KR20050100371A

KR20050100371A - 정상 및 암세포에서의 유전자 발현의 검출 방법

Info

Publication number: KR20050100371A
Application number: KR1020057013002A
Authority: KR
Inventors: 릴리 양; 강 바오; 찰스 스텔리; 신시아 코헨
Original assignee: 에모리 유니버시티
Priority date: 2003-01-13
Filing date: 2004-01-13
Publication date: 2005-10-18
Also published as: US20060210979A1; AU2004204820A1; WO2004062487A3; JP2006526390A; CN101061236A; WO2004062487A2; CA2512956A1; EP1587412A4; EP1587412A2

Abstract

본 발명은 정상세포 및 암세포에서의 유전자 발현을 검출하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 시료 세포 중의 각종 종양 마커의 존재 또는 유전자 발현의 변화를 검출, 확인, 또는 정량하기 위해 형광 영상 기술과 결합된 분자표지(molecular beacon:MB) 기술을 이용하는 방법을 제공한다.

Description

정상 및 암세포에서의 유전자 발현의 검출 방법{METHODS OF DETECTING GENE EXPRESSION IN NORMAL AND CANCEROUS CELLS}

본 발명은 분자표지술(molecular beacon technology)을 사용하여 정상 및/또는 암세포에서 종양 마커 유전자와 돌연변이 종양유전자(oncogene)의 발현 수준의 검사를 통해 인간 암세포를 검출하는 방법에 널리 관계되는 것이다.

유방암은 여성들에게 가장 흔한 유형의 암이며 주요한 사망 원인이다. 생존율을 높이는 결정적인 인자는 이를 조기에 진단하는 것이다. 유방조영술(mammography)에 의한 조기 진단이 이 질병의 사망률을 낮추기는 했지만, 유방암 환자의 거의 20%는 여전히 유방조영술에 의해 포착되지 않는다.

게다가, 비정상적인 유방조영상을 나타내는 모든 환자 중의 10%∼20%만이 생검(biopsy)에 의해 유방암으로 확인되었다(Harris et al., In Detita VT, Lippincott-Raven; 1557-1616 (1997)). 현재로서는, 유방암 진단을 위한 신뢰할만한 혈청 종양 마커가 없다. 그러므로, 유방암의 조기 진단에 대한 새로운 접근 방식의 개발은 환자들의 성공적인 치료와 생존률의 고양에 있어서 결정적으로 중요하다.

현재까지는, 세포병리학적 분석용의 유즙 도관 상피 세포를 수집하기 위한 최소한도의 침습적인 방법으로서, 도관 세척이 이용되어 왔다(O'Shaughnessy et al., Cancer 94(2):292-298 (2002)). 이 방법은 유두구(nipple orifice)에 미세도관을 삽입하는 공정, 삽관된(cannulated) 도관을 생리식염수로 세척하는 공정, 세척유출물을 수집하는 공정을 포함한다. 정상, 비정형성(atypical), 악성의 유즙 도관 세포의 존재를 분석하기 위해서, 도관당 약 13,500개의 세포가 수집될 수 있다. 그러나, 서로다른 세포 유형을 동정하는 현재의 방법은, 종종 그 정확도가 떨어지는 형태학상의 분류에 의한다.

췌장암은 그 극단적으로 불량한 예후 때문에 미합중국에서의 암 사망의 4번째로 주요한 원인이다(Parker et al., CA. Cancer J. Clin . 46:5-27 (1996)). 미합중국에서는 매년 약 29,000건이 신규진단되며, 28,000건의 사망이 발생한다(Gold E.I, Surg . Clin . North Am. 75:819-839 (1995)). 췌장 환자의 50% 미만이 진단후 3개월 이상 생존하며 그들 중 8%가 2년간 생존한다(National Institute of Health: NIH Publication 93-2789 (1993)). 예후가 불량한 주요 이유는, 극소수의 췌장암 환자만이 조기에 발견되기 때문이다. 전통적인 방사선촬영법 및 초음파촬영법을 이용한 췌장암의 조기 진단은 극히 어렵다(Barkin et al., Gastroenterology Clinics of North America 28:709-722(1999)). 지난 수십년간의 강도높은 생의학 연구 노력에도 불구하고, 90% 이상의 췌장암 환자는 진단시에 이미 국소 및/또는 원격 전이가 진행되어 있어, 종종 치료하기엔 너무 늦게 되어버린다. 따라서, 췌장암의, 가능하게는 종양의 크기보다는 분자 마커에 근거한 조기 검출은 극히 중요하다.

췌장 및 유방암의 분자 마커

현재 K-ras 종양유전자가 초기 췌장암의 검출을 위한 가장 매력적인 분자 마커들 중의 하나라는 것은 잘 확립되어 있다(Minamoto et al., Cancer Detection & Prevention 24:1-12 (2000)); Futakawa et al., Journal of Hepato - Biliary -Pancreatic Surgery 7:63-71 (2000); Puig et al., International Journal of Cancer 85(1):73-77 (2000); Watanabe et al., Pancreas 17:341-7 (1998); Shibata et al., International Journal of Oncology 12: 1333-1338 (1998); Urgell et al., European Journal of Cancer 36:2069-2075, 2000)). G-프로틴 군의 일원인 K-ras는 세포 표면으로부터 성장 촉진 효과자(growth-promoting effector)의 신호 전달에 관계한다. K-ras의 점 돌연변이는 췌장 암종의 80∼100%에서 발견되는데, 이는 이것이 암 검출의 민감한 마커임을 시사한다(Minamoto et al., Cancer Detection & Prevention 24:1-12 (2000)). 게다가, 이들 돌연변이의 대부분이 코돈 12에 집중되어 있음은, 표지 설계의 용이성 면에서 K-ras를 더욱 매력적이게 한다. K-ras 돌연변이는 췌장암 발달의 극히 초기에 발생하므로, K-ras를 표적으로 하는 시험은 췌장 암종의 조기 검출을 가능하게 한다.

최근, 세포자멸사 단백질의 저해제(IAPs: Inhibitor of apoptosis proteins) 군의 유전자들이 발견되었다(LaCasse et al., Oncogene 17:3247-3259 (1998)). IAP류는 카스파제 활성의 저해를 통해 세포자멸사 경로의 연속단계를 저해한다(Deveraux et al., EMBO Journal 17(8):2215-2223 (1998)). IAP 단백질들 중 하나인 서바이빈(survivin)도, 몇 종류의 암에 대한 전도유망한 종양 마커임을 나타내는 증거들이 늘어나고 있다(Altieri et al., Lab. Invest. 79:1327-1333 (1999); Tanakaa et al., Clin . Cancer Res. 6:127-134 (2000); Moore et al., J. of Insurance Med . 33:202-203 (2001); Altieri et al., Trends in Mol . Med . 7:542-547 (2001)). 서바이빈은 태아 발달 동안에는 정상적으로 발현되지만 대부분의 정상 성인 조직에서는 발현되지 않는다(Altieri et al., Lab. Invest. 79:1327-1333 (1999)). 19개의 인간의 정상 및 병든 조직형으로부터의 350만 전사체를 분석한 결과로부터, 서바이빈은, 정상 조직에서는 그러하지 않으나 검사된 모든 암 조직에서 상승된 수준으로 균일하게 발현되는 상위 4가지 유전자 중의 하나임이 밝혀졌다(Velculescu et al., Nature Genetics 23:387-388 (1999)). 최근의 연구는, 면역조직화학(immunohistochemistry), 면역블로팅(immunoblotting) 및 실시간(RT)-PCR 측정에 의해, 췌장 도관 세포 샘암종(pancreatic duct cell adenocarcinoma)의 77% 및 도관내 유두 모양 점액 암종(IPMT: intraductal papillary-mucinous tumor)의 56% 이상에서의 서바이빈의 존재를 입증하였다(Saton et al., Cancer 92:271-278 (2001)). 서바이빈의 발현은 췌장암 세포의 종양 전이의 초기 단계를 포함하는, 췌장관 세포 암종의 모든 단계(제1기∼제4기)에서 검출가능하다. 그러나, 서바이빈의 발현은 정상 췌장 조직, 종양 세포 주변의 염증 세포 및 만성 췌장염 환자의 췌장 조직에서는 검출되지 않았다. 정상 췌장 및 다른 정상 조직에서의 서바이빈 발현의 부재는, 서바이빈을 췌장암 세포의 검출을 위한 이상적인 분자 마커이도록 한다.

도관 암종을 침습하는 정상 유방 상피로부터의 전이는, 과다형성(hyperplasia), 비정형적 과다형성(atypical hyperplasia)으로부터 도관상피내암종(DCIS: duct carcinoma in situ)에 이르는 유방 조직에서의 일련의 조직학적 변화를 포함하는 다단계 과정이다. 몇가지 종양 마커들이 DCIS 환부 및 침습적 유방암에 존재함이 밝혀졌다. 세포 주기의 중요한 조절자인 사이클린 D1은, 정상 유방 조직에서는 낮게 발현되거나 또는 발현되지 않는 반면, DCIS의 80%에서 과발현된다(Weinstat-Saslow et al., Nat Med 1(12):1257-1260 (1995); Vos et al., J. of Path. 187(3):279-84 (1999)). 침습성 유방암의 30% 및 DCIS 조직의 60∼80%에서의 Her-2/neu 유전자의 증폭 및 과발현도 입증되었다(Janocko et al., Cytometry 46(3);136-49 (2001); Poller et al., Breast Cancer Res. & Treat. 20(1):3-10 (1991); Ramachandra et al., J. of Path. 161(1):7-14 (1990)). 그러나, Her-2/neu의 과발현은 정상 도관 세포 및 단순 과다형성에서는 발견되지 않는다(Poller et al., Breast Cancer Res. & Treat. 20(1):3-10 (1991); Ramachandra et al., J. of Path. 161(1):7-14 (1990)). 이는, 이들 유전자의 조절이 양성 상태로부터 암종 상태로의 전이를 한정(define)할 지도 모른다는 것과, 사이클린 D1 및 Her-2/neu의 조절되지 않는 과발현은 유방 암종에서의 공통적인 초기 현상일 수 있다는 것을 시사한다. 또한, 침습성 및 전이성 유방암 환자로부터 얻어지는 유방암 조직의 71%에서도 서바이빈이 높은 수준으로 검출되나, 이를 둘러싼 정상 유방 조직은 음성이다. 서바이빈 수준의 증가는 유방 종양 세포의 더 높은 세포자멸사 역치(threshold) 및 생존 능력에 기여한다(Tanaka et al., Clin . Cancer Res. 6:127-134 (2000)). 서바이빈 유전자의 발현은 발달중인 유방암에 있어서의 초기 종양 마커인 것으로 보이는데, 이는 유방암 환자의 DCIS 조직의 80% 이상에서 높은 수준의 서바이빈이 검출되기 때문이다(Yang L. et al. 미공표 관찰). 따라서, 사이클린 D1, Her-2/neu 및 서바이빈은, 침습전(pre-invasive) 단계에서 유방암 세포의 조기 검출을 위한 민감한 종양 마커이다.

