CN102517372B

CN102517372B - 一种微藻胞内油脂含量的快速测定方法

Info

Publication number: CN102517372B
Application number: CN 201110409516
Authority: CN
Inventors: 敬科举; 文昌; 卢英华; 吴意珣; 凌雪萍
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2011-12-09
Filing date: 2011-12-09
Publication date: 2013-05-08
Anticipated expiration: 2031-12-09
Also published as: CN102517372A

Abstract

一种微藻胞内油脂含量的快速测定方法，涉及一种油脂含量测定方法。以小球藻Chlorellavulgaris为出发藻种，以SE培养基培养小球藻，生长期内用自制光箱拍照，并用MATLAB编程分析照片中R、G、B的值，从而建立实测油脂含量与R、G、B平均值的关系模型，最后可以直接通过拍照读取R、G、B的值来计算胞内油脂的含量。操作简单，测定结果精确，模型计算油脂含量与实际油脂含量线性相关系数R²达到0.9978，而且重复性好，需要样品量少。总之，与传统的分析油脂含量的方法相比，具有更简捷，精确的优势。

Description

一种微藻胞内油脂含量的快速测定方法

技术领域

本发明涉及一种油脂含量测定方法，尤其是涉及一种利用RGB三原色原理的微藻胞内油脂含量的快速测定方法。

背景技术

生物柴油(脂肪酸甲酯)是一种已经得到证明的燃料，以其为可再生性的环保燃料能源而得到世界的广泛关注。生物柴油的主要成分是脂肪酸甲酯(FAME)，是以可再生资源(如油菜籽油、大豆油、玉米油、棉籽油、花生油、葵花子油、棕榈油、椰子油、回收烹饪油、动物油以及微生物油脂等)为原料而制成，具备与石油柴油相近的性能。生产和使用生物柴油的技术已经存在了50余年。与石油柴油相比，生物柴油的性能更加优良。

面对植物原料生产生物柴油的诸多问题，利用微藻产油具有不与农业争地的明显优势，而且可用海水作为天然培养基进行大量繁殖。跟植物一样，微藻也是利用光照产油，但却比植物作物的效率高很多。大多数微藻的产油量远远超过了最好的油料作物。不像其他油料作物，微藻生长极为迅速，而且含有极其丰富的油脂。藻类光合作用转化效率可达10％以上，含油量达30％。微藻的生物柴油产量是最好的油料作物的8～24倍。

小球藻是属于绿藻门绿藻目卵囊藻科小球藻属普生性单细胞绿藻，它是一种球形单细胞淡水藻类，直径3～8μm，是地球上最早的生命之一，出现在20多亿年前，基因始终没有变化，是一种高效的光合植物，以光合自养生长繁殖，分布极广。小球藻的光合作用色素是叶绿素，几种叶黄素，类胡萝卜素有β-胡萝卜素，可能不含同属绿藻门的团藻目-红球藻科-红球藻属中的虾青素。其贮藏的食物主要是淀粉。它是单细胞藻类，常单生，也常有多数细胞聚于一起；细胞多为球形、椭圆形；每个细胞内有1个周生、杯状或片状的叶绿体，具有1个蛋白核或缺如，1个细胞核；细胞壁通常很薄；每个细胞可以产生2、4、8或16个似亲孢子，进行无性繁殖。

