CN104749314A - 一种酵母中甘油三酯的薄层层析检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酵母中甘油三酯的薄层层析检测方法，包括以下步骤：诱导培养酵母菌株；荧光染料染色，观察酵母中油体的情况；提取酵母油脂，将油脂溶解于正己烷中；切割硅胶板成尺寸合适的小块；使用玻璃点样毛细管在硅胶板上点样，点样之后用吸耳球吹干；将薄板放置在密闭层析缸中，使用展开剂从薄板的一端向另一端进行浸润展开的过程，当展开剂距薄板的上边缘1cm处时取出薄板，室温干燥；喷以显色剂，干燥薄板直至显现油脂成分斑点，标出甘油三酯的位置。本发明方法操作简单，耗材常见易得，分析简易准确，需要的样品量少，具有很好的通用性，是一种实验室中方便快捷的酵母油脂中甘油三酯的定性检测方法。
Description
技术领域
本发明涉及酵母中甘油三酯的薄层层析检测方法，属于酵母油脂成分分析技术领域。
背景技术
薄层层析法是一种在覆有一层吸附剂的薄层板来分离混合物的技术。薄层板可以是玻璃、塑胶、铝箔纸等；吸附剂也称为固定相，通常为硅胶、三氧化二铝、纤维素等。在薄层板上点样后放入封闭展开缸，由展开剂(一般为混合溶剂)携带混合样品向上移动，混合样中的不同组分因在薄层板上的吸附和解析能力不同而分离开来，通过适当技术对被展开的组分斑点进行处理可得到定性和定量的检测结果。
薄层层析法适用于微量样品的分离、鉴定和制备，不仅可以分离混合物并测定目标样品的纯度，也可以监测反应过程。薄层色谱法技术简单、易于操作、分析速度快、结果直观，不需复杂仪器设备就可以分离比较复杂混合物。
在色谱技术出现以后，油脂分析有了迅速的发展。在油脂分析的色谱法中以气相色谱和薄层层析法最为普遍。薄层层析法有设备简单、操作方便且快速的优点，特别是近年来薄层直接定量扫描仪准确度提高之后，薄层层析法已不再单纯地用于分离。
本研究发明的酵母油脂中甘油三酯的定性检测方法操作简单、可靠，耗材常见易得，分析简易准确，需要的样品量少，具有很好的通用性，是一种实验室中方便快捷的甘油三酯检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种适合实验室操作的方便快捷的酵母中甘油三酯的薄层层析检测方法。
为达到上述目的，本发明采用以下步骤：
诱导培养酵母菌株；荧光染料染色，观察酵母中油体的情况；提取酵母油脂，将油脂溶解于正己烷中；切割硅胶板成尺寸合适的小块；使用玻璃点样毛细管在硅胶板上点样，点样之后用吸耳球吹干；将薄板放置在密闭层析缸中，使用展开剂从薄板的一端向另一端进行浸润展开的过程，当展开剂距薄板的上边缘1cm处时取出薄板，室温干燥；喷以显色剂，干燥薄板直至显现油脂成分斑点，标出甘油三酯的位置。具体来说，所述的方法如下：
(1)诱导培养酵母菌株，并收集菌体；
(2)采用荧光染料BODIPY505/515对酵母细胞染色，染料使用液浓度为2uM，染色1min后，使用激发波长488nm激发光，在荧光显微镜下观察并拍照记录酵母中油体的情况；
(3)冷冻干燥新鲜的酵母菌体获得干组织。称取酵母干粉0.2g(m)，液氮研磨。采用甲醇-氯仿(2:1，V:V)提取液提取酵母油脂，并采用重量法计算油脂的含量；
(4)将酵母油脂样品溶解于正己烷中；
(5)采用钻石头玻璃刀和引导尺切割硅胶板成尺寸合适的小块；
(6)使用玻璃点样毛细管在硅胶板上点样，点样之后用吸耳球吹干；
(7)当样点上的溶剂充分挥干后，将薄板放置在密闭层析缸中，使用展开剂从薄板的一端向另一端进行浸润展开的过程。当展开剂距薄板的上边缘1cm处时取出薄板，室温干燥。
