60% (% mol), preferencialmente, pelo menos, 65% (% mol) ou, pelo menos, 66% (% mol) dos ácidos graxos totais no lipídeo apolar da parte da planta vegetativa, organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente é o ácido oleico, (vii) o teor total de ácidos graxos no lipídeo da parte da planta vegetativa, organismo não humano ou parte do mesmo, ou de sementes compreende o, pelo menos, 2% mais de ácido oleico e/ou, pelo menos, 2% menos ácido palmítico do que lipídeos na correspondente parte da planta vegetativa, organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente faltando um ou mais polinucleotídeos exógenos, e/ou (viii) o teor total de ácidos graxos rio lipídeo apolar da parte da planta vegetativa, organism.o não humano ou parte do mesmo, ou semente compreende, pelo menos, 2% mais ácido oleico e/ou, pelo menos, 2% menos ácido palmítico do que lipídeo apolar na parte de planta vegetativa correspondente, organismo não hurnano ou parte do mesmo, ou sementes desprovidas de um ou mais polinucleotídeos exógenos, (ix) os lipídeos apolares compreendem um nível de modificação de esteróis totais, preferencialmente, esteróis livres, ésteres esteroil e/ou glicosídeos esteroi-l, (X) os lipídeos apolares compreendem ceras e/ou ésteres de cera, e (xi) o organismo não humano ou parte do rnesmo é um membro de uma população ou coleção de, pelo menos, cerca de 1000 de ditos organismos não humanos ou partes dos mesmos.
[13J]Em uma modalidade, o um ou mais polinucleotídeos exógenos compreendem o primeiro polinucleotídeo exógeno e o segundo polinucleotídeo exógeno, e em que uma ou rnais ou todas as características (ii) a (xi), são aplicáveis.
[138]Em uma modalidade de (ii) acima, o conteúdo total de lipídeos apolar é entre 5% e 25%, entre 7% e 25%, entre 10% e 25%, entre 12% e 25%, entre 15% e 25 %, entre 7% e 20%, entre 10% e 20%, cerca de 10%, cerca de 11%, cerca de 12%, cerca de 13%, cerca de 14°õ, cerca de 15%, cerca de 16%, cerca de 17%, cerca 18%, cerca de 20%, ou cerca de 22%, cada um, como uma percentagem do peso seco. Em uma modalidade mais preferencial, a parte da planta vegetativa é uma porção de folha tendo uma área de superfície de pelo menos 1 cm2,
[139]Em modalidades preferenciais, o organismo não humano ou parte do mesmo é uma planta, uma alga, ou um organismo adequado para a fermentação, como um fungo. A parte do organismo não humano pode ser uma semente, fruto, ou uma parte vegetativa de uma planta, como uma parte da planta aérea ou uma parte verde COIllO uma folha ou caule. Em outra modalidade, a parte é uma célula de um organismo multicelular. No que diz respeito à parte do organismo não humano, a parte compreende, pelo menos, uma célula do organismo não humano. Em outras modalidades preferenciais, o organismo não humano ou parte do mesmo é ainda definido por características como definidas em qualquer urna das modalidades descritas nos primeiro e segundo aspectos da invenção, incluindo, entre outras, características (i), (ii) e (iii), e o polinucleotídeos exógenos ou combinações de polinucleotídeos exógenos, como definidos em qualquer uma das ínodalidades descritas no primeiro e segundo aspectos da invenção.
[140]Em uma modalidade, a planta, parte da planta vegeta'tiva, organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente compreende um ou mais polinucleotídeos exógenos que codificam: i) um fator de transcrição wrinkled 1 (WRII) e um DGAT, ii) um fator de transcrição WRII e um DGAT e uma oleosina, iii) um fator de transcrição WRII, um DGAT, um MGAT e uma oleosina, iv) uma monoacilglicerol aciltransferase (MGAT), v) urn diacilglicerol aciltransferase 2 (DGAT2), vi) um MGAT e um aciltransferase de glicerol-3-fosfato (GPAT), vii) um MGAT e um DGAT, viii) um MGAT, um GPAT e um DGAT, ix) um fator de transcrição WRII e uma MGAT, X) um fator de transcrição WRII, um DGAT e um MGAT, xi) um fator de T-ranscrição WRII, um DGAT, um MGAT, uma oleosina e GPAT, xii) um DGAT e uma oleosina, ou xiii) um MGAT e uma oleosina, e xiv') opcionalmente, um polipeptídeo supressor de silenciamento, em que cada um polinucleotídeo exógeno está ligado operativamente a um promotor que é capaz de dirigir a expressão do polinucleotídeo em uma planta, parte da planta vegetativa, ou um organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente, respectivamente. Os um ou mais polinucleotídeos exógenos pode compreender nucleotídeos, cuja sequência é aqui definida. Preferencialmente, a planta, parte da planta vegetativa, organismo não humano ou parte do mesmo, ou sementes é homozigoto para urri ou mais polinucleotídeos exógenos. Preferencialmente, os polinucleotídeos exógenos são integrados no genoma da planta, parte da planta vegetativa, organismo não humano ou parte do mesmo, ou sementes. Os um ou mais polinucleotídeos podem ser fornecidos como moléculas separadas ou podem ser fornecidos como uma única molécula contígua. Preferencialmente, os polinucleotídeos exógenos são integrados no genoma da planta ou organismo em um único local genético ou locais geneticamente ligados, mais preferencjalmente, no estado homozigótico. Mais preferencialmente, os polinucleotídeos exógenos integrados são ligados geneticamente com um gene marcador selecionável como um gene de tolerância ao herbicida.
[141]Em uma modalidade preferencial, a parte da planta vegetativa, o organismo não humano ou parte do mesmo, ou a semente compreende um primeiro polinucleotídeo exógeno que codifica um WRII e um segundo polinucleotídeo exógeno que codifica um DGAT, preferencialmente um DGATI.
[142]Em outra modalidade preferencial, a parte da planta vegetativa, o organismo não humano ou parte do mesmo, ou a semente compreende um primeiro polinucleotídeo exógeno que codifica um WRII e um segundo polinucleotídeo exógeno que codifica um DGAT, preferencialmente um DGATI e um terceiro polinucleotídeo exógeno que codifica uma oleosina.
[143]Em outra modalidade, a parte da planta vegetativa, o organismo não humano ou parte do mesmo, ou a semente compreende um primeiro polinucleotídeo exógeno que codifica um WRII, urn segundo polinucleotídeo exógeno que codifica um DGAT, preferencialmente um DGATI, um terceiro polinucleotídeo exógeno que codifica uma oleosina, e um quarto polinucleotídeo exógeno que codifica um MGAT, preferencialmente um MGAT2.
[144]Em outra modalidade, a parte da planta vegetativa, o organismo não humano ou parte do mesmo, ou a semente compreende um primeiro polinucleotídeo exógeno que codifica um WRII, um segundo polinucleotídeo exógeno que codifica um DGAT, preferencialmente um DGATI, um terceiro polinucleotídeo exógeno que codifica uma oleosina, e um quarto polinucleotídeo exógeno que codifica LEC2 ou BBM..
[145]Em outra modalidade, a parte da planta vegetativa, o organismo não humano ou parte do mesmo, ou a semente compreende um primeiro polinucleotídeo exógeno que codifica um WRII, um segundo polinucleotídeo exógeno que codifica um DGAT, preferencialmente um DGATI, um terceiro polinucleotídeo exógeno que codifica uma oleosina, quarto polinucleotídeo exógeno que codifica um MGAT, preferencialmente um MGAT2, e um quinto polinucleotídeo exógeno que codifica LEC2 ou BBM.
[146]Ern outra modalidade, a parte da planta vegetativa, o organismo não humano ou parte do mesrno, ou a semente compreende um primeiro polinucleotídeo exógeno que codifica um WRII, um segundo polinucleotídeo exógeno que codifica um DGAT, preferencialmente um DGATI, um terceiro polinucleotídeo exógeno que codifica uma oleosina, e um quarto polinucleotídeo exógeno que codifica para uma molécula de RNA que inibe a expressão de um gene que codifica para uma lipase como polipeptídeo CGi58.
[147]Em outra modalidade, a parte da planta vegetativa, o organismo não humano ou parte do mesmo, ou a semente compreende um primeiro polinucleotídeo exógeno que codifica um WRII, urn segundo polinucleotídeo exógeno que codifica um DGAT, preferencialmente um DGATI, um terceiro polinucleotídeo exógeno que codifica uma oleosina, quarto polinucleotídeo exógeno que codifica para uma molécula de RNA que inibe a expressão de um gene que codifica para uma lipase, como um polipeptídeo CGi58, e urri quinto polinucleotídeo exógeno que codifica LEC2 ou BBM.
[148]Em outra modalidade, a parte da planta vegetativa, o organismo não humano ou parte do mesmo, ou a semente compreende um primeiro polinucleotídeo exógeno que codifica um WRII, um segundo polinucleotídeo exógeno que codifica um DGAT, preferencialmente um DGATI, um terceiro polinucleotídeo exógeno que codifica uma oleosina, quarto polinucleotídeo exógeno que codifica para uma molécula de RNA que inibe a expressão de um gene que codifica para uma lipase como um polipeptídeo CGi58, e um quinto polinucleotídeo exógeno que codifica um MGAT,
preferencialmente um MGAT2.
[149]Em outra modalidade, a parte da planta vegetativa, o organismo não humano ou parte do mesmo, ou a semente compreende um primeiro polinucleotídeo exógeno que codifica um WRII, um segundo polinucleotídeo exógeno que codifica um DGAT, preferencialrnente um DGAT 1, um terceiro polinucleotídeo exógeno que codifica uma oleosina, um quarto polinucleotídeo exógeno que codifica para uma molécula de RNA que inibe a expressão de um gene que codifica para uma lipase, como um polipeptídeo CGi58, um quinto polinucleotídeo exógeno que codifica um MGAT, preferencialmente um MGAT2, e um sexto polinucleotídeo exógeno que codifica LEC2 ou BBM.
[150]Em uma modalidade, a semente compreende um primeiro polinucleotídeo exógeno que codifica um WRII, um segundo polinucleotídeo exógeno que codifica um DGAT, preferencialmente um DGATI, um terceiro polinucleotídeo exógeno que codifica uma oleosina, e um quarto polinucleotídeo exógeno que codifica urri MGAT, preferencialmente um MGAT2. Preferencialmente, a semente compreende ainda um quinto polinucleotídeo exógeno que codifica um GPAT.
[151]Onde relevante, em vez de um polinucleotídeo que codifica urna molécula de RNA que inibe a expressão de um gene que codifica para uma lipase, corno um polipeptídeo CGi58, a parte de planta vegetativa, o organismo não humano ou parte do mesmo, ou a semente tem uma ou mais rnutações introduzidas no gene da lipase, como um gene CGi58 que confere níveis reduzidos do polipeptídeo de lipase, quando comparado com uma parte de planta vegetativa isogênica, organismo não humano ou parte do mesmo, ou as q"ementes desprovidas de mutação.
[152]Em uma modalidade preferencial, os polinucleotídeos exógenos que codificam para o DGAT e oleosina estão operacionalmente ligados a um promotor constitutivo, ou um promotor ativo em tecidos verdes de uma planta, pelo menos, antes e até floração, o qual é capaz de dirigir a expressão dos polinucleotídeos na parte da planta vegetativa, o organismo não humano ou parte do mesmo, ou a semente. Em outra modalidade preferencial, o polinucleotídeo exógena codificando WRII, e a molécula de RNA que inibe a expressão de um gene que codifica para uma lipase, como um polipeptídeo CGi58, está operativamente ligado a um promotor constitutivo, um promotor ativo erri tecidos verdes de uma planta, pelo menos, antes e até floração, ou um promotor induzível, que é capaz de dirigir a expressão dos polinucleotídeos na parte da planta vegetativa, o organismo não humano ou parte do mesmo, ou a semente. Ainda em outra modalidade preferencial, os polinucleotídeos exógenos que codificam LEC2, BBM e/ou MGAT2 estão operativamente ligados a um promotor induzível, que é capaz de dirigir a expressão dos polinucleotídeos na parte de planta vegetativa, o organismo não humano ou parte do mesmo, ou a semente.
[153]Em cada uma das modalidades anteriores, o teor total de lipídeos apolares da parte da planta vegetativa, ou organismo não humano ou parte do mesmo, ou a semente, preferencialmente uma folha da planta ou parte da mesma, caule ou tubérculo, é, pelo menos, cerca de 3 °0, mais preferencialmente pelo menos cerca de 5°5, preferencialmente pelo menos cerca de 7%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 10%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 11%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 12%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 13%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 14°:, ou mais preferencialmente pelo menos cerca de 15% (p/p de peso seco ou peso de semente). Em outra modalidade preferencial, o conteúdo total de lipídeos apolares é entre 5% e 25%, entre 7% e 25%, entre 10% e 25%, entre 12°ó e 25%, entre 15% e 25%, entre 7% e 20%, entre 10% e 20%, entre 10% e 15%, entre 15% e 20%, entre 20% e 25%, cerca de 10%, cerca de 11%, cerca de 12%, cerca de 13%, cerca de 14%, cerca de 15%, cerca de 16%, cerca de 17%, cerca de 18%, cerca de 20%, ou cerca de 22%, cada um corno uma percentagern de peso seco ou peso da semente. Em uma modalidade particularmente preferencial, a parte da planta vegetativa é uma folha {ou folhas) ou uma porção da mesma. Em uma modalidade mais preferencial, a parte da planta vegetativa é uma porção de folha tendo uma área de superfície de pelo menos 1 cm2.
[154]Além disso, em cada uma das modalidades acima, o teor total de TAG da parte de planta vegetativa, ou organismo não humano ou parte do mesmo, ou a semente, preferencialmente urna folha da planta ou parte da mesrna, caule ou tubérculo, é, pelo menos, cerca de 3°0, mais preferencialmente pelo menos cerca de 5°5, preferencialmente pelo menos cerca de 7°5, mais preferencialmente pelo menos cerca de 10%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 11%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 12%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 13%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 14%, rnais preferencialmente pelo menos cerca de 15%, ou mais preferencialmente pelo menos cerca de 17% (p/p de peso seco ou peso de semente). Em outra modalidade preferencial, o conteúdo total de TAG é entre 5% e 30%, entre 7% e 30%, entre 10% e 30%, entre 12% e 30%, entre 15% e 30°ó, entre 7% e 30%, entre 10% e 30%, entre 20°õ e 28%, entre 18% e 25%, entre 22% e 30%, cerca de 10%, cerca de 11%, cerca de 12%, cerca de 13%, cerca de 14%, cerca de 15%, cerca de 16%, cerca de 17%, cerca de 18%, cerca de 20%, ou cerca de 22%, cada um como uma percentagem de peso seco ou peso da semente. Ein uma modalidade particularmente preferencial, a parte da planta vegetativa é uma folha (ou folhas) ou uma porção da mesma. Em uma modalidade mais preferencial, a parte da planta vegetativa é uma porção de folha tendo uma área de superfície de pelo menos 1 cm2.
[155]Além disso, em cada uma das modalidades acima, o conteúdo total de lipídeos de parte da planta vegetativa, ou organismo não hurnano ou parte do mesmo, ou a semente, preferencialmente uma folha da planta ou parte da mesma, caule ou tubérculo, é, pelo menos, cerca de 3%, rnais preferencialmente pelo menos cerca de 5°5, preferencialmente pelo menos cerca de 7°5, mais preferencialmente pelo menos cerca de 10%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 11%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 12%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 13%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 1%, mais preferencialrnente pelo menos cerca de 15%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 17% (p/p peso seco ou peso de semente), mais preferencialmente pelo menos cerca de 20%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 25%. Em outra modalidade preferencial, o conteúdo total de lipídeos está entre 5% e 35%, entre 7% e 35%, entre 10% e 35%, entre 12% e 35%, entre 15% e 35%, entre 7°5 e 35%, entre 10% e 20%, entre 18% e 28%, entre 20°ó e 28%, entre 22% e 28%, cerca de 10%, cerca de 11%, cerca de 12%, cerca de 13%, cerca de 14%, cerca de 15%, cerca de 16%, cerca de 17%, cerca de 18%, cerca de 20%, cerca de 22%, ou cerca de 25%, cada um como uma percentagem do peso seco ou peso de semente. Tipicamente, o teor total de lipídeos de parte da planta vegetativa, ou organismo não humano ou uma parte do mesmo é de cerca de 2-3% mais elevado do que o teor de lipídeos apolares. Em uma modalidade particularmente preferencial, a parte da planta vegetativa é uma folha (ou folhas) ou uma porção da mesma. Erri uma modalidade mais preferencial, a parte da planta vegetativa é uma porção de folha tendo uma área de superfície de pelo menos 1 cm2.
[156]Em uma modalidade, a parte da planta vegetativa, o organismo não humano ou parte do mesmo, ou a semente, preferencialmente, a parte da planta vegetativa, compreende um primeiro polinucleotídeo exógeno que codifica um WRII, urn segundo polinucleotídeo exógeno que codifica urrt DGAT, preferencialmente um DGATI, um terceiro polinucleotídeo exógeno que codi-fica um MGAT, preferencialmente um MGAT2, e um quarto polinucleotídeo exógeno que codifica uma oleosina, em que a parte da planta vegetativa, organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente tem urna ou mais ou todas as seguintes características: i) um teor total de lipídeo de, pelo menos, 8%, pelo menos,
10%, pelo menos 12%, pelo menos 14°:, ou pelo rnenos 15,5°õ (% em peso de peso seco ou peso da semente), ii) pelo menos 3 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos, 7 vezes, pelo menos 8 vezes, ou pelo menos 10 vezes, com maior conteúdo total de lipídeos na parte de planta vegetativa ou organismo não humano em relação a uma correspondente parte da planta vegetativa ou organismo não humano desprovido dos polinucleotídeos exógenos, iii) um teor total de TAG de pelo menos 5%, pelo menos 6%, pelo menos 6,5°s, ou pelo menos 7°5 (% em peso de peso seco ou no peso da semente), iv) pelo menos um de 40 vezes, pelo menos, 50 vezes, pelo menos, 60 vezes, ou, pelo menos, 70 vezes, ou, pelo menos, 100 vezes, maior teor total de TAG em relação a uma parte de planta vegetativa correspondente ou organismo não humano desprovidos dos polinucleotídeos exógenos, v) ácido oleico compreende pelo menos 15%, pelo menos 19% ou pelo menos 22% {% em peso) dos ácidos graxos em TAG,
vi) pelo menos 10 vezes, pelo menos, 15 vezes, ou, pelo menos, 17 vezes maior nível de ácido oleico em TAG em relação a uma parte de planta vegetativa correspondente ou organismo não humano desprovido dos polinucleotídeos exógenos,
vii) ácido palmítico compreende pelo menos 20%, pelo menos
25%, pelo menos 30% ou pelo menos 33% (% em peso) dos ácidos graxos em TAG, viii) pelo menos um 1,5 vezes de nível mais elevado de ácido palmítico em TAG em relação a uma parte da planta vegetativa correspondente no organismo não humano desprovido dos polinucleotídeos exógenos,
ix) ácido linoleico compreende pelo menos 22%, pelo menos
25%, pelo menos 30% ou pelo menos 34% (% em peso) dos ácidos graxos em TAG, x) ácido a-linolênico compreende menos do que 20%, menos do que 15%, menos do que 11% ou menos de 8% (°5 em peso) dos ácidos graxos em TAG, e xi) pelo menos um 5 vezes, ou pelo menos 8 vezes menor nível de ácido a-linolênico na TAG em relação a uma correspondente parte de planta vegetativa ou organismo não humano desprovido dos polinucleotídeos exógenos. Nesta modalidade, preferencialmente, a parte da planta vegetativa, pelo rnenos, tem as características, i), ii) iii), iv), i) e ii), i) e iii), i) e iv), i) a iii ), i), iii) e iv), i) a iv), ii) e iii), ii) e iv), ii) a iv), ou iii) e iv). Em uma modalidade,% de peso seco é % em peso seco da folha.
[157]Em outra modalidade, a parte da planta vegetativa, o organismo não humano ou parte do rnesmo, ou a semente, preferencialmente, a parte da planta vegetativa, compreende um primeiro polinucleotídeo exógeno que codifica um WRII, um segundo polinucleotídeo exógeno que codifica uma DGAT, preferencialmente, um DGATI, um terceiro polinucleotídeo exógeno que codifica uma oleosina, em que a parte da planta vegetativa, organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente tern uma ou mais ou todas as seguintes características: i) um teor total de TAG de pelo menos 10%, pelo menos 12.5%, pelo menos 15%, ou pelo menos 17% (°0 em peso de peso seco ou no peso da semente), ii) pelo menos 40 vezes, pelo menos 50 vezes, pelo menos, 60 vezes, pelo menos 70 vezes, ou pelo menos 100 vezes maior teor total de TAG na parte de planta vegetativa ou organismo não humano em relação a uma correspondente parte da planta vegetativa ou organismo não humano desprovido dos polinucleotídeos exógenos, iii) ácido oleico compreende pelo rrienos 19%, pelo menos 22% ou pelo menos 25% (% em peso) dos ácidos graxos em TAG,
iv) pelo menos, 10 vezes, pelo menos, 15 vezes, pelo menos, 17 vezes, ou, pelo menos, 19 vezes nível mais elevado de ácido oleico em TAG na parte de planta vegetativa ou organismo não humano em relação a uma correspondente de parte de planta vegetativa ou organismo não humano desprovido dos polinucleotídeos exógenos, v) ácido palmítico compreende pelo menos 20%, pelo menos 25%, ou, pelo menos, 28% (% peso) dos ácidos graxos em TAG, vi) pelo menos um nível 1,25 vezes superior de ácido palmítico na TAG na parte de planta vegetativa ou organismo nãc humano em relação a uma parte de planta vegetativa correspondente ou organismo não humano desprovido dos polinucleotídeos exógenos, vii) ácido linoleico compreende pelo menos 15%, ou, pelo menos, 20%, (°5 em peso) dos ácidos graxos em TAG, viii) ácido a-linolênico compreende menos do que 15%, menos do que l1°o" ou menos de 8°0 (°5 em peso) dos ácidos graxos em TAG, e ix) pelo menos um de 5 vezes, ou pelo menos 8 vezes, menor nível de ácido a-linolênico em TAG na parte de planta vegetativa ou organismo não humano em relação a uma parte de planta vegetativa correspondente ou organismo não humano desprovido de polinucleotídeos exógenos. Nesta modalidade, preferencialmente, a parte da planta vegetativa, pelo rr.enos, tem as características, i), ii), ou i) e ii). Em uma modalidade,% de peso seco é % em peso seco da folha.
[158]Preferencialmente, as características definidas para as duas modalidades acima são como na fase de floração da planta.
[159]Em um quarto aspecto, a invenção proporciona uma semente de planta capaz de crescer em uma planta da presente invenção, ou obtida a partir de uma planta da presente invenção, por exemplo, um organismo não humano da invenção que é uma planta. Em uma modalidade, a semente compreende um ou inais polinucleotídeos exógenos, como aqui definido.
[160]Em um quinto aspecto, a invenção proporciona um processo para obter uma célula com maior capacidade para produzir um ou mais lipídeos apolares, o processo compreendendo as etapas de: a) introduzir em uma célula um ou mais polinucleotídeos exógenos, b) expressar um ou mais polinucleotídeos exógenos na célula ou uma célula descendente da mesma, C) analisar o conteúdo lipídico da célula ou descendência, e d) selec,ionar uma célula ou a descendência da célula tendo um aumento do nível de um ou mais lipídeos apolares em relação a uma célula correspondente ou célula descendente desprovida dos polinucleotídeos exógenos, em que o um ou mais polinucleotídeos exógenos codificam i) um fator de transcrição wrinkled 1 (WRII) e um DGAT, ii) um fator de transcrição WRII e um DGAT e uma oleosina, iii) um fator de transcrição WRII, um DGAT, um MGAT e uma oleosina, iv) um monoacilglicerol aciltransferase (MGAT), v) um diacilglicerol aciltransferase 2 (DGAT2), vi) um MGAT e uma aciltransferase de glicerol-3-fosfato (GPAT), vii) um MGAT e um DGAT, viii) um MGAT, um GPAT e um DGAT, ix) um fator de transcrição WRII e uma MGAT, X) um fator de transcrição WRII, um DGAT e um MGAT, xi) um fator de transcrição WRII, um DGAT, um MGAT, uma oleosina e GPAT, xii) um DGAT e uma oleosina, ou xiii) um MGAT e uma oleosina, e xiv) opcionalmente, um polipeptídeo supressor de silenciamento, em que cada um polinucleotídeo exógeno é operativamente ligado a um promotor que é capaz de dirigir a expressão do polinucleotídeo exógeno na célula ou a descendência.
[161]Em uma rnodalidade, a célula ou descendência selecionada compreende: i) um primeiro polinucleotídeo exógeno que codifica um WRII e um segundo polinucleotídeo exógeno que codifica um DGAT, preferencialmente um DGATI, ii) um primeiro polinucleotídeo exógeno que codifica urn WRII, um segundo polinucleotídeo exógeno que codifica um DGAT, preferencialmente um DGATI, e um terceiro polinucleotídeo exógeno que codifica uma oleosina, iii) um primeiro polinucleotídeo exógeno que codifica um WRII, um segundo polinucleotídeo exógeno que codifica um DGAT, preferencialmente um DGATI, um terceiro polinucleotídeo exógeno que codifica uma oleosina, e um quarto pclinucleotídeo exógeno que codifica um MGAT, preferencialmente um MGAT2, iv) um primeiro polinucleotídeo exógeno que codifica um WRII, um segundo polinucleotídeo exógeno que codifica um DGAT, preferencialmente um DGATI, um terceiro polinucleotídeo exógeno que codifica uma oleosina, e um quarto polinucleotídeo exógeno que codifica LEC2 ou BBM V) um primeiro polinucleotídeo exógeno que codifica urn WRII, um segundo polinucleotídeo exógeno que codifica um DGAT, preferencialmente urn DGATI, um terceiro polinucleotídeo exógeno que codifica uma oleosina, um quarto polinucleotídeo exógeno que codifica um MGAT, preferencialmente um MGAT2, e um quinto polinucleotídeo exógeno que codifica LEC2 ou BBM, vi) um primeiro polinucleotídeo exógeno que codifica um WRII, um segundo polinucleotídeo exógeno que codifica um DGAT, preferencialmente um DGATI, um terceiro polinucleotídeo exógeno que codifica uma oleosina, e um quarto polinucleotídeo exógeno que codifica para uma molécula de RNA que inibe a expressão de um gene que codifica para uma lipase como um polipeptídeo CGi58, vii) uin primeiro polinucleotídeo exógeno que codifica uin
79/3'75 WRII, um segundo polinucleotídeo exógeno que codifica um DGAT, preferencialmente um DGATI, um terceiro polinucleotídeo exógeno que codifica uma oleosina, um quarto polinucleotídeo exógeno que codifica para uma molécula de RNA que inibe a expressão de um gene que codifica para uma lipase, como um polipeptídeo CGi58, e um quinto polinucleotídeo exógeno que codifica LEC2 ou BBM viii) um primeiro polinucleotídeo exógeno que codifica um WRII, um segundo polinucleotídeo exógeno que codifica um DGAT, preferencialmente um DGATI, um terceiro polinucleotídeo exógeno que codifica uma oleosina, um quarto polinucleotídeo exógeno que codifica para uma molécula de RNA que inibe a expressão de um gene que codifica para uma lipase, como um polipeptídeo CGi58, e um quinto polinucleotídeo exógeno que codifica um MGAT, preferencialmente um MGAT2, ou ix) um primeiro polinucleotídeo exógeno que codifica um WRII, um segundo polinucleotídeo exógeno que codifica um DGAT, preferencialmente um DGATI, um terceiro polinucleotídeo exógeno que codifica uma oleosina, um quarto polinucleotídeo exógeno que codifica para uma molécula de RNA que inibe a expressão de um gene que codifica para uma lipase, como um polipeptídeo CGi58, um quinto polinucleotídeo exógeno que codifica um MGAT, preferencialmente um MGAT2, e um sexto pclinucleotídeo exógeno que codifica LEC2 ou BBM.
[162]Em outra modalidade, a célula selecionada ou descendência é selecionada uma célula de uma semente de planta e compreer.de um primeiro polinucleotídeo exógeno que codifica um WRll, um segundo polinucleotídeo exógeno que codifica um DGAT, preferencialmente um DGATI, um terceiro polinucleotídeo exógeno que codifica urna oleosina, e um quarto polinucleotídeo exógeno que codifica um MGAT, preferencialmente um MGAT2. Preferenci-almente, a semente compreende ainda um quinto polinucleotídeo exógeno que codifica um GPAT.
[163]Em uma modalidade preferencial, os urri ou rr,ais polinucleotídeos exógenos são integrados de forma estável no genoma da célula ou a descendência.
[164]Em uma modalidade preferencial, o processo compreende ainda uma etapa de regeneração de uma planta transgênica a partir da célula ou da descendência da célula que compreende um \ ou mais polinucleotídeos exógenos. A etapa de regeneração de uma planta transgênica pode ser realizada antes da etapa de expressar um ou mais polinucleotídeos exógenos na célula ou uma célula descendente da mesma, e/ou antes da etapa de analisar o teor de lipídeos da célula ou descendência, e/ou antes do etapa de seleção da célula ou da descendência da célula tendo um aumento do nível de um ou mais lipídeos apolares. O processo pode ainda compreender uma etapa de obtenção de sementes de uma planta ou descendência de planta transgênica, em que a semente ou a descendência de plantas compreende um ou mais polinucleotídeos exógenos.
[165]0 processo do quinto aspecto pode ser utilizado como um ensaio de triagem para determinar se um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo exógeno tem uma função desejada. Os um ou mais polinucleotídeos exógenos neste aspecto podem compreender uma sequência como definida acima. Além disso, os um ou mais polinucleotídeos exógenos podem não ser conhecidos, antes do processo para codificar um fator de transcrição WRII e um DGAT, um fator de transcrição WRII e um MGAT, um fator de transcrição WRII, um DGAT e um MGAT, um fator de transcrição WRII, um DGAT, um MGAT e uma oleosina, um fator de transcrição WRII, um DGAT, um MGAT, uma oleosina e GPAT, urri fator de transcrição WRII, um DGAT e uma oleosina, um DGAT e uma oleosi-na, ou um MGAT e uma oleosina, mas em vez disso podem ser candidatos para os mesmos. O processo, portanto, pode ser utilizado como um ensaio para identificar ou selecionar os polinucleotídeos que codificam para um fator de transcrição WRII e um DGAT, um fator de transcrição WRI1 e um MGAT, um.fator de transcrição WRII, um DGAT e um MGAT, um fator de transcrição WRII, uni DGAT, um MGAT e uma oleosina, um fator de transcrição
WRII, um DGAT, um MGAT, uma oleosina e um GPAT, um fator de transcrição WRII, um DGAT e uma oleosina, um DGAT e uma oleosina, ou um MGAT e uma oleosina. Os polinucleotídeos candidatos são introduzidos em uma célula, e os produtos analisados para determinar se os candidatos têm a função desejada.
[166]Em um sexto aspecto, a invenção proporciona uma célula transgênica ou planta transgênica obtida utilizando um processo da invenção, ou uma parte da pIanta vegetativa ou de semente obtidas a partir destes, que compreende um ou mais polinucleotídeos exógenos.
[167]Em um sétimo aspecto, a invenção proporciona a utilização de um ou mais polinucleotídeos que codificam, ou uma construção genética compreendendo polinucleotídeos que codificam: i) um fator de transcrição wrinkled 1 (WRII) e um DGAT, ii) um fator de transcrição WRII e um DGAT e uma oleos"ina, iii) um fator de transcrição WRII, um DGAT, um MGAT e uma oleosina, iv) um monoacilglicerol aciltransferase {MGAT), v) um diacilglicerol aciltransferase 2 (DGAT2), vi) um MGAT e uma aciltransferase de glicerol-3-fosfato (GPAT), vii) um MGAT e um DGAT, viii) um MGAT, um GPAT e um DGAT, ix) um fator de transcrição WRII e uma MGAT, x) um fator de transcrição WRII, um DGAT e um MGAT, xi) um fator de transcrição WRII, um DGAT, um MGAT, uma oleosina e GPAT, xii) um DGAT e uma oleosina, ou xiii) um MGAT e uma oleosina, e xiv) opcionalmente, um polipeptídeo supressor de silenciamento, para produzir uma célula transgênica, um organismo transgênico não humano ou urna parte do mesrno ou uma semente transgênica tendo uma maior capacidade para produzir um ou mais lipídeos apolares em relação a uma célula correspondente, organismo não humano ou parte do mesmo, ou sementes desprovidas de urn ou mais polinucleotídeos, em que cada um dos um ou mais polinucleotídeos é exógeno à célula, organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente e está operativamente ligado a um promotor que é capaz de dirigir a expressão do polinucleotídeo em uma célula, um organismo não humano ou um parte do mesmo ou uma semente, respectivamente.
[168]Em urna modalidade, a invenção proporciona a utilização de um primeiro polinucleotídeo que codifica um RNA ou fator de transcrição do polipeptídeo que aumenta a expressão de um ou rnais genes da biossíntese do ácido graxo ou glicolítico ou uma célula, um organismo não humano ou uma parte do mesmo, ou sementes, em conjunto corn um segundo polinucleotídeo que codifica para um RNA ou um polipeptídeo envolvido na biossíntese de um ou mais lipídeos apolares, para produzir uma célula transgênica, um organismo transgênico não humano ou parte do mesmo, ou uma semente transgênica tendo uma capacidade aumentada para produzir um ou mais lipídeos apolares em relação a uma célula correspondente, organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente desprovidos do primeiro e segundo polinucleotídeos, em que o primeiro e segundo polinucleotídeos são cada um exógeno à célula, organismo não humano ou parte do mesrno, ou sementes e são, cada um, ligado operativamente a um premotor que é capaz de dirigir a expressão do polinucleotídeo na célula transgênica, organismo transgênico não humano ou parte do rnesmo, Qü sementes transgênicas, respectivamente.
[169]Em outra modalidade, a invenção proporciona a utilização de um ou mais polinucleotídeos para produzir uma célula transgênica, um organismo transgênico não humano ou parte do mesmo, ou uma semente transgênica tendo uma maior capacidade para produzir um ou mais lipídeos apolares em relação a uma
L célula correspondente, organismo não humano ou parte do mesmo, ou sementes desprovidas de um ou mais polinucleotídeos exógenos, em que cada um dos um ou rnais polinucleotídeos é exógeno à célula, organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente e é operativamente ligado a um promotor que é capaz de dirigir a expressão do polinucleotídeo em uma célula, um organisrno não humano ou uma parte do mesmo, ou de uma semente, respectivamente, e em que os lipídeos apolares compreendem um ácido graxo que compreende um grupo hidroxil, um grupo epoxi, um grupo ciclopropano, uma ligação dupla carbono-carbono, uma ligação tripla carbono-carbono, ligações duplas conjugadas, uma cadeia rarnificada, como uma cadeia ramificada metilada ou hidroxilada, ou uma combinação de dois ou mais do mesmo, ou qualquer de dois, três, quatro, cinco ou seis dos grupos acima mencionados, ligações ou cadeias ramificadas. Tais utilizações também têm utilidade como ensaios de triagem.
[170]Em um oitavo aspecto, a invenção proporciona um processo para produzir sementes, o processo compreendendo: i) cultivar uma planta, várias plantas, ou organismo não humano de acordo com a invenção, e ii) colher sementes da planta, plantas, ou organismo não humano.
[171]Em uma modalidade preferencial, o processo compreende o crescimento de uma população de, pelo menos, cerca de 1000 de tais plantas no campo, e colher sementes a partir da população de plantas. A semente pode ser colocada em urri recipiente e transportada para fora do campo, por exemplo exportada para fora do campo, ou armazenada antes de serem utilizadas.
[172]Em urn nono aspecto, a invenção fornece um processo de fermentação que compreende as etapas de: i) proporcionar um recipiente que contém uma composição líquida que compreende urrt organismo não humano da invenção que é adequada para a fermentação, e componentes necessários para a biossíntese de ácidos graxos e de fermentação, e ii) proporcionar condições favoráveis para a fermentação da composição líquida contida ern dito vaso.
[173]Em um décimo aspecto, a invenção proporciona um lipídeo recuperado ou extraído obtido por um processo da invenção, ou obtido a partir de uma parte da planta vegetativa, organismo não humano ou parte do mesmo, célula ou descendência da célula, planta transgênica ou semente da invenção. O lipídico recuperado ou extraído, preferencialmente óleo, como óleo de sernente, pode ter um teor de TAG aumentado, teor de DAG, teor de TAG e DAG, teor de MAG, o teor de PUFA, teor de PUFA específico, ou um teor de ácido graxo específico e/ou teor total de lipídeos apolares. Erri uma modalidade preferencial, o MAG é 2-MAG. A extensão do teor de TAG aumentado, o teor de DAG, teor de TAG e DAG, teor de MAG, teor de PUFA, teor de PUFA específico, o teor de específico de ácidos graxos e/ou teor total de lipídeos apolares pode ser conforme definido na Característica {i).
[174]Em um décimo primeiro aspecto, a invenção proporciona um produto industrial, produzido por um processo da invenção, preferencialmente, que é um produto de hidrocarboneto, como os ésteres de ácidos graxos, preferencialmente ésteres de metil de ácidos graxos e/ou ésteres etílicos de ácidos graxos, um alcano, como o metano, etano ou um alcano de cadeia mais longa, uma mistura de alcanos de cadeia mais longa, um alqueno, um biocombustível, monóxido de carbono e/ou de gás hidrogênio, um bioálcool, como etanol, propanol, ou butanol, biocarvão, ou urna combinação de rnonóxido de carbono, hidrogênio e biocarvão.
[175]Em um décimo segundo aspecto, a invenção proporciona a utilização de uma planta, parte da planta vegetativa, organismo não humano ou uma parte do mesmo, célula ou célula descendente, planta transgênica produzida por um processo da invenção, ou uma semente ou um lipídeo recuperado ou extraído da invenção na fabricação de um produto industrial. O produto industrial pode ser como definido acima.
[176]Em um décimo terceiro aspecto, a invenção proporciona uin processo para produzir combustível, o processo compreendendo: i) reagir um lipídeo da presente invenção com um álcool, opcionalmente na presença de um catalisador, para produzir os ésteres de alquil, e ii) opcionalmente, misturar os ésteres alquil com combustível à base de petróleo. Os ésteres de alquil são preferencialmente ésteres de metil. O combustível produzido pelo processo pode compreender um nível mínimo de lipídeo da invenção, ou um produto de hidrocarboneto produzido a partir do mesmo, como pelo menos 10%, pelo menos 20%, ou pelo menos 30% em volume.
[177]Em um décimo quarto aspecto, a invenção proporciona um processo para produzir um combustível diesel sintético, o processo compreendendo: i) converter um lipídeo em planta vegetativa, organismo não humano ou parte do mesmo da invenção a um gás de síntese por gaseificação, e ii) converter gás de síntese a um biocombustível utilizando um catalisador de metal ou um catalisador microbiano.
[178]Em um decimo quinto aspecto, a invenção proporciona um processo para produzir um biocombustível, compreendendo o processo de conversão de lipídeo em uma parte da planta vegetativa, organismo não humano ou parte do mesmo da invenção para o bio-óleo por pirólise, um bioálcool por fermentação, ou um biogás por gaseificação ou digestão anaeróbia.
[179]Em um décimo sexto aspecto, a invenção proporciona um processo para produzir um ingrediente alimentar, o processo compreendendo a mistura de urna planta, parte da planta vegetativa da mesma, organismo não humano ou parte do mesmo, células ou célula descendente, planta transgênica produzida por um processo da invenção, sementes, lipídeo recuperado ou extraído, ou um extrato ou parte do mesmo, com pelo menos outro ingrediente alimentar.
[180]Em um décimo sétimo aspecto, a invenção proporciona alimentos para animais, cosméticos ou produtos químicos que compreendem uma planta, parte vegetativa das mesmas, organismo não humano ou parte do mesmo, células ou descendência da célula, planta transgênica produzida por um processo da invenção, semente, ou um lipídeo recuperado ou extraído da invenção, ou um extrato ou porção do mesmo.
[181]Naturalmente, quando o material vegetativo de uma planta deve ser colhido por causa do seu teor de Óleo é desejável colher o material, quando os níveis de lipídeos são tão altos quanto possíveis. Os presentes inventores observaram uma associação entre o brilho do tecido vegetativo das plantas da presente invenção e o teor de óleo, com níveis elevados de lipídeos sendo associados com alto brilho. Assim, o brilho do material vegetativo pode ser usado como marcador para auxiliar na determinação do momento para a colheita do material.
[182]Em outro aspecto, a invenção proporciona uma célula recombinante que compreende um ou mais polinucleotídeos exógenos e um aumento do nível de um ou mais lipídeos apolares em relação a uma célula correspondente desprovida de um ou mais polinucleotídeos exógenos, em que cada um dos um ou mais polinucleotídeos exógenos estão operativamente ligados a um promotor que é capaz de dirigir a expressão do polinucleotídeo em uma célula, e em que um ou mais ou todas as seguintes características aplicam-se: (a) o um ou mais polinucleotídeos exógenos compreendem um primeiro polinucleotídeo exógeno que codifica um fator de transcrição de RNA ou polipeptídeo que aumenta a expressão de um ou mais genes da biossíntese do ácido graxo ou glicolítica ou um organismo não humano ou uma parte do mesmo, e urri segundo polinucleotídeo exógeno que codifica para um RNA ou urri polipeptídeo envolvido na biossíntese de um ou mais lipídeos apolares, {b) se a célula é uma célula de uma parte vegetativa de uma planta, a célula tem um teor de lipídeos apolares total de pelo menos cerca de 3%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 5°5, preferencialmente pelo menos cerca de 7°5, mais preferencialmente pelo menos cerca de 10°:, mais preferencialmente pelo menos cerca de 11%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 12%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 13%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 14%, ou mais preferencialmente pelo menos cerca de 15% (p/p),
(C) a célula é uma alga selecionada a partir do grupo que consiste em diatomáceas (bacillariofitas), algas verdes
(clorófitas), algas azuis-verdes (cianófitas), algas castanho-
dourado (chrysofitas), haptofitas, algas castanhas e algas heterokont,
(d) um ou mais lipídeos apolares compreendem um ácido graxo que compreende um grupo hidroxil, um grupo epoxi, um grupo ciclopropano, uma ligação dupla carbono-carbono, uma ligação tripla carbono-carbono, ligações duplas conjugadas, um cadeia ramificada, como uma cadeia ramificada metilada ou hidroxilada,
ou uma combinação de dois ou mais destes, ou qualquer um dos /
dois, três, quatro, cinco ou seis dos grupos acima referidos, ligações ou cadeias ramificadas, (e) o teor total de ácidos graxos nos lipídeos apolares compreende, pelo menos, 2% mais de ácido oleico e/ou, pelo menos, 2% menos o ácido palmítico do que lipídeos apolares na célula correspondente sem o um ou mais polinucleotídeos exógenos,
(f) lipídeos apolares compreendem um nível modificado de esteróis totais, preferencialmente esteróis livres (não esterificados), ésteres esteroil, glicosídeos esteroil, em relação aos lipídeos apolares na célula correspondente sem o um ou mais polinucleotídeos exógenos,
(g) os lipídeos apolares cornpreendem ceras e/ou de ésteres de cera, e (h) a célula é um membro de uma população ou a coleção de,
pelo menos, cerca de 1000 de tais células.
[183]Ern uma modalidade, o um ou mais polinucleotídeos exógenos corripreendem o primeiro polinucleotídeo exógeno e o segundo polinucleotídeo exógeno, e em que um ou mais ou todas as características (b) a (h) se aplicam.
[184]Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um método para determinar quando a colheita de uma planta otimiza a quantidade de lipídeo no tecido vegetativo da planta na colheita, o método compreendendo i) medir o brilho do tecido vegetativo, ii) comparar a medida com um nível de brilho mínimo predeterminado, e iii) opcionalmente, coletar a planta.
[185]Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um método para prever a quantidade de lipídeo no tecido vegetativo de uma planta, o método compreendendo medir o brilho do tecido vegetativo.
[186]Em uma modalidade preferencial dos dois aspectos acima do tecido vegetativo é uma folha (folhas) ou uma porção da mesma.
[187]Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um método para negociar uma planta ou de parte da mesma, compreendendo obter a planta ou parte que compreende uma célula da invenção, e negociar a planta ou parte da planta obtida por ganho oneroso.
[188]Em uma modalidade, o método compreende ainda um ou mais ou todos de: i) cultivar a planta, ii) a colheita da parte da planta a partir da planta, iii) armazenar a planta ou parte da mesma, ou iv) transportar a planta ou parte da mesma para urn local diferente.
{189]Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um processo para produzir armazéns de partes de plantas compreendendo: a) colher partes de plantas que compreende uma célula da invenção, através da coleta de partes da planta a partir de plantas, ou "eparar as partes da planta a partir de outras partes das plantas, b) opcionalmente, peneirar e/ou ordenar as partes das plantas colhidas, e c) carregar partes da planta de a) ou as partes de plantas peneiradas e/ou classificadas de b) em armazéns, produzindo, assim, armazéns de partes da planta.
[190]Qualquer modelo aqui devem ser tornado para aplicar, mutatis mutandis, a qualquer outra modalidade a menos que especificamente indicado de outra forrna.
[191]A presente invenção não deve ser limitada no escopo pelas rnodalidades específicas aqui descritas, as quais são destinadas para fins de exemplificação apenas. Produtos funcionalrnente equivalentes, composições e métodos são claramente dentro do escopo da invenção, como aqui descrito.
[192]AO longo deste relatório descritivo, a menos que especificamente indicado de outro modo ou que o contexto exija de outra forma, uma referência a urna única etapa, composição de matéria, grupo de etapas ou grupo de composições de matéria será feita para incluir um e uma pluralidade (isto é, uma ou mais) daqueles etapas, composições da matéria, grupos de etapas ou grupo de composições de matéria.
[193]A invenção será a seguir descrita por meio dos seguintes Exemplos não limitantes e com referência às figuras anexas.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS ANEXOS
[194]Fígura 1. Uma representação de várias vias de sintese de lipídeos, a maioria das quais converge e, DAG, uma molécula central na síntese de lipídeos. Este modelo inclui uma possível rota para a formação de sn-2 MAG que pode ser usada por uma MGAT/DGAT bifuncional para formação de DAG a partir de glicerol-
3-fosfato (G-3-P). As abreviaturas são como se segue: G-3-P; glicerol-3-fosfato LysoPA; ácido lisofosfatídico PA; ácido fosfatídico MAG; monoacilglicerol DAG; diacilglicerol TAG; triacilglicerol AC11-CoA e FA-COA; acil-coenzima A e acil-coenzima A graxa PC; fosfatidilcolina GPAT; glicerol-3-fosfato aciltransferase; glicerol-3-fosfato O-aciltransferase; acil-CoA:sn-glicerol-3-fosfato-l-O- aciltransferase; EC 2,3,1,15 GPAT4; glicerol-3-fosfato aciltransferase 4 GPAT6; glicerol-3-fosfato aciltransferase 6 LPAAT; 1-acil-glicerol-3-fosfato aciltransferase; l- acilglicerol-3-fosfato O-aciltransferase; acil-CoA: l-acil-sn- glicerol-3-fosfato 2-O-aciltransferase; EC 2,3,1,51 PAP; ácido fosfatídico fosfatase; fosfatidato fosfatase; ácido fosfático fosfo-hidrolase; ácido fomfatídico fosfatase; EC
3.1.3.4 MGAT; uma aciltransferase tendo atividade de monoacilglicerol aciltransferase (MGAT; 2-acilglicerol O- aciltransferase acil-CoA:2-acilglicerol O-aciltransferase; EC
2.3.1.22 M/DGAT; uma aciltransferase tendo atividade de monoacilglicerol aciltransferase (MGAT; 2-acilglicerol O- aciltransferase; acil-CoA:2-acilglicerol O-aciltransferase; EC
2.3.1.22) e/ou diacilglicerol aciltransferase (DGAT; diacilglicerol O-aciltransferase; acil-CoA: l,2-diacil-sn- glicerol O-aciltransferase; EC 2.3.1.20) LPCAT; acil-CoA:lisofosfatidilcolina aciltransferase; l- acilglicerofosfocolin O-aciltransferase; acil-CoA:l-acil-sn- glicero-3-fosfocolina O-aciltransferase; EC 2.3.1.23 PLD-Z; Fosfolipase D zeta; colina fosfatase; lecitinase D;
lipofosfodiesterase II; EC 3.1.4.4 CPT; CDP-colina:diacilglicerol colinafosfotransferase; l- alquil-2-acetilglicerol colinafosfotransferase; alquilacilglicerol colinafosfotransferase; colinafosfotransferase; fosforilcolina-glicerídeo transferase; EC 2.7.8.2 PDCT; fosfatidilcolina:diacilglicerol colinafosfotransferase PLC; fosfolipase C; EC 3.1.4.3 PDAT; fosfolipídio: diacilglicerol aciltransferase; fosfolipid: 1,2-diacil-sn-glicerol O-aciltransferase; EC
2.3.1.158 Pi; fosfato inorgânico.
[195] Fígura 2. Aumentos de DAG e TAG relativos em tecido de folha de Nicotiana benthamiana transformada com construtos que codificam pi 9 (controle negativo), Arabidopsis thaliana DGATI, Mus musculus MGATI e uma combinação de DGATI e MGATI, cada urn expresso a partir do promotor 35S. A enzima MGATI foi muito mais ativa do que a enzima DGATI na promoção de acúmulo de DAG e TAG no tecido da folha. A expressão do gene MGATI resultou em duas vezes o acúmulo de DAG e TAG, no tecido da folha em comparação corn a expressão de DGATI individualmente.
[196] Fígura 3. Aumentos de TAG relativos em folha de N. benthamiana transformada com construtos que codificam pi 9 (controle nç"gativo), A. thaliana DGATI, M. musculus MGAT2 e uma combinação de MGAT2 e DGATI. As barras de erro indicam o erro padrão das amostras em triplicata.
[197] Fígura 4. A radioatividade (DPM) em frações MAG, DAG e TAG isoladas de lisados de folha de N. benthamiana transformados transitoriamente alimentados com sn-2-MAg[14C] e ácido oleico não marcado ao longo de uni tempo-curso. Os construtos utilizados foram como para a Figura 3.
[198] Fígura 5. Como para a Figura 4, mas alimentado com ["C]G-3-P e ácido oleico não marcado.
[199] Fígura 6. Autorradiograma de placa de TLC que mostra a
92/3'75 formação de TAG por A. thaliana DGATI e M. musculus MGATI, mas não M. musculus MGAT2 em ensaios de levedura. O ensaio é descrito no Exemplo 5.
[200] Fígura 7. Níveis de TAG em sementes T2 e T3 de Arabidopsis thaliana transformadas com um MGAT2 expressando DNA quimérico em relação ao controle parental (não transformado). As sementes foram coletadas em maturidade (dissecadas). SW: peso de semente dessecada. Níveis de TAG são apresentados como µg TAG por 1OOµg peso de semente.
[201] Fígura 8. Teor de ácido graxo total em semente de plantas Arabidopsis thaliana transformadas com construções codificando MGATI ou MGAT2.
[202]Fígura 9. Nível relativo de TAG em tecido de folha de N. benthamiana transformada transitoriamente para super expressão de DGATI de Arabidopsis thaliana.
[203]Figura 10. Conversão de TAG de sn-1,2-DAG em ensaio de DGAT de microssomas de tecidos de folha de N. benthamiana expressando controle P19, DGATI de Arabidopsis thaliana e DGAT2 de Arabidopsis thaliana.
[204] Fígura 11. Quantificação de FAME total em sementes de A. thaliana transformadas com pjP3382 e pjP3383.
[205] Fígura 12. Níveis máximos de TAG obtidos para diferentes combinações de genes transitoriamente expressos em folhas de N. benthamiana. O controle negativo V2 representa o nível médio de TAG baseado em 15 repetições independentes.
[206]F'gura 13. Co-expressão dos genes que codifica para DGATI de Arabidopsis thaliana aciltransferase e fator de transcrição WRII de A. thaliana resultou ein um efeito sinérgico em níveis de TAG em folhas de Nicotiana benthamiana. Os dados mostrados são médias e desvios padrões de cinco infiltrações independentes.
[207] Fígura 14. Níveis de TAG em tecido de plântula aérea de N. benthamiana transformada. Lipídeos totais foram extraídos de tecidos aéreos de plântulas de N. benthamiana e analisados por TLC-FID usando um padrão DAGE para permitir comparação precisa entre amostras.
[208]Fígura 15. Níveis de ácido graxo total de populações de sementes T2 de A. thaliana T2 transformadas com vetor de controle (pORE04), M. musculus MGATI (35S:MGAT1) ou M. musculus MGAT2 (35S:MGAT2).
[209]Fígura 16. Mapa da região de inserção entre as bordas esquerda e direita de pjP3502. TER Glyma-Lectin denota o terminador lectina de Glycine max; Arath-WRI1, região codificadora de fator de transcrição WRII de Arabidopsis thaliana; PRO Arath-Rubisco SSU, promotor de subunidade pequena rubisco de A. thaliana; Sesina-Oleosina, região codificadora de oleosina de Sesame indicum; PRO CaMV35S-Ex2, promotor 35S de vírus de mosaico de couve-flor tendo uma região melhoradora em duplicada; Arath-DGAT1, região codificadora de DGATI aciltransferase de A. thaliana; TER Agrtu-NOS, terminador de nopalina sintase de Agrobacterium tumefaciens.
[210] Fígura 17. Representação esquemática do constructo pjP3503 incluindo a região de inserção entre as bordas esquerda e direita de pjP3503. TER Agrtu-NOS denota o terminador nopalina sintase de Agrobacterium tumefaciens; Musmu-MGAT2, MGAT2 aciltransferase de Mus Musculus; PRO CaMV24S-Ex2, região melhoradora duplicada 35S de vírus de rnosaico da couve-flor; TER Glyma-Lectin, terminador de lectina de Glycine max; Arath-WRI1, fator de transcrição WRII de Arabidopsis thaliana; PRO Arath- Rubisco SSU, promotor de subunidade pequena de rubisco de A. thaliana; Sesina-Oleosina, oleosina de Sesame indicum; Arath- DGATI, DGATI aciltransferase de A. thaliana.
[211] Fígura 18. Rendimentos de TAG em diferentes idades de folhas de três tipos de plantas de tabaco tipo selvagem (wt1-3) e três transformantes primários pjP3503 (4, 29, 21). Estágios de folha são indicados por 'G', verde; 'YG', amarelo-verde; 'Y', amarelo. Estágios de planta durante amostragern foram em botão, tipo selvagem 1; primeiras flores aparecendo, tipo selvagem 2;
floração, tipo selvagem 3; produzindo vagens de sementes (transformantes pjP3503).
[212] Fígura 19A. Inserto de DNA contendo cassetes de expressão para a DGAT2A de Umbelopsis ramanniana expressa pelo promotor debat-conglicinina subunidade alfa de Glycine max, WRll de Arabidopsis thaliana expresso pelo promotor 3 inibidor de tripsina kunitz de Glycine max e o MGAT2 de Mus musculus expresso pelo promotor de beta-conglicinina subunidade alfa de Glycine max. Regiões codificadores de gene e cassetes de expressão são coletáveis por digestão de restrição.
[213] Fígura 19B. Inserto de DNA contendo cassetes de expressão para LEC2 de Arabidopsis thaliana e genes de fator de transcrição WRII expressos por promotores alcA de Aspergillus induzíveis, o DGATI de Arabidopsis thaliana expresso pelo promotor CaMV-35S constitutivo e o gene alcR de A"pergillus expresso pelo promotor CSVMV constitutivo. A expressão de fatores de transcrição LEC2 e WRII é induzida por etanol ou um composto análogo.
[214] Fígura 20. Mapa de pjP3507.
[215] Fígura 21. Mapa de pjP3569.
LEGENDA PARA A LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS SEQ ID NO:MGATI códon otimizada para Mus musculus SEQ ID NO:2 MGAT2 códon otimizada para Mus musculus SEQ ID NO:3 MGATI códon otimizada para Ciona intestinalis SEQ ID NO:4 MGATI códon otimizada para Tribolium castaneum SEQ ID NO:5 MGATI códon otimizada para Danio rerio SEQ ID NO:6 MGAT2 Danio códon otimizada para Danio rerio SEQ ID NO:7 polinucleotídeo MGATI de Homo sapiens (AF384163) SEQ ID NO:8 polinucleotídeo MGATI de Mus musculus (AF384162) SEQ ID NO:9 variante de transcrito de polinucleotídeo MGATI para Pan troglodytes (XMO01166055) SEQ ID NO:lO variante 2 de transcrito de polinucleotídeo MGATI para"Pan troglodytes 2 (XM_0526044.2) SEQ ID NO:ll polinucleotídeo MGATI para Canis familiaris
(XM 545667.2)
SEQ ID NO:12 polinucleotídeo MGATI para Bos taurus
(NM 001001153.2)
SEQ ID NO:13 polinucleotídeo MGATI para Rattus norvegicus
(NM 001108803.1)
SEQ ID NO:14 polinucleotídeo MGATI para Danio rerio
(NM 001122623.1)
SEQ ID NO:15 polinucleotídeo MGATI para - Caenorhabditis elegans (NM 073012.4)
SEQ ID NO:16 polinucleotídeo MGATI para Caenorhabditis elegans (NM 182380.5)
SEQ ID NO:17 polinucleotídeo MGATI para Caenorhabditis elegans (NM 065258.3)
SEQ ID NO:18 polinucleotídeo MGATI para Caenorhabditis elegans (NM 075068.3)
SEQ ID NO:19 polinucleotídeo MGATI para Caenorhabditis elegans (NM 072248.3)
SEQ ID NO:20 polinucleotídeo MGATI para Kluyveromyces lactis
(XM 455588.1)
SEQ ID NO:21 polinucleotídeo MGATI para Ashbya gossypii
(NM 208895.1)
SEQ ID NO:22 polinucleotídeo MGATI para Magnaporthe oryzae
{XM 368741.1)
SEQ ID NO:23 polinucleotídeo MGATI para Ciona intestinalis
(XM 002120843.1)
SEQ ID NO:24 Homo sapiens polinucleotídeo MGAT2 (AY157608)
SEQ ID NO:25 polinucleotídeo MGAT2 para Mus musculus
(AY157609)
SEQ ID NO:26 polinucleotídeo MGAT2 para Pan troglodytes
(XM 522112.2)
SEQ ID NO:27 polinucleotídeo MGAT2 para Canis familiaris
(XM 542304.1)
SEQ ID NO:28 polinucleotídeo MGAT2 para Bos taurus
(NM 001099136.1)
SEQ ID NO:29 polinucleotídeo MGAT2 para Rattus norvegicus (NM 001109436.2) SEQ ID NO:30 polinucleotídeo MGAT2 para Gallus gallus (XM 424082.2) SEQ ID NO:31 polinucleotídeo MGAT2 para Danio rerio (NM 001006083.1) SEQ ID NO:32 polinucleotídeo MGAT2 para Drosophila melanogaster (NM 136474.2) SEQ ID NO:33 polinucleotídeo MGAT2 para Drosophila melanogaster (NM 136473.2) SEQ ID NO:34 polinucleotídeo MGAT2 para Drosophila melanogaster (NM 136475.2) SEQ ID NO:35 polinucleotídeo MGAT2 para Anopheles gambiae (XM 001688709.1) SEQ ID NO:36 polinucleotídeo MGAT2 para Anopheles gambiae (XM 315985) SEQ ID NO:37 polinucleotídeo MGAT2 para Tribolium castaneum (XM 970053.1) SEQ ID NO:38 Homo sapiens MGAT3 polinucleotídeo (AY229854) SEQ ID NO:39 variante 1 de transcrito de polinucleotídeo MGAT3 para Pan troglodytes (XM 001154107.1)
SEQ ID NO:40 variante 2 de transcrito de polinucleotídeo MGAT3 para Pan troglodytes {XM 001154171.1) SEQ ID NO:41 variante 3 de transcrito de polinucleotídeo MGAT3 para Pan troglodytes (XM 527842.2) SEQ ID NO:42 polinucleotídeo MGAT3 para Canis familiaris (XM 845212.1) SEQ ID NO:43 polinucleotídeo MGAT3 para Bos taurus (XM 870406.4) SEQ ID NO:44 polinucleotídeo MGAT3 para Danio rerio (XM 688413.4) SEQ ID NO:45 polipeptídeo MGATI de Homo sapiens (AAK84178.1)
SEQ ID NO:46 polipeptídeo MGATI para Mus musculus (AAK84177.1)
SEQ ID NO:47 isoforma 1 de polipeptídeo MGATI para Pan troglodytes {XP 001166055.1) SEQ ID NO:48 isoforma 2 de polipeptídeo MGATI para Pan troglodytes (XP 526044.2)
SEQ ID NO:49 polipeptídeo MGATI para Canis familiaris (XP 545667.2)
SEQ ID NO:50 polipeptídeo MGATI para Bos taurus (P 001001153.1)
SEQ ID NO:51 polipeptídeo MGATI para Rattus norvegicus {NP 001102273.1) SEQ ID NO:52 polipeptídeo MGAT1 para Danio rerio (P 001116095.1) SEQ ID 0:53 polipeptídeo MGATI para Caenorhabditis elegans (NP 505413.1) SEQ ID NO:54 polipeptídeo MGATI para Caenorhabditis elegans (NP 872180.1) SEQ ID NO:55 polipeptídeo MGATI para Caenorhabditis elegans (NP 497659.1) SEQ ID NO:56 polipeptídeo MGATI para Caenorhabditis elegans (NP 507469.1) SEQ ID NO:57 polipeptídeo MGATI para Caenorhabditis elegans (NP 504649.1) SEQ ID NO:58 polipeptídeo MGATI para Kluyveromyces lactis (XP 455588.1) SEQ ID NO:59 polipeptídeo MGATI para Ashbya gossypii (NP 983542.1) SEQ ID NO:60 polipeptídeo MGATI para Magnaporthe oryzae (XP J368741.1) SEQ ID NO:61 polipeptídeo MGATI para Ciona intestinalis (XP 002120879) SEQ ID NO:62 polipeptídeo Homo MGAT2 para sapiens (AA023672.1)
SEQ ID NO:63 polipeptídeo MGAT2 para Mus musculus (AA023673.1)
SEQ ID NO:64 polipeptídeo MGAT2 para Pan troglodytes
(XP 522112.2)
SEQ ID NO:65 polipeptídeo MGAT2 para Canis familiaris
(XP 542304.1)
SEQ ID NO:66 polipeptídeo MGAT2 para Bos taurus
(P 001092606.1)
SEQ ID NO:67 polipeptídeo MGAT2 para Rattus norvegicus
(NP 001102906.2)
SEQ ID NO:68 polipeptídeo MGAT2 para Gallus gallu.s
(XP 424082.2)
SEQ ID NO:69 polipeptídeo MGAT2 para Danio reria
(P 001006083.1)
SEQ ID NO:70 polipeptídeo MGAT2 para Drosophila melanogaster
(NP 610318.1)
SEQ ID NO:71 polipeptídeo MGAT2 para Drosophila melanogaster
(NP 61031'7.1) — SEQ ID NO:72 polipeptídeo MGAT2 para Drosophila melanogaster
(NP 610319.1)
SEQ ID NO:73 polipeptídeo MGAT2 para Anopheles gambiae (
(XP 001688761)
SEQ ID NO:74 polipeptídeo MGAT2 para Anopheles gambiae (XP_315985.3)
SEQ ID NO:75 polipeptídeo MGAT2 para Tribolium castaneum (XP 975l46)
SEQ ID NO:76 polipeptídeo MGAT3 para Ho.mo sapiens (AA063579.1)
SEQ ID NO:77 isoforma 1 de polipeptídeo MGAT3 para Pan troglodytes para (XP 001154107.1)
SEQ ID NO:78 isoforma 1 de polipeptídeo MGAT3 para Pan troglodytes (XP 001154171.1)
SEQ ID NO:79 isoforma 3 de MGAT3 para Pan troglodytes (XP 527842.2)
SEQ ID NO:80 polipeptídeo MGAT3 para Pan troglodytes (XP 850305.1)
SEQ ID NO:81 polipeptídeo MGAT3 para Bos taurus (XP 875499.3) SEQ ID NO:82 polipeptídeo MGAT3 para Danio rerio (XP 693505.1) SEQ ID NO:83 polipeptídeo DGATI para Arabidopsis thaliana (CAB44774.1) SEQ ID NO:84 polinucleotídeo GPAT4 Arabidopsis thaliana (NM 100043.4) SEQ ID NO:85 polinucleotídeo GPAT6 Arabidopsis thaliana (NM 129367.3) SEQ ID NO:86 polinucleotídeo GPAT Arabidopsis thaliana (AF195115.1) SEQ ID NO:87 polinucleotídeo de GPAT Arabidopsis thaliana (AY062466.1) SEQ ID NO:88 polinucleotídeo GPAT para Oryza sativa (AC118133.4) SEQ ID NO:89 polinucleotídeo GPAT para Picea sitchensis (EF086095.1) SEQ ID NO:90 polinucleotídeo GPAT de Zea mays (BT067649.1) SEQ ID NO:91 polinucleotídeo GPAT para Arabidopsis thaliana (AK228870.1) SEQ ID NO:92 polinucleotídeo GPAT para Oryza sativa (AK241033.1) SEQ ID NO:93 polinucleotídeo de cromossorno 2 para Oryza sativa (CMOO0127.1) SEQ ID ,NO:94 polinucleotídeo GPAT para Oryza sativa (CMOO0130.1) SEQ ID NO:95 polinucleotídeo GPAT para Oryza sativa (CMOO0139.1) SEQ ID NO:96 polinucleotídeo GPAT para Oryza sativa (CMOO0126.1) SEQ ID NO:97 polinucleotídeo GPAT para Oryza sativa (CMOO0128.1) SEQ ID NO:98 polinucleotídeo GPAT para Oryza sativa
(CMOO0140.1)
SEQ ID NO:99 polinucleotídeo GPAT para Selaginella moellendorffii (GL377667.2)
SEQ ID NO:lOO polinucleotídeo GPAT para Selaginella moellendorffii (GL377667.2)
SEQ ID NO:lOl polinucleotídeo GPAT para Selaginella moellendorffii (GL377648.1)
SEQ ID NO:102 polinucleotídeo GPAT para Selaginella moellendorffii (GL377622.1)
SEQ ID NO:103 polinucleotídeo GPAT para Selaginella moellendorffii (GL377590.1)
SEQ ID NO:104 polinucleotídeo GPAT para Selaginella moellendorffii (GL377576.1)
SEQ ID NO:105 polinucleotídeo GPAT para Selagir.ella moellendorffii (GL377576.1)
SEQ ID NO:106 polinucleotídeo GPAT para Oryza sativa
(NM_O01051374.2)
SEQ ID NO:107 polinucleotídeo GPAT para Oryza sativa
(NM 001052203.1)
SEQ ID NO:108: polinucleotídeo GPAT8 pai Zea mays
(NM 001153970.1)
SEQ ID NO:109: polinucleotídeo GPAT para Zea mays
(NM_O01155835.1)
SEQ ID NO:llO: polinucleotídeo GPAT para Zea mays
(NM 001174880.1)
SEQ ID NO:111 polinucleotídeo GPAT4 para Brassica napus
{JQ666202.1)
SEQ ID NO:112 polinucleotídeo GPAT8 para Arabidopsis thaliana (NM 116264.5)
SEQ ID NO:113 polinucleotídeo GPAT para Physcomitrella patens (XM_O01764949.2)
SEQ ID NO:114 polinucleotídeo GPAT para Physcomitrella patens (XM 001769619.1)
SEQ ID NO:115 polinucleotídeo GPAT para Physcomitrella patens (XM 001769672.1) SEQ ID NO:116 polinucleotídeo GPAT para Physcomitrella patens (XM 001771134.1) SEQ ID NO:117 polinucleotídeo GPAT para Physcomitrella patens (XM 001780481.1) SEQ ID NO:118 polinucleotídeo GPAT para Vitis Vinifera (XM 002268477.2) SEQ ID NO:119 polinucleotídeo GPAT para Vitis Vinifera (XM_002275312.1) SEQ ID NO:120 polinucleotídeo GPAT para vitis Vinifera (XM_002275996.1) SEQ ID NO:121 polinucleotídeo GPAT para vitis Vinifera (XM 002279055.1) — SEQ ID NO:122 polinucleotídeo GPAT para Populus trichocarpa (XM_002309088.1) SEQ ID NO:123 polinucleotídeo GPAT para Populus trichocarpa (XM_002309240.1) SEQ ID NO:124 polinucleotídeo GPAT para Populus trichocarpa (XM 002322716.1) SEQ ID NO:125 polinucleotídeo GPAT para Populus trichocarpa (XM 002323527.1) SEQ ID NO:126 polinucleotídeo GPAT para Sorghum bicolor (XM_002439842.1) SEQ ID NO:127 polinucleotídeo GPAT para Sorghum bicolor (XM 002458741.1) — SEQ ID NO:128 polinucleotídeo GPAT para Sorghum bicolor (XM 002463871.1) SEQ ID NO:129 polinucleotídeo GPAT para Sorghum bicolor
(XM 002464585.1) SEQ ID NO:130 polinucleotídeo GPAT para Ricinus communis aciltransferase (XM 002511827.1) SEQ ID NO:131 polinucleotídeo GPAT para Ricinus communis
(XM 002517392.1) SEQ ID NO:132 polinucleotídeo GPAT para Ricinus communis
(XM 002520125.1)
SEQ ID NO:133 polinucleotídeo GPAT para Arabidopsis lyrata (XM 002872909.1) SEQ ID NO:134 polinucleotídeo GPAT6 para Arabidopsis lyrata
(XM 002881518.2)
SEQ ID NO:135 polinucleotídeo GPAT8 para Vernicia fordii putativo (FJ479753.2)
SEQ ID NO:136 polinucleotídeo GPAT para Oryza sativa (NM_O01057724.2)
SEQ ID NO:137 polinucleotídeo GPAT4 para Brassica napus (JQ666203.1)
SEQ ID NO:138 polinucleotídeo GPAT para Populus trichocarpa
(XM 002320102.1)
SEQ ID NO:139 polinucleotídeo GPAT para Sorghum bicolor (XM_002451332.1)
SEQ ID NO:140 polinucleotídeo GPAT para Ricinus communis (XM 002531304.1) — SEQ ID NO:141 polinucleotídeo GPAT4 para Arabidopsis lyrata
(XM_002889315.1)
SEQ ID NO:142 polinucleotídeo GPAT 1 para Arabidopsis thaliana (NM 100531.2) — SEQ ID NO 143 polinucleotídeo GPAT3 para Arabidopsis thaliana (NM 116426.2)
SEQ ID NO:144 polipeptídeo GPAT4 para Arabidopsis thaliana (NP 171667.1)
SEQ ID NO:145 polipeptídeo GPAT6 para Arabidopsis thaliana (NP 181346.1)
SEQ ID NO:146 polipeptídeo GPAT Arabidopsis thaliana F5I10.4
(AAF02784. 1)
SEQ ID NO:147 polipeptídeo GPAT para Arabidopsis thaliana (AAL32544.1) SEQ ID NO:148 polipeptídeo GPAT Oryza sativa (AAP03413.1)
SEQ ID NO:149 polipeptídeo GPAT para Picea sitchensis (ABK25381.1) \
SEQ ID NO:150 polipeptídeo GPAT para Zea mays (ACN34546.1)
SEQ NO ID: 151 polipeptídeo GPAT para Arabidopsis thaliana de (BAFO0762.1) SEQ ID NO:152 polipeptídeo GPAT para Oryza sativa (BAHO0933.1) SEQ ID NO:153 polipeptídeo GPAT para Oryza sativa (EAY84189.1) SEQ ID NO:154 polipeptídeo GPAT para Oryza sativa (EAY98245.1) SEQ ID NO:155 polipeptídeo GPAT para Oryza sativa (EAZ21484.1) SEQ ID NO:156 polipeptídeo GPAT para Oryza sativa (EEC71826.1) SEQ ID NO:157 polipeptídeo GPAT para Oryza sativa (EEC76137.1) SEQ ID NO:158 polipeptídeo GPAT para Oryza sativa (EEE59882.1) SEQ ID NO:159 polipeptídeo GPAT para Selaginella moellendorffii (EFJ08963.1) SEQ ID NO:160 polipeptídeo GPAT para Selaginella moellendorffii (EFJ08964.1) SEQ ID NO:161 polipeptídeo GPAT para Selaginella moellendorffii (EFJ11200.1) SEQ ID NO:162 polipeptídeo GPAT para Selaginella moellendorffii (EFJ15664.1) SEQ ID NO:163 polipeptídeo GPAT para Selaginella moellendorffii (EFJ24086.1) SEQ ID NO:164 polipeptídeo GPAT para Selaginella moellendorffii (EFJ29816.1)
. SEQ ID NO:165 polipeptídeo GPAT para Selaginella moellendorffii (EFJ29817.1) SEQ ID NO:166 polipeptídeo GPAT para Oryza sativa (NP 001044839.1) SEQ ID NO:167 polipeptídeo GPAT para Oryza sativa (NP
001045668.1) SEQ ID NO:168 polipeptídeo GPAT 8 para Zea mays (NP 001147442.1) SEQ ID NO:169 polipeptídeo GPAT para Zea mays (NP
001149307.1) SEQ ID NO:170 polipeptídeo GPAT de proteína para Zea mays (NP 001168351.1) SEQ ID NO:171 polipeptídeo GPAT4 para Brassica napus (AFH02724.1) SEQ ID NO:172 polipeptídeo GPAT8 para Arabidopsis thaliana (NP 191950.2) SEQ ID NO:173 polipeptídeo GPAT para Physcomitrella patens (XP 001765001.1) SEQ ID NO:174 polipeptídeo GPAT para Physcomitrella patens (XP 001769671.1) SEQ ID NO:175 polipeptídeo GPAT para Physcomitrella patens (XP 001769724.1) SEQ ID NO:176 polipeptídeo GPAT para Physcomitrella patens (XP 001771186.1) SEQ ID NO:177 polipeptídeo GPAT para Physcomitrella patens {XP 001780533.1) SEQ ID NO:178 polipeptídeo GPAT para Vitis vinifera (XP 002268513.1) SEQ ID NO:179 polipeptídeo GPAT para vitis vinifera (XP 002275348.1) SEQ ID NO:180 polipeptídeo GPAT para vitis Vinifera {XP 002276032.1) SEQ ID NO:181 polipeptídeo GPAT para Vitis Vinifera (XP 002279091.1) SEQ ID NO:182 polipeptídeo GPAT para Populus trichocarpa (XP 002309124.1) SEQ ID NO:183 polipeptídeo GPAT para Populus trichocarpa (XP 002309276.1) SEQ ID NO:184 polipeptídeo GPAT para Populus trichocarpa
(XP 002322752.1) SEQ ID NO:185 polipeptídeo GPAT para Populus trichocarpa (XP 002323563.1) SEQ ID NO:186 polipeptídeo GPAT para Sorghum bicolor (XP 002439887.1) SEQ ID NO:187 polipeptídeo GPAT para Sorghum bicolor (XP 002458786.1) SEQ ID NO:188 polipeptídeo GPAT para Sorghum bicolor (XP 002463916.1) SEQ ID NO:189 polipeptídeo GPAT para Sorghum bicolor (XP_002464630.1) SEQ ID NO:190 polipeptídeo GPAT Ricinus communis (XP 002511873.1) SEQ ID NO:191 polipeptídeo GPAT Ricinus communis (XP 002517438.1) SEQ ID NO:192 polipeptídeo GPAT Ricinus communis (XP 002520171.1) SEQ ID NO:193 polipeptídeo GPAT para Arabidopsis lyrata (XP 002872955.1) SEQ ID NO:194 polipeptídeo GPAT6 para Arabidopsis lyrata (XP 002881564.1) — SEQ ID NO:195 polipeptídeo GPAT para Vernicia fordii (ACT32032.1) SEQ ID NO:196 polipeptídeo GPAT para Oryza sativa (NP 001051189.1) SEQ ID NO:197 polipeptídeo GPAT4 para Brassica napus (NP 171667.1) SEQ ID NO:198 polipeptídeo GPAT para Populus trichocarpa (XP 002320138.1) SEQ ID NO:199 polipeptídeo GPAT para Sorghum bicolor (XP 002451377.1) SEQ ID NO:200 polipeptídeo GPAT Ricinus communis (XP 002531350.1) SEQ ID NO:201 polipeptídeo GPAT4 de Arabidopsis thaliana
(XP 002889361.1)
SEQ ID NO:202 polipeptídeo GPATI de Arabidopsis thaliana
{NP 563768.1)
SEQ ID NO:203 polipeptídeo GPAT3 de Arabidopsis thaliana
(NP 192104.1)
SEQ ID NO:204 polipeptídeo DGAT2 de Arabidopsis thaliana
(NM 115011.3)
SEQ ID NO:205 polipeptídeo DGAT2 de Ricinus communis
(AY916129.1)
SEQ ID NO:206 polipeptídeo DGAT2 de Vernica fordii
(DQ356682.1)
SEQ ID NO:207 polipeptídeo DPAT2 de Mortierella ramanniana
(AF391089.1)
SEQ ID NO:208 polipeptídeo DGAT2 de Homo sapiens
(NM 032564.1)
SEQ ID NO:209 polipeptídeo DGAT2 de Homo sapiens
(NM 00103579.2)
SEQ ID NO:210 polipeptídeo DGAT2 de Bos taurus (NM 205793.2)
SEQ ID NO:211 polipeptídeo DGAT2 de Mus musculus
(AF384160.1)
SEQ ID NO:212 polipeptídeo DGAT2 de Arabidopsis thaliana
(NI? 566952.1)
SEQ ID NO:213 polipeptídeo DGAT2 de Ricinus communis
{AAY16324.1)
SEQ ID NO:214 polipeptídeo DGAT2 de Vernicia fordii
(ABC94474.1)
SEQ ID NO:215 polipeptídeo DGAT2 de Mortierella ramanniana
(AAK84179.1)
SEQ ID NO:216 polipeptídeo DGAT2 de Homo sapiens (Q96PD7.2)
SEQ ID NO:217 polipeptídeo DGAT2 de Homo sapiens (Q58HT5.1)
SEQ ID NO:218 polipeptídeo DGAT2 de Bos taurus (Q70VZ8.1)
SEQ ID NO:219 polipeptídeo DGAT2 de Mus musculus
(AAK84175.1)
SEQ ID NO:220 motivo de sequência conservada DGAT2 e/ou
MGAT1/2FP-tripeptídeo SEQ ID NO:221 rnotivo de sequência conservada DGAT2 e/ou MGAT1/2 - HPHG tetrapeptídeo SEQ ID NO:222 motivo de sequência conservada de planta DGAT2 - EPHS tetrapeptídeo SEQ ID NO:223 RXGFX(K/R)XAXXXGXXX(L/V)VPXXXFG(E/Q) - motivo de sequência conservada longa de DGAT2 que é parte do domínio de glicerol fosfolipídio putativo SEQ ID NO:224 FLXLXXXN - motivo de sequência conservada de camundongo DGAT2 e MGAT1/2 que é um domínio de ligação de lipídeo neutro putativo SEQ ID NO:225 domínio plsC aciltransferase (PFO1553) de GPAT SEQ ID NO:226 domínio da superfamília de GPAT de hidrolase tipo HAD {PF12710) SEQ ID NO:227 domínio de Fosfoserina fosfatase (PFO0702).