서바이빈은 전립선, 폐, 결장, 위, 간, 신장, 멜라닌종 및 림프종과 같은 다수의 흔한 종양 유형에 있어서도 검출된다(Altierie et al., Trends in Mol . Med . 7;542-547 (2001)). 예를 들면, 인간 직장암의 64%는 서바이빈을 높은 수준으로 발현한다. 서바이빈 양성 환자의 2기에서의 5년 생존률은 서바이빈 음성 환자의 그것보다 낮다(Sarela et al., Gut 46(5):645-650 (2000)). 몇가지 다른 종양 유형에 있어서도 서바이빈 발현과 암 환자의 예후의 상관관계가 입증되었다(Kappler et al., International Journal of Cancer 95:360-363 (2001); Swana et al., New England Journal of Medicine 341:452-453 (1999)). 종양 세포에서의 서바이빈 유전자의 발현은 화학적 또는 방사선치료에 대한 종양 세포의 내성의 원인으로 된다는 것을 보여주는 몇 건의 보고가 있었다(Kato et al., International Journal of Cancer 95:92-5 (2001); Azuhata et al., Journal of Pediatric Surgery 36:1785-1791 (2001); Asanuma et al., Japanese Journal of Cancer Research 91:1204-9 (2000)). 따라서, 서바이빈 유전자의 발현 수준은 화학요법 의약에 대한 인간 종양 세포의 민감성을 결정함에도 사용될 수 있다.

분자표지술에 의한 인간 암세포의 검출

현재, 임상 시료 중의 유전자 돌연변이를 검출함에 통상 사용되는 방법은, 돌연변이-풍부 PCR(mutant-enriched PCR) 또는 RT-PCR에 이은, 게놈 DNA의 DNA 정제 또는 RNA 분리이다. 그리고나서, 단일 가닥 형태 다형성(SSCP: single strand conformation polymorphism), 제한효소 절편 길이 다형성(RELP: restriction fragment-length polymorphism), 또는 대립유전자 특이적 올리고데옥시뉴클레오티드 하이브리다이제이션(ASOH: allele-specific oligodeoxynucleotide hybridization)에 의해 돌연변이 PCR 산물의 존재를 결정한다(Futakawa et al., Journal of Hepato - Biliary -Pancreatic Surgery 7:63-71 (2000); Puig et al., International Journal of Cancer 85(1):73-77 (2000); Watanabe et al., Pancreas 17:341-7 (1998); Shibata et al., International Journal of Oncology 12:1333-1338 (1998); Fischer et al., Laboratory Investigation 81:827-831 (2001); Clayton et al., Clinical Chemistry 46:1929-1938 (2000)). PCR에 의한 K-ras 돌연변이의 확인은 상당히 민감한 분자적 접근방법이기는 하지만, PCR 과정 및 이에 이어지는 분석은 매우 시간소모적이어서, 임상 과정으로 하기 어렵다. 지금까지는 원형그대로의(intact) 세포에서 돌연변이 발암유전자의 발현을 직접 검출하는 것은 극히 어려웠는데, 그 이유는 현재의 형광표지된 선형 올리고뉴클레오티드 프로브에 의한 제자리(in situ) 하이브리다이제이션법은, 배경 형광이 높은 수준이고, 단일 염기쌍 돌연변이를 갖는 mRNA들의 검출에 대한 민감성이 낮기 때문이다. 항체에 의한, 돌연변이 단백질들에 대한 면역염색법(immunostaining)은, 통상 특이성이 결여되어 있어, "위 양성(false positive)" 데이타가 얻어진다. 비특이적 라벨링(labeling) 및 내인성(endogenous) 페록시다제 또는 알칼린 포스파타제의 존재에 기인하여 "위 양성"이 높은 수준으로 나타났다. 따라서, 돌연변이 발암유전자를 발현하는 종양 세포의 검출에 대한 보다 특이적인 분석법을 개발하는 것이 중요하다.

암세포가 발암유전자와 종양 억제 유전자의 유전자 변이(genetic alteration) 및 세포에 성장 우월성(growth advantage)과 전이 잠재력(metastatic potential)을 부여하는 유전자 발현의 비정상성에 기인하여 발달한다는 것은 잘 확립되어 있다. 지금까지 사용되어 온 암의 조기 검출을 달성하는 방법은, 암세포에서는 발현되지만 정상 세포에서는 낮게 발현되거나 또는 발현되지 않는, mRNA 전사체의 검출을 통해 암세포를 확인하는 것이다. 따라서, 당 분야에는, 상술한 부족함과 부적당함에 대처할, 이제껏 주목되지 않은 필요성이 있다.

[발명의 요약]

본 발명의 다양한 태양은 정상 또는 암세포의 고정된 세포 또는 생세포에서의 유전자 발현 수준을 검출하는 방법을 제공한다. 특히, 세포 시료 중에서의 다양한 종양 마커의 유전자 발현의 존재 또는 변화를 검출, 확인 또는 정량하는, 형광조영술과 결합된 분자표지술을 사용하는 방법을 제공한다.

분자표지는, 일단에 형광단(fluorophore)을, 타단에 억제제(quencher)를 갖는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드이다. 이것은 그 표적 mRNA가 존재하지 않는 때에는 형광단의 형광이 억제되게 하는, 스템-루프 구조를 이루도록 설계된다. 루프 부분은 표적 mRNA 분자에 상보적인 프로브 서열을 갖는다. 루프의 각 끝부근의 암(arm) 서열은 서로 상보적이다. 이들은 어닐(anneal)하여 분자표지의 스템을 이룬다. 분자표지가 표적 mRNA 분자를 만나면, 루프와, 가능하게는 스템의 일부분이 표적 mRNA에 하이브리다이즈하여, 스템을 서로 떼어지게 하는 자발적인 형태 변화(conformational change)를 유발한다. 억제제가 형광단으로부터 멀어져서, 형광이 회복된다. 스템-루프 프로브의 주요 잇점은 이것이 선형 프로브보다 높은 특이성으로 그 표적을 인식한다는 것이다. 적합하게 설계된 분자표지는 1개의 염기만큼 작은 차이를 갖는 표적들을 판별할 수 있다. 분자표지의 설계는 또한 분자표지의 표적 뉴클레오티드 서열에 대한 특이적 결합을 가능하게 하며, 유리(free) 분자표지는 형광을 발하지 않으므로, 결합되지 않은 프로브를 분자표지-표적 복합체로부터 분리하지 않고도, 형광 시그널의 생성을 통해 하이브리다이제이션을 보고한다. 따라서, 분자표지는 용액에서뿐만 아니라 원형그대로의(intact) 세포에서도, 높은 노이즈 대 신호 비율로 mRNA 및 DNA와 같은 특이적인 뉴클레오티드 서열을 검출하는 탁월한 도구를 제공하는 것이어야 한다.

따라서, 본 발명의 일 태양은, 시료 중의 적어도 하나의 종양 마커 mRNA의 존재를 검출하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 분석용 세포 시료를 마련하는 공정과, 그리고나서 종양 마커 mRNA를 표적으로 하는 원형 올리고뉴클레오티드(분자표지)로 시료를 처리하는 공정을 포함한다. 그리고나서, 시료 중에 존재하는 표적 서열의 존재, 부재 또는 양이, 검출가능한 형광 시그널의 변화와 상관관계에 있게 하는 적합한 하이브리다이제이션 조건 하에서 표적 서열의 하이브리다이제이션을 검출, 확인 또는 정량화한다. 그리고나서 측정되는 상기 올리고뉴클레오티드의 표적 서열에 대한 하이브리다이제이션의 존재, 부재 또는 양에 근거하여 종양 마커의 존재를 검출, 확인 또는 정량화한다. 분자표지는 아세톤-고정된 세포내로는 직접 배양(direct incubation)에 의해 또는 생세포내로는 트랜스펙션(transfection)에 의해 도입할 수 있다. 분자표지를 고정된 세포 또는 생 종양 세포에 전달한 후에, 형광 현미경 및 세포 집단의 개개에 대한 FACS-스캔 분석을 이용하여 형광 강도 측정, 또는 형광 마이크로플레이트 리더를 사용하여 96-웰 플레이트에서 상대 형광 단위의 변화의 실시간 모니터링 함에 의해, 종양 마커 mRNA의 수준의 존재 및 정량화를 수행한다.

검출할 종양 마커는 어떤 종양 마커라도 좋으며 본 발명의 어떤 태양에서는, 서바이빈(survivin), 사이클린 D1(cyclin D1), Her2/neu, 돌연변이 K-ras, 키모트립시노겐(chymotrypsinogen), XIAP, 염기성 섬유아세포 성장 인자(basic fibroblast growth factor), EGF 수용체, 암태아성 항원(carcinoembryonic antigen), 전립선(prostate) 특이적 항원, 알파-태아단백질(alpha-fetoprotein), 베타-2-마이크로글로불린(beta-2-microglobulin), 방광 종양 항원, 크로모그라닌 A(chromogranin A), 뉴런 특이적 에놀라제(enolase), S-100, TA-90, 조직 폴리펩티드 항원 및 인간융모 생식샘 자극 호르몬(human chorionic gonadotropin)의 하나 이상을 포함할 수 있다.

본 발명의 어느 태양에 있어서도, 시료는 혈액, 소변, 췌액(pancreatic juice), 복수(ascrites), 유즙 도관 세척물(breast ductal lavage), 유두 흡인(nipple aspiration)물, 바늘 생검(niddle biopsy) 또는 조직(tissue)을 포함하는, 그러나 이에 한정되는 것은 아닌, 각종 소스(source)의 하나 또는 그 이상으로부터 얻어질 수 있다. 본 발명의 어떤 태양에서는, 상기 조직은 췌장 또는 유방으로부터의 생검이다. 본 발명의 다른 태양에서는 상기 조직은 동결 현미경 절편의 형태일 수 있다.

본 발명의 다른 태양은 종양 세포 중의 돌연변이 유전자의 존재를 검출하는 방법에 관한 것으로서, 분석용 종양 세포 시료를 마련하는 공정 및 그리고나서 그 돌연변이 유전자를 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드로 시료를 처리하는 공정을 포함하는 것이다. 본 발명의 어떤 태양에서, 상기 돌연변이 유전자는 돌연변이 K-ras 유전자이다.

