CN101928771A - 一种鸡球虫种类快速鉴定的多重pcr方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物鉴定领域，具体涉及一种鸡球虫种类快速鉴定的多重PCR方法，以及检测用试剂盒。所说的鸡球虫种类多重PCR快速检测方法，是以待测样本DNA为模板，以SEQ ID NO.1-6的序列为引物进行多重PCR反应，PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带判定样本种类；其中151bp、463bp、303bp大小条带，分别为巨型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫检测阳性。本发明的方法与传统鉴定鸡球虫种类的方法相比具有快速准确敏感的优点。

Description

一种鸡球虫种类快速鉴定的多重PCR方法及试剂盒

技术领域

本发明属于分子生物鉴定领域，具体涉及一种鸡球虫种类快速鉴定的多重PCR方法，以及检测用试剂盒。

背景技术

鸡球虫病是由艾美耳属(Eimeria)的一种或数种球虫寄生于鸡消化道上皮细胞内引起的一种原虫病，在国内外广泛流行，是严重危害养禽业的重大疾病。寄生于鸡的球虫公认的种类有7种，分别是柔嫩艾美球虫、堆型艾美球虫、巨型艾美球虫、毒害艾美球虫、布氏艾美球虫、和缓艾美球虫和早熟艾美球虫。其中，巨型艾美球虫、柔嫩艾美球虫和堆型艾美球虫流行最广泛。在自然情况下，鸡球虫往往混合感染。因此，鸡球虫虫种的鉴别对该病的诊断与防治具有重要意义。鸡球虫种类的鉴定，传统方法是以卵囊形态、致病性、寄生部位、肠道病变特征等为鉴别指标。由于球虫受到遗传和环境等因素的影响，这些鉴别指标有时会发生变异，因而不能作为虫种鉴别的精确指标，且用传统方法鉴别鸡球虫种类需三周时间，鉴别者还应熟练掌握有关鸡球虫病的背景知识。

真核生物的rDNA为串联重复序列，约100～200个拷贝，包括编码28S RNA、18S RNA和5.8S RNA的基因，组成一个转录单元，产生一个前体RNA。在形成rRNA时，有两段RNA被剪切，第一段位于5.8S和18S rRNA之间的片段，称之为ITS-1(internal transcribespacer1)即核糖体RNA第一内转录间隔区。第二段位于5.8S和28SrRNA之间，被称之谓核糖体RNA第二内转录间隔区，即ITS-2(internal transcribed spacer2)。ITS-1区和ITS-2区，进化较快，具有一定的种间特异性和种内保守性，是进行种间分类的极好材料。PCR技术具有简便、快速、灵敏度高的优点。因此，可设计特异性的引物扩增和比较ITS序列，来快速鉴定形态学上难以区别的近缘种。

鸡球虫在分类上属于原生动物界，为真核生物，可根据ITS序列设计种特异性引物，用PCR方法来鉴别鸡球虫种类。用单一PCR的方法来鉴别球虫种类在国内外见有报道，但在生产实际中鸡球虫往往混合感染，因此，用单一PCR方法来鉴别临床样品中的球虫种类，则需对同一样品进行针对不同种类的多次PCR，这既增加了成本，又耗时费力。多重PCR方法是将数种球虫的种特异性引物加到同一个反应体系中，通过优化反应条件如MgCl₂浓度、退火温度、变性温度、变性时间、延伸温度、延伸时间、循环次数等，一次反应就能检测出同一样品中不同的鸡球虫种类，真正做到简便、快速，适用于生产实际，为鸡球虫病的临床诊断、药物防治、疫苗类型的选择及流行病学调查等提供一种快速有效方法。

发明内容

为了解决现有鸡球虫种类鉴定存在的时间长，不够准确的问题。本发明应用球虫ITS序列具有种间特异性和种内保守性的特点，以及PCR技术具有简便、快速、灵敏度高的优点，建立一种以ITS-1序列为靶序列的多重PCR快速鉴定鸡球虫种类的方法。

本发明根据GenBank中发表的巨型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫ITS-1序列，设计了3对种特异性引物，建立了这3种球虫的多重PCR检测方法，对该方法的特异性和敏感性进行了研究，对3种球虫的混合卵囊与临床样品进行了检测，显示该方法能扩增出巨型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫特异性条带，其大小分别为151bp、463bp、303bp，其最小检测浓度为0.5ng，对水牛梭形肉孢子虫、有毒艾美耳球虫、猪源弓形虫汤山株及其田间分离株均不起反应，具有很强的特异性和较高的敏感性。完成检测的时间最多需要2天。

