CN107884487B

CN107884487B - 测定餐厨垃圾乙醇预发酵-厌氧发酵过程中碳流分布方法

Info

Publication number: CN107884487B
Application number: CN201710999166.2A
Authority: CN
Inventors: 高明; 邹惠; 于淼; 任媛媛; 汪群慧
Original assignee: University of Science and Technology Beijing USTB
Current assignee: Shanxi Zihuan Technology Co ltd
Priority date: 2017-10-23
Filing date: 2017-10-23
Publication date: 2020-11-10
Anticipated expiration: 2037-10-23
Also published as: CN107884487A

Abstract

本发明一种测定餐厨垃圾乙醇预发酵‑厌氧发酵过程中碳流分布的方法，该方法采用了基于液相色谱‑串联质谱仪和气相色谱‑串联质谱仪的方法来测定厌氧消化过程中标记性产区的含量，结果准确，灵敏度高。所述乙醇预发酵‑厌氧发酵过程为：添加¹³C‑葡萄糖（取代餐厨垃圾中30%还原糖）的餐厨垃圾经过12 h的乙醇预发酵后，添加活化污泥（VS底物/VS污泥＝１）在35℃下厌氧发酵，在厌氧发酵0 h，24 h，360 h时分别取气样和液样。本发明的有益效果是该方法在餐厨垃圾中引入标记性底物方法，既简化分析过程，又描述复杂底物厌氧发酵过程的碳流分布，为厌氧发酵过程理论研究提供了一个很好的工具。

Description

测定餐厨垃圾乙醇预发酵-厌氧发酵过程中碳流分布方法

技术领域

本发明公开了一种测定餐厨垃圾乙醇预发酵-厌氧发酵过程中碳流分布的方法，具体来说是涉及一种基于GC/LC-MS测定餐厨垃圾乙醇预发酵-厌氧发酵过程中碳流分布的测定方法。

背景技术

餐厨垃圾是城市垃圾的主要组成部分，主要来自餐饮业和大型公共食堂的食物残余、城市居民家庭的厨余垃圾及蔬菜水果等食品加工业及市场产生的食品垃圾。据统计，全世界每年产生13亿吨的餐厨垃圾，在中国每年将近产生6000万吨的垃圾，安全处置餐厨垃圾已然变成政府部门非常关注的问题。近年来利用餐厨垃圾进行厌氧发酵成为了研究热点，但由于餐厨垃圾中含有大量的碳水化合物，在厌氧发酵过程中极易酸化，鉴于此，公开号为CN103667101A的专利指出在餐厨垃圾酸化阶段接种酵母菌进行乙醇预发酵，可缓解厌氧发酵体系的酸化问题，且乙醇可逐渐转化为易被甲烷菌利用的乙酸，从而提高甲烷产量，使餐厨垃圾干式厌氧发酵稳定运行，但此过程依然存在很多亟待解决的技术瓶颈和机理问题：如乙醇预发酵如何提高甲烷产量；此过程中酵母菌，产甲烷菌，水解菌种群演替、结构和相互关系及重要功能基因的开发利用等。

为进一步明确乙醇预发酵提高厌氧消化过程甲烷产量的机理机制，传统的方法主要采用化学计量手段或分子生物学手段，但前者仅能针对化学组成变化明确的过程进行物料衡算和热量衡算，后者可以定量分析过程中微生物种类和数量的变化，但不能分析过程中碳源转变过程，而同位素分析法可以精确和定量分析过程参数变化，还可以实时描述过程中碳流量变化。餐厨垃圾接种污泥进行厌氧发酵的体系十分复杂，涉及多种化学反应，因此采用碳同位素标记可以区别原本底物中存在的碳源物质，这样既简化代谢分析过程，又能描述此复杂底物厌氧消化过程的碳流向，是一个方便、有效的示踪办法。

液相色谱-串联质谱法、气相色谱-串联质谱法是近年来发展起来的一种色谱/质谱联用技术。两种方法不仅具有样品前处理简单、操作方便、清洁实验等优势，且质谱分析可以定量分析标记性物质含量，已广泛用于土壤，食品，医疗等领域。为此，本论文创新采用GC-MS和LC-MS联合分析方法测定餐厨垃圾乙醇预发酵-厌氧发酵过程中碳流分布，以期为厌氧发酵理论研究提供一种可靠有效的方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供了一种测定餐厨垃圾乙醇预发酵-厌氧发酵过程中碳流分布的方法，该方法能够定量分析乙醇预发酵-甲烷发酵过程的碳流分布，为阐明厌氧发酵过程机理研究提供了一有效的分析方法；而且该方法前处理简单、操作简单。