본 발명의 또다른 태양은, 생세포 중의 유전자 발현의 수준을 모니터링하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또다른 태양은, 피험체의 유방암의 존재 또는 진행을 검출 또는 모니터링하는 방법에 관한 것으로서, 유방암 마커의 존재를 모니터링 또는 검출하는 공정을 포함하는 것이다. 본 발명의 다양한 태양에서, 상기 유방암 마커는 서바이빈, 사이클린 D1, Her2/neu, 염기성 섬유아세포 성장 인자, 및 암태아성 항원의 하나 또는 그 이상일 수 있다. 본 발명의 어떤 태양에서, 상기 시료는 혈액, 소변, 유즙 도관 세척, 유두 흡인, 복수, 바늘 생검 또는 조직의 하나 또는 그 이상으로부터 얻어질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 또다른 태양은, 피험체의 췌장암의 존재 또는 진행을 검출 또는 모니터링하는 방법에 관한 것으로서, 췌장암 마커의 존재를 검출 또는 모니터링하는 공정을 포함하는 것이다. 본 발명의 다양한 태양에서, 상기 췌장암 마커는 서바이빈, 돌연변이 K-ras 유전자 및 암태아성 항원의 하나 또는 그 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 다양한 태양에서, 상기 시료는 혈액, 소변, 췌액, 바늘 생검 또는 조직의 하나 또는 그 이상으로부터 얻어질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 태양은 세포에서 암세포를 검출하는 방법에 관한 것으로서, 세포 시료를 암 특이적 마커 유전자 서열을 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드로 처리하는 공정을 포함하는 것이다. 본 발명의 다양한 태양에서, 상기 암 세포는 유방, 췌장, 난소, 전립선, 직장, 간세포, 다발골수종(multiple myeloma), 림프종(lymphoma), 방광, 갑상선의 속질암종(medullary carcinoma of the thyroid), 신경내분비암종(neuroendocrine tumors), 카르시노이드종양(carcinoid tumor), 고환, 임신융모종양(gestational trophoblast neoplasm), 폐, 멜라닌종(melanoma) 및 위장을 포함하나 이에 한정되는 것은 아닌 암들 중의 하나 또는 그 이상으로부터 유래한다.

본 발명의 다른 태양은 1) 암세포의 진행의 검출 또는 모니터링, 및 2) 생세포 중의 유전자 발현 수준의 실시간 검출을 위한 진단 키트를 제공한다.

[도면의 간단한 설명]

도 1은 분자표지(Molecular beacons:MBs)의 개략도를 나타낸다. (A) 분자표지는 헤어핀 구조를 가진 이중 표지된 올리고뉴클레오티드이고; (B) 세포로의 분자표지의 전달에 의해 상기 프로브와 표적 mRNA의 하이브리다이제이션에 기인한 형광 시그널이 나타날 수 있다.

도 2는 시험관내(in vitro) 분자표지 프로브의 그들의 올리고뉴클레오티드 표적에 대한 특이적 결합을 나타낸다. K-ras MB1, K-ras MB2, 서바이빈(survivin) 및 사이클린 D1 MBs는 합성된 특이적 또는 비특이적 DNA 표적과 혼합하여, 37℃(서바이빈 및 사이클린 D) 또는 50℃(K-ras)에서 1시간 동안 배양하였다. 상대 형광 단위(relative fluorescence unit:RFU)는 형광 마이크로플레이트 리더로 측정하였다. 도면에서 바(bar)는 4개 반복 시료의 평균 RFU이다. 도 2a 및 2b : K-ras Mut1 또는 Mut 2 표적에 특이적으로 결합된 K-ras MB 1 또는 MB2는 K-ras WT 표적 또는 다른 K-ras 돌연변이를 가진 표적에 비해서 높은 형광 강도를 나타낸다. 도 2c 및 2d : 서바이빈 또는 사이클린 D1 표적에 대해서만 하이브리드하고 K-ras 또는 Her-2 표적에는 결합하지 않는 서바이빈 MB 또는 사이클린 D1 MB는 높은 수준의 형광 시그널을 나타낸다.

도 3은 인간 췌장암세포주에서의 K-ras 돌연변이 유전자 및 서바이빈 유전자의 발현을 동시에 검출함에 의한 췌장 암세포의 분자표지 화상을 나타낸다. 췌장암세포주 및 정상 세포주는 아세톤으로 고정하였다. 상기 세포를 K-ras MB 1-cy3(GGT에서 GAT로)와 서바이빈 MB-FITC의 혼합물 또는 K-ras MB 2-Texas red(GGT에서 GTT로)와 서바이빈 MB-FITC의 혼합물과 함께 50℃에서 1시간 동안 배양하였다. 그 다음, 상기 슬라이드를 공초점 형광 현미경 하에서 관찰하였다. 형광 화상을 얻은 다음 동일한 노출 조건 하에서 각 칼라에 대한 모든 화상을 얻었다. 적색 형광을 가진 세포는 K-ras MB 1나 K-ras MB 2에 의해 검출된 바와 같이 특이적인 K-ras 돌연변이 유전자를 발현하는 췌장암세포였다. 또한, 상기 세포는, 이들 종양 세포가 종양 마커 서바이빈을 발현함을 보여주는 녹색 형광으로 이중 표지되었다. 도 3a는 특이적인 K-ras 돌연변이 및 고수준의 서바이빈을 가진 종양 세포주에서 K-ras 돌연변이 유전자 및 서바이빈 유전자를 발현하는 췌장암세포의 검출 특이성을 나타낸다. Panc-1 세포주는 K-ras GGT에서 GAT로의 돌연변이를 가지며 K-ras MB 1과 배양 후에 강한 형광 강도를 나타내었으나, K-ras MB2 염색 세포에서는 약한 형광을 나타내었다. Capan-2 세포주는 K-ras GGT에서 GTT로의 돌연변이를 포함하며, K-ras MB 2 염색 세포에서 더 밝은 형광이 검출되었다. 두 세포주 모두 서바이빈 MB에 의해서 검출된 바와 같은 고수준의 서바이빈을 발현하였다. 도 3b는 다른 돌연변이 유전자 또는 K-ras MBs에 대한 약거나 네거티브를 나타내는 야생형 K-ras 유전자를 발현하는 췌장암세포가 여전히 서바이빈 MB에 의해서 검출될 수 있음을 나타낸다. K-ras MBs는 K-ras GGT에서 TGT로의 돌연변이를 가진 MIA PaCa-2 세포주, 또는 K-ras 야생형 BXPC-3 세포에서 강한 형광 시그널을 생성하지 않았다. 그러나, 그러한 세포들은 서바이빈 MB 염색에 대해 포지티브를 나타냈다. K-ras 및 서바이빈 MBs의 배양에서는 정상 피부 섬유아세포로부터 생성된 정상 세포주(HDF)에서 검출가능한 형광 시그널이 생성되지 않았다. 도 3c는 K-ras MBs의 전달 후 췌장암세포와 정상 세포의 형광 강도의 비교를 나타낸다. 그 형광 강도는 아도브 포토샵 소프트웨어를 사용하여 3개의 랜덤하게 선택된 영역의 각 화상에 대해서 측정되었다. 바 부분에서의 숫자는 5∼7개 화상의 평균 형광 강도를 나타낸다.

도 4는 종양 마커 사이클린 D1 및 서바이빈을 발현하는 인간 유방암세포의 분자표지 영상을 나타낸다. 도 4a는 사이클린 D1-Texas red와 서바이빈 MB-Alexa 488의 혼합물과 함께 37℃에서 1시간 동안 배양한 유방암 및 정상 유방상피세포주를 나타낸다. 그 다음 그 슬라이드를 공초점 형광 현미경 하에서 관찰하였다. 그 형광 화상을 얻은 다음 동일한 노출 조건하에서 각 칼라에 대한 모든 화상을 얻었다. 도 4b는 서바이빈 및 사이클린 D1 MBs에 의해 검출된 유방암세포주에서의 형광 강도 수준이 웨스턴 블랏 분석에 의해 검출된 서바이빈 및 사이클린 D1의 수준과 상관관계가 있음을 나타낸다.

도 5는 서바이빈 mRNA를 검출하기 위한 서바이빈 단백질 또는 서바이빈 MB의 면역형광염색에 의해, DCIS 및 침습성 단계의 인간 유방암 조직의 동결 절편에서의 서바이빈 발현의 검출을 나타낸다. 유방암조직 또는 정상조직의 동결 조직 절편을 다클론(polyclonal) 서바이빈 항체나 서바이빈 MB-cy3와 배양하였다. 도 5a: 서바이빈은 초기 종양 마커이고 서바이빈 mRNA 및 단백질은 유방암의 초기 단계, 생체내 관암종(duct carcinomaa in situ:DCIS)에서 검출할 수 있다. 서바이빈은 정상 유방 조직이 아니라 침습성 유방암 조직에서도 검출된다. 도 5b: 서바이빈 MB은 림프절내의 전이 유방암세포를 검출하였고, 이는 환자의 림프절내 유방암세포의 존재를 검출하기 위한 빠르고 민감한 방법의 개발 가능성을 나타낸다.

도 6은 췌장암조직의 동결 조직 절편에서 K-ras 돌연변이 및 서바이빈 mRNAs를 발현하는 췌장암세포의 특이적 영상을 나타낸다. 동결 조직 절편은 K-ras MB1 또는 K-ras MB 2, 또는 서바이빈 MB와 1시간 동안 배양하고 훽스트(Hoechst) 33342(청색)로 대조염색하였다. 도 6a: K-ras MB 1은 K-ras 코돈 12 GGT에서 GAT로의 돌연변이를 포함하는 환자 #1 및 #2의 췌장암조직의 동결 절편에서 GGT에서 GAT로의 K-ras 돌연변이 유전자를 발현하는 암세포를 검출하였다. 그러나, K-ras MB 1이 아니라 K-ras MB 2와 배양한 후 K-ras 코돈 GGT에서 GTT로의 돌연변이를 가진 환자 #5의 췌장암조직의 동결 절편에서, 밝은 적색 형광 세포가 발견되었다. 도 6b: 면역형광 또는 서바이빈 MB 염색에 의해 동결 조직 절편에서 췌장 암세포내의 서바이빈 단백질 또는 mRNA의 수준을 검출한 결과를 나타낸다. 면역형광염색에 의한 서바이빈 단백질 수준의 검출하기 위해서는, 췌장암 또는 정상 조직의 동결 조직 절편을 마우스 항서바이빈 항체(서바이빈 Ab)와 배양한 다음 FITC-표지 염소 항마우스 2차 항체와 배양하였다. 고수준의 서바이빈 단백질 및 mRNA가 췌장암 조직에서 발견되었으나, 정상 췌장 조직에서는 발견되지 않았다.

도 7은 EGF 처리 후 유방암 생세포에서의 서바이빈 유전자 발현의 실시간 검출을 나타낸다. 도 7a: 유방암세포주 MCF-7를 96웰 플레이트에서 배양하여 2% FBS를 함유하는 배지에서 하룻밤 두었다. 그 다음, 상기 세포를 리포펙타민 2000을 사용하여 3시간 동안 200nM의 서바이빈-6FAM과 GAPDH-cy3 MBs 혼합물로 트랜스펙션시켰다. 상기 조직 배양 플레이트를 즉각 형광 마이크로플레이트 리더에 배치하고 상대 형광 단위(relative fluorescence unit:RFU)를 3시간 동안 30분마다 측정하였다. 도면 중의 곡선(curve)은 3개의 반복 샘플의 평균수를 나타내며 6-FAM(서바이빈 MB)와 cy3(내부 컨트롤 GAPDH MB)의 RFU 비이다. 도 7b: EGF로 처리하거나 처리하지 않은 상기 트랜스펙트된 세포를 공초점 현미경하에서 24시간 관찰하여 형광 화상을 얻었다

도 8은 도세탁셀(docetaxel) 처리 후 다른 시점에서의 서바이빈 MB 사용에 의한 서바이빈 유전자 발현 변화의 실시간 검출을 나타낸다. 도 8a: 인간 유방암세포주 MCF-7 및 MDA-MB-231을 96웰 플레이트에서 배양하였다. 100nM의 서바이빈과 GAPDH MB 혼합물로 트렌스펙션시킨 후, 상기 세포를 화학치료 약제 도세탁셀로 처리하거나 또는 처리하지 않은 다음, 각 군에서의 형광 강도의 변화를 형광 마이크로플레이트 리더로 48시간 동안 실시간 측정하였다. 도 8b: 상기 트랜스펙트된 세포를 24시간 동안 20nM(MDA-MB-231) 또는 50nM(MCF-7)의 도세탁셀을 처리하거나 처리하지 않은 다음, 공초점 현미경 하에서 관찰하여 형광 화상을 얻었다.

