CN100368565C - 肺特异性X蛋白mRNA表达量检测试剂盒及其专用引物与探针 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肺特异性X蛋白基因mRNA表达量的检测试剂盒及其专用引物与探针。该专用引物是具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2序列的引物对。专用探针是具有序列表中SEQ ID NO：3的DNA序列。试剂盒包括权利要求1和权利要求2所述的检测肺特异性X蛋白基因mRNA表达量的专用引物和探针。本发明所提供的试剂盒可用于临床及科研中对肿瘤患者的外周血、骨髓中LUNX mRNA的表达情况进行定性及定量分析，对判断肺癌的发生、转移、复发，治疗效果评价及病情的动态观察具有重要意义，将在医学检测领域发挥重要作用。

Description

肺特异性X蛋白mRNA表达量检测试剂盒及其专用引物与探针

技术领域

本发明涉及一种肺特异性X蛋白基因mRNA表达量的检测试剂盒及其专用引物与探针。

背景技术

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，严重危害人类的健康和生命。近年来，世界各国肺癌的发病率和死亡率均持续上升，在人口密度较高的工业城市尤为显著。资料显示，全球每年有100万名新发肺癌患者；在男性肿瘤死因中肺癌已居首位，在女性中仅次于乳腺癌位居第二。我国致人死亡的各种病因中，因恶性肿瘤而导致的死亡已占所有死亡原因的第二位。肺癌居所有肿瘤发病率的首位，成为本世纪发病率和死亡率增长最快，严重危害人类健康和生命的恶性肿瘤。我国目前每年新发肺癌人数已达21万，其中非小细胞肺癌病患占总数的70％-80％。

针对肺癌现有多种治疗方法，如外科手术切除、放射治疗、化学治疗等。目前，手术切除为肺癌综合治疗方法中的首选。然而，在手术切除技术已达到相当成熟和普及的同时，肺癌切除后的高复发和转移率已成为阻碍肺癌患者生存期提高的主要原因。肺癌术后复发率高的主要原因是手术前肺癌细胞自然或由于侵袭性医源性因素脱落至外周血，并随血转移至肺外，形成循环肿瘤细胞，但是由于受检测方法灵敏度及特异性较低的限制，该微量的癌细胞未能被检测到。这些癌细胞随血液到达外周组织并处于休眠状态，当患者机体免疫功能下降时，如大手术或移植后应用抗排斥免疫抑制剂等，休眠的癌细胞就有可能被激活，并随血液循环返回到肺脏，并在肺内恢复增殖，从而导致了肺癌的复发。

肿瘤的转移是临床治疗的一大难题，也是肿瘤致死的一个重要原因。目前，肿瘤转移的发现和确定，主要根据影像学(X光片、CT、磁共振、PET等)或病理形态来诊断。影像学检查中能够发现的病灶，需要一定大小转移灶的形成、能够被仪器成像且有效分辨；病理形态上判断细胞恶变与否，则一定要取到合适的检测标本，且有相当数量的可观察到的肿瘤细胞存在。因此，无论是影像学诊断还是病理学诊断，都是肿瘤形成及转移后晚期、存在大量恶变细胞积累的阶段。如果在肿瘤发生转移的早期，能够发现并确定其转移，则可以指导临床治疗方案的设计，并提供有力的预后依据。血行播散是肿瘤转移的主要途径之一，所以在肿瘤患者外周血中进行肿瘤细胞基因表达、肿瘤特异性标记产物检测是了解肿瘤转移情况的一种有效方法，因此肿瘤标志物的检测对肿瘤形成及转移的诊断具有极大的帮助。但是在肿瘤转移发生的早期，外周血中的肿瘤细胞一般很少，无法完全依赖病理形态检查；未形成转移灶或转移灶未达到一定体积时，影像学诊断也无能为力。因此，循环血中的微量肿瘤细胞基因表达和一些特异性产物检测的研究，引起了学者们的广泛关注。

随着分子生物学技术的飞速发展及其在医学研究中的广泛应用，通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测外周血中微量肿瘤细胞已成为可能并被尝试。实时荧光定量PCR技术是一种能够准确定量mRNA的检测方法，通过检测肿瘤特异性基因mRNA的表达以判断循环肿瘤细胞的存在。外周血中肿瘤特异性基因mRNA的定量测定，有利于肿瘤的早期诊断，治疗方案的确定以及预后的判断。实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入一对引物的同时加入一个特异性荧光探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程。目前常用的Taqman荧光探针为寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，故检测不到荧光；在PCR扩增过程中，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。在PCR扩增过程中，每个循环结束后检测一次荧光强度，整个反应结束后，便可得到一条工作曲线，根据该曲线可对未知模板进行定量分析。但是，目前尚没有专门用于人类肺组织肿瘤特异性基因mRNA检测的RT-PCR技术，因为没有合适的引物和特异性荧光探针。

