ES2873198T3 - Microorganismos que tienen un aumento en la productividad de lípidos - Google Patents

Abstract

Un microorganismo de alga eucariota mutante que tiene una expresión atenuada de un gen que codifica un polipéptido que contiene el dominio de unión al ADN tipo fúngico Zn(2)Cys(6), en donde el polipéptido del dominio de unión al ADN tipo fúngico Zn(2)-C(6) tiene al menos un 65 % de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15 y SEQ ID NO:16, en donde el mutante produce al menos un 50 % más de lípidos derivatizables de ésteres metílicos de ácidos grasos (lípidos FAME) que un microorganismo control del que se deriva directamente el microorganismo mutante, que no tiene una expresión atenuada del gen y al menos un 70 % de la cantidad de biomasa acumulada por el microorganismo control cuando el microorganismo mutante y el microorganismo control se cultivan bajo condiciones ricas en nitrógeno bajo las que el microorganismo control se encuentra acumulando biomasa.

Description

DESCRIPCIÓN

Microorganismos que tienen un aumento en la productividad de lípidos

Antecedentes de la invención

La descripción se refiere a microorganismos mutantes, tales como algas y heterocontos, que tienen un aumento en la productividad de lípidos y su uso en la producción de lípidos.

Muchos microorganismos tales como algas, laberintulomicetos ("quítridos"), y levaduras oleaginosas inducen la biosíntesis de lípidos en respuesta al estrés de nutrientes, por ejemplo la inanición de nitrógeno. Bajo condiciones de depleción de nitrógeno, tales microorganismos redirigen la biosíntesis de compuestos de proteína a lípidos de almacenamiento, típicamente lípidos de triacilglicéridos ("TAG"). Debido a que la depleción de nitrógeno disminuye simultáneamente el crecimiento celular, la biosíntesis óptima de lípidos se limita a una ventana relativamente corta antes de que las células se deterioren demasiado metabólicamente para mantener altos niveles de producción. El combustible biológico derivado de microalgas se ha considerado por mucho tiempo una alternativa viable a los combustibles convencionales en base a petróleo. Sin embargo, a pesar de décadas de investigación biológica, privar a las cepas de macronutrientes esenciales tales como nitrógeno, fósforo, o silicio, para obtener altos rendimientos de lípidos, condiciones bajo las que se compromete el crecimiento del microorganismo huésped, sigue siendo el modus operandi. Se ha hecho poco progreso en el diseño por ingeniería genética de cepas de algas para acumular lípidos mientras se mantiene el crecimiento, ya que solo existe una comprensión incipiente de la regulación del metabolismo subyacente a la acumulación de lípidos (Courchesne y otros (2009) J. Biotechnol. 141:31-41; Goncalves y otros (2016) Plant Biotechnol. J. doi:1111/12523).

Varios intentos de mejorar la productividad de lípidos mediante el aumento de la biosíntesis de lípidos durante el crecimiento rico en nutrientes se han centrado en la manipulación de genes que codifican enzimas para la asimilación de nitrógeno o el metabolismo de lípidos, así como también genes que codifican polipéptidos que se involucran en el almacenamiento de lípidos. Por ejemplo, el documento US2014/0162330 describe una cepa de Phaeodactylum tricornutum en la que el gen de la nitrato reductasa (NR) se ha atenuado mediante bloqueo de expresión basado en ARNi; Trentacoste y otros ((2013) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110:19748-19753) describen diatomeas transformadas con una construcción de ARNi que se dirige al gen Thaps3_264297 que se predice que se involucra en el catabolismo de lípidos; y el documento WO2011127118 describe la transformación de Chlamydomonas con genes que codifican oleosinas (proteína de almacenamiento de lípidos) así como también con genes que codifican genes de diacilglicerol transferasa (DGAT). Aunque en cada caso se afirmó un aumento en la producción de lípidos en base a microscopía o tinción con tintes lipofílicos, no se proporcionó ninguna cuantificación de lípidos por las células manipuladas, ni se determinó la relación entre la biomasa y las productividades de lípidos en el tiempo.

Los documentos WO 2011/097261 y US 2012/0322157 reportan que un gen denominado "SN03" que codifica una proteína arrestina tiene un papel en el aumento de la producción de lípidos bajo condiciones ricas en nutrientes cuando se sobreexpresa en Chlamydomonas. Sin embargo, se observó que la sobreexpresión del gen SN03 resulta en la aparición de lípidos polares sin identificar, que no se cuantificaron, y no resultaron en un aumento en los triglicéridos (TAG). Otro polipéptido que se identificó como potencialmente regulador de la biosíntesis de lípidos que se induce por estrés se ha descrito por Boyle y otros ((2012) J. Biol. Chem. 287:15811-15825). La desactivación del gen NRR1 en Chlamydomonas que codifica un polipéptido de dominio "SQUAMOUSA" resulta en una reducción de la biosíntesis de lípidos con respecto a las células tipo salvaje bajo depleción de nitrógeno; sin embargo, no se obtuvieron mutantes que demostraran un aumento en la producción de lípidos. El documento US 2010/0255550 recomienda la sobreexpresión de factores de transcripción putativos ("TF1, TF2, TF3, TF4, y TF5") en células de algas para aumentar la producción de lípidos, pero no se describen mutantes que tienen una producción de lípidos potenciada.

Daboussi y otros 2014 (Nature Comm. 5:3881) reportan que la alteración del gen UGPasa en Phaeodactylum triconornutum, que se cree que proporciona precursores de la síntesis de laminarina (carbohidratos de almacenamiento), resulta en un aumento de la acumulación de lípidos. Sin embargo, no fueron mostrados datos bioquímicos que indicaran que el contenido de laminarina se afectó y no se reportaron las productividades de lípidos y biomasa. De manera similar, varios grupos han reportado aumentos en la acumulación de lípidos en mutantes sin almidón de Chlamydomonas (Wang y otros 2009 Eukaryotic Cell 8:1856-1868; Li y otros 2010 Metab Eng. 12:387-391) pero reportes sucesivos que realmente midieron la productividad de los lípidos concluyeron que estas cepas se deterioraron en crecimiento cuando crecían en condiciones fototróficas (Siaut y otros 2011 BMC Biotechnol. 11:7; Davey y otros 2014 Eukaryot Cell 13:392-400). Estos reportes concluyeron que las productividades de lípidos más altas (que se miden como TAG por litro por día) se alcanzaron realmente mediante la cepa parental tipo salvaje. El documento WO 2012/082731 describe microalgas diseñadas (Phaeodactylum tricornutum o Thalassiosira pseudonana) que exhiben una producción de lípidos potenciada durante el crecimiento exponencial, bajo condiciones en las que no se encuentran privados de nutrientes (por ejemplo, nitrógeno) debido a la atenuación de un gen que codifica una proteína que facilita la asimilación de nitrógeno, tal como la nitrato reductasa.

Boyle, Nanette R. y otros Journal of Biological Chemistry 287.19 (2012):15811-15825 describe la eliminación del gen que codifica el factor de transcripción NRR1 en Chlamydomonas por mutagénesis de inserción, lo que resulta en una reducción de la biosíntesis de lípidos (solo 50 % de TAG) con respecto a la cepa parental en condiciones de inanición de nitrógeno.

El documento US 2015/183838 describe la sobreexpresión de un factor de transcripción de tipo MYB (denominado MALTA) en Nannochloropsis, que resulta en la mejora de las tasas de crecimiento y una productividad de FAME más alta bajo condiciones ricas en nutrientes (medio que contiene nitrato 10 mM)

Resumen de la invención

Se proporcionan en la presente descripción mutantes de algas que tienen niveles elevados de producción de lípidos constitutivos. Como se demuestra en los ejemplos, el análisis de perfiles de transcripción tempranos de Nannochloropsis gaditana a la privación de N reveló un nuevo regulador negativo de la biosíntesis de lípidos ZnCys-2845, un factor de transcripción de la familia de genes fúngicos Zn(II)2Cys6. Mediante el uso de mutagénesis mediada por Cas9 y tecnología de ARNi, se produjeron cepas de ZnCys atenuadas que fueron capaces de dividir aproximadamente el 45 % de su contenido total de carbono en lípidos y de mantener el crecimiento en un sistema de crecimiento continuo, lo que resulta en una duplicación de la productividad de lípidos.

El objeto de estudio para el que se solicita protección es el que se define por las reivindicaciones.

En un primer aspecto de la invención se proporciona un microorganismo de alga eucariota mutante que tiene una expresión atenuada de un gen que codifica un polipéptido que contiene el dominio de unión al ADN tipo fúngico Zn(2)Cys(6), en donde el polipéptido del dominio de unión al ADN tipo fúngico Zn(2)-C(6) tiene al menos un 65 % de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, y SEQ ID NO:16, en donde el mutante produce al menos un 50 % más de lípidos derivatizables de ésteres metílicos de ácidos grasos (lípidos FAME) que un microorganismo control del que se deriva directamente el microorganismo mutante, que no tiene una expresión atenuada del gen y al menos un 70 % de la cantidad de biomasa acumulada por el microorganismo control cuando el microorganismo mutante y el microorganismo control se cultivan bajo condiciones ricas en nitrógeno bajo las que el microorganismo control se encuentra acumulando biomasa.

En una modalidad de la invención se proporciona un microorganismo de alga eucariota mutante de acuerdo con el primer aspecto de la invención, en donde el microorganismo mutante es un mutante de obtención clásica o un mutante diseñado por ingeniería genética.

En una modalidad adicional de la invención se proporciona un microorganismo de alga eucariota mutante de acuerdo con el primer aspecto de la invención, en donde las condiciones de cultivo son ricas en nutrientes con respecto al microorganismo control, y adicionalmente en donde las condiciones de cultivo son por lote, continuas, o semicontinuas. En una modalidad adicional de la invención se proporciona un microorganismo de alga eucariota mutante de acuerdo con el primer aspecto de la invención, en donde las condiciones de cultivo incluyen un medio de cultivo que comprende menos de 2,5 mM, menos de 1 mM, o menos de 0,5 mM de amonio, en donde de forma opcional el medio de cultivo comprende nitrato o urea.

En una modalidad adicional de la invención se proporciona un microorganismo de alga eucariota mutante de acuerdo con el primer aspecto de la invención, en donde el microorganismo mutante produce al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 75 %, o al menos un 100 % más de lípidos FAME que un microorganismo control mientras acumula al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % de la cantidad de biomasa acumulada por el microorganismo control en un período de cultivo de al menos tres, al menos cinco, al menos siete, al menos diez, o al menos doce días.

En una modalidad adicional de la invención se proporciona un microorganismo de alga eucariota mutante de acuerdo con el primer aspecto de la invención, en donde el microorganismo tiene una relación C:N que es al menos 1,5 veces la relación C:N de un microorganismo control bajo las condiciones de cultivo en las que el microorganismo mutante produce al menos un 50 % más de lípidos y al menos un 70 % de la biomasa que el microorganismo control. En una modalidad adicional de la invención se proporciona un microorganismo de alga eucariota mutante de acuerdo con el primer aspecto, en donde el microorganismo mutante exhibe una relación de éster metílico de ácido graso/carbono orgánico total (FAME/TOC) de al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, o al menos un 100 % más alta que la relación FAME/TOC del microorganismo control mientras que acumula al menos un 70 % de la biomasa acumulada por el microorganismo control, cuando el microorganismo mutante y el microorganismo control se cultivan bajo condiciones idénticas bajo las que el microorganismo control se encuentra acumulando biomasa.

En una modalidad adicional de la invención se proporciona un microorganismo de alga eucariota mutante de acuerdo con el primer aspecto de la invención, en donde el microorganismo es una especie de Labyrinthulomycte, de forma opcional una especie de Labryinthula, Labryinthuloides, Thraustochytrium, Schizochytrium, Aplanochytrium, Aurantiochytrium, Oblongichytrium, Japonochytrium, Diplophrys, o Ulkenia. En una modalidad adicional de la invención, se proporciona un microorganismo de alga eucariota mutante de acuerdo con el primer aspecto de la invención, en donde el microorganismo es una especie de alga, de forma opcional una especie de Achnanthes, Amphiprora, Amphora, Ankistrodesmus, Asteromonas, Boekelovia, Bolidomonas, Borodinella, Botrydium, Botryococcus, Bracteococcus, Chaetoceros, Cartería, Chlamydomonas, Chlorococcum, Chlorogonium, Chlorella, Chroomonas, Chrysosphaera, Cricosphaera, Crypthecodinium, Cryptomonas, Cyclotella, Desmodesmus, Dunaliella, Elipsoidon, Emiliania, Eremosphaera, Ernodesmius, Euglena, Eustigmatos, Franceia, Fragilaria, Fragilaropsis, Gloeothamnion, Haematococcus, Hantzschia, Heterosigma, Hymenomonas, Isochrysis, Lepocinclis, Micractinium, Monodus, Monoraphidium, Nannochloris, Nannochloropsis, Navicula, Neochloris, Nephrochloris, Nephroselmis, Nitzschia, Ochromonas, Oedogonium, Oocystis, Ostreococcus, Parachlorella, Parietochloris, Pascheria, Pavlova, Pelagomonas, Phaeodactylum, Phagus, Picochlorum, Platymonas, Pleurochrysis, Pleurococcus, Prototheca, Pseudochlorella, Pseudoneochloris, Pseudostaurastrum, Pyramimonas, Pyrobotrys, Scenedesmus, Schizochlamydella, Skeletonema, Spyrogyra, Stichococcus, Tetrachlorella, Tetraselmis, Thalassiosira, Tribonema, Vaucheria, Viridiella, Vischeria, y Volvox.

En un segundo aspecto de la invención se proporciona una biomasa que comprende un microorganismo de alga eucariota mutante del primer aspecto de la invención.

En un tercer aspecto de la invención se proporciona un método para producir lípidos, que comprende cultivar el microorganismo de alga eucariota mutante del primer aspecto y aislar el lípido del microorganismo, el medio de cultivo o ambos.

En una modalidad de la invención el microorganismo de alga eucariota mutante se cultiva en un medio que comprende menos de aproximadamente 2,5 mM o menos de 1 mM de amonio, de forma opcional en donde el medio incluye nitrato o urea. En una modalidad adicional de la invención el cultivo se encuentra bajo condiciones en las que la relación de éster metílico de ácido graso/carbono orgánico total (FAME a TOC) del microorganismo de alga eucariota mutante se mantiene entre 0,3 y 0,9, entre aproximadamente 0,4 y 0,8, o entre aproximadamente 0,4 y aproximadamente 0,7.

En una modalidad adicional de la invención el microorganismo de alga eucariota mutante es una especie de Labyrinthulomycte, de forma opcional una especie de Labryinthula, Labryinthuloides, Thraustochytrium, Schizochytrium, Aplanochytrium, Aurantiochytrium, Oblongichytrium, Japonochytrium, Diplophrys, o Ulkenia, o en donde el microorganismo mutante es una especie de alga, de forma opcional una especie de Achnanthes, Amphiprora, Amphora, Ankistrodesmus, Asteromonas, Boekelovia, Bolidomonas, Borodinella, Botrydium, Botrycoccus, Bracteococcus, Chaetoceros, Carteria, Chlamydomonas, Chlorococcum, Chlorogonium, Chlorella, Chroomonas, Chrysosphaera, Cricosphaera, Crypthecodinium, Cryptomonas, Cyclotella, Desmodesmus, Dunaliella, Elipsoidon, Emiliania, Eremosphaera, Ernodesmius, Euglena, Eustigmatos, Franceia, Fragiliaria, Fragilaropsis, Gloeothamnion, Haematococcus, Hantzschia, Heterosigma, Hymenomonas, Isochrysis, Lepocinclis, Micractinium, Monodus, Monoraphidium, Nannochloris, Nannochloropsis, Navicula, Neochloris, Nephrochloris, Nephroselmis, Nitzschia, Ochromonas, Oedogonium, Oocystis, Ostreococcus, Parachlorella, Parietochloris, Pascheria, Pavlova, Pelagomonas, Phaeodactylum, Phagus, Picochlorum, Platymonas, Pleurochrysis, Pleurococcus, Prototheca, Pseudochlorella, Pseudoneochloris, Pseudostaurastrum, Pyramimonas, Pyrobotrys, Scenedesmus, Schizochlamydella, Skeletonema, Spyrogyra, Stichococcus, Tetrachlorella, Tetraselmis, Thalassiosira, Tribonema, Vaucheria, Viridiella, Vischeria, y Volvox. En una modalidad adicional de la invención el cultivo es fotoautótrofo.

Un primer caso que se describe en la presente descripción es un microorganismo mutante que produce al menos un 25 % más de lípidos que el que se produce por un microorganismo control mientras que produce no menos de un 45 % de la biomasa que se produce por el microorganismo control que se cultiva bajo las mismas condiciones, en las que las condiciones de cultivo apoyan la producción de biomasa por el microorganismo control. Por ejemplo, un microorganismo mutante como se proporciona en la presente descripción puede producir al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, o al menos un 100 % más de lípidos que los que se producen por un microorganismo control que se cultiva bajo las mismas condiciones que el microorganismo mutante, que pueden ser condiciones de cultivo por lote, semicontinuas, o continuas, y en varios casos son condiciones de cultivo en las que el microorganismo control acumula biomasa. El microorganismo control puede ser, en algunos ejemplos, un microorganismo tipo salvaje, es decir, un microorganismo tipo salvaje del que se deriva directa o indirectamente el microorganismo mutante. El microorganismo mutante puede producir, en varios casos, al menos aproximadamente un 50 % de la biomasa y al menos aproximadamente un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 100 %, al menos un 110 %, o al menos un 120 % más de lípidos que los que se producen por un microorganismo control que se cultiva bajo las mismas condiciones, donde el microorganismo control produce la biomasa, por ejemplo, produce biomasa en el transcurso del cultivo o diariamente, bajo las condiciones de cultivo en las que el mutante produce más lípidos. En varios ejemplos un microorganismo mutante como se proporciona en la presente descripción produce al menos un 50 % de la biomasa y al menos un 130 %, al menos un 150 %, al menos un 140 %, al menos un 155 %, al menos un 160 %, al menos un 170 %, al menos un 175 %, al menos un 180 %, al menos un 185 %, al menos un 190 %, al menos un 195 %, al menos un 200 %, al menos un 210 %, o al menos un 215 % de la cantidad de lípidos que se producen por un microorganismo tipo salvaje que se cultiva bajo las mismas condiciones, bajo las que el microorganismo tipo salvaje acumula biomasa. Por ejemplo, las condiciones de cultivo se pueden encontrar ricas en nitrógeno con respecto al microorganismo control o tipo salvaje.

Un microorganismo mutante como se describe en la presente descripción puede producir al menos un 25 % más de lípidos FAME que un microorganismo control o tipo salvaje mientras que produce al menos un 45 % o al menos aproximadamente un 50 % igual de biomasa que el microorganismo control o tipo salvaje en un período de cultivo de al menos tres días, al menos cinco días, al menos siete días, al menos ocho días, al menos diez días, al menos doce días, al menos quince días, al menos veinte días, al menos treinta días, o al menos sesenta días. Por ejemplo, la productividad promedio diaria de FAME puede ser al menos un 50 % mayor que la de un microorganismo control o tipo salvaje, mientras que la productividad promedio diaria de la biomasa (por ejemplo, TOC) puede ser al menos un 45 % o al menos aproximadamente un 50 % que la del microorganismo control o tipo salvaje en un período de cultivo de al menos tres días, al menos cinco días, al menos siete días, al menos diez días, al menos doce días, al menos quince días, al menos veinte días, al menos treinta días, o al menos sesenta días. En ejemplos particulares, un microorganismo mutante como se proporciona en la presente descripción puede producir al menos un 50 % más de lípidos FAME que un microorganismo control o tipo salvaje mientras que produce al menos un 60 % igual de biomasa que el microorganismo control en un período de cultivo de al menos siete días, al menos ocho días, o al menos diez días donde la cantidad diaria que se produce de FAME por el mutante no es inferior a la cantidad diaria que se produce de FAME por el microorganismo control o tipo salvaje en cualquier día durante un período de cultivo de al menos siete, al menos ocho, o al menos diez días. En ejemplos adicionales, la productividad promedio diaria de FAME de un microorganismo mutante como se proporciona en la presente descripción puede ser al menos un 50 % más alta que la productividad promedio diaria de FAME de un microorganismo control o tipo salvaje, la productividad promedio diaria de la biomasa puede ser al menos un 50 % de la productividad promedio diaria de la biomasa del microorganismo control en un período de cultivo de al menos siete días, al menos ocho días, o al menos diez días donde la cantidad diaria que se produce de FAME por el mutante no es inferior a la cantidad diaria que se produce de FAME por el microorganismo control o tipo salvaje en cualquier día durante un período de cultivo de al menos siete, al menos ocho, o al menos diez días.

Por ejemplo, un microorganismo mutante como se describe en la presente descripción puede producir más lípidos derivatizables de FAME ("lípidos FAME" o "FAME") que un microorganismo control mientras que produce no menos de un 45 % de la biomasa que se produce por el microorganismo control, cuando el microorganismo mutante y el microorganismo control se cultivan bajo las mismas condiciones de cultivo bajo las que el microorganismo control produce biomasa. Un microorganismo mutante como se proporciona en la presente descripción puede tener mayor productividad promedio diaria de FAME que un microorganismo control mientras exhibe al menos un 45 % de la productividad promedio diaria de biomasa del microorganismo control, cuando el microorganismo mutante y el microorganismo control se cultivan bajo las mismas condiciones de cultivo bajo las que el microorganismo control produce biomasa. En varios ejemplos, un microorganismo mutante como se proporciona en la presente descripción produce al menos un 50 % más de lípidos FAME mientras que produce no menos de aproximadamente 50 %, no menos de aproximadamente 60 %, o no menos de aproximadamente 70 % de la biomasa que se produce por el microorganismo control, cuando el microorganismo mutante y el microorganismo control se cultivan bajo las mismas condiciones de cultivo bajo las que el cultivo del microorganismo control produce biomasa, que pueden ser condiciones de cultivo ricas en nitrógeno con respecto al microorganismo control. El microorganismo control en varios casos puede ser un microorganismo tipo salvaje, por ejemplo, un microorganismo tipo salvaje del que se deriva directa o indirectamente el microorganismo mutante.

En algunos ejemplos, las condiciones de cultivo bajo las que el mutante produce más lípidos que un microorganismo control o tipo salvaje pueden ser condiciones de cultivo en las que la concentración de amonio en el medio de cultivo es menos de aproximadamente 2,5 mM, por ejemplo, menos de aproximadamente 2 mM, menos de aproximadamente 1,5 mM, menos de aproximadamente 1 mM, o menos de o igual a aproximadamente 0,5 mM. En algunos ejemplos el medio de cultivo puede no incluir el amonio que se añade o sustancialmente nada de amonio. En algunos ejemplos, el medio de cultivo puede no incluir una fuente que se añade de nitrógeno reducido para el microorganismo, por ejemplo, amonio, urea, o aminoácidos que se pueden metabolizar por el microorganismo. El medio de cultivo puede, en algunos ejemplos, incluir una fuente de nitrógeno tal como, pero que no se limita a, nitrato. Alternativamente o, además, el medio de cultivo puede incluir urea. En algunos ejemplos, el medio de cultivo se encuentra rico en nutrientes con respecto a un microorganismo tipo salvaje de la especie de la que se deriva el microorganismo mutante.

En varios casos, el microorganismo mutante puede ser un microorganismo fotosintético y el microorganismo mutante puede producir al menos un 25 % más de lípidos FAME que un microorganismo control mientras que produce al menos un 45 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % de la cantidad de biomasa que un microorganismo control o tipo salvaje bajo condiciones de cultivo fotoautótrofo. Por ejemplo un microorganismo mutante como se proporciona en la presente descripción puede ser un alga, tal como una microalga eucariota, y puede producir al menos un 25 % más de lípidos FAME que un microorganismo control o tipo salvaje mientras que produce al menos un 45 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % de la cantidad de biomasa que un microorganismo control cuando ambos microorganismos control se cultivan mediante el uso de carbono inorgánico como sustancialmente la única fuente de carbono en los cultivos. El microorganismo control puede ser, por ejemplo, un microorganismo tipo salvaje.

Las condiciones de cultivo en las que un microorganismo mutante como se describe en la presente descripción puede producir más lípidos FAME que un microorganismo control o tipo salvaje mientras que produce al menos un 45 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o al menos un 95 % de la cantidad de biomasa que un microorganismo control o tipo salvaje incluye cualquiera de las condiciones de cultivo por lote, continuas, o semicontinuas en las que el microorganismo control o tipo salvaje produce biomasa. En varios casos, un microorganismo mutante como se proporciona en la presente descripción puede producir al menos un 50 % más de lípidos FAME que un microorganismo control o tipo salvaje mientras que produce al menos un 45 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % igual de biomasa que el microorganismo control o tipo salvaje en un período de cultivo de al menos al menos tres días, al menos cuatro días, al menos cinco días, al menos siete días, al menos ocho días, al menos diez días, o al menos doce días. En algunos casos, la productividad promedio diaria de FAME de un microorganismo mutante es al menos un 50 % más que la de un microorganismo control o tipo salvaje, mientras que la productividad promedio diaria de la biomasa (por ejemplo, productividad de TOC) es al menos un 45 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % tan grande como el del microorganismo control o tipo salvaje en el período de cultivo, por ejemplo, en un período de cultivo de al menos tres días, al menos cuatro días, al menos cinco días, al menos siete días, al menos diez días, o al menos doce días.

En algunos ejemplos, un microorganismo mutante como se describe en la presente descripción puede producir al menos un 50 % más de lípidos FAME mientras que produce al menos aproximadamente un 75 % de la cantidad de biomasa que se produce por un microorganismo tipo salvaje o control durante un período de cultivo de al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos diez, al menos once, al menos doce, o al menos trece días, por ejemplo, en un período de cultivo de al menos cinco, al menos diez, al menos quince, al menos veinte, o al menos treinta días donde el microorganismo mutante y control se cultivan bajo las mismas condiciones, bajo las que tanto los microorganismos mutantes como control producen biomasa. Por ejemplo, un microorganismo mutante puede demostrar al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 100 %, o al menos un 110 %, o al menos un 120 % más alto de productividad de FAME y no exhibir más que un 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, 2 %, o 1 % de disminución en la productividad de la biomasa (por ejemplo, TOC) con respecto a un microorganismo tipo salvaje o control que se cultiva por al menos cinco, al menos seis, al menos siete, o al menos ocho días bajo condiciones en las que tanto el cultivo de microorganismos control como mutantes producen biomasa. Por ejemplo, la productividad promedio diaria de FAME de un mutante como se proporciona en la presente descripción puede ser al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 100 %, o al menos un 110 % más que la de un microorganismo tipo salvaje o control y la productividad promedio diaria de la biomasa (por ejemplo, TOC) puede ser al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, o al menos aproximadamente un 80 % de la productividad promedio diaria de la biomasa del microorganismo control bajo condiciones en las que tanto el cultivo de microorganismos control como mutantes se encuentran produciendo biomasa. En varios casos, la productividad promedio diaria de FAME de un mutante como se proporciona en la presente descripción puede ser al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 100 %, o al menos un 110 % más que el de un microorganismo tipo salvaje o control y la productividad promedio diaria de la biomasa (por ejemplo, TOC) puede ser al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 60 %, al menos aproximadamente un 70 %, o al menos aproximadamente un 80 % de la productividad promedio diaria de la biomasa del microorganismo control bajo condiciones en las que tanto el cultivo de microorganismos control como mutantes se encuentran produciendo biomasa diariamente. En algunos ejemplos, un microorganismo mutante puede producir al menos un 100 % más o al menos un 120 % más de lípidos FAME que un microorganismo tipo salvaje o control, mientras que produce al menos aproximadamente un 75 % o al menos aproximadamente un 80 % de la biomasa que se produce por un microorganismo tipo salvaje que se cultiva bajo condiciones idénticas que se encuentran ricas en nitrógeno con respecto al microorganismo control. En otros ejemplos un microorganismo mutante puede producir al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 % más de lípidos FAME que un microorganismo tipo salvaje o control, mientras que produce aproximadamente igual biomasa que la que se produce por un microorganismo tipo salvaje que se cultiva bajo condiciones idénticas bajo las que el microorganismo control o tipo salvaje produce biomasa, por ejemplo, dentro del 10 % o dentro del 5 % de la cantidad de biomasa que se produce por el microorganismo control. En varios ejemplos, la productividad promedio diaria de FAME por al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos diez, al menos once, al menos doce, o al menos trece días de cultivo, por ejemplo, al menos cinco, al menos diez, al menos quince, al menos veinte, o al menos treinta días de cultivo pueden ser al menos un 80 % mayor que la productividad promedio diaria de FAME de un microorganismo tipo salvaje o control y la productividad promedio diaria de la biomasa puede ser sustancialmente la misma que la de un microorganismo control o tipo salvaje que se cultiva bajo condiciones idénticas bajo las que el microorganismo tipo salvaje o control produce biomasa, por ejemplo, dentro del 10 %, dentro del 5 %, o dentro del 2 % de la productividad de la biomasa del microorganismo control. Las condiciones en las que un microorganismo mutante produce al menos un 80 % más de lípidos FAME que un microorganismo tipo salvaje o control mientras que produce al menos igual biomasa que la que se produce por un microorganismo tipo salvaje se pueden encontrar ricas en nutrientes con respecto al microorganismo tipo salvaje o control, y se puede encontrar rico en nitrógeno con respecto al microorganismo tipo salvaje o control. En varios casos el microorganismo mutante puede ser un microorganismo fotosintético, por ejemplo, un alga, y las condiciones de cultivo bajo las que el alga mutante tiene una mayor productividad de FAME mientras que produce al menos un 50 % del TOC como un microorganismo control son condiciones fotoautótrofas.

Un microorganismo mutante como se describe en la presente descripción puede tener una relación de lípidos FAME (FAME) a carbono orgánico total (TOC) al menos un 30 % más alta que la relación FAME/TOC del microorganismo control bajo condiciones de cultivo en las que el microorganismo mutante produce al menos un 45 % más de lípidos FAME y al menos un 50 % igual de biomasa que el microorganismo control. La relación FAME/TOC de un microorganismo mutante como se proporciona en la presente descripción puede ser, por ejemplo, al menos un 30 % más alto, al menos un 40 % más alto, al menos un 50 % más alto, al menos un 60 % más alto, al menos un 70 % más alto, al menos un 80 % más alto, al menos un 90 % más alto, al menos un 100 % más alto, al menos un 110 % más alto, al menos un 120 % más alto, al menos un 130 % más alto, al menos un 140 % más alto, al menos un 150 % más alto, o al menos un 200 % más alto a la relación FAME/TOC de un microorganismo control o tipo salvaje que se cultiva bajo condiciones idénticas bajo las que el organismo control o tipo salvaje produce biomasa, que se puede encontrar repleta de nitrógeno con respecto al microorganismo tipo salvaje. En varios casos, la relación FAME/TOC del mutante es al menos 0,3, al menos 0,4, al menos 0,5, al menos 0,6, al menos 0,7, o al menos 0,8 mientras que el cultivo del microorganismo mutante se encuentra acumulando TOC. Por ejemplo, un microorganismo mutante como se proporciona en la presente descripción puede tener al menos un 25 % de productividad de lípidos más alto que un microorganismo control, mientras que exhibe no menos de un 45 % o no menos de aproximadamente un 50 % de la productividad promedio diaria de la biomasa del microorganismo control, y puede tener adicionalmente relaciones de lípidos FAME (FAME)/carbono orgánico total (TOC) al menos un 30 %, al menos un 50 %, al menos un 70 %, o al menos un 90 % más altas que la relación FAME/TOC de un microorganismo tipo salvaje, por al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos diez, al menos once, al menos doce, al menos trece, al menos quince, al menos veinte, al menos veinticinco, al menos treinta, o al menos sesenta días de cultivo, cuando el microorganismo mutante y el microorganismo control se cultivan bajo las mismas condiciones de cultivo en las que tanto el microorganismo mutante como el microorganismo control acumulan biomasa, por ejemplo, acumulan biomasa diariamente. En varios casos, la relación FAME/TOC del mutante es al menos 0,3, al menos 0,4, al menos 0,5, al menos 0,6, al menos 0,7, al menos 0,8, o entre aproximadamente 0,35 y 0,85, o entre aproximadamente 0,4 y aproximadamente 0,8 mientras que el microorganismo mutante produce al menos un 50 % de TOC que se produce por el microorganismo control en un período de al menos tres, al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos diez, al menos once, al menos doce, al menos trece, al menos quince, al menos veinte, al menos veinticinco, al menos treinta, o al menos sesenta días de cultivo, donde se cultivan el microorganismo mutante y control bajo las mismas condiciones y el mutante produce más lípidos que el microorganismo control, y tanto el microorganismo mutante como el microorganismo control producen biomasa.

Por tanto, un caso adicional que se describe en la presente descripción es un microorganismo mutante que exhibe una relación FAME/TOC más alta que la que se exhibe por un microorganismo control cuando tanto el microorganismo mutante como el microorganismo control se cultivan bajo condiciones sustancialmente idénticas bajo las que tanto el cultivo del microorganismo mutante como del microorganismo control se encuentran acumulando TOC. En varios ejemplos, un microorganismo mutante tiene una relación FAME/TOC más alta que la que se exhibe por un microorganismo control cuando el microorganismo mutante y el microorganismo control se cultivan bajo condiciones idénticas bajo las que tanto el microorganismo control como el microorganismo mutante producen biomasa y el cultivo del microorganismo mutante produce al menos aproximadamente un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, o aproximadamente o sustancialmente la misma cantidad de TOC que el cultivo del microorganismo tipo salvaje. La relación FAME/TOC de un microorganismo mutante como se proporciona en la presente descripción puede ser, por ejemplo, al menos un 30 % más alto, al menos un 40 % más alto, al menos un 50 % más alto, al menos un 60 % más alto, al menos un 70 % más alto, al menos un 80 % más alto, al menos un 90 % más alto, al menos un 100 % más alto, al menos un 110 % más alto, al menos un 120 % más alto, al menos un 130 % más alto, al menos un 140 % más alto, o al menos un 150 % más alto que la relación FAME/TOC de un microorganismo control o tipo salvaje durante un período de cultivo en el que el microorganismo mutante produce al menos aproximadamente un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, o sustancialmente la misma cantidad de TOC que el cultivo del microorganismo tipo salvaje. Por ejemplo, la productividad promedio diaria de la biomasa de un microorganismo mutante puede ser al menos aproximadamente un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, que la de un cultivo de microorganismos control o tipo salvaje, mientras que tiene una relación FAME/TOC al menos un 30 % más alto, al menos un 40 % más alto, al menos un 50 % más alto, al menos un 60 % más alto, al menos un 70 % más alto, al menos un 80 % más alto, al menos un 90 % más alto, al menos un 100 % más alto, al menos un 110 % más alto, al menos un 120 % más alto, al menos un 130 % más alto, al menos un 140 % más alto, o al menos un 150 % más alto que la relación FAME/TOC de un microorganismo control o tipo salvaje que se promedia en el mismo período de tiempo.

Un microorganismo muíante como se describe en la presente descripción, por ejemplo, un microorganismo muíante tal como cualquiera de los que se describen en la presente descripción que produce al menos aproximadamente un 50 % de la biomasa y al menos aproximadamente un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 100 %, al menos un 110 %, o al menos un 120 % más de lípidos que los que se producen por un microorganismo control que se cultiva bajo las mismas condiciones, donde las condiciones apoyan la acumulación de biomasa por el microorganismo control, pueden tener una relación de carbono a nitrógeno (C:N) más alta que un microorganismo control. Por ejemplo, la relación C:N puede ser de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 2,5 veces la relación C:N de un microorganismo control cuando el microorganismo mutante y el microorganismo control se cultivan bajo condiciones en las que tanto los microorganismos mutantes como control acumulan biomasa, y el mutante produce al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, o al menos un 100 % más de lípidos que el microorganismo control y al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, o al menos un 85% del TOC del microorganismo control. Un microorganismo mutante como se proporciona en la presente descripción, por ejemplo, un microorganismo mutante tal como cualquiera de los que se describen en la presente descripción que produce al menos aproximadamente un 50 % de la biomasa y al menos aproximadamente un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 100 %, al menos un 110 %, o al menos un 120 % más de lípidos que los que se producen por un microorganismo control que se cultiva bajo las mismas condiciones, donde las condiciones apoyan la acumulación diaria de biomasa por el microorganismo control, pueden tener una relación de carbono a nitrógeno (C:N) más alta que un microorganismo control. Por ejemplo, la relación C:N puede ser de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 2,5 veces la relación C:N de un microorganismo control cuando el microorganismo mutante y el microorganismo control se cultivan bajo condiciones en las que tanto los microorganismos mutantes como control acumulan biomasa diariamente, y el mutante produce al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o al menos un 100 % más de lípidos que el microorganismo control y al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, o al menos un 85 % del TOC del microorganismo control. En algunos casos, la relación C:N de un mutante como se proporciona en la presente descripción se encuentra entre aproximadamente 7 y entre aproximadamente 20, o entre aproximadamente 8 y aproximadamente 17, o entre aproximadamente 10 y aproximadamente 15, durante el período de cultivo en el que el mutante produce al menos un 50 % más de lípidos que un microorganismo control mientras que produce al menos un 50 % igual de biomasa que el microorganismo control. Un microorganismo control en cualquiera de los casos o ejemplos de la presente descripción puede ser un microorganismo tipo salvaje.

Alternativamente o además, un microorganismo mutante como se describe en la presente descripción, por ejemplo, un microorganismo mutante tal como cualquiera de los que se describen en la presente descripción que produce al menos aproximadamente un 50 % de la biomasa y al menos aproximadamente un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 100 %, al menos un 110 %, o al menos un 120 % más de lípidos que los que se producen por un microorganismo control que se cultiva bajo las mismas condiciones, donde las condiciones apoyan la acumulación de biomasa por el microorganismo control (por ejemplo, cuando las condiciones apoyan la acumulación diaria de biomasa por el microorganismo control), pueden tener una reducción del contenido de proteína cuando se compara con un microorganismo control. Por ejemplo, un microorganismo mutante como se proporciona en la presente descripción puede tener una disminución en el contenido de proteína de al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 45 %, o al menos un 50 % con respecto a un microrganismo control. El microorganismo mutante puede dividir al menos un 35 %, al menos un 40 %, o al menos aproximadamente un 45 % de su carbono total en lípidos mientras que produce al menos un 50 % más de lípidos que un microorganismo control bajo las mismas condiciones de cultivo en las que los microorganismos mutantes producen al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 % igual de biomasa que el microorganismo control.

Adicionalmente, un microorganismo mutante tal como cualquiera de los que se proporciona en la presente descripción puede, en algunos casos, tener una expresión atenuada de un gen que codifica una proteína cuya expresión afecta la expresión de otros genes, por ejemplo, al menos diez, al menos veinte, al menos treinta, al menos cuarenta, al menos cincuenta, al menos sesenta, al menos setenta, al menos ochenta, al menos noventa, o al menos 100 genes adicionales. Por ejemplo, un mutante como se proporciona en la presente descripción puede tener al menos diez genes que se regulan positivamente con respecto a un microorganismo tipo salvaje y al menos diez genes que se regulan negativamente con respecto a un microorganismo tipo salvaje bajo condiciones en las que se muestra el fenotipo mutante (como se describe en la presente descripción). Un mutante como se proporciona en la presente descripción puede tener al menos veinte, al menos treinta, al menos cuarenta, al menos cincuenta, al menos sesenta, al menos setenta, al menos ochenta, al menos noventa, o al menos 100 genes que se regulan positivamente con respecto a un microorganismo tipo salvaje y al menos veinte, al menos treinta, al menos cuarenta, al menos cincuenta, al menos sesenta, al menos setenta, al menos ochenta, al menos noventa, o al menos 100 genes que se regulan negativamente con respecto a un microorganismo tipo salvaje bajo condiciones en las que se expresa el fenotipo mutante (por ejemplo, mayor producción de lípidos con respecto al microorganismo tipo salvaje). En algunos casos, los genes que codifican polipéptidos que se involucran en la síntesis de proteínas se pueden regular positivamente en un mutante como se proporciona en la presente descripción, por ejemplo, genes que codifican polipéptidos ribosomales u otros polipéptidos que funcionan en la traducción de proteínas, que incluyen, sin limitación, aquellos que pertenecen a los grupos de ontología genética (GO) tales como "traducción", "ribosoma" y/o "regulación del inicio de la traducción". Alternativamente a o en combinación con la regulación positiva de genes que codifican polipéptidos que se relacionan con la síntesis de proteínas, uno o más genes que codifican polipéptidos que se involucran en la asimilación de nitrógeno tales como uno o más de una nitrito reductasa, glutamina sintetasa, transportador de amonio y/o una enzima que se involucra en la biosíntesis del cofactor molibdeno se pueden regular negativamente en un mutante como se proporciona en la presente descripción. Alternativamente o en combinación con cualquiera de los anteriores, un mutante como se proporciona en la presente descripción puede exhibir una regulación positiva de uno o más genes que se relacionan con la biosíntesis de lípidos que incluyen, pero no se limitan a, desaturasas, elongasas, proteínas de superficie de gotas lipídicas y/o lipasas, aciltransferasas, y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasas particulares.

Un mutante como se describe en la presente descripción puede ser un mutante que se obtiene mediante mutagénesis clásica o puede ser un mutante diseñado por ingeniería genética. En varios casos, se ha generado un microorganismo mutante como se describe en la presente descripción se ha generado mediante la introducción de una o más construcciones genéticas (una o más moléculas de ácido nucleico) en el microorganismo. En algunos ejemplos, una o más construcciones genéticas que se introducen en un microorganismo se diseñan para atenuar la expresión de un gen nativo.

En varios ejemplos, los mutantes que se describen en la presente descripción pueden tener una expresión atenuada de un factor de transcripción fúngico de tipo Zn(2)Cys(6), es decir, un gen que codifica un polipéptido que tiene un dominio Zn(2)Cys(6), por ejemplo, tiene una secuencia de aminoácidos que codifica un dominio "GAL4" cd00067 o un dominio "Zn_clus" que pertenece a pfam PF00172. Por ejemplo, un microorganismo mutante tal como cualquiera que se describe en la presente descripción tiene una producción de FAME que aumenta por al menos un 25 % y una producción de biomasa que se reduce por no más de un 50 % con respecto a un microorganismo control por al menos 3, al menos 5, al menos 7, al menos 10, al menos 12, al menos 13, al menos 15, al menos 20, al menos 25, o al menos 30 días de cultivo pueden tener una expresión atenuada de un gen que codifica un polipéptido que recluta a pfam PF00172. Alternativamente o además, un microorganismo mutante tal como cualquiera que se describe en la presente descripción que tiene una relación FAME/TOC que es al menos un 30 % más alta que la relación FAME/TOC de un microorganismo control bajo condiciones en las que el microorganismo control se encuentra produciendo biomasa puede ser un microorganismo mutante que tiene una expresión atenuada de un gen que codifica un polipéptido que tiene un dominio Zn(2)Cys(6), por ejemplo, que tiene una secuencia de aminoácidos que codifica un dominio que pertenece a pfam PF00172 o se caracteriza como un dominio cd00067 "GLA4". En algunos ejemplos, el dominio Zn(2)Cys(6) puede tener al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % de identidad con SEQ ID NO:3.

Por tanto, otro caso es un microorganismo mutante que tiene una expresión atenuada de un gen que codifica un polipéptido que tiene un dominio Zn(2)Cys(6), en donde el microorganismo mutante tiene un aumento en la división de carbono a lípido con respecto a un microorganismo control que no tiene una expresión atenuada del gen que codifica un polipéptido que tiene un dominio ZnCys. Por ejemplo, un microorganismo mutante como se proporciona en la presente descripción que tiene una expresión atenuada de un polipéptido que tiene un dominio Zn(2)Cys(6) puede tener un aumento de la relación FAMe/TOC con respecto a una célula control cuando el microorganismo mutante y el microorganismo control se cultivan bajo condiciones idénticas bajo las que el cultivo del microorganismo control experimenta un aumento en TOC. En algunos ejemplos, un microorganismo mutante como se proporciona en la presente descripción puede tener una relación FAME/TOC que aumenta por al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 100 %, al menos un 110 %, al menos un 120 %, al menos un 130 %, al menos un 140 %, o al menos un 150 % en comparación con la relación FAME/TOC de un microorganismo control cuando el microorganismo mutante y el microorganismo control se cultivan bajo condiciones idénticas bajo las que el cultivo del microorganismo control experimenta un aumento en TOC. Alternativamente o además, un microorganismo mutante como se proporciona en la presente descripción que tiene una expresión atenuada de un gen que codifica un polipéptido que tiene un dominio Zn(2)Cys(6) puede tener un aumento en la producción de lípidos FAME con respecto a un microorganismo control mientras que no demuestra más que una reducción de un 45 % en la producción de TOC con respecto al microorganismo control cuando el microorganismo mutante y el microorganismo control se cultivan bajo condiciones idénticas bajo las que el microorganismo control experimenta un aumento en TOC. Por ejemplo, un microorganismo mutante como se proporciona en la presente descripción que tiene una expresión atenuada de un gen que codifica un polipéptido que tiene un dominio Zn(2)Cys(6) puede producir al menos un 25 % o al menos un 50 % más de lípidos FAME o al menos un 75 % más de lípidos FAME con respecto a un microorganismo control mientras que demuestran no más que una reducción de un 50 % en la producción de TOC con respecto al microorganismo control cuando el microorganismo mutante y el microorganismo control se cultivan bajo condiciones idénticas bajo las que el microorganismo control experimenta un aumento en TOC. En varios casos, el microorganismo mutante puede mostrar una productividad de lípidos y/o división de carbono a lípidos más alta en un período de cultivo de al menos 3, al menos 5, al menos 7, al menos 10, al menos 12 días, al menos 13, al menos 15, al menos 20, o al menos 30 días. Por ejemplo, el microorganismo mutante puede tener una productividad de lípidos más alta cada día en un período de cultivo de al menos 5, al menos 7, al menos 10, al menos 12 días, al menos 15, al menos 20, o al menos 30 días.