도 9는 FACScan 분석에 의해 검출한 생세포내에서의 서바이빈 유전자 발현 수준을 나타낸다. 유방암세포주 MDA-MB-231 및 정상 세포주 HDF를 서바이빈 또는 β-액틴 MB로 3시간동안 트랜스펙션시켰다. 상기 세포를 배양 접시로부터 채취하여, FACScan에 의해 정상세포 및 암세포에서의 서바이빈 유전자 발현 수준을 분석하였다. 그 결과는 생세포에서의 유전자 발현 수준을 FACScan를 사용하여 정량적으로 측정할 수 있음을 나타낸다.

도 10은 웨스턴 블랏 분석에 의해 유방 정상 조직 및 암조직에서의 서바이빈 수준의 검출을 나타낸다. 유방암 환자로부터 얻은 쌍을 이루거나 쌍을 이루지 않은 정상조직 및 암조직 시료 중에서의 서바이빈 수준을 나타낸다.

[바람직한 태양의 상세한 설명]

본 명세서에서 사용되는 용어는, 본 발명의 문맥에 맞는 범위에서, 또 각각의 용어가 사용되는 문맥에 맞는 범위에서, 일반적으로 당 기술분야에서 통상 사용되는 의미를 갖는다. 본 발명을 설명하기 위해 사용되는 어떤 용어들은, 실시자가 본 발명의 조성물과 방법을 묘사하고, 이를 제조, 사용함에 있어 더 참고로 할 수 있도록, 이하 또는 본 명세서의 다른 부분에서 토의된다. 편의상, 어떤 용어는 예를 들면 이탈릭체 및/또는 인용 부호를 사용하여 강조될 수도 있다. 이러한 강조는 용어의 범위 및 의미에 영향을 미치지 않는다. 용어의 범위와 의미는, 그것이 강조되어 있든 그렇지 않든, 같은 문맥에서는 같다. 똑같은 것을 하나 이상의 방법으로 말할 수 있다. 따라서, 여기서 토의되는 하나 이상의 용어에 대하여 대안적 언어와 유사어를 사용할 수도 있으나, 용어가 여기서 더 상세하게 설명 또는 토의되든 그렇지 않든 간에 어떤 특별한 중요성도 부여되지 않는다. 어떤 용어에 대해서는 유사어들이 제공된다. 하나 또는 그 이상의 유사어의 설명은 다른 유사의 사용을 배제하지 않는다. 본 명세서의 어느 곳에서든 예의 사용은, 여기서 토의되는 어떤 용어의 예를 포함하여, 단지 실제 예를 드는 것일 뿐이고, 어떤 식으로든 본 발명 또는 예시된 용어의 범위와 의미를 한정하지 않는다. 마찬가지로, 본 발명은 이 명세서에 주어진 각종 태양에 한정되지 않는다.

여기서 사용된 "약" 또는 "대략"은, 주어진 값 또는 범위의 일반적으로 20%, 바람직하게는 10%, 더 바람직하게는 5% 내를 의미한다. 여기에 주어진 수량은 대략적인 것인데, 이는 "약" 또는 "대략"이라는 용어가 명시적으로 기재되어 있지 않은 경우에는, 추정될 수 있다는 의미이다.

정의

여기서 사용되는, “하이브리다이제이션”과 “상보적”은, 두개의 뉴클레오티드간이 정확히 짝지어질 수 있는 것을 가리킨다. 예를 들면, 올리고뉴클레오티드의 어느 위치의 뉴클레오티드가 어느 DNA 또는 RNA 분자의 같은 위치의 뉴클레오티드와 수소 결합할 수 있다면, 그때는 그 올리고뉴클레오티드와 그 DNA 또는 RNA는 그 위치에서 서로 상보적 또는 하이브리드제이션 가능하다고 할 수 있다. 올리고뉴클레오티드와 DNA 또는 RNA는, 상호간에 수소 결합하는 뉴클레오티드가 각 분자내의 충분한 수량의 상응하는 위치를 점할 때, 하이브리다이즈한다. 당 기술분야에서는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 서열은 그것이 하이브리다이즈할 표적 핵산 서열에 100% 상보적일 필요가 없다고 이해되고 있다. 올리고뉴클레오티드는 그 화합물이 표적 DNA 또는 RNA 분자에 결합할 때 특이적으로 하이브리다이즈할 수 있으며, 특이적 결합이 요망되는 조건, 예를 들면, 생체내 분석 또는 치료의 경우 생리학적 조건, 또는 시험관내 분석의 경우 그 분석이 수행되는 조건 하에서, 비표적(non-target) 서열에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 비특이적 결합을 피하기 충분한 정도의 상보성을 갖는다.

본 발명의 맥락에서,“올리고뉴클레오티드”라는 용어는 리보핵산(RNA) 또는 데옥시리보핵산(DNA) 또는 이들을 모방한 것(mimetic)의 올리고머 또는 중합체를 가리킨다. 이 용어는, 자연발생 및/또는 합성의 핵염기(nucleobase), 당, 및 뉴클레오시드간(골격) 공유 결합으로 이루어지는 올리고뉴클레오티드를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 수식되거나 치환된 올리고뉴클레오티드는 종종 자연 형태의 것보다 선호되는데, 그 이유는 세포 섭취(cellular uptake)의 증진, 핵산 표적에의 부착성의 증진, 및/또는 핵산분해효소 존재하에서의 안정성의 증가와 같은 바람직한 특성 때문이다.

본 발명은 정상 및 암세포 중의 유전자 발현을 검출하는 방법을 제공한다. 특히 세포 시료 중의 다양한 종양 마커의 존재 또는 유전자 발현에 있어서의 변화 를 검출, 확인 또는 정량하는 방법을 제공한다.

본 발명자들은 고정된 종양 세포 뿐만 아니라 생세포 중의 유전자 발현을 검출하는 분자표지술을 개발하였다. 분자표지는 스템-루프 헤어핀 구조를 갖는, 일단은 형광단으로 타단은 억제제로 이중 표지된 물질이다. 분자표지를 세포 내로 전달함으로써, 분자표지가 표적 mRNA에 하이브리다이즈하면 형광 시그널이 생기게 된다. 그러므로, 표적 mRNA가 암의 분자 마커에 해당할 때, 암세포(밝은 색)는 정상 세포(어두운 색)로부터 쉽게 판독될 것이다. 다음과 같은 방법이 제공된다: 세포 시료 중의 적어도 하나의 종양 마커 mRNA의 존재를 검출하는 방법; 종양 세포 중의 돌연변이 유전자의 존재를 검출하는 방법; 생세포 중의 유전자 발현에 있어서의 변화를 모니터링하는 방법; 시험체의 유방암의 존재나 진행을 검출 또는 모니터링하는 방법으로서, 유방암 마커의 존재를 모니터링 또는 검출하는 공정을 포함하는 것; 시험체의 췌장암의 존재나 진행을 검출 또는 모니터링하는 방법으로서, 췌장암 마커의 존재를 모니터링 또는 검출하는 공정을 포함하는 것; 및, 시료 중의 암세포를 검출하는 방법으로서, 암 특이적 마커 유전자 서열을 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드로 세포 시료를 처리하는 공정을 포함하는 것. 또한 1) 암세포의 진행을 검출 또는 모니터링하고; 및 2) 생세포에서의 유전자 발현에 있어서의 변화를 실시간으로 검출하기 위한 진단 키트도 제공된다.

분자표지

도 1에 개략적으로 나타나 있는 바와 같이, 분자표지는 일단에 형광단을 갖고, 타단에 억제제를 갖는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드이다. 이렇게 한정되는 것은 아니지만, 전형적으로는, 형광단은 5' 말단에 부착되고 억제제는 3' 말단에 부착된다. 이것은 그 표적 mRNA가 존재하지 않는 때에는 형광단의 형광이 억제되는, 스템-루프 구조를 이루도록 설계되어 있다. 루프 부분은 표적 mRNA 분자에 상보적인 프로브 서열을 갖는다. 사용이 고려되는 전형적인 형광단으로는 Cy3 형광단(Cy3 Amidite, 애머샴 파마시아 바이오테크사(Amersham Pharmacia Biotech)제, Piscataway, NJ) Alexa Fluor 488 (분자 프로브); Alexa Fluor 350 (청색), CMAC (7-아미노-4-클로로메틸쿠마린), 6-FAM 및 FITC가 포함되나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 전형적인 억제제로는, 답실(4-(4'-디메틸아미노페닐아조)벤조산){dabcyl (4-(4'-dimethylaminophenylazo) benzoic acid} (Dabcyl-CPG, 글렌리서어치사(Glen Research)제, Sterling, VA)가 포함되나, 이들에 한정되는 것은 아니다.

분자표지가 표적 mRNA 분자를 만나면, 루프와, 가능하게는 스템의 일부분이 표적 mRNA에 하이브리다이즈하여, 스템을 서로 떼어지게 하는 자발적인 형태 변화를 유발한다. 억제제가 형광단으로부터 멀어져서, 형광이 회복된다(Tyagi et al., Nature Biotechnol 14:303-308 (1996); Dubertret et al., Nat Biotechnol 19:365-370 (2001)). 스템-루프 프로브의 주요 잇점 중의 하나는, 이것이 선형 프로브보다 높은 특이성으로 그 표적을 인식한다는 것이다. 적합하게 설계된 분자표지는, 1개의 염기만큼 작은 차이를 갖는 표적들을 판별할 수 있다(Tyagi et al., Nature Biotechnol 16:49-53 (1998)). 분자표지는 살아있는 세포 중의 DNA 돌연변이의 검출, 단백질-DNA 상호작용, PCR의 실시간 모니터링, 유전자 타이핑(gene typing) 및 mRNA 검출을 포함하는 다양한 응용분야에 사용할 수 있다(Dubertret et al., Nat Biotechnol 19:365-370 (2001); Dirks et al., Histochem . & Cell Biol . 115(1):3-11 (2001); Tyagi et al., Nat Biotechnol 16:49-53 (1998); Sokol et al., Proc Natl Acad Sci USA 95:11538-11543 (1998)).

