CN101624634A

CN101624634A - 斑节对虾杆状病毒现场快速高灵敏检测试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN101624634A
Application number: CN200910017895A
Authority: CN
Inventors: 张庆利; 黄倢; 宋晓玲; 刘莉
Original assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Current assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date: 2009-08-18
Filing date: 2009-08-18
Publication date: 2010-01-13
Anticipated expiration: 2029-08-18
Also published as: CN101624634B

Abstract

本发明涉及一种斑节对虾杆状病毒现场快速高灵敏检测试剂盒及检测方法。本发明的检测试剂盒包括：采样管、内装蒸馏水的漂洗管、内装TE缓冲液的核酸变性管、内装扩增反应液和核酸染料的扩增检测管、阴性对照管、阳性对照管、FTA膜片及其快速干燥液等。本发明的检测方法具有比普通PCR检测方法更高的特异性、灵敏性和便捷性，并且成本非常低，无毒，安全，使用方便，检测更准确、快速，且灵敏度极高，可以替代已有的相关检测方法如病理切片法、电镜观察法、抗体检测法和PCR检测法。本发明的检测试剂盒和检测方法不仅可在室内的实验室使用，也可在野外的生产现场使用，对加强斑节对虾杆状病毒的流行病学监测和疾病防控意义重大，具有很高的推广应用价值。

Description

斑节对虾杆状病毒现场快速高灵敏检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及海洋生物病原检测技术，具体是斑节对虾杆状病毒(Monodon Baculovirus，简称MBV)的现场快速高灵敏检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

斑节对虾杆状病毒，又名草虾杆状病毒(Grass Shrimp Baculovirus)、斑节对虾型杆状病毒(Penaeusmonodon-type Baculovirus)，是一种双链DNA杆状病毒，MBV可以感染斑节对虾(Penaeus monodon)、长毛对虾(P.penicillatus)、墨吉对虾(P.merguiensis)、短沟对虾(P.semisulcatus)、新对虾等多种养殖及野生对虾。该病毒严重感染时可导致对虾幼体大量死亡，使对虾育苗及养殖遭受经济损失，影响水产养殖业的稳定和可持续发展。所以开发新的技术快速、准确、灵敏地检测MBV，加强对虾苗种和成虾检疫以及养殖水体环境的监测，对预防病毒感染，切断病毒传播，保障我国对虾养殖业的健康持续发展具有重要意义。

目前，有关MBV检测还主要依赖于病理切片法、电镜观察法和PCR检测法。病理切片法不能直接对病毒进行检测，只能利用发病的组织病理征兆进行检测，并且还局限于在实验室内进行；电子显微镜技术虽然可以直接观察到病毒粒子的存在，但其操作复杂、耗费时间长、准确性低；用抗体检测法检测MBV虽然在速度上优于病理切片法，但其灵敏度较低，在MBV尚未引发感染或感染的极早期很难用抗体法检测出来；MBV的PCR检测法，虽然克服了前面几种方法的缺点，在实验室条件下能实现对MBV的相对快速、准确检测，但由于常规的PCR检测需要昂贵的PCR仪、凝胶电泳和成像系统，使得PCR检测法难以用于现场的快速检测，这大大限制了PCR检测方法在现场生产中的推广应用。

发明内容

本发明的目的是要提供一种适于生产现场应用、快速、高灵敏度且易操作的斑节对虾杆状病毒检测方法，并将检测方法标准化，同时将检测试剂集中于规范的试剂盒中，以克服现有技术的不足，使MBV的检测更准确、灵敏、快速、安全和方便。