En algunos casos ilustrativos la secuencia de aminoácidos del polipéptido que tiene un dominio Zn(2)Cys(6) es al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % idéntico a cualquiera de SEQ ID NO:2,

SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, o SEQ ID NO:17. En algunos ejemplos, un microorganismo mutante como se proporciona en la presente descripción puede tener una expresión atenuada de un gen que codifica un polipéptido que tiene al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un

75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % de identidad con SEQ ID NO:2,

SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:11, o SEQ ID NO:17. Por ejemplo, un microorganismo mutante como se proporciona en la presente descripción puede tener una expresión atenuada de un gen que codifica un polipéptido que tiene al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % de identidad con SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:17, o al menos los

517 aminoácidos N-terminal de SEQ ID NO:2 o los 540 aminoácidos N-terminal de SEQ ID NO:17. En ejemplos adicionales un microorganismo mutante como se proporciona en la presente descripción ha atenuado la expresión de un gen que codifica un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 % al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % de identidad con cualquiera de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, o

SEQ ID NO:19, o a los aminoácidos 1-200 de SEQ ID nO:20. En algunos ejemplos, un microorganismo mutante como se proporciona en la presente descripción puede tener una expresión atenuada de un gen que codifica un polipéptido que tiene al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % de identidad con SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:17.

Alternativamente o, además, un microorganismo mutante como se proporciona en la presente descripción puede tener una expresión atenuada de un gen que tiene una secuencia de codificación con al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % de identidad con SEQ ID NO:1 o cualquiera de SEQ ID NO:72-84.

En varios casos el microorganismo es una diatomea o alga eustigmatófita, y en algunos ejemplos puede ser una especie de Nannochloropsis.

Alternativamente o, además de cualquiera de los anteriores, un microorganismo mutante como se proporciona en la presente descripción puede tener una expresión atenuada de un gen que codifica un polipéptido que tiene un dominio Zn(2)Cys(6) e incluye adicionalmente un dominio PAS3. En algunos ejemplos el dominio PAS3 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % de identidad con cualquiera de SEQ ID NO:21-25. El gen cuya expresión se encuentra atenuada puede codificar adicionalmente un polipéptido que incluye adicionalmente una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50

%, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80

%, al menos un 85 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % de identidad con al menos 200 aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO:18-20. En varios casos el gen que tiene una expresión atenuada puede ser un gen que codifica un polipéptido que tiene al menos

Un gen atenuado que codifica un polipéptido que tiene un dominio Zn(2)Cys(6) puede ser un gen que tiene una inserción, deleción y/o uno o más cambios de base con respecto al gen tipo salvaje. La inserción, deleción, o uno o más cambios de base se pueden encontrar en una región de codificación, intrón, región 3' sin traducir, o región 5' sin traducir del gen, o se puede encontrar corriente arriba de la región 5' sin traducir del gen, por ejemplo, en la región promotora de un gen, donde el mutante produce menos de un ARN correspondiente al gen y/o produce menos del polipéptido que se codifica. Alternativamente o, además, un microorganismo mutante como se proporciona en la presente descripción puede incluir una construcción antisentido, una construcción de ARNi, un A^r N guía (ARNg) como parte de un sistema CRISPR, o una ribozima que se dirige al gen que codifica el polipéptido que tiene un dominio Zn(2)Cys(6), lo que resulta en una reducción de la expresión del gen.

Un microorganismo mutante como se describe en la presente descripción puede ser cualquier microorganismo eucariota y, en algunos ejemplos, es un heteroconto o alga. Por ejemplo, el microorganismo mutante puede ser una especie de Labyrinthulomycte, tal como, por ejemplo, una especie de Labryinthula, Labryinthuloides, Thraustochytrium, Schizochytrium, Aplanochytrium, Aurantiochytrium, Oblongichytrium, Japonochytrium, Diplophrys, o Ulkenia. Alternativamente un microorganismo mutante puede ser una especie de alga tal como por ejemplo, una especie que pertenece a cualquiera de los géneros Achnanthes, Amphiprora, Amphora, Ankistrodesmus, Asteromonas, Boekelovia, Bolidomonas, Borodinella, Botrydium, Botryococcus, Bracteococcus, Chaetoceros, Carteria, Chlamydomonas, Chlorococcum, Chlorogonium, Chlorella, Chroomonas, Chrysosphaera, Cricosphaera, Crypthecodinium, Cryptomonas, Cyclotella, Desmodesmus, Dunaliella, Elipsoidon, Emiliania, Eremosphaera, Ernodesmius, Euglena, Eustigmatos, Franceia, Fragilaria, Fragilaropsis, Gloeothamnion, Haematococcus, Hantzschia, Heterosigma, Hymenomonas, Isochrysis, Lepocinclis, Micractinium, Monodus, Monoraphidium, Nannochloris, Nannochloropsis, Navicula, Neochloris, Nephrochloris, Nephroselmis, Nitzschia, Ochromonas, Oedogonium, Oocystis, Ostreococcus, Parachlorella, Parietochloris, Pascheria, Pavlova, Pelagomonas, Ph&odactylum, Phagus, Picochlorum, Platymonas, Pleurochrysis, Pleurococcus, Prototheca, Pseudochlorella, Pseudoneochloris, Pseudostaurastrum, Pyramimonas, Pyrobotrys, Scenedesmus, Schizochlamydella, Skeletonema, Spyrogyra, Stichococcus, Tetrachlorella, Tetraselmis, Thalassiosira, Tribonema, Vaucheria, Viridiella, Vischeria, y Volvox. En algunos casos, un microorganismo muíante es una diatomea o alga eustigmatofita. En algunos casos, el microorganismo mutante es una especie de Nannochloropsis.

Un caso adicional que se describe en la presente descripción es un método para producir lípidos, que comprende cultivar un microorganismo mutante como se proporciona en la presente descripción y aislar el lípido del microorganismo, el medio de cultivo o ambos. El microorganismo mutante se puede cultivar en un medio que comprende menos de aproximadamente 5 mM de amonio, menos de aproximadamente 2,5 mM de amonio, menos de o igual a aproximadamente 1 mM de amonio, o menos de o igual a aproximadamente 0,5 mM. El medio de cultivo puede incluir, por ejemplo, de aproximadamente 0 a aproximadamente 2,5 mM de amonio, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 2,5 mM de amonio, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 2,5 mM de amonio, de aproximadamente 0 a aproximadamente 1 mM de amonio, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1 mM de amonio, o de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 1 mM de amonio. El microorganismo se puede cultivar en un medio que incluye nitrato, que en algunos ejemplos puede ser sustancialmente la única fuente de nitrógeno en el medio de cultivo o se puede encontrar presente además del amonio, que se puede encontrar presente en una concentración de menos de 5 mM, menos de 2,5 mM, menos de 2 mM, o menos de 1 mM. Alternativamente o, además, el medio de cultivo puede comprender urea, que en algunos ejemplos puede ser sustancialmente la única fuente de nitrógeno en el medio de cultivo. El microorganismo mutante se puede cultivar bajo los modos por lote, continuo, o semicontinuo. El microorganismo mutante puede, en algunos casos, ser un microorganismo fotosintético, por ejemplo, un alga, y se puede cultivar fotoautotróficamente.

Aún otro caso que se describe en la presente descripción es un método para producir lípidos que incluye cultivar un microorganismo bajo condiciones en las que la relación de FAME a TOC del microorganismo se mantiene entre aproximadamente 0,3 y aproximadamente 0,8, y aislar el lípido del microorganismo, el medio de cultivo o ambos. Por ejemplo, los microorganismos se pueden cultivar de modo que la relación de FAME a TOC se mantiene entre aproximadamente 0,3 y aproximadamente 0,8, entre aproximadamente 0,4 y aproximadamente 0,7, entre aproximadamente 0,4 y aproximadamente 0,6, o entre aproximadamente 0,45 y aproximadamente 0,55. La relación se puede mantener entre aproximadamente 0,3 y aproximadamente 0,8, por ejemplo entre aproximadamente 0,4 y aproximadamente 0,8, entre aproximadamente 0,4 y aproximadamente 0,7, entre aproximadamente 0,4 y aproximadamente 0,6, o entre aproximadamente 0,45 y aproximadamente 0,55 por al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 15, al menos 20, al menos 30 días, o al menos 60 días. El microorganismo se puede cultivar bajo los modos por lote, continuo, o semicontinuo. El método de producción de lípidos puede incluir cultivar un microorganismo mutante tal como cualquiera de los que se proporciona en la presente descripción bajo condiciones en las que la relación de FAME a TOC del microorganismo se mantiene entre aproximadamente 0,3 y aproximadamente 0,8, entre aproximadamente 0,3 y aproximadamente 0,8, entre aproximadamente 0,4 y aproximadamente 0,7, entre aproximadamente 0,4 y aproximadamente 0,6, o entre aproximadamente 0,45 y aproximadamente 0,55. Por ejemplo, el microorganismo puede ser un microorganismo mutante que tiene una expresión atenuada de un gen regulador Zn(2)Cys(6), tal como pero no que no se limita a, un gen que codifica un polipéptido que tiene al menos un 55 %, al menos un 65 %, al menos un 75 %, o al menos un 85 % de identidad con un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:5-17. Alternativamente o, además, el microorganismo puede ser un microorganismo mutante que tiene una expresión atenuada de un gen que tiene una secuencia de codificación que tiene al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % de identidad con SEQ ID NO:1 o cualquiera de SEQ ID NO:71-84. En cualquiera de los métodos anteriores para producir lípidos, el microorganismo mutante puede ser un alga y el cultivo se puede encontrar bajo condiciones fotoautótrofas, es decir, condiciones en las que el carbono inorgánico es sustancialmente la única fuente de carbono en el medio de cultivo.

Aún otro caso que se describe en la presente descripción es una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, o al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % de identidad con SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, o SEQ ID NO:17. El polipéptido que tiene al menos un 60 % de identidad con una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:5-17 puede incluir una secuencia de aminoácidos que codifica un dominio Zn(2)Cys(6). La molécula de ácido nucleico en varios ejemplos puede ser o comprender un ADNc que carece de uno o más intrones presentes en el gen de origen natural o, alternativamente, puede incluir uno o más intrones no presentes en el gen de origen natural. La molécula de ácido nucleico en varios ejemplos puede tener una secuencia que no es 100 % idéntica a un gen de origen natural. La molécula de ácido nucleico en varios ejemplos puede comprender un promotor heterólogo enlazado operativamente a la secuencia que codifica un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, o al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % de identidad con SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, o SEQ ID NO:17 y/o puede comprender un vector que incluye una secuencia que codifica un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, o al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % de identidad con SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, o SEQ ID NO:17.

Un ejemplo adicional de la descripción es una construcción que se diseña para atenuar la expresión de un gen que codifica un polipéptido que contiene un dominio Zn(2)Cys(6). La construcción puede ser o comprender, en varios ejemplos, una secuencia que codifica un ARN guía de un sistema CRISPR, una construcción de ARNi, una construcción antisentido, una construcción de ribozima, o una construcción por recombinación homóloga, por ejemplo, una construcción que tiene una o más secuencias de nucleótidos que tienen homología con un gen que codifica el dominio Zn(2)Cys(6) de origen natural como se describe en la presente descripción y/o secuencias adyacentes a las mismas en el genoma nativo del que se deriva el gen. Por ejemplo, la construcción puede incluir al menos una porción de un gen que codifica un polipéptido que tiene un dominio Zn(2)Cys(6), por ejemplo, una secuencia homóloga a al menos una porción de un gen que codifica un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácido que tiene al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, o al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % de identidad con SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, o SEQ ID NO:17. Alternativamente o, además, la construcción puede incluir una secuencia que tiene al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % de identidad con SEQ ID NO:1 o cualquiera de SEQ ID NO:71-84.

La construcción puede incluir, por ejemplo, al menos una porción de la región de codificación de un gen que codifica un polipéptido que tiene un dominio Zn(2)Cys(6), al menos una porción de un intrón de un gen que codifica un polipéptido que tiene un dominio Zn(2)Cys(6), al menos una porción de una UTR 5' de un gen que codifica un polipéptido que tiene un dominio Zn(2)Cys(6), al menos una porción de la región promotora de un gen que codifica un polipéptido que tiene un dominio Zn(2)Cys(6) y/o al menos una porción de una UTR 3' de un gen que codifica un polipéptido que tiene un dominio Zn(2)Cys(6). En algunos ejemplos, la construcción puede ser un ARNi, ribozima, o construcción antisentido y puede incluir una secuencia de la región que se transcribe del gen que codifica un polipéptido que tiene un dominio Zn(2)Cys(6) ya sea en orientación con sentido o antisentido. En otros ejemplos, se puede diseñar una construcción para la expresión in vitro o in vivo de un ARN guía (por ejemplo, de un sistema CRISPR) que se diseña para dirigirse a un gen que codifica un polipéptido que tiene un dominio Zn(2)Cys(6), y puede incluir una secuencia homóloga a una porción de un gen que codifica un polipéptido que tiene un dominio Zn(2)Cys(6), que incluye, por ejemplo, un intrón, una UTR 5', una región promotora y/o una ^uT^r 3' de un gen que codifica un polipéptido que tiene un dominio Zn(2)Cys(6). Aún en ejemplos adicionales, una construcción para atenuar la expresión de un gen que codifica un polipéptido que contiene el dominio Zn(2)Cys(6) puede ser un ARN guía de un sistema CRISPR o un sistema CRISPRi o puede ser un oligonucleótido antisentido, donde la secuencia que tiene la homología con una región que se transcribe de un gen que codifica un polipéptido que tiene un dominio Zn(2)Cys(6) se encuentra en orientación antisentido.

Estos y otros objetos y características de la invención se harán más evidentes cuando se lea la siguiente descripción detallada de la invención junto con los dibujos que la acompañan.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A-1B, A) proporciona un gráfico que muestra la acumulación de lípidos (FAME) de cultivos de Nannochloropsis tipo salvaje que crecen en condiciones ricas en N (+N) y de depleción de N (-N). Las muestras de un punto de tiempo de 3 horas se sometieron a análisis transcriptómico (RNA-seq). B) proporciona un gráfico de los genes que se expresan de forma diferencial en células que se transfieren al medio -N en comparación con las células que se proporcionan con el medio rico en N. Los genes (que se representan como puntos) se grafican frente al cambio de pliegues (log2) en las células que se tratan con -N en comparación con las células ricas. Los factores de transcripción putativos se representan como X. Los genes presentes en el lado derecho del eje y se regulan positivamente y los genes del lado izquierdo del eje y se regulan negativamente. Solo los genes con una tasa de descubrimiento falso (FDR) menor de o igual a 0,01 se muestran en el gráfico.

La Figura 2 es un mapa esquemático del vector pSGE-6206 que se usa para introducir el gen Cas9 en la línea del editor de N. gaditana.

Las Figuras 3A-3C, A) proporciona un mapa del vector que se usa para generar la cepa de expresión Ng-CAS9+ de Cas9 en Nannochloropsis; B) es un histograma superpuesto del citómetro de flujo Accuri C6 que muestra la fluorescencia de la GFP en la cepa del editor de Ng-Cas9 (pico derecho, en rojo) en comparación con la cepa tipo salvaje (pico izquierdo, en negro); C) es una imagen de una transferencia Western con un anticuerpo anti-FLAG que demuestra la expresión de Cas9 en la línea Ng-CAS9+, sin antecedentes en el control tipo salvaje.

Las Figuras 4A-4C, A) proporciona un diagrama del fragmento donante que se usa para la alteración del gen en los sitios diana Cas9. La construcción del fragmento donante incluye el gen HygR (resistencia a higromicina) controlado por el promotor EIF3 y es seguido del terminador GNPDA en orientación invertida. B) Representación esquemática de una inserción mediada por Cas9 del casete de resistencia a higromicina (HygR) en el locus ZnCys. El casete HygR consiste de un promotor (Prom) que impulsa el gen HygR seguido de un terminador (T). El genotipo mutante resultante (ZnCys-KO) se identificó por PCR mediante el uso de cebadores que flanquean la inserción (flechas). El diagrama no se encuentra escalado. C) El genotipado por PCR de varias colonias resistentes a Hyg transformadas con un ARN guía que se diseña para dirigirse al locus ZnCys. La presencia de una banda de 3 Kb indica la inserción en el locus que se pretende, mientras que una banda de 0,5 Kb indica un locus tipo salvaje intacto.

La Figura 5 es una representación esquemática del gen ZnCys-2845 de N. gaditana. Un cuadro denota la posición del dominio Zn(2)Cys(6), que fue la región diana de la construcción de ARNi. Las posiciones de las inserciones del fragmento donante en los mutantes BASH-3, con desactivación génica, y BASH-12 son mostradas mediante flechas. También es mostrada la ubicación general de la señal de localización nuclear monopartita putativa (NLS). La figura no se encuentra escalada.

Las Figuras 6A-6B, A) proporciona perfiles de irradiación incidente para la evaluación del crecimiento por lote, B) y el ensayo de productividad semicontinuo.

Las Figuras 7A-7H, A) es un gráfico que representa la productividad de FAME de células de N. gaditana tipo salvaje y con desactivación génica de ZnCys-2845 que se cultivan en modo por lote en medio solo de nitrato como se determina a partir de muestras tomadas en días impares del cultivo; B) es un gráfico que representa las productividades de TOC por 3-7 días del ensayo de productividad del lote. C) es un gráfico que representa las relaciones FAME/TOC que se calculan a partir de muestras tomadas en días impares del cultivo; D) es un gráfico de barras que representa la cantidad de ácidos grasos de varias longitudes de cadena presentes en el lípido que se aísla el día 7 del ensayo por lote de la cepa GE-8564 de WT-3730 tipo salvaje y con desactivación génica de ZnCys 2845; E) es un gráfico de barras que representa el nivel de TAG que se aísla de la cepa GE-8564 tipo salvaje y con desactivación génica de ZnCys 2845 el día 7 del ensayo por lote; F) es una micrografía electrónica de una célula de Nannochloropsis gaditana tipo salvaje que se cultiva en medio de cultivo solo de nitrato (rico en nitrógeno), G) es una micrografía electrónica de una célula GE-8564 mutante por desactivación génica de ZnCys de Nannochloropsis gaditana que se cultiva en medio de cultivo solo de nitrato, H) es una micrografía electrónica de una célula de Nannochloropsis gaditana tipo salvaje que se cultiva en medio de cultivo de depleción de nitrógeno. Las barras de error en los gráficos representan la desviación estándar del valor promedio de tres cultivos (réplicas biológicas). Símbolos que se usan en los gráficos: los asteriscos representan el WT-3730 tipo salvaje que se cultivan en medio de nitrato más amonio PM124, los diamantes negros representan el GE-8564 mutante por desactivación génica que se cultiva en medio de nitrato más amonio PM124, las X representan el WT-3730 tipo salvaje que se cultiva en medio solo de nitrato PM074, y los círculos negros representan el GE-8564 mutante por desactivación génica que se cultiva en medio solo de nitrato PM074. N: núcleo; Ch: cloroplasto; LD: gota de lípido; M: mitocondria.

Las Figuras 8A-8C, proporcionan gráficos que demuestran la represión del fenotipo de acumulación de lípidos de ZnCys-KO por la suplementación con NH4+ en un ensayo de modo por lote de cinco días. A) FAME (mg/L) por día, B) TOC (mg/L) por día, y C) valores de FAME/TOC por día de ZnCys-KO (círculos) y WT (diamantes) que crecen en modo por lote en un medio que se complementa con NH4+ (SM-NH4+/NO3'). Las barras de error son desviaciones estándar de 2 réplicas biológicas (n=2).

La Figura 9 es una alineación de las secuencias del dominio PAS3 de ZnCys-2845 de N. gaditana y las secuencias del dominio PAS3 de los ortólogos ZnCys-2845 de N. oceanica, N. oculata, N. salina y N. granulata.

La Figura 10 es una alineación de la secuencia de polipéptidos de N. gaditana que se codifica por el gen ZnCys-2845 y la secuencia de polipéptidos de N. oceanica que se codifica por el ortólogo del gen ZnCys-2845, así como también secuencias parciales N-terminal de polipéptidos que se codifican por genes ortólogos en N. granulata, N. oculata y N. salina.

Las Figuras 11A-11C proporcionan gráficos que representan las productividades de la cepa tipo salvaje de N. gaditana y la cepa GE-8564 con desactivación génica en un ensayo semicontinuo en el que el medio de cultivo incluye urea como la única fuente de nitrógeno. A) muestra la productividad diaria de FAME en trece días del ensayo; B) muestra la productividad diaria de TOC en trece días del ensayo; y C) proporciona las relaciones FAME/TOC para cada día del ensayo. Las barras de error en los gráficos representan la desviación estándar de los tres cultivos independientes (réplicas biológicas). Símbolos que se usan en los gráficos: los cuadrados representan el WT-3730 tipo salvaje que se cultiva en medio solo de urea PM125, los triángulos representan el WT-3730 tipo salvaje que se cultiva en medio solo de nitrato PM074, los círculos representan el GE-8564 mutante por desactivación génica de ZnCys-2845 que se cultiva solo en medio solo de urea PM125, y los diamantes representan el GE-8564 mutante por desactivación génica de ZnCys-2845 que se cultiva en medio solo de nitrato PM074.

Las Figuras 12A-B A) es una descripción esquemática del gen ZnCys-2845 con las posiciones de la señal de localización nuclear (NLS), el dominio (Zn) de Zn(2)Cys(6) y el dominio PAS3 mostrados como cuadros y flechas que representan los sitios de mutaciones que se dirigen a CRISPR, B) muestra los niveles de transcripción relativos de los mutantes que se dirigen a CRISPR correspondientes (posición de cebadores que se usan para la evaluación de la transcripción mostrada en A). Los niveles de expresión normalizados son relativos al nivel promedio tipo salvaje que se estableció en 1,0.

Las Figuras 13A-13C, A) es un gráfico que representa la productividad de FAME de células de N. gaditana tipo salvaje y con bloqueo de expresión de ZnCys-2845 que se cultivan en modo por lote en medio solo de nitrato; B) es un gráfico que muestra los valores de TOC para los días impares del cribado (días 1-3 y días 3-5); C) es un gráfico que proporciona las relaciones FAME/TOC de los cultivos que se calculan los días 3, 5 y 7. Símbolos que se usan en los gráficos: los círculos abiertos representan el WT-3730 tipo salvaje, un signo más representa el GE-13108 mutante por desactivación génica, "BASH2"; un asterisco representa el ^g E-13109 mutante por desactivación génica, "BASH3"; las X representan el GE-13112 mutante por desactivación génica, "BASH12"; los triángulos abiertos representan el GE-8564 mutante por desactivación génica de ZnCys-2845; y los guiones representan la cepa GE-13103 de ARNi-7. Las barras de error representan la desviación estándar de dos valores de productividad que se calculan de dos cultivos por separado.

Las Figuras 14A-14C, A) proporciona la estructura modular y las características destacadas del locus ZnCys. Abreviaturas: NLS, secuencia de localización nuclear; Zn2Cys6, dominio de agrupamiento binuclear Zn(II)2Cys6 (Pfam id: PF00172). La ubicación aproximada de la inserción en el ZnCys-KO mutante original se indica con una flecha negra. Las flechas estampadas indican ubicaciones de mutantes de inserción Cas9 exitosos en UTR 5' putativo (BASH-3 (cepa GE-13109) ~ 65 pb del sitio de inicio predicho) y regiones UTR 3' (BASH-12 (cepa GE-13112), aproximadamente 30 pb del codón de parada predicho). Las flechas horizontales negras muestran la ubicación aproximada de los cebadores de qRT-PCR que se usan para evaluar los niveles de expresión génica en el panel B. La horquilla de ARNi que se diseña para silenciar ZnCys que abarca el dominio conservado de Zn2Cys6 fue homóloga a la secuencia que se indica por la flecha doble punteada. La figura no se encuentra escalada. B) Niveles de ARNm en estado estacionario del locus ZnCys en líneas de ZnCys atenuadas (de izquierda a derecha en el gráfico, ZnCys-BASH-3, ZnCys-BASH-12, ZnCys-ARNi-7, y ZnCys-KO tipo salvaje (WT)) en relación con el tipo salvaje (WT) como se determina por qRT-PCR (de izquierda a derecha en el gráfico, ZnCys-BASH-3, ZnCys-BASH-12, ZnCys-ARNi-7, y ZnCys-KO tipo salvaje (WT)). Los niveles de expresión se normalizaron a un gen de mantenimiento y se calcularon en relación con el WT mediante el uso del método AAC^{t .} Las barras de error son errores estándar para 3 réplicas técnicas. C) Productividad de TOC y valores de FAME/TOC de líneas mutantes de ZnCys que se evalúan en modo por lote en medio rico en nitrato (SM-NO3-). Los puntos de datos individuales que se usan para calcular los promedios de productividad de biomasa y FAME/TOC son mostrados en la Figura 15. Las barras de error son desviaciones estándar de dos réplicas biológicas.

Las Figuras 15A-15B, A) evaluación del modo por lote de FAME (mg/L) que se produce por líneas atenuadas de ZnCys (ZnCys-BASH-3 (GE-13109), ZnCys-BASH-12 (GE-13112), ZnCys-ARNi-7 (GE-13103)) que se cultiva en medio rico en nitrato y B) evaluación en modo por lote de las mediciones de TOC (mg/L) correspondientes a los días 3, 5 y 7 del cribado.

Las Figuras 16A-16D proporcionan gráficos y una tabla que representan las productividades de la cepa tipo salvaje de N. gaditana y la cepa GE-8564 con desactivación génica en un ensayo semicontinuo en el que el medio de cultivo que se usa para la dilución diaria incluye nitrato como la única fuente de nitrógeno. A) muestra la productividad diaria de FAME en trece días del ensayo (mg/L de cultivo); B) proporciona las productividades diarias de los cultivos en g/m2/día (desviación estándar de tres cultivos entre paréntesis), junto con la productividad promedio diaria para cada cultivo; C) muestra la productividad diaria de TOC en trece días del ensayo (mg/L de cultivo); y D) proporciona las relaciones FAME/TOC para cada día del ensayo. Símbolos que se usan en los gráficos: los diamantes representan el WT-3730 tipo salvaje que se cultiva previamente en medio solo de nitrato; Las X representan el GE-13108 mutante por bloqueo de expresión "BASH2" que se cultiva previamente en medio de nitrato más amonio; los triángulos representan el GE-13109 mutante por bloqueo de expresión "BASH3" que se cultiva previamente en medio de nitrato más amonio; los cuadrados representan el GE-13112 mutante por bloqueo de expresión "BASH 12" que se cultiva previamente en medio de nitrato más amonio; los círculos abiertos representan el GE-13103 mutante por bloqueo de expresión "ARNi-7" que se cultiva previamente en medio de nitrato más amonio; los círculos cerrados representan el GE-13103 mutante por bloqueo de expresión "ARNi-7" que se cultiva previamente en medio solo de nitrato; y los guiones representan el GE-8564 mutante por desactivación génica que se cultiva previamente en medio de nitrato más amonio. Las barras de error en los gráficos representan la desviación estándar de los tres cultivos independientes (réplicas biológicas).

Las Figuras 17A-17B. Evaluación de la productividad de mutantes de ZnCys que crecen en modo semicontinuo por 8 días en medio de cultivo que contiene NO3'. Mediciones A) diarias de FAME y B) TOC (mg/L) para mutantes de ZnCys (ZnCys-ARNi-7, ZnCys-BASH-12, y ZnCys-BASH-3) en comparación con sus líneas parentales Ng-CAS9+ y WT. Los cultivos crecieron en modo semicontinuo a una tasa de dilución diaria del 30 % en SM-NO3-. Las barras de error representan desviaciones estándar para 3 réplicas biológicas (n=3).

La Figura 18 proporciona un gráfico de barras de las productividades de FAME y TOC (g/m2/día) de mutantes de ZnCys (ZnCys-ARNi-7 (GE-13103), ZnCys-BASH-12 (GE-13112), y ZnCys-BASH-3 (GE-13109)) en comparación con sus líneas parentales Ng-CAS9+ (GE-6791) y WT en el ensayo cuyas productividades diarias de FAME y TOC se muestran en la Figura 17. Los valores de productividad son promedios de 8 días de mediciones diarias (n=3).

La Figura 19 proporciona un gráfico que representa el contenido diario de nitrógeno de las células (mg/L de cultivo, solo sedimentos) en el ensayo semicontinuo cuyas productividades diarias de FAME y TOC se proporcionan en las Figuras 16A-D. Símbolos que se usan en los gráficos: los diamantes representan el WT-3730 tipo salvaje que se cultiva previamente en medio solo de nitrato; las X representan el GE-13108 mutante por bloqueo de expresión "BASH2" que se cultiva previamente en medio de nitrato más amonio; los triángulos representan el GE-13109 mutante por bloqueo de expresión "BASH3" que se cultiva previamente en medio de nitrato más amonio; los cuadrados representan el ^g E-13112 mutante por bloqueo de expresión "BASH 12" que se cultiva previamente en medio de nitrato más amonio; los círculos abiertos representan el GE-13103 mutante por bloqueo de expresión "ARNi-7" que se cultiva previamente en medio de nitrato más amonio; los círculos cerrados representan el GE-13103 mutante por bloqueo de expresión "ARNi-7" que se cultiva previamente en medio solo de nitrato; y los guiones representan el GE-8564 mutante por desactivación génica que se cultiva previamente en medio de nitrato más amonio. Las barras de error en los gráficos representan la desviación estándar de los tres cultivos independientes (réplicas biológicas).

La Figura 20 proporciona un gráfico que representa el nitrógeno total y los niveles de FAME de cultivos de la cepa WT-3730 tipo salvaje de N. gaditana y el GE-13103 mutante de ARNi en un ensayo semicontinuo mediante el uso de medio solo de nitrato, en el que la cepa GE-13103 con bloqueo de expresión se cultivó previamente por separado ya sea en medio PM124 que incluye tanto nitrato como amonio o en medio PM074 que incluye solo nitrato. La cepa WT-3730 tipo salvaje se cultivó previamente en medio PM074 que incluye solo nitrato. Los diamantes sólidos y los triángulos sólidos representan el contenido total de nitrógeno de los cultivos (células más medio de cultivo) de GE-13103 que se cultiva previamente en PM124 y PM074, respectivamente. Los diamantes abiertos y los triángulos abiertos representan el contenido de FAME de los cultivos de GE-13103 que se cultiva previamente en PM124 y PM074, respectivamente. Los cuadrados sólidos representan el contenido de FAME de un cultivo de WT-3730 que se cultiva previamente en medio solo de nitrato. La cantidad que se calcula de amonio en tres días del ensayo de productividad se indica en el gráfico.

Las Figuras 21A-21F, proporcionan gráficos y una tabla que muestra las productividades de la cepa WT-3730 tipo salvaje de N. gaditana y la cepa de GE-13103 con bloqueo de expresión en un ensayo semicontinuo en el que el medio de cultivo incluye tres concentraciones diferentes de amonio. A) representa la productividad de FAME (mg/L) en el ensayo semicontinuo en cultivo en el que el nivel de amonio del medio que se usa a lo largo del ensayo fue 2,5, 1,0, o 0,5 mM; B) proporciona productividades de FAME diarias (g/m2/día) (desviación estándar de tres cultivos entre paréntesis), junto con la productividad promedio diaria para cada condición de cultivo en el ensayo semicontinuo en el que el nivel de amonio del medio que se usa a lo largo del ensayo fue de 2,5, 1,0, o 0,5 mM; C) representa la productividad de TOC (mg/L) en el ensayo semicontinuo en el que el nivel de amonio del medio que se usa a lo largo del ensayo fue 2,5, 1,0, o 0,5 mM; D) proporciona productividades diarias de TOC (g/m2/día) (desviación estándar de tres cultivos para cada concentración de amonio que se proporciona entre paréntesis), junto con la productividad promedio diaria para cada condición de cultivo en el ensayo semicontinuo en el que el nivel de amonio de los medios que se usan a lo largo del ensayo fue 2,5, 1,0, o 0,5 mM; E) representa las proporciones de FAME/TOC diarias en el ensayo semicontinuo en el que el nivel de amonio del medio que se usa a lo largo del ensayo fue 2,5, 1,0, o 0,5 mM; y F) proporciona conteos celulares diarios determinados mediante citometría de flujo de cultivos que se analizan para las productividades de FAME y TOC en A-E. Símbolos que se usan en los gráficos: Círculos: WT-3730 que se cultiva en medio solo de nitrato; Cuadrados: cepa GE-13103 con bloqueo de expresión por ARNi que se cultiva en medio que contiene nitrato que también incluye 2,5 mM de amonio; Triángulos: cepa GE-13103 con bloqueo de expresión por ARNi que se cultiva en medio que contiene nitrato que también incluye 1,0 mM de amonio; X: cepa GE-13103 con bloqueo de expresión por ARNi que se cultiva en medio que contiene nitrato que también incluye 0,5 mM de amonio. Las barras de error en los gráficos representan la desviación estándar de los tres cultivos independientes (réplicas biológicas).

Las Figuras 22A-22D, Evaluación de la productividad de ZnCys-KO y ZnCys-ARNi-7 que crecen en modo semicontinuo en medio que contiene nitrato. A) FAME diario (mg/L), B) TOC diario (mg/L), y C) Valores de C/N que se derivan del contenido de N celular. D) proporciona un gráfico de barras que compara las productividades de FAME y E) TOC (g/m2/día) para WT y ZnCys-ARNi-7 que se calculan para el ensayo completo de 13 días. El ZnCys-KO falló en alcanzar el estado estacionario en un esquema de dilución diaria del 30 % y esencialmente se lavó a medida que avanzó el proceso, por lo tanto no se calcularon los valores de productividad de lípidos y biomasa para esta línea (N/A, no disponible). Se amplió la escala de ZnCys-KO en un medio de cultivo que incluye NH4+ además de NOa- para obtener suficiente biomasa para el ensayo.

La Figura 23 es un gráfico de barras que representa la composición biomolecular de la cepa tipo salvaje de Nannochloropsis WT-3730 y dos mutantes con bloqueo de expresión de ZnCys, GE-13112 (BASH 12) y GE-13130 (ARNi).

La Figura 24 muestra el agrupamiento jerárquico por distancia euclidiana de los cambios de pliegues de transcripción de genes que codifican proteínas que se involucran en la asimilación de N a partir de triplicados biológicos de ZnCys-KO, la nitrato reductasa imitante por desactivación génica (NR-KO), ARNi-7 y WT que crecen en modo por lote en medio solo de nitrato (NO3, verde claro) o medio que incluye tanto amonio como nitrato (NH4, verde oscuro). El rojo indica un aumento de la expresión y el azul indica una reducción de la expresión, siendo el negro neutro (ni aumento ni disminución).

La Figura 25 proporciona imágenes de análisis de inmunotransferencia de enzimas en el ciclo FAS (KAR1, KAS1/3, HAD y ENR), acetil-CoA carboxilasa (ACCasa), glutamato sintasa (GOGAT2) y nitrato reductasa (NR) para cultivos por duplicado que crecen en modo por lote en medio solo de nitrato (WT, ZnCys-KO y ZnCys-ARNi-7 mostrados como ARNi-7). La tinción con azul brillante de Coomassie (CBB) de un gel de proteína que se usa para la transferencia es mostrado como referencia de carga.

Descripción detallada de la invención

Definiciones

A menos que se defina de cualquier otra manera, todos los términos técnicos y científicos que se usan en la presente descripción tienen el mismo significado que el que se entiende comúnmente por un experto en la técnica al que pertenece esta invención. En caso de conflicto, prevalecerá la presente solicitud que incluye las definiciones. A menos que el contexto lo requiera de cualquier otra manera, los términos singulares deberán incluir pluralidades y los términos plurales deberán incluir el singular. Todos los intervalos que se proporcionan dentro de la solicitud incluyen los valores de los extremos superior e inferior del intervalo a menos que se indique específicamente de cualquier otra manera.

El término "y/o" como se usa en una frase tal como "A y/o B" en la presente descripción pretende incluir "A y B", "A o B", "A", y "B".

"Aproximadamente" significa ya sea dentro del 10 % del valor que se establece, o dentro del 5 % del valor que se establece, o en algunos casos dentro del 2,5 % del valor que se establece, o, "aproximadamente" puede significar que se redondea al dígito significativo más cercano.

El término "gen" se usa ampliamente para referirse a cualquier segmento de una molécula de ácido nucleico (típicamente ADN, pero de forma opcional ARN) que codifica un polipéptido o ARN que se expresa. Por tanto, los genes incluyen secuencias que codifican ARN que se expresa (que pueden incluir secuencias de codificación de polipéptidos o, por ejemplo, ARN funcionales, tales como ARN ribosomales, ARNt, ARN antisentido, microARN, ARN en horquilla corta, ribozimas, etc.). Los genes pueden comprender adicionalmente secuencias de regulación que se requieren para o que afectan su expresión, así como también secuencias que se asocian con la proteína o secuencia que codifica el ARN en su estado natural, tales como, por ejemplo, secuencias de intrones, secuencias 5' o 3' sin traducir, etc. En algunos ejemplos, "gen" se puede referir solo a una porción que codifica una proteína de una molécula de ADN o ARN, que puede o no incluir intrones. Un gen es preferentemente mayor que 50 nucleótidos de longitud, con mayor preferencia mayor que 100 nucleótidos de longitud, y puede tener, por ejemplo, entre 50 nucleótidos y 500 000 nucleótidos de longitud, tal como entre 100 nucleótidos y 100000 nucleótidos de longitud o entre aproximadamente 200 nucleótidos y aproximadamente 50 000 nucleótidos de longitud, o aproximadamente 200 nucleótidos y aproximadamente 20000 nucleótidos de longitud. Los genes se pueden obtener de una variedad de fuentes, que incluye la clonación de una fuente de interés o la síntesis a partir de información de secuencia conocida o predicha.

El término "ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico" se refiere a, un segmento de ADN o ARN (por ejemplo, ARNm), y también incluye ácidos nucleicos que tienen cadenas principales que se modifican (por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos, ácidos nucleicos que se bloquean) o se modifican o nucleobases de origen no natural. Las moléculas de ácido nucleico pueden ser bicatenarias o monocatenarias; una molécula de ácido nucleico monocatenario que comprende un gen o una parte del mismo puede ser una cadena de codificación (con sentido) o una cadena sin codificación (antisentido).

Una molécula de ácido nucleico se puede "derivar de" una fuente indicada, que incluye el aislamiento (total o en parte) de un segmento de ácido nucleico de una fuente indicada. Una molécula de ácido nucleico también se puede derivar de una fuente indicada mediante, por ejemplo, clonación directa, amplificación por PCR o síntesis artificial a partir de la fuente de polinucleótidos indicada o en base a una secuencia que se asocia con la fuente de polinucleótidos indicada, que puede ser, por ejemplo, una especie de organismo. Los genes o moléculas de ácido nucleico que se derivan de una fuente o especie particular también incluyen genes o moléculas de ácido nucleico que tienen modificaciones de secuencia con respecto a las moléculas de ácido nucleico fuente. Por ejemplo, un gen o molécula de ácido nucleico que se deriva de una fuente (por ejemplo, un gen articular de referencia) puede incluir una o más mutaciones con respecto al gen fuente o molécula de ácido nucleico que no se pretende o que se introduce deliberadamente, y si una o más mutaciones, que incluyen sustituciones, deleciones, o inserciones, se introducen deliberadamente, las alteraciones de secuencia se pueden introducir mediante mutación aleatoria o dirigida de células o ácidos nucleicos, mediante amplificación u otra síntesis de genes o técnicas de biología molecular, o mediante síntesis química, o cualquier combinación de las mismas. Un gen o molécula de ácido nucleico que se deriva de un gen o molécula de ácido nucleico de referencia que codifica un ARN o polipéptido funcional puede codificar un ARN o polipéptido funcional que tiene al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 %, de identidad de secuencia con el ARN o polipéptido funcional de referencia o fuente, o con un fragmento funcional del mismo. Por ejemplo, un gen o molécula de ácido nucleico que se deriva de un gen o molécula de ácido nucleico de referencia que codifica un ARN o polipéptido funcional puede codificar un ARN o polipéptido funcional que tiene al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, o al menos un 99 % de identidad de secuencia con el ARN o polipéptido funcional de referencia o fuente, o con un fragmento funcional del mismo.

Como se usa en la presente descripción, un ácido nucleico o proteína "aislado" se elimina de su medio natural o del contexto en el que el ácido nucleico o la proteína existe en la naturaleza. Por ejemplo, una proteína que se aísla o una molécula de ácido nucleico se eliminan de la célula u organismo con el que se asocia en su ambiente nativo o natural. Un ácido nucleico o proteína que se aísla se puede, en algunos casos, purificar parcial o sustancialmente, pero no se requiere un nivel particular de purificación para el aislamiento. Por tanto, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que se aísla puede ser una secuencia de ácido nucleico que se ha escindido del cromosoma, genoma, o episoma en el que se encuentra integrado en la naturaleza, o se ha sintetizado aparte de otras secuencias del cromosoma, genoma, o episoma con el que se encuentra asociado en la naturaleza, o se ha sintetizado aparte de otras secuencias con las que se encuentra yuxtapuesto en la naturaleza.

Una molécula de ácido nucleico o secuencia de nucleótidos "purificada", o una proteína o secuencia de polipéptidos, se encuentra sustancialmente libre de material celular y componentes celulares. La molécula de ácido nucleico o proteína purificada se puede encontrar sustancialmente libre de productos químicos más allá del tampón o solvente, por ejemplo. "Sustancialmente libre" no pretende significar que otros componentes más allá de las nuevas moléculas de ácido nucleico son indetectables.

Los términos "de origen natural" y "tipo salvaje" se refieren a una forma que se encuentra en la naturaleza. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico, secuencia de nucleótidos o proteína de origen natural o tipo salvaje se puede encontrar presente en y aislarse de una fuente natural, y no se modifica intencionalmente mediante manipulación humana.

Como se usa en la presente descripción, "atenuado" significa que se reduce en cantidad, grado, intensidad, o fuerza con respecto a un control que no tiene la manipulación o mutación que resulta en una expresión o actividad atenuada. La expresión génica atenuada se puede referir a una reducción de forma significativa de la cantidad y/o tasa de transcripción del gen en cuestión, o de traducción, plegamiento, o ensamblaje de la proteína que se codifica. Como ejemplos no limitantes, un gen atenuado puede ser un gen endógeno del organismo que se encuentra mutado o alterado (por ejemplo, un gen alterado por deleción, truncamiento, cambio de marco, o mutación de inserción parcial o total) que no codifica un marco de lectura abierta funcional completa o que tiene una disminución de la expresión debido a la alteración o interrupción de las secuencias de regulación de genes. Un gen atenuado también puede ser un gen que se dirige por una construcción que reduce la expresión del gen, tal como, por ejemplo, un ARN antisentido, microARN, molécula de ARNi, o ribozima. La expresión génica atenuada puede ser una expresión génica que se elimina, por ejemplo, se reduce a una cantidad que es insignificante o indetectable, o puede ser una expresión génica que se reduce en cualquier cantidad con respecto a la expresión génica de un microorganismo control, por ejemplo, se reduce de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 99 %, o de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 95 % del nivel de expresión génica del microrganismo control. La expresión génica atenuada también puede ser la expresión génica que resulta en un ARN o una proteína que no es totalmente funcional o no funcional, por ejemplo, la expresión génica atenuada puede ser una expresión génica que resulta un ARN y/o polipéptido truncado.

"Molécula de ácido nucleico exógeno" o "gen exógeno" se refiere a una molécula de ácido nucleico o gen que se ha introducido ("transformado") en una célula. Una célula que se transforma se puede denominar como célula recombinante, en la que se pueden introducir el gen o los genes exógenos adicionales. Un descendiente de una célula que se transforma con una molécula de ácido nucleico también se denomina como "transformado" si ha heredado la molécula de ácido nucleico exógena. El gen exógeno puede ser de una especie diferente (y por tanto "heterólogo"), o de la misma especie (y por tanto "homóloga"), en relación con la célula siendo transformada. Una molécula, gen o proteína de ácido nucleico "endógeno" es una molécula, gen o proteína de ácido nucleico nativo como se encuentra en, o se produce naturalmente por, el huésped.

El término "nativo" se usa en la presente descripción para referirse a secuencias de ácidos nucleicos o secuencias de aminoácidos como ocurren naturalmente en el huésped. El término "no nativo" se usa en la presente descripción para referirse a secuencias de ácidos nucleicos o secuencias de aminoácidos que no ocurren naturalmente en el huésped. Una secuencia de ácidos nucleicos o secuencia de aminoácidos que se ha eliminado de una célula, se ha sometido a manipulación en el laboratorio, y se ha introducido o se reintrodujo en una célula huésped de modo que difiera en secuencia o ubicación en el genoma con respecto a su posición en un organismo sin manipular (es decir, se encuentra yuxtapuesto con o enlazado operativamente a secuencias con las que no está yuxtapuesto ni enlazado operativamente en un organismo sin transformar) se considera "no nativo". Por tanto los genes no nativos incluyen genes endógenos al microorganismo huésped enlazados operativamente a una o más secuencias de regulación heterólogas que se han recombinado en el genoma del huésped.

Una molécula de ácido nucleico "recombinante" o "diseñado" es una molécula de ácido nucleico que se ha alterado a través de manipulación humana. Como ejemplos no limitantes, una molécula de ácido nucleico recombinante incluye cualquier molécula de ácido nucleico que: 1) se ha sintetizado o modificado parcial o totalmente in vitro, por ejemplo, mediante el uso de técnicas químicas o enzimáticas (por ejemplo, mediante el uso de síntesis química de ácidos nucleicos, o mediante el uso de enzimas para la replicación, polimerización, digestión (exonucleolítica o endonucleolítica), ligación, transcripción inversa, transcripción, modificación de base (que incluye, por ejemplo, metilación), integración o recombinación (que incluye la recombinación homóloga y específica del sitio) de moléculas de ácidos nucleicos); 2) incluye secuencias de nucleótidos que se unen que no se encuentran unidas por naturaleza; 3) se ha diseñado mediante el uso de técnicas de clonación molecular de modo que carece de uno o más nucleótidos con respecto a la secuencia de las moléculas de ácidos nucleicos de origen natural; y/o 4) se ha manipulado mediante el uso de técnicas de clonación molecular de modo que tiene uno o más cambios de secuencia o reordenamientos con respecto a la secuencia de ácidos nucleicos de origen natural. Como ejemplos no limitantes, un ADNc es una molécula de ADN recombinante, como lo es cualquier molécula de ácido nucleico que se ha generado por reacción o reacciones de polimerasa in vitro, o a la que se han unido enlazadores, o que se ha integrado en un vector, tal como un vector de clonación o un vector de expresión.

El término "proteína recombinante" como se usa en la presente descripción se refiere a una proteína que se produce mediante el diseño de ingeniería genética independientemente de si la secuencia de aminoácidos varía de la de una proteína tipo salvaje.