一种鸡球虫种类多重PCR快速检测方法，是以待测样本DNA为模板，以SEQ ID NO.1-6的序列为引物进行多重PCR反应，PCR产物过琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带判定样本种类；其中151bp、463bp、303bp大小条带，分别为巨型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫检测阳性。

上述方法中所说的多重PCR反应的具体条件是：在0.5mL的Eppendorf管中依次加入下列试剂：10×buffer，MgCl₂，4×dNTPs，序列分别如SEQ ID NO.1-6所示的引物，TaqDNA聚合酶，摸板DNA，灭菌去离子水，反应总体积为25μL，混匀，瞬离，加入20μL矿物油；将Eppendorf管置于PCR仪中，循环参数为94℃预变性4min，94℃45s，55℃30s，72℃1min，35个循环，最后72℃延伸7min。

待测样本DNA的准备是常规的，可以先从鸡粪中分离纯化出卵囊，再用超声波细胞粉碎仪裂解卵囊壁，然后提取卵囊总DNA。

更为具体的待测样品的准备和前处理步骤是：

①分离纯化卵囊在鸡舍分点采集新鲜鸡粪约250g，按常规方法分离卵囊；卵囊经次氯酸钠灭菌处理后，用1.1mM蔗糖溶液漂浮，用灭菌水洗涤6次。

②提取DNA用超声波细胞粉碎仪裂解卵囊壁，然后按商品化试剂盒或自行配置的提取液提取DNA。

本发明还提供了用于该检测方法的试剂盒，所说的试剂盒包括：巨型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫DNA阳性对照，PCR反应液。PCR反应液包括：1号液(10×buffer)、2号液(25mM MgCl₂)、3号液(2.5mM 4×dNTPs)、4号液(50pmol巨型艾美耳球虫上游引物)、5号液(50pmol巨型艾美耳球虫下游引物)、6号液(50pmol柔嫩艾美耳球虫上游引物)、7号液(50pmol柔嫩艾美耳球虫下游引物)、8号液(50pmol堆型艾美耳球虫上游引物)、9号液(50pmol堆型艾美耳球虫下游引物)、10号液(5U/μL TaqDNA聚合酶)、11号液(灭菌去离子水)、12号液(矿物油)。

试剂盒的操作步骤如下：

(1)加样体系：在0.5mL的Eppendorf管中依次加入下列试剂：1号液2.5μL，2号液3μL，3号液1μL，4、5、6、7、8、9号液各1μL，10号液0.5μL，11号液11μL，提取的DNA摸板1μL。反应总体积为25μL。混匀，瞬离，加入12号液20μL。

(2)反应程序

94℃预变性             4min

72℃延伸               7min。

(3)取5μLPCR产物，混合1μL上样缓冲液，2.5％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，以50bp DNA分子量Marker为参考。

(4)结果判定：出现151bp、463bp、303bp大小条带，定为巨型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫检测阳性，否则判为阴性。

本发明的方法与传统鉴定鸡球虫种类的方法相比具有下列优点：

①快速用传统鉴定方法，从鸡场采集粪样分离出球虫卵囊后，首先对卵囊进行孢子化培养(需3天)；其次观察孢子化卵囊，进行初步鉴定(需3天)；将孢子化卵囊接种无球虫感染的雏鸡(15日龄)，80小时后每间隔数小时粪检一次卵囊，同时每间隔12小时剖检鸡2只，观察其肠道病变(需7天)；对排出的卵囊进行分离、培养，进一步观察鉴定。用本发明的方法，分离出的卵囊不需进行孢子化培养，直接纯化后提取DNA，进行PCR反应，反应结束后取产物进行琼脂糖凝胶电泳，EB染色后紫外光下观察结果(需2天)。

②准确用传统鉴定方法，按上述步骤鉴定出的有些球虫种类还不能完全确定，需要进一步的做同工酶分析、鸡胚接种等试验。用本发明的方法，由于设计的引物有种特异性，扩增出的目的片段明显不同，易于观察。

③敏感用传统鉴定方法，当一种球虫占粪样中总卵囊的比例很小时，用显微镜直接观察到的概率极小，出现假阴性。用本发明的方法，最小检出的模板DNA浓度为0.5ng，相当于球虫的2个卵囊。

附图说明

图1是已知样品的电泳检测结果，Lane 1：50bp Marker；Lane 2：从上至下分别为：巨型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫与堆型艾美耳球虫