首先，本发明利用针对MBV多角蛋白基因中保守区段设计的4条特异引物和一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在恒定温度下对目的核酸进行扩增，实现对MBV的快速和高灵敏检测。为了进一步缩短检测时间、消除检测过程中可能发生的污染、简化检测步骤，使检测实验能够在生产现场开展，本发明对MBV的实验室检测方法进行了优化。在用FTA卡片制备样品核酸的标准步骤中，需要将被样品匀浆液润湿的FTA膜片在室温下干燥至少一个小时，然后才能进行漂洗；本发明通过在被样品匀浆液润湿的FTA膜片上滴加亲水性且易挥发的醇类物质(主要是叔醇、伯醇和仲醇)，使润湿的FTA膜片在室温条件下只需10分钟即可完成干燥过程，大大缩短了样品核酸制备的时间。在利用等温扩增方法检测病原时，目前普遍采用扩增反应结束后向反应管中添加核酸染料以判断检测结果的方法；由于等温扩增反应的产物量非常大，这种打开反应管再添加核酸染料的方法极易导致后续待检样品被污染而使检测结果出现假阳性；有报道和专利采用在扩增反应试剂中添加尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)的方法消除污染风险，但却增加了成本；本发明先将核酸染料粘附到扩增反应管的内侧上方或盖子内侧，等扩增反应结束后再通过上下反复震荡使扩增反应液和核酸染料混合，这样不打开扩增反应管就能完成扩增产物的染色，消除了打开扩增反应管再添加核酸染料过程中反应液可能溅出造成后续样品被污染的风险。在用FTA卡片制备样品核酸的标准步骤中，需要用Whatman公司(英国)专门的纯化试剂反复漂洗FTA膜片；本发明无需专门的纯化试剂，采用普通的蒸馏水漂洗即可完成FTA膜片的纯化，这样不仅简化了检测实验的操作步骤，还降低了成本。为了使该方祛在生产现场更具实用性，本发明在上述优化的基础上，将检测MBV病毒所需的试剂与器材进行了组装，使之标准化、配套化，形成了检测试剂盒。

本发明的检测试剂盒包括：

(1)采样管，用来盛放、研磨待检样品；

(2)漂洗管，内装蒸馏水；

(3)核酸变性管，内装TE缓冲液；

(4)扩增检测管，内装扩增反应液和核酸染料，扩增反应液组成成分如下：扩增引物MBV-F1和MBV-B1各1～2μM，扩增引物MBV-F2和MBV-B2各0.1～0.4μM，dATP、dTTP、dGTP和dCTP各0.8～2.0mM，MgCl₂4～10mM，Betaine(甜菜碱)0.6～1.2M，Tris-HCl 10～40mM，KCl 10～20mM，MgSO₄ 1～4mM，(NH₄)₂SO₄ 6～12mM，TritonX-100 0.05％～1.0％，具有链置换活性的DNA聚合酶2～20U；核酸染料为分子生物学研究中常用的核酸染料，包括但不限于SYBR Green、GelRed、GelGreen、GoldView^TM、GeneFinder^TM等；且核酸染料预先粘附于扩增检测管管壁内侧上方或扩增检测管盖子内侧；