Cuando se aplica a organismos, el término recombinante, diseñado o diseñado por ingeniería genética se refiere a organismos que han sido manipulados mediante la introducción de una secuencia de ácido nucleico recombinante heteróloga o exógena en el organismo, e incluye eliminaciones genéticas, mutaciones dianas, reemplazo de genes, y reemplazo de promotores, deleción, o inserción, así como también introducción de transgenes o genes sintéticos en el organismo. Los organismos recombinantes o diseñados por ingeniería genética también pueden ser organismos en los que se han introducido construcciones para el "bloqueo de expresión" de genes. Tales construcciones incluyen, pero no se limitan a, ARNi, microARN, ARNhc, ARNip, antisentido, y construcciones de ribozima. También se incluyen organismos cuyos genomas se han alterado por la actividad de meganucleasas, nucleasas con dedos de zinc, TALEN, o sistemas cas/CRISPR. Una molécula de ácido nucleico exógena o recombinante se puede integrar en el genoma del organismo recombinante/diseñado por ingeniería genética o, en otros casos, se puede encontrar no integrada en el genoma del huésped. Como se usa en la presente descripción, "microorganismo recombinante" o "célula huésped recombinante" incluye la progenie o derivados de los microorganismos recombinantes de la invención. Debido a que pueden ocurrir determinadas modificaciones en generaciones sucesivas debido ya sea a mutaciones o influencias ambientales, tal progenie o derivados pueden no ser, de hecho, idénticos a la célula parental, pero aún se encuentran incluidos dentro del alcance del término como se usa en la presente descripción.

El término "promotor" se refiere a una secuencia de ácido nucleico capaz de unirse a la ARN polimerasa en una célula e iniciar la transcripción de una secuencia de codificación corriente abajo (dirección 3'). Un promotor incluye el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables por encima del fondo. Un promotor puede incluir un sitio de inicio de la transcripción, así como también dominios de unión a proteínas (secuencias consenso) responsables de la unión de la ARN polimerasa. Los promotores eucariotas a menudo, pero no siempre, contienen cuadros "TATA" y cuadros "CAT". Los promotores procarióticos pueden contener secuencias consenso de promotores procarióticos de -10 y -35. Son bien conocidos en la técnica un gran número de promotores, que incluyen promotores constitutivos, inducibles y reprimibles, de una variedad de fuentes diferentes. Las fuentes representativas incluyen por ejemplo, tipos de células de algas, virales, mamíferos, insectos, plantas, levaduras, y bacterias, y los promotores adecuados de estas fuentes se encuentran fácilmente disponibles, 0 se pueden producir sintéticamente, en base a en secuencias disponibles públicamente en línea o, por ejemplo, de depositarios tales como la ATCC, así como también de otras fuentes comerciales o individuales. Los promotores pueden ser unidireccionales (iniciar la transcripción en una dirección) o bidireccionales (iniciar la transcripción en cualquier dirección). Un promotor puede ser un promotor constitutivo, un promotor reprimible o un promotor inducible. Una región promotora puede incluir, además del promotor proximal del gen donde la ARN polimerasa se une para iniciar la transcripción, secuencias adicionales corriente arriba del gen que se pueden encontrar dentro de 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb o más del sitio de inicio de transcripción de un gen, donde las secuencias adicionales pueden influenciar la tasa de transcripción del gen corriente abajo y, de forma opcional, la capacidad de respuesta del promotor a las condiciones de desarrollo, ambientales, o bioquímicas (por ejemplo, metabólicas).

El término "heterólogo" cuando se usa en referencia a un polinucleótido, gen, ácido nucleico, polipéptido, o enzima se refiere a un polinucleótido, gen, ácido nucleico, polipéptido, o enzima que es de una fuente o se deriva de una fuente distinta de la especie de organismo huésped. En contraste, un polinucleótido, gen, ácido nucleico, polipéptido, o enzima "homólogo" se usa en la presente descripción para denotar un polinucleótido, gen, ácido nucleico, polipéptido, o enzima que se deriva de la especie del organismo huésped. Cuando se hace referencia a una secuencia de regulación de genes o a una secuencia de ácidos nucleicos auxiliar que se usa para mantener o manipular una secuencia de genes (por ejemplo, un promotor, una región 5' sin traducir, región 3' sin traducir, secuencia de adición de poli A, secuencia de intrón, sitio de empalme, sitio de unión del ribosoma, secuencia de entrada del ribosoma interno, región de homología del genoma, sitio de recombinación, etc), "heteróloga" significa que la secuencia de regulación o secuencia auxiliar no se encuentra asociada naturalmente con el gen con el que la secuencia de ácidos nucleicos de regulación o auxiliar se encuentra yuxtapuesta en un constructo, genoma, cromosoma, o episoma. Por tanto, un promotor enlazado operativamente a un gen al que no se encuentra enlazado operativamente en su estado natural (es decir, en el genoma de un organismo no diseñado por ingeniería genética) se denomina en la presente descripción como un "promotor heterólogo", aunque el promotor se puede derivar de la misma especie (o, en algunos casos, del mismo organismo) como el gen al que se encuentra enlazado.

Como se usa en la presente descripción, el término "proteína" o "polipéptido" pretende abarcar un "polipéptido" en singular, así como también "polipéptidos" en plural, y se refiere a una molécula que se compone de monómeros (aminoácidos) enlazados linealmente por uniones amida (también conocidas como uniones peptídicas). El término "polipéptido" se refiere a cualquier cadena o cadenas de dos o más aminoácidos, y no se refiere a una longitud específica del producto. Por tanto, los péptidos, dipéptidos, tripéptidos, oligopéptidos, "proteína", "cadena de aminoácidos" o cualquier otro término que se usa para referirse a una cadena o cadenas de dos o más aminoácidos, se incluyen dentro de la definición de "polipéptido" y el término "polipéptido" se puede usar en lugar de, o de manera intercambiable con cualquiera de estos términos.

Los números de acceso de genes y proteínas, que se proporcionan comúnmente entre paréntesis después del nombre de un gen o de una especie, son identificadores únicos para un registro de secuencia disponible públicamente en el sitio web del National Center for Biotechnology Information (NCBI) (ncbi.nlm.nih.gov) que se mantiene por el United States National Institutes of Health. El número de identificación de secuencia "Identificador GenInfo" (GI) es específico de una secuencia de nucleótidos o aminoácidos. Si una secuencia cambia de alguna forma, se asigna un nuevo número GI. Una herramienta de Historial de revisión de secuencias se encuentra disponible para rastrear los varios números de GI, números de versión, y fechas de actualización para secuencias que aparecen en un registro específico de GenBank. La búsqueda y obtención de secuencias de ácidos nucleicos o genes o secuencias de proteínas en base a números de acceso y números de GI es bien conocida en las técnicas de, por ejemplo, biología celular, bioquímica, biología molecular, y genética molecular.

Como se usa en la presente descripción, los términos "porcentaje de identidad" u "homología" con respecto a secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos se definen como el porcentaje de residuos de nucleótidos o aminoácidos en la secuencia candidata que son idénticos a los polipéptidos conocidos, después de alinear las secuencias para un máximo porcentaje de identidad e introducción de espacios, si es necesario, para alcanzar el máximo porcentaje de homología. Las inserciones o deleciones N-terminal o C-terminal no se deberán interpretar como que afectan la homología, y las deleciones y/o inserciones internas en la secuencia de polipéptidos de menos de aproximadamente 50, menos de aproximadamente 40, menos de aproximadamente 30, menos de aproximadamente 20, o menos de aproximadamente 10 residuos de aminoácidos no se deberán interpretar como que afectan la homología. La homología o identidad a nivel de secuencia de nucleótidos o aminoácidos se puede determinar mediante análisis BLAST (herramienta básica de búsqueda de alineación local) mediante el uso del algoritmo que se emplea por los programas blastp, blastn, blastx, tblastn y tblastx (Altschul (1997), Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402, y Karlin (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 2264-2268), que se encuentran diseñados para la búsqueda de similitudes de secuencia. El enfoque que se usa por el programa BLAST es considerar primero segmentos similares, con y sin espacios, entre una secuencia de consulta y una secuencia de base de datos, después evaluar la significación estadística de todas las coincidencias que se identifican, y finalmente resumir solo aquellas coincidencias que satisfacen un umbral de significación que se selecciona previamente. Para una discusión de los problemas básicos en la búsqueda de similitudes de bases de datos de secuencias, ver Altschul (1994), Nature Genetics 6, 119-129. Los parámetros de búsqueda para histograma, descripciones, alineaciones, expectativas (es decir, el umbral de significación estadística para reportar coincidencias frente a secuencias de base de datos), límite, matriz, y filtro (baja complejidad) se pueden encontrar en el ajuste predeterminado. La matriz de puntuación predeterminada que se usa por blastp, blastx, tblastn, y tblastx es la matriz BLOSUM62 (Henikoff (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10915-10919), que se recomienda para secuencias de consulta de más de 85 de longitud (bases de nucleótidos o aminoácidos).

Para blastn, diseñado para comparar secuencias de nucleótidos, la matriz de puntuación se puede establecer por las relaciones de M (es decir, la puntuación de recompensa para un par de residuos coincidentes) a N (es decir, la puntuación de penalización para residuos que no coinciden), en donde los valores predeterminados para M y N pueden ser 5 y -4, respectivamente. Se pueden ajustar cuatro parámetros de blastn de la siguiente manera: Q=10 (penalización por creación de espacio); R=10 (penalización por extensión de espacio); wink=1 (genera coincidencias de palabras en cada posición de winkth a lo largo de la consulta); y gapw=16 (establece el ancho de la ventana dentro de la que se generan alineaciones de espacio). Los ajustes del parámetro Blastp equivalente para la comparación de secuencias de aminoácidos puede ser: Q=9; R=2; wink=1; y gapw=32. Una comparación de Bestfit entre secuencias, disponible en el paquete GCG versión 10.0, puede usar parámetros de ADN GAP=50 (penalización por creación de espacio) y LEN=3 (penalización por extensión de espacios), y los ajustes equivalentes en las comparaciones de proteínas pueden ser GAP=8 y LEN=2. Los ajustes de parámetros anteriores son solo ilustrativos y se pueden usar otros ajustes de parámetros.

Por tanto, cuando se refiere a las secuencias de polipéptidos o ácidos nucleicos que se describen en la presente descripción, se incluyen identidades de secuencias de al menos un 40 %, al menos un 45 %, al menos un 50 %, al menos un 55 %, de al menos un 70 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, o al menos un 85 %, por ejemplo al menos un 86 %, al menos un 87 %, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, al menos un 95 %, al menos un 96 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, o aproximadamente un 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de polipéptido o ácido nucleico de longitud completa, o a fragmentos de los mismos que comprenden una secuencia consecutiva de al menos 50, al menos 75, al menos 100, al menos 125, al menos 150, al menos 200, o más de 200 residuos de aminoácidos de la proteína completa; variantes de tales secuencias, por ejemplo, en donde al menos un residuo de aminoácido se ha insertado en N y/o C-terminal a y/o dentro de, la secuencia o las secuencias que se describe que contienen la inserción y sustitución. Las variantes que se contemplan pueden incluir adicional o alternativamente aquellas que contienen mutaciones predeterminadas mediante, por ejemplo, recombinación homóloga o mutagénesis que se dirige al sitio o por PCR, y los polipéptidos o ácidos nucleicos correspondientes de otras especies, que incluyen, pero no se limitan a, aquellos que se describen en la presente descripción, los alelos u otras variantes de origen natural de la familia de polipéptidos o ácidos nucleicos que contienen una inserción y sustitución; y/o derivados en donde el polipéptido se ha modificado covalentemente mediante sustitución, químico, enzimático, u otro medio apropiado con un resto distinto de un aminoácido de origen natural que contiene la inserción y la sustitución (por ejemplo, un resto detectable tal como una enzima).

Como se usa en la presente descripción, la frase "sustitución conservadora de aminoácidos" o "mutación conservadora" se refiere al remplazo de un aminoácido por otro aminoácido con una propiedad común. Una forma funcional para definir propiedades comunes entre aminoácidos individuales es analizar las frecuencias normalizadas de cambios de aminoácidos entre proteínas correspondientes de organismos homólogos (Schulz (1979) Principles of Protein Structure, Springer-Verlag). De acuerdo con tales análisis, se pueden definir grupos de aminoácidos donde los aminoácidos dentro de un grupo se intercambian preferentemente entre sí y, por lo tanto, se parecen más entre sí en su impacto sobre la estructura general de la proteína (Schulz (1979) Principles of Protein Structure, Springer-Verlag). Los ejemplos de grupos de aminoácidos que se definen de esta manera pueden incluir: un "grupo cargado/polar" que incluye Glu, Asp, Asn, Gln, Lys, Arg, e His; un "grupo aromático o cíclico" que incluye Pro, Phe, Tyr, y Trp; y un "grupo alifático" que incluye Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Ser, Thr, y Cys. Dentro de cada grupo, también se pueden identificar subgrupos. Por ejemplo, el grupo de aminoácidos cargados/polares se puede subdividir en subgrupos que incluyen: el "subgrupo cargado positivamente" que comprende Lys, Arg e His; el "subgrupo cargado negativamente" que comprende Glu y Asp; y el "subgrupo polar" que comprende Asn y Gln. En otro ejemplo, el grupo aromático o cíclico se puede subdividir en subgrupos que incluyen: el "subgrupo de anillo de nitrógeno" que comprende Pro, His, y Trp; y el "subgrupo fenilo" que comprende Phe y Tyr. En otro ejemplo adicional, el grupo alifático se puede subdividir en subgrupos que incluyen: el "subgrupo alifático no polar grande" que comprende Val, Leu, e Ile; el "subgrupo alifático ligeramente polar" que comprende Met, Ser, Thr, y Cys; y el "subgrupo de residuos pequeños" que comprende Gly y Ala. Los ejemplos de mutaciones conservadoras incluyen sustituciones de aminoácidos de aminoácidos dentro de los subgrupos anteriores, tales como, pero que no se limitan a: Lys por Arg o viceversa, de modo que se puede mantener una carga positiva; Glu para Asp o viceversa, de modo que se puede mantener una carga negativa; Ser por Thr o viceversa, de modo que se puede mantener un -OH libre; y Gln por Asn o viceversa, de modo que se puede mantener un -NH2 libre. Una "variante conservadora" es un polipéptido que incluye uno o más aminoácidos que se han sustituido para reemplazar uno o más aminoácidos del polipéptido de referencia (por ejemplo, un polipéptido cuya secuencia se describe en una publicación o base de datos de secuencias, o cuya secuencia se ha determinado mediante secuenciación de ácidos nucleicos) con un aminoácido que tiene propiedades comunes, por ejemplo, que pertenecen al mismo grupo o subgrupo de aminoácidos como se define anteriormente.

Como se usa en la presente descripción, "expresión" incluye la expresión de un gen al menos al nivel de producción de ARN, y un "producto de expresión" incluye el producto resultante, por ejemplo, un polipéptido o ARN funcional (por ejemplo, un ARN ribosomal, un ARNt, un ARN guía, un ARN antisentido, un micro ARN, un ARNhc, una ribozima, etc.), de un gen que se expresa. El término "aumento de la expresión" incluye una alteración en la expresión génica para facilitar el aumento de la producción de ARNm y/o el aumento de la expresión de polipéptidos. La "el aumento de la producción" [de un producto génico] incluye un aumento en la cantidad de expresión de polipéptidos, en el nivel de actividad enzimática de un polipéptido, o una combinación de ambos, en comparación con la producción nativa o actividad enzimática del polipéptido.

Algunos aspectos de la descripción incluyen la deleción, silenciamiento, inactivación, o regulación negativa parcial, sustancial, o completa de la expresión de secuencias de polinucleótidos particulares. Los genes se pueden eliminar, silenciar, e inactivar parcial, sustancial, o completamente, o su expresión se puede regular negativamente con el fin de afectar la actividad que se realiza por el polipéptido que codifican, tal como la actividad de una enzima. Los genes se pueden eliminar, silenciar, e inactivar parcial, sustancial, o completamente, o regular negativamente mediante la inserción de secuencias de ácido nucleico que alteran la función y/o expresión del gen (por ejemplo, inserción viral, mutagénesis de transposones, diseño de meganucleasas, recombinación homóloga, u otros métodos conocidos en la técnica). Los términos "eliminar", "eliminación" y "desactivación" se pueden usar de manera intercambiable con los términos "deleción", "deleción parcial", "deleción sustancial", o "deleción completa" y se refieren a eliminar sustancialmente la expresión del gen, por ejemplo, reducir el nivel de expresión a menos de un 10 %, menos de un 5 %, menos de un 2 %, o menos de 1 % de los niveles control o niveles indetectables. Los términos "atenuación" y "bloqueo de expresión" se pueden usar para describir mutaciones y manipulaciones que resultan en un nivel inferior de expresión de un gen con respecto a los niveles de expresión del tipo salvaje, o, en algunos casos, que resulta en una reducción de la actividad de un producto génico, tal como mediante la mutación de un dominio funcional del polipéptido que se codifica. La atenuación puede ser una atenuación completa (por ejemplo, "desactivación génica") o puede ser una atenuación parcial, donde, por ejemplo, los niveles de ARN o proteínas se reducen o "bloquean" entre 1-99,5 % de los niveles control, por ejemplo, a un nivel donde la expresión de ARN o proteína es detectable, pero se reduce con respecto a los controles. En determinados casos, un microorganismo de interés se puede diseñar mediante recombinación homóloga que se dirige al sitio para eliminar un gen de interés particular. Aún otros casos más, las construcciones de ARNi o ^a Dⁿ antisentido (ADNc) se pueden usar para silenciar e inactivar parcial, sustancial, o completamente, o regular negativamente un gen de interés particular.

Se puede entender que estas inserciones, deleciones, u otras modificaciones de determinadas moléculas de ácidos nucleicos o secuencias de polinucleótidos particulares abarcan " la modificación genética o modificaciones genéticas" o "la transformación o transformaciones" de modo que se puedan entender las cepas resultantes de los microorganismos o células huésped son "modificadas por ingeniería genética", "diseñado por ingeniería genética" o "transformado".

Como se usa en la presente descripción, "regulado positivamente" o "regulación positiva" incluye un aumento en la expresión de un gen o molécula de ácido nucleico de interés o la actividad de una enzima, por ejemplo, un aumento en la expresión génica o actividad enzimática en comparación con la expresión o actividad en un gen o enzima idéntica de cualquier otra manera que no se ha regulado positivamente.

Como se usa en la presente descripción, "regulado negativamente" o "regulación negativa" incluye una disminución en la expresión de un gen o molécula de ácido nucleico de interés o la actividad de una enzima, por ejemplo, una disminución en la expresión génica o actividad enzimática en comparación con la expresión o actividad en un gen o enzima idéntica de cualquier otra manera que no se ha regulado negativamente.

Como se usa en la presente descripción, "mutante" se refiere a un organismo que tiene una mutación en un gen que es el resultado de mutagénesis clásica, por ejemplo, mediante el uso de irradiación gamma, UV, o mutágenos químicos. "Mutante" como se usa en la presente descripción también se refiere a una célula recombinante que tiene una estructura o expresión alterada de un gen como resultado del diseño por ingeniería genética que muchos incluyen, como ejemplos no limitantes, sobreexpresión, que incluyen la expresión de un gen bajo diferentes condiciones temporales, biológicas, o de regulación ambiental y/o en un grado diferente al que ocurre naturalmente y/o expresión de un gen que no se expresa naturalmente en la célula recombinante; recombinación homóloga, que incluye desactivaciones génicas e inserciones génicas (por ejemplo, el reemplazo de genes con genes que codifican polipéptidos que tienen mayor o menor actividad que el polipéptido tipo salvaje, y/o polipéptidos negativos dominantes); atenuación génica mediante ARNi, ARN antisentido, o ribozimas, o similares; y diseño del genoma mediante el uso de meganucleasas, TALEN y/o tecnologías CRISPR, y similares. Un mutante, por lo tanto, no es un organismo de origen natural. Un organismo mutante de interés tendrá típicamente un fenotipo diferente al de la cepa tipo salvaje o progenitora correspondiente que carece de la mutación, donde el fenotipo se puede evaluar mediante ensayos de crecimiento, análisis de productos, propiedades fotosintéticas, ensayos bioquímicos, etc. Cuando se refiere a un gen "mutante" significa que el gen tiene al menos un cambio, deleción, o inserción de base (nucleótido) con respecto a un gen nativo o tipo salvaje. La mutación (cambio, deleción, y/o inserción de uno o más nucleótidos) se puede encontrar en la región de codificación del gen o se puede encontrar en un intrón, UTR 3', UTR 5', o región promotora, por ejemplo, dentro de 2 kb del sitio de inicio de transcripción o dentro de 3 kb o del sitio de inicio de la traducción. Como ejemplos no limitantes, un gen mutante puede ser un gen que tiene una inserción dentro de la región promotora que puede ya sea aumentar o disminuir la expresión del gen; puede ser un gen que tiene una deleción, lo que resulta en la producción de una proteína no funcional, una proteína truncada, una proteína negativa dominante, o sin proteína; puede ser un gen que tiene una o más mutaciones puntuales que conducen a un cambio en el aminoácido de la proteína que se codifica o resulta en un empalme aberrante de la transcripción del gen, etc.

El término "Pfam" se refiere a una gran colección de dominios de proteínas y familias de proteínas que se mantienen por el Consorcio de Pfam y disponibles en varios sitios web que se patrocinan en todo el mundo, que incluyen: pfam.xfam.org/ (European Bioinformatics Institute (EMBL-EBI). La última versión de Pfam es Pfam 30.0 (junio de 2016). Los dominios y familias de Pfam se identifican mediante el uso de múltiples alineaciones de secuencia y modelos de Markov ocultos (HMM). Las asignaciones de dominio o familia de Pfam-A son asignaciones de alta calidad que se generan por una alineación de siembras que se conservan mediante el uso de miembros representativos de una familia de proteínas y modelos de Markov de perfil ocultos en base a la alineación de siembra. (A menos que se especifique de cualquier otra manera, las coincidencias de una proteína que se consulta con un dominio o familia de Pfam son coincidencias de Pfam-A). Todas las secuencias identificadas que pertenecen a la familia se usan después para generar automáticamente una alineación completa para la familia (Sonnhammer (1998) Nucleic Acids Research 26, 320-322; Bateman (2000) Nucleic Acids Research 26, 263-266; Bateman (2004) Nucleic Acids Research 32, Database Issue, D138-D141; Finn (2006) Nucleic Acids Research Database Issue 34, D247-251; Finn (2010) Nucleic Acids Research Database Issue 38, D211-222). Al acceder a la base de datos de Pfam, por ejemplo, mediante el uso del sitio web que se referencia anteriormente, las secuencias de proteínas se pueden consultar frente a los HMM mediante el uso del programa de búsqueda de homología HMMER (por ejemplo, HMMER2, HMMER3, o una versión más alta, hmmer.org). Las coincidencias significativas que identifican una proteína que se consulta como que es de una familia de pfam (o que tiene un dominio de Pfam particular) son aquellas en las que la puntuación de bits es mayor que o igual al umbral de recopilación para el dominio de Pfam. Los valores de expectativa (valores e) también se pueden usar como criterio para la inclusión de una proteína que se consulta en una Pfam o para determinar si una proteína que se consulta tiene un dominio de Pfam particular, donde los valores e bajos (mucho menos de 1,0, por ejemplo, menos de 0,1, o menor de o igual a 0,01) representan bajas probabilidades de que una coincidencia se deba al azar.

Un "ADNc" es una molécula de ADN que comprende al menos una porción de la secuencia de nucleótidos de una molécula de ARNm, con la excepción de que la molécula de ADN sustituye la nucleobase timina, o T, en lugar de uridina, o U, que se encuentra en la secuencia de ARNm. Un ADNc puede ser bicatenario o monocatenario y puede ser, por ejemplo, el complemento de la secuencia de ARNm. En ejemplos preferidos, un ADNc no incluye una o más secuencias de intrones que ocurren en el gen de origen natural al que corresponde el ADNc (es decir, el gen como ocurre en el genoma de un organismo). Por ejemplo, un ADNc puede tener secuencias a partir de la corriente arriba de un intrón de un gen de origen natural que se yuxtapone a secuencias corriente abajo de un intrón de un gen de origen natural, donde las secuencias corriente arriba y corriente abajo no se yuxtaponen en una molécula de ADN en la naturaleza (es decir, las secuencias no se yuxtaponen en el gen de origen natural). Se puede producir un ADNc mediante transcripción inversa de moléculas de ARNm, o se puede sintetizar, por ejemplo, mediante síntesis química y/o mediante el uso de una o más enzimas de restricción, una o más ligasas, una o más polimerasas (que incluyen, pero no se limitan a, polimerasas que toleran altas temperaturas que se pueden usar en reacciones en cadena de la polimerasa (PCR)), una o más recombinasas, etc., en base al conocimiento de la secuencia de ADNc, donde el conocimiento de la secuencia de ADNc se puede basar de forma opcional en la identificación de regiones de codificación a partir de secuencias del genoma o que se compilan a partir de secuencias múltiples de ADNc parciales.

La referencia a propiedades que son "sustancialmente las mismas" o "sustancialmente idénticas" sin una explicación adicional del significado que se pretende, significa que pretende que las propiedades se encuentren dentro de un 10 %, y preferentemente dentro de un 5 %, y se pueden encontrar dentro de un 2,5 %, dentro de un 1 %, o dentro de un 0,5% del valor de referencia. Donde no se establece el significado que se pretende de "sustancialmente" en un contexto particular, el término se usa para incluir desviaciones menores e irrelevantes que no son material para las características que se consideran importantes en el contexto de la invención.

Aunque se pueden usar métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos que se describen en la presente descripción en la práctica o en las pruebas de la presente invención, los métodos y materiales adecuados se describen más abajo. Los materiales, métodos, y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser limitantes. Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción detallada y a partir de las reivindicaciones.

Una "célula control" o "microorganismo control" es una célula o microorganismo que es sustancialmente idéntico a la célula manipulada, recombinante, o mutante a la que se refiere, con la excepción de que la célula control no tiene la modificación de la célula manipulada, recombinante, o mutante. Una célula control puede ser una célula tipo salvaje, por ejemplo una célula tipo salvaje de la cepa de la que se deriva directa o indirectamente la célula manipulada, recombinante, o mutante.

"Las mismas condiciones" o "las mismas condiciones de cultivo", como se usa en la presente descripción, significa sustancialmente las mismas condiciones, es decir, cualquier diferencia entre las condiciones de referencia es menor y no es relevante para la función o propiedades del microorganismo que es material para la invención, por ejemplo, producción de lípidos o producción de biomasa.

Las condiciones "ricas en nitrógeno", con respecto a un tipo de célula particular, son condiciones bajo las que la célula no experimenta deficiencia de crecimiento debido a insuficiente nitrógeno.

Como se usa en la presente descripción, "lípido" o "lípidos" se refiere a grasas, ceras, ácidos grasos, derivados de ácidos grasos tales como alcoholes grasos, ésteres de cera, alcanos, y alquenos, esteroles, monoglicéridos, diglicéridos, triglicéridos, fosfolípidos, esfingolípidos, sacarolípidos, y glicerolípidos. Los "lípidos FAME" o "FAME" se refieren a lípidos que tienen restos acilo que se pueden derivatizar a ésteres metílicos de ácidos grasos, tales como, por ejemplo, monoacilglicéridos, diacilglicéridos, triacilglicéridos, ésteres de cera, y lípidos de membrana tales como fosfolípidos, galactolípidos, etc. La productividad de lípidos se puede evaluar como productividad de FAME en miligramos por litro (mg/L) en un período de tiempo dado (por ejemplo, por día) y para las algas, se puede reportar como productividad de área, por ejemplo, gramos por metro2 por día (g/m2/día). En los ensayos semicontinuos que se proporcionan en la presente descripción, los valores de mg/L/día se convierten a g/m2/día al tomar en cuenta el área de irradiación incidente (la apertura de la gradilla de matraces SCPA de 11^ " x 33/8", o 0,003145 m2) y el volumen del cultivo (550 mL). Para obtener valores de productividad en g/m2/día, los valores de mg/L/día se multiplican por la tasa de dilución diaria (30 %) y un factor de conversión de 0,175. Donde se refieren a los lípidos o subcategorías de los mismos (por ejemplo, TAG o FAME) como un porcentaje, el porcentaje es un porcentaje en peso a menos que se indique de cualquier otra manera.

La "Biomasa" se refiere a masa celular, ya sea de células vivas o muertas, y se puede evaluar, por ejemplo, como el peso del sedimento que se aspira, pero es con mayor preferencia el peso seco (por ejemplo, liofilizado de una muestra de cultivo o células que sedimentan), peso seco libre de cenizas (AFDW), o carbono orgánico total (TOC), mediante el uso de métodos conocidos en la técnica. La biomasa aumenta durante el crecimiento de un cultivo bajo condiciones de crecimiento permisivo y se puede denominar como "acumulación de biomasa" en cultivos por lote, por ejemplo. En cultivos continuos o semicontinuos que se someten a una dilución estable o regular, la biomasa que se produce que de cualquier otra manera se acumula en el cultivo se elimina durante la dilución del cultivo. Por tanto, la productividad diaria de la biomasa (aumento de la biomasa) de estos cultivos también se puede denominar como "acumulación de biomasa". La productividad de la biomasa se puede evaluar como la productividad de TOC en miligramos por litro (mg/L) por período de tiempo dado (por ejemplo, por día) y para algas, se puede reportar como gramos por metro2 por día (g/m2/día). En los ensayos semicontinuos que se proporcionan en la presente descripción, los valores de mg/L se convierten a g/m2/día al tomar en cuenta el área de irradiación incidente (la apertura de la gradilla de matraces SCPA de 11^" x 33/8", o 0,003145 m2) y el volumen del cultivo (550mL). Para obtener valores de productividad en g/m2/día, los valores de mg/L se multiplican por la tasa de dilución diaria (30 %) y un factor de conversión de 0,175. Donde la biomasa se expresa como un porcentaje, el porcentaje es un porcentaje en peso a menos que se indique de cualquier otra manera.

En el contexto de la invención, una "fuente de nitrógeno" es una fuente de nitrógeno que se puede absorber y metabolizar por el microorganismo objeto de estudio e incorporarse en biomoléculas para su crecimiento. Por ejemplo, los compuestos que incluyen nitrógeno que no se pueden absorber y/o metabolizar por el microorganismo para su crecimiento (por ejemplo, tampones biológicos que contienen nitrógeno tales como Hepes, Tris, etc.) no se consideran fuentes de nitrógeno en el contexto de la invención.

El "nitrógeno reducido", como se usa en la presente descripción, es nitrógeno en la forma química de amonio, amoníaco, urea, o un aminoácido que se puede metabolizar por el microorganismo que se encuentra siendo cultivado para proporcionar una fuente de nitrógeno para su incorporación en biomoléculas, lo que apoya así el crecimiento. Por ejemplo, además de amonio/amoniaco y urea, el nitrógeno reducido puede incluir varios aminoácidos donde el aminoácido o los aminoácidos pueden servir como fuente de nitrógeno al microorganismo objeto de estudio. Los ejemplos de aminoácidos pueden incluir, sin limitación, glutamato, glutamina, histidina, lisina, arginina, asparagina, alanina, y glicina. El "nitrógeno sin reducir" en el contexto de una fuente de nitrógeno que se puede encontrar presente en un medio de cultivo para microorganismos se refiere a nitrato o nitrito que se debe reducir antes de la asimilación en compuestos orgánicos por el microorganismo.

"La única fuente de nitrógeno [en el medio de cultivo]" se usa de manera intercambiable con "sustancialmente la única fuente de nitrógeno" e indica que no se añade intencionalmente ninguna otra fuente de nitrógeno al medio de cultivo y/o que ninguna otra fuente de nitrógeno se encuentra presente en una cantidad suficiente para aumentar de forma significativa el crecimiento de los microorganismos o células que se cultivan en el medio de referencia. A lo largo de esta solicitud, por brevedad, los términos "solo de nitrato" y "solo de urea" se usan para caracterizar los medios de cultivo en los que el nitrato es sustancialmente la única fuente de nitrógeno que se encuentra disponible para los microorganismos para apoyar el crecimiento o la urea es la única fuente de nitrógeno que se encuentra disponible para los microorganismos para apoyar el crecimiento, respectivamente.

De manera similar, "la única fuente de carbono [en el medio de cultivo]" se usa de manera intercambiable con "sustancialmente la única fuente de carbono" e indica que donde el carbono inorgánico es sustancialmente la única fuente de carbono en el medio de cultivo, ninguna otra fuente de carbono se encuentra presente en una cantidad suficiente para aumentar la productividad o crecimiento de los microorganismos o células que se cultivan en el medio de referencia o cualquier otra fuente de carbono que se puede encontrar presente no se incorpora de forma significativa en biomoléculas tales como lípidos que se producen por los microorganismos o células. El "carbono inorgánico" se refiere a dióxido de carbono, carbonato y sales de carbonato, y ácido carbónico.

En la presente descripción se describen métodos para manipular, ensayar, cultivar, y analizar microorganismos. La invención que se establece en la presente descripción también hace uso de métodos, técnicas, y reactivos estándar para el cultivo celular, transformación de microorganismos, diseño por ingeniería genética, y el análisis bioquímico que son conocidos en la técnica.

Todos los títulos son para conveniencia del lector y no limitan la invención de ninguna forma.

Microorganismos mutantes que tienen un aumento en la productividad de lípidos

La descripción proporciona microorganismos mutantes que tienen al menos un 45 % de la productividad de la biomasa de un microorganismo control y una productividad de lípidos más alta (por ejemplo, una productividad más alta por día, preferentemente que se promedia en el período de cultivo) con respecto al microorganismo control cuando tanto el microorganismo mutante como el microorganismo control se cultivan bajo condiciones idénticas en las que el cultivo del microorganismo control se encuentra produciendo biomasa. La productividad de la biomasa se puede evaluar, por ejemplo, como producción o productividad de peso seco libre de cenizas (AFDW) (es decir, cantidad que se produce por día) o productividad de carbono orgánico total (TOC). Un microorganismo mutante como se proporciona en la presente descripción puede demostrar una mayor productividad de lípidos que un microorganismo control y al menos un 45 % de la productividad de la biomasa del microorganismo control en un período de cultivo de al menos tres días, por ejemplo, un período de cultivo de al menos cuatro, al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos diez, al menos once, al menos doce, al menos trece, al menos catorce, al menos quince, al menos veinte, al menos treinta o al menos sesenta días cuando el microorganismo mutante y el microorganismo control se cultivan bajo condiciones que apoyan el crecimiento del microorganismo control, es decir, bajo condiciones en las que el cultivo del microorganismo control produce biomasa. En algunos ejemplos, el período de cultivo en el que un microorganismo mutante como se proporciona en la presente descripción produce al menos un 45 % de la biomasa y produce más lípidos con respecto a un microorganismo control puede ser menos de 180 días, menos de 120 días, o menos de 90 días. En algunos ejemplos, un microorganismo mutante como se proporciona en la presente descripción produce cantidades más altas de lípidos con respecto a un microorganismo control bajo condiciones de cultivo en las que tanto el microorganismo mutante como el control se encuentran produciendo biomasa y el mutante produce al menos un 45 %, al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 100 %, al menos un 105 %, al menos un 110 %, o al menos un 120 % de la biomasa que se produce por un microorganismo control diariamente. En algunos ejemplos, un microorganismo mutante como se proporciona en la presente descripción produce cantidades más altas de lípidos con respecto a un microorganismo control y al menos un 45 % de la biomasa, pero menos de un 300 % o menos de un 325 %, o menos de un 200 % de la biomasa que se produce por el microorganismo control. En algunos ejemplos, un microorganismo mutante como se proporciona en la presente descripción produce cantidades más altas de lípidos con respecto a un microorganismo control bajo condiciones de cultivo en las que tanto el microorganismo mutante como el control se encuentran produciendo biomasa y se dividen activamente.

Los métodos para medir la cantidad de lípidos que se producen por microorganismos son bien conocidos en la técnica y se proporcionan en los ejemplos de la presente descripción. Los lípidos extraíbles totales se pueden determinar de acuerdo con Folch y otros (1957) J. Biol. Chem. 226:497-509; Bligh y Dyer (1959) Can. J. Biochem. Physiol. 37:911-917; o Matyash y otros (2008) J. Lipid Res. 49:1137-1146, por ejemplo, y el porcentaje de biomasa presente como lípido también se puede evaluar mediante el uso de espectroscopia infrarroja por transformación de Fourier (FT-IR) (Pistorius y otros (2008) Biotechnol y Bioengin. 103:123-129). Se proporcionan referencias adicionales para el análisis gravimétrico de FAME y TAG en los documentos US 8,207,363 y WO 2011127118 por ejemplo. Los métodos de análisis FAME también se pueden encontrar, por ejemplo, como los métodos Ce 1b-89 y Ce 1-62 de la American Oil Chemists' Society (aocs.org/Methods/).

La biomasa se puede evaluar al medir el carbono orgánico total (TOC) o mediante otros métodos, tal como la medición del peso seco libre de cenizas (AFDW). Los métodos para medir el TOC son conocidos en la técnica (por ejemplo, el documento US 8,835,149) y se proporcionan en la presente descripción. Los métodos para medir el AFDW también son bien conocidos y se pueden encontrar, por ejemplo, en el documento US 8,940,508.

Un microorganismo mutante puede producir, por ejemplo, al menos un 25 % más de lípidos que un microorganismo control y al menos un 45 % igual de biomasa que el microorganismo control durante un período de cultivo de al menos tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, veinte, treinta, o sesenta días durante los que tanto los microorganismos mutantes como control producen biomasa. Por ejemplo, la productividad promedio diaria de lípidos puede ser al menos un 25 % mayor que la productividad promedio diaria de lípidos de un microorganismo control y la productividad promedio diaria de biomasa puede ser al menos un 45 % igual que la productividad de la biomasa del microorganismo control durante un período de cultivo de al menos tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, veinte, treinta, o sesenta días. En ejemplos adicionales, un microorganismo mutante puede producir al menos aproximadamente un 50 % más de lípidos que los que se producen por un microorganismo control y al menos un 45 % igual de biomasa que el microorganismo control, es decir, no puede exhibir más de un 55 % de reducción en biomasa con respecto al microorganismo control, bajo condiciones en las que el microorganismo control se encuentra produciendo biomasa. Un mutante puede producir, en algunos ejemplos, menos de un 400 % o menos de un 300 % más de lípidos que un microorganismo control mientras acumula al menos un 45 % igual de biomasa que el microorganismo control durante un período de cultivo de al menos tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, veinte, treinta, o sesenta días.

Las condiciones de cultivo bajo las que un mutante como se describe en la presente descripción produce al menos un 25 % o al menos aproximadamente un 50 % más de FAME mientras que produce al menos un 50 % de la cantidad de TOC como un microorganismo control se pueden encontrar ricas en nutrientes, y se pueden encontrar ricas en nitrógeno con respecto al microorganismo control, es decir, las condiciones de cultivo pueden ser suficientes en nutrientes con respecto al microorganismo control de modo que los nutrientes adicionales no aumentan la tasa de crecimiento del microorganismo (donde todas las demás condiciones de cultivo e ingredientes siguen siendo los mismas). Por ejemplo, las condiciones de cultivo pueden ser suficientes en nitrógeno con respecto al microorganismo control de modo que el nitrógeno adicional no aumenta la tasa de crecimiento del microorganismo (donde todas las demás condiciones de cultivo e ingredientes siguen siendo las mismas). Alternativamente, en algunos casos las condiciones de cultivo bajo las que un mutante como se proporciona en la presente descripción produce al menos un 25 % o al menos un 50 % más de FAME (que puede ser la productividad promedio diaria de FAME) mientras que produce al menos un 45 % de la cantidad de TOC (por ejemplo la productividad promedio diaria de TOC) como microorganismo control puede incluir nitrógeno que apoya la producción de biomasa, pero a una tasa inferior al medio de cultivo completamente rico en nitrógeno. Por ejemplo, las condiciones de cultivo pueden permitir la producción de biomasa (TOC o AFDW) a al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % de la tasa de producción de biomasa en el medio de cultivo completamente rico en nitrógeno.

Los microorganismos mutantes que se describen en la presente descripción pueden producir al menos un 25 % más de lípidos, por ejemplo, un 25 % más de FAME, como se produce por un microorganismo control, mientras que producen al menos un 45 % de la biomasa del microorganismo control bajo condiciones que apoyan la producción de biomasa que es comparable a los niveles de biomasa del microorganismo control bajo condiciones ricas en nitrógeno. Por ejemplo, la producción de biomasa del microorganismo control se puede encontrar dentro de un 20 % o dentro de un 15 % de la producción de biomasa del microorganismo control bajo condiciones ricas en nitrógeno. Alternativamente o, además, un mutante como se proporciona en la presente descripción puede producir al menos un 45 % de la biomasa del microorganismo control mientras que produce al menos un 25 % más de lípidos que el microorganismo control, donde el mutante y el microorganismo control se cultivan bajo condiciones que se encuentran ricas en nitrógeno con respecto al microorganismo control. En varios ejemplos, el mutante puede producir al menos un 45 % de la biomasa que se produce por una célula control y al menos un 25 % más de lípidos que la célula control en el mismo período de tiempo en un cultivo que incluye uno o más de nitrato o urea, y en algunos ejemplos puede incluir adicionalmente de forma opcional menos de aproximadamente 5 mM de amonio, tal como menos de aproximadamente 2,5 mM de amonio, menos de aproximadamente 2 mM de amonio, menos de aproximadamente 1,5 mM de amonio, amonio, menos de aproximadamente 1 mM de amonio, aproximadamente 0,5 mM de amonio, o menos de 0,5 mM de amonio.

En ejemplos particulares no limitantes, un microorganismo puede ser un microorganismo de algas o heteroconto y puede producir al menos un 25 % más de FAME mientras que produce al menos un 45 % de la cantidad de TOC como se produce por un microorganismo control de algas o heteroconto en un medio de cultivo que incluye menos de aproximadamente 5 mM, menos de aproximadamente 4,5 mM, menos de aproximadamente 4 mM, menos de aproximadamente 3,5 mM, menos de aproximadamente 3 mM, menos de aproximadamente 2,5 mM, menos de aproximadamente 1 mM, o menos de aproximadamente 0,5 mM de amonio. Por ejemplo, la concentración de amonio se puede encontrar a una concentración que varía de aproximadamente 0 a aproximadamente 5 mM, de aproximadamente 0 a aproximadamente 4,0 mM, de aproximadamente 0 a aproximadamente 3 mM, de aproximadamente 0 a aproximadamente 2,5 mM, de aproximadamente 0 a aproximadamente 2,0 mM, de aproximadamente 0 a aproximadamente 1,5 mM, de aproximadamente 0 a aproximadamente 1,0 mM, o de aproximadamente 0 a aproximadamente 0,5 mM. La concentración de amonio se puede encontrar a una concentración que varía de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 5 mM, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 4 mM, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 3 mM, de 0,5 a aproximadamente 2,5 mM, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 2,0 mM, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 1,5 mM, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 1 mM, o de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 mM, de aproximadamente 1 a aproximadamente 2,5 mM, o de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1 mM, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1,5 mM, o de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 2 mM. En ejemplos adicionales, la concentración de amonio se puede encontrar en una concentración que varía de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 2,5 mM o de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 1,5 mM.

En algunos ejemplos, un microorganismo mutante puede ser una célula de algas o heteroconto que produce al menos un 25 % más de FAME mientras que produce al menos un 45 % de la cantidad de TOC como un microorganismo control en un medio de cultivo que incluye aproximadamente 2,5 mM de amonio o menos, aproximadamente 2,0 mM de amonio o menos, aproximadamente 1,5 mM de amonio o menos, aproximadamente 1,0 mM de amonio o menos, aproximadamente 0,5 mM de amonio o menos, o sustancialmente nada de amonio, y de forma opcional puede incluir, por ejemplo, al menos 1,0 mM, al menos 2,0 mM, al menos 3,0 mM, al menos 4,0 mM, al menos 5,0 mM, al menos 6,0 mM, al menos 7,0 mM, al menos 8,0 mM, o al menos 10,0 mM de nitrato y/o urea. En ejemplos adicionales no limitantes, un microorganismo puede ser una célula de algas o heteroconto y puede producir al menos un 50 % más de FAME mientras que produce al menos un 45 % de la cantidad de TOC como un microorganismo control en un medio de cultivo que incluye menos de aproximadamente 5 mM, menos de aproximadamente 2,5 mM, menos de aproximadamente 1 mM, o menos de aproximadamente 0,5 mM de amonio. Por ejemplo, un microorganismo puede ser una célula de algas o heteroconto que produce al menos un 50 % más de FAME mientras que produce al menos un 45 % de la cantidad de TOC como un microorganismo control en un medio de cultivo que incluye aproximadamente 2,5 mM de amonio o menos, aproximadamente 1,0 mM de amonio o menos, aproximadamente 0,5 mM de amonio o menos, o sustancialmente nada de amonio, y puede incluir, por ejemplo, al menos 1,0 mM, al menos 2,0 mM, al menos 3,0 mM, al menos 4,0 mM, al menos 5,0 mM, al menos 6,0 mM, al menos 7,0 mM, al menos 8,0 mM, o al menos 10,0 mM de nitrato y/o urea.

Los microorganismos mutantes que se describen en la presente descripción pueden tener mayor división de carbono a lípido con respecto a un microorganismo control que se cultiva bajo condiciones idénticas en las que tanto el microorganismo control como el microorganismo mutante se encuentran produciendo biomasa. Un mutante que tiene un aumento de la división de carbono a lípido con respecto a un microorganismo control puede tener un aumento de la división de carbono a lípido extraíble total, a lípidos neutros totales, a triglicéridos, y/o a lípidos derivatizables de FAME. Por ejemplo, un microorganismo mutante como se proporciona en la presente descripción puede tener una relación de la cantidad de lípidos derivatizables de FAME ("FAME") que se producen a la biomasa (TOC o peso seco libre de cenizas (AFDW), por ejemplo) que se produce que es de al menos un 50 % más alto que el de un microorganismo control. La producción y/o producción de lípidos y biomasa se puede evaluar, por ejemplo, mediante análisis gravimétrico como es conocido en la técnica y se demuestra en los ejemplos de la presente descripción. Por ejemplo, un microorganismo mutante como se proporciona en la presente descripción puede tener una relación de FAME a TOC que es al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 100 %, al menos un 110 %, al menos un 120 %, al menos un 130 %, al menos un 140 %, al menos un 150 %, al menos un 160 %, al menos un 170 %, al menos un 180 %, al menos un 190 %, al menos un 200 %, o al menos un 250 % más alta que la relación FAME/TOC de un microorganismo control cuando tanto el microorganismo mutante como el microorganismo control se cultivan bajo condiciones en las que tanto el cultivo del microorganismo mutante como el cultivo del microorganismo control producen biomasa. En algún ejemplo, la relación FAME/TOC de un microorganismo mutante como se proporciona en la presente descripción se puede aumentar con respecto a la relación FAME/TOC de un microorganismo control que se cultiva bajo condiciones idénticas en menos de aproximadamente 300 %.