为了解决上述技术问题，本发明提供了测定餐厨垃圾乙醇预发酵-厌氧发酵过程中碳流分布的方法，具体步骤为：1)餐厨垃圾底物中添加¹³C-葡萄糖，按照0.5％～2.5％(w/v)比例接种活化酵母菌，进行6h-24h的餐厨垃圾乙醇预发酵；2)预发酵后在密封环境下接种活性污泥(VS_污泥/VS_底物＝1-2)，于33℃～37℃下进行厌氧发酵；3)通过控制三通管的开关定时收集发酵体系中气体样品和液体样品；4)采用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)测定带有标记性的VFAs，乙醇，甲烷和二氧化碳；5)采用液相色谱-质谱联用仪(LC-MS)测定带有标记性的葡萄糖，乳酸；6)通过外标法核定不同时间下的产物产量，定量分析碳流分布。

本发明所述的测定餐厨垃圾乙醇预发酵-厌氧发酵过程中碳流分布，是通过GC/LC-MS法测定底物中添加¹³C-葡萄糖及随着厌氧发酵进行带有¹³C标记的相关产物含量，进而分析底物的代谢流，分析乙醇预发酵提高甲烷产量的机理；该分析方法具有样品前处理简单、操作简单、清洁实验等明显优势。

优选的，所述方法具体的为：添加的¹³C-葡萄糖不少于餐厨垃圾底物中还原糖浓度的30％。

更优选的，所述方法具体为：添加的¹³C-葡萄糖为餐厨垃圾底物中还原糖浓度的30％。选择此浓度是在考虑经济性和整体性能的基础上做出的优化选择，能够确保标记性物质在实验过程中被检测到。

本发明的有益效果是：由于上述技术方案具有以下有益效果：本发明所述的测定餐厨垃圾乙醇预发酵-厌氧发酵过程中碳流分布的方法，通过在餐厨垃圾底物中添加¹³C-葡萄糖，在简化厌氧发酵复杂代谢的同时，又能描述底物随着代谢的进行各物质之间的转换，进而从微观的角度阐明厌氧发酵机理。而本发明所采用GC/LC-MS测试方法可对全过程的标记性物质进行测定，不但结果精准，而且样品前处理简单，操作方便，此举亦可用于木质纤维素，如秸秆，稻草等复杂底物厌氧发酵生产甲烷的机理研究。

附图说明

图1为发酵液中乙醇，乙酸，丙酸，丁酸的质谱图(24h)。

图2为甲烷和二氧化碳的质谱图(24h)。

图3为厌氧发酵液中葡萄糖的质谱图(24h)。

图4为厌氧发酵液中乳酸的质谱图(24h)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。

本发明的目的在于提供一种测定餐厨垃圾乙醇预发酵-厌氧发酵过程中碳流分布的方法，本发明方法采用了基于液相色谱-串联质谱仪和气相色谱-串联质谱仪的方法来测定厌氧消化过程中标记性产区的含量，结果准确，灵敏度高。以下实施例用于说明本发明，但不能用来限制本发明的范围。

本发明一种测定餐厨垃圾乙醇预发酵-厌氧发酵过程中碳流分布的方法，该方法具体包括如下步骤：

1)餐厨垃圾底物中添加¹³C-葡萄糖，按照0.8％～2.5％(w/v)比例接种活化酵母菌，进行8h～24h的餐厨垃圾乙醇预发酵；

2)预发酵后在密封环境下接种活性污泥(VS_污泥/VS_底物＝1-2)，于33℃～37℃下进行厌氧发酵；

3)通过控制三通管的开关定时收集发酵体系中气体样品和液体样品；

4)采用GC-MS分析法测定带有标记¹³C的VFAs、乙醇、甲烷和二氧化碳；

5)采用LC-MS分析法测定带有标记¹³C的葡萄糖和乳酸；

6)通过外标法核定不同时间下的产物产量，定量分析碳流分布。

所述添加的¹³C-葡萄糖含量不小于餐厨垃圾底物中还原糖浓度的30％。

所述气体样品用顶空进样瓶进行收集，测试时用纯度为99.999％的氮气进行稀释。

利用GC-MS测定标记性VFAs和乙醇，采用的色谱质谱条件为：

色谱柱：毛细管柱，30m×0.32mm×0.25μm；

进样量：0.5uL～1.0uL；

升温程序：初始温度45～50℃，保持5～10min，以10～15℃/min升温至240℃，保持10min。载气为氩气(纯度≥99.999％)，柱流量1ml/min；

