CN102033114A - 一种快速简便分析传统酿造用大曲微生物群落结构的方法 - Google Patents

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秦臻
黄钧
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Abstract

本发明涉及一种用于分析传统酿造用大曲微生物群落结构的免培生物化学方法，即使用磷脂脂肪酸谱图分析技术分析传统酿造用大曲微生物群落结构。具体步骤如下：1)称取一定量粉碎混匀后的大曲样品；2)加入缓冲液和有机试剂，得到含有脂质的有机相；3)有机相经硅胶小柱分离，洗脱收集含极性脂质有机组分；4)温和甲酯化，加入提取试剂得到相应脂肪酸甲酯；5)使用气相色谱-质谱联用仪进行脂肪酸甲脂的定量分析；6)根据不同磷脂脂肪酸组成特点，确定样品中微生物群落结构特征。本发明对研究酿造用大曲微生物群落结构组成；了解制曲过程不同微生物群落消长规律，提供了准确、快速的免培检测手段。

Description

一种快速简便分析传统酿造用大曲微生物群落结构的方法
技术领域
本发明属于大曲微生物群落结构免培法分析领域，磷脂脂肪酸(phospho lipid fatty acid，PLFA)是几乎所有微生物(除古生细菌)活细胞膜的重要组成成分，基于大曲样品磷脂脂肪酸分析结果可以快速定量剖析大曲复杂微生物群落组成情况。
背景技术
白酒、食醋等酿造用大曲不仅是其酿造过程中重要的生物催化剂，也是产品中香味组分的主要来源之一。独特的生产工艺与悠久的生产历史赋予其微生物群落结构多样性和时空性。经过长期驯化的生产环境中，也富集了大量适应极端环境的微生物资源。基于传统酿造用大曲微生物群落区系特定的剖析，有益于了解、认识传统固态酿造生产过程中微生物作用的基本规律，促进在传承特色生产工艺的基础上，应用微生物培养技术提高产品质量和劳动生产效率，发掘特色生物资源。由于大部分环境微生物都处于存活不可培养状态，使得了解微生物实际群落变化比较困难。基于可培养方法研究传统酿造用大曲微生物群落特征，在认识其优势微生物种属所取得的成果，促进了固态酿造微生物相关研究的发展；基于PCR的免培技术，在酿酒大曲微生物群落结构剖析研究的应用，为从分子生物学的水平全貌认识和了解其群落结构开辟了有效的途径。但因受多种因素的限制，上述方法在定量揭示微生物群落特征方面存在许多局限。
磷脂是所有生物活细胞细胞膜的重要组分，含量在自然生理条件下相对恒定，不同的微生物由于生长和代谢作用，所含种类和数量均不相同，并且磷脂脂肪酸对环境因素敏感，在细胞体死亡后可迅速降解。因此，磷脂脂肪酸(PLFA)分析可以快速、定量地了解样品中微生物群落结构和微生物生物量，作为生物标记分子表征微生物群落结构和动态变化。目前，国内磷脂脂肪酸分析方法主要是用于分析土壤微生物群落的多样性(CN 1611450A)、与DNA技术结合分析微量堆肥样品，保证样品信息来源的同一性(CN 101261204)以及结合稳定同位素示踪技术跟踪被污染土壤中微生物群落修复(CN 101034087)等。而利用本专利所述改进的磷脂脂肪酸分析方法来分析传统酿造用大曲微生物群落结构，至今国内外还未见相关文献或专利报道。
磷脂脂肪酸(PLFA)谱图分析技术，对大曲样品微生物群落进行定量分析，能够克服传统方法的缺点。用PL FA方法定量分析大曲样品微生物群落的生物量和群落结构不需要对微生物进行纯培养，也避免了其他免培方法的复杂和不可预见性。虽然其不能在菌种和菌株(strain)水平鉴别出相关微生物的类别，但是能够依靠脂肪酸谱图定量描述整个微生物群落结构特征，是一种快捷、可靠的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简便快速分析传统酿造用大曲微生物群落结构的方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案来实现：从经粉碎混匀的大曲样品中萃取得到脂质；通过硅胶小柱分离、洗脱得到极性脂，在碱性条件下对极性脂进行脂肪酸的温和甲酯化，得到相应脂肪酸甲酯；溶解样品，加入内标物质，使用气相色谱-质谱联用仪进行定量分析，得到样品磷脂脂肪酸的组成及含量；根据磷脂脂肪酸的组成及含量分析特征脂肪酸分布情况，得到大曲微生物群落结构组成。
采用本发明的方法分析传统酿造用大曲微生物群落结构具有以下优点：
(1)本发明采用免培技术分析大曲样品微生物群落结构，避免了传统培养法分析大曲样品微生物群落结构费时、复杂的操作过程，解决了大量环境微生物无法培养所致的分析误差。
(2)本发明为分析传统酿造用大曲微生物群落结构，跟踪制曲过程微生物群落结构变化趋势提供了准确、快速、有效的分析手段。
(3)本发明所述方法条件温和，操作简单，具有推广应用的价值。
附图说明
图中为某知名酿造用大曲磷脂脂肪酸组成结构的主成分分析(PCA)载荷图。
具体实施方式
向3g大曲样品中先后加入3.2ml磷酸盐缓冲液、4ml氯仿和8ml甲醇，于暗处，室温250r/min条件下振荡2h。先后加入4.8ml缓冲液和6ml氯仿，剧烈振荡混匀，静置过夜。将氯仿相(下层)转移至新试管中，氮气吹干。提取出的脂肪酸用氯仿溶解，转移至硅胶小柱中，分别用10ml氯仿，10ml丙酮，10ml无水甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液，氮气吹干。向干燥所得固体组分中加入1ml甲苯∶甲醇((1∶1)v/v)，1ml 0.2mol·l-1氢氧化钾-甲醇，37℃水浴15min，冷却后，加入2ml超纯水和0.3ml乙酸溶液(1mol/L)，用正己烷(4ml)萃取FAME，取有机相，氮气吹干，加入内标物正十九酸甲酯；在下述条件下分析FAME样本：色谱柱：TR-5MS(30.0m×320μm×0.25μm)；色谱条件：进样口温度：250℃；进样量：0.5μl；分流比：10∶1；载气(He)流速：1ml·min-1；起始柱温：50℃，保持2min；以5℃·min-1升至220℃，保持15min。质谱条件：电子强度：70eV；离子源温度：200℃；扫描范围：35～400amu。
待测样品各组分质谱图与NIST 05标准谱库比对以及保留时间与37种FAME标准品的保留时间比较确定其PLFA组分；以19:0为内标，采用内标法计算各组分的含量。根据磷脂脂肪酸的组成及含量分析特征脂肪酸分布情况，得到大曲微生物群落结构组成。