肺特异性X蛋白(Lung specific X protein，LUNX)基因，人类肺组织特异性基因，由Iwao等人利用mRNA差异显示技术分离得出，定位于20p11.1-q12，cDNA全长1015bp，包括一个开放读码框，编码的蛋白质由256个氨基酸残基组成，分子量为26.7kDa。Iwao等研究表明，LUNX基因仅在肺部组织和肺癌原发部位以及扩散的肿瘤组织中有活性，而在胃、胆囊和胆管癌等组织中无活性(Iwao K，Watanabe T，FujiwaraY，et al.Isolation of a novel human lung-specific gene，LUNX，a potentialmolecular marker for detection of micrometastasis in non-small-cell lungcancer.Int J Cancer.2001 Feb 15；91(4)：433-437.)。大量研究均显示正常人外周血LUNX mRNA呈阴性，表明血液中存在核细胞不表达的LUNX mRNA；游离于细胞外的mRNA很不稳定，极易被RNA酶解，故在外周血中若测得LUNX mRNA，则提示血循环中存在有完整的肺癌细胞。因此，LUNX mRNA是一项较好的血源性肺癌细胞的监测指标，检测非小细胞肺癌患者骨髓及血中的LUNX mRNA对判断非小细胞肺癌的发生、转移、复发，治疗效果评价及病情的动态观察具有重要意义。但是，目前尚没有合适的阳性率高的检测技术，例如Mitas等应用普通的RT-PCR检测非小细胞肺癌患者外周血LUNXmRNA的表达，阳性率仅为42％(10/24)，健康人对照组均为阴性(Mitas M，Hoover L，Silvestri G，et al.Lunx is a superior molecular marker for detect ion ofnon-small lung cell cancer in peripheral blood.Journal of MolecularDiagnostics.2003Nov 5(4)，237-242.)。并且普通的RT-PCR检测只能对肺癌患者外周血LUNX mRNA的表达进行定性检测，不能进行定量分析。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测人外周血中肺特异性X蛋白(LUNX)基因mRNA表达量的实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒及其专用引物与探针。

本发明所提供的检测肺特异性X蛋白基因mRNA表达量的专用引物，可为由序列表中的SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2组成的引物对。序列表中的SEQ ID №：1由25个碱基组成，SEQ ID №：2由24个碱基组成，扩增片段长度为151bp。

本发明所提供的检测肺特异性X蛋白基因mRNA表达量的专用探针，可具有序列表中SEQ ID NO：3的DNA序列。序列表中的SEQ ID №：3由27个碱基组成。所述探针为经过荧光标记的，且两端分别连接有报告荧光基团和淬灭荧光基团。

本发明所提供的检测肺特异性X蛋白基因mRNA表达量的试剂盒，可包括用于检测肺特异性X蛋白基因mRNA表达量的专用引物和探针。

所述试剂盒还可包括细胞裂解液、RNA洗涤缓冲液、无RNA酶的水、RNA分离柱、DNA酶I储存液、反转录缓冲液、dNTP混合物、逆转录酶储存液、PCR反应液、尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)储存液、已知浓度的标准品；所述标准品为任意可与专用引物及探针特异结合的DNA序列；所述各种溶液的溶剂均为水。

所述标准品可具有序列表中SEQ ID №：4的DNA序列，序列表中的SEQID№：4由151个碱基组成。标准品的浓度可设定为2×10⁶拷贝数/μl，用时将其梯度稀释为2×10⁵、2×10⁴、2×10³、2×10²、2×10¹拷贝数/μl等，以使标准曲线相关性大于0.99，以便准确定量待测基因的拷贝数。

所述试剂盒中还可包括阳性对照品和阴性对照品，阳性对照品可为含有LUNX mRNA的人肺腺癌A549细胞总RNA，阴性对照品可为正常人外周血总RNA。

所述细胞裂解液包括细胞裂解液I和细胞裂解液II，RNA洗涤缓冲液包括RNA洗涤缓冲液I和RNA洗涤缓冲液II，试剂盒中各溶液具体的组成成份可如下所示：

(1)细胞裂解液I包含0.1mol/L Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸，pH7.6，25℃)、0.1mol/L氯化钠、0.05mol/L氯化镁、水。

(2)细胞裂解液II包含3mol/L异硫氰酸胍、2mol/L盐酸胍、0.3mol/L醋酸钠(pH5.2)、0.2％(W/V)SDS(十二烷基硫酸钠)、水。

(3)RNA洗涤缓冲液I包含0.2mol/L醋酸钠(pH5.2)、0.1mol/L氯酸钠、0.1mol/L Tris-HCl(pH7.5，25℃)、水。

(4)RNA洗涤缓冲液II包含1.2mol/L柠檬酸钠、0.5mol/L Tris-HCl(pH7.5，25℃)、水。

(5)无RNA酶的水制备方法可为：向去离子水加入DEPC(焦碳酸二乙酯)，至终浓度为0.05％(V/V)，室温(22-25℃)放置10-12小时后，121℃，高压20min，室温放置备用。