质谱条件：EI离子源，电子能量70eV；离子源温度250℃；溶剂延迟为2.65min；扫描模式为Scan，扫描质量范围29～650μ。

利用GC-MS测定标记性甲烷和二氧化碳，采用的色谱质谱条件为：

色谱柱：苯乙烯-二乙烯基苯色谱柱，30m×0.32mm×40μm；

气谱条件：分流比20～25：1，进样体积50μL～100μL，载气为纯度≥99.999％氩气，柱流量1ml/min，柱温维持在35℃～40℃。

质谱条件：EI离子源，电子能量70eV；离子源温度250℃；溶剂延迟时间为1.6～1.8min(气体)；扫描模式为Scan，扫描质量范围29～650μ。

利用LC-MS测定标记葡萄糖含量，采用的色谱质谱条件为：

色谱柱：氨基柱，4.6×150mm，3.5μm；

液谱条件：柱温：30℃～40℃，流动相：50％～70％乙腈(v/v)，流速：0.15ml/min～0.25ml/min，进样量为5μL～10μL。

质谱条件：干燥气温度325℃，干燥气流速10L/min(液氮)，电喷雾压力30psi，驻留时间200ms，在SIM模式下进行扫描。

利用LC-MS测定标记乳酸含量，采用的色谱质谱条件为：

色谱柱：C18柱，2.1×150mm，5.0μm，

液谱条件：柱温：25℃～35℃，流动相：40％～60％甲醇(v/v)，流速：0.1ml/min～0.2ml/min，进样量为5μL～10μL。

餐厨垃圾底物中还原糖测定方法为DNS法，测定前餐厨垃圾进行糖化，糖化方法为：餐厨垃圾∶水＝2∶1(v/v)，加入2％(w/v)的糖化酶，调节pH至5.0，温水浴(55-60℃)糖化6h。

所述活化酵母菌方法为称取一定量的安琪干酵母倒入已经灭菌的2％(w/v)蔗糖溶液中，在35℃水浴中，恒温活化2h备用。

所用干酵母粉为安琪活性干酵母。

实施例1：

本实施例对餐厨垃圾乙醇预发酵-厌氧发酵过程中碳流分布的检测方法如下：

(1)标准工作溶液的制备：

①葡萄糖：用50％乙腈(v/v)溶液将葡萄糖稀释成一系列浓度梯度的标准溶液(6.25，12.5，25，50，100mg/L)，实施过程添加一定量的优品级乙酸钠，保证标液中钠离子含量在20umol/L。②乳酸：用60％甲醇(v/v)将乳酸稀释成一系列浓度梯度的标准溶液(1.25，2.5，5，10，20mg/L)。③乙醇，乙酸，丙酸，丁酸混标：用色谱纯甲醇将上述四种标品稀释成一系列梯度的混标(12.5，25，50，100，200mg/L)。④甲烷和二氧化碳：用高纯氮气进行系列稀释，保证气体体积在1％-5％之间，换算后混标气体浓度(6.53，13.06，19.59，26.12，32.65mg/L)。

(2)样品的制备：

①液体样品：将厌氧消化不同时间的液样低温离心(10000rpm)20min后上清液过0.45μm水系微孔滤膜备用。¹³C-葡萄糖：备用样品用50％(v/v)乙腈稀释50倍，正离子模式分析。¹³C-乳酸：备用样品用60％(v/v)甲醇稀释100倍，负离子模式分析。¹³C-乙醇，¹³C-乙酸，¹³C-丙酸，¹³C-丁酸：备用样品用色谱纯甲醇稀释20倍。