GPAT4-8 contém urna região homóloga N-terminal deste domínio SEQ ID NO:228 sequência de aminoácido conservada GPAT
GDLVICPEGTTCREP SEQ ID NO:229 sequência de aminoácido conservada GPAT/fosfatase (Motivo I) SEQ ID NO:230 sequência de aminoácido conservada GPAT/fosfatase (Motivo III).
SEQ ID NO:231 polinucleotídeo WRII para Arabidopsis thaliana (NM 202701.2) SEQ ID NO:232 polinucleotídeo WRII para Arabidopsis thaliana (NM 001035780.2) SEQ ID NO:233 polinucleotídeo Arabidopsis thaliana WRII (NM 115292.4) SEQ ID NO:234 polinucleotídeo para Arabidopsis lyrata subsp.
lyrata (XM 002876205.1) SEQ ID NO:235 polinucleotídeo WRII para Brassica napus (DQ370141.1) SEQ ID NO:236 polinucleotídeo WRII para Brassica napus (HM370542.1)
SEQ ID NO:237 polinucleotídeo WRII para Glycine max (XM 003530322.1) SEQ ID NO:238 polinucleotídeo WRII para jatropha curcas (JF703666.1) SEQ ID NO:239 polinucleotídeo WRII para Ricinus communis (XM 002525259.1) SEQ ID NO:240 polinucleotídeo WRII para Populus trichocarpa (XM_002316423.1) SEQ ID NO:241 polinucleotídeo WRII para Brachypodium distachyon XM 003578949.1) SEQ ID NO:242 polinucleotídeo WRII para Hordeum vulgare subsp. vulgare (AK355408.1) SEQ ID NO:243 polinucleotídeo WRII para Sorghum bicolor (XM 002450149.1)
SEQ ID NO:244 polinucleotídeo WRII para Zea mays (EU960249.1)
SEQ ID NO:245 polinucleotídeo WRII para Brachypodium distachyon (XM 003561141.1) SEQ ID NO:246 polinucleotídeo WRII para Sorghum bicolor (XM 002437774.1) SEQ ID NO:247 polinucleotídeo WRII para Sorghum bicolor (XM_002441399.1) SEQ ID NO:248 polinucleotídeo WRII para Glycine max (XM 003530638.1) SEQ ID NO:249 polinucleotídeo WRII para Glycine max (XM 003553155.1) SEQ ID NO:250 polinucleotídeo WRII para Populus trichocarpa {XM 002315758.1)
SEQ ID NO:251 polinucleotídeo WRII para Vitis vinifera (XM 002270113.1) SEQ ID NO:252 polinucleotídeo WRII para Glycine max (XM 003533500.1)
SEQ ID NO:253 polinucleotídeo WRII para Glycine max (XM 003551675.1)
SEQ ID NO:254 polinucleotídeo WRII para Nedicago truncatula (XM 003621069.1) SEQ ID NO:255 polinucleotídeo WRII para Populus trichocarpa (XM 002323800.1) SEQ ID NO:256 polinucleotídeo WRII para Ricinus communis (XM 002517428.1) SEQ ID NO:257 polinucleotídeo WRII para Brachypodium distachyon (XM 003572188.1) SEQ ID NO:258 polinucleotídeo WRII para Sorghum bicolor (XM 002444384.1) SEQ ID NO:259 polinucleotídeo WRII para Zea mays (NM 001176888.1) SEQ ID NO:260 polinucleotídeo WRII para Arabidopsis lyrata subsp. lyrata (XM_002889219.1) SEQ ID NO:261 polinucleotídeo WRII para Arabidopsis thaliana (NM 106619.3) — SEQ ID NO:262 polinucleotídeo WRII para Arabidopsis lyrata subsp. lyrata (XM 002890099.1) SEQ ID NO:263 polinucleotídeo WRII para Thellungiella halophila (AK352786.1) SEQ ID NO:264 polinucleotídeo WRII para Arabidopsis thaliana (NM_101474.2)
SEQ ID NO:265 polinucleotídeo WRII para Glycine max (XM 003530302.1) — SEQ ID NO:266 polinucleotídeo WRII para Brachypodium distachyon (XM 003578094.1)
SEQ ID NO:267 polinucleotídeo WRll para Sorghum bicolor (XM 002460191.1)
SEQ ID NO:268 polinucleotídeo WRII para Zea mays (NM 001152866.1) SEQ ID NO:269 polinucleotídeo WRII para Glycine max (XM 003519119.1)
SEQ ID NO:270 polinucleotídeo WRII para Glycine max (XM 003550628.1)
SEQ ID NO:271 polinucleotídeo WRII para Medicago truncatula (XM 003610213.1) SEQ ID NO:272 polinucleotídeo WRII para Glycine max (XM 003523982.1) SEQ ID NO:273 polinucleotídeo WRII para Glycine max (XM003525901.1) SEQ ID NO:274 polinucleotídeo WRII para Populus trichocarpa (XM_0023250Í75.1)
SEQ ID NO:275 polinucleotídeo WRII para Vitis vinifera (XM 002273010.2) SEQ ID NO:276 polinucleotídeo WRII para Populus trichocarpa (XM 002303830.1) SEQ ID NO:277 sequência parcial de polinucleotídeo WRII para Lupinis angustifolius (NA-080818 Plate14f06.b1)
SEQ ID NO:278 polinucleotídeo WRII para Lupinis angustifolius SEQ ID NO:279 polinucleotídeo WRII para Arabidopsis thaliana (A8MS57) SEQ ID NO:280 polinucleotídeo WRII para Arabidopsis thaliana (Q6X5Y6) SEQ ID NO:281 polipeptídeo WRII para Arabidopsis lyrata subsp. lyrata (XP 002876251.1) SEQ ID NO:282 polipeptídeo WRII para Brassica napus (ABD16282.1) SEQ ID NO:283 polipeptídeo WRII para Brassica napus (ADO16346.1) SEQ ID NO:284 polipeptídeo WRII para Glycine max (XP 003530370.1) SEQ ID NO:285 polipeptídeo WRII para jatropha curcas (AEO22131.1) SEQ ID NO:286 polipeptídeo WRII para Ricinus communis (XP 002525305.1) SEQ ID NO:287 polipeptídeo WRII para Populus trichocarpa (XP 002316459.1)
SEQ ID NO:288 Vitis polipeptídeo WRII para vinifera (CBI29147.3) SEQ ID NO:289 polipeptídeo WRII para Brachypodium distachyon (XP 003578997.1) SEQ ID NO:290 polipeptídeo WRII para Hordeum vulgare subsp. vulgare (BAJ86627.1) SEQ ID NO:291 polipeptídeo WRII para Oryza sativa (EAY79792.1) SEQ ID NO:292 polipeptídeo WRII para Sorghum bicolor (XP_002450194.1) SEQ ID NO:293 polipeptídeo WRII para Zea mays (ACG32367.1) SEQ ID NO:294 polipeptídeo WRII para Brachypodium distachyon (XP_003561189.1) SEQ ID NO:295 polipeptídeo WRII para Brachypodium sylvaticum (ABL85061.1) SEQ ID NO:296 polipeptídeo WRII para Oryza sativa (BAD68417.1) SEQ ID NO:297 polipeptídeo WRII para Sorghum bicolor (XP_002437819.1) SEQ ID NO:298 polipeptídeo WRII para Sorghum bicolor (XP 002441444.1) SEQ ID NO:299 polipeptídeo WRII para Glycine max (XP 003530686.1) SEQ ID NO:300 polipeptídeo WRII para Glycine max (XP 003553203.1) SEQ ID NO:301 polipeptídeo WRíl para Populus trichocarpa (XP 002315794.1) SEQ ID NO:302 polipeptídeo WRII para Vitis vinifera (XP 002270149.1) SEQ ID NO:303 polipeptídeo WRII para Glycine max (XP 003533548.1) SEQ ID NO:304 polipeptídeo WRII para Glycine max (XP 003551723.1) SEQ ID NO:305 polipeptídeo WRII para Medicago truncatula
112/3"/5
(XP 003621117.1) SEQ ID NO:306 polipeptídeo WRII para Populus trichocarpa (XP 002323836.1) SEQ ID NO:307 polipeptídeo WRII para Ricinus communis (XE? 002517474.1) SEQ ID NO:308 polipeptídeo WRII para Vitis vinifera (CAN79925.1) SEQ ID NO:309 polipeptídeo WRII para Brachypodium distachyon (XP 003572236.1) SEQ ID NO:310 polipeptídeo WRII para Oryza sativa (BAD10030.1) SEQ ID NO:311 polipeptídeo 'NRII para Sorghum bicolor (XP 002444429.1) SEQ ID NO:312 Zea mays WRII polypeptide (NP 001170359.1) SZQ ID NO:313 polipeptídeo WRII para Arabidopsis lyrata subsp. lyrata (XP 002889265.1) SEQ ID NO:314 polipeptídeo WRII para Arabidopsis thaliana (AAF68121.1) SEQ ID NO:315 polipeptídeo WRII para Arabidopsis thaliana (NP 178088.2) SEQ ID NO:316 polipeptídeo WRII para Arabidopsis lyrata subsp. lyrata (XP 002890145.1) SEQ ID NO:317 polipeptídeo WRII para Thellungiella halophila (BAJ33872.1) SEQ ID NO:318 polipeptídeo WRII para Arabidopsis thaliana (NP 563990.1) SEQ ID NO:319 polipeptídeo WRII para Glycine max {XP 003530350.1) SEQ ID NO:320 polipeptídeo WRII para Brachypodium distachyon (XP 003578142.1) SEQ ID NO:321 polipeptídeo WRII para Oryza sativa (EAZ09147.1) SEQ ID NO:322 polipeptídeo WRII para Sorghum bicolor (XP 002460236.1)
SEQ ID NO:323 polipeptídeo WRII para Zea mays (NP 001146338.1) SEQ ID NO:324 polipeptídeo WRII para Glycine max (XP 003519167.1)
SEQ ID NO:325 polipeptídeo WRII para Glycine max (XP 003550676.1)
SEQ ID NO:326 polipeptídeo WRII para Medicago truncatula {XP 003610261.1) SEQ ID NO:327 polipeptídeo WRII para Glycine max {XP 003524030.1)
SEQ ID NO:328 polipeptídeo WRII para Glycine max (XP 003525949.1) SEQ ID NO:329 polipeptídeo WRII para Populus trichocarpa (XP 002325111.1) SEQ ID NO:330 polipeptídeo WRII para Vitis vinifera (CBI36586.3)
SEQ ID NO:331 polipeptídeo WRII para vitis vinifera (XP 002273046.2)
SEQ ID NO:332 polipeptídeo WRII para Populus trichocarpa (XP 002303866.1)
SEQ ID NO:333 polipeptídeo WRII para Vitis vinifera (CBI25261.3) SEQ ID NO:334 Sorbi-WRL1 SEQ ID NO:335 Lupan-WRL1 SEQ ID NO:336 R1CCO-WRL1 SEQ ID NO:337 polipeptídeo WRII para Lupin angustifolius
SEQ ID NO:338 polinucleotídeo DGAT para Aspergillus fumigatus (XM 750079.1)
SEQ ID NO:339 polinucleotídeo DGAT para Ricinus communis (AY366496.1) SEQ ID NO:340 polinucleotídeo DGATI para Vernicia fordii {DQ356680.1) SEQ ID NO:341 polinucleotídeo DGATI para Vernonia galamensis (EF653276.1)
SEQ ID NO:342 polinucleotídeo DGATI para Vernonia galamensis
(EF653277.1) SEQ ID NO:343 polinucleotídeo DGATI para Euonymus alatus (AY751297.1) SEQ ID NO:344 polinucleotídeo DGATI para Caenorhabditis elegans (AF221132.1) SEQ ID NO:345 polinucleotídeo DGATI para Rattus norvegicus (NM 053437.1) SEQ ID NO:346 polinucleotídeo DGATI para Homo sapiens (NM 012079.4) SEQ ID NO:347 polinucleotídeo DGATI para Aspergillus fumigatus (XP 755172.1)
SEQ ID NO:348 polinucleotídeo DGATI para Ricinus communis (AAR11479.1) SEQ ID NO:349 polinucleotídeo DGATI para Vernicia fordii (ABC94472.1) SEQ ID NO:350 polinucleotídeo DGATI para Vernonia galamensis (ABV21945.1) SEQ ID NO:351 polinucleotídeo DGATI para Vernonia galamensis (ABV21946.1) SEQ ID NO:352 polinucleotídeo DGATI para Euonymus alatus (AAV31083.1) SEQ ID NO:353 polinucleotídeo DGATI para Caenorhabditis elegans (AAF82410.1) SEQ ID NO:354 polinucleotídeo DGATI para Rattus norvegicus (NP 445889.1) SEQ ID NO:355 polinucleotídeo DGATI para Homo sapiens (NP 036211.2) SEQ ID NO:356 motivo WRII (R G V T/S R H R W T G R) SEQ ID NO:357 motivo WRII (F/Y E A H L W D K) SEQ ID NO:358 motivo WRII (D L A A L K Y W G) SEQ ID NO:359 motivo WRII (S X G F S/A R G X) SEQ ID NO:360 motivo WRII (H H H/Q N G R/K W E A R I G R/K
V)
SEQ ID NO:361 motivo WRII (Q E E A A A X Y D) SEQ ID NO:362 polipeptídeo oleosina para Brassica napus (CAA57545.1) SEQ ID NO:363 polipeptídeo oleosina Sl-l para Brassica napus (ACG69504.1) SEQ ID NO:364 polipeptídeo oleosina S2-1 para Brassica napus (ACG69503.1) SEQ ID NO:365 polipeptídeo oleosina S3-1 para Brassica napus (ACG69513.1) SEQ ID NO:366 polipeptídeo oleosina S4-1 para Brassica napus (ACG69507.1) SEQ ID NO:367 polipeptídeo oleosina S5-1 para Brassica napus (ACG69511.1) SEQ ID NO:368 polipeptídeo oleosina 1 para Arachis hypogaea (AAZ20276.1) SEQ ID NO:369 polipeptídeo oleosina 2 para Arachis hypogaea (AAU21500.1) SEQ ID NO:370 polipeptídeo oleosina 3 para Arachis hypogaea (AAU21501.1) SEQ ID NO:371 polipeptídeo oleosina 5 para Arachis hypogaea (ABC96763.1) SEQ ID NO:372 polipeptídeo oleosina 1 para Ricinus communis (EEF40948.1) SEQ ID NO:373 polipeptídeo oleosina 2 para Ricinus communis (EEF51616.1) SEQ ID NO:374 polipeptídeo oleosina isoforma a para Glycine max (P29530.2) SEQ ID NO:375 polipeptídeo oleosina isoforma b para Glycine max (P29531.1) SEQ ID NO:376 polipeptídeo oleosina isoforma de baixo peso molecular para Linum usitatissimum (ABBO1622.1) SEQ ID NO:377 sequência de aminoácido de polipeptídeo oleosina isoforma de alto peso molecular Linum usitatissimum (ABBO1624.1)
SEQ ID NO:378 polipeptídeo oleosina para Helianthus annuus
(CAA44224.1) SEQ ID NO:379 polipeptídeo oleosina para Zea mays (NP 001105338.1) SEQ ID NO:380 polipeptídeo estereoleosina para Brassica napus (ABM30178.1)
SEQ ID NO:381 polipeptídeo estereoleosina SLO1-1 para Brassica napus (ACG69522.1)
SEQ ID NO:382 polipeptídeo estereoleosina SLO2-1 para Brassica napus (ACG69525.1) SEQ ID NO:383 polipeptídeo estereoleosina para Sesamum indicum (AAL13315.1)
SEQ ID NO:384 polipeptídeo estereoleosina para Zea mays (NP 001152614.1)
SEQ ID NO:385 polipeptídeo caleosina CLO-l para Brassica napus (ACG69529.1) SEQ ID NO:386 polipeptídeo caleosina CLO-3 para Bras'sica napus (ACG69527.1) SEQ ID NO:387 polipeptídeo caleosina para Sesamum indicum (AAF13743.1) SEQ ID NO:388 polipeptídeo caleosina para Zea mays (NP 001151906.1) SEQ ID NO:389 Brassica napus oleosina polinucleotídeo (X82020.1) SEQ ID NO:390 polinucleotídeo oleosina Sl-l para Brassica napus (EU678256.1) SEQ ID NO:391 polinucleotídeo oleosina S2-1 para Brassica napus (EU678255.1) SEQ ID NO:392 polinucleotídeo oleosina S3-1 para Brassica napus (EU678265.1) SEQ ID NO:393 polinucleotídeo oleosina S4-1 para Brassica napus (EU678259.1) SEQ ID NO:394 polinucleotídeo oleosina S5-1 para Brassica napus (EU678263.1)
SEQ ID NO:395 polinucleotídeo oleosina 1 para Arachis hypogaea {DQ097716.1) SEQ ID NO:396 polinucleotídeo oleosina 2 para Arachis hypogaea (AY722695.1) SEQ ID NO:397 polinucleotídeo oleosina 3 para Arachis hypogaea {AY722696.1)
SEQ ID NO:398 polinucleotídeo oleosina 5 para Arachis hypogaea (DQ368496.1) SEQ ID NO:399 polinucleotídeo oleosina para Helianthus annuus (X62352.1) SEQ ID NO:400 polinucleotídeo oleosina para Zea mays {NM_OO1111868.1) SEQ ID NO:401 polinucleotídeo esteroleosina para Brassica napus (EF143915.1) SEQ ID NO:402 polinucleotídeo oleosina SLO1-1 para Brassica napus (EU678274.1) SEQ ID NO:403 polinucleotídeo oleosina SLO2-1 para Brassica napus (EU678277.1) SEQ ID NO:404 polinucleotídeo esteroleosina para Zea mays (NM 001159142.1) SEQ ID NO:405 polinucleotídeo caleosina CLO-l para Brassica napus (EU678281.1) SEQ ID NO:406 polinucleotídeo caleosina CLO-3 para Brassica napus (EU678279.1) SEQ ID NO:407 polinucleotídeo caleosina para Sesamum indicum (AF109921.1)
SEQ ID NO:408 polinucleotídeo caleosina para Zea mays (NM 001158434.1)
SEQ ID NO:409 sequência de vetor inteiro pjP3502 (três genes) SEQ ID NO:410 sequência de vetor inteiro pjP3503 (quatro genes) SEQ ID NO:411 sequência pjP3502 TDNA (inserida no genoma) SEQ ID NO:412 sequência pjP3503 TDNA (inserida no genoma)
SEQ ID NO:413 sequência de vetor pjP3507 SEQ ID NO:414 sequência ligante SEQ ID NO:415 sinergia Soybsojaean SEQ ID NO:416 12ABFJYC pjP3569 inserto SEQ ID NO:417 sequência parcial CGI-58 para N. benthamiana selecionada para silenciar hpRNAi (pTV46) SEQ ID NO:418 sequência parcial AGPASe para N. tabacum selecionada para silenciar hpRNAi (pTV35) SEQ ID NO:419 motivo lipase GXSXG SEQ ID NO:420 motivo aciltransferase HX(4)D SEQ ID NO:421 motivo de ligação de lipídeo provável VX(3)HGF SEQ ID NO:422 polinucleotídeo CGi58 para Arabidopsis thaliana (NM118548.1) SEQ ID NO:423: polinucleotídeo CGi58 para Brachypodium distachyon (XM_003578402.1)
SEQ ID NO:424 polinucleotídeo CGi58 para Glycine max (XM 003523590.1) — SEQ ID NO:425 polinucleotídeo CGi58 para Zea mays (NM 001155541.1) — SEQ ID NO:426 polinucleotídeo CGi58 para Sorghum bicolor (XM 002460493.1) SEQ ID NO:427 polinucleotídeo CGi58 para Ricinus communis (XM 002510439.1) SEQ ID NO:428 polinucleotídeo CGi58 para Medicago truncatula (XM 003603685.1) SEQ ID NO:429 polipeptídeo CGi58 para Arabidopsis thaliana (NP 194147.2) SEQ ID NO:430 polipeptídeo CGi58 para Brachypodium distachyon (XP 003578450.1) SEQ ID NO:431 polipeptídeo CGi58 para Glycine max (XP 003523638.1) SEQ ID NO:432 polipeptídeo CGi58 para Zea Mays (NP 001149013.1) SEQ ID NO:433 polipeptídeo CGi58 para Sorghum bicolor
(XP 002460538.1) SEQ ID NO:434 polipeptídeo CGi58 para Ricinus communis (XP 002510485.1) SEQ ID NO:435 polipeptídeo CGi58 para Medicago truncatula (XP 003603733.1) SEQ ID NO:436 polipeptídeo CGi58 para Oryza sativa (EAZ09782.1) SEQ ID NO:437 polinucleotídeo LEC2 para Arabidopsis thaliana (NM 102595.2) SEQ ID NO:438 polinucleotídeo LEC2 para Medicago truncatula (X60387.1) SEQ ID NO:439 polinucleotídeo LEC2 para Brassica napus (HM370539.1) SEQ ID NO:440 polinucleotídeo BBM para Arabidopsis thaliana (NM 121749.2) SEQ ID NO:441 polinucleotídeo BBM para Medicago truncatula (AY899909.1) SEQ ID NO:442 polipeptídeo LEC2 para Arabidopsis thaliana (NP_564304.1) SEQ ID NO:443 polipeptídeo LEC2 para Medicago truncatula (CAA42938.1) SEQ ID NO:444 polipeptídeo LEC2 para Brassica napus (ADO16343.1) SEQ ID NO:445 polipeptídeo BBM para Arabidopsis thaliana (NP 197245.2) SEQ ID NO:446 polipeptídeo BBM para Medicago truncatula (AAW82334.1) SEQ ID NO:447 protomor alcA de Aspergilus niger induzível SEQ ID NO:448 indutor AICR que ativa o promotor AICA na presença de etanol
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Técnicas gerais e Definições
[216] Salvo especificamente definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados devem ser considerados como tendo o mesmo significado como normalmente é entendido por um especialista na técnica (por exemplo, em cultura de células, genética molecular, imunologia, imuno- histoquímica, química de proteínas, quírnica de ácidos graxos e lipídeos, produção de biocombustível, e bioquímíca).
[217] Salvo indicação em contrário, as técnicas de proteína recombinante, cultura de células, e imunológicas utilizadas na presente invenção são os procedimentos padrão, bem conhecidas dos especialistas na técnica. Tais técnicas são descritas e explicadas em toda a literatura em fontes como, j. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, john Wiley and Sons (1984), j. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual., Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), TA Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (editores), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 e 1996), F.M. Ausubel et al. (editores), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-lnterscience (1988, incluindo todas as atualizações até o presente), Ed Harlow and David Lane (editores) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), e J.E. Coligan et al. {editores) Current Protocols in Immunology, john Wiley & Sons (incluindo todas as atualizações até o presente). Definições selecionadas
[218]0 termo "organismo transgênico não humano" a, por exemplo, uma planta inteira, alga, animal não humano ou uni organismo adequado para a fermentação, como um fungo ou levedura, compreendendo um polinucleotídeo exógeno (transgene) ou um polipeptídeo exógeno. Em uma modalidade, o organismo transgênico rião humano não é um animal ou parte do mesmo. Em urna modalidade, o organismo transgênico não humano é um organisrno fototrófico (por exemplo, uma planta ou urna alga), capaz de obter energia a partir da luz solar, para sintetizar compostos orgânicos para nutrição. Em outra modalidade, o organismo transgênico não humano é uma bactéria fotossintética.
[219]0 termo "exógeno", no contexto de urri polinucleotídeo ou polipeptídeo refere-se ao polinucleotídeo ou polipeptídeo, quando presente em uma célula que naturalmente não compreende o polinucleotídeo ou polipeptídeo. Dita uma célula é referenciada aqui como uma "célula recombinante" ou uma "célula transgênica".
Erít uma modalidade, o polinucleotídeo ou polipeptídeo exógeno é de um gênero diferente para a célula que compreende o polinucleotídeo exógeno ou polipeptídeo. Em outra rnodalidade, o polinucleotídeo ou polipeptídeo exógeno é de uma espécie diferente. Em uma modalidade, o polinucleotídeo ou polipeptídeo exógeno é expresso em uma planta hospedeira ou célula de planta e o polinucleotídeo exógeno ou polipeptídeo é de uma espécie ou gênero diferente. O polinucleotídeo exógeno ou polipeptídeo pode ser de ocorrência não natura, como por exemplo, uma molécula de DNA sintético que foi produzido por métodos de DNA recombinante.
A molécula pode, geralmente preferencialmente, incluir urna região de codificação de proteína que foi otimizada por códon para expressão na célula, assim, produzindo um polipeptídeo que tem a mesrüa sequência de aminoácido que um polipeptídeo de ocorrência natural, embora a sequência de nucleotídeo da região de codificação de proteína é de ocorrência não natural. O polinucleotídeo exógeno pode codificar ou o polipeptídeo exógeno pode ser: um diacilglicerol aciltransferase (DGAT) com u.m DGATI ou um DGAT2-, um glicerol-3-fosfato aciltransferase (GPAT) corno um GPAT que é capaz de sintetizar MAG, um fator de transcrição Wrinkled 1 (WRII), uma Oleosina, ou um polipeptídeo supressor de silenciamento. Em uma modalidade, o polipeptídeo exógeno é um MGAT exógeno como um MGATI ou um MGAT2.
[220]Conforme usado aqui, o terrrio "lipídeo extraído" refere-se a uma composição extraída de um organismo transgênico ou parte do mesmo, que compreende, pelo menos, 60% (p/p) de lipídeos.
[221] Conforme usado aqui, o termo "lipídeo apolar" refere- se a ácidos graxos e seus derivados, que são solúveis em solventes orgânicos, mas insolúveis em água. Os ácidos graxos podem ser ácidos graxos livres e/ou sob uma forma esterificada.
Exemplos de formas esterificadas incluem, entre outros, triacilglicerc)l (TAG), diaciliglicerol (DAG), rríonoacilglicerol (MAG). Lipíçleos apolares incluem esteróis, ésteres de esteróis e ésteres de cera. Lipídeos apolares são também conhecidos como "lipídeos neutros". Lipídeos apolares são geralmente líquidos à temperatura, ambiente. Preferencialmente, o lipídeo apolar predominantemente {> 50%) compreende ácidos graxos que são, pelo menos, 16 carbonos de comprimento. Mais preferencialmente, pelo menos 50% do total de ácidos graxos no lipídeo apolar são os ácidos graxos C18, por exemplo, o ácido oleico. Em u.ma modalidade, pelo menos 50%, mais preferencialmente pelo menos 70%, mais preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 90°s, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, mais preferencialmente pelo menos 93°s, mais preferencialmente pelo menos 94%, mais preferencialmente pelo menos 95-%, mais preferencialmente pelo menos 96%, mais preferencialmente pelo menos 97%, mais preferencialmente pelo menos 98%, mais preferencialmente pelo menos 99% dos ácidos graxos em lipídeos apolares da invenção podem ser encontrados como TAG. O lipídeo apolar pode ser ainda purificado ou tratado, por exemplo, por hidrólise com uma base forte para liberar o ácido graxo livre, ou por fracionamento, destilação, ou semelhantes. Lipídeo apolar pode estar presente em ou obtidos em partes de planta como semente, folhas ou fruta, de células recombinantes ou de organismos não humanas como leveduras. Lipídeo apolar da invenção p.ode formar parte de "óleo de semente" se este é obtido de semente. Concentrações de esterol livre e esterificado (por exemplo, sitosterol, campesterol, estigmasterol, brassicasterol, A5-avenasterol, sitostanol, campestanol, e colesterol) no lipídeo extraído podem ser como descrito ern Phillips et al.,
2002. Esteróis em Óleos de planta são presentes como álcoois livres, ésteres com ácidos graxos (esteróis esterificados), glicosídeos e glicosídeos acilados de esteróis. Concentrações de esterol em óleos vegetais de ocorrência natural (óleo de sementes) faixas de até um máximo de cerca de 110Omg/1OOg. Óleo de palma hid.rogenado tem uma das mais baixas concentrações de óleos vegetais de ocorrência natural em cerca de 60mg/1OOg. Os óleos de sementes recuperados extraídos da invenção preferencialmente têm entre cerca de 100 e cerca de 1OOOmg esterol total/lOOg de óleo. Para uso como alimento ou alimentação, é preferencial que esteróis estejam presentes principalmente como formas livres ou esterificadas do que em formas glicosiladas. Nos óleos de sementes da presente invenção, preferencialmente pelo menos 50% dos esteróis nos óleos estão presentes como esteróis esterificados, exceto para óleo de semente de soja que tem cerca de 25% dos esteróis esterificados.
O óleo de semente de canola e óleo de colza da invenção preferencialmente tem entre cerca de 500 e cerca de 800 mg esterol total/lOOg, com sitosterol o esterol principal e campesterol o segundo mais abundante. O óleo de seniente de milho da invenção preferencialmente tem entre cerca' de 600 e cerca de 800 mg esterol total/lOOg, com sitosterol sendo o esterol principal. O óleo de semente de soja da invenção preferencialmente tem entre cerca de 150 e cerca de 350 rng esterol tòtal/lOOg, com sitosterol sendo o esterol principai e estigmasterol o segundo mais abundante, e com mais esterol livro do que esterol esterificado. O óleo de semente de algodão da invenção preferencialmente tem entre cerca de 200 e cerca de 350 mg esterol tctal/1OOg, com sitosterol sendo o esterol principal.
O óleo de coco e óleo de palma da invenção preferencialmente têm entre cerca de 50 e cerca de lOOmg esterol total/lOOg, com sitosterol sendo o esterol principal. O óleo de semente de cártamo da invenção preferencialmente tem entre cerca de 150 e cerca de 250mg mg esterol total/lOOg, com sitosterol sendo o esterol principal. O óleo de sernente de amendoim da invenção preferencialmente tem entre cerca de 100 e cerca de 20Omg mg esterol total/lOOg, com sitosterol sendo o esterol principal. O Óleo de gergelim da invenção preferencialrnente tem entre cerca de 400 e cerca de 60Omg mg esterol total/lOOg, com sitosterol sendo o esterol principal. O óleo de girassol da invenção preferencialmente tem entre cerca de 200 e cerca de 40Omg mg esterol total/lOOg, com sitosterol sendo o esterol principal. Óleos obtidos de partes de planta vegetativas de acordo com a invenção preferencialmente têm menos do que cerca de 20Omg esterol total/lOOg, mais preferencialrnente menos do que lOOmg esterol total/lOO g, e mais preferencialmente menos do que 50mg esteróis totais/lOOg, com a maioria dos esteróis sendo esteróis livres.
[222] Como usado aqui, o termo "óleo de semente",refere-se a uma composição obtida a partir da sernente/grão de um planta que compreende pelo menos 60% (p/p) lipídeo, ou obtenível a partir de semente/grão se o óleo de semente ainda está presente na semente/grão. Isto é, óleo de semente da invenção inclui óleo de seniente que está presente na semente/grão ou parte do mesrüo, bem como óleo de semente qual foi extraído a partir da semente/grão. O óleo de semente é preferencialmente óleo de sernente extraído. Óleo de semente é tipicamente um líquido à ternperatura ambiente.
Preferencialmente, o total de ácido graxo de conteúdo (TFA) no óleo de semente predominantemente (> 50%) compreende ácidos graxos que são, pelo menos, 16 .carbonos de comprimento. Mais p.referencialmEnte, pelo menos 50% do total de ácidos graxos no óleo de semente são os ácidos graxos C18, por exemp1o, o ácido oleico. Os ácidos graxos são tipicameríte em uma forma esterificada como, por exemplo, TAG, DAG, acil-CoZí ou fosfolipídeo.
Os ácidos graxos podem ser ácidos graxos livres e/ou sob' uma forma esterificada.
Em uma modalidade, pelo menos
50%, mais preferencialmente pelo menos 70%, ínais preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 9Ô°5, mais preferencialmente pelo menos 91°s, rnais preferencialmente pelo menos 92%, mais preferencialmente pelo rnenos 93%, mais preferencialmente pelo rnenos 94%, mais preferencialmente pelo menos 95%, mais preferencialmente pelo menos 96%., mais preferencialmente pelo menos 97%, mais preferencialmente pelo menos 98%, mais preferencialmente pelo menos 99% dos ácidos graxos no óleo de semente da invenção podem ser encontrados como TAG.
Em uma modalidade, óleo de semente da invenção é óleo "substancialmente purificado" ou "purificado"
que foi separado de um ou mais outrcs lipídeos, ácidos nucleicos, polipeptídeos, ou outras moléculas contaminantes com os quais está associado na semente ou em urn extrato, bruto.
É preferencial que o óleo de semente substancialmente purificado seja pelo menos 60% livre, mais preferencialmente pelo menos 75%
livre, mais preferencialmente, pelo menos .90% livre de outros componentes com os quais está associado na semente ou no extrato.
Óleo de semente da presente invenção pode ainda compreender as moléculas de ácidos não graxos, como, entre outros, os esteróis.
Em uma modalidade, o óleo de semente é óleo d.e canola (Brassica sp. como Brassica carinata, Brassica juncea,
Brassica napobras'sica, Brassica napus) óleo de mostarda
(Brassica juncea), outro óleo de Brassica (por exemplo, Brassica napobrassica, Brassica camelina), óleo de girassol (Helianthus sp. coiro Helianthus annuus), óleo de linhaça (Linum usitatissiir.um), óleo de soja (Gl.ycine max), óleo de cártamo
(Carthamus tinctorius), óieo de milho (Zea mays), óleo de tabaco
(Nicotiana sp. como Nicotiana tabacum ou Nicotiana benthamiana),
Óleo de amer'-doim (Arachis hypogaea), óleo de palma (Elaeis guineens'is), óleo de semerite de algodão (Gossypium hirsutum),
óleo de coco (Cocos nuc4fera) , o óleo de abacate ( Persea americana) , azeite de oliva ( Olea europaea) , óleo de ca j u (Anacardium occidentale) , óleo de macadâmia (Macadamia in ter grifolia) , óleo de amêndoa (Prunus amygdalus) , óleo de sementes de aveia (Avena sativa), óleo de arroz ( Oryza sp. como Oryza sativa e Oryza glaberriina) , óleo de semente de Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) , ou óleo de semente de Acrocomia aculeata
(palma de macaúba) , Aracinis hypogaea (amendoim) , As trocaryum murumuru (murumuru) , Astrocaryum vulgare (tucumã) , Attalea geraensis (Iridaiá-rateiro) , Attalea humilis (óleo de palma americana) , Attalea oleifera (andaiá) , Attalea phalera ta (uricuri) , Attalea speciosa (babaçu) , Beta vulgaris (açúcar de beterraba) , Camelina sativa (falso linho), Caryocar brasiliense (pequi) , Crambe abyssinica (couve abissínia) , , Cucumis melo
(melão) , Horde um vulgare (cevada) , ja tropha curcas (pinhão manso) , joannesia princeps (nogueira de arara) , Licania rigida (oiticica) , Lupinus angustifolius (lupin) , Mauritia flexuosa
(palma de buriti) , Maximiliana maripa (palma de inaja) r Miscanthus sp. corno Miscanthus x giganteus e ,Miscanthus sinensis, Oenocarpus ba caba (bacaba-do-azeite) , Oenocarpus bataua (patauã) , Oenocarpus distichus (bacaba-de-leque) , Panicum vi rga tum (switchgrass) , Paraqueiba paraensis (mari) , Persea amencana (a.bacate) , Pongamia pinna ta (faia indiana) , Populus trichocarpa, Ricinus communis (castor) , Saccharum sp. (cana-de- açúcar) , Sesamum indicum {gergelim) , Solanum tuberosum (batata) ,
Sorghum sp. como Sorghum bicolor, Sorghum vulgare, Theobroma grandiforum (cupuaçu) , Trifolium sp. , Trithrinax brasiliensis
(palma brasileira) e Tri ti cum sp. (trigo) como Tri ticum aestivum.
Óleo de semente pode ser extraído a partir de semente/grão por qualquer método conhecido na técnica . Isto envolve tipicamente a extração com solventes apolares, como éter dietílico, éter de petróleo, clorofórrr).io/lnetanol, ou misturas de butanol, geralmente associados à primeira moagern das sementes . "Lipídeos associados com o amido no grão podem ser extraídos com água saturada com butanol. O óleo de semente pode ser "degornado" por métodos conhecidos na técnica para remover polissacarídeos ou tratado de outra forma para remover contaminantes ou melhorar a pureza, a estabilidade, ou a cor. Os TAG e outros ésteres do óleo de semente podern ser hidrolisados para liberar os ácidos graxos livres, ou o óleo de sernente hidrogenado, tratado quimicamente, ou enzimaticarnente como é conhecido na técnica.
[223] Conforme usado aqui, o terrno "ácido graxo" refere-se a um ácido carboxílico com uma cauda longa alifát.ica de pelo menos 8 átomos de carbono de comprimento, saturados ou insaturados. Tipicamente, os ácidos graxos têrn uma cadeia de ligação carbono- carbono, de pelo menos 12 carbonos de comprirnento. A maioria de ácidos graxos de ocorrência natural tem um número par de átomos de carbono porque a sua biossíntese envolve acetato, que tem dois átomos de carbono. Os ácidos graxos podem estar num estado livre (não esterificado) ou em uma forma esterificada como parte de um TAG, DAG, MAG, acil-CoA (tio-éster) liaado, ou ligado de outra forma covalente. Quando ligado de forma covalente a urna forma esterificada, o ácido graxo é aqui referido como um grupo "acil". O ácido graxo pode ser esterificado como um fosfolipídeo, como uma fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol ou difosfatidilglicerol. Ácidos graxos saturados não contêm quaisquer ligações duplas ou outros grupos funcionais ao longo da cadeia. O termo "saturado" refere-se ao hidrogênio, em que todos os carbonos (além do grupo do ácido carboxílico [-COOH]) contern hidrogênios tantos auanto possível. ^ Em outras palavras, o final ômega (ój) contém três átomos de hidrogênio (CH3-) e cada carbono dentro da cadeia contérn dois átomos de hidrogênio (-CH2-). Os ácidos graxos insaturados são de forma semelhante a de ácidos graxos saturados, com exceção de que urri ou mais grupos funcionais de alqueno existem ao longo da cadeia, com cada alqueno isoladamente substituindo a ligação"- CH2-CH2-" parte da cadeia com um duplamente ligado à fração"-
ch=ch-" (ou seja, um carbono duplamente ligado a outro carbono). Os dois átomos de carbono nas cadeias próximas que estão ligadas a ambos os lados da ligação dupla podem ocorrer em uma configuração cis ou trans.
[224] Conforme usado aqui, o termo "ácido graxo poli- insaturado" ou "PUFA" refere-se a um ácido graxo que cornpreende pelo menos 12 átomos de carbono na sua cadeia de carbono e pelo menos dois grupos alqueno (ligações carbono-carbono duplas). O teor de PUFA a parte de planta veoetativa, ou o organisrno não humano ou parte do mesmo da invenção pode ser aumentado ou reduzido dependendo da combinação d.e polinucl?otídeos exóaenos expressc's r.a parte da planta vegetativa, ou organismo não huriiano ou parte do mesmo ou semente da invenção. Por exemplo, quando um MGAT é expresso o nível PUFA tipicamente aumenta, enquanto que quando DGATI é expresso isolado ou em combinação corn WRII, o teor de P'JFA é tipicamente reduzido devido à um aumento no nível de ácido oleico. Além disso, se atividade de LJ12 desaturase é reduzida, por exemplo,. por silenciamento de uma LJ12 desaturase endógena, teor de PUFA é improvável aumentar na ausência de um polinucleotídeo exógeno que codifica uma diferente LJ12 desaturase. {225]"Monoacilglicerídeo" ou "MAG" é urri glicerídeo no qual o glicerol é esterificado com um ácido graxo." Conforme usado aqui, o MAG compreende um grupo hidroxila err, sn-1/3 (também referido aqui como sn-l ou I-MAG MAG ou 1/3-MAG) ou na posição sn-2 (tambérrt referido aqui como 2-MAG), e, por conseguinte, MAG não inclui moléculas fosforiladas como PA ou PC. MAG é, portanto, um componente de lipídeos neutros em uma célula.
[226]"Diacilglicerídeo" ou "DAG" é glicerídeo no qual o glicerol é esterificado com dois ácidos grax.os que podem ser o mesmo ciu, preferencialmente, diferente. Corno aqui utilizado, DAG compreende um grupo hidroxil em urna posição sn-1,3 ou sn-2, e, portanto, DAG não inclui moléculas fosforilados como PA ou PC. DAG é, portanto, um componente de lipídeos neutros de uma célula. Na via de síntese Kennedy de DAG (Figura 1), o precursor do sn-glicerol-3-fosfato (G-3-P), é esterificado com dois grupos acil, cada um proveniente de um éster coenzima A de ácido graxo, em uma primeira reação catalisada por uma glicerol-3-fosfato aciltransferase (GPAT) na posição sn-l para formar LysoPk,, seguido por uma segunda acilação na posição sn-2 catalisada por urna ácido lisofosfatídico aciltransferase (LPAAT) para formar o ácido fosfatídico (PA). Este intermediário é, em seguida, de- fosforilado para formar DAG. Em uma via alternativa anabólica (Figura 1), DAG pode ser formada pela acilação de sn-l MAG ou preferencialmente sn-2 MAG, catali-sada por MGAT. DAG podem também ser formados a partir de TAG por remoção de um grupo acil por uma lipase, ou a partir do PC, essencialmente, pela remoção de um grupe cabeça de uma colina por qualquer uma das enzirnas CPT, PDCT ou PLC {Figura 1).
[227]"Triacilglicerídeo" ou "TAG" é urn glicerídeo em que o glicerol é esterificado com três ácidos graxos, que podem ser o mesmo (por exemplo, como em tri-oleína) ou, mais geralmente, diferente. Na via de síntese de Kennedy de TAG, DAG é formada como descrito acima, e, em seguida, um terceiro grupo acil é esterificado para a estrutura de glicerol pela atividade de DGAT. Vias alternativas para a formação de TAG incluem uma catalisada pela enzima PDAT e da via MGAT aqui,descrita.
[228] Como aqui utilizado, o termo "aciltransferase" refere- se a uma proteína que é capaz de transferir um grupo acil de acil-CoA sobre um substrato e inclui MGATS, GPATS e DGATS.
[229]Como aqui utilizado, o termo "wrinkled 1" ou "WRíl" ou "WRLI" refere-se a um fator de transcrição da classe AE?2/ERWEBP que regula a expressão de várias enzimas envolvidas na glicólise e biossíntese de novo de ácidos graxos. WRII tem dois domínios de ligação ao DNA específicos para planta (AP2/EREB). WRII em pelo menos Arabidopsis também regula a quebra da sacarose via glicólise regulando assim o fornecimento de precursores para a biossíntese de ácidos graxos. Em outras palavras, controla o fluxo de carbono a partir da fotossíntese r)ara lipídeos de armazenamento. As mutantes wril têm fenótipo de serrtente enrrugado fenótipo da semente, devido a u.m defeito na incorporação de sacarose e glvcose em TAGs.
[230] Exemplos de genes que são transcritos por WRII incluem, entre outros, um ou mais, preferencialmente todos, de piruvato quinase (At5g52920, At3g22960), piruvato desidrogenase (PDH) subunidade Elalfa (At1gO1090), acetil-CoA carboxilase (ACCase), subunidade BCCP2 (At5g15530), redutase enoil-ACP {At2g05990; EAR), fosfoglicerato mutase (At1g22170), frutoquinase citosólica e mutase fosfoglicerato citosólica, sacarose sintase (SuSy) (ver, por exemplo, Liu e't al, 201Ob.; Baud et al, 2007;. Ruuska et al, 2002).
[231]WRLI contém o domínio conservado AP2 {cdOO018). AP2 é um domínio de ligação de DNA encontrado em reguladoreS da transcrição em plantas, como APETALA2 e EREBP (proteína de ligação ao elemento sensível de etileno). Em EREBPs o domínio se liga especisficamente à caixa 11bp CCG do elemento de resposta ao etileno (ERE), um elemento promotor essencial para a capacidade de resposta de etileno. EREBPS e o fator de ligação CBFI de ligação à repetição C, que está envolvido na. resposta ao estresse, contêm uma única cópia do domínio AP2. Proteínas tipo APETALA2, que desempenham um papel no desenvolvimento da planta contêm duas cópias.
[232] Outros motivos de sequência em WRII e seus homólogos funcionais incluem:
1. R G V T/S R H R W T G R (SEQ ID NO:356).
2. F/Y E A H L W D K (SEQ ID NO:357).
3. D L A A L K Y W G (SEQ ID NO:358).
4. S X G F S/A R G X (SEQ ID NO:359).
5. H H H/Q N G R/K yq E A R I G R/K V (SEQ ID NO:360).
6. C E E A A A X Y D (SEQ ID NO:361).
[233] Como aqui utilizado, o termo "wrinkled 1" ou "WRíl" também inclui "Wrinkled tipo 1" ou "proteínas tjpo WRII.".
Exemplos de proteínas WRII incluern Acessão Nos: Q6X5Y6, (Arabidopsis thaliana; SEQ ID NO:280), XP_002876251.1 (Arabidopsis lyrata subsp.
Lyrata; SEQ ID NO:281), ABD16282.1 (Brassica napus; SEQ ID NO:282), ADO16346.1 (Brassica napus; SEQ
ID NO:283), XP 003530370.1 (Glycine max; ' SEQ ID NO:284), AEO22131.1 (jatropha curcas; SEQ ID NO:285), XP_002525305.1 (Ricinus communis; SEQ ID NO:286), XP 002316459.1 (Populus trichocarpa; SEQ ID NO:287), CBI29147.3 (Vitis vinifera; SEQ ID
NO:288), XP G03578997.1 (Brachypodium distachyon; SEQ ID — NO:289), BAJ86627.1 (Hordeum vulgare subsp. vulgare; SEQ ID NO:290), EAY79792.1 (Oryza sativa; SEQ ID NO:291), XP 002450194.1 (Sorghum bicolor; SEQ ID NO:292), ACG32367.1 (Zea — mays; SEQ ID NO:293), XP_003561189.1 (Brachypodium distachyon; SEQ ID NO:294), ABL85061.1 (Brachypodium sylvaticum; SEQ ID NO:295), BAD68417.1 (Oryza sativa; SEQ ID NO:296), XP 002437819.1 (Sorghum bicolor; SEQ ID NO:297), XP_002441444.1 — (Sorghum bicolor; SEQ ID NO:298), XP_003530686.1 (Glycine max;
SEQ ID NO:299), XP_003553203.1 (Glycine max; SEQ ID NO:300), XP 002315794.1 (Populus trichocarpa; SEQ ID NO:301), XP_002270149.1 (Vitis vinifera; SEQ ID NO:302), XP 003533548.1 — (Glycine max; SEQ ID NO:303), XP_003551723.1 (Glycine max; SEQ ID NO:304), XP 003621117.1 (Medicago truncatula; SEQ ID NO:305), XP 002323836.1 (Populus trichocarpa; SEQ ID NO:306), XP 002517474.1 (Ricinus con'.munis; SEQ ID NO:307), CAN79925.1 (Vitis vinifera; SEQ ID NO:308), XP 003572236.1 (Brachypodium distachyon; SEQ ID NO:309), BAD10030.1 (Oryza sativa; SEQ ID NO:310), XP 00244442°.1 (Sorghum bicolor; SEQ ID NO:311), NPO01170359.1 (Zea mays; SEQ ID NO:312), XP_002889265.1 (Arabidopsis lyrata subsp. lyrata; SEQ ID NO:313), AAF68121.1 (Arabidopsis thaliana; SEQ ID NO:314), NP178088.2 (Arabidopsis thaliana; SEQ ID NO:315), XP 002890145.1 (Arabidopsis lyrata subsp. lyrata; SEQ ID NO:316), BAJ33872.1 (Thellungiella haiophila; SEQ ID NO:317), NP563990.1 (Arabidopsis thaliana;
SEQ ID NO:318), XP 003530350.1 (Glycine max; SEQ ID NO:319),
XP_003578142.1 (Brachypodium distachyon; SEQ ID NO:320), EAZ09147.1 (Oryza sativa; SEQ ID NO:321), XP_002460236.1 {Sorghum bicolor; SEQ ID NO:322), NP 001146338.1 (Zea mays; SEQ ID NO:323), XP003519167.1 (Glycine max; SEQ ID NO:324), XP_003550676.1 (Glycine max; SEQ ID NO:325), XP_003610261.1 (Medicago truncatula; SEQ ID NO:326), XP 003524030.1 (Glycine max; SEQ ID NO:327), XFfOO3525949.1 (Glycine max; SEQ ID NO:328), XP 002325111.1 (Populus trichocarpa; SEQ ID NO:329), CBI36586.3 (Vitis vinifera; SEQ ID NO:330), XP002273046.2 (Vitis vinifera; SEQ ID NO:331), XP 002303866.1 (Populus trichocarpa; SEQ ID NO:332), e CBI25261.3 (Vitis vinifera; SEQ ID NO:333). Outros exemplos incluem Sorbi-WRL1- (SEQ ID NO:334), Lupan-WRL1 (SEQ ID NO:335), R1CCO-WRL1 (SEQ ID NO:336), e Lupin angustifolius WRII (SEQ ID NO:337).
[234] Como aqui utilizado, o termo "aciltransferase monoacilglicerol" ou "MGAT" refere-se a uma proteína que transfere um grupo acil graxo de acil-CoA para um substrato MAG para a produção de DAG. Assim, o termo "atividade de aciltransferase monoacilglicerol" refere-se a, pelo menos, a transferência de um grupo acil de acil-CoA para MAG para produzir DAG. MGAT é mais conhecido por seu papel na absorção de gordura no intestino dos mamíferos, onde os ácidos graxos e sn-2 MAG gerados ·a partir da digestão de gordura na dieta são novamente sintetizados em TAG em enterócitos para a síntese e secreção quilomícron. MGAT catalisa a primeira etapa deste processo, em que o grupo acil graxo de acil-CoA, formados a partir de ácidos grax.os e de CoA, e sn-2 MAG são ligadas de forma covalente. O termo "MGAT", como aqui utilizado, inclui enzimas que agem em substratos MAG sn-1/3 e/ou MAG sn-2 para formar sn-1,3 DAG e/ou sn-1,2/2,3-0?\G, respectivamente. Em uma modalidade, o MGAT tem çma preferência para substrato sn-2 MAG em relação a sn-l MAG, ou substancialmente utiliza apenas sn-2 MAG como substrato (exemplos incluem MGATS descritos em Cao et al. 2003 (especificidade de MGATI de camundongos para sn2-18: 1-
M.AG> sn 1/3-18: I-MAG (Figura 5)); Yen e Farese, 2003 (atividades gerais de MGATI de camundongo e MGAT2 humano são mais elevados em substratos receptores de acil 2-MAG do que em I-MAG (Figura 5); e Cheng. et al, 2003 (atividade de MGAT3 humano em 2-MAG é muito mais elevado do que em substratos 1/3- MAG (Figura 2D)).
[235] Como aqui utilizado, MGAT não inclui enzimas que transferem um grupo acil, preferencialmente para LysoPA em relação ao MAG, tais enzimas são conhecidas como LPAATs. Ou seja, um MGAT preferencialmente utiliza substratos de monoacil não fosforilados, embora possam ter baixa ati.vidade catalítica em LysoPA. Um MGAT preferencial não tem atividade detectável na acilação de LysoPA. Como aqui mostrado, um MGAT (isto é, MGAT2 de M. musculus) pode também ter a função DGAT mas predominantemente funciona como um mgat, ou seja, tem uma maior ati-vidade catalítica como um MGAT do que como urn DGAT quando a atividade enzimática é expressa em unidades de nmoles de produto/min/mg de proteína (ver também Yen et al., 2002).
[236] Existem três classes conhecidas de MGAT, referidos como, MGATI, MGAT2 e MGAT3, respectivamente. Homólogos do gene MGATI humano {AF384163; SEQ ID NO:7) estão presentes (ou seja, as sequências são conhecidas), pelo menos no chimpanzé, cão, vaca, camundongo, ratg, ppixe-zebra, Caenorhabaütis elegans, Schizosaccha.romyces pombe, Saccharomyces ce.revisiae, Kluyveromyces lactis, Eremothecium gossypii, Magnaporthe grisea, e Neurospora crassa. Homólogos do gene MGAT2 humano (AY157608) estão presentes, pelo menos no chimpanzé, cão, vac'a, camundongo, rato, galinha, peixe-zebra, rnosca da fruta, e mosquito. Os homólogos do gene MGAT3 humano (AY229854) estão presentes pelo menos no chimpanzé, cão, vaca, e peixe-zebra. No entanto, homólogos de outros organismos podem ser prontamente identificados por métodos conhecidos na técnica para a identificação de sequências homólogas.
[237] Exemplos de polipeptídeos MGATI incluem proteínas codificadas por genes MGATI do Homo sapiens (AF384163; SEQ ID NO:7), Mus musculus (AF384162; SEQ ID NO:8), Pan troglodytes
Í (XM_O01166055 e XM_0526044.2; SEQ ID NO:9 e SEQ ID NO:lO, respectivamente), Canis familiaris (XM 545667.2; SEQ ID NO:ll), Bos taurus (NMOO1001153.2; SEQ ID NO:12), Rattus norvegicus (NM 001108803.1; SEQ ID NO:13), Danio rerio MGATI (NMO01122623.1; SEQ ID NO:14), Caenorhabditis elegans (NM_073012.4, NM_182380.5, NM 065258.3, NM 075068.3, e NM_072248.3; SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO':18, e SEQ ID NO:19, respectivamente), Kluyveromyces lactis (XM_455588.1; SEQ ID NO:20), Ashbya gossypii (NM_208895.1; SEQ ID NO:21), Magnaporthe oryzae (XM 368741.1; SEQ ID NO:22), Ciona intestinalis previsto (XM_002120843.1 SEQ ID NO:23). Exerr.plos de polipeptídeos MGAT2 incluem proteínas codificadas por genes MGAT2 de Homo sapiens (AY157608; SEQ ID NO:24), Mus musculus (AY157609.; SEQ ID NO:25), Pan troglodytes {XM_522112.2; SEQ ID NO:26), Canis familiaris (XM 542304.1; SEQ ID NO:27), Bos taurus (NM_O01099136.1; SEQ ID NO:28), Rattus norvegicus (NMOO1109436.2; SEQ ID NO:29), Gallus gallus (XM_424082.2; SEQ ID NO:30), Danio rerio (NM 001006083.1 SEQ ID NO:31), Drosophila melanogaster (NM 136474.2, NM 136473.2, e NM 136475.2; SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, e SEQ ID NO:34, respectivamente), Anopheles gambiae (XM 001688709.1 e XM 315985; SEQ ID NO:35 e SEQ ID NO:36, respectivamente), Triboliuir. castaneum (XM 970C53.1.; SEQ ID NO:37). Exemplos de polipeptídeos MGAT3 j-;?cluem proteínas codificadas por genes MGAT3 de Homo sapiens {AY229854; SEQ ID NO:38), Pan troglodytes (XM 001154107.1, XM 001154171.1, e — XM_527842.2; SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, e SEQ ID NO:41), Canis familiaris {XP4 845212.1;' SEQ ID NO:42), Bos taurus {XM 870406.4; SEQ ID NO:43), Danio rerio (XM 688413.4; SEQ ID NO:44).
[238] Conforme usado aqui "via MGAT" refer{=-se a uma via anabólica, diferente da via de Kennedy para a formação de TAG, na qual DAG é forrnado por acilação de ambos sn-l MAG ou preferencialmente sn-2 MAG, catalisada por MGAT. O DAG podem
135/3?5 subsequentemente ser utilizados para formar' TAG ou outros lipídeos. A via MGAT é exemplificada na Figura 1.
[239] Conforme usado aqui, o termo "diacilglicerol aciltransferase" (DGAT) refere-se a uma proteína que transfere um grupo acil graxo de acil-CoA para um substrato DAG para a produção de TAG. Assim, a "atividade de diacilglicerol aciltransferase" refere-se à transferência de um grupo acil de acil-CoA para DAG para a produção de TAG. A DGAT pode também ter a função MGAT, mas predominantemente funciona como um DGAT, ou seja, tem uma maior atividade catalítica como um DGAT do que como um MGAT quando a atividade enzimática é expressa em unidades de prcduto nmoles/min de proteína/mg (ver, por exemplo, Yen, et. al., 2005).
[240]Ha três tipos conhecidos de DGAT, referidos como DGAT 1, e DGAT 2 DGAT 3, respectivamente. Polipeptídeos DGATI tipicamente possuem 10 domínios transmembranas, polipeptídeos DGAT2 tipicamente possuem dois domínios transu|embrana, enquanto polipeptídeos DGAT3 tipicamente possuem nenhum e pensa-se que sejam solúveis no citoplasma, não integrados membranas. Exemplos de polipeptídeos DGAT 1 incluem proteínas codificadas por genes DGATI de Aspergillus fumigatus (XP 755172.1; SEQ ID NO:347), Arabidopsis thaliana (CAB44774.1; SEQ ID NO:83), Ricinus communis (AAR11479.1; SEQ ID NO:348), Vernicia fordii (ABC94472.1; SEQ ID NO:349), Vernonia galamensis (ABV21945.1 e ABV21946.1; SEQ ID NO:350 e SEQ ID NO:351, respectivamente), Euonymus ' alatus (AAV31083.1; SEQ ID NO:352), Caenorhabditis elegans (AAF82410.1; SEQ ID NO:353), Rattus norvegicus (NP_445889.1; SEQ ID NO:354), Homo sapiens (NP_036211.2; SEQ ID NO:355), assim como variantes e/ou mutantes dos mesmos. Exemplos de oolipeptí'deos DGAT2 incluem proteínas codificadas por gçnes DGAT2 de Ara-bidopsis thaliana (NP_566952.1; SEQ ID NO:2i2), Ricinus communis (AAY16324.1; SEQ ID NO:213), Vernicia fofdii (ABC94474.1; SEQ ID NO:214), Mortierella ramanniana (AAK8417g.1; SEQ ID NO:215), Homo sapiens (Q96PD7.2; SEQ ID No:j?1Q
(Q58HT5.1; SEQ ID NO:217), Bos taurus (Q70VZ8.1; SEQ ID NO:218), Mus musculus (AAK84175.1; SEQ ID NO:219), assirn como variantes e/ou mutantes dos mesmos.
[241]Exemplos de polipeptídeos DGAT3 incluem proteínas codificadas por genes DGAT3 de amendoim (Arachis hypogaea, Saha, et al., 2006), assim como variantes e/ou mutantes do mesmo. A DGAT tem pouca ou nenhuma atividade MGAT detectável, por exemplo, inferior a 300 pmol/min/mg de proteína, preferencialmente menos de 200 pmol de proteína/min/mg, mais preferenci.aZmente de 100 pmol/min/mg de proteína.
[242] DGAT2 mas não DGATI compartilha alta homologia de sequência com as enzimas MGAT, sugerindo que os genes DGAT2 e MGAT provavelmente partilham uma origem genética cornum. Ernbora isoformas múltiplas estejam envolvidas na catalisação do mesmo passo na síntese de TAG, eles podem desempenhar diferentes papéis funcionais como sugerido pela distribuição diferencial do tecido e localização subcelular da família DGAT/MGAT de enzimas.
Nos mamíferos, MGATI é expresso principalmente no estômago, rim, tecido adiposo, enquanto MGAT2 e MGAT3 mostra expressão rnais elevada no. intestino delgado. Nos mamíferos, a DGATI é ubiquamente expressa em muitos tecidos, com rnaior expressão no intestino delgado, enquanto DGAT2 é mais abundante no fígado.
MGAT3 só .existe em mamíferos superieres e humanos, mas não em roedores por análise bioinforn'.ática. MGAT3 compartilha homologia maior de se-quência a DGAT2. do que MGATI e MGAT3. MGAT3 exibe atividade DGAT significativamente rnais elevada do que enzimas MGATI e MGAT2 (MGAT3> MGAT1> MGAT2) quando tanto MAG ou DAGS foram utilizados como substratos, sugerindo que MGAT3 funciona corr.o uma sintase TAG putativa.
[243]Ambos MGATI e MGAT2 pertencem à mesma classe de acúltra.nsferases como DGAT2. Alguns dos motivos que foram demonstrados ser importantes para a atividade catalítica DGAT2 em alguns DGAT2s também estão conservados em. aciltransferases MGAT. De particular interesse é um dornínio putativo de ligação de lipídeos neutros, com a sequência de consenso FLXLXXXN (SEQ ID NO:224), onde cada X é, independentemente, qualquer aminoácido exceto a prolina, e N é qualquer aminoácido apolar, localizado dentro do N-terminal transmembrana seguido por uma região de domínio de glicerol/fosfolipídeo putativo aciltransferase. O motivo FLXLXXXN (SEQ ID NO:224)é encontrado na DGAT2 murina (aminoácidos 81-88) e MGAT1/2, mas não na DGAT2S de leveduras ou plantas. É importante para a atividade do DGAT2 murino. Outros motivos de sequência DGAT2 e/ou MGAT1/2 incluem:
1. Um tripeptídeo YFP altamente conservado (SEQ ID NO:220), na maioria dos polipeptídeos DGAT2 e também em MGATI MGAT2 e, por exemplo, presentes como aminoácidos 139-141 em DGAT2 murino. Mutando este motivo dentro do DGAT2 de levedura com substituições não conservativas rendeu a enzima não funcional.
2. Um tetrapeptídeo HPHG (SEQ ID NO:221), altamente conservado em sequências MGATS bem como em sequências DGAT2 de animais e de fungos, por exemplo, presentes como aminoácidos 161-164 em DGAT2 murino, e importante para a atividade catalítica, pelo menos, em DGAT2 de leveduras e camundongos. DGAT2 aciltransferase de planta tem um EPHS (SEQ ID NC:222), em vez de sequência conservada, então as alterações conservadoras para os, primeiros e quartos aminoácidos podem ser toleradas.
3. Um motivo mais conservado faz parte do domínio putativo do glicerol fosfolipídeo. Um exemplo deste motivo é RXGFX{K/R)XAXXXGXXX(L/V)VPXXXFG{E/Q) (SEQ ID NO:223), que está presente comc aminoácidos 304-327 no DGAT2 murino. Este motivo é menos conservado na sequência de aminoácidos do que os outros como seria de esperar por seu comprimento, mas homólogos podem s(=r reconhecidos por busca de motivo. O espaçamento pode variar entre os aminoácidos mais conservados, ou seja, pode haver X arninoácidos adicionais dentro do motivo, ou menos X aminoácidos em comparação com a sequência acima.
[244]Conforme usado aqui, o termo "glicero.1-3-fosfato- aciltransferase" ou "GPAT" refere-se a uma proteína que acila glicerol-3-fosfato (G-3-P), para forrnar L,YSoPA e/ou MAG, formando este último produto, se o GPAT tiver tarnbém a atividade da fosfatase em LysoPA. O grupo acil que é transferido é tipicamente a partir de acil-CoZi. Assim, o termo "atividade do glicerol-3-fosfato-aciltransferase" refere-se a acilação de' G-3- P para formar LysoPA e/ou MAG. O termo "GPAT" abrange as enzimas que acilam G-3-P para formar sn-l LPA e/ou sn-2 LPA, preferencialmente, sn-2 LPA. Em uma modalidade preferencial., o GPAT tem atividade de fosfatase. Em uma rnodalidade mais prefencial, o GPAT é um sn-2 GPAT tendo atividade de fosfatase que produz sn-2 MAG.