(8)喷以显色剂，干燥薄板直至显现油脂成分斑点，标出甘油三酯的位置。
优选地，步骤(4)中溶解后油脂样品浓度为2mg/ml。
优选地，步骤(5)所述的硅胶板为GF254硅胶板。
优选地，步骤(6)所述的璃点样毛细管内径为内径0.5mm，管长100mm。点样之前先采用正己烷清洗玻璃点样毛细管2-3次。用尺子和铅笔在薄板的硅胶面上距离底边1-1.5cm处轻轻标出基线的位置(注意不要损坏硅胶面)。将样品在标记过的基线处，距离硅胶板左侧边缘约1cm处进行点样，点样量适当，样点直径小于2-3mm。点样之后用吸耳球吹干，在同一位置连续点样4-6次。多个样点时，间隔为2cm且处于同一直线上。点下一个样品之前清洗点样毛细。
优选地，步骤(7)所述的展开剂为正己烷-乙醚-乙酸，体积比例为50:50:1。薄层浸入时不能歪斜进入。
优选地，步骤(8)中所述的显色剂为大茴香醛-乙酸-浓硫酸，体积比例为1:100:2。将干燥的薄板用镊子夹起，在通风橱中喷以显色剂，确保从基线到溶剂前沿都被喷到。用吹风机干燥薄板直至显现油脂成分斑点。在斑点变得可见而且背景颜色未能遮盖住斑点之前，停止加热，拍照，标出甘油三酯的位置。
本发明方法所用设备简单，操作方便，目标斑点定位清晰，检测结果准确有效，分离时间短，分离能力强，灵敏度高，是一种既简单易行又经济可靠的方法。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步说明本发明的技术方案，本发明包括但不限于以下实施方式。根据现有技术对本发明所进行的不脱离本发明实质内容的改变，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae H1246是甘油三酯(TAG)合成缺陷突变株，其中编码TAG合成的DGA1(编码DGAT)和LRO1(编码PDAT)以及编码固醇脂合成的基因ARE1和ARE2都被敲除了。因此H1246不能合成甘油三酯(TAG)，且不能形成油体。分别挑取野生型菌株INVSc1和突变型菌株H1246的单菌落至5-10ml YPD液体培养基中。设定震荡培养箱28℃，200rpm培养12-16h。测定将上述培养物的OD600，当OD600＝0.4时4000rpm离心收集菌体，转移至100ml YPD液体培养基中，继续培养2-3d。亲脂性荧光染料BODIPY 505/515溶解于有机溶剂(二甲亚矾)配制成10mM/l的母液，保存于-20℃。酵母细胞染色时，取0.2ul母液注入lml酵母细胞悬浮液中染色lmin左右。使用荧光显微镜(Nikon Eclipse 80i)在蓝色激发光(488nm)下观察并拍照记录酵母细胞内油体情况。4℃条件下6000r/min转速离心10min，收集酵母菌体。将收集的菌体进行冷冻干燥，于-70℃超低温冰箱保存。用万用天平准确称取酵母干粉0.2g(m)，放入事先已处理(酒精烧除杂质)干净的研钵中，加入液氮反复研磨，以破坏组织细胞壁。加入7.0ml甲醇-氯仿(2:1，V:V)提取液到研钵中，充分转移组织提取液和残渣到15ml玻璃管中，超声(300w，28kHz)10min混匀。6000r/min转速离心15min，采用胶头滴管吸取上层有机相到新的15ml玻璃管中，残渣先后加3ml、2ml、1ml甲醇-氯仿(2:1，V:V)，超声5min混匀，6000r/min转速离心15min，保留上层有机相。