上述液体样品稀释后均要通过0.22μm有机系微孔滤膜。

②气体样品：收集的气样装入顶空进样瓶中，用高纯氮气稀释20倍后备用。

(3)气相色谱-串联质谱分析

气相色谱-串联质谱仪分析¹³C-乙醇、¹³C-乙酸、¹³C-丙酸、¹³C-丁酸、¹³CH₄、¹³CO₂及其标样。典型样品的质谱图如图1和图2所示，图1中：peak1代表¹²C₂H₆O，peak2代表¹³C₂H₆O，peak3代表¹²C₂H₄O₂，peak4代表¹²C¹³CH₄O₂，peak5代表¹³C₂H₄O₂，peak6代表¹²C₃H₆O₂，peak7代表¹³C₃H₆O₂，peak8代表¹²C₄H₈O₂，peak9代表¹²C₂ ¹³C₂H₈O₂，peak10代表¹³C₄H₈O₂，图2中：peak1代表¹²CH₄，peak2代表¹³CH₄，peak3代表¹²CO₂，peak4代表¹³CO₂；

其仪器分析条件为：¹³C-乙醇、¹³C-乙酸、¹³C-丙酸、¹³C-丁酸及其标样色谱柱：Agilent DB-FFAP(30m×0.32mm×0.25μm)，进样方式为不分流，进样量0.5μL，升温程序：初始温度45℃，保持5min，以10℃/min升至240℃，保持10min，载气为氩气(纯度≥99.999％)，柱流量1.0mL/min。

¹³CH₄、¹³CO₂及其标样色谱柱：Agilent HP-PLOT-Q(30m×0.32mm×40μm)，分流比25∶1。进样体积：稀释后吸取10μL气体，载气为氩气(纯度≥99.999％)，柱流量1mL/min，柱温维持在35℃。

上述质谱条件：EI离子源，电子能量70eV；离子源温度250℃；溶剂延迟为2.65min(酸和乙醇)及1.6min(气体)；扫描模式为Scan，扫描质量范围29～650μ。采集到的质谱图利用NIST谱库进行检索。

(4)液相色谱-串联质谱分析

液相色谱-串联质谱仪分析¹³C₆-葡萄糖、¹³C-乳酸及其标样。典型样品质谱图如图3和图4所示，图3中peak1代表¹²C₆H₆O₆，peak2代表1³C₆H₆O₆，peak3代表加钠的¹²C₆H₆O₆，peak4代表加钠的¹³C₆H₆O₆；图4中peak1代表¹²C₃H₆O₃，peak2代表¹³C₃H₆O₃

其仪器分析条件为：葡萄糖色谱柱：Xbridge Amide(3.5μm，4.6×150mm)，柱温：40℃，流动相：50％乙腈(v/v)，流速：0.25mL/min，进样量为5μL。

乳酸色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(5.0μm，2.1×150mm)，柱温：25℃，流动相：60％甲醇(v/v)，流速：0.2mL/min，进样量为5μL。

上述质谱条件：干燥气温度325℃，干燥气流速10L/min(液氮)，电喷雾压力30psi，驻留时间200ms，扫描模式为SIM。

(5)标准曲线绘制及计算结果

以标准工作溶液中物质浓度为横坐标，以色谱图中标记性物质峰面积为纵坐标，进行线性回归分析，得到标准工作曲线。以最低浓度的标准工作溶液，做5次平行检测分析，计算其标准偏差，按照下列公式计算检出限。与标准工作曲线相对应的回归方程、相关系数、检出限数据见表1。

C_L＝K_si S_ic//X

式中：C_L-方法检出限；K_i-置信因子，取3时相应的置信水平大约为90％；s_i-测量结果的标准偏差；c-样品含量值；X-样品测量读数平均值。

表1分析方法的工作曲线及检出限

式中：X-物质浓度，mg/L；Y-峰面积。

然后，通过测定样品中标记性物质峰面积，代入标准工作曲线，得出不同时间下各物质含量。并根据下列公式求得厌氧消化不同时间下各标记性产物的碳流分布：

式中：CFD-实验过程中各标记性物质的碳流分布(％)；P-标记性产物含量(mM)；U-¹³C-葡萄糖的消耗量(mM)。

本实施例中不同厌氧消化时间下各标记性物质含量以及碳流分布结果见表2。

表2各标记性物质含量及产物的碳流分布

实施例2

本实施例对本发明的精密度和实验过程标记碳回收率的检测方法如下：

以实施例1中厌氧消化72h时的样品为分析对象，精密度实验为此样品在同一条件下平行测定5次，分别计算5次平均测定结果的相对标准偏差(RSD)，测定结果见表3。表中结果显示，本实验方法的RSD在1.86％-3.56％之间，对于定量分析来说，表明方法具有良好的精密度。

同时对厌氧消化不同时间下的碳回收率进行了计算(以标记性碳为计算基础)，得到实验中的碳回收率均超过98％，说明此方法准确可靠，简单迅速，完全适用于厌氧消化同位素的定量分析。