[245] Conforme usado aqui, o termo "sn-l glicerol-3-fosfato- aciltransferase" (sn-l GPAT) refere-se a uma proteína que acila sn-glicerol-3-fosfato (G-3-P), para formar preferencialmente l- acil-sn-glicerol-3-fosfato (sn-l LPA). Assim, o termo "atividade de sn-l glicerol-3-fosfato- aciltransferase" refere-se a acilação de sn-glicerol-3-fosfato, para formar l-acil-sn-- glicerol-3-fosfato de (sn-l LPA).
[246] Conforme usado aqui, o termo "sn-2-glicerol-3-fosfato- aciltransferase" (sn-2 GPAT) refere-se a uma proteína que acila sn-glicerol-3-fosfato (G-3-P) para formar preferencialmente 2- acil- sn-gl.icerol-3-fosfato (sn-2 LPA). Assim, o termo "atividade de sn-2-glicerol-3-fosfato-aciltransferase" reflere-se a acilação de sn-glicerol-3-fosfato, para forrnar 2-acil-sn- glicerol-3-fosfato (sn-2 LPA).
[247]A família GPAT é grande e todos os rríembros conhecidos contêm dois domínios conservados, um domínio plsC aciltransferase (PFO1553; SEQ ID NO:225) e uma hidrolase HAD- like (PF12710; SEQ ID NO:226) domínio de superfamíiia. Além disso, em Arabidopsis thaliana, GPAT4-8, todos contêm um.a região N-terminal homóloga a urrí domínio de fosfatase fosfo-serina (PFO0702; SEQ ID NO:227). GPAT4 GPAT6 e ambos contêm resíduos conservados que são conhecidos por sereIn essenciais para a atividade da- fosfatase, especificamente aminoácidos conservados
139/37'5 (mostrados em negrito) em Motivo I (DXDX[T/V][L/V]; SEQ ID NO:229) e Motivo III (K-[G/S][D/S]XXX[D/N]; SEQ ID NO:330) localizada no N terminal (Yang et al., 2010). Preferencialmente, a GPAT tem preferência sn-2 e atividade de fosfatase para produzir sn-2 MAG (também aqui referido como "2-MAG") de glicerol-3-fosfato (G-3-P) (Figura 1), por exemplo, (GPAT4 (NP_171667.1; SEQ ID NO:144) e GPAT6 (P_181346.1; SEQ ID NO:145) de Arabidopsis. Mais preferencialmente, a GPAT usa acil-CoA como um substrato de ácido graxo.
[248]OS homólogos do GPAT4 (NP 171667.1; SEQ ID NO:144) e GPAT6 (NP_181346.1; SEQ ID NO:145) incluem AAF02784.1 (Arabidopsis thaliana; SEQ ID NO:146), AAL32544.1 (Arabidopsis thaliana; SEQ ID NO:14j), AAP03413.1 (Oryza sativa; SEQ ID NO:148), ABK25381.1 (Picea sitchensis; SEQ ID NO:149), ACN34546.1 (Zea Mays; SEQ ID NO:150), BAFO0762.1 (Arabidopsis thaliana; SEQ ID NO:151), BAHO0933.1 (Oryza sativa; SEQ ID NO:152), EAY84189.1 (Oryza sativa; SEQ ID NO:153), EAY98245.1 (Oryza sativa; SEQ ID NO:154), EAZ21484.1 (Oryza sativa; SEQ ID NO:155), EEC71826.1 (Oryza sativa; SEQ ID NO:156), EEC76137.1 (Oryza sativa; SEQ ID NO:157), EEE59882.1 (Oryza sativa; SEQ ID NO:158), EFJ08963.1 (Selaginella moellendorffii; SEQ ID NO:159), EFJ08964.1 (Selaginella moellendorffii; SEQ ID NO:160), EFJ11200.1 (Selaginella moellendorffii; SEQ ID NO:161), EFJ15664.1 (Selaginella moellendorffii; SEQ ID NO:162), EFJ24086.1 (Selaginella moeliendorffii; SEQ ID NO:163), EFJ29816.1 (Selaginella moellendorffii; SEQ ID NO:164), EFJ29817.1 (Selaginella moellendorffii; SEQ ID NO:165), NP_O01044839.1 (Oryza sativa; SEQ ID NO:166), NP_O01045668.1 (Oryza sativa,; SEQ ID NO:167), NP_O01147442.1 (Zea mays; SEQ ID NO:168), NP_O01149307.1 (Zea mays; SEQ ID NO:169), 'NP 001168351.1 (Zea mays; SEQ ID NO:170), AFH02724.1 (Brassica napus; SEQ ID NO:171) NP_191950.2 (Arabidopsis thaliana; SEQ ID NO:172), XP 001765001.1 (Physcomitrella patens; SEQ ID NO:173), XP 00176967(1 (Physcomitrella patens; SEQ ID NO:174),
XP 001769724.1 (Physcomitrella patens; SEQ ID NO:175), XP 0017"71186.1 (Physcomitrella patens; SEQ ID NO:176), XP 001780533.1 (Physcomitrella patens; SEQ ID NO:177), XP_002268513.1 (Vitis vinifera; SEQ ID NO:178), XP_00227"í348.1 (Vitis vinifera; SEQ ID NO:179), XP_002276032.1 (Vitis vinifera; SEQ ID NO:180), XP_002279091.1 (Vitis vinifera; SEQ ID NO:181), XP_002309124.1 (Populus trichocarpa; SEQ ID NO:182), XP 002309276.1 (Populus tr4chocarpa; SEQ ID NO:183), — XP_002322752.1 (Populus trichocarpa; SEQ ID NO:184), XP_002323563.1 (Populus trichocarpa; SEQ ID NO:185), XP_002439887.1 (Sorghum bicolor; SEQ ID NO:186), XP_002458786.1 (Sorghum bicolor; SEQ ID NO:187), XP_002463916.1 (Sorghum bicolor; SEQ I DNO:188), XP 002464630.1 {Sorghum bicolor; SEQ I — DNC:189), XP_002511873.1 (Ricinus communis; SEQ ID NO:190), XP_002517438.1 (Ricinus communis; SEQ ID NO:191), XP_00252017i.1 {Ricinus conmunis; SEQ ID NO:192), XP_002872955.1 (Arabidopsis lyrata; SEQ ID NO:193), XP 002881564.1 (Arabidopsis lyrata; SEQ — ID NO:194), ACT32032.1 (Vernicia fordii; SEQ ID NO:195), NP 001051189.1 (Oryza, sativa; SEQ ID NO:196), AFH02725.1 — (Brassica napus; SEQ ID NO:197), XP 002320138.1 (Populus trichocarpa; SEQ ID NO:198), XP 002451377.1 (Sorghum bicolor; SEQ ID NO:199), XP_OG2531350.1 (Ricinus communis; SEQ ID NO:200), and XP_002889361.1 (Arabidopsis lyrata; SEQ ID NO:20I).
[249]Motivos conservados e/ou resíduos podem ser utilizados como um diagnóstico baseado na sequência de identificação de GPAT bifuncionais/enzimas fosfatase. Alternativamente, um ensaio mais rigoroso baseado em função poderia ser utilizado. Tal ensaio envolve, por exemplo, a alimentação de céluias ou microssomos com glicerol-3-fosfato marcado e Quan.tificaç(ã.o dos níveis de produtos rotulados por cromatografia em camada fina ou uma técnica semelhante. Atividade de GPAT resulta na produção de LPA marcado enquanto que GPAT/atividade de fosfatase resulta na proçíução de MAG rr.arcado.
[250]Como aqui utilizado, o termo "Oleosina" refere-se a uma proteína anfipática presente na membrana de corpos oleosos dos tecidos de armazenagem de sementes (ver, por exemplo, Huang, 1996; Lin et al, 2005.; Capuano et al, 2007.; Lui et al, 2009.; Shimada e Hara-Nishimura, 2010).
[251] Sementes de planta acumulam ' TAG em estruturas subcelulares chamadas corpos oleosos. Essas organelas consistem em um núcleo TAG circundado por uma monocamada de fosfolipídeos contendo várias proteínas embutidas incluindo oleosinas (Jolivet et al., 2004). Oleosinas representam a proteína mais abundante da membrana. de corpos oleosos.
[252]Oleosinas são de baixo M, (15-26.000). Dentro de cada uma das espécies de sementes, geralmente há duas ou mais oleosinas de diferentes M,. Cada molécula de oleosina contém um domínio relativamente hidrofílico do terminal N (por exemplo, cerca de 48 resíduos de aminoácido), um domínio hidrofóbico totalmente central (por exemplo, cerca de 70-80 resíduos de aminoácidos), o que é particularmente rico em aminoácidos alifáticos como alanina, glicina, leucina, isoleucina e valina, e um domínio de a-hélice anfipático (por exemplo, cerca de cerca de 33 resíduos de aminoácidos), ou perto do C terminal. Geralmente, a extensão central de resíduos hidrófobos é inserida no núcleo lipídico e o anfipático C terminal e/ou anfipático N terminal estão localizados na superfície dos corpos oleosos, com resíduos carregados positivamente embutidos eIn uma monocamada de fosfolipídio e aqueles carregados negativamente expostos ao exterior.
[253]Como aqui utilizado, o termo "oleosina" engloba polioleosinas que têm múltiplos polipeptídeos oleosina fundidos como um único polipeptídeo, por exemplo, 2x, 4x ou 6x peptídeos de oleosina, e caleosinas que ligam cálcio (Froissard et al. 2009), e esteroleosinas que ligam esteróis. No entanto, em geral, uma grande proporção das oleosinas de corpos oleosos não será caleosinas e/ou esteroleosinas.
[254]Um número substancial de sequências de proteína oleosina, e sequências de nucleotídeo que codificam para estes, são conhecidos a partir de um grande número de diferentes espécies de plantas.
Exemplos incluem, entre outros, oleosinas de Arabidposis, canola, milho, arroz, amendoim, rícino, soja, · linho, uva, repolho, algodão, girassol, sorgo e cevada.
Exemplos de oleosinas (com os Nos. de Acessões) incluem oleosina de Brassica napus (CAA57545.1; SEQ ID NO:362), oleosina Sl-l de Brassica napus (ACG69504.1; SEQ ID NO:363), oleosina S2-1 de Brassica napus (ACG69503.1; SEQ ID NO:364), oleosina S3--1 de Brassica napus (ACG69513.1; SEQ ID NO:365), oleosina S4-1 de Brassica napus (ACG69507.1; SEQ ID NO:366), oleosina S5-1 de Brassica napus (ACG69511.1; SEQ ID NO:367), oleosina 1 Arachis hypogaea (AAZ20276.1; SEQ ID NO:368), oleosina 2 de Arachis hypogaea (AAU21500.1; SEQ ID NO:369), oleosina 3 de Arachis hypogaea {AAU21501.1; SEQ ID N?:370), oleosina 5 de Arachis hypogaea (ABC96763.1; SEQ ID NÒ:371), oleosina 1 de Ricinus communis (EEF40948.1; SEQ ID N(K372Á oleosina 2 de Ricinus communis (EEF51616.1; SEQ ID NÓ:373), oleosina isoforma a de Glycine max (P29530.2; SEQ ID NO:374), oleosina isoformas b de Glycine ínax (P29531.1; SEQ ID'NO:375), oleosina isoforma de baixo peso molecular de Linum ubitatissimum (ABBO1622.1; SEQ ID
NO:376), oleosina isoforma de alto peso molecular de Linum usitatis'simuin (ABBO1624.1; SEQ ID NO:37j), ol-eosina de Helianthus annuus (CAA44224.1; SEQ ID NO:378), cjeosina de Zea mays (NP 001105338.1; SEQ ID NO:379), esteroleosina de Brassica napus (ABM30178.1; SEQ ID NO:380), esteroleosina SLOl-l de Brassica napus (ACG69522.1; SEQ ID NO:38I), esteroleosina SLO2-1 de Brassica napus (ACG69525.1; SEQ ID NO:382), esteroleosina de
Sesamum indicum (AALI3315.1; SEQ ID NO:383), esteroleosina de Zea mays (NP 001152614.1; SEQ ID NO:384), caleosina CLO-l de Brassica napus (ACG69529.1; SEQ ID NO:385), caleosina CLO-3 de Brassica Eapus (ACG69527.1; SEQ ID NO:386), caleosina de Sesamum -indicum (AAF13743.1; SEQ ID NO:387), caleosina de Zea mays (NP_O01151906.1; SEQ ID NO:388).
[255]Como aqui utilizado, o termo um "polipeptídeo envolvido na biossíntese de amido" refere-se a qualquer polipeptídeo, a regulação negativa da qual em uma célula níveis abaixo do normal (do tipo selvagem) resultam em uma redução no nível da síntese de amido e um aumento nos níveis de amido. Um exemplo de um tal polipeptídeo é AGPase.
[256]Como aqui utilizado, o termo "fosforilase ADP-glicose" ou "AGPase" refere-se a uma enzima que regula a biossíntese de amido, que catalisa a conversão de glicose-l-fosfato e ATP a AOP-glicese, que serve como o bloco de construção de polímeros de amido. A forma ativa da enzima AGPase consiste errt 2 grandes e 2 pequenas subunidades. [257jA enzima AOPase em plantas existem princi-palmente como um tetrâmrro que consiste em 2 grandes e 2 pequenas subunidades. Embora estas subunidades difiram nas suas funções catalíticas e regulatórias, dependendo da espécie (Kuhn et al. 2009), em plantas a pequena subunidade geralmente exibe atividade catalítica. O peso molecular da subunidade pequena é de aproximadamente 50-55 kOa. O peso molecular da subunidade grande é de aproximadamente 55-60 kDa. A enzima de planta é fortemente ativada pela 3-fosfoglicerato (PGA), um produto de fixação do dióxido de carbono; na ausência de PGA, a enzima apresenta apenas cerc.a de 3% da sua atividade. AGPase de planta também é fortemente inibida por fosfato inorgânico (Pi). Em contraste, AGPase bacteriana e de algas existem como homotetrâmeros de 50 kDa. A enzima de algas, como o seu homólogo da planta, é ativada pela PGA e inibida por Pi, enquanto que a enzima bacteriana é ati-vada pela frutose-1,6-bisfosfato (FBP) e inibida pelo AMP e Pi.
[258]Como aqui utilizado, o termo "polipeptídeo envolvido na degradação de lipídeos e/ou que reduz o teor de lipídeos" refere-se a qualquer polipeptídeo, a regulação negativa de uma célula na qual níveis abaixo do normal (tipo selvagem) resultam em um aumento do nível de óleo, como ácidos graxos e/ou TAGs, na célula, preferencialmente uma célula do tecido vegetativo de uma planta. Exemplos de tais polipeptídeos incluem, entre outros, lipases, ou uma lipase como polipeptídeo CGi58, lipase triacilglicerol DEPENDENTE DE AÇÚCAR-I (ver, por exemplo, Kelly et al., 2012) ou uma lipase descrita em WO 2009/027335.
[259]Como aqui utilizado, o termo "lipase" refere-se a uma proteína que hidrolisa gorduras em glicerol e ácidos graxos. Assim, o termo "atividade de lipase" refere-se à hidrólise de gorduras em glicerol e ácidos graxos.
[260] Como aqui utilizado, o termo "CGi58" refere-se a um ácido lisofosfatídico aciltransferase dependente de acil-CoA soIúvel também conhecida na técnica como "At4g24160" (em plantas) e "Ictlp" (em levedura). O gene da planta, como o do locus. do gene de Arabidopsis, At4g24160, é expresso como dois transcritos alternativos: uma isoforma de comprimento completo maior (At4g24160.1) e uma isoforma de menor (At4g24160.2) faltando uma porção da extremidade 3' (ver james et al, 2010; Ghosh et al, 2009; US 201000221400). Ambos os códigos mRNAs para uma proteína que é homóloga à proteína CGI-58 humana e outros membros ortólogos desta família a/j3 hidrolase (ABHD). Em uma rnodalidade, a proteína CGI58 (At4g24160) contém três motivos que são conservados entre espécies de plantas: um motivo lipase GXSXG (SEQ ID NO:419), um motivo HX(4)D aciltransferase (SEQ ID NO:420), e um motivo VX(3)HGF, um motivo de lic'ação provável de lipídeos (SEQ ID NO:421). A proteína CGI-58 humana tem atividade de ácido lisofosfatídico aciltransferase (LPAAT), mas não a atividade lipase. Em contraste, as proteínas de plantas e levedura possuem um motivo GXSXG de sequência de lipase canônica (SEQ ID NCi:419), que está ausente em vertebrados (humanos, camundongos, e as proteínas de peixe-zebra). Embora as proteínas de plantas e levedura CGI58 pareçam possuir quantidades detectáveis de atividades de TAG lipase e fosfolipase D além da atividade LPAAT, a proteína humana não.
[261]0 rompimento de gene homólogo CGI-58 em Arabidopsis thaliana résulta na acumulação de gotículas lipídicas neutras nas foihas maduras. Espectroscopia de massa de gotículas lipídicas isoladas de cgi-58 mutantes de perda de função mostrou que eles contêm triacilgliceróis com ácidos graxos comuns específicos de folhas. Folhas de plantas cgi-58 maduras apresentam um aumento marcado dos níveis absolutos de triacilglicerol, mais do que 10 vezes mais elevado do que em plantas de tipo selvagem. Os níveis lipídicos nas sementes de armazenamento de óleo de plantas cgi-58 de perda de função mantiveram-se inalterados, e diferentes mutações em j3-oxidação, as sementes cgi-58 gerrninaram e cresceram norrnalmente, sem necessidade de resgate com sacarose (james et al., 2010).
[262]Exemplos de polipeptídeos CGi58 incluem proteínas a partir de Arabidopsis thaliana (NP 194147.2; SEQ ID NO:429), Brachypodium distachyon (XP_003578450.1; SEQ ID No:430), Glycine max (XP OC3523638.1; SEQ ID NO:431), Zea mays (NP 001149013,1; SEQ ID NO:432), Sorghum bicolor (XP_002460538.1; SEQ ID NO:433), Ricinus communis (XP 002510485.1; SEQ ID NO:434), Medicago truncatula (XP 003.603.733.1; SEQ ID : 435), e Oryza sativa (EAZ09J82.1; SEQ ID NO:436). {263]Como aqui utilizado, o terrno "cotilédone frondoso 2" ou "LEC2" refere-se a um fator de transcrição do domínio B3 que participa em embriogênese zigótica e somática. Sua expressão ectópica facilita a embriogênese a partir de tecidos de plantas vegetativas (Alemanno et al., 2008). LEC2 também compreende urna região de ligação de DNA encontrada até agora apenas em proteínas vegetais. Exemplos de polipeptídeos , LEC2 incluem proteínas a nartir de Arabidopsis thaliana (NP 564304.1) (SEQ ID NO:442), Medicago truncatula (CAA42938.1) (SEQ ID No:443) e Brassica napus (ADO16343.1) (SEQ ID NO:444).
[264] Como usado aqui, o termo "BABY BOOM" ou "BBM" refere- se um fator de transcrição que induz a regeneração AP2/ERF em condições de cultura que normalmente não suportam a regeneração em plantas do tipo selvagem. A expressão ectópica de genes BBM de Brassica napus (BnBBM) em B. napus e Arabidopsis induz embriogênese somática espontânea e organogênese a partir de mudas cultivadas em meio basal sem hormônio (Boutilier et al., 2002). Em tabaco, expressão BBM ectópica é suficiente para induzir brotações adventícias e regeneração de raízes em meio basal, mas citocinina exógena é necessária para formação de embriões somáticos (SE) (Srinivasan et al., 2007). Exernplos de polipeptídeos BBM incluem proteínas de Arabidopsis thaliana (Nl?_197245.2) (SEQ ID NO:445) e Medicago truncâtula (AAW82334.1) (SEQ ID NO:446).
[265] Como aqui utilizado, o termo "FAD2" refere-se a um ácido graxo delta-12 desaturase ligado à membrana que dessatura ácido oleico (18: 1^9) para produzir o ácido linoleico (C18: 2L!.9,l2) ,
[266]Como aqui utilizado, o .termo "epoxigenase" ou "epoxigenase de ácido graxo" refere-se a uma enzima que introduz um grupo epoxi em um ácido graxo, resultando na produção de um ácido graxo de epóxi. Na modalidade preferencial, o grupo epoxi é introduzicío no 12° carbono em uma cadeia de ácido graxo, erri cujo caso 2.- epoxigenase é uma Lj12-epoxigenase, especialmente de uma cadeia de ácido graxo C16 ou C18. A epoxigenase pode ser uma A9-epoxigenase, uma LJ15 epoxigenase, ou atuar em urna posição diferente da cadeia de acil, como conhecido na técnica. O epoxigenase pode ser da classe E'450. Epoxigenases preferenciais são da classe mono-oxigenase, como descrito em W098/46762. Várias epoxigenases ou epoxigenases presumidas foram clonadas e são conhecidas na técnica. Outros exeniplos de epoxigenases incluem proteínas que compreendem uma sequência de aminoácidos fornecida na SEQ ID NO:21 do docurnento WO 2009/129582, polipeptídeos codificados por genes de Crepis pã.zeastina (CAA76156, Lee et al, 1998.), Stokesia laevis (AAR23815, Hatanaka et al., 2004) (tipo mono-oxigenase), Euphorbia lagascae (AAL62063) (tipo P450), CYP2J2 humana (ácido araqui)dônico epoxigenase, U37143); CYPIAI humano (ácido araqui)dônico epoxi-genase, K03191), bem como as variantes e/ou mutantes.
[267] Como aqui utilizado, o termo, "hidroxilase" ou "hidroxilase de ácidos graxos" refere-se a uma enzirna que introduz um grupo hidroxilo num ácido graxo, resultando na produção de um ácido graxo hidroxilado. Em uma modalidade preferencial, o grupo hidroxil é introduzido no 2°, 12° e/oú 17° carbono em uma cadeia de ácido graxo C18. Preferencialmente, o grupo hidroxil é introduzido no 12° carbono, caso em que a hidroxilase é uma Lj12-hidroxilase. Em urna outra modalidade preferencial, o grupo hidroxil é introduzido no 15° carbono na cadeia de ácido graxo C16. Hidroxilases também podem ter uma atividade enzimática, como uma dessaturase de ácido graxo. Exemplos de genes que codificam Lj12-hidroxilases incluem aqueles de Ricinus communis (AAC9010, van de Loo, 1995); Physaria lindheimeri, (ABQO1458, Dauk et al, 2007); Lesquerella fendleri, (AAC32755, Broun et al, 1998.); Daucus carota (AAK30206); hidroxilases de ácidos graxos que hidroxilam o terminal de ácidos graxos, por exemplo: A. thaliana CYP86A1 (P48422, ácidos graxos (Ú-hidroxilase); Vicia sativa CYP94A1 (P98188, ácido graxo @-hidroxilase); CYP2E1 de camundongo (X62595, ácido láurico cu-1 hidroxilase); CYP4A1 de rato (M57718, ácido graxo új- hidroxilase), bem como como as variantes e/ou mutantes.
[268] Corno aqui utilizado, o termo "conjugase" ou "ácido cjraxo conjugase" refere-se a uma enzima capaz de formar uma ~ ligação conjugada na cadeia de acil de um ,ácido graxo. Exemplos de conjugases incluem os codificados, por genes de Calendula officinal.is (AF343064, Qiu et al, 2001); Vernicia fo.rdii (AAN87574, Dyer et al, 2002); Punica . granatum (AY178446, Iwabuchi et al, 2003) e Trichosanthes kirilowii (AY178444, Iwabuchi e"t al, 2003); bem como variantes e/ou mutantes.
[269]Corrio aqui utilizado, o termo "acetilenaje" ou "ácido graxo acetilenase" refere-se a uma enzima que ) introduz uma ligação tripla em um ácido graxo, resultando na Êirodução de um ácido graxo acetilênico. Em uma modalidade, a liçjação tripla é introduzida no 2°, 6°, 12° e/ou 17° carbono em uma cadeia de ácido graxo C18. Exemplos de acetilenases incluem aqueles de Helianthus annuus (AA038032, ABC59684), bem como as variantes e/ou mutantes.
[270] Exemplos de tais ácidos graxos modificadores de genes incluem proteínas de acordo com os seguintes números de Acessão que são agrupados por função putativa, e homólogos de outras espécies: LI12 acetilenases ABCO0769, CAA76158, AAO38036, AAO38032; Lj12 conjugases AAG42259, AAG42260, AAN87574; A12 dessaturases P46313, ABS18716, AAS57577, AAL61825, AAF04093, AAF04094; LJ12 epoxigenases XP_O01840127, CAA76156, AAR23815; LJ12 hid'roxilases ACF37070, AAC32755, ABQO1458, AAC49010; e as enzimas P450 LJ12, tal como AF406732.
[271] Como aqui utilizado, c) termo "tecido vegetativo" ou "parte vegetativa da planta" é qualquer tecido da planta, órgão ou parte além dos órgãos de reprodução sexuada de plantas, especialmente sementes tendo órgãos, flores, pólen, frutos e sementes. Tecidos e partes vegetativos incluem, pelo menos, as folhas das plantas, caules (incluindo botões e rebentos, i'nas excluindo as cabeças), tubérculos e raízes, mas exclui as flores, pólen, semente incluindo o tegumento, embrião e endosperma, frutas incluindo tecido mesocarpo, vagens com sementes e cabeças com seinentes. Em uma modaliclade, a parte vegetativa da planta é uma parte da plan'Ca aérea. Ern outra modalidade, a parte da planta vegetativa é uma parte verde como uma folha.ou caule.
[272] Como aqui utilizado, o termo "de tipo selvagem" ou as suas variações refere-se a uma célula, ou organismo não hurnano ou parte do mesmo, que não foi geneticamente modificado.
[273] O termo "correspondente" refere-se a uma parte vegetativa da planta, urna c.élula ou oroanismo não humano ou parte do mesmo, ou semente que tem o mesmo ou semelhante furidamento genético como uma parte vegetatíva da planta, urna célula ou organismo não humano ou parte do mesmo, ou sernente da invenção, mas que não tenha sido modificado, como aqui descrito (por exernplo, uma parte vegetativa da planta, uma célula ou organismo não humano ou parte do mesmo, ou sernente é desprovida de um polinucleo'tídeo exógeno que codifica um MGAT ou um MGAT exógeno). Em uma modalidade preferencial, uma parte da planta vegetativa, uma célula, ou organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente está no mesmo estágio de desenvolvimento, como uma parte vegetativa da planta, uina célula ou organismo não hurnano ou parte do mesmo, ou semente da invenção. Por exemplo, se o organismo não hurnano é uma planta, em seguida, preferencialmente, a planta correspondente é também floração.
Uma parte vegetativa da planta correspondente, uma célula ou organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente pode ser utilizada como controle, para comparar c)s níveis de ácido nucleico Qu a expressão da proteína, ou a extensão e natureza da modificação característica, por exernplo, produção de lipídeos apolares e/ou conteúdo, com uma parte vegetativa da planta, uma célula ou organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente modificada como aqui descrito. Um especialista na técnica é capaz de determinar prontamente uma célula "correspondente" adequada, tecido, órgão ou organismo para tal comparação.
[274] Como aqui utilizado "em comparação com" refere-se à comparação dos níveis de lipídeos apolares ou conteúdo de 1ipídeos a.polares do organismo transgênico não hurnano ou parte do mesmo que expressam um ou mais polinucleotídeos exógenos ou polipeptídeos exógenos com um organisrno transgênico não humano ou parte do mesmo sem o um ou mais polinucleotídeos exógenos ou polipeptídeos.
[275] Conforme usado aqui, "capacidade aumentada para produzir lipídeo não polar" é um termo relativo, que se refere à quantidade total de lipídeo apolar a ser produzida por uma célula ou organismo não humano ou parte do mesmo da invenção é aumentada em relação à uma célula correspondente, ou organismo não humano ou parte do mesmo. Em uma modalidade, o TAG e/ou teor de ácido graxo poli-insaturado do lipídeo apolar é aumentada.
[276] Como aqui utilizado, "germinar em uma taxa substanci.almente igual que para um tipo selvagem da planta correspondente" refere-se às sementes de uma planta da invenção sendo relativamente férteis, quando comparadas corri as sementes de uma planta de tipo selvagem sem os polinucleotídeos exógenos definidos. Em uma modalidade, o número de sementes que germinam, por exemplo, quando cultivada sob condições de estufa ideais para as espécies de planta,", é, pelo menos, 75%, mais preferencialmente pelo menos 90%, do que quando comparado com a semente tipo selvagem correspondente. Em outra modalidade, as sementes que germinam, por exemplo, quando cultivadas sob condições de estufa ideais para as espécies de plantas, cresceui ern uma velocidade que, em média, é de pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 90%, de que quando comparado com as correspondentes plantas do tipo selvagem.
[277] Conforme usado aqui, o termo "um polinucleotídeo isolado ou recombinante que regula a produção e/ou atividade de uma enzima endógena" ou variações do rnesmo, refere-se a um polinucleotídeo que codifica uma molécula de RNA que regula a produção e/ou a atividade (por exemplo, a codificação de um s1RNA, hpRNAi), ou regula a produção e/ou a atividad.e para menos {por exemplo, é um S1RNA que pode ser entregue diretamente a, por exemplo, uma célula) de uma enzima endógena, por exemplo, DGAT, sn--l glicerol-3-fosfato aciltransferase (GPAT), 1-acil- glicerol-3-fosfato aciltransferase (LPAAT), acil- CoA:lisofosfatidileolino aciltransferase (LPCAT), fosfatase de ácido fosfatídico (PAP), AGPase ou ácido graxo delta-12 desaturase (FAD2) ou uma c.ombinação de dois ou mais dos mesmos.
[278]Conforme usado aqui, o termo "em urna base de peso" refere-se ao peso de uma substância (por exemplo, TAG, DAG, ácidos graxos), como uma percentagem do peso da composição que compreende a substância (por exemplo, sementes, folhas). Por exemplo, se a semente transgênica tiver 25 µg total de ácidos
151,/375 graxos por 120 µg de peso da semente, a percentagem de ácidos graxos totais, em uma base de peso é de 20,8%.
[279] Conforme usado aqui, o termo "em uma base relativa" refere-se à quantidade de uma substância de uma composição que compreende a substância, em comparação com uma composição correspondente, como uma percentagern.
[280] Conforme usado aqui, o termo "teor de não lipídeos relativo" refere-se a expressão do teor de lipídeos apolares de uma célula, organismo ou parte do mesmo, ou lipídeo extraído d.elas, em comparação com uma célula correspondente, organismo ou parte do mesmo, ou o lipídeo extraído da célula correspondente, organismo ou parte deste, como uma percentagem. Por exernplo, se a semente transgênica tiver 25 µg total em ácidos graxos, enquanto que as sementes correspondentes tinham 20 µg total de ácidos graxos, o aumento do conteúdo lipídico apolar em uma base relativa é igual a 25%.
[281] Como aqui utilizado, o termo "biocombustível" refere- se a qualquer tipo de combustível, como tipicamente usado para alimentar máquinas, como automóveis, caminhões ou motores alimentados por petróleo, cuja energia é derivada de fixação de carbono bi.ológico. Biocombustíveis incluem combustíveis derivados da conversão de biomassa, bern como a biornassa sólida, combustíveis líquidos e biogás. Exemplos de biocombustíveis incluem bioálcool, biodiesel, diesel sintético, óleo vegetal, bioéteres, biogás, gás de síntese, biocorrtbustíveis sólidos, combustível derivado de algas, biohjdrogênio, biometanol, 2,5- Dimetilfurano (DMF), éter biodimetil (bioDME), diesel de Fischer-Tropsch, diesel biohidrogênio, álcoois mistos e do diesel de mad.eira.
[282] Como aqui utilizado, o terrno "bioálcool" refere-se aos álcoois produzidos biologicamente, por exemplo, ePnoi, propanol e butanol. Bioálcoois são produzidos pela aÇão de micro- organismos e/ou enzimas, por meio da fermentaçãjo de açúcares, celulose ou hemicelulose.
152,'375
[283] Como aqui utilizado, o termo "biodiesel" refere-se a uma composição compreendendo ésteres etil ou metil de ácidos graxos derivados de lipídeos apolares por ou transesterificação.
[284] Como aqui utilizado, o termo "diesel sintético" refere-se a uma forma de combustível diesel, que é derivado a partir de matérias-primas renováveis ern vez de a rnatéria-prima fóssil utilizada na maioria dos combustíveis diesel.
[285] Como aqui utilizado, o termo "óleo vegetal" inclui um óleo vegetal puro (ou óleo vegetal puro) ou um óleo vegetal de resíduo (por produto de outras indústrias). {286] Como aqui utilizado, o termo "bioéteres" refere-se aos compostos que atuam como inten3ificadores de octanos.
[287] Como aqui utilizado, o termo "biogás" refere-se a metano ou uma mistura inflamável de metano e outros gases produzidos pela digestão anaeróbica da rnatéria orgânica por anaeróbios.
[288] Como aqui utilizado, o termo "gás de síntese" refere- se a uma mistura de gases que contém quantidades variáveis de monóxido de carbono e hidrogênio e, eventualmente, de outros hidrocarbonetos, produzidos pela cornbustão parcial da biomassa.
[289] Como aqui utilizado, o termo "biocombustíveis sólidos" inclui .madeira, serradura, grama cortada, e as culturas de energia não alimentares.
[290] Como aqui utilizado, o termo "etanol celulósico" refere-se ao etanol produzido a partir de celulose ou a hemicelulose.
[291] Como aqui utilizado, o termo "cornbustível de algas" refere-se a um biocombustível feito a partir de algas e inclui o biodiesel de algas, biobutanol, biogasolina, metano, etanol,, e o equivalente de óleo vegetal feito a partir das algas.
[292]Como aqui utilizado, o termo "bio-hidrogênio" refere- se ao hidrogênio produzido biologicamente, por exemplo, as algas.
[293] Como aqui utilizado, o termo "biometanol" refere-se ao ,
metanol produzido biologicamente. Biometanol pode ser produzido por gaseificação de matérias orgânicas para gás de síntese, seguido de síntese de metanol convencional.
[294] Como aqui utilizado, o termo "2,5-Dimetilfurano" ou "DMF" refere-se a um composto heterocíclico com a fórmula (CH3)2C4H2O. DMF é um derivado do furano que é derivável a partir de celulose.
[295] Como aqui utilizado, o termo "éter biodimetil" ou "B1ODME", também conhecido como metoximetano, refere-se a um composto orgânico com a fórmula CH3OCH3. Gás de síntese pode ser convertido em metanol na presença de um catalisador (geralmente baseado em cobre), com a subsequente desidratação de metanol na presença de um catalisador diferente (por exemplo, sílica- alumina) que resulta na produção de DME.
[296] Como aqui utilizado, o termo "Fischer-Tropsch" refere- se a um conjunto de reações químicas que convertem uma mistura de monóxido de carbono e hidrogênio em hidrocarbonetos líquidos. O gás de síntese pode ser primeiramente condicionado utilizando, por exemplo, um deslocamento de gás de água para conseguir a necessária proporção H2/CO. A conversão ocorre na presença de um catalisador, geralmente de ferro ou cobalte. A temperatura, pressão e catalisador determinam se um syncrude leve ou pesado é produzido. Por exemplo, a 330°C a maior parte da gasolina e olefinas são produzidas enquanto que a 180° a 250°C a maior parte do diesel e ceras é produzida. Os líquidos prodU.zidos a partir de gás de síntese, que compreendern várias frações de hidrocarbonetos, são hidrocarbonetos de cadeia linear muito limpos (livres de enxofre). Diesel de Fischer-Tropsch pode ser produzido diretamente, mas um rendimento maior é alcançado se primeiro a cera de Fischer-Tropsch é produzida, seguido de hidrocraqueamento. [297Í Como aqui utilizado, o termo "biocarvão" refere-se ao carvão a partir da biomassa, por exemplo, por pirólise da biomassa.
[2')8] Como aqui utilizado, o termo "matéria-prima" refere-se a um material, por exemplo, biomassa ou de um produto de conversão do mesmo (por exemplo, gás de síntese), quando utilizado para a produção de um produto, por exemplo, biocombustível como biodiesel ou um diesel síntético.
[299] Como aqui utilizado, o termo "produto industrial" refere-se a um produto de hidrocarboneto que é predominantemente feito de carbono e de hidrogênio, como ésteres metil e/ou etil de ácidos graxos ou os alcanos, como o metano, rnisturas' de alcanos de cadeia mais longa, que são tipicamente líquidos à tempera'tura ambiente, um biocombustível, monóxido de carbono e/ou hi.drogêriio, ou um bioálcool, como etanol, propanol, ou butanol, ou biocarvão. O termo "produto industrial" pretende incluir produtos intermediários que podem ser convertidos para outros produtos industriais, por exemplo, gás de síntese é em si considerado um produto industrial que pode ser utilizado para sintetizar um produto de hidrocarboneto, o qual tambérn é considerado um produto industrial. O termo produto industrial como aqui utilizado, inclui ambas as formas puras dos compostos anteriores, ou mais comumente uma mistura de vários compostos e componentes, por exemplo, o produto de hidrocarboneto pode conter uma gama de comprimentos da cadeia de carbono, corno. bem entendido na técnica.
[300] Como aqui utilizado, "brilho" refere-se a um fenômeno óptico causado quando se avalia a aparência de urna superfície. A avaliação de brilho descreve a capacidade de uina superfície em refletor a luz dirigida.
[301]Ao longo deste relatório descritivo, a palavra "compreenderr.", ou variações como "compreende" ou "compreendendo", será entendida como implicando a inclusão de um elemento declarado, inteiro ou etapa, ou grupo de elementos, inteiros ou etapas, mas não a exclusão de qualquer outro elemento, inteiro ou etapa, ou grupo de elementos, inteiros ou etapas.
[302] O termo "e/ou", por exemplo, "X e/ou Y" deve ser entendido conio qualquer um "X e Y" ou "X ou Y", e devem ser tomadas para fornecer suporte explícito para ambos os significados ou para qualquer significado.
[303] Como aqui utilizado, o termo cerca de, salvo se declarado o contrário, refere-se a +/-10%, mais preferencialmente +/- 5%, mais preferencialmente +/- 2%, mais preferencialmente +/- 1%, ainda mais preferencialmente +/- 0,5%, do valor indicado. Produção de Diacilgliceróis e Triacilgliceróis
[304] Ein uma modalidade, a parte de planta vegetativa, o organismo transgênico não humano ou parte da invenção produz níveis mais elevados de lipídeos apolares, corno DAG ou TAG, preferencialmente arnbos, do que uma parte de planta vegetativa, um organismo não humano correspondente ou parte do mesmo. Em um exemplo, as plantas transgênicas da presente invenção produzem sementes, folhas, porções de folha de pelo menos 1cm2 err, áreas de superfície, caules e/ou túberos tendo um teor lipídico apolar aumentado como DAG ou TAG, preferencialmente ambos, quando comparado com sementes correspondentes, folhas, porções de folhas de pelo menos 1cm2 em área de superfície, caules ou túberos. O teor de lipídeos apolares da parte de planta vegetativa, organismo não humano ou uma parte do mesmo é 0,5% superior em relação ao peso, quando comparado com um organismo não humano correspondente ou parte do mesmo ou como ainda definido na Característica (I).
[305] Em outra modalidade, a parte de planta vegetativa, o organismo transgênico não humano ou parte do mesmo, prefere.ncialmente, uma planta ou semente, produz DAGS e/ou TAGS que são enriquecidos para um ou mais ácidos graxos particulares. Um"largo espectro de ácidos graxos pode ser incorporado erri DAGs e/ou TAGS, incluindo ácidos graxos saturados e insaturados e ácidos graxos de cadeia curta e de cadeia longa. Alguns exemplos não limitativos de ácidos graxos que podem ser incorporados em
DAGS e/ou TAGs e que podem ser aumentados em nível incluem: ácidos graxos cáprico (10:0), láurico (12:0), mirístico (14:0), palrnítico (16:0), palmitoleico (16:1), esteárico (18:0), oleico (18:1), vacênico (18:1), linoleico (18:2), eleosteárico (18:3), Y-iinolênico (18:3), a-linoleico (18:3@3), estearidonico (18:4cú3), araquidico (20:0), eicosadienoico (20:2), ácido dihomo-\(-iinoleico (20:3), eicosatrienoico (20:3), ácido araquidonico (20:4) eicosatetraenoico (20:4), eicosapentaenoico (20:5cú3), beenico (22:0), docosapentaenoico (22:5Cú), docosa- hexaenoico (22:6co3), lignocérico (24:0), nervonico (24:1), cerótico (26:0), e montânico (28:0). Ern urria modalidade da presente invenção, a parte de planta vegetativa,. o organismo transgênico ou partes do mesmo é enriquecido para DAGS e/ou TAGS que compreendem ácido oleico, ou ácidos graxos poli-insaturados.
[306] Em uma modalidade da invenção, a parte de planta vegetativa, o organismo transgênico não hurnano ou parte do mesmo, preferencialmente, uma planta ou semente, é transforrnado com um DNA quimérico que codifica uma MGAT que pode ou não ter atividade de DGAT. A expressão da MGAT preferencialmente resulta em níveis mais elevados de lipídeos apolares, como DAG ou TAG e/ou o rendimento lipídico apolar aumentado no dito organismo transgênico não humano ou parte do mesmo. Em urna modalidade preferencial, o organismo não humano transgênico é uma planta.
[307] Em uma modalidade adicional, a parte de planta vegetativa, organismo não humano transgênico ou parte do mesmo é transformado com um DNA quimérico que codifica uma GPAT ou um DGAT. Preferencialmente, a parte de planta vegetativa ou organismo transgênico não humano é transformado com ambas os DNAs quiméricos, os quais são preferencialmente ligados de forma covalente a uma molécula de DNA, como, por exeniplo, urna única molécula de T-DNA.
[308] Yang et al. (2010) descrevem dois glicerol-3-fosfato (aciltransferases GPAT4 e GPAT6) de Arabidopsis com sn-2 preferencialmente e atividade da fosfatase que são capazes de produzir sn-2 MAG de glicerol-3-fosfato (G-3-P) (Figura 1).
Propõe-se que estas enzimas fazem parte da via de síntese de cutina. Foi demonstrado que Arabidopsis GPAT4 e GPAT6 usam acil- CoA como um substrato de ácido graxo (Zheng et al., 2003).
[309] Combinando um GPAT bifuncional/fosfatase com um MGAT produz urna nova via de síntese DAG usando G-3-P como um substrato e dois grupos acil derivados de acil-CoZi como os outros substratos. Do mesmo modo,. combinando um GPAT bifuncional/fosfatase com um MGAT que tem a,tividade de DGAT produz iíma via de síntese nova TAG utilizando glicerol-3-fosfato ccmo um substrato e três grupos acil derivados de acil-CoA como outrcs substratos.
[310]Assim, em uma modalidade da invenção, o organismo transgênico não humano ou parte dele é cotransformado com um GPAT bifuncional/fosfatase e com um MGAT que não tem atividade de DGAT. Isto resultaria na produção de MAG pela GPAT bifuncional/fosfatase que seria então convertido em DAG pela MGAT e em seguida TAG por urn DGAT nativo ou outra atividade.
Nova produção de DAG pode ser confirmada e selecionada, por exemplo, realizando uma co-transformação de uma cepa de levedura contendo knocouts SLCl + SLC4 letais, como o descrito por Benghezal et al. (2007, Figura 2). A Figura 2 de Benghezal et al. (2007) mostra que excluindo os dois LPATS (SLCl & SLC4) de leveduras é letal. O SLCl + SLC4 duplo mutante de levedura só pode ser mantido por causa de um plasmídeo complementador que fornece um dos genes sic (SLCl no seu caso) em trans. Seleção negativa por adição de FOA para os resultados de meios, em que a perda do plasInídio complerr'.entador (countraseleção do marcador de seleção Ura) e torna as células não viáveis.
[311] Em outra modalidade da invenção, o organismo transgênico não humano ou parte do mesmo, preferencialmente de uma planta ou semente, é cotransformado com o DNA quimérico que codifica para uma GPAT bifuncional/fosfatase e urna.MGAT que tem atividade de DGAT. Isto resultaria na produção de MAG pela GPAT bifuncional/fosfatase que seria então convertido em DAG e, erri seguida TAG pela MGAT.
[312]Em outra modalidade, um ou mais GPATS endógenos sem atividade de fosfatase d.etectável são silenci-ados, por exemplo, urn ou mais genes que codificam GPATS que acilam glicerol-3- fosfato para formar LPA na via Kennedy (por exemplo, Arabidopsis GPATI) é silenciado.
[313] Em outra modalidade, a parte da planta vegetativa, organismo transgênico não humano ou parte do mesmo, preferencialmente uma planta ou semente, é transformado com urri IJNA quimérico que codifica para uma DGATI, urn DGAT2, um fator de transcriçZo wrinkled 1 (WRII), uma oleosina, ou um poli-peptídeo supressor de silenciamento. Os DNAs quirnéricos são preferencialmente ligados de forma covalente a uma molécula de DNA, como, por exemplo, uma única molécula de T-DNA, e parte da planta vegetativa, organismo transgênico não humano ou parte do mesmo, é preferencialmente homozigoto para a molécula de DNA inserida no seu genoma.
[314] Preferências de substrato podem ser manipulados nas novas vias de síntese de DAG e TAG por, por exernplo, fornecendo cepas de leveduras Hl246 transgênicas que expressam variantes MGAT com uma concentração de um ácido graxo livre particular (por exemplo, DHA) que impede a complementação pelo gene de tipo selvagem MGAT. Apenas as variantes capazes de usar o ácido graxo livre for;ríecido cresceriam. Vários ciclos de MG{\T modificados resultariãm na produção de MGAT com maior preferê|icia de ácidos graxos particulares.
[315]AS várias complementações à via cije Kennedy e suplementações descritas acima podem ser realizadjís em qualquer tipo de célula, devido à natureza ubíqua doj substrato de glicerol-3-fosfato inicial. Em uma rnodalidadej, o uso de transgenes resulta em rendimentos aurnentados do ól4o.
Polinucleotídeos
[316] Os termos "polinucleotídeo" e "ácido jnucleico" são utilizados indiferentemente. Eles referem-se a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer compri-mento, quer ribonucleotídeos ou desoxi-rribonucleotídeos, ou análogos dos mesmos. Um polinucleotídeo da invenção pode ser de origem genômica, CDNA, semissintético ou sintético, origem de cadeia dupla ou de cadeia simples e ern virtude da sua origem ou manipulação: {1) não está associado com a totalidade ou uma porção de um polinucleotídeo com o qual ele está associado na natureza, (2) está ligado a um outro polinucleotídeo que não aquele ern que está ligado na natureza, ou (3) não ocorre na natureza. Os seguintes são exemplos não limitantes de poIinucleotídeos: codificação ou regiões não codificantes d.e um fragmento de gene ou de genes, loci (locus) definida a partir de análise de ligação, exons, introns, RNA mensageiro (mRNA), RNA de transferência {tRNA), RNA ribossornico (rRNA), ribozimas, cDNA, polinucleotídeos recombinantes, polinucleotídeos ramificados, plasmídeos, vetores, DNA isolado de qualquer sequência, RNA isolado de qualquer sequência de DNA quimérico, de qualquer sequência, sondas de ácido nucleico, e iniciadores.
Urri polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, como nucleotídeos metilados e análogos de nucleotídeo. Se presente, as modificaçCies da estrutura de nucleotídeos podem ser transmitidas antes ou depois da rnontagem do polímero. A sequência de nucleotídeos pode ser interrompida por corrmonentes não nucleotídeos. Um polinucleotídeo pode ser adicionalmente modificado após polimerização, como por conjugação, corn um componente de marcação.
[317] Por "polinucleotídeo isolado" entende-se um polinucleotídeo que tem sido geralrnente separado das sequências de polinucleotídeos com os quais está associado ou ligado no seu estado nativo. Preferencialmente, o polinucleotídeo isolado é peio menos 60% livre, mais preferencialrnente pelo menos 75% livre, mais preferencialmente pelo menos 90% livre de sequências de polinucleotídeos com os quais está natt'ralmente associado ou ligado.
[318] Conforme usado aqui, o termo "gene" é para ser tomado no seu contexto mais amplo e inclui as sequências que cornpreendem a região de desoxirribonucleotídeos e transcrita, se traduzida, a região codificadora da proteína, de um gene estrutural e incluem sequências localizadas adjacentes à região de codificação no tanto a 5'e 3' de uma distância de, pelo menos, cerca de 2 kb de cada lado, e que estão envolvidas na expressão do gene. A este respeito, o gene inclui os sinais de controle, como promotores, estimuladores, terminação e/ou sinais de poliadenilação, que estão naturalmente associados a uw. determinado gene, ou os sinais de controle heterólogo, caso ern que o gene é referido como um "gene quimérico". As sequências que estão lc:calizadas na região 5' de codificação da proteína e que estão presentes no mRNA são referidas como sequências 5' não-traduzidas. As sequências que estão localizadas na região de codificação 3' da proteína ou a jusante e que estão presentes no mRNA são referidas como 3' sequências não traduzidas. O termo "gene" engloba ambas as formas CDNA e genômicas de um gene. A forma genômica ou de um gene clone contém a região de codificação que pode ser interrompida com sequências não codificadoras denominados "introns", "regiões intervenientes", ou "sequências intervenientes." Introns são segmentos de um gene que são transcritos em RNA nuclear (nRNA). Introns podem conter elementos reguladores, como intensificadores. Introns são removidos ou "spliced out" do transcrito nuclear ou básico; intr-ons, portanto, não estão presentes no mRNA transcrito. As funções de mRNA durante a tradução para especificar a seq¢ncia ou a ordem dos aminoácidos em um polipeptídeo nascente. O tjerrno "gene" inclui uma molécula sintética ou de fusão que codifica a totalidade ou uma parte das proteínas da invenção aqui descjrita e uma sequência de nucleotícleos complementar a qualquer um dos acima.
[319] Conforme usado aqui, "DNA quimérico" refere-s)e a qualquer Ir.o1écula de DNA que não é encontrada naturalm.ente na natureza, também aqui referida como uni "constructo de DNA". Tipicamente, o DNA quimérico compreende regulanientar e transcritos ou sequências codificadoras de proteínas que não são naturalmente encontradas juntas na natureza. Assim, o DNA quimérico pode compreender as sequências reguladoras e sequências codificadoras que são derivados a partir de fontes diferentes, ou sequências reguladoras e sequências codificadoras derivadas da mesma fonte, mas dispostas de maneira diferente do que a encontrada na natureza. A estrutura aberta de leitura pode ou não estar ligado a seus elementos reguladores a montante e a jusante. O quadro aberto de leitura pode ser incorporadc, por exemplo, no genoma da planta, um local não natural., ou num replicon ou vetor em que não é encontrado naturalmente como um plasmídeo bacteriano ou um vetor viral. O "DNA quimérico" não está limitado a moléculas de DNA que são rep]icáveis em um hospedeiro, mas inclui DNA capaz de ser ligado a um replicon por, por exemplo, sequências adaptadoras específicas.
[320] Um "transgene" é um gene que foi introduzido no genoma por um processo de transformação. O termo inclui um gene de uma célula descendente, planta, semente, organismo não humano ou parte do mesmo, que foi introduzido no genoma de uma célula progenitora destes. Tais células descendentes etc. podem ser, pelo menos, uma 3" ou 4" geração da descendência de células progenitoras, que foi a célula primária transformada. As descendentes podem ser produzidas por reprodução sexual ou vegetativamente corno, por exemplo, a partir de tubérculos de batata ou cana-de-açúcar. O termo "geneticamente rnodificado", e variãções dos mesmos, é um termo genérico que inclui a introdução de um gene em uma célula por transformação ou transdução, mutação de um gene em uma célula e alterar geneticamente ou modular a regulação de um gene em uma célula, ou a descendência de qualquer célüla modificada como descrito acima.
[321] Uma "região genômica" conforme usado aqui refere-se a uma posição dentro do genoma onde um transgene, ou um grupo de genes trans (também referida aqui como um cluster), tem sido inserido em uma célula, ou predecessor do mesmo. Estas regiões cor.preendem apenas os nucleotídeos que foram incorporados pela intervenção do homem, como por meio de métodos aqui descritos.
[322] Um "polinucleotídeo recombinante" da invenção refere- se a uma molécula de ácído nucleico que foi construído ou modificado por métodos recombinantes artificiais. O polinucleotídeo recombinante pode estar presente em uma célula em uma quantidade alterada ou expressa a um ritmo alterado (por exemplo, no caso do mRNA) em relação ao seu estado nativo. Erri uma modalidade, o polinucleotídeo é introduzido em uma célula que naturalmente não compreende o polinucleotídeo. Tipicamente um DNA exógeno é usado como um modelo para a transcrição de mRNA, que é então traduzido para uma sequência de resíduos de aminoácidos que codificam para um polipeptídeo da presente invenção dentro da célula transformada. Em outra modalidade, o polinucleotídeo é endógeno para a célula e a sua expressão está alterada por meios recombinantes, por exemplo, uma sequência de controle exógeno é introduzida à montante de um gene endógeno de interesse para permitir que a célula transformada expresse o polipeptídeo codificado pelo gene.
[323] Um· polinucleotídeo recombínante da presente invenção inclui poiinucleotídeos que não foram separados de outros componentes do sistema de expressão com base em células ou isento de células, em que está presente, e polinucleotídeos produzidos em tais sistemas à base de células ou células livres que são subsequentemente purificados distantes pelo menos de alguns dos outros componentes. O polinucleotídeo pode ser uma extensão contígua de nucleotídeos existentes na natureza, ou compreendem dois ou mais trechos contíguos de nucleotídeos a partir de fontes diferentes (de ocorrência natural e/ou sintética) unidos para formar um único poli-nucleotídeo.
Tipicamente, tais polinucleotídeos quiméricos compreendem pelo menos um quadro aberto de leitura que codifica um polipeptídeo da presente invenção operativamente ligado a um promotor adequado para dirigir a transcrição do quadro aberto de leitura em uma célula de interesse.
[324] No que diz respeito aos polinucleotídeos definidos, faz-se observar que porcentagens de identidade mais elevadas do que os fornecidos acima irão abranger modalidades preferenciais. Assim, se for aplicável, em função dos valores mínimos de porcentagem °5 de identidade, prefere-se que o polinucleotídeo compreenda uma sequência de polinucleotídeo que é pelo menos 60%, mais preferencialmente pelo menos 65%, rnais preferencialmente pelo menos 70%, mais preferencialmente pelo menos 75 %, mais preferencialmente pelo menos 80%, rnais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, mais preferencialmente pelo menos 91%, mais preferencialmente pelo menos 92%, mais preferencialmente pelo menos 93%, mais preferencialmente pelo menos 94%, mais preferencialmente pelo menos 95%, mais preferencialmente pelo menos 96%, mais preferencialmente pelo menos 97%, mais preferencialmente pelo menos 98%, mais preferencialrnente pelo menos 99%, mais preferer.cialmente pelo menos 99,1%, rnais preferencialmente pelo menos 99,2%, mais preferencialmente pelo menos 99,3%, mais preferenci-almente pelo menos 99,4%, mais preferencialmente pelo menos 99,5%, mais preferencialmente pelo menos 99,6%, mais preferencialmente pelo menos 99,7%, mais preferencialmente pelo menos 99,8%, e ainda rnais prefere.ncialmente pelo menos 99,9% idêntica à SEQ ID NO relevante indicada.
[325] Um polinucleotídeo da, ou útil para a, presente invenção podem hibridizar seletivamente, sob condições rigorosas, com um polinucleotídeo como aqui definido. Conforrne usado aqui, as condições rigorosas são aquelas que: (1) utilizam durante a hibridização um agente desnaturante, corr'.o a formamida,
por exemplo.. formamida a 50% (V/V), formamida com 0,1% (p/v) de albumina de soro de bovino, 0,1% Ficoll, 0,1% de polivinilpirrolidona, 50 mM de tampão de fosfato de sódio pH 6,5 com NaCl 750 mM, citrato de sódio 75 mM a 42°C, ou (2) empregam 50% de formamida, 5 x SSC (NaCl 0,75 M, citrato de sódio 0,075 M), 50 MM fosfato de sódio (pH 6,8), pirofosfato de sódio a 0,1%, 5 x solução de Denhardt, DNA de esperma de salmão (50 g/ml) sonicado, 0,1% de SDS e 10% de sulfato de dextrano a 42°C em 0,2 x SSC e SDS a 0,1%,. e/ou (3) empregam baixa força iônica e temperatura elevada para lavagem, por exerr.plo, 0,015 M de NaCl/O,0015 M citrato de sódio e/O,1% de SDS a 50°C.
[326]OS polinucleotídeos da presente invenção Kjodem possuir, em relação a moléculas que ocorrem natura1rrlente, uma ou niais mutações que são deleções, inserções ou substituições de resíduos de. nucleotídeos. Os polinucleotídeos que possuem mutações em relação à sequência de referência, estas podern ser de ocorrência natural {isto é, isolados a partir de uma fonte natural) ou sintética (por exemplo, através da realização de mutagênese dirigida ao local ou DNA shuffling no ácido nucleico, como descrito acima). Polinucleotídeo para Reduzir Níveis de Expressão de Proteínas Endógenas lnterferência de RNA
[327] Interferência de RNA (RNA1) é particularmente útil para inibir especificamente a produção de uma proteína particular. Embora não desejando estar limitado pela teoria, Waterhouse et al. (1998) proporcionaram um modelo para o mecanismo através do qual o dsRNA (RNA duplex) pode, ser utilizado para reduzir a produção de proteína. Esta t?cnologia baseia-se na presença de moléculas de dsRNA, que ccjntêm uma sequência que é essencialmente idêntica ao mRNA do} gene de interesse ou parte do mesmo. Convenientemente, o dsRNAjpode ser produzido a partir de um único promotor em um vetor recÇmbinante ou uma célula hospedeira, em que as sequências jsenso e antissenso são flanqueadas por uma sequência não relacionada que permite que as sequências senso e antissenso hibridizem, para formar a molécula de dsRNA com a sequência não relacionada formando uma estrutura em alça. A concepção e produção de moléculas de dsRNA adequadas está dentro da capacidade de um especialista na técnica, especialmente considerado Waterhouse et al. (1998), Smith et al.(2000), WO 99/32619, WO 99/53050, WO 99/49029, e WO 01/34815.
[328] Em um exemplo, urn DNA que é introduzido dirige a síntese de produtos de RNA, pelo menos, parcialmente de fita dupla com homologia com o gene alvo a ser inativado. Por conseguinte, o DNA compreende ambas sequências senso e antissenso que que, quando transcritas no RNA, podem hibridizar para formar a região de RNA de fita dupla. Em uma modalidade da invenção, as sequências de senso e antissenso são separadas por uma região espaçadora que compreende um íntron que, quando transcritas em RNA, são unidas por fora. Este arranjo tem rnostrado resultar uma maior eficiência de silenciamento do ,gene. A região de fita dupla pode compreender uma ou duas moléculas de RNA, transcritas a partir de qualquer uma região de DNA ou duas. A presença da molécula de fita dupla é provável que desencadeie uma resposta de um sistema endógeno que destrói o RNA de fita dupla e também a transcrição do RNA homólogo do gene alvo, reduzindo ou eliminando eficazmente a atividade do gene alvo.
[329]0 comprimento das sequências de senso e antissenso que hibridizam cada uma deve ser de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos. A sequência de comprimento completo correspondente a toda a transcrição do gene pode ser utilizada. O grau de identidade das sequências de senso e antissenso para a transcrição alvo deve ser pelo menos 85%, pelo menos 90%, ou, pelo menos, 95-100%. A molécula de RNA pode, naturalmente, compreender sequências não relacionadas que podem funcionar para estabilizar a molécula. A molécula de RNA pode ser expressa sob o controle de um promotor RNA polimerase II ou RNA polimerase
166/3'75 III. Exemplos destes últimos incluem promotores tRNA ou snRNA.
[330] Pequenas moléculas de RNA de interferência preferenciais ("S1RNA") compreendem uma sequência de nucleotídeos que é idêntica a cerca de 19-21 nucleotídeos contíguos do mRNA alvo. Preferencialmente, a sequência de s1RNA inicia-se com o dinucleotídeo AA, compreende um conteúdo GC de cerca de 30-70% (preferencialmente, de 30-60%, mais preferencialmente 40-60% e mais preferencialmente cerca de 45%- 55%), e não tem nenhuma elevada percentagem de identidade qualquer uma de sequência de nucleotídeos além do alvo no genoma do organismo no qual deve ser introduzido, por exemplo, como determinado por pesquisa BLAST padrão. microRNA
[331]MicroRNAs (abreviado miRNAs) são geralmente 19-25 nucleotídeos (comumente cerca de 20-24 nucleotídeos em plantas) de moléculas de RNA não codificadoras que são derivadas de precursores maiores que formam as estruturas de haste-alça imperfeitas.
[332]miRNAs ligam-se às sequências complementares sobre transcrições de RNA mensageiro alvo (mRNA), geralmente resultando em repressão de tradução ou degradação alvo e silenciamento de gene.
[333]Nas células de plantas, as moléculas precursoras de miRNA devem ser amplamente processadas no núcleo. O pri-rr'.iARN (contendo uma ou mais regiões "hairpin", ou locais de fita dupla bem como o de costume 5' "cap" e cauda poliadenilada de um mRNA) é processado para uma molécula precursora menor miARN que também inclui uma estrutura haste-alça ou dobra-invertida e é chamado de "pré-miRNA". Nas plantas, os pré-miRNAs são clivados por enzimas tipo DICER distintas (DCL), produzindo. miRNA:m.iRNA* duplex. Antes de transportar para fora do núcleo, ,estas duplexes são metilados.
[334] No citoplasma, a fita de miRNA do dupieZ miRNA:miRNA* é incorporada seletivamente em u.m. complexo d.j silenciamento ,
induzido por RNA ativo (RISC).OS complexos RISC contêm um subconjunto específico de proteínas Argonauta que exercem repressão gene específica de sequência (ver, por exemplo, Millar e Waterhouse, 2005; Pasquinelli et al, 2005; Almeida e Allshire, 2005). Cossupressão [33S] Os genes podem suprimir a expressão de genes e/ou transgenes endógenos relacionados já presentes no genorría, um fenômeno denominado silenciamento de genes dependentes da homologia. A maioria dos casos de silenciamento do gene dependente de homologia está em duas classes - aqueles que funcionam ao nível da transcrição do transgene, e aqueles que funcionam de após a transcrição.
[336]0 silenciamento de gene após a transcrição dependente de homologia (isto é, cossupressão) descreve a perda de expressão de um transgene e genes endógenos relacionados ou virais em p-lantas transgênicas. Cossupressão muitas vezes, mas nem sempre, ocorre quando transcritos de transgene são abundantes, e é geralmente considerado para ser disparado, em nível de processamento de mRNA, localização, e/ou degradação. Existem vários modelos para explicar como funciona a cossupressão (ver, em Taylor, 1997).
[337] Um modelo, o modelo "quanti-tativo" ou "limiar de RNA", propõe que células podem competir corri o acúmulo de grandes quantidades de transcritos transgenes, mas somente até um pornto. Uma vez que o limiar crítico tenha sido cruzado, a degradação dependente de sequência de ambos os transcritos transgene e de gene endógeno relacionado é iniciada. Foi proposto que este modo de cossupressão pode ser disparado em seguida a síntese de moléculas de RNA de cópia (CRNA) por transcrição reversa do mRNA transgene em excesso, presumivelmente por RNA polimerases dependentes de RNA. Estas cRNAS poderr. hibridizar com mRNAs transgene e endógeno, os híbridos i.ncomuns dirigindo transcritos homólogos para degradação. No entanto, este modelo não leva em conta relatórios sugerindo que a cossupressão pode ocorrer aparentemente na ausência de transcrição transgene e/ou sem o acúmulo detectável de transcritos transgene.
[338] Para levar em conta estes dados, um segundo rnodelo, o modelo "qualitativo" ou "RNA aberrante", propõe que interações entre RNA transgene e DNA e/ou entre DNAS endógenos e introduzidos levam à metilação de regiões transcritas dos genes. Os genes metilados são propostos para produzir RNAS que são de alguma forma aberrantes, suas características anômalas disparando a degradação específica de todos os transcritos relacionados. Esses RNAs aberrantes podem ser produzidos por loci transgene complexos, paraticularmente aqueles que contêm repetições invertidas.
[339] Um terceiro modelo propõe que emparelhamento de base intermolecular entre transcritos, ao invés de híbridos cRNA-mRNA gerados pela ação de uma RNA polimerase dependente de RNA, pode disparar cossupressão. Esse emparelhamento de base se torna mais comum quando os níveis de transcrito sobem, as regiões de dupla fita putativas disparando a degradação direcionada . de transcritos homólogos. Um modelo similar propõe emparelhamento de base intramolecular ao invés de emparelhamento de base intermolecular entre transc.ritos.
[340] Cossupressão envolve introduzir uma cópia extra de um gene ou um fragmento do mesmo em uma planta n.a orientação senso com respeito a um promotor para sua expressão. Uma pe"soa versada na técnica apreciaria que o tamanho do fragmento senso, sua correspondência a regiões de gene alvo e seu grau de identidade de sequência para o gene alvo podem variar. Em alguns casos, a cópia adicional da sequência de gene interfere com a expressão do gene de planta alvo. Faz-se referência a WO 97/20936 e EP 0465572 para métodos de implementar enfoques de cossupressão. Polinucleotídeos Antissenso
[341] O termo "polinucleotideo antissenso" deve ser levado em consideração para significar um DNA ou RNA, ou uma combinação dos mesmos, molécula que é complementar a pelo menos uma porção de uma molécula específica de mRNA que codifica um polipeptídeo endógeno e capaz de interferir com um evento pós-transcrição, como tradução do mRNA. A utilização de métodos antissenso é bem conhecida na técnica (ver, por exemplo, G. Hartmann e S. Endres, Manual of Antisense Methodology, Kluwer (1999)). O uso de técnicas antissenso em plantas foi revista por Bourque (1995) e Senior (1998). Bourque (1995) lista um grande número de exemplos de como sequências antissenso foram utilizados em sisternas de plantas, como um método de inativação do gene. Bourque também afirma que alcançar 100% de inibição de qualquer atividade da enzima pode não ser necessário, uma vez que a inibição mais do que provável resultará em mudanças mensuráveis no sistema. Senior (1998) afirma que os métodos antissenso são agora uma técnica muito bem estabelecida para manipular a expressão do gene.
[342] Em uma modalidade, o polinucleotídeo antissenso hibridiza em condições fisiológicas, ou seja, é o polinucleotídeo antissenso (que é total ou parcialmente fita simples) é pelo menos capaz de formar um polinucleotídeo de fita dupla com um mRNA codificando uma proteína como uma enzima endógena, por exemplo, DGAT, GPAT, LPAA, LPCAT, P.AP, AGPase, erri condições normais em uma célula.
[343]Moléculas antissenso podem incluir sequências que correspondem aos genes estruturais ou para sequências que efetuam controle sobre a expressão de gene ou evento de junção.
Por exemplo, a sequência antissenso pode corre3ponder à região de codificação direcionada de gene endógeno, ou a região 5' não traduzidà {UTR) ou a 3'-UTR ou combinação destas. Pode ser coníplementar em parte às sequências de íntron, que podem ser excluídas durante ou após a transcrição, preferencialmente apenas às sequências de éxons do gene alvo. Em vista da divergência geralmente maior de UTRS, direciohamento destas regiões fornece maior especificidade de inibição g|ênica.
[344]0 comprimento da sequência antissensoj deve ser pelo menos 19 nucleotídeos contíguos, preferencialmentÉ pelo menos 50 nucleotídeos, e mais preferencialmente pelo menoj 100, 200, 500 ou 1000 nucleotídeos. A sequência total ccomplementar ao transcrito de gene inteiro pode ser usada. O coArimento é rnais preferencialmente 100-2000 nucleotídeos. O grau d: identidade da sequência antissenso ao transcrito objetivado deve ser pelo menos 90% e mais preferencialmente 95-100%. A molécula de RNA antissenso pode, claro, compreender sequências não relacionadas que podem funcionar para estabilizar a molécula. Polinucleotídeos Catalíticos
[345] O termo "polinucleotídeo catalítico" rêfere-se a uma molécuía de DNA ou molécula contendo DNA (tambékl conhecido na técnica como uma "deoxiribozima") ou um RNA ou mofécula contendo RNA (tambérr, conhecido como "ribozima") que especificamente reconhece um substrato distinto e catalisa a modiificação química deste substrato. As bases de ácido nucleico no ácido nucleico catalítico podem ser bases A, C, G, T (e U para RNÁÁ
[346]Tipicamente, o ácido nucleico catalítjco contém uma sequência antissenso para reconhecimento específijco de um ácido nucleico al:vo, e um ácido nucleico clivando ativiàade enzimática (também referenciada aqui como o "domínio catalítj-co"). Os tipos de ribozimas que são particularmente úteis nestá invenção são ribozimas hammerhead (Haseloff and Gerlach, 198È; Perriman et al., 1992) e ribozimas hairpin (Zolotukhin et af., 1996; Klein et al., 1998; Shippy et al., 1999).
[347] Ribozimas úteis na invenção e DNA Fodificando as ribozimas pc)dem ser quimicamente sintetizadas usa,-do .r.étodos bem conhecidos na. técnica. As ribozimas podem ainda ser preparadas de uma molécula de DNA (que na transcrição, gera úma molécula de RNA) operativamente ligadas a um promotor de RNA Poiimerase, por exemplo, o promotor para T7 RNA polimerasej ou SP6 RNA polimerase. Em uma modalidade separada, o DNA pode ser inserido em um cassete de expressão ou cassete de transcrição. Após "a síntese, a molécula de RNA pode ser modificada por ligação a uma molécula de DNA tendo a caDacidade de estabilizar a ribozima e tornar esta resistente à RNase.
[348] Como com oligonucleotídeos antissenso, " RNA de interferência pequeno e microRNA descritos aqui, polinucleotídeos catalíticos úteis na invenção devem ser capazes de "hibridizar" a molécula de ácido nucleico alvo sob "condições fisiológicas", a saber, aquelas condições dentro de uma célula de planta, alga ou fungo. Ve,tores recombinantes
[349] Uma modalidade da presente invenção inclui um vetor recombinante, o qual compreende pelo menos um polinucleotídeo aqui definido e é capaz de 'liberar o polinucleotídeo a uma célula hospedeira. Vetores incluem vetores de expressão recombinantes. Vetores recombinantes contêm as sequências de polinucleotídeos heterólogos, isto é, sequências de polinucleotídeos que não são naturalmente encont.radas adjacentes a um polinucleotídeo como aqui definido, que preferencialmente, são derivadas de uma espécie diferente. O vetor pode ser RNA ou DNA, quer procariota ou eucariota, e tipicamente é um vetor viral., derivado de um vírus, ou um plasmídeo. Os vetores plasmídicos adicionais incluem tipicamente sequências de ácido nucleico que proporcionam uma fácil seleção, amplificação e transformação do cassete de expressão em células procarióti-cas, por exemplo, derivados de pUC, vetores derivados de pSK, vetores derivados de pGEM, vetores derivados pSP, vetores derivados pBS, ou vetores binários contendo uma ou mais regiões de T-DNA. As sequências de ácidos nucleicos adicionais incluem origens de replicação para fornecer replicação autônorrl? do vetor, os genes marcadores selecionáveis, preferencialmente, que codificam antibiótiCos ou resistência a herbicidas, únicos sítios de clonagem múltiplos preveem vários locais de inserção de sequências de ácido nucleico ou genes codificados na estrutura de ácido nucleico, e sequências que aumentam a transformação de células procarióticas e eucarióticas (especialmente de plantas).