(5)阴性对照管，内装无斑节对虾杆状病毒核酸的FTA膜片；

(6)阳性对照管，内装吸附了斑节对虾杆状病毒核酸的FTA膜片；

(7)快速干燥液，为亲水性且易挥发的醇类物质；

(8)FTA膜片、研磨棒、牙签和吸管分别封装于无菌袋中；

(9)包装盒，内装一块有多个小孔的泡沫板或海绵块；

(10)使用说明书。

上述检测试剂盒中所述的扩增引物是根据MBV多角蛋白基因保守区序列设计的，其核苷酸序列如下：

上游引物1：5′-CCAGATTCCATAGGCAATAGATGATTTTTTAGAATTCAACGATATGAACGG

下游引物1：5′-AACAGACACTTATGAGATGCCATCTTTTGATATGGTTGGTGTGCGG

上游引物2：5′-CTCCAGGGGATAATCCAATT

下游引物2：5′-TGAGGAGACTTCCAAGAGT。

用本发明的试剂盒检测对虾MBV的方法，按下列步骤进行：

(1)取样品对虾组织约0.02～1.0g置于采样管中，用研磨棒将样品对虾组织磨碎至浆状；

(2)用研磨棒蘸取浆状的样品对虾组织将FTA膜片充分润湿；

(3)吸取快速干燥液滴于上述FTA膜片上，静置10～20min；

(4)用牙签将上述FTA膜片转移到漂洗管内，震荡漂洗管3～5min以洗涤FTA膜片；

(5)用牙签将上述漂洗管内的FTA膜片转移到核酸变性管内，95℃保温3～6min，让DNA双链充分解链，然后再迅速置于室温条件下2～5min，使FTA膜片上的核酸DNA保持两条单链状态；

(6)再用牙签将上述核酸变性管内的FTA膜片转移到扩增检测管内，将扩增检测管置于55～65℃条件下保温40～70min；

(7)将扩增检测管上下反复甩动1-3min，使扩增反应液与粘附于扩增检测管管壁或管盖上的核酸染料充分混匀；

(8)用力向下甩动扩增检测管，使管内混有核酸染料的扩增反应液集聚于扩增检测管底部，用眼睛观察反应液，如果反应液呈现绿色则表示该样品的MBV检测结果为阳性，如果反应液呈现橙黄色则表示该样品的MBV检测结果为阴性。

在上述步骤中，从第(4)步开始应将作为阴性对照的无斑节对虾杆状病毒核酸的FTA膜片、作为阳性对照的吸附了斑节对虾杆状病毒核酸的FTA膜片，以及吸附了样品核酸的FTA膜片一起处理，直至完成检测反应。

本发明的积极效果在于：在试剂盒中汇集MBV现场快速检测所需的FTA膜片、TE缓冲液、扩增反应液、核酸染料等试剂和研磨棒、牙签、吸管等器材，使得MBV的检测能够快速有序地进行，实现了检测过程的程序化和标准化，使得操作规范、不易出错；本发明依据优选的MBV多角蛋白基因保守区序列所设计的扩增引物不仅能有效检测MBV的所有毒株，而且与其他杆状病毒的多角体蛋白基因无同源性，检测特异性非常好；采用醇类物质对取样后的FTA膜片进行快速干燥处理，使得样品核酸的制备时间大大缩短；采用内置核酸染料，在反应结束后不用打开反应管即可直接对反应液进行染色，避免了打开反应管再添加核酸染料使后续待检样品被扩增产物污染而造成假阳性的结果，从而大大提高了可靠性。使用本发明在1.5～2小时内就可完成对虾MBV的检测，检测过程无需昂贵的仪器设备如离心机、PCR仪和凝胶成像系统，仅需水浴锅或金属浴甚至更简单的保温装置即可；而且检测结果非常容易判别；与对虾MBV已有检测技术相比，本发明的检测方法成本非常低，整个过程不涉及有毒试剂，对操作人员和环境都非常安全，并且检测灵敏度极高，可以替代斑节对虾杆状病毒之前的相关检测方法如病理切片法、电镜观察法、抗体检测法和PCR检测法；本发明的检测试剂盒不仅可在实验室使用，也可在野外生产现场使用，对加强MBV的流行病学监测和疾病防控意义重大，具有很高的推广应用价值。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：斑节对虾杆状病毒现场快速高灵敏检测试剂盒

本发明的试剂盒由以下部件组成(可检测4个样品的包装)：

(1)采样管，4个，用来盛放、研磨待检样品；

(2)漂洗管，6个，每个管内装有1ml的蒸馏水；

(3)核酸变性管，6个，每个管内装有20μL的TE缓冲液(含10mM Tris-HCl和1mM EDTA，pH8.0)；

(4)扩增检测管，6个，每个管内装有25μL扩增反应液和1μL的核酸染料，扩增反应液组成成分如下：扩增引物的上游引物1和下游引物1各1.6μM，扩增引物的上游引物2和下游引物2各0.2μM，dATP、dTTP、dGTP和dCTP各1.4mM，MgCl₂ 8mM，Betaine(甜菜碱)1.2M，Tris-HCl 20mM，KCl10mM，MgSO₄ 2mM，(NH₄)₂SO₄ 10mM，Triton X-100 0.1％，Bst DNA聚合酶8U；核酸染料成分为稀释10倍的GeneFinder^TM，且核酸染料粘附固定于扩增检测管的管盖内侧。