(6)DNA酶I储存液包含50mmol/L Tris-HCl(pH 7.5，25℃)、25mmol/LTris-COOCH₃(pH7.5，25℃)、12.5mmol/L MgCl₂、5.5mmol/L CaCl₂、25％(V/V)甘油、0.5U/μl DNA酶I、水。

(7)反转录缓冲液包含9.1μmol/L Oligo(dT)_12-18、3.6U/μl Rnase Inhibitor、72.7mmol/L DTT(二硫苏糖醇)、182mmol/L Tris-HCl(pH8.3，25℃)、273mmol/LKCl、11mmol/L MgCl₂、水。

(8)逆转录酶储存液包含20mmol/L Tris-HCl(pH 7.5，25℃)、100mmol/L NaCl、0.1mmol/L EDTA、1.0mmol/L DTT、50％(V/V)甘油、0.01％(V/V)Nonidet p-40、200U/μl逆转录酶(M-MLV)、水。

(9)dNTP混合物包含dATP、dCTP、dGTP、dTTP，为其钠盐-水溶液(pH7.0-7.5，25℃)，四种dNTP浓度均为10mmol/L。

(10)PCR反应液包含18.5mmol/L Tris-HCl(pH8.3，25℃)、2.78mmol/L MgCl₂、92.6mmol/L KCl、0.1U/μl Taq酶、400nmol/L dATP、400nmol/L dCTP、400nmol/L dGTP、800nmol/L dUTP、水。为方便操作，引物可直接添加入PCR反应液中。

(11)UNG酶储存液包含50％(V/V)甘油、30mmol/L Tris-HCl(pH7.5，25℃)、150mmol/L NaCl、1.0mmol/L EDTA、1.0mmol/L DTT、0.05％(V/V)Tween 20、1U/μlUNG酶、水。

RNA分离柱优选为硅胶柱，并采用Hibind硅胶基质薄膜结合技术，可以特异性结合RNA，并可用水洗脱RNA，达到分离纯化RNA的目的。

标准品及探针可溶于TE(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，水)中，其中探针的浓度可为2μmol/L。

本试剂盒中的各组分均可按照常规方法制备。总RNA提取试剂保存于室温(22-25℃)；RT-PCR试剂保存于-20℃，并尽量减少反复冻融。

本发明提供了一种检测人外周血中肺特异性X蛋白(LUNX)基因mRNA表达量的试剂盒。该试剂盒通过提取新鲜抗凝外周血总RNA，并通过逆转录mRNA样品得到cDNA，再结合实时荧光定量PCR检测技术，可达到准确定量待测标本中肺特异性X蛋白(Lungspecific X protein，LUNX)mRNA表达量的目的。本发明所提供的试剂盒可用于临床及科研中对肿瘤患者的外周血、骨髓中LUNX mRNA的表达情况进行定性及定量分析，对判断肺癌的发生、转移、复发，治疗效果评价及病情的动态观察具有重要意义。本发明将在医学检测领域发挥重要作用。

附图说明

图1为标准品的检测结果

图2为标准品的标准曲线

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所述百分比浓度均为质量/体积(W/V)百分比浓度或体积/体积(V/V)百分比浓度。

实施例1、肺特异性X蛋白(LUNX)mRNA表达量检测试剂盒的制备

材料及设备：

DEPC(焦碳酸二乙酯)购自Biobasic公司；M-MLV逆转录酶购自Invitrogen公司；Taq酶、Oligo(dT)、T-载体(pMD18-T Vector)、普通PCR扩增试剂盒购自TaKaRa公司；DTT(二硫苏糖醇，0.1M)购自Invitrogen公司；DNA gel extraction kit、质粒大量回收试剂购自杭州维特洁生化技术有限公司；1-15K型微量高速低温离心机、2-5型低速常温离心机购自德国Sigma公司；超速低温离心机购自德国Hettich公司；3111型恒温水套式CO₂培养箱购自美国Forma公司；超低温冰箱购自日本SANYO公司；超净工作台购自上海智诚生物设备公司；Biometra PCR仪购自Biometra公司；ABI7000型实时荧光定量PCR仪、测序试剂、377测序仪、购自美国Applied Biosystems公司。

一、引物、探针的设计与合成

以LUNX全长cDNA序列(GenBank号为：NM_130852)为模板，使用ABI7000型实时荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)随机软件分析TaqMan引物和探针位点，同时考虑LUNX基因组DNA序列情况，从中选择最佳组合，设计的用于扩增检测肺特异性X蛋白(LUNX)mRNA表达量的实施荧光定量PCR试剂盒中的标准品引物序列与检测用PCR引物序列相同，上、下游引物序列分别为：