表3精密度和碳回收率

本实施例的检出限仅以其中一个浓度为例进行说明，精密度也仅以一个样品为例进行说明，其余浓度或样品测定所得数据与上述实施例相同，在此不再一一列举。所举实施例只是为了更好的理解本发明方法，并不具有任何限制作用，即上述方法或者等同上述情况的方法均包含在本发明的技术方案的保护范围内。

上面结合附图和具体实施例对本发明的实施方式作了详细说明，选择和描述实施例是为了更好说明本发明的原理和实际应用，并且使本领域的普通技术人员能够理解本发明从而设计适于特定用途的带有各种修改的各种实施例。

Claims

1.一种测定餐厨垃圾乙醇预发酵-厌氧发酵过程中碳流分布的方法，其特征在于，该方法具体包括如下步骤：

1）餐厨垃圾底物中添加¹³C-葡萄糖，按照0.8%~2.5%w/v比例接种活化酵母菌，进行8h~24 h的餐厨垃圾乙醇预发酵；所述添加的¹³C-葡萄糖含量不小于餐厨垃圾底物中还原糖浓度的30%；

2）预发酵后在密封环境下接种活性污泥：VS_污泥/ VS_底物=1-2，于33℃~37℃下进行厌氧发酵；

3）通过控制三通管的开关定时收集发酵体系中气体样品和液体样品；

4）采用GC-MS分析法测定带有标记¹³C的VFAs、乙醇、甲烷和二氧化碳；

采用的色谱质谱条件为：

色谱柱：毛细管柱 Agilent DB-FFAP，30 m×0.32 mm×0.25 μm；

进样量：0.5 μL ~1.0μL；

升温程序：初始温度45 ~50 ℃，保持5 ~10 min ，以10 ~15℃/min升温至240 ℃，保持10 min,载气为氩气纯度≥99.999%, 柱流量1 ml/min；

质谱条件：EI离子源，电子能量 70 eV；离子源温度 250℃；溶剂延迟为 2.65min；扫描模式为 Scan，扫描质量范围 29～650u;

色谱柱：苯乙烯-二乙烯基苯色谱柱，30 m×0.32 mm×40 μm；

气谱条件：分流比20~25：1，进样体积50μL ~100 μL，载气为纯度≥99.999%氩气，柱流量1 ml/min，柱温维持在35℃~40℃；

质谱条件：EI离子源，电子能量 70 eV；离子源温度 250℃；溶剂延迟时间为1.6~1.8min气体；扫描模式为 Scan，扫描质量范围 29～650u

5）采用LC-MS分析法测定带有标记¹³C的葡萄糖和乳酸；其中，利用LC-MS测定标记葡萄糖含量，采用的色谱质谱条件为：

色谱柱：氨基柱，4.6×150 mm，3.5 μm；

液谱条件：柱温：30℃～40℃，流动相：50%～70%乙腈，v/v，流速：0.15ml/min～0.25ml/min，进样量为5μL～10μL；

质谱条件：干燥气温度325 ℃，干燥气流速10 L/min液氮，电喷雾压力30psi，驻留时间200ms，在 SIM模式下进行扫描；

利用LC-MS测定标记乳酸含量，采用的色谱质谱条件为：

色谱柱：C18柱，2.1×150 mm，5.0 μm；

液谱条件：柱温：25℃～35℃，流动相：40%～60%甲醇，v/v，流速：0.1 ml/min～0.2 ml/min，进样量为5μL～10μL；

质谱条件：干燥气温度325℃，干燥气流速10 L/min液氮，电喷雾压力30psi，驻留时间200ms，在 SIM模式下进行扫描;

6）通过外标法核定不同时间下的产物产量，定量分析碳流分布。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述气体样品用顶空进样瓶进行收集，测试时用纯度为99.999%的氮气进行稀释。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：餐厨垃圾底物中还原糖测定方法为DNS法，测定前餐厨垃圾进行糖化，糖化方法为：餐厨垃圾：水=2：1，v/v，加入2%，w/v的糖化酶，调节pH至5.0，55-60℃温水浴糖化6h。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述活化酵母菌方法为称取一定量的安琪干酵母倒入已经灭菌的2%，w/v蔗糖溶液中，在35℃水浴中，恒温活化2 h备用。

5.如权利要求1所述方法，其特征在于：所用干酵母粉为安琪活性干酵母。