合并有机相提取液转移到25ml分液漏斗中，加入2.5ml氯仿和3.0ml 1％氯化钠溶液，混匀，静置分层，分为三层，回收下层。加2.5ml氯仿于原上、中层溶液中再萃取一次，再加2.5ml氯仿于原上、中层溶液中再萃取一次，合并下层液，置于提脂瓶中。提脂瓶使用前已在105℃烘箱中干燥2h，放入干燥器冷却至恒重，于万用天平称量得到提脂瓶的重量(m1)。采用氮吹仪，50℃水浴加热，氮气挥干溶剂至恒重。把提脂瓶置入105℃烘箱中干燥2h，放入干燥器冷却至恒重，于万用天平称量得到总脂和提脂瓶的总重量(m2)。采用重量法计算总脂的含量，公式如下：ω＝(m2－m1)/m×100％。将酵母油脂样品溶解于正己烷中，溶解后油脂样品浓度为2mg/ml。采用钻石头玻璃刀和引导尺切割GF254硅胶板(青岛海洋化工厂产品)成尺寸合适的小块。薄层点样：点样之前先采用正己烷清洗玻璃点样毛细管(内径0.5mm，管长100mm)2-3次。用尺子和铅笔在薄板的硅胶面上距离底边1-1.5cm处轻轻标出基线的位置(注意不要损坏硅胶面)。将样品在标记过的基线处，距离硅胶板左侧边缘约1cm处进行点样，点样量适当，样点直径小于2-3mm。点样之后用吸耳球吹干，在同一位置连续点样4-6次。多个样点时，间隔为2cm且处于同一直线上。点下一个样品之前清洗点样毛细管。展开：当样点上的溶剂充分挥干后，将薄板放置在密闭层析缸中，使用展开剂从薄板的一端向另一端进行浸润展开的过程。采用的展开剂为正己烷-乙醚-乙酸(50:50:1，V:V:V)。薄层浸入时不能歪斜进入。当展开剂距薄板的上边缘1cm处时取出薄板，室温干燥。显色：将干燥的薄板用镊子夹起，在通风橱中喷以显色剂，确保从基线到溶剂前沿都被喷到。显色剂为大茴香醛-乙酸-浓硫酸(1:100:2，V:V:V)。用吹风机干燥薄板直至显现油脂成分斑点。在斑点变得可见而且背景颜色未能遮盖住斑点之前，停止加热，拍照，标出甘油三酯的位置。BODIPY 505/515染色发现，野生型酵母菌株INVSc1中能够检测到油体，而突变型菌株H1246中检测不到油体。薄层层析发现，在野生型菌株INVSc1中能检测到TAG的斑点，而在突变型菌株H1246中不能检测到TAG的斑点。该结果与荧光染色获得的结果一致。
实施例2
分别挑取转花生AhDGAT1-1、AhDGAT1-2、AhDGAT3-3基因和pYES2空载的H1246酵母单菌落至5-10ml SC-U(尿嘧啶缺陷的合成完全培养基)液体培养基中(培养基中不要添加葡萄糖，添加过滤除菌的2％(W/V)的半乳糖)。设定震荡培养箱28℃，200rpm培养12-16h。测定将上述培养物的OD600，当OD600＝0.4时4000rpm离心收集菌体，转移至100ml含有2％半乳糖的SC-U培养基，继续培养，测定培养物OD600。当OD600＝1时4000rpm收集菌体，转移至添加2％(W/V)的半乳糖和1％棉籽糖(W/V)的培养基，将温度降至22℃继续培养2-3d。亲脂性荧光染料BODIPY 505/515溶解于有机溶剂(二甲亚矾)配制成10mM/l的母液，保存于-20℃。酵母细胞染色时，取0.2ul母液注入lml酵母细胞悬浮液中染色lmin左右。使用荧光显微镜(Nikon Eclipse 80i)在蓝色激发光(488nm)下观察并拍照记录酵母细胞内油体情况。4℃条件下6000r/min转速离心10min，收集酵母菌体。将收集的菌体进行冷冻干燥，于-70℃超低温冰箱保存。用万用天平准确称取酵母干粉0.2g(m)，放入事先已处理(酒精烧除杂质)干净的研钵中，加入液氮反复研磨，以破坏组织细胞壁。