P1(上游引物)：5’-GCCTCATTGTCTTCTACGGGCTGTT-3’(序列表中的SEQ ID NO：1)；

P2(下游引物)：5’-CTGAGGGCATTTGTCAAGCTTCCT-3’(序列表中的SEQ ID NO：2)

荧光标记的探针序列为：5’-FAM-CAGACCATGGCCCAGTTTGGAGGCCTG-TAMRA-3’(序列表中的SEQ ID NO：3)。均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物及探针可溶于TE(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，水)中，其中探针的浓度为2μmol/L。

二、制备无RNA酶的水

向去离子水加入DEPC(焦碳酸二乙酯)，至终浓度为0.05％(V/V)，室温(22-25℃)放置10-12小时后，121℃，高压20min，室温放置备用。

三、试剂盒中其它溶液的配制

按以下配方进行配制：

(1)细胞裂解液I包含0.1mol/L Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸，pH7.6，25℃)、0.1mol/L氯化钠、0.05mol/L氯化镁、水。

(2)细胞裂解液II包含3mol/L异硫氰酸胍、2mol/L盐酸胍、0.3mol/L醋酸钠(pH5.2)、0.2％(W/V)SDS(十二烷基硫酸钠)、水。

(3)RNA洗涤缓冲液I包含0.2mol/L醋酸钠(pH5.2)、0.1mol/L氯酸钠、0.1mol/L Tris-HCl(pH7.5，25℃)、水。

(4)RNA洗涤缓冲液II包含1.2mol/L柠檬酸钠、0.5mol/L Tris-HCl(pH7.5，25℃)、水。

(6)DNA酶I储存液包含50mmol/L Tris-HCl(pH7.5，25℃)、25mmol/LTris-COOCH₃(pH7.5，25℃)、12.5mmol/L MgCl₂、5.5mmol/L CaCl₂、25％(V/V)甘油、0.5U/μl DNA酶I、水。

(7)反转录缓冲液包含9.1μmol/L Oligo(dT)_12-18、3.6U/μl Rnase Inhibitor、72.7mmol/L DTT(二硫苏糖醇)、182mmol/L Tris-HCl(pH8.3，25℃)、273mmol/LKCl、11mmol/L MgCl₂、水。

(8)逆转录酶储存液包含20mmol/L Tris-HCl(pH7.5，25℃)、100mmol/L NaCl、0.1mmol/L EDTA、1.0mmol/L DTT、50％(V/V)甘油、0.01％(V/V)Nonidet p-40、200U/μl逆转录酶(M-MLV)、水。

(9)dNTP混合物包含dATP、dCTP、dGTP、dTTP，为其钠盐-水溶液(pH7.0-7.5，25℃)，四种dNTP浓度均为10mmol/L。

(10)PCR反应液包含18.5mmol/L Tris-HCl(pH8.3，25℃)、2.78mmol/L MgCl₂、92.6mmol/L KCl、0.1U/μl Taq酶、400nmol/L dATP、400nmol/L dCTP、400nmol/L dGTP、800nmol/L dUTP、水。为方便操作，上、下游引物(P1和P2)可直接添加入PCR反应液中，上、下游引物浓度分别为0.37μmol/L。

(11)UNG酶储存液包含50％(V/V)甘油、30mmol/L Tris-HCl(pH7.5，25℃)、150mmol/L NaCl、1.0mmol/L EDTA、1.0mmol/L DTT、0.05％(V/V)Tween 20、1U/μlUNG酶、水。

四、标准品的制备

1、细胞总RNA的提取

所用的细胞为人肺腺癌A549细胞，用RPMI1640完全培养基(Gibco公司)按常规方法进行培养。然后将培养的细胞用0.25％(W/V)胰蛋白酶消化，1000rpm离心收集细胞，转移到1.5mL离心管中，每管约有1×10⁶个细胞。提取细胞总RNA，具体过程包括以下步骤：

1)向沉淀的有核细胞中加入1mL细胞裂解液I稀释液(将细胞裂解液I按1∶9的比例用灭菌去离子水稀释成细胞裂解液I稀释液)，漩涡振荡以完全悬浮细胞，再将其转移至无菌的1.5mL离心管，4℃、450g离心10分钟，完全弃去上清。

2)往沉淀的有核细胞中加入650μl细胞裂解液II(向细胞裂解液II中加入2-巯基乙醇，加入量为每1mL细胞裂解液II加入20μl浓度为14.5mol/L的2-巯基乙醇，分装2-巯基乙醇要在通风厨下进行)，漩涡振荡充分混匀。

3)再加入650μl的70％(V/V)乙醇，漩涡振荡混匀。此时可能会由于乙醇的加入而产生沉淀物，但不会影响RNA的提取。

4)把上述混合液(不包括沉淀)加入到固定在2mL收集管上的RNA分离柱(硅胶柱，并采用Hibind硅胶基质薄膜结合技术，购自安徽优晶生物工程有限公司，该柱最大结合能力是800μl，故每次加入量不宜超过750μl)内，10000g，离心1分钟，弃去流出液体并继续进行步骤9的操作。

