ES2870474T3 - Métodos de evaluación de muestras celulares de mama y composiciones para uso en practicar los mismos - Google Patents

Métodos de evaluación de muestras celulares de mama y composiciones para uso en practicar los mismos Download PDF

Info

Publication number
ES2870474T3
ES2870474T3 ES16800679T ES16800679T ES2870474T3 ES 2870474 T3 ES2870474 T3 ES 2870474T3 ES 16800679 T ES16800679 T ES 16800679T ES 16800679 T ES16800679 T ES 16800679T ES 2870474 T3 ES2870474 T3 ES 2870474T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
sample
cell
data
cells
breast
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES16800679T
Other languages
English (en)
Inventor
Keith Shults
Amanda Noel Chargin
Seyedhamed Jafarianmohamady
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
IncellDx Inc
Original Assignee
IncellDx Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by IncellDx Inc filed Critical IncellDx Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2870474T3 publication Critical patent/ES2870474T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/4833—Physical analysis of biological material of solid biological material, e.g. tissue samples, cell cultures
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5094—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for blood cell populations
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57415—Specifically defined cancers of breast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/71—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/72—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for hormones
    • G01N2333/723—Steroid/thyroid hormone superfamily, e.g. GR, EcR, androgen receptor, oestrogen receptor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Ecology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Un método para detectar una célula de cáncer de mama en una muestra celular de mama obtenida de tejido mamario de un sujeto, el método comprende: a) análisis citométrico de flujo de la muestra celular de mama para obtener: i) datos de muestra que comprenden datos de densidad celular de muestra; ii) datos de células epiteliales que comprenden datos de contenido de ADN, datos de proliferación y datos de volumen celular; y iii) datos de glóbulos blancos (WBC) que comprenden al menos uno de un nivel de expresión del receptor de estrógeno y un nivel de expresión del receptor de progesterona; y b) evaluar los datos de muestra obtenidos, los datos de células epiteliales y los datos de glóbulos blancos para detectar la célula de cáncer de mama en la muestra celular de mama.

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos de evaluación de muestras celulares de mama y composiciones para uso en practicar los mismos
Esta solicitud reivindica prioridad a la fecha de presentación de la Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos N° de serie 62/166.583, presentada el 26 de mayo de 2015.
Introducción
El cáncer de mama es la tercera causa principal de muerte por cáncer en los Estados Unidos. Se estima que, en 2011, había 2.899.726 mujeres con cáncer de mama en los Estados Unidos. En 2014, se estima que habrá 232.670 nuevos casos de cáncer de mama y se estima que 40.000 personas morirán a causa de la enfermedad en los Estados Unidos. El cáncer de mama representa 22,2 muertes por cada 100.000 mujeres por año y aproximadamente el 12,3% de las mujeres en los Estados Unidos serán diagnosticadas con cáncer de mama en algún momento de su vida.
La etapa del cáncer en el momento del diagnóstico, en lo que se refiere a la extensión del cáncer en el cuerpo, determina las opciones de tratamiento y tiene una gran influencia en la duración de la supervivencia. Las tasas de supervivencia relativas a cinco años para el cáncer de mama diagnosticado en la Etapa 1 (es decir, el cáncer "localizado", se limita al sitio primario) son del 98,5%. Sin embargo, las tasas de supervivencia relativas a cinco años para el cáncer de mama caen hasta el 84,6% cuando se diagnostica en la Etapa 2 (es decir, el cáncer "regional", se ha diseminado a los ganglios linfáticos regionales) y hasta el 25% cuando se diagnostica en la Etapa 3 (es decir, cáncer "distante", el cáncer ha producido metástasis). Como tal, la detección y el diagnóstico precoces del cáncer de mama son muy predictivos de los resultados del paciente, incluida la respuesta al tratamiento y la supervivencia. Dado que la metástasis del cáncer está fuertemente correlacionada con el cáncer en una etapa avanzada, determinar si el cáncer de un paciente es o no metastásico puede ser una etapa invaluable para que un médico elija una estrategia de tratamiento y/o haga predicciones de los resultados del paciente, ya sea que se inicie o no el tratamiento (Breast cáncer surveillance and epidemiology statistics retrieved from National Center Institute at seer (dot)cancer(dot)gov).
Uno de los factores que complican el diagnóstico son las pruebas de falsos positivos que conducen a un sobrediagnóstico. El porcentaje estimado de sobrediagnóstico de cáncer de mama en los Estados Unidos es del 30%. Las mamografías que dan como resultado falsos positivos son comunes. Una mujer de 60 años examinada anualmente durante 10 años mediante una mamografía tiene aproximadamente un 50% de probabilidad de tener al menos un falso positivo que conduce a una prueba de seguimiento y aproximadamente un 20% de probabilidad de un falso positivo que conduce a una biopsia. (véase Schwartz et al. (2000) West J Med. 173(5):307-312). El sobrediagnóstico puede ser el resultado de una prueba que depende demasiado de determinaciones subjetivas, por ejemplo, tales como las realizadas por un evaluador humano (por ejemplo, un citólogo, histólogo o patólogo), o por muy pocas variables (por ejemplo., ensayos de expresión de un solo gen o proteína). Se ha demostrado que la inmunohistoquímica de sólo la proteína Her2 sobrestima su sobreexpresión en el 40% de todos los casos, lo que requiere pruebas adicionales para un diagnóstico adecuado. Además de las consecuencias directas sobre el tratamiento médico de un sujeto, un resultado falso positivo de un ensayo también puede tener impactos negativos indirectos en el bienestar físico y psicológico de un sujeto.
