KR20130023909A

KR20130023909A - 병아리 성 감별용 ｄｎａ 프로브 및 상기 프로브를 이용한 병아리 깃털을 이용한 성 감별법

Info

Publication number: KR20130023909A
Application number: KR1020110087012A
Authority: KR
Inventors: 손시환
Original assignee: 경남과학기술대학교 산학협력단
Priority date: 2011-08-30
Filing date: 2011-08-30
Publication date: 2013-03-08

Abstract

본 발명은 병아리의 W-염색체에 특이적 DNA 프로브 및 이를 이용한 병아리의 성을 감별하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 병아리의 W-염색체 특이적 핵산 서열(서열번호 3)을 포함하는 프로브(probe) 및 이를 형광접합보인법을 이용하여 병아리의 깃털로서 성을 감별하는 방법에 관한 것이다.

Description

병아리 성 감별용 ＤＮＡ 프로브 및 상기 프로브를 이용한 병아리 깃털을 이용한 성 감별법 {DNA probe for gender determination of chick and method for gender determination of chick by the probe using feather}

닭의 경우 성계가 되기 이전에는 외관상으로 암수감별이 불가능하다. 따라서 병아리의 암수 감별은 전문감별사에 의한 항문돌기의 모양과 광택의 차이로 성을 식별하거나, 유전학적으로 특정 형질에 대한 반성유전을 이용하여 부모 계통을 조성하여 생산되는 병아리의 형태로서 성을 식별할 수 있다.

따라서 병아리의 성을 식별하기 위해서는 전문감별사의 도움이나 반성유전관련 형질을 보유한 종계들의 계통 조성이 선행되어야 함으로 일반적인 병아리의 암수 감별은 용이하지를 않다.

US 6396938 B1(PN)

이에 본 발명자는 상기와 같은 문제점을 극복하고자 병아리의 깃털로부터 쉽게 암수를 구별할 수 있는 병아리 성 감별용 DNA 프로브 및 상기 프로브를 이용하여 병아리의 성을 감별하는 방법을 개발하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명은 병아리 성 감별용 DNA 프로브 및 상기 프로브를 이용하여 병아리의 성을 감별하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 서열번호 1, 서열번호2및 이의 상보서열로 구성되는 프라이머에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 서열번호 3 또는 이의 상보서열을 갖고, 병아리의 W-염색체 존재여부를 진단하기 위한 프로브에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 (a)분리된 핵산을 형광물질로 표지화하여 프로브를 준비하는 과정; (b) 진단하고자 하는 병아리의 세포 또는 핵산을 추출하여 표본을 제조하는 과정; (c) 상기 프로브를 상기 표본과 혼성화 반응을 시킨 후 분석하는 과정을 포함하는 병아리의 성을 감별하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 적어도 하나의 용기에 상기 프로브를 포함하는 병아리의 W-염색체 및 병아리의 성을 감별하기 위한 키트에 관한 것이다.

본 발명에 의하면, 전문 감별사의 도움이나 반성유전관련 형질을 보유한 종계들의 계통 조성이 필요 없이 병아리의 깃털로 쉽게 암수를 구별할 수 있다.

도 1은 10일령 된 병아리 깃털의 양상에 관한 것이다.
도 2는 병아리 깃털로부터 수질세포를 분리 하는 것에 관한 것이다.
도 3은 깃털세포의 성 염색체(W) 특이 형광접합 발현 양상을 나타낸다 (W-프로브 형광접합이 있는 것은 암컷, 형광접합이 없는 것은 수컷).
도 4는 닭 생식기의 해부학적 소견에 관한 것이다 (좌측은 암컷, 우측은 수컷).

본 발명은 닭을 포함한 대부분의 동물들에 있어 암컷과 수컷의 성 염색체가 다름에 착안하여 병아리의 깃털세포로부터 성 염색체를 식별하여 암수를 판단하고자 하는 기법이다. 즉, 병아리로부터 하나의 깃털을 뽑고 깃털수질(Feather pulp) 세포를 분리하여 형광접합보인법(fluorescence in situ hybridization; FISH)으로 성 염색체를 식별하여 암수를 감별하고자 하는 것이다.