(5)阴性对照管，1个，内装无斑节对虾杆状病毒核酸的FTA膜片；

(6)阳性对照管，1个，内装吸附了斑节对虾杆状病毒核酸的FTA膜片；

(7)快速干燥液，1管，内装500μL无水乙醇；

(8)FTA膜片(4片)、研磨棒(4个)、牙签(6个)和吸管(1个)分别封装于无菌袋中；

(9)包装盒(1个)，内装一块有多个小孔的海绵块，海绵块上有小孔4×6个；

(10)使用说明书，1份。

实施例2本发明的斑节对虾杆状病毒等温扩增检测方法

使用实施例1中的检测试剂盒，按下列步骤进行：

(1)取样品对虾组织约0.1g置于采样管中，用研磨棒快速将样品磨碎至浆状；

(2)用研磨棒蘸取浆状的样品将FTA膜片充分润湿；

(3)吸取快速干燥液滴于上述FTA膜片上，将FTA膜片室温静置10min；

(4)用牙签将上述FTA膜片转移到漂洗管内，将漂洗管剧烈震荡3min；

(5)用牙签将上述漂洗管内的FTA膜片转移到核酸变性管内，95℃保温3min，让DNA双链充分解链，然后再迅速置于室温条件下2min，目的是使核酸DNA保持呈两条单链状态；

(6)再用牙签将上述核酸变性管内的FTA膜片转移到扩增检测管内，将扩增检测管置于58℃条件下保温60min；

(7)将扩增检测管上下反复用动2min，使扩增反应液与管盖上的核酸染料充分混匀；

(8)然后用力向下甩动扩增检测管，使管内混有核酸染料的扩增反应液聚于扩增检测管底部，用眼睛观察扩增反应液，如果呈现绿色则表示该样品的MBV检测结果为阳性，如果呈现橙黄色则表示该样品的MBV检测结果为阴性。

在上述步骤中从第4步开始，应将无斑节对虾杆状病毒核酸的FTA膜片、吸附了斑节对虾杆状病毒核酸的FTA膜片和吸附了样品核酸的FTA膜片一起处理，直至完成检测反应，分别用作检测的阴性和阳性对照。

本发明中所述的FTA膜片是英国Whatman公司用来制备核酸的FTA卡片；将FTA卡片裁切成长×宽不小于1毫米×1毫米的纸片或打孔成直径不小于1毫米的纸片即可制成FTA膜片。

本发明使用的试剂和材料：引物由上海生物工程有限责任公司合成；乙二胺四乙酸二钠、三羟甲基氨基甲烷、dNTP、甜菜碱(Betaine)、dATP、dGTP、dCTP和dTTP、KCl、MgSO₄、(NH₄)₂SO₄、MgCl₂、TritonX-100购自上海生物工程有限责任公司；等温扩增用的BstDNA聚合酶等购自NEB公司；核酸染料GeneFinder^TM购自厦门百维信生物科技有限公司。

<110>中国水产科学研究院黄海水产研究所

<120>斑节对虾杆状病毒现场快速高灵敏检测试剂盒及检测方法

<160>4

<210>1

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据斑节对虾杆状病毒多角蛋白基因序列和等温扩增引物设计要求而设计，用作斑节对虾杆状病毒等温扩增检测的上游引物1

<400>1

ccagattcca taggcaatag atgatttttt agaattcaac gatatgaacg g 51

<210>2

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据斑节对虾杆状病毒多角蛋白基因序列和等温扩增引物设计要求而设计，用作斑节对虾杆状病毒等温扩增检测的下游引物1