Además de las pruebas de diagnóstico con fines médicos, la industria farmacéutica se basa en las determinaciones de la presencia, la etapa, la progresión, y el crecimiento del cáncer como medidas empleadas para evaluar tratamientos y nuevos fármacos. Como tal, debido en parte a los factores discutidos anteriormente, la industria farmacéutica se está alejando de la inmunohistoquímica como una forma de evaluar el rendimiento clínico y preclínico de nuevos fármacos y tratamientos y hacia métodos más cuantitativos. Además, debido a la gran diferencia en los resultados de los pacientes entre los cánceres primarios y los cánceres metastásicos, existe un gran interés en comprender el desarrollo del cáncer para identificar nuevas dianas terapéuticas.
Compendio
Se proporcionan métodos para evaluar una muestra celular de mama. Los aspectos de los métodos incluyen la obtención de datos de muestra por citometría de flujo, datos celulares y combinaciones de los mismos, y a continuación la evaluación de la muestra celular de mama en base a los datos obtenidos. Además, se proporcionan composiciones, por ejemplo, kits, sistemas y programación, útiles en la práctica de diversas realizaciones de los métodos.
Breve descripción de los dibujos
La invención se comprende mejor a partir de la siguiente descripción detallada cuando se lee junto con los dibujos adjuntos. Se enfatiza que, según la práctica común, las diversas características de los dibujos no están a escala. Por el contrario, las dimensiones de las diversas características se amplían o reducen arbitrariamente para mayor claridad. En los dibujos se incluyen las siguientes figuras.
Fig. 1 representa la estrategia de activación del receptor de estrógeno, receptor de progesterona, ARNm de Her2, proteína HER2, DAPI, y células marcadas con CD45.
Fig. 2 representa la matriz de compensación generada para las células activadas según la Fig.1.
Fig. 3 representa un ejemplo de las poblaciones de células diana activadas para las que se generaron datos. Fig. 4 representa la generación de datos del índice de ADN (DI) y del ciclo celular.
Fig. 5 representa poblaciones de células que expresan CD44 y E-cadherina relevantes para el modelo de metástasis.
Fig. 6 representa la separación del fabricante del receptor de estrógeno y del ARNm de her2 y los índices de ADN tumoral y de glóbulos blancos que se pueden resolver de las poblaciones de células de muestra.
Fig. 7 representa la separación estadística de muestras de sujetos con tumores y de sujetos sanos utilizando el modelo reducido de 5 variables.
Fig. 8 representa la separación estadística de muestras de tumores metastásicos y tumores no metastásicos empleando el modelo de metástasis completo.
Fig. 9 representa la separación estadística de muestras de tumores metastásicos y tumores no metastásicos utilizando el modelo de metástasis reducida.
Fig. 10 representa el cáncer frente a la clasificación de muestra normal según un modelo de múltiples parámetros como se describe en la presente memoria.
Fig. 11 representa comparaciones de control de muestras normales relevantes para la Fig. 10.
Fig. 12 proporciona un diagrama de flujo que muestra un proceso para la generación y evaluación de un modelo de múltiples parámetros para la clasificación de muestras cancerosas y no cancerosas.
Descripción detallada
Se proporcionan métodos para evaluar una muestra celular de mama. Los aspectos de los métodos incluyen la obtención de datos de muestra por citometría de flujo, datos celulares, y combinaciones de los mismos, y a continuación la evaluación de la muestra celular de mama en base a los datos obtenidos. Además, se proporcionan composiciones, por ejemplo, kits, sistemas y programación, útiles en la práctica de diversas realizaciones de los métodos.
Antes de que se describan los presentes métodos y composiciones, se debe entender que esta invención no se limita al método o composición particulares descritos, ya que tales pueden, por supuesto, variar. También se debe entender que la terminología empleada en la presente memoria tiene el propósito de describir únicamente realizaciones particulares, y no pretende ser limitante, ya que el alcance de la presente invención se limitará sólo por las reivindicaciones adjuntas.
Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, hasta la décima parte de la unidad del límite inferior, a menos que el contexto indique claramente lo contrario, entre los límites superior e inferior de ese intervalo también se describe específicamente. Cada intervalo más pequeño entre cualquier valor establecido o valor intermedio en un intervalo establecido y cualquier otro valor establecido o intermedio en ese intervalo establecido está incluido dentro de la invención. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños se pueden incluir o excluir independientemente en el intervalo, y cada intervalo donde cualquiera de los dos, ninguno o ambos límites se incluyen en los intervalos más pequeños también se engloban dentro de la invención, sujeto a cualquier límite excluido específicamente en el intervalo indicado. Cuando el intervalo indicado incluye uno o ambos límites, se incluyen también en la invención los intervalos que excluyen uno o ambos de los límites incluidos.
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos empleados en la presente memoria tienen el mismo significado que el entendido habitualmente por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque en la práctica o ensayo de la presente invención se puede emplear cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en la presente memoria, ahora se describen algunos métodos y materiales potenciales y preferidos.
Como será evidente para los expertos en la técnica al leer esta descripción, cada una de las realizaciones individuales descritas e ilustradas en la presente memoria tiene componentes y características discretos que se pueden separar fácilmente o combinar con las características de cualquiera de las otras realizaciones sin apartarse del alcance de la presente invención. Cualquier método enumerado se puede llevar a cabo en el orden de los eventos enumerados o en cualquier otro orden que sea posible de manera lógica.