[350]"Operativamente ligado", conforme usado aqui, refere- se a uma relação funcional entre dois ou mais segmentos de ácidos nucleicos (por exemplo, DNA). Tipicamente, refere-sp à.
relação funcional do elemento regulador da transcrição (promotor), a uma sequência transcrita. Por exemplo, um promotor está cperativamente ligado a uma sequência de codificação de um polinucleotídeo como aqui definido, se ele estimula ou modula a transcrição da sequência de codificação em uma célula apropriada. Geralmente, 03 promotores de elementos reguladores da transcrição que estão operativamente ligados a uma sequência transcrita são fisicamente contíguos à sequência transcrita, ou seja, são atuantes em cis. No entanto, alguns elementos transcricionais reguladores como promotores, não precisam estar fisicamente localizados contiguamente ou em estreita proximidade com as sequências codificantes cuja transcrição eles aumentam.
[351] Quando existem vários promotores presentes, cada. um pode de forma independente ser o mesmo ou diferente.
[352] Os vetores recombinantes podem também conter: (a) um ou mais sinais de secreção, que codificam sequências de peptídeo de sinal., para permitir que um polipeptídeo definido aqui seja secretado da célula que produz o polipeptídeo, ou que fornecem a localização do polipeptídeo expresso, por exemplo, para a retenção do polipeptídeo no retículo endoplasmático (ER) na célula, ou de transferência num plasto, e/ou (b) conter sequências de fusão que conduzem à expressão de moléculas de ácidos nucleicos, como prQteínas de fusão. Exemplos de segmentos de sinal adequados incluem qualquer segmento de sinal capaz de dirigir a secreção ou localização de um polipeptídeo def4nido. Segmentos de sinal preferenciais incluern, entre outros, peptídeo de sinal Nicotiana nectarin (US 5.939.288), o sinal de extensina de tabaco, d sinal da proteína de ligação da soja oleosina. Os vetores recombinantes podem também incluir sequencias intervenientes e/ou não traduzidas em torno e/ou no interior da sequência de ácido nucleico de um polinucleotídeo como aqui definido.
[353] Para facilitar a identificação dos transformantes, o vetor recombinante compreende, desejavelmente, um gene marcador de seleção ou triável, ou em adição à sequência de ácido nucleico de um polinucleotídeo como aqui definido. Por "gene rnarcador" significa um gene que confere um fenótipo distinto para as células que expressam o gene marcador e, assim, permite que estas células transformadas sejam distinguidas das células que não possuem o marcador. Um gene rnarcador selecionável confere uma característica para os quais se pode "selecionar", corn base na resistência a um agente seletivo (por exemplo, um herbicida, antibiótico, radiação, calor ou outro tratamento para danificar as .células não transformadas). Um gene marcador triável (ou gene repórter) confere uma característica que se pode identificar através da observação ou de teste, isto é, de "triagem" {por exemplo, j3-glucuronidase, GFP, luciferase ou atividade de outras enzimas não presentes em células não transformadas). O gene marcador e da sequência de nucleotídeos de interesse não tem que ser ligado, uma vez que a cotransformação de genes não ligados, como por exemplo, descritas em US 4.399.216, é também um processo eficiente de, por exemplo, transformação de plantas. A escolha real de um marcador não é crucial, desde que seja funcional (isto é, seletiva), em combinação com as células de escolha como uma célula de planta.
[354] Exemplos de marcadores selecionáveis bacterianos são marcadores que conferem resistência a antibióticos como arnpicilina, eritromicina, cloranfenicol, tetraciclina ou resistência, preferencialmente, a resistência à canamicina.
Exemplos de marcadores selecionáveis para a seleção de transformantes de plantas incluem, entre outros, um gene hyg,
que codifica a -resistência à higromicina B, uma neomicina- fosfotransferase (nptll), gene que confere resistência à canamicina, paromomicina, G418, um gene da glutationa-S- transferase de fígado de rato e confere resistência a herbicidas derivados de glutationa como, por exemplo, descritos em EP 256223; um gene da glutamina sintetase, que confere resistênc.ia a inibidores da glutamina sintetase em super-expressão, como fosfinotricina, como por exemplo, descrito em WO 87/05327, um gene de acetiltransferase de Streptomyces viridochrcmogenes conferindo resistência a fosfinotricina do agente seletivo, como por exemplo, descrito na patente EP 275957, um gene que codifica para uma sintase 5-enolchiquimato-3-fosfato (EPSPS), que confere tolerância a N-fosfonometilglicina corrio por exemplo, descrito por Hinchee et al. (1988), um gene bar que confere resistência contra a bialafos como por exemplo, descrito em WO91/02071, um gene de nitrilase como BXN de Klebsiella ozaenae que confere resistência ao bromoxinil (Stalker et al., 1988), um gene de di-
hidrofolato redutase (DHFR) que confere resistência ao metotrexato (Thillet et al., 1988), um gene de sintase de acetolactato mutante (ALS) que confere resistência a imidazolinona, sulfonilureia, ou outros produtos químicos inibidores da ALS (EP 154204), um gene de sintase de antranilato mutante que confere resistência a 5-metil triptofano, ou urn aene dealogenase dalapon, que confere resistência ao herbicida. [355jMarcadores preferenciais triáveis incluem, entre outros, um gene uidA que codifica uma enzima 8-glucuronidase (GUS) para os quais vários substratos crornogênicos são conhecidos, um gene j3-galactosidase que codifica uma enzima para a qual substratos cromogênicos são conhecidos, um gene aequorina
(Prasher et al., 1985) que pode ser empregue na detecção de cálcio sensiveis a bioluminescência, um gene da proteína verde fluorescente (Niedz et al., 1995) ou os seus derivados, ou um gene da luciferase (luc) (Ow et al., 1986) que permite detecção de bioluminescência.
Por ."molécula repórter", pretende-se significar uma molécula que, pela sua natureza química, proporciona um sinal analiticamente identificável que facilita a determinação da atividade de promotor por referência ao produto de proteína.
[356] Preferencialmente, o vetor recombinante é estavelmente incorporado no genoma da célula, como a célula de planta. Assim, o vetor recombinante pode compreender elementos apropriados que permitem que o vetor seja incorporado no genoma ou em um cromossomo da célula. Vetor de ExpressãQ
[357] Conforme usado aqui, um "vetor de expressão"' é urri vetor de DNA ou RNA que é capaz de transformar uma célula hospedeira e de efetuar a expressão de um ou mais polinucleotídeos especificados. Preferencialmente, o vetor de expressão é também capaz de se replicar dentro da célula hospedeira. Os vetores de expressão podem ser procarióticos ou eucarióticos, e são tipicamente vírus ou plasmídeos. Os vetores de expressão da presente invenção incluem quaisquer vetores que funcionem {isto é, a expressão de genes direta) em células hospedeiras da presente invenção, incluindo, de bactérias, fungos, endoparasitas, artrópodes, animal, de algas, e as células de plantas. Vetores de expressão particularmente preferenciais da presente ínvenção pode dirigir a expressão do gene em algas, leveduras e/ou células de plantas.
[358] Os vetores de expressão da presen.te invenção, contem sequências reguladoras, como sequências de transcrição de controle, as sequências de controle da tradução, as origens de replicação e outras sequências reguladoras que são compatíveis com a célula hospedeira, e que controlam a expressão de polinucleotídeos da presente invenção. Em particular, os vetores de e?gpressão da presente invenção incluem sequências d,e controle de transcrição. As sequências de controle da transcrição são sequências que controlam a iniciação, elongação e terminação de transcri-ção. As sequências de controle da transcrição são particula[mente impor.tantes os que controlam a iniciação da transcrição, como o promotor, enhancer, sequências de operador e repressores. As sequências de controle de transcrição adequadas incluem qualquer sequência de controle de transcrição que pode furicionar em pelo menos uma das células recombinantes da presente invenção. A escolha das sequências reguladoras usadas depende do organismo alvo como uma planta e/ou o Órgão ou tecido alvo de interesse. Tais sequências reguladoras podem ser obtidas a partir de qualquer organismo eucariótico, como plantas ou vírus de olantas, ou podem ser quimicamente sintetizados. Uma variedade de tais sequências de controle da transcrição é bem conhecida dos especialistas da técnica. Particularmente sequências de controle de transcrição preferenciais são os promotores ativos em dirigir a transcrição em plantas, quer constitutivamente ou fase e/ou específi-cas do tecido, dependendo da utilização da planta ou de parte(s) da mesma.
[359] Uma série de vetores adequados para a transfecção estável de células de plantas ou para o estabelecirr.ento de plantas transgênicas foi descrita em, por exemplo, Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual., 1985, supp. 1987, Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989, and Gelvin et al., Plant Molecular Biology Manual., Kluwer Academic Publishers, 1990. Tipicamente, os vetores de expressão de plantas incluem, por exemplo, um ou mais genes de p1antas clonados sob o controle transcricional das sequências de regulação 5' e 3' e de urn marcador de seleção dominante. Tais vetores de expressão de plantas também pode conter uma região reguladora do promotor (por exemplo, uma região reguladora controla induzível ou constitutiva, ambiental ou desenvolvimentalmente regulada, de cél'-ílas ou de tecidos específicos ou de expressão), um sítio de iniciação da transcrição de iniciação, um sítio de ligação ao ribossoma, um RNA de processamento de sinal, um local de terminação da transcrição, e/ou um sinal de poliadenilação.
[360]Uma série de promotores constitutivos que são ativos nas células de plantas tem sido descrita. Os promotores adequados para a expressão constitutiva em plantas incluem, entre outros, promotor do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) 35S, o víru3 do mosaico Figwort (FMV) 35S, o promotor de vírus baciliforme de cana, o promotor do vírus Commelina amarelo rnottle, promotor induzível por luz da subunidade pequena da ribulose-1,5-bis-fosfato carboxilase, o promotor citosólico triosefosfato isomerase do arroz, o promotor de adenina fosforribosil de Arabidopsis, o promotor clo gene da actina do arroz 1, a sintase de manopina e prornotores da octopina sintetase, o promotor Adh, o promotor da sacarose sintase, o promotor complexo de genes R, e promotor do gene da proteína de ligação da clorofila a/j3. Tais promotores podem ser utilizados para criar vetores de DNA que têm sido expressos em plantas, ver, por exemplo, WO 84/02913. Todos estes promotores têm sido usados para criar vários tipos de vetores planta expressáveis de DNA recombinante.
[361] Para efeitos de expressão em tecidos de origem da planta, como a folha, semente de raiz ou caule, prefere-se que os promotores utiliz.ados na presente invenção tenham uma expressão relativamente elevada nesses tecidos específicos. Para este efeito, pode-se escolher a partir de uma série de promotores de genes com tecido ou expressão específica de células ou reforçada. Exemplos de tais promotores descritos na literatura incluem, o cloroplasto glutamina sintetase GS2 promotor de ervilha, o cloroplasto de frutose-1,6 bifosfatase- promotor a partir de trigo, a nuclear fotossintética ST-LS 1 de promotor de batata, o promotor da cinase da serina/treonina e o promotor da glucoamilase (CHS) da Arabidopsis thaliana. Também relataram ser ativos em tecidos fotossinteticamente ativos são a ribulose-1,5-bifosfato carboxilase promotor de larício do leste (Larix laricina), o promotor para o gene CAB, CAB6 de pinho, o promotor para o gene Cab-l a partir de trigo, o promotor para o gene de Cab-l a partir de espinafres, o promotor para o gene Cab 1R a partir de arroz, o piruvato, o ortofosfato diquiinase promotor (PPDK) a partir de Zea mays, o promotor para o gene Lhcbl *2 do tabaco, a Arabidopsis thaliana SUC2 sacarose -H30 symporter promotor, e o promotor para os genes da proteína de membrana tilacóides de espinafre (Psalj, PsaF, PsaE, PC, FNR, AtpC, AtpD, Cab, RbcS). Outros promotores para a proteínas de ligação da clorofila cx/j3 podem também ser utilizados na presente invenção, como os promotores para gene LhcB e gene PsbP de mostarda branca (Sinapis alba).
[362] Uma variedade de promotores de genes de plantas que são regulados ern resposta ao ambiente, químicos, hormonais e/ou sinais de desenvolvimento, também pode ser usados para a expressão de genes de proteínas de ligação a RNA em células de plantas, incluindo promotores regulados por (1) calor, (2) luz (por exemplo, promotor de RbcS-3A de ervilha, o promotor RbcS de rnilho), (3) hormônios, como o ácido abscísico, (4) ferimento (por exemplo, Wunl), ou (5) substâncias químicas corno jasmonato de metila, ácido salicílico, esteroides hormonais, álcool, agentes de proteção (WO 97/06269), ou pode tarnbém ser vantajoso empregar (6) promotores específicos de órgãos.
[363]Conforme usado aqui, o termo "pr.omotor .vegetal específico de órgão de armazenamento" refere-se a um promotor que, preferencialmente, quando comparado com outros tecidos de plantas, dirige a transcrição do gene em um órgão de armazena-nento da planta. Preferencialmente, o promotor apenas dirige a expressão de um gene de interesse no Órgão de armazenamento, e/ou a expressão do gene de interesse em outras partes da planta como as folhas não são detectáveis por análise de Northern blot e/ou RT-PCR. Normalmente, o promotor dirige a expressão de genes durante o crescirnento e desenvolvimento do Órgão de armazenamento, errí particular durante a fase de síntese e acumulação de compostos de armazenagem no órgão de armazenamento. Tais promotores podem dirigir a expressão do aene no órgão inteiro de armazenamento na planta ou aper.as uma parte do mesmo, c.omo o tegumento de embriões, ou do(s) cotilédone(s) de sementes de plantas dicotiledôneas ou c) endosperma ou camada de aleurona das sementes de plantas monocotiledôneas.
[364] Para efeitos de expressão em tecidos dissipadores da planta, como o tubérculo da planta de batata, o fruto de tomate, ou a sementes de soja, canola, algodão, Zea mays, trigo, arroz e cevada é preferencial que os promotores utilizados no presente invento têm uma expressão relativarnente elevada nesses tecidos específicos. Certo número de promotores de genes com expressão específica de tubérculos ou de realce são conhecidos, incluindo o promotor de patatiría classe I, o promotor para os genes de ADPGPP de tubérculo de batata, ambas as subunidades pequenas e grandes, o promotor da sacarose sintase, o promotor para a principal proteínas dos tubérculos, incluindo os complexos de proteína de 22 kO e inibidores de proteinases, o promotor para o gene da sintetase de amido de grânulos ligados (GBSS), e outra classe I e II patatins promotores. Outros promotores podem também ser usados para expressar uma proteína em tecidos específicos, como sementes ou frutos. O promotor para a B- conglicinina ou outros promotores específicos de sernentes, como a napina, a zeína, linin e promotores de faseolina, pode ser usado. Promotores específicos de raiz podem também ser usados. Um exemplo de tal promotor é o promotor para o. gene da quitinase do ácido. A expressão em tecido de raiz também pode ser conseguida utilizando os subdornínios raiz específicos do proinotor CaMV 35S, que têm sido identificados.
[365] Em uma modalidade particularmente preferencial o promotor dirige a expressão em tecidos e órgãos onde a biossíntese de lipideos têm lugar. Tais promotores podem atuar no desenvolvimento da semente, no momento apropriado para , modificar a composição lipídica em sementes.
[366] E.m uma modalidade, o promotor é um promotor vegetal específico de órgãos de armazenamento. Em uma modalidade, o promotor da unidade de armazenamento de órgãos é um promotor específico da semente específica. Em uma modalidade mais preferencial, o promotor dirige a expressão preferencialmente nos cotilédones de uma planta dicotiledônea ou no endosperma de uma planta monocotiledônea, em relação à expressão no embrião da semente ou relativo a outros órgãos da planta como as folhas. Os promotores preferenciais para a expressão específica de sementes são: 1) promotores de genes que codificam enzimas envolvidas na biossíntese de lipídeos e a acumulação de sementes, como dessaturases e elongases, 2) promotores de genes que codificam proteínas de armazenamento de sementes, e 3) os promotores de genes que codificam enzimas envolvidas na biossíntese de carboidrato e acumulação de sementes. Promotores específicos de sementes, qu.e são adequados são, a colza, a região promotora do gene da napina (US 5.608.152), o promotor USP Vicia faba (Baumlein et al., 1991), o promotor oleosina de Arabidopsis (WO 98/45461), o promotor faseolina de Phaseolus vulgaris (EUA
5.504.200), o promotor Bce4 de Brassica (WO 91/13980), ou o promotor legumina B4 (Baumlein et al., 1992), e os promotores que conduzem a expressão específica de sementes em rnonocotiledôneas como milho, cevada, trigo, arroz, centeio, etc.
Promotores notáveis que são adequados são promotor do gene ou lpt2 ou lptl da cevada (WO 95/15389 e WO 95/23230), ou os promotores descritos em WO 99/16890 (a partir de promotores de gene de cevada hordeína, gene glutelina do arroz, o gene oryzin do arroz, q gene prolamina de arroz, o gene gliadina de trigo, o gene glutelina de trigo, o gene zeína de milho, o gene glutelina de aveia, q c'ene Kasirin de sorgo, gene secalin de centeio). Outros prcmotores incluem os descritos por Broun et al. (1998), Potenza et al. (2004), US 20070192902 e US 20030159173. Em uma modalidade, o promotor específico da semente é preferencialmente expresso em partes definidas da semente, como o cotilédone ou o endosperma. Exemplos de promotores específicos de cotilédones, incluem, entre outros, o promotor FPl (Ellerstrom et al., 1996),
o promotor legumina de ervilha (Perrin et al., 2000), e o promotor fitohemaglutnina de feijão (Perrin et al., 2000). Exemplos de promotores específicos de endosperma incluem, entre outros, promotor zeína a-l do milho (Chikwamba et al., 2003), o promotor glutelina 1 do arroz (Yang et al., 2003), o promotor D- hordeína de cevada (Horvath et al., 2000) e promotores HMW gluteninas de trigo (Alvarez et al., 2000). Em outra modalidade, o promotor específico de sementes não é expresso, ou só é expresso a um nível baixo, no ernbrião e/ou depois de a semente germinada.
[367] Em outra modalidade, o proinotor específico de órgão de armazenamento de planta é um promotor específico de tubérculos.
Os exemplos incluem, entre outros, a patatina B33 de batata, e promotores PAT21 e GBSS, bem como o promotor sporamina de batata doce (para revisão, ver Potenza et al., 2004). Em uma modalidade preferencial, o promotor dirige a expressão preferencialmente na medula do tubérculo, em relação às camadas externas da pele (casca), ou o embrião do tubérculo.
[368] Em outra modalidade, o promotor específico de órgão de armazenamento da planta é um promotor específico de fruta. Os exemplos incluem, entre outros, a poligalacturonase do tomate, promotores E8 e PDS, assim como o promotor ACC oxidase de maçã (para revisão, ver Potenza et al., 2004). Em uma rnodalidade preferencial., o promotor diriae a expressão preferencialmente nas partes comestíveis dos frutos, por exemplo, a medula da fruta, eríi relação à pele do fruto ou a semente dentro da fruta.
[369] Em uma modalidade, o promotor induzível é o sistema alc de Aspergillus nidulans. Exemplos de sistemas de expressão induzíveis que podem ser usados ao invés do sisterna alc de Aspergillus nidulans são descritos em uma revisão por Pad-idani (2003) and Corrado e Karali (2009). Estes incluem um sistema baseado em repressor de tetraciclina (TetR) e induzível de tetraciclina (Gatz, 199'7), sistemas baseados em repressor de tetraciclina e inativável de tetraciclina (Weinmann et al.,
1994), baseado em receptor de glicocorticoide (Picard, 1994), sistemas baseados em receptor de estrogênio e outros sistemas induzívei.s por esteroides (Bruce et al., 2000), sistemas de controle dual baseados em receptor de glicocorticoide, baseado em repressor de tetraciclina (Bohner et al., 1999), sistemas induzíveis por inseticida baseado em receDtor de ecdisona (Martinez et al., 1999, Padidam et al., 2003, Unger et al, 2002, Riddiford et al., 2000, Dhadialla et al., 1998, Martinez and jepson, 1999), sistemas induzíveis por etanol baseados em AICR (Felenbok, 1991) e sistemas induzíveis por cobre baseados em ACEI (Mett et al., 1993).
[370] Em outra modalidade, o promotor induzível é um promotor induzível por safener como, por exemplo, o promotor ln2-1 ou ln2-2 de milho (Hershey and Stoner, 1991), o promotor induzível por safener é o promotor GST-27 de milho (jepson et al., 1994), ou o promotor GH2/4 de soja (Ulmasov et al., 1995).
[371] Safeners são um grupo de diversos produtos quírnicos estruturalmente diversos usados para aumentar a tolerância da planta aos efeitos tóxicos de um composto herbicida. Exemplos destes compostos incluem anidreto naftálico e N,N-dialil-2,2- dicloroacetamida (DDCA), que protegem o rnilho e sorgo contra herbicidas tiocarbamato; ciometrinil, que protege o sorgo contra metoclor; triapentenol, que protege soja contra metribuzina; e benzenesulfonamidas substituídas, que aumenta a tolerância de várias espécies de colheita de cereais para os herbicidas sulfonilureia.
[372] Em outra modalidade, o promotor induzível é um promotor induzível de senescência como, por exemplo, promotor SAG induzível por senescência (gene associado à senescência) 12 e SAG 13 de Arabidopsis (Gan, 1-995; Gan and Amasino, 1995) e LSC54 de Brassica napus (Buchanan-Wollaston, 1994).
[373] Para a expressão em promotores específicos de folha de tecido vegetativo, corno promotores ribulose bifosfato carboxilase (RBCS), podem ser usados. Por exemplo, os genes
RBCSI, RBCS2 e RBCS3A de tomate são expressos em folhas mudas crescidas na luz (Meier et al., 1997). Um promotor ribulose bisfosfato carboxilase expresso quase exclusivamente em células mesófilas em lâminas foliares e bainhas foliares em altos níveis, descritos por Matsuoka et al. {1994), pode ser usado.
Outro promotor específico de folha é o promotor do gene da proteína de ligação à clorofila a/b colhida na luz (ver, Shiina et al., 1997). O promotor de gene relacionado a myb de Arabidopsis thaliana (Atmyb5) descrito por Li et al. (1996), é específico para folha. O promotor Atmyb5 é expresso em tricomas de folha em desenvolvimento, estípulas, e células epidérmicas nas margens de rosetas jovens e folhas caulinares, e em sementes imaturas. Um promotor de folha identificar em milho por Busk et al. (1997), pode ser usado.
[374] Em alguns casos, por exemplo, quando LEC2 ou BBM é recombinanternente expresso, pode ser desejável que o transgene não é expresso em níveis altos. Um exemplo de um prornotor que pode ser usado em ditas circunstâncias em um promotor de napina A truncado que retém o padrão de expressão específico de semente mas com um nível de expressão reduzido (Tan et al., 2011).
[375]A sequência líder 5' não traduzida pode ser derivada do promotor selecionado para expressar a sequência do gene heterólogo do polinucleotídeo da presente invenção, ou pode ser heterólogo em relação à região de codificação da enzima a ser produzida, e pode ser especificarnente modificado, se desejado, de modo a aumentar a tradução do mRNA. Para uma revisão da expressão de transgenes otimizando, ver Koziel et al. (1996). As regiões 5'não traduzidas podem também ser obtidas a partir de RNAS virais de plantas (vírus do mosaico do tabaco, vírus Tobacco etch, vírus do mosaico anão do mi-lho, do vírus do mosai.co da alfalfa, entre outros) a partir de genes eucarióticos adequados, genes de plantas (gene líder de proteina de ligação a clorofila a/b de trigo e milho), ou a partir de uma sequência sintética' de gene. A presente invenção não está limitada a construções onde a região não traduzida é derivada da sequência 5' não traduzida que acompanha a sequência do promotor. A sequência de comando pode também ser derivada de um promotor ou sequência de código não relacionado. Sequências líder úteis no contexto da presente invenção compreendem o líder de milho Hsp70 (US 5362865 e US 5859347), e o elemento de TMV ôrnega.
[376]A terminação da transcrição é realizada por uma sequência de 3' não traduzida de DNA operativamente ligada ao vetor de expressão para o polinucleotídeo de interesse. A região 3' não traduzida de uma molécula de DNA recombinante contém uin sinal de poliadenilação que funciona em plantas para causar a adição de nucleotídeos adenilatos a extremidade 3! do RNA. A região 3' não traduzida pode ser obtida de vários genes que são expressos em células de plantas. A nopalina sintase da região 3' não traduzida, a região 3' não traduzida de oene Rubisco de subunidade pequena de ervilha, a região 3' não traduzida do gene da proteína de armazenamento de soja 7S são norrnalmente usados nesta capacidade. As regiões 3' transcritas, não traduzidas contendo o sinal de poliadenilato dos genes do plasmídeo induzidos por tumor em Agrobacterium (Ti) também são adequados.
[377] Tecnologias de DNA recombinante podem ser utilizadas para melhorar a expressão de um polinucleotídeo transformado por manipulação, por exemplo, o número de cópias do polinucleotídeo em uma célula hospedeira, a eficiência com que os polinucleotídeos são transcritos, a eficiência com que as transcrições resultantes são traduzidas, e a eficiência de modificações pós-traducionais. Técnicas recombinantes úteis para o aumento da expressão de polinucleotídeos como aqui definidos incluem, entre outros, ligar operativamente o polinucleotídeo para um número de cópias elevado de plasmídeos, a integração da molécula de polinucleotídeo em um ou mais cromossomos da célula hospedeira, a adição de sequências de estabilidade de vetor ao plasmídeo, substituições ou modificações de sinais de controle de transcrição (por exemplo, prornotores, operadores,
potencializadores), substituições ou modificações de sinais de controle da tradução (por exemplo, locais de ligação ao ribossoma, sequências de Shine-Dalgarno), modificação do polinucleotídeo para corresponder à utilização de códons da célula hospedeira, e a eliminação de sequências que desestabili-zam os transcritos. Transferência de Ácidos Nucleicos
[378]A transferência de ácidos nucleicos pode ser utilizada para liberar urri polinucleotídeo exógeno a uma célula e compreendem uma, preferencialmente duas, sequências de fronteira e um polinucleotídeo de interesse. A transferência de ácido nucleico pode ou não codificar um marcador de seleção. Preferencialmente, o ácido nucleico de transferência faz parte de um vetor binário em uma bactéria, onde o vetor binário compreende ainda elementos que permitem a replicação do vetor na bactéria, seleção, ou manutenção de células bacterianas que contêm o vetor binário. Após transferência para uma célula eucariótica, a transferência do componente de ácido nucleico do vetor binário é capaz de integração ao genoma da célula eucariótica.
[379] Conforme usado aqui, o termo "ácido nucleico extracromossômico de transferência" refere-se a uma molécula de ácido nucleico que é capaz de ser transferida de uma bactéria como Agrobacterium sp., para uma célula eucariótica, como uma célula de folha da planta. Um ácido nucleico extracromossômico de transferência é um elemento genético que é bem conhe.cido como um elemento capaz de ser transferido, corri a subsequente integração de uma sequência de nucleotídeo contida dentro das suas fronteiras no genoma da célula receptora. A este respeito, um ácido nucleico de transferência está flanqueado, tipicamente, por d'aas sequências de "fronteira", embora em alguns casos, uma única fronteira de um lado pode ser utilizada e a segunda extremidade do ácido nucleico transferido é gerada aleatoriamente no processo de transferência. Um polinucleotídeo de interesse é geralmente posicionado entre a sequência de fronteira esquerda e a sequência de fronteira direita, de um ácido nucleico de transferência. O polinucleotídeo contido no ácido nucleico de transferência pode ser operativamente ligado a uma variedade de promotores diferentes e elementos terminadores de regulação que facilitem a sua expressão, isto é, a transcrição e/ou tradução do polinucleotídeo. DNAS de transferência (T-DNAS) de Agrobacterium sp. como Agrobacterium tuinefaciens ou Agrobacterium rhizogenes, e variantes/mutantes feitos pelo homem são provavelmente os melhores exemplos caracterizados de ácidos nucléicos de transferência. Outro exemplo é o P-DNA ("DNA de plantas"), que compreende T-DNA de sequências de fronteira de plantas.
[380] Conforme usado aqui, "T-DNA" refere-se a, por exemplo, T-DNA d.e um plasmídeo Ti de Agrobacterium tumefaciens ou de um plasmídeo Ri de Agrobacterium rhizogenes, ou variantes dos mesmos feitos pelo homem, que funcionam como T-DNA. O T-DNA pode compreender um T-DNA inteiro incluindo as sequências de fronteira direita e esquerda, mas precisa apenas compreender as sequências mínimas necessárias em cis para a transferência, isto é, a sequência de fronteira direita e a fronteira de sequência de T-DNA. Os T-DNAS da invenção foram inseridos nas mesmas, em ' qualquer ponto entre as sequências de fronteira direita e esquerda (se presente), o polinucleotídeo de interesse flanqueado por locais-alvo para uma recombinase específica de sítio. As sequências que codificam para fatores necessários em trans para a transferência do T-DNA para uma célula de planta., como genes vir, podem ser inseridas no T-DNA, ou podem estar presentes no mesmo replicon como o T-DNA, ou preferencialmente, estar em trans em um replicon compatível no hospedeiro Agrobacterium. Tais "sistemas de vetores binários" são bem conhecidos na técnica.
[381] Conforme usado aqui, "P-DNA" refere-se a um ácido nucleico de transferência isolado de um genoma de planta, ou variantes/mutantes dos mesmos feitos pelo homern, e compreende, em cada extremidade, ou em apenas uma extremidade, uma sequência do tipo fronteira de T-DNA. A sequência de fronteira, preferencialmente, compartilha pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95%, mas menos de 100% de identidade de sequência, com uma sequência de fronteira de T-DNA de Agrobacterium sp como Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes. Assim, P- DNAS podem ser usados em vez de T-DNAs para transferir uma sequência de nucleotídeos contida no P-DNA a partir de, por exemplo, Agrobacterium, a outra célula. O P-DNA, antes da inserção do polinucleotídeo exógeno que é para ser transferido, pode ser modificado para facilitar a clonagem e não deve preferencialmente codificar todas as proteínas. O P-DNA é caracterizado pelo fato de conter, pelo menos, uma sequência de fronteira direita e, preferencialmente, também urna sequência de fronteira esquerda.
[382] Conforme usado aqui, uma sequência de "fronteira" de um ácido nucleico de transferência pode ser isolado a partir de um organismo selecionado, como uma planta ou bactéria, ou será um variante/mutante feito pelo homem. A sequência de fronteira promove e facilita a transferência do polinucleotídeo ao qual está ligado, e ,pode facilitar a sua integração no genoma da célula receptora. Em uma modalidade, uma sequênci-a de fronteira é de entre 5-100 pares de bases (pb) de comprimento, 10-80 pb de comprimento, 15-75 pb de comprirnento, 15-60 pb de comprimento, 15-50 pb de comprimento, 15-40 pb de comprimento, 15-30 pb de comprimento, 16-30 pb de comprimento, 20-30 pb de comprimento, 21-30 pb de comprimento, 22-30 pb de con1primentQ, 23-30 pb de comprimento, 24-30 pb de comprimento, 25-30 pb de comprimento, ou 26-3'0 pb de comprimento. Sequências de fronteira de T-DNA de Agrobacterium sp. são bem conhecidas na técnica e incluem os descritos E.líl Lacroix et al. (2008), Tzfira e Citovsky (2006) e Glevin (2003).
[383] Enquanto tradicionalrnente só Agrobacterium sp. tem sido utilizado para transferir genes para células de plantas, há agora um grande núrnero de sistemas que têm sido identificados/desenvolvidos que atuam de uma forrna semelhante a de Agrobacterium sp. Várias espécies não Agrobacterium têm recentemente sido geneticamente modificadas para serem cornpetentes para a transferência de genes (Chung et al., 2006; Broothaerts et al., 2005). Estas incluem Rhizobium sp. NGR234, Sinorhizobium meliloti e Mezorhizobium loti. As bactérias são tornadas corüpetentes para a transferência d-e genes, fornecendo às bactérias o maquinário necessário para o processo de transformação, isto é, um conjunto de genes de virulência codificados por um plasmídeo Ti de Agrobacterium e do segmento de T-DNA que reside em um pequeno plasmídeo binário separado.
Bactérias rnodificadas desta maneira são capazes de transforrnar tecidos vegetais diferentes (discos de folhas, calos e tecido oval), monocotiledôneas ou dicotiledôneas, e várias espécies de plantas diferentes (por exemplo, tabaco, arroz).
[384]A transferência direta de plasmídeos de expressão eucarióticos a partir de bactérias aos hospedeiros eucarióticos foi primeiramente alcançada há várias décadas por fusão de protoplastos de células de mamíferos e de Escherichia coli carreadoras d.e plasmídeo {Schaffner, 1980). Descije então, o número de bactérias capazes de transportar genes eijí células de mamíferos tem aumentado (Weiss, 2003), sendo desjcoberto por quatro grupos independentemente (Siz=more et al 1995j;. Courvalin et al., 1995;. Powell et al., 1996; darji et al., 19)ÍÜ.
[385] Shigella flexneri, Salmonella typhimuriuf' ou E.coli atenuadas que foram geradas invasivas pela viPuiência do plasrnídeo (pWRlOO) de S. flexneri forarn demonstjradas serem capazes de transferir os plasrnídeos de expressão ap"s a invasão das células do hospedeiro e rnorte intracelulak devido à atenuação metabólica. Aplicação na mi.'cosa quer por Pi-a nasal ou por via oral., tais recombinantes de Sallnon(=lla jou Shigella l induziram respostas imunes contra o antígeno codificado pela expressão dos plasmídeos. No entanto, a lista de bactérias, demonstrou ser capaz de transferir os plasmídeos de expressão de células hospedeiras de mamíferos in vitro e in vivo foi mais do que duplicada e foi documentada para S. typhi, S. choleraesuis, Listeria monocytogenes, Yersinia pseudotuberculosis e Y. enterocolitica (Fennelly et al., 1999; Shiau et al., 2001; Dietrich et al., 1998:. Hense et al., 2001; Al-Mariri et al., 2002).
[386] Em geral, pode-se assumir que todas as bactérias que são capazes de entrar no citosol da célula hospedeira (como S.
flexneri ou L. monocytogenes) e lisar dentro deste compar'timento celular, devendo ser capaz de transferir DNA. Isto é conhecido como invasão "abortiva" ou "suicida", como as bactérias têm de lisar para a transferência de DNA ocorrer (Grillot-Courvalin et al., 1999). Além disso, até rriuitas das bactérias que permanecem no vacúolo fagocítico (como S. typhimurium) podem também ser capazes de fazer isso. Assim, as cepas laboratoriais recombinantes de E. coli que foram modificadas para serem invasivas, mas são incaDazes de escapar de um fagossomo, poderiam liberar sua carga de plasmídeo para o núcleo da célula infectada de mamífero, no entanto (Grillot-Courvalin et al., 1998). Além disso, o Agrobacteríum tumefaciens foi recenternente também demonstrado poder introduzir transgenes em células de mamíferos (Kunik et al., 2001).
[387] Conforme usado aqui, o termo "transfecção", "transformação" variações dos mesmos são geralmente usados de modo intercambiável. As células "transfectadas" ou "transformadas" podem ter sido manipuladas para introduzir os polinucleotídeos de interesse, ou podem ser células derivadas da progênie. Células recombinantes
[388]A invenção também fornece uma célula recombinante, por exemplo, uma célula de planta recombinante, que é uma célula hospedeira transformada com urn ou mais polinucleotídeos ou vetores como aqui definido, ou combinações dos mesmos. O termo "célula recombinante" é utilizado de forma intercambiável com o termo "célula transgênica" neste documento. As células adequadas da presente invenção incluem qualquer célula que pode ser transformada com um vetor de polinucleotídeo ou recombinantes da invenção, que codifica, por exemplo, um polipeptídeo ou urna enzima aqui descrita. A célula é preferencialrnente uma célula capaz de ser utilizada para a produção de lipídeos. A célula recombi-nante pode ser uma célula em cultura, uma célula in vitro, ou eíri um organismo como, por exemplo, uma planta, ou um órgão, como, por exemplo, uma semente ou uma folha.
Preferencialmente, a célula está em uma planta, mais preferencialmente, na semente de uma planta. Em uma modalidade, a célula recombinante é uma célula não humana.
[389]As células hospedeiras em que os polinucleotídeos são introduzidos podem ser ou células não transformadas ou células que já estão transformadas com pelo menos um ácido nucleico. Tais ácidos nucleicos podem estar relacionados com a síntese de lipídeos, ou não relacionados. As células hospedeiras da presente invenção podem ser endogenamente (isto é, naturalmente) capazes de produzir polipeptídeos aqui definidos, caso em que a célula recombinante dele derivada tern uma maior capacidade de produção de polipeptídeos, ou pode ser capaz de produzir ditos polipeptídeos só depois de ter sido transformada corn pelo menos um polinucleotídeo da invenção. Em uma rnodalidade, uma célula recombinante da invenção tem uma mai-or capacidade de produzir lipídeo apolar.
[390]As células hospedeiras da presente invenção podew, ser quaisquer células capazes de produzir pelo menos uma proteína aqui descrita, e incluem células de bactérias, fungos (incluindo leveduras), parasitas, a.rtrópodes, anirnal, de algas, e as células de plantas. As células podem ser procarióticas ou eucarióticas. As células ·hospedeiras preferenciais são algas,
leveduras e células de plantas. Em unia modalidade preferencial., a célula é uma célula de planta de semente, em particular, uma célula de uma cotiledônia ou do endosperma da semente. Em uma modalidade, a célula é uma célula animal. A célula animal pode ser de qualquer tipo de animal., como, por exemplo, uma célula de animal não humano, uma célula de vertebrado não humano, uma célula de mamífero não humano, ou células de animais aquáticos, como peixes ou crustáceos, invertebrados, insetos, etc. Exemplos não limitantes de células de artrópodes incluem células de inseto como Spodoptera frugiperda (Sf), células, por exemplo, Sf9, Sf21, células TrichoDlusia ni, 6 e células S2 de Drosophila.
Um exemplo de uma célula bacteriana útil como uma célula hospedeira da presente invenção é Synechococcus sp (também conhecido como Syn,echocystis spp.), Por exemplo, Synechococcus elongatus. Exemplos de células de algas úteis como células hospedeiras da presente invenção incluem, por exemplo, Chlamydomonas sp. (por exemplo, Chlamydomonas reinhardtii), Dunaliella sp., Haematococcus sp., Chlorella sp., Thraustochytrium sp., Schizochytrium sp. e Volvox sp.
[391]AS células hospedeiras para a expressão dos ácidos nucleicos instantâneos podem incluir hospedeiros microbianos que crescem sobre uma grande variedade de matérias-primas, incluindo carboidratos simples ou complexos, ácidos orgânicos e álcoois e/ou hidrocarbonetos através de uma vasta gama de valores de temperatura e pH. Hospedeiros microbianos preferenciais são organismos oleaginosos, que são naturalmente capazes de síntese de lipídeos apolares.
[392]AS células hospedeiras podem ser de um organismo adequado para um processo de fermentação, como, por exernplo, Yarrowia lipolytica ou outras leveduras. Plantas Transgênicas " {3':3]A invenção também fornece uma planta que corripreende um polinucleotídeo polipeptídeo exógeno da presente invenção, uma célula da invenção, um vetor da invenção, ou uma cornbinação dos mesmos. O termo "planta" refere-se a plantas inteiras, enquanto que ç) termo "parte do mesmo" refere-se a órgãos da planta (por exemplo, folhas, caules, raízes, flores, frutos), células individuais (por exemplo, pólen), sementes, partes de sementes, como um embrião, endosperma, escutelo ou revestimento de semente, tecido de planta como o tecido vascular, células de plantas e progênie das mesmas. Conforme usado aqui, partes da planta compreendem células de plantas.
[394] Conforme usado aqui, o termo "planta" é utilizado em se.u sentido mais amplo. Ele inclui, entre outros, qualquer espécie de grama, planta ornamental ou decorativa, cultura ou cereais (por exemplo, sementes oleaginosas, soja, milho), forragem, frutas ou vegetais, erva, plantas lenhosas, flor ou árvore. Ele não se destina a limitar uma planta a qualquer estrutura particular. Ela também se refere a plantas unicelulares (por exemplo, rnicroalgas). O termo "parte dos mesmos" em referência a uma planta refere-se a uma célula de planta e a descendência da mesma, uma pluralidade de células de plantas que são largamente diferenciadas em uma colônia (por exemplo, volvox), uma estrutura em que está presente em todas as fases de desenvolvimento de uma planta, ou tecido de uma planta.
Tais estruturas incluem, entre outras a, folhas, caules, flores, frutos, nozes, raízes, sementes, revestimento de sementes, embriões. O termo "tecido vegetal" inclui os tecidos diferenciados e não diferenciados de plantas incluindo aqueles presentes em folhas, caules, flores, frutos, nozes, raízes, sementes, por exemplo, o tecido embrionário, o endosperma, tecido dérmico (por exemplo, epiderme, periderme), tecido vascular (por exemplo, xilema, floema) ou de tecido do solo (que compreende parênquima, colênquima, e/ou céjuias de esclerênquima), bem como células em cultura (por exemplo, células isoladas, protoplastos, calos, embriões, etc.). Tecido da planta pode ser em planta, em cultura de órgãos, cultura de tecidos ou cultura de células.
[395] Uma "planta transgênica", "planta geneticamente modificada" ou variações das mesmas referem-se a uma planta que contém um transaene não encontrado em uma planta de tipo selvagem da rnesma espécie, variedade ou cultivar. As plantas transgênicas, como definidas no contexto da presente invenção, incluem plantas e sua progênie que foram geneticamente modificadas utilizando técnicas recombinantes, para causar a produção de pelo menos um polipeptídeo definido na planta desejada ou em parte da mesma. Partes de plantas transgênicas tem u.m significado correspondente.
[396] Os termos "sernente" e "grãos" são aqui utilizados de mocio intercambiável. "Grão" refere-se ao grão maduro, como grãos de cereais colhidos ou que ainda estão em uma planta, rnas prontos para a colheita, mas pode também referir-se ao grão de embebição ou germinação, de acordo com o. contexto. Grão maduro geralmente tem um teor de umidade de menos do que cerca de 18- 20%. Em urna modalidade preferencial, o teor de umidade do grão é ern U.m nível que é geralmente considerado como seguro para armazenamento, preferencialmente entre 5% e 15%, entre 6% e 8%, entre 8% e 10%, ou entre 12% e 15%. "Semente em desenvolvimento" conforme usado aqui refere-se a uma semente antes da maturação, tipicamente encontrada nas estruturas reprodutivas da planta após fertilização ou antes, mas também pode se referir a tais sementes antes da maturação, que são isoladas de uma planta. Semente madura comumente tem um teor de umidade d.e menos do que cerca de 18-20%. Em uma modalidade preferencial, o teor da semente é em um nível que é geralmente considerado como seguro para armazenamento, preferencialmente entre 5°5 e 15%, entre 6°5 e 8%, entre 8% e 10%, ou entre 12% e 15%.
[397] C.onforme usado agui, o termo "órgão de armazenamento da planta" réfere-se a uma parte de uma planta especializada para arrr.ãzenar energia sob a forina de, por exemplo, proteínas, carboidratos, lipídeos. Exemplos de órgãos de armazenamento de plantas são frutos, sementes, raízes tuberosas e tubérculos. Um órgão de armazenamento preferencial de plantas da presente invenção é a semente. {398] Conforme usado aqui, o termo "fenotipicarnente normal" refere-se a uma planta geneticamente modificada ou parte desta, em particular um órgão de armazenamento, como a semente de tubérculos ou de frutos da presente invenção não tendo uma capacidade significativamente reduzida para crescer e reproduzir-se, quando comparado com uma planta não modificada ou parte da mesma. Em uma modalidade, a planta geneticamente modificada ou parte da mesma que. é fenotipicamente normal compreende um polinucleotídeo recombinante que codifica um supressor de silenciamento operativamente ligado a um promotor específico do órgão de armazenamento da planta e tem uma capacidade para crescer ou reproduzir o qual é essencialrnente a mesma que a planta correspondente ou parte da mesma não compreendendo o dito polinucleotídeo. Preferencialmente, a biomassa, taxa de crescimento, taxa de germinação, tamanho do órgão de armazenagem, o tamanho das sementes e/ou o número de sementes viáveis produzidos não é inferior a 90°s daquela de uma planta deficiente no dito polinucleotídeo recombinante, quando cultivada sob condições idênticas. Este termo não engloba características da planta. que podem ser diferentes p,ara a planta de tipo selvagem, rnas que não afetam a utilidade da planta para fins comerciais, como, por exemplo, um fenótipo bailarina de folhas de mudas.
[399].Plantas fornecidas ou contempladas para utilização na prática da presente invenção incluem tanto monocotiledôneas e dicotiledôneas. Em modalidade preferencial, as plantas da presente invenção são plantas de cultura (por exemplo, cereais e leguminosas, rnilho, trigo, batata, tapioca, arroz, milho, sorgo, mandioca, cevada, ou ervilha), ou outras leguminosas. As plantas podem ser cultivadas para a produção de raízes, tubérculos comestíveis, folhas, c.aules, flores ou frutos. As plantas podem ser vegetais ou plantas ornamentais. As plantas da presente invenção podem ser: Acrocomia aculeata (palma de macaúba) , Arabidopsis thaliana, Aracinis hypogaea (amendoim) , Astrocaryum murumuru (rnurumuru) , As troca ryum vulgare (tucumã) , Attalea geraensis (Indaiá-rateiro) , Attalea humilis (Palma de óleo americano) , Attalea oleifera (andaiá) , Attalea phalera ta (uricuri) , Attalea speciosa (babaçu) , Avena sa tiva (aveias) , Beta vulgaris (beterraba) , Brassica sp. como Brassica carinata, Brassica juncea, Brassica napobrassica, Brassica napus (canola) , Camelina sa tiva (linho falso) , Cannabis sa tiva (cânhamo) , Carthamus tinctorius (cártamo) , Caryccar brasiliense (pequi) , Cccos nucifera {cOCO) , Crambe abyssinica (Abyssinian kale) , Cucumis melo (melão) , Elaeis guineensis (palma africana) , Glycine max (soja) , Gossypium hirsutum (algodão) , Helianthus sp.
como Helianthus annuus (girassol, Hordeum vulgare (cevada) , ja tropha curcas (pinhão manso) , joannesia princeps (nogueira de arara) , Lemna sp. (lentilha d' água) corno Lemna aequinoctialis, Lemna disperma, Lemna ecuadoriensis, Lemna gibba (lentilha d' água inchada) , Lemna japonica, Lemna minor, Lemna minuta, Lemna obscura , Lemna paucicostata, Lemna perpusilla, Lemna tenera , Lemna trisulca, Lemna turionifera, Lemna valdiviana, Lemna yungensis, Licania rigida (oiticica) , Linum usitatissimum (linho) , Lupinus angustifolius (tremoço) , Mauritia flexuosa (palma de buriti) , Maximiliana maripa (palma de inaja) Y Miscanthus sp. como Miscanthus x giganteus e bíiscanthus sinensis, Nicotiana sp. (tabaco), como Nicotiana tabacum ou Nicotiana benthamiana, Oenocarpus ba caba (bacaba-cio-azeite) , Oenocarpus bataua (patauã) , Oenocarpus distichus (bacaba-de- leque) , Oryza sp. (arroz) como Oryza sa tiva e Oryza glaberrima, Panicum virga t um {switchgrass) , Paraqueiba paraensis (mari) , Persea amencana (abacate) , Pongamia pinna ta (Faia indiana) , Populus trichocarpa, Ricinus communis (rícino) , Sa ccharum sp. (cana de açúcar) , Sesamum indicum (gergelim) , Solanum tuberosum (batata) , Sorghum sp. como Sorghum bicolor, Sorghum vulgare, Theobroma grandiforum (cupuaçu) , Trifolium sp. , Trithrinax brasiliensis (palma brasileira), Triticum sp. (trigo) como Triticum aestivum, Zea maj's (milho), alfalfa (Medicago sativa) , centeio (Secale cerale), batata doce (Lopmoea batatus) , mandioca (Manihot esculenta), café (Cofea spp.), abacaxi (Anana comosus), árvore de citrino (Citrus spp.), cacau (Theobroma cacao), chá (Camellia senensis), banana (Musa spp.), abacate (Persea americana), figo (Ficus casica), goiaba (Psidium guajava), manga (Mangifer indica), azeitona (Olea europaea), papaia (Carica papaya), caju (Anacardium occidentale), macadâmia (Macadamia interg.rifolia) e amêndoa (Prunus amygdalus).
[400] Outras plantas preferenciais incluem gramíneas C4, coríio, além das mencionadas acima, Andropogon gerardi, Bouteloua curtipendula, B. gracilis, Buchloe dactyloides, Schizachyrium scoparium, Sorghastrum nutans, Sporobolus cryptandrus; gramíneas C3, como Elymus canadensis, os legumes Lespedeza capitata e Petalostemum villosum, o forb Aster azureus, e plantas lenhosas como Quercus ellipsoidalis e Q. macrocarpa. Outras plantas preferenciais incluem gramíneas C3.
[401] Em uma modalidade preferencial, a planta é uma angiosperma.
[402] Em uma modalidade, a planta é uma planta de semente oleaginosa, preferencialmente uma planta oleaginosa. Conforme usado aqui, uma "planta oleaginosa" é uma espécie de planta usada na produção comercial de lipídeo a partir das sementes da planta. A planta de sementes oleaginosas, por exemplo, pode ser óleo de semente de colza (por exemplo, canola), rnilho, oirassol, açafrãc, soja, sorgo, linho (linhaça) ou de beterraba. Além disso, a planta oleaginosa pode ser outras Brassicas, algodão, amendoim, papoila, rutabaga, mostarda, mamona, gergelim, açafrão, noz ou plantas produtoras. A planta pode produzir níveis.'elevados de lipídeos no seu fruto, como azeite, óleo de palma ou coco. Plantas hortícolas na qual a presente invenção pode ser aplicada são alface, endívia Brassicas, ou vegetal., incluindo couve, brÓcolis ou couve-flor. A presente invenção pode ser aplicada no tabaco, cucurbitáceas, cenoura, morango, tomate ou pimenta.
[403] Em uma modalidade preferencial, a planta transgênica é homozigótica para cada e todo gene que foi introduzido (transgene), de modo que a sua descendência não segrega para o fenótipo desejado. a planta transgênica pode também ser heterozigótica para o transgene introduzido, preferencialmente uniformemente heterozigótica para o transgene, como, por exemplo, na progênie F1 que foi cultivada a partir de sementes híbridas. Tais plantas podem proporcionar vantagens, como vigor híbrido, bem conhecidas na técnica.
[404] Quando relevante as plantas transgênicas podem também
X compreender outros transgenes que ccdificam enzimas envolvidas na produção de lipídeos apolares, como, entre outros, a LPAAT, LPCAT, PAP, ou um fosfolipídio: diacilglicerol aciltransferase (PDATI, PDAT2 ou PDAT3; ver, por exemplo, Ghosal et al., 2007), ou uma combinação de dois ou mais destes. As plantas transgênicas da presente invenção podem também expressar oleosina de um polinucleotídeo exógeno.
Transformação de plantas
[405]AS plantas transgênicas podem ser produzidas utilizando técnicas conhecidas na técnica, como os geralmente descritos em Slater et al., Plant Biotechnology - The Genetic Manipulation of Plants, Oxford University Press (2003), and Christou and Klee, Handbook of Plant Biotechnology, John Wiley and Sons {2004).
[406] Conforme usado aqui, os termos "transfcrmar de forma estável", "transformado de forma estável" e variações dos mesmos referem-se à integração do polinucleotídeo no genoma da célula de tal modo que eles são transferidos para as células descendentes durante a divisão celular, sem necessidade de seleção positiva para a sua presença. Os transforrnantes de forrna estável, ou seus descendentes, podem ser selecionados por qualquer meio conhecido na técnica, como Southern blots de DNA cromossômico, ou hibridização in situ de DNA genômico.
[407]Transferência mediada por Agrobacterium é um sistema largamente aplicável para a introdução de genes em células de plantas porque o DNA pode ser introduzido nas células em tecidos de plantas inteiras, órgãos vegetais, ou explantes' em cultura de tecidos, quer para a expressão transiente, quer para a integração estável do DNA no genoma da célula de planta. A utilização de plantas mediadas por Agrobacterium para introdução de vetores de integração de DNA em células de plantas é bem conhecido na técnica (ver, por exemplo, US 5177010, US 5104310, US 5004863, ou US 5159135). A região do DNA a ser transferida é definida pelas sequências de fronteira, e o DNA interveniente (T-DNA) é usualmente inserido no genoma da planta. Além disso, a integração do T-DNA é urri processo relativamente preciso resultando em poucos rearranjos. Nessas variedades vegetais onde a transformação mediada por Agrobacterium é eficiente, é este o método de escolha devido à natureza fácil e definida do gene de transferência. Vetores de transformação de Agrobacterium preferenciais são capazes de replicação em E. coli bem como em Agrobacterium, permitindo manipulações convenientes como descri-to (Klee et al., In: Plant DNA Infections Agents, Hohn e Schell, eds, Springer-Verlag, New York, pp 179-203 (1985)).
[408]Iqétod.os de aceleração que podem ser utilizados incíuem, por exemplo, bom.bardeio de microprojéteis, etc. Um exemplo de método para a liberação de moléculas de ácido nucleico transformadas para células de plantas é o bombardeio de microprojéteis. Este método tem sido revisto por Yang et al., Particle Bombardment Technology for Gene Transfer, Oxford Press, Oxford, Inglaterra {1994).Partículas não biológicas (microprojéteis) que podem ser revestidas com ácidos nucleicos e liberadsa às células através de uma força de propulsão. Exemplos de partículas incluem aquelas compostas ,de tungstênio, ouro, platina, e outros semelhantes. Uma vantagem particular do bornbardeio de microprojéteis, além cio fato de ser um meio eficaz de reproduzível de transformar monocotiledôneas, e nem o isolamento de protoplastos nem a suscetibilidade da infecção por Agrobacterium são necessários. Uma modalidade ilustrativa de um método para a liberação de DNA em células de Zea mays por aceleração é um sisterna de liberação de a-partículas por biolística, que pode ser usado para propulsionar partículas revestidas com DNA através de uma tela, como um aço inoxidável ou tela Nytex, para uma superfície de filtro coberta com células de milho cultivadas em suspensão. Um sistema de liberação de partícula adequado para uso com a presente invenção é a arma de aceleração de hélio PDS-lOOO/He disponível a partir de 81o-Rad Laboratories.
[409] Para o bombardeio, células em suspensão podem ser concentradas em filtros. Filtros contendo as células a serem bombardeadas são posicionados a uma distância adequada por baixo da placa de parada de microprojéteis. Se desejado, uma ou mais telas são também posicionadas entre a arma e as células a serem bombardeadas.
[410]Alternativamente, embriões imaturos ou outras células alvo podem ser dispostos em meios de cultura sólidos. As células a serem bombardeadas são posicionadas a uma distância adequada por baixo da placa de parada de microprojéteis. Se desejado, uma ou 'mais telas são também posicionadas entre o dispositivo de aceleração e as células a serem bombardeadas. Através da utilização de técnicas estabelecidas na presente invenção, podem-se obter até 1000 ou mais focos de células expressando transitoriamente um gene marcador. O número de células em um foco que expressa o produto do gene 48 horas após bombardeio, muitas vezes varia de um a dez e tem a média de um a três.
[411] Na transformação por bombardeio, pode-se otimizar as condições de cultura pré-bombardeio e os parârnetros de bombardeio para dar os números máximos de transformantes estáveis. Ambos os parâinetros físicos e biológicos para bombardeio são importantes nesta tecnologia. Os fatores físicos são aqueles que envolvem a manipulação do DNA precipitado /microprojétil ou os que afetam o voo e velocidade tanto do macro ou microprojéteis. Os fatores biológicos incluem todos os passos envolvidos na manipulação de células antes e imediatamente após o bombardeio, o ajuste osmótico das células alvo para ajudar a aliviar o trauma associado com o bombardeio, e também a natureza do DNA transformante, como o DNA linearizado ou plasmídeos superenrolados intactos. Acredita-se que as manipulações pré-bombardeio são especialmente importantes para a transformação bem sucedida de embriões imaturos.
[412] Em outra modalidade alternativa, os plastídeos pcdem ser estavej-mente transformados. Métodos revelados para a transformação de plastídeos em plantas superiores incluem a liberação de partículas de DNA contendo um marcador de seleção por arma e de direcionamento do DNA para o genoma do plastídeo através de recombinação homóloga (US 5.451.513, US 5.545.818, US
5.877.402, US 5.932.479, e WO 99/05265).
[413]Assim, contempla-se que se pode pretender ajustar os vários aspectos dos parâmetros de bombardeio em estudos de pequena escala para otimizar totalmente as condições. Pode-se particularmente desejar ajustar os parâmetros físicos como distância do espaçamento, distância de voo, distância do tecido e pressão de hélio. Pode-se tambéni minirnizar os fatores de redução de trauma, modificando as condições que influenciam o estado fisiológico das células receptoras e que podem, portanto influenciar na eficiência de transformação e integração. Por exemplo, o estado osmótico, hidratação do tecido e fase de subcultura ou ciclo celular das células receptoras podem ser ajustados para uma transformação ótima. A execução de outros ajustes de rotina será conhecida pelos especialistas na técnica, à luz da presente revelação.
[414] Transformação de protoplastos de plantas pode ser conseguida usandc métodos baseados em precipitação com fosfato de cálcio, tratamento com polietilenoglicol, eletroporação e combinações destes tratamentos. A aplicação destes sistemas a diferentes variedades de plantas depende da capacidade de regenerar a linhagem particular da planta a partir de protoplastos. Métodos ilustrativos para a regeneração de cereais a partir de protoplastos são descritos (Fujimura et al., 1985; Toriyama et al., 1986; Abdullah et al., 1986).
[415]Outros métodos de transformação de células também podem ser usados e incluem, entre outros, a introdução de DNA em plantas por transferência de DNA direta no pólen, por injeção direta de DNA em órgãos reprodutores de uma planta, ou por injeção direta de DNA dentro das células de embriões imaturos seouido da rehidratação de embriões dessecados.
[416]A regeneração, desenvolvimento, e cultivo de plantas a partir de protoplastos transformantes de plantas únicas ou a partir de várias explantes transformaci|os é bem conhecido na técnica {Weissbach et al., In: Methods for Plant Molecular Biology, Acadernic Press, San Diego, Calif, (1988)). Este processo de regeneração e crescimento inclui tipicamente os passos de seleção das células transformadas, cultura dessas células individualizadas através das fases habituais do desenvolvirnento ernbrionário até o estágio de plântula enraizada. Embriões transgênicos e sementes são regenerados de forma semelhante. Os brotos enraizados transgênicos resultantes são depois plantados em meio adequado de creScimento de plantas como O solo.
[417] O desenvolvimento ou regeneração de plantas contendo o gene, gen'e exógeno é bem conhecido na técnica. Preferencialmente, as plantas regeneradas são auto polinizadas para fornecer plantas transgênicas homozigóticas. De outro modo, pólen obtido das plantas regeneradas é cruzado com plantas crescidas de sementes de linhagens agronomicarrlente importantes. Por outro lado, o pólen de plantas destas linhagens importantes é usado para polinizar plantas regeneradas. Uma planta transgênica da presente invenção contendo um poli.nucleotídeo desejado é cultivada utilizando métodos bem conhecidos de um especialista na técnica.
[418] Os métodos para a transformação de dicotiledôneas, primariamente através da utilização de Agrobacterium tumefaciens, e obtenção de plantas transgênicas foram publicados para o algodão (US 5.004.863, US 5.159.135, US 5.518.908), soja (US 5.569.834, US 5.416.011), Brassica (US 5.463.174), amendoim (Cheng et al., 1996), e ervilhas (Grant et al., 1995).
[419] Os métodos para a transformação de plantas de cereais, como trigo e cevada, para a introdução de variações genéticas na planta por meio da introdução de um ácido nucleico exógeno e para a regeneração de plantas a partir de protoplastos ou de embriões imaturos de plantas são bem conhecidos na técnica ver, por exemplo, CA 2.092.588, AU 61781/94, AU 667939, US 6.100.447, WO 97/048814, US 5.589.617, US 6.541.257, e outros métodos são estabelecidos no WO 99/14314. Preferencialmente, as plantas transgênicas de trigo ou de cevada são produzidas por procedimentos de transformação mediados por Agrobacterium tumefaciens. Vetores que transportam o polinucleotídeo de3ejado podem ser introduzidos nas células de plantas de trigo regeneráveis de tecidos de plantas cultivados ou explantes, ou sistemas de plantas adequadas, como protoplastos.
[420]AS células de trigo regeneráveis são preferencialmente do escutelo de embriões imaturos, embriões maduros e calos derivados destes, ou do tecido meristemático.
[421] Para confirmar a presença dos transgenes nas células e plantas transgênicas, uma reação em cadeia da polimerase (PCR) ou análise de Southern blot pode ser efetuada utilizando métodos conhecidos dos especialistas na técnica. Produtos de expressão dos transgenes podem ser detectados em qualquer uma de uma variedade de formas, dependendo da natureza do produto e incíuem Western blot e ensaios enzimáticos. Uma forma particularmente Ú.til para quantificar a expressão da proteína e para detectar a replicaçáo em diferentes tecidos vegetais é utilizar um gene repórter como GUS. Uma vez que as plantas transgênicas tenharn sido obtidas, elas podem ser cultivadas para produzir tecidos ou partes de plantas que possuem o fenótipo desejado. O tecido da planta ou partes de planta, pode ser colhida e/ou as semente colhidas. A semente pode servir como fonte para o crescimento de plantas adicionais com tecidos ou partes possuindo as características desejadas. Preferencialrnente, as partes de planta vegetativas são coletadas em um momento quando os rendimentos de lipídeos apolares estão mais altos. Em uma modalidad-e, as partes de planta vegetativa são coietadas próximas ao tempo de floração.
[422]Uma planta transgênica formada utilizando Agrobacterium ou outros métodos de transformação contém tipicamente um único locus genético em um cromossomo. Tais plantas transgênicas podem ser referidas como sendo hemizigóticas para o gene adicionado. Mais preferencial é uma planta transgênica que é homozigóti-ca para o gene adicionado, isto é, urna planta transgênica que contém dois genes adicionados, um gene no mesmo locus em cada cromossomo do par de cromossomos. Uma planta transgênica homozigótica pode ser obtída por autofertilização de uma planta transgênica hemizigota, germinando algumas das sementes produzidas e analisando as plantas resultantes para o gene de interesse.
[423] Deve ser entendido também que duas plantas transgênicas diferentes que contêm dois genes exógenos segregando independentemente ou loci podern também ser cruzados {acoplados) para produzir descendência que contem ambos os conjuntos de genes ou loci. Autofecundação de progênie Fl apropriada pode produzir plantas que são homozigotos para os genes exógenos ou loci. Cruzamento reverso para uma planta parental e cruzamento com uma planta não trangênica estão tarnbém contempladas, assim como a propagação vegetativa. Descri-ções de outros métodos de melhoramento que são comumente usados para diferentes características e culturas podern ser encontradas em in Fehr, In: Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison Wis.(1987).
TILLING
[424] Em uma modalidade TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes - Lesões locais induzidas por direcionamento em genoma) pode ser utilizado para produzir onde os genes endógenos são suprimidos, por exemplo, genes que codificam uma DGAT, sn-l-glicerol-3-fosfato aciltransferase (GPAT), 1-acil- glicerol-3-fosfato-aciltransferase (LPAAT), acil-CoA: lisofosfatidileolino aciltransferase (LPCAT), fosfatase de ácido fosfatídico (PAP), ou uma combinação de dois ou mais destes.
[425] Em uma primeira etapa, as mutações introduzidas, como alterações de um único par de novas bases são induzidas em uma população de plantas por tratamento de sementes (ou pólen), com um agente mutagênico químico, e, em seguida, avançar para uma geração de plantas, onde mutações serão estavelmente herdadas. O DNA é extraído, e as sementes são armazenadas de todos os membros da população para criar um recurso que pode ser acessado repetidamente ao longo do tempo.
[426] Para um ensaio TILLING, os iniciadores de PCR foram designados para amplificar especificamente um único gene alvo de interesse. A especificidade é particularmente importante se o alvo é um membro de uma família de genes, ou parte de um genoma poliploide. Eni seguida, os iniciadores marcados com corante podem ser usados para amplificar os produtos de PCR a partir de um conjunto de dna de múltiplos indivíduos. Estes produtos de PCR foram desnaturados e reanelados para permi.tir a formação de pares de bases desemparelhados. O deserr.parelhamento ou heteroduplexes representa ambos os polimorfismos de um único nucleotídeo (SNPs) ocorrendo naturalmente (isto é, várias plantas da população são prováveis de carregar o mesrno polimorfismo) e o polimorfismo induzido SNP (ou seja, só raras plantas individuais são prováveis de exibir a mutação). Após a formação do heteroduplex, o uso de uma endonuclease, como Cell,
que reconhece e cliva o DNA sem born emparelhamento é a chave para descobrir novos SNPS dentro de uma população TILLING.
[427]Utilizando esta abordagem, inuitos milhares de plantas podem ser triadas para identificar qualquer individual com uma mudança de uma única base, bem como pequenas inserções ou deleções (1-30 pb) em qualquer gene ou região específica do genoma. Fragmentos genômicos analisados podem variar em tamanho, em qualquer lugar de 0,3 a 1,6 kb. Agrupamentos ern oito vezes, frac'mentos de 1,4 kb (descontando as extremidades de fragmentos onde a detecção SNP é problemática devido ao ruído) e 96 poços por ensaio, esta combinação permite que até um mi-lhão de pares de bases de DNA genômico sejam rastreados por único ensaio, fazendo TILLING uma técnica de alto rendimento. TILLING é ainda descrita em .Knauf e Slade (2005), e Henikoff et al. (2004).
[428]Além de permitir a detecção eficiente de mutações, tecnologia TILLING de alto rendimento é ideal para a detecção de polimorfismos naturais. Portanto, interrogando um DNA homólogo desconhecido por heteroduplexação a urna sequência conhecida, revela o número e posição dos sítios polimórficos. Ambas as alterações de nucleotídeos e as inserções e deleções pequenas são identificadas, incluindo, pelo menos, algum número de polimorfismos repetidos. Isto tem sido chamado Ecotilling (Comai et al., 2004).
[429] Cada SNP é gravada por sua posição aproxirnaça entre poucos nucleotídeos. Assim, cada haplotipo pode ser aírquivado com base em sua mobilidade. Dados de sequência podem ser obtidos com um esforço adicional relativamente pequeno utilizando alíquotas do mesmo DNA amplificado que é utilizado para ? ensaio de clivagem de desemparelhamento. O iniciador para a esqµerda ou para a direita para uma reação de sequenciamento individual é escolhido pela sua proximidade com o polimorfismo. f3oftware Sequencher realiza um alinhamento múltiplo e descobre aÍmudança de base, que em cada caso, confirmou a banda no gel. '
[430] Ecotilling pode ser realizada de forma mais b?rata do que sequenciamento completo, o método usado atualniente para a maioria das descobertas de SNP. Placas contendo arranjo de DNA ecotipico podem ser rastreadas em vez de conjuntos de dna a partir de plantas mutagenizadas. Como a detecção é em géis com resolução por par de bases e padrões de fundo são uniformes ern toda faixas, bandas que são de tamanho idêntico podem ser combinadas, descobrindo assim a genotipagem de SNPS em um único passo. Desta forma, o sequenciamento final do SNP é simples e eficiente, ainda mais acentuado pelo fato de que as alíquotas dos mesmos produtos de PCR utilizados para o rastreio podem ser submetidos a sequenciamento dp DNA.
Aume:"ítando os níveis de RNA exógenos e expressão estabilizada
[431] Silenciamento pós-transcricional de genes (P'I'GS) é um mecanismo de defesa específico da sequência nucleotídica que pode ter como alvo tanto mRNAs virais e celulares para a degradação. PTGS ocorre em plantas ou fungos de forma estável ou transientemente transformados com um polinucleot,ídeo recombinante e resulta na acumulação reduzida de moléculas de RNA com semelhante idade de sequência com o polinucleotídeo introduzido. "PÓs transcricional" refere-se a um mecanismo operando pelo menos parcialmente, mas não necessariamente exclusivamente, após a produção de um transcrito de RNA inicial, por exemplo durante o processamento do transcrito de RNA inicial, ou concomitante com junção ou exportação de RNA ao citoplasma, ou dentro do citoplasma por complexos associ-ados com proteínas Argonauta.
[432j Níveis de molécula de RNA podem ser aurnentados, e/ou os níveis de moléculas de RNA estabilizados durante muitas gerações ou em diferentes condições ambientais ao limitar a expressão de um supressor de silenciamento em um órgão de armazenamento de uma planta ou parte da mesma. Conforme usado aqui, um "supressor de silenciamento" é qualquer polinucleotídeo ou polipeptídeo que pode ser expresso em uma célula de planta que aumenta o nível do produto de expressão a partir de um transgene diferente na célula de planta., em particular, ao longo de gerações repetidas da planta, inicialmente transformada. Em uma modalidade, o supressor de silenciamento é um supressor de silenciamento viral ou mutante do mesmo. Um grande número de supressores de silenciamento viral é conhecido na técnica e incluem, entre outros, P19, V2, P38, Pe-Po e RPV- PO. Exemplos de supressores de silenciamento virais incluem os descritos ern WO 2010/057246. Um supressor de silenciamento pode ser expresso de forma estável em uma planta ou parte da mesma da presente invenção.
[433] Conforme usado aqui, o termo "expresso de forma estável" ou variações do mesmo se refere ao nível da molécula de RNA que é essencialmente o mesmo ou mais elevado nas gerações repetidas na progênese de plantas, por exemplo, pelo menos três, pelo menos cinco, ou pelo menos dez gerações, quando comparado a plantas correspondentes com falta do polinucleotídeo exógeno que codifica o supressor silenciador. Entretanto, este termo não exclui a possibilidade que ao longo de gerações repetidas haja alguma perda dos níveis da molécula de RNA quando comparadas a uma geração precedente, por exemplo, não menos de 10% de perda por geração.