En varios ejemplos un microorganismo mutante como se describe en la presente descripción puede tener una relación de la cantidad de FAME que se produce a TOC que se produce, que es al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 100 %, al menos un 110 %, al menos un 120 %, al menos un 130 %, al menos un 140 %, al menos un 150 %, al menos un 160 %, al menos un 170 %, al menos un 180 %, al menos un 190 %, al menos un 200 %, o al menos un 250 % más alta que la relación FAME/TOC de un microorganismo control cuando tanto el microorganismo mutante como el microorganismo control se cultivan bajo condiciones en las que el cultivo control produce biomasa (por ejemplo, TOC) y el cultivo mutante produce al menos un 45 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % de la cantidad de biomasa que se produce por el cultivo control. En varios ejemplos, la relación FAME/TOC de un mutante como se proporciona en la presente descripción puede ser al menos 0,30, al menos 0,35, al menos 0,40, al menos 0,45, al menos 0,50, al menos 0,55, al menos 0,60, al menos 0,65, al menos 0,7, o al menos 0,75 cuando se cultiva bajo condiciones en las que el cultivo del microorganismo mutante produce al menos un 45 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % igual de biomasa (por ejemplo, TOC) que un cultivo de microorganismos control, bajo condiciones donde tanto los cultivos control como el mutante producen biomasa. En varios ejemplos, la relación FAME/TOC de un mutante como se proporciona en la presente descripción puede ser al menos 0,30, al menos 0,35, al menos 0,40, al menos 0,45, al menos 0,50, al menos 0,55, al menos 0,60, al menos 0,65, al menos 0,7, o al menos 0,75 cuando se cultivan bajo condiciones en las que el cultivo mutante produce al menos aproximadamente un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, o al menos un 100 % igual de biomasa (por ejemplo, TOC) que la que produce un microorganismo control cuando se cultiva bajo condiciones ricas en nitrógeno.

En algunos ejemplos, un microorganismo mutante como se describe en la presente descripción puede producir al menos un 50 % más de FAME mientras que produce al menos un 80 %, al menos un 85 %, o al menos un 90 % del TOC que se produce por una célula control (tal como una célula tipo salvaje) cuando se cultiva bajo condiciones en las que tanto el microorganismo control como el mutante producen biomasa, y la relación FAME/TOC del microorganismo mutante es al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, o al menos un 75 % más alto que el FAME/TOC del microorganismo control. La relación FAME/TOC del microorganismo mutante puede ser, por ejemplo, al menos 0,30, al menos 0,35, o al menos 0,40. Las condiciones de cultivo pueden incluir, por ejemplo, un medio de cultivo que incluye menos de 5 mM, menos de 2,5 mM, menos de 2 mM, menos de 1,5 mM, menos de 1,0 mM, o menos de 0,5 mM de amonio y puede incluir al menos 2 mM, al menos 4 mM, o al menos 6 mM de urea o nitrato. En ejemplos adicionales un microorganismo mutante como se proporciona en la presente descripción puede producir al menos un 60 %, al menos un 70 %, o al menos un 80 % más de FAME mientras que produce al menos un 85 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % del TOC que se produce por una célula control (tal como una célula tipo salvaje) cuando se cultiva bajo condiciones en las que tanto el microorganismo tipo salvaje como el mutante se encuentran produciendo biomasa, y la relación FAME/TOC del microorganismo mutante es al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, o al menos un 75 % mayor que la relación FAME/TOC del microorganismo control. La relación FAME/TOC del microorganismo mutante puede ser, por ejemplo, al menos 0,35, al menos 0,40, o al menos 0,45. Las condiciones de cultivo pueden incluir, por ejemplo, un medio de cultivo que incluye menos de 2,5 mM, menos de 1,0 mM, o menos de 0,5 mM de amonio y puede incluir al menos 2 mM, al menos 4 mM, o al menos 6 mM de urea o nitrato. Las condiciones de cultivo pueden, en algunos ejemplos, incluir sustancialmente nada de amonio, y en algunos ejemplos pueden incluir sustancialmente nitrógeno sin reducir como una fuente de nitrógeno.

Aún en ejemplos adicionales un microorganismo mutante como se describe en la presente descripción puede producir al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 100 %, al menos un 105 %, al menos un 110 %, o al menos un 115 % más de FAME mientras que produce al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, o al menos un 85 % del TOC que se produce por una célula control (tal como una célula tipo salvaje) cuando se cultiva bajo condiciones en las que tanto el microorganismo tipo salvaje como el mutante se encuentran produciendo biomasa, y la relación FAME/TOC del microorganismo mutante es al menos un 100 %, al menos un 110 %, al menos un 120 %, al menos un 130 %, al menos un 140 %, al menos un 150 %, al menos un 160 %, al menos un 170 %, o al menos un 180 % mayor que la relación FAME/TOC del microorganismo control. La producción de FAME y TOC se puede evaluar como la productividad promedio diaria de FAME en el período de cultivo, por ejemplo en un período de cultivo de al menos tres, al menos cinco, al menos diez, al menos veinte, al menos treinta, o al menos sesenta días, o un período de cultivo de entre tres y sesenta días, o entre tres y treinta días, por ejemplo entre tres y quince días o entre cinco y quince días. La relación FAME/TOC del microorganismo mutante puede ser, por ejemplo, al menos 0,50, al menos 0,55, al menos 0,60, al menos 0,65, al menos 0,70, o al menos 0,75. Las condiciones de cultivo pueden incluir, por ejemplo, un medio de cultivo que incluye menos de 2,5 mM, menos de 1,0 mM, o menos de 0,5 mM de amonio y puede incluir al menos 2 mM, al menos 4 mM, o al menos 6 mM de urea o nitrato.

En ejemplos adicionales, un microorganismo mutante puede producir al menos aproximadamente un 70 % de la biomasa que se produce por un microorganismo tipo salvaje o control y al menos un 90 % más de lípidos que el que se produce por un microorganismo tipo salvaje o control cuando el microorganismo mutante y el microorganismo tipo salvaje o control se cultivan bajo las mismas condiciones. La producción de FAME y TOC se puede evaluar como la productividad promedio diaria de FAME en el período de cultivo, por ejemplo en un período de cultivo de al menos tres, al menos cinco, al menos diez, al menos veinte, al menos treinta, o al menos sesenta días. Por ejemplo el microorganismo tipo salvaje y control se puede cultivar en cultivo por lote, semicontinuo, o continuo por al menos tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, veinte, treinta, o sesenta días. En algunos ejemplos la concentración de amonio en el medio de cultivo puede ser menos de aproximadamente 5 mM o menos de aproximadamente 2,5 mM. En algunos ejemplos, el medio de cultivo puede incluir al menos 2 mM de nitrato o al menos 2 mM de urea. El microorganismo mutante puede producir, en algunos ejemplos, al menos aproximadamente un 75 % o al menos aproximadamente un 80 % de la biomasa que se produce por un microorganismo tipo salvaje o control y al menos un 100 % o al menos un 110 % más de lípidos que los que se producen por un microorganismo tipo salvaje o control cuando el microorganismo mutante y el microorganismo tipo salvaje o control se cultivan bajo las mismas condiciones. La relación FAME/TOC puede ser al menos un 80 %, al menos un 100 %, al menos un 120 %, o al menos un 150 % mayor que la relación FAME/TOC de un microorganismo tipo salvaje que se cultiva bajo las mismas condiciones. En algunos ejemplos, el microorganismo mutante puede producir al menos aproximadamente un 70 % o al menos aproximadamente un 75 % de la biomasa que se produce por un microorganismo tipo salvaje o control y al menos un 100 % o al menos un 120 % más de lípidos FAME que los que se producen por un microorganismo tipo salvaje o control cuando el microorganismo mutante y el microorganismo tipo salvaje o control se cultivan bajo las mismas condiciones, y el microorganismo mutante puede tener una relación FAME/TOC al menos un 100 % o al menos un 120 % mayor que la relación FAME/TOC de un microorganismo tipo salvaje que se cultiva bajo las mismas condiciones.

En varios casos, un microorganismo mutante como se describe en la presente descripción, por ejemplo, un microorganismo mutante tal como cualquiera de los que se describen en la presente descripción que produce al menos aproximadamente un 50 % de la biomasa y al menos aproximadamente un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 100 %, al menos un 110 %, al menos un 120 %, al menos un 125 %, o al menos un 130 % más de lípidos que los que se producen por un microorganismo control que se cultiva bajo las mismas condiciones, donde las condiciones apoyan la acumulación diaria de biomasa por el microorganismo control, puede tener una relación de carbono a nitrógeno (C:N) más alta que un microorganismo control. Por ejemplo, la relación C:N puede ser de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 2,5 la relación C:N de un microorganismo control cuando el microorganismo mutante y el microorganismo control se cultivan bajo condiciones en las que tanto los microorganismos mutantes como control acumulan biomasa, y el mutante produce al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o al menos un 100 % más de lípidos que el microorganismo control y al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, o al menos un 85 % del TOC del microorganismo control. En algunos casos, la relación C:N de un mutante como se proporciona en la presente descripción se encuentra entre aproximadamente 7 y aproximadamente 20 o entre aproximadamente 8 y aproximadamente 17, o entre aproximadamente 10 y aproximadamente 15 durante el cultivo en el que el mutante produce al menos un 50 % más de lípidos que un microorganismo control mientras que produce al menos un 50 % igual de biomasa que el microorganismo control. Un microorganismo control en cualquiera de los casos o ejemplos de la presente descripción puede ser un microorganismo tipo salvaje.

Alternativamente o además, un microorganismo mutante como se describe en la presente descripción, por ejemplo, un microorganismo mutante tal como cualquiera de los que se describen en la presente descripción que produce al menos aproximadamente un 50 % de la biomasa y al menos aproximadamente un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 100 %, al menos un 110 %, o al menos un 120 % más de lípidos que los que se producen por un microorganismo control que se cultiva bajo las mismas condiciones, donde las condiciones apoyan la acumulación diaria de biomasa por el microorganismo control, puede tener una reducción en el contenido de proteína en comparación con un microorganismo control. Por ejemplo, en algunos casos un microorganismo mutante como se proporciona en la presente descripción puede tener una disminución en el contenido de proteínas de al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 45 %, o al menos un 50 % con respecto a un microrganismo control.

En varios casos, un microorganismo mutante como se proporciona en la presente descripción puede tener la expresión atenuada de un gen que codifica una proteína cuya expresión afecta la expresión de otros genes, por ejemplo, al menos diez, al menos veinte, al menos treinta, al menos cuarenta, al menos cincuenta, al menos sesenta, al menos setenta, al menos ochenta, al menos noventa, o al menos 100 genes adicionales. Por ejemplo, un mutante como se proporciona en la presente descripción puede tener al menos diez genes que se regulan positivamente con respecto a un microorganismo tipo salvaje y al menos diez genes que se regulan negativamente con respecto a un microorganismo tipo salvaje bajo condiciones en las que el fenotipo mutante (mayor producción de lípidos) se expresa. Un mutante como se proporciona en la presente descripción puede tener al menos veinte, al menos treinta, al menos cuarenta, al menos cincuenta, al menos sesenta, al menos setenta, al menos ochenta, al menos noventa, o al menos 100 genes que se regulan positivamente con respecto a un microorganismo tipo salvaje y al menos veinte, al menos treinta, al menos cuarenta, al menos cincuenta, al menos sesenta, al menos setenta, al menos ochenta, al menos noventa, o al menos 100 genes que se regulan negativamente con respecto a un microorganismo tipo salvaje bajo condiciones en las que se expresa el fenotipo mutante (por ejemplo, mayor producción de lípidos con respecto al microorganismo tipo salvaje). En algunos casos, los genes que codifican polipéptidos que se involucran en la síntesis de proteínas se pueden regular positivamente en un mutante como se proporciona en la presente descripción, por ejemplo, genes que codifican polipéptidos ribosomales u otros polipéptidos que funcionan en la traducción, que incluyen, sin limitación, aquellos que pertenecen a grupos de ontología genética (GO) tales como "traducción", "ribosoma", "constituyente estructural del ribosoma", "complejo del factor 3 de iniciación de la traducción eucariota", "actividad del factor de iniciación de la traducción", "iniciación de la traducción", "subunidad ribosómica pequeña", "formación del complejo de iniciación previa de la traducción", "regulación del inicio de la traducción, "complejo de iniciación previa eucariota 43S", y "complejo de iniciación previa eucariota 48S". Alternativamente o en combinación con la regulación positiva de genes que codifican polipéptidos que se relacionan con la síntesis de proteínas, cualquiera de varios genes que codifican polipéptidos que se involucran en la asimilación de nitrógeno, tal como una proteína de biosíntesis del cofactor de molibdeno, un transportador de nitrato, una nitrato reductasa, una nitrito reductasa, una glutamato sintasa, una glutamina sintasa, una glutamato deshidrogenasa, y un transportador de amonio se pueden regular negativamente en un mutante como se proporciona en la presente descripción. Alternativamente o en combinación con cualquiera de los anteriores, un mutante como se proporciona en la presente descripción puede exhibir una regulación positiva de determinados genes que se relacionan con la biosíntesis de lípidos que incluyen, pero no se limitan a una proteína de superficie de gotas lipídicas y/o una o más desaturasas, elongasas, lipasas, aciltransferasas y/o gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasas.

Las propiedades de un mutante como se describe en la presente descripción que tiene un aumento en la producción de lípidos se comparan con las mismas propiedades de un microorganismo control que puede ser un organismo tipo salvaje de la misma especie que el mutante, preferentemente la cepa progenitora del mutante de sobreproducción de lípidos. Alternativamente, un microorganismo control puede ser un microorganismo que es sustancialmente idéntico al microorganismo mutante con la excepción de que el microorganismo control no tiene la mutación que conduce a una productividad de lípidos más alta. Por ejemplo, un microorganismo control puede ser un microorganismo diseñado por ingeniería genética o un organismo con mutación clásica que se ha mutado o diseñado adicionalmente para generar un mutante que tiene un aumento en la productividad de lípidos y/o un aumento en la división de lípidos como se describe en la presente descripción.

En algunos ejemplos, un microorganismo control puede ser un microorganismo que es sustancialmente idéntico al microorganismo mutante, con la excepción de que el microorganismo control no tiene una mutación en un gen o una expresión atenuada de un gen que regula la inducción de lípidos (es decir, el gen cuya mutación resulta en un aumento de la producción de lípidos bajo condiciones en las que el microorganismo mutante tiene al menos aproximadamente la mitad de la productividad de la biomasa de la cepa progenitora). Las propiedades de un mutante de sobreproducción de lípidos que tiene un gen alterado, atenuado, o de cualquier otra manera directa o indirectamente manipulado por ingeniería genética (que resulta en una estructura o expresión alterada del gen regulador de la inducción de lípidos) también se comparan con las mismas propiedades de una célula control que no tiene un gen regulador de la inducción de lípidos alterado, atenuado, o de cualquier otra manera directa o indirectamente manipulado por ingeniería genética que resulta en una estructura o expresión alterada del gen regulador de la inducción de lípidos (independientemente de si la célula es "tipo salvaje"). Por ejemplo, una célula control puede ser una célula recombinante o una célula mutada en un gen distinto del gen regulador de la inducción de lípidos cuyos efectos se encuentran siendo evaluados, etc.

Las especies de heteroconto que se consideran para su uso en la invención incluyen, pero no se limitan a, Bacillariophytes, Eustigmatophytes, Labrinthulids, and Thraustochytrids, tales como, por ejemplo, especies de Labryinthula, Labryinthuloides, Thraustochytrium, Schizochytrium, Aplanochytrium, Aurantiochytrium, Oblongichytrium, Japonochytrium, Diplophrys, o Ulkenia.

Los microorganismos mutantes que tienen las propiedades que se describen en la presente descripción, tales como los microorganismos mutantes que tienen una expresión atenuada de un gen que regula la biosíntesis de lípidos, tal como el gen ZnCys-2845 de N. gaditana y ortólogos de los mismos, pueden ser, en varios ejemplos, de cualquier cepa de microalgas eucariotas tales como, por ejemplo, cualquier especie de cualquiera de los géneros Achnanthes, Amphiprora, Amphora, Ankistrodesmus, Asteromonas, Boekelovia, Bolidomonas, Borodinella, Botrydium, Botryococcus, Bracteococcus, Chaetoceros, Carteria, Chlamydomonas, Chlorococcum, Chlorogonium, Chlorella, Chroomonas, Chrysosphaera, Cricosphaera, Crypthecodinium, Cryptomonas, Cyclotella, Desmodesmus, Dunaliella, Elipsoidon, Emiliania, Eremosphaera, Ernodesmius, Euglena, Eustigmatos, Franceia, Fragilaria, Fragilaropsis, Gloeothamnion, Haematococcus, Hantzschia, Heterosigma, Hymenomonas, Isochrysis, Lepocinclis, Micractinium, Monodus, Monoraphidium, Nannochloris, Nannochloropsis, Navicula, Neochloris, Nephrochloris, Nephroselmis, Nitzschia, Ochromonas, Oedogonium, Oocystis, Ostreococcus, Parachlorella, Parietochloris, Pascheria, Pavlova, Pelagomonas, Ph&odactylum, Phagus, Picochlorum, Platymonas, Pleurochrysis, Pleurococcus, Prototheca, Pseudochlorella, Pseudoneochloris, Pseudostaurastrum, Pyramimonas, Pyrobotrys, Scenedesmus, Schizochlamydella, Skeletonema, Spyrogyra, Stichococcus, Tetrachlorella, Tetraselmis, Thalassiosira, Tribonema, Vaucheria, Viridiella, Vischeria, y Volvox. Los ejemplos no limitantes de especies particularmente adecuadas incluyen, por ejemplo, algas heteroconto, tales como pero que no se limitan a, diatomeas tales como, por ejemplo, una especie de cualquiera de los géneros Amphora, Chaetoceros, Cyclotella, Fragilaria, Fragilaropsis, Hantzschia, Navicula, Nitzschia, Ph&odactylum, oThalassiosira, o Eustigmatophytes, por ejemplo, Chloridella, Chlorobptrys, Ellipsoidion, Eustigmatos, Goniochloris, Monodopsis, Monodus, Nannochloropsis, Pseudocharaciopsis, Pseudostaruastrum, Pseudotetraedriella, o Vischeria. En algunos ejemplos, la célula de alga mutante es una especie de Ellipsoidion, Eustigmatos, Monodus, Nannochloropsis, Pseudostaruastrum, Pseudotetraedriella, o Vischeria. En algunos ejemplos, la célula de alga mutante es una especie de Nannochloropsis, por ejemplo, N. gaditana, N. granulata, N. limnetica N. oceanica, N oculata, o N. salina.

Los mutantes pueden ser mutantes espontáneos, mutantes de obtención clásica, o mutantes diseñados por ingeniería genética que tienen una expresión atenuada de un gen regulador. Por ejemplo, un microorganismo mutante tal como cualquiera de los que se describen en la presente descripción puede ser un mutante que se obtiene mediante mutagénesis clásica o diseño por ingeniería genética. En casos particulares, un microorganismo mutante como se proporciona en la presente descripción es un mutante diseñado por ingeniería genética, por ejemplo, un microrganismo en el que se ha introducido al menos una molécula de ácido nucleico exógeno, por ejemplo, en el que se ha introducido al menos una molécula de ácido nucleico recombinante, donde el microorganismo mutante se diseña por ingeniería genética para incluir la molécula de ácido nucleico exógeno y/o la molécula de ácido nucleico exógeno efectúa al menos una alteración del genoma del microorganismo.

En varios ejemplos, el microorganismo mutante es una especie de alga o heteroconto y tiene la expresión atenuada de un gen que codifica un polipéptido que tiene al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % de identidad con SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, o SEQ ID NO:17 y/o tiene una región de codificación que tiene al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % de identidad SEQ ID NO:1 o cualquiera de SEQ ID NO:72-84. Alternativamente o, además, el microorganismo mutante es una especie de alga o heteroconto y tiene una expresión atenuada de un gen que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % de identidad con los aminoácidos 1-200 de SEQ ID NO:20 o con SEQ ID NO:18 o SEQ ID NO:19. El microorganismo mutante puede en determinados casos, incluir adicionalmente un dominio que tiene al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % de identidad con cualquiera de SEQ ID NO:21-25. El dominio puede ser un dominio PAS3. El microorganismo mutante se puede diseñar para atenuar la expresión de al menos un gen que codifica un polipéptido como se establece en la presente descripción mediante cualquier método de atenuación de genes, tal como cualquiera de los que se describen en la presente descripción o equivalentes de los mismos.

El polipéptido que se codifica por el gen cuya expresión se encuentra atenuada puede ser una proteína de factor de transcripción de la familia de proteínas del dominio de unión al ADN tipo fúngico Zn(II)2Cys6. El polipéptido que se codifica por el gen cuya expresión se encuentra atenuada puede incluir un dominio Zn(2)Cys(6), que se categoriza como dominio conservado cd00067 por la base de datos de dominios conservados NCBI (ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml), denominado como "dominio de unión al ADN de agrupamiento binuclear de Zn2Cys6 tipo GAL4" que se encuentra en factores de transcripción tales como GAL4, que también se caracteriza como smart00066: "dominio de unión al ADN de agrupamiento binuclear de Zn(II)2Cys6 (o zinc C6) tipo GAL4". Este dominio, que se puede denominar en la presente descripción como un dominio Zn2Cys6, Zn2Cys6, o Zn(2)Cys(6) o simplemente un dominio ZnCys, ocurre en los aminoácidos 190-219 de SEQ ID NO:2, también se caracteriza como pfam PF00172 ("Zn_Clus" o "dominio de agrupamiento binuclear fúngico de Zn(2)-Cys(6)") con un límite de reunión para esta familia de 20,8. En algunas modalidades, un mutante como se proporciona en la presente descripción puede tener una expresión atenuada de un gen que codifica un polipéptido que tiene un dominio Zn(2)Cys(6) que tiene al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % de identidad con SEQ ID NO:3.

Alternativamente o además, el gen cuya expresión se encuentra atenuada puede codificar un polipéptido que tiene un dominio PAS_3 (pfam 08447, que tiene un límite de reunión de 25,6) también llamado "dominio de pliegues PAS" o simplemente un dominio PAS, tal como, por ejemplo, un dominio PAS que tiene al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % de identidad con cualquiera de SEQ ID NO:19-23.

El microorganismo mutante que tiene una expresión atenuada de un gen que regula la producción de lípidos puede ser un mutante por "desactivación génica", por ejemplo, en el que el marco de lectura del polipéptido se altera de modo que no se produce una proteína funcional. Por ejemplo, el gen puede incluir una inserción, deleción, o mutación en el marco de lectura que resulta en que no se produce una proteína funcional. La inserción, deleción, o mutación se puede producir por diversos medios, tales como, por ejemplo, construcciones de recombinación homóloga, endonucleasas guiadas por ARN que emplean ARN guía, de forma opcional en combinación con fragmentos de ADN del donante, etc. En otros ejemplos, el microorganismo mutante puede ser un mutante por "bloqueo de expresión" en el que la expresión del gen se reduce con respecto a una célula tipo salvaje. Por ejemplo, los niveles de transcripción del gen diana, que puede ser, por ejemplo, un gen que codifica una proteína del dominio de unión al ADN tipo fúngico Zn(2)-C6, se pueden reducir entre aproximadamente un 5 % y aproximadamente un 95 % o entre aproximadamente un 10 % y aproximadamente un 90 % con respecto al nivel de transcripción en un microorganismo control, tal como un microorganismo tipo salvaje. Los mutantes por bloqueo de expresión pueden ser aquellos en los que ocurre una mutación, inserción, o deleción en una región sin codificación del gen o se pueden efectuar mediante la expresión de construcciones en las células que reducen la expresión del gen diana, tales como construcciones de ribozima, de ARNi o antisentido. En algunos casos la atenuación de genes se puede efectuar mediante la inserción de un fragmento de ADN en una región sin codificación del gen, tal como una UTR 5' o UTR 3'. La inserción de un fragmento de ADN puede ser de forma opcional mediante el uso de una endonucleasa guiada por ARN, por ejemplo, una proteína cas. El microorganismo mutante que tiene una expresión atenuada de un gen que regula la producción de lípidos puede incluir, por ejemplo, una o más de una construcción de ARNi para expresar ARNi o una o más moléculas de ARNi, una construcción antisentido para expresar ARN antisentido o una o más moléculas antisentido, una construcción de ribozima para expresar una ribozima o una o más ribozimas, uno o más ARN guía, una o más construcciones para expresar un ARN guía, uno o más fragmentos donantes para la inserción mediada por cas, una o más construcciones de recombinación homóloga, uno o más genes que codifican una enzima cas, o una enzima cas, uno o más genes que codifican una TALEN, o una o más TALEN, o una o más meganucleasas.

Por tanto, se describen en la presente descripción microorganismos que tienen una expresión atenuada de un gen que codifica un polipéptido de la familia Zn(II)2Cys6, es decir, un polipéptido que incluye un "dominio de unión al ADN de agrupamiento binuclear de Zn2Cys6 tipo GAL4" (dominio conservado cd00067 de NCBI) y/o recluta a pfam PF00172 ("Zn_Clus" o "dominio de agrupamiento binuclear fúngico de Zn(2)-Cys(6)") con una puntuación de bits mayor que el límite de reunión para esta familia de 20,8. Alternativamente o, además, un microorganismo mutante como se proporciona en la presente descripción puede tener una expresión atenuada de un gen que codifica un polipéptido que incluye un dominio PAS (por ejemplo, un "dominio PAS3" o "dominio de pliegues PAS") que se puede caracterizar como PF08447 o PF00989. El mutante puede producir más lípidos que un microorganismo control bajo condiciones de cultivo en las que tanto el microorganismo mutante como el control producen biomasa y en las que el microorganismo mutante produce al menos un 50 % de la biomasa que se produce por el microorganismo control. Por ejemplo, el microorganismo mutante puede producir al menos un 25 %, al menos un 30 %, al menos un 35 %, al menos un 40 %, al menos un 45 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 100 %, al menos un 110 % o al menos un 120 % más de lípidos que un microorganismo control bajo condiciones de cultivo en las que tanto el microorganismo mutante como el control producen biomasa y en las que el microorganismo mutante produce al menos un 50 % de la biomasa que se produce por el microorganismo control. En varios casos el microorganismo que tiene una expresión atenuada de un gen que codifica un polipéptido de la familia Zn(II)2Cys6 y/o que tiene un dominio PAS produce al menos un 50 % más de lípidos y al menos un 50 % de la biomasa como se produce por un microorganismo control diariamente por al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos diez, al menos once, o al menos doce días de cultivo. El mutante puede incluir cualquiera de las propiedades que se describen anteriormente en la presente descripción, que incluye, sin limitación, un aumento en la relación FAME/TOC bajo condiciones en las que el mutante produce más lípidos que un microorganismo control. Las condiciones de cultivo bajo las que el mutante produce una cantidad más alta de lípidos mientras que produce al menos un 50 % de la biomasa como el microorganismo control pueden incluir menos de 2,5 mM, menos de 1,5 mM, menos de 1 mM, o aproximadamente 0,5 mM o menos de amonio. Las condiciones de cultivo bajo las que el mutante produce una cantidad más alta de lípidos mientras que produce al menos un 50 % de la biomasa como el microorganismo control pueden incluir un medio de cultivo que incluye nitrato, tal como al menos 2, 3, 4, o 5 mM de nitrato. Alternativamente o, además, las condiciones de cultivo pueden incluir un medio de cultivo que incluye urea, tal como al menos 2, 3, 4, o 5 mM de urea. El cultivo en algunos ejemplos puede proporcionar nitrato como sustancialmente la única fuente de nitrógeno disponible para el microorganismo mutante y control. El microorganismo control puede ser un microorganismo tipo salvaje de la misma especie que el mutante, por ejemplo, puede ser una cepa tipo salvaje de la que se derivó el mutante. El microorganismo puede ser un alga o un heteroconto, y en algunos ejemplos es un alga heteroconto tal como, pero que no se limita a, una diatomea o un eustigmatofito. En varios ejemplos los lípidos se pueden medir como lípidos FAME, y la biomasa se puede medir, por ejemplo, como TOC.

Alternativamente o además, un microorganismo mutante como se describe en la presente descripción que tiene una expresión atenuada de un gen que codifica un polipéptido de la familia Zn(II)2Cys6 puede demostrar una relación FAME/TOC que es al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 100 %, al menos un 110 %, al menos un 120 %, al menos un 130 %, al menos un 140 %, al menos un 150 %, al menos un 160 %, al menos un 170 %, al menos un 180 %, al menos un 190 %, al menos un 200 %, o al menos un 250 % más alto que la relación FAME/TOC de un microorganismo control cuando tanto el microorganismo mutante como el microorganismo control se cultivan bajo condiciones en las que el cultivo control produce biomasa (por ejemplo, TOC) y el cultivo mutante produce al menos un 45 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % de la cantidad de biomasa que se produce por el cultivo control. En un caso ilustrativo, una cepa de atenuación de ZnCys puede exhibir aproximadamente el doble de la productividad de lípidos de una cepa control (por ejemplo, una cepa tipo salvaje), mientras que asigna aproximadamente un 35-70 % de su carbono a lípidos, por ejemplo, mientras que asigna de aproximadamente un 40 % a aproximadamente un 65 % de su carbono a lípido, tal como aproximadamente un 45 %, 50 %, 60 %, o 65 % de su carbono a lípido en un sistema de cultivo semicontinuo o continuo. Además, adicionalmente o alternativamente, un microorganismo mutante como se proporciona en la presente descripción, por ejemplo, un microorganismo mutante que tiene una expresión atenuada de un gen que codifica un polipéptido de la familia Zn(II)2Cys6 que produce al menos aproximadamente un 50 % de la biomasa y al menos aproximadamente un 50 % más de lípidos que los que se producen por un microorganismo control que se cultiva bajo las mismas condiciones, donde las condiciones apoyan la acumulación diaria de biomasa por parte del microorganismo control, pueden tener una relación de carbono a nitrógeno (C:N) más alta que un microorganismo control. Por ejemplo, la relación C:N puede ser de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 2,5 la relación C:N de un microorganismo control cuando el microorganismo mutante y el microorganismo control se cultivan bajo condiciones en las que tanto los microorganismos mutantes como control acumulan biomasa, y el mutante produce al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 % o al menos un 100 % más de lípidos que el microorganismo control y al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, o al menos un 85 % del TOC del microorganismo control.

El gen cuya expresión se encuentra atenuada en un mutante que tiene productividad de lípidos más alta que un microorganismo control puede ser un gen que codifica un polipéptido de la familia Zn(II)2Cys6 que tiene al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % de identidad con SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, o SEQ ID NO:18. Alternativamente o, además, el gen cuya expresión se encuentra atenuada puede codificar un polipéptido que tiene un dominio PAS3 (pfam08447), tal como, por ejemplo, un dominio PAS3 que tiene al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % de identidad con cualquiera de SEQ ID NO:19-23.

Un microorganismo mutante como se describe en la presente descripción se puede diseñar al dirigirse a un gen endógeno de un microorganismo de interés que codifica un polipéptido que incluye un dominio Zn2Cys6 como se describe en la presente descripción y/o un dominio PAS3 como se describe en la presente descripción. Tales genes se pueden identificar en un microorganismo de interés mediante métodos bioinformáticos, técnicas de biología molecular, y combinaciones de los mismos. Por ejemplo, un gen que codifica un polipéptido que incluye un dominio Zn2Cys6 y/o un dominio PAS3 se puede identificar mediante el uso de hibridación Southern, cribado de bibliotecas de ADNc mediante hibridación o PCR, por ejemplo, mediante el uso de sondas y/o cebadores degenerados. Las secuencias del genoma disponibles en bases de datos públicas o patentadas se pueden buscar mediante cualquiera de un número de programas que realizan el emparejamiento de secuencias (programas blast) o analizan estructuras de dominio de secuencias de aminoácidos que se codifican. Por ejemplo, hmmer.org proporciona programas para analizar dominios estructurales y funcionales que se codifican por genes que se pueden usar para escanear secuencias del genoma, que incluyen, por ejemplo, hmmsearch y hmmscan. Estas búsquedas se pueden realizar en línea. Los programas tales como MUSCLE y hmmalign también se pueden usar para buscar ortólogos de proteínas tales como las proteínas que se describen en la presente descripción (por ejemplo, ZnCys-2845 y ortólogos) mediante la construcción de árboles filogenéticos para determinar las relaciones entre las proteínas. Además, búsquedas en base a secuencias, que incluyen blastp, blastn, y tblastn (secuencia de proteínas que se consulta frente a la secuencia de nucleótidos que se traduce). El direccionamiento de genes puede hacer uso de las secuencias que se obtienen del genoma del microorganismo de interés. No es necesario resolver la estructura completa de un gen para dirigirse al gen para su atenuación. Por ejemplo, mediante el uso de métodos que se describen en la presente descripción, que incluyen, sin limitación, la edición del genoma cas/CRISPR, construcciones de ARNi, construcciones antisentido, construcciones de recombinación homóloga, y construcciones de ribozimas, y solo una porción de una secuencia de genes se pueden emplear en construcciones y técnicas de atenuación de genes.

Atenuación de genes

Un microorganismo mutante que tiene una expresión atenuada de un gen que regula la biosíntesis de lípidos puede ser un mutante que se genera por cualquier método factible, que incluye pero no se limita a irradiación UV, irradiación gamma, o mutagénesis química, y cribado de mutantes que tienen un aumento en la producción de lípidos, por ejemplo mediante el uso de los ensayos que se describen en la presente descripción o mediante tinción con tintes lipofílicos tal como Rojo Nilo o BODIPY (por ejemplo, Cabanelas y otros (2015) Bioresource Technology 184:47-52). Los métodos para generar mutantes de cepas microbianas son bien conocidos.

Un mutante como se describe en la presente descripción que produce al menos un 25 % más de lípidos mientras que produce al menos un 50 % de la biomasa como célula progenitora también puede ser un mutante diseñado por ingeniería genética, por ejemplo, un mutante en el que un gen de regulación tal como una proteína del dominio de unión al ADN tipo fúngico Zn(2)-C(6) (por ejemplo, ZnCys-2845 o un ortólogo del mismo, por ejemplo, un gen que codifica un polipéptido que tiene al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % de identidad con SEQ ID NO:2 o cualquiera de SEQ ID NO:5-18) se ha dirigido por recombinación homóloga para knock-out o reemplazo de genes (por ejemplo, con la forma mutada del gen que codifica un polipéptido que tiene una reducción de la actividad con respecto al polipéptido tipo salvaje). Por ejemplo, una cepa microbiana de interés se puede diseñar mediante recombinación homóloga que se dirige al sitio para insertar una secuencia en un locus genómico y alterar así un gen y/o su expresión, donde la inserción puede ser, como ejemplos no limitantes, en la región de codificación del gen, en un intrón del gen, en la UTR 3' o el gen, en la UTR 5' del gen, o corriente arriba del sitio de inicio de transcripción, es decir, en la región promotora del gen.

Por ejemplo, la eliminación o reemplazo de genes por recombinación homóloga puede ser mediante la transformación de una construcción de ácido nucleico de recombinación homóloga, es decir, un fragmento de ácido nucleico (por ejemplo, ADN) que incluye una secuencia homóloga a la región del genoma que se va a alterar, donde la secuencia homóloga se interrumpe por una secuencia extraña, típicamente, pero no necesariamente, por un gen marcador seleccionable que permite la selección para la construcción que se integra. Las secuencias flanqueantes homólogas del genoma ya sea a cada lado de la secuencia extraña o la secuencia del gen mutado pueden ser, por ejemplo, al menos 20, al menos 50, al menos 100, al menos 200, al menos 300, al menos 400, al menos 500, al menos 600, al menos 700, al menos 800, al menos 900, al menos 1000, al menos 1200, al menos 1500, al menos 1750, o al menos 2000 nucleótidos de longitud. Una construcción de desactivación génica o de "inserción" génica en el que una secuencia extraña se encuentra flanqueada por secuencias de genes diana, se puede proporcionar en un vector que se puede linealizar de forma opcional, por ejemplo, mediante escisión en un sitio fuera de la región que se va a someter a recombinación homóloga, o se puede proporcionar como un fragmento lineal que no se encuentra en el contexto de un vector, por ejemplo, una construcción de desactivación génica o de inserción génica puede ser un fragmento aislado o sintetizado, que incluye pero no se limita a un producto de PCR. En algunos casos, se puede usar un sistema marcador que se divide para generar desactivaciones génicas mediante recombinación homóloga, donde se pueden introducir dos fragmentos de ADN que pueden regenerar un marcador seleccionable y alterar el locus del gen de interés mediante tres eventos cruzados (Jeong y otros (2007) FEMS Microbiol Lett 273:157-163).

En un aspecto, la descripción proporciona organismos modificados por ingeniería genética, por ejemplo microorganismos que tienen una o más modificaciones genéticas para atenuar la expresión de un gen de regulación de lípidos, tal como un gen que codifica una proteína del dominio de unión al ADN tipo fúngico Zn(2)-C(6), que además puede tener al menos un 55 % de identidad con cualquiera de SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:5-18. Como se usa en la presente descripción, "atenuar la expresión de un gen de regulación de lípidos" significa reducir o eliminar la expresión del gen de cualquier manera que reduzca la producción de la proteína de regulación de lípidos completamente funcional. Como se usa en la presente descripción, "gen de regulación de lípidos" se refiere a un gen cuya expresión atenuada en un organismo o célula resulta en una regulación alterada de al menos 50, al menos 100, al menos 200, o al menos 300 genes en el organismo o célula con respecto a un organismo o célula control y resulta en una productividad de lípidos alterada por el organismo o célula. En un caso ilustrativo, un gen de regulación de lípidos es un gen que codifica una proteína del dominio de unión al ADN tipo fúngico Zn(2)-C(6). Los medios para atenuar un gen de regulación de lípidos incluyen, por ejemplo, construcciones de recombinación homóloga; sistemas CRISPR, que incluyen uno o más ARN guía, una enzima cas tal pero que no se limita a, una enzima Cas9 o un gen que codifica una enzima cas y, de forma opcional, uno o más fragmentos donantes para la inserción en un sitio diana; construcciones de ARNi; ARNhc; construcciones de ARN antisentido; construcciones de ribozima; TALENS o genes que codifican TALEN, nucleasas con dedos de zinc o genes que codifican nucleasas con dedos de zinc; y meganucleasas o genes que codifican nucleasas con dedos de zinc.

Por ejemplo, un microorganismo recombinante diseñado para tener una expresión atenuada de un gen de regulación de lípidos puede tener un gen de regulación de lípidos alterado que incluye al menos una inserción, mutación, o deleción que reduce o anula la expresión del gen de modo que un gen de regulación de lípidos completamente funcional no se produce o se produce en cantidades inferiores a las que se producen por un microorganismo control que no incluye un gen de regulación de lípidos alterado. El gen de regulación de lípidos alterado se puede alterar, por ejemplo, mediante una inserción o reemplazo de genes mediado por recombinación homóloga y/o por la actividad de una meganucleasa, nucleasa de dedos de zinc (Pérez-Piñera y otros (2012) Curr. Opin. Chem. Biol. 16: 268-277), TALEN (documento WO 2014/207043; documento WO 2014/076571), o una proteína cas (por ejemplo, una proteína Cas9) de un sistema CRISPR.

Sistemas CRISPR, revisados recientemente por Hsu y otros (Cell 157:1262-1278, 2014) incluyen, además del polipéptido de nucleasa cas o complejo, un ARN de direccionamiento, a menudo denominado "ARNcr", que interactúa con el sitio diana del genoma por complementariedad con una secuencia del sitio diana, un ARN transactivador ("tracr") que forma complejos con el polipéptido cas y también incluye una región que se une (por complementariedad) al ARNcr de direccionamiento.

La invención contempla el uso de dos moléculas de ARN (un "ARNcr" y un "ARNtracr") que se pueden cotransformar en una cepa huésped (o se expresar en una cepa huésped) que expresa o se transfecta con una proteína cas para la edición del genoma, o el uso de un único ARN guía que incluye una secuencia complementaria a una secuencia diana, así como también una secuencia que interactúa con una proteína cas. Es decir, en algunas estrategias, un sistema CRISPR como se usa en la presente descripción puede comprender dos moléculas de ARN por separado (un "ARN tracr" y un "ARN diana" o "ARNcr", ver más abajo) y se denomina en la presente descripción como un "sistema CRISPR de dos moléculas ARN" "sistema de dos ARN guía" o un" sistema de ARN guía que se divide". Alternativamente, como se ilustra en los ejemplos, el ARN que se dirige al ADN también puede incluir la secuencia de activación trans para la interacción con la proteína cas (además de las secuencias homólogas a la diana ("cr")), es decir, el ARN que se dirige al ADN puede ser una única molécula de ARN y se denomina en la presente descripción como "ARN guía quimérico", "ARN de guía única", o "ARNg". Los términos "ARN que se dirige al ADN" y "ARNg" son inclusivos, y se refieren tanto a un sistema de dos ARN guía como a los ARN que se dirigen a una única molécula de ADN (es decir, ARNsg). Tanto los ARN guía de una única molécula como el sistema de dos ARN guía se han descrito en detalle en la literatura y, por ejemplo, en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos número US 2014/0068797, y ambos se consideran en la presente descripción.

Se puede usar cualquier proteína cas en los métodos de la presente descripción, tal como pero que no se limitan a, Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (también conocido como Csn1 y Csxl2), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, homólogos de los mismos, o versiones que se modifican de los mismos. La proteína cas puede ser una proteína Cas9, tal como una proteína Cas9 de Staphylococcus pyogenes, S. thermophilus, S. pneumonía, S. aureus, o Neisseria meningitidis, como ejemplos no limitantes. También se consideran las proteínas Cas9 que se consideran como SEQ ID NO:1-256 y 795-1346 en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos número US 2014/0068797, y proteínas quiméricas Cas9 que pueden combinar dominios de más de una proteína cas9, así como también variantes y mutantes de proteínas Cas9 que se identifican. En ejemplos adicionales, una proteína cas que se usa para la modificación del genoma puede ser una proteína Cpf1 que usa un único sistema de ARN guía, tal como pero que no se limita a, una proteína Cpf1 de Acidaminococcus o Lachnospiraceae (ver por ejemplo Fagerlund y otros (2015) Genome Biol. 15:261; Zetsche y otros (2015) Cell 163:1-13); y la solicitud de patente europea EP3009511), así como también las nucleasas guiadas por ARN C2c1, C2c2, C2c3 (Shmakov y otros (2015) Molecular Cell 60:1-13).

La actividad de la nucleasa Cas escinde el ADN diana para producir rupturas de doble cadena. Estas rupturas se reparan después por la célula de una de dos formas: unión de extremos no homólogos o reparación que se dirige por homología. En la unión de extremos no homólogos (NHEJ), las rupturas de doble cadena se reparan mediante la ligadura directa de los extremos de ruptura entre sí. En este caso, no se inserta nuevo material de ácido nucleico en el sitio, aunque se puede perder algo de material de ácido nucleico, lo que resulta en una deleción, o una alteración, que a menudo resulta en una mutación. En la reparación que se dirige por homología, un polinucleótido donante (a veces denominado como "ADN donante" o "ADN de edición") que puede tener homología con la secuencia de ADN diana que se escinde se usa como plantilla para reparar la secuencia de ADN diana que se escinde, lo que resulta en la transferencia de información genética del polinucleótido donante al ADN diana. Como tal, se puede insertar/copiar nuevo material de ácido nucleico en el sitio. Las modificaciones del ADN diana que se deben a NHEJ y/o la reparación que se dirige por homología (por ejemplo mediante el uso de una molécula de ADN de un donante) pueden conducir a, por ejemplo, corrección de genes, reemplazo de genes, etiquetado de genes, inserción de transgenes, deleción de nucleótidos, alteración de genes, mutación de genes, etc.

En algunos casos, la escisión del ADN por un polipéptido modificador que se dirige al sitio (por ejemplo, una nucleasa cas, nucleasa con dedos de zinc, meganucleasa, o TALEN) se puede usar para eliminar material de ácido nucleico de una secuencia de ADN diana mediante la escisión de la secuencia de ADN diana y al permitir que la célula repare la secuencia en ausencia de un polinucleótido donante que se proporciona exógenamente. Tales eventos NHEJ pueden resultar en mutaciones ("reparación errónea") en el sitio de unión de los extremos que se escinden que pueden resultar en la alteración del gen.

Alternativamente, si un ARN que se dirige al ADN se coadministra a células que expresan una nucleasa cas junto con un ADN donante, los métodos objeto de estudio se pueden usar para añadir, es decir, insertar o reemplazar, material de ácido nucleico a una secuencia de ADN diana (por ejemplo "desactivación génica" por mutagénesis de inserción, o "inserción" de un ácido nucleico que codifica una proteína (por ejemplo, un marcador seleccionable y/o cualquier proteína de interés), un ARNip, un ARNmi, etc., para modificar una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, introducir una mutación), y similares.

Un ADN donante puede incluir, en casos particulares, una secuencia de regulación de genes (por ejemplo, un promotor) que se puede, mediante el uso del direccionamiento CRISPR, insertar corriente arriba de las regiones de codificación del gen y corriente arriba de la supuesta región promotora proximal del gen, por ejemplo, al menos 50 pb, al menos 100 pb, al menos 120 pb, al menos 150 pb, al menos 200 pb, al menos 250 pb, al menos 300 pb, al menos 350 pb, al menos 400 pb, al menos 450 pb, o al menos 500 pb corriente arriba del ATG de inicio de la región de codificación del gen de regulación de lípidos. El ADN donante puede incluir una secuencia, tal como por ejemplo un marcador seleccionable o cualquier secuencia conveniente, que puede interferir con el promotor nativo. La secuencia adicional que se inserta corriente arriba del ATG de inicio del marco de lectura que se abre del regulador de lípidos (por ejemplo, en la UTR 5' o corriente arriba del sitio de inicio de transcripción del gen de regulación de lípidos) puede disminuir o incluso eliminar la expresión del gen de regulación de lípidos endógeno. Alternativamente o, además, el gen de regulación de lípidos nativo puede tener su promotor endógeno que se reemplaza total o parcialmente por un promotor más débil o regulado de forma diferente, o una secuencia no promotora.