5)向DNA酶I储存液管中加入400μl无RNA酶的水，混匀、短暂离心收集，吸取45μl该液体直接加到RNA分离柱滤膜上，室温放置15分钟。

6)吸取700μl RNA洗涤缓冲液I加入到RNA分离柱上内，10000g，离心1分钟，弃去2mL收集管。

7)将RNA分离柱固定于另一2mL收集管上，加入500μl经稀释的RNA洗涤缓冲液II(RNA洗涤缓冲液II在使用前，加入12mL无水乙醇)，10000g离心1分钟，弃去流出液，得到细胞总RNA。该收集管可重复使用。

2、逆转录反应

将装有反转录缓冲液、dNTP混合物、逆转录酶储存液的离心管从-20℃冰箱中取出，置于冰盒上待其缓慢融化后，短暂离心，将dNTP混合物及逆转录酶储存液全部加入反转录缓冲液管中配制成反转录反应液，混匀，短暂离心，置于冰盒上备用，使用后剩余的反转录反应液可于-20℃冰箱中保存。反转录体系：反转录反应液3.5ul、总RNA溶液2.0ul、无RNA酶的水4.5ul；反转录反应条件为：42℃15分钟，95℃5分钟，反应结束后，取出置于冰盒上。

3、PCR扩增

用TaKaRa公司的普通PCR扩增试剂盒并参照试剂盒说明书进行操作，PCR反应体系为：反转录产物10ul、10×PCR缓冲液5.0ul、dNTP混合物4.0ul、上、下游引物(P1、P2)各2.0ul、Taq酶0.5ul、水26.5ul。PCR反应条件为：先94℃3分钟；再94℃30秒，56℃30秒，72℃50秒，共35个循环；最后72℃7分钟。

4、LUNX扩增产物的获得

1)将步骤3的PCR扩增产物进行1.2％(W/V)琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下切取含151bp目的DNA的琼脂，用纸巾擦干后，切碎，称重，按照100mg＝100μl的比例确定胶的体积。

2)用DNA gel extraction试剂盒并按照试剂盒说明书中的比例加入DE-A液，60℃加热至完全熔化。

3)加入0.5倍体积于DE-A液的DE-B液，混匀；加入异丙醇，使其终浓度为20％(V/V)。

4)将上述液体转入制备管中，5500rpm离心1min，弃滤液。

5)加入0.5mL缓冲液W1后，5500rpm离心1min，弃滤液。

6)加入0.7mL缓冲液W2，5500rpm离心1min，弃滤液。

7)再加入0.7mL缓冲液W2，5500rpm离心1min，弃滤液；12000rpm，离心1min，以甩干滤膜基质。

8)将制备管置于新的1.5mL离心管中，在silica膜中央加入25μl水，室温静置1min后，12000rpm，离心1min洗脱DNA。

5、LUNX扩增产物的克隆及鉴定

1)重组LUNX克隆载体的构建

A、10μl体系中，加入1μl T载体(pMD18-T Vector)，4μl DNA样品，加入5μl连接缓冲液，16℃反应10-14小时。

B、取5μl连接产物，加入到100μl大肠杆菌DH5α感受态细菌中，混匀后冰浴40min，置于42℃水中热休克90s，冰浴2min。

C、加入无抗生素的LB培养基400μl，于37℃摇床上以150rpm的速度混合振摇45min后，将离心管中液体均匀地涂布于LA平板上，37℃平放20min后，倒置培养10-14小时。

2)重组载体的鉴定

A、观察LA平板上的菌落，随机挑取长得较好的菌落，分别转至装有5mL LA培养基的大试管中，编号后置37℃摇床中，250rpm，振摇8-14小时左右，至OD₆₀₀≈0.4。

B、取1.5mL培养物至离心管中，4℃，11000rpm离心30s，弃尽上清液。

C、100μl预冷的裂解液I(500mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris.Cl(pH8.0，25℃)，10mmol/L EDTA(pH8.0，25℃)，水)重悬沉淀，剧烈振荡混匀后加入200μl新配制的裂解液II(200mmol/l NaOH，1％(W/V)SDS，水)，混匀后，冰浴3min，再加入150μl预冷的裂解液III(3mol/L醋酸钾pH5.2，25℃)，颠倒混匀后冰浴3-5min；4℃，11000rpm离心5min后将上清转移至另一离心管中。