[434]0 supressor pode ser selecionado a partir de qualquer fonte, por exemplo, planta, viral., mamífero, etc. O supressor pode ser, por exemplo, vírus flock house B2, vírus pothos latente P14, vírus pothos latente AC2, vírus de mosaico de mandioca africana AC4, doença de mosaico de veia amarela de bhendi C2, doença de mosaico de veia amarela de bhendi C4, doença de mosaico de veia amarela de bhendi j3cl, vírus de clorose de tomate p22, vírus de clorose de tomate CP, vírus de clorose de tomate CPm, vírus de mosaico dourado de tomate AL2, vírus java de folha curva de tomate j3c1, vírus de fo1ha curva amarela de tomate V2, vírus de folha curva amarela de tomate-China C2, isolado j3c1 vírus China de folha curva amarela de tomate YlO,
isolado V2 de Israeli folha curva amarela de tomate, vírus de raosaico de feijão mungo verde amarelo-Vigna AC2, vírus de mancha em anel clorótica de hibiscus CP, vírus de mosqueado do nabo P38, vírus de mosqueado do nabo CP, vírus do mosaico da couve-flor P6, vírus do amarelo da beterraba p21, vírus citrus tristeza p20, vírus citrus tristeza p23, vírus citrus tristeza
CP, vírus de mosaico de feijão de corda SCP, vírus do nanismo clorótico de batata doce p22, vírus do mosaico do pepino 2b, vírus de aspermia do tomate HC-Pro, vírus superior de beterraba curvada L2, vírus do mosaico do trigo 19K, vírus de mosaico de estripe de cevada Gammab, vírus semilatente de poa Gammab, pecluvírus clump de amendoim P15, vírus de arroz anão PnslO, vírus pulgão de abóbora amarela PO, vírus do amarelo da beterraba do oeste PO, vírus da batata X P25, vírus de amarelamento de veia do pepino Plb, vírus eruptivo da ameixa HC- Pro, vírus do mosaico da cana de açúcar HC-Pro, vírus da batata
Y cepa HC-Pro, vírus de corrosão do tabaco P1/HC-Pro, vírus do mosaico amarelo do nabo P1/HC-Pro, vírus mosqueado de cocksfoot
Pl, vírus mosqueado de cocksfoot -isolado norueguês Pl, vírus mosqueado ãmarelo de arroz Pl, vírus mosqueado amarelo de arroz- isolado nigeriano Pl, vírus de folha branca do arroz NS3, vírus de estirpè de arroz NS3,. vírus de mosaico do.tabaco infectando crucíferas 126K, vírus de mosaico do tabaco infectando de crucíferas p122, vírus de mosaico do tabaco p122, vírus de mosaico do tabaco 126, vírus de mosaico do tabaco 130K, vírus rattle de tabaco 16K, vírus de atrofia do tomateiro P19, víru.s do vira-cabeça do tomateiro NSs, vírus de mancha de folha clorCtica de maçã P50, vírus da parreira A plO, vírus associado à enrolamento da parreira -2 homólogo de BYV p21, bem. como variantes/mutantes dos mes.mos.
A lista acima fornece o vír'-is do qual o supressor pode ser obtido e a proteína (por exemplo, B2,
1?14, etc.), ou designação de região de codificação para o supressor para cada vírus particular.
Outros supressores de silenciamento candidatos podem ser obtidos por avaliação de sequências de genoma vi-ral codificadas na mesma posição dentro do genoma viral, em relação à estrutura de um genoma viral relacionado compreendendo um supressor de silenciamento conhecido, como é apreciado por um especialista na técnica.
[435] Supressores de silenciamento podem ser categorizados baseado em seus modos de ação. Supressores como V2 que preferencialmente ligam á uma molécula de RNA de fita dupla que tem extremidades 5' overhanging a uma molécula de RNA de fita dupla correspondente tendo extremidades embotadas são particularmente úteis para melhorar a expressão de transgene quando usado em combinação com silenciamento do gene (polinucleotídeo exógeno codificando um CISRNA). Outros supressores como p19 que preferencialmente ligam uma molécula de dsRNA que é 21 pares de base em comprimento em relação a uma molécula de dsRNA de um comprimento diferente pode ainda permitir expressão de transgene na presença de um polinucleotídeo exógeno que codifica um CISRNA, mas geralmente em um grau menor do que, por exemplo, V2. Isto permite a seleção de uma combinação ideal de dsRNA, supressor de silenciarnento e transgene super expresso para uma finalidade particular. Ditas combinações ideais podem ser identificadas usando um método da invenção.
[436] Em uma modalidade, o supressor de silenciamento preferencialmente liga a urna molécula de RNA de fita dupla que tem extremidades 5' overhanging em relação a uma molécula de RNA de fita dupla correspondente tendo extremidades embotadas. Neste contexto, a molécula de RNA de fita dupla correspondente preferencialmente tem a mesma sequência de nucleotídeo como a molécula com as extremidades 5' overhanging, mas sem as extremidades 5' overhanging. Ensaios de ligação são rotineiramente realizados, por exemplo, em ensaios in vitro, por qualquer método conhecido a um especialista na técnica.
[437]Múltiplas cópias de um supressor poderr. ser usadas. Os diferentes supressores podem ser usados juntos (por exemplo, em tandem).
[438] Essencialmente qualquer molécula de RNA que é desejável a ser expressa em um órgão de armazenamento de planta pode ser coexpressa com o supressor silenciador. A molécula de RNA pode influenciar uma característica agronômica, resistência a insetos, resistência a doenças, resistêncía a herbicidas, esterilidade, características de grãos e semelhantes. Os polipeptídeos codificados podem estar envolvidos no metabolismo de lipídeos, amido, carboidratos, nutrientes, etc., ou podem ser responsáveis pela síntese de proteínas, oeptídeos, lipídeos, ceras, amidos, açúcares, carboidratos, sabores, odores, toxinas, carotenoides, hormônios, polímeros, flavonoides, proteínas de armazenamento, ácidos fenólicos, alcaloides, ligninas, taninos, celulose, glicoproteínas, glicolipídeos, etc.
[439] Em um exemplo específico, as plantas produziram aumento dos níveis de enzimas para produção de lipídeos em plantas, como couves, colza ou girassol, algodão, linho, cártamo, soja ou milho. Biomassa de planta
[440] Um aumento no teor de lipídeo total de biomassa de planta equaciona para aumentar o teor de energia tornando seu uso na produção de biocombustível mais econômico.
[441] Biomassa de pIanta é o rnaterial orgânico produzido por plantas, como folhas, raízes, sementes e talos. Biomassa de planta é uma mistura complexa de materiais orgânicos, como carboidratos, gorduras e proteínas junto com pequenas quantidades de minerais como sódio, fósfor, cálcio e ferro. Os principais componentes de biomassa de planta são carboidratos (aproximadamente 75%, peso seco) e lignina (aproximadamente 25%), que podem variar com tipo de planta. Os carboidratos são principalmente fibras de celulose ou hemicelulose, que conferem resistência à estrutura da planta, e lignina, que mantérn as fibras juntas. Algumas plantas também armazenam amido (outro polímero de carboidrato) e gorduras como fontes de energia,
211,'375 principalmente em sementes e raízes (como milho, sojas, e batatas).
[442] Biomassa de planta tipicamente tem uma densidade de energia como um resultado de ambos sua forma física e teor de umidade. Isto o torna inconveniente e ineficiente para armazenamento e transporte, e também geralmente não apropriado para uso sem algum tipo de pré-processamento.
[443] Há uma faixa de processos disponíveis para converter este de uma forma mais conveniente incluindo: 1) pré- processamento físico (por exemplo, moagem) ou 2) conversão por processos térmicos (por exemplo, combustão, gasificação, pirólise) ou químicos (por exemplo, digestão anaeróbica, fermentação, compostagem, transesterificação). Desta forma, a biomassa é convertida no que pode ser descrito como um combustível de biomassa. Combustão [Ll44]A combustão é o processo pelo qual materiais inflamáveis são deixados queimar na presença de ar ou oxigênio com a liberação de calor. O processo básico é oxidação. Combustão é o método mais simples pelo qual a biomassa pode ser usada para energia, e foi usada para fornecer calor. Este calor pode por si só ser usado em um número de formas: 1) aquecimento de espaço, 2) aquecimento de água (ou outro fluido) para aquecimento central ou distrital ou calor de processo, 3) produção de yapor para geração de eletricidade ou força motriz. Quando material combustível inflamável é uma forma de biomassa a oxidação é de predominante o carbono (C) e hidrogênio (H) na - celulose, hemicelulose, lignina, e outras rnoléculas presentes para formar dióxido de carbono (CO2) e água (H2O). Gaseificação
[445]Gaseificação é um processo de oxidação parcial pelo qual uina fonte de carbono como biomassa de planta é quebrada em monóxido de carbono (CO) e hidrogênio (H2), mais dióxido de carbono (CO2) e possivelmente moléculas de hidrocarboneto como metano (CH4). Se a gasificação ocorre em uma temperatura relativamente baixa, como 700°C a 1OOO°C, o gás produto terá urri nível relativamente alto de hidrocarbonetos em comparação à gasificação em alta temperatura. Como resultado, pode ser usada diretamente, para ser queimado para geração de calor ou eletricidade através de uma turbina de vapor ou com limpeza de gás apropriado, para executar um motor de combustão interno para geração de eletricidade. A câmara de combustão para uma caldeira simples pode ser próxima acoplada com o gaseificador, ou o gás produtor pode ser limpo de hidrocarbonetos de cadeias maiores (alcatrões), transportado, armazenado e queimado rernotamente. Um sistema de gaseificação pode ser intimamente integrado com uma turbina de gás em ciclo combinada para geração de eletricidade (IGCC - ciclo combinado de gaseificação integrada). Gaseificação em temperatura maior (1200°C a 1600°C) Ieva à poucos hidrocarbonetos no gás produto, e uma maior proporção de CO e H2.
Isto é conhecido como gás de síntese (syngas ou biosyngas) uma vez que este pode ser usado para sintetizar hidrocarbonetos de cadeias maiores usando técnicas como síntese de Fischer-Tropsch (FT). Se a proporção de H2 para CO é correta (2:1) a síntese de FT pode ser usada para converter syngas em biocombustível dieses sintético de alta qualidade que é compatível com dieses fássil convencional e motores a diesel. Pirólise
[446] Como usado aqui, o termo "pirólise" signiíica um processo que usa aquecimento lento na ausência de oxigênio para produzir produtos gasosos, oleosos e carvão de biomassa.
Pirólise é uma conversão térmica ou termo-química de materiais baseados. em lipídeos, particularmente triglicerídeo. Os produtos de pirólise incluem gás, líquido e um carvão sólido com as proporções de cada um dependendo dos parâmetros do |processo.
Temperaturas inferiores (ao redor de 400°C) tendem a produzir mais carvão sólido (pirólise lenta), enquanto que de alguma forma temperaturas maiores (ao redor de 500°c) projuzem uma proporção muito maior de líquido (bio-óleo), desde qt!e o tempo de residência de vapor seja mantido em torno de ls jou menos. Após isto, as reações secundárias ocorrem e ayimentam o rendimento de gás. O bio-óleo produzir por pirólise rápida (temperatura maior) é um líquido marrom escuro móvel com um valor de aquecimento de metade do óleo combustível conGencional.
Este pode ser queimado diretamente, co-queimado, aprimorado a outros combustíveis ou gasificado.
[447]A pirólise envolve craqueamento térmico cjireto dos lipídeos ou uma combinação de craqueamento térmico e c,atalítico. Em temperaturas de cerca de 400-500°C, ocorre crajqueamento, produzido hidrocarbonetos de cadeia curta comoi alcanos, alquenos, alcadienos, aromaticos, olefinas e acido cairboxílico, bem como monóxido de carbono e dióxido de carbono. ) i
[448] Quatro tipos de catalisadores principaig i incluem
C catalisadores de metal de transição, catalisadores tiÈ)o peneira molecular, carbonato de alumina e sódio ativado (Mah?r et al., 2007). Exemplos são dados em US 4102938. Alumina (Al2O3) ativada por ácido é um catalisador eficaz (US 5233109). cataljsadores em g peneira molecular são porosos, estruturas altamente Çristalinas i que apresentam seletividade de tamanho, de modo que as) moléculas i de apenas determinados tamanhos podem passar por ejta. Estes incluem catalisadores zeolito como ZSM-5 ou HzsM-!j que são l materiais cristalinos compreendendo AlO4 e SiO4 ) e outros ( catalisadores sílica-alumina. A atividade e seletividàde destes catalisadores dependem da acidez, tamanho de poro e forma do poro, e tipicamente operam a 300-500°C. Catalisadores de rnetal de transição são descritos, por exemplo, em US 4992605. Catalisadores de carbonato de sódio foram usados na pirólise de óleos (Dandik and Aksoy, 1998). Transesterificação
[449]"Transesterificação" como usado aqui é a conversão de lipídeos, pri-ncipalmente triacilglicerois, em ésteres de metil de ácido graxo ou ésteres etílicos usando álcoois de cadeia curta como metanol ou etanol, na presença de um catalisador como alcalinos ou ácidos. Metanol é usado mais cornumente devido à baixo custo e disponibilidade. Os catalisadores podem ser catalisadores homogêneos, catalisadores heterogêneos ou catalisadores enzimáticos. Catalisadores homogêneos incluem sulfato férrico seguido por KOH. Catalisadores heterogêneos incluem CaO, K3PO4, e WO3/ZrO2. Catalisadores enzimáticos incluem Novozyme 435 Produzidos de Candida antarctica. Digestão a.naeróbica
[450] Digestão anaeróbica é o processo pelo qual a bactéria quebra o material orgânico na ausência de ar, gerando um biogás contendo metano. Os produtos deste processo são biogás {principalmente metano (CHJ e dióxido de cclrbono (CO2)), um resíduo sólido (fibra ou digestato) que é serjielhante, mas não idêntico, ao composto e um líquor líquido qub pode ser usado como um fertilizante. O metano pode ser queimacijo para geração de calor ou eletricidade. O resíduo sólido do prokesso de digestão anaeróbica pode ser usado como um condicidnador sólicio ou alternativamente pode ser queimado como urrj combustível ou gasificado.
[451] Digestão anaeróbica é tipicamentp realizada em material bi.ológico em uma pasta aquosa. No entjnto, há urr'. número crescente de digestores secos. A digestão r'aesofílica ocorre entre 20°C e 40°C e pode levar um mês ou dois jpara compíetar. A digestão termofílica ocorre de 50-65°C e é inafs rápida, mas as bactérias são mais sensíveis.
Fermentação
[452]OS processos de fermentação convelcionais para a produção de bioálcool fazem uso de compostos Je amido e açúcar de colheitas de planta. Bioálcool de segundj geração procede este com hidrÓlise ácida e/ou enzimática dÇ hemicelulose e celulose em sacarídeos fermentáveis para fÇzer uso de uma proporção maior de biomassa disponível. Mais dêtalhe é fornecido sob o título "Processos de fermentação pjara produção de lipídeo". Compostagem
[453]A compostagem é a decomposição aeróbica de matéria orgânica por micro-organismos. É tipicamente realizado em material relativamente seco além de uma pasta. Em vez disso, ou além disso, coletar o biogás inflamável emitido, a natureza exotérmica do processo de compostagem podem ser explorados e o calor produzido usado, geralmente usando uma bomba de calor. Produção de Lipídeos Apolares
[454]Técnicas que são rotineiramente praticadas na téc.nica podem ser usadas para extrair, processar, purificar e analisar os lipídeos apolares produzidos por células, organismos ou partes dos mesmos na presente invenção. Tais técnicas são descritas e explicadas durante toda a literatura em fontes como, Fereidoon Shahidi, Current Protocols in Food Analytical Chemistry, john Wiley & Sons, Inc. (2001) D1.1.1-D1.1.11, e Perez-Vich et al. (1998). Produção de Óleo de semente
[455]Normalmente, sementes de planta são cozidas, pressionadas, e/ou extraídas para produzir óleo de semente bruto, que é então desengomado, refinado, branqueado e desodorizado. Geralmente, as técnicas para esrnagar as sernentes são conhecídas na técnica. Por exemplo, óIeos de semente podem ser temperados, pulverizando-os com água para aumentar o teor de umidade, por exemplo, 8,5% e em flocos usando um rolo liso corn uma configuração de lacuna de 0,23 a 0,27 mm. Dependendo do tipo de semente, a água não pode ser adicionada antes de esmacjar.
Aplicação de calor desativa enzimas, facilita ainda mais a ruptura das células, aglutina as gotículas lipídicas e aglomera partículas de proteína, que facilitam o processo de extração.
[456] Em uma modalidade, a maioria do óleo de semente é liberada pela passagem através de uma prensa de rosca. Tortas expelidas da prensa de rosca são então extraídas com solventes, por exemplo, com o hexano, usando uma coluna de calor rastreado.
Alternativamente, óleo de semente bruto produzido pela operação de prensagem pode ser passado através de um tanque de sedimentação com um topo de drenagem do fio com fenda para remover os sólidos que são expressos com o óleo de semente durante a operação de prensagem. O óleo de semente clarificado pode ser passado através de uma placa e de um filtro de estrutura para remover quaisquer partículas sólidas finas restantes. Se desejado, o óleo de sernente recuperado do processo da extração pode ser combinado com o óleo de semente clarificado para produzir um óleo de semente bruto misturado.
[457] Uma vez que o solvente é retirado do óleo de semente bruto, as partes pressionadas e extraídas são combinadas e submetidas a processamento de procedimentos normais de lipídeos (isto é, degomagem, refino cáustico, branqueamento e desodorização).
[458] Em uma modalidade, o teor de óleo e/ou proteína da semente é analisado por espectroscopia de reflectância de infravermelho como descrito em Hom et al. (2007).
Degomagem
[459]Degomagem é uma etapa precoce no refino de óleos e sua finalidade principal é a remoção da maioria dos fosfolipídeos do óleo, que pode estar presente como aproximadamente 1-2% do lipídeo extraído total. Adição de -2% de água, tipicamente contendo ácido fosfórico, a 70-80°C ao óleo bruto resulta na separação da maior parte dos fosfolipídeo" acompanhados por metais traços e pigmentos. O material insolúvel que é removido é principalmente uma mistura de fosfolipídeos e triacilglicerois e é conhecido como lectina. Degomagem pode ser realizada pela adição de ácido fosfórico concentrado ao óleo de semente bruto para converter fosfatídeos não hidratados em forma hidratada e para quelar metais menores que estão presentes. A goma é separada do Óleo de semente por centrifugação. O óleo de semente pode ser refinado por adição de uma quantidade suficiente de uma solução de hidróxido de sódio para titular todos os ácidos
21'7/375 graxos e remover os sabões assim formados.
Refinamento alcalino
[460]Refinamento alcalino é um dos processos de refinamento para tratar óleo bruto, algumas vezes referenciado como neutralização. Este geralmente segue degomagem e procede o branqueamento. Após a degomagem, o óleo de semente pode ser tratado pela adição de uma quantidade suficiente de uma solução alcalina para titular todos os ácidos graxos e ácidos fosfÓricos e removendo os sabões assim formados. Materiais alcalinos apropriados incluem hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, carbonato de sódio, hidróxido de lítio, hidróxido de cálcio, carbonato de cálcio e hidróxido de amônio. Este processo é tipicamente realizado em temperatura ambiente e remove a fração de ácido graxo livre. Sabão é removido por centrifugação ou por extração em um solvente para o sabão, e o óleo neutralizado é lavado com água. Se requerido, qualquer excesso alcalino no óleo pode ser neutralizado com um ácido apropriado como ácido clorídrico ou ácido sulfúrico.
Branqueamento
[461]Branqueamento é um processo de refinamento em que óleos são aquecidos a 90-120°C por 10-30 minutos na presença de uma terra branqueadora (0,2-2,0%) e na ausência de oxigênio por operação com nitrogênio ou vapor em um vácuo. Esta etapa no processamento de óleo é destinada a remover pigmentos indesejados {carotenoides, clorofila, gossipol etc), e o processo remove produtos de oxidação, metais de traço, compostos de enxofre e traços de sabão.
Desodorização Desodorização é um tratamento de óleos e gorduras a uma temperatura alta (200-260°C) e baixa pressão (0,1-1 mm Hg). Esta é tipicamente obtida introduzindo vapor no óleo de semente a uma taxa de cerca de 0,1 ml/minuto/lOO ml de óleo de semente. A desodorização pode ser reali.zada aquecendo o óleo de semente a 260°C em vácuo e lentamente introduzindo vapor no óleo de semente a uma taxa de O,1ml/minuto/1OOml de óleo de semente. Após aproximadamente 30 minutos de borbulhamento, o óleo de semente é deixado esfriar sob vácuo. O óleo de semente é normalmente transferido para um recipiente de vidro e lavado com argônio antes de ser armazenado sob refrigeração. Se a quantidade de óleo de semente for limitada, o óleo de semente pode ser colocado sob vácuo, por exemplo, em um reator de Parr e ser aquecido a 260°C pelo mesmo período de ternpo da desodorização. Este tratamento melhora a cor do óleo de sernente e remove a maioria das substâncias voláteis ou compostos com odor incluindo qualquer ácido graxo rernanescente, monoacilglicerois e produtos de oxidação. Winterização
[462]Winterização é um processo eventualmente usado em produção comercial de óleos para a separação de óleos e gord.uras em frações de sólido (estearina) e líquido (oleina) oor cristalização em temperaturas sub-ambiente. Este foi aplicado originalmente para óleo de semente de algodão para produzir um produto isento de sólido. Este é tipicamente usado Dara reduzir o teor de ácido graxo saturado de óleos. Biomassa de plantas para a produção de lipídeos
[463]AS partes de plantas envolvidas na fotossíntese (por exemplo, hastes e folhas de plantas superiores e de plantas aquáticas como algas) podem também ser usadas para prciduzir os lipídeos. Independentemente do tipo de plan.ta, existem vários métodos para extrair lipídeos de biomassa verde. Uma maneira é a extração física, que frequentemente não usa a extração por solvente. É, uma maneira "tradicional" usando diversos tipos diferentes dê extração mecânica. Bagaço obtido por pressão é um tipo comum,, como são os métodos da extração da prensa de parafíuso e ça prensa ram. A quantidade cle. lipídeos ex.traídos usando estes métodos varia amplamente, dependendo do material vegetal e do) processo mecânico empregado. A extração mecç.nica é tipicaniente jrr'-enos eficiente do que a extração por sÔlvente !
descrita abaixo.
[464]Na extração por solvente, um solvente orgânico (por exemplo, hexano) está misturado com pelo menos a biomassa verde geneticamente modificada da planta, preferencialmente depois que a biomassa verde é secada e moída. Naturalmente, outras partes da planta além da biomassa verde (por exemplo, sementes que contenham lipídeos) podem ser moídas e misturadas também. O solvente dissolve os lipídeos na biomassa e semelhantes, cuja solução é então separada da biomassa pela ação mecânica (por exemplo, com os processos de prensagem acima). Esta etapa de separação também pode ser realizada por filtraçãQ (por exemplo, com uma prensa de filtro ou dispositivo sernelhante) ou centrifugação etc. O solvente orgânico pode então ser separado do lipídeo apolar (por exemplo, por destilação). Este segundo passo de separação produz lipídeos apolares a partir da planta e pode produzir um solvente reutilizável se empregar recuperação de vapor convencional.
[465] Se, por exemplo, tecido vegetativo como descrito aqui, não é usado imediatamente para extrair, e/ou processar, o lipídeo este é preferencialmente manipulado após a colheita para garantir que o conteúdo de lipídeo não reduz, OLl de modo que qualquer aumento no teor de lipídeo seja minimizado o máximo"' possível (ver, por exemplo, Christie, 1993). Em uma modalidade, o tecido vegetativo é congelado assim que possível após a colheita usando, por exemplo, gelo seco ou nitrogênio líquido. Em outra modalidade, o tecido vegetativo é armazenad.o em uma temperatura fria, por exemplo, -20°C ou -60°C em uma atmosfera de nitrogênio. Algas para a produção de lipídeos
[466]Algas podem produzir 10 a 100 vezes tanta massa quanto plantas terrestres em um ano. Alérn de ser um organismo prolífico, as altas são ainda capazes de produzir óleos e amidos que podem ser convertidos em biocombustíveis.
[467]AS algas específicas mais úteis para a produção de biocombustível são conhecidas como microalgas, consistem em tipos pequenos geralmente unicelulares. Estas algas podem crescer em quase todos os lugares. Com mais de 100.000 espécies conhecidas de diatomáceas (um tipo de alga), 40.000 espécies conhecidas de altas tipo plantas verdes, e números menores de outras espécies de algas, as algas crescerão rapidamente em quase qualquer ambiente, com quase qualqúer tipo de água. Especificamente, algas úteis podem ser crescidas em áreas marginais com água limitada ou qualidade fraca, como nas regiões áridas e praticamente vazias do Sudoeste Americano. Estas áreas ainda têm abundante luz solar para a fotossíntese. Erri resumo, as algas podem ser um organismo ideal para a produção de biocombustíveis - crescirnento eficaz, não precisamente de terra especial ou água, não competindo com culturas alimentares, necessitando de quantidades muito pequenas de terra do que culturas alimentares, e armazenando energia em uma forma desejável.
[468]As algas podem armazenar energia em sua estrutura celular na forma de óleo ou amido. Óleo armazenado pode ser tanto quanto 60% do peso da alga. Determinadas espécies que são altamente prolíficas em produção de óleo ou amido foram identificadas e condições de crescimento foram testadas. Processos para a extração e conversão destes materiais para combustíveis foram ainda desenvolvidos.
[469]AS altas de produção de óleo mais comuns podem geralmente incluir ou consistir em, diatomáceas (bacilariófitas), algas verdes (clorofíceas), alaa azul-verde (cianofitas), e alga dourada-marrom (crisófitas). Além disso, um quinto grupo conhecido como haptófitas pode ser usado. Os grupos incluem algas marrons e heterokonts. Exemplos específicos não limitantes de algas incluem as Classes: Chlorophyceae, Eustigmatophyceae, Prymnesiophyceae, Bacillariophyceae. Bacillariophytes capas de produzir óleo incluem os gêneros Amphipleura, Amphora, Chaetoceros, Cyclotella, Cymbella,
Fragilaria, Hantzschia, Navicula, Nitzschia, Phaeodactylum, e Thalassiosira. Exemplos específicos não limtaitens de clrófitas capazes de produzirem óleos incluem Ankistrodesmus, Botryococcus, Chlorella, Chlorococcum, Dunaliella, Monoraphidium, Oocystis, Scenedesmus, e Tetraselmis. Em um aspecto, as clorofíceas podem ser Chlorella ou Dunaliella. Exemplos não limitantes específicos de cianoficeas capazes de produzirem oelo incluem Oscillatoria e Synechococcus. Um exemplo específico de crisofíceas capazes de produzirem óleo inclui Boekelovia. Exemplos específicos não limitantes de haptofíceas incluem Iso-chysis e Pleurochysis.
[470]Algas específicas úteis na presente invenção incluem, por exemplo, Chlamydomonas sp. como Chlamydomonas reinhardtii, Dunaliella sp. como Dunaliella salina, Dunaliella tertiolecta, D. aciâophila, D. bardawil, D. bioculata, D. lateralis, D. maritima, D. minuta, D. parva, D. peircei, D. polymorpha, D. primolecta, D. pseudosalina, D. quartolecta. D. viridis, Haematococcus sp., Chlorella sp. como Chlorella vulgaris, Chlorella sorokiniana ou Chlorella protothecoides, Thraustochytrium sp., Schizochytrium sp., Volvox sp, Nannochloropsis sp., Botryococcus braunii que podem conter mais de 60% em peso de lipídeos, Phaeodactylum tricornutum, Thalassiosira pseudonana, Isochrysis sp., Pavlova sp., Chlorococcum sp, Ellipsoidion sp., Neochloris sp., Scenedesmus sp.
[471]Outras algas produtoras de óleo da presente invenção podem incluir uma combinação de uma quantidade eficaz de duas ou mais cepas para maximizar os benefícios de cada cepa. Como uma matéria prá'tica, pode ser difícil para obter 100% de pureza de uma cepa única de algas ou uma combinação de cepas de algas desejadas. No entanto, quando discutido aqui, as algas produtoras de óleo pretendem cobrir cepas introduzidas intencionalmente de algas, enquanto cepas estranhas são preferencialmente rninimizad.as e mantidas abaixo de uma quantidade que poderia afetar de modo prejudicial os rendimentos de algas produtoras de óleo desejadas e óleo de alga. Cepas de algas indesejáveis podem ser controladas e/ou MÁminadas usando qualquer número de técnicas. Por exemplo, controle cuidadoso do ambiente de crescimento pode reduzir a introdução de cepas estranhas. Alternativamente ou além de outras técnicas, um vírus seletivamente escolhido para especificamente objetivar apenas as cepas estranhas pode ser introduzido nos reservatórios de crescimento em uma quantidade que é eficaz para reduzir e/ou eliminar a cepa estranha. Um vírus apropriado pode ser prontamente identificado usando técnicas convencionais. Por exemplo, uma amostra da alga estranha irá mais frequentemente incluir pequenas quantidades de um vírus que objetiva a alga estranha. Este vírus pode ser isolado e crescido para produzir quantidades pequenas que poderia efetivamente controlar ou eliminar a população de alga estranha entre as algas produtoras de óleo mais desejáveis.
[472]Algacultura é uma forma de aquacultura envolvendo o cultivo de espécies de algas (incluindo microalgas, também conhecidas como fitoplâncton, micrófitas, ou algas planctônicas e macroalgas, comumente conhecidas como algas).
[473] Cultivo comercial e industrial de algas tem numerosos usos, incluindo a produção de ingredientes alimentares, alimentos e combustível de algas.
[474]As monoculturas ou culturas misturadas de alga podem ser cultivadas nas lagoas abertas (como um tipo canal adutor, lagoas e lagos) ou nos fotobiorretores. 0
[475]Algas podem ser colhidas usando micro telas, por centrifugação, por floculação (usando, por exernplo, o quitosano, o alúmen e cloreto férrico) e por flotação. Interromper o fornecimento de dióxido de carbono pode causar a floculação de algas por si só, o que é charnado de "autofloculaçµo". Na flotação, o cultivador aera a água em uma espuma, e, ern i3eguida, desliza a espuma de algas a partir do topo. Ultrassom tj outros métodos de colheita estão atualmente em desenvolvimento. {476] Lipídeos podem ser separados da alga por esmagamento mecâniço. Quando as algas são secas mantérn o seu teor de lipídeos, o qual pode então ser "prensado" para fora com uma prensa de óleo. Uma vez que diferentes cepas de algas variam muito em seus atributos físicos, configurações de diversas prensas (parafuso, bagaço de pistão, etc) funcionam melhor para alguns tipos de algas.
[477] Choque osmótico é por vezes utilizado para liberar os componentes celulares, como lipídeos a partir de algas. Choque osmótico é a redução brusca da pressão osmótica e pode causar as c.élulas em urr.a solução por ruptura. [478jExtração por ultrassom pode acelerar processos de extração, em particular os processos de extração enzimática empregados para extrair lipídeos de algas. Ondas ultrassônicas são usados para criar bolhas de cavitação no material solvente. Quando estas bolhas colapsam perto das pared?s das células, as ondas de choque resultantes e os jatos de líquido causam o rompimento das paredes das células e liberam os seus conteúdos em um solv'=nte.
[479] Solventes químicos (por exemplo, hexano, benzeno, éter de petróleo) são muitas vezes utilizados na extração de lipídeos de algas. Ezrtração Soxhlet pode ser usada para extrair os lipídeos de algas por meio de lavagem repetida, ou percolação, com um solvente orgânico sob refluxo, em vidraria especial.
[480] Extração enzimática pode ser usada para extrair os lipídeos de algas. Extração enzimática utiliza enzimas para degradar as paredes das células com a água atuando como solvente. A extração enzimática pode ser suportada por ultra- sonicação.
[481] CO2 supercrítico também pode ser usado como um solvente. Neste método, o CO2 é liquefeito sob pressão e aquecido até ao ponto que se torna supercrítico (que tera propriedades tanto de um .líquido quanto de um gás), deixando-o atuar como um solvente. Processos de fermentação para a produção de lipídeos
[482] Conforme usado aqui, o termo "processo de fermentação" refere-s'e a qualquer processo de fermentação, ou qualquer processo que compreende uma etapa de fermentação. Um processo de fermentação inclui, entre outros, os processos de fermentação utilizados para a produção de álcoois (por exemplo, etanol, butanol, metanol), ácidos orgânicos (por exemplo, ácido cítrico, ácido acético, ácido itacônico, ácido láctico, ácido glucônico), cetonas (por exemplo, acetona), aminoácidos (por exemplo, ácido glutâmico), gases {por exemplo, H2 e CÕ2), antibióticos (por exemplo, a penicilina e tetraciclina), enzimas, vitaminas (por exernplo, riboflavina, beta-caroteno), e hormônios. Processos de fermentação também incluem processos de fermentação utilizados na indústria do álcool de consumo (por exemplo, cerveja e vinho), indústria de laticínios (por exemplo, produtos lácteos fermentados), na indústria do couro e na indústria do tabaco. Os processos de fermentação preferenciais incluem os processos de fermentação do álcool, como são bem conhecidos na técnica. Os processos de fermentação preferenciais são os processos de fermentação anaeróbica, como são bem conhecidos na técnica.
Células adeq'-iadas para fermentação, tipicamente micro-organismos que são capazes de fermentar, ou seja, converter os açúcares como glicose ou maltose, direta ou indiretarnente, no produto de ferinentação desejado.
[483] Exemplos de micro-organismos incluem organismos fungos de fermentação como leveduras, preferencialmente um organismo oleaginoso. Conforme usado aqui, um "organismo oleaginoso" é um que se acumula pelo menos 25% do seu peso seco como triglicerídeos. Conforme usado aqui, "levedura" inclui Saccharomyces spp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlbergensis, Candida spp., Kluveromyces spp., Pichia spp., Hansenula spp., Trichoderma spp., Lipomyces Starkey, e Yarrowia lipolytica. Leveduras preferenciais incluem Yarrow-ia lipolytica ou outras leveduras oleaginosas e as cepas de Saccharomyces spp.
E, em particular, Saccharomyces cerevisiae.
[484] Ern uma modalidade, o micro-organismo de fermentação é um organismo transgênico que compreende um ou mais polinucleotídeos exógenos, em que o organismo transgênico tem um nível aumentado de um ou mais lipídeos apolares quando comparados a um organismo correspondente desprovido de um ou mais polinucleotídeos exógenos. O micro-organismo transgênico é preferencialmente cultivado em condições que otimizam a atividade dos genes de bicssíntese de ácidos graxos e de genes de aciltransferase de ácido graxo . Isto leva à produção de rnaior rendimento e a mais econômica de lipídeos. Em geral., as condições de meios que podem ser otimizadas incluem o tipo e a quantidade de fonte de carbono, o tipo e da quantidade de fonte de nitrogênio, a relação de carbono-nitrogênio, o nível de oxigênio, a temperatura de crescimento, o pH, a duração da fase de produção de biomassa, duração da fase de acumulação de lipídeos e o tempo da colheita de células.
[485]Meios para ferrnentação devem conter uma fonte de carbono adequada. As fontes de carbono podem incluir, entre outras: monossacarídeos (por exemplo, glucose, frutose), dissacarídeos (por exemplo, lactose, sacarose), oligossacarídeos, polissacarídeos (por exemplo, arnido, celulose ou misturas dos mesmos), álccois de açúcar (por exemplo, glicerol) ou misturas de matérias-primas renováveis (por exemplo, soro de queijo permeado, licor de milho, melaço de bete.rraba, cevada malte). Além disso, as fontes de carbono podem incluir os alcanos, ácidos graxos, ésteres de ácidos graxos, monoglicerídeos, diglicerídeos, triglicerídeos, fosfolipídeos e várias fontes comerciais de ácidos graxos, incluindo os óleos vegetais (por exemplo, Óleo de soja) e gorduras animais. Além disso, o substrato de carbono pode incluir um substrato de carbono (por exemplo, dióxido de carbono, metanol, formaldeído, formiato, aminas contendo carbono) para os quais a conversão metabólica ein intermediários bioquímicos chaves tem sido demonstrada. Deste modo, é contemplado que a fonte de carbono utilizada na presente invenção pode englobar uma grande variedade de substratos que contêm carbono e será apenas limitada pela escolha do microorganismo hospedeiro. Apesar de todos os substratos de carbono mencionados acima e suas misturas, são esperados como sendo adequados na presente invenção, os substratos de carbono preferenciais são os açúcares e/ou ácidos graxos. A mais preferencial é a glicose e/ou ácidos graxos contendo entre 10-22 carbonos. Nitrogênio pode ser fornecido a partir de uma fonte inorgânica (por exemplo, (NH4)2SO4) ou orgânica (por exemplo, ureia, glutamato). Além de carbono e fontes de nitrogênio adequado, os meios de fermentação podem também. conter minerais adequados, sais, cofatores, tampões, vitaminas e outros componentes conhecidos dos especialistas na técnica apropriada para o crescimento de micro- organismo e. promoção das vias enzimáticas necessárias para a produção de lipídeos.
[486]Uma faixa de pH adequada para a fermentação é, tipicamente, entre cerca de pH 4,0 a pH 8,0, onde o pH 5,5 a pH 7,0 é preferencial como intervalo para as condições iniciais de crescimento. A fermentação pode ser realizada em condições aeróbías ou anaeróbias, onde as condições microaeróbias são preferenciais.
[487] Tipicamente, a acumulação de níveis elevados de lipídeos nas células de micro-organismos oleaginosos requer um processo em duas fases, uma vez que o estado metabólico deve ser "balanceado" entre o crescirnento e a síntese/armazenamento de gorduras. Assim, mais preferencialmente, um processo de fermentação em duas fases é necessário para a produção de .lipídeos em micro-organismos. Nesta abordagem, a primeira fase da fermentação é dedicada à geração e acumulação de massa celular, e é caracterizada por um crescimer.to celular rápido e divisão celular. Na segun'da fase da fermentação, é preferencial a criação de condições de privação de nitrogênio na cultura para promover a altos níveis de acumulação lipídica. O efeito da privação de nitrogênio presente é o de reduzir a concentração eficaz de AMP nas células, reduzindo desse modo a atividade do isocitrato desidrogenase dependente de NAD de mitocôndrias. Quando isso ocorre, o ácido cítrico vai acumular-se, formando assim conjuntos abundantes de acetil-CoA no citoplasma e na síntese de ácidos graxos de condicionamento. Assim, esta fase é caracterizada pela cessação da divisão celular, seguida pela síntese de ácidos graxos e de acumulação de TAGS.
[488] Embora as células sejam tipicamente cultivadas a cerca de 30°C, alguns estudos demonstraram aumento da síntese de ácidos graxos insaturados a temperaturas mais ba.ixas. Com base na economia do processo, esta mudança de temperatura deve provavelmente ocorrer após a primeira fase da Íjermentação em duas fases, onde a maior parte do cresciinento do jnicroorganismo ocorreu.
[489] É contemplado que uma variedade de model js de processo de fermentação pode ser aplicada, onde a produçà l comercial de lipídeos utilizando os ácidos nucleicos instantâne js é desejada.
Por exemplo, a produção comercial de lipídeo a partir de um hospedeirci microbiano recombinante pode ser pro luzida por em batelada, batelada alimentada ou um processo ce fermentação contínua.
[490] Um processo de fermentação em batelada é um sistema fechado onde a composição do meio é definida no início do processo e não está sujeita a outras adiçõ 2s , além das necessárias para a manutenção do pH e níveis de ox igênio durante o processo. Assim, no início do processo de culfmra o meio é inoculado com o organismo desejado e o cresjcimento ou a atividade metabólica é permitida ocorrer sem I a adição de substratos adicionais (isto é, de carbono |e fontes de nitrogênio) ao meio. No processo em batelada ijls composições metabólitas e de biomassa do sistema mudam constadtemente até ao momento em que a cultura é terminada. Erri um processo descontínuo típico, as células moderadas por uma fase lag estática a uma fase de log elevado crescimento e finalmente at.é urna fase estacionária, onde a taxa de crescimento é diminuída ou interrompida. Deixada sem tratamento, as células na fase estacionária acabarão por morrer. Uma variação do processo de batelada padrão é o processo de batelada alimentada, onde o substrato é continuamente adicionado ao fermentador durante o curso do processo de fermentação. Um processo semicontínuo é igualmente apropriado na presente invenção. Processos de batelada limentada são úteis quando a repressão catabólica está apta a inibir o metabolismo das células ou onde é desejável ter quantidades limitadas de substrato nos meios a cada vez. A medição da concentração do substrato em sistemas de batelada alimentada s é difícil e, portanto, pode ser estimada com base nas alterações dos fatores mensuráveis como pH, oxigênio dissolvido e pressão parcial de gases residuais (por exemplo, CO2). Métodos de cultura por batelada e batelada alimentada são comuns e bem conhecidos na técnica e exemplos podem ser encontrados em Brock, em Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, ed 2.sup.nd, Sinauer Associates, Sunderland, Massachusetts, EUA, {1989), ou Deshpande {1992).
[491]A produção comercial de lipídeo usando as células instantâneas pode também ser obtida por um processo de ferrrleRtação contínua, onde um meio definido é continuamente adicionado a um biorreator, enquanto .a mesma quantidade de volume de cultura é removida, simultaneamente, para a recuperação do produto. Culturas contínuas geralmente mantem as células na fase log de crescimento a uma densidade celular constante. Métodos de cultura contínua ou semicontínua permitem a modulação de um fator ou de qualquer número de fatores que afetam o crescimento das células ou a concentração do produto final. Por exemplo, uma abordagem pode limitar a fonte de carbono e permitir que todos os outros parâmetros moderem o metabolismo. Em outros sistemas, um número de fatores que afetam o crescimento pode ser alterado continuamente enquanto que a concentração celular, rnedida pela 'turbidez do meio, é rnanti-da constante. Sistemas contínuos esforçam para manter o crescimento de estado estacionário e, portanto, a taxa de crescimento celular deve ser equilibrada com a perda de células devido ao material que está sendo retirado da cultura. Métodos de modulação de nutrientes e fatores de crescimento para os processos de cultura contínua, bem como técnicas para maximizar a taxa de formação de produto são bem conhecidos na técnica da microbiologia industrial e uma variedade de rr.étodos é detalhada por Brock, supra.
[492]Ácidos graxos, incluindo PUFAs, podem ser encontrados no micro-organismo hospedeiro como ácidos graxos livres ou em formas esterificadas como acilgliceróis, fosfolipídeos, sulfolipídeos ou glicolipídeos, e podem ser extraídos da célula hospedeira por intermédio de uma variedade de meios bem conhecidos na técnica.
[493] Em geral, os meios para a purificação dos ácidos graxos, incluindo PUFAs, podem incluir a extração com solventes orgânicos, sonicação, a extração com fluido supercrítico (por exemplo, utilizando-se dióxido de carbono), saponificação e meios físicos, como prensas, ou combinações dos mesmos. De interesse particular é a extração com metanol e clorofórmio, na presença de água (Bligh and Dyer, 1959). Quando desejável, a camada aquosa pode ser acidificada para protonar porções negativamente carregadas e, assim, aumentar a partição dos produtos desejados para a camada orgânica. Depois da extração, os solventes orgânicos podem ser removidos por evaporaçãc sob uma corrente de Nitrogênio. Quando isolados em formas conjugadas, os produtos podem ser enzimática ou quimicamente clivados para libertar o ácido graxo livre ou um conjugado menos complexo de interesse, e podem então ser sujeitos a manipulações adicionais para produzir um produto final desejado.
Desejavelinente, as formas conjugadas de ácidos graxos são clivadas com hidróxido de potássio.
[494] Se for necessária purificação adicional, os métodos padrão podem ' ser utilizados. Tais métodos podem incluir a extração, tratamento com ureia, cristalização fracionária, HPLC, destilação fracionada, cromatografia em g.el de sílica, centrifugação ou destilação de alta velocidade, ou combinações destas técnicas. Proteção dos grupos reativos como o ácido ou grupos alcenilo, pode ser feita em qualquer passo através de técnicas conhecidas (por exemplo, alquilação, iodação). Os métodos utilizados incluem a metilação dos ácidos graxos para produzir ésteres de metila. Do mesmo modo, os grupos proteteres pod.em ser removidos em qualquer passo. Desejavelmente, a purificaçãc de frações contendo GLA, STA, ARA, DHA e EPA pode ser realizada por tratamento com ureia e/ou destilação fracionada.
[495] Uín exemplo do uso de biomassa de planta para a produção de uma pasta de biomassa usando levedura é descrito em WO 201.1/100272.
Usos de Lipídeos |.496]OS lipídeos produzidos pelos métodos descritos têrn uma va.riedade de usos. Em algumas modalidades, os lipídeos são usados como óleos alimentares. Em outras modalidades, os lipídeos são refinados e usados como lubrificantes ou para outros usos industriais como a síntese de plásticos. Em algumas modalidades preferenciais, os lipídeos são refinados para produzir biodiesel. Biocombustível
[497]Como usado aqui o termo "bioconibustível" inclui biodiesel e bioálcool. Biodiesel pode ser preparado de óleos derivados de plantas, algas e fungos. Bioálcool é produzido a partir da fermentação de açúcar. Este açúcar pode ser extraído diretamente de plantas (por exemplo, cana de açúcar), derivado de amido de planta (por exemplo, milho ou trigo) ou feito de celulose (por exemplo, rr'.adeira, folhas ou caules).
[498] Biocombustíveis atualmente custam rriais para produzir do que os combustíveis de petróleo. Além dos custos de processamento, as culturas de biocombustível exigem plantio, fertilização, aplicação de pesticidas e herbicidas, colheita e transporte. As plantas, algas e fungos da presente invenção podem reduzir os custos de produção de biocombustível.
[499]Os métodos gerais para a produção de biocornbustível podem ser encontradas em, por exemplo, Maher e Bressler, 2007; Greenwell et al, 2010; Karmakar et al, 2010; Alonso et al, 2010; Lee e Mohamed, 2010; Liu et al, 201Oa; Gong e jiang, 2011; Endalew et al, 2011; Semwal et al., 2011. Bioálcool
[500]A produção de álcoois produzidos biologicamente, por exemplo, etanol, propanol e butanol é bem conhecida. Etanol é o bioálcool mais comum.
[501]As etapas básicas para a produção em larga escala de etanol são as seguintes: 1) fermentação rnicrobiana (por exemplo, levedura) dos açúcares, 2) destilação, 3) desidratação e, opcionalmente 4) desnaturação. Antes da fermentação, algumas culturas necessitam sacharificação ou hidrólise de carboidratos como celulose e amido em açúcares. Sacarificação de celulose é chamada celulólise. As enzimas podem ser utilizadas para converter o amido em açúcar.
Fermentação
[502]Bioálcool é produzido por fermentação microbiana do açúcar. Fermentação microbiana atualmente irá só trabalhar diretamente com açúcares. Dois importantes componentes das plantas, amido e celulose, são ambos compostos de açúcares, e podem, em princípio, ser convertidos em açúcares para a fermentação. Destilação
[503]Para o etanol ser utilizável como combustível, a maior parte da água deve ser removida. A maior parte da água é removida por destilação, mas a pureza é limitada a 95-96% devido à formação de um azeótropo de água-etanol de baixo ponto de ebulição com a máxima (95,6% m/m (96,5% V/v) de etanol e 4,4 % m/m (3,5°s v/v) de água). Esta mistura é chamada de etanol hidratado e pode ser usada como um combustível sozinho, mas ao contrário de etanol anidro, o etanol hidratado não é miscível em todas as proporções com a gasolina, de modo que a fração de água é tipicamente removida por tratamento adicional, a fim de queimar em combinação com gasolina em motores a gasolina.
Desidratação.
[504]A água pode ser removida a partir de uma mistura de etanol/água azeotrópica, por desidratação. A destilação azeotrópica, usado em muitas plantas etanólicos de combustível precoce, consiste na adição de benzeno ou ciclohexano à mistura. Quando estes componentes são adicionados à mistura, esta forma uma mistura azeotrópica heterogênea em equilíbrio de vapor- líquido-líquido que, quando destilado produz etano.L anidro na parte inferior da coluna, e uma mistura de vapor de água e ciclohexano/benzeno. Quando condensada, esta se torna uma mistura líquida de duas fases. Outro método precoce, chamado destilação extrativa, consiste na adição de um componente ternário que irá aumentar a volatilidade relativa do etanol. Quando a mistura ternária é destilada, esta irá produzir o etanol anidro no fluxo superior da coluna.
[505] Um terceiro método surgiu e foi adotado pela maioria das plantas etanólicos modernas. Este novo processo utiliza peneiras moleculares para remover a água do etanol combustível.
Neste processo, o etanol sob pressão de vapor passa através de um leito de contas de peneira molecular. Os poros do leito são dimensionados para permitir a absorção de água, excluindo etanol. Depois de um período de tempo, o leito é regenerado sob vácuo ou no fluxo de atmosfera inerte (por exemplo, N2) para remover a água absorvida. Dois leitos são muitas vezes utilizados de modo que uma está clisponível para absorver água,
enquanto o outro está sendo regenerado.
Biodiesel
[506]A produção de biodiesel, ou ésteres alquil, é bem conhecida. Há três rotas básicas para a produção de éster a partir de lipídeos: 1) Transesterificação por catálise básica de lipídeos com álcool; 2) Esterificação direta por catálise ácida de lipídeos com metanol; e 3) Conversão dos lipídeos a ácidos graxos e, em seguida, a ésteres alquil com catálise ácida.
[507]Qualquer método para preparar ésteres alquil de ácido graxo e ésteres gliceril (em que um, dois ou três dos grupos hidroxi em glicerol são eterificados) pode ser usado. Por exemplo, ácidos graxos podem ser preparados, por exemplo, por hidrolisação ou saponificação de triglicerídeos com catalisadores ácidos ou base, respectivamente, ou usando uma enzima como urr.a lipase ou uma esterase. Ésteres alquil de ácido graxo podem ser preparados reagindo um ácido graxo com um álcool na presença de um catalisador ácido. Ésteres de ácido graxo podem ser ainda preparados reagindo um triglicerídeo com um álcool na presença de um catalisador ácido ou base. Ésteres de glicerol podem ser preparados, por exemplo, reagindo glicerol com um haleto de alquil na presença de base, ou com uma olefina ou álcool na presença de um catalisador ácido.
[508] Em algumas modalidades preferenciais, os lipídeos são transesterificados para produzir ésteres metílicos e glicerol.
Em algumas modalidades preferenciais, os lipídeos reagem com um álcool {como o metanol ou o etanol) na presença de um catalisador (por exemplo, hidróxido de potássio ou sódio) para produzir ésteres metílicos. Os ésteres alquil podem ser usados para biodiesel ou misturados com combustíveis a base de petróleo.
[509] Os ésteres alquil podem ser diretarriente misturados com óleo diesel, ou lavados com água ou outras soluções aquosas para remover várias impurezas, incluindo os catalisadores, antes da mistura. É possível neutralizar os catalisadores de ácido com uma base. No entanto, este processo produz sal. Para evitar a corrosão do motor, é preferencial minimizar a concentração de sal na composição de aditivo de combustível. Os sais podem ser substancialmente removidos a partir da composição, por exemplo, por lavagem da composição com água.
[510] Em outra modalidade, a composição é seca depois de ser lavada, por exemplo, passando a composição através de um agente de secagem como sulfato de cálcio.
[511]Ainda em outra modalidade, um aditivo para combustível neutro é obtido sem a produção de sais de ou usando uma etapa de lavagem, usando um ácido polimérico, Como Dowex 50"", que é uma resina que contém grupos de ácido sulfônico. O catalisador é fa'cilmente removido por filtração após reações de esterificação e eterificação serem completas.
Triacilglicerois de planta como uma fonte de biocombustível
[512] Utilização da triacilglicerois de planta para a produção de biocombustível é revisto em Durrett et al. (2008).
Resuinidamente, óleos vegetais são compostos principalmente de vários triacilglicerois (TAG), moléculas que consistem em três cadeias de ácido graxo (geralmente 18 ou 16 carbonos de comprimento) esterificadas ao glicerol. As cadeias de axil graxos são quimicamente semelhantes para os hidrocarbonetos alifáticos que formam a maior parte das moléculas presentes na gasolina e no diesel. Os hidrocarbonetos em gasolina contêm entre 5 e 12 átomos de carbono por molécula, e este combustível volátil é misturado com o ar e inflamado com uma faísca em um motor convencional. Em contraste, os componentes combustíveis do diesel possuem tipicamente 10-15 átomos de carbono por molécula e são inflamados por muito alta compressão obtida em um motor diesel. No entanto, a maioria dos TAGS de plantas tem uma faixa de viscosidade que é muito mais elevada do que a do diesel convencional: 17,3-32,9 mnl2s"1, em comparação com 1,9-4,1 rrlm2s-1, respectivamente (ASTM D975; Knothe e Steidley, 2005). Esta maior viscosidade resulta em atomização fraca do corabustívei em motores diesel modernos, levando a problemas derivados da combustão incompleta como deposição de carbono e coqueificação (Ryan et al., 1984). Para superar este problema, TAGS são convertidos em ésteres de ácido graxo menos viscosos por esterificação com um álcool primário, geralmente metanol. O combustível resultante é geralmente referido como o biodiesel e tem uma faixa de viscosidade dinâmica de 1,9-6,0 rrlIn2s"1 (ASTM D6751). Os ésteres metílicos de ácido graxo (FAMES) encontrados em biodiesel têm uma densidade de energia elevada tal como refletida pelo seu elevad.o calor de conibustão, o que é semelhante, se não maior do que a do diesel convencional (Knothe, 2005). Da mesma forma, o número de cetano (uma medida de qualidade de ignição para motores diesel) das FAMEs encontrado no biodiesel excede o de diesel convencional (Knothe, 2005).
[513] Os óleos vegetais são principalmente compostos de cinco ácidos graxos comuns, nomeadamente palmitato (16:0), estearato (18:0), oleato (18:1), linoleato (18:2) e linolenato (18:3), embora, dependendo da espécie particular, ácidos graxos maiores ou menores também podem ser constituintes principais.
Estes ácidos graxos são diferentes uns dos outros em termos de comprimento de cadeia acil e número. de ligações duplas, que conduz às propriedades físicas diferentes. Consequentemente, as propriedades dos combustíveis derivados de biodiesel a partir de uma mistura de ácidos graxos são depender-tes de composição. Alterar o perfil de ácido graxo pode, portanto, melhorar as propriedades de combustível de biodiesel como características de fluxo em baixa temperatura, estabilidade oxidativa e as emissões de NOx. Alterar a composição de ácido graxo de TAGS pode reduzir a viscosidade dos óleos vegetais, eliminando a necessidade de mod.ificação quírnica, melhorando assim a relação custo-eficácia dos biocombustíveis.
[514]A maioria dos óleos vegetais são derivados de triacilglicerois armazenados em sementes. No entanto, a presente invenção proporciona também métodos para aumentar o teor de óleo nos tecidos vegetativos. Os tecidos de plantas da presente invenção possuem um maior rendimento total de lipídeos. Além disso, o nível de ácido oleico é aumentado significativamente enquanto o ácido graxo ácido poli-insaturado alfa-linolênico foi reduzida.
[515] Uma vez que uma folha é desenvolvida, ela passa por uma mudança no desenvolvimento de pia (absorção de nutrientes) para fonte (fornecer açúcares). Em culturas alimentares, a maioria dos açúcares são translocados das folhas de origem para apoiar o crescimento de novas folhas, raízes e frutos. Porque translocação de carboidrat.os é um processo ati-vo, há uma perda de carbeno e energia durante a translocação. Além disso, / depois de a semente em desenvolvimento absorver carbono a rjartir da planta, existem perdas adicionais de carbono e de energia associadas com a conversão de carboidratos para o óleo, proteína ou outros componentes principais da semente (Goffman et al., 2005). Plantas da presente invenção aumentam o conteúdo energético de folhas e/ou talos de modo que a planta inteira acima do solo possa ser colhida e utilizada para produzir biocombustível.
Algas como fonte biocoinbustível
[516]Algas armazenam óleo dentro do corpo celular,. às vezes, mas nem sempre em vesículas. Es'ce óleo pode ser recuperado de várias formas relativamente simpies, incluindo solventes, calor, e/ou pressão. No entanto, estes métodos geralmente recuperam apenas cerca de 80% a 90% do óleo armazenado. Processos que oferecem métodos de extração de óleo mais eficazes que podem recuperar cerca de 100% do óleo armazenado a baixo custo são conhecidos na técnica. Estes processos incluem ou consistem na despolimerização, como quebra biologicamente das paredes das algas e/ou vesículas de óleo de células, se presente, para liberar o óleo das algas produtoras de óleo.
[517]Além disso, existe um grande número de vírus que invadem e rompem as células de algas, e pode, assim, liberar o conteúdo da célula, em particular, amido ou óleo armazenado. Tais vírus são parte integrante do ecossistema das algas, e muitos dos vírus são específicos para um único tipo de algas. Os exemplos específicos de tais vírus incluem o vírus da chlorella PBCV-l (Paramecium Bursaria Chlorella Vírus), que é específico para determinadas algas Chlorella, e cianofagos como SM-l, P-60 e AS-l específico para as algas azuis-verdes Synechococcus. O vírus em particular selecionado irá depender da espécie particular de alga a ser utilizada no processo de crescirnento. Um aspecto da presente invenção é a utilização de um dito vírus para romper as algas, de modo que o óleo contido dentro da parede da célula de alga pode ser recuperado. Em outro aspecto detalhado da presente invenção, uma mistura de agentes biológicos pode ser usada para romper as paredes das células da alga e/ou vesículas de óleo.
[518] Esmagamento mecânico, por exemplo, uma prensageín ou uma etapa de recuperação do solvente hexano ou butano, extração com fluido supercrítico, ou como também pode ser útil para extrair o óleo das vesículas de óleo de algas produtoras de óleo. Alternativamente, as abordagens mecânicas podem ser usadas em combinação com agentes biológicos, a fim de melhorar a taxa de reação e/ou separação de materiais. Independentemente do agente biológico específico ou agentes escolhidos, estes podem pode ser introduzidos em quantidades que são suficientes para servir como o principal mecanismo pelo qual o óleo de algas é liberado a partir de vesículas de óleo nas algas produtoras de óleo, ou seja, não uma presença meramente incidental de qualquer destes.
[519] Uma vez que o óleo tenha sido liberado das algas este pode ser recuperado ou separado 16 de uma pasta de material de fragmentos de algas, por exemplo, resíduo celular, óleo, enzima, subprodutos, etc. Isto pode ser feito por sedimentação ou centrifugação, com centrifugação em geral, sendo mais rápida. Produção de amido pode seguir processos de separação semelhantes.
[520]Uma alimentação de algas pode ser formada a partir de uma fonte de alimentação de biomassa, assim corno uma fonte de alimentação de algas. A biomassa a partir de fontes terrestres ou de algas pode ser despolimerizada em uma variedade de maneiras, como, entre outras, sacarificação, hidrólise ou semelhantes. O material de origem pode ser quase qualquer celulose suficientemente volumosa, lignocelulose, polissacarídeo ou carboidrato, glicoproteína, ou outro material que forma a parede celular do material de fonte.
[521]A etapa de fermentação pode ser convencional na sua utilização de levedura para fermentar açúcar em álcool. O processo de fermentação produz dióxido de carbono, álcool, e cascas de algas. Todos estes produtos podem ser usados em outras partes do processo e sistemas da presente invenção, com substancialmente nenhum material não utilizado ou calor desperdiçado. Alternativamente, se o etanol é assim produzido, pode ser vendido como um produto ou usado para produzir acetato de etila para o processo de transesterificação. Considerações semelhantes se aplicam a outros álcoois além de etanol.
[522] Óleo de algas pode ser convertido em biodiesel por meio de um processo de hidrogenação direta ou transesterificação do óleo de algas. Óleo de algas é de uma forma semelhante como a maior parte dos óleos vegetais, que estão na forma de triglicerídeos. Um triglicerídeo composto por três cadeias de ácido graxo, um ligado a cada um dos três átomos de carbono em uma estrutural de glicercl. Esta forma de óleo pode ser queimada diretamente. No entanto, as propriedades do óleo nesta forma não são ideais para o uso em um motor diesel, e sem rriodificação, o niotor logo executará fracamente ou falhará. De acordo com a presente invenção, o triglicerídeo é convertido em biodiesel, que é semethante, mas superior ao combustível diesel de petróleo, em muitos aspectos.
[523] Um processo para a conversão do triglicerídeo para biodiesel é transesterificação, e inclui reagir o triglicerídeo com álcool ou outro receptor de acil para produzir ésteres de ácido graxo livre e glicerol. Os ácidos graxos livres são na forma de ésteres alquil de ácido graxo (FAAE).
[524] Com o processo químico, etapas adicionais são necessárias para separar o catalisador e limpar os ácidos graxos. Além disso, se o etanol é utilizado como receptor de acil, deve ser essencialmente seco, para evitar a produção de sabão através de saponificação no processo, e o glicerol deverá ser purificado. O processo biológico, por comparação, pode aceitar o etanol no estado seco e limpeza e purificação do biodiesel e glicerol são muito mais fáceis.
[525] Transesterificação, muitas vezes usa um álcool simples, tipicamente metanol derivado do petróleo. Quando metanol é utilizado o biodiesel resultante é chamado de éster metílico de ácido graxo (FAME) e maior parte de biodiesel vendido hoje, especialmente na Europa, é a FAME. No entanto, o etanol, também pode ser utilizado como o álcool em transesterificação, no caso em que o biodiesel é éster etílico de ácido graxo (FAEE). Nos EUA, os dois tipos geralmente não são distintos., e são conhecidos coletivamente como ésteres alquil de ácido graxo (FAAE), que como um termo genérico pode se aplicar independentemente do receptor de acil usado. Hidrogenação direta também pode ser utilizada para converter, pelo menos, uma porção do óleo de algas a um biodiesel. Como tal, em um aspecto, o produto de biodiesel pode incluir um alcano.
[526]0 triglicerídeo de algas também pode ser convertido em biodiesel por hidrogenação direta. Neste processo, os produtos são cadeias de alcanos, propano, e água. A estrutura de glicerol é hidrogenada para propano, de modo que não há substancialmente glicerol produzido como um subproduto. Além disso, nenhum álcool ou catalisadores de transesterificação são necessários. Toda a biomassa pode ser utilizada como alimentação para as algas produtoras de óleo com nenhuma necessidade para fermentação para a produção álcool para transesterificação. Os alcanos resultantes são hidrocarbonetos puros, sem oxigênio, de modo que o biodiesel produzido desta forma tem um teor de energia ligeiramente mais elevada do que os ésteres de alquil, se degrada mais lentamente, não atrai a água, e tem outras propriedades químicas desejáveis.
Rações
[527]A presente invenção inciui composições que podern ser usadas como rações. Para fins da presente invenção, "rações" incluem qualquer alimento ou preparação para consumo humano ou animal (incluindo para consumo enteral e/ou parenteral) que, quando administrados no corpo: (1) servem para nutrir ou construir tecidos ou fornecer energia, e/ou (2) mantém, restauram ou suportam o status nutritivo apropriado ou a função metabólica. As rações da invenção incluem composições nutricionais para bebês e/ou crianças pequenas.
[528]AS rações da invenção compreendem, por exemplo, uma célula da invenção, uma planta da invenção, uma parte da planta da invenção, uma semente da invenção, um extrato da invenção, o produto de um método da invenção, o produto de um processo de fermentação da invenção, ou uma composição junto c.cm um carreador apropriado. O termo "carreador" é usado em seu sentido mais amplo para abranger qualquer componente que pode, ou não, ter valor nutricional. Como a pessoa especialista na técnica apreciará, o carreador deve ser apropriado para ser usado (ou usado em uma concentração suficientemente baixa) em uma ração, tal que não tenha efeito nocivo em um organismo que consuma a ração.
[529]A ração da presente invenção cornpreende um lipídeo produzido diretamente ou indiretamente pelo uso dos métodos, células ou organismos revelados aqui. A composição pode ser na forma sólida ou líquida. Além disso, a composição pode incluir macronutrientes comestíveis, vitaminas e,/ou minerais em quantidades desejadas para um determinado uso. As quantidades destes ingredientes variam dependendo se a composição sé destina para uso com indivíduos normais ou para uso com indivíd(íos tendo necessidades especiais como indivíduos que sofrem de distúrbios metabólicos e semelhantes. , ln l
[530] Exemplos de carreadores apropri-ados co va or nutritivo incluem, entre outros, macronutrientes como gorduras comestíveis, carboidratos e proteínas. Exemplos de tais gorduras comestíveis incluem, entre outros, óleo de coco, óleo de borragem, óleo de fungo, óleo de groselha, óleo de soja e mono- e di-glicerídeos. Exemplos de tais carboidratos incluem, entre outros, glicose, lactose comestível, e amido hidroiisàdo. Além disso, exemplos de proteínas que podem ser utilizadas na composição nutritiva da invenção incluem, entre outras, proteínas de soja, soro eletrodialisado, leite desnatado eletrodialisado, soro do leite, ou os hidrolisados destas proteínas.
[531] Em relação a vitaminas e minerais, o seguinte pode ser adicionado nas composições das rações da presente invenção, cálcio, fósforo, potássio, sódio, cloreto, magnésio, manganês, ferro, cobre, zinco, selênio, iodo e vitaminas A, E, D, C e o complexo B. Outras vitaminas e minerais também podem ser adicionados.
[532]OS componentes utilizados nas composições dqs rações da presente invenção podem ser de origem semipurificado ou purificado. Por semipurificado ou purificado entende-se urn material que tenha sido preparado por purificação de um material natural ou por síntese de novo.
[533] Uma composição de ração da presente invenção também pode ser adicionada aos alimentos, mesmo quando a suplementação da dieta não é necessária. Por exemplo, a composição pode ser adicionada aos alimentos de qualquer tipo, incluincjo, entre outros, margarina, manteiga modificada, queijos, leite, iogurte,
chocolate, doces, lanches: óleos de salada, óleos para cozinhar, gorduras para cozinhar, carnes, peixes e bebidas.
[534] O gênero Saccharomyces spp é usado na fermentação de cerveja e do vinho e também como um agente de cozimento, especialmente pão. A levedura é o principal constituinte de extratos vegetais. A levedura é usada também como um aditivo na alimentação animal. Ficará aparente que cepas de leveduras geneticamente modificadas podem ser fornecidas, as quais estão adaptadas para sintetizar lipídeos conforme descrito aqui. Estas cepas de leveduras podem' ser usadas em rações alimentares e na produção de vinho e cerveja para fornecer produtos com uma melhora no conteúdo lipídico.
[535]Além disso, os lipídeos produzidos de acordo coin a presente invenção ou as células hospedeiras transformacías para conter e expressar os genes objetos, também podem ser utilizados como suplementos alimentares para animais para alterar a composição de ácidos graxos em tecido ou no leite de um animal, para uma mais desejável, para consumo humano ou animal. Exemplos de tais animais incluem ovelhas, gado, cavalos e similares.
[536]Além disso, as rações da invenção podem ser usadas em aquicultura para aumentar os níveis de ácidos graxos em peixes para consumo humano ou animal.
[537] Rações preferenciais da invenção são as pIantas, as sementes e outras partes de plantas, como folhas, frutos e hastes que podem ser usadas diretamente como alimento ou para alimentação de seres humanos ou outros aniinais. Por exemplo, os animais podem pastar diretamente em tais plantas crescidas no campo, ou ser alimentados com quantidades medidas em aiimentação controlada. A invenção inclui o uso de plantas e de partes da planta como a alimentação para aumentar os níveis de ácido graxos poli-insáturados em seres humanos e outros animais.
Composições
[538]A presente invenção tambérn abrange composições, particularmente composições farmacêuticas, que compreendem um ou mais lipídeos produzidos usando os métodos da invenção.
[539]A composição farmacêutica pode incluir um ou mais dos lipídeos, em combinação com um carreador padrão, conhecido, não tóxico, farmaceuticamente aceitável, adjuvante ou veículo como o tampão salino de fosfato, água, etanol, polióis, óleos vegetais, um agente umectante ou uma emulsão como uma emulsão de óleo/água. A composição pode ser na forma líquida ou sólida. Por exemplo, a composição pode estar na forma de um comprimido, cápsula, líquido ingerível, pó, pomada ou creme tópico. A fluidez apropriada pode ·ser mantida, por exemplo, mediante a manutenção do tamanho requerido de partícula no caso de uma dispersão e pelo uso de surfactantes. Tarnbém pode ser desejável incluir agentes isotônicas, por exemplo, açúcares, cloreto de sódio e semelhantes. Além desses diluentes inertes, a composição também pode incluir adjuvantes como agentes umectantes, emulsionantes e agentes de suspensão, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes e agentes odorizantes.
[540]AS suspensões, além dos cornpostos ativos, podem incluir agentes de suspensão como álcoois de isoestearato etoxilados, polioxietileno sorbitol e ésteres de sorbitano, celulose microcristalina, metahidróxido de alumínio, bentonita, ágar-ágar e tragacanto ou misturas destas substâncias.
[541] Formas de dosagem sólidas, como comprimidos e cápsulas, podem ser preparadas utilizando técnicas bem conhecidas na técnica. Por exemplo, lipídeos produzidos de acordo com a presente invenção podem ser comprimidos com bases de compressão convencionais, como lactose, sacarose e amido de milho ein combinação com ligantes como acácia, amido de milho ou gelatina, agentes desintegrantes como amido de batata ou ácido algínico e um lubrificante como ácido esteárico ou estearato de magnésio. As cápsulas podem ser preparadas, incorporando estes excipientes em uma cápsula de gelatina junto com arjtioxidantes e os lipídeos relevantes.
[542] Para a administração intravenosa, ios lipídeos produzidos de acordo corn a presente invenção ou seus derivados podem ser incorporados em formulações comerciais.
[543] Uma dosagem típica de um determinado ácido graxo está entre 0,1 mg a 20 g, tomado de uma a cinco vezes por dia (até 100 g diários) e é preferencialmente na faixa de cerca de 10 mg a cerca de 1, 2, 5, ou 10 g diárias (tomadas em uma ou múltiplas doses). Como conhecido na técnica, um mínimo de 300 mg/dia de ácidos graxos, especialmente ácidos graxos ooli-insaturados, é desejável. No entanto, será apreciado que qualquer quantidade de ácido graxo será benéfica para o sujeito.
[544] possíveis vias de administração das composições farmacêuticas da presente invenção incluem, por exemplo, a enteral e a parenteral. Por exemplo, uma preparação líquida pode ser administrada por via oral. Além disso, uma mistura homogênea pode ser completamente dispersa em água, em condições estéreis com diluentes fisiológicos aceitávei.s, conservantes, tampões ou propelentes para formar um spray ou inalador.
[545]A dosagem da composição a ser administ-rada ao sujeito pode ser determinada por um especialista na técnica e depend.e de vários fatore-s como peso, idade, saúde geral., históri-a passada, estado imune, etc., do sujeito.
[546jAlém disso, as composições da presente invenção podem ser utilizadas para fins cosméticos. As con?posições podem ser adicionadas a composições cosméticas pré-·existentes, de forma que uma mistura é formada, ou um ácido graxo produzido de acordo com a invenção pode ser usado como o único ingrediente "ativo" em uma composição cosmética.
Polipeptídeos
[547] Os termos "polipeptídeo" e "proteína" são geralmente usados de forma intercambiável.
[548] Um polipeptídeo ou classe de polipeptídeos pode se definir pela extensão da identidade (% de identidade), da sua sequência de aminoácidos com uma sequência' de aminoácidos de referência, ou por ter uma maior °5 de identidade a uma sequência de aminoácidos de referência do que a outra. A % de identidade de um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos de referência normalmente" é deterrr.inada pela análise GAP (Needleman e Wunsch, 1970; Programa GCG) com parâmetros de uma penalidade de criação gap = 5 e uma penalidade de extensão gap = 0,3. A sequência de consulta é pelo menos 100 aminoácidos de comprimento e a análise GAP alinha as duas sequências em uma região de pelo menos 100 aminoácidos. Ainda rnais, preferencialmente, a sequência de consulta é pelo menos 250 aminoácidos de comprimento e a análise GAP alinha as duas sequências em uma região de pelo menos 250 aminoácidos. Ainda mais, preferencialmente, a análise GAP alinha duas sequências ao iongo de toda a sua extensão. O polipeptídeo ou classe de polipeptídeos pode ter a mesma atividade enzimática, ou uma atividade diferente, ou falta de atividade, do polipeptídeo de referência. Preferencialmente, o polipeptídeo tem uma atividade enzimática de pelo menos 10% da atividade do polipeptídeo de referência.