En algunos ejemplos, una molécula de ácido nucleico que se introduce en una célula huésped para generar una línea celular de edición del genoma de más alta eficiencia codifica una enzima cas9 que se encuentra mutada con respecto a la enzima tipo salvaje correspondiente de modo que la enzima cas9 mutada carece de capacidad para escindir una o ambas cadenas de un polinucleótido diana que contiene una secuencia diana. Por ejemplo, una sustitución de aspartato a alanina (D10A) en el dominio catalítico RuvC I de Cas9 de S. pyogenes convierte a Cas9 de una nucleasa que escinde ambas cadenas en una nickasa (una enzima que escinde una sola cadena). Otros ejemplos de mutaciones que hacen de Cas9 una nickasa incluyen, sin limitación, H840A, N854A, y N863A. En algunos casos, se puede usar una nickasa Cas9 en combinación con una secuencia o secuencias guía, por ejemplo, dos secuencias guía, que se dirigen respectivamente a las cadenas con sentido y antisentido del ADN diana. Esta combinación permite cortar ambas cadenas y usarlas para inducir NHEJ. Se pueden usar dos dianas de nickasa (dentro de la proximidad cercana pero que se dirigen a diferentes cadenas del ADN) para inducir NHEJ mutagénico. Tal direccionamiento de un locus mediante el uso de enzimas que escinden cepas opuestas en posiciones escalonadas también puede reducir la escisión no diana, ya que ambas cadenas se deben escindir de forma precisa y específica para lograr la mutación del genoma.

En ejemplos adicionales, una enzima mutante cas9 que tiene deterioro en su capacidad para escindir el ADN se puede expresar en la célula, donde también se introducen uno o más ARN guía que se dirigen a una secuencia corriente arriba del sitio de inicio de transcripción o traducción del gen diana. En este caso, la enzima cas se puede unir a la secuencia diana y bloquear la transcripción del gen diana (Qi y otros (2013) Cell 152:1173-1183). Esta interferencia CRISPR de la expresión génica se puede denominar como ARNi y también se describe en detalle en Larson y otros (2013) Nat. Protoc. 8:2180-2196.

En algunos casos, un polipéptido cas tal como un polipéptido Cas9 es un polipéptido de fusión, que comprende, por ejemplo: i) un polipéptido Cas9 (que puede ser de forma opcional un polipéptido Cas9 variante como se describe anteriormente); y ii) un polipéptido heterólogo que se enlaza covalentemente (también denominado como "pareja de fusión"). Una secuencia de ácido nucleico heteróloga se puede enlazar a otra secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, mediante diseño por ingeniería genética) para generar una secuencia de nucleótidos quimérica que codifica un polipéptido quimérico. En algunos casos, un polipéptido de fusión Cas9 se genera mediante la fusión de un polipéptido Cas9 con una secuencia heteróloga que proporciona la localización subcelular (es decir, la secuencia heteróloga es una secuencia de localización subcelular, por ejemplo, una señal de localización nuclear (NLS) para dirigirse al núcleo; una señal de localización mitocondrial para dirigirse a las mitocondrias; una señal de localización de cloroplasto para dirigirse a un cloroplasto; una señal de retención ER; y similares). En algunos casos, la secuencia heteróloga puede proporcionar una etiqueta (es decir, la secuencia heteróloga es una marca detectable) para facilitar el seguimiento y/o purificación (por ejemplo, una proteína fluorescente, por ejemplo, la proteína fluorescente verde (GFP), YFP, RFP, CFP, mCherry, tdTomato, y similares; una etiqueta de hemaglutinina (Ha ); una etiqueta FLAG; una etiqueta Myc; y similares).

Las células huésped se pueden diseñar por ingeniería genética (por ejemplo, transducir o transformar o transfectar) con, por ejemplo, una construcción de vector que puede ser, por ejemplo, un vector para la recombinación homóloga que incluye secuencias de ácido nucleico homólogas a una porción de un locus de gen de regulación de lípidos de la célula huésped o de regiones adyacentes a la misma, o puede ser un vector de expresión para la expresión de cualquiera o una combinación de: una proteína cas (por ejemplo, una proteína cas9), un ARN guía quimérico CRISPR, un ARNcr y/o un ARNtracr, una construcción de ARNi (por ejemplo, un ARNhc), un ARN antisentido o una ribozima. El vector se puede encontrar, por ejemplo, en forma de un plásmido, una partícula viral, un fago, etc. También se puede diseñar un vector para la expresión de un polipéptido o ARN para la edición del genoma para la integración en el hospedador, por ejemplo, por homólogos recombinación. Un vector que contiene una secuencia de polinucleótidos como se describe en la presente descripción, por ejemplo, secuencias que tienen homología con las secuencias del gen de regulación de lípidos del hospedador (que incluye las secuencias que se encuentran corriente arriba y corriente abajo de las secuencias que codifican el regulador de lípidos), así como también, de forma opcional, un gen marcador o reportero seleccionable, se puede emplear para transformar un huésped apropiado para causar la atenuación de un gen de regulación de lípidos.

El microorganismo recombinante en algunos ejemplos puede tener una reducción pero no una anulación de la expresión del gen de regulación de lípidos, y el microorganismo recombinante puede tener un aumento en la producción de lípidos de aproximadamente un 25 % a aproximadamente un 200 % o más, por ejemplo. Un microorganismo que se modifica por ingeniería genética como se proporciona en la presente descripción puede incluir en algunos ejemplos una construcción de ácido nucleico para atenuar la expresión de un gen de regulación de lípidos, tales como, por ejemplo, un gen que codifica un polipéptido que tiene al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % de identidad con SEQ ID NO:2 o cualquiera de SEQ ID NO:5-18. Por ejemplo, un microorganismo huésped puede incluir una construcción para expresar una molécula de ARNi, de ribozima, o una molécula antisentido que reduce la expresión de un gen de regulación de lípidos que codifica un polipéptido que tiene al menos un 55 % de identidad con SEQ ID NO:2 o cualquiera de SEQ ID NO:5-18. En algunos ejemplos, un microorganismo recombinante como se proporciona en la presente descripción puede incluir al menos una construcción que se introduce (exógena o no nativa) para reducir la expresión de un gen de regulación de lípidos.

En algunos ejemplos, se pueden seleccionar cepas diseñadas para la expresión de un gen de regulación de lípidos que se encuentra disminuido con respecto a una célula control que no incluye una modificación genética para atenuar la expresión del gen de regulación de lípidos, pero no se elimina, mediante el uso de métodos conocidos en la técnica, tal como, por ejemplo, RNA-Seq o PCR de transcripción inversa (RT-PCR).

Una cepa diseñada por ingeniería genética como se describe en la presente descripción se puede diseñar por ingeniería genética para incluir una construcción para atenuar la expresión génica mediante la reducción de la cantidad, estabilidad, o traducibilidad del ARNm de un gen que codifica un regulador de lípidos. Por ejemplo, un microorganismo tal como una cepa de algas o heteroconto se puede transformar con una construcción de ARN antisentido, de ARNi o de ribozima que se dirige a un ARNm de un gen de regulación de lípidos mediante el uso de métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, una construcción de ARN antisentido que incluye toda o una porción de la región que se transcribe de un gen se puede introducir en un microorganismo para disminuir la expresión génica (Shroda y otros (1999) La célula vegetal 11:1165-78; Ngiam y otros (2000) Apl. Environ. Microbiol. 66:775-782; Ohnuma y otros (2009) Protoplasma 236:107-112; Lavaud y otros (2012) PLoS One 7:e36806). Alternativamente o, además, una construcción de ARNi (por ejemplo, una construcción que codifica un ARN en horquilla corta) que se dirige a un gen que tiene un dominio Zn(2)Cys(6) se puede introducir en un microorganismo tal como un alga o heteroconto para reducir la expresión del gen de regulación de lípidos (ver, por ejemplo, Cerruti y otros (2011) Eukaryotic Cell (2011) 10:1164-1172; Shroda y otros (2006) Curr. Genet. 49: 69-84).

Las ribozimas son complejos de proteína de ARN que escinden los ácidos nucleicos de una manera específica al sitio. Las ribozimas tienen dominios catalíticos específicos que poseen actividad de endonucleasa. Por ejemplo, la patente de los Estados Unidos número 5,354,855 reporta que determinadas ribozimas pueden actuar como endonucleasas con una especificidad de secuencia mayor que la de las ribonucleasas conocidas y que se aproxima a la de las enzimas de restricción de ADN. Las construcciones de ARN catalítico (ribozimas) se pueden diseñar para emparejar las bases con un ARNm que codifica un gen como se proporciona en la presente descripción para escindir el ARNm diana. En algunos ejemplos, las secuencias de ribozimas se pueden integrar dentro de una construcción de ARN antisentido para mediar la escisión de la diana. Se pueden considerar que en varios tipos de ribozimas, su diseño y uso es conocido en la técnica y se describe, por ejemplo, en Haseloff y otros (1988) Nature 334:585-591.

Las ribozimas se dirigen a una secuencia dada en virtud de la hibridación con un sitio mediante interacciones complementarias de pares de bases. Se requieren dos tramos de homología para este direccionamiento. Estos tramos de secuencias homólogas flanquean la estructura de ribozima catalítica que se define anteriormente. Cada tramo de secuencia homóloga puede variar en longitud de 7 a 15 nucleótidos. El único requisito para definir las secuencias homólogas es que, en el ARN diana, se encuentren separadas por una secuencia específica que es el sitio de escisión. Para la ribozima de cabeza de martillo, el sitio de escisión de una secuencia de dinucleótidos en el ARN diana es un uracilo (U) seguido de ya sea una adenina, citosina o uracilo (A, C o U) (Thompson y otros, (1995) Nucl Acids Res 23:2250-68). La frecuencia en que ocurre este dinucleótido en cualquier ARN dado es estadísticamente 3 de 16. Por lo tanto, para un ARN mensajero diana dado de 1000 bases, son estadísticamente posibles 187 sitios de escisión de dinucleótidos.

El diseño general y la optimización de la actividad de escisión del ARN que se dirige a ribozimas se han discutido en detalle (Haseloff y Gerlach (1988) Nature 334:585-591; Symons (1992) Ann Rev Biochem 61:641-71; Chowrira y otros (1994) J Biol Chem 269:25856-64; Thompson y otros (1995) supra). El diseño y prueba de ribozimas para la escisión eficiente de un ARN diana es un proceso bien conocido por los expertos en la técnica. Los ejemplos de métodos científicos para diseñar y probar ribozimas se describen por Chowrira y otros, (1994) supra y Lieber y Strauss (1995) Mol Cell Biol. 15:540-51. La identificación de secuencias operativas y preferidas para su uso en la regulación negativa de un gen dado es una cuestión de preparar y probar una secuencia dada, y es un método de "cribado" que se practica de forma rutinaria conocido por los expertos en la técnica.

El uso de construcciones de ARNi se describe en la literatura que se cita anteriormente, así como también en el documento US2005/0166289 y el documento WO 2013/016267, por ejemplo. Un ARN bicatenario con homología con el gen diana se administra a la célula o se produce en la célula mediante la expresión de una construcción de ARNi, por ejemplo, una construcción de horquilla corta (hc) de ARNi. La construcción puede incluir una secuencia que es idéntica al gen diana, o al menos un 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, o entre un 95 % y un 100 % idéntica a una secuencia del gen diana. La construcción puede tener al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 100, al menos 200, al menos 300, al menos 400, al menos 500, al menos 600, al menos 700, al menos 800, al menos 900, o al menos 1 kb de secuencia homóloga al gen diana. Los vectores de expresión se pueden diseñar mediante el uso de promotores seleccionados para la expresión continua o inducible de una construcción de ARNi, tal como una construcción que produce un ARNhc.

Una construcción de ácido nucleico para atenuación de genes, por ejemplo, una construcción de ribozima, de ARNi, o antisentido puede incluir al menos quince, al menos veinte, al menos treinta, al menos cuarenta, al menos cincuenta, o al menos sesenta nucleótidos que tienen al menos un 80 % de identidad, tal como al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, o al menos un 99 % de complementariedad con al menos una porción de la secuencia de un gen de regulación de lípidos endógeno del microorganismo que se va a diseñar. Una construcción de ácido nucleico para la atenuación de genes, por ejemplo, una construcción de ribozima, de ARNi, o antisentido puede incluir al menos quince, al menos veinte, al menos treinta, al menos cuarenta, al menos cincuenta, o al menos sesenta nucleótidos que tienen al menos un 80 %, tal como al menos un 95 % o aproximadamente un 100 % de identidad o complementariedad con la secuencia de un gen de origen natural, tal como un gen que codifica un polipéptido que tiene al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, o al menos un 85 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % de identidad con secuencia de un gen de regulación de lípidos endógeno. Por ejemplo, una construcción de ácido nucleico para la atenuación de genes, por ejemplo, una construcción de ribozima, de ARNi, o antisentido puede incluir al menos quince, al menos veinte, al menos treinta, al menos cuarenta, al menos cincuenta, o al menos sesenta nucleótidos que tienen al menos un 80 % de identidad o complementariedad con la secuencia de un gen de regulación de lípidos de origen natural, tal como cualquiera que se proporciona en la presente descripción. La secuencia de nucleótidos puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 30 nucleótidos a aproximadamente 3 kilobases o más, por ejemplo, de 30 a 50 nucleótidos de longitud, de 50 a 100 nucleótidos de longitud, de 100 a 500 nucleótidos de longitud, de 500 nucleótidos a 1 kb de longitud, de 1 kb a 2 kb de longitud, o de 2 a 5 kb. Por ejemplo, una secuencia antisentido puede ser de aproximadamente 100 nucleótidos a aproximadamente 1 kb de longitud. Por ejemplo, una construcción de ácido nucleico para la atenuación de genes, por ejemplo, una construcción de ribozima, de ARNi, o antisentido puede incluir al menos quince, al menos veinte, al menos treinta, al menos cuarenta, al menos cincuenta, al menos sesenta, o al menos 100 nucleótidos que tienen al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, o al menos un 85 %, por ejemplo al menos un 86 %, al menos un 87 %, al menos un 88 %, al menos un 89 %, al menos un 90 %, al menos un 91 %, al menos un 92 %, al menos un 93 %, al menos un 94 %, o al menos un 95 % de identidad o complementariedad con un gen de regulación de lípidos endógeno o una parte del mismo.

Los promotores que se usan en construcciones antisentido, de ARNi, o de ribozima pueden ser cualquiera que sea funcional en el organismo huésped y que sea adecuado para los niveles de expresión que se requieren para reducir la expresión del gen diana a una cantidad que se desea. Los promotores funcionales en algas y heterocontos son conocidos en la técnica y se describen en la presente descripción. La construcción se puede transformar en algas mediante el uso de cualquier método factible, que incluye cualquiera de los que se describen en la presente descripción. Un organismo recombinante o un microorganismo transformado con una molécula de ácido nucleico para atenuar la expresión del gen de regulación de lípidos, tal como pero que no se limita a, una construcción antisentido, de ARNi, o de ribozima, puede tener las propiedades de un mutante de regulación de lípidos como se describe en la presente descripción, que incluye, por ejemplo, reducción de clorofila, aumento de la eficiencia fotosintética, y aumento de la productividad en el cultivo, con respecto a un organismo huésped o microorganismo que no incluye la molécula de ácido nucleico exógeno que resulta en una expresión génica atenuada. En ejemplos adicionales, tal como se describe en los Ejemplos de la presente descripción, la atenuación del gen que disminuye, pero no elimina la expresión del gen diana se puede alcanzar a través del uso de recombinación homóloga o edición del genoma CRISPR/Cas9 donde el fragmento donante es la diana para la inserción en la región de codificación de un gen. Por ejemplo, un casete de marcador seleccionable u otro fragmento donante se puede dirigir mediante el uso de un ARN guía apropiado para la UTR 5', UTR 3', o un intrón de un gen cuya reducción de expresión se desea. Por tanto, otro aspecto es un método para atenuar la expresión de un gen que incluye insertar un fragmento de ácido nucleico en un sitio corriente arriba del sitio de inicio de la traducción o corriente abajo de un sitio de terminación de la traducción, en donde se reduce el nivel de expresión del gen. Como ejemplos no limitantes, la inserción de un fragmento donante se puede introducir en una región hasta 2 kb corriente arriba del sitio de inicio de la traducción de un gen, o hasta 2 kb corriente abajo del codón de terminación de un gen. Por ejemplo, una inserción que se dirige a un sitio de entre aproximadamente 5 pb y 2 kb corriente arriba del sitio de inicio de la traducción, o entre aproximadamente 10 pb y 1,5 kb corriente arriba del sitio de inicio de la traducción, o entre aproximadamente 10 pb y aproximadamente 1,2 kb corriente arriba del sitio de inicio de la traducción, o entre aproximadamente 20 pb y aproximadamente 1 kb corriente arriba del sitio de inicio de la traducción. Alternativamente o, además, una inserción se puede dirigir a la UTR 3' de un gen. Alternativamente o, además, una inserción que se dirige a un sitio de entre aproximadamente 5 pb y 2 kb corriente abajo del sitio de terminación de la traducción (codón de terminación), o entre aproximadamente 10 pb y 1,5 kb corriente abajo del codón de parada, o entre aproximadamente 10 pb y aproximadamente 1,2 kb corriente abajo del codón de parada, o entre aproximadamente 20 pb y aproximadamente 1 kb corriente abajo del codón de parada. Sin limitarse a ningún mecanismo particular, tales inserciones pueden reducir la tasa o la transcripción de un gen o pueden reducir la estabilidad de una transcripción resultante.

Moléculas y construcciones de ácidos nucleicos

También se describen en la presente descripción moléculas de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos que incluyen secuencias de aminoácidos que tienen al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, o al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % de identidad con SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, o SEQ ID NO:17. Alternativamente o, además, una molécula de ácido nucleico como se proporciona en la presente descripción puede incluir una secuencia que tiene al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % de identidad con SEQ ID NO:1 o cualquiera de SEQ ID NO:72-84. El polipéptido que tiene al menos un 60 % de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:5-17 o que se codifica por SEQ ID NO:1 o cualquiera de SEQ ID NO:72-84 puede incluir una secuencia de aminoácidos que codifica un dominio Zn(2)Cys(6), por ejemplo, un dominio que pertenece a pfam PF00172. Por ejemplo, el polipéptido que se codifica por la molécula de ácido nucleico puede incluir un dominio Zn(2)Cys(6) que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, o al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % de identidad con SEQ ID NO:3. Alternativamente o, además, un polipéptido que se codifica por una molécula de ácido nucleico como se proporciona en la presente descripción puede incluir de forma opcional adicionalmente un dominio PAS (o PAS3). Por ejemplo, un polipéptido que se codifica por una molécula de ácido nucleico como se proporciona en la presente descripción puede incluir un dominio PAS que tiene al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, o al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % de identidad con cualquiera de SEQ ID NO:21-SEQ ID NO:25.

La molécula de ácido nucleico en varios ejemplos puede ser o comprender un ADNc que carece de uno o más intrones presentes en el gen de origen natural o, alternativamente, puede incluir uno o más intrones no presentes en el gen de origen natural. La molécula de ácido nucleico en varios ejemplos puede tener una secuencia que no es 100 % idéntica a un gen de origen natural. Por ejemplo, la molécula de ácido nucleico puede incluir una mutación con respecto a un gen de origen natural que reduce la actividad del polipéptido que se codifica o reduce la expresión del ARNm o proteína que se codifica por el gen.

La molécula de ácido nucleico en varios ejemplos puede comprender un promotor heterólogo enlazado operativamente a la secuencia que codifica un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, o al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % de identidad con SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, o SEQ ID NO:17 y/o puede comprender un promotor heterólogo enlazado operativamente a una secuencia que tiene al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85%, al menos un 90 %, o al menos un 95 % de identidad con SEQ ID NO:1 o cualquiera de SEQ ID NO:72-84. Alternativamente o además, una molécula de ácido nucleico puede comprender un vector que incluye una secuencia que codifica un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos 70 %, o al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % de identidad con SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, o SEQ ID NO:17 y/o tiene al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % de identidad con SEQ ID NO:1 o cualquiera de SEQ ID NO:72-84.

Un aspecto adicional de la descripción es una construcción diseñada para atenuar la expresión de un gen que codifica un polipéptido del dominio de unión al ADN Zn(2)Cys(6). La construcción puede ser o comprender, en varios ejemplos, una secuencia que codifica un ARN guía de un sistema CRISPR, una construcción de ARNi, una construcción antisentido, una construcción de ribozima, o una construcción por recombinación homóloga, por ejemplo, una construcción que tiene una o más secuencias de nucleótidos que tienen homología con un gen que codifica el dominio Zn(2)Cys(6) de origen natural como se describe en la presente descripción y/o secuencias adyacentes a las mismas en el genoma nativo del que se deriva el gen. Por ejemplo, la construcción puede incluir al menos una porción de un gen que codifica un polipéptido que tiene un dominio Zn(2)Cys(6), por ejemplo, una secuencia homologa a al menos una porción de un gen que codifica un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, o al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % de identidad con SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, o SEQ ID NO:17 o puede incluir al menos una porción de una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, o al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % de identidad con SEQ ID NO:1 o cualquiera de SEQ ID NO:72-84.

La construcción para la atenuación de genes puede incluir, por ejemplo, al menos una parte de la región de codificación de un gen que codifica un polipéptido que tiene un dominio Zn(2)Cys(6) o un polipéptido que tiene al menos un 60 % de identidad con cualquiera de SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:5-17 o al menos una porción de un gen que tiene al menos un 50 % de identidad con SEQ ID NO:1 o cualquiera de SEQ ID NO:72-84, al menos una porción de un intrón de un gen que codifica un polipéptido que tiene un dominio Zn(2)Cys(6) o un polipéptido que tiene al menos un 60 % de identidad con cualquiera de las SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:5-17, al menos una porción de una UTR 5' de un gen que codifica un polipéptido que tiene un dominio Zn(2)Cys(6) o un polipéptido que tiene al menos un 60 % de identidad con cualquiera de SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:5-17, al menos una porción de la región promotora de un gen que codifica un polipéptido que tiene un dominio Zn(2)Cys(6) o un polipéptido que tiene al menos un 60 % de identidad con cualquiera de SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:5-17, y/o al menos una porción de una UTR 3' de un gen que codifica un polipéptido que tiene un dominio Zn(2)Cys(6) o un polipéptido que tiene al menos un 60 % de identidad con cualquiera de SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:5-17. En algunos ejemplos, la construcción puede ser un ARNi, ribozima, o construcción antisentido y puede incluir una secuencia de la región que se transcribe del gen que codifica un polipéptido que tiene un dominio Zn(2)Cys(6) o un polipéptido que tiene al menos un 60 % de identidad con cualquiera de SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:5-17 en orientación con sentido o antisentido.

En ejemplos adicionales, se puede diseñar una construcción para la expresión in vitro o in vivo de un ARN guía (por ejemplo, un sistema CRISPR) diseñado para dirigirse a un gen que tiene una secuencia que tiene al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, o al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % de identidad con al menos una porción de SEQ ID NO:1 o cualquiera de SEQ ID NO:72-84 o que codifica un polipéptido que tiene un dominio Zn(2)Cys(6) o un polipéptido que tiene al menos un 60 % de identidad con cualquiera de SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:5-17, y puede incluir una secuencia homóloga a una porción de un gen que codifica un polipéptido que tiene un dominio Zn(2)Cys(6) o un polipéptido que tiene al menos un 60 % de identidad con cualquiera de SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:5 -17, que incluye, por ejemplo, un intrón, una UTR 5', una región promotora y/o una UTR 3' de un gen que codifica un polipéptido que tiene un dominio Zn(2)Cys(6) o un polipéptido que tiene al menos un 60 % de identidad con cualquiera de SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:5-17. Aún en ejemplos adicionales, una construcción para atenuar la expresión de un gen que codifica un polipéptido que contiene el dominio Zn(2)Cys(6) puede ser un ARN guía o un oligonucleótido antisentido, donde la secuencia tiene homología con una región que se transcribe de un gen que codifica un polipéptido que tiene un dominio Zn(2)Cys(6) en orientación antisentido.

Se describen adicionalmente los ARN guía para atenuar la expresión de un gen Zn(2)Cys(6) o un gen que codifica un polipéptido que tiene al menos un 60 % de identidad con cualquiera de SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:5-17, y construcciones de ADN que codifican tales ARN guía. Los ARN guía pueden ser ARN guía único o quimérico o pueden ser ARN guía que incluyen una secuencia de parejas tracr pero requieren un ARN tracr adicional para efectuar la edición del genoma. En varios casos, se proporciona en la presente descripción una molécula de ácido nucleico que tiene al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, o al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % de identidad con al menos una porción de SEQ ID NO:1 o cualquiera de SEQ ID NO:72-84, donde la molécula de ácido nucleico codifica un ARN guía de un sistema CRISPR, que puede ser, como ejemplos no limitantes, un sistema Cas9/CRISPR o un sistema Cpf1 CRISPR. La molécula de ácido nucleico puede incluir, por ejemplo, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 21, al menos 22, al menos 23, al menos 24, o al menos 25 nucleótidos de la secuencia de un gen Zn(2)Cys(6) de origen natural, tal como SEQ ID NO:1 o cualquiera de SEQ ID NO:72-84. En casos ilustrativos, el ARN guía o la secuencia de ácido nucleico que codifica el ARN guía puede incluir cualquiera de SEQ ID NO:51-62 o secuencias que tienen al menos un 88 % o un 93 % de identidad con cualquiera de las mismas.

Además, se describen en la presente descripción construcciones antisentido, de ribozima, o de ARNi que incluyen al menos una porción de un gen que codifica un Zn(2)Cys(6) o un polipéptido que tiene al menos un 60 % de identidad con cualquiera de SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:5-17, en la que un promotor, tal como un promotor heterólogo, se encuentra enlazado operativamente a la secuencia del gen Zn(2)Cys(6) y la secuencia del gen Zn(2)Cys(6) se encuentra en orientación antisentido.

Adicionalmente, en la presente descripción se describen construcciones para la recombinación homóloga que incluyen al menos una secuencia de un locus del gen Zn(2)Cys(6) del genoma de un alga que se yuxtapone con una secuencia de ácido nucleico heteróloga que puede ser, en ejemplos no limitantes, un gen marcador seleccionable o marcador detectable. En algunos ejemplos una construcción para la recombinación homóloga incluye dos secuencias de ácidos nucleicos de un locus del gen Zn(2)Cys(6) del genoma de un alga donde las dos secuencias flanquean una secuencia heteróloga para la inserción en el locus de genes Zn(2)Cys(6).

Un experto en la técnica apreciará que se pueden usar un número métodos de transformación para la transformación genética de microorganismos y, por lo tanto, se pueden implementar para los métodos de la presente descripción. La "transformación estable" pretende significar que la construcción de ácidos nucleicos que se introduce en un organismo se integra en el genoma del organismo o es parte de una construcción episomal estable y es capaz de ser heredado por la progenie del mismo. La "transformación transitoria" pretende significar que un polinucleótido se introduce en el organismo y no se integra en el genoma o se establece de cualquier otra manera y se hereda de forma estable por generaciones sucesivas.

La transformación genética puede resultar en una inserción y/o expresión estable de transgenes, construcciones ya sea del núcleo o del plástido y, en algunos casos, puede resultar en una expresión transitoria de transgenes. Los métodos de transformación también se pueden usar para la introducción de ARN guía o la edición de ADN. Se ha reportado que la transformación genética de microalgas ha tenido éxito para más de 30 cepas diferentes de microalgas, que pertenecen al menos a ~ 22 especies de algas verdes, rojas, y pardas, diatomeas, euglenidos y dianoflagelados (ver, por ejemplo, Radakovits y otros, Eukaryotic Cell, 2010; y Gong y otros, J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 2011). Los ejemplos no limitantes de tales métodos de transformación útiles incluyen agitación de las células en presencia de perlas de vidrio o bigotes de carburo de silicio como se reporta, por ejemplo, por Dunahay, Biotechniques, 15(3):452-460, 1993; Kindle, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 1990; Michael y Miller, Plant J., 13, 427-435, 1998. Las técnicas de electroporación se han usado con éxito para la transformación genética de varias especies de microalgas, que incluyen Nannochloropsis sp. (ver, por ejemplo, Chen y otros, J. Phyotros, 44:768-76, 2008.), Chlorella sp. (ver, por ejemplo, Chen y otros, Curr. Genet., 39:365-370, 2001; Chow y Tung, Plant Cell Rep. Vol.18, Número 9, 778-780, 1999), Chlamydomonas (Shimogawara y otros, Genetics, 148:1821-1828, 1998), Dunaliella (Sun y otros, Mol. Biotechnol., 30(3):185-192, 2005). El bombardeo de microproyectiles, también denominado como bombardeo de micropartículas, transformación con pistola de genes, o bombardeo biolístico, se ha usado con éxito para varias especies de algas, que incluyen, por ejemplo, especies de diatomeas tales como Phaeodactylum (Apt y otros, Mol. Gen. Genet., 252:572-579, 1996), Cyclotella y Navicula (Dunahay y otros, J. Phyotros, 31:1004-1012, 1995), Cylindrotheca (Fischer y otros, J. Phyotros, 35:113-120, 1999), y Chaetoceros sp. (Miyagawa-Yamaguchi y otros, Phyotros Res. 59:113-119, 2011), así como también especies de algas verdes tales como Chlorella (El-Sheekh, Biologia Plantarum, Vol.42, Número 2:209-216, 1999) y especies de Volvox Jakobiak y otros, Protist, 155:381-93, 2004). Adicionalmente, las técnicas de transferencia de genes mediadas por Agrobacterium también pueden ser útiles para la transformación genética de microalgas, como se ha reportado, por ejemplo, por Kumar, Plant Sci., 166(3):731-738, 2004, y Cheney y otros, J. Phyotros, Vol. 37, Supl. 11, 2001.

Un vector de transformación o construcción como se describe en la presente descripción comprenderá típicamente un gen marcador que confiere un fenotipo seleccionable o puntuable a las células huésped diana, por ejemplo, células de algas o se puede cotransformar con una construcción que incluye un marcador. Se han desarrollado con éxito un número de marcadores seleccionables para el aislamiento efectivos de transformantes genéticos de algas. Los marcadores seleccionables comunes incluyen la resistencia a antibióticos, los marcadores fluorescentes, y los marcadores bioquímicos. Se han usado con éxito varios genes de resistencia a antibióticos diferentes para la selección de transformantes de microalgas, que incluyen blastocidina, bleomicina (ver, por ejemplo, Apt y otros, 1996, supra; Fischer y otros, 1999, supra; Fuhrmann y otros, Plant J., 19, 353-61, 1999, Lumbreras y otros, Plant J., 14(4):441-447, 1998; Zaslavskaia y otros, J. Phyotros, 36:379-386, 2000), espectinomicina (Cerutti y otros, Genetics, 145:97-110, 1997; Doetsch y otros, Curr. Genet., 39, 49-60, 2001; Fargo, Mol. Cell. Biol., 19:6980-90, 1999), estreptomicina (Berthold y otros, Protist, 153:401-412, 2002), paromomicina (Jakobiak y otros, Protist, supra; Sizova y otros, Gene, 277:221-229, 2001), nourseotricina (Zaslavskaia y otros, 2000, supra), G418 (Dunahay y otros, 1995, supra; Poulsen y Kroger, FEBS Lett., 272:3413-3423, 2005, Zaslavskaia y otros, 2000, supra), higromicina (Berthold y otros, 2002, supra), cloranfenicol (Poulsen y Kroger, 2005, supra), y muchos otros. Los marcadores seleccionables adicionales para su uso en microalgas tales como Chlamydomonas pueden ser marcadores que proporcionan resistencia a la kanamicina y resistencia a la amikacina (Bateman, Mol. Gen. Genet. 263:404-10, 2000), resistencia a zeomicina y fleomicina (por ejemplo, fenomicina D1 ZEOCIN™) (Stevens, Mol. Gen. Genet. 251:23-30, 1996), y resistencia a paramomicina y neomicina (Sizova y otros, 2001, supra). Otros marcadores fluorescentes o cromogénicos que se han usado incluyen luciferasa (Falciatore y otros, J. Mar. Biotechnol., 1:239-251, 1999; Fuhrmann y otros, Plant Mol. Biol., 2004; Jarvis y Brown, Curr. Genet., 19:317-322, 1991), p-glucuronidasa (Chen y otros, 2001, supra; Cheney y otros, 2001, supra; Chow y Tung, 1999, supra; El-Sheekh, 1999, supra; Falciatore y otros 1999, supra; Kubler y otros, J. Mar. Biotechnol., 1:165-169, 1994), p-galactosidasa (Gan y otros, J. Appl. Phyotros, 15:345-349, 2003; Jiang y otros, Plant Cell Rep., 21:1211-1216, 2003; Qin y otros, High Technol. Lett., 13:87-89, 2003), y proteína fluorescente verde (GFP) (Cheney y otros, 2001, supra; Ender y otros, Plant Cell, 2002, Franklin y otros, Plant J., 2002; 56, 148, 210).

Un experto en la técnica apreciará fácilmente que una variedad de secuencias promotoras conocidas se puede implementar de forma útil para sistemas de transformación de especies de microalgas de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, los promotores que se usan comúnmente para impulsar la expresión de transgenes en microalgas incluyen varias versiones del promotor del virus del mosaico de la coliflor 35S (CaMV35S), que se han usado tanto en dinoflagelados como en clorofitas (Chow y otros, Plant Cell Rep., 18:778-780, 1999; Jarvis y Brown, Curr. Genet., 317-321, 1991; Lohuis y Miller, Plant J., 13:427-435, 1998). También se reporta que el promotor SV40 del virus de los simios se encuentra activo en varias algas (Gan y otros, J. Appl. Phyotros, 151:345-349, 2003; Qin y otros, Hydrobiologia 398-399, 469-472, 1999). Los promotores de RBCS2 (ribulosa bisfosfato carboxilasa, subunidad pequeña) (Fuhrmann y otros, Plant J., 19:353-361, 1999) y PsaD (proteína abundante del complejo del fotosistema I; Fischer y Rochaix, FEBS Lett. 581:5555-5560, 2001) de Chlamydomonas también pueden ser útiles. Los promotores de fusión de HSP70A/RBCS2 y HSP70A/p2TUB (tubulina) (Schroda y otros, Plant J., 21:121-131, 2000) también pueden ser útiles para una mejora de la expresión de transgenes, en los que el promotor HSP70A puede servir como activador de transcripción cuando se coloca corriente arriba de otros promotores. La expresión de alto nivel de un gen de interés también se puede alcanzar, por ejemplo, en especies de diatomeas, bajo el control de un promotor de un gen fcp que codifica una proteína de unión a diatomeas fucoxantina-clorofila a/b (Falciatore y otros, Mar. Biotechnol., 1:239-251, 1999; Zaslavskaia y otros, J. Phyotros 36:379-386, 2000) o el gen vcp que codifica una proteína de unión a violaxantina-clorofila a/b eustigmatofita (ver la patente de los Estados Unidos Número 8,318,482). Si se desea, los promotores inducibles pueden proporcionar una expresión de genes rápida y estrictamente controlada en microalgas transgénicas. Por ejemplo, las regiones promotoras de los genes NR que codifican la nitrato reductasa se pueden usar como tales promotores inducibles. La actividad del promotor NR se suprime típicamente por el amonio y se induce cuando el amonio se reemplaza por nitrato (Poulsen y Kroger, FEBS Lett 272:3413-3423, 2005), por tanto la expresión génica se puede desactivar o activar cuando se cultivan células de microalgas en presencia de amonio/nitrato. Los promotores de algas adicionales que pueden encontrar uso en las construcciones y sistemas de transformación que se proporcionan en la presente descripción incluyen aquellos que se describen en la patente de los Estados Unidos número 8,883,993; la solicitud de publicación de patente de los Estados Unidos número US 2013/0023035; la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos número US 2013/0323780; y la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos número US 2014/0363892.

Las células huésped pueden ser ya sea células sin transformar o células que ya se encuentran transfectadas con al menos una molécula de ácido nucleico. Por ejemplo, una célula huésped de algas que se diseña para tener una expresión atenuada de un gen de regulación de lípidos puede incluir adicionalmente uno o más genes que pueden conferir cualquier rasgo deseable, tal como, pero que no se limita a, un aumento en la producción de biomoléculas de interés, tales como una o más proteínas, pigmentos, alcoholes, o lípidos.

Métodos de producción de lípidos

También se describen en la presente descripción métodos para producir lípidos mediante el cultivo de un microorganismo mutante como se proporciona en la presente descripción que ha aumentado la productividad de los lípidos con respecto a una célula control mientras que produce al menos un 45 % de la biomasa que se produce por una célula control bajo las mismas condiciones de cultivo. Los métodos incluyen cultivar un microorganismo mutante como se proporciona en la presente descripción en un medio adecuado para producir lípidos y recuperar biomasa o al menos un lípido del cultivo. El microorganismo puede, en algunos ejemplos, ser un alga y el cultivo puede ser un cultivo fotoautótrofo. El cultivo puede ser en modo por lote, semicontinuo, o continuo.

El microorganismo mutante en algunos ejemplos se puede cultivar en un medio que comprende menos de aproximadamente 5 mM de amonio, por ejemplo, menos de aproximadamente 2,5 mM de amonio, menos de aproximadamente 2 mM de amonio, menos de aproximadamente 1,5 mM de amonio, menos de o igual a aproximadamente 1 mM de amonio, o menos de o igual a aproximadamente 0,5 mM. El medio de cultivo puede incluir, por ejemplo, de aproximadamente 0 a aproximadamente 2,5 mM de amonio, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 2,5 mM de amonio, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 2,5 mM de amonio, de aproximadamente 0 a aproximadamente 1,5 mM de amonio, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 1 mM de amonio, o de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 1 mM de amonio. El microorganismo se puede cultivar en un medio que incluye nitrato, que en algunos ejemplos puede ser sustancialmente la única fuente de nitrógeno en el medio de cultivo o se puede encontrar presente además de menos de 5 mM de amonio, menos de 2,5 mM de amonio, menos de 1,0 mM de amonio, o menos de o igual a aproximadamente 0,5 mM de amonio. Alternativamente o, además, el medio de cultivo puede comprender urea, que en algunos ejemplos puede ser sustancialmente la única fuente de nitrógeno en el medio de cultivo.

Aún otro aspecto de la descripción es un método para producir lípidos que incluye cultivar un microorganismo bajo condiciones en las que la relación FAME a TOC del microorganismo se mantiene entre aproximadamente 0,3 y aproximadamente 0,8, y aislar el lípido del microorganismo, el medio de cultivo o ambos. Por ejemplo, los microorganismos se pueden cultivar de modo que la relación de FAME a TOC se mantiene entre aproximadamente 0,3 y aproximadamente 0,8, entre aproximadamente 0,4 y aproximadamente 0,7, entre aproximadamente 0,4 y aproximadamente 0,6, o entre aproximadamente 0,45 y aproximadamente 0,55. La relación se puede mantener entre aproximadamente 0,3 y aproximadamente 0,8, por ejemplo entre aproximadamente 0,4 y aproximadamente 0,8, entre aproximadamente 0,4 y aproximadamente 0,7, entre aproximadamente 0,4 y aproximadamente 0,6, o entre aproximadamente 0,45 y aproximadamente 0,55 por al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 15, al menos 20, al menos 30 días, o al menos 60 días. En estos métodos el microorganismo se puede cultivar bajo condiciones continuas o semicontinuas. El método de producción de lípidos puede incluir cultivar un microorganismo mutante tal como cualquiera de los que se proporciona en la presente descripción bajo condiciones en las que la relación de FAME a TOC del microorganismo se mantiene entre aproximadamente 0,3 y aproximadamente 0,8, entre aproximadamente 0,3 y aproximadamente 0,8, entre aproximadamente 0,4 y aproximadamente 0,7, entre aproximadamente 0,4 y aproximadamente 0,6, o entre aproximadamente 0,45 y aproximadamente 0,55. Por ejemplo, el microorganismo puede ser un microorganismo mutante que tiene una expresión atenuada de un gen que codifica un polipéptido que tiene al menos un 55 %, al menos un 65 %, al menos un 75 %, o al menos un 85 % de identidad con un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO:2 y SEQ ID ⁿ O:5-17. La relación de FAME a TOC se puede ajustar, por ejemplo, por el tipo y concentración de la fuente de nitrógeno presente en el medio de cultivo. Por ejemplo, el método puede incluir cultivar un microorganismo, tal como un microorganismo mutante como se describe en la presente descripción, en un medio de cultivo que incluye nitrato y menos de 2,5 mM de amonio o menos de 1,0 mM de amonio.

Las condiciones de cultivo en los métodos que se proporcionan en la presente descripción son preferentemente condiciones en las que un microorganismo control (es decir, un microorganismo que no tiene la mutación que conduce a una productividad de lípidos más alta) produce biomasa diariamente, por ejemplo, produce biomasa diariamente por al menos cinco, al menos ocho, al menos diez, o al menos doce días, y en varios casos los métodos de producción de lípidos resultan en que el microorganismo mutante produce al menos un 50 % más de lípidos que un microorganismo control mientras que exhibe una disminución en la acumulación de biomasa (por ejemplo, TOC) de no más de un 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, 2 %, o 1 % con respecto al microorganismo control. Por ejemplo, los métodos para producir lípidos pueden incluir cultivar un microorganismo mutante como se proporciona en la presente descripción en un medio adecuado para producir lípidos y recuperar biomasa o al menos un lípido del cultivo, en el que el microorganismo mutante produce al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 100 %, al menos un 110 %, al menos un 120 % más de lípidos que un microorganismo control mientras que produce al menos un 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, o 99 % de la biomasa que se produce por el microorganismo control, bajo condiciones donde tanto el microorganismo mutante como el microorganismo control se encuentran produciendo biomasa diariamente. El microorganismo puede, en algunos ejemplos, ser un alga y el cultivo puede ser un cultivo fotoautótrofo. El cultivo puede ser en modo por lote, semicontinuo, o continuo.

Los microorganismos que producen lípidos se pueden cultivar en cualquier recipiente adecuado, lo que incluye matraces o biorreactores, donde las algas se pueden exponer a luz artificial o natural (o luz natural que se complementa con luz artificial). El cultivo que comprende algas mutantes que se desregulan en su respuesta a poca luz se puede cultivar en un ciclo de luz/oscuridad que puede ser, por ejemplo, un ciclo de luz/oscuridad natural o programado, y como ejemplos ilustrativos, puede proporcionar doce horas de luz a doce horas de oscuridad, catorce horas de luz a diez horas de oscuridad, dieciséis horas de luz a ocho horas de oscuridad, etc.

El cultivo se refiere al fomento intencional del crecimiento (por ejemplo, aumentos en el tamaño celular, contenido celular y/o actividad celular) y/o propagación (por ejemplo, aumento en el número de células mediante la mitosis) de una o más células mediante el uso de condiciones seleccionadas y/o controladas. La combinación de crecimiento y propagación se puede denominar proliferación. Un microorganismo como se proporciona en la presente descripción se puede cultivar por al menos cinco, al menos seis, al menos siete, al menos ocho, al menos nueve, al menos diez, al menos once, al menos doce, al menos trece, al menos catorce, o al menos quince días, o al menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, o diez semanas, o más.

Los ejemplos no limitantes de condiciones seleccionadas y/o controladas que se pueden usar para cultivar el microorganismo recombinante pueden incluir el uso de un medio definido (con características conocidas tales como pH, fuerza iónica, y/o fuente de carbono), temperatura que se específica, tensión de oxígeno, niveles de dióxido de carbono, crecimiento en un biorreactor, o similares, o combinaciones de los mismos. En algunos casos, el microorganismo o la célula huésped pueden crecer mixotróficamente, mediante el uso tanto de luz como de una fuente de carbono reducida. Alternativamente, el microorganismo o la célula huésped se pueden cultivar fototróficamente. Cuando crece fototróficamente, la cepa de algas puede usar ventajosamente la luz como fuente de energía. Una fuente de carbono inorgánico, tal como CO2 o bicarbonato se puede usar para la síntesis de biomoléculas por el microorganismo. El "Carbono inorgánico", como se usa en la presente descripción, incluye compuestos o moléculas que contienen carbono que no se pueden usar como fuentes de energía sostenible por un organismo. Típicamente, el "carbono inorgánico" se puede encontrar en forma de CO2 (dióxido de carbono), ácido carbónico, sales de bicarbonato, sales de carbonato, sales de hidrogenocarbonato, o similares, o combinaciones de los mismos, que no se pueden oxidar adicionalmente para obtener energía sostenible ni usarse como una fuente de poder reductor por parte de los organismos. Un microorganismo que crece fotoautotróficamente se puede cultivar en un medio de cultivo en el que el carbono inorgánico es sustancialmente la única fuente de carbono. Por ejemplo, en un cultivo en el que el carbono inorgánico es sustancialmente la única fuente de carbono, cualquier molécula de carbono orgánico (reducido) o compuesto de carbono orgánico que se puede proporcionar en el medio de cultivo no puede ya sea ser absorbido y/o metabolizado por la célula por energía y/o no se encuentra presente en una cantidad suficiente para proporcionar energía sostenible para el crecimiento y proliferación del cultivo celular.

Los microorganismos y las células huésped que pueden ser útiles de acuerdo con los métodos de la presente descripción se pueden encontrar en varias ubicaciones y ambientes a lo largo de todo el mundo. El medio de crecimiento particular para la propagación y generación óptimas de lípidos y/u otros productos puede variar y se puede optimizar para promover el crecimiento, propagación, o producción de un producto tal como un lípido, proteína, pigmento, antioxidante, etc. En algunos casos, determinadas cepas de microorganismos pueden ser incapaces de crecer en un medio de crecimiento particular debido a la presencia de algún componente inhibidor o la ausencia de algún requerimiento nutricional esencial de la cepa particular del microorganismo o célula huésped.

Los medios de crecimiento sólidos y líquidos se encuentran generalmente disponibles a partir de una amplia variedad de fuentes, como lo son las instrucciones para la preparación de medios particulares adecuados para una amplia variedad de cepas de microorganismos. Por ejemplo, varios medios de agua dulce y agua salada frescos pueden incluir los que se describen en Barsanti (2005) Algae: Anatomy, Biochemistry & Biotechnology, CRC Press para medios y métodos de cultivo de algas. También se pueden encontrar fórmulas de medios de algas en los sitios web de varias colecciones de cultivos de algas, que incluyen, como ejemplos no limitantes, la colección de cultivos de algas UTEX (www.sbs.utexas.edu/utex/media.aspx); la colección de cultivos de algas y protozoos (www.ccap.ac.uk); y la katedra Botaniky (botany.natur.cuni.cz/algo/caup-media.html).

Los métodos de cultivo pueden incluir de forma opcional inducir la expresión de uno o más genes y/o regular una vía metabólica en el microorganismo. Inducir la expresión puede incluir añadir un nutriente o compuesto al cultivo, eliminar uno o más componentes del medio de cultivo, aumentar o disminuir la luz y/o la temperatura y/u otras manipulaciones que promueven la expresión del gen de interés. Tales manipulaciones pueden depender en gran medida de la naturaleza del promotor (heterólogo) enlazado operativamente al gen de interés.