1978年，美国能源部可再生能源国家实验室开始养殖微藻生产生物燃料项目(AquaticSpices Program，简称ASP项目)的研究，研究内容从微藻筛选、微藻生化机理分析、工程微藻制备到中试。该项目持续到1996年，在实验室研究的基础上，研究人员在美国加利福尼亚州、夏威夷州、新墨西哥州等地进行了中试放大。中试装置运行了一年，可获得高达0.05kg/(m²·d)的工程微藻，微藻含油量达到40％～60％。1978-1996年累计投入科研经费2505万美元。该研究室是迄今对微藻研究最全面和权威的机构。由于油价上涨，2007年底美国能源部又将这个中断了11年之久的项目重新启动。美国SappHire公司2008年9月宣布投资1亿美元开展养殖海藻生产生物燃料的研究，SappHire公司有两个引人注目的投资商：比尔盖茨私人名下的一家投资公司(Cascade in-vestments)和为洛克菲勒家族服务的投资合作商(VenrockPartner)。SappHire公司宣称通过一种用太阳光、二氧化碳和光合海藻的工艺研制出了辛烷值达91的“绿色”汽油，而且生产的“绿色”燃料与现有的从炼油厂到加油站的销售网络设施完全兼容，显示了微藻汽油与第一代生物乙醇相比的优势所在。美国生物技术公司Solazyme于2008年7月9日生产出第一批海藻基可再生生物柴油，并已通过美国材料试验协会(ASTM)D-975规格的认证。美国国际能源公司(International Energy)于2007年11月初宣布启动“海藻变油”研发计划，将从基于海藻的光合成来生产可再生柴油和喷气燃料。美国GreenFuel技术公司开发的海藻技术于2005年在Arizona的APS电厂完成了中试。选用高生长率的海藻，置于装有水的大型试管内，并曝置于直接的阳光照射下。这项技术计划2008年开始商业化生产。美国Algenol公司2008年7月宣布在美国Maryland投运了世界上最大的海藻库场，目标是在美国沿海地区建设海藻制乙醇工厂。该公司估算可从1acre(约为4046.9m²)土地生产6000gal(1 gal＝3.785L)乙醇。按照估计，如果美国所需乙醇全部从海藻制取，则仅需使用谷物制取乙醇需用土地的3％。美国可再生能源集团(REG)于2008年8月21日宣布，该公司已拥有规模化的商业化技术，可炼制和生产大量高质量的海藻生物柴油，柴油质量超过ASTM D6751和EN 14214M标准。REG公司计划采用专有预处理技术对粗海藻油进行净化和精制。然后采用与目前商业规模生物柴油生产过程相似的系统，使之转化为生物柴油。美国Valencent产品公司和全球绿色解决方案公司合作开发的Vertigro工艺正处于工业应用准备阶段，包括海藻生长、海藻收集和萃取海藻油用于生物柴油3个步骤。工艺的核心是连续闭环生物反应器。在25-30d之后就可收集海藻，海藻的含油量约为50％。Vertigro工艺的生物柴油产量要比用常规农作物生产的生物柴油增加20倍，用水量只有5％。

石油公司也加入了养殖海藻生产生物柴油的研究开发。Shell公司与美国从事海藻生物燃料业务的HR生物石油公司(HR Biopetroleum)于2007年12月组建合资企业Cellena公司，在夏威夷用面积2.5hm²的实验基地作为海藻养殖场，建设利用海藻生产植物油再转化为生物燃料的中试装置，进行为期2年的生物柴油生产实验。Chevron公司也与美国可再生能源国家实验室、Solazyme公司签署了协议，共同开展研究工作。

任何颜色都可以用红、绿、蓝这3种颜色按不同的比例混合而成，这就是三原色原理。三原色的原理可解释如下：(1)自然界的任何颜色都可以由3种颜色按不同的比例混合而成；而每种颜色都可以分解成3种基本颜色；(2)三原色之间是相互独立的，任何一种颜色都不能由其余的两种颜色来组成；(3)混合色的饱和度由3种颜色的比例来决定。混合色的亮度为3种颜色的亮度之和。用以上的相加混色三基色所表示的颜色模式称为RGB模式，而用相减混色三基色原理所表示的颜色模式称为CMYK模式，它们广泛运用于绘画和印刷领域。RGB是一种依赖于设备的颜色空间：不同设备对特定RGB值的检测和重现都不一样，因为颜色物质(荧光剂或者染料)和它们对红、绿和蓝的单独响应水平随着制造商的不同而不同，甚至是同样的设备不同的时间也不同。RGB颜色模型的主要目的是在电子系统中检测，表示和显示图像，比如电视和电脑，但是在传统摄影中也有应用。在电子时代之前，基于人类对颜色的感知，RGB颜色模型已经有了坚实的理论支撑。