[549] Conforme usado aqui um "fragmento biologicamente ativo" é uma parte de um polipeptídeo da invenção que mantém uma atividade definida de um polipeptídeo completo de referência, por exemplo, atividade MGAT. Fragmentos biologicamente ativos, conforme usado aqui excluem o polipeptídeo cornPieto. Fragme.ntos biologicamentí" ativos mdem ser partes de qualquer tamanho, enquanto mantêm a- atividade definida. Preferencialmente, o fragmento biologicamente ativo mantém pelo menos 10% da atividade do polipeptídeo completo.
[550] Em relação a um determinado polipeptídeo ou enzima, será apreciado que % de identidade calculados superiores aos fornecidos aqui abrangerão modalidades preferenciais. Assim, onde aplicável, à luz dos °5 de identidade mínimos calculados, prefere-se que o polipeptídeo/enzima compreenda uma sequência de aminoácidos que seja pelo inenos 60%, preferencialmente pelo menos 65°s, preferencialmente pelo menos 70%, preferencialmente pelo menos 75%, preferencialmente pelo menos 80%, preferencialmente pelo menos 85%, preferencialmente pelo menos 90%, preferencialmente pelo menos 91%, preferencialmente pelo menos 92%, preferencialmente pelo menos 93%, preferencialmente pelo menos 94%, preferencialmente pelo menos 95%, preferencialmente pelo menos 96%, preferencialmente pelo menos 97%, preferencialmente pelo menos 98%, preferencialmente pelo menos 99%, preferencialmente pelo menos 99,1%, preferencialmente pelo menos 99,2%, preferencialmente pelo menos 99,3%, pelo menos 99,4%, preferencialmente pelo raenos 99,5%, preferenci-alrnente pelo menos 99,6%, preferencialmente pelo menos 99,7%, preferencialmente pelo menos 99,8%, e preferencialmente pelo menos 99,9% idêntica à SEQ ID NO nomeada relevante.
[551]Mutantes de sequência de aminoácidos de polipeptídeos definidos aqui podem ser preparados introduzindo alterações de nucleotídeos apropriadas em um ácido nucleico definido aqui, ou por síntese in vitro do polipeptídeo desejado. Tais mutantes incluem, por exemplo, deleções, inserções ou substituições de resíduos dentro da sequência de aminoácidos. Uma combinação de deleções, inserções e substituições pode ser feita para chegar à construção final., desde que o produto final do polipeptídeo possua as características desejadas.
[552] Polipeptídeos de mutantes (alterados) podem ser preparados usando qualquer técnica conhecida na técnica, por exemplo, usando evolução dirigida ou estratégias de desenho racional (veja abaixo). Produtos derivados de DNA mutado/alterado podem facilmente ser selecionados usando técnicas descritas aqui para deterrninar se eles possuem atividade aciltransferase de ácido graxo, por exemplo, atividade MGAT, DGAT ou GPAT/fosfatase.
[553]NO desenho de mutantes de sequências de aminoácidos, a posição do sítio de mutação e a natureza da mutação dependerão das características a serem modificadas. Os sítios de mutação podem ser modificados individualmente ou em série, por exemplo,
(1) substituindo primeiro com escolhas de aminoácidos conservados e depois com seleções mais radicais, dependendo dos resultados obtidos, (2) deletando o resíduo alvo, ou (3) inserindo outros resíduos adjacentes ao sitio localizado.
[554] Deleções de sequência de aminoácidos geralrnente variam de cerca de 1 a 15 resíduos, mais preferencialmente cerca de 1 a resíduos e normalmente cerca de 1 a 5 resíduos contíguos.
[555]Mutantes de substituição têm pelo menos um resíduo de aminoácido no polipeptídeo removido e um resíduo diferente inserido em seu lugar. Os sítios de maior interesse para a mutagênese de substituição incluem sítios identi"icados como os sítios ativos. Outros sítios de interesse são aqueles em que determinados resíduos obtidos de várias cepas ou espécies são idênticos. Estas posições podem ser importantes para a atividade biológica. Estes sítios, especialmente aqueles que estão uma sequência de pelo menos outros três idênticos conservados, preferencialmente são substituídos de uma forma relativamente conservadora. Tais substituições conservadoras são mostradas na Tabela 1 sob o título de "substituições exemplares".
[556] Em uma modalidade preferencial um polipeptídeo mutante/variante tem apenas, ou não mais que, um ou dois ou três ou quatro mudanças de aminoácidos conservados quando comparado com um polipeptídeo natural. Detalhes das mudanças de aminoácidos conservados são fornecidos na Tabela 1. Como a pessoa especialista estaria consciente, essas pequenas alterações razoavelmente podem ser previstas não para alterar a atividade do polipeptídeo quando expresso em uma célula recombinante.
Tabela 1 Substituiçõe" exe.nplares .
I Resíduo Su bstitu ições I original Exempfares 4 Ala (A) l val; leu: ik: &1y ! Arg (R) } 's Asn(N:) lm his ksEg?L___ *]l! pCys ("C) . l ser ' !G|n{'Q') J_m: his Glu {E) l G|y(C;) , | puü, ala íHi-q (H) ! asn: ;;M F llc (I) . ..._ .. ku; \«,],:,#,l.& l Leu (L") ile: val; ma: ak; j!he |Lys(K) ^r2 LMct (M,) l·eu: £h,e ! Phc ('F) !"u: r"ai; ala LEro (P) i t:'lv ! Ser(S) I thr | ThMT) ser kT(w) m . +,. kr !TyT(Y) . . jtrp:phc l Va! ("V) I ik': lcu: mct: phc. tt1a Evolução dirigida
[557]Na evolução dirigida, a mutagênese aleatória é aplicada a, uma proteína e um regime de seleção é usado para escolher as variantes que poss'uem as qualidades desejadas, por exemplo, atividade aci.ltransferase de ácido graxo aumentada. Novas rodadas de mutação e' seleção são então aplicadas. Uma estratégia de evolução dirigida típica envolve três etapas: 1) Diversificação: O gene que codifica a proteína de interesse é mutado e/ou recombinado aleatoriamente para criar uma gránde biblioteca de variantes do "gene. As bibliotecas de variantes do gene podem ser construídas com o PCR erro-prone (veja, por exemplo, Leung, 1989; Cadwell e joyce, 1992), a partir dos grupos de fragmentos digeridos por DNasel·preparados de moldes parentais (Stemmer, 1994a; Stemmer, 1994b; Crarneri et al., 1998; Coco et al., 2001) de oligonucleotídeos degenerados {Ness et al., 2002, Coco, 2002) ou de misturas de am.bos, ou ainda de moldes parentais não digeridos (Zhao et al.., 1998; Eggert et al., 2005; jezéquek et al., 2008) e são montados geralmente por PCR.
As bibliotecas também podem ser feitas de sequências parentais recombinadas in vivo ou in vitro por recombinação homóloga ou não homóloga (Ostermeier et al., 1999; Volkov et al., 1999; Sieber et al., 2001). As bibliotecas de variantes de genes tambérn podem ser construídas por subclonagem de um gene de interesse em um vetor apropriado, transformando o vetor em uma cepa "modifi.cadcra" como E. coli XL-l vermelha (Stratagene) e propagando as bactérias transformadas por um número apropriado de gerações.
As bibliotecas de variantes de genes também podem ser construídas submetendo o gene de interesse ao embaralhamento de DNA {ou seja, recombinação homóloga in vitro de grupos de genes mutantes selecionadas por fragmentação aleatória e remontagem), tão amplamente descrito por Harayama (1998). 2) Seleção: A biblioteca é testada para a presença de mutantes (variantes) que possuam a propriedade desejada usando uma triagem ou seleção.
As triagens permitem a identificação e isolamento de mutantes de alto rendimento à mão, enquanto as seleções automaticamente eliminam todas as mutantes não funcionais.
Urría triagem pode envolver a triagem para a presença de motivos conhecidos de aminoácidos conservados.
Como alternativa ou, além disso, uma triagem pode envolver a expressão do polinucleotídeo mutado em um organismo hospedeiro ou parte dele e a análise do nível de atividade aciltransferase de ácido graxo por, por exemplo, quantificação do nível de produto resultante nos lipídeos extraídos do organismo ou parte dele e determinação do nível de produto nos lipídeos extraídos do organismo ou parte dele em relação a um organismo correspondente ou parte dele deficiente no polinucleotídeo mutado e, opcionalmente, a expressão do polinucleotídeo parental (não mutado). Alternativamente, a triagem pode envolver a alimentação do organismo ou parte dele com substrato marcado e a determinação do nível de substrato ou do produto em um organismo ou parte dele em relação a um organismo correspondente ou parte dele deficiente no polinucleotídeo rnutado e, opcionalmente, a expressão do polinucleotídeo parental (não mutado). 3) Amplificação: As variantes identificadas na seleção ou triagem são replicadas várias vezes, permitindo aos pesquisadores de sequenciar seu DNA a firn de compreender quais rnutações ocorreram.
[558]juntas, estas três etapas são chamadas de uma "rodada" de evolução dirigida. A maioria dos experimentos envolverá mais de urna rodada. Nestes experimentos, os "vencedores" da rodada anterior são diversificados na próxima rodada para criar uma nova hiblioteca. No final do experimento, todas as proteínas evoluídas ou as rnutantes de polinucleotídeos são caracterizadas usando métodos bioquímicos. Desenho racional
[559] Uma proteína pode ser desenhada racionalmente, com base nas informações conhecidas sobre a estrutura e plegamento da proteína. Isso pode ser feito por desenho partindo do zero (desenho de novo) ou por redesenho baseado em estruturas nativas (ver, por exernplo, Hellinga, 1997; e Lu e Berry, Protein Sturcture Design and Engineering, Handbook of Proteins 2, 1153- 1157 (2007)). O desenho de proteína normalmente envolve a identificação das sequências que se enovelam em uma estrutura determinada ou alvo e pode ser feita usando modelos computacionais. Algoritmos de desenho computacional de proteína buscam o espaço da conformação da sequência para sequências que são de baixa energia quando enoveladas na estrutura alvo. Os algoritmos de desenho computacional de proteína usam modelos de energética de proteína para avaliar como mutações afetariam a estrutura e a função de uma proteína. Essas funções de energia normalmente incluem uma combinação de mecânica rnolecular, estatística (ou seja, baseada no conhecimento) e outros termos empíricos. Um programa apropriado disponível inclui IPRO
(Redesenho e Otimização de Proteina Interativo), EGAD (Um Algoritmo Genético para o Desenho de Proteína), Rosetta Design, Sharpen e Abalone.
[560] Também incluídos no escopo da invenção são polipeptídeos definidos aqui que são diferencialmente modificados durante ou após a síntese, por exemplo, por biotinilação, benzilação, glicosilação, acetilação, fosforilação, amidação, derivatização por grupos conhecidos de proteção/bloqueio, clivagem proteolítica, ligação a uma molécula de anticorpo ou outro ligante celular, etc. Essas modificações pod.em servir para aumentar a estabilidade ou a bioatividade do polipeptídeo da invenção. Identificação de Aciltransferases de Ácido Graxo
[561] Em um aspecto, a invenção fornece um método para identificar uma molécula de ácido nucleico codificante para uma aciltransferase de ácido graxo tendo uma maior capacidade de produzir MAG, DAG e/ou TAG em uma célula.
[562]0 método compreende a obtenção de uma célula que contem uma molécula de ácido nucleico codificante para uma aciltransferase operativamente ligada a um promotor que está ativo na célula. A molécula de ácido nucleico pode codificar uma aciltransferase natural como MGAT, GPAT e/ou DGAT ou um mutante(s) deles. Mutantes podem ser desenhados usando procedimentos padrões da técnica (veja acima), como, por meio de mutagênese aleatória, mutagênese direcionada ou mutagênese de saturação em genes de interesse conhecidos, ou submetendo diferentes genes ao embaralharnento DNA. Por exemplo, um polinucleotídeo que compreende uma seqüência selecionada de alguma das SEQ ID NOS: 1 a 44 que codificam para uma MGAT pode ser mutado e/ou recombinado aleatoriamente para criar uma biblioteca grande de variantes do gene (mutantes) usando por exemplo, PCR error-prone e/ou embaralhamento de DNA. Mutantes podem ser selecionadas para mais investigação com base em que elas compreendem um motivo conservado de aminoácidos. Por exernplo, no caso de um ácido nucleico candidato que codifica para uma MGAT, uma pessoa especializada pode determinar se compreende uma sequência nas SEQ ID NOs: 220, 221, 222, 223 e/ou 224 antes de testar se o ácido nucleico codifica para uma mutante de MGAT funcional (por transfecção por exeínplo, em uma célula hospedeira, como uma célula de planta e analisar para a atividade de aciltransferase de ácido graxo (ou seja, atividade MGAT conforme descrito aqui).
[563] Sequenciamento por PCR direto do ácido nucleico ou de um fragmento dele pode ser usado para determinar a sequência exata de nucleotídeos e deduzir a sequência correspondente de aminoáçidos e assim identificar as sequências de aminoácidos conservadas. Os iniciadores degenerados com base nas sequências de aminoácidos conservadas podem ser usados para direcionar a amplificação por PCR. Os iniciadores degenerados podem também ser usados corrio sondas em ensaios de hibridização de DNA. Como alternativa, as sequências de aminoácidos conservadas podem ser detectadas em ensaios de hibridização de proteína que utilizam por exemplo, um anticorpo que se liga especificamente às sequências de aminoácidos conservadas, ou a um substrato que se liga especificamente às sequências de aminoácidos conservadas como, por exemplo, um lipídeo que se liga a FLXLXXXN (um domínio neutral putativo de ligação a lipídeo; SEQ ID NO:224).
[564] Em uma modalidade, a molécula de ácido nucleico é composta por uma sequência de nucleotídeos que codifica para uma MGAT. A sequêricia de nucleotídeos pode i) compreender uma . sequência selecionada de qualquer uma das SEQ ID NOS: l a 44, ii) codificar um polipeptídeo composto de aminoácidos, tendo uma sequência, conforme em qualquer uma das SEQ ID NOS: 45 a 82, ou um fragmento biologicamente ativo do mesmo, iii) ser pelo menos 50% idêntica ao i) ou ii), ou iv) hibridizar a qualquer um de i) até iii) sob condições rigorosas. Em outra modalidade ou adicional., a molécula de ácido nucleico é composta por uma sequência de nucleotídeos que codifica para uma ou mais sequências conservadas de aminoácidos DGAT2 e/ou MGAT 1/2 nas SEQ ID NOS: 220, 221, 222, 223 e 224. Em uma modalidade preferencial., a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência dc" nucleotídeos que codifica para as sequências de aminoácidos conservadas previstas nas SEQ ID NO:220 e/ou SEQ ID NO:224.
[565] Em outra modalidade, a molécula de ácido nucleico é composta por uma sequência de nucleotídeos que codifica para uma GPAT, preferencialmente uma GPAT que tem atividade fosfatase. A sequência de nucleotídeos pode i) compreender urría sequência selecionada de qualquer uma da SEQ ID NOS: 84 a 141, ii) codificar um polipeptídeo composto de aminoácidos que tem uma sequência corno em qualquer uma das SEQ ID NOS: 144 a 201, ou um fragmento biologicamente ativo dele, iii) ser pelo menos 50% idêntica a i) ou ii), ou iv) hibridizar a qualquer uma de i) a iii) sob condições estritas. Em outra modali.dade ou adicional., a molécula de ácido n'iicleico é composta por uma sequência de nucleotídeos que codifica para uma ou mais sequências conservadas de aminoácidos GPAT como nas SEQ ID NOS: 225, 226 e 227, ou uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 50%, preferencialmente pelo menos 60%, preferencialmente pelo menos 65% idêntica a elas.
[566] Em outra modalidade, a molécula de ácido nucleico é composta por uma sequência de nucleotídeos que codifica para uma DGAT2. A sequência de nucleotídeos pode i) compreender uma sequência de nucleotídeos selecionada de qualquer uma das SEQ ID NO:204 a 211, ii) codificar um polipeptídec composto de aminoácidos, tendo uma sequência, conforn'.e em qualquer uma das SEQ ID NO:212 a 219, ou um fragmento biologicamente ativo dele, iii) ser pelo menos 50% idêntica ao i) ou ii), ou iv) hibridizar a qualquer um de i) a iii) sob condições rigorosas. Em uma modalidade preferencial., a DGAT2 é composta por uma seqvência de nucleotídeos da SEQ ID NO:204 e/ou uma sequência de nucleotídeos que codifica para um polipeptídeo composto de aminoácidos, tendo uma sequência em SEQ ID NO:212.
[567] Uma célula composta por uma molécula de ácido nucleico que codifica para uma aciltransferase de ácido graxo operativamente ligada a um promotor que é ativo na célula pode ser obtida usando procedimentos padrões na técnica como por introdução da molécula de ácido nucléico em uma célula por, por exemplo, precipitação com fosfato de cálcio, tratamento com polietilenoglicol, eletroporação, e combinações destes tratamentos. Outros métodos de transformação de células também podem ser usados e incluem, entre outros, a introdução de DNA em plantas por transferência direta ou injeção do dna. As células de plantas transformadas podem também ser obtidas utilizando métodos de transferência e aceleração mediados por Agrobacterium conforme descrito aqui.
[568] O método ainda compreende a determinação de se o nível de MAG, DAG e/ou TAG produzido na célula se incrementou quando comparada a uma célula correspondente deficiente no ácido nucleico usando técnicas conhecidas na técnica como aquelas exemplificadas no Exemplo 1. Por exemplo, os lipídeos podem ser extraídos em uma solução de clorofórmio/metanol, secades e separados por cromatografia de camada fina (TLC). Identidades de tag DAG, MAG, ácidos graxos livres e outros lipídeos podem ser verificadas com padrões de lipídeos internos após coloração com vapor de iodo. Os cromatogramas resultantes podem ser analisados usando uma Phosphorlmager e a quantidade de MAG, DAG e TAG medidas em função da quantidade conhecida de padrões internos, ou alternativamente, as células podem ser alimentadas com sn-2 monooleoilglicerol [14C] ou [14C]-glicerol-3-fosfato e a radioatividade associada quantificada por contador de cintilação líquida (isto é, a quantidade de MAG, DAG e TAG marcada é inedida).
[569] O método ainda compreende a identificação de uma molécula de ácido nucleico codificante para uma aciltransferase de ácido graxo tendo uma inaior capacidade de produzir MAG, DAG e/ou TAG em uma célula. Em uma modalidade preferencial., a aciltransferase catalisa uma reação de enzimática na via MGAT. Ainda em uma modalidade preferencial., o DAG é aumentado através da via da mgat (ou seja, a acilação de MAG com acil graxo -COA é catalisada por uma MGAT para formar DAG). Em outra modalidade ou adicional., o substrato MAG é produzido por uma GPAT que também tem atividade de fosfatase e/ou o DAG é acilado com o acil graxo-CoA por uma DGAT e/ou uma MGAT com atividade DGAT para formar TAG. Brilho
[570]Alguns aspectos da invenção referem-se à medição de brilho do material vegetativo, como um marcador para o nível de lipídeos no material, com níveis mais elevados de brilho sendo associados com níveis mais elevados de lipídeos.
[571]0 brilho do material vegetativo pode ser deterrninado utilizando processos conhecidos. Medidor de brilho (refletômetros) fornecem uma forma quantificável de medir a intensidade de brilho garantindo a consistência da medição, definindo a iluminação precisa e condições de visualização. A configuração de ambos fonte de iluminação e ângulos de recepção de observação permite a medição durante um pequeno intervalo do ângulo de reflexão geral. Os resultados da medição de um medidor de brilho estão relacionados com a quantidade de Iuz refletida a partir de um padrão de vidro preto com um índice de refração definido. A proporção de luz refletida para incidente para o espécime, em comparação com a proporção para o padrão de brilho, é registrada como unidades de brilho.
[572]A escala de medição, Unidades de Brilho (GU), de um medidor de brilho é um escalonamento baseado em um padrão de referência de vidro preto altamente polido com um índice de refração definido tendo uma refletância especular de IOOGU no ângulo especificado. Este padrão é utilizado para estabelecer um ponto de calibração superior de 100 com o ponto de extremidade inferior estabelecido em 0 sobre uma superfície perfeitamente mate. Este escalonamento é adequado para a maioria dos materiais não metálicos.
[573] O nível ideal ou esperado de brilho de material vegetativo é susceptível de variar entre as espécies de plantas.
O especialista na técnica pode prontamente analisar o teor de lipídeos de material vegetativo de diferentes plantas da invenção e identificar um nível predeterminado apropriado de brilho que pode ser utilizado como um padrão no campo para avaliar o melhor momento para colher um material vegetativo de uma determinada espécie de plantas.
EXEMPLOS ExexrElo 1: Métodos_e_materíaís qeraís Expressão dos genes em células de planta em um sistema de expressão transiente
[574]Os genes foram expressos em células de plantas, usando essencialmen.te um sistema de expressão transiente conforme descrito por Voinnet et al. (2003) e Wood et al. (2009). Vetores binários contendo a região codificante a ser expressa por um promotor " forte constitutivo e35S que contém uma região melhoradora duplicada foram introduzidos em cepa AGLI de Agrobacterium tumefaciens. Um vetor binário quimérico, 35S:pl9, para a expressão do supressor silencioso viraj- pl9, separadamente foi introduzido no AGLI, conforme descrito em WO2010/057246. Um vetor binário quimérico, 35S:V2, para expressão . de supressor de silenciamento viral V2 foi separadamente introduzido em AGLI. As células recornbinantes foram cultivadas até fase estacionária a 28°C em meio LB suplementado com 50mg/L de canamicina e 50 mg/L de rifampicina.
As bactérias foram então precipitadas por centrifugação a 5.000 g por 5 min a temperatura ambiente antes de ser resuspensas eín uma OD600 = 1,0 em um tampão de infiltração com 10 mm de MES pH 5,7, 10 mM de Mgcl2 e 100 µM de acetoseringona. As células foram então incubadas a 28°C, com agitação por 3 horas, depois a OD600 foi medida e um volume cile cada cultura, incluindo o constructo de supressor viral 35S:pl9 ou 35S:V2, necessários para atingir uma concentração final de OD600 = 0,125 foi adicionado a um tubo fresco. O volurííe final foi composto do tampão acimaj. As folhas forarn, em seguida, infiltradas com a mistura de cçíltura e as plantas foram normalmente cultivadas por mais três á cinco dias após infiltração antes que os discos de folhas foram,recuperados para uma preparação de lisado celular purificado ou isolamento de lipídeos totais. Ensaio de lisado de folha purificado
[575]Tecidos de folha de Nicotiana benthamiana previarnente infiltrados como descrito acima foram cultivados em uma solução contendo 0,1 M tampão de fosfato de potássio (pH 7,Z) e 0,33 M de sacarose usando um homogeneizador de vidro. O hómogeneizado de folha foi centrifugado a 20.000 g por 45 minutos a 4°C, após o qual cada sobrenadante foi coletado. O conteúdo proteico em cada sobrenadante foi medido de acordo com Bradford (1976), usando um contador multi-marcação Wallac1420 e um reagente corante 131o-Rad Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA USA). Os ensaios de aciltransferase usaram 100 µg de proteína de acordo com Cao et al. (2007) com algumas modificações. O meio de reação continha 100 mM de Tris-HCl (pH 7,0), 5 mM de MgCl2, 1 mg/mL de BSA (livre de ácidos graxos), 200 mM de sacarose, 40 niM de oleoil-CoZ\ frio, 16,4 µM de sn 2 mono-oleoi1glicero1 [i'ç] (55mCi/mmol, American Radiochemicals, Saint Louis, ,MO USA) ou 6,0 µM de sal de ["C]glicerol-3-fosfato (G-3-P) dissódico (150 mCi/mmol, American Radiochemicals). Os ensaios foram reali-zados por 7,5, 15 ou 30 minutos. Análise de lipídeos
[576]Em resumo, os métodos utilizados para a' análise de lipídeos nas sementes ou tecidos vegetativos fori;im como se segue: Semente de Arabidopsis e qualquer outra semente de tamanho similar: (i) composição de ácido graxo - rnetilação direta de ácidos graxos em sementes, sem esmagamento de sementes.
(ii) quantificação de ácido graxo total ou TAG - metilação direta de ácidos graxos em sementes, sem esmagamento de sementes, com o uso de um padrão TAG 17:0.
Semente de canola, semente de camelina, e quaisquer outras sementes de maiores dimensões: (i) Composição de ácido graxo de semente única - rnetilação direta de ácidos graxos em semente depois de quebrar tegumento.
(ii) Composição de ácido graxo de semente agrupada de lipídeos totais extraídos - esmagando sementes erri CHCljMeOH e rnetilação de alíquotas do lipídeo extraído.
(iii) Teor de lipídeos totais de semente agrupada (teor de óleo das sementes) - duas vezes a extração de lipídeos para a recuperação completa de lipídeos de sementes após o esmagamento de sementes de quantidade conhecida de sementes dissecadas, com a metilação de lipídeos de quantidade conhecida de sementes junto com graxos ácidos 17:0 como padrão interno.
(iv) quantificação de TAG purificado de semente agrupada - duas vezes a extração de lipídeos para a recuperação completa de lipídeos de sementes após o esmagamento de sementes, de quantidade conhecida de sementes dessecadas, fracionamento de TAG do lipídeo usando TLC, e metilação direta da TAG em sílica usando TAG 17:0 como padrão interno.
Amostras de folhas: {i) Composição em ácido graxo de lipídeo total - metilação direta de ácidos graxos em amostras liofilizadas. (ii) Quantificação total de lipídeos - rnetilação direta de ácidos graxos em peso conhecido de amostras liofi-lizadas, com 17:0 FFA.
(iii) a quantificação do TAG - devido à presença de quantidades substanciais de lipídeos polares em folhas, TAG foi fraccionado por TLC de lipídeos totais extraídos, e metilado na presença de TAG 17:0 padrão interno. Etapas: Amostras congeladas secas, pesando, extração de lipídeos, fracionamento do TAG da quantidade conhecida de lipídeos totais, metilação direta da TAG em sílica, juntamente com 17:0 TAG como padrão interno. [57Í7]Os métodos são detalhados como segue: Análise do teor de óleo em sementes Arabidposis
[578] Sempre que o teor de óleo da semente for determinado em pequenas sementes como as sementes de Arabidopsis, as sementes foram secas em um dessecador durante 24 horas e aproximadamente 4 mg de sementeira foi transferido para um frasco de vidro de 2 ml com tampa de rosca contendo coberta de teflon. 0,05 mg triheptadecanoina dissolvido em 0,1 ml de tolueno foi adicionada ao frasco como padrão interno. FAME semente foram preparados por adição de 0,7 ml de 1N HCl metanólico (Supelco) para o frasco contendo o material de serrtentes. Esmagamento das sementes não foi necessário, com pequenas sementes como sementes de Arabidopsis. A mistura foi submetida a vórtice e incubada brevemente a 80°C durante 2 horas. Após resfriamento até temperatura ainbiente, 0,3 rril de NaCl a 0,.9% (p/v) e 0,1 ml de hexano foram adicionados ao frasco e misturados bem durante 10 minutos em um Heidolph Vibrarnax 110.
FAME foi recolhido em 0,3 inl de uma inserção de vidro e analisados por GC com um detector de ionização de chama (FID), como mencionado anteriormente.
. [579]A área do pico de FAME individual foi corrigida primeiro, com base nas respostas de área de pico de uma quantidade conhecida dos m.esmos FAMES presentes em um padrão comercial GLC-411 {NU-CHEK PREP, Inc., EUA). GLC-411 contém quantidades iguais de 31 ácidos graxos (% em peso), que variam de C8: 0 e C22: 6. No caso de os ácidos graxos que não estavam presentes no padrão, as respostas do FAME mais semelhante das áreas dos picos foi feita. Por exemplo, a área de pico de resposta de FAMES de 16:ld9 foi utilizada para 16:1d7 e a resposta FAME de C22:6 foi utilizada para C22:5. As áreas corrigidas foram usadas para calcular a massa de cada FAME na amostra por comparação com a massa do padrão interno. O óleo é armazenado principalmente na forma de TAG e seu peso foi calculado com base no peso de FAME. Total de moles de glicerol foi determinada pelo cálculo de moles de cada FAME e dividindo moles totais de FAMES por três. TAG foi calculado como a soma de glicerol e frações de ácidos graxos porções utilizando uma relação: % de óleo em peso, = lOOx ((41x total de mol FAME/3) + {g total de FAME-(15x mol total de FAME)))/9 de semente, em que 41 e 15, são os pesos moleculares de porção glicerol e o grupo metil, respectivamente. Análise do teor de óleo em sementes de Camelina e sementes de canola por extração
[580]Após a colheita na maturidade da planta, sementes de Camelina ou canola foram dessecadas armazenando as sementes durante 24 horas em temperatura ambiente eín um dessecador com sílica gel como dessecante. O teor de umidade das sementes é tipicamente 6-8%. Os lipídeos totais foram extraídos a partir de pesos conhecidos de sementes dissecadas por esmagamento das sementes com uma mistura de clorofórmio e metanol (2/1 v/v) em um tubo eppendorf utilizando um lisador de tecido Reicht (22 frequência/segundos, durante 3 minutos) e uma bola de metal. Um volume de 0,1 M KCl foi adicionado e a mistura foi agitada durante 10 minutos. A fase apolar menor foi recolhida após centrifugação da mistura durante 5 minutos a 3000 rpm. A fase remanescente superior (aquosa) foi lavada com 2 volumes de clorofórmio através da mistura durante 10 minutos. A segunda fase apolar também foi recolhida e combinada com a prirneira. O solvente foi evaporado a partir dos lipídeos presentes no extrato sob fluxo de nitrogênio e o total de lipídeo seco foi dissolvido em um volume conhecido de clorofórmioi
[581] Para medir a quantidade de lipídeo no material extraído, uma quantidade conhecida de 17:0 TAG foi adicionado como padrão interno e os lipídeos a parti.r da quantidade conhecida de sementes incubadas em 1 N de HCl rnetanólico- ,
(Supelco) durante 2 Mras a 80°C. FAME assim preparado foi extraído com hexano e analisado por GC. FAMEs individuais foram quantificados com base na quantidade de 17:0 TAG-FAME. Pesos de FAMES individuais, após a subtração de pesos dos grupos metil esterificados de FAME, foram convertidos em rnoles dividindo por pesos moleculares de FAMES individuais. Total de moles de todos os FAMEs foi dividido por três para calcular moles de TAG e, portanto, o glicerol. Então, moles de TAG foram convertidos para peso de TAG. Finalmente, o teor de óleo em percentagem em uma base de peso de semente foi calculado usando os pesos de sementes, assumindo que todo o lipídeo extraído é TAG ou equivalente para o propósito de calcular o teor de óleo. Este método foi baseada em Li et al., (2006). Sementes alérn de Camelina ou de canola, que são de um tamanho semelhante também podem ser analisadas por este método.
[582] Teor de óleo de canola e outras sementes também pode ser medido por meio de técnicas de ressonância magnética nuclear {Rossell e Pritchard, 1991), por exernplo, por uma onda pulsada NMS 100 Minispec (Bruker Pty Ltd Scientific Instrurnents, Alemanha), ou por infravermelho próximo como espectroscopia de reflectância usando um monocromador NIRSystems rnodelo 5000. O método de NMR pode, simultaneamente, medir o teor de umidade. O teor de humidade pode também ser medido ein uma amostra de um lote de sementes por secagem das sementes na amostra durante 18 horas a cerca de 1OO°C, de acordo coíq Li et al., (2006).
[583] Onde a composição de ácido graxo deve ser determinada para o óleo em sementes de canola, o método de metilação direta utilizado para as sementes de Arabidopsis (acima) pode ser usado, modificado com a adição de craqueamento do tegumento de canola. Este método extrai óleo suficiente a partir da semente para permitir a análise da composição de ácido graxo. Análise de lipídeos a partir de ensaios de lisado de folha
[584]OS lipídeos dos ensaios de lisado foram extraídos usando clorofórmio:metanol:0,l M KCl (2:1:1) e recuperados. As diferentes classes de lipídeos nas amostras foram separadas em placas de cromatografia fina camada (TLC) em gel de sílica 60 (MERCK, Dernistadt, Alemanha), impregnadas com ácido bórico 10%.
O sistema solvente usado para fracionar o TAG do extrato lipídico consistia de clorofórmio/acetona (90/10 v/v). Classes individuais de lipídeos foram visualizadas por exposição das placas ao vapor de iodo e identificadas por execução paralelas de padrões autênticos na mesma placa de TLC. As placas foram expostas a telas de imageamento com fósforo durante a noite e analisadas por fosforoimageador Fujifilm FLA-5000 antes do contador de cintilação líquida para a quantificação do DPM.
Isolamento e fracionamento de lipídeos totais
[585]Tecidos, incluindo amostras de foiha foram liofilizadas, pesadas (peso seco) e lipídeos totais extraídos como descrito por Bligh e Dyer (1959) ou usando clorofórmio: metanol: 0,1 M de KCl (CMK, 2:1:1) como um solvente. Os lipídeos totais foram extraídos a partir de amostras de folhas de N.
benthamiana, após liofilização, por adição de 9"00 µL de uma mistura de clorofórmio/metanol (2/1 V/V) por 1 cm de diâmetro da amostra da folha. 0,8 µg DAGE foi adicionado 0,5 mg por peso da folha seca, como padrão interno, quando a análise por TLC-FID devia ser executada. As amostras foram homogeneizadas utilizando um IKA Ultra-l'urrax lisador d? teci-do após o qual "íOO }JÍi de KCl 0,1 M. foi adi-cionado. As amostras foram agitadas, centrifugadas durante 5 min e a fase inferior foi recolhida. A fase superior restante foi extraída uma segunda vez através da adição de 600 µL de clorofórmio, vortexada e centrifugada durante 5 min. A fase inf=rior foi recuperada e reunidas na coleção anterior. Os lipídeos foram secos sob um fluxo de nitrogênio e novamente suspensos em 2 µL de clorofórmio por mg de peso seco de folha. Os lipídeos totais de N. tabacum amostras de folha folhas foram extraídos como acima com algumas modificações. Se 4 ou 6 discos foliares (cada área de superfície de aproximadamente 1 cm2) forarn combinados, 1,6 ml de solvente CMK foi utilizado, enquanto que se 3 ou menos discos foliares foram combinadas, 1,2 ml de CMK foi usado. Tecidos foliares congelados secos foram homogenei.zados em um tubo eppendorf contendo uma bola metálica com um lisador de tecido Reicht (Qiagen) durante 3 minutos a 20 frequência/s.
Separação de lipídeos neutros através de TLC e transmetilação
[586]Volumes conhecidos de extratos totais de folhas, como, por exernplo, 30 µL, foram carregados em um TLC de sílica gel de placa de 60 (1X20 cm) (Merck KGaA, Alemanha). Os lipídeos neutros foram separados por meio de TLC em um tanque de desenvolvimento equilibrado contendo um sistema solvente de hexano/DEE/ácido acético (70/30/1 respectivamente v/v/v). As bandas TAG foram visualizadas por vapor de iodo, raspadas da placa de TLC, transferidas para frascos de 2 ml de GC e seca com N2. 750. ,µL de 1N HCl metanólico-(Supelco analítica, EUA) foi adicionado a cada frasco, juntamente com uma quantidade conhecida de C17:0 TAG, como, por exemplo, 30 µg, como padrão interno para quantificação.
[587]AO analisar o efeito sobre os níveis de ácido oleico de combinações de genes específicos, bandas de TAG e lipídeos polares foram coletadas a partir das placas de TLC. Em seguida, mg de C17: 0 padrão interno foi adicionado às amostras como amostras TAG, amostras de lipídeos polares e 20 µ1 dos extratos de lipídeos totais. Após a secagem sob uma atmosfera de N2, foram adicionados 70 µL de tolueno e 700 µL de HCl metanólico.
[588]AS amostras de lipídeo para análise da composição de ácido graxo por CG foram transmetiladas por incubação das misturas a 80°C durante 2 horas, na presença de uní HCl metanólico. Depois de se resfriar as amostras até temperatura ambiente, a reação foi interrompida pela adição de 350 µ1 de H2O. Ésteres meti.l de acil graxo (FAME) foram extraídos a partir da mistura por adição de 350 µ1 de hexano, vórtice e centrifugação a 1700 rpm durante 5 min. A fase de hexano superior foi recolhida e transferida para pequenos frascos de GC com 300 µ1 de inserções cônicas. Após a evaporação, as amostras foram novamente suspensas em 30 µ1 de hexano. Um µ1 foi injetada no GC.
[589]A quantidade de ácidos graxos individuais e totais (TFA) presentes nas frações lipídicas foi quantificada por GC por determinação da área sob cada pico e calculada por comparação com a área do pico para uma quantidade conhecida de padrão interno. Teor de TAG em folha foi calculado como a soma de glicerol e frações acil graxo na fração TAG usando uma relação: % TAG em peso, = lOOx ((41x total de mol FAME/3) + (g total de FAME-(15x mol total de FAME)))/9 peso seco de folha, em que 41 e 15, são os pesos moleculares de porção glicerol e o grupo metil, respectivamente. Cromatografia capilar de gás-líquido (GC)
[590]FAME foram analisados por GC usando uma Agilent Technologies 7890A GC (Palo Alto, Califórnia, EUA), equipado com um BPX70 SGE (70% cianopropil polisilfeniler.o-siloxano) de coluna (30 mx 0,25 milímetros ID, 0,25 µm de espessura de filme), um FID, um injetor de divisão/sem dívisão e um amostrador automático Agilent Technologies 7693 Series e injetor. Hélio foi utilizado como gás de transporte. As amostras foram injetadas no modo split (50:1) a uma temperatura de forno de í50°C. Após a injeção, a temperatura do forno foi mantida a i50°C durante 1 min, depois aumentada para 210°C a 3°C.rrlin"1 e, finalmente, a 240°C a 50 °C.min-1. Os picos foram quantificados com o software da Agilent Technologíes ChernStatíon (Rev B.04.03 (16), Palo Alto, Califórnia, EUA) corr, base na resposta da quantidade conhecida do padrão externo GLC-411 (Nucheck) e padrão interno C17:0-Me. Quantificação de TAG via Iatroscan
[591] Uríi µL de extrato de lipídeo foi carregado sobre uma Chromarod-Sll por TLC-FID Iatroscan'" (Mitsubishi Chemical Medience Corporation - japão). O rack Chromarod foi então transferido para um tanque de desenvolvimento equilibrado contendo 70 ml de um sistema solvente hexano/CHClj2- propanol/ácido fÓrmico (85/10,716/0,567/0,0567 v/V/V/V). Após 30 min de incubação, o rack Chromarod foi seco durante 3 min a 1OO°C e imediatamente triado em um analisador Iatroscan MK-6S TLC-FID (Mitsubishi Chemical Medience Corporation - Japão). As áreas de pico de DAGE de padrão interno e TAG foram integradas usando software de integração SIC-480II (versão:7.0-E SIC System Ins'truments Co., LTD - japão).
[592] Quantificação TAG foi realizada em duas etapas. Primeiro, DAGE foi triado em todas as amostras para corrigir os rendimentos de extração, após o qual as amostras concentradas de TAG foram selecionadas e diluídas. Em seguida, a TAG foi quantificado em amostras diluídas com urna segunda triagem de acordo com a calibração externa usando trilinoleato de gliceril como padrão externo (Sigma-Aldrich). Quantificação da TAG em amostras de folhas por GC
[593]As áreas do pico do FAME individual foram primeiro corrigidas, com base nas respostas de áreas de pico de quantidades conhecidas dos mesmos FAMES presentes em um padrão comercial GLC-411 (NU-CHEK PREP, Inc., EUA). As áreas corrigidas foram usadas para calcular a massa de cada FAME na arr.ostra por comparação com o padrão interno. Uma vez que o óleo está armazenado, principalmente sob a forma de TAG, a quantidade de óleo foi calculada com base na quantidade de FAME, em cada amostra. Total de moles de glicerol foi determinada pelo cálculo de moles de FAMEs e dividindo moles totais de FAMES por três. A quantidade de TAG foi calculada como a soma de glicerol e frações de ácidos graxos utilizando a fórmula: % óleo em peso, = lOOx ((41x total de mol FAME/3) + (g total de FAME-(15x mol total de FAME)))/9 peso seco de folha, em que 41 e 15, são os pesos moleculares de fração glicerol e o grupo metil, respectivamente. Ensaio de DGAT em Saccharomyces cerevisiae H1246
[594]A cepa H1246 de Saccharomyces cerevisiae é completamente sem a atividade DGAT e carece de TAG e ésteres de esterol como resultado de mutações suprimidas em quatro genes (DGAI, LROI, AREI, ARE2). A adição de ácidos graxos livres (por exemplo, 1 mM 18:1a9) ao meio de crescimento H1246 é tóxica na ausência de atividade DGAT. O crescimento em tal meio, portanto, pode ser usado como um indicador ou seleção para a presença da atividade DGAT nesta cepa de levedura.
[595]A cepa H1246 de S. cerevisiae foi transformada com o constructo pYES2 (controle negativo), um constructo que codifica para a DGATI de Arabidopsis thaliana em pYES2, ou um constructo que codifica para MGAT2 de Mus musculus em pYES2. As transformadas foram alimentadas com ácidos graxos livres de [14C] 18:lA9,
[596] Em um experimento separado, HI 246 de S. cerevisiae foi transformada com o constructo pYES2 (controle negativo), um constructo que codifica para DGATI de Bernadia pulchella em pYES2 ou um constructo que codifica MGATI de M. musculus em pYES2 e alimentada com ácidos graxos livres de [14C] 18:1^9. A cepa tipo selvagem S288C de S. cerevisiae transformada com pYES2 serviu como controle positivo.
[597]AS leveduras transformadas foram ressuspensas em água mQ estéril e diluídas para OD600 = 1. Amostras adicionais foram diluídas ern quatro diluições consecutivas, cada uma em 1/10. 2µ1 de cada .diluição forarn colocados em cada uma das placas (YNBD, YNBG, YNBG+FA) juntamente com 2 µL mQ de água 2 µL de urna suspensão d.e células H1246 sem transformação (OD600 = 1). As placas foram incubadas durante 6 dias a 30°C antes de classificar o crescimento. Meio da placa, 40 mL dos meios por placa " YNBD: meio de gotejamento mínimo deficiente em uracil e contendo 2% de glicose, 0,01% de NP40 e 100 µ1 de etanol.
· YNBG: meio de gotejamento mínimo deficiente errI uraci.l e contendo 2% de galactose, 1% de rafinose, 0,01% de NEj40 e 100 µL l de etanol.
" YNBG+FA: meio mínimo da saída deficiente em uracil e contendo 2% de galactose, 1% de rafinose, 0,01% de NP40 e 1 rnM de C18:1l\9 dissolvido em 100 µ1 de etanol.
ExeInp1o 2. ExEressão constítutiva de uma monoací1£1ícero1 aeíltransferase em eé1u1as de pIantas
MGATI
[598]A atividade enzimática da monoacilglicerol aciltransferase 1 (MGATI), codificada pelo gene de M. musculus (Yen et al., 2002) e diacilglicerol aciltransferase (DGATI) da A. thaliana {Bouvier-Nave et al., 2000), usada aqui corao uma comparação com a MGATI, foram demonstradas no tecido da folha de N. benthamiana usando um sistema de expressão transiente, conforme descrito no Exemplo 1.
[599]Urn vetor designado 35S-pORE04 foi construído através da inserção de um fragmento de Pstl contendo um promotor 35S no sítio Sfol do vetor pORE04 após o tratamento com T4 DNA polimerase para deixar sem pontas as extr,emidades (Coutu et al., 1- · .
2007). Um DNA -quimérico que codifica para a MGATI de M. musculus, códon-otimizado para Brassica napus, foi sintetizado por Geneart e designado 0954364 MGAT pMA. Um DNA quiinérico designado 35S:MGAT1 e codíficante para a MGATI de M. musculus (Genbank N.° de Acessão Q91ZV4) para a expressão em células de plantas foi feita através da inserção de toda a região de codificação de 0954364 MGAT pMA, contida em um fragmento de ECORI, em 35S-pORE04 no sítio Ecori. O vetor contendo o constructo do 35S:MGAT1 foi designado como pjP3184. Da mesma forma, um DNA quimérico 35S:DGAT1 codificante para DGATI de A. thaliana (Genbank N.° de Acessão AAF 19262) para a expressão em células de plantas foi feita através da inserção de toda a região de codificação de pXZP513E, contida dentro de um fragmento BamHI-EcoRY, em 35S-pORE04 no sítio BamHI-EcoRY. O vetor contendo o constructo 35S:DGAT1 foi designado pjP2078.
[600]Os vetores quiméricos forarn introduziram ern cepa AGLI de A. tumefaciens e as células de culturas destes infiltrados no tecido da folha de N. benthamiana plantadas em um quarto de crescimento a 24°C. A fim de permitir comparações diretas entre amostras e reduzir a variação inter-folha, as amostras que estão sendo comparadas foram infiltradas em ambos os lados da mesma folha. Foram realizados experimentos em triplicado. Após a infiltração, as plantas foram cultivadas por mais três dias antes que discos de folhas foram tomados, liofilizados, e os lipídeos extraídos das amostras foram fracionados e quantificados conforme descrito no Exemplo 1. Esta análise revelou que os genes MGATI e DGATI estavam funcionando para aumentar os níveis de óleo da folha de N. benthamiana como segue.
[601] Tecido da folha transformado sornente com o constructo 35S:p19 (controle negativo) conteve uma média de 4 µg de ácidos graxos livres (FFA) derivados do DAG/mg de peso seco de folha e µg de FFA derivado do TAG/mg de peso seco de folha. Tecido da folha transformado com os constructos 35S:p19 e 35S:DGAT1 (controle para expressão da DGATI) continham urna média de 4 µg de FFA, derivado de DAG/mg de peso de folha seca e 22 µg de FFA derivado de TAG/mg de peso de folha seca. Tecido da folha transformado com os constructos 35S:p19 e 35S:MGAT1 continham uma média de 8 µg de FFA derivado de DAG/rr.g de peso seco de folha e 44 µg de FFA derivado de TAG/mg de peso seco de folha. Tecido de folha transformado com os const.ruÇtos 35S:pl9, 35S:DGAT1 e 35S:MGAT1, não continham níveis de Diljg ou TAG mais elevades do que aqueles observados no infiltrjdo 35S:pl9 e 35S:MGAT1 (Fi-gura 2). Também, uma diminuição do nfvel de ácidos graxos saturados em sementes foi observada após ijl expressão de MGAT quando comparado ccm o controle de pl9 ou amostras de DGATI (Tabela 2).
[602]OS dados descritos acima demonstraramjque a enzima MGAT 1 era muito mais ativa do que a enzima DGATI ha promoção da acumulação de DAG e TAG no tecido de folha. A expfessão do gene
MGAT 1 resultou no acúmulo em duas vezes mais de TAG e DAG no tecido de folha, comparado a quando a DGATI foi expressa. Este resultado foi altamente surpreendente e inesperado, considerando que a MGAT é uma enzima expressa no intestino de camundongo, um sistema biológico totalmente diferente das folhas de planta. Este estudo foi a primeira demonstração da expressão ectópica de MGAT em uma célula de planta.
[603]Amostras de folhas infiltradas com MGATI de M. musculus acumularam o dobro de DAG e TAG em relação ao tecido de folha infiltrado unicamente com DGATI de A. thaliana. A eficiência da produção de TAG foi também surpreendente e inesperada, dado que a MGAT de camundongo tem muita pouca atividade como a DGAT. O tecido de folha infiltrado com os genes que codificam MGATI e DGATI não acumularam significativamente mais TAG do que MGAT 1 - somente amostra da folha. A Figura 1 é uma representação de várias vias de acumuiação de TAG, muitas da que convergem no DAG, uma molécula central na síntese de lioídeos. Por exemplo, MAG, DAG e TAG podem ser interconvertidos através de várias atividades enzimáticas, incluindo transacilação, lipase, MGAT, DGAT e PDAT. Uma diminuição do nível de ácidos graxos saturados observou-se também após a expressão da MGAT.
MGAT2
[604] Um DNA quimérico designado 35S:MGAT2 e codificante para a MGAT2 de M. musculus para a expressão em células de plantas foi construída através da inserção de toda a região de codificação de MGAT2, contida em um fragmento de ECORI, em 35S- pORE04 no sítio ecori. A atividade enzimática da monoaci.lglicerol aciltransferase 2 (MGAT2), codificada pelo gene de M. musculus (Yen, 2003) (Genbank N.° de Acessão Q80W94) e da DGATI da A. thaliana (DGATI) (Bouvier-Nave et al., 2000), usada aqui como uma comparação com MGAT2, também forarn demo stradas no tecido da folha de N. benthamiana usando üIIl sistema d expressão transiente, conforme descrito no Exemplo 1.
2"/0/375
[605] Comparado com os controles, a expressão de DGATI incrementou a TAG de folha 5,9 vezes, MGAT2 em 7,3 vezes e a combinação de MGAT2+DGAT1 em 9,8 vezes (Figura 3). A capacidade da MGAT2 sozinha para produzir tais aumentos significativos de TAG foi inesperada por um número de razões. Em primeiro lugar, a quantidade de substrato MAG presente no tecido de folha é conhecida por ser baixa e não seria de se esperar grandes aumentos na acumulação de TAG deste substrato. Em segundo lugar, a adição da atividade MGAT sozinha (ou seja, adição de MGAT2 que não tem atividade DGAT) seria esperada de produzir DAG, não TAG, especialmente em um ambiente de folha onde pouca atividade DGAT nativa geralmente está presente.
Discussão
[606]OS presentes inventores demonstraram surpreendentemente que a expressão transgênica de um gene MGAT resulta em aumentos significativos na produção de lipídeos em células de plantas. Os presentes inventores entendern que Tumaney et al. tinham isolado uma DGAT com alguma atividade MGAT e que eles não foram bem sucedidos na tentativa de clonar um gene que codifique para um MGAT conforme definido aqui. Tumaney et al.
(2001) relataram a atividade MGAT em amendoirn e isolaram uma enzima responsável por esta atividade. No entanto, Tumaney et al. não publicaram os resultados dos testes de atividade DGAT e, portanto, parece que a enzima relatada foi uma.DGAT com alguma atividade MGAT. Certamente, trabalhos anteriores não conseguiram identificar qualquer atividade MGAT em outras espécies (Stobart et al., 1997). Além disso, foi surpreendente que a enzima isolada por Tumaney et al. era uma enzima solúvel, citosólica, ao invés de uma enzima de superfície de membrana.
[607] Recentemente, os pesquisadores identificaram um monoacilglicerol aciltransferase ligado à membrana microssomal (MGAT) de sementes imaturas de amendoim (Arachis hypogaea). O MGAT pode ser solubilizado a partir de membranas microssomais usando uma combinação de um agente caotrópico e de um detergente
271,'375 zwitteriônico, e um complexo multiproteico 14S funcionalmente ativo foi isolado e caracterizado. Oleosin3 (OLE3) foi identificado como parte do complexo multiproteico, o qual é capaz de realizar atividades bifuncionais como acilação de monoacilglicerol (MAG) a diacilglicerol (DAG) e fosfolipase A2 (PLA2; Parthibane et al, 2012). Ex,empIo 3 : ~D,em,o,nstração bíomím,í.e,a da _ a,t,í,v,í,da,de da_ MGAT transgêníca em ex,t,r,a.t,o.s _ de _ f,o.1,h,a
[608] Lisados celulares foram feitos a partir de tecido de folha de N. benthamiana que tinha sido infiltrado com 35S:MGAT1, 35S:MGAT2 e 35S:DGAT1, conforme descrito no Exemplo 1. Infiltrações de folhas separadas foram realizadas, cada uma em triplicado, para cepas contendo apenas o constructo 35S:p19 (controle negativo), a cepa 35S:MGAT2 juntamente com a cepa .
35S:p19 e uma mistura das cepas de Agrobacterium 35S:MGAT2 e 35S:DGAT1 com a cepa 35S:p19. As triplicatas das amostras foram colhidas após três dias e um lisado celular purificado foi elaborado por lise mecânica e centrifugação do tecido. As atividades da MGAT dos lisados de célula purificados foram comparadas por alimentação com [14C] MAG com os lisados conforme descrito no Exemplo 1. OS dados são mostrados na Figura 4.
[609] Pouca atividade da MGAT foi observada na amostra de controle 35S:p19, senM que a maioria da radioatividade permaneceu na MAG durante todo o ensaio. Em contraste, a maioria da MAG marcada na amostra 35S:MGAT2 foi rapidamente convertida em DAG (Figura 4, painel central), o que indica forte atividade MGAT expressa do constructo 35S:MGAT2. Além' disso, uma quantidade significativa de TAG também foi produzida. A produção de TAG observada na amostra 35S:MGAT2 foi provavelmente devido à atividade da DGAT nativa de N. benthamiana, ou produzida por outra via de síntese de TAG. A quantidade de produção de TAG esteve consideravelmente aumentada através da adição posterior de 35S:DGAT1 (Figura 4, painel lado direito), indicando que a enzima MGAT2 produziu DAG o que foi acessível para a conversão a
TAG por DGATI nos tecidos vegetativos de planta. ExmaE1o 4: Demonstra£ão bío«ímíca da Arodu£ão de MAG acessíveí à MGAT em extrato de folha
[610]NOS ensaios in vitro descritos no Exemplo 3 usando lisados de folha, os substratos (sn-2 MAG e oleoilo-CoA) foram fornecidos exogenamente, considerando que a atividade in vivo da MGAT em tecidos de plantas intactos exigiria a presença nativa destes substratos. A presença de níveis baixos de MAG em vários tecidos d.e plantas tem sido relatada anteriormente (Hirayama e Hujii, 1965; Panekina et al., 1978; Lakshminarayana et al., 1984; Perry & Harwood, 1993). Para testar se a MGAT2 poderia acessar à MAG produzida por rotas nativas da planta, o experimento acima foi repetido, mas este vez alimentando com [l4C] G-3-P aos lisados. Os dados resultantes são mostrados esquematicamente na Figura 5. . [611]A -produção de MAG marcado observou-se em todas as amostras, indicando a produção de novo de MAG a partir de G-3-P em lisados de folhas de plantas. Os produtos DAG e TAG marcados também foram observados em todas as amostras, embora estes foram relativamente baixos na amostra. de controle 35S:pl9, indicando que a produção destes lipídeos neutros pela rota endógena de Kennedy foi relativamente baixa nesta amostra. Em contraste, a maioría da rnarcação r'-as amostras de MGAT2 e MGAT2 + DGATI apareceram nos grupos de DAG e TAG, irídicando que o MGAT exogenamente adicionado catalisou a conversã.o do MAG que tinha sido prod.uzido a partir do G-3-P marcado por uma rota nativa da planta.
[612] Os exemplos 2 a 4 demonstram vários pontos-chaves: 1) O tecido de folha pode sintetizar MAG a partir de G-3-P, tal que o MAG é acessível a uma MGAT exógeno expressado no tecido de folha; 2) Mesmo uma MGAT que é derivada do intestino de rnamíferos pode funcionar nos tecidos de plantas, não conhecidos por possuir uma MGAT endógena, requerendo uma interação bem sucedida com outros fatores da planta envolvidos na síntese de
273/3"/5 lipídeos; 3) DAG produzi-do pela atividade MGAT exógena é acessível a uma DGAT de planta, ou uma DGAT exógena, para produzir TAG; e 4) a expressão de uma MGAT exógena pode produzir níveis de TAG muito elevados em tecidos vegetais, níveis que são pelo menos tão grandes como os que são gerados pela expressão exógena da DGATI de A. thaliana.
ExemE1o 5: ExEressão de DGAT1m MGATI e MGAT2 em 1eye,du,r,a,
[613]Vetores quiméricos de expressão em levedura foram constr'-íídos através da inserção de genes que codificam para DGATI d.e A. thaliana, MGATI de M. musculus e MGAT2 de M.
musculus, no vetor pYES2 para produzir pYES2:DGATI, pYES2:MGAT1 e pYES2:MGAT2. Estos constructos forarn transformadas na cepa H1246 de Saccharomyces cerevisiae que é completamente deficiente da atividade DGAT e carece d-e TAG e ésteres de esterol como resultado de mutações suprimidas em quatro genes (DGAI, LROI, AREI, ARE2). A cepa de levedura H1246 é capaz de sintetizar o DAG a partir de ácidos graxos exógenos adicionados, mas é incapaz de converter o DAG a TAG devido às mutações suprimidas.
Os cultivos da levedura transformada forarn alimentados com [14C] 18:1a9 antes que os lipídeos totais foram extraídos e fracionados por TLC, conforme descrito no Exernplo 1. Um autoradiograma de uma placa de TLC representativa é mostrado na Fígura 6.
[614]A formação de TAG, indicando a presença da atívidade DGAT, observou-se para as células de levedura contendo qualquer DGATI (controle positivo) e o MGATI dos mamíferos, mas não em células que contêm o MGAT2 codificado pela região codificadora de M. musculus nativa. Concluiu-se que MGATI de camundongo também tinha atividade DGAT em células de levedura e, portanto, funcionou como uma enzima de dupla função MGAT/DGAT, considerando que a MGAT2 não tem atividade detectável de DGAT e, portanto, apenas MGAT. Um constructo que inclui uma região de codificação MGAT2 que foi otimizado por códon para a expressão em levedura apresentou atividade MGAT (produção de DAG), quando testada in vitro utilizando microssomas de levedura p substrato
" marcado com MAG, enquanto que um constructo semelhante que foi otimizada pcr códon para a expressão em B. napus não apresentou produção de DAG nos microssomas de levedura. Este experimento mostrou o benefício de otimização por códon para o organismo em que as regiões de codificação heterólogas deveriam ser expressas. ExemE1o 6. ExEressão de um monoaeí1Á1íeero1 acíltransferase 1antasj_ sementes e funAos.
Expressão do MGAT 1 em sementes de Arabidopsis thaliana
[615] Um gene que codifica para MGATI de M. musculus e sob o controle de um promotor específico de semente (FPl, um promotor truncado d.e Brassica napus napin) foi usado para gerar plantas de A. thaliana transformadas estáveis e sementes de ,,, descendência. O vetor designado pjP3174 foi feito através por R inserçãQ de um fragmento Sall contendo um sítio de Ecori " flanqueado pelo promotor Fpl e o sinal de poliadenilação de lectina de Glicine max no sítio Sall-Xhol do vetor pCW141. O vetor de pCW141 também continha um GFP secretado de semente, direcionado a FPl, interrompido por intron, como um gene marcador de triagem. O gene quimérico designado FPI:MGATI-GFP foi feito atrçivés da inserção de toda a região de codificação do constructo 0954364_MGAT_pMA, contido em um fragmento de ECOKL, em pjP3174, no sítío de ECoRI, gerando pjP3179. Esse vetor quimérico foi introduzido em cepa AGL 1 de A. tumefaciens e células de cultura de Agrobacterium transformadas usadas para tratar plantas de A. thaliana (ecotipo Columbia) usando o método de mergulho floral para a transformação (Clough e Bent, 1998).
Após a maturação, as sementes das plantas tratadas foram vistas sob um microscópio de dissecação Leica MZFLIII e uma lâmpada de mercúrio 100 ebq. Quinze sementes transgênicas (GFP fortemen.te positivo) e quinze sementes não transgênicas (GFP negativo) foram isoladas e cada conjunto agrupado. Os grupos de GFP positivos e GFP negativos foram analisados para o conteúdo total de ácidos graxos, conforme descrito no Exemplo 1. Esta análise fornece c) conteúdo médio de ácidos graxos e a composição para sementes transformadas com o constructo de MGAT, mas em urna população que pode ter contido tanto sementes transformadas heterozigotas e homozigotas.
[616] Esta análise revelou que o gene MGATI estava funcionando para aumentar os níveis de óleo de semente erri sementes de A. thaliana com quinze sementes não transgênicas (controle, o mesmo que o tipo selvagem) contendo uma média de 69,4 µg de ácidos graxos totais enquanto as quinze sementes transgênicas transformadas com o gene GFP e, portanto, susceptíveis de conter o constructo genética FPI:MGATI, continha uma média de 71,9 µg total de ácidos graxos. Este foi um aumento de 3,5% no conteúdo de óleo em relação ao controle (tipo ..m selvagem). A análise revelou também que o gene dp MGAT estava funcionando para enriquecer os ácidos graxos poli-'nsaturados na semente, como pode ser visto da corr.posição de ácicijos graxos dos lipídeos totais extraídos obtidos das sementes. Emjparticular, a quantidade de ALA presente, como uma porcentagem qo total ácido graxo extraído das sementes, aumentou de 16,0 pQra 19,6%. Da mesma forma, a porcentagem do ácido graxo 20:2ntj aumentou de 1,25% para 1,90% e o ácido graxo 20:3n3 aumentou fiíe 0,26% para 0,51% {Tabeia 2). Tábela 2. Efeíto da expressão de MGAT na Pomposí,ção de ácídos graxos da semente.
Perfii FA (% de TFA) 8 a T"' m a © m N ¢Q 3 Ò > W & Ò Ó iô C3 t r u t t r m
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H & O O ÇJ r
O Amostra Controle 7.41 0.36 0.12 3.CK) 15.26 1.98 30.93 15.98 N!GAT1 7.11 0.32 0.11 2.95 13.86 1.51 28.87 19.59 a m o ¢d n d " ?. ? S w 0 e c "" &1 4 m d µ « n &1 "" n f O rÕ &-· Ô çq a n O O O à" n n Total Amostra
1.86 17.95 1.74 1.25 0.26 0.57 0.98 0.2C 0.17 10090 Controíe MGATI 1.90 17.22 1.71 1.90 0.51 0.57 1.52 0.19 0.17 1OO.(X)
[617]Um novo experimento foi realizado onde o DNA quimérico FPI:MGATI-GFP foi modificado para remover o gene GFP. Esse constructo genético, designado FPl: MGATI foi transformada em uma linha de A. thaliíana que era mutante para FAD2. O conteúdo total de ácidos graxos da semente T2 de plantas T1 resistentes a antibióticos, bem como as linhas parentais crescidas ao lado destas plantas, foi determinado de acordo com o Exemplo 1. Os dados são mostrados na Tabela 3. A média de ácidos graxos totais da semente a partir das linhas de controle foi 347,9 µg/1OO sementes, considerando que a média das sementes transgênicas foi 381,0 µ"g/1'OO sementes. Quando os dados para a linha de controle C6 foí,,,exciuídos para a deterrriinação da média, a média para os controles foi 370 µg/1OO sementes. O conteúdo de óleo nas sementes transgênicas representou um aumento de cerca de 3% em termos relativos, em comparação com o conteúdo de óleo nas sementes não transformadas.
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[618]A região de codificação do gene de MGAT2 de camundongó, otimizada por códons paiia a expressão em células de plantas, foi substituída para a região de codificação de MGATI nos constructos referidas acima, e introduzida em Arabidopsis.
Trinta plantas de cada linhagem transgênica (plantas Tl e T2, dando origem a sementes de geração T2 e T3) foram cultivadas na estufa em uma distribuição disposta aleatoriamente e em comparação com as plantas de controle. Sernentes de plantas transgêni.cas aumentararn seu teor de óleo em relação às sernentes de controle (Figura 7). O percentual médio de TAG das sementes transgênicas T3 representou um aumento relativo de cerca de 8% em relação ao percentual TAG nas sementes não transforrnadas {Tabela 4). Um aumento acentuado foi observado no nível de ácidos graxos poli-insaturados na TAG das sementes transgénicas, em particular de ALA, e uma diminuição em níveis de ácido graxo saturado como ácidos palmítico e esteárico. Além disso, os níveis aumentados de TAG e composição alterada em ácido graxo foram mais pronunciados na geração T3 do que nas sementes T2, presumivelmente devido ao estado homozigoto do transgene nas sementes T3.
Tabela 4. Níveis TAG e composição de ácido graxo em TAG extraído.de sementes T2 e T3 de Arabidopsis thaliana expressando MGAT2 em comparação com a semente controle não transformada.
C14:0 C16:0 C16:1 C18:0 C18:1d9 C18:1d11 C18:2 C18:3 Controle 0,1 8,1 0,3 3,3 13,2 1,8 28,4 20,0 Sementes T2 0,1 7,2 0,2 2,8 13,0 1,3 27,9 24,3 Sementes T3 0,1 6,1 0,2 2,5 12,3 1,2 28,4 26,7 I '/) TAG por I peso de C20:0 I C20:1 I 20:1iso I 20:2n6 ! C22:1 C24:0 24:1 ! semente í
2,2 17,2 1,9 1,8 1,2 0,3 0,2 32,4 1,6 14,8 3,1 1,8 1,2 0,3 0,2 37,9 | 1,8 15,3 1,5 1,9 1,5 0,4 0,2 40,2 Expressão de MGATI em sementes de Brassica napus
[619]0 vetor FP1:MGAT1 usado para a expressão de MGATI de
14. musculus em sementes de Arabidopsis thaliana foi usado para gerar plantas de B. napus transformadas. O vetor foi irjitroduzido em cepas AGLI de A. tumefaciens através de procedimentos padrões de eletroporação. Cultivos foram cultivados durante toda a noite a 28°C em meio LB com agitação a 150 rpm. As células bacterianas foram coletadas por centrifugação a 4000 rpm por 5 minutos, lavadas com AB de Winans (Winans, 1988) e resuspendidas eni 10 rriL de meio AB de Winans (pH 5,2) e crescidas com canamicina (50 mg/L) e rifampicina (25 mg/L) durante toda a noite, com'a adição de 100 µM de acetoseringone. Duas horas antes da infecção das células Brassica, espermidina (120 mg/L) foi adicionada e a densidade final das bactérias ajustada para uma OD 60Onm de 0,3- 0,4 com meio fresco de AB. Pecíolos cotiledonares recentemente isolados de 8 dias de idade de B. nap'is cultivadas em 1/2 MS (Murashige-·Skoog, 1962) ou segmentos hipocotil pré-condicionados por 3-4 d.ias no meio MS com 1 mg/L de tidiazuron (TDZ) + 0,1 mg/L de ácido alfa-Naftalenoacético (NAA) foram infectados com mL de cultivos de Agrobacterium durante 5 minutos. Explantes (pecíolo cotiledonar e hipocotil) infectados com Agrobacterium foram então desmanchados em papel de filtro estéril para remover o exc.esso de Agrobacterium e transferido para meio de co-cultivo (meio MS com 1 mg/L TDZ + 0,1 mg/L NAA + 100 µM acetoseringone) suplementado com ou sem diferentes antioxidantes (L-cisteína 50 mg/L e ascórbico 15 mg/L). Todas as placas foram seladas com parafilme e incubadas no escuro em 23-24°C du.rante 48 horas.
[620] Os explantes co-cultivados (pecíolo cotiiedonar e hipocotil) foram, em seguida, lavado.s corri água destilada esterilizada + 50Omg/L de cefotaxima + 50 mg/L de timentina por 10 minutos, enxaguados em água destilada estéril durante 10 minutos, desmanchados a seco em papel de filtro estéril, transferidos para meio de pré-seleção (MS + 1 mg/L de TDZ + 0,1 mg/L de NAA + 20 mg/L de sulfato de adenina (ADS) + 1,5 mg/L de
AgN03+ 250 mg/L de cefotaxima e 50 mg/L de timentina) e cultivados por cinco dias a 24°C com foto-período de 16 horas/8 horas.
Eles foram transferidos para meios de seleção (MS + 1 mg/L de TDZ + 0,1 mg de L NAA + 20 mg/L de ADS + 1,5 mg/L de
AgNO3+ 250 mg/L de cefotaxima e 50 mg/L de timentina) com 1,5 mg/L de amônio de glufosinato e cultivados por 4 semanas a 24°C,
com foto-período de 16 horas/8 horas corn uma subcultura quinzenal no mesmo meio.
Explantes com calo verde foram transferidos para meios de iniciação de brotos (MS + 1 mg/L de quinetina + 20 mg/L de ADS + 1,5 mg/L de AgNO,+ 250 mg/L de cefotaxima + 50 mg/L de timentina + 1,5 mg/L de arnônio de glufosinato) e cultivados por mais 2-3 semanas.
Brotos emergentes dos explantes resistentes foram transferidos para meios de elcngação de brotos (meio MS com 0,1 mg/L de ácido giberelico + 20 mg/L de ADS + 1,5 mg/L de AgNO,+ 250 nig/L de cefotaxima e 1,5 mg/L de amônio de glufosinato e cultivados por outras duas semanas.
Brotos saudáveis de 2-3 cm de comprimento foram selecionados e transferidos para meio de enraizamento (1/2 MS com 1 mg/L NAA + 20 mg/L ADS + 1,5 mg/L de AgNQ3+ 250 mg/L de cefotaxima) e cultivados por 2-3 sernanas.
Brotos bem estabelecidos com raízes forarri transferidos para potes
(aumentar.do a mistura de mudas) e crescidos em uma cabina de crescimento por duas semanas e posteriormente transferidas para estufa.
Dezesseis transformantes individuais na cultivar Oscar foram confirmados sendo transgênicos para o constructo FE'I:MGATI e cresceram normalmente sob condições de estufa.
As plantas foram crescidas até a maturidade e as sementes obtidas de plantas tra.nsformadas foram colhidas.
As sementes de algumas das plantas transformadas foram analisadas para teor de óleo de semente e composição de ácido graxo.
Os dados destas análises preliminares mostraram variabilidade no teor de óleo e composição de ácido graxo, provavelmente devido ao às plantas estarem crescendo ern tempos diferentes e sob condições ambientais diferentes. Para reduzir a variabilidade, plantas Tl que expressam MGATI são produzidas e crescidas sob as mesmas condições que as plantas de controle (tipo selvagem, cultivar Oscar) do mesmo genótipo, e teor de óleo comparado. Expressão de MGATI em sementes de Gossypium hirsutum
[621]0 mesmo gene quimérico específico de semente usado para a expressão de MGATI de M. musculus em sementes de Arabidopsis thaliana foi usado para gerar plantas transformadas de Gossypium hirsutum. O vetor designado FPI:MGATI foi introduzido em cepa de A. tumefaciens AGLI via procedimentos padrões de eletroporação e células de cultivos de Agrobacterium usados para introduzir os DNAS quiméricos nas células de Gossypium hirsutum, variedade Coker315. Cotilédones extirpados da rnudas de algodão de 10 dias de idade foram utilizados como explantes e infectados e co-cultivados com A. tumefaciens por urn período de dois dias. Isto foi seguido por uma seleção de seis semanas em meio MS (Murashige e Skoog, 1962) contendo 0,1 rng/L de 2,4-D, 0,1 mg/L de quinetina, 50 mg/L de sulfato de canamicina e 25 mg/L de cefotaxirna. Caules saudáveis derivados dos explantes de cotilédones foram transferidos para meio MS contendo 5 mg/L de 6-( Y, Y-dimeti1alilamino)-purinja (2ip), 0,1 mg/L de ácido naftalenoacético (NAA), 25 mg/L de Panamicina e 250 mg/L de cefotaxima para urn segundo período de sjis semanas a 28°C. Embriões somáticos que se formaram após de cefca de seis a dez semanas de incubação foram germinados e rnantijos no mesmo meio, mas sem adicionado de fitohormônios ou ijntibióticos. Plântulas desenvolvidas a partir de embriões somjiticos foram transferidas para o solo e rnantidas em uma estufa urrja vez que as folhas e raízes foram desenvolvidas, com temk)eratura de crescimento de 28°C/20°C (dia/noite). Dez plantas jtransgênicas primárias independentes (TO) contendo o construcijo fp1-mgat1 foram cultivadas em estufa, floresceram e produzi7am cápsulas contendo sementes. As sementes foram colhidas na maturidade. Para melhorar a confiança da análise de teor de óleo, 5 plantas foram estabelecidas de cada uma das 10 plantas transgênicas primárias e as sementes maduras T2 são submetidas à análise de teor de óleo. A expressão específica de semente de MGATI aumenta o conteúdo de óleo e aumenta a porcentagem de ácidos graxos poli-insaturados no óleo da semente de algodão.