<400>2

aacagacact tatgagatgc catcttttga tgatgttggt gtgcgg 46

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据斑节对虾杆状病毒多角蛋白基因序列和等温扩增引物设计要求而设计，用作斑节对虾杆状病毒等温扩增检测的上游引物2

<400>3

ctccagggga taatccaatt 20

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据斑节对虾杆状病毒多角蛋白基因序列和等温扩增引物设计要求而设计，用作斑节对虾杆状病毒等温扩增检测的下游引物2

<400>4

tgaggagact tccaagagt 19

Claims

1.一种斑节对虾杆状病毒现场快速高灵敏检测试剂盒，其特征是该检测试剂盒包括：

(1)采样管，用来盛放、研磨待检样品；

(2)漂洗管，内装蒸馏水；

(3)核酸变性管，内装TE缓冲液；

(4)扩增检测管，内装扩增反应液和核酸染料；

(5)阴性对照管，内装无斑节对虾杆状病毒核酸的FTA膜片；

(7)快速干燥液；

(8)FTA膜片、研磨棒、牙签和吸管分别封装于无菌袋中；

(9)包装盒，内装一块有多个小孔的泡沫板或海绵块；

(10)使用说明书。

2.如权利要求1所述的检测试剂盒，其中所述的核酸染料为分子生物学中应用的核酸染料，包括但不限于SYBR Green、GelRed、GelGreen、GoldView^TM或GeneFinder^TM。

3.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于所述的快速干燥液是亲水性且易挥发的醇类物质。

4.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于上述扩增检测管内的核酸染料粘附于扩增检测管的管壁内侧上方或扩增检测管的管盖内侧。

5.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于所述的FTA膜片为英国Whatman公司用来制备核酸的FTA卡片裁切成尺度1毫米的纸片而成。

6.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于上述的扩增反应液由以下组份组成：扩增引物的上游引物1和下游引物1各1～2μM，扩增引物的上游引物2和下游引物2各0.1～0.4μM，dATP、dTTP、dGTP和dCTP各0.8～2.0mM，MgCl₂ 4～10mM，甜菜碱0.6～1.2M，Tris-HCl 10～40mM，KCl 10～20mM，MgSO₄ 1～4mM，(NH₄)₂SO₄6～12mM，Triton X-1000.05％～1.0％，具有链置换活性的DNA聚合酶2～20U。

7.如权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于扩增反应液中扩增引物的核酸序列如下：

上游引物1：5′-CCAGATTCCATAGGCAATAGATGATTTTTTAGAATTCAACGATATGAACGG

下游引物1：5′-AACAGACACTTATGAGATGCCATCTTTTGATGATGTTGGTGTGCGG

上游引物2：5′-CTCCAGGGGATAATCCAATT

下游引物2：5′-TGAGGAGACTTCCAAGAGT。

8.使用权利要求1所述检测试剂盒检测斑节对虾杆状病毒的方法，其特征在于该方法包括下列步骤：

(1)取样品对虾组织约0.02～1.0g置于采样管中，用研磨棒将样品磨碎至浆状；

(2)用研磨棒蘸取浆状的样品将FTA膜片充分润湿；

(3)吸取快速干燥液滴于上述FTA膜片上，静置10～20min；

(5)用牙签将上述漂洗管内的FTA膜片转移到核酸变性管内，95℃变性3～6min，然后再置于室温条件下2～5min；

(7)将上述扩增检测管上下反复甩动1-3min，使反应液与粘附于扩增检测管管壁或管盖上的核酸染料充分混匀；

(8)向下甩动扩增检测管，使管内混有核酸染料的扩增反应液集聚于扩增检测管底部，直接观察扩增反应液颜色，如果扩增反应液呈现绿色则表示该样品的斑节对虾杆状病毒检测结果为阳性，如果扩增反应液呈现橙黄色则表示该样品的斑节对虾杆状病毒检测结果为阴性。