본 발명은 서열번호 1, 서열번호 2 및 이의 상보서열로 구성되는 프라이머에 관한 것이다. 보다 구체적으로,

본 발명은 서열번호 1, 서열번호 2 및 이의 상보서열로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함하는, 병아리의 게놈 DNA로부터 서열번호 3 또는 이의 상보서열을 분리하기 위한 프라이머에 관한 것이다.

본 발명의 명세서에 사용된 "게놈 DNA(genomic DNA)"은 특정 개체의 유전자 정보의 집합체를 말하는 것으로, "병아리의 게놈 DNA"란 병아리의 DNA를 구성하는 모든 유전자 집합체를 말한다.

상기 게놈 DNA는 닭의 모든 세포로부터 추출할 수 있다. 보다 구체적으로, 혈액 및 조직 등의 세포로부터 일반적으로 분리하여 추출할 수 있고, 특히, 암탉의 모든 세포, 바람직하게는 혈액세포로부터 추출할 수 있다.

또한, 서열번호 3 또는 이의 상보서열을 갖고, 병아리의 W-염색체 존재여부를 진단하기 위한 프로브에 관한 것이다.

상기 프로브는 형광접합보인법에 사용될 수 있으며, 즉, 서열번호 3 또는 이의 상보서열을 갖고 형광접합보인법에 사용되는 것을 특징으로 하는 병아리의 W-염색체 존재여부를 진단하기 위한 프로브에 관한 것이다.

본 발명의 명세서에 사용된 용어 “W-염색체”는 병아리의 성 염색체로서 수컷에는 없고 암컷에만 있는 것으로, 이런 이유로 암컷 특성을 나타내는 유전자 일부가 존재할 것으로 여겨지고 있다. 본 발명의 진단 프로브는 병아리의 W-염색체에 특이적으로 결합하여 개체의 성을 판단하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 명세서에 사용된 "프로브(probe)"는 진단용 탐침을 말하는 것으로, W-염색체에 특이적으로 결합할 수 있는 뉴클레오타이드(nucleotide)를 포함한다. 또한, 검출의 용이함을 위해 표지(labeling)될 수 있다.

상기 핵산서열(서열번호 3)은 W-염색체 특이적 DNA 또는 RNA 서열을 검출할 수 있는 혼성화 프로브로 사용될 수 있다. 본 발명의 W-염색체 특이적 혼성화 프로브는 서열번호 3의 핵산 서열, 이의 상보서열 또는 이들의 단편을 포함한다.

본 발명의 W-염색체 특이적 혼성화 프로브에 포함되는 핵산 서열은 표지되거나 또는 표지되지 않고 사용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 핵산서열은 동일한 조건으로 혼성화를 수행하였을 때, 병아리의 전체(total) 암컷 DNA에만 혼성화된다. 본 발명의 상기 핵산서열을 포함하는 프로브는 엄격한 조건(stringent condition)으로 혼성화를 수행할 때 전체 수컷 DNA에서는 혼성화가 일어나지 않으며, 반면에 전체 암컷 DNA와는 혼성화가 일어난다.

본 발명의 프로브는 병아리에서만 특이적으로 W-염색체에 존재하는 DNA의 일부와 혼성된다.

본 발명의 핵산을 포함하는 프로브는 표지된 경우 또는 표지되지 않은 경우 모두에 있어서 동일한 혼성화 조건 하에서 병아리 암컷 DNA에 대하여 99%이상의 빈도로 혼성화된다. 본 발명의 프로브는 병아리의 W-염색체에 특이적으로 혼성화하는 정도를 변경하지 않는 범위 내에서 서열번호 3의 핵산 서열을 변경하거나 양단에 핵산 단편을 부가할 수 있다.

본 발명의 혼성화 프로브로 사용되는 핵산 서열은 검출의 용이성을 위해 표지화될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 핵산은 비오틴(Biotin), 디곡시제닌(Digoxygenin, 이하 Dig라 함) 등과 같은 비-방사성 물질로 표지될 수 있다. 또한, 브로모데옥시유리딘(bromodeoxyuridine)과 같은 다른 비-방사성 표지가 사용될 수도 있다. 방사성 동위원소 또한 본 발명의 핵산 프로브를 표지하기 위해 사용될 수 있다. 프로브에 ³²P로 표지할 수 있으며, ³H, ¹⁴C, 또는 ¹²⁵L과 같은 다른 방사성 원소도 용이하게 사용될 수 있다. 표지는 예를 들면 동위원소로 표지된 하나 또는 그 이상의 데옥시-뉴클레오사이드-5-트리포스페타제의 존재 하에서 DNA 샘플의 절단 수선 복제(Nick-Translation)을 사용하여 표지할 수 있다.