Expressão de genes de uma MGATI e MGAT2 em plantas de N. benthamiana após transformãção estável.
[622]A N. benthamiana foi transformada estavelmente com o constructo de 35S:MGAT1 descrita no Exempío 2. A 35S:MGAT1 foi introduzid.a em cepa AGLI de A. tumefaciens através de procedimento padrão de eletroporação. As células transformadas foram cultivadas em meio LB sólido suplementado com canamicina (50 mg/L) e rifampicina (25 mg/L) e incubadas a 28°C durante dois dias. Uma única colônia foi usada para iniciar a cultura fresca. Após 48 horas de cultura vigorosa, as células foram coletadas por centrifugação a 2000 x g e o sobrenadante descartado. As células foram resuspendidas em solução fresca contendo 50% de meio LB e 50% de meio MS na densidade de OD600= 0,5.
[623]Amostras de folha de N. benthamiana cultivadas in vitro foram extírpadas e cortadas em quadrado de seções de cerca de 0,5 a 1 cm2 de tamanho com- um bisturi afiado, enquanto imersa na solução de A. tumefaciens. Os pedaços de folha de N. benthamiana feridos submergidos em A. tumefaciens foram deixados em temperatura ambiente por 10 minutos antes de serem desmanchadas em papel filtro estéreis e transferidas para placas de MS sem suplemento. Após um período de co-cultivo de dois dias a 24°C, os explantes foram lavados três vezes com meio MS estéril líquido, então desmanchados com papel de filtro estéril e colocados no agar seletivo MS suplementado com 1,0 mg/L de benzilaminopurina (BAP), 0,25 mg/L de indoleacético (IAA), 50 mg/L de canamicina e 250 mg/L de cefotaxima. As placas foram incubadas ã 24°C, durante duas sernanas per itindo o desenvolyimento de brotos a partir dos pedaços) de folha transformada de N. benthamiana.
[624] Para estabelecer plantas transgênicas com raízes in vitro, saudáveis brotos verdes foram cortados e tranÇferidos em potes de cultura de tecidos de 200 mL contend.Ç MS ágar suplementado com 25 µg/L de IAA, 50 mg/L de canamibina e 250 rng/L de cefotaxima. Discos de folha suficientemenje grandes foram retirados de brotos transgênicos e liofiliÍzados para fracionamento e quantificação de TAG, conforme dÜcrito no Exemplo 1 (Tabela 5). A melhor planta 35s:MgijT1 de N. benthamiana tinha um conteúdo de TAG de 204,85 µg/1OO,mg de peso seco de tecido de folha em comparação com um conteúcjo médio de TAG de 85,02 µg/1OO mg cle peso seco da folha nas! linhas de controle, que representa um aumento no conteúdo de TAGl de 24i·%.
[625] N. benthamiana tarnbém foi transformada estavelmente com o constructo 35S:MGAT2 descrita no Exemplo 2 e ccjm um vetor binário pORE4 de controle (Tabela 6). A melhor plant) 35S:MGAT2 de N. benthamiana tinha um conteúdo de TAG de 79,0 µj/10O mg de peso seco de tecido de folha erri comparação com um çonteúd.o de TAG de 9,5 µg/1OO mg de peso seco da folha na linha Çe controle no mesrno estágio de desenvolvimento, que representa jurn aurnento no conteúdo de TAG de 731%. O perfil de ácidos jgraxos das frações de TAG tarnbém foi alterado com níveis signifijativamente reduzidos dos ácidos graxos saturacios 16:0 e 18:¢ e níveis aumentados d.os ácidos graxos poli-insaturados, esÉ)ecialrr.ente 18:3o3 (ALA) (Tabela 6). O perfil de ácidos graxos dÇs lipídeos l pola'res das rnesmas arnostras de folha não fcji afetado significativamente, o que indica que as mudanças na) composição i de ácidos araxos dos lipídeos não polares foram) reais. As 3 plantas de controle neste experiínento foram menores C diferente fisiologicamente que no experimento anterior com O)| censtructo 35S:FÍGAT1, e isso pode ter explicado o diferente Gonteúdo de ! l óleo das plantas controle de um experirnento parài o outro.
Experimentos para comparar diretamente os constructos 35S:MGAT1 e 35:MGAT2 com plantas controles são realizados usando plantas do mesmo tarr'.anho e fisiologia.
[626]Um novo conjunto de vetores binários de expressão constitutiva foi feito usando um promotor 35S com região enhancer duplicada (e35S). 35S:MGAT1 #2 (pjP3346), 35S:MGAT2 #2 (pjP3347) e 35S:DGAT1 #2 (pjP3352) foram feitas primeiramente clonando o promotor e35S, contido dentro de um fragmento BamHI- EcoRI, nc: pORE04 nos sítios BamHI-EcoRI para produzir pjP3343. pjp3346 e pjP3347, em seguida, foram produzidos por clonagem dos genes MGATI e MGAT2, respectivamente, no sítio Ecori de pjP3343.
pjP3352 foi produzido por clonagem de DGATI de A. thaliana, contido ern um sítio Xhol-ZlsiSl, nos sítios XhoI-AsiSl de pjp3343.
[627]As pjP3346, pjP3347 e pjP3352 em cepa AGLI de Agrobacterium foram usadas para transformar N. benthamiana, conforme descrito acima. Catorze plantas transgênicas confirmadas foram recuperadas para pjP3346 e 22 para pjP334Í7. Um número de brotos transforrnados, resistentes a canamicina, foram gerados com pjP3352. A análise da expressão dos genes trans realizou-se nas plantas transformadas com MGATI ou MGAT2. Foram selecionadas píantas com altos níveis de expressão. Análise da expressão das plantas transformadas cora DGATI de A. thaliana DGAT é realizada. As plantas crescem normalmente e são cultivadas até maturidade. A semente é colhida quando madura. As sementes de descendência de alta-expressão são semeadas diretamente no solo para análise de lipídeos da população segregando T2, que inclui plantas homozigotas e heterozigotas. O conteúdo de óleo das folhas de plantas expressando altos níveis de MGATI ou de MGAT2 é significativamente maior em comparação com plantas transformadas com DGATI de A. thaliana ou plantas controles. Plantas transgênicas MGAT2 rnostraram um aurnento significativo no ácido graxo insaturado 18:1 e 1 °5 em relação ao aumento no teor de ácido graxo total em comparação aos eventos nulos (Tabela 7).
[628]pjP3346, pjP3347 e um vetor de controle em AGLI também foram utilizados para transformar A. thaliana, conforme descrito acima. Vinte e cinco plantas transgênicas de T2 confirmadas, compreendendo o T-DNA de pjP3346 e 43 plantas transgênicas para pjP3347 foram identificadas. Análise da expressão foi realizada nas plantas transgênicas. Sementes de descendência de alta- expressão foram colhidas e semeadas diretamente no solo. Foi realizada a análise de lipídeos, incluindo o conteúdo de óleo d.as folhas da descendência de T2 e T3, incluindo das segregantes deficientes dos genes trans. Os níveis os mais elevados de TAG foram obtidos nas plantas que são homozigotas para os transgenes de MGAT.
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[629]Trinta plantas de cada linhagem transgênica foram crescidas em um arranjo aleatório na estuda com as plantas de controle parental. Sementes T2 foram analisadas para teor de óleo e apresentaram um aumento de cerca de 2% no teor de óleo (nível de ácido graxo total) em comparação ao teor de ácido graxo total de sementes parentais (Figura 8).
Expressão de MGATI em plantas de TrifoHum repens estavelmente transformadas
[630]Um gene quimérico que codifica para MGATI de M. musculus foi usado para transformar Trifolium repens, outra planta de dicotiledôneas. Vetores contendo os genes quiméricos 35S:MGAT1 e 35S:DGAT1 foram introduzidos em A. tumefaciens através de um procedimento padrão de eletroporação. Ambos os vetores também contêm um gene marcador de seleção 35S:BAR. As células de Agrobacterium transformadas foram cultivadas em meio LB sólido suplementado com canamicina (50 mg/L) e rifampicina (25 mg/L) e incubadas a 28°C durante dois dias. Uma única colônia foi usada para iniciar uma cultura fresca para cado constructo. Após vigorosa cultura de 48 horas, as culturas de Agrobacterium foram usadas para tratar cotilédones de T. repens (cv. Haifa) que tinham sido dissecados de sementes embebidas conforme descrito por Larkin et al. (1996). Co-cultivados pelos seguintes três dias, os explantes foram expostos a 5 mg/L de PPT para selecionar brotos transformados e então transferidos para meio de enraizamento para formar raízes, antes da transferência para o solo. Obteve-se uma planta transformada contendo MGATI. O promotor 35S é constitutivamente expresso nas células das plantas transformadas. O conteúdo de óleo está aurnentado pelo menos nos tecidos vegetativos como folhas.
Expressão de MGAT em Hordeum vulgare estavelmente tra-nsformado
[631] Um vetor quimérico incluindo MGATI de M. musculus foi usado para produzir a transformação estável de Hordeum vulgare, uma planta monocotiledônea. Os vetores contendo os genes quiméricos Ubi:MGAT1 e Ubi:DGAT1 foram construídos mediante clonagem de MGATI de M. musculus inteiro e regiões codificantes de DGATI de A. thaliana separadamente em pwVEC8-Ubi. Vetores contendo os genes quiméricos Ubi:MGAT1 e Ubi:DGAT1 foram introduzidos em cepa AGLI de A. tumefaciens através de procedimento padrão de eletroporação. As células de Agrobacterium transformadas foram cultivadas em meio LB sólido suplementado com canamicina (50 mg/L) e rifampicina (25 mg/L) e as placas incubadas a 28°C durante dois dias. Uma única colônia de cada uma foi usada para iniciar as culturas frescas.
[632]Após cultura vigorosa de 48 horàs, as culturas de Agrobacterium foram usadas para transformar células de embriões imaturos de cevada {cv. Golden Promise) de acordo com os métodos publicados (Tingay et al., 1997; Bartlett et al., 2008) com algumas modificações. Brevemente, embriões entre 1,5 e 2,5 mm de comprimento foram isolados de cariopses imaturas e os eixos embrionários removidos. Os explantes resultantes foram co- cultivados por 2-3 dias com o Agrobacterium transgênico e depois cultivados na obscuridade por 4-6 semanas nos rrieios que contêm o timentin e o higromicina para gerar o calo embriogênico antes de ser movido para meios de transição em condições de luz baixa por duas semanas. O calo foi então transferido para meio de regeneração para permitir a regeneração de brotos e raízes, antes da transferência para o solo. Plantas transformadas foram obtidas e transferidas para a estufa. A região codificante MGATI foi expressa constitutivamente sob o controle do promotor Ubi nas células das plantas transformadas. As plantas transgênicas foram geradas e seus tecidos analisados para teor de óleo. Devido ao baixo número de eventos transgênicos em uma primeira transformação, nenhuma conclusão estatisticamente significativa poderia ser tirada dos dados.
[633]A região codificante do gene MGAT2 de camundongo, códon-otimizado para a expressão em células de plantas, é substituída para o MGATI nos constructos mencionados acima e introduzida em Hordeum conforme descrito acima. Tecidos vegetativos das plantas transgênicas resultantes estão aumentados no conteúdo de óleo. Expressão do MGAT em células de levedura
[634]Um vetor quimérico incluindo MGATI de M. musculus foi usado para transformar levedura, neste exemplo Saccharomyces cerevisiae, um micróbio fúngico apropriado para a produção de óleo por fermentação. Um constructo genético Gall: MGATI foi feita através da inserção de toda a região de codificação de um constructo designada 0954364 MGAT_pMA, contido em um fragmento — de EcoRI, em pYES2 no sítio Ecori, gerando pjP3301. Da mesma forma, um constructo genético Gal1:DGAT1, usada aqui como urna comparação e separadamente codificando para a enzima DGATI de A.
thaliana foi feita inserindo toda a região codificante DGATI de A. thaliana eín pYES2. Estes vetores quiméricos foram introduzidos em cepa S288C de S. cerevisiae por choque térmico e os transformantes foram selecionados em placas com meio mínimo de levedura (YMM) contendo 2°5 de rafinose como fonte única de carbono. Culturas de inóculo clonal estabeleceram-se em YMM líquido com 2% de rafinose como fonte única de carbono. Culturas experimentais foram inoculadas a partir deste meio YMM contendo 1% NP-40, para um OD600 inicial de cerca de 0,3. Culturas foram cultivadas a 28°C, com agitação (cerca de 100 rpm) até OD600 aproximadamente de 1,0. Neste ponto, a galactose foi adicionada em urna concentração final de 2% (p/v)- Culturas forarn incubadas a 25°C, com agitação por mais 48 horas antes da colheita por centrifugação. Os sedimentos de células foram lavados com água antes de serem liofilizados para o fracionamento ,de tipos de lipídeos e análise de quantificação. conforme descrito no Exemplo
1. O promotor Gal é expresso induzivelmente em células de levedura transfcrmadas, aumentan.do o conteúdo de óleo nas células.
[635]A região codificante do gene MGAT2 de camundongo, códon-otimizado para a expressão em células de leveduras, é substituído para o MGATI nos constructos mencionados acima e introduzido em leveduras. As células transgênicas resultantes estão aumentadas no conteúdo de óleo. Os genes são também introduzidos na levedura oleaginosa, Yarrowia lipolytica, para aumentar o conteúdo de óleo.
Expressão de MGAT em células de alga Chlamvdomonas reinhardtii
[636] Um vetor quimérico incluindo MGATI de M. inusculus é usado para transformar estavelmente células de algas. Os constructas genéticas designadas 35S:MGAT1 feita por clonagem da região codificante para MGATI em um vetor de clonagem contendo um cassete de promotor 35S do vírus mosaico couve-flor e um gene de resistência a paramomicina (aminoglicosídeo-O- fosfotransferase VIII) expressado por um promotor RBCS2 de C. reinhardtii. 35S:MGAT1 é introduzido separadamente em uma cultura logarítmica de 5xl07cc503, uma cepa de Chlamydomonas reinhardtii deficiente de parede celular por um método de contas de vidro rnodificado (Kindle, 1990). Ambos os vetores também contêm o gene de resistência BLE como um gene marcador de seleção. Brevemente, uma colônia de células não transformadas em uma placa de ágar TAP rnantida a cerca de 24°C é cultivada até cerca de 5x106 células/mL durante quatro dias, as células resultantes são precipitadas a 3000 g por 3 minutos em temperatt'ra ambiente e resuspendidas para produzir 5x107 células em 300 uL de meio TAP. 300 uL de contas de vidro de diâmetro 0,6 mm, 0,6 µg de plasmídeo em 5µL e 100 µL 20% PEG MW8000 são adicionados e a mistura é vortexada na velocidade máxima por 30 segundos, em seguida, transferida para 10 rriL de TAP e incubada durante 16 horas com agitação no escuro. As células são precipitadas, ressuspendidas em 200 µL da TAP, logo plaqueadas em placas com TAP contendo 5 mg/L de zeocina e incubadas no escuro por 3 semanas. As colônias transforrnadas são repicadas para placa com TAP fresco + 5 mg/L de zeocina, depois as quais são cultivadas em condições de meio padrão com seleção de zeocina. Depois de colhidas por centrifugação, os precipitados de célu'las são lavados com água antes de serem liofilizados para o fracionamento de tipos de lipídeos e análise de quantificação conforme descrito no Exemplo 1. O promotor 35S:MGAT1 é constitutivamente expresso nas células de algas transformadas. O conteúdo de óleo das células é significativamente maior.
[637]A região codificante do gene MGAT2 de camundongo, códon-otimizado para a expressão em células de plantas, é substituído para o MGATI nos constructos rnencionadas acima e introduzido em Chlamydomonas. O conteúdo de óleo das células transgênicas resultantes é significativamente maior. Expressão do MGAT em Lupinus angustifolius transformado estavelmente
[638]0 vetor quimérico incluindo MGATI de M. musculus é usado para transformar Lupinus angustifolius, uma planta leguminosa. Vetores qui-mérico 35S:MGAT1 e 35S: DGATI no Agrobacterium são usados para transformar L. angustifolius conforme descrito por Pigeaire et al. (1997). Brevemente, explantes de ápice de broto são co-cultivados com Agrobacterium transgênico antes de ser completamente molhadas com solução PPT (2 mg/ml) e transferidos para um meio de regeneração PPT-livre. Os múltiplos brotos axilares desenvolvidos a partir de ápices de brotos são extírpados em um meio contendo 20 mg/L PPT e os brotos sobreviventes transferidos para meio fresco contendo 20 mg/L PPT. Os brotos saudáveis são transferidos então ao solo. O promotor 35S é expresso constitutivamente nas células das plantas transformadas, aumentando o conteúdo de óleo em tecidos vegetativos e sementes. Um promotor específico de semente é usado para aumentar o conteúdo de óleo em sementes de Lupinus transgênicas.
[639]A região codificante do gene MGAT2 de camundongo, códon-otirnizado para a expressão em células de plantas, é substituído para o MGATI nos constructos mencionados acima e introduzido em Lupinus. Sementes e tecidos vegetativos das plantas transgrânicas resultantes estão aumentados no conteúdo de óleo.
Expressão de MGAT células estavelmente transformadas de Sorghum bicolor
[640] Um vetor quimérico incluindo MGATI de M. musculus é usado para transformar estavelmente Sorghum bicolor. Ubi:MGAT1 e Ubi:DGAT1 em cepa AGLI de A. tumefaciens são usadas para transformar Sorghum bicolor conforme descrito por Gurel et al. (2009). O Agrobacterium primeiro é centrifugado a 5.000 rpm a 4°C por 5 minutos e diluído para OD55C = 0,4 com meio líquido de co-cultura. Embriões imaturos previamente isolados são então cobertos completamente com a suspensão de Agrobacterium durante minutos e, em seguida, cultivados, com lado do escutelo para cima, no meio de co-cultivo no escuro por 2 dias a 24°C. Os embriões imaturos são então transferidos para meio de indução de calos (CIM) com 100 mg/L de carbenicilina para inibir o crescimento de Agrobacterium e deixar por 4 semanas. Tecidos são então transferidos para meio de regeneração para brotos e raiz.
O promotor Ubi é expresso constitutivamente nas células das plantas transformadas, aumentando o conteúdo de Óleo em pelo menos os tecidos vegetativos.
[641]A região codificante do gene MGAT2 de camundongo, códon-otimizado para a expressão em células de plantas, é substituído para o MGATI nos constructos mencionadas acima e introduzido em Sorghum. Tecidos vegetativos das plantas transgênicas resultantes estão aumentados no conte'ido de óleo.
Expressão do MGAT em plantas estavelmente transformadas de Glycine max
[642] Um gene quimérico que codifica para MGATI de M.
musculus é usado para transformar estavelmente Glycine max, outra leguminosa que pode ser utilizada para produção de óleo.
35S:MGAT1 em Agrobacterium é usado para transformar G. max, conforme descrito por Zhang et al. (1999). O Agrobacterium é co- cultivadc por três dias com explantes cotiledonares derivados de mudas de cinco dias de idade. Os explantes, erü seguida, são cultivados eni meio B5 de Gamborg suplementado com 1,67 mg/L de BAP e 5,0 mo/L de glufosinato por quatro semanas depois as quais os explantes são repicados para meio contendo sais de MS maiores e menores e vitaminas B5 (MS/B.5) suplementado com 1,0 mg/L de zeatina-ribosídeo, 0,5 mg/L de GA3 e 0,1 mg/L de IAA alterada com 1,7 mg/L, ou 2,0 mg/L de glufosinato. Brotos alongados estão enraizados num meio de enraizamento MS/B5 suplementado com 0,5 mg/L de NAA sem seleção posterior com glufosinato. O promotor 35S é expresso constitutivamente nas células das plantas transformadas, aumentando o conteúdo de óleo em tecidos vegetativos e sementes.
[643]A região codificante do gene MGAT2 de camundongo, códon-otimizado para a expressão em células de plantas, é substituído para o MGATI nos constructos mencionadas aciraa e introduzido em Glycine. Sementes e tecidos vegetativos das plantas transgênicas resultantes estão aumentados no conteúdo de óleo. Expressão do MGAT em Zea mays estavelmente transformada
[644] Um gene quimérico que codifica para MGATI de M. musculus é usado para a transformação estável de Zea mays. Os vetores que inclui 35S:MGAT1 e 35S:DGAT1 são usados para transformar Zea mays conforme descrito por Gould et al. (1991).
Brevemente, explantes de ápice de brotos são co-cultivados com Agrobacterium transgênico por dois dias antes de ser transferido para um meio salino MS contendo canamicina e carbenicilina. Após várias rodadas de sub-cultura, raízes e brotos transformados espontaneamente se formam e são transplantados para o solo. O promotor 35S é expresso nas células das plantas transformadas, aumentando o conteúdo de óleo nos tecidos vegetativos e nas sementes.
[645]A região codificante do gene MGAT2 de camundongo, códon-otimizado para a expressão em células de plantas, é substituíd.o para o MGATI nos constructos mencionadas acima e introduzido em Zea mays. Sementes e tecidos vegetativos das plantas transgênicas resultantes estão aumentados no conteúdo de óleo. Alternativamente, as regiões codificantes MGAT são expressas sob o controle de um promotor específico de endosperma como o promotor de zeina, ou um promotor específico de embriões obtidos a partir de uma planta monocotiledônea, para expressão aumentada e para o conteúdo aumentado de óleo nas sementes. Outro gene quimérico que codifica uma GPAT com atividade Eosfatase, corno GPAT4 ou GPAT6 de A. thaliana é introduzido em Zea mays em combinação com o MGAT, aumentando ainda mais o conteúdo de óleo em sementes de milho.
Expressão do MGAT em Elaeis guineensis (óleo de palma) transformada estavelmente
[646]Um gene quimérico que codifica para MGATI de M. musculus é usado para a transformação estável de Elaeis guineensis. Vetores quiméricos designados Ubi:MGAT1 e Ubi:DGAT1 em Agrobacterium são usados. Após vigorosa cultura de 48 horas, as células são usadas para transformar Elaeis guineensis, conforme descrito por Izawati et al. (2009).. O promotor Ubi é expresso constitutivamente nas células das plantas transformadas, aumentando o conteúdo de óleo pelo menos nos frutos e nas sementes e pode ser usado para obter óleo.
[647]A região codificante do gene MGAT2 de camundongo, códon-otimizado para a expressão em células de plantas, é substituído para o MGATI nos constructos mencionadas acima e introduzido em Elaeis. Sementes das plantas transgênicas resultantes estão aumentadas no conteúdo de óleo. Expressão do MGAT em Avena sativa (aveia) transformada estavelmente
[648] Um gene quimérico que codifica para MGATI de j'q. musculus é usado para transformar estavelmente Avena sativa, outra planta monocotiledônea. Vetores quirnéricos designados Ubi:MGAT1 e Ubi:DGAT1, conforme descrito acima e ambos contendo um marcador de seleção Ubi:BAR, são usados para transformar a
Avena sativa, conforme descrito por Zhang et al. (1999).
[649]A região codificante do gene MGAT2 de camundongo, códon-otimizado para a expressão em células de plantas, é substituído para o MGATI nos constructos mencionados acima e introduzido em Avena. Sementes das plantas transgênicas resultantes estão aumentadas no conteúdo de óleo. Exeme1o 7: Desenho de um MGAT com atívídade DGAT
[650] Um MGAT com atividade DGAT alterada, especialmente atividade DGAT aumentada e atividade MGAT potencialniente aumentada pode ser desenhado para realizar mutagênese aleatória, mutagênese direcionada ou mutagênese de saturação no(s) gene(s) MGAT de interesse ou submetendo diferentes genes MGAT e/ou DGAT a embaralhamento de DNA. A função DGAT pode ser positivamente selecionada usando, por exemplo, uma cepa de levedura que tem urna exigência absoluta de complernentação de síntese de TAG quando alimentada com ácidos graxos livres como cepa H1246 que contém mutações nos quatro genes (DGAI, LROI, AREI, ARE2). Transformando as variantes MGAT em tal cepa e, em seguida, fornecendo a levedura transformada com uma concentração de ácidos .graxos livres que impede a complementação pelo gene MGAT selvagem só permitirá o crescimento de variantes com maior capacidade de síntese de TAG devido à atividade DGAT melhorada. A atividade MGAT destes genes mutantes pode ser determinada por alimentação marcada MAG sn-l ou sn-2 e quanti-ficar a produção de DAG marcada. Várias rodadas de evolução dirigida erri combinação com desenho racional de proteína resultaria na produção d.e um novo gene MGAT com atividades MGAT e. DGAT similares.
[651] O gene que codifica para o MGATI aciltransferase de M.
musculus foi subrnetido a PCR propensa a erros usando Taq DNA polimerase na presença de MnCl2 0,15 mM, para introduzir rnutações aleatórias. As regiões de codificação randomizadas foram então utilizadas como megainiciadores para amplificar todo o vetor de expressão de levedura utilizando condições de reação de PCR de alta fidelidade. O sequenciamento de 9099 pb de DNA recuperado mutagenizado revelou uma frequência de mutação de cerca de 0,8%, o que corresponde a 8 mutações por gene ou, em média, 5,3 substituições de aminoácidos por polipeptídeo. Toda a biblioteca mutagenizada foi transformada em E. coli DH5Cx para armazenamento a -80°C e a preparação de plasmídeo. O tamanho da biblioteca MGATI foi estimada em 3,8356E6 clones. Uma cópia da biblioteca MGATI foi transformada na cepa H1246 de levedura, resultando em um tamanho de biblioteca de clones 3E6. A biblioteca MGATI, bem como um controlo negativo pYES2, transformada em S. cerevisiae H1246, foram submetidos a 8 fases de seleção, cada urria consistindo em (re) diluindo as culturas em meio de indução mínima (1% + rafinose a 2% de galactose; diluída para OD600 = 0,35-0,7), na presença de graxo ácido livre C18:1, a uma concentração final de 1 MM. Os controles negativos consistiram em culturas idênticas cultivadas simultaneamente em meio mínimo contendo glucose (2%) e, na ausência de ácidos graxos livres C18:1. Depois de 8 fases de seleção, uma alíquota da biblioteca MGATI selecionada foi plaqueada em meio mínimo contendo glicose (2%). Um total de 120 colônias foram cultivadas em 240 µ1 de meio de indução mínimo em 96 placas de microtitulação e avaliados para a produção de lipídeo neutro, utilizando um ensaio de fluorescência Vermelho do Nilo como descrito por Siloto et al. (2009). Minipreps plasmídeo foram preparados a partir de 113 clones (= topo 6%) que apresentaram mais altos níveis TAG.
[652]A região de codificação MGATI inteira dos clones selecionados é sequenciada para identificar o número de mutantes originais e para identificar a natureza das mutações selecionadas. Mutantes MGATI únicas são novamente transformados em S. cerevisiae H1246 para ensaios in vitro de DGAT e MGAT usando MAG marcado e substratos C18:1, respectivamente (ver Exemplo 5). Variantes MGATI selecionadas demonstraram exibir atividade DGAT aumentada em comparação com aciltransferase tipo selvagem, enquanto atividade MGAT é, possivelmente, também aumentada.
[653]Variantes MGATI exibindo atividades de MGAT e/ou DGAT aumentadas são utilizadas como parentes em uma reação de embaralhamento de DNA. A biblioteca resultante foi submetida a um sistema de seleção semelhante ao descrito acima, resultando na melhoria da atividade de aciltransferase geral. Além disso, outros ácidos graxos livres além de C18:1 são adicionados ao meio de crescimento para selecionar para variantes MGATI exibindo especificidades alteradas de doadores de acil.
ExeInE1o + 8: ExEressão constítutíva de díacíLgm1.í,c,e,r,o.1, acíltransferase 2 de A. thalíana em pIantas
[654]A expressão de DGAT2 de A. thaliana em céiu)as de levedura (Weselake et al., 2009) e em células de í-nsetos (Lardizabal et al., 2001) não demonstrou atividade DgjíT. Da mesma forrna, o DGAT2 não foi capaz de complementar um DÇATI de A. thaliana .suprimida (Weselake et al., 2009). a atj!vidade enzimática do DGAT2 de A. thaliana no tecido de folha foi determinada utilizando um sistema de expressão transiente em N.
benthamiana, conforme descrito no Exemplo 1. O DGAT2 de A.
thaliana (adesão Q9ASU1) foi obtido por PCR genômico e clonado em um vetor de expressão binária sob o controle do promo:or 35S para gerar 35S:DGAT2. Os vetores quiméricos foram introduziram em cepçt AGLI de A. tumefaciens e as células de culturas destes infiltrados no tecido da folha de N. benthamiana plantadoG em um quarto de crescimento a 24°C utilizando 35S:DGAT1 como um controle. Várias comparações diretas foram infiltradas com as amostras que estão sendo comparadas localizadas em arnbos os lados da mesma folha. Foram realizados experimentos em triplicado. Após a infiltração, as plantas foram cultivadas por mais cinco dias antes que discos de folhas forarn tomádos e líofilizados para o fracionamento dos tipos de lipíjeos e análise de quantificação conforme descrito no Exemplo 1. Esta análise revelou que DGATI e DGAT2 estavam funcionando para aumentar os níveis de óleo da folha em Nicotiana benthamiana
(Tabela 8).
[655]Tecido da folha transformado com o constructo 35S:pl9 (controle-negativo) continha uma média de 25 µg TAG/1OO do peso seco da folha. Tecido da folha transformado com construções 35S:pI9 e 35S:DGAT1 (controle positivo) continham uma média de 241 µg TAG/IOO mg de peso seco da folha. Tecido da folha transformado com construções 35S:pI9 e 35S:DGAT2 continham uma média de 515 µg TAG/IOO mg de peso seco da folha.
[656]Os dados descritos acima demonstram que a enzima DGAT2 de A. thaliana é mais ativa do que a enzima DGATI de A. thaliana para promciver o acúmulo de TAG no tecido de fclha. A exoressão do gene DGAT2 resultou no acúmulo em 229% mais de TAG no tecido de folha, comparado a quando a quantidade de TAG de DGATI super expresso foi definido com 100% relativo (Figura 9).
[657]Os tecidos de folha de N. benthamiana transitoriarnente transformados expressando P19 isolado (controle), ou P19 com AtDGAT1 ou AtDGAT2 também foram utilizados para preparar microssomas para ensaios in vitro de atividade enzimática. Um ensaio bioquíinico DGAT foi realizado utilizando microssomas correspondentes a 50 µg de proteína e adição de 10 nmol de
[14]C6:0-DAG e 5 nmoles de acil-CoA, em 50 mM de tampão Hepes, pH 7,2, contendo 5 mM de MgCl2, e 1% BSA, em um volume final de 100 µL para cada ensaio. Os ensaios foram conduzidos a 30°C durante 30 minutos. Lipídeo total de cada ensaio foi extraído e as amostras carregadas em placas de TLC, que foram desenvolvidas utilizando uma mistura de solvente hexano:DEE:Hac (70:30:1 vol:vol:vol). A quantidade de radioatividade em manchas de DAG e TAG foi quantificada por medição Phosphorlmage. A percentagem de DAG convertido para TAG foi calculado para cada uma das preparações de microssomos.
[658]Alguma atividade DGAT endógena foi detectada nas folhas de N. benthamiana, como o ensaio controle de P19 rnostrou baixos níveis de produção TAG. A expressão de AtDGAT1 gerou maior atividade DGAT em relação ao controle P19 quando os ensaios foram suplernentadas com C18:1-CoA O'-l C18:2-COA, ma," não quando suplementado com C18:3-COA, em que os níveis de TAG para a controle P19 e o AtDGAT1 forani serrielhantes. No entanto, em todos os ensaios microssomais quando AtDGAT2 foi expresso em tecidos de folha, níveis n'.ais elevados de atividade de DGAT (produção TAG) foram observados em comparação com os microssomas AtDGAT1. Maiores níveis de produção TAG foram observados quando os microssomas foram suplementados com C18:2-COA ou C18:3-CoA em relação ao C18:1-CoA (Figura 10). Isto indicou que DGAT2 tinha uma preferência diferente do substrato, em particular para C18:3-COA (ALA), de DGATI.
ExeInEIo 9: Co-exEressão de MGAT _e _ G,PAT em _ s,eme,n,tes transAênícas
[659] Yang et al. (2010) descreveram dois glicerol-3-fosfato aciltransferases (GPAT4 e GPAT6) de A. thaliana ambos com uma preferência de sn-2 (ou seja, preferencialmente formando MAG,sn- 2, em vez de MAG sn-1/3) e atividade fosfatase, que foram capazes de produzir sn-2 MAG a partir de G-3-P (Figura 1). Estas enzimas foram propostas ser parte da rota metabólica da síntese de cutina. GPAT4 e GPAT6 não tiveram uma alta expressão em tecido de semente. A combinação de tal GPAT/fosfatase bifuncional com MGAT gera uma nova rota de síntese de DAG usando o G-3-P como um substrato que pode substituir cju compíementar a rota típica de Kennedy para síntese de DAG em plantas, especialmente em sementes .oleaginosas, ou em outras células, o que resulta no incremento do conteúdo de óleo, em particular os níveis de TAG.
[660] DNAs quiméricos designados pjP3382 e pjP3383, que codificam para GPAT4 e GPAT6 de A. thaliana, respectivaniente, junt:amente com MGAT2 de M. musculus para a emressão em sementes de plantas, foram construídos inserindo primeiro a região codificante inteira de MGAT2, contido em urn fragmento Swal, em pjP3362 no sítio Smal para produzir pjP3378. O pjP3362 foi um vetor de expressão binário contendo cassetes de expressão FAEI e
FPl vazios e um gene de resistência à canamicina como marcador de, seleção. O GPAT4 de A. thaliana fo.i amplificado de cDNA e clonado em pjP3378 no sítio Noil para produzir pjP3382 ern que o GPAT4 foi expresso pelo promotor truncado napina, FPl, e a MGAT2 foi expressa pelo promotor FAEI de A. thaliana. Da mesma forma, GPAT6 de A. thaliana foi amplificado de CDNA e clonado em pjP3378 no sítio Notl para produzir pjP3384 em que o GPAT6 estava operacionalmente ligado ao promotor napin truncado, FPl, e MGAT2 foi expresso pelo promotor FAEI de A. thaliana. Os pjP3382 e pjP3383 foram transformados em A. thaliana (ecotipo Columbia) pelo método do mergulho floral. Sementes de plantas tratadas foram plaqueadas em meios contendo o antibiótico, canamicina, para selecionar as plantas progênie (plantas Tl) que foram transformadas. As mudas transgênicas foram transferidas para o solo e cultivadas em estufa. Determinou-se a expressão de transgenes no desenvolvimento de embriões. Plantas transgênicas com o nível mais elevado de expressão e que mostram uma relação de 3:1 para plantas transgênicas:não transgênicas por linha, indicativa de um único locus de inserção dos transgenes, são selecionadas e cultivadas até maturidade. Sementes são obtidas a partir dessas plantas (T2) que incluíram alguns que eram homozigotos para os transgenes. 30 a 32 (plantas T2) de cada linhagem foram cultivadas em vasos de solo em um arranjo aleatório na estufa de plantas controle, e o teor de lipídeo, teor de TAG e composições de ácido graxo da semente resultante foram determinados. O teor total de ácido graxo (conforme determinado a partir do total de FAME), em particular o teor de TAG das sementes que incluem um MGAT e um GPAT4 ou GPAT6 foi substancial e significativamente aumentado em quase 3% (nível absoluto) ou em cerca de 9°5 (aumento relativo) nos controles, e aumentou ení relação às sementes que compõem o MGAT sozinho ou DGATI sozinho de A. thaliana (Figura 11).
[661]A região de codificação do gene MGAT2 de carnundongo, códons otimizados para a expressão em células de plantas, foi introduzida ern Brassica napus, juntamente com um gene quimérico que coclifica GPAT4de Arabidopsis. As sementes de plantas transgênicas resultantes foram colhidas e alguns forarn analisadas. Os dados destas análises preliminares mostraram variabilidade no teor de óleo e composição de ácido graxo, provavelmente devido ao às plantas estarem crescendo em tempos diferentes e sob condições ambientais diferentes. As sementes são plantadas para produzir plantas descendentes, e as sementes descendentes são colhidas. ExemE1© lC): Ava1ía£ão do e£eít,o_de_G,PAT,4 e GpAT£_ngj .aume,n,t,o, de TAG medíado LEor MGAT =e1o síleneíamento e muta£ao de gpat
[662]A família de GPAT é grande e todos os membros conhecidos contêm dois dornínios conservados, um domínio plsC aciltransferase e um domínio hidrolase similar ao HAD. Além deste, GPAT4-8 de A. thaliana, todos contêm uma região N- terminal homóloga a um domínio fosfoserina fosfatase. Os GPAT4 e GPAT6 de A. thaliana ambos contêm resíduos conservados que são conhecidos por serem essenciais para a atividade fosfatase (Yang et al., 2010).
[663] Iniciadores degenerados com base na sequência de aminoácidos conservados GDLVICPEGTTCREP (SEQ ID NO:228) foram desenhados para amplificar fragmentos de GPAl's de N. benthamiana expressos eni tecido de foíha. 3' RACE será realízado usando esseS inicia.dores e iniciadores reversos de ,oligo-dT em RNA isolado do tecido de folha de N. benthamiana. GPATS com a atividade fosfatase (ou seja, GPAT4/6-semelhante) serão identificados por sua homologia com a região do dornínio N- terminal da fosfoserina fosfatase descrita acima. Os constructos RNA1 dirigidas pelo 35S que são alvos destes genes serão geradas e transformadas em cepa AGLI de A. tumefaciens. Da rnesma forma, um constructo 35S:V2 contendo a proteína viral supressora por silenciamento V2 será transformada em cepa AGLI de A. tumefaciens. V2 é conhecido por suprimir o mecanismo de silenciamento de planta nativa para permi.tir a expressão
W. 305/375 transiente eficaz, mas também permitir o silenciamento da função do gene baseado em RNA1.
[664] O acúmulo de TAG será comparado então entre as amostras de folha transientemente transformadas infiltradas com as seguintes misturas de cepa: 1) 35S:V2 (controle negativo); 2) 35S:V2 + 35S:MGAT2 (controle positivo); 3) 35S:V2 + GPAT-RNA1; 4) 35S:V2 + GPAT-RNA1 e 35S:MGAT2. Espera-se que a mistura 35S:V2 + GPAT-RNA1 + 35S:MGAT2 resultará em menos acúmulo de TAG do que a amostra 35S:V2 + 35S:MGAT2 devido à interrupção da síntese sn-2 MAG resultantes do silenciamento de GPAT.
[665]Um experimento semelhante será executado usando sequências semelhantes a GPAT 4/6 de a. thaliana e n. benthamiana que são mutadas para remover os resíduos ccÍnservados que são conhecidos por serem essenciais para a jatividade fosfatase (Yang et al., 2010). Estes genes mutados Qonhecidos coletivamente como GPAT4/6-delta) serão clonados errj vetores binários de expressão dirigida pelo 35S e serão trarjsformados então em A. tumefaciens. O acumulo de TAG será compaÍado então entre as amostras de folha transientemente trarjsformadas infiltradas com as seguintes misturas de cepa: 1) 35S:p19 (controle negativo); 2) 35S:p19 + 35S:MGAT2 (controle Elositivo); 3) 35S:p19 + GPAT4/6-de1ta; 4) 35S:p19+ GPAT4/6Ldelta + 35S:MGAT2. Espera-se que a mistura 35S:pI9 + GPAT4/G-delta + 35S:MGAT2 resultará em menos acúmulo de TAG do que jí amostra 35S:p19 + 35S:MGAT2 devido à interrupção da síntese sn-2 MAG resultantes da mutação de GPAT. Enquanto os geneq nativos GPZ\T4/6-semelhantes de N. benthamiana estarão presenÇes neste experimento, espera-se que a expressão eríi altj rjível dos constructos de GPAT4/6-delta vai concorrer corn jjs genes endógenos para aceder ao substrato G-3-P.
ExemE1o 11ressão constítutíva de um díací1±1ícero1 acíltransferase e fator de tFanscrí£ão YIRI1 em Á1u1as de E1,a,n,t,a,s,
[666] Um vetor designado 35S-pORE04 foi preparado Qtravés da inserção de um fragmento de Pstl que contérn um promotor 35S no local Sfol de vetor pORE04 depois tratamento com T4 DNA polimerase para cortar as extremidades (Cout et al., 2007). Um constructo genético 35S:Arath-DGAT1 que codifica o DGATI diacilglicerol aciltransferase de A. thaliana (. Bouvier-Nave et al, 2000) foi preparada. Exemplo 3 de WO 2009/129582 descreve o constructo de AtDGAT1 em pXZP163. Um fragmento de PCR amplificado com extremidades Kpnl e EcORV foi preparado a partir de pXZP163 e inserido em pENTR11 para gerar pXZP513E. A região de codificação inteira AtDGAT1 de pXZP513E contida dentro de um fragmento BamHI-EcoRV foi inserida em 35S-pORE04 no sítio Bam.4l- ECORV, gerando pjP2078. Um fragmento sintético, Arath-WRI1, que codifica para o fator de transcrição WRII de A. thaliana (Cernac e Benning, 2004), flanqueado por sítios de restrição ECORI e códon otimizado para B. napus, foi sintetizado. Um constructo genético designada 35S:Arath-WRI1 foi preparada por clonagem de toda a região codificadora de Arath-WRI1, flanqueada por sítios EcoRI em 35S-pORE04 no sitio Ecori gerando pjP3414. A expressão dos genes em tecido de folha de N. benthamiana foi realizada de acordo com o sistema de expressão transiente, tal como descrito no Exemplo 1.
[667] Quantificação dos níveis de TAG de folhas infiltrada de N. benthamiana por Iatroscan revelou que a expressão combinada dos genes DGATI e WRII de A. thaliana resultou em 4,5 vezes e 14,3 vezes maior teor de TAG ein comparação com a expressão de WRII e o controle negativo V2 respectivamente {Tabela 9). Isto corresponde a um rendimento médio e máximo observado de TAG por peso seco de folha de 5,7% e 6,51%, respectivamente (Tabela 9 e Figura 12). O aumento do óleo na folha não se deveu unicamente à atividade da aciltransferase DGATI super expressa como ficou evidente nos níveis TAG reduzidos quando WRII foi deixado de fora da cornbinação. Além disso, um efeito sinérgico foi observado considerado 48% do aumento total de TAG.
[668]Ambas os constructos de DGATI e WRII também levaram a um aumento dos níveis de ácido oleico à custa de ácido linoleico em fracções de TAG de folhas de N. benthamiana infiltradas (Tabela 10). Estes resultados confirmam descobertas recentes por Andrianov et al. (2010) que relataram mudanças sirnilares no TAG, fosfolipídeos e frações lipídicas de TFA de plantas transgênicas de tabaco transformadas com o DGATI aciltransferase de A. thaliana. No entanto, quando os genes DGATI e WRII foram co- expressos, um efeito sinérgico foi observado na acumulação de ácido oleico em folhas de N. benthamiana - este sinergismo foi responsável por uma estimativa de 52% do conteúdo total de ácido oleico, quand.o ambos os genes foram expressos. Os efeitos sinérgicos inesperados, em ambos acúmulo de TAG e os níveis de ácido oleico em folhas transgênicas de N. benthamiana demonstraram o potencial de, simultaneamente, regulação positiva de biossíntese de ácido graxo e captação de acil em lipídeo apolar como TAG em tecidos vegetativos, dois processos metabólicos que são altamente ativos no desenvolvimento de sementes oleaginosas.
[669]0 experimento de expressão transitória foi repeticío, exceto que a supressor de silenciamento viral p1g como substituto do supressor V2, e com a comparação cuidacijosa de amostras sobre a mesma folha para evitar qualquer variição da folha-a-folha. Para isso, um constructo 35S:P19 quiméricajpara a expressão da proteína supressora de silenciarnento viral dè vírus P19 de atrofia do tomateiro (Wood et al, 2009) foi apre!3entada separadamente em A. tumefaciens GV3101 para co-infiltraçãoj.
[670]Quantificação dos níveis de TAG de folhas infijLtradas de N. benthamiana por Iatroscan neste experimento reveloÇi que a expressão transitória combinada dos genes DGATI e WRI1i de A. thaliana resultou em 141 vezes teor de TAG aumentido em comparação ao controle negativo P19 (Fic'ura 13). l Quando comparada com a expressão dos genes DGATI e WRII separajíamente na mesma folha, a infiltração combinada aumentou os níYeis de
TAG em 17 e 5 vezes, respectivamente. Mais uma vez, a co- expressão de ambos os genes teve um efeito sinérgico (maior do que aditivo) sobre a acumulação de óleo na folha coin o componente sinérgico representando 73% do aumento total de TAG.
A maior extensão do aumento do teor de TAG neste experirnento (141 vezes) em comparação com a experiência anterior (14,3 vezes), pode ter sido devido ao uso do supressor de silenciamento de P19 em vez de V2 e, por conseguinte, um aumento da expressão de genes a partir dos transgenes.
[671]A Tabela 11 mostra a composição erri ácido graxo da TAG.
Quando os genes DGATI e WRII foram co-expressos em N.
benthamiana, um efeito sinérgico foi mais uma vez observado no nível da acumulação de ácido oleico na fração TAG de folha. Este aumento foi em grande parte à custa de ácidos c[raxos insaturados de cadeia média de ácido palmítico e ácido esteárico (Tabela 11). O ácido linoleico, também foi aumentado o que pode ser explicado pelos níveis mais elevados de substrato de ácide oleico disponível à FAD2 A12-dessaturase endóoeno. Expressão individual dos genes DGATI e WRII em N. benthamiana levou a alterações intermediárias no perfil de TAG sem aumento. tão grande do ácido oleico. Além disso, mas em contraste com o primeiro experimento, os níveis mais elevados de ácido a- linolênico (ALA) foram detectados enquanto esta foi observada em menor grau, sobre a co-expressão de DGATI e WRII em tecido de folha.
[672]0 efeito sinérgico observado de expressão de DGATI e WRI1 em biossíntese TAG foi confirmado em mais detalhe por meio da comparação do efeito da introdução em N. benthamiana de ambos os genes individualmente ou em combinação, erri comparação com a introdução de um gene de Pí9 por si só, como um controle, no interior da mesma folha. Isto foi benéfico na redução da variação de folha a folha. Além disso, o número de repetições foi aumentado para 5 e as amostras foram recolhidas através de folhas diferentes a partir da mesma planta para mèlhorár a qualidade dos dados. Os resultados são apresentados na Tabela
12.
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Tábela 12. Comparação de WRII + dgati junto com os rnesmos genes únicos Combinação de gene )Nível TAG (% peso) Razão (comparado aj ! seco) ! P19) P19 (controle) 0,01 ± 0,00 1 P19+WRI1 jo,08 ± 0,04 I8 P19+DGAT1 l 0,27 ± 0,03 i 27 P19+WRI1+DGAT1 I 1,29 ± 0,26 I 129
[673] Com base nos efeitos individuais de ambos os genes WRII e DGATI após expressão em N. benthamiana e, na presença de um mero efeito aditivo, mas a ausência de qualquer efeito sinérgico, os presentes inventores esperaram um nível de cerca de 0,35 TAG ou um aumento de 35 vezes em relação ao controle negativo P19. No entanto, a introdução de ambos os genes resultou em níveis de TAG que foram 129 vezes maiores do que o controle de P19. Com base nestes resultados, os presentes inventores estimaram o efeito aditivo e o efeito sinérgico sobre a acumulação de TAG como 26,9% e 73,1%, respectivamente. Além disso, quando a composição de ácido graxo do lipídeo total nas amostras de folha foi analisada por GC, um efeito sinérgico foi observado em níveis de C18: j^9 na fração TAG de folhas infiltradas de N. benthamiana corn WRII. e DGATI (3 repetições cada). Os dados são mostrados na Tabela 11.
[674] Para a expressão específica de sementes da combinação de WRII + DGATI, Arabidopsis thaliana foi transformada com um constructo de vetor binário incluindo um DNA quimérico tendo ambos genes pFAEI::WRII e pCln2::DGAT1, ou, para comparação, os genes individuais pFAEI::WRII ou pCln2::DGAT1. As sementes Tl foram colhidas a partir de plantas. O teor de óleo das sementes é determinado. As sementes têm um maior teor de óleo.
ExemE1o 12. ExEressão constítutíva de um monoací1£1ícero1 acíltransferase e fator de transcrí£ão WRII em células de Eaantas
[675] Um DNA quimérico que codifica para Mus musculus MGAT2
" (Cao et al, 2003; Yen e Farese, 2003) e para B. napus otimizado por códon foi sintetizado por Geneart. Um constructo genético designada 35S:Musmu-MGAT2 foi preparada através da inserção de toda a região codificadora de 1022341 MusmuMGAT2, contida dentro de um fragmento ECoRI, em pjP3343 ng .sítio de EcoRI, ,gerando pjP3347. Clonagem do constructo 35S:Arath-WRI1 é descrita no Exemplo 11. A expressão transitória em tecido de folha de N. benthamiana foi realizada como descrito no Exemplo 1.
[676]Quando o MGAT2 de camundongo e o vetor de transcrição WRII de A. thaliana foram co-expressos, os níveis médios de TAG em folha de N. benthamiana aumentaram 3,3 vezes em c.omparação com a expressão de WRII isolado (Tabela 13). Além disso, a expressão dos dois genes resultou em um pequeno {29%) efeito sinérgico sobre a acumulação de TAG na folha. O nível TAG obtido com o gene MGAT2 na presença de WRII foi 3,78% como quantificado por Iatroscan (Figura 12). Os resultados semelhantes obtidos com aciltransferases MGAT2 animal e DGATI vegetal em combinação com o WRII de A. thaliana sugere que um efeito sinérgico pode ser um fenômeno geral, quando WRI e aciltransferases são sobre- expressos em tecidos de plantas vegetativas não acumuladores de óleo.
[677]0 experimento foi repetido para introduzir construções para expressar V2+MGAT2 em comparação com V2+MGAT2+WRI1, de modo a que as amostras da folha infiltradas foram reunidas em três folhas a partir da mesma planta, para duas plantas de cada um.
No total, cada combinação, portanto, tinha 6 infiltrações replicadas. Isto produziu um desvio padrão inferior do que agrupar amostras de folha entre plantas diferentes, como foi feito nos primeiros experimentos. Os dados deste experimento são mostrados na Tabela 14. Foram confirmados os resultados anteriores {Tabela 13). Embora os níveis de TAG absolutos sejam diferentes (inerentes ao ensaio Benth e também diferente agrupamento de amostras), aumento relativo em TAG quando WRII é co-expresso com V2 + MGAT2 são similares (2,45 e 2,65 vezes).
ExemE1o 13. ExEressão constítutíva de um monoaci1q1ícero1 ací1trans£erase, díacilq1íeero1 acíltransferase e fator de transQrí£ão WRII em células de _R1antas
[678] Os genes que codificam para a diacilglicerol aciltransferase de DGATI de A. thaliana, o monoacilglicerol aciltransferase MGAT2 de camundongo e o WRII de A. thaliana foram expressos em diferentes cornbinações em tecido de folha de N. benthamiana de acordo com o sistema de expressão transitório, como descrito no Exemplo 1. Urna descrição detalhada das diferentes construções pode ser encontrada nos Exemplos 11 e 12.
[679]A expressão combinada dos genes DGATI, WRII e MGAT2 resultou em quase 3 vezes maior aumento médio de TAG quando comparada com a expressão destes últimos dois' (Tabela 15). O rendimento de TAG máximo observado obtido foi de 7,28%, como quantificados por Iatroscan (Figura 12). Níveis de TAG em folha não foram afetados significativamente quando o gene da MGAT2 aciltransferase de camundongo foi deixado de fora dessa combinação. Os resultados descritos no Exemplo 16, no entanto, demonstraram claramente o efeito positivo da MGAT2 de camundongo sobre a biossíntese de lipídeos neutros em folhas de N. benthamiana, quando expressos em combinação com WRII, DGATI e a proteína oleosina de Sesamum indicum.
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[680]Dados adicionais foram obtidos a partir de uma novo experimento onde as amostras da folha foram agrupadas com folhas da mesma planta, 6 repetições de cada uma. Os dados são mostrados na Tabela 16. Tabela 16. Teor de TAG de amostras de folhas infiltradas de N. benthamiana. Combinação de gene TAG (% peso seco) Razão V2+MGAT2+DGAT1 1,08 ± 0,1 2,06 V2+MGAT2+DGAT1+ 2,22 ± 0,31
WRII ExeInE1o 14. ExEressão constitutíva de um monoacíIA1íeero1 acíltransferase, díací1A1ícero1 acíltransferase e fator de transcrí£ão WRII e ^1ícero1-3-fo.s.f,a.t,o _ a,c,i.1.t,r,a,n.s.£,e,r,a,s,e _ em _ c,é,1,u,1,a,s, de =Iantas
[681]Um constructo genético 35S: GPAT4 foi preparado por clonagem do gene GPAT4 (Zheng et al, 2003) de A. thaliana a partir de RNA total isolado a partir de siliques em desenvolvimento, seguido por inserção de urrí fragmento ECORI em pjP3343 resultando em pjP3344. Outros constructos são descritas nos Exemplos 11 e 12. Expressão transitória em tecido de folha de N. benthamiana foi realizada como descrito no Exemplo 1.
[682]A expressão transitória do GPAT4 aciltransferase de A.
thaliana em combinação com MGAT2, DGATI e WRII levou a um pequeno decréscimo no conteúdo de TAG de folha de-N. benthamiana quantificada por Iatroscan (Tabela 17). O nível de TAG (5,78%) também demonstrou ser mais baixo quando GPAT4 foi incluído na mistura de infiltração (Figura 12). No entanto, este achado não exclui a hipótese de síntese. sn2-MAG de G3P como catalisada pela aciltransferase GPAT4. Em vez disso, isto sugere que esta etapa catalítica é improvável que seja limitante da taxa no tecido de folha devido aos níveis elevados de expressão do gene endógeno GPAT4 (Li et al. 2007). Além disso, o GPAT8 aciltransferase de A. thaliana apresenta um perfil de expressão semelhante como GPAT4 e demonstrou apresentar uma sobreposição de funções (Li et ai., 2007). Em sementes em desenvolvimento os níveis de GPAT4 e GPAT8 são baixos.
Como resultado, a co-expressão de GPAT4 em um contexto de sementes pode ser crucial para garantir substrato sn2-MAG suficiente para uma MGAT aciltransferase heteróloga expressa.
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[683]Dados adicionais forarn obtidos a partir de'uma novo experimento onde as amostras da folha foram agrupadas com folhas da mesma planta, 6 repetições de cada uma. Os dados são mostrados na Tabela 18. Tabela 18. Teor de TAG de amostras de folhas infiltradas de N. benthamiana. Combinação de gene TAG (% peso Razão seco) V2+MGAT2+DGAT1 1,54 ± 0,36 1,01 V2+MGAT2+DGAT1+GPAT4 1,56 ± 0,18 Exemp1c 15. Expressão constítutíva de um monoací1g1íceroí acíltransferase, díací1q1ícero1 acíltransferase e £atDr de transcrí£ão WRII e em constru£ão de sílencíamento de AGPase- bs2RNAí células de E1antas
[684] Um fragmento de DNA correspondente aos nucleotídeos 595-1187 do mRNA que codifica pequena subunidade de AGPase de Nicotiana tabacum {DQ399915) (Kwak et al., 2007) foi sintetizado. O fragmento 1118501 NtAGP de 593 bp fragmento foi primeiro cortado com NcoI, tratado corn fragmento de DNA polimerase I grande (Klenow) para gerar extremidades 5' sem corte e, finalmente, digeridos com Xhol. Do mesmo modo, o vetor de entrada pENTR11-NcoI foi primeiro digerido com BamHI, tratado com fragmento de DNA polimerase I grande (Klenow) e cortado com Xhol. Ligação de inserto 1118501 NtAGP em pENTRII-NCOI geEou o clone de entrada pENTR11.-NcoI-NtAGP. A recombinação LR entre o clone de entrada pENTR11-NCOI-NtAGP e .o vetor. de destino pHELLSGATE12 gerou pTV35, um vetor binárío contendo a cassete NtZiGPase RNA1 sob o controle do prornotor 35S. Outros constructos são descritas nos Exemplos 11 e 12. Expressão transitória em tecido de folha de N. benthamiana foi realizada como descrito no Exemolo 1. "
[685] Expressão do constructo de silenciamento de AGPase de N. tabacum juntamente com os genes que codificam para MGAT2 e WRI resultou em um aumento de 1,7 vezes nos níveis de TAG em folha como quantificado por Iatroscan (Tabela 19). Na ausência de MGAT2 aciltransferase níveis de TAG caíram quase 3 vezes.
Portanto, o aumento de TAG observado não pode ser atribuído exclusivamente ao silenciamento do gene AGPase endógena de N. benthamiana. Surpreendentemente, substituindo MGAT2 para a DGATI de A. thaliana não alterou os níveis TAG em folhas infiltradas de N. benthainiana em combinação com o constructo de silenciamento de AGPase de N. tabacum. Silenciamento de AGPase de N. benthamiana, por conseguinte, parece ter um diferente efeito metabólico em MGAT e DGAT aciltransferases. Uma diferença semelhante também é observada nos níveis máximos observados de TAG com WRII e o constructo de silenciamento de AGPase em combinação com MGAT2 ou DGATI rendendo 6,16% e 5,51% de óleo de folha respectivamente (Figura 12). .
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[686]A superexpressão de WRII e MGAT em cornbinação com silenciamento de AGPase é particularmente promissora para aumentar os rendimentos de óleo em tecidos que acumulam amido. Exemplos incluem tubérculos como batatas, e o endosperma dos cereais, potencialmente levando aos cereais corn rnaior teor de óleo nos grãos (Barthole et al., 2011). Embora os genes AGPase de N. tabacum e N. benthamiana sejam susceptíveis de terem identidade de sequência significativa, é provável que um constructo AGPase-hpRNAi de N. benthamiana elevará ainda mais os rendimentos de TAG devido à maior eficiência de silenciamento. [68'7] Dados adicionais foram obtidos a partir de uma novo experimento onde as amostras da folha foram agrupadas com folhas da mesma planta, 6 repetições de cada uma. Os dados são mostrados na Tabela 19 e 20. Tabela 20. Teor de TAG de amostras de folhas infiltradas de N. benthamiana. Combinação de gene |TAG (% pesoj Razão I seco) V2+MGAT2+DGAT1+WRI1+Oleosin 1,93 ± 0,18 1,14 V2+MGAT2+DGAT1+WRI1+Oleosin+AGPase- 2,19 ± 0,19 hpRNAi Exemp1o 16. ExEressão eonstítutíva de um monoací1AIíe.ero1 ací1trans£erase, díací1qlíeeroi aeíltransferase e fat.or de, Er,a,n,s.c,r,íç.ão WRII e uma =roteína oIeosina ern eé1u1a! de =1antas
[688] Um vetor binário pRShl contendo o gene que codifica a oleosina de semente de S. indicum (SCOtt et al., 2010) sob o controle do promotor 35S foi fornecido pelo Dr. N. Roberts (AgResearch Limited, Nova Zelândia). Outros constructos são descritas nos Exemplos 11 e 12. Expressão transitória em tecido de folha de N. benthamiana foi realizada corno descrito no Exemplo 1.
[689]Quando a proteína oleosina de gergelim foi expressa em conjunto coni o fator de transcrição WRI de A. thaliana e MGAT2 aciltransferase de M. musculus, os níveis de TAG em folhas de N.
benthamiana quantificados por Iatroscan demonstraram ser 2,2 vezes maiores (tabela 21). Não foram detectadas alterações significativas nos perfis de ácido TAG em folha (Tabela 22). Um pequeno aumento na TAG também foi observado quando a DGATI aciltransferase de A. thaliana foi incluída. Em comparação com o controlo negativo V2, a expressão combinada de WRII, DGATI e a proteína oleosina de gergelim, resultou num aumento de 3 vezes em TAG e um nível TAG máximo observado de 7,72% (Tabela 21 e Figura 12). Níveis de TAG em folha foram mai.s elevados em um fator de 2,5, incluindo a MGAT2aciltransferase. Isto corresponde a uma média de 5,7% e um máximo observado de 18,8% de TAG em uma base de peso seco. O aumento adicional da TAG na folha quando MGAT2 foi incluído demonstra claramente o efeito positivo desta aciltransferase na biosíntese e acumulação de lipídeos neutros nos tecidos da folha transgênica.
[690] O experimento foi repetido com a combinação de genes para expressar e V2 e V2 + MGAT2 + DGATI + + WRII + Oleosina, testado em diferentes plantas de N. benthamiana com amostras combinadas através de folhas a partir da mesma planta e com 12 infiltrações em replicada para cada. Os dados são mostrados na Tabela 23. Amostras em reolicata, também foram reunidas através de folhas de mesma planta, com 6 repeti.ções para cada ínfiltração: Os dados são mostrados nas Tabelas 24 e 25.
[691] Embora a infiltração d.e folhas de N. benthamiana resultou em aumento dos níveis de óleo de folha (TAG), não foi detectado aumento significativo no teor de lipídeos totais, o que sugere que uma redistribuição de ácidos graxos de diferentes lipídeos agrupados em TAG estava ocorrendo. Em contraste, quando o gene MGAT2 foi co-expressos com genes de DGATI, WRII e oleosina, lipídeos totais aumentaram 2,21 vezes, o que demonstra um aumento líquido na síntese de lipídeos da folha. ExemE1o 17 . ExEressã,o _ e,o,n,s.t,í.tu.tíva _ de _ uma mo,n,o,a,c,í.1g1ícero1 aciltransferase, diaci1g1ícero1 acíltransferase fator de transerí£ão WRII e um cons.tFµc,t,ode_sA1,encj.amento FAD2=RNAí em
327/3'75 células de =1antas
[692]Um cassete de FAD2 RNA1 de N. benthamiana sob o controle de um promotor 35S foi obtido por recombinação LR para o vetor de destino pHELLSGATEB para gerar vector pFN033. Outros constructos são descritas nos Exemplos 11 e 12.
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Tabela 23. Teor de TAG de amostras de folhas infiltradas de N. benthamiana. Combinação de gene | TAG (°; peso Proporção seco) V2 0,19 ± 0,05 18, 74 V2+MGAT2+DGAT1+WRI1+Oleosin 3,56 ± 0,86 Tabela 24. Teor de TAG de amostras de folhas infiltradas de N. benthamiana. Combinação de oene tag {% pesoj Proporção I seco) |V2+MGAT2+DGAT1+WRI1 j2,17 ± 0,30 , 0,79 |V2+MGAT2+DGAT1+WRI1+Oleosina|2,11 ± 0,20 jv2+MgAT2 I 0,32 ± 0,06 ) 2,19 jv2+MgAT2+oleosina I 0,70 ± 0,17 Tabela 25. Teor de ácido graxo de amostras de folhas infiltradas de N. benthamiana. )V2 i 3,12 ± 0,14 I1 )V2+MGAT2 I 3,28 ± 0,33 I 1,05 iV2+MGAT2+DGAT1+WRI1+Oleosina| 6,88 ± 0,37 |2,21
[693] Os " genes que codificam para o monoacilglicerol aciltransferase MGAT2 de camundongo, diacilglicerol aciltransferase· DGATI de A. thaliana, WRII de A. thaliana e construção FAD2 Lj12-ácido graxo dessaturase hairpin RNA1 de N. benthamiana (Wood et al., Manuscrito em preparação), foram , expressos em combinação em tecido de folha de N. benthamiana utilizando o sistema de expressão transitório, como descrito no Exemplo 1.
[694]Alterações semelhantes forarn observadas nas composições de ácido graxo de TAG, lipídeos polares e TFA de folhas de N. benthamiana infiltradas com WRII, MGAT2, DGATI e o
I ) constructo de silenciamento FAD2 (Tabelas 26-28). Em todas as três frações de lipídeos, os níveis de ácido oleico foram novamente aumentados e atingiram cerca de 20% em lipídeos , polares, 40% em TFA e mais do que 55% em TAG. Este aumento ocorreu principalmente em detrimento de ácido linoleico que reflete o efeito de silenciamento no retículo endoplasmático FAD2 A12-dessaturase. Folha TAG também continha menos ácido a- linolênico, enquanto os níveis de TFA e lipídeos polares não foram afetados.
[695]Quando estes experimentos forarn repetidos e as composições de ácido graxo determinadas para TAG, lipídeos polares e lipídeos totais, os resultados (Tabela 29) foram consistentes com o primeiro experimento.
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ExemE1o 18. ExEressão de Mus musculus MGATI e MGAT2 em eéíulas de Nícotíana benthamíana _Eor trans£orma£ão estável Expressão constitutiva em N. benthamiana
[696]A atividade enzimática de M. musculus MGATI e MGAT2 foi demonstrada em Nicotiana benthamiana. Os vetores quiméricos 35S:Musmu-MGAT1 e 35S:Musmu-MGAT2 foram introduzidos em cepa AGLI de A. tumefaciens através do procedimento de eletroporação padrão e crescido em meio LB sólido suplementado com canamicina (50 mg/L) e rifampicina (25 mg/L) e incubados a 28°C durante dois dias. Uma única colônia foi usada para iniciar a cultura fresca. Após 48 horas de cultura com aeramento vigoroso, as células foram recolhidas por centrifuc'ação a 200Ox g e o sobrenadante foi retirado. As células foram suspensas novamente em uma nova solução contendo 50% de LB e 50% de meio MS com uma densidade de OD600 = 0,5. Amostras de folha de plantas Nicotiana benthamiana cultivadas assepticamente in vitro, foram retiradas e cortadas em seções quadradas ao redor de 0,5-1 cm2 de tamanho, corn um bisturi afiado enquanto imersos na solução de A. tumefaciens. As peças de folha feridas de N. benthamiana 'submersas em A. tumefaciens foram deixadas em repouso à temperatura ambiente durante 10 min antes de serem secas por absorção em um papel de filtro estéril e transferidas para placas de MS sem suplemento. Após um período de co-cultura de dois dias a 24°C, os explantes foram lavados três vezes com meio MS líquido estéril, e, finalmente, secos com papel de filtro estéril e colocados em meio de ágar MS solidificado seletivo suplementado com 1,0 mg/L bencilaminopurina (BAP), 0,25 mg/L ácido indolacético (IAA), 50 mg/L de canamicina e 250 mg/L de cefotaxima e incubados a 24°C durante duas semanas para permitir o desenvolvimento de brotos a partir de discos de folha de N.
È)entha1niana transformad.as. Para estabelecer plantas transgênicas in vitro, brotos verdes saudáveis foram cortados e transferidos bara um novo pote de cultura de tecido de 200 ml contendo meio fs solidificado com ágar suplementado com 25 µg/L de IAA e 50 mg/L de canamicina e 250 mg/L de cefotaxima.
[697]A expressão dos transgenes MGATI e MGAT2 foi determinada por PCR em Tempo Real. Linhagens expressando altamente forarn selecionadas e suas sementes colhidas. Esta semente foi plantada diretamente no solo e a população de segregação de plântulas colhidas depois de quatro semanas. Eventos expressando altamente foram selecionados e as sementes produzidas por estas plantadas diretamente no solo para provocar uma população de segregação de 30 plântulas. Depois de três "emanas discos de folha foram retirados de cada plântula para extração de DNA e PCR subsequente para determinar quais linhagens foram geneticamente modificadas e quais foram nulas para o transgene. A população foi então colhida com todo o tecido aéreo a partir de cada plântula limpa de solo e liofilizada. O peso seco de cada amostra foi registrado e lipídeos totais isolados. O TAG nestas amostras totais de lipídeos foi quantificada por TLC-FID e a proporção de TAG a urri padrão interno (DAGE) em cada amostra determinada (Figura 14). O nível médio de TAG nas plântulas transgênicas de 35S:Musmu-MGAT2 linhagem 3347-19 demonstrou ser 4,1 vezes maior do que o nível médio de TAG nas plântulas nulas. O evento com o maior aumento de TAG teve TAG 7,3 vezes maior do que a média dos eventos nulos. Expressão constitutiva em A. thaliana
[698]A atividade enzimática de M. musculus MGATI e MGAT2 foi demonstrada em A. thaliana. Os vetores quiméricos 35S:Musmu- MGAT1 e 35S:Musmu-MGAT2 juntamente com o vetor de controle vazio pORE04 foram transforrnados em A. thaliana pelo método mergulho floral e semente de transformantes primários selecionados em meio de canamicina. As sementes T2 a partir destas plantas T1 foram colhidas e TFA das sementes de cada planta determinado (Figura 15). A média de TFA em mg/g de semente demonstrou ser 139 ±13 para as linhagens de controle pORE04 com média 136,0, 152 ±14 para as linhagens 35S:MGAT1 com média 155,1 e 155 ±11 para as linhagens 35S:MGAT2 com média 154,7. Isso representou um aumento médio de TFA em comparação com o çontrole de 9,7% para 35S:MGAT1 e 12,1% para o 35S:MGAT2. ExemE1o 19. Genes adícíonaís Novos aumentos em óleo
[699]Genes adicionais são testados paralelamente às combinações descritas acima, para determinar se os aumentos adicionais de óleo podem ser alcançados. Estes incluem os seguintes genes de Arabidopsis: AT4G02280, sacarose sintase SUS3; AT2G36190, Invertase CWINV4; AT3G13790, Invertase CWINVI; AT1G61800, glicose 6 fosfato:fosfato translocador GPT2; AT5G33320, transportador de fosfoenolpiruvato PPTl; AT4G15530, Piruvato ortofosfato diquinase plastídeo-PPDK; AT5G52920, Piruvato quinase ppK-j31. Os genes que codificam para estas enzimas são sintetizados e clonados em um vetor de expressão constitutivo binário pjP3343 como fragmentos EcORI para testar em N. benthamiana. ,
[700]Quando um número de genes que foram adicionados à combinação de WRII, DGATI, MGAT2 e oleosina e expressa em folhas de N. benthamiana, foi observado um aumento adicional no nível de TAG, nomeadamente para: cártamo PDAT, Arabidopsis thaliana PDATI, Arabidopsis thaliana DGAT2, Arabidopsis thaliana caleosina, oleosina de amendoim, hemoglobina 2 de Arabidopsis thaliana, iPLAh Homo sapiens, Arabidopsis thaliana GPAT4, E. coli G3P desidrogenase, desidrogenase G3P de levedura, LPAAT2 de rícino, Arabidopsis thaliana beta-frutofuranosidase (ATBFRUCTI, NM 112232), Arabidopsis thaliana beta-frutofuranosidase (cwINV4, NM 129177), indicando que nenhuma das atividades enzimativas foram limitantes em taxa em folhas de N. benthamiana quando expressas transitoriamente. Isto não indica que não terão efeito em plantas transformadas estavelmente, como na semente ou em outros organismos.