近年来，虽然有很多关于微藻胞内油脂含量的测定方法报道，缪晓玲(太阳能学报，2007，Vol.28，No.2)报道了先将藻粉于钵体中研磨，然后用正己烷抽提，最后称重测量油脂含量；胡小文(中国油脂，2011，Vol.36，No.2)报道了利用尼罗红染色法荧光光谱检测微藻中油脂的方法。总得来说，目前研究中检测油脂的方法主要分两种，一种是利用各种手段把油脂分离提取出来称重；另一种是利用油脂荧光染色的特性，用荧光检测手段定量检测油脂含量。但是这两种手段要么操作起来很麻烦，需要的样品量很大，要么实验误差大，重复性不高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用RGB三原色原理的微藻胞内油脂含量的快速测定方法。

本发明的技术方案是以小球藻Chlorella vulgaris为出发藻种，以SE培养基培养小球藻，生长期内用自制光箱拍照，并用MATLAB编程分析照片中R、G、B的值，从而建立实测油脂含量与R、G、B平均值的关系模型，最后可以直接通过拍照读取R、G、B的值来计算胞内油脂的含量。

本发明采用的藻种为小球藻Chlorella vulgaris，所述小球藻Chlorella vulgaris购自中国科学院典型培养物种保藏委员会淡水藻种库，藻种编号：FACHB-32。

本发明包括以下步骤：

1)制作拍照用光箱；

2)将不同培养时期的藻液，倒在培养皿中，再放置在不透光板中央，然后放入光箱内，打开光源，用数码相机从箱体的顶面通孔拍照；

3)从小球藻照片上中央位置截取图像；

4)用MATLAB编写程序，分析图像上的R、G、B三种颜色的平均像素值，并绘制像素分布图；

5)建立实测油脂含量与R、G、B三种颜色平均像素值关系的模型：Y_L＝aR+bG+cB，求模型参数a、b、c；

6)建立模型后，通过拍照截图，用MATLAB编程读取RGB值，带入模型得到小球藻细胞中油脂的含量，单位为mg/g。

在步骤1)中，所述光箱设有箱体，箱体的底面为敞口，顶面中央设有通孔，在箱体内设有灯管，所述箱体的棱长可为50cm，所述通孔的直径可为5cm，箱体内壁可为黑色；所述灯管可设4根白色LED灯管，4根白色LED灯管设在灯箱内的四角。

在步骤2)中，所述培养皿可采用一次性培养皿；所述不透光板可采用白色不透光亚克力板。

在步骤3)中，所述图像可为100×100像素大小的图像。

在步骤4)中，所述分析图像上的R、G、B三种颜色的平均像素值，可分析图像上10000个点的R、G、B三种颜色的平均像素值。

本发明建立的小球藻胞内油脂测定方法操作简单，测定结果精确，模型计算油脂含量与实际油脂含量线性相关系数R²达到0.9978，而且重复性好，需要样品量少。总之，与传统的分析油脂含量的方法相比，具有更简捷，精确的优势。

附图说明

图1为本发明实施例的光箱结构示意图。

图2为本发明实施例的小球藻图片R、G、B值分布图。在图2中，横坐标为象素值，纵坐标为出现次数；图中a为蓝色，b为红色，c为绿色。

图3为RGB模型预测油脂含量与实际油脂含量线性关系图。在图3中，横坐标为预测油脂含量(mg/g)，纵坐标为实际油脂含量(mg/g)；线性相关系数R²＝0.9978。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。

1)制作拍照用光箱，参见图1，所述光箱设有箱体1，箱体1可采用铝合金制作，呈棱长50cm的正方体框架，箱体1的底面11为敞口，顶面12中央设有通孔13，在箱体1内设有4根白色LED灯管2，4根白色LED灯管2设在箱体1内的四角，所述通孔13的直径可为5cm，箱体1内壁可为黑色；箱体1上可设开关3。

2)判断光箱内光源分布是否均匀：光箱内光源分布均与否对建立模型的准确性和重复性影响极大，判断光箱内光源分布是否均匀可以采用分析光箱所拍照片的RGB均匀度来判断。从小球藻照片上截取100×100的像素图后，用MATLAB编辑的统计RGB值的程序来分析像素图，然后绘制R、G、B的分布图，看分布图中R、G、B的分布是否为单峰状。如果是单峰状的，说明所拍小球藻的照片光线分布很均匀，重复性很好，从而也说明了自制光箱内光源分布很均匀，适合用来拍照。如图2所示即为R、G、B分布很均匀的图，都是单峰状的。