Cabe señalar que, como se emplea en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una", y "el" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, la referencia a "una célula" incluye una pluralidad de tales células y la referencia al "péptido" incluye la referencia a uno o más péptidos y equivalentes de los mismos, por ejemplo, polipéptidos, conocidos por los expertos en la técnica, y así sucesivamente.
Las publicaciones discutidas en la presente memoria se proporcionan únicamente para su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente divulgación. Nada en la presente memoria se debe interpretar como una admisión de que la presente invención no tiene derecho a ser anterior a dicha publicación en virtud de una invención anterior. Además, las fechas de publicación proporcionadas pueden ser diferentes de las fechas de publicación reales que pueden necesitar ser confirmadas de forma independiente.
Métodos
Como se resumió anteriormente, las realizaciones de la invención se dirigen a métodos para evaluar una muestra celular de mama, es decir, una muestra de células de mama o una muestra celular de mama. Por "muestra celular de mama" se entiende una muestra que contiene células derivadas, por ejemplo, empleando los métodos que se describen con más detalle a continuación, de la mama de un sujeto, es decir, de tejido mamario. Según los métodos descritos en la presente memoria, los datos se obtienen de la muestra analizando la muestra mediante citometría de flujo que se describe con más detalle a continuación, seguido de la evaluación de los datos para realizar una valoración de la muestra.
Datos
Los datos obtenidos de una muestra pueden incluir varias categorías de datos que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, datos de muestra y datos celulares. Por "datos de muestra" se entiende datos pertenecientes a la muestra en su conjunto y que representan una o más características de la muestra. Los datos de la muestra se pueden obtener mediante el análisis de la muestra completa o una parte de la muestra (es decir, tomar una muestra de la muestra). Por "datos celulares" se entiende los datos que pertenecen a una célula individual de la muestra y que representan una o más características de la célula particular. Los datos celulares se pueden expresar "por célula" o en base a una célula individual o se pueden expresar como una característica estadística (por ejemplo, promedio) de 2 o más células, tales como, pero no limitadas a, todas las células de la muestra o alguna parte de las células de la muestra, incluidas las células de una población o subpoblación particular.
En los casos donde los datos de la muestra se obtienen de una parte de la muestra, una o más mediciones de la muestra realizadas en la parte de la muestra se pueden extrapolar a la muestra completa en consonancia con los procedimientos de muestreo de rutina. En algunas realizaciones, la parte de la muestra de la que se obtienen los datos de la muestra puede ser hasta el 50% o más de la muestra, que incluyen pero no se limita a, por ejemplo, el 45% de la muestra, el 40% de la muestra, el 35% de la muestra, el 33% de la muestra, el 30% de la muestra, el 25% de la muestra, el 20% de la muestra, el 15% de la muestra, el 10% de la muestra, el 5% de la muestra, el 4% de la muestra, el 3% de la muestra, el 2% de la muestra, el 1% de la muestra, el 0,5% de la muestra, el 0,1% de la muestra, etc., incluyendo opcionalmente un mínimo del 0,01% de la muestra y un máximo del 99,99% de la muestra.
En algunos casos, se pueden analizar múltiples partes de una muestra por duplicado para añadir confianza en la extrapolación a toda la muestra de la característica medida. El número de partes replicadas de la muestra analizada variará dependiendo, por ejemplo, de la característica particular de la muestra que se esté analizando y del tamaño de la parte de la muestra. En algunos casos, el número de mediciones repetidas puede ser 2 o más, que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, 3 o más, 4 o más, 5 o más, 6 o más, 7 o más, 8 o más, 9 o más, 10 o más, etc., que incluyen opcionalmente un máximo de 100 réplicas. En otros casos, se puede emplear una sola medición para evaluar una característica particular de la muestra.
Los datos obtenidos de la muestra pueden requerir o no directamente el uso de marcadores o tintes para marcar o teñir la muestra con el fin de permitir la adquisición de la característica particular de los datos. Por ejemplo, en algunos casos, los datos, incluidos los datos de la muestra y los datos celulares, se pueden obtener sin marcar o teñir las células de la muestra. En otros casos, la adquisición de datos, incluidos los datos de la muestra y los datos celulares, puede requerir marcar o teñir las células de la muestra.
En determinadas realizaciones, los datos obtenidos de la muestra pueden incluir datos de la muestra obtenidos sin requerir la detección de un marcador. Los datos de muestra que se pueden obtener sin la detección de un marcador incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, un recuento del número total de células en la muestra (es decir, el recuento celular total), un recuento del número de células individuales en la muestra (es decir, recuento de células individuales), un recuento del número de células en un volumen particular de muestra (es decir, recuento de células por volumen o concentración celular o densidad celular), un recuento del número de células no individuales en la muestra (por ejemplo, recuento doble), un recuento del número de células de un tamaño o intervalo de tamaño particular en la muestra (por ejemplo, recuento del tamaño celular), la concentración del número de células de un tamaño o intervalo de tamaño particular en la muestra (por ejemplo, concentración de tamaño celular o densidad de tamaño celular), un recuento del número de células de una granularidad particular o intervalo de granularidad (por ejemplo, recuento de granularidad celular), la concentración de células de una granularidad o intervalo de granularidad particular (por ejemplo, concentración de granularidad celular o densidad de granularidad celular), y similares. En algunos casos, la detección de tales datos de muestra sin el empleo de un marcador proporciona ciertas ventajas que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, la capacidad de emplear marcadores adicionales para otros fines, detección más rápida de la característica particular de los datos de muestra, facilidad de uso, rentabilidad, etc.