D、加入等体积的酚/氯仿(1∶1)，振荡后4℃，11000rpm离心2min，再将上清转移至另一离心管。

E、加入1/10体积的3M NaAc溶液和2.5倍无水乙醇，混匀后，室温静置10min，4℃，11000rpm离心10min后弃上清。

F、加入1mL 70％(V/V)乙醇，振荡漂洗后4℃，11000rpm离心2min；弃去上层液体。

G、加入少量无水乙醇，4℃，11000rpm离心2min，弃去乙醇后，室温倒置10min，加入30μl蒸馏水溶解质粒DNA。

H、取适量的质粒DNA作为模板，在引物P1和P2的引导下，进行PCR鉴定，可扩增出151bp DNA片段的为阳性克隆质粒，从而筛选出目的菌落。

6、质粒的大量抽提

A、取1mL含有步骤5鉴定出的目的菌落的菌液，加入到30mL LA培养基中，摇床培养至OD₆₀₀约为0.6。

B、取25mL上述菌液接种至300mL LA培养基中，37℃，250rpm培养10-14小时，然后4℃，4500rpm，20min离心收集细菌。

C、用200mL预冷的STE(10mmol/L Tris-HCl(PH8.0，25℃)，0.1mol/L NaCl，1mmol/L EDTA(PH8.0，25℃)，水)重悬菌体，4℃，4500rpm，20min离心收菌。

D、加入9mL Solution I(500mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris.Cl(pH8.0，25℃)，10mmol/L EDTA(pH8.0，25℃)，水)，混匀，再加入1mL用10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)新鲜配制的溶菌酶(10mg/mL)，再加入10mL新鲜配制的Solution II(200mmol/l NaOH，1％(W/V)SDS，水)，轻轻混匀5-7次，室温静置5分钟。

E、加入7.5mL冰冷的SolutionIII(3mol/L醋酸钾pH5.2，25℃)，轻轻混匀，冰浴10分钟；4℃，11000rpm离心10分钟，取上清。

F、加入2/3体积的异丙醇，混匀，室温静置10分钟，111000rpm离心10分钟，弃上清。

G、用70％(V/V)乙醇洗涤沉淀，8000rpm，15min离心回收，用2mL TE溶解沉淀。

H、加入2mL 5mol/L的LiCl(氯化锂)，混匀，10000g离心10分钟，弃去上清。

I、用70％(V/V)乙醇洗涤沉淀，弃上清，尽量控干液体，室温静置至干燥。

J、加入300μl TER，溶解沉淀，转移至1.5mL离心管中，37℃水浴1-2小时。

K、加入300μl 1.6mol/L NaCl(含13％(W/V)聚乙二醇)，混匀，4℃，12000rpm离心15分钟，弃上清。

L、250μl TE(pH8.0)溶解沉淀，分别用酚、酚/氯仿、氯仿各抽提一次。

M、取上清，加入60μl 10mol/L NH₄Ac及2倍体积的无水乙醇(或95％(V/V)乙醇)，混匀，4℃，12000g离心5分钟，弃上清。

N、120μl 75％(V/V)乙醇洗涤沉淀，4℃，12000g离心10分钟，弃上清，尽量控干液体，室温静置至干燥。

O、加入100μl三蒸水溶解沉淀，紫外分光光度计下检测质粒的浓度和纯度。

7、质粒的序列测定

对步骤6获得含有目的基因片段的阳性克隆质粒用美国Applied Biosystems公司的377测序仪进行序列测定，结果重组载体中的插入片段具有序列表中SEQ ID №：4的DNA序列，表明上述制备的标准品与本发明试剂盒所设计的标准品序列完全一致，获得了序列正确的标准品。

五、阳性对照品和阴性对照品的制备

阳性对照品为含有LUNX mRNA的人肺腺癌A549细胞总RNA，阴性对照品为正常人外周血总RNA，RNA提取方法与上述方法相同。

六、各组分的分装

试剂盒的规格为10人份/盒，每盒中各组分的量为：细胞裂解液I 1瓶(30mL/瓶)、细胞裂解液II 1瓶(10mL/瓶)、RNA洗涤缓冲液I 1瓶(10mL/瓶)、RNA洗涤缓冲液II 1瓶(3mL/瓶)、无RNA酶水1瓶(4mL/瓶)、RNA分离柱(10个)、DNA酶I储存液1管(100ul/管)、反转录缓冲液1管(33ul/管)、dNTP混合物1管(6.0ul/管)、逆转录酶1管(3.0ul/管)、PCR反应液1管(225.5ul/管)、UNG酶储存液1管(4.25ul/管)、探针1管(25.5ul/管)、标准品1管(10ul/管)、阳性对照品1管(1.0ug/管)、阴性对照品1管(1.0ug/管)。按上述剂量对试剂盒中的各组分进行分装，包装后得到肺特异性X蛋白基因mRNA表达量的检测试剂盒。

实施例2、肺特异性X蛋白基因mRNA表达量的检测

用实施例1制备的试剂盒检测下述实验组和对照组标本中的肺特异性X蛋白基因mRNA表达量，实验组：31例经病理确诊的肺癌患者，其中8例临床确诊已发生转移；对照组：5例乳腺癌患者、2例贲门癌患者、15例肺部良性疾病患者及10例正常健康人。具体过程包括以下步骤：