图2是临床样品的电泳检测结果，Lane 1：50bp Marker；Lane 2：1号样品；Lane 3：2号样品

具体实施方式

本发明方法中所需的试剂与器材：

主要试剂：TaqDNA酶、10×buffer、Mg²⁺、dNTP(均为Sangon产品)；ProteinaseK(Merck公司产品)；RNAase A(Amresco产品)；50bp DNA Ladder(MBI产品)；酚：氯仿(BBI产品)；琼脂糖(Promega产品)；其它试剂均为国产分析纯。

主要仪器及设备：台式高速冷冻离心机；超净工作台；梯度PCR扩增仪(美国MJ公司)、DYY-2型电泳仪(北京六一仪器厂)、GIS凝胶成像系统(上海天能科技有限公司)。

实施例1

1、引物设计与合成从Genbank中获得巨型艾美耳球虫(EUR，AF065095)、柔嫩艾美耳球虫(EUR，AF026388)和堆型艾美耳球虫(EUR，AF026384)ITS1序列，使用DNAstar3.0分子生物学软件分析，设计种特异性引物并由宝生物(大连)工程公司合成。

巨型艾美耳球虫

上游引物：5’-TTGTGGGGCATATTGTTGTG-3’(SEQ ID NO.1)

下游引物：5’-CAATGAGGCACCACATGTCT-3’(SEQ ID NO.2)

预计扩增片段长度为151bp。

柔嫩艾美耳球虫

上游引物5’-CGCTGCTGGTTTTACAGGTT-3’(SEQ ID NO.3)

下游引物5’-GCTGAAGCAAAGTTCCAAGC-3’(SEQ ID NO.4)

预计扩增片段长度为463bp。

堆型艾美耳球虫

上游引物5’-CTGCGAGGGAACGCTTAAT-3’(SEQ ID NO.5)

下游引物5’-AACGAACGCAATAACACACG-3’(SEQ ID NO.6)

预计扩增片段长度为303bp。

2、球虫卵囊的分离与纯化

将粪样置于干净的烧杯中，加入少量清水搅拌均匀，用60目铜筛和260目尼龙筛兜分别过滤，弃粪渣，将滤液静置30min后倾弃上层液，保留沉淀物；取沉淀物置于离心管，加饱和食盐水搅拌均匀，3000rpm离心8min，吸取漂浮至液面的卵囊至另一离心管；加生理盐水搅拌均匀，3000rpm离心8min，倾弃上层液，保留沉淀物；沉淀物中加次氯酸钠(次氯酸钠∶卵囊液＝1∶4)，搅拌均匀后静置15min，灭菌水洗涤3次，每次3000rpm离心8min；取沉淀物，加1.1mM蔗糖溶液搅拌均匀，3000rpm离心8min，吸取漂浮至液面的卵囊至另一离心管中，灭菌水离洗涤6次，每次3000rpm离心8min；纯化卵囊4℃保存备用。

3、提取球虫卵囊的总DNA

纯化的卵囊+500μL消化液+6μL蛋白酶K(56℃温浴过夜)→10Rnase(37℃，1h)→加等体积水饱和的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)→振动5min→12000rpm，10min→上清转移至另一离心管+同体积氯仿∶异戊醇，拌均匀，2min→12000rpm，5min→上清转移至另一离心管(约400μL)+40μL NaAc(1/10体积)+1mL冰冻无水乙醇(2.5倍体积)→-20℃，2h→12000rpm，10min→干燥(打开风机)→加TE溶解→1％琼脂糖电泳分析。

4、多重PCR反应体系及反应条件

在0.5mL的Eppendorf管中依次加入下列试剂：10×buffer 2.5μL，MgCl₂ 3μL(25mM)，4×dNTPs 1μL(2.5mM each)，巨型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫的上下游引物各1μL(50pmol)，TaqDNA聚合酶0.5μL(5U/μL)，巨型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫的DNA摸板各1μL，灭菌去离子水9μL，反应总体积为25μL。混匀，瞬离，加入20μL矿物油。反应过程：94℃4min；94℃45s，55℃30s，72℃1min，35个循环，72℃7min；PCR产物4℃保存。

5、电泳分析

反应结束后取产物进行2.5％琼脂糖凝胶，60V电泳1h，EB染色后后紫外光下观察结果。扩增出的巨型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫特异性条带大小，分别为151bp、463bp、303bp。

6、对已知样品样品的检测结果

将巨型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫卵囊混合，提取DNA模板，按发明的多重PCR技术进行检测，检测到3种球虫的特异性条带(图1)。