다른 표지방법으로는 핵산의 화학적 표지화 방법이 있다. 랜덤 프라임드 라벨링(Random Primed Labeling)은 5' 에서 3' 폴리머라제 활성을 가지는 E.coli 폴리머라제의 클레노우(Klenow) 단편과 DNA의 폴리머라제 프라이머로 제공되는 헥사뉴클레오타이드(hexanucleotide)를 이용한다. 모든 DNA 서열 조합이 헥사뉴클레오타이드 프라이머 혼합물에 존재하므로 프라이머는 DNA틀에 각 80-100bases 정도로 결합하게 되고, 새로운 DNA 가닥은 표지된 핵산과 비 표지된 핵산을 함유한 반응 혼합물(reaction mixture) 내에서 DNA 폴리머라제의 클레노우 단편에 의해 합성된다. 이 방법은 반응이 일어나는 동안 DNA가 변성되지 않기 때문에 적은 양의 DNA(예를 들면, 10-200ng)에 이용할 수 있으며, 한 가닥 혹은 두 가닥 DNA를 모두 반응의 틀(template)로 사용할 수 있고, 작은 DNA 단편(100-500 bp)의 표지화에 응용할 수 있다.

절단 수선 복제(Nick translation) 방법은 DNA 양 가닥에 표지 뉴클레오타이드(labeled nucleotide)를 결합시킬 수 있는 DNAaseI과 E. coli DNA 폴리머라제를 이용한다. 이 반응 중 가장 중요한 변수는 두 가닥의 DNA에 닉(nick)을 만드는 DNAaseI의 활성도이다. 만약에 너무 조그만 닉을 형성한다면 표지된 프로브가 커서 결합되기 어렵고 너무 큰 닉을 형성한다면 표지된 프로브가 작아서 단단히 결합될 수 없다.

DNAaseI과 E.coli DNA 폴리머라제가 섞여 있는 상품화된 효소 혼합물(enzyme mix)을 사용할 수 있는데, 60-90분에 50% 이상 표지를 결합시킬 수 있으며 200-400bp의 프로브 길이를 형성할 수 있는 것을 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용된 프로브의 표지 방법으로는 PCR-Dig 표지방법이다. PCR-Dig 표지(labeling) 방법은 PCR 방법과 결합한 비-방사성 물질의 표지 방법으로서 제한된 양의 DNA로부터 다량의 Dig이 표지된 프로브를 얻을 수 있다. 본 방법을 이용하여 성공적인 표지 프로브를 얻기 위해서는 PCR의 조건이 가장 중요한데, 이는 대상 DNA(template DNA)와 프라이머에 따라 달라질 수 있다. 즉, 대상 DNA, 프라이머, Mg 이온 및 폴리머라제의 농도와 PCR의 반복수 및 온도가 결정적 요인이다.

보다 구체적으로 본 발명에서 이용한 진단용 프로브의 제작은 PCR-Dig 표지 방법을 이용하는데, 본 발명의 W-염색체 특이적 핵산서열을 주형으로 하고 형광물질을 포함하는 PCR 반응 혼합물의 존재 하에서 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하는 과정; 및 PCR 산물의 확인과정을 포함한다.

본 발명의 명세서에 사용된 "형광접합보인법(Fluorescence In Situ Hybridization)"이라 함은 특정 DNA 탐침자를 형광물질로 표지하고, 이를 표적 DNA와 접합시킴으로써 표적 시료에 대한 탐침자의 정보를 알 수 있는 방법이다. 구체적으로 접합보인기술(In situ hybridization)이란 특정 핵산이 염색체상 혹은 세포나 조직 상의 어디에 위치하는가를 인지하는 방법으로서 면역화학적 기술과 결합하여 이들의 존재 유무를 확인할 수 있다. 이의 원리는 핵산은 상보적 결합 속성이 있으므로 특정 서열을 지닌 DNA 혹은 RNA 프로브와 단일 쇄 DNA를 혼합하여 가열 융해 후 서서히 냉각하면 상동성이 존재하는 영역에서 프로브와 대상 분자(target molecule)간에 염기 쌍을 형성하게 되는 것이다. 이전까지의 접합보인기술은 주로 방사성 물질을 이용하여 표지시키고, 자가방사성탐침(autoradiography)을 통해 검색하였다. 그러나 최근 비-방사성 물질 표지 방법으로서 형광물질을 이용하여 접합보인법에 응용함으로서 형광접합보인법(FISH)이란 방법이 개발되게 되었다.