一、实验准备

1、将细胞裂解液I按1∶9的比例用灭菌去离子水稀释成细胞裂解液I稀释液。

2、向细胞裂解液II中加入2-巯基乙醇，加入量为每1mL细胞裂解液II加入20μl浓度为14.5M的2-巯基乙醇，分装2-巯基乙醇要在通风厨下进行。

3、RNA洗涤缓冲液II在使用之前，加入12mL无水乙醇。

4、配制70％(V/V)的乙醇溶液10mL。

二、取样

采上述受试者静脉血3mL于无菌离心管中，使用EDTA作抗凝剂(1.44mg/mL全血)。样本采集后应立即使用，若不能立即使用，可在4℃保存1-2小时，但时间不宜过长，否则将影响测定结果。全血经处理后，得到的有核细胞可于-80℃或液氮中保存数月，不会影响测定结果。

试剂盒中设有阳性和阴性对照，均为RNA样品，使用时4℃、12000g离心10分钟，弃上清液，室温倒置10分钟后加入无RNA酶的水10μl溶解RNA，然后取4μl可直接进行后续RT-PCR扩增。

三、细胞总RNA的提取

1、取3mL步骤二获得的新鲜抗凝血液加入到50mL无菌离心管后，再加入15mL的细胞裂解液I稀释液，漩涡振荡混匀。

2、冰浴15分钟后，在漩涡振荡器上迅速混匀两次，溶液变澄清表明红细胞已裂解。如果个别样品的血细胞计容或ECR升高时，可延长冰浴时间至20分钟。

3、4℃、450g离心10分钟沉淀有核细胞，完全弃去上清液。

4、用5mL的细胞裂解液I稀释液洗涤沉淀的有核细胞，漩涡振荡以完全悬浮细胞。

5、4℃、450g离心10分钟，并再次完全弃去上清。

6、向沉淀的有核细胞中加入1mL细胞裂解液I稀释液，漩涡振荡以完全悬浮细胞，将其转移至无菌的1.5mL离心管中，4℃、450g离心10分钟，完全弃去上清。

7、往沉淀的有核细胞中加入650μl细胞裂解液II(已加入2-巯基乙醇)，漩涡振荡充分混匀。

8、再加入650μl的70％(V/V)乙醇，漩涡振荡混匀。此时可能会由于乙醇的加入而产生沉淀物，但这不会影响RNA的提取。

9、把上述混合液(不包括沉淀)加入到固定在2mL收集管上的RNA分离柱内(该柱最大结合能力是800μl，故每次加入量不宜超过750μl)，10000g离心1分钟，弃去流出液体并继续进行步骤9的操作。

10、向DNA酶I储存液管中加入400μl无RNA酶的水，混匀、短暂离心收集，吸取45μl该液体直接加到RNA分离柱滤膜上，室温放置15分钟。

11、吸取700μl RNA洗涤缓冲液I加入到RNA分离柱上内，10000g离心1分钟，弃去2mL收集管。

12、将RNA分离柱固定于另一2mL收集管上，加入500μl已稀释的RNA洗涤缓冲液II，10000g离心1分钟，弃去流出液。该收集管可重复使用。

13、再用500μl已稀释的RNA洗涤缓冲液II洗涤RNA分离住，离心并弃去流出液。然后12000g离心1分钟，以甩干RNA分离柱基质。

14、将RNA分离柱转移至无RNA酶的1.5mL离心管上，取50μl无RNA酶的水加入到RNA分离柱基质上，10000g，离心1分钟。将装有RNA的离心管置于冰盒上备用。

三、RT-PCR反应

1、将装有反转录缓冲液、dNTP混合物、逆转录酶的离心管从-20℃冰箱中取出，置于冰盒上待其缓慢融化后，短暂离心，将dNTP混合物及反转录缓冲液全部加入逆转录酶管中配制成反转录反应液，混匀，短暂离心，置于冰盒上备用，使用后剩余反转录反应液可于-20℃冰箱中保存。反转录体系：反转录反应液3.5ul、总RNA溶液4.0ul、无RNA酶的水2.5ul；反转录反应条件为：42℃15分钟，95℃5分钟，反应结束后，将反应产物取出置于冰盒上。

2、将装有PCR缓冲液、UNG酶储存液及探针的离心管从-20℃冰箱中取出，置于冰盒上待其缓慢融化后，短暂离心，将探针及PCR缓冲液全部加入UNG酶储存液管中配制成PCR反应液，混匀，短暂离心，置于冰盒上备用，使用后剩余PCR反应液可于-20℃冰箱中保存。在ABI公司7000型定量PCR仪上进行PCR扩增，PCR反应体系为：反转录产物2.0μl、PCR反应液15.0μl、水8.0μl。PCR反应条件为：先37℃10分钟；然后95℃15分钟；最后95℃15秒，56℃1分钟，共50个循环。