加入7.0ml甲醇-氯仿(2:1，V:V)提取液到研钵中，充分转移组织提取液和残渣到15ml玻璃管中，超声(300w，28kHz)10min混匀。6000r/min转速离心15min，采用胶头滴管吸取上层有机相到新的15ml玻璃管中，残渣先后加3ml、2ml、1ml甲醇-氯仿(2:1，V:V)，超声5min混匀，6000r/min转速离心15min，保留上层有机相。合并有机相提取液转移到25ml分液漏斗中，加入2.5ml氯仿和3.0ml 1％氯化钠溶液，混匀，静置分层，分为三层，回收下层。加2.5ml氯仿于原上、中层溶液中再萃取一次，再加2.5ml氯仿于原上、中层溶液中再萃取一次，合并下层液，置于提脂瓶中。提脂瓶使用前已在105℃烘箱中干燥2h，放入干燥器冷却至恒重，于万用天平称量得到提脂瓶的重量(m1)。采用氮吹仪，50℃水浴加热，氮气挥干溶剂至恒重。把提脂瓶置入105℃烘箱中干燥2h，放入干燥器冷却至恒重，于万用天平称量得到总脂和提脂瓶的总重量(m2)。采用重量法计算总脂的含量，公式如下：ω＝(m2－m1)/m×100％。将酵母油脂样品溶解于正己烷中，溶解后油脂样品浓度为2mg/ml。采用钻石头玻璃刀和引导尺切割GF254硅胶板(青岛海洋化工厂产品)成尺寸合适的小块。薄层点样：点样之前先采用正己烷清洗玻璃点样毛细管(内径0.5mm，管长100mm)2-3次。用尺子和铅笔在薄板的硅胶面上距离底边1-1.5cm处轻轻标出基线的位置(注意不要损坏硅胶面)。将样品在标记过的基线处，距离硅胶板左侧边缘约1cm处进行点样，点样量适当，样点直径小于2-3mm。点样之后用吸耳球吹干，在同一位置连续点样4-6次。多个样点时，间隔为2cm且处于同一直线上。点下一个样品之前清洗点样毛细管。展开：当样点上的溶剂充分挥干后，将薄板放置在密闭层析缸中，使用展开剂从薄板的一端向另一端进行浸润展开的过程。采用的展开剂为正己烷-乙醚-乙酸(50:50:1，V:V:V)。薄层浸入时不能歪斜进入。当展开剂距薄板的上边缘1cm处时取出薄板，室温干燥。显色：将干燥的薄板用镊子夹起，在通风橱中喷以显色剂，确保从基线到溶剂前沿都被喷到。显色剂为大茴香醛-乙酸-浓硫酸(1:100:2，V:V:V)。用吹风机干燥薄板直至显现油脂成分斑点。在斑点变得可见而且背景颜色未能遮盖住斑点之前，停止加热，拍照，标出甘油三酯的位置。BODIPY 505/515染色发现，在三个转基因酵母突变株中均能观察到油体的存在，而在转空载的菌株中观察不到油体。薄层层析发现，在三个转基因酵母突变株中均能检测到TAG的斑点，而在转空载菌株中不能检测到TAG的斑点，这说明AhDGAT1-1、AhDGAT1-2和AhDGAT3-3基因在酿酒酵母突变株中的表达恢复了H1246的合成TAG的能力，表明克隆所得的三个基因编码具有DGAT酶活性的蛋白，该结果与荧光染色获得的结果一致。使用GC-MS测定转基因酵母突变株脂肪酸成分和含量，分析花生3个DGAT基因的表达是否影响酵母突变株自身脂肪酸组分和含量的变化。将3个转基因菌株与阴性对照菌株(H1246和pYES2)的脂肪酸成分进行比较发现，3个转基因酵母突变株中的C16:1和C18:0含量明显降低；C16:0、C18:1和C18:2的含量显著提高。与阴性对照酵母突变株的脂肪酸含量比较，转AhDGAT基因的酵母突变株的C16:1和C18:1分别降低了64％-77％和35％-60％。相反，在转AhDGAT基因的酵母突变株中的C16:0的含量提高了1倍以上，C18:2的含量提高至15倍，C18:1的含量则增加了4％-11％。这些结果表明，3个花生DGAT基因在酵母突变株中的表达促进了酵母内源不饱和脂肪酸向脂类的转变。