본 발명은 병아리의 W-염색체에 특이적인 반복 핵산 서열을 밝혀낸 것에서부터 출발한다. 구체적으로, 본 발명은 병아리의 W-염색체에 특이적으로 혼성화하는 핵산 서열, 더 구체적으로 서열번호 3의 서열, 이의 상보 서열 또는 이의 단편을 포함하는 핵산 서열을 포함한다.

본 발명은 닭의 모든 세포, 보다 구체적으로, 혈액 및 조직 등의 세포, 특히, 암탉의 모든 세포, 바람직하게는 혈액세포로부터 게놈 DNA을 추출하고 상기 DNA로부터 병아리의 W-염색체에 특이적으로 혼성화하는 핵산 서열을 분리하기 위한 PCR 프라이머를 포함한다. 보다 구체적으로 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열을 포함하는 프라이머를 포함한다.

본 발명은 서열번호 3의 핵산 서열, 이의 상보 서열 또는 이의 단편을 포함하는 병아리의 W-염색체 존재 여부를 진단하여 병아리의 성을 감별할 수 있는 프로브를 포함한다.

본 발명은 서열번호 3의 핵산 서열, 이의 상보 서열 또는 이의 단편을 표지하는 과정을 포함하는 병아리의 W-염색체의 존재 여부를 진단하여 병아리의 성 감별용 프로브를 제작하는 방법을 포함한다.

또한, 본 발명은 병아리의 성 감별법에 관한 것으로, 보다 구체적으로,

(a)분리된 핵산을 형광물질로 표지화한 프로브를 준비하는 과정; (b) 진단하고자 하는 병아리의 세포를 추출하여 표본을 제조하는 과정; (c) 상기 프로브를 상기 표본과 혼성화 반응을 시킨 후 분석하는 과정을 포함하는 병아리의 W-염색체 존재를 확인함으로써 병아리의 성을 감별하는 방법에 관한 것이다.

상기 (a)과정의 핵산은 서열번호 3 또는 이의 상보서열을 갖는 병아리의 W-염색체에 특이적으로 혼성화되는 핵산을 분리하기 위한 프라이머를 사용하여 PCR을 수행함으로써, 병아리의 게놈 DNA로부터 분리하는 것일 수 있다.

상기 프라이머가 서열번호 1, 서열번호 2 및 이의 상보 서열로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 서열을 포함할 수 있다.

상기 (b)과정의 세포는 병아리의 깃털수질세포일 수 있다.

본 발명의 명세서에 사용된 "PCR(중합효소 연쇄반응, Polymerase Chain Reaction)"은 특정 DNA 부위를 특이적으로 반복 합성하여 시험관 내에서 원하는 DNA 분자를 증폭시키는 방법을 말하는 것으로, 게놈 DNA와 같은 상당히 큰 DNA로부터 일부 DNA 부분만을 선택적으로 증폭시킨 후 일반적으로 사용되는 아가로즈겔이나 폴리아크릴아마드겔 상에서 뚜렷하게 보이는 밴드로 가시화 할 수 있는 방법이다. 또한, PCR의 수행에 있어서 주형이 되는 이미 알고 있는 DNA 서열에 상보적으로 결합하여 PCR 증폭의 시발체가 되는 20~30 염기서열을 "프라이머(primer)"라 한다. 통상적으로, 프라이머는 GC%가 대략 50~60%로 구성되며, 4종의 염기가 고르게 분포하도록 하고, 퓨린 또는 피리미딘의 연속적인 배열구조는 피하는 것이 좋다. 프라이머의 G 또는 C가 3개 이상 연속적으로 배열되면 원치 않는 부위에 결합할 수 있기 때문에 피하는 것이 좋으며, 한 쌍의 프라이머에서 3'말단이 상보적인 결합을 하여 '프라이머-다이머'가 형성되는 것을 최소화하여야 하며, PCR 산물의 효율적인 클로닝을 위해서 프라이머의 5'말단에 적당한 제한효소의 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 병아리의 W-염색체에 특이적으로 혼성화할 수 있는 핵산 서열은 단일-쇄 또는 이중 쇄 DNA 또는 RNA, DNA와 RNA 혼성체를 포함한다. 구체적으로, 본 발명의 W-염색체에 특이적으로 혼성화할 수 있는 핵산 서열은 서열번호 3의 핵산 서열, 이의 상보서열 또는 이들의 단편을 포함한다.