본 발명의 다양한 태양은, 다음의 방법들을 제공한다:

세포 시료 중의 적어도 하나의 종양 마커 mRNA의 존재를 검출하는 방법; 종양 세포 중의 돌연변이 유전자의 존재를 검출하는 방법; 생세포 중의 유전자 발현에 있어서의 변화를 모니터링하는 방법; 시험체의 유방암의 존재나 진행을 검출 또는 모니터링하는 방법으로서, 유방암 마커의 존재를 모니터링 또는 검출하는 공정을 포함하는 것; 시험체의 췌장암의 존재나 진행을 검출 또는 모니터링하는 방법으로서, 췌장암 마커의 존재를 모니터링 또는 검출하는 공정을 포함하는 것; 및, 시료 중의 암세포를 검출하는 방법으로서, 암 특이적 마커 유전자 서열을 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드로 세포 시료를 처리하는 공정을 포함하는 것.

이러한 방법들은

i) 분석용 세포 시료를 마련하는 공정;

ii) 소망하는 마커나 유전자를 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드로 상기 시료를 처리하는 공정;

iii) 적합한 하이브리다이제이션 조건 하에서 상기 표적 서열의 하이브리다이제이션을 검출, 확인 또는 정량하는 공정으로서, 시료 중에 존재하는 표적 서열의 존재, 부재 또는 양은 상기 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 공여체 또는 수용체 부분과 관련된 검출가능한 시그널의 변화와 상관 관계에 있는 공정; 및

iv) 측정되는 상기 올리고뉴클레오티드의 표적 서열에 대한 하이브리다이제이션의 존재, 부재 또는 양에 근거하여 마커 또는 유전자의 존재를 검출, 확인 또는 정량하는 공정

을 포함한다.

상술한 분자표지로서 사용하기 위해 구성된 올리고뉴클레오티드는 어느 것이든 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 특정 태양에서, 상기 올리고뉴클레오티드는, 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 및 13의 하나 이상을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 하나의 태양에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 종양 마커 서바이빈을 표적으로 한다. 바람직한 하나의 태양에서, 서바이빈을 표적으로 하는 상기 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 1, 2 및 9의 하나 이상을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또다른 태양에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 종양 마커 사이클린 D1을 표적으로 한다. 바람직한 하나의 태양에서, 사이클린 D1을 표적으로 하는 상기 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 3 및 4의 하나 이상을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또다른 태양에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 종양 마커 Her2/neu를 표적으로 한다. 바람직한 하나의 태양에서, Her2/neu를 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 5 및 6의 하나 이상을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또다른 태양에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 K-ras 돌연변이 유전자 종양 마커를 표적으로 한다. 바람직한 하나의 태양에서, K-ras 돌연변이 유전자 종양 마커를 표적으로 하는 상기 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 7, 8, 11, 12 및 13의 하나 이상을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

종양 마커의 검출

본 발명은, 다양한 태양에서, 여기서 기재하는 분자표지술을 사용하여 시료 중의 적어도 하나의 종양 마커 mRNA 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은, 당업자에 의해 쉽게 인지될 수 있으며, 시료 중에 존재하는 어떠한 종양 마커 mRNA의 존재를 검출하는데 이용할 수 있다. 이러한 마커로는 서바이빈(survivin), 사이클린 D1(cyclin D1), Her2/neu, 돌연변이 K-ras, 염기성 섬유아세포 성장 인자, EGF 수용체, XIAP, 암태아성 항원(carcinoembryonic antigen), 전립선(prostate) 특이적 항원, α-태아단백질(α-fetoprotein), β-2-마이크로글로불린, 방광 종양 항원, 크로모그라닌 A(chromogranin A), 뉴런 특이적 에놀라제(enolase), S-100, TA-90, 조직 폴리펩티드 항원 및 인간융모 생식샘 자극 호르몬(human chorionic gonadotropin)을 들 수 있으며, 이들에 한정되지는 않는다.

시료 채취 : 테스트할 세포 시료는 일반적인 진단 과정을 통해서 얻을 수 있다. 이러한 시료로는 혈액, 소변, 미세침 흡인물, 유즙 도관 세척물(breast ductal lavage), 췌액, 복수(ascrites), 유두 흡인 시료(nipple aspiration sample), 또는 유방, 췌장 또는 림프절 등의 환자의 신체 부위로부터 채취한 생검을 포함한 기타 조직을 들 수 있으며, 이들에 한정되지는 않는다. 상기 조직 시료는 현미경 슬라이드, 플레이트 또는 웰에 고정된 어떠한 종류의 조직을 포함하는, 일반적인 병리학적 방법으로 제조한 어떠한 종류의 시료일 수 있다. 바람직한 태양에서는, 상기 조직 시료는 조직의 동결 절편이다. 또다른 바람직한 태양에서는, 상기 시료는 유즙 도관 세척물로부터 얻어진다. 또다른 바람직한 태양에서는, 상기 시료는 췌장액으로부터 얻어진다.

유방암 종양 마커의 검출

본 발명의 어떠한 태양은 여기서 개시한 분자표지술을 사용하여 피험체에서의 유방암의 존재 또는 진행을 검출 또는 모니터링하는 방법을 제공한다. 본 발명은 유방암의 종양형성 초기 단계에서 발현되는 것으로 보이는 유전자의 mRNA를 표적으로 하는 MBs의 조합물을 사용하여, 도관 세척물 및 미세침 흡인물(FNA)으로부터 유방암세포를 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명자들은 생체내(in situ) 도관 암종의 진단 시 각 유전자의 검출 또는 2개 또는 3개의 유전자의 동시발현의 모니터링에 대한 예상값을 나타내었다. 본 발명의 어떠한 태양에서는, 유즙 도관 상피세포내에서의 서바이빈, 사이클린 D1 및 Her-2/neu 유전자의 과발현을 동시 검출하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 종양 단세포가 하나 이상의 마커 유전자를 발현하는 경우 이들 종양 마커의 존재를 검출하는데 특히 유용하다. 바람직한 태양에서는, 도관 세척물 중의 서바이빈, 사이클린 D1 및/또는 Her-2/neu 발현 세포를 검출하는 방법을 제공한다.

다양한 태양에서, 상기 방법들은 서바이빈, 사이클린 D1 또는 Her-2/neu의 mRNA에 특이적으로 하이브리다이즈하도록 설계된 MBs를 이용한다. 출원인은 인간 유방암세포주, 정상 유방 상피세포주 및 정상 섬유아세포주내에서의 MBs의 특이성과 민감성은 물론, 정상세포에 대한 암세포의 비율이 다른, 정상세포 바탕 중의 단리된 종양세포의 확인 시의 MBs의 특이성과 민감성을 나타내었다. 상기 제공된 방법은 정상 대조군 피험체 및 질병의 다른 단계에 있는 환자의 초기 단계의 유방암 또는 생체내 관내암종(ductal carcinoma in situ:DCIS)으로부터 얻는 도관 세척물 및 미세침 흡인물의 세포 분획 중에서의 이들 종양 마커의 발현을 검출하는데 이용할 수 있다.

시료 채취 : 테스트할 세포 시료는 일반적인 진단 과정을 통해서 얻을 수 있다. 이러한 시료로는 혈액, 소변, 미세침 흡인물, 유즙 도관 세척물, 복수, 유두 흡인 시료, 또는 유방 또는 림프절 등의 부위로부터 채취한 생검을 포함한 기타 조직을 들 수 있으며, 이들에 한정되지는 않는다. 상기 조직 시료는 현미경 슬라이드, 플레이트 또는 웰에 고정된 어떠한 조직을 포함하는, 일반적인 병리학적 방법으로 제조한 어떠한 종류의 시료일 수 있다. 바람직한 태양에서는, 상기 조직 시료는 조직의 동결 절편이다.

시료는 유방암 환자나 유방암 발병 위험성이 높은 여성에 대한 일반적인 진단 과정을 통해 얻을 수 있다. 일반적인 예로서, 암환자가 유방암을 제거하기 위해 외과수술을 하거나 병원에 정기 방문시, 그 환자로부터 얻은 도관 세척물을 채취한다. 마취 하에, 마이크로카테터(microcathether)를 도관에 삽입하고 식염수(saline)을 주입한다. 유출액을 채취한 뒤 원심분리하여 세포 분획을 농축(enrich)한다. 그 다음, 도관 세척물 또는 흡인물로부터 얻은 상기 농축 세포 분획을 유리 슬라이드에 배치한다. 일반적으로, 도관 당 평균 13,500의 상피세포를 가진 하나의 도관 세척물로부터 약 10∼15 사이토스핀 슬라이드가 얻어진다. 얼음같이 찬 아세톤 중에서 세포를 고정한 후, 그 슬라이드를, 연속적으로 또는 동시에, 최적의 배양 조건에서 하나 이상의 MBs와 배양한 다음 형광 현미경 하에서 관찰한다. 각 유전자에 대한 MBs가 다른 형광 염료로 표지되어 있으므로, 시료 중에서의 표적 종양 마커에 대한 어떠한 또는 모든 유전자를 과발현하는 세포수를 측정한다.

분석 : 본 발명자들은 종양 마커의 동정, 모니터링 또는 검출, 암의 진단 또는 암의 진행 모니터링에 도움이 되도록, 한 종류의 시료 채취로부터 얻는 결과를 또다른 것으로부터 얻는 결과와 비교할 수 있다. 따라서, 동일한 슬라이드를 염색한 다음, 정상, 비정형성 또는 악성 세포의 존재에 대한 세포 병리학자에 의해 분석될 수 있다. 이러한 염색은 H&E 또는 특정 항체를 사용한 면역염색 등의 일반적인 세포 염색을 포함할 수 있다.

정량화 : 무손상 세포 중에서의 MB와 그 표적 서열의 하이브리다이제이션 검출은 형광 현미경, FACS 분석 및 형광 마이크로플레이트 리더에 의해 수행할 수 있다. 일반적인 예로서, 유방암세포를 서바이빈와 GAPDH MBs로 함께 트랜스펙션시킨 다음 EGF로 처리한다. EGF 처리 후의 서바이빈 유전자 발현의 변화를 마이크로플레이트 리더로 3시간 동안 실시간 모니터링하였다. 그 결과는 EGF가 처리 30분 이내에 서바이빈 유전자 발현의 증가를 유도함을 나타내었다.

췌장암 종양 마커의 검출

본 발명의 어떠한 태양은 여기서 기재하는 분자표지술을 사용하여 피험체에서의 췌장암의 존재 또는 진행을 검출 또는 모니터링하는 방법을 제공한다.

췌장암의 초기 검출을 위한 결정적인 문제점의 하나는 다수의 정상 세포 중에서 소수의 종양 세포를 확인할 수 있는 평가법을 개발하는 것이다. 현재, 종양 세포에서 높게 발현하는 유전자의 검출, 또는 K-ras 돌연변이 유전자 등의 변이된 유전자 산물 또는 암태아성 항원에 대한 검출을 위한 가장 민감한 평가법은 RT-PCR이다. RT-PCR이 10⁴∼10⁵ 세포 중에서 하나의 종양 세포를 검출할 수 있더라도, 이러한 평가법은 "잘못된 포지티브"를 생성할 수 있다. 게다가, 현재의 분자 마커를 사용하면, 많은 종류의 암은 물론 악성이 아닌 질병도 그러한 분자 마커를 발현할 수 있기 때문에, 말초 혈액 및 췌액에서의 유전자 발현 또는 돌연변이 유전자의 RT-PCR 검출을 췌장암으로 한정할 수 없다. 또한, RT-PCR 평가법은 시간이 많이 걸리고, 일반적으로 한번에 하나의 유전자를 검출하므로, 효율적인 암진단 임상방법이 되기 어렵다.