实施例2、检测用试剂盒

试剂盒包括巨型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫DNA阳性对照，PCR反应液。PCR反应液包括：1号液(10×buffer)、2号液(25mM MgCl₂)、3号液(2.5mM4×dNTPs)、4号液(50pmol巨型艾美耳球虫上游引物)、5号液(50pmol巨型艾美耳球虫下游引物)、6号液(50pmol柔嫩艾美耳球虫上游引物)、7号液(50pmol柔嫩艾美耳球虫下游引物)、8号液(50pmol堆型艾美耳球虫上游引物)、9号液(50pmol堆型艾美耳球虫下游引物)、10号液(5U/μL TaqDNA聚合酶)、11号液(灭菌去离子水)、12号液(矿物油)。

试剂盒中三种阳性模板的制备：

巨型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫纯种卵囊分别接种无球虫雏鸡，扩增卵囊，按常规方法分离纯化后按下列步骤提取卵囊的总DNA：

纯化的卵囊+500μL消化液+6μL蛋白酶K(56℃温浴过夜)→10Rnase(37℃，1h)→加等体积水饱和的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)→振动5min→12000rpm，10min→上清转移至另一离心管+同体积氯仿∶异戊醇，拌均匀，2min→12000rpm，5min→上清转移至另一离心管(约400μL)+40μL NaAc(1/10体积)+1mL冰冻无水乙醇(2.5倍体积)→-20℃，2h→12000rpm，10min→干燥(打开风机)→加TE溶解→1％琼脂糖电泳分析。

本发明中所说的巨型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫纯种卵囊本领域技术人员可根据传统方法分离鉴定得到。本发明实验中所用的纯种是发由明人分离鉴定并保存的(陶建平，沈永林，李文超，等.巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima)地理株研究I.十一株巨型艾美耳球虫的分离与基本特征.中国兽医学报，2004，24(4)：349～351.)(陶建平，符敖齐.柔嫩艾美尔球虫和巨型艾美尔球虫的分离与鉴定.畜牧与兽医，1997，29(6)：248～249.)

实施例3：对临床样本的检测

采集不同点的新鲜鸡粪样两份，分别将粪样置于干净的烧杯中，加入少量清水搅拌均匀，用60目铜筛和260目尼龙筛兜分别过滤，弃粪渣，将滤液静置30min后倾弃上层液，保留沉淀物，得到1号样品和2号样品，将1号和2号样品分成两份，分别用本发明的试剂盒及方法与传统鉴定方法进行鸡球虫种类的检测：

利用本发明试剂盒及方法的操作如前所述，检测结果如图2，从1号样品中检出巨型艾美耳球虫与柔嫩艾美耳球虫，从2号样品中检出堆型艾美耳球虫与柔嫩艾美耳球虫。

对两个临床样品中鸡球虫种类的传统鉴定方法如下：

(1)卵囊分离与培养

采集新鲜粪样，置于干净的烧杯中，再加入适量的清水搅拌均匀，分别经60目铜丝筛和260目尼龙筛过滤。收集滤液自然沉淀30min，倾去上清得到沉淀物。沉淀物中加入等量的5％重铬酸钾，放入29℃的恒温箱中培养3～5d，使卵囊进行孢子化发育。

(2)初次种类鉴定

取培养后的卵囊液转入离心管中，3000rpm离心8min后倾弃上清液，沉淀物用清水洗涤一次。随后沉淀物中加入饱和食盐水，搅匀，静置3～5min，3000rpm离心8min。吸取漂浮至液面的卵囊至另一离心管中，清水洗涤3次，每次3000rpm离心8min。取卵囊液做一涂片镜检，在10×10或10×40下详细观察球虫卵囊的形态结构特征，测量卵囊大小，参照文献对球虫种类的进行初步鉴定。余下的卵囊进行回归动物试验。

(3)回归动物试验

①卵囊接种收集的卵囊经培养孢子化后，接种8羽20日龄无球虫感染的黄羽肉雏鸡。

②粪检卵囊分别在接种后80h、90h、100h、110h、125h、140h收集粪便，用饱和盐水漂浮法粪检卵囊，并观察卵囊形态特征。

③观察肠道病变与虫体寄生部位在接种后120h、144h与168h分别剖检2只雏鸡，观察肠道病变特征与虫体的寄生部位。

(4)种类判定

以卵囊形态、致病性、寄生部位、肠道病变特征等为鉴别指标：

①巨型艾美耳球虫卵囊卵圆形，囊壁黄褐色，较粗糙，无卵膜孔和卵囊残余体，有极粒。卵囊大小为21.5～30.7μm×16.5～25.0μm，平均大小为27.6μm×20.2μm，形状指数平均1.37。孢子囊呈长卵圆形，有斯氏体，大小为15.2～18.5μm×7.5～9.8μm，平均为17.5μm×8.3μm。感染后125h粪检见有少量的特征性卵囊。感染后120h扑杀剖检扑杀可见小肠中段肠管肿大，肠壁增厚，内容物粘稠，呈淡灰色、淡褐色或淡红色，有时混有很小的血凝块。