본 발명의 병아리의 W-염색체에 특이적으로 결합하는 핵산 서열을 제작하는 방법은 화학 합성법을 포함한다. DNA 서열은 예를 들면, Applied Biosystems 380A DNA synthesizer (Applied Biosystem, Inc., Foster City, Calif., U.S.A.)와 같은 올리고뉴클레오티드 합성기를 사용하는 화학적 방법에 의해서 합성할 수 있다. 또한, 재조합 DNA 기술을 이용하여 숙주 진핵 또는 원핵세포 내에서 클로닝, 증폭 및/또는 발현시켜 수득할 수 있다.

또한, 본 발명의 W-염색체 특이적 DNA 서열을 제작하는 다른 방법으로 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 포함한다. 즉, 병아리의 게놈 DNA로부터 전체(total) RNA를 추출해 낸 다음 이 RNA를 주형으로 하고 특정의 프라이머, 보다 바람직하게는 서열번호 1 및 2의 염기서열을 가지는 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 이용하여 RT-PCR을 수행함으로써 수득할 수 있다. 또는 병아리의 게놈 DNA로부터 특정의 프라미어, 또는 서열번호 1 및 2의 염기서열을 가지는 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 이용하여 PCR을 수행함으로써 수득할 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 W-염색체 특이적 혼성화 핵산 서열을 제작하는 방법의 한 형태는 암탉의 게놈 DNA를 준비하는 과정; 준비된 암탉의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 하기의 서열번호 1 및 2의 염기서열을 가지는 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 이용하여 PCR을 수행하는 과정 및 PCR 산물을 분리 및 동정하는 과정을 포함한다.

Forward 5' CCCAAATATAACACGCTTCACT 3' (22mers) (서열번호 1)

Reverse 5' GAAATGAATTATTTTCTGGCGAC 3'(23mers) (서열번호 2)

상기 PCR 방법은 통상의 방법으로 수행될 수 있으며, 생성된 PCR 산물은 완충-구배 또는 전해질-구배 방법 등으로 분리될 수 있다. 분리된 핵산 서열에 대한 서열분석이 수행되고, 디데옥시 체인 종결방법 (Sanger 등, 1997) 등으로 확인할 수 있다. 본 발명은 상기의 방법으로 병아리의 게놈 DNA로부터 분리되어 동정된 416bp 크기의 염기서열 (서열번호 3)을 포함한다.

cccaaatataacacgcttcactcacaaagcacgcattttcaccccgaaagtaccacctttcagccgaaaattacgctttttcctccagaaaataccacttctcaaacagaaatatcacgtttcgccaagaaaatagcaccattcaccccaaaatcacgcgttttctctccagaactaccacttttctcacggaaatcacacattttcttcccgaaagtaccaccttgcacacgaaaatcacgcattttctgcgcgaaacaaccccatttcaccccaaaatcagtctttttcttccggaaaatacaacttttctaacgaaatccatgcgttatcactctgaaaatacacgtttttgcccgaaaatcacgcattttcccttcgtaaattccccatgtcgccagaaaataattcatttc (서열번호 3)

또한, 본 발명은 서열번호 3의 핵산 서열, 이의 상보 서열 또는 이의 단편을 포함하는 병아리의 W-염색체의 존재를 확인할 수 있는 프로브를 포함하는 성 감별용 키트에 관한 것이다.

또한, 적어도 하나의 용기에 상기 프로브를 포함하는 병아리의 W-염색체 및 병아리의 성을 감별하기 위한 키트에 관한 것이다.

본 발명의 분리된 핵산 또는 이를 포함하는 진단 프로브는 다양한 조직 또는 세포 샘플 내의 W-염색체 존재 여부 또는 병아리의 성을 감별하기 위한 키트를 구성하거나 키트의 일부를 형성할 수 있다. 본 발명의 키트에 포함되는 진단 프로브는 서열번호 3의 핵산 서열, 이의 상보 서열 또는 이들의 단편을 포함한다. 또한, 상기 핵산은 비-방사성 마커를 포함하여 표지될 수 있다.