본 발명자들은, 여기서 재시한 바와 같이, 말초 혈액 및 췌액 시료 중에서 소수의 췌장암 세포를 동정할 수 있는 민감하고 더 효율적인 방법을 개발하였다. 여기서 개시한 MB를 기본으로 하는 방법은 단일 MB 타입 또는 여러 MBs의 조합을 이용하여 혼합된 세포 집단으로부터 췌장암 또는 종양 세포를 검출하는데 이용할 수 있다. 상기 제공된 방법은 K-ras 엑손 1의 RT-PCR 증폭 후의 K-ras 돌연변이 검출에 사용할 수 있다. 또한, 다양한 세포학적 또는 면역염색 방법을 상기 개시한 방법과 함께 사용할 수 있다.

고위험 환자 집단 또는 췌장암을 갖는 것으로 예상되는 환자의 췌장암의 조기 검출을 위해서는, 비침습 또는 최소한의 침습 방법에 의해서 얻어질 수 있는 환자 시료의 임상적인 평가법의 개발이 중요하다. 췌장암 환자의 혈액, 골수 및 복강에서의 파종종양세포의 존재에 대한 많은 증거가 알려져 있다(LaCasse et al., Oncogene 17:3247-3259(1998); Li et al., Nature 396:580-584(1998); Tamm et al., Cancer Research 58:5315-5320(1998); Ambrosini et al., Nature Medicine 3:917-921(1997)). 예를 들면, 다수의 사이토케라틴 및 종양 마커를 검출하는 항체를 사용하는 면역조직화학 염색에 의하면, 췌장암을 가진 환자로부터 얻어진 혈액 샘플의 28%에서 암세포가 확인되었다. 혈액 시료내에서의 암세포 발견의 유병율은 종양 단계에 따라 증가하였다. 그러나, 제1기 췌장암 환자의 혈액 시료에서의 암세포 발견은 실패하였다(Z'graggen et al., Surgery 129:537-545(2001)). 본 발명은 여기서 개시한 MB술을 사용하여 모든 단계의 췌장암 환자에서 채취한 다양한 시료를 시험할 수 있는, K-ras 돌연변이 유전자 및 서바이빈 유전자 등을 포함한 췌장 종양 마커를 발현하는 세포를 동정하기 위한 민감한 방법을 제공한다.

시료 채취 : 테스트할 세포 시료는 일반적인 진단 과정을 통해서 얻을 수 있다. 이러한 시료로는 혈액, 소변, 미세침 흡인물, 췌액, 또는 췌장 또는 주변 조직으로부터 채취한 생검을 포함한 기타 조직을 들 수 있으며, 이들에 한정되지는 않는다. 상기 조직 시료는 현미경 슬라이드, 플레이트 또는 웰에 고정된 어떠한 종류의 조직을 포함하는, 일반적인 병리학적 방법으로 제조한 어떠한 종류의 시료일 수 있다. 바람직한 태양에서는, 상기 조직 시료는 조직의 동결 절편이다. 췌액은 ERCP 진단 과정 중에 있는 환자로부터 얻을 수 있다. 또한, 췌액은 위십이지장경을 사용한 세크레틴 자극 및 췌액 추출에 의해 무증상 개체나 고위험 집단으로부터 비침습적으로 채취할 수 있다. 췌장암 환자로부터 얻는 미세침 생검 시료 또는 췌장종양 조직은 절제가능한 종양일 경우 외과수술 후에 채취할 수 있다.

분석 : 본 발명자들은 종양 마커의 동정, 모니터링 또는 검출, 또는 암의 진행 모니터링 또는 진단에 도움이 되도록, 한 종류의 시료 채취로부터 얻는 결과를 또다른 것으로부터 얻는 결과와 비교할 수 있다고 생각한다. 따라서, 동일한 슬라이드를 염색한 다음, 정상, 비정형성 또는 악성 세포의 존재에 대해 세포 병리학자가 분석할 수 있다. 이러한 염색은 H&E 또는 특정 항체를 사용한 면역염색 등의 일반적인 세포 염색을 포함할 수 있다.

혈액 및 췌액을 사용한 상기 MB를 기본으로 하는 검출의 민감성은 나선식 CT, MRI 또는 내시경 초음파 등의 영상 기술, 또는 암의 외과적 절제 후의 병리학적 진단에 의해 진단된 췌장암 병변의 크기와 단계를 비교함으로써 평가한다.

돌연변이 유전자의 존재 모니터링

본 발명은 여기서 개시한 분자표지술을 사용하여 종양 세포내 돌연변이 유전자의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. K-ras 유전자 등의 이러한 변이된 유전자의 존재에 대한 모니터링은 췌장암을 포함하여 각종 암의 진단에 도움이 될 수 있다.

유전자 발현에서의 변화 모니터링

분자표지술을 사용하여 생세포내의 유전자 발현의 변화를 실시간 모니터링하는 방법이 여기에 개시되어 있다. 이러한 방법들은 종양 마커, 돌연변이 유전자 등을 포함한 표적 유전자의 발현을 모니터링한다. 따라서, 임상의사들은, 예를 들면, 유전적으로 특정 암에 걸리기 쉬운 것으로 결정된 개체의 암 발생을 검출 또는 모니터링할 수 있다. 이와 같이, 암 발생 과정 중 초기에 적당한 처리를 행함으로써, 종양 또는 암의 성장의 개시를 실제로 방지 또는 줄일 수 있다. 특히, 생세포에서의 유전자 발현 수준의 검출에 의해, 다양한 처리 후의 동일한 세포 집단에서의 유전자 발현의 변화를 실시간으로 측정할 수 있다. 이러한 시도는 생물학적 시약에 의한 종양세포에서의 유전자 발현 변화 시험은 물론, 치료 시약으로 암세포를 처리 한 후의 분자 표적 유전자 발현의 평가에 사용할 수 있다.

또한, 생세포에서의 유전자 발현의 변화를 실시간 검출하기 위한 진단 키트는 상기 개시한 방법을 수행하기에 적합한 어떠한 물질 또는 시약을 포함한다.

암성 세포의 검출

본 발명은 여기서 개시한 분자표지술을 사용하여 시료 중의 암성 세포를 검출하는 방법을 제공한다. 유방, 췌장, 난소, 전립선, 직장, 간세포, 다발골수종, 림프종, 방광, 갑상선의 속질암종, 신경내분비암종, 카르시노이드종양, 고환, 임신융모종양, 폐, 멜라닌종 및 위를 포함하는 하나 이상의 암으로부터 유래하는 암세포를 검출할 수 있다. 또한 암세포의 검출하기 위한 진단 키트는 상기 개시한 방법을 수행하는데 적합한 물질 또는 시약을 포함한다.

본 발명의 범위를 제한할 의도 없이, 본 발명의 태양에 의한 대표적인 방법 및 그 관련 결과를 하기에 나타낸다. 제목과 부제는 독자의 편리를 위해 예로서 사용될 수 있으며, 이들이 본 발명의 범위를 제한하지는 않는다.

[실시예 1]

서바이빈 MB를 사용하여 유방암세포주에서의 서바이빈 유전자 발현의 예비 검출

인간 서바이빈 유전자의 27nt∼43nt cDNA 서열에 상보적인 프로브 서열(서열번호 1: 5'-Alexa-fluo-488-CTGAGAAAGGGCTGCCAGTCTCAG-Dabcyl-3')을 사용하여, 상기 유전자에 특이적인 MBs를 설계하여 합성하였다. 서바이빈 MB의 밑줄친 스템(stem) 서열을 특이적으로 설계하여 최상의 열역학적 효과를 성취하였다. 먼저, 서바이빈 MB의 특이적 하이브리다이제이션은 시험관내에서(in viro) 합성된 서바이빈 올리고뉴클레오티드 표적을 사용하여 연구하였다.

결과는 상기 서바이빈 MB가 서바이빈 표적에 특이적으로 결합함을 나타내었다(도 2c). 서바이빈 mRNA를 검출하기 위한 서바이빈 MBs의 특이성은 다른 수준의 서바이빈 유전자를 발현하는 유방암세포주 MDA-MB-231, MDA-MB-435 및 MCF-7, 및 정상 인간 유방 상피세포주(MCF-10A)에서 더 시험하였다. 고정된 세포와 서바이빈 MBs를 37℃에서 1시간 동안 배양한 후, 상기 세포를 PBS로 세정하고 니콘 형광 현미경 하에서 관찰하였다. 세포는 챔버 슬라이드에서 성장시켜 아세톤으로 고정하였다; 서바이빈 MB는 Alexa-Fluo 488(녹색, 도 4b)로 표지하였다. 웨스턴 블랏에 의한 유방암세포 및 정상세포에서의 서바이빈 발현의 검출은 도 4b에 나타내었다. 도 4a에 나타낸 바와 같이, MCF-10A 세포에서는 단지 약한 형광만이 관찰되는 반면에, 암세포는 중간∼강한 적색 형광을 나타내었다. 또한, 상기 형광의 강도는 웨스턴 블랏에 의해 검출된 서바이빈의 수준과 상관관계가 있다(도 4b).

[실시예 2]

유방암세포 중에서의 서바이빈 및 사이클린 D1 발현의 동시 검출

더 많은 연구를 수행하여 수개의 암 마커 MBs를 사용하여 암세포의 검출 특이성을 시험하였다. 사이클린 D1 및 Her-2/neu 유전자에 대한 MBs를 설계하여 합성하였다(표 1). 그 다음 발명자들은 합성된 올리고뉴클레오티드 표적을 사용하여 시험관내에서 상기 MBs의 특이성을 시험하였다. 각 MB에 대한 서열을 표 1에 나타낸다. 밑줄친 서열은 유전자 부분이 아니라 스템을 형성하도록 설계되었다. 또한, 발명자들은 상이한 형광 염료(6-FAM, Cy3, Alexa-Fluo-488)를 사용하여 동일한 서열을 갖는 수개의 서바이빈 MB를 합성하였다. 서바이빈 MB-FITC는 표 2에 나타낸 바와 같이 다른 표적 서열을 갖는다. 상기 MBs는 MWG Biotech(High point, NC) 및 Integrated DNA Technologies, Inc.(IDT, Corlville, IA)에 의해 합성하였다.

