CN102565012B

CN102565012B - 一种检测微藻含油量的方法

Info

Publication number: CN102565012B
Application number: CN201010620678.1A
Authority: CN
Inventors: 叶乃好; 徐东; 张晓雯
Original assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Current assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date: 2010-12-24
Filing date: 2010-12-24
Publication date: 2014-06-11
Anticipated expiration: 2030-12-24
Also published as: CN102565012A

Abstract

本发明涉及产脂微藻，具体地说是一种检测微藻含油量的方法，1)取进行微藻培养的藻液，计算微藻细胞的数量浓度C；2)微藻油脂观察：采用BODIPY 505/515染色荧光记录法；染料使用液浓度为1～2mM，染色1～2min后，使用激发波长488nm激发光，在荧光显微镜下观察并拍照记录单细胞油脂积累变化情况；根据照片记录单细胞油滴颗粒数目(n)，并测定油滴直径(d)，按照球体积公式计算每个油滴体积，每个细胞油脂含量为所有油滴体积的加和；根据微藻数量浓度C和单个细胞油脂含量计算单位体积藻液油脂含量：V_t＝CV，C为扁藻细胞浓度，V为单细胞油脂体积，V_t单位体积油脂含量。

Description

一种检测微藻含油量的方法

技术领域

本发明涉及产脂微藻，具体地说是一种检测微藻含油量的方法。

背景技术

作为一种重要的可再生资源，藻类具有分布广泛、生物量大、光合作用效率高、环境适应能力强、生长周期短、产量高等突出特点，藻类尤其是微型藻类的进一步开发利用，将提供新的资源来源。微藻作为能源原料的潜力巨大，其细胞中含独特的初级或次级代谢产物，化学成分复杂，太阳能转化效率可达到3.5％，是生产药品、精细化学品和新型燃料的潜在资源。从微藻中得到的脂肪酸可转化成脂肪酸甲酯，即生物柴油；在沸石催化剂的作用下，微藻通过热化学转化可生产出汽油型燃料；生长在海水中的绿藻，能积累大量游离的甘油以平衡环境中的盐浓度，其甘油的含量可占自身干重的85％。另外，随着全球石油能源短缺问题日益突出，微藻因具有光合作用效率高、含油量高、生长周期短、可减排CO₂、可利用有机废水、不与人争粮地水等独特优势，而被认为是发展潜力巨大、最有可能替代石油的生物能源原料，微藻生物柴油开发方兴未艾。

微藻已经成为能源等领域研究开发的热点，而研究开发的首要问题是获得产脂性状稳定、适应环境能力强的高效产脂微藻良种。尽管已有一些微藻藻株用于研究和中试规模生产，但仍存在产脂量不稳定、易污染、适应环境能力差等问题，难以用于规模化生产。因此，通过探索创新相关的技术和方法，建立产脂微藻的优良品系高效筛选技术体系，通过对自然界藻种及现有种质库藻种进行筛选和遗传改良，获得遗传性状稳定、生长速度快、抗逆性强、适合于规模化培养的高产脂微藻良种，已成为产脂微藻高效开发利用的迫切需求。

目前产油微藻筛选主要指标是微藻的含油量和生物量，而检测微藻含油量的方法主要有：1)传统的抽提法；2)染色荧光比色法；3)气相色谱法等。其中，传统抽提法和色谱法都费时费力，而且对仪器设备要求较高；染色比色法比较省时，但是只能测定微藻油脂的相对含量。因此，目前急需一种快速、简洁而且可以估算油脂含量的微藻油脂测定方法。

发明内容

本发明的目的活体检测微藻油脂的含量，使培养过程和油脂检测融为为一体，过程简单方便，是简单高效的定量检测方法。

一种检测微藻含油量的方法，

1)取进行微藻培养的藻液，计算藻液中微藻细胞的数量浓度C(个cell/ml)；

2)微藻油脂观察：采用BODIPY 505/515染色荧光记录法；使用有机溶剂二甲亚砜溶解BODIPY 505/515染料并配制成10～20mM的母液；染料使用液浓度为1～2mM，染色1～2min后，使用激发波长488nm激发光，在荧光显微镜下观察并拍照记录单细胞油脂积累变化情况；

根据照片记录单细胞油滴颗粒数目(n)，并测定油滴直径(d)，按照球体积公式计算每个油滴体积，每个细胞油脂含量为所有油滴体积的加和；

根据微藻数量浓度C和单个细胞油脂含量计算单位体积藻液油脂含量：V_t＝CV，C为扁藻细胞浓度，V为单细胞油脂体积，V_t单位体积油脂含量。

细胞计数法计算微藻细胞的数量；采用鲁哥氏液固定微藻的方法；在光学显微镜下利用血球计数仪记录各个时期微藻的细胞数目进而计算藻液浓度。

藻细胞染色后在488nm激发波长下，使用激光扫描共聚焦显微镜每隔0.01-0.5μm对藻细胞断层扫描并拍照记录，后经3D合成软件重建油滴3D图片表明油滴近似正球体；采用显微镜照相软件测定油滴颗粒直径。