En determinadas realizaciones, los datos obtenidos de la muestra pueden incluir datos de la muestra obtenidos empleando la detección de un marcador. Los datos de muestra que se pueden obtener con la detección de un marcador incluyen, pero no se limitan a, las características de la muestra descritas anteriormente que se pueden detectar sin un marcador, donde dichas características pueden incluir, pero no se limitan a, por ejemplo, un recuento del número total de células en la muestra (es decir, recuento total de células), un recuento del número de células individuales en la muestra (es decir, recuento de células individuales), un recuento del número de células en un volumen particular de muestra (es decir, recuento de células por volumen o concentración celular o densidad celular), un recuento del número de células no individuales en la muestra (por ejemplo,, recuento doble), un recuento del número de células de un tamaño o intervalo de tamaño particular en la muestra (por ejemplo, recuento de tamaño celular), la concentración del número de células de un tamaño o intervalo de tamaño particular en la muestra (por ejemplo, concentración de tamaño celular o densidad de tamaño celular), un recuento del número de células de una granularidad o intervalo de granularidad particular (por ejemplo, recuento de granularidad celular), la concentración de células de una granularidad o intervalo de granularidad particular (por ejemplo, concentración de granularidad celular o densidad de granularidad celular), y similares. En algunos casos, el empleo de un marcador, por ejemplo, un marcador celular no específico, para detectar los datos de la muestra que se pueden detectar sin un marcador permite ventajas particulares que incluyen, pero no se limitan a, una detección más rápida de los datos de la muestra, una detección más precisa de los datos de la muestra, etc.
En algunos casos, los datos de muestra obtenidos empleando la detección de un marcador pueden incluir datos de muestra que no se pueden detectar por citometría de flujo sin el empleo del marcador, que incluye, pero no se limita a, por ejemplo, datos del ciclo celular o datos de proliferación, y similares. Por ejemplo, en algunos casos, los datos de la muestra se pueden obtener empleando un marcador nuclear fluorescente (por ejemplo, un marcador de ADN) y pueden incluir datos del ciclo celular de la muestra (por ejemplo, que incluye el recuento o el porcentaje de células de la muestra en una o más fases particulares del ciclo celular) o datos de proliferación de la muestra (por ejemplo, que incluye el recuento o el porcentaje de células de la muestra que están o no proliferando), etc. En algunos casos, los datos del ciclo celular de la muestra pueden incluir, pero no se limitan a, el recuento o porcentaje de células de la muestra que están en la fase G1 del ciclo celular, recuento o porcentaje de células de la muestra que están en la fase G2 del ciclo celular, recuento o porcentaje de células de la muestra que están en la fase S del ciclo celular, recuento o porcentaje de células de la muestra que están en la fase M del ciclo celular, recuento o porcentaje de células de la muestra que están en la fase G0 del ciclo celular, y combinaciones de los mismos. Las combinaciones de recuentos o porcentajes de células de la muestra que están en fases particulares del ciclo celular incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, "post Grque incluye, por ejemplo, una combinación de S, G2 y M.
Los datos de la muestra obtenidos empleando un marcador también incluyen, cuando se desee, datos de marcaje negativo o datos de muestra que representan el número o porcentaje de células de una muestra que no se marcan con un marcador en particular, que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, los datos de viabilidad obtenidos empleando un tinte de viabilidad negativa que incluyen, pero no se limitan a, yoduro de propidio (PI), 7-aminoactinomicina D (7-AAD), y los disponibles en distribuidores comerciales, tales como Fixable Viability Dye eFluor 455UV/450/506/520/660/780 (Affymetrix eBioscience, San Diego, CA), LIVE/DEAD Fixable Blue/Violet/Aqua/Yellow stain (Life Technologies, Grand Island, NY), Zombie Aqua/Green/NIR/RED/UV/Violet/Yellow (BioLegend, San Diego, CA), y similares.
En algunos casos, los datos de muestra pueden incluir combinaciones de datos de muestra, incluidas combinaciones de datos de muestra obtenidos con y sin el empleo de un marcador. Por ejemplo, en algunos casos, los datos de muestra pueden incluir el recuento de células o datos de densidad celular en combinación con datos del ciclo celular o datos de viabilidad celular y sub-combinaciones de los mismos.
En determinadas realizaciones, se puede emplear un marcador para permitir la división de células de la muestra con el fin de obtener datos para una o más subpoblaciones de células. Por ejemplo, las células de la muestra se pueden dividir en base a la presencia o ausencia de un marcador detectado y se pueden obtener datos para las células divididas. En otros casos, las células de la muestra se pueden dividir en función del nivel de un marcador detectado (por ejemplo, detección por encima de un nivel umbral) y se pueden obtener datos para las células divididas. Los marcadores empleados para dividir las células de la muestra en una o más subpoblaciones variarán dependiendo de los datos particulares que se obtengan y pueden incluir, pero no se limitan a, por ejemplo, identificación de marcadores de tipo celular, identificación de marcadores de inmunofenotipo, identificación de marcadores de fenotipo canceroso, marcadores y tinciones celulares no específicos (por ejemplo, marcadores nucleares fluorescentes, tinciones de ADN, etc.), etc. En la presente memoria se describen ejemplos de dichos marcadores e identificadores. En algunos casos, una subpoblación de células pueden ser células que expresan un marcador de tipo celular (por ejemplo, el marcador detectado indica la presencia del marcador en las células y/o la presencia del marcador en las células por encima de un nivel umbral) y los datos se obtienen en base a la subpoblación de células (por ejemplo, el número de células de la subpoblación en la muestra, la concentración de células de la subpoblación en la muestra, etc.). Por ejemplo, en algunos casos, los datos basados en una subpoblación de células pueden incluir, pero no se limita a, el número o concentración de células epiteliales en una muestra, el número o concentración de glóbulos blancos en la muestra, el número o concentración del biomarcador que expresa células en la muestra, el número o concentración del biomarcador que expresa células epiteliales en la muestra, el número o concentración del biomarcador que expresa glóbulos blancos en la muestra, etc.