본 발명의 키트는 이 기술 분야에 널리 알려진 필수 구성 요소를 포함하는데, 다음에 제한되는 것은 아니지만, 희석을 위한 완충액, 시약, 표지된 화합물, 분석을 위한 고상 지지체(solid support) 등을 포함할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 >

1. 재료 및 방법

1) 공시병아리

병아리의 깃털세포로부터 암수 감별을 수행하고자 경남과학기술대학교 종합농장에서 부화한 10일령 된 한국재래닭, 로드아일랜드레드종, 코니시종 각 20수씩을 분석 대상으로 하였고, 각 개체 정깃의 깃털수질세포를 채취하여 본 시험을 실시하였다. 또한 공시된 병아리 암, 수 확인을 위하여 모든 개체를 해부하여 암수 생식기의 유무를 검정하였다.

2) 병아리 성 염색체(W- chromosome ) 특이 형광보인용 DNA 프로브 ( probe ) 제작

병아리의 W 염색체 특이 형광접합보인용 DNA 프로브 제작을 위한 프라이머(primer)는 다음과 같다.

Forward 5' CCCAAATATAACACGCTTCACT 3' (22mers) : 서열번호 1

Reverse 5' GAAATGAATTATTTTCTGGCGAC 3'(23mers) : 서열번호 2

제작된 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction ; PCR)을 시행하였다. 증폭된 중합효소연쇄반응 생성물들에 딕 표식(Dig-labeling)을 위하여 다음과 같은 방법으로 증폭하였다. PCR buffer 5㎕,　PCR DIG mix 5㎕, primer(5pmol/㎕) 4㎕, Enzyme mix 0.5㎕, PCR product (200ng/㎕) 2㎕, 멸균된 초자수 13.5㎕를 넣어 혼합한 후 94℃에서 5분간 최초 변성을 시키고, 94℃ 30초간 변성, 56℃에서 30초간 접합, 그리고 72℃에서 30초간 신장하는 과정을 35회 순환시킨 후 마지막 신장과정을 72℃에서 5분간 실시하였다. 이상의 방법으로 증폭된 416bp의 딕(dig) 표지 생성물을 병아리의 W 염색체 특이 형광접합보인용 프로브로 하였다. 증폭된 생성물은 2% 아가로스 겔(agarose gel)로 전기 영동하여 생성물의 유무를 확인하였다.

cccaaatataacacgcttcactcacaaagcacgcattttcaccccgaaagtaccacctttcagccgaaaattacgctttttcctccagaaaataccacttctcaaacagaaatatcacgtttcgccaagaaaatagcaccattcaccccaaaatcacgcgttttctctccagaactaccacttttctcacggaaatcacacattttcttcccgaaagtaccaccttgcacacgaaaatcacgcattttctgcgcgaaacaaccccatttcaccccaaaatcagtctttttcttccggaaaatacaacttttctaacgaaatccatgcgttatcactctgaaaatacacgtttttgcccgaaaatcacgcattttcccttcgtaaattccccatgtcgccagaaaataattcatttc : (서열번호 3)

3) 병아리 깃털세포( feather pulp cell ) 표본 제작

부화 후 10일령 된 병아리 정깃(날개의 깃털, feather) 1~2개를 뽑아 표본을 제작하였다. 각 정깃 내에 있는 수질(pulp)을 채취하기 위하여 핀셋을 이용하여 우축(깃털의 축) 아래 부분을 잡고 뿌리깃촉(calamus)으로 수질(pulp)이 나오도록 짜내었다(도2). 채집한 수질은 생리식염수(D-PBS)로 3~4번 세척하여 이물질을 제거하고 세절판에서 칼로 잘게 다져주었다. 잘게 다져진 조직들은 생리식염수 용액이 들어있는 시험관으로 옮겨 200× g에서 10분간 원심분리 시켰다. 침전된 세포에 1.0% 소디움 시트르산(sodium citrate)용액을 첨가하여 20분간 저장처리하고 원심분리 시켰다. 고정처리는 메탄올(methanol)과 아세트산(acetic acid)이 3:1로 혼합된 고정액을 이용하고, 이를 3회 반복 처리한 후 세포액을 3~4방울 정도 떨어뜨려 슬라이드 표본을 제작하고 제작된 표본은 24시간 건조 후 형광접합보인법을 시행하였다.