1)以藻液中微藻细胞的培养时间为横坐标，以藻液中微藻细胞的数量浓度C为纵坐标，建立微藻生长动力学曲线；

2)根据微藻生长曲线和不同时期单细胞油脂体积，按上述试验方法计算各个培养时期单位体积藻液油脂含量Vt的变化，进而确定最佳产油时期，为实际生产提供一种简单、便捷、高效、低廉的检测油脂含量的方法。

实验操作

1、微藻培养。取处于对数生长期、活力旺盛的微藻作为实验藻种。设置一定的生长培养条件(温度、盐度、营养盐浓度等等)或培养方式(自养、异养等等)，研究并绘制微藻生长动力学曲线。本实验主要研究了亚心型扁藻在一个生长周期中油脂积累的情况。

2、细胞计数法计算微藻细胞的数量。采用鲁哥氏液固定微藻的方法。在光学显微镜下利用血球计数仪记录各个时期微藻的细胞数目进而计算藻液浓度。

3、微藻油脂观察采用BODIPY 505/515染色荧光记录法。使用有机溶剂二甲亚砜溶解BODIPY 505/515染料并配制成10mM的母液。染料使用液浓度为1mM，染色1min后，使用488nm激发波长，在荧光显微镜下观察并拍照记录单细胞油脂积累变化情况。

4、测量并记录单细胞油滴颗粒数目(n)和直径(d)，采用球体积公式计算单细胞油脂体积：

从而结合微藻生长曲线计算单位培养液中油脂的总量。

实验结果

能够快速、清晰地检测单细胞油滴积累情况，包括油滴体积大小和数目多少的变化。同时结合微藻生长曲线，通过简单的数学运算即可计算出各个培养时期单位体积培养液中油脂含量的变化。

本发明的优点

1.检测快速简单。本发明将微藻培养与检测方法融为一体，过程简单方便，即通过活体检测测定微藻油脂含量。需要时间较常规方法明显减少，单个样品检测只需要2分钟。

2.可以近似定量检测单位体积油脂的含量。荧光显微镜观察并测定油滴数目(n)和油滴直径(d)后，采用

计算单个微藻的油滴体积，从而通过生长曲线计算单位培养液中油脂的总量。

3.成本低。检测过程不需要高端的仪器设备和耗材，因此较常规方法成本低廉。

4.应用效果好。实验证明，BODIPY 505/515较尼罗红更能清晰的反应出油滴的轮廓和数量。

附图说明

图1为扁藻可见光(A)与荧光染色(B)图片对比；

图2为扁藻生长曲线；

图3为单细胞油脂体积变化；

图4为单位体积藻液油脂含量变化。

具体实施方式

实施例

材料与方法：

1)实验藻种实验用藻种亚心型扁藻(Platymonas subcordiformis)，取自中国水产科学院-黄海水产研究所微藻培养室。

2)培养条件实验用基本培养液配方为NaNO₃(120mg/L)，KH₂PO₄(4mg/L)，FeC₆H₅O₇(5mg/L)，维生素B₁(200μg/L)，维生素B₁₂(200μg/L)。微藻培养采用室内恒温培养法，在光化培养箱(GXZ智能型，宁波江南仪器厂)中进行。设置光照强度为120μmol·m^-2·s^-1，温度20±1℃，光周期12h(L):12h(D)。

3)实验方法

3.1)实验设计在上述培养条件下，取对数生长期藻种作为实验材料接种至上述培养液中，初始接种密度为2.375±0.916(×10⁴cell/ml)。设置3个平行样，测定扁藻生长曲线和油脂积累情况。

3.2)生长测定每隔2d从各实验组中取1mL藻液，加1～2滴鲁哥氏液固定藻细胞，以血球计数板在显微镜下计数藻细胞。每个样品计数3次，3次的计数结果相比较标准偏差不超过20％，否则要进行第4次计数。

3.3)荧光染色亲脂性荧光染料BODIPY 505/515溶解于有机溶剂(二甲亚砜)配制10mM/L的母液。使用时，取0.1μL母液注入1mL藻液中染色1min左右。使用荧光显微镜(Nikon Eclipse 80i)在蓝色激发光(488nm)下随机选取6个视野观察并拍照记录细胞内油脂颗粒分布情况。