Cualquier parámetro de datos de muestra o parámetro de datos celulares, que incluyen, pero no se limitan a, los descritos en la presente memoria, se puede determinar específicamente para una subpoblación de células dividida. Por ejemplo, en algunos casos, se puede dividir una subpoblación de células en base a la expresión de un marcador de identificación y se pueden determinar uno o más parámetros de datos de muestra o parámetros de datos celulares para la subpoblación. En algunos casos, una subpoblación epitelial de células se puede dividir y se pueden determinar uno o más parámetros de datos de muestra o parámetros de datos celulares para la subpoblación epitelial. Por ejemplo, en algunos casos, se puede dividir una subpoblación epitelial de células y se puede determinar un parámetro del ciclo celular para la subpoblación epitelial (por ejemplo, el recuento o porcentaje de células en la fase G1 del ciclo celular, el recuento o porcentaje de células en la fase S del ciclo celular, el recuento o porcentaje de células en la fase M del ciclo celular, el recuento o porcentaje de células en la fase G2 del ciclo celular, el recuento o porcentaje de células en post-G1, etc.). En algunos casos, una subpoblación epitelial de células se puede dividir y se puede determinar el recuento o porcentaje de células epiteliales que expresan o no un biomarcador particular, que incluyen, pero no se limita a, por ejemplo, cuando el biomarcador particular es un inmuno-marcador (por ejemplo, CD44, CD45, etc.).
En algunos casos, un umbral de marcador (por ejemplo, que representa un umbral de marcaje) se determina haciendo una comparación de los niveles de marcador en dos poblaciones de células separadas que se sabe que difieren en su nivel del marcador sujeto. Por ejemplo, se mide una primera población de células que se sabe que tiene un alto nivel del Marcador X, por ejemplo, en un citómetro de flujo, y se compara con una segunda población de células, que se sabe que tiene un nivel bajo del Marcador X y la comparación se emplea para determinar un nivel umbral que se puede emplear para clasificar las células por tener un nivel bajo o alto del Marcador X y, por consiguiente, se pueden dividir las poblaciones.
En algunos casos, un umbral del marcador (por ejemplo, que representa un umbral de marcaje) se determina haciendo una comparación de los niveles del marcador dentro de una población de células, por ejemplo, una población de células de niveles desconocidos del Marcador X o una población de células sospechosas de contener subpoblaciones de células que tienen diferentes niveles del Marcador X. Por ejemplo, el nivel del Marcador X se mide en un citómetro de flujo de al menos un número suficiente de células de modo que las mediciones se puedan representar, por ejemplo, en un histograma, y la separación entre dos o más subpoblaciones de células se revela en base a los niveles de células individuales del Marcador X. Por consiguiente, el operador del citómetro de flujo puede después determinar un nivel umbral entre las subpoblaciones que se puede emplear para clasificar las células como pertenecientes a una subpoblación particular, por ejemplo, una subpoblación que tiene un nivel bajo del Marcador X o una subpoblación que tiene un nivel alto del Marcador X y, por consiguiente, se pueden dividirlas poblaciones.
En algunos casos, el umbral del marcador (por ejemplo, que representa un umbral de marcaje) se basa en el límite de detección del citómetro de flujo. Por ejemplo, células de una población de células se pueden identificar por tener un marcador particular (es decir, que son positivas para un marcador en particular) si las células tienen algún nivel detectable de un marcador particular. Asimismo, se pueden identificar las células de una población de células por no tener un marcador en particular (es decir, que son negativas para un marcador en particular) si las células no tienen un nivel detectable de un marcador particular. Por consiguiente, el nivel de detección del citómetro de flujo se puede emplear para determinar el umbral del marcador, según se desee.
En algunos casos, el umbral del marcador (por ejemplo, que representa un umbral de marcaje) se basa en niveles del marcador determinados previamente (es decir, niveles de marcador de referencia), por ejemplo, de experimentos de control realizados previamente o niveles de expresión de referencia adquiridos previamente. Por ejemplo, los niveles de marcadores determinados en muestras analizadas previamente, por ejemplo, de pacientes con cáncer y pacientes sanos, tales como los descritos en la presente memoria, se pueden emplear para determinar los niveles umbral de los marcadores. En algunos casos, los niveles de marcadores esperados de las células obtenidas de sujetos sanos se pueden emplear para determinar los niveles de marcadores normales de manera que se pueda determinar un umbral de marcador que sea representativo del intervalo del marcador normal. En tales casos, la expresión del marcador por fuera, es decir, por encima o por debajo, del intervalo del marcador normal se considera que está por encima o por debajo del umbral del marcador particular. En algunos casos, el empleo de tales niveles del marcador determinados previamente o niveles umbral determinados previamente permite el análisis de células y la identificación de subpoblaciones celulares en ausencia de una muestra celular de control o de referencia.