[701]Outros genes adicionais são testados para atividade aditiva o'j sinérgica em aumento de óleo. Estes incluem os seguintes modelos de genes de Arabidopsis thaliana ou suas proteínas codificadas, e homólogos de outras espécies, que são agrupados por função putativa e foram anteriormente demonstrados para serem regulados para cima em tecidos com aumento do teor de óleo. Genes/proteínas envolvidas na degradação de sacarose: AT1G73370, AT3G43190, AT4G02280, AT5G20830, AT5G37180, AT5G49190, AT2G36190, AT3G13784, AT3G13790, AT3G52600. Genes/proteínas envolvidas na via oxidativa de pentose fosfato: AT3G27300, AT5G40760, AT1G09420, AT1G24280, AT5G13110, AT5G35790, AT3G02360, AT5G41670, AT1G64190, AT2G45290, AT3G60750, AT1G12230, AT5G13420, AT1G13700, AT5G24410, AT5G24420, AT5G24400, AT1G63290, AT3GO1850, AT5G61410, AT1G71100, AT2GO1290, AT3G04790, AT5G44520, AT4G26270, AT4G29220, AT4G32840, AT5G47810, AT5G56630, AT2G22480, AT5G61580, AT1G18270, AT2G36460, AT3G52930, AT4G26530, AT2GO1140, AT2G21330, AT4G38970, AT3G55440, AT2G21170. Genes/proteínas envolvidas na glicólise: AT1G13440, AT3G04120, AT1G16300, AT1G79530, AT1G79550, AT3G45090, AT5G60760, AT1G56190, AT3G12780, AT5G61450, AT1G09780, AT3G08590, AT3G30841, AT4G09520, AT1G22170, AT1G78050, AT2G36530, AT1G74030. Genes/proteínas que funcionam como transportadores de plastídeos: AT1G61800, AT5G16150, AT5G33320, AT5G46110, AT4G15530, AT2G36580, AT3G52990, AT3G55650, AT3G55810, AT4G26390, AT5G08570, AT5G56350, AT5G63680, AT1G32440, AT3G22960, AT3G49160, AT5G52920. Genes/proteínas envolvidas em metabolismo de malato e piruvato: AT1G04410, AT5G43330, AT5G56720, AT1G53240, AT3G15020, AT2G22780, AT5G09660, AT3G47520, AT5G58330, AT2G19900, AT5G11670, AT5G25880, AT2G13560, AT4GO0570.
[702]OS constructos são preparados que incluem sequências que codificam estas proteínas candidatas, que estão infiltradas em folhas de N. benthamiana como nos experimentos anteriores, e o teor de ácido graxo e composição analisada. Os genes que auxiliam no aumento do teor de lipídeos apolares são combinados com os outros genes, como descrito acima, principalmente os que codificam MGAT, Wril, DGATI e uma oleosina, e usados para transformar células de plantas. Aumentos nos ácidos graxos não usuais
[703]Genes adicionais são testados paralelamente às combinações descritas acima, para determinar se os aumentos de ácidos graxos não usuais podem ser alcançados. Estes incluem os seguintes genes {são fornecidos o número de acessão GenBank Nos.) que são agrupadas por função putativa e homólogos de outras espécies. Delta-12 acetilenases ABCO0769, CAA76158, AAO38036, AAO38032; Delta-12 conjugases AAG42259, AAG42260, AAN87574; Delta-12 desaturases P46313, ABS18716, AAS57577, AAL61825, AAF04093, AAF04094; Delta-12 epoxigenases XP 001840127, CAA76156, AAR23815; Delta-12 hidroxilases ACF37070, AAC32755, ABQO1458, AAC49010: e Delta-12 P450 enzimas como AF406732.
[704]OS constructos são preparados que incluem sequências que codificam estas proteínas candidatasj, que estão infiltradas em folhas de N. benthamiana como nos experimentos anteriores, e o teor de ácido graxo e composição analisada. As sequências de nucleotídeos das regiões de codificação podem ser otimizados por códons para as espécies hospedeiras de interesse. Os genes que auxiliam no aumento do teor de ácído graxo não usual são combinados com os outros genes, como descrito acima, principalmente os que codificam MGAT, WRII, DGATI e- uma oleosina, e usados para transformar células de plantas. Exe1nEIo 20. Transforma£ão estáveí de ^1antas íncluíndo a Nícotíana tabacum com combína£ões =enes de aumento de ÓIeo
[705]Um vetor de expressão binário existente, pORE04+11ABGBEC {Pedido de Patente Provisório US 61/660392), que continha um duplo promotor 35S de região potencializada dupla que expressa o gene de resistência à canamicina NPTII e três cassetes de expressão do gene, foi usado como urn vetor de partida para preparar vários constructos cada uma contendo uma combinação de genes para a transformação estável de plantas.
Este vetor foi modificado por troca dos genes expressos com genes de aumento de óleo, como a seguir. pORE04+11ABGBEC foi . primeiro modificado inserindo um gene de oleosina de gergelirn interrompido por íntron, flanqueado por sítios Notl, a partir do vetor pRShl-PSPl nos sítios pORE04+11ABGBEC Notl para gerar pjP3500. pjP3500 foi então modificado inserindo um fragmento de DNA otimizado por códon codificando o ge"ne WRLI de A. thaliana nos sítios EcoRI para gerar pjP3501. pjP3501 foi ainda modificado por inserção de um fragmento de DNA codificando a região codificadora DGATI de A. thaliana tipo selvagem, flanqueada por sítios AsiSl, nos sítios AsiSl para gerar pjP3502 (SEQ ID NO:409). Uma modificação final foi realizada inserindo outro cassete de expressão, que consiste em um promotor 35S de região potencializada dupla expressando uma região codificadora que codifica MGAT2 de M. musculus, como um fragmento Stul-Zral no sítio Sfol de pjP3502 para gerar pjP3503 (SEQ ID NO:410). O cassete de expressão MGAT2 foi retirado de pjP3347 nos sítios Stul + Zral. pjP3502 e pjP3503 onde ambos usaram para transformar estavelmente N. tabacum como descrito abaixo. Por estos constructos, pjP3502 continha as regiões codificadoras WRLI e DGATI de A. thaliana dirigidas pelo promotor de pequena subunidade rubisco de A. thaliana (SSU) e promotor 35S potencializador de região dupla, respectivamente, bem como um cassete SSU:oleosina de gergelim. A região de T-DNA desto constructo é mostrada esquematicamente na Figura 16. O vector pjP3503 continha adicionalmente os cassetes e35S::MGAT2. Esto constructo é mostrada esquematicarnente na Ficura 17. A sequência de nucleotídeos da região de T-DNA do constructo pjP3503 é apresentada na SEQ ID NO:412. Transformaç.ão estável de Nicotiana tabacum com combinações genes
[706]Os vetores binários pjP3502 e pjP3503 foram introduzidos separadamente na cepa de A. tumefaciens AGLI por um
343/37.5 procedimento de eletroporação padrão. As células transformadas foram selecionadas e cultivadas em placas de Ll3-agar suplementadas com canamicina {50 mg/l) e rifampicina (25 mg/l) e incubadas a 28°C durante dois dias. Uma única colônia de cada uma delas foi utilizada para iniciar as culturas frescas em caldo LB. Após 48 horas de incubação com aeramento vigoroso, as células foram recolhidas por centrifugação a 200Ox g e o sobrenadante foi retirado. As células foram novamente suspensas a uma densid.ade de OD600 = 0,5, em meio fresco que consiste de 50% de LB e 50% de meio MS.
[707]Amostras da folha de N. tabacum cultivar W38 cultivadas assepticamente in vitro foram excisadas com urri bisturi e cortada em pedaços de cerca de 0,5-1 cm2 enquanto imergidas em suspensões de A. tumefaciens. As peças folha cortadas foram deixadas em suspensões de A. tumefaciens em temperatura ambiente durante 15 minutos, antes de serem secas por absorção em um papel de filtro estéril e transferidas para placas de MS, sem suplemento de antibiótico. Após um período de co-cultura.de dois dias a 24°C, os explantes foram lavados três vezes com meio MS líquido estéril, e, finalmente, secos com papel de filtro estéril e colocados em meio de ágar MS solidificado seletivo suplementado com 1,0 mg/L bencilaminopurina (BAP), 0, 5 rng/L ácido indolacético (IAA), 100 mg/L de canamicina e 200 mg/L de cefotaxima. As placas foram incubadas a 24°C durante duas semanas para permitir o desenvolvimento de brotos a partir de pedaços da transformadas de N. tabacum.
[708] Para estabelecer plantas transgênicas enraizadas in vitro, brotos verdes saudáveis foram cortados e transferidos para um meio MS ágar suplementado com 25 µo/L de IAA e 100 rng/L de canamicina e 200 mg/L de cefotaxima. Depois de raízes terem se desenvolvido, as plantas individuais foram transferidas para o solo e cresceram na estufa. Amostras da folha foram colhidas em diferentes fases de desenvolvimento da planta, incluindo,
antes e durante a floração. Ácidos graxos totais, lipídeos polares e TAG foram quantificados e os seus perfis de ácido graxo determinados por TLC/CG conforme descrito no Exemplo 1. Análise de transformantes pjP3503
[709] Para a transformação com pjP3503 ("constructo 4- gene"), as amostras de folha de cerca de 1 cm2, foram tomadas a partir de 30 tr.ansformantes primários antes de brotos de flores se formando e níveis TAG nas amostras foram quantificados por Iatroscan. Sete plantas foram selecionadas para posterior análise, d.as quais cinco apresentando níveis de óleo de folha aumentados e duas apresentando níveis de óleo essencialmente os mesmos que as plantas do tipo selvagem. Amostras da folha liofilizadas destas plantas foram analisadas quanto ao teor de lipídeos totais e conteúdo TAG e composição de ácido graxo por TLC e GC. As plantas transformadas numeradas 4 e 29 demonstraram ter aumentado consideravelmente os níveis de óleo na folha em Comparação com o tipo selvagem, enquanto o número de planta 21 apresentou os rnais baixos níveis TAG essencialmente nos níveis do tipo selvagem (Tabela 30). Plantas numeradas 11, 15 e 27 tinham níveis intermediários de óleo na folha. Os níveis de ácido oleico em TAG demonstraram estar inveFsamente correlacionados com os rendimentos TAG, consistentes com os resultados dos experimentos de expressão transitória anteriores èm N. benthamiana.
[710] Nas plantas transformadas numerados 4 e 29, o teor de óleo da folha (como uma percentagem de peso seco) demonstrou aumentar consideravelmente o tempo de floração (Tabela 31). A partir dos dados da Tabela 31, o aumento foi de pelo menos 1,7 e de 2,4 vezes para as plantas 4 e 29, respectivamente. Nenhuma mudança foi observada para planta 21 que tinha níveis TAG semelhantes ao controle do tipo selvagem. Os níveis de ácido oleico na frações TAG isoladas de cada amostra seguiram um padrão semelhante. Esse ácido graxo acumulou até 22,1% do ácido graxo na TAG de plantas 4 e 29, um aumento de 17-18-vezes em comparação com a planta 21 e do tipo selvagem. O aumento em ácido oleico foi acompanhado por um aumento nos níveis de ácido linoleico e ácido palmítico, enquanto os níveis de ácido a- linolênico diminuiu 8 vezes em comparação com a planta 21 e o controle do tipo selvagem. Ao contrário de TAG, os níveis de lipídeos polares diminuíram ligeiramente no estágio de floração nas três linhagens (Tabela 32). Alterações em níveis de ácido graxo C18 monoinsaturados e poli-insaturados em fracções de lipídeos polares das três linhagens for?m semelhantes para as mudanças na sua composição em TAG embora as alterações no ácido oleico e ácido linoleico, foram menos acentuadas. Foram observados aumentos significativos nos libídeos totais da folha de linhaoens 4 e 29 durante a floração, com níveis atingindo mais de 10% do peso seco (Tabela 33). Tottal de níveis lipídicos em folha de planta 21, antes e durante a íioração foi semelhante aos níveis observados em plantas do tipÓ selvagem em estágios semelhantes (Tabelas 33 e 35). Mudanças lia composição em ácido graxo de lipídeos totais de todas as três plantas foram semelhantes às respectivas composições TA,G ácido graxo. Óleo de folha na planta 4 durante ajustamento de sementes .demonstrou ser mais elevado no início da clorose da folhá. Os mais altos níveis de TAG em folha detectados nesta fase corresponderam a um aumento de 65 vezes em comparação com fo-lhas envelhecidas similares na planta 21 durante ajustamento de sementes e um aumento de 130 vezes,. err'. comparação com folhas semelhantes de plantas com flores do tipo selvagem (Tabela 34; Figura 18).
[711] O aumento da TAG nesta planta coincidiu com níveis elevados de ácido oleico. Ao contrário de'planta 4, os níveis de TAG na folha nos outros dois transformantes primários e do tipo selvagem de tabaco não aurnentaram, ou apenas aumentaram marginalmente, após a floração e durante a clorose. As folhas inferiores de plantas de 4 e 29 apresentaram níveis reduzidos de TAG sobre senescência. Em todas as plantas, os níveis de ácido linoleico caiu enquanto os níveis àe ácido a-linolênico aumentaram com o progresso da idade da folha.
[712] Em consonância com o aumento dos níveis de TAG, os níveis totais de lipídeos em folhas de plantas 4 e 29 durante ajustamento de sernente foram mais elevados ern comparação com folhas semelhantes de ambas as plantas durante a floração (Tabelas 33 e 35). O nível mais alto de lipídeos totais detectados na planta 4 em uma base de peso seco foi de 15,8%, equivalente a um 7,6 e 11,2 vezes maior aumento em comparação com folhas semelhantes de plantas e 21 plantas do tipo selvagem, respectivamente. Embora a composição ern ácido graxo de lipídeos totais nas folhas da planta de tipo selvagem e planta 21 foram semelhantes, diferenças significativas forarrt observadas em plantas 4 e 29. Estas mudanças espelharam aquelas encontradas ern TAG de ambos os transformantes primários.
[713] Curiosamente, as folhas de plantas de 4 e 29, antes e durante o ajustamento das sementes foram caracterizadas por uma superfície brilhante, proporcionando uma alteração fenotípica que pode servir como uín fenótipo que é facilmente avaliado visualmente, que pode contribuir para o momento da colheita, para o teor de óleo máximo.
[714] Em resumo, folhas de plantas 4 e 29 rapidamente acumularam TAG durante a floração, até ajustamento de semente.
Na última fase, a maior parte das folhas exibiram níveis de TAG entre 7% e 13% em uma base de peso seco, em comparação com 0,1% -. 0,2% para a linhagem 21. Estes níveis observados de TAG e os níveis totais de lipídeos excedem os níveis atingidos por Andrianov et al., (2010) que relatou um máximo de 5,8% e 6,8% de TAG em folhas de N. tabacum após expressão constitutiva do DGATI de A. thaliana e expressão induzível dos genes LEC2 de A.
thaliana.
Tábela 30. Percentual de TAG (% peso de peso seco de folha) e os níveis de ácido oleico (% do total de ácidos graxos) no TAG isolado a partir de folhas de plantas de tabaco primárias selecionadas transformadas com pjP3503 t I N. ° da pIanta I %TAG (DW) |% C18:1L\9 l Estágío de I ) desenyo1vímento I ! da pljanta I Tipo selvagem ) 0,06 j2,3 ) Brotajnento Tipo selvagem 0,1 1, 3 FloraÇão 3 - 0, 05 1, 5 Brotajnento 4 1,29 10,2 Brotajnento 11 0,21 7, 4 FloraGão 15 0,23 4, 5 Sem bõtões 21 0,01 1, 9 Sem bptões 27 0,19 3, 3 Brotamento 29 1,15 10,4 Sem bptões Tabela 31. Níveis de TAG (% em peso de peso SeCOj da folha) e composição ácido graxo da TAG isolado do tipo sel agem e três plantas de tabaco transformadas com pjP3503 selecionadas, antes ,e durante a floração. Os dados mostrados São Çs médias e desvios-padrão de 2-3 repetições independentes.
Antes de floração Floração , Tipo Planta Planta Planta Tipo Planta PIanta Planta selvagem 21 4 29 selvagem 21 4 29 °/) lfolha DW 0,1 0,0 3,1 ± 4,1 ± 0,1 0,1 ± i7,3 ± 6,9 ± i 0,3 i 0,3 i l 0,0 j'0,3 i 0,5 C14:0 0,6 0,6 ± I 0,1 ± 0,2 ± 0,5 0,4 ± | 0,1 ± ) 0,1 ± 0,2 0,0 0,0 0,0 j'0,o i 0,0 ! C16:0 9,1 15,9 ± 42,0 ± 34,9 ± 7,5 15,0 ±),33,1 ±j24,8 ± .. 0,3 0,5 0,7 0,7 |'1,9 i 1,4 [C16:1^" 0,0 0,4 ± 0,1 ± 0,2 ± 0,4 0,2 ± )'0,j ± 0,2 ± 0,1 0,0 0,0 0,0 jof 0,0 C16:1^' 0,3 0,6 ± 3,3 ± 1,5 ± 0,3 0,6 ± |,3Á3 ± 1,2 ± 0,0 0,2 0,1 0,0 joç? 0,1 j C16:3^'g"g" 3,7 0,8 ± 0,1 ± 0,2 ± 3,6 0,8 ± |)O,' ± 0,2 ± 0,1 0,0 0,0 0,1 jo¢' 0¶O b
C13,2 4,6"±T3,0 ± 5,6 ± 2,4 3,4 ± 3,3 'f'48 ± 0,4 i 0,1 0,3 0,0 0,1 jo,1 C18:1^9 ) 2,3 1,2 ±j10,6 ± 10,6 ± 1,3 1,2 ± 19,1 ±)22,1 ± 0,2 i 0,3 0,2 0,2 1,8 j: 2,7 C18:1^" | 0,1 0,1 ± i 2,2 ± 1,2 ± 0,1 0,1 ± 2,1 ± ' 0,9 ± 0,0 i 0,2 0,1 0,0 0,0 |0,0 C18:2^9g" l 26,9 20,4 ±j20,7 ± 30,0 ± 23,7 19,5 ± 25,3 ±j34,7 ± 1,1 l 0,7 1,0 0,8 0,6 i 1,0 C18:3^9y"y" i 52,6 54,0 ±j15,9 ± 11,5 ± 59,3 57,5 ± 10,8 ±|l7,1 ± 0,8 i 0,5 1,3 0,4 0,5 jo,6 C20:0 i 0,3 0,6 ±j1,o ± 2,1 ± 0,3 0,4 ± 1,3 ±j2,0 ± 0,0 i 0,0 0,2 0,0 0,0 i 0,1 C20:1^" | 0,1 0,0 i 0,0 0,2 ± 0,1 0,1 ± 0,1 ± j'0,3 ± 0,1 0,0 0,0 |0,0 C20:2^"t" i 0,2 0,2 ± i 0,0 0,1 ± 0,2 0,3 ± 0,0 |0,1 ± 0,0 ) 0,0 0,0 ' jo,o C20:3^"g"y" ! 0,2 0,2 ± ! 0,0 0,0 0,1 0,2 ± 0,0' j)'0,0 0,0 l 0,0 C22:0 ! 0,1 0,2 ±jo,5 ± 1,0 ± 0,0 0,2 ± 0,7' ±(,0 ± 0,0 i 0,0 0,1 0,0 0}0 I) 0}0 C24:0 ! 0,4 0,1 ± l 0,4 ± 0,9 ± 0,3 0,1 ± 0,5 ± i) 0,7 ± 0,1 ) 0,0 0,1 0,0 0,0 ij 0,1 Tabela 32. Níveis de lipídeo polar (% em peso de' pes|it) seco da folha) e composição ácido graxo da Iipídeos POlaÁSj de jecido de folha selecionado de plantas de tabaco trans'fotmadjús corn pjP3503, antes e durante a floração. Os dados mostlraàos |fão as médias e desxTios-padrão de 2-3 repetições indeoendenÈes ))exceto para a planta 21 (antes da floração) . |1
Ê Antes de floração Floração ' l Planta 21 Planta 4 Planta 29 ) Planta 21 P|antá 4 ) ' P)tnta 29 I %lfolha DW 2,0 3,3 ± 0,4 2,5 ± 0,4 j1,7±0,0 2,4±'0,0 ) 1j)'± 1,1 !ci4:0 0,0 0,0 0,0 |o,o 0,0 ) ' of ,! c16:0 12,0 18,7±0,6 12,7±0,4 !12,7±0,0 16,2±0,2, 1j,8±0,2
C18:3^9t"7'5 60,6 ± 1,4 33,6 ± 1,5 36,0± 1,0 58,5 ± 1,2 18,3±0,5 15,5±0,6
C20:0 0,3 ± 0,0 0,7 ± 0,0 1,0 ±0,1 0,3 ± 0,0 1,0±0,0 1,5 ± 0,0
C20:1^" 0,0 0,0 0,1 ±0,0 0,0 0,1 ± 0,0 0,3± 0,0
C20:2^"y" 0,1 ± 0,0 0,0 0,1 ±0,0 0,2 ± 0,0 0,0 0,0
C20:3^"t"y" 0,1 ± 0,0 0,0 0,3 ± 0,0 0,8±0,0 0,0 0,6±0,0
C22:0 0,2±0,0 0,3±0,0 0,5±0,1 1,3±0,1 0,3 ±0,0 0,2±0,0
C24:0 0,2 ± 0,0 0,3 ±0,0 0,5±0,0 0,3 ± 0,0 T 0,5 ± 0,0 0,6±0,0
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Análise de plantas de tabaco transformadas com pjP3502
[715] Para a transformação com pjP3502 ("constructo de 3 genes"), o teor de sacarose no meio MS agar foi reduzido para metade do nível normal até calos suficientes serem estabelecidos, que ajudou a recuperação de transformantes que expressam WRII. Quarenta e um transformantes primários foram obtidos a partir da transformação com pjP3502 e transferidas para a estufa. Amostras da folha de diferentes idades foram coletadas em cada fase de floração ou de ajuste de sementes (Tabela 36). As plantas parecem fenotipicamente normais exceto para três transformantes, originando do mesmo calo no processo de transformação e, portanto, susceptível de ser do mesmo evento de transformação, que eram um pouco menores e apresentaram um fenótipo de folha brilhante semelhante ao observado para planta 4 com pjP3503 (acima), mas menos em extensão.
[716]Amostras de disco em folha de transformantes primários foram colhidas durante a floração e TAG foi quantificada visualizado por coloração de iodo após TLC. Plantas transgênicas selecionadas que exibem maiores níveis de TAG em comparação com os controles do tipo selvagem foram ainda analisados com maiores detalhes através de TLC e GC. O nível mais alto TAG em folhas verdes jovens foi detectado na linhagem 8.1 e corresponderam a 8,3% TAG em uma base de peso seco ou um aumento aproximado de 83 vezes em comparação com folhas tipo selvagem da mesma idade (Tabela 36). Folhas verde-amarelo tipicamente continham um teor de óleo mais elevado em comparação com folhas verdes mais jovens com níveis máximos de TAG observados em linhagem de 14,1 (17,3% TAG em uma base de peso seco). Teor de lipídeo total e composição de ácido graxo de lipídeo total nas folhas também foram quantificados (Tabela 37).
[717] Semente (seinente Tl) foi coletada a partir dos transformantes primários na maturidade de semente e algumas foram plantadas para produzir plantas Tl. Estas plantas foram previstas para ser secretar para o transgene e, por conseguinte,
algumas secretadoras nulas eram esperadas nas populações Tl, que podem servir como controles negativos adequados, além das eonhecidas plantas de tipo selvagem, que foram cultivadas, ao mesmo tempo e nas mesmas condições. 51 plantas Tl, derivados do transformante primário 14.1, que tinha uma inserção de T-DNA de um único exemplar, que eram de 6-8 semanas de idade e 10-25 cm de altura foram analisados em conjunto com 12 plantas de tipo selvagem.
As plantas pareceram fenotipicamente normal, verde e saudável, e não parecem menores do que as plantas do tipo selvagem correspondentes.
Amostras da folha de cerca de 1 cm de diâmetro foram retiradas de folhas verdes completamente expandidas. 30 das plantas Tl apresentaram níveis elevados de TAG nas folhas, das quais oito plantas apresentaram altos níveis de TAG, cerca do dobro do nível de TAG em comparação com o transformante primário 14.1 no mesmo estágio de desenvolvimento da planta.
Estas últimas plantas são susceptíveis de serem homozigóticas para os transgenes.
O nível de TAG e a composição de ácido graxo TAG em folhas de plantas Tl selecionadas foram medidos por carregamento de lipídeos isolados a partir de cerca de 5 mg de peso seco de tecido de folha para cada pista de TLC,
os dados são apresentados na Tabela 38.
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[718]Constructos genéticos adequadas para a transformação de plantas monocotiledôneas são feitas através da troca de promotores Arath-SSU em pjP3502 e pjp3503 para os promotores mais ativos' em mónocotiledôneas. Os promotores adequados incluem promotores virais constitutivos de vírus rnonocotiledôneas ou promotores que demonstraram funcionar em um contexto transgênico em espécies de monocotiledôneas (por exemplo, o promotor Ubi de milho descrito por Christensen et al., 1996). Da mesma forma, os promotores CaMV-35S em pjP3502 e pjP3503 são trocados por promotores que são mais ativos em espécies de monocotiledôneas. Estos constructos são transformadas em trigo, cevada e milho, utilizando métodos convencionais. Espécies Miscanthus
[719]Constructos genéticos para a transformação de espécies Miscanthus são feitas através da troca dos promotores Arath-SSU em pjP3502 e pjP3503 para os promotores mais ativos em Miscanthus. Os promotores adequados incluem prornotores virais constitutivos, um promotor de ubiquitina (Christensen et al., 1996) ou promotores que demonstraram funcionar em um contexto transgênico em Miscanthus. Da mesma forma, os promotores CaMV- 35S em pjP3502 e pjP3503 são trocados por promotores que são mais ativos em Miscanthus. Novos constructos são transformadas em Miscanthus por um método mediado por microprojéteis semelhante ao descrito por Wang et al. 2011. Switchgrass (Panicum virgatum)
[720]Constructos genéticos para a transformação de switchgrass são feitas através da troca de os promotores Arath- SSU em pjP3502 e pjP3503 nara os promotores mais ativos em switchgrass. Os promotores adequados incluem promotores virais, promotores constitutivos ou que demonstraram funcionar em um contexto transgênico em switchgrass (por exemplo, Mann et al. 2011). Da mesma forma, os promotores CaMV-35S em pjP3502 e pjP3503 são trocados por promotores que são mais ativos ern switchgrass. Novos constructos são transforriiadas em switchgrass por um método mediado por Agrobacterium semelhante ao descrito por Chen et al. 2010 e Ramamoorthy e Kumar, 2012. Cana de açúcar
[721]Constructos genéticos para transformação de cana de açúcar são feitas através da troca dos promotores Arath-SSlj em pjP3502 e pjP3503 para os promotores mais ativos em cana de açúcar. Os promotores adequados incluem promotores virais, promotores constitutivos ou que demonstrararn funcionar em um contexto transgênico na cana de açúcar (por exernplo, o promotor Ubi de milho descrito por Christensen et al., 1996). Da mesma forma, os promotores CaMV-35S em pjF3502 e pjP3503 são trocados por promotores que são mais ativos em cana de açúcar. Novos constructos são transformadas em cana de açúcar por um rnétodo mediado por microprojéteis semelhante ao descrito por Bower et al. 1996. Capim-elefante
[722]Constructos genéticos para a transformação de Pennisetum purpureum são feitas através da troca dos promotores Arath-SSU em pjP3502 e pjP3503 para os promotores mais ativos em capim-elefante. Os promotores adequados incluem promotores virais, promotores constitutivos ou que demonstraram funcionar em um contexto transgênico em espécies de Pennisetum como tipo P. glaucum (por exemplo, o promotor Ubi de milho descrito por Christensen et al., 1996). Da mesma forma, os promotores CaMV- 35S em pjP3502 e pjP3503 são trocados por prcimotores que são mais ativos em espécies de Pennisetum. Novos constructos são transformados em P. purpureum pelo método mediado por microprojéteis semelhante ao descrito por Girgi et al. 2002. Lolium
[723] Constructos genéticos para Lolium perenne e transformação de outras espécies de Lolium são feitas através da troca dos promotores Arath-SSU em pjP3502 e pjP3503 para os promotores mais ativos em azevém. Os prornotores adequados incluem promotores virais, promotores constitutivos ou que demonstraram funcionar ern um contexto transgênico em espécies de Lolium (por exemplo, o promotor Ubi de rnilho descrito por Christensen et al., 1996). Da mesma forma, os promotores CaMV- 35S em pjP3502 e pjP3503 são trocados por promotores que são mais ativos em espécies Pennisetum. Novos constructos são transformadas em Lolium perenne por urn método mediado por carboneto de silício, semelhante ao descrito por Dalton et al. 2002 ou um método mediado por Agrobacterium semelhante ao descrito por Bettany et al. 2003.
[724]pjP3502 e pjP3503 são modificados para constructos genéticos de expressão específica de semente, trocando os promotores CaMV-35S e Arath-SSU (exceto o cassete de marcador selecionável) com promotores específicos de sementes ativos nas espécies alvo.
Canola
[725]Constructos genéticos para a transformação Brassica napus são feitas por meio da troca dos promotores CaMV-35S e Arath-SSU em pjP3502 e pjP3503 para os promotores mais ativos em canola. Os promotores adequados incluem promotores que foram previamente demonstrados para funcionar no contexto transgênico em Brassica napus (por exemplo, o promotor FAEI A. thaliana, promotor napina de Brassica napus, promotores conlininl e conlinin2 de Linum usitatissimum). Novos constructos são transformadas em B. napus tal descrito anteriormente. soja (Glycine max)
[726] Um constructo genético é feito por clonagem do fragmento PspOMI partir de um fragmento de DNA sintetizado tendo a sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO:415 (inserção sinergia de soja; Figura 19A) em um vetor binário como pORE04 no sítio Notl. Este fragmento contém Arath-WRII expressa por um promotor Arath-FAE1, Arath-DGAT1 expressa por um promotor Linus-Cnl2, Musmu-MGAT2 expressa por Linus-Cnll e Arath-GPAT4 expressa por Linus-Cnll. Outro constructo genética é feita por meio da troca da região de codificação GPAT para uma região de codificação oleosina. Outro constructo genética é fei-ta por exclusão de cassete de expressão MGAT.
[727] Um constructo genético, pjP3569 (Figura 21), foi gerado por clonagem do fragmento Sbfl-Pstl a partir da molécula de DNA tendo a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO:415 no sítio Pstl de pORE04. Esto constructo continha (i) uma região de codificação que codifica o fator de transcrição WRII de A. thaliana, otimizada por códon para a expressão de G. max, e expressa a partir promotor de inibidor 3 de tripsina de G. max kunitz 3 (Glyma-KTi3), (ii) uma região de codificação que codifica o promotor de DGAT2A Umbelopsis ramanniana (otimizado por códon, como descrito por Lardizabal et al., 2008) e expressos a partir do promotor alfa-subunidade beta-conglicinina de G. max (Glyma-b-conglicinina) e (iii) uma região de codificação que codifica MGAT2 de M. musculus, otimizado por códon para expressão de G. max. Uma segundo constructo genética, pjP3570, foi gerada por clonagem do fragmento Sbfl-Swal da molécula de DNA tendo a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO:415 em pORE04 nos sítios EcoRV-Pstl para produzir um vetor binário que contém os genes que expressam Fator de Transcrição WRII de A. thaliana e enzima DGAT2A de U. ramanniana. De modo semelhante, uma terceiro constructo genética, pjP3571, foi gerada por clonagem do fragmento AsiSl da molécula de DNA tendo a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO:415 para o sítio AsiSl de pORE04 para produzir um vetor binário que contém um gene que codifica para enzima DGAT2A U. ramanniãna. Uma quarto constructo genética, pjP3572, foi gerada por clonagem do fragmento Notl da molécula de DNA terído a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO:415 em pORE04 no sítio Notl para produzir um vetor binário que contém um gene que expressa o fator de transcrição WRII de A. thaliana. Uma quinto constructo genética, pjP3573, foi gerada por clonagem do fragmento Swal da molécula de DNA tendo a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO:415 em pORE04 no sítio
- 362/375 ECORV para produzir um vetor binário que contérn o gene que codifica MGAT2 M. musculus.
[728] Uma sexto constructo genética, pjP3580, é gerada através da substituição do M. musculus MGAT2 corn o gene da oleosina de Sesamum indicum.
[729]Cada um destes seis constructos é usado para transformar soja, utilizando os métodos como descritos no Exemplo 6. Plarrtas transgênicas produzidas por transformação com cada uma dos constructos, particularmente pjP3569, produz sementes com maior teor de óleo.
Beterraba
[730] Os vetores pjP3502 e pjp3503 (ver acima) como utilizados para a transformação de tabaco são usados para transformar plantas de beterraba (Beta vulgaris), por transformação mediada por Agrobacterium como descrito por Lindsey & Gallois (1990). As plantas produzem urn grande aumento dos níveis de TAG nas suas folhas, semelhantes na medida das plantas de tabaco produzidas como descrito acima. Plantas de beterraba transgênicas são colhidas enquanto as folhas ainda estão verdes ou de preferência verde/arnarelo pouco antes do início da senescência ou antes nesse processo de desenvolvimento, ou seja, e enquanto o teor de açúcar da beterraba está em um nível alto e depois de permitír o acúmuío de TAG nas folhas. Isso permite que a produção de beterrabas de duplo propósito, que são adequadas para a produção de açúcar da beterraba e lipídeo das folhas; o lipídeo pode· ser convertido diretamente para biodiesel por esmagamento das folhas e a centrifugação do material resultante para separar a fração de óleo, .ou a produção direta de hidrocarbonetos por pirólise do material da folha.
[731] Os promotores que atuam na raiz (tubérculo) de beterraba também são usados para expressar transgenesj no tubérculo. Exemp1o 21. Transfoão est,á,ve,í_de_ SQ1an,z=_t,ub,e=Qs" com
Cnes de aumento do óleo
[732]pjP3502, o vetor de expressão binário intermediário descrito no exemplo anterior, foi modificado por primeiro 'b retjrando um promotor SSU por digestão ASCI + NCoI e substituindo com o promotor B33 de batata flanqueado por AscI e NCOI para gerar pjP3504. O promotor SSU em pjP3504 juntamente com um fragmento do gene WRLI de A. thaliana foi substituído nos sítios PspOMI por um promotor B33 de batata com o mesmo fragmento do gene WRLI de A. thaliana flanqueado por NotI--PspOMI para gerar pjP3506. O pjP3347 foi adicionado a pjP3506 como descrito no exemplo acima, para gerar pjP3507. Esto constructo é niostrada esquematicamente na Figura 20. Sua sequência é apresentada na SEQ ID NO:413. O constructo é utilizada para transformar a batata (Solanum tuberosum), para aumentar o teor de óleo em tubérculos.
ExemE1o 22. Enzímas de Eusão GPAT-MGAT
[733]A atividade enzimática de fusões de enzimas GPAT-MGAT é testada para determinar se isso iria aurnentar a acessibilidade do MAG produzido por GPAT para atividade MGAT. Urna região ligante apropriada foi primeiro sintetizada e clonada em um vetor de clonagem. Este ligante continha sítios adequados para a clonagem do N-terminal (EcoRI-Zral) e regiões de codificação do terminal-C (Ndel-Smal ou Ndel ou Pstl).
[734] atttaaatgcggccgcgaattcgtcgattgaggacgtccctactagacctgctg gacctcctcctgctacttactacgattctctcgctgtgcatatggtcagtcatgcccgggcctg caggcggccgcatttaaat (SEQ ID NO:414)
[735] Uma fusão GPAT4-MGAT2 (GPAT4 N-terminal e MGAT2 C- terminal) foi feita por clonagem de um primeiro fragmento de DNA que codifica para a GPAT4 de A. thaliana, flanqueado por sítios Mfel e Zral e sem um códon de terminação C-terminal, para os sítios EcoRI-Zral. O fragmento de DNA que codifica o MGAT2 M.
musculus, flanqueado por sítios de Ndel-Pstl, foi então clonado nos sítios Ndel-Pstl para gerar uma única sequência codificadora de GPAT4-MGAT2. A sequência de codificação fundida foi então clonada como um fragmento Notl em pYES2 para gerar pYES2::GPAT4- MGAT2 e os vetores de expressão constitutivos binários pjP3343 para gerar pjP3343::GPAT4-MGAT2.
[736] De modo semelhante, uma fusão MGAT2-GPAT4 (MGAT2 N- terminal e GPAT4 C-terminal) foi feita primeiro por clonagem do fragmento DNA que codifica MGAT2 M. musculus, flanqueada por sítios de Ecori e Zral sem um códon de terminação C-terminal, nos sítios EcoRI-Zral. O fragmento de DNA que codifica para o GPAT4 A. thaliana, flanqueado por sítios Ndel-Pstl, foi então clonado nos sítios Ndel-Pstl para gerar uma única sequência de codificação MGAT2-GPAT4. A sequência de codificação fundida foi então clonada como um fragmento Notl em pYES2 para gerar pYES2:: MGAT2-GPAT4 e os vetores de expressão constitutivos binários pjP3343 para gerar pjP3343:: MGAT2-GPAT4.
[737]Os vetores de expressão de levedura são testados na levedura S. cerevisiae, e os vetores binários são testados em N. benthamiana em comparação com o teor de óleo e composição com controles de região de codi.ficação única. ExemE1o 23. Descoberta de novas 3e=êncías de WRLI
[738] Três novas sequências WRLI são clonadas em pjP3343 e outros vetores de expressão constitutivos binários adequadas e testadas em N. benthamiana..Estes incluem os genes que codificam Sorbi-WRLI1 (de Sorghum bicolor; SEQ ID NO:334), Lupar'.-WRL1 (de Lupinus angustifolius; SEQ ID NO:335) e R1CCO-WRL1 (de Ricinus communis, SEQ ID NO:336). Estos constructos são testadas em comparação com o gene que codifica WRII de Arabidopsis no ensaio de folha N. benthamiana.
[739] Como etapa inicial do processo, um fragmento de CDNA parcial correspondente à WRLI foi identificado na base de dados EST de sementes em desenvolvimento de Lupinus angustifolius (NA- 080818 Plate14f06.b1, SEQ ID NO:277). IJm CDNA de comprimento completo {SEQ ID NO:278) foi sub,sequentemente recuperado efetuando PCR 5' e 3'-RACE utilizando iniciadores encaixados e CDNAS isolados a partir de sementes em desenvolvimento de
Lupinus angustifolius. O CDNA de comprimento total foi de 1729 pb de comprimento, incluindo uma sequência de codificação de proteína de 1284 pb que codifica uma proteína de polipeptídeo previsto de 428 aminoácidos (SEQ ID NO:337). A região codificadora de comprimento completo do CDNA WRLI de tremoço foi então amplificada por PCR utilizando iniciadores diretos e reversos que ambos incorporaram sítios de restrição ECORI para facilitar a clonagem no vetor pjP3343 sob o controle de um promotor 35S melhorado na orientação de sentido reverso. A. tumefaciens cepa AGLI contendo pjP3343-LuangWRL1 foi infiltrada em tecido" de folha N. benthamiana como descrito no Exemplo 1. Discos de folha que expressam transitoriamente o pjP3343- Luang¶RL1 foram então colhidos e analisados quanto ao teor de óleo. ExemE1o 24. Sílencíamento do homó1oqo CGI-58 em N. tabaczm
[740] James et al. (2010) relataram que o silenciamento da CGI-58 homólogo de A. thaliana resultou em acumulação TAG até 10 vezes em folhas, principalmente na forma de gotículas lipídicas em citossol. Níveis de galactolipídio também demonstraram ser maiores, enquanto que os níveis da maioria das principais espécies de fosfolipídeos permaneceram inalterados. Curiosamente, os níveis de TAG em sementes não foram afetados e, ao contrário de outros mutantes de degradação de TAG, nenhum efeito negativo sobre a germinação das sementes foi observado.
[741] Três transcritos de comprimento total e dois parciais foram encontrados em transcriptoma de N. benthamiana mostrando homologia com o gene CGI-58 de A. thaliana. Uma região de 434 pb presente em todos os cinco transcritos foi amplificada a partir de RNA de folha isolada de N. benthamiana e clonada através de clonagem LR (gateway) para o vetor de destino pHELLSGATE12. O vetor de expressão resultante designado pTV46 codifica uma molécula de RNA hairpin (dsRNA) para reduzir a expressão do gene que de tabaco codifica o homólogo de CG1-58 e foi utilizado para transformar N. tabacum, como descrito no Exemplo 1, gerando 52 transformantes primários.
[742]Transformantes primários que apresentam maiores níveis de TAG nos seus tecidos vegetativos são cruzadas com linhagens homozigóticas descritas no Exemplo 20. ExemE1o 25. Sílencíamento de subunídade =eaena ADP^ícose erofosforí1,a,s,e (,AG,P,a,s,e.) _ de _ N]ab,a,c,um
[743] Sanjaya et al. (2011) dernonstraram que o silenciamento da pequena subunidade AGPase em combinação com sobre-expressão de WRI aumen'ta ainda mais a acumulação TAG ern mudas de A. thaliana, enquanto foram reduzidos os níveis de ainido. Uma pequena subunidade AGPase foi clonada a parti-r de botões florais (Kwak et al., 2007). A sequência de aminoácidos deduzida revelou 87% de identidade com a AGPase de A. thaliana. Um fragmento de 593 bp foi sintetizado e clonado no pHELLSGATE12 através de clonagern LR (gateway), resultando no vetor binário pTV35. Transformação de N. tabacum foi feita como descrito no Exernplo 1 e gerou 43 transformantes primários.
[744] Transformantes primários indica uma redução nos níveis totais de arnido em folha são cruzadàs com linhagens homozigóticas descritas nos Exemplos 20 e 21. Além disso, os transformantes primários são cruzados com linhagens homozigóticas que são o resultado de uma passagem das linhagens descritas em 20 e 21. ExeInE1o 26. Produção e utí1ízaYo de construcões de combína£ões de ,Aenes ínàmíndo um ,Rromotor índuzíye,1,
[745] Outros constructos genéticos são feitos usando um sistema promotor induzível para dirigir a expressão de pelo menos urn dos genes nas combinações de genes, como descrito acima, particularmente no pjP3503 e pjP3502. Nos constructos modificadas, o gene WRII é expresso por um proinotor induzível como promotor alcA de Aspergillus niger, na presença de um gene de alcR de Aspergillus niger expresso. Alternativamente, um DGAT é expresso usando um promotor induzível. Isso é vantajoso quando a acumulação TAG máxima não é desejável em todos os momentos
,.,. . ..,. -36,7/3 75 durante o desenvolvimento. Um sistema promotor induzível ou um sistema promotor controlado por desenvolvente, preferencialmente para dirigir o fator de transcrição WRII, permite a indução de alta fenótipo TAG em um momento apropriado durante o desenvolvimento, e a acumulação subsequente de TAG em altos níveis.
[746]TAG pode ser aumentado pela co-expressão de fatores de transcrição, incluindo fatores de transcrição embriogênicos como LEC2 ou BAÉY BOOM (BBM, Srinivasan et al., 2007). Estes são expressos sob o controle de promotores induzíveis são descritos acima e suoer-transformadas & em linhagens transgênicas ou co- transformadas com o WRI e DGAT.
[747]pjI?3590 é gerado por clonagem de urn espaçador MAR como um fragmento Aatll no sítio Aatll de pORE04. pjP3591 é gerado por clonagem de um segundo espaçador MAR, como um fragmento Kpnl no sítio Kpnl de pjP3590. pjP3592 é gerado por clonaoem do fragmento SmaI-AsiSl da molécula de DNA tendo a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO:416 (12ABFJYC pjP3569 insert; Figura 19B) nos sítios As1SI-EcoRV de pjP3591. pjP3596 é aerado por clonagem de uma cassete de expressão induzível Pstl-flanqueado contendo o promotor alcA expressando o MGAT2 M. musculus e um sinal de poliadenilação de lectina de Glycine max para um sítio Sbfl introduzido em pjP3592. Versões resistentes a higromicina de ambos pj23592 e pjP3596 (pjP3598 e pjP35o7, respectivamente) são gerados através da substituição do gene marcador selecionável NPTII com o gene HPH flanqueado nos sítios FseI-AscI.
[748] Estos constructos são utilizados para transformar as mesmas espécies de plantas, como descrito no Exemplo 20. Expressão a partir do promotor induzível é aumentada por tratamento coni o indutor das plantas transgênicas, depois de terem crescido substancialmente, de modo que eles acumulam um aumento dos níveis de TAG. Estos constructos são também super- transformadas em construções estavelmente transformadas já contendo um constructo de óleo aumentado, incluindo a região de TDNA de três genes ou quatro genes (SEQ ID NO:411 e SEQ ID NO:412, respectivamente). Em alternativa, os cassetes de expressão do gene a partir dos constructos de três genes e de quatro genes foram clonados nos sítios Notl de pjP3597 e pjP3598 para se obter um sistema de vetor constitutivo e induzível combinados para síntese alta ácido graxo e TAG, acumulação e o armazenamento.
[749] Em adição a outros promotores induzíveis, urna alternativa é que a expressão do gene pode ser termoral m e espacialmente restringida utilizando promotores que são apenas ativos durante períodos específicos do desenvolvimento ou ern tecidos específicos. Proinotores endógenos quimicamente induzíveis também são usados para limitar a expressão de janelas específicas de desenvolvimento.
[750] Será apreciado por pessoas especialistas na técnica que inúmeras variações e/ou modificações podem ser feitas para a invenção conforme mostrado nas modalidades específicas sem afastar o espírito e o espírito da invenção tão amplamente descrita. As presentes modalidades devem, consequentemente, ser consideradas em todos os respeitos como ilustrativas e não restritivas.
[751]0 presente pedido reivindica prioridade de US 61/580590 depositado em 27 de dezerríbro de 2011 e US 61/718.563 depositado em 25 de outubro de 2012, todo o conteúdo de ambas as quais são aqui incorporada" por referência.
[752] Todas as publicações discutidas e/ou mencionados neste documento são incorporadas aqui na totalidade.
[753] Qualquer discussão de docurnentos, atos, materiais, dispositivos, artigos ou similares que foi incluída no presente relatório descritivo é exclusivamente com o propósito de fornecer urn contexto para a presente invenção. Não deve ser tomada como uma admissão de que algum ou todos estes assu tos fazem parte da técnica anterior de base ou conhecimento cj ral comum no campo relevante para a presente invenção como existia antes da data de prioridade de cada reivindicação deste pedido.
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Claims (28)

REIVINDICAÇÕES
1. Processo para produzir um produto industrial, o processo caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: i) obter um organismo não humano ou uma parte do mesmo tendo um teor de lipídeos não polares totais de pelo menos 3% (p/p de peso seco ou peso da semente), ii) qualquer um de: a) converter pelo menos parte dos lipídeos no organismo não humano ou parte do mesmo da etapa (i) para o produto industrial por aplicação de meios de calor, químicos ou enzimáticos ou qualquer combinação dos mesmos, para o lipídeo in situ no organismo não humano ou parte do mesmo, ou b) processar fisicamente o organismo não humano ou parte do mesmo da etapa (i) e subsequentemente ou simultaneamente converter pelo menos parte dos lipídeos no organismo não humano ou parte do mesmo processado para o produto industrial por aplicação de meios de calor, químicos ou enzimáticos ou qualquer combinação dos mesmos, para os lipídeos no organismo não humano ou parte do mesmo processado, e iii) recuperar o produto industrial, produzindo assim o produto industrial.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o organismo não humano ou uma parte do mesmo compreende um ou mais polinucleotídeos exógenos, em que cada um dos um ou mais polinucleotídeos exógenos está ligado operativamente a um promotor que é capaz de direcionar a expressão do polinucleotídeo em um organismo não humano ou uma parte do mesmo, e em que o organismo não-humano ou parte do mesmo tem um nível aumentado de um ou mais lipídeos não polares em relação a um organismo não-humano ou uma parte do mesmo correspondente sem um ou mais polinucleotídeos exógenos.
3. Processo para a produção de lipídeos extraídos, o processo caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: i) a obtenção de um organismo não humano ou uma parte do mesmo compreendendo um ou mais polinucleotídeos exógenos e um nível aumentado de um ou mais lipídeos não polares em relação a um organismo não humano ou uma parte do mesmo correspondente, respectivamente, sem o um ou mais polinucleotídeos exógenos, ii) a extração de lipídeo do organismo não humano ou parte do mesmo, e iii) recuperação do lipídeo extraído, produzindo, assim, o lipídeo extraído, em que cada dos um ou mais polinucleotídeos exógenos está operativamente ligado a um promotor que é capaz de direcionar a expressão do polinucleotídeo em um organismo não humano ou parte do mesmo, e em que uma ou mais ou todas as seguintes características se aplicam: (a) o um ou mais polinucleotídeos exógenos compreendem um primeiro polinucleotídeo exógeno que codifica um RNA ou polipeptídeo de fator de transcrição que aumenta a expressão de um ou mais genes da biossíntese de ácidos graxos em glicolíticos em um organismo não humano ou uma parte do mesmo, e um segundo polinucleotídeo exógeno que codifica um RNA ou polipeptídeo envolvido na biossíntese de um ou mais lipídeos não polares,
(b) se o organismo não humano é uma planta, uma parte vegetativa da planta tem um teor de lipídeos não polares total de pelo menos cerca de 3%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 5%, preferencialmente pelo menos cerca de 7%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 10%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 11%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 12%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 13%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 14%, ou mais preferencialmente pelo menos cerca de 15% (p/p em peso seco),
(c) o organismo não humano é uma alga selecionada a partir do grupo que consiste em diatomáceas (bacilariofitos), algas verdes (clorófitas), algas azuis- verdes (cianofíceas), algas castanho-dourado (crisófitos), haptofitos, algas castanhas e algas heterokont,
(d) o um ou mais lipídeos não polares compreendem um ácido graxo que compreende um grupo hidroxil, um grupo epóxi, um grupo ciclopropano, uma ligação dupla carbono- carbono, uma ligação tripla carbono-carbono, ligações duplas conjugadas, uma cadeia ramificada, como uma cadeia ramificada metilada ou hidroxilada, ou uma combinação de dois ou mais dos mesmos, ou qualquer de dois, três, quatro,
cinco ou seis dos grupos acima mencionados, ligações ou cadeias ramificadas, (e) o teor total de ácidos graxos nos lipídeos não polares compreende, pelo menos, 2% mais ácido oleico e/ou, pelo menos, 2% menos ácido palmítico do que lipídeos não polares no correspondente organismo não humano ou parte do mesmo sem o um ou mais polinucleotídeos exógenos, (f) os lipídeos não polares compreendem um nível modificado de esteróis totais, preferencialmente esteróis livres (não esterificados), ésteres de esteroil, glicosídeos de esteroil, em relação aos lipídeos não polares no correspondente organismo não humano ou parte do mesmo sem o um ou mais polinucleotídeos exógenos, (g) os lipídeos não polares compreendem ceras e/ou de ésteres de cera, e (h) o organismo não humano ou parte do mesmo é um membro de uma população agrupada ou coleta de, pelo menos, cerca de 1000 tais organismos não humanos ou partes dos mesmos, respectivamente, a partir do qual o lipídeo é extraído.
4. Processo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o um ou mais polinucleotídeos exógenos compreendem o primeiro polinucleotídeo exógeno e o segundo polinucleotídeo exógeno, e em que um ou mais ou todas as características (b) a (h) se aplicam.
5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que:
(i) o organismo não humano é uma planta, uma alga, ou um organismo adequado para a fermentação, como um fungo, ou (ii) a parte do organismo não humano é uma semente, fruto, ou uma parte vegetativa de uma planta.
6. Processo para produzir óleo de canola extraído, o processo caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: i) obter sementes de canola que compreende pelo menos 5% óleo de semente em uma base em peso, ii) extrair óleo de semente de canola, e iii) recuperar o óleo, em que o óleo recuperado compreende, pelo menos, 90% (p/p) triacilgliceróis (TAG), produzindo, assim, o óleo de canola.
7. Processo para produzir óleo de soja extraído, o processo caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: i) obter sementes de soja, compreendendo, pelo menos, 20% óleo de semente em uma base de peso, ii) extrair óleo de semente de soja, e iii) recuperar o óleo, em que o óleo recuperado compreende, pelo menos, 90% (p/p) de triacilgliceróis (TAG), produzindo, assim, o óleo de soja.
8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a etapa de processar fisicamente compreende um ou mais de secar, laminar, prensar, triturar ou moer o organismo não humano ou parte do mesmo, ou a semente, e/ou purificar o lipídeo ou óleo extraído.
9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o lipídeo ou óleo extraído ou recuperado compreende triacilgliceróis, e em que os triacilgliceróis compreendem pelo menos 90% (p/p) do lipídeo ou óleo extraído.
10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que compreende um ou mais de: a) recuperar o lipídeo ou o óleo extraído, coletando o mesmo em um recipiente, b) um ou mais de desgomar, desodorizar, descolorir, secar, fracionar o lipídeo ou óleo extraído, c) removendo pelo menos algumas ceras e/ou de ésteres de cera do lipídeo ou óleo extraído, e d) analisar a composição de ácido graxo do lipídeo ou óleo extraído.
11. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o produto industrial é um produto de hidrocarboneto, como ésteres de ácidos graxos, preferencialmente ésteres metílicos de ácidos graxos e/ou ésteres etílicos de ácidos graxos, um alcano, como o metano, etano ou um alcano de cadeia mais longa, uma mistura de alcanos de cadeia mais longa, um alqueno, um biocombustível, monóxido de carbono e/ou de gás hidrogênio, um bioálcool, como etanol, propanol ou butanol, biocarvão,
ou uma combinação de monóxido de carbono, hidrogênio e biocarvão.
12. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 11, caracterizado pelo fato de que uma ou mais ou todas as seguintes características se aplicam: (i) o nível de um ou mais lipídeos não polares no organismo não humano ou parte do mesmo, ou a semente é pelo menos 0,5% superior com base em peso em relação ao nível em um correspondente organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente, respectivamente, sem o um ou mais polinucleotídeos exógenos, (ii) o nível de um ou mais lipídeos não polares no organismo não humano ou parte do mesmo, da semente é pelo menos 1% superior em termos relativos do que em um correspondente organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente, respectivamente, sem o um ou mais polinucleotídeos exógenos, (iii) o teor de lipídeos não polares total no organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente é pelo menos 0,5% superior com base no peso em relação ao nível em um correspondente organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente, respectivamente, sem um ou mais polinucleotídeos exógenos, (iv) o teor de lipídeos não polares total no organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente é pelo menos 1% superior em termos relativos do que em um correspondente organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente, respectivamente, sem o um ou mais polinucleotídeos exógenos,
(v) o nível de um ou mais lipídeos não polares e/ou o teor de lipídeos não polares total do organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente é pelo menos 0,5% superior com base em peso e/ou pelo menos 1% superior em uma base relativa do que um correspondente organismo não humano ou uma parte do mesmo, ou semente, respectivamente, que está sem o um ou mais polinucleotídeos exógenos e que compreende um polinucleotídeo exógeno que codifica um Arabidopis thaliana DGAT1,
(vi) o teor de TAG, DAG, TAG e DAG, ou MAG no lipídeo no organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente e/ou no lipídeo ou óleo extraído deste é de pelo menos 10% superior em uma base relativa do que o teor de TAG, DAG, TAG e DAG, ou MAG no lipídeo ou óleo em um correspondente organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente sem o um ou mais polinucleotídeos exógenos, ou um correspondente lipídeo ou óleo extraído do mesmo, respectivamente, e
(vii) o teor total de ácido graxo poli-insaturado (PUFA) no lipídeo no organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente e/ou no lipídeo ou óleo extraído deste é aumentado ou diminuído em relação ao teor total de PUFA no lipídeo ou óleo em um correspondente organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente sem o um ou mais polinucleotídeos exógenos, ou um correspondente lipídeo ou óleo extraído do mesmo, respectivamente,
(viii) ácido oleico compreende, pelo menos, 20% (%mol), pelo menos, 22% (%mol), pelo menos, 30% (%mol), pelo menos, 40% (%mol), pelo menos, 50% (%mol), ou, pelo menos, 60% (%mol), preferencialmente, pelo menos, 65%
(%mol) ou, pelo menos, 66% (%mol) do teor total de ácidos graxos no lipídeo não polar ou óleo no organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente, e (ix) o lipídeo não polar ou óleo no organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente compreende um ácido graxo que compreende um grupo hidroxil, um grupo epóxi, um grupo ciclopropano, uma ligação dupla carbono-carbono, uma ligação tripla carbono-carbono, ligações duplas conjugadas, uma cadeia ramificada, como uma cadeia ramificada metilada ou hidroxilada, ou uma combinação de dois ou mais dos mesmos, ou quaisquer de dois, três, quatro, cinco ou seis dos grupos acima mencionados, ligações ou cadeias ramificadas.
13. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o organismo não humano ou parte do mesmo, ou a semente compreende um primeiro polinucleotídeo exógeno que codifica um RNA ou um polipeptídeo de fator de transcrição que aumenta a expressão de um ou mais genes da biossíntese de ácido graxos ou glicolíticos em um organismo não humano ou uma parte do mesmo, ou uma semente, respectivamente, e um segundo polinucleotídeo exógeno que codifica um RNA ou um polipeptídeo envolvido na biossíntese de um ou mais lipídeos não polares, em que o primeiro e segundo polinucleotídeos exógenos são cada um operativamente ligado a um promotor que é capaz de direcionar a expressão do polinucleotídeo em um organismo não humano ou uma parte do mesmo, ou uma semente, respectivamente.
14. Processo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o primeiro polinucleotídeo exógeno codifica um fator de transcrição Wrinkled 1 (WRI1), um fator de transcrição de cotilédone frondosa 1 (Lecl), um fator de transcrição de cotilédone frondosa 2 (LEC2), um fator de transcrição Fus3, um fator de transcrição ABI3, um fator de transcrição Dof4, um fator de transcrição BABY BOOM (BBM), ou um fator de transcrição Dof11.
15. Processo, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que o segundo polinucleotídeo exógeno codifica um polipeptídeo tendo atividade de monoacilglicerol aciltransferase (MGAT) e/ou atividade de diacilglicerol aciltransferase (DGAT) ou atividade de glicerol-3-fosfato aciltransferase (GPAT).
16. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15, caracterizado pelo fato de que o organismo não humano ou parte do mesmo, ou a semente compreende ainda um terceiro ou mais polinucleotídeos exógenos que codificam uma ou mais ou qualquer combinação de: i) um outro RNA ou polipeptídeo de fator de transcrição que aumenta a expressão de um ou mais genes da biossíntese de ácidos graxos ou glicolíticos no organismo não humano ou uma parte do mesmo, ou semente, ii) um outro RNA ou polipeptídeo envolvido na biossíntese de um ou mais lipídeos não polares, iii) um polipeptídeo que estabiliza os um ou mais lipídeos não polares, preferencialmente, uma oleosina, como uma polioleosina ou uma caleosina, mais preferencialmente uma polioleosina, iv) uma molécula de RNA que inibe a expressão de um gene que codifica um polipeptídeo envolvido na biossíntese de amido, como um polipeptídeo AGPase, v) uma molécula de RNA que inibe a expressão de um gene que codifica um polipeptídeo envolvido na degradação de lipídeos e/ou que reduz o teor de lipídeos, como uma lipase, como um polipeptídeo CGi58, ou vi) um polipeptídeo supressor de silenciamento, em que o terceiro, ou mais polinucleotídeos exógenos estão ligados operativamente a um promotor que é capaz de direcionar a expressão dos polinucleotídeos em um organismo não humano ou uma parte do mesmo, ou uma semente, respectivamente.
17. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que o organismo não humano ou parte do mesmo, ou a semente compreende um ou mais polinucleotídeos exógenos que codificam: i) um fator de transcrição Wrinkled 1 (WRI1) e um DGAT, ii) um fator de transcrição WRI1, um DGAT e uma oleosina, iii) um fator de transcrição WRI1, um DGAT, um MGAT e uma oleosina, iv) uma monoacilglicerol aciltransferase (MGAT),
v) uma diacilglicerol aciltransferase 2 (DGAT2), vi) um MGAT e uma glicerol-3-fosfato aciltransferase (GPAT), vii) um MGAT e um DGAT, viii) um MGAT, um GPAT e um DGAT, ix) um fator de transcrição WRI1 e um MGAT, x) um fator de transcrição WRI1, um DGAT e um MGAT, xi) um fator de transcrição WRI1, um DGAT, um MGAT, uma oleosina e GPAT, xii) um DGAT e uma oleosina, ou xiii) um MGAT e uma oleosina, e xiv) opcionalmente, um polipeptídeo supressor de silenciamento, em que cada um dos um ou mais polinucleotídeos exógenos está ligado operativamente a um promotor que é capaz de direcionar a expressão do polinucleotídeo no organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente, respectivamente.
18. Célula recombinante, caracterizada pelo fato de que compreende um teor de lipídeos não polares total de pelo menos cerca de 3%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 5%, preferencialmente pelo menos cerca de 7%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 10%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 11%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 12%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 13%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 14%, ou mais preferencialmente pelo menos cerca de 15% (p/p), em que o lipídeo não polar compreende pelo menos 90% de triacilgliceróis (TAG), e em que a célula compreende um ou mais polinucleotídeos exógenos e um aumento do nível de um ou mais lipídeos não polares em relação a uma célula sem o um ou mais polinucleotídeos exógenos, em que cada dos um ou mais polinucleotídeos exógenos está operativamente ligado a um promotor que é capaz de direcionar a expressão do polinucleotídeo na célula, e em que um ou mais ou todas as seguintes características se aplicam:
(i) o um ou mais polinucleotídeos exógenos compreendem um primeiro polinucleotídeo exógeno que codifica um RNA ou polipeptídeo de fator de transcrição que aumenta a expressão de um ou mais genes da biossíntese do ácido graxo ou glicolítico na célula, e um segundo polinucleotídeo exógeno que codifica um RNA ou um polipeptídeo envolvido na biossíntese de um ou mais lipídeos não polares,
(ii) se a célula é uma célula de uma parte vegetativa de uma planta, a célula tem um teor de lipídeos não polares total de pelo menos cerca de 3%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 5%, preferencialmente pelo menos cerca de 7%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 10%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 11%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 12%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 13%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 14%, ou mais preferencialmente pelo menos cerca de 15% (p/p),
(iii) a célula é uma alga selecionada a partir do grupo que consiste em diatomáceas (bacilariofitos), algas verdes (clorófitas), algas azuis-verdes (cianofíceas), algas castanho-dourado (crisófitos), haptofitas, algas castanhas e algas heterokont,
(iv) os lipídeos não polares compreendem um ácido graxo que compreende um grupo hidroxil, um grupo epóxi, um grupo ciclopropano, uma ligação dupla carbono-carbono, uma ligação tripla carbono-carbono, ligações duplas conjugadas, uma cadeia ramificada, como uma cadeia ramificada metilada ou hidroxilada, ou uma combinação de dois ou mais dos mesmos, ou qualquer de dois, três, quatro, cinco ou seis dos grupos acima mencionados, ligações ou cadeias ramificadas,
(v) a célula compreende ácido oleico em uma forma esterificada ou não esterificada em seu lipídeo em que pelo menos, 20% (%mol), pelo menos, 22% (%mol), pelo menos, 30% (%mol), pelo menos, 40% (%mol), pelo menos, 50% (%mol), ou, pelo menos, 60% (%mol), preferencialmente, pelo menos, 65% (%mol) ou, pelo menos, 66% (%mol) do teor total de ácidos graxos no lipídeo da célula é ácido oleico,
(vi) a célula compreende ácido oleico em uma forma esterificada em seu lipídeo não polar em que pelo menos, 20% (%mol), pelo menos, 22% (%mol), pelo menos, 30% (%mol), pelo menos, 40% (%mol), pelo menos, 50% (%mol), ou, pelo menos, 60% (%mol), preferencialmente, pelo menos, 65% (%mol) ou, pelo menos, 66% (%mol) do teor total de ácidos graxos no lipídeo não polar da célula é ácido oleico,
(vii) o teor total de ácidos graxos no lipídeo da célula compreende, pelo menos, 2% mais ácido oleico e/ou, pelo menos, 2% menos ácido palmítico do que o lipídeo na célula correspondente sem o um ou mais polinucleotídeos exógenos, (viii) o teor total de ácidos graxos nos lipídeos não polares da célula compreende, pelo menos, 2% mais ácido oleico e/ou, pelo menos, 2% menos ácido palmítico do que o lipídeo não polar na célula correspondente sem o um ou mais polinucleotídeos exógenos, (ix) os lipídeos não polares compreendem um nível modificado de esteróis totais, preferencialmente esteróis livres, ésteres de esteroil e/ou glicosídeos de esteroil, (x) os lipídeos não polares compreendem ceras e/ou de ésteres de cera, (xi) a célula é um membro de uma população ou coleta de, pelo menos, cerca de 1000 tais células, e (xii) se a célula é uma célula de uma parte vegetativa de uma planta, a célula tem um teor de lipídeos não polares total de pelo menos cerca de 3%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 5%, preferencialmente pelo menos cerca de 7%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 10%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 11%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 12%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 13%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 14%, ou mais preferencialmente pelo menos cerca de 15% (p/p).
19. Processo para obter uma célula com maior capacidade para produzir um ou mais lipídeos não polares, o processo caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:
i) introduzir em uma célula um ou mais polinucleotídeos exógenos,
ii) expressar o um ou mais polinucleotídeos exógenos na célula ou uma célula descendente da mesma,
iii) analisar o teor lipídico da célula ou célula descendente, e iv) selecionar uma célula ou célula descendente que tem um aumento do nível de um ou mais lipídeos não polares em relação a uma célula correspondente ou célula descendente sem os polinucleotídeos exógenos,
em que o um ou mais polinucleotídeos exógenos codificam:
i) um fator de transcrição Wrinkled 1 (WRI1) e um DGAT,
ii) um fator de transcrição WRI1, um DGAT e uma oleosina,
iii) um fator de transcrição WRI1, um DGAT, um MGAT e uma oleosina,
iv) uma monoacilglicerol aciltransferase (MGAT),
v) uma diacilglicerol aciltransferase 2 (DGAT2),
vi) um MGAT e uma glicerol-3-fosfato aciltransferase (GPAT),
vii) um MGAT e um DGAT,
viii) um MGAT, um GPAT e um DGAT,
ix) um fator de transcrição WRI1 e um MGAT,
x) um fator de transcrição WRI1, um DGAT e um MGAT,
xi) um fator de transcrição WRI1, um DGAT, um MGAT, uma oleosina e GPAT, xii) um DGAT e uma oleosina, ou xiii) um MGAT e uma oleosina, e xiv) opcionalmente, um polipeptídeo supressor de silenciamento, em que cada polinucleotídeo exógeno é operativamente ligado a um promotor que é capaz de direcionar a expressão do polinucleotídeo exógeno na célula ou célula descendente.
20. Uso de um ou mais polinucleotídeos, ou um constructo genético compreendendo polinucleotídeos, caracterizado pelo fato de que codificam: i) um fator de transcrição Wrinkled 1 (WRI1) e um DGAT, ii) um fator de transcrição WRI1, um DGAT e uma oleosina, iii) um fator de transcrição WRI1, um DGAT, um MGAT e uma oleosina, iv) uma monoacilglicerol aciltransferase (MGAT), v) um diacilglicerol aciltransferase 2 (DGAT2), vi) um MGAT e uma glicerol-3-fosfato aciltransferase (GPAT), vii) um MGAT e um DGAT, viii) um MGAT, um GPAT e um DGAT, ix) um fator de transcrição WRI1 e um MGAT, x) um fator de transcrição WRI1, um DGAT e um MGAT,
xi) um fator de transcrição WRI1, um DGAT, um MGAT, uma oleosina e GPAT, xii) um DGAT e uma oleosina, ou xiii) um MGAT e uma oleosina, e xiv) opcionalmente, um polipeptídeo supressor de silenciamento, para produzir uma célula transgênica, um organismo transgênico não humano ou uma parte do mesmo ou uma semente transgênica tendo uma maior capacidade para produzir um ou mais lipídeos não polares em relação a uma célula, organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente correspondentes sem os um ou mais polinucleotídeos, em que cada um dos um ou mais polinucleotídeos é exógeno à célula, organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente e é operativamente ligado a um promotor que é capaz de direcionar a expressão do polinucleotídeo em uma célula, um organismo não humano ou uma parte do mesmo, ou uma semente, respectivamente.
21. Uso de um primeiro polinucleotídeo que codifica um RNA ou polipeptídeo de fator de transcrição que aumenta a expressão de um ou mais genes da biossíntese do ácido graxo ou glicolítico em uma célula, um organismo não humano ou uma parte do mesmo ou uma semente, em conjunto com um segundo polinucleotídeo que codifica um RNA ou um polipeptídeo envolvido na biossíntese de um ou mais lipídeos não polares, caracterizado pelo fato de ser para produzir uma célula transgênica, um organismo transgênico não humano ou parte do mesmo, ou uma semente transgênica tendo uma maior capacidade para produzir um ou mais lipídeos não polares em relação a uma célula, organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente correspondentes sem os primeiros e segundo polinucleotídeos, em que o primeiro e segundo polinucleotídeos são cada um exógeno à célula, organismo não humano ou parte do mesmo, ou semente e são cada operativamente ligado a um promotor que é capaz de direcionar a expressão do polinucleotídeo na célula transgênica, organismo transgênico não humano ou parte do mesmo, ou sementes transgênicas, respectivamente.
22. Processo para produzir semente, o processo caracterizado pelo fato de que compreende: i) crescer uma planta, e ii) coletar semente da planta, em que a semente compreende uma célula como definida na reivindicação 18.
23. Lipídeo recuperado ou extraído, caracterizado pelo fato de que é obtenível pelo processo, como definido em qualquer uma das reivindicações 3 a 17, ou obtenível pela célula, como definida na reivindicação 18, ou um organismo não humano compreendendo a célula, ou a semente produzida pelo processo, como definido na reivindicação 22.
24. Produto industrial produzido pelo processo como definido em de qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 11 a 17, caracterizado pelo fato de que é um produto de hidrocarboneto, como os ésteres de ácidos graxos, preferencialmente ésteres metílicos de ácidos graxos e/ou ésteres etílicos de ácidos graxos, um alcano como metano, etano ou um alcano de cadeia mais longa, uma mistura de alcanos de cadeia mais longa, um alqueno, um biocombustível, monóxido de carbono e/ou de gás hidrogênio, um bioálcool como etanol, propanol, ou butanol, biocarvão, ou uma combinação de monóxido de carbono, hidrogênio e biocarvão.
25. Processo para produzir combustível, o processo caracterizado pelo fato de que compreende: i) reagir o lipídeo, como definido na reivindicação 23, com um álcool, opcionalmente, na presença de um catalisador, para produzir os ésteres de alquil, e ii) opcionalmente, misturar os ésteres alquil com combustível à base de petróleo.
26. Processo para produzir um combustível diesel sintético, o processo caracterizado pelo fato de que compreende: i) converter o lipídeo na célula, como definida na reivindicação 18, ou um organismo não humano compreendendo a célula ou a semente produzida pelo processo, como definido na reivindicação 22, a um gás de síntese por gaseificação, e ii) converter gás de síntese a um biocombustível utilizando um catalisador de metal ou um catalisador microbiano.
27. Processo para produzir um biocombustível, o processo caracterizado pelo fato de que compreende converter o lipídeo na célula, como definida na reivindicação 18, ou um organismo não humano compreendendo a célula, ou a semente produzida pelo processo, como definido na reivindicação 22, a um bio-óleo por pirólise, um bioálcool por fermentação, ou biogás por gaseificação ou digestão anaeróbica.
28. Processo para produzir um ingrediente alimentar, o processo caracterizado pelo fato de que compreende misturar a célula, como definida na reivindicação 18, ou um organismo não humano compreendendo a célula, ou a semente produzida pelo processo, como definido na reivindicação 22, ou o lipídeo recuperado ou extraído, como definido na reivindicação 23, ou um extrato ou porção do mesmo, com pelo menos outro ingrediente alimentar.
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