Claims (6)
1.一种酵母中甘油三酯的薄层层析检测方法，包括以下步骤：
(1)诱导培养酵母菌株，并收集菌体；
(2)采用荧光染料BODIPY505/515对酵母细胞染色，染料使用液浓度为2uM，染色1min后，使用激发波长488nm激发光，在荧光显微镜下观察并拍照记录酵母中油体的情况；
(3)冷冻干燥新鲜的酵母菌体获得干组织，称取酵母干粉0.2g(m)，液氮研磨，采用甲醇-氯仿(2:1，V:V)提取液提取酵母油脂，并采用重量法计算油脂的含量；
(4)将酵母油脂样品溶解于正己烷中；
(5)采用钻石头玻璃刀和引导尺切割硅胶板成尺寸合适的小块；
(6)使用玻璃点样毛细管在硅胶板上点样，点样之后用吸耳球吹干；
(7)当样点上的溶剂充分挥干后，将薄板放置在密闭层析缸中，使用展开剂从薄板的一端向另一端进行浸润展开的过程，当展开剂距薄板的上边缘1cm处时取出薄板，室温干燥；
(8)喷以显色剂，干燥薄板直至显现油脂成分斑点，标出甘油三酯的位置。
2.根据权利要求1所述的一种酵母中甘油三酯的薄层层析检测方法，其特征在于，步骤(4)中溶解后油脂样品浓度为2mg/ml。
3.根据权利要求1所述的一种酵母中甘油三酯的薄层层析检测方法，其特征在于，步骤(5)所述的硅胶板为GF254硅胶板。
4.根据权利要求1所述的一种酵母中甘油三酯的薄层层析检测方法，其特征在于，步骤(6)所述的璃点样毛细管内径为内径0.5mm，管长100mm，点样之前先采用正己烷清洗玻璃点样毛细管2-3次，用尺子和铅笔在薄板的硅胶面上距离底边1-1.5cm处轻轻标出基线的位置(注意不要损坏硅胶面)，将样品在标记过的基线处，距离硅胶板左侧边缘约1cm处进行点样，点样量适当，样点直径小于2-3mm，点样之后用吸耳球吹干，在同一位置连续点样4-6次，多个样点时，间隔为2cm且处于同一直线上，点下一个样品之前清洗点样毛细管。
5.根据权利要求1所述的一种酵母中甘油三酯的薄层层析检测方法，其特征在于，步骤(7)所述的展开剂为正己烷-乙醚-乙酸，体积比例为50:50:1。
6.根据权利要求1所述的一种酵母中甘油三酯的薄层层析检测方法，其特征在于，步骤(8)中所述的显色剂为大茴香醛-乙酸-浓硫酸，体积比例为1:100:2，将干燥的薄板用镊子夹起，在通风橱中喷以显色剂，确保从基线到溶剂前沿都被喷到，用吹风机干燥薄板直至显现油脂成分斑点在斑点变得可见而且背景颜色未能遮盖住斑点之前，停止加热，拍照，标出甘油三酯的位置。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: No. 38, Zhifu Road, Wangcheng Subdistrict Office, Laixi, Shandong Applicant after: Shandong Peanut Inst. Address before: Licang District of Shandong Province million years road Qingdao City No. 126 Applicant before: Shandong Peanut Inst. |
|
| COR | Change of bibliographic data | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20150701 |