En algunos casos de la presente descripción, los microorganismos que tienen un aumento en la productividad de lípidos se pueden cultivar en un "fotobiorreactor" equipado con una fuente de luz artificial, y/o que tiene una o más paredes que son lo suficientemente transparentes para la luz, que incluye la luz solar, para permitir, facilitar, y/o mantener el crecimiento y la proliferación de microorganismos aceptables. Para la producción de productos de ácidos grasos o triglicéridos, se pueden cultivar adicional o alternativamente microorganismos fotosintéticos o células huésped en matraces que se agitan, tubos de ensayo, viales, placas de microtitulación, placas Petri, o similares, o combinaciones de los mismos.

Adicional o alternativamente, los microorganismos fotosintéticos mutantes o recombinantes o las células huésped se pueden crecer en estanques, canales, contenedores de crecimiento en base a mar, zanjas, conductos de rodadura, canales, o similares, o combinaciones de los mismos. En tales sistemas, la temperatura puede se puede encontrar sin regular, o se pueden emplear varios métodos o dispositivos de calentamiento o enfriamiento como con los biorreactores estándar, una fuente de carbono inorgánico (tales como, pero que no se limitan a, CO2, bicarbonato, sales de carbonato, y similares), que incluyen, pero no se limitan a, aire, aire que se enriquece con CO2, gases de combustión, o similares, o combinaciones de los mismos, se pueden ser suministrar al cultivo. Al suministrar gases de combustión y/u otras fuentes inorgánicas que pueden contener CO además del CO2, puede ser necesario tratar previamente tales fuentes de modo que el nivel de CO que se introduce en el biorreactor (foto) no constituya un peligro y/o una dosis letal con respecto al crecimiento, proliferación, y/o supervivencia de los microorganismos.

Los microorganismos mutantes pueden incluir uno o más genes no nativos que codifican un polipéptido para la producción de un producto, tal como pero que no se limita a, un lípido.

Los métodos incluyen cultivar un microorganismo mutante como se describe en la presente descripción, tal como un microorganismo mutante como se proporciona en la presente descripción que ha aumentado la productividad de lípidos con respecto a una célula control mientras que produce al menos un 50 % de la biomasa que se produce por una célula control bajo las mismas condiciones de cultivo para producir biomasa o lípidos. Los lípidos se pueden recuperar del cultivo mediante medios de recuperación conocidos por los expertos en la técnica, tales como mediante la extracción del cultivo total, por ejemplo, mediante el uso de solventes orgánicos o al aislar primero la biomasa de la que se extraen los lípidos (ver, por ejemplo, Hussein y otros Apl. Biochem. Biotechnol. 175:3048-3057; Grima y otros (2003) Biotechnol. Advances 20:491-515). En algunos casos, la recuperación de productos de ácidos grasos se puede potenciar mediante la homogeneización de las células (Gunerken y otros (2015) Biotechnol. Advances 33:243-260). Por ejemplo, los lípidos tales como ácidos grasos, derivados de ácidos grasos y/o triglicéridos se pueden aislar de las algas mediante la extracción de las algas con un solvente a temperatura y/o presión elevadas, como se describe en el documento adjunto, comúnmente asignado de solicitud de patente de los Estados Unidos número 13/407,817 que se titula "Extracción con solvente de productos a partir de algas", presentado el 29 de febrero de 2012.

La biomasa se puede cosechar, por ejemplo, mediante centrifugación o filtración. La biomasa se puede secar y/o congelar. Se pueden aislar productos adicionales de la biomasa, tales como, por ejemplo, varios lípidos o una o más proteínas. También se incluye en la presente descripción una biomasa de algas que comprende biomasa de un regulador de lípidos mutante, tal como cualquiera de los que se describen en la presente descripción, tales como pero que no se limitan a, un regulador de lípidos mutante que incluye una mutación en un gen que codifica un polipéptido que tiene al menos un 50 %, al menos un 55 %, al menos un 60 %, al menos un 65 %, al menos un 70 %, al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, o al menos un 95 % de identidad con un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO:5-17.

Ejemplos

Medios que se usan en los ejemplos

Los siguientes medios se usan en los Ejemplos.

El medio PM066 (Ejemplo 1) incluye nitrato 8,8 mM como la única fuente de nitrógeno. El medio PM066 incluye nitrato (NO3) 10 mM y fosfato (PO4) 0,417 mM junto con trazas de metales y vitaminas en las sales instantáneas del océano. El medio PM066 se produjo mediante la adición de 5,71 mL de una solución madre de NaNO31,75 M (148,7 g/L) y 5,41 mL de una solución madre de K2HPO4- 3H2O 77 mM (17,57 g/L) a 981 mL de una solución de sales instantáneas del océano (35 g/L) junto con 4 mL de una solución madre de metales quelados y 4 mL de una solución madre de vitaminas. La solución madre de metales quelados se preparó mediante la adición a 400 mL de agua de 2,18 g de Na2EDTA-2H2O; 1,575 g de FeCb6H2O; 500 pL de solución madre 39,2 mM (0,98 g/100 mL) de CuSO4-5H2O; 500 pL de solución madre 77,5 mM (2,23 g/100 mL) de ZnSO4-7H2O; 500 pL de solución madre 42,0 mM (1,00 g/100 mL) de COCh-6H2O; 500 pL de solución madre 910,0 mM (18,0/100 mL) de MnCh4H2O; 500 pL de solución madre 26,0 mM (0,63 g/100 mL) de Na2MoO4-2H2O; que se lleva hasta 500 mL de volumen final, y se esteriliza por filtración. La solución madre de vitamina se preparó mediante la adición a 400 mL de agua de 0,05 g de tiamina HCl; 500 pL de solución madre 0,37 mM (0,05 g/100 mL) de cianocobalamina; y 2,5 mL de solución madre 0,41 mM (0,01 g/100 mL) de biotina, que se lleva hasta un volumen final de 500 mL, y se esteriliza por filtración. El medio PM067 no incluye una fuente de nitrógeno (sin nitrato, amonio, o urea), y fosfato (PO4) 0,417 mM junto con trazas de metales y vitaminas en las sales instantáneas del océano. El medio PM067 se produjo mediante la adición de 5,41 mL de una solución madre de K 2HPO43H2O 77 mM (17,57 g/L) a 987 mL de solución de sales instantáneas del océano (35 g/L) junto con 4 mL de una solución madre de metales quelados y 4 mL de solución madre de vitaminas. La solución madre de metales quelados se preparó mediante la adición a 400 mL de agua de 2,18 g de Na2EDTA-2H2O; 1,575 g de FeCb6H2O; 500 pL de solución madre 39,2 mM (0,98 g/100 mL) de CuSO4-5H2O; 500 pL de solución madre 77,5 mM (2,23 g/100 mL) de ZnSO4-7H2O; 500 pL de solución madre 42,0 mM (1,00 g/100 mL) de COCh-6H2O; 500 pL de solución madre 910,0 mM (18,0/100 mL) de MnCh-4H2O; 500 pL de solución madre 26,0 mM (0,63 g/100 mL) de Na2MoO4-2H2O; que se lleva hasta 500 mL de volumen final, y se esteriliza por filtración. La solución madre de vitamina se preparó mediante la adición a 400 mL de agua de 0,05 g de tiamina HCl; 500 pL de solución madre 0,37 mM (0,05 g/100 mL) de cianocobalamina; y 2,5 mL de solución madre 0,41 mM (0,01 g/100 mL) de biotina, que se lleva hasta un volumen final de 500 mL, y se esteriliza por filtración.

El PM074 es un medio rico en nitrógeno ("solo de nitrato") (que incluye nitrato como sustancialmente la única fuente de nitrógeno) que es 10X F/2 se produce mediante la adición de 1,3 mL de PROLINE® F/2 Algae Feed Part A (Aquatic Eco-Systems) y 1,3 mL de PROLINE® F/2 Algae Feed Part B (Aquatic Eco-Systems) a un volumen final de 1 litro de una solución de sales instantáneas del océano (35 g/L) (Aquatic Eco Systems, Apopka, FL). La prolina A y la prolina B juntas incluyen NaNO38,8 mM, NaH2PO4H2O 0,361 mM, trazas de metales 10X F/2, y vitaminas 10X F/2 (Guillard (1975) Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates, in "Culture of Marine Invertebrate Animals." (eds: Smith W.L. and Chanley M.H.) Plenum Press, Nueva York, Estados Unidos páginas 26-60).

El medio PM123 es el medio PM074 que se complementa con Prolina B adicional de modo que la concentración de nitrato se aumentó de aproximadamente 8,8 mM a aproximadamente 15 mM. Este es también un medio "solo de nitrato".

El medio PM124 es el PM074 que se complementa con amonio 5 mM y HEPES 10 mM pH 8,0. Se produce mediante la adición de 10 mL de HEPES 1 M pH 8 y 5 mL de NH4Cl a la fórmula de PM074 (volumen final de 1 L). En algunos ejemplos, se produjeron medios adicionales con niveles de amonio controlados mediante el ajuste de la concentración de amonio de PM074 y al añadir tampón Hepes adicional.

El medio PM125 (Ejemplo 5): incluye urea 7,5 mM como la única fuente de nitrógeno disponible para las células. A sales instantáneas del océano 1x se le añadió (mientras se mezclaba): 3,75 mL de solución madre de urea 2 M, 0,32 mL de solución madre de NaH2PO41 M, 4 mL de solución madre de metales quelados y 4 mL de solución madre de vitaminas (ver arriba). El medio se esterilizó por filtración a través de un filtro < 0,1 pm y se almacenó a temperatura ambiente.

Ejemplo 1.

Identificación de un polipéptido de dominio Zinc-Cys regulado negativamente durante la inanición de nitrógeno. Varias cepas de Nannochloropsis acumulan altos niveles de lípidos de almacenamiento de triacilgliceroles (TAG) durante la privación de nitrógeno y se han reportado correlaciones entre el aumento de la producción de TAG y las correlaciones entre la acumulación de TAG y supuestos cambios subyacentes en la expresión génica en diferentes vías metabólicas que conducen a la síntesis de TAG (Radakovits y otros (2012) Nat Commun 3:686; Li y otros (2014) The Plant Cell 26: 1645-1665; Corteggiani Carpinelli y otros (2014) Mol Plant 7:1645-1665). Para identificar genes que codifican reguladores que influyen en la biosíntesis y acumulación de lípidos, se analizó la respuesta de transcripción temprana de las células de Nannochloropsis que se someten a privación de N (-N). Se realizó un experimento de transcriptómica comparativa en el que se compararon los niveles de transcripción de ARN de genes de células de Nannochloropsis gaditana bajo inanición de nitrógeno, durante el que Nannochloropsis induce la biosíntesis de lípidos de almacenamiento, con los niveles de transcripciones de ARN de la misma cepa de Nannochloropsis gaditana que se cultiva bajo condiciones idénticas excepto que la cantidad de nitrógeno en el medio de crecimiento no fue limitante.

Las células de N. gaditana (WT-3730) tipo salvaje crecieron en un medio rico en nutrientes bajo un ciclo de luz de 16 horas (120 |jE)/8 horas de oscuridad hasta la limitación de la luz (hasta una DO de 1,25) y al comienzo del fotoperíodo se centrifugaron y se resuspendieron ya sea en medio PM066 rico en nitrógeno o en medio de cultivo que carece de una fuente de nitrógeno (medio PM067 con "depleción de nitrógeno" o "-N") y se incubó bajo las condiciones de luz que se proporcionaron. El ARN se aisló de las muestras que se eliminaron a varios intervalos de tiempo después de la resuspensión de las células en medio rico en nitrógeno (+ N) o con depleción de nitrógeno (-N). La acumulación de lípidos se determinó a partir de muestras tomadas a lo largo de todo el ensayo. La acumulación de lípidos (que se mide como FAME como se describe en el Ejemplo 4) fue indistinguible entre cultivos con depleción de nitrógeno y ricos en nitrógeno en el punto de tiempo de 3 h, pero a las 10 h la acumulación de FAME en el cultivo con depleción de nitrógeno fue el doble que en el cultivo rico en nitrógeno (Figura 1A). Los tratamientos se realizaron por triplicados biológicos. Bajo el supuesto de que los cambios de transcripción deben preceder los cambios metabólicos, se seleccionó el punto de tiempo de 3 h para la secuenciación del ARNm. Se secuenciaron dos muestras para cada tratamiento.

El ARN se aisló mediante la centrifugación de 10 mL de cada cultivo de células de algas (4000 x g por 5 minutos) y la decantación del sobrenadante. Los sedimentos se resuspendieron en 1,8 mL de tampón A (5 mL de tampón de molienda TLE, 5 mL de fenol, 1 mL de 1-bromo-3-cloropropano y 20 ^j L de mercaptoetanol, donde el tampón de molienda TLE incluye 9 mL de Tris 1 M pH 8, 5 mL de ^s D^s al 10 %, 0,6 mL de LiCl 7,5 M y 450 ^j L de ED^tA 0,5 M en un volumen final de 50 mL) y se transfirieren a tubos de microcentrífuga de 2 mL que contienen aproximadamente 0,5 mL de perlas de circonio de 200 jm. Los tubos se agitaron en vórtex vigorosamente por 5 minutos a 4 °C y después se centrifugaron por 2 minutos a 11,8 x g. Las capas acuosas se eliminaron después y se pipetearon en nuevos tubos de 2 mL, a los que se añadió 1 mL de tampón de extracción de fenol 25:24:1 (25 mL de fenol pH 8,1; 24 mL de 1-bromo-3-cloropropano, y 1 mL de alcohol isoamílico). Los tubos se agitaron vigorosamente y se centrifugaron por 2 minutos a 11,8 x g. Después de la centrifugación, se eliminó la capa acuosa y se pipeteó en nuevos tubos de centrífuga de 2 mL, a los que se añadió 1 mL de 1-bromo-3-cloropropano. Los tubos se agitaron y se centrifugaron de nuevo por 2 minutos a 11,8 x g. La capa acuosa se eliminó para un tubo nuevo y se añadieron 0,356 volúmenes de LiCl 7,5 M. Los tubos se invirtieron de 10-12 veces y se almacenaron a -20 °C durante la noche. Al día siguiente, se permitió que las muestras alcanzaran la temperatura ambiente sin mezclarlas y se centrifugaron a 16000 x g por 30 minutos. Se eliminaron los sobrenadantes y se lavaron los sedimentos con 1 mL de etanol al 80 % que se enfría con hielo. Los tubos se centrifugaron por 30 min a 16000 x g y se les permitió secar al aire después que se habían eliminado los sobrenadantes. Finalmente, los sedimentos de ARN se resuspendieron en 50 ^j L de agua ultrapura. La calidad del ARN se evaluó mediante electroforesis en gel en chip mediante el uso de un bioanalizador Agilent 2100 y RNA6000 LabChip de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Se prepararon bibliotecas de secuenciación de la siguiente generación a partir del ARN que se aísla mediante el uso del estuche TruSeq Stranded mRNA Sample Prep (Illumina, San Diego, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las bibliotecas TruSeq se secuenciaron mediante el uso de secuenciación por síntesis (Illumina MiSeq) para generar lecturas de extremos que se emparejan de 100 pb mediante el uso del procedimiento ARNm-Seq (que se describe en Mortazavi y otros (2008) Nature Methods 5:621-628). Las lecturas mapeables se alinearon con la secuencia del genoma de referencia de N. gaditana mediante el uso TopHat (tophat.cbcb.umd.edu/). Los niveles de expresión se calcularon para cada gen anotado mediante el uso del componente Cuffdiff del programa Cufflinks (cufflinks.cbcb.umd.edu). TopHat y Cufflinks se describen en Trapnell y otros (2012) Nature Protocols 7:562-578. El análisis de expresión diferencial se realizó mediante el uso del paquete R edgeR (McCarthy y otros (2012) Nucl. Acids Res. 40:doi:10/1093/nar/gks042). Se reportaron los niveles de expresión en unidades de fragmentos por kilobase por millón (FPKM) para cada gen en cada muestra mediante el uso de parámetros estándar. FPKM es una medida de los niveles de transcripción relativos que se normalizan para las diferencias en la longitud de la transcripción.

El análisis global del transcriptoma de cultivos -N y N a las 3 h revela 1064 genes que se expresan de forma diferencial que tienen una diferencia en la expresión mayor de 1 vez y una tasa de descubrimiento falso (FDR) de menos de 0,01. Estos genes se representan como puntos y X en el gráfico de la Figura 1B. De estos genes, 363 se regularon positivamente (lado derecho del gráfico) y 701 se regularon negativamente en la condición -N (lado izquierdo del gráfico). La lista de genes que se expresan de forma diferencial se comparó con una lista que se conserva bioinformáticamente de factores de transcripción de Nanoclorosis putativos que se generan previamente mediante la búsqueda en el genoma de Nannochloropsis de proteínas que contienen dominios de unión al ADN y otros dominios pfam conservados típicos de factores de transcripción que se caracterizan mediante el uso de la base de datos de factores de transcripción de plantas como referencia (Pérez-Rodríguez y otros (2010) Nucl. Acids Res.

38:D822-D827; Jin y otros (2013) Nucl. Acids Res.42:D1182-D1187). Encontramos 20 factores de transcripción, que se representan como X en la Figura 1B y se enumeran en la Tabla 1, que se representaron solo en el conjunto regulado negativamente de factores de transcripción. No se encontraron factores de transcripción regulados positivamente en el punto de tiempo de 3 h. Los identificadores del gen de N. gaditana se encuentran en base a la secuencia del genoma que se describe en Corteggiani Carpinelli y otros, Mol Plant 7, 323-335 (2014).

T l 1. F r r n ri i n in ^ l iv i n ni r

Ejemplo 2

Desactivación de genes de factores de transcripción en Nannochloropsis

Los 20 genes de factores de transcripción que se descubrieron que se encontraban regulados de forma diferencial bajo la privación de nitrógeno (Tabla 1) fueron dianas para mutagénesis de desactivación génica por inserción mediante el desarrollo de una línea del editor que expresa Cas9 de alta eficiencia en Nannochloropsis (ver el documento WO 2016/109840 y la solicitud US 14/986,492, presentada el 31 de diciembre de 2015 correspondiente). Como se describe en el documento US 14/986,492, una línea del editor de Cas9 de Nannochloropsis altamente eficiente, y una cepa de N. gaditana GE-6791, que expresan un gen que codifica la nucleasa de Streptococcus pyogenes Cas9, se usó como huésped para la transformación con un ARN guía quimérico y ADN de donante para la desactivación génica por inserción.

Para producir la línea del editor de Nannochloropsis Cas9 de alta eficiencia, se diseñó y aisló una cepa de Nannochloropsis que exhibe la expresión del gen cas9 que se introduce en esencialmente el 100 % de la población celular de un cultivo en crecimiento. El vector pSGE-6206 (Figura 2; SEQ ID NO:26), que se usa para transformar la cepa WT-3730 tipo salvaje de N. gaditana, incluye los tres elementos siguientes: 1) un casete de expresión de Cas9 que contiene un gen de Cas9 de Streptococcus pyogenes con codones optimizados para Nannochloropsis gaditana (SEQ ID NO:27) que también incluye secuencias que codifican una etiqueta FLAG N-terminal (SEQ ID NO:28), una señal de localización nuclear (SEQ ID NO:29) y un enlazador peptídico (FLAG completo, NLS, y secuencia de linder que se proporciona como SEQ ID NO:30), controlado por el promotor de N. gaditana RPL24 (SEQ ID NO:31) y que termina por el terminador bidireccional 2 de N. gaditana o el terminador "FRD" (SEQ ID NO:32); 2) un casete de expresión de marcador seleccionable, que contiene el gen de blasticidina desaminasa ("blast" o "BSD") de Aspergillus terreus con codones optimizados para N. gaditana (SEQ ID NO:33), controlado por el promotor TCTP de N. gaditana (SEQ ID NO:34) y es seguido del terminador EIF3 (SEQ ID NO:35); y 3) un casete de expresión del reportero de la GFP, que contiene el gen TurboGFP (Evrogen, Moscú, Rusia) con codones optimizados para Nannochloropsis gaditana (SEQ ID NO:36), controlado por el promotor de N. gaditana 4A-III (SEQ ID NO:37) y es seguido del terminador bidireccional 5 de N. gaditana o el terminador "GNPDA" (SEQ ID NO:38). La construcción de expresión de Cas9 se ensambló de acuerdo con el estuche Gibson Assembly® HiFi 1 Step (Synthetic Genomics, La Jolla, CA) en la cadena principal de un vector pUC mínimo; la secuencia de ADN confirmada de este plásmido se proporciona como SEQ ID NO:26.

La construcción de expresión de Cas9 que se linealiza con ZraI (Figura 3A) se transformó en células de Nannochloropsis por electroporación. Se transformaron 1 x 109 células en una cubeta de 0,2 cm mediante el uso de una fuerza de campo de 7000 V/cm que se suministra con el Gene Pulser II (Biorad, Carlsbad, CA, Estados Unidos). La mezcla de transformación se sembró en medio de agar PM074 que contiene 100 mg/L de blasticidina. Las colonias resultantes se colocaron en medios de selección para su análisis y archivo. Una pequeña cantidad de biomasa fue tomada de los parches y se resuspendió completamente en 300 pL de solución de sales instantáneas del océano 1x (Aquatic Eco Systems; Apopka, Fl ). Se tuvo cuidado de no añadir demasiada biomasa de modo que se obtuviera una resuspensión verde clara. Esta suspensión se analizó directamente mediante citometría de flujo mediante el uso de un citómetro de flujo BD Accuri c6, mediante el uso de un láser de 488 nm y un filtro de 530/10 nm para medir la fluorescencia de la GFP por célula. Se registraron de 10000-30000 eventos para cada muestra mediante el uso del ajuste de fluidos lentos. Una cepa que tiene un único pico de fluorescencia que se desplazó a un nivel de fluorescencia más alto que el que se demuestra por las células tipo salvaje (Figura 3B) y que también demuestra la expresión de la proteína cas9 por transferencia Western mediante el uso de un anticuerpo anti-FLAG (Sigma # A9469) (Figura 3C), que se designa cepa GE-6791, se seleccionó como una cepa del editor de cas9 y se usó en la generación mutante mediante la edición del genoma cas9/CRISPR como se describe en la presente descripción. Se encontró que la línea del editor de Ng-Cas9 es equivalente al tipo salvaje en la productividad de FAME y TOC (ver por ejemplo la Figura 18).

Generación de mutantes de inserción diana en la línea del editor de Ng-Cas9.

Los 20 factores de transcripción identificados que se encontraron regulados negativamente bajo la inanición de nitrógeno (Tabla 1) fueron dianas para la desactivación génica en la línea del editor de Cas9. Los ARN guía (ver Tabla 2 para las secuencias diana que se usan para la desactivación génica de cada uno de los 23 factores de transcripción) se sintetizaron in vitro de acuerdo con (Cho y otros (2013) Nature Biotechnol. 31:230-232) y se describe en el Ejemplo 3, y se electropora en conjunto con un casete de expresión amplificado por PCR (pHygR, SEQ ID NO:45) que contiene un gen de resistencia a higromicina con un codones optimizados (HygR, SeQ ID NO:44) controlado por el promotor EIF3 endógeno (SEQ ID NO:46) y es seguido del terminador bidireccional de fumarato reductasa dependiente de NADH de N. gaditana (SEQ ID NO:32) en orientación invertida. Aproximadamente 1 pg de cada uno de los ARN guía que se dirigen al factor de transcripción particular y el fragmento donante pHygR (Figura 4A) se añadieron a la cubeta y se realizó la electroporación como se describe anteriormente. En general, los mutantes por "desactivación génica" con pérdida de función se generaron mediante la selección de un locus diana del ARN guía en la primera mitad de la secuencia de codificación exónica. La selección de transformantes HygR fue como antes, excepto que se añadieron 500 mg/L de higromicina a placas de agar en lugar de blasticidina. La inserción diana del fragmento pHygR mediante la reparación mediada por NHEJ de la ru p tu ra d e l A D N b ic a te n a r io q u e se c a ta liz a p o r C a s 9 en lo s lo c i d ia n a p o r lo s A R N g u ía s e e v a lu ó p o r P C R de c o lo n ia s m e d ia n te e l u s o d e c e b a d o re s q u e f la n q u e a ro n e l s it io d ia n a d e l A R N g u ía p o r ~ 200 p b e n c u a lq u ie r la d o (Tabla 3). ^{M e d ia n te e l u s o d e e s to s c e b a d o re s , la a m p lif ic a c ió n p o r P C R d e lo c i t ip o s a lv a je re s u lta r ía e n p ro d u c to s} d e ~ 400 pb , m ie n tra s q u e lo s m u ta n te s d e in s e rc ió n d ia n a p H y g R re s u lta r ía e n p ro d u c to s d e ~ 2800 p b q u e ju s t if ic a n la in s e rc ió n d e l f ra g m e n to p H y g R d e 2400 pb . S e c o n f irm a ro n la s s e c u e n c ia s d e lo s p ro d u c to s d e P C R p a ra to d o s lo s m u ta n te s , lo q u e p e rm it ió la d e te rm in a c ió n d e la o r ie n ta c ió n d e l in s e r to y la d e te c c ió n d e c u a lq u ie r p é rd id a d e A D N c ro m o s ó m ic o y /o in s e rto , o la g a n a n c ia d e p e q u e ñ a s in s e rc io n e s q u e s e g e n e ra n d u ra n te e l p ro c e s o ^{d e re p a ra c ió n d e ro tu ra d e l A D N d s m e d ia d o p o r N H E J ( v e r} Figura 4B y Figura 4C ^{p a ra un d ia g ra m a d e l p ro c e s o de} in s e rc ió n y re s u lta d o s d e P C R d e c o lo n ia s ilu s tra t iv a s ) .

^{D ie c io c h o d e lo s 20 fa c to re s d e t ra n s c r ip c ió n d ia n a} (Tabla 1) ^{s e in te r ru m p ie ro n e n e l lo c u s q u e s e p re te n d ía , c o m o} s e c o n f irm ó m e d ia n te la g e n o t ip if ic a c ió n p o r P C R . En b a s e a la a lta e f ic ie n c ia d e e d ic ió n g e n e ra l q u e s e o b s e rv a , es p ro b a b le q u e lo s 2 lo c i re s ta n te s fu e ra n e s e n c ia le s p a ra la v ia b il id a d . P a ra p ro b a r la s d e s a c tiv a c io n e s g é n ic a s en c u a n to a lo s e fe c to s e n la in d u c c ió n d e líp id o s , se c r ib a ro n d o s m u ta n te s in d e p e n d ie n te s p o r lo c u s p a ra d e te rm in a r la p ro d u c t iv id a d d e líp id o s y b io m a s a m e d ia n te la e v a lu a c ió n d e lo s n iv e le s d e F A M E y t O c a lo la rg o d e m ú ltip le s p u n to s d e t ie m p o d e un c u lt iv o d e 7 d ía s c o m o s e d e s c r ib e e n d e ta l le e n e l E je m p lo 4 , m á s a b a jo .

T l 2. n i A R N í r r i m i n l m n i m i r

T l . r ri n n l m n i m i r

Ejemplo 3

Mutante por desactivación génica de ZnCys-2845

El gen ZnCys-2845 (Naga_100104g18, segunda fila de la Tabla 1) fue la diana para la alteración mediante la producción primero de una construcción de ADN para producir un ARN guía en el que la construcción incluye la secuencia de una guía quimérica diseñada corriente abajo de un promotor T7. La secuencia guía quimérica incluye una secuencia diana de 18 pb (SEQ ID NO:39) homóloga a una secuencia dentro de la secuencia del gen ZnCys-2845 que se encontraba inmediatamente corriente arriba de una secuencia PAM (NGG) de S. pyogenes cas9, y también incluye la secuencia CRISPR de transactivación (tracr). La secuencia guía quimérica se sintetizó mediante la producción primero de un molde de ADN que se compone por oligonucleótidos de ADN complementario que incluyen la secuencia promotora de T7 (SEQ ID NO:40 y SEQ ID NO:41, producido por SGI-DNA, La Jolla, CA) que incorpora la secuencia del promotor T7 y se hibridaron para crear una plantilla de ADN de bicatenario que se usó en reacciones de transcripción in vitro mediante el uso del estuche MEGAshortscript™ T7 (Life Technologies #AM1354M) de acuerdo con las instrucciones del fabricante para sintetizar el ARN guía. El ARN resultante se purificó mediante el uso de columnas Zymo-Spin™ V-E (Zymo Research #C1024-25) de acuerdo con el protocolo del fabricante.

El fragmento donante para la inserción en el locus ZnCys-2845 diana (SEQ ID NO:44) incluye un casete de marcador seleccionable que incluye el gen de resistencia a higromicina (HygR, SEQ ID NO:45) corriente abajo del promotor EIF3 de N. gaditana (SEQ ID NO:46) y seguido del terminador bidireccional 2 de N. gaditana (s Eq ID NO:32), con la secuencia completa del promotor-terminador del gen de resistencia a higromicina flanqueada por secuencias de identificación de 27 pares de bases en los extremos 5' (SEQ ID NO:475'ID) y 3' (SEQ ID NO:483'ID) para rendir el fragmento de ADN denominado como "Casete de Resistencia Hyg" (SEQ ID NO:44, Casete HygR). Para la desactivación génica dirigida del locus ZnCys-2845 (Naga_100104g18), la línea GE-6791 del editor de Cas9 se transformó por electroporación mediante el uso de 5 pg de ARN guía quimérico purificado que se dirige al gen ZnCys-2845 y 1 pg del ADN donante seleccionable (Casete de Resistencia Hyg; SEQ ID NO:44, mostrada en la Figura 4A) esencialmente como se describe en el documento US 2014/0220638. Seguido de la electroporación, las células se sembraron en placas sobre medio de agar PM124 que contiene higromicina para seleccionar los transformantes que incorporaron el casete de resistencia a higromicina. Los transformantes se colocaron en una placa nueva y se cribaron mediante PCR de colonias para la inserción del fragmento donante en el gen ZnCys-2845. Para el cribado por PCR de colonias, se suspendió una pequeña cantidad de células de una colonia a cribar en 100 pL de solución de resina Chelex 100 (BioRad)/TE al 5 % y la suspensión se hirvió por 10 minutos a 99 °C, después de que los tubos se centrifugaron brevemente. Se añadió un microlitro del sobrenadante de lisado a una mezcla de reacción de PCR, en la que la mezcla de PCR y las reacciones se establecieron y se realizaron de acuerdo con el protocolo QIAGEN Fast Cycling PCR Master Mix Protocol del fabricante (Manual disponible en qiagen.com). Los cebadores que se usaron para detectar la inserción del fragmento donante en el locus diana del gen ZnCys-2845 fueron SEQ ID NO:49 y SEQ ID NO:50. En base al cribado de colonias en base a PCR, se probaron dos cepas con desactivación génica, GE-8564 y GE-8565, en ensayos de productividad.

Como se describe más abajo, los mutantes que albergan el casete HygR en la secuencia de codificación del locus del genoma Naga_100104g18 tiene una inserción del casete del donante en un gen que codifica una proteína del dominio de agrupamiento binuclear Zn(II)2Cys6 predicha (Pfam PF00173, ver Figura 5) y se denomina como ZnCys-2845. Estos mutantes exhibieron un marcado aumento en la acumulación de lípidos con respecto al tipo salvaje como se evalúa por FAME/TOC (Ejemplo 4, Figura 7C). Como se describe más abajo, se confirmó adicionalmente que el fenotipo de acumulación de lípidos en estos mutantes KO de ZnCys-2845 fue similar al que se observa en células tipo salvaje con inanición de nitrógeno por la aparición de gotas lipídicas prominentes (Figuras 7F-H).

Ejemplo 4

Mutantes por desactivación génica de ZnCys-2845 en un Ensayo de Productividad por Lote

Para determinar el efecto de la eliminación del gen ZnCys-2845 sobre el crecimiento y la producción de lípidos, se cultivaron la cepa GE-8564 con desactivación génica de ZnCys-2845 y la cepa progenitora WT-3730 tipo salvaje en un ensayo de productividad por lote en medio PM123 rico en nitrógeno que incluye nitrato 15 mM como la única fuente de nitrógeno disponible para las células, es decir, el medio de cultivo no tiene fuente de nitrógeno reducido. Debido a que se había determinado que el mutante ZnCys-2845 no crece en ausencia de nitrógeno reducido, los cultivos de producción se inocularon a una DO730 inicial de 0,5 a partir de cultivos de siembra (escalado) que crecieron en medio PM124 que incluye amonio 5 mM además de nitrato 8,8 mM.

Después de la inoculación, la cepa GE-8564 con desactivación génica de ZnCys y la cepa WT-3730 tipo salvaje crecieron en cultivos por triplicado en un ensayo por lote en matraces rectangulares de cultivo de tejidos de 75 cm2 que contienen 175 mL de medio PM123, que incluye nitrato 15 mM como la única fuente de nitrógeno, por siete días. Los matraces se colocaron con su dimensión de "ancho" más estrecha frente a una luz LED. Los matraces de cultivo se enmascararon con un plástico blanco opaco para proporcionar una abertura rectangular de 21,1 cm2 para que la irradiación alcanzara los cultivos. La irradiación incidente se programó a un ciclo de 16 h de luz:8 horas de oscuridad con una rampa lineal ascendente de irradiación de 0 a 1200 uE en 4 horas, después de las que la irradiación se mantuvo por seis horas a 1200 uE, y después una rampa lineal descendente en irradiación de 1200 a 0 uE en un período de 4 h (aumentando en intervalos de 15 min) (Figura 6A). Se añadió H2O desionizada a los cultivos diariamente para reemplazar las pérdidas por evaporación. Se reguló la temperatura de los cultivos mediante un baño de agua que se establece a 25 °C. Los cultivos se inocularon a una DO730 de 0,5 el día 0 y se eliminaron las muestras (5 mL) los días 3, 5, y 7 para evaluar la densidad celular, los ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME) como una medida de lípidos, y el carbono orgánico total (TOC). El muestreo se realizó 30 minutos antes del final del ciclo de luz. El análisis de FAME se realizó en muestras de 2 mL que se secaron mediante el uso de un GeneVac HT-4X. A cada uno de los sedimentos secos se le añadió lo siguiente: 500 pL de KOH 500 mM en metanol, 200 pL de tetrahidrofurano que contiene hidroxitolueno butilado al 0,05 %, 40 pL de una mezcla de estándar interno de 2 mg/mL de ácido graso libre C11:0/triglicérido C13:0/éster metílico de ácido graso C23:0 y 500 pL de perlas de vidrio (425-600 pm de diámetro). Los viales se taparon con tapas que se revisten con septa de PTFE en la parte superior abierta y se colocaron en un SPEX GenoGrinder a 1,65 krpm por 7,5 minutos. Las muestras se calentaron después a 80 °C por cinco minutos y se les permitió enfriar. Para la derivatización, se añadieron 500 pL de trifluoruro de boro en metanol al 10 % a las muestras antes de calentarlas a 80 °C por 30 minutos. Los tubos se permitieron enfriar antes de añadir 2 mL de heptano y 500 pL de NaCl 5 M. Las muestras se agitaron en vórtex por cinco minutos a 2K rpm y finalmente se centrifugaron por tres minutos a 1K rpm. Se muestreó la capa de heptano mediante el uso del Gerstel MPS Autosampler. La cuantificación usó 80 pg de estándar interno FAME C23:0. Las muestras se procesaron en un sistema de cromatografía de gases Agilent 7890A mediante el uso de una columna Agilent 127­ 3212 DB-FFAP, 10 m x 100 pm x 100 nm y un detector FID a 260 °C. El régimen de flujo fue de 500 pL/minuto mediante el uso de H2 como un portador con control de flujo constante. El horno se estableció a 90 °C por 0,98 minutos, después de 15,301 °C/minuto a 230 °C y se mantuvo por 1,66 minutos. La entrada contiene un revestimiento relleno de lana de vidrio de 4 mm (Agilent P/N 5183-4647), y se estableció a 250 °C y se usó una relación de división de 40:1. El volumen de inyección fue de 900 nL.

Se determinó el carbono orgánico total (TOC) mediante la dilución de 2 mL de cultivo celular a un volumen total de 20 mL con agua DI. Se inyectaron tres inyecciones por medición en un analizador Shimadzu TOC-Vcsj para la determinación de carbono total (TC) y carbono inorgánico total (TIC). El horno de combustión se estableció a 720 °C y el TOC se determinó mediante la sustracción de TIC a partir de TC. El intervalo de calibración de 4 puntos fue de 2 ppm a 200 ppm correspondiente a 20-2000 ppm para cultivos sin diluir con un coeficiente de correlación de r2 > 0,999.

Los resultados de estos análisis son mostrados en las Tablas 4-6. Los valores que se proporcionan para el mutante GE-8564 tipo salvaje y con desactivación génica son el promedio de tres cultivos con desviaciones estándar (de). La columna de "% de aumento" se refiere al aumento del porcentaje del mutante por desactivación génica de ZnCys con respecto a los valores tipo salvaje.

Tabla 4. Lípidos (FAME) que se producen por cultivos tipo salvaje y mutantes por desactivación génica de ZnCys-2845 en un ensayo por lote con medio de cultivo solo con nitrato.

Tabla 5. Biomasa (TOC) que se por cultivos tipo salvaje y mutantes por desactivación génica de ZnCys-2845 en un ensayo por lote con medio de cultivo solo con nitrato.

Tabla 6. Relaciones FAME/TOC de cepas mutantes por desactivación génica de ZnCys-2845 y tipo salvaje en un ensayo por lote con medio de cultivo solo con nitrato.

Se realizó el mismo ensayo de productividad por lote en el GE-8564 mutante por desactivación génica cas9 de ZnCys-2845 mediante el uso de medio PM124 que incluye amonio 5 mM además de nitrato 8,8 mM. Las muestras se eliminaron como se describe y se analizaron para FAM^e y TOC como se proporciona anteriormente. La columna de "% de diferencia" se refiere a la diferencia de porcentaje del mutante por desactivación génica de ZnCys con respecto a los valores tipo salvaje.

Tabla 7. FAME que se produce por el muíante por desactivación génica de ZnCys-2845 y cultivos tipo salvaje en ensayo por lote con medio de cultivo con nitrato más amonio.

Tabla 8. Biomasa (TOC) que se produce por cultivos mutantes por desactivación génica de ZdenCys-2845 y tipo salvaje en un ensayo por lote con medio de cultivo con nitrato más amonio.

Tabla 9. Relaciones FAME/TOC de cepas mutantes por desactivación génica de ZnCys-2845 y tipo salvaje en el ensayo por lote con medio de cultivo con nitrato más amonio.

Los gráficos de las Figuras 7A-D muestran los resultados de este análisis. La Figura 7A demuestra que los cultivos de la cepa GE-8564 con desactivación génica de ZnCys-2845 (valores promedio para cultivos triplicados que se representan como círculos en el gráfico) que crecen en un medio que solo incluye nitrato como fuente de nitrógeno tienen un contenido de FAME más alto que los cultivos tipo salvaje que se probaron todos los días. Como se puede ver en la Tabla 4, estos valores de FAM^e fueron considerablemente más altos que el tipo salvaje sobre una base volumétrica. Aunque el contenido de FAME del cultivo mutante por desactivación génica de ZnCys-2845 en medio solo de nitrato se encontró en un nivel más alto el día 3 del cultivo, que fue el primer día de ensayo, así como también los días 5 y 7 (Tabla 4 y Figura 7A), el aumento de FAME por día entre los días 3 y 7 fue menos para la cepa con desactivación génica de ZnCys-2845 que para la cepa tipo salvaje. La Figura 7B demuestra que, en este período de tiempo, el mutante de alteración del gen ZnCys-2845 que se cultiva en medio solo de nitrato (círculos) aumentó su carbono orgánico total muy poco en comparación con el tipo salvaje (X), que mostró un crecimiento estable como se evalúa mediante la acumulación de TOC (como también se ve en la Tabla 5). Por tanto, la cepa con desactivación génica de ZnCys-2845, cuando se cultiva en un medio que incluye nitrato como la única fuente de nitrógeno, se comportó como si estuviera en inanición de nitrógeno, lo que aumenta la producción de lípidos, pero también disminuye la acumulación de biomasa. La Figura 7C confirma esto, lo que demuestra que en el transcurso del ensayo de productividad de una semana, la relación FAME/TOC de la cepa GE-8564 con desactivación génica de ZnCys-2845 se elevó sobre el tipo salvaje (aproximadamente tres veces el del tipo salvaje, Tabla 6), siendo asignado más de un 60 % (y hasta al menos aproximadamente un 80 %) de TOC a los lípidos FAME. La Figura 7D muestra que los ácidos grasos C16 y C18 que se produjeron en exceso en la cepa GE-8564 con desactivación génica (barras negras) con respecto al tipo salvaje en condiciones ricas en nitrógeno (barras con rayas diagonales), mientras que los ácidos grasos C20 se encontraron subrepresentados con respecto a su abundancia en células tipo salvaje, como se esperaba para la sobreproducción selectiva de lípidos de almacenamiento (es decir, triglicéridos). El perfil de ácidos grasos de la cepa GE-8564 con desactivación génica fue muy similar al de las células tipo salvaje bajo inanición de nitrógeno (barras punteadas).

La demostración directa de producción de TAG se determinó mediante el análisis de los lípidos que se extrajeron. Los lípidos que se extrajeron de la cepa GE-8564 mutante por desactivación génica y de la progenitora WT-3730 tipo salvaje de las muestras tomadas el día 7 del ensayo por lote en el medio PM074 solo de nitrato se identificaron y cuantificaron mediante HPLC. Para el análisis de HPLC de los lípidos, muestras de 2 mL de cada cultivo se centrifugaron a velocidad máxima por 5 minutos, los sobrenadantes se eliminaron, y los sedimentos se resuspendieron en 400 pL de H2O. Las suspensiones celulares (aproximadamente 500 pL) se transfirieron a viales de vidrio de 4 mL con tapas que se revisten con teflón. Se añadieron 500 pL de perlas de vidrio (212-300 pm de diámetro) a cada una de las suspensiones celulares, después de lo cual se añadieron 50 pL de H2SO4 al 50 % y 100 pL de NaCl 5 M. El batido de perlas se realizó durante 5 minutos a 1 krpm, después se añadieron 2 mL de hexano a cada muestra y el batido de perlas se repitió por 5 minutos a 1 krpm. Las muestras se cargaron en un agitador en vórtex de múltiples tubos y se agitaron por 30 minutos a 1 krpm, y después se agitaron en vórtex por 30 segundos a 2,5 krpm. Se transfirieron 500 pL de la capa orgánica a un vial de HPLC, y se añadieron a cada vial 50 pL de solución de estándar interno (1 mg/mL de 6-cetocolestanol en tolueno). Los estándares fueron de NuCheck, Sigma-Aldrich, o Supelco. Los viales se taparon y se agitaron en vórtex brevemente (5 segundos a 2,5 krpm) antes del análisis por HPLC. El HPLC se procesó a un régimen de flujo de 2 mL/minuto en una columna Chromegasphere SI-60 de 150 mm x 4,6 mm x 10 pm (ES Industries), con un compartimento de la columna que se establece a 40 °C. El volumen de inyección fue de 25 pL con una velocidad de extracción y eyección de 200 pL/minuto. El eluyente A fue hexano y el eluyente B fue una mezcla 80:10:10:1 de hexano, isopropanol, acetato de etilo, y ácido fórmico al 10 % en isopropanol, que se procesa como un programa de gradiente de la siguiente manera: B al 2 % a 0,0 minutos; B al 2 % a 1,0 minuto; B al 25 % a 5,0 minutos; B al 98 % a 5,5 minutos; B al 98 % a 8,99 minutos; B al 2 % a 9,00 minutos; tiempo de parada: 9,0 minutos; 4 minutos después del tiempo. El detector fue ELSD a 30 °C y N2 a 3,5 bar, con una ganancia de 5.

La Figura 7E muestra que la cantidad de TAG en las células con desactivación génica de ZnCys-2845 en medio solo de nitrato fue mayor que 5 veces la de las células tipo salvaje, es decir, el aumento que se observa en el lípido FAME se podría atribuir al aumento en TAG. La microscopía electrónica también mostró la impresionante acumulación de lípidos característica de la respuesta a la inanición de nitrógeno. La Figura 7F muestra una célula tipo salvaje que crece bajo condiciones ricas en nitrógeno (medio de cultivo solo de nitrato), con un núcleo prominente (N), cloroplastos (Ch), y mitocondrias (M), así como también algunas pequeñas gotas lipídicas (LD). La Figura 7G muestra el mutante por desactivación génica de ZnCys que crece en medio solo de nitrato, en el que una gota lipídica prominente (LD) es la estructura celular más grande visible, una morfología celular altamente similar a la célula tipo salvaje con inanición de nitrógeno mostrada en la Figura 7H. Por tanto, el polipéptido ZnCys-2845 actúa como un regulador negativo de la biosíntesis de lípidos, ya que la expresión atenuante del gen ZnCys-2845 da como resultado un aumento de la producción de lípidos.

El aumento de FAME que se exhibe por la cepa con desactivación génica de ZnCys-2845 que se cultiva en medio solo de nitrato no fue evidente cuando la cepa con desactivación génica de ZnCys-2845 creció en un medio de cultivo que también incluye, sin embargo, amonio (Tabla 7). En este caso, la cantidad de FAME que se produjo fue muy similar a la que se produjo por las células tipo salvaje que crecieron en medio de nitrato más amonio, con producción de lípidos del mutante por desactivación génica, lo que aumenta algo en relación con el tipo salvaje hacia el final en el proceso, que indica probablemente una depleción de amonio del cultivo por lote (Tabla 7). La Figura 8A muestra que la cantidad de FAME que se produce por el tipo salvaje (diamantes) y la cepa con desactivación génica de ZnCys-2845 (círculos) que se cultiva en medio solo de amonio fue prácticamente idéntica en el ensayo por lote de una semana, como lo fue la acumulación de TOC, mostrada en la Figura 8B (también evidente de la Tabla 8). Los valores de FAME/TOC de la cepa tipo salvaje y con desactivación génica de ZnCys-2845 fueron en consecuencia similares (Figura 8C, Tabla 9).

Por tanto, el mutante de alteración del gen ZnCys-2845 se comporta como la cepa tipo salvaje cuando el amonio se encontraba pleno en el medio de cultivo (Tablas 7-9 y Figuras 8A-8C), pero parecía encontrarse deteriorado en la asimilación de nitratos, que se comportan como si las células se encontraran en medio con depleción de nitrógeno cuando el nitrato fue la única fuente de nitrógeno presente mediante la inducción de la biosíntesis de lípidos de almacenamiento (Figuras 7A-H).

Ejemplo 5

Análisis bioinformático de la proteína ZnCys-2845: dominios y ortólogos

Como se describe en el Ejemplo 1, el gen ZnCys-2845 en el locus Naga 100104g18 que se expresó de forma diferencial entre las muestras ricas en N y con depleción de N fue un gen (secuencia de ADNc que se proporciona como SEQ ID NO:1) que codifica un polipéptido (SEQ ID NO:2) que aparecía en una lista de factores de transcripción putativos de Nannochloropsis que se genera por bioinformática. Se observó que el polipéptido tiene un dominio zinc(2)Cys(6) característico de algunos factores de transcripción y, por lo tanto, se clasifica como una proteína del dominio de unión al ADN tipo fúngico Zn(2)-C(6). Además del dominio Cys(6)Zn(2), el polipéptido ZnCys-2845 de Nannochloropsis contiene una secuencia distinta de localización nuclear con una puntuación de confianza de 1,0 (lo que equivale a un 100 % de confianza), consistente con su caracterización como factor de transcripción (Figura 5).

ZnCys-2845 es una proteína de 1065 aminoácidos (SEQ ID NO:2) que se identifica por análisis transcriptómico de genes regulados de forma diferencial durante la inducción de lípidos y anotada como un factor de transcripción putativo debido a la extensión del dominio de agrupamiento binuclear Zn(2)-Cys(6) del aminoácido 190 al 219 (SEQ ID NO:3). La proteína recluta a Pfam PF00172 ("Zn_Clus" o "dominio de agrupamiento binuclear fúngico de Zn(2)Cys(6)" con una puntuación de bits de 25,2 (el límite de reunión para esta familia es 20,8) y un valor e de 1,1 e-05. Por tanto, ZnCys-2845 es un miembro de la familia de proteínas del dominio de unión al ADN tipo fúngico Zn(II)2Cys6. Los miembros de esta familia contienen el resto bien conservado de CysX2CysX6CysX5-12CysX2CysX6-8Cys (un residuo de cisteína seguido de dos residuos de aminoácidos de cualquier identidad, seguido de un segundo residuo de cisteína seguido de seis residuos de aminoácidos de cualquier identidad, seguido de un tercer residuo de cisteína seguido de entre cinco y doce residuos de aminoácidos de cualquier identidad, seguido de un cuarto residuo de cisteína seguido de dos residuos de aminoácido de cualquier identidad, seguido de un quinto residuo de cisteína seguido de entre seis y ocho residuos de aminoácidos de cualquier identidad, seguidos de un sexto residuo de cisteína; SEQ ID NO:4). Se ha demostrado que los residuos de cisteína se pueden unir a dos átomos de zinc, que coordinan el plegamiento del dominio que se involucra en la unión del ADN. Otros identificadores para este dominio incluyen el dominio de base de datos de dominio conservado (cdd) cd00067, el dominio de base de datos de dominio de proteína interpro IPR001138, el dominio de proteína SMART 'GAL4', y el dominio de proteína PROSITE PS00463.

Esta clase de factores de transcripción "ZnCys" se pensó originalmente que fuera exclusivamente fúngico, pero más recientemente se han identificado miembros entre los cromalveolatos, en particular los estramenopilas/heterocontos (que incluyen los laberintulomicetos o "quítridos" no fotosintéticos) y los haptofitos (por ejemplo, E. huxleyi). La primera y mejor proteína que se estudia de esta familia es Gal4p, un activador de transcripción de genes de Saccharomyces que se involucran en el catabolismo de la galactosa (Leverentz y Reece (2006) Biochem Soc Transac 34:794-797; Breunig (2000) Food Technol. Biotechnol. 38:287-293). Los términos "proteína del dominio de unión al ADN tipo fúngico Zn(2)-C(6)", "proteína del dominio de unión al ADN tipo fúngico Zn(II)2Cys6", "polipéptido del dominio Zn(2)-Cys(6)", "Proteína/polipéptido Zn(2)Cys(6)" y "proteína/polipéptido Zn2Cys6" se usan de manera intercambiable en la presente descripción.

El examen de las bases de datos del genoma revela genes que codifican polipéptidos que tienen dominios Zn(2)-Cys(6) en plantas y hongos. Curiosamente, se encontraron varias especies de heteroconto incluyen polipéptidos de dominio Zn(2)-Cys(6), que incluyen especies de laberintulomicetos tales como los de los géneros Schizochytrium y Aplanochytrium y especies de diatomeas, que incluyen miembros de los géneros Navicula, Cyclotella, Thalassiosira, Phaeodactylum, Fragilariopsis.

Tabla 10. Ortólogos putativos del regulador de lípidos de ZnCys-2845 de N. gaditana

El gen de N. oceanica (secuencia de codificación que se proporciona como SEQ ID NO:84, que codifica un polipéptido que se proporciona como SEQ ID NO:17) se encontró al escanear el conjunto de proteínas predichas de un genoma patentado de Nannochloropsis para buscar coincidencias con el modelo PF00172 HMM mediante el uso de hmmsearch (hmmer.org) y el límite de confianza para la puntuación de coincidencia; sin embargo, no se encontraron ortólogos adicionales de Nannochloropsis al escanear genomas de Nannochloropsis, genomas que se descargan de singlecellcenter.org/en/NannoRegulationDatabase/Download/S11.zip, probablemente debido a conjuntos de proteínas incompletas de los genomas. Se encontraron ortólogos putativos adicionales de la proteína ZnCys-2845 de Nannochloropsis gaditana (SEQ ID NO:2) mediante BLAST (tblastn) frente a conjuntos de genomas públicos de cepas y especies de Nannochloropsis, que incluye la cepa CCMP526 de N. gaditana, la cepa IMET1 de N. oceanica, la cepa CCMP531 de N. oceanica, la cepa CCMP525 de N. oculata, la cepa CCMP537 de N. salina, y la cepa CCMP529 de N. granulata. Sin embargo, en cada caso, se observó que las coincidencias de alineación se rompen dentro del dominio PF00172 Zn_Clus, de modo que se encontraron todas las secuencias incompletas, con carencia del extremo 5' de la región de codificación y de la secuencia N-terminal de las proteínas. Una región adicional conservada, de aproximadamente 170 aminoácidos de longitud del polipéptido ZnCys-2845 (posiciones 345-51 de SEQ ID NO:27), se identificó claramente en todos los genomas de Nannochloropsis que se analizaron y examinaron adicionalmente. La herramienta delta-blast en NCBI se usó para evaluar la región altamente conservada entre los ortólogos putativos WT-3730 de ZnCys-2845 de N. gaditana (SEQ ID NO:2) en otras especies de Nannochloropsis.

E s te d o m in io , un d o m in io d e p lie g u e s P A S 3 (p fa m P F 08447 ) , s e e n c u e n tra e n m u c h a s p ro te ín a s d e s e ñ a liz a c ió n d o n d e fu n c io n a c o m o un s e n s o r d e s e ñ a l. M e d ia n te e l u s o d e e s te e n fo q u e , la s c o in c id e n c ia s p u ta t iv a s c o n Z n C y s -^{28345 s e p o d ría n id e n t if ic a r c la ra m e n te en c a d a u n o d e lo s s e is g e n o m a s d e} Nannochloropsis ^{q u e s e b u s c a ro n .} D e s a fo r tu n a d a m e n te , la s c o in c id e n c ia s d e a lin e a c ió n en to d o s lo s c a s o s p a re c ía n ro m p e rs e d e n tro d e la c o in c id e n c ia p u ta t iv a co n e l d o m in io P F 00172 Z n _ C lu s . S in e m b a rg o , a p a r t ir d e la s a lin e a c io n e s d e b la s t, se o b s e rv ó u n a re g ió n d e a p ro x im a d a m e n te 170 a a d e Z n C y s -28345 (p o s ic io n e s 345 -517 ) y q u e s e id e n tif ic a c la ra m e n te a t ra v é s d e to d a s la s c e p a s (c o p ia ú n ic a ) . U n a a lin e a c ió n d e lo s d o m in io s P A S 3 e n lo s o r tó lo g o s Z n C y s -^{2845 id e n t if ic a d o s d e} Nannochloropsis ^{s e p ro p o rc io n a en} la Figura 9, ^{d o n d e e l a lto g ra d o d e c o n s e rv a c ió n d e la s e c u e n c ia d e l d o m in io e n tre d ife re n te s e s p e c ie s d e} Nannochloropsis ^{e s e v id e n te . E l d o m in io P A S 3 d e Z n C y s -2845 ( id e n t if ic a d o s e n e l d ia g ra m a d e g e n e s d e la} Figura 12A) ^{s e e x t ie n d e d e l a m in o á c id o 345 a l a m in o á c id o 517 d e S E Q ID N O :2 , y s e p ro p o rc io n a c o m o S E Q ID N O :21. L a} s Eq ^{ID N O :21 ta m b ié n re p re s e n ta la s e c u e n c ia d e l d o m in io P A S 3 d e la c e p a C C M P 526} de N. gaditana. ^{L a s e c u e n c ia d e l d o m in io P A S 3 d e lo s o r tó lo g o s Z n C y s -2845 d e la c e p a W T -5473 d e} N. oceánica, ^{la c e p a IM E T 1 d e} N. oceánica, ^{y la c e p a C C M P 531 d e} N. oceánica ^{s e p ro p o rc io n a c o m o S E Q ID N O :22. E l d o m in io P A S 3 d e l o r tó lo g o Z n C y s -2845 d e} N. oceanica ^{(S E Q ID N O :22 ) e s un 86 % id é n tic o e n s e c u e n c ia a l d o m in io P A S 3 d e} N. gaditana ^{(S E Q ID N O :21 ). E l d o m in io P A S 3 d e l o r tó lo g o Z n C y s -2845 d e la c e p a C C M P 537 d e} N. salina ^{s e p ro p o rc io n a c o m o S E Q ID N O :23 , q u e e s un 98 % id é n t ic o a l d o m in io P A S 3 de Z n C y s -2845 d e} N. gaditana ^{(S E Q ID N O :21 ). E l d o m in io P A S 3 d e l o r tó lo g o Z n C y s -2845 d e la c e p a C C M P 539 d e} N. oculata ^{s e p ro p o rc io n a c o m o S E Q ID N O :24 , y d e m u e s tra un 86 % d e id e n t id a d d e s e c u e n c ia c o n e l d o m in io P A S 3 d e Z n C y s -2845 d e} N. gaditana ^{(S E Q ID N O :21 ). C o m o s e p ro p o rc io n a a n te r io rm e n te , e l d o m in io P A S 3 d e l o r tó lo g o Z n C y s -2845 d e la c e p a C C M P 529 d e} N. granulata ^{s e p ro p o rc io n a c o m o S E Q ID N O :22 , q u e e s a p ro x im a d a m e n te un 86 % id é n tic o a l d o m in io P A S 3 d e Z n C y s -2845 d e} N. gaditana ^{(S E Q ID N O :21 ).}

^{U n a a lin e a c ió n d e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s q u e s e c o d if ic a p o r e l g e n Z n C y s -2845 d e} N. gaditana ^{y la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s (S E Q ID N O :17 ) q u e s e c o d if ic a p o r e l o r tó lo g o d e la c e p a W T -5473 d e l g e n Z n C y s -2845 d e} N. oceanica ^{, a m b o s d e lo s c u a le s s e d e te rm in a ro n m e d ia n te s e c u e n c ia c ió n in te rn a d e l g e n o m a y a s ig n a c ió n d e g e n e s , s e p ro p o rc io n a n e n la} Figura 10. ^{L a s s e c u e n c ia s d e l g e n o m a d e t re s e s p e c ie s a d ic io n a le s d e} Nannochloropsis, ^{la c e p a C C M P 529 d e} N. granulata, la cepa CCMP539 de N. oculata, y la ^{c e p a C C M P 537 d e} N. salina, ^{s e e x a m in a ro n} a d ic io n a lm e n te p a ra in te n ta r u n ir s e c u e n c ia s q u e c o d if ic a n p ro te ín a s d e o r tó lo g o s d e Z n C y s -28545 p u ta t iv o s q u e se c a ra c te r iz a n p o r lo s d o m in io s P A S 3. L o s s e is g e n o m a s d e N a n n o c h lo ro p s is s e c o n s e rv a ro n p a ra e n c o n tra r re g io n e s d e h o m o lo g ía q u e s e e x t ie n d e n h a c ia fu e ra d e los d o m in io s P A S 3. S e u s ó b la s tn p a ra id e n t if ic a r s e c u e n c ia s h o m ó lo g a s , q u e s e e n la z a ro n c o n e s p a c io s q u e s e in tro d u c e n p a ra m a x im iz a r la h o m o lo g ía .

^{E l d o m in io Z n (2 ) -C y s (6 ) d e} N. oceanica ^{e s id é n tic o a l d o m in io Z n (2 ) -C y s (6 ) d e} N. gaditana ^{(S E Q ID N O :3 ). L o s p o lip é p tid o s q u e se c o d if ic a n p o r lo s d o s g e n e s (Z n C y s -2845 d e} N. gaditana ^{y o r tó lo g o d e} N. oceanica) ^{t ie n e n un 56} % d e id e n t id a d a tra v é s d e la s e c u e n c ia p o lip e p tíd ic a d e d u c id a c o m p le ta y un 71 % d e id e n t id a d en lo s p r im e ro s 517 ^{a m in o á c id o s d e Z n C y s -2845 d e} N. gaditana ^{(S E Q ID N O :2 ), u n a p o rc ió n d e la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s q u e se e x t ie n d e d e l N - te rm in a l d e la p ro te ín a a t ra v é s d e l d o m in io Z n (2 ) -C y s (6 ) y a t ra v é s d e l d o m in io P A S 3 (v e r} Figura 5^{). L o s a m in o á c id o s d e 1 -200 q u e s e c o d if ic a n p o r la s e c u e n c ia h o m ó lo g a d e Z n C y s -2845 d e} N. salina ^{(S E Q ID N O :20 )} t ie n e n a p ro x im a d a m e n te un 98 % d e id e n tid a d co n la s e c u e n c ia d e a m in o á c id o s c o r re s p o n d ie n te d e Z n C y s -2845 d e N. gaditana ^{(S E Q ID N O :2 ); m ie n tra s q u e la s e c u e n c ia p o lip e p tíd ic a in c o m p le ta d e un o r tó lo g o p u ta t iv o d e} N. granulata ^{(S E Q ID N O :18 ) e s a p ro x im a d a m e n te un 61 % id é n tic a a Z n C y s -2845 d e} N. gaditana (SeQ ^{ID N O :2 ) y la s e c u e n c ia p o lip e p tíd ic a in c o m p le ta d e un o r tó lo g o p u ta t iv o d e} N. oculata ^{(S E Q ID N O :19 ) e s a p ro x im a d a m e n te un 61 % id é n tic a a Z n C y s -2845 d e} N. gaditana ^{(S E Q ID N O :2 ). E s ta s s e c u e n c ia s d e p o lip é p tid o s p a rc ia le s n o in c lu y e n lo s d o m in io s P A S 3 d e o r tó lo g o s d e} Nannochloropsis, ^{q u e , c o m o s e in d ic a a n te r io rm e n te , t ie n e n un % d e id e n t id a d e s m u c h o m á s a lto co n e l d o m in io P A S 3 d e Z n C y s -2845 d e} N. gaditana ^{(S E Q ID N O :21 ).}

E je m p lo 6

C re c im ie n to y b io s ín te s is d e líp id o s d e l m u ta n te p o r d e s a c tiv a c ió n g é n ic a d e Z n C y s -2845 e n un s is te m a d e p ro d u c c ió n s e m ic o n t in u o m e d ia n te e l u so d e u n a fu e n te d e n itró g e n o d e u re a

P a ra d e te rm in a r s i e l m u ta n te p o r d e s a c tiv a c ió n g é n ic a d e a lte ra c ió n d e l g e n Z n C y s -2845 p o d ría u t i l iz a r o tra s fu e n te s d e n itró g e n o , s e e s ta b le c ió un e n s a y o d e p ro d u c t iv id a d s e m ic o n t in u o e n e l q u e e l m e d io d e c u lt iv o in c lu y e u re a c o m o la ú n ic a fu e n te d e n itró g e n o .

P a ra lo s e n s a y o s en c u lt iv o s q u e in c lu y e n u re a c o m o la ú n ic a fu e n te d e n itró g e n o , s e c u lt iv a ro n c u lt iv o s d e s ie m b ra ( ta m b ié n d e n o m in a d o s c o m o "c u lt iv o s d e in ic io " o " c u lt iv o s e s c a la d o s " ) d e la c e p a G E -8564 c o n d e s a c tiv a c ió n g é n ic a d e Z n C y s -2845 y la c e p a W T -3730 t ip o s a lv a je e n m e d io P M 125 q u e in c lu y e u re a 7 ,5 m M c o m o la ú n ic a fu e n te d e n itró g e n o . P a ra lo s e n s a y o s e n lo s q u e s e c u lt iv a ro n c é lu la s t ip o s a lv a je en m e d io s o lo d e n it ra to (P M 074 ) , la s c é lu la s t ip o s a lv a je s e e s c a la ro n e n c u lt iv o s q u e in c lu y e n e l m e d io P M 074 s o lo d e n itra to . L o s G E -8564 m u ta n te s p o r d e s a c tiv a c ió n g é n ic a d e Z n C y s -2845 se e s c a la ro n e n c u lt iv o s q u e in c lu y e n e l m e d io P M 124 q u e in c lu y e ta n to n itra to (8 ,8 m M ) c o m o a m o n io (5 m M ) p a ra lo s e n s a y o s s e m ic o n t in u o s q u e in c lu y e n s o lo n itra to c o m o fu e n te de n itró g e n o e n e l m e d io d e c u lt iv o d e l e n s a y o .

L o s c u lt iv o s e s c a la d o s se u s a ro n p a ra in o c u la r m a tra c e s re c ta n g u la re s d e c u lt iv o d e te jid o s d e 225 c m 2, c a d a u n o d e lo s c u a le s c o n t ie n e un v o lu m e n to ta l f in a l d e 550 m L d e c u lt iv o d e s p u é s d e la in o c u la c ió n . L o s c u lt iv o s s e in o c u la ro n de modo que cada cultivo de 550 mL tuviera una DO730 inicial de 0,9. Un volumen de inoculo típico fue de aproximadamente 200 mL de cultivo escalado que se añadió a aproximadamente 350 mL de medio de cultivo de ensayo, que fue ya sea PM074 (medio solo de nitrato) o PM125 (medio solo de urea). Los cultivos se diluyeron diariamente al mediodía, cuando la intensidad de la luz se encontraba en su pico, mediante la eliminación del 30 % del volumen (165 mL) y reemplazándolo con el mismo volumen del medio de ensayo (ya sea PM074 o PM125) más 10 mL adicionales de agua desionizada para compensar la evaporación (que se incluye en el medio de compensación). Los ensayos semicontinuos se procesaron típicamente por 10-14 días. Las productividades diarias de lípidos y biomasa solo se calcularon para cultivos que habían alcanzado el estado estacionario (donde el aumento en el crecimiento fue igual al factor de dilución para el ensayo).

Se iniciaron tres cultivos por cepa. Los matraces que incluyen barras de agitación y tienen tapones que tienen un tubo insertado que se conecta con filtros de jeringa para el suministro de aire que se enriquece con CO2 (CO2 al 1 %, régimen de flujo, a 300 mL por minuto) que se burbujeó a través de los cultivos. Los matraces se colocaron en un baño de agua que se programa para mantener una temperatura constante de 25 °C en placas de agitación que se establecen a 575 rpm durante el período de ensayo. Los matraces de cultivo fueron enmascarados con un plástico blanco opaco para proporcionar una abertura rectangular de 31,5 cm2 para que la irradiación alcanzara los cultivos. Los matraces se alinearon con el ancho (dimensión más estrecha) frente a un banco de luz LED que fue programado con un ciclo de luz/oscuridad y un perfil de luz que aumenta hasta el "mediodía solar" y después disminuye hasta el final del período de luz. El perfil de luz se diseñó para simular un día de primavera en el sur de California: 14 h de luz:10 h de oscuridad, con un pico de luz de aproximadamente 2000 pE (Figura 6B). Los matraces que incluyen barras de agitación y tienen tapones que tienen un tubo insertado que se conecta con filtros de jeringa para el suministro de aire que se enriquece con CO2 (CO2 al 1 %, régimen de flujo, a 300 mL por minuto). Los matraces se colocaron en un baño de agua que se programa para mantener una temperatura constante de 25 °C en placas de agitación que se establecen a 575 rpm durante el período de ensayo.

Los cultivos se diluyeron diariamente al mediodía, cuando la intensidad de la luz se encontraba en su pico, mediante la eliminación del 30 % del volumen (165 mL) y reemplazándolo con el mismo volumen del medio de ensayo más 10 mL adicionales de agua desionizada para compensar la evaporación. Se determinó empíricamente una tasa de dilución del 30 % como la tasa de dilución más productiva para Nannochloropsis, ya que las diluciones diarias al 50, 30, y 15 % resultaron en productividades promedio de t Oc de 6,5, 9 y 8 g/m2/día, respectivamente. Los ensayos semicontinuos se procesaron típicamente por 7-14 días. Las productividades diarias de lípidos (FAME) y biomasa (TOC) se calcularon a partir de cultivos que habían alcanzado la densidad de TOC y FAME del cultivo en estado estacionario. Las productividades volumétricas de FAME y TOC en (mg/L/día) se calcularon mediante la multiplicación de las cantidades volumétricas de FAME y TOC por la tasa de dilución del 30 %. Las productividades aéreas (g/m2/día) se calcularon mediante la división de la productividad total del cultivo por el tamaño de la apertura a través de la que se permitió la irradiación:

(productividad volumétrica) ^{m g} * o,55 ¿ *

^{L * día} 0,00315 1000 mg ^{m 2 * día}

La Figura 11A muestra que el GE-8564 mutante por desactivación génica de ZnCys-2845, cuando se cultiva en el ensayo semicontinuo donde el nitrato es la única fuente de nitrógeno (diamantes), mostró una gran inducción de la producción de lípidos al comienzo del ensayo que posteriormente disminuye abruptamente después del día 3 del ensayo de modo que la producción de lípidos cae más abajo de la del cultivo tipo salvaje sin inducir el día 10 del ensayo, después de lo cual disminuye a niveles incluso más bajos. Este patrón es consistente con los resultados del ensayo por lote del Ejemplo 4 que indica que el GE-8564 mutante por desactivación génica de ZnCys-2845 se induce para la producción de lípidos en medios solo de nitrato.

En contraste, los cultivos del GE-8564 mutante que tiene un gen ZnCys-2845 alterado que se cultiva en medio solo de urea (Figura 11A, círculos) tienen una productividad diaria de FAME consistentemente más alta que la cepa tipo salvaje que se cultiva ya sea en medio solo de nitrato (triángulos) o medio solo de urea (cuadrados), ambas de las cuales son condiciones en las que la cepa tipo salvaje no se induce para la producción de lípidos (como se evidencia por las relaciones FAME/TOC de estos cultivos a lo largo del ensayo, ver la Figura 11C y la Tabla 14, más abajo). La Tabla 11 proporciona las cantidades diarias de FAME que se producen por área por todas las cepas en el ensayo semicontinuo junto con el aumento del porcentaje de la cantidad de FAME que se produce por la cepa GE-8564 mutante por desactivación génica sobre los niveles de FAME tipo salvaje cuando ambas fueron cultivadas en medio de cultivo solo de urea que también se proporciona. La productividad promedio por área de FAME para cada cepa, que se expresa como g/m2/día, se proporciona en la Tabla 12. El aumento en la productividad de FAME de la cepa GE-8564 mutante por desactivación génica sobre la cepa tipo salvaje promedia un 58 % en el transcurso del ensayo de trece días cuando ambas cepas se cultivaron en medio solo de urea. También se puede ver que las células tipo salvaje que se cultivan en medio solo de urea mostraron, en promedio, un 16 % menos de productividad de FAM^e que las células de tipo salvaje en medio solo de nitrato. El GE-8564 mutante por desactivación génica en medio solo de nitrato mostró un aumento en la producción de FAME con respecto al tipo salvaje en los primeros 8 días del ensayo y después experimentó disminuciones en la producción diaria de FAME a medida que progresaba el ensayo, consistente con una respuesta de depleción de nitrógeno.

Tabla 11. FAME (g/m2/día) que se produce por cepas con desactivación génica de ZnCys y tipo salvaje que se cultivan con nitrato o urea como fuente de nitrógeno en un ensayo semicontinuo.

La Tabla 12 proporciona la productividad promedio diaria de FAME de los cultivos en el día trece del cultivo semicontinuo. La productividad promedio diaria de FAME para el GE-8564 con desactivación génica de ZnCys que crece en un medio solo de urea fue un 32 % más alta que la productividad promedio diaria de FAME de la cepa tipo salvaje (WT-3730) que crece en medio de nitrato (columna más a la derecha). El alto valor de productividad de FAME de la desactivación génica de ZnCys-2435 en medio solo de nitrato se debe a la muy alta producción de FAME en los primeros 7 días del cultivo. Sin embargo, la productividad diaria de FAME ya se encuentra disminuyendo para el día 5 del cultivo, después de lo cual disminuye mucho más abajo del tipo salvaje que se cultiva en medio solo de nitrato (Figura 11A).

Tabla 12. Productividad promedio diaria de FAME de cultivos semicontinuos en medios solo de urea o solo de nitrato

La Figura 11B muestra que el mutante por desactivación génica de ZnCys-2845 (GE-8564) que se cultiva en el ensayo semicontinuo en un medio solo de nitrato (diamantes) demostró una caída precipitada en la producción de biomasa en el transcurso del ensayo, lo que disminuye a niveles que fueron solo una fracción de la biomasa que se produce por células tipo salvaje que se cultivan en medio de nitrato al final del ensayo. En contraste, durante este ensayo de productividad semicontinuo, hubo poca disminución en la productividad de la biomasa (TOC) en el mutante de alteración del gen ZnCys-2845 que se cultiva en medio de urea (círculos) con respecto a la cepa tipo salvaje que se cultiva en medio de nitrato (triángulos), y el mutante por desactivación génica de ZnCys-2845 incluso demostró una productividad ligeramente mejor que el tipo salvaje que se cultiva en medio de urea (cuadrados), los tres de los cuales siguen siendo bastante consistentes en el transcurso completo del ensayo.

La Tabla 13 proporciona el contenido de TOC de estos cultivos semicontinuos y la diferencia de porcentaje en la cantidad diaria de TOC que se produce entre el mutante por desactivación génica de ZnCys-2845 que se cultiva en medio solo de nitrato con respecto a las células tipo salvaje que se cultivan en medio solo de nitrato, y la diferencia de porcentaje en el TOC diario que se produce entre el mutante por desactivación génica de ZnCys-2845 que se cultiva en medio de urea con respecto a las células tipo salvaje que se cultivan en medio de urea. En la Tabla 13 se puede ver la reducción en la cantidad de biomasa que se produce diariamente en el mutante por desactivación génica de ZnCys-2845 que se cultiva en medio solo de nitrato a medida que progresa el ensayo. Los niveles de producción de biomasa de los otros cultivos, que incluye el mutante por desactivación génica de ZnCys-2845 que se cultiva en medio de urea que tiene un aumento de un 58 % en la productividad diaria de FAME con respecto al tipo salvaje en medio de urea, sigue siendo bastante consistente a lo largo del ensayo de trece días, y tiene una productividad promedio de TOC ligeramente mejor que la de la cepa tipo salvaje que se cultiva en medio de urea. Por tanto, el mutante por desactivación génica de ZnCys-2845 fue capaz de acumular biomasa a niveles al menos equivalentes a la cepa tipo salvaje mientras que demuestra casi un 60 % de productividad diaria de FAME más alta cuando se cultiva en un medio que incluye urea como la única fuente de nitrógeno.

Tabla 13. Biomasa (g/m2/día de TOC) que se produce por cepas que crecen en nitrato o urea en un ensayo semicontinuo

De hecho, a pesar del aumento en la producción de lípidos por el mutante por desactivación génica de ZnCys-2845 en medio solo de urea con respecto a las células tipo salvaje en medio rico en nutrientes (solo de nitrato) (Figura 11A y Tabla 11), la cantidad promedio de TOC que se produce a lo largo del transcurso del ensayo por el mutante por desactivación génica de ZnCys en medio que contiene urea fue al menos un 90 % que el de las células tipo salvaje que se cultivan en medio de nitrato, es decir, solo aproximadamente un 10 % menos que el de las células tipo salvaje ricas en nitrógeno.

La Figura 11C muestra las relaciones diarias de FAME a TOC de los cultivos en el ensayo semicontinuo. Estas relaciones se mantienen bastante consistentes para todas las muestras con la excepción del mutante de alteración del gen ZnCys-2845 ("ZnCys-KO") que se cultiva en medio solo de nitrato (diamantes), que muestra relaciones de FAME a TOC que aumentan del primer día de cultivo al día 8, después del que la relación comienza a disminuir. Estas relaciones FAME:TOC del mutante de alteración del gen ZnCys-2845 que se cultiva en medio solo de nitrato son mucho más altas que las relaciones FAME:TOC del tipo salvaje que se cultivan en medio solo de nitrato y solo de urea y el mutante por desactivación génica de ZnCys-2845 que se cultiva en medio solo de urea y son indicativos de la respuesta clásica de inducción de lípidos a la depleción de nitrógeno. Las relaciones de FAME a TOC de los cultivos de ensayo semicontinuos mutante y tipo salvaje se proporcionan en la Tabla 14.

Tabla 14. Relaciones FAME/TOC de cultivos ue se cultivan en nitrato o urea.

El mutante de alteración del gen ZnCys-2845 que se cultiva solo en urea muestra relaciones FAME:TOC consistentemente más altas con respecto a las células tipo salvaje que se cultivan ya sea en medio solo de nitrato o solo de urea, pero la relación FAME:TOC es bastante estable a lo largo del período de cultivo, en el intervalo de 0,3 a menos de 0,5, lo que representa un aumento del promedio de aproximadamente un 45% sobre el tipo salvaje. Por tanto, cuando se usó urea como la única fuente de nitrógeno reducido en el ensayo, el mutante de alteración del gen ZnCys-2845 demostró un aumento de forma significativa de la división de carbono a lípido (Tabla 14, Figura 11C) sin una pérdida sustancial de la asimilación general de carbono (Tabla 13, Figura 11B), lo que resulta en un aumento de aproximadamente un 57 % en FAME que se produce diariamente y solo una disminución de aproximadamente un 6 % en el TOC que se produce con respecto a las células tipo salvaje que se cultivan bajo las mismas condiciones (solo urea) en el transcurso del ensayo.

Ejemplo 7

Construcciones de bloqueo de expresión de ZnCys-2845 por Cas9

Dado que la línea con desactivación génica de ZnCys-2845 exhibe un déficit significativo en la productividad de TOC concomitante con un aumento en la división de carbono a lípidos en el crecimiento por lote (Ejemplo 4, Figura 7B), investigamos a continuación si al variar el grado de atenuación de la expresión de ZnCys-2845 resultaría en cepas diseñadas en las que la productividad de lípidos y TOC se encontrara mejor optimizada. Se diseñaron cepas mutantes adicionales para tener una disminución de la expresión del gen ZnCys-2845 mediante el uso del diseño del genoma Cas9/CRISPR. Se diseñaron doce ARN guía quiméricos para dirigirse a secuencias corriente arriba del ATG, dentro de un intrón del gen, en el extremo 3' del gen pero aún dentro de la secuencia de codificación, o en la región 3' sin traducir del gen (Figura 12A). Estas construcciones se describen en la presente descripción como "construcciones de bloqueo de expresión Bash" o simplemente "construcciones Bash" debido a que se diseñan para insertar el fragmento donante en un sitio en una región del gen donde se espera que la inserción permita que el gen diana se exprese en un nivel inferior que en el tipo salvaje. (En consecuencia, las cepas que incluyen tales inserciones se denominan como "cepas Bash", "Bashers" o "mutantes por bloqueo de expresión Bash"). Las doce secuencias de 18 nucleótidos que tienen homología con el gen ZnCys-2845 (secuencias del sitio diana) se proporcionan en la Tabla 15.

Tabla 15: Secuencias guía dianas y quiméricas para atenuar la expresión de ZnCys-2845

Las construcciones de ADN guía quimérico se sintetizaron como dos cadenas complementarias que se hibridaron para producir una construcción bicatenaria con un promotor T7 que se posiciona corriente arriba de la secuencia guía (que incluye la secuencia diana de 18 nucleótidos además de la secuencia tracr), y se usó para producir los ARN guía quiméricos mediante transcripción in vitro y purificación como se describe en el Ejemplo 3. SEQ ID NO:42 es un ejemplo de una cadena "con sentido" genérica para producir un ARN guía y SEQ ID NO:43 es un ejemplo de una cadena "complementaria" genérica que se hibridaría con la cadena con sentido (donde la secuencia diana se representa de nuevo por 18 N), para producir el ARN guía mediante transcripción in vitro.

En los presentes experimentos, cada ARN guía quimérico se transformó individualmente en la cepa del Editor GE-6791 de Nannochloropsis junto con el fragmento donante que incluye un casete de resistencia Hyg ("HygR") (Figura 4A, SEQ ID NO:44) como se describe en el Ejemplo 3. Las colonias resistentes a higromicina se seleccionaron y se cribaron mediante PCR de colonias como se describe mediante el uso de cebadores adyacentes a las regiones diana del gen ZnCys-2845. Se usaron los cebadores MA-ZnCys-FP (SEQ ID NO:49) y MA-ZnCys-RP (SEQ ID NO:50) para confirmar la desactivación génica (GE-8564) y la inserción del fragmento donante en intrones; los cebadores MA-5'Bash-ZnCys-FP (SEQ ID NO:63) y MA-5'Bash-ZnCys-RP (SEQ ID NO:64) se usaron para confirmar la inserción del fragmento donante en las regiones 5 'del gen ZnCys-2845; y los cebadores MA-3'Bash-ZnCys-FP (SEQ ID NO:65) y MA-3'Bash-ZnCys-RP (SEQ ID NO:66) se usaron para confirmar la inserción del fragmento donante en las regiones 3' del gen ZNCys-2845. Once de los doce ARN guía resultaron en aislamientos que, por PCR de colonias, parecían tener la inserción del gen Hyg en el locus diana (no se observó inserción en el sitio diana -1 de UTR 5')

Se realizó un PCR de transcripción inversa cuantitativa (qRT-PCR) en ARN que se aísla de las líneas con bloqueo de expresión para determinar si la expresión del gen ZnCys-2845 se encontraba de hecho reducida en estas líneas. Las cepas Bash con bloqueo de expresión de ZnCys-2845 crecieron bajo condiciones estándar ricas en nitrógeno (medio PM074 (solo de nitrato)) y se cosecharon durante la fase estacionaria temprana. El ARN total se aisló de las células Bash con bloqueo de expresión de ZnCys-2845, mediante el uso de los métodos que se proporcionan en el Ejemplo 1, anteriormente. El ARN se convirtió en el estuche cDNA BioRad's iScript™ Reverse Transcription Supermix de acuerdo con el protocolo del fabricante. Para PCR, se usó Ssofast EvaGreen Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA) junto con cebadores específicos de genes. La reacción de PCR se llevó a cabo en un termociclador C1000 que se acopla con un sistema en tiempo real CFX (BioRad). Las concentraciones del cebador y de ADNc fueron de acuerdo con la recomendación del fabricante. Los cebadores para amplificar una secuencia de la transcripción de ZnCys-2845 fueron SEQ ID NO:67 y SEQ ID NO:68. Los niveles de transcripción para cada muestra se normalizaron frente a un gen doméstico con niveles de expresión consistentes bajo diferentes condiciones de cultivo (1T5001704; SEQ ID NO:69) y los niveles de expresión relativa se calcularon mediante el uso del método ddCT mediante el uso del programa BioRad's CFX Manager.

La Figura 12B muestra que varias de las cepas tienen una reducción en los niveles de transcripción de ZnCys-2845. De estas, las cepas GE-13108 (Bash-2 de ZnCys-2845) y GE-13109 (Bash-3 de ZnCys-2845), que se dirigen al extremo 5' del gen ZnCys-2845, y la cepa GE-13112 (Bash-12 de ZnCys-2845), que se dirige al extremo 3' del gen ZnCys-2845, se seleccionaron para ensayos de productividad.

Ejemplo 8

Construcción de bloqueo de expresión por ARNi

En otra estrategia para determinar si la disminución de la expresión del gen ZnCys-2845 permitiría a las células acumular más carbono que la desactivación génica por Cas9 mientras que aún produce un aumento en las cantidades de lípidos con respecto al tipo salvaje, se diseñó una construcción de ARN de interferencia (ARNi) para la expresión en células de Nannochloropsis. La construcción incluye una secuencia diseñada para formar una horquilla que incluye una secuencia homóloga a una región del gen ZnCys-2845 (SEQ ID NO:70), seguida de una secuencia de bucle y después seguida de la secuencia inversa a la secuencia homóloga del gen ZnCys-2845, controlado por el promotor EIF3 de N. gaditana (SEQ ID NO:46) y seguida del "terminador 9" de N. gaditana (SEQ ID NO:71). La construcción también incluye un gen que codifica GFP con codones optimizados para Nannochloropsis (SEQ ID NO:36) bajo el control del promotor 4AIII de Nannochloropsis (SEQ ID ⁿO:37) y seguido del "terminador 5" (SEQ ID NO:38), así como también un gen que confiere resistencia a higromicina (SEQ ID NO:45) controlado por el promotor TCTP (SEQ ID NO:34) y que termina por el terminador EIF3 (SEQ ID NO:35). La construcción se linealizó y se transformó en WT-3730 tipo salvaje de Nannochloropsis gaditana por electroporación como se describe.

Las colonias resistentes a higromicina se cribaron en busca de la presencia de la construcción de ARNi y las cepas positivas se cribaron adicionalmente por qRT-PCR como se describe en el Ejemplo 7 para el bloqueo de expresión de los niveles de transcripción de ZnCys-2845.

Ejemplo 9

Construcciones de bloqueo de expresión en ensayos por lote

La cepa GE-13103 de ARNi de ZnCys-2845 y las cepas "basher" con bloqueo de expresión de ZnCys-2845 GE-13108, GE-13109, y GE-13112 se probaron en el ensayo de productividad por lote que se describe en el Ejemplo 4 mediante el escalado de los cultivos en medio de cultivo PM124 (que incluye tanto NH4 como NO3 como fuentes de nitrógeno) y al llevar a cabo el ensayo en medio de cultivo PM123 que incluye nitrato como la única fuente de nitrógeno. La cepa GE-8564 con desactivación génica de ZnCys-2845 y la cepa de fondo tipo salvaje se procesaron en el mismo ensayo como controles.

Los resultados, que se proporcionan en las Tablas 16-18 y mostrados en las Figuras 13A-C, fueron sorprendentes. Todos los mutantes de atenuación de genes, que incluyen el GE-8564 mutante por desactivación génica original (triángulos), produjeron FAME en cantidades mayores que el tipo salvaje (círculos) cuando se cultivaron con nitrato como la única fuente de nitrógeno en todos los días que se muestrearon (Figura 13A, datos que se proporcionan en la Tabla 16). Sin embargo, mientras que la cepa ^g E-8564 con desactivación génica original (triángulos) tiene una reducción de forma significativa de la tasa de acumulación de carbono orgánico total con respecto al tipo salvaje (Figura 13B), en estas condiciones, las cepas con bloqueo de expresión atenuadas - las cepas "bash" y la cepa de ARNi que tienen una reducción de la expresión del gen ZnCys-2845 - tiene tasas de acumulación de ^t O^c cercanas o (por ejemplo, en el caso de GE-13112 (que se representa como X)) esencialmente idénticas al, tipo salvaje (Figura 13B, datos que se proporcionan en la Tabla 17). Sorprendentemente, estos mutantes por bloqueo de expresión de ZnCys-2845 demostraron relaciones de FAME a TOC que se potenciaron de forma significativa con respecto al tipo salvaje (Figura 13C y Tabla 18), aunque no tan altas como las relaciones de FAME a TOC del GE-8564 mutante por desactivación génica de ZnCys-2845, es decir, la división de carbono en lípidos en estas cepas con bloqueo de expresión fue intermedia entre la cepa tipo salvaje y la cepa con desactivación génica de ZnCys-2845.

Tabla 17. Productividad de TOC de cepas con bloqueo de expresión de ZnCys-2845 en comparación con el tipo salvaje en el ensayo por lote con medios de cultivo que contienen NO3 (mg/L de cultivo)

La Figura 14A proporciona un diagrama del gen ZnCys-2845 y la Figura 14B proporciona un gráfico que muestra los niveles de ARN de ZnCys-2845 normalizados en cepas que se cultivan que tienen mutaciones BASH de inserción (cepas "basher" GE-13109 y GE-13112), la construcción de ARNi (cepa GE-13103 de ARNi de ZnCys -2845), o la mutación de desactivación génica (KO) (GE-8564 mutante por desactivación génica de ZnCys-2845) como se cuantifica por PCR mediante el uso de los métodos que se proporcionan en el Ejemplo 7. La cepa GE-13109 BASH-3 de ZnCys demuestra una reducción de aproximadamente un 20 % en el nivel de transcripción de ZnCys-2845, la cepa GE-13112 BASH-12 de ZnCys demuestra una reducción de aproximadamente un 50 % en el nivel de transcripción de ZnCys-2845 y el ARNi de ZnCys-2845 que se aísla (GE-13103) demuestra una reducción de aproximadamente un 70 % en el nivel de transcripción de ZnCys-2845. La Figura 14C proporciona un gráfico de la relación FAME/TOC y la productividad de TOC de cada cepa en base a un ensayo por lote en medio solo de nitrato como se describe anteriormente, excepto que en el ensayo de la Figura 14C, la cepa GE-8564 con desactivación génica de ZnCys-2845 no se cultivó previamente en presencia de amonio sino en medio solo de nitrato. Como se resume en la Figura 14C, en el crecimiento por lote sin nitrato, las tres líneas de atenuación del gen ZnCys-2845 exhibieron aumentos en la división de carbono a lípidos evidentes en las relaciones FAME/TOC (ver también Tabla 18) que fueron intermedias entre las relaciones FAME/TOC del tipo salvaje y la desactivación génica de ZnCys (cepa GE-8564). La acumulación de TOC en los mutantes por bloqueo de expresión fue casi equivalente a la del tipo salvaje (la cepa GE-13103 de ARNi-7 de ZnCys que tiene el mayor deterioro de solo aproximadamente un 20 %), lo que muestra una mejora sustancial en la reducción mostrada en el mutante por desactivación génica de ZnCys-2845 que demuestra una reducción de aproximadamente un 85 % en la productividad promedio diaria de TOC (Figura 14C). Los valores diarios de FAME y TOC del ensayo por lote del que se derivan los datos de la Figura 14C se proporcionan en los gráficos de las Figuras 15A y 15B.

Ejemplo 10

Mutantes por bloqueo de expresión de ZnCys-2845 en el ensayo de productividad semicontinuo

La cepa GE-13103 de ARNi de ZnCys-2845, la cepa GE-13108 de BASH2, la cepa GE-13109 de BASH3, y la cepa GE-13112 de BASH12 se ensayaron después en el ensayo de productividad semicontinuo que se describe en el Ejemplo 6, excepto que en este caso el medio del ensayo, PM074, incluya nitrato como la única fuente de nitrógeno y las cepas con bloqueo de expresión se cultiven previamente en medio PM124 que incluye amonio 5 mM además de nitrato 8,8 mM. Para la cepa GE-13103 de ARNi de ZnCys-2845, la productividad se ensayó de dos maneras: se inoculó un primer conjunto de cultivos de ensayo semicontinuo mediante el uso de cultivos de inicio que incluyen el medio de cultivo PM074 solo de nitrato, y se inoculó un segundo conjunto de GE-13103 de cultivos de ensayo semicontinuo mediante el uso de cultivos iniciadores que incluyen amonio 5 mM además de nitrato 8,8 mM (medio PM124).

Los cultivos de inicio se usaron para inocular matraces rectangulares de cultivo de tejidos de 225 cm2, cada uno de los cuales contiene un volumen total final de 550 mL de cultivo después de la inoculación. Los cultivos se inocularon de modo que cada cultivo de 550 mL tuviera una DO730 inicial de 0,9. Un volumen de inóculo típico fue de aproximadamente 200 mL de cultivo escalado que se añadió a aproximadamente 350 mL de medio de cultivo de ensayo, que fue PM074 (medio solo de nitrato). Los cultivos se diluyeron diariamente al mediodía, cuando la intensidad de la luz se encontraba en su pico, mediante la eliminación de un 30 % del volumen (165 mL) y reemplazándolo con el mismo volumen del medio de ensayo (PM074) más 10 mL adicionales de agua desionizada para compensar la evaporación (que se incluye en el medio de compensación). Por tanto, los cultivos de ensayo que se inoculan a partir de cultivos escalados de ARNi de ZnCys-2845 que incluyen amonio 5 mM en el medio de cultivo (medio PM124) comenzaron con una cantidad significativa de amonio (por ejemplo, aproximadamente amonio 2 mM o menos) que disminuye progresivamente y se diluyó adicionalmente durante el transcurso del ensayo. Los ensayos semicontinuos se procesaron típicamente por 10-14 días. Las productividades diarias de lípidos y biomasa solo se calcularon para cultivos que habían alcanzado el estado estacionario (donde el aumento en el crecimiento fue igual al factor de dilución para el ensayo).

Durante el transcurso del ensayo semicontinuo, las diluciones diarias al 30 % fueron con medio solo de nitrato (PM074) para todos los cultivos. En estos ensayos, se produjeron muchos más lípidos diariamente por células GE-13103 con bloqueo de expresión por ARNi escaladas en medio solo de nitrato en el ensayo semicontinuo (círculos rellenos, Figura 16A) en comparación con las células tipo salvaje que se encontraban en condiciones ricas en nitrógeno (diamantes). La cantidad de lípido que se produce diariamente por la cepa GE-13103 fue incluso más alta cuando el medio de cultivo escalado incluyó amonio además de nitrato (círculos abiertos en la Figura 16A). La cepa GE-13108 de BASH2 (X), la cepa GE-13109 de BASH3 (triángulos), y la cepa GE-13112 de BASH12 (cuadrados) también produjeron considerablemente más FAME en el ensayo semicontinuo que la cepa tipo salvaje.

La Figura 16B proporciona la cantidad diaria de FAME que se produce por las cepas con bloqueo de expresión en el ensayo semicontinuo que incluye nitrato como la única fuente de nitrógeno en el medio de cultivo (medio PM074). Las cepas con bloqueo de expresión, que incluyen GE-13108 (Bash25'), GE-13109 (Bash35'), GE-13112 (Bash12 3'), y Ge -13103 (ARNi-7) se cultivaron previamente en el medio PM124 de nitrato más amonio. La cepa g E-13103 con bloqueo de expresión por ARNi también se ensayó después que se cultivó previamente en medio solo de nitrato (PM074), junto con la cepa WT-3730 tipo salvaje que se cultivó previamente en medio solo de nitrato (PM074) (que es un medio rico en nitrógeno para la cepa tipo salvaje). La cepa GE-8564 con desactivación génica se cultivó por separado en medio solo de nitrato (PM074) como el medio de cultivo que se usa en el ensayo semicontinuo. La tabla de la Figura 16B demuestra que todas las cepas con bloqueo de expresión tienen productividades más altas que la cepa tipo salvaje cuando se cultivan en el ensayo semicontinuo con dilución regular mediante el uso de un medio de cultivo en el que el nitrato fue sustancialmente la única fuente de nitrógeno (PM074). En este ensayo, la cepa GE-13112 con bloqueo de expresión (BASH12), demuestra que la producción de una cantidad promedio diaria de FAME fue un 83 % mayor que la de tipo salvaje, y la cepa GE-13109 con bloqueo de expresión (BASH3), demuestra que la producción de una cantidad promedio diaria de FAME fue un 81 % mayor que la de tipo salvaje en nitrato. La cepa GE-13108 con bloqueo de expresión (BASH2), demuestra que la producción de una cantidad promedio diaria de FAME fue un 88 % mayor que la de tipo salvaje que se diluye con el mismo medio de cultivo (PM074) en el transcurso del ensayo. Por tanto, todos los mutantes con bloqueo de expresión por inserción que se dirigen a regiones sin codificación del gen ZnCys-2845 demostraron aumentos sustanciales en la productividad de área de FAME de al menos un 70 % más altas (y aproximadamente un 80 %-90 % más alto), que las células tipo salvaje en medio de cultivo solo de nitrato, con solo una disminución mínima de la productividad de TOC de aproximadamente un 5-15 % en las cepas GE-13108 (BASH2), GE-13112 (BASH12), y GE-13103 de ARNi-7 en comparación con la cepa tipo salvaje (Figura 16C). La cepa GE-13103 de ARNi-7 que se cultiva previamente en medio solo de nitrato que se produce es en promedio un 107 % más de FAME diariamente que el tipo salvaje que se cultiva bajo las mismas condiciones. La cepa GE-13103 de ARNi-7 que se cultiva previamente en un medio que incluye ambos, amonio más nitrato que se produce es en promedio un 122 % más de FAME diariamente que el tipo salvaje que se cultiva bajo las mismas condiciones. Por tanto, el mutante de atenuación del gen GE-13103 produjo al menos el doble de lípidos que el tipo salvaje en un ensayo semicontinuo en el que los cultivos se diluyeron regularmente con medio solo de nitrato, independientemente de la fuente de nitrógeno en el medio de cultivo previo. El mutante por desactivación génica, GE-8564, también produjo algo más de FAME que el tipo salvaje en el ensayo, aunque el aumento no fue tan grande como para los mutantes por bloqueo de expresión (aproximadamente un 40 % mayor que cuando ambos se cultivaron en medio solo de nitrato). La cantidad de FAME que se produce por el GE-8564 mutante por desactivación génica que se cultiva en medio de solo nitrato cae drásticamente comenzando aproximadamente el día 6 del cultivo, lo que refleja grandes pérdidas de biomasa (Tabla 20).

Estas mejoras en la productividad de FAME por las cepas con bloqueo de expresión se presentan como un aumento del porcentaje sobre el tipo salvaje, que se promedia en la duración del cultivo, en la Tabla 19. Todas las cepas con bloqueo de expresión (GE-13103, g E-13108, GE-13109, y GE13112) tienen aumentos en la productividad de FAME (es decir, g/m2/día) con respecto al tipo salvaje en el transcurso del cultivo, que varía de 81 % a 122 % en el transcurso del cultivo completo, con aumentos de productividad aún mayores que se ven en los primeros cuatro días de cultivo, que varían de 100 % (es decir, el doble de la productividad tipo salvaje) a 160 %. GE-13103, la cepa con bloqueo de expresión por ARNi, tiene el aumento más grande de productividad con respecto al tipo salvaje en el transcurso del cultivo semicontinuo, aproximadamente un 100 % de mejora (cuando se cultiva previamente en PM074) y aproximadamente un 120 % de mejora (cuando se cultiva previamente en PM124).

T l 1. Pr ivi FAME l n l x r i n iv i n ni m2 í

La cantidad de TOC que se acumula diariamente por las cepas con bloqueo de expresión fue solo de leve a modestamente menos que el TOC que se acumula por el tipo salvaje en cultivos con bloqueo de expresión, GE-13109 (Bash-35') y GE13112 (Bash-12 3') aunque fue inferior de forma significativa en GE-13108 (Bash-2 5') y la cepa GE-8564 con desactivación génica que se cultiva en medio solo de nitrato (Figuras 16C y Tabla 20). Sin embargo, la productividad de TOC en la cepa con bloqueo de expresión por ARNi (GE-13103) que exhibe un aumento de aproximadamente un 100 % en la productividad de FAM^e en 11 días (y aproximadamente un 120 % que aumenta cuando se cultiva previamente con amonio) se redujo solo aproximadamente un 18 % con respecto al tipo salvaje, y las productividades de TOC de las cepas mutantes por bloqueo de expresión GE-13112 y ^g E-13109 de BASH-12 y BASH-4 (que demostraron aumentos de al menos un 80 % en la productividad de FAMe en once días) disminuyeron por solo un 5 % o menos.

Tabla 20. Productividad promedio diaria de TOC de cepas con bloqueo de expresión y desactivación génica

Todos los cultivos con bloqueo de expresión y desactivación génica de ZnCys-2845 demostraron un aumento de las relaciones de FAME a TOC en comparación con el tipo salvaje (diamantes sólidos) en el ensayo semicontinuo en medio de nitrato (Figura 16D y Tabla 21). Cuando se escala en medio solo de nitrato, la cepa GE-13103 con bloqueo de expresión por ARNi (círculos cerrados) demuestra un aumento superior al 100 %, un aumento de aproximadamente un 150 %, en la relación FAME/TOC con respecto al tipo salvaje y la misma cepa GE-13103 escalada en medio de nitrato más amonio (círculos abiertos) demostraron un aumento de un 153 % en su relación FAME a TOC en el ensayo de productividad semicontinuo (Tabla 21).

Tabla 21. Relaciones FAME/TOC de cepas con bloqueo de expresión y desactivación génica

Estas células con bloqueo de expresión diseñadas por ingeniería genética fueron capaces de dividir más de su carbono en lípidos que el tipo salvaje (Figura 16D). El aumento de las relaciones FAME/TOC fueron particularmente notables en la cepa de atenuación GE13103 de ARNi de ZnCys, ya que solo tienen reducciones modestas en TOC (entre aproximadamente un 15 % y aproximadamente un 20 %, Tabla 20) que se acopla con un aumento de FAME con respecto al tipo salvaje a lo largo del ensayo (aumento mayor que 100 %, un aumento de aproximadamente un 120 %, Tabla 19).

Se proporcionan gráficos de productividades volumétricas de FAME y TOC tipo salvaje, línea GE-6791 del editor de Cas9 y líneas con bloqueo de expresión de ZnCys-2845 GE-13112 (BASH-12A), GE-13109 (BASH-3A), y GE-13108 (BASH-2A) que se ensayan en un ensayo semicontinuo por separado mediante el uso de medio solo de nitrato en las Figuras 17A y 17B (datos que se proporcionan en la Tabla 22 y Tabla 23), y las productividades promedio por área de TOC y FAME (g/m2/día) de la cepa tipo salvaje y la línea del editor de Cas9 (como controles) y los mutantes BASH-3, BASH-12 y ARNi (los que se cultivan previamente en medio solo de nitrato) en este ensayo se resumen en el gráfico de la Figura 18, donde se puede ver que la cepa de ARNi tiene la productividad de FAME más alta de los mutantes que se prueban.

Tabla 22. Productividad promedio diaria de FAME de cepas con bloqueo de expresión en un ensayo semicontinuo mediante el uso de medio solo de nitrato

Tabla 23. Productividad promedio diaria de FAME de cepas con bloqueo de expresión en un ensayo semicontinuo mediante el uso de medio solo de nitrato

Los aumentos en FAME/TOC fueron menores de forma significativa al comienzo del período de cultivo en los cultivos de atenuación de ARNi de ZnCys que se habían cultivado previamente en un medio que contiene una mezcla de nitrato y amonio que en los cultivos de atenuación de ARNi de ZnCys que se habían cultivado previamente en un medio que contiene solo nitrato (Figura 16D). Por tanto, parecía que las cepas que se cultivaron previamente en medio de nitrato más amonio incluyen nitrógeno reducido (amonio) del cultivo previo que se introdujo en los cultivos de ensayo, y este amonio residual reprime la biosíntesis de lípidos en algún grado. Este efecto desapareció al quinto día del ensayo (ver Figura 16A, círculos abiertos (cepa de ARNi que se cultiva previamente con amonio en el medio) frente a círculos sólidos (cepa de ARNi que se cultiva previamente solo con nitrato en el medio)), momento en el que la tasa de producción de lípido por la cepa de atenuación de ARNi de ZnCys no difiere de forma significativa entre cultivos que se han inoculado con un cultivo de siembra que incluía amonio y nitrato y cultivos que se han inoculado con un cultivo de siembra que incluye solo nitrato como fuente de nitrógeno. En este punto, presumiblemente, los cultivos que se han cultivado previamente en un medio que incluye amonio se quedaron sin su fuente de nitrógeno reducido e indujeron la biosíntesis de lípidos en aproximadamente el mismo grado que los cultivos que no se han cultivado previamente en un medio que contiene amonio. Esta interpretación se apoyó por el análisis del nitrógeno presente en los cultivos. Para el análisis de nitrógeno total (TN) de los sedimentos celulares, se centrifugaron muestras de cultivo de 10 mL, el medio que se elimina de los sedimentos, y cada sedimento se resuspendió en 1 mL de H2O nanopura, que se transfirió después a un vial de 22 mL, para lo que se añadieron 19 mL de H2O nanopura. El análisis de nitrógeno total se realizó mediante el uso de un analizador Shimadzu TOC-V^{c s h} /VN^{m - 1 .} La Figura 19 muestra que la cantidad de nitrógeno total en los sedimentos celulares fue más alta de forma significativa en los cultivos GE-13103 que se han inoculado con un cultivo previo que incluye amonio en el medio (círculos abiertos) que en los cultivos que se habían inoculado con un cultivo previo que incluye solo nitrato (NO3) (por ejemplo, círculos cerrados). Por tanto, parecía que las células de atenuación de ARNi de ZnCys, mientras que son capaces de utilizar nitrato para el crecimiento (como se evidencia por la acumulación continua de TOC, por ejemplo, Figura 16C), aún inducen la biosíntesis de lípidos siempre que el amonio se encuentre presente en bajas concentraciones, por ejemplo, de menos de aproximadamente 2 mM o menos de aproximadamente 1,5 mM.

La relación entre la cantidad de amonio presente en los cultivos de la cepa GE-13103 de ARNi de ZnCys-2845 durante los ensayos semicontinuos se investigó en ensayos de productividad semicontinuos que se realizan como se describe anteriormente en los que se analizaron muestras diarias para determinar el contenido de nitrógeno de todo el cultivo (medio de cultivo más células) así como también el contenido de FAME como se describe en los ejemplos anteriores.

La Figura 20 muestra gráficamente la cantidad de FAME y nitrógeno presente en el cultivo en días sucesivos de cultivo semicontinuo. El nitrógeno total (TN) del cultivo total se determinó mediante la eliminación de una muestra de 2 mL del cultivo a un vial de 22 mL, al que se añadieron 18 mL de H2O nanopura, y al analizar la muestra con un analizador Shimadzu TOC-VCS^h /VN^{m - 1}. La cantidad de nitrato que se podría contabilizar en el medio PM074 se sustrajo del nitrógeno total de la muestra para llegar a la cantidad de nitrógeno presente como amonio que se indica en la Figura 19. Debido a que el amonio presente en el cultivo de inicio PM124 se diluyó progresivamente de los cultivos que se inocularon con PM124 (cultivos de inicio de NH4+NO3), se puede ver que, para esta muestra, la producción de FAME (diamantes abiertos) aumenta a medida que la concentración de amonio (diamantes macizos) cae. Los niveles de amonio en el cultivo más abajo de aproximadamente 2,5 mM, y especialmente más abajo de aproximadamente 2 mM, parecieron dar como resultado la inducción de la producción de FAME en la cepa de ARNi atenuada (diamantes abiertos).

Ejemplo 11

Relación de la productividad de los mutantes de atenuación de ZnCys-2845 con la concentración disponible de NH4

La relación entre la disponibilidad de nitrógeno y la productividad de FAME en la cepa GE-13103 de ARNi de ZnCys-2845 se investigó adicionalmente en un ensayo de productividad semicontinuo como se describe en el Ejemplo 10, excepto que el ensayo semicontinuo se realizó en tres medios de cultivo por separado en los que la concentración de amonio se mantuvo constante en tres niveles diferentes. En el ensayo también se incluyó Nannochloropsis gaditana (WT-3730) tipo salvaje, donde la cepa tipo salvaje se cultivó en el medio estándar PM074 que no incluye amonio (pero incluye nitrato 8,8 mM como la única fuente de nitrógeno).

En este experimento, se usaron cultivos de inicio que incluyen medio de cultivo que contiene amonio 0,5 mM, 1,0 mM, o 2,5 mM además de nitrato 8,8 mM para inocular matraces de ensayo que incluyen medios de cultivo que incluyen la cantidad correspondiente de amonio (además de nitrato 8,8 mM). Después de alcanzar el estado estacionario, los cultivos se diluyeron de nuevo diariamente con el medio que se complementa con amonio, de modo que se inoculó un conjunto de cultivos por triplicado en el que el medio de ensayo incluye amonio 0,5 mM a partir de un cultivo de siembra que incluye amonio 0,5 mM y se diluyó diariamente con un medio que contiene amonio 0,5 mM a lo largo del ensayo, se inoculó otro conjunto de cultivos por triplicado a partir de un cultivo de siembra que incluye amonio 1,0 mM e incluye 1,0 mM a lo largo del ensayo, y se inoculó un tercer conjunto de cultivos por triplicado a partir de un cultivo de siembra que incluye amonio 2,5 mM e incluye amonio 2,5 mM a lo largo del ensayo. En cada caso, el medio fue PM074 que incluye nitrato 8,8 mM como la única fuente de nitrógeno que se puede usar por los microorganismos, que se complementa con la cantidad apropiada de NH4Cl, así como también con Hepes 5 mM, pH 7,5. Los resultados se pueden ver en las Tablas 22-24. Todas las muestras se ensayaron por triplicado, y los valores que se proporcionan son el promedio de los tres cultivos.

La Figura 21A muestra la cantidad de FAME presente en el cultivo en días sucesivos de cultivo semicontinuo para cultivos que se mantienen en amonio 0,5 mM, 1,0 mM, y 2,5 mM (diamante sólido y triángulos, que representan símbolos de ARNi). Se puede ver claramente que reducir la concentración de amonio del cultivo de 2,5 mM (cuadrados) a 1,0 mM (triángulos) aumenta la productividad de FAME, que aumenta aún más cuando la concentración de amonio se mantiene en 0,5 mM (X) (ver también la Tabla 24).

Tabla 24. Contenido diario de FAME (mg/L) de cultivos: Promedio de valores por triplicado de FAME (de)

La productividad de FAME se muestra en la tabla de la Figura 21B. La productividad de FAME de la cepa GE13103 con bloqueo de expresión en medio NH42,5 mM se reduce por aproximadamente un 15 % con respecto a la productividad de FAME tipo salvaje en medio solo de nitrato (que no induce la producción de lípidos en la cepa tipo salvaje). Sin embargo, a concentraciones inferiores de amonio, el mutante por bloqueo de expresión muestra una mayor productividad de FAME en el transcurso del ensayo que la cepa tipo salvaje. Por ejemplo, en un medio de cultivo en el que la concentración de amonio es 1 mM, la cepa mutante por bloqueo de expresión demuestra un aumento de la productividad promedio diaria de FAME de un 22 %, mientras que en amonio 0,5 mM, GE-13103 demuestra un aumento de la productividad promedio diaria de FAME de un 77 % con respecto a la cepa tipo salvaje, es decir, la cepa GE-13103 con bloqueo de expresión a una concentración de amonio muy baja produce casi el doble de lípidos FAME que el tipo salvaje.

Sin embargo, la Figura 21C muestra que la reducción de la concentración de amonio del medio de cultivo más abajo de NH42,5 mM no tiene un efecto importante sobre la acumulación de TOC por el mutante GE13103 por bloqueo de expresión (Tabla 25).

Por ejemplo, la productividad promedio diaria de TOC de la cepa muíante por bloqueo de expresión que se cultiva en amonio 0,5 mM fue esencialmente idéntica a la del tipo salvaje que se cultiva bajo condiciones ricas en nitrógeno (solo de nitrato) (Figura 21D). Por tanto, el GE-13103 mutante por bloqueo de expresión demuestra al menos un 75 % más de productividad de lípidos mientras que no demuestra reducción en la productividad de biomasa con respecto a las células tipo salvaje en condiciones ricas en nitrógeno en un período de al menos 10 días de cultivo. Como se muestra en la Figura 2 l F, los conteos celulares, como se determina por citometría de flujo, siguen siendo razonablemente consistentes para una concentración de amonio dada a lo largo del ensayo, lo que indica que las células se dividen activamente a lo largo del ensayo semicontinuo bajo todas las condiciones, lo que incluye las condiciones en las que se indujeron cultivos bajos en amonio para la biosíntesis de lípidos, como se indica por las elevadas relaciones FAME/TOC de los cultivos que contienen amonio 1 mM y amonio 0,5 mM (como se demuestra en la Figura 21E).

La relación de FAME a TOC del GE-13103 mutante por bloqueo de expresión que se cultiva en un medio que tiene concentraciones variables de amonio es mostrada en la Figura 21E. La relación de FAME a TOC sigue siendo entre aproximadamente 0,3 y 0,4 cuando la concentración de amonio se encuentra entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 2,5 mM, pero aumenta adicionalmente cuando la concentración de amonio cae de aproximadamente 1,0 mM a aproximadamente 0,5 mM, permaneciendo cerca de 0,5 a lo largo del ensayo mediante el uso de amonio 0,5 mM en el medio, por ejemplo dentro del intervalo de entre aproximadamente 4,0 y aproximadamente 6,0, y dentro de la región de entre aproximadamente 4,5 y aproximadamente 5,5 (ver Tabla 26).

Tabla 26. Relaciones FAME/TOC: Promedio de valores por triplicado de FAME/TOC (de)

Por tanto, las cepas que se obtienen mediante la atenuación de la expresión de un gen como se proporciona en la presente descripción que regula la biosíntesis de lípidos son capaces de dividirse activamente mientras que producen considerablemente más lípidos que el tipo salvaje. La capacidad de mantener niveles elevados de producción de lípidos sin una disminución en la acumulación de TOC a lo largo del ensayo (Figura 22), indica que los mutantes que se proporcionan en la presente descripción pueden proporcionar una producción de lípidos de alto nivel sostenido tal como en cultivos continuos y semicontinuos.

Ejemplo 12

Análisis del contenido de proteínas, carbohidratos, y lípidos de mutantes de ZnCys

En los experimentos anteriores (por ejemplo, Ejemplo 4), se encontró que las productividades de FAME y TOC de la cepa GE-8564 mutante por desactivación génica son esencialmente iguales a aquellas de la cepa tipo salvaje cuando ambas se cultivaron en presencia de amonio (Figuras 8A-C), lo que sugiere que un cuello de botella en la asimilación de nitrato condujo a fenotipos marcados de aumento de la producción de lípidos que se observaron solo cuando se usó nitrato como la única fuente de nitrógeno. Se observó que los mutantes por bloqueo de expresión de ZnCys-2845 exhiben aumentos sustanciales en la productividad de FAME (Tabla 16 y Figura 13A, así como también Figuras 16A y 16B) con disminuciones mínimas de TOC de aproximadamente 1 % a aproximadamente 33 % (Tabla 17 y Figura 13B; Figura 16C). Las productividades de FAME y TOC para un ensayo semicontinuo que incluye la cepa GE-13103, BASH-3 de ZnCys-2845, BASH-12 de ZnCys-2845, y ARNi de ZnCys-2845 tipo salvaje son mostrados en los gráficos de la Figura 17A y 17B, respectivamente. Los BASH-3 de ZnCys, BASH-12 de ZnCys, y ARNi ZnCys todos exhibieron aumentos sustanciales en la productividad aérea de FAME (hasta 103 % para ARNi-7 de ZnCys) con solo disminuciones mínimas de TOC de aproximadamente 5-15 % en comparación con la cepa tipo salvaje y la línea progenitora de Cas9 (Figura 18). Para determinar cómo se asignó el carbono a las categorías principales de biomoléculas, las cepas crecieron en el sistema de ensayo semicontinuo como se describe en el Ejemplo 10, donde el medio de dilución PM074 incluye nitrato como la única fuente de nitrógeno. En este ensayo la línea de ARNi demuestra un aumento en la productividad de FAME y la línea con desactivación génica es incapaz de mantener el crecimiento (Figuras 22A-D). Las cepas de estos cultivos se evaluaron para determinar carbohidratos, lípidos, y proteínas, que juntas contabilizan aproximadamente un 75 % de TOC.

Para el análisis de HPLC de los lípidos, muestras de 2 mL de cada cultivo se centrifugaron a velocidad máxima por 5 minutos, se eliminaron los sobrenadantes, y los sedimentos se resuspendieron en 400 pL de H2O. Las suspensiones celulares (aproximadamente 500 pL) se transfirieron a viales de vidrio de 4 mL con tapas que se revisten con teflón. Se añadieron 500 pL de perlas de vidrio (212-300 pm de diámetro) a cada una de las suspensiones celulares, después de lo cual se añadieron 50 pL de H2SO4 al 50 % y 100 pL de NaCI 5 M. El batido de perlas se realizó durante 5 minutos a 1 krpm, después se añadieron 2 mL de hexano a cada muestra y el batido de perlas se repitió por 5 minutos a 1 krpm. Las muestras se cargaron en un agitador en vórtex de múltiples tubos y se agitaron por 30 minutos a 1 krpm, y después se agitaron en vórtex por 30 segundos a 2,5 krpm. Se transfirieron 500 pL de la capa orgánica a un vial de HPLC, y se añadieron a cada vial 50 pL de solución de estándar interno (1 mg/mL de 6-cetocolestanol en tolueno). Los estándares fueron de NuCheck, Sigma-Aldrich, o Supelco. Los viales se taparon y se agitaron en vórtex brevemente (5 segundos a 2,5 krpm) antes del análisis por HPLC. E1HPLC se procesó a un régimen de flujo de 2 mL/minuto en una columna Chromegasphere SI-60 de 150 mm x 4,6 mm x 10 pm (ES Industries), con un compartimento de la columna que se establece a 40 °C. El volumen de inyección fue de 25 pL con una velocidad de extracción y eyección de 200 pL/minuto. El eluyente A fue hexano y el eluyente B fue una mezcla 80:10:10:1 de hexano, isopropanol, acetato de etilo, y ácido fórmico al 10 % en isopropanol, que se procesa como un programa de gradiente de la siguiente manera: B al 2 % a 0,0 minutos; B al 2 % a 1,0 minuto; B al 35 % a 8,0 minutos; B al 98 % a 8,5 minutos; B al 98 % a 11,5 minutos; B al 2 % a 11,6 minutos; tiempo de parada: 11,6 minutos; 5 minutos después del tiempo. El detector fue ELSD a 30 °C y N2 a 3,5 bar, con una ganancia de 5.

El análisis de carbohidratos totales se condujo en ~ 0,7 mg de equivalente de TOC del cultivo celular que se concentra a 0,5 mL en solución salina tamponada con fosfato (PBS) después de tres centrifugaciones seguidas de lavado con PBS. La hidrólisis ácida se usó para convertir carbohidratos a sus monómeros constituyentes mediante la adición de 0,5 mL de H2O desionizada y 1 mL de HCl 6 N y U-13C-glucosa y -galactosa como patrones internos a una concentración final de 50 pg/mL cada una. Las muestras se calentaron a 105 °C por una hora en viales de vidrio con tapas que se revisten con PTFE. Se secaron alícuotas de cien pL de las muestras que se enfrían a temperatura ambiente, que se centrifugan con 3000 g (1 minuto) en un EZ-2 Genevac (Stoneridge, NY) y se derivatizaron con MSTFA/TMCS y se analizaron por GC-MS de acuerdo con Ruiz-Matute y otros (2011) J. Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 879:1226-1240. Se usaron estándares internos marcados con C13 para cuantificar la concentración de los monómeros de carbohidratos, glucosa y galactosa principales, y estimar la concentración de azúcares menos abundantes (arabinosa, ramnosa, xilosa y manosa). Estos se sumaron para rendir una concentración total de sacárido en pg/mL que se convirtió en el contenido de carbono de los carbohidratos totales por un factor de multiplicación de 0,45 (es decir, ~un 45 % de la masa de carbohidratos se representa por carbono. Este valor se dividió por la cantidad de TOC que se detecta en una alícuota idéntica de cultivo celular concentrado para estimar el porcentaje de carbono que se asigna a los carbohidratos.

El análisis de aminoácidos totales se condujo mediante la derivatización de hidrolizado de aminoácidos totales a ésteres de propoxicarbonilpropilo mediante el uso de un método que se modifica de acuerdo con el estuche EZ:faast de Phenomenex (Torrance, CA). Brevemente, a 0,5 mL de células concentradas (como se describe anteriormente para el análisis de carbohidratos) se añadieron 800 pL de HCl 6 N que contiene 200 pL/mL de ácido tioglicólico, 10 pL de p-mercaptoetanol, y 200 pL de norvalina 2 mM (estándar interno) y la muestra que se agita en vórtex se incubó a 110 °C por 24 h. Las muestras que se enfrían a temperatura ambiente se centrifugaron a 1500 g por 1 minuto y se transfirió una alícuota de 50 pL a un vial GC nuevo de 2 mL. Las alícuotas se derivatizaron y analizaron por GC-MS de acuerdo con el manual EZ-faast y (8). Este método permite que la cuantificación de Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Pro, Asp Asn, Met, Glu Gln, Phe, Lys, Tyr, y Cys; Trp, Thr, Ser, Arg, y His se excluyera Las concentraciones volumétricas de cada aminoácido hidrolizado que se detecta se convirtieron en el contenido de carbono presente en esa cantidad. Estos valores se sumaron y normalizaron a TOC como se describe anteriormente para los carbohidratos totales para dar una estimación del carbono que se asigna a la proteína.

Los resultados se ven en la Figura 23, donde se puede ver que tanto los mutantes de ZnCys atenuados ZnCys-BASH-12 como ARNi de ZnCys tienen disminuciones de aproximadamente 45-50 % en proteína en comparación con la cepa tipo salvaje, lo que acompaña un aumento de aproximadamente un 90-125% aumento de lípidos en las cepas. Consistentemente, se observó que la cepa con desactivación génica de ZnCys tiene las relaciones de C:N más altas mientras que el ARNi de ZnCys muestra niveles más intermedios (Figura 22C), lo que sugiere que puede haber un valor umbral de C:N que maximiza la productividad de lípidos. La cepa con desactivación génica de ZnCys parece encontrarse más allá de ese umbral, dividiendo tanto carbono en lípidos que la biomasa y la productividad de lípidos general se ven afectadas negativamente. En contraste, en este conjunto de mutantes de atenuación de genes, el ARNi de ZnCys parece tener el valor de C:N óptimo para la productividad de lípidos en el intervalo de aproximadamente 10-15.

Tabla 27. % de composición de proteínas, carbohidratos, y lípidos (FAME) de cepas tipo salvaje y con bloqueo de expresión de ZnCys

La cepa GE-1112 de BASH-12 asigna aproximadamente un 38 % de su carbono a los lípidos FAME, y aproximadamente un 22 % de su carbono a la proteína, mientras que la cepa GE-13103 de ARNi asigna aproximadamente un 43 % de su carbono a los lípidos, y aproximadamente un 20 % de su carbono a la proteína. Esto se distingue de las células tipo salvaje en medio solo de nitrato que asigna aproximadamente un 20 % de carbono a los lípidos, y aproximadamente un 40 % de carbono a la proteína. (Tanto en las células mutantes como las de tipo salvaje, aproximadamente de un 10-15 % de carbono se asigna a los carbohidratos). Por tanto, ambos mutantes por atenuación del gen ZnCys ("bloqueo de expresión") aumentaron la asignación de carbono a los lípidos por un 90-120% (duplicando la productividad de lípidos con respecto al tipo salvaje) en gran parte a expensas de la asignación de carbono a la proteína, que cae en aproximadamente un 40-50 % con respecto a la asignación de carbono a la proteína en células tipo salvaje que se cultivan bajo las mismas condiciones.

Ejemplo 13

Análisis transcriptómico de los mutantes por desactivación génica y bloqueo de expresión de ZnCys-2845.

La capacidad de la cepa GE-8564 con desactivación génica de ZnCys-2845 para acumular FAME y TOC a niveles esencialmente idénticos a las células tipo salvaje cuando el medio de cultivo se complementó con amonio (Tablas 7­ 9, Figura 8), indica que el mutante se encontraba deteriorado en la asimilación de nitrato. Para investigar adicionalmente la asimilación de nitrógeno en estos mutantes, se determinaron los niveles de ARNm en estado estacionario de genes clave de asimilación de N por qRT-PCR para ganar una mejor comprensión de la deficiencia de N en los mutantes bajo condiciones que se inducen (medio solo de nitrato) y sin inducir (complementación con amonio).

Se diseñó un mutante de la nitrato reductasa mediante el uso de la misma línea del editor de Cas9 que se describe en el Ejemplo 2. Brevemente, se diseñó un ARN guía que tiene la secuencia diana de una porción de la región de codificación del gen de la nitrato reductasa Naga_100699g1 de N. gaditana. El ARN guía (que tiene la secuencia diana SEQ ID NO:193) se sintetizó como se describe en el Ejemplo 3, y se transformó en la línea del editor de Cas9 junto con el fragmento donante (SEQ ID NO:44) como se describe en el Ejemplo 2. La cepa con desactivación génica de la nitrato reductasa resultante (NR-KO) sirvió como control de la incapacidad para asimilar nitrato, ya que es necesaria una enzima nitrato reductasa funcional para asimilar nitrógeno cuando el nitrato es la única fuente de nitrógeno. Efectivamente, la cepa NR-KO se encuentra bajo inanición de nitrógeno cuando se cultiva en medio solo de nitrato.

Los niveles de ARNm en estado estacionario de genes clave de asimilación de N se evaluaron por qRT-PCR para ganar una mejor comprensión de la deficiencia de N en los mutantes bajo condiciones que se inducen (NO3') y sin inducir (NH4+), donde el mutante de la nitrato reductasa (NR-KO) que se crea por mutagénesis mediada por Cas9 se usó como un control de inanición de N bajo crecimiento en NO3-. Cuando crecen en un medio que incluye amonio, todas las cepas compartieron perfiles de expresión génica similares para el conjunto de genes de asimilación de N, consistente con su fenotipo tipo salvaje con respecto a la acumulación de biomasa y FAME cuando se cultivaron con medio que contiene amonio (Figura 24, perfiles de transcripción de amonio de la desactivación génica de ZnCys, bloqueo de expresión por ARNi de ZnCys, el tipo salvaje y con desactivación génica de NR mostrados en las columnas 2-5).

Tabla 28. Secuencias de cebadores para transcripciones que se miden por PCR en tiempo real

cuantitativo

Sin embargo, cuando crece en nitrato como la única fuente de nitrógeno, NR-KO muestra un perfil de expresión radicalmente diferente de las líneas mutantes de ZnCys (Figura 24, columna 1 en comparación con las columnas 6 y 7 que muestran perfiles de transcripción de mutantes por desactivación génica de ZnCys-2845 y bloqueo de expresión por ARNi). Consistente con reportes previos de N. gaditana privada de N (Radakovitz y otros 2012), un gran número de genes que se involucran en la asimilación de N se regularon positivamente de forma severa en el NR-KO (mostrado en color rojo), que incluye dos transportadores de amonio (AMT1 y AMT2), una glutamato sintasa (GOGAT1), un transportador de NO3" (NRT2) y nitrito reductasa (NiR). Curiosamente, esta respuesta no se observó para mutantes de ZnCys. De hecho, los perfiles de expresión génica para los mutantes diseñados con desactivación génica de ZnCys-2845 y bloqueo de expresión por ARNi de ZnCys-2845 se asemejan más al tipo salvaje bajo estas condiciones, aunque NiR y NRT2 se regularon negativamente de forma significativa en la desactivación génica de ZnCys-2845 con respecto al tipo salvaje, lo que ofrece por tanto una posible explicación a la deficiencia de N de las células (Figura 22C). El análisis de los niveles de proteína mediante transferencia Western muestra que la nitrato reductasa no se podría detectar en extractos de la cepa GE-8564 con desactivación génica de ZnCys-2845, mientras que se detectó una señal en los extractos de la cepa GE-13103 con bloqueo de expresión por ARNi de ZnCys-2845, así como también en extractos tipo salvaje (Figura 25). Asimismo, se observó una señal muy débil para la enzima de asimilación de nitrógeno glutamina oxoglutarato aminotransferasa (GOGAT1) en GE-8564, mientras que fue más evidente para GE-13103.

Los cambios en el nivel de proteínas en la maquinaria biosintética de lípidos plástidos también se evaluaron mediante el uso de anticuerpos peptídicos específicos frente a ACCasa y componentes de la vía de síntesis de ácidos grasos (FAS) (F igu ra 25). Para la producción de anticuerpos, se sintetizaron dos péptidos ((#1 y #2 en la T a b la 29) y se inyectaron en conejos. Las cisteínas terminales son mostradas como referencia.

Tabla 29. Secuencias peptídicas que se usan para generar anticuerpos que detectan enzimas de biosíntesis de ácidos grasos en N. gaditana.

En comparación con el tipo salvaje, los niveles de estas enzimas no fueron notablemente más altos en los mutantes de ZnCys, y en el caso de NR-KO, ACCasa y KAR1 se redujeron. Estos datos sugieren que bajo condiciones ricas en N, la maquinaria biosintética de lípidos plástidos ya se encuentra presente a una capacidad que es capaz de al menos duplicar el flujo a ácido graso dado el aumento de ~ 100 % en la productividad de FAME que se observa en la cepa GE-13103 con bloqueo de expresión por ARNi de ZnCys-2845. Esta conclusión es consistente con cambios de transcripción que se observan para Nanocloropsis privada de N, donde las vías que se involucran en proporcionar precursores de carbono a la biosíntesis de lípidos parecen expresarse de forma más diferencial que las vías biosintéticas de lípidos "centrales" (Radakovitz y otros 2012, Carpinelli y otros 2014, Li y otros 2014).

Con el fin de ganar información adicional de los mecanismos que permiten que las líneas atenuadas de ZnCys-2845 produzcan de forma constitutiva lípidos y mantengan el crecimiento, analizamos los perfiles de transcripción globales de la cepa GE-13103 de ARNi de ZnCys-2845 durante condiciones de crecimiento en estado estacionario (por ejemplo, F igu ra 17 ). Mediante el uso de un límite de 2 veces y FDR <0,05, se encontraron 1118 genes que se expresaban de forma diferencial entre ZnCys-ARNi-7 y el tipo salvaje en medio de cultivo solo de nitrato. De estos, 790 se regularon positivamente y 328 se regularon negativamente en el mutante. El análisis del conjunto de genes regulados negativamente para las categorías de ontología genética que se enriquecen (GO) por "función molecular", "proceso biológico" o "componente celular" revela que los genes que se involucran en la fotosíntesis y la cosecha de luz se sobrerrepresentan en el mutante con respecto al tipo salvaje (T abla 30).

Tabla 30. Categorías de ontología genética que se sobrerrepresentan correspondientes a genes que se regulan negativamente en ZnCys _ARNi-7

El mismo análisis que se conduce en el conjunto de genes regulados positivamente revela que los componentes de síntesis de proteínas se enriquecieron de forma significativa en la cepa GE-13103 de ARNi ZnCys-2845 atenuada (T ab la 31). Considerando que nuestro análisis de la composición de biomasa indica una disminución de aproximadamente un 45 % en el contenido de proteína total en GE-13103 (F igu ra 23), la regulación positiva de la maquinaria de traducción y la regulación negativa del aparato fotosintético es probablemente una respuesta a ese déficit.

Tabla 31. Categorías de ontología genética (GO) que se sobrerrepresentan correspondientes a genes que se r l n iiv m n n l E-1 1 ARNi Zn -2 4

Consistente con nuestros hallazgos de qRT-PCR (F igu ra 24), el análisis de los genes de asimilación de N revela algunos genes clave regulados negativamente que podrían contabilizar los bajos niveles de N en el mutante, que incluye la nitrito reductasa, dos glutamina sintetasas (GS1 y GS2), un transportador de amonio (AMT1) y una enzima clave que se involucra en la biosíntesis del cofactor de molibdeno (MoeA/CNX1), un cofactor que es esencial para la actividad de la nitrato reductasa (T abla 29).

Tabla 32. Niveles promedio de transcripción y cambios pliegues de genes que se expresan de forma diferencial ue se involucran en la asimilación de N

El análisis de categoría de GO no encuentra un enriquecimiento estadístico para genes que se involucran en la biosíntesis de lípidos. Sin embargo, cuando la lista se conserva manualmente, se identificaron 26 genes que se relacionan con la biosíntesis de glicerolípidos como regulados positivamente mediante el uso del mismo criterio de filtración que el anterior (T abla 30). Estos genes incluyen seis ácidos grasos desaturasas, elongasas, lipasas y aciltransferasas de especificidad de sustrato desconocida, y la proteína de superficie de gotas lipídicas (LDSP) que se cree que es el principal componente estructural de la gota lipídica (Vieler y otros (2012) Plant Physiol. 158:1562-1569).

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Un microorganismo de alga eucariota muíante que tiene una expresión atenuada de un gen que codifica un polipéptido que contiene eldominio de unión alADN tipofúngico Zn(2)Cys(6), en donde el polipéptido del dominio de unión alADN tipofúngicoZn(2)-C(6)tienealmenos un 65 % de identidadcon una secuencia de aminoácidos seleccionada delgrupo que consiste de: SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13,SEQ IDNO:14,SEQ IDNO:15ySEQ IDNO:16,endondeelmutanteproducealmenosun50% más de lípidosderivatizablesde ésteresmetílicosde ácidosgrasos (lípidosFAME) que un microorganismo controldel quesederivadirectamenteelmicroorganismomutante,quenotieneunaexpresiónatenuadadelgenyalmenos un 70% delacantidaddebiomasaacumuladaporelmicroorganismocontrolcuandoelmicroorganismomutante y el microorganismo control se cultivan bajo condiciones ricas en nitrógeno bajo las que el microorganismo controlseencuentraacumulandobiomasa.

2. Un microorganismodealgaeucariotamutante de acuerdocon lareivindicación 1,en donde elmicroorganismo mutanteesunmutantedeobtenciónclásicaounmutantediseñadoporingenieríagenética.

3. Un microorganismodealgaeucariotamutantedeacuerdocon lareivindicación1,en donde lascondicionesde cultivosonricasennutrientesconrespectoalmicroorganismocontrolyadicionalmenteendondelascondiciones de cultivosonporlote,continuasosemicontinuas.

4. Un microorganismodealgaeucariotamutantedeacuerdocon lareivindicación1,en donde lascondicionesde cultivoincluyenun mediodecultivoquecomprende menos de2,5mM, menos de 1mM omenos de0,5mM de amonio,endondedeformaopcionalelmediodecultivocomprendenitratoourea.

5. Un microorganismodealgaeucariotamutante de acuerdocon lareivindicación1,en donde elmicroorganismo mutanteproducealmenos un50%, almenos un60%, almenos un75% oalmenos un 100 % más de lípidos FAME que unmicroorganismocontrolmientrasqueacumulaalmenos un70%, almenos un80%, almenos un 90 % oalmenos un95% delacantidaddebiomasaacumuladaporelmicroorganismocontrolenunperíodode cultivodealmenostres,almenoscinco,almenossiete,almenos diezoalmenosdocedías.

6. Un microorganismode algaeucariotamutante de acuerdo con lareivindicación3,en donde elmicroorganismo tiene una relación C:N que es al menos 1,5 veces la relación C:N de un microorganismo control bajo las condiciones de cultivoen lasque elmicroorganismo mutante produce almenos un 50 % más de lípidosy al menos un70% delabiomasaqueelmicroorganismocontrol.

7. Un microorganismodealgaeucariotamutantede acuerdocon lareivindicación 1,en donde elmicroorganismo mutante exhibeuna relaciónde éstermetílicode ácidograso/carbonoorgánicototal(FAME/TOC) de almenos un 30%, almenos un40%, almenos un50%, oalmenos un 100% más altaqueunarelaciónFAME/TOC del microorganismo control mientras que acumula al menos un 70 % de la biomasa acumulada por el microorganismo control, cuando el microorganismo mutante y el microorganismo control se cultivan bajo condicionesidénticasbajolasqueelmicroorganismocontrolseencuentraacumulandobiomasa.

8. Un microorganismodealgaeucariotamutantedeacuerdoconcualquierade lasreivindicaciones1-7,en donde el microorganismo es una especie de Labyrinthulomycte, de forma opcional una especie de Labryinthula, Labryinthuloides, Thraustochytrium, Schizochytrium, Aplanochytrium, Aurantiochytrium, Oblongichytrium, Japonochytrium, Diplophrys, o Ulkenia.

9. Un microorganismodealgaeucariotamutantedeacuerdocon cualquierade lasreivindicaciones1-7,endonde el microorganismo es una especie de alga, de forma opcional una especie de Achnanthes, Amphiprora, Amphora, Ankistrodesmus, Asteromonas, Boekelovia, Bolidomonas, Borodinella, Botrydium, Botryococcus, Bracteococcus, Chaetoceros, Carteria, Chlamydomonas, Chlorococcum, Chlorogonium, Chlorella, Chroomonas, Chrysosphaera, Cricosphaera, Crypthecodinium, Cryptomonas, Cyclotella, Desmodesmus, Dunaliella, Elipsoidon, Emiliania, Eremosphaera, Ernodesmius, Euglena, Eustigmatos, Franceia, Fragilaria, Fragilaropsis, Gloeothamnion, Haematococcus, Hantzschia, Heterosigma, Hymenomonas, Isochrysis, Lepocinclis, Micractinium, Monodus, Monoraphidium, Nannochloris, Nannochloropsis, Navicula, Neochloris, Nephrochloris, Nephroselmis, Nitzschia, Ochromonas, Oedogonium, Oocystis, Ostreococcus, Parachlorella, Parietochloris, Pascheria, Pavlova, Pelagomonas, Phaeodactylum, Phagus, Picochlorum, Platymonas, Pleurochrysis, Pleurococcus, Prototheca, Pseudochlorella, Pseudoneochloris, Pseudostaurastrum, Pyramimonas, Pyrobotrys, Scenedesmus, Schizochlamydella, Skeletonema, Spyrogyra, Stichococcus, Tetrachlorella, Tetraselmis, Thalassiosira, Tribonema, Vaucheria, Viridiella, Vischeria y Volvox.

10.Una biomasaquecomprendeunmicroorganismodealgaeucariotamutantedecualquieradelasreivindicaciones Un métodoparaproducirlípidos,quecomprendecultivarelmicroorganismodealgaeucariotamutantedela reivindicación1yaislarlípidosdelmicroorganismo,elmediodecultivooambos.

El métododelareivindicación11,endondeelmicroorganismodealgaeucariotamutantesecultivaenunmedio quecomprendemenosde2,5mMomenosde1mMdeamonio,endondedeformaopcionalelmedioincluye nitratoourea.

El métododelareivindicación11,endondeelcultivoseencuentrabajocondicionesenlasquelarelaciónde éstermetílicode ácidograso/carbonoorgánicototal(FAMEaTOC)delmicroorganismodealgaeucariota mutantesemantieneentre0,3y0,9,entre0,4y0,8,oentre0,4y0,7.

Elmétododecualquieradelasreivindicaciones11-13,endondeelmicroorganismodealgaeucariotamutantees una especie de Labyrinthulomycte, de forma opcional una especie de Labryinthula, Labryinthuloides, Thraustochytrium, Schizochytrium, Aplanochytrium, Aurantiochytrium, Oblongichytrium, Japonochytrium, Diplophrys o Ulkenia, oendondeelmicroorganismomutanteesunaespeciedealga,deformaopcionaluna especiede Achnanthes, Amphiprora, Amphora, Ankistrodesmus, Asteromonas, Boekelovia, Bolidomonas, Borodinella, Botrydium, Botrycoccus, Bracteococcus, Chaetoceros, Cartería, Chlamydomonas, Chlorococcum, Chlorogonium, Chlorella, Chroomonas, Chrysosphaera, Cricosphaera, Crypthecodinium, Cryptomonas, Cyclotella, Desmodesmus, Dunaliella, Elipsoidon, Emiliania, Eremosphaera, Ernodesmius, Euglena, Eustigmatos, Franceia, Fragiliaria, Fragilaropsis, Gloeothamnion, Haematococcus, Hantzschia, Heterosigma, Hymenomonas, Isochrysis, Lepocinclis, Micractinium, Monodus, Monoraphidium, Nannochloris, Nannochloropsis, Navicula, Neochloris, Nephrochloris, Nephroselmis, Nitzschia, Ochromonas, Oedogonium, Oocystis, Ostreococcus, Parachlorella, Parietochloris, Pascheria, Pavlova, Pelagomonas, Phaeodactylum, Phagus, Picochlorum, Platymonas, Pleurochrysis, Pleurococcus, Prototheca, Pseudochlorella, Pseudoneochloris, Pseudostaurastrum, Pyramimonas, Pyrobotrys, Scenedesmus, Schizochlamydella, Skeletonema, Spyrogyra, Stichococcus, Tetrachlorella, Tetraselmis, Thalassiosira, Tribonema, Vaucheria, Viridiella, Vischeria y Volvox.

Elmétododelareivindicación14,endondeelcultivoesfotoautótrofo.