3)建模过程：对正常生长的小球藻，每次取样60～70ml，然后摇匀，倒入一次性平板中没过底部，放在亚克力板的中央位置，盖上光箱用数码相机拍照。

用截图工具，例如photoshop、QQ截图等从所拍小球藻照片上中央位置截取100×100大小的像素图。把这个像素图移动到用MATLAB所编统计像素值的程序所在文件夹，运行程序，输入截图名称，即可得到截图的10000个点的R、G、B的平均值以及R、G、B值的分布图。

然后再取50ml样品，测OD684，然后对照DCW-OD684的标准线性关系式，计算样品中小球藻的生物量。然后离心、洗涤、烘干样品，用索氏萃取法以正己烷为溶剂萃取小球藻中的油脂，通过称量接受瓶萃取前后的重量差来测定油脂的重量，这样就可以得到实测油脂占细胞干重的含量mg/g。

间隔时间取8个样，得到8组数据，包括样品R、G、B的平均值以及实测油脂含量如表1所示。

表1 R、G、B的平均值以及实测油脂含量与模型预估含量

然后对8组数据用MATLAB进行线性拟合，模型为Y_L＝aR+bG+cB，其中R、G、B为表中红色、绿色、蓝色的值，Y_L为表中实测油脂含量。拟合完得到模型参数值为a＝-1.5379，b＝1.8504，c＝1.6343。所以建立的胞内油脂含量与R、G、B平均值的模型为：Y_L＝-1.5379R+1.8504G+1.6343B(Y_L：mg/g DCW)。

模型建立后，就可以简单快速的只通过取少量藻液，拍照后用MATLAB编的程序读取R、G、B值，带入模型方程计算得出小球藻胞内油脂含量Y_L。表1中预估油脂含量为用模型方程计算出来的预估油脂含量，可见与实际油脂含量差距不大，模型的重复性很高。

4)验证模型方程的精确性：在小球藻培养的不同时期，取样用RGB模型分析预估油脂含量，同时用传统的称重法测量实际油脂含量，建立模型预估含量与实际含量的线性关系，分析线性度。

如图3所示为小球藻胞内油脂预测含量与实际含量的线性关系图。由图3中可见，线性相关系数R²值有0.9978，相关度非常高，模型方程的重复性很高，经验证可以用来作为快速测定小球藻胞内油脂含量的简易方法。

Claims

1.一种微藻胞内油脂含量的快速测定方法，其特征在于包括以下步骤：

1）制作拍照用光箱；所述光箱设有箱体，箱体的底面为敞口，顶面中央设有通孔，在箱体内设有灯管，所述箱体的棱长为50cm，所述通孔的直径为5cm，箱体内壁为黑色；所述灯管设4根白色LED灯管，4根白色LED灯管设在灯箱内的四角；

2）将不同培养时期的藻液，倒在培养皿中，再放置在不透光板中央，然后放入光箱内，打开光源，用数码相机从箱体的顶面通孔拍照；

3）从小球藻照片上中央位置截取图像；

4）用MATLAB编写程序，分析图像上的R、G、B三种颜色的平均像素值，并绘制像素分布图；所述分析图像上的R、G、B三种颜色的平均像素值，是分析图像上10000个点的R、G、B三种颜色的平均像素值；

5）建立实测油脂含量与R、G、B三种颜色平均像素值关系的模型：Y_L=aR+bG+cB，求模型参数a、b、c；

6）建立模型后，通过拍照截图，用MATLAB编程读取RGB值，带入模型得到小球藻细胞中油脂的含量，单位为mg/g。

2.如权利要求1所述的一种微藻胞内油脂含量的快速测定方法，其特征在于在步骤2）中，所述培养皿采用一次性培养皿。

3.如权利要求1所述的一种微藻胞内油脂含量的快速测定方法，其特征在于在步骤2）中，所述不透光板采用白色不透光亚克力板。

4.如权利要求1所述的一种微藻胞内油脂含量的快速测定方法，其特征在于在步骤3）中，所述图像为100×100像素大小的图像。