MBs와 그들의 표적의 특이적 하이브리다이제이션을 측정하기 위해서, MBs와 그들의 올리고뉴클레오티드 표적을 혼합함에 의해서 하이브리다이제이션 연구를 수행한 다음, 형광 마이크로플레이트 리더로 형광 강도를 측정하였다. 이 연구에 대한 대조군(control group)은 다른 유전자 유래의 올리고뉴클레오티드 표적과 혼합된 MBs로 하였다(도 2c 및 2d). 상기 MBs와 그들의 표적의 특이적 결합을 나타낸 후에, 인간 유방 종양 및 정상 세포주의 사이클린 D1 검출에서의 상기 MBs의 특이성을 더 시험하였다(도 4).

<표 1>

서바이빈, 사이클린 D1 및 Her-2/neu mRNA 검출용 분자표지

사이클린 D1 및 서바이빈 MBs를 사용하여 유방암세포를 검출하기 위해서, 100nM의 사이클린 D1과 서바이빈 MBs의 혼합물을, 아세톤으로 고정시킨 MDA-MB-231, SKBr3, MDA-MB-435, MCF-7 또는 MCF-10A 세포와 1시간 동안 배양하였다. 그 형광 강도는 형광 현미경 하에서 시험하였다(도 4a). 서바이빈 및 사이클린 D1 단백질의 수준을 웨스턴 블랏 분석에 의해 시험하여, 도 4b에 나타내었다. 이는 상기 MBs에 의해 검출된 서바이빈 및 사이클린 D1 mRNA의 수준과 단백질 수준 사이의 상관관계를 나타낸다(도 4b). 도 7은 인간 유방암세포주 MCF-7 세포를 EGF로 처리한 후의 분자표지를 사용한 생세포내에서의 유전자 발현의 실시간 검출을 나타낸다. 도 8은 도세탁셀 처리에 의해 유방암세포주에서의 서바이빈 유전자 발현 수준이 증가됨을 나타낸다.

[실시예 3]

원발 유방암조직에서의 서바이빈 발현 세포의 동정

유방암 마커로서 서바이빈의 사용 가능성을 조사하기 위해, 쌍을 이루거나 쌍을 이루지 않은 정상 및 유방암조직에서의 서바이빈 단백질의 발현을 웨스턴 블랏에 의해 시험하였다. 그 서바이빈은 유방암조직에서는 73% 이상 발현하지만 정상 유방 조직에서는 전혀 발현하지 않음을 확인하였다(도 10). 서바이빈 항체를 사용한 동결 조직 절편의 면역형광염색 결과, 서바이빈이 침습성 관상 암세포에서 높게 발현하지만 정상 유방 관상 세포에서는 발현하지 않음이 확인되었다(도 5a). 흥미롭게도, DICS 병변은 중간 수준의 서바이빈을 나타내었다(도 5a). 서바이빈 MBs를 사용하여 동결 조직 절편에서 서바이빈 유전자 발현을 시험한 결과, DCIS 병변, 침습성 관상 암종, 및 유방암 환자의 림프절 배출시의 전이 내에서 서바이빈 발현 암세포를 확인하였다. 그러나, 정상 유방 조직에서는 서바이빈 포지티브 세포가 발견되지 않았다(도 5a 및 5b)

[실시예 4]

췌장암세포 및 조직에서의 돌연변이 K- ras 및 서바이빈 mRNA 의 검출을 위한 MBs의 설계

표지(beacon) 구조 및 하이브리다이제이션 조건에 대한 파라미터를 결정한 다음, K-ras 돌연변이 유전자의 발현을 검색하기 위한 MBs를 설계하여 합성하였다. 이들을 표 4에 나타낸다. K-ras 돌연변이의 80% 이상이 K-ras 코돈 12에서 확인되었기 때문에(Vos et al, J. of Path. 187(3):279-84(1999)), GGT-GAT(Gly에서 Asp로)의 전이를 검출하는 K-ras MB 1, 및 GGT에서 GTT로의 돌연변이를 표적으로 하는 K-ras MB 2를 합성하였다(표 2). GGT에서 GAT로의 변이는 췌장암에서 가장 일반적인 K-ras 점돌연변이(point mutation)의 하나이다(표 3).

K-ras MB 1 또는 MB 2는 시험관내에서 그의 DNA 표적에 선택적으로 결합하여, 다른 비특이적 DNA 표적에 비해서 더 강한 형광 시그널을 생성한다. 췌장암세포주에서의 K-ras MBs의 특이성 시험 결과, K-ras MBs는 특이적 K-ras 돌연변이를 가진 췌장암세포를 검출할 수 있음을 확인하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, Panc-1 세포주는 K-ras GGT에서 GAT로의 돌연변이를 갖고, K-ras MB 1과 배양 후에 강한 형광 강도를 나타내었으나, K-ras MB 2 염색 세포에서는 약한 형광을 나타내었다. Capan-2 세포주는 K-ras GGT에서 GTT로의 돌연변이를 포함하고, K-ras MB 2 염색 세포에서는 더밝은 형광이 검출되었다. 두 세포주는 서바이빈 MB에 의해 검출되는 바와 같이 고수준의 서바이빈을 발현하였다(도 3a). 다른 한편, K-ras MBs는, K-ras GGT에서 TGT로의 돌연변이를 갖는 MIA PaCa-2 세포주, 또는 K-ras 야생형 BXPC-3 세포에서는 강한 형광 시그널을 생성하지 않았다. 그러나, 이 세포들은 서바이빈 MB 염색에 대해 포지티브를 나타냈다. 특히, 정상 피부 섬유아세포로부터 얻은 정상 세포주(HDF)에서는 K-ras 및 서바이빈 MBs의 배양에 의해 검출가능한 형광 시그널이 생성되지 않았다(도 3b).

또한, K-ras MBs는 동결 조직 절편에서 K-ras 돌연변이를 가진 췌장암세포를 검출할 수 있다. K-ras MB 1 또는 K-ras MB 2와 1시간 동안 배양하고 훽스트 33342(청색)로 대조염색한 후, 그 슬라이드를 디지탈 이미지 시스템이 장착된 형광 현미경 하에서 관찰하였다. K-ras MB 1은 K-ras 코돈 12 GGT에서 GAT로의 돌연변이를 포함하는 환자 #1 및 #2로부터 채취한 췌장암조직의 동결 절편에서 GGT에서 GAT로의 돌연변이 K-ras 유전자를 발현하는 암세포를 검출하였다. 그러나, K-ras MB 1이 아니라 K-ras MB 2와 같이 배양한 후 K-ras GGT에서 GTT로의 돌연변이를 가진, 환자 #5로부터 채취한 췌장암조직의 동결 절편에서는 밝은 적색 형광을 띠는 세포가 확인되었다(도 6a).

서바이빈 MB에 의한 췌장암조직에서의 서바이빈 발현의 검출 가능성을 시험하였다. 먼저, 췌장암조직에서의 서바이빈 발현은 항서바이빈 단일클론항체를 이용한 면역형광염색에 의해 나타내었다. 발명자들은 서바이빈 단백질이 췌장암조직에서는 높게 발현하지만 정상 췌장에서는 검출되지 않음을 나타내었다(도 6b).

<표 2>

K-ras codon 12 돌연변이 및 서바이빈 유전자에 대한 분자표지 및 그 상보적인 표적 서열의 설계

A. K-ras 돌연변이 및 서바이빈 mRNA를 검출하기 위한 MBs의 설계

B. K-ras 및 서바이빈 MBs에 대한 DNA 표적으로서 작용하는 올리고뉴클레오티드

<표 3>

췌장암세포주에서의 K-ras 돌연변이

<표 4>

K-ras 코돈 12 돌연변이를 표적으로 하는 분자표지 설계

상기한 명세서, 실시예, 및 데이터는 본 발명의 제조 및 용도의 완전한 설명을 제공한다. 다른 특정 없다면, 인용된 모든 특허 및 비특허 참조문헌은 배경 정보용 참조문헌으로서 여기서 삽입된다. 본 발명의 많은 태양들은 본 발명의 사상과 범위를 벗어나지 않는 한 이루어질 수 있으며, 본 발명은 하기에 첨부한 청구범위에 속한다.

[참고 문헌]

SEQUENCE LISTING <110> Emory University Yang, Lily Bao, Gang Staley, Charles Cohen, Cynthia <120> Methods of Detecting Gene Expression in Normal and Cancerous Cells <130> 14507-44296 <140> PCT/US2004/000755 <141> 2004-01-13 <160> 13 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is a, c, g, t or u <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n is a, c, g, t or u <400> 1 nctgagaaag ggctgccagt ctcagn 26 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 ctgagaaagg gctgccagtc tcag 24 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 tggagttgtc ggtgtagact cca 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 cacttgatca ctctggacaa gtg 23 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 tagaggtggc ggagcatctc ta 22 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 caatccgcag cctctgcgat tg 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 cctacgccat cagctccgta gg 22 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 cctacgccaa cagctccgta gg 22 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 tggtccttga gaaagggcga cca 23 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 gagtccttcc acgataccga ctc 23 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 cctacgccac gagctccgta gg 22 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 cctacgccac aagctccgta gg 22 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 cctacgccag cagctccgta gg 22

Claims

i) 분석용 세포 시료를 마련하는 공정;

ii) 종양 마커 mRNA(tumor maker mRNA)을 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드로 시료를 처리하는 공정으로서, 상기 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 결합된 에너지 공여체 부분(donor moiety)과 적어도 하나의 결합된 에너지 수용체 부분(acceptor moiety)을 포함하고, 상기 올리고뉴클레오티드는 스템-루프 헤어핀을 형성하고 상기 공여체와 수용체 부분은 적어도 탐색(probing) 핵산염기서열 부분에 의해 분리되어 있는 공정;

iii) 적합한 하이브리다이제이션 조건 하에서 상기 표적 서열의 하이브리다이제이션을 검출, 확인 또는 정량하는 공정으로서, 시료 중에 존재하는 표적 서열의 존재 또는 부재 또는 양은 상기 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 공여체 또는 수용체 부분과 관련된 검출가능한 시그널의 변화와 상관 관계에 있는 공정; 및

iv) 측정되는 상기 올리고뉴클레오티드의 표적 서열에 대한 하이브리다이제이션의 존재, 부재 또는 양에 근거하여 종양 마커의 존재를 검출, 확인 또는 정량하는 공정