3.4)油脂含量测定藻细胞染色后在488nm激发波长下，使用激光扫描共聚焦显微镜(Nikon ECLIPSE TE 2000-U)每隔0.5μm对藻细胞断层扫描并拍照记录，后经尼康EZ-C1软件处理系统，重建油滴3D图片表明油滴近似正球体。采用尼康NIS-elements BR软件测定油滴颗粒直径，根据球体积公式计算每个油滴体积，每个细胞油脂含量为所有油滴体积的加和：(其中d为油滴直径，n为单细胞油滴数)。根据扁藻生长曲线和单个细胞油脂含量计算单位体积藻液油脂含量：V_t＝CV(C为扁藻细胞浓度，V为单细胞油脂体积，V_t单位体积油脂含量)。

4)数据方法实验所有数据均表示为平均值±标准差(mean±SD)，采用SPSS 17.0统计软件进行单因子方差分析(One-Way ANOVA)和组间多重比较分析(LSD ANOVA)，P＜0.05为差异显著水平。

试验结果：

1)扁藻可见光与荧光染色对比

经亲脂性荧光染料BODIPY 505/515染色后，在488nm激发波长下扁藻细胞内油脂颗粒可被清晰标记出来。使用激光扫描共聚焦显微镜每隔0.5μm对藻细胞断层扫描并拍照记录，后经尼康EZ-C1软件处理系统，重建油滴3D图片表明油滴近似正球体。采用尼康NIS-elements BR软件测定图1B中油滴颗粒直径，波动范围为0.758±0.079～1.598±0.206μm，根据球体积公式计算每个油滴体积，波动范围为0.066±0.011μm³～2.866±0.868μm³.

2)扁藻生长曲线

取对数生长期的扁藻接种于上述(3.1)培养基中，初始接种浓度为2.375±0.916(×10⁴cell/ml)。随着培养时间，扁藻细胞经过短暂的延迟期至第4天进入对数期，细胞浓度迅速增加，至22天达到最大值之后进入平台期。在各时间点，取培养藻液1ml，血球计数板计数，计算各时间点细胞密度并绘制生长曲线如表1和图2所示。

表1扁藻细胞浓度

3)单细胞油脂体积测定

表2单细胞油脂体积

在各时间点取藻液1ml，加荧光染料(BODIPY 505/515)0.1μL，染色1min。使用荧光显微镜(Nikon Eclipse 80i)在蓝色激发光(488nm)下随机选取6个视野观察并拍照记录细胞内油脂颗粒分布情况。采用尼康NIS-elements BR软件测定油滴颗粒直径，根据球体积公式计算每个油滴体积，每个细胞油脂含量为所有油滴体积的加和：

(其中d为油滴直径，n为单细胞油滴数)。单细胞油脂体积随培养天数变化如图3和表2所示，在一个生长周期中，单细胞油脂积累有两个峰值，分别在第22天和第37天，且单因素方差(One-way ANOVA)分析表明，第37天油脂体积大于第22天。因此采用本实验方法可以随时检测单细胞油脂含量变化。

4)单位体积藻液油脂含量测定

表3单位体积油脂含量测定

根据扁藻生长曲线(图2)和单细胞油脂含量(图3)计算得出单位体积油脂含量变化如图4和表3所示。因此采用本实验方法可以随时检测单位体积藻液油脂含量变化，进而确定最佳产油时期，为实际生产提供一种简单、便捷、高效、低廉的检测油脂含量的方法。

Claims

1.一种检测微藻含油量的方法，其特征在于：

1)取进行微藻培养的藻液，计算藻液中微藻细胞的数量浓度C，C的单位为cell／ml；

2)微藻油脂观察：荧光染色亲脂性荧光染料BODIPY505／515溶解于有机溶剂配制10mM／L的母液，取0.1μL母液注入1mL-2mL藻液中染色1min-2min后，使用激发波长488nm激发光，在荧光显微镜下观察并拍照记录单细胞油脂积累变化情况；

根据照片记录单细胞油滴颗粒数目，并测定油滴直径，按照球体积公式计算每个油滴体积，每个细胞油脂含量为所有油滴体积的加和；

根据微藻细胞的数量浓度C和单个细胞油脂含量计算单位体积藻液油脂含量：V_t=CV，C为微藻细胞的数量浓度，V为单细胞油脂体积，V_t为单位体积油脂含量。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：

微藻细胞染色后在488nm激发波长下，使用激光扫描共聚焦显微镜每隔0.01-0.5μm对微藻细胞断层扫描并拍照记录，后经3D图像合成软件重建油滴3D图片，采用显微镜照相软件测定油滴颗粒直径。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：

1)以藻液中微藻细胞的培养时间为横坐标，以藻液中微藻细胞的数量浓度C为纵坐标，建立微藻生长曲线；

2)根据微藻生长曲线和不同时期单细胞油脂体积，按权利要求1所述方法计算各个培养时期单位体积藻液油脂含量V_t的变化。