②柔嫩艾美耳球虫卵囊多为宽卵圆形，囊壁光滑，呈浅绿色；无卵膜孔和卵囊残余体，有极粒。卵囊大小为19.5～26.0μm×16.5～12.8μm，平均大小为22.0μm×19.0μm。形状指数平均1.16。孢子囊卵圆形，有斯氏体，大小为11.7～13.5μm×4.5～7.8μm，平均大小为12.5μm×6.5μm。感染后第5～6天鸡排出血便，144h粪检见有少量卵囊，剖检可见鸡盲肠严重出血和高度肿胀，其中充满凝固的或新鲜的暗红色血液，盲肠壁变厚，并伴有严重的糜烂。

③堆型艾美耳球虫卵囊卵圆形，囊壁光滑无色；无卵膜孔和卵囊残余体，有极粒。卵囊大小为16～21μm×11～18μm，平均大小为18.7μm×15.4μm，形状指数为1.06～1.38，平均为1.22。孢子囊呈卵圆形，有斯氏体，大小为8～13μm×4～8μm，平均10.3μm×6.3μm。感染后110h粪检见有卵囊。感染后120h扑杀剖检可见在十二指肠和小肠前段肠管肿大，黏膜面有大量淡白色斑点，排列成横行，外观呈阶梯样。

经传统方法鉴定，结果从1号样品中检出巨型艾美耳球虫与柔嫩艾美耳球虫，从2号样品中检出堆型艾美耳球虫与柔嫩艾美耳球虫。两种方法的符合率为100％。

SEQUENCE LISTING

<110>扬州大学

<120>一种鸡球虫种类快速鉴定的多重PCR方法及试剂盒

<130>

<160>6

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

ttgtggggca tattgttgtg                                        20

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>从工序列

<400>2

caatgaggca ccacatgtct                                        20

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

cgctgctggt tttacaggtt                                20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

gctgaagcaa agttccaagc                                20

<210>5

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

ctgcgaggga acgcttaat                                 19

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

aacgaacgca ataacacacg                                20

Claims (4)

1.一种鸡球虫种类多重PCR快速检测方法，其特征在于，是以待测样本DNA为模板，以SEQ ID NO.1-6的序列为引物进行多重PCR反应，PCR产物过琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带判定样本种类；其中151bp、463bp、303bp大小条带，分别为巨型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫检测阳性。

2.根据权利要求1所述的鸡球虫种类多重PCR快速检测方法，其特征在于，多重PCR的具体条件是：在0.5mL的Eppendorf管中依次加入下列试剂：10×buffer，MgCl₂，4×dNTPs，序列分别如SEQ ID NO.1-6所示的引物，TaqDNA聚合酶，摸板DNA，灭菌去离子水，反应总体积为25μL，混匀，瞬离，加入20μL矿物油；将Eppendorf管置于PCR仪中，循环参数为94℃预变性4min，94℃ 45s，55℃ 30s，72℃ 1min，35个循环，最后72℃延伸7min。

3.根据权利要求1所述的鸡球虫种类多重PCR快速检测方法，其特征在于，待测样本DNA是通过下述步骤得到：先从鸡粪中分离纯化出卵囊，再用超声波细胞粉碎仪裂解卵囊壁，然后提取卵囊总DNA。

4.一种用于权利要求1所述的鸡球虫种类多重PCR快速检测方法的试剂盒，其特征在于，包括巨型艾美耳球虫、柔嫩艾美耳球虫和堆型艾美耳球虫DNA阳性对照，以及PCR反应液，其中PCR反应液PCR反应液由下列1-12号液组成：

1号液：10×buffe；

2号液：25mM MgCl₂；

3号液：2.5mM 4×dNTPs；

4号液：50pmol巨型艾美耳球虫上游引物，序列如SEQ ID NO.1所示；

5号液：50pmol巨型艾美耳球虫下游引物，序列如SEQ ID NO.2所示；

6号液：50pmol柔嫩艾美耳球虫上游引物，序列如SEQ ID NO.3所示；

7号液：50pmol柔嫩艾美耳球虫下游引物，序列如SEQ ID NO.4所示；

8号液：50pmol堆型艾美耳球虫上游引物，序列如SEQ ID NO.5所示；

9号液：50pmol堆型艾美耳球虫下游引物，序列如SEQ ID NO.6所示；

10号液：5U/μL TaqDNA聚合酶；

11号液：灭菌去离子水；

12号液：矿物油。

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