4) 형광접합보인법

슬라이드 표본을 RNA분해효소(RNase A)로 RNA를 제거한 후 초자수로 세척하고 에탄올로 탈수 건조시켰다. 이후 접합용액(13㎕ formamide, 5㎕ hybridization buffer, 2㎕(100ng/㎕) chicken W-specific DNA probe)을 떨어뜨린 후 밀봉하고 72℃에서 10분간 변성(denaturation)시킨 후 38℃에서 12시간이상 접합(hybridization)시켰다. 접합 후 슬라이드를 2×SSC용액으로 72℃에서 5분간 처리하고 PN완충액(0.1% sodium phosphate, 0.1% Nonidet P-40)으로 세척하였다. 형광접합 탐지를 위하여 anti-digoxigenin-fluorescein을 처리하고 커버글라스로 덮은 후 38.5℃에서 10분간 반응시켰다. 반응이 끝난 슬라이드는 PN완충액으로 세척하고 건조시켰다. 배경염색은 propidium iodide용액으로 하고 암소에서 건조시켰다. 처리가 끝난 표본은 적녹 파장대의 겸용 필터를 부착한 형광현미경을 이용하여 성(W) 염색체의 형광접합보인 양상을 관찰하였다.

2. 결과

깃털을 이용한 암수 감별을 위하여 부화한지 10일령된 병아리 60마리의 깃털로부터 수질 세포를 분리하였다. 제작된 병아리 성 염색체(W) 특이 형광접합보인용 DNA 프로브로 깃털 세포에 대한 형광접합보인법을 시행한 결과 총 60마리 중 28마리에서 성 염색체(W) 특이 형광발현이 있었고, 32마리는 형광발현이 나타나지 않았다. 병아리의 성 염색체는 수컷은 ZZ로 구성되어 있고, 암컷은 ZW로 구성되어 있다. 따라서 성 염색체(W) 특이 형광발현이 나타나는 28마리는 암컷, 형광발현이 나타나지 않은 32마리는 수컷으로 판정하였다. 본 결과의 확인을 위하여 깃털 형광접합보인분석을 한 모든 병아리를 해부하고, 정소와 난소의 유무로 성별을 검정하였다. 병아리의 내부 생식기의 경우 수컷은 2개의 정소가 뚜렷이 나타났고, 암컷은 한쪽 난소는 형태가 분명하지 않은 퇴화양상을 보이고 1개의 난소만 뚜렷한 형태를 보였다.

표 1은 깃털을 이용한 형광접합보인분석의 결과와 분석 개체들의 해부결과를 비교한 것으로 깃털에서 성 염색체(W) 특이 형광발현 양상이 있었던 28개체는 해부결과 1개의 난소만을 지닌 암컷이었고, 형광접합 발현이 되지 않은 32개체는 뚜렷한 2개의 정소를 지닌 수컷으로 판별되어 100%의 성의 일치를 나타내었다. 도3은 병아리의 깃털 수질세포를 이용한 형광접합보인의 결과로서 암컷 세포의 경우 각 세포마다 뚜렷한 성 염색체(W) 특이 형광접합 발현양상을 보였다. 암 병아리의 경우 모든 세포의 핵에 하나의 프로브의 접합 발광(노란점)이 나타났고, 숫 병아리의 경우는 전혀 접합양상이 나타나지 않았다.

도 4는 병아리의 성별확인을 위한 해부 사진으로 숫 병아리의 경우 2개의 정소가 뚜렷이 보이고, 암컷은 한쪽의 난소만 명확하게 구분할 수 있었다.