Los datos celulares, como se describen en la presente memoria, se pueden obtener para las células de la muestra en su conjunto o para las células de una subpoblación particular. Los datos celulares se pueden obtener con o sin el empleo de un marcador. Los datos celulares que se pueden obtener sin el empleo de un marcador incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, datos de tamaño celular, datos de granularidad celular, datos de autofluorescencia celular, volumen celular, y similares. Los datos celulares obtenidos sin el empleo de un marcador se pueden adquirir a través de cualquier método de citometría de flujo conveniente, incluida la detección y el análisis de dispersión frontal (FSC), dispersión lateral (SSC), o autofluorescencia (detectada en uno o más detectores de fluorescencia), y similares.
En algunos casos, los datos celulares que incluyen el volumen celular se pueden recopilar mediante el empleo de uno o más detectores electrónicos. Por ejemplo, una medición del volumen celular puede incluir una medición electrónica del volumen basada en el principio de Coulter o la impedancia de corriente en un campo eléctrico causada por la célula que pasa a través del campo (es decir, el volumen de Coulter). En algunos casos, las células de la muestra preparada según los métodos descritos en la presente memoria pueden mantener el volumen de células electrónicas de las células no preparadas, incluidas las células sin fijar, que incluyen al menos el 70% del volumen sin fijar, al menos el 75% del volumen sin fijar, al menos 80% del volumen sin fijar, al menos 85% del volumen sin fijar, al menos 90% del volumen sin fijar, etc., incluyendo opcionalmente un máximo del 100% del volumen sin fijar.
En algunos casos, los datos celulares se pueden obtener mediante el empleo de uno o más marcadores celulares, por ejemplo, mediante la unión de uno o más marcadores celulares con un agente de unión específico que se une al marcador (es decir, biomarcador). El agente de unión específico puede servir en sí mismo como un marcador detectable, por ejemplo, en virtud de una característica detectable inherente del miembro de unión específico (por ejemplo, fluorescencia, magnetismo, carga eléctrica, impedancia eléctrica, color, reflectancia, etc.) o el miembro de unión específica se puede detectar indirectamente mediante la adhesión o unión de un marcador detectable al miembro de unión específico. Los miembros de unión específicos y los marcadores detectables se analizan con mayor detalle a continuación. Dichos miembros de unión específicos son útiles para obtener datos celulares que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, expresión de biomarcadores, contenido de ADN, características del ciclo celular, fase del ciclo celular, proliferación celular, y similares.
En algunos casos, los datos celulares pueden incluir datos celulares obtenidos para una población de glóbulos blancos de la muestra. Los datos celulares para los glóbulos blancos que se pueden evaluar en evaluaciones como se describen en la presente memoria variarán según el ensayo y los marcadores empleados y pueden incluir cualquier componente de los datos celulares descritos como obtenidos para otras células y poblaciones de células descritas en la presente memoria, que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, tamaño celular, volumen celular, contenido de ADN, expresión de biomarcadores, características del ciclo celular, fase del ciclo celular, proliferación celular, y similares. En algunos casos, los datos de los glóbulos blancos pueden incluir la medición del componente proliferativo o del componente de la fase G1 del ciclo celular de una población de glóbulos blancos. En algunos casos, los datos de los glóbulos blancos pueden incluir la medición de la señal del biomarcador, o una combinación de señales de biomarcadores, de una población de glóbulos blancos. Para los propósitos de los métodos descritos en la presente memoria, la señal del biomarcador evaluado de los glóbulos blancos no se limita a los inmunomarcadores y puede incluir, por ejemplo, la evaluación de la señal o las señales de otros biomarcadores de otras categorías que incluyen, pero no se limitan a, biomarcadores del cáncer y/o del cáncer de mama., biomarcadores de adhesión celular, biomarcadores del ciclo celular o de la proliferación celular, y similares. En algunos casos, la señal de un biomarcador particular o combinación de biomarcadores para una población de glóbulos blancos útiles como datos para realizar una evaluación como se describe en la presente memoria puede ser la señal del biomarcador o la combinación de los mismos por encima o por debajo de un umbral particular.
Los datos de biomarcadores se refieren a cualquier tipo de dato de los que se pueda derivar información de biomarcadores para la célula. En algunos casos, los datos de biomarcadores son datos que incluyen una señal emitida por el marcador de la sonda de biomarcador marcada que se emplea en el ensayo. Los datos de los biomarcadores pueden estar en forma de presencia y amplitud de la luz emitida, el número de posiciones discretas en una célula u otro objeto del que se origina la señal o las señales luminosas, la ubicación relativa de las fuentes de señales, y el color (longitud de onda o banda de onda) de la luz emitida en cada posición en la célula. Los datos de los biomarcadores pueden adoptar la forma de datos cualitativos, semicuantitativos o cuantitativos. Los datos cualitativos son simplemente la presencia o ausencia del biomarcador. Los datos semicuantitativos o cuantitativos son datos que proporcionan alguna indicación de la cantidad, por ejemplo, número de copias, concentración, etc., del biomarcador en la célula. Por ejemplo, los datos semicuantitativos pueden adoptar la forma de una indicación de que el número de copias de un biomarcador de interés está por encima de un determinado número umbral. Los datos cuantitativos proporcionan una indicación de un valor absoluto, por ejemplo, número de copias, cantidad, etc., del biomarcador en la célula. Los datos semicuantitativos y cuantitativos se pueden denominar colectivamente como datos de cuantificación del biomarcador.