四、标准曲线的制作

将标准品贮存液(2×10⁶拷贝数/ul)梯度稀释为2×10⁵，2×10⁴，2×10³，2×10²，2×10¹拷贝数/ul，取5ul为模板(加水5ul，PCR反应液15.0μl)按上述与待测样品相同的方法进行PCR扩增，标准品检测结果如图1所示(横坐标为PCR反应的循环数，纵坐标为检测器检测到的荧光值，图中曲线从左至右分别代表起始模板数为：1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³、1×10²拷贝数)，根据检测结果绘制标准曲线，标准曲线如图2所示(横坐标为标准品起始拷贝数的对数值，纵坐标为Ct值)。

五、检测结果

选中上述所有样品检测孔，根据标准曲线进行相应分析，得出待测样品的起始模板数(M)。每毫升全血样本中LUNX mRNA的拷贝数N＝M×20。8例临床确诊已转移的肺癌患者检测结果均为阳性，具体结果如表1所示：

表1 8例临床确诊已转移的肺癌患者LUNX mRNA拷贝数的检测结果

患者编号	病理分型	性别	年龄	标本	LUNX mRNA值(拷贝数/毫升全血)
						12345678	鳞癌腺癌腺癌腺癌鳞癌鳞癌鳞癌腺癌	男男女女男男男男	7769776465707547	外周血外周血外周血外周血外周血外周血外周血外周血	1.2×10<sup>5</sup>9.4×10<sup>5</sup>3.2×10<sup>5</sup>1.3×10<sup>6</sup>6.8×10<sup>5</sup>1.6×10<sup>6</sup>7.9×10<sup>5</sup>1.2×10<sup>6</sup>

23例临床未确诊转移的肺癌患者中10例为阳性，其余13例为阴性，具体结果如表2所示：

表2 23例临床未确诊转移的肺癌患者LUNX mRNA拷贝数的检测结果

患者编号	病理分型	性别	年龄	标本	LUNX值(拷贝数/毫升全血)
						12131418202325282931	腺癌鳞癌鳞癌腺癌大细胞癌鳞癌腺癌腺癌腺癌鳞癌	男女男男男男男男女男	65706965727055588962	外周血外周血外周血外周血外周血外周血外周血外周血外周血外周血	5.6×10<sup>5</sup>6.4×10<sup>5</sup>2.0×10<sup>3</sup>4.1×10<sup>4</sup>2.0×10<sup>5</sup>1.0×10<sup>5</sup>2.7×10<sup>5</sup>2.8×10<sup>5</sup>6.9×10<sup>5</sup>1.4×10<sup>5</sup>

对照组：5例乳腺癌患者、2例贲门癌患者、15例肺部良性疾病患者及10例正常健康人均为阴性，未检测到LUNX的表达。上述结果表明用本发明的试剂盒可对LUNX mRNA的表达进行较为准确的定性及定量分析。

序列表

<160>4

<210>1

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

gcctcattgt cttctacggg ctgtt    25

<210>2

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

ctgagggcat ttgtcaagct tcct    24

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

cagaccatgg cccagtttgg aggcctg    27

<210>4

<211>151

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

gcctcattgt cttctacggg ctgttagccc agaccatggc ccagtttgga ggcctgcccg    60

tgcccctgga ccagaccctg cccttgaatg tgaatccagc cctgcccttg agtcccacag    120

gtcttgcagg aagcttgaca aatgccctca g                                   151

Claims (8)

1.检测肺特异性X蛋白基因mRNA表达量的专用探针，是具有序列表中SEQ ID NO：3的DNA序列。

2.根据权利要求1所述的专用探针，其特征在于：所述探针为经过荧光标记的，且两端分别连接有报告荧光基团和淬灭荧光基团。

3.检测肺特异性X蛋白基因mRNA表达量的试剂盒，包括权利要求1所述的检测肺特异性X蛋白基因mRNA表达量的专用探针和检测肺特异性X蛋白基因mRNA表达量的专用引物；所述检测肺特异性X蛋白基因mRNA表达量的专用引物，是具有SEQ ID NO：1和SEQID NO：2序列的引物对。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括细胞裂解液、RNA洗涤缓冲液、无RNA酶的水、RNA分离柱、DNA酶I储存液、反转录缓冲液、dNTP混合物、逆转录酶储存液、PCR反应液、尿嘧啶DNA糖基化酶储存液和已知浓度的标准品；所述标准品为与专用引物及探针特异结合的DNA序列；所述各种溶液的溶剂为水。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述标准品具有序列表中SEQ IDN0：4的DNA序列；标准品的浓度为2×10⁶拷贝数/μl。

6.根据权利要求3或4或5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括阳性对照品和阴性对照品，所述阳性对照品为含有LUNX mRNA的肺癌患者外周血总RNA，阴性对照品为正常人外周血总RNA。

7.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于：所述RNA分离柱为硅胶柱。

8.根据权利要求3或4或5所述的试剂盒，其特征在于：所述探针的浓度为2μmol/L。

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