형광보인분석법을 이용한 병아리 깃털 세포로부터 암수 감별 및 해부학적 검정

품종	개체번호	깃털세포 분석에 의한 성 감별	해부학적 소견	일치양상
재래닭	K-1	ZZ	수컷	일치
	K-2	ZZ	수컷	일치
	K-3	ZW	암컷	일치
	K-4	ZZ	수컷	일치
	K-5	ZW	암컷	일치
	K-6	ZW	암컷	일치
	K-7	ZW	암컷	일치
	K-8	ZZ	수컷	일치
	K-9	ZZ	수컷	일치
	K-10	ZW	암컷	일치
	K-11	ZZ	수컷	일치
	K-12	ZW	암컷	일치
	K-13	ZW	암컷	일치
	K-14	ZZ	수컷	일치
	K-15	ZZ	수컷	일치
	K-16	ZW	암컷	일치
	K-17	ZZ	수컷	일치
	K-18	ZZ	수컷	일치
	K-19	ZW	암컷	일치
	K-20	ZZ	수컷	일치
로드종	R-1	ZW	암컷	일치
	R-2	ZW	암컷	일치
	R-3	ZZ	수컷	일치
	R-4	ZZ	수컷	일치
	R-5	ZW	암컷	일치
	R-6	ZW	암컷	일치
	R-7	ZZ	수컷	일치
	R-8	ZW	암컷	일치
	R-9	ZZ	수컷	일치
	R-10	ZW	암컷	일치
	R-11	ZZ	수컷	일치
	R-12	ZZ	수컷	일치
	R-13	ZW	암컷	일치
	R-14	ZW	암컷	일치
	R-15	ZW	암컷	일치
	R-16	ZZ	수컷	일치
	R-17	ZZ	수컷	일치
	R-18	ZW	암컷	일치
	R-19	ZZ	수컷	일치
	R-20	ZZ	수컷	일치
코니시종	C-1	ZW	암컷	일치
	C-2	ZW	암컷	일치
	C-3	ZZ	수컷	일치
	C-4	ZW	암컷	일치
	C-5	ZZ	수컷	일치
	C-6	ZZ	수컷	일치
	C-7	ZZ	수컷	일치
	C-8	ZZ	수컷	일치
	C-9	ZW	암컷	일치
	C-10	ZZ	수컷	일치
	C-11	ZZ	수컷	일치
	C-12	ZW	암컷	일치
	C-13	ZW	암컷	일치
	C-14	ZZ	수컷	일치
	C-15	ZZ	수컷	일치
	C-16	ZW	암컷	일치
	C-17	ZZ	수컷	일치
	C-18	ZW	암컷	일치
	C-19	ZW	암컷	일치
	C-20	ZZ	수컷	일치

<110> Kyungnam University of Science and Technology Industry-Academic Cooperation Foundation <120> DNA probe for gender determination of chick and method for gender determination of chick by the probe using feather <130> P110861 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 1 cccaaatata acacgcttca ct 22 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 2 gaaatgaatt attttctggc gac 23 <210> 3 <211> 416 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 3 cccaaatata acacgcttca ctcacaaagc acgcattttc accccgaaag taccaccttt 60 cagccgaaaa ttacgctttt tcctccagaa aataccactt ctcaaacaga aatatcacgt 120 ttcgccaaga aaatagcacc attcacccca aaatcacgcg ttttctctcc agaactacca 180 cttttctcac ggaaatcaca cattttcttc ccgaaagtac caccttgcac acgaaaatca 240 cgcattttct gcgcgaaaca accccatttc accccaaaat cagtcttttt cttccggaaa 300 atacaacttt tctaacgaaa tccatgcgtt atcactctga aaatacacgt ttttgcccga 360 aaatcacgca ttttcccttc gtaaattccc catgtcgcca gaaaataatt catttc 416

Claims

서열번호 1, 서열번호 2 및 이의 상보서열로 구성되는 프라이머.
서열번호 3 또는 이의 상보서열을 갖고, 병아리의 W-염색체 존재여부를 진단하기 위한 프로브.
제 2항에 있어서, 상기 프로브는 형광접합보인법에 사용되는 것을 특징으로 하는 프로브.
(a)분리된 핵산을 형광물질로 표지하여 프로브를 준비하는 과정; (b) 진단하고자 하는 병아리의 세포를 추출하여 표본을 제조하는 과정; (c) 상기 프로브를 상기 표본과 혼성화 반응을 시킨 후 분석하는 과정을 포함하는 병아리의 성을 감별하는 방법.
제 4항에 있어서, 상기 (b)과정의 세포는 병아리의 깃털수질세포인 것을 특징으로 하는 병아리의 성을 감별하는 방법
적어도 하나의 용기에 제2항 또는 제3항에 따른 프로브를 포함하는 병아리의 W-염색체 및 병아리의 성을 감별하기 위한 키트.