Los aspectos de la divulgación inmediata incluyen combinaciones de datos que, en combinación, tienen mayor poder predictivo que los tipos individuales de datos en solitario. Cualquiera de los tipos de datos descritos en la presente memoria se pueden combinar según sea apropiado cuando, como resultará evidente fácilmente para el experto en la técnica, los aspectos físicos del marcaje y la recopilación de los datos combinados no interfieran de manera significativa. Por ejemplo, en algunos casos, las evaluaciones de las células de una muestra de células mamarias pueden incluir la recopilación de combinaciones de datos de muestra y datos celulares y la evaluación de los datos para realizar una evaluación del cáncer de mama con mayor poder predictivo que el que se obtendría a partir de los datos de la muestra o sólo con los datos celulares. En algunos casos, las evaluaciones de las células de una muestra de células mamarias pueden incluir la recopilación de combinaciones de datos de la muestra y los datos de los glóbulos blancos y la evaluación de los datos para realizar una evaluación del cáncer de mama con mayor poder predictivo que el que se obtendría de sólo de los datos de la muestra o de los datos de los glóbulos blancos. En algunos casos, las evaluaciones de las células de una muestra de células mamarias pueden incluir la recopilación de combinaciones de datos celulares y datos de los glóbulos blancos y la evaluación de los datos para realizar una evaluación del cáncer de mama con mayor poder predictivo que el que se obtendría sólo de los datos celulares o de los datos de los glóbulos blancos. En algunos casos, las evaluaciones de las células de una muestra de células mamarias pueden incluir la recopilación de combinaciones de datos de muestra, datos celulares y datos de glóbulos blancos y evaluar los datos para realizar una evaluación del cáncer de mama con mayor poder predictivo que el que se obtendría a partir de sólo los datos de la muestra, los datos celulares o los datos de los glóbulos blancos o en subcombinaciones de los mismos. En algunos casos, las evaluaciones de las células de una muestra de células mamarias pueden incluir la recopilación de combinaciones de dos o más tipos diferentes de datos de muestra. En algunos casos, las evaluaciones de las células de una muestra de células mamarias pueden incluir la recopilación de combinaciones de dos o más tipos diferentes de datos celulares. En algunos casos, las evaluaciones de las células de una muestra de células mamarias pueden incluir la recopilación de combinaciones de dos o más tipos diferentes de datos de glóbulos blancos.
Muestras
Las muestras que contienen células de mama se pueden obtener empleando cualquier método conveniente de recogida de muestras, que incluyen, pero no se limitan a, los métodos de biopsia para obtener biopsias de tejido sólido y aspirados de biopsia. En algunos casos, se puede obtener una muestra que contiene células mamarias como parte de un procedimiento médico separado realizado con un propósito distinto a la obtención de la muestra, que incluye, pero no se limita a, un procedimiento quirúrgico. En otros casos, una muestra que contiene células de mama se puede obtener de forma independiente, por ejemplo, no como parte de un procedimiento médico separado. Los métodos de recogida de muestras variarán y dependerán de, por ejemplo, si la recogida se realiza o no como parte de un procedimiento médico adicional, el tipo particular de muestra que se obtendrá, el propósito principal para obtener la muestra y/o el método por el cual la muestra se va a procesar y/o analizar.
En algunos casos, una muestra se puede obtener mediante una biopsia quirúrgica. Para la biopsia quirúrgica se puede emplear cualquier técnica conveniente y apropiada para la recogida de una muestra que se analizará según los métodos descritos en la presente memoria que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, biopsia por escisión, biopsia por incisión, biopsia de localización con alambre, y similares. En algunos casos, se puede obtener una biopsia quirúrgica como parte de un procedimiento quirúrgico que tiene un propósito principal además del de obtener la muestra, por ejemplo, que incluye, pero no se limita a, mastectomía parcial, mastectomía segmentaria, cuadrantectomía, mastectomía simple, mastectomía total, mastectomía radical, mastectomía radical modificada, mastectomía con conservación de piel, aumento de senos, reconstrucción de senos, cirugía de ganglios linfáticos, disección de ganglios linfáticos axilares, cirugía de ganglios linfáticos centinela, y similares.
En algunos casos, se puede obtener una muestra mediante una biopsia con aguja. Se puede emplear cualquier técnica conveniente y apropiada para la biopsia con aguja para la recogida de una muestra que se analizará según los métodos descritos en la presente memoria que incluyen ,pero no se limitan a, por ejemplo, la aspiración con aguja fina (FNA, de sus siglas en inglés), la biopsia con aguja gruesa, la biopsia central estereotáctica, biopsia asistida por vacío, y similares.