을 포함하는 시료 중의 적어도 하나의 종양 마커 mRNA의 존재를 검출하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 종양 마커는 서바이빈(survivin), 사이클린 D1, Her2/neu, 돌연변이 K-ras, 키모트립시노겐, 염기성 섬유아세포 성장 인자, 암태아성 항원(carcinoembryonic antigen), 전립선(prostate) 특이적 항원, 알파-태아단백질, 베타-2-마이크로글로불린, 방광 종양 항원, 크로모그라닌 A, 뉴런 특이적 에놀라제, S-100, TA-90, 조직 폴리펩티드 항원 및 인간융모 생식샘 자극 호르몬(human chorionic gonadotropin)으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 마커인 방법.
제1항에 있어서, 상기 시료는 혈액, 소변, 췌액, 복수(ascrites), 유즙 도관 세척물(breast ductal lavage), 유두 흡인(nipple aspiration)물, 바늘 생검 또는 조직(needle biopsy or tissue)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 소스로부터 얻어지는 방법.
제3항에 있어서, 상기 조직은 췌장 또는 유방 유래의 생검인 방법.
제3항에 있어서, 상기 조직은 동결 절편인 방법.
제1항에 있어서, 상기 시료는 유즙 도관 세척으로부터 얻어지는 방법.
제1항에 있어서, 상기 시료는 췌액으로부터 얻어지는 방법.
제1항에 있어서, 상기 종양 마커 존재의 정량은 FACScan 분석에 의해 수행되는 방법.
제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 및 13으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상인 방법.
제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 종양 마커 서바이빈(tumor marker survivin)을 표적으로 하는 방법.
제10항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 1, 2 및 9로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상인 방법.
제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 종양 마커 사이클린 D1을 표적으로 하는 방법.
제12항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 3 및 4로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 방법.
제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 종양 마커 Her2/neu를 표적으로 하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 5 및 6으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 방법.
제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 종양 마커 K-ras 돌연변이 유전자를 표적으로 하는 방법.
제16항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 7, 8, 11, 12 및 13으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상인 방법.
i) 분석용 종양 세포 시료를 마련하는 공정;

ii) 상기 시료를 돌연변이 유전자를 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드로 처리하는 공정으로서, 상기 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 결합된 에너지 공여체 부분과 적어도 하나의 결합된 에너지 수용체 부분을 포함하고, 상기 올리고뉴클레오티드는 스템-루프 헤어핀을 형성하고 상기 공여체와 수용체 부분은 적어도 탐색 핵산염기서열 부분에 의해 분리되어 있는 공정;

iii) 적합한 하이브리다이제이션 조건 하에서 상기 올리고뉴클레오티드의 상기 돌연변이 유전자에 대한 표적 서열의 하이브리다이제이션을 검출, 확인 또는 정량하는 공정으로서, 시료 중에 존재하는 돌연변이 유전자 표적 서열의 존재 또는 부재 또는 양은 상기 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 공여체 또는 수용체 부분과 관련된 검출가능한 시그널의 변화와 상관 관계에 있는 공정; 및

iv) 측정되는 상기 올리고뉴클레오티드의 상기 돌연변이 유전자 표적 서열에 대한 하이브리다이제이션의 존재, 부재 또는 양에 근거하여 돌연변이 유전자의 존재를 검출, 확인 또는 정량하는 공정

을 포함하는 종양 세포 중의 돌연변이 유전자의 존재를 검출하는 방법.
제18항에 있어서, 상기 돌연변이 유전자는 K-ras 돌연변이 유전자인 방법.
제19항에 있어서, 상기 돌연변이 유전자의 존재의 정량은 FACScan 분석에 의해 수행되는 방법.
제19항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 서열 번호 7, 8. 11, 12 및 13으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상인 방법.
i) 분석용 생세포 시료를 마련하는 공정;

ii) 상기 시료를 특정 유전자 서열을 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드로 처리하는 공정으로서, 상기 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 결합된 에너지 공여체 부분(donor moiety)과 적어도 하나의 결합된 에너지 수용체 부분(acceptor moiety)을 포함하고, 상기 올리고뉴클레오티드는 스템-루프 헤어핀을 형성하고 상기 공여체와 수용체 부분은 적어도 탐색 핵산염기서열 부분에 의해 분리되어 있는 공정;

iii) 적합한 하이브리다이제이션 조건 하에서 상기 표적 서열의 하이브리다이제이션을 검출, 확인 또는 정량하는 공정으로서, 시료 중에 존재하는 표적 서열의 존재, 부재 또는 양은 상기 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 공여체 또는 수용체 부분과 관련된 검출가능한 시그널의 변화와 상관 관계에 있는 공정; 및

iv) 측정되는 상기 올리고뉴클레오티드의 상기 표적 서열에 대한 하이브리다이제이션의 존재, 부재 또는 양에 근거하여 상기 특정 유전자의 발현에 있어서의 변화(alteration)를 검출, 확인 또는 정량하는 공정

을 포함하는 생세포내의 유전자 발현에서의 변화를 모니터링하는 방법.
제22항에 있어서, 상기 유전자 발현에 있어서의 변화의 정량은 FACScan 분석 및 형광 마이크로플레이트 리더(fluorescence microplate reader)에 의해 수행하는 방법.
i) 피험체로부터 분석용 세포 시료를 마련하는 공정;

ii) 상기 시료를 유방암 마커 유전자 서열을 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드로 처리하는 공정으로서, 상기 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 결합된 에너지 공여체 부분(donor moiety)과 적어도 하나의 결합된 에너지 수용체 부분(acceptor moiety)을 포함하고, 상기 올리고뉴클레오티드는 스템-루프 헤어핀을 형성하고 상기 공여체와 수용체 부분은 적어도 탐색 핵산염기서열 부분에 의해 분리되어 있는 공정;

iii) 적합한 하이브리다이제이션 조건 하에서 상기 표적 올리고뉴클레오티드의 서열과 상기 유방암 마커 유전자 서열에 대한 하이브리다이제이션을 검출, 확인 또는 정량하는 공정으로서, 시료 중에 존재하는 표적 올리고뉴클레오티드 서열의 존재, 부재 또는 양은 상기 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 공여체 또는 수용체 부분과 관련된 검출가능한 시그널의 변화와 상관 관계에 있는 공정; 및

iv) 측정되는 상기 올리고뉴클레오티드의 유방암 표적 서열에 대한 하이브리다이제이션의 존재, 부재 또는 양에 근거하여 유방암의 존재 또는 진행을 검출, 확인 또는 정량하는 공정

을 포함하는 피험체의 유방암의 존재 또는 진행을 검출 또는 모니터링하는 방법.
제24항에 있어서, 상기 유방암 마커는 서바이빈, 사이클린 D1, Her2/neu, 염기성 섬유아세포 성장 인자, EGF 수용체 및 암태아성 항원으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 마커인 방법.
제24항에 있어서, 상기 시료는 혈액, 소변, 유즙 도관 세척(breast ductal lavage), 복수(acrites), 유두 흡인(nipple aspiration), 바늘 생검 또는 조직으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 소스로부터 얻어지는 방법.
제26항에 있어서, 상기 조직은 유방 또는 림프절 유래의 생검인 방법.
제26항에 있어서, 상기 조직은 동결 절편인 방법.
제24항에 있어서, 상기 유방암의 존재 또는 진행의 정량은 FACScan 분석에 의해 수행되는 방법.
제24항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 유방암 마커 서바이빈을 표적으로 하는 방법.
제30항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 1, 2 및 9로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 방법.
제24항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 유방암 마커 사이클린 D1을 표적으로 하는 방법.
상기 제32항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 3 및 4로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 방법.
제24항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 유방암 마커 Her2/neu를 표적으로 하는 방법.
제34항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 5 및 6으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상인 방법.
i) 피험체로부터 분석용 세포 시료를 마련하는 공정;

ii) 상기 시료를 췌장암 마커 유전자 서열을 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드로 처리하는 공정으로서, 상기 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 결합된 에너지 공여체 부분(donor moiety)과 적어도 하나의 결합된 에너지 수용체 부분(acceptor moiety)을 포함하고, 상기 올리고뉴클레오티드는 스템-루프 헤어핀을 형성하고 상기 공여체와 수용체 부분은 적어도 탐색 핵산염기서열 부분에 의해 분리되어 있는 공정;

iii) 적합한 하이브리다이제이션 조건 하에서 상기 표적 올리고뉴클레오티드 서열의 상기 췌장암 마커 유전자 서열에 대한 하이브리다이제이션을 검출, 확인 또는 정량하는 공정으로서, 시료 중에 존재하는 표적 올리고뉴클레오티드 서열의 존재 또는 부재 또는 양은 상기 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 공여체 또는 수용체 부분과 관련된 검출가능한 시그널의 변화와 상관 관계에 있는 공정; 및

iv) 측정되는 상기 올리고뉴클레오티드와 유방암 표적 서열의 하이브리다이제이션의 존재, 부재 또는 양에 근거하여 췌장암의 존재 또는 진행을 검출, 확인 또는 정량하는 공정

을 포함하는 피험체의 췌장암의 존재 또는 진행을 검출 또는 모니터링하는 방법.
제36항에 있어서, 상기 췌장암 마커는 서바이빈, K-ras 돌연변이 유전자, 및 암태아성 항원으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 마커인 방법.
제36항에 있어서, 상기 시료는 혈액, 소변, 췌액, 복수(acrites), 바늘 생검 또는 조직으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 소스로부터 얻어지는 방법.
제38항에 있어서, 상기 조직은 동결 절편인 방법.
제36항에 있어서, 상기 췌장암의 존재 또는 진행의 정량은 FACScan 분석에 의해 수행되는 방법.
제36항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 췌장암 마커 서바이빈을 표적으로 하는 방법.
제41항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 1, 2 및 9로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 방법.
제36항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 돌연변이 K-ras 췌장암 마커를 표적으로 하는 방법.
상기 제43항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열 번호 7, 8, 11, 12 및 13으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 방법.
i) 분석용 세포 시료를 마련하는 공정;

ii) 상기 시료를 암특이적 마커 유전자 서열을 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드로 처리하는 공정으로서, 상기 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 결합된 에너지 공여체 부분(donor moiety)과 적어도 하나의 결합된 에너지 수용체 부분(acceptor moiety)을 포함하고, 상기 올리고뉴클레오티드는 스템-루프 헤어핀을 형성하고 상기 공여체와 수용체 부분은 적어도 탐색 핵산염기 서열 부분에 의해 분리되어 있는 공정;

iii) 적합한 하이브리다이제이션 조건 하에서 상기 표적 올리고뉴클레오티드 서열의 상기 암특이적 마커 유전자 서열에 대한 하이브리다이제이션을 검출, 확인 또는 정량하는 공정으로서, 시료 중에 존재하는 표적 올리고뉴클레오티드 서열의 존재, 부재 또는 양은 상기 올리고뉴클레오티드의 적어도 하나의 공여체 또는 수용체 부분과 관련된 검출가능한 시그널의 변화와 상관 관계에 있는 공정; 및

iv) 측정되는 상기 올리고뉴클레오티드의 암특이적 표적 서열에 대한 하이브리다이제이션의 존재, 부재 또는 양에 근거하여 암세포의 존재를 검출, 확인 또는 정량하는 공정

을 포함하는 시료 중의 암세포 검출 방법.
제45항에 있어서, 상기 암세포의 존재의 정량은 FACScan 분석에 의해 수행되는 방법.
제45항에 있어서, 상기 암세포가 유방, 췌장, 난소, 전립선, 직장, 간세포, 다발골수종, 림프종, 방광, 갑상선의 속질암종, 신경내분비암종, 카르시노이드종양, 고환, 임신융모종양, 폐, 멜라닌종 및 위로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 암으로부터 유래하는 방법.
제36항의 방법을 수행하기에 적합한 재료를 포함하는, 암세포 진행 검출용 또는 모니터링용 진단 키트.
제22항의 방법을 수행하기에 적합한 재료를 포함하는, 생세포내의 유전자 발현에 있어서의 변화의 실시간 검출용 진단 키트.