Claims (3)

1.一种快速简便分析传统酿造用大曲微生物群落结构的方法，包括以下步骤：
a)采集用于实验的大曲样品，粉碎混匀；
b)称量一定量a)中的大曲样品，依次加入3.2ml磷酸盐缓冲液、8ml甲醇、4ml氯仿，振荡静置过夜，收集含有脂质的有机相；
c)将步骤b)中获得的有机相经硅胶小柱分离，分别用10ml氯仿、10ml丙酮和10ml甲醇洗脱，收集含有极性脂的甲醇相洗脱液；
d)将步骤c)得到的洗脱液经氮气吹干后加入1ml甲苯∶甲醇((1∶1)v/v)和1ml 0.2mol·l-1氢氧化钾-甲醇，甲脂化环境为37℃水浴15min；
e)将步骤d)得到脂肪酸甲酯混合液，通过4ml正己烷萃取；
f)将步骤e)得到的脂肪酸甲酯萃取液经氮气吹干，加入含有正十九酸甲酯内标物质的溶剂溶解；
g)将步骤f)得到的溶液进行气相色谱-质谱联用仪的分析测定，得到样品中相关磷脂脂肪酸的分布及含量，气相色谱-质谱联用仪采用的是Thermo Trace GC Ultra DSQ II气质联用仪，检测中使用的升温程序如下：进样口温度：250℃；进样量：0.5μl；分流比：10∶1；载气(He)流速：1ml·min-1；起始柱温：50℃，保持2min；以5℃·min-1升至220℃，保持15min；质谱条件：电子强度：70eV；离子源温度：200℃；扫描范围：35～400amu；
h)结合相关的数据处理方法，处理步骤g)得到的数据，确定样品微生物群落特征。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤a)中：实验材料可以为任意用途的传统酿造用曲，如：白酒，食醋，酱油，本实验采用的是浓香型白酒大曲及麸醋醋曲。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤h)中：大曲样品微生物群落结构分析方法为微生物标记法，采用特征磷脂脂肪酸作为微生物群落的指标，其中18:2ω6，9，18:3ω6，9，12，19:1ω9是用于表征真菌的特征脂肪酸；10Me15:0，10Me16:0，10Me 17:0，i1 5:0，a1 5:0，i1 6:0，i17:0，a17:0是表征G+细菌的特征脂肪酸；16:1ω5，16:1ω7，16:1ω9，cy17:0，18:1ω5，18:1ω7，cy19:0是表征G-细菌的特征脂肪酸；16∶0是表征微生物通用的特征脂肪酸，用于估算微生物总量，微生物群落结构分析采用的是主成分分析(PCA)以及聚类分析。
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