La biopsia FNA se puede realizar tanto en lesiones palpables como no palpables e implica la introducción de una aguja de calibre pequeño, por ejemplo, de calibre que oscila de 18 a 25, en la masa o área sospechosa, y la extracción de material celular. El hecho de que la biopsia FNA se realice con o sin la toma conjunta de imágenes puede variar y dependerá de varios factores, que incluye si la lesión es palpable. En los casos en los que la FNA se realiza con la toma conjunta de imágenes, la técnica se puede denominar FNA guiada por imágenes y puede incluir, pero no se limita a, técnicas de toma de imágenes radiológicas, tales como ecografía, tomografía computarizada (TC), fluoroscopia, mamografía, resonancia magnética de imagen (RMI), y similares. Las técnicas de FNA, y variaciones de las mismas, útiles para recoger muestras como se describe en la presente memoria variarán, y la selección de técnicas específicas dependerá de varios factores que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, las características del sujeto, las características de la lesión detectada en particular, el procedimiento de análisis, etc. Las variaciones de tales técnicas de FNA incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, la aguja de extremo abierto (es decir, la "técnica francesa"), la técnica de presión negativa, la FNA guiada por obtención de imágenes, y similares. Como tal, las técnicas de FNA particulares pueden incluir o no succión negativa. Por ejemplo, en la técnica francesa de FNA corta, los golpes cortos y rápidos dentro de la lesión provocan el desplazamiento de las células y permiten una recogida eficaz dentro de la aguja a través de la acción capilar sin necesidad de aspiración negativa. En algunos casos, por ejemplo, cuando hay exceso de líquido (por ejemplo, de una lesión quística), se puede emplear una jeringa con el émbolo extraído para recoger una muestra mediante FNA. En algunos casos, se puede emplear presión negativa para introducir la muestra en una jeringa. En algunos casos, se puede emplear un soporte de jeringa o una pistola de aspiración o un mango de aspiración.
La biopsia con aguja gruesa se puede realizar tanto en lesiones palpables como no palpables e implica la introducción de una aguja hueca gruesa en la masa o área sospechosa y la extracción de material celular. El hecho de que la biopsia con aguja gruesa se realice con o sin la toma conjunta de imágenes puede variar y dependerá de varios factores, que incluye si la lesión es palpable. En los casos en los que la biopsia con aguja gruesa se realiza con la toma conjunta de imágenes, la técnica se puede denominar biopsia con aguja gruesa guiada por imagen o biopsia con aguja gruesa estereotáctica y puede incluir, pero no se limita a, técnicas de toma de imagen radiológica tales como ecografía, tomografía computarizada (TC), fluoroscopia, mamografía, resonancia magnética de imagen, y similares. Las variaciones de tales técnicas de biopsia con aguja gruesa incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, biopsia central asistida por vacío, biopsia central guiada por toma de imágenes, y similares. Como tal, las técnicas particulares de biopsia con aguja gruesa pueden incluir o no una incisión realizada en la piel antes de la inserción de la aguja de biopsia gruesa. Por ejemplo, en la biopsia asistida por vacío se realiza un pequeño corte y se coloca una sonda hueca a través del corte y se guía hasta el sitio de la lesión y después se introduce un cilindro de tejido en la sonda mediante presión de vacío. En general, una biopsia con aguja gruesa obtiene más tejido que la técnica FNA descrita.
En algunos casos, el término "biopsia con aguja" se puede referir generalmente a cualquier biopsia de mama que se puede realizar sin anestesia o que puede requerir sólo anestesia local y que no se consideran procedimientos quirúrgicos. En algunos casos, tales biopsias pueden utilizar dispositivos distintos de las "agujas", tales como, pero no se limitan a, aquellos dispositivos que se pueden utilizar para obtener una biopsia por punción, por ejemplo, una biopsia por punción de piel. Dichos dispositivos incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, aquellos dispositivos empleados en la recogida de biopsias cutáneas obtenidas comúnmente cuando se sospecha de un cáncer de mama inflamatorio o de la enfermedad de Paget.
Según el método de biopsia particular empleado y dependiendo de las características específicas de un sujeto particular y/o de la lesión particular de un sujeto, se puede realizar una biopsia o múltiples biopsias. Por ejemplo, en algunos casos, se puede realizar una única biopsia, por ejemplo, una única biopsia FNA o una única biopsia con aguja gruesa, para tomar una muestra suficiente de un sujeto en particular o de una lesión de un sujeto en particular. En otros casos, se pueden realizar múltiples biopsias, por ejemplo, múltiples biopsias FNA o múltiples biopsias con aguja gruesa, para la recogida de una sola muestra o múltiples muestras de un sujeto o de la lesión de un sujeto. En los casos en que se recolectan múltiples biopsias, el número real de biopsias variará dependiendo del sujeto en particular y/o de la lesión o lesiones particulares del sujeto y, como tal, puede variar de 2 a 10 o más biopsias, que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, 2 biopsias, 3 biopsias, 4 biopsias, 5 biopsias, 6 biopsias, 7 biopsias, 8 biopsias, 9 biopsias, 10 biopsias, etc. Se pueden recoger múltiples biopsias de manera puntual o se pueden recolectar a lo largo de un período de tiempo predeterminado, por ejemplo, como parte de un protocolo de vigilancia.
Una muestra recolectada de células mamarias puede contener varios tipos de células mamarias que incluyen, pero no se limitan a, células del lóbulo, células de los lóbulos, células de los conductos, células epiteliales mamarias, células del tejido adiposo, adipocitos, células de tejido conectivo, fibroblastos, células de los ligamentos, células nerviosas, células de los vasos linfáticos, células de los ganglios linfáticos, células de los vasos sanguíneos, células de la piel, células del pezón, células del complejo areola, etc. Una muestra de células mamarias también puede contener células de origen no mamario, que incluyen, pero no se limitan a, células sanguíneas, glóbulos rojos, glóbulos blancos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos, linfocitos, monocitos, células B, células T, células asesinas naturales, histiocitos, y similares.
Las muestras de células de mama recogidas según los métodos descritos en la presente memoria pueden ser muestras sólidas, semisólidas, o líquidas. Por ejemplo, en algunos casos, por la naturaleza de la técnica de recogida empleada, por ejemplo, técnicas que provocan la disociación o aspiración de las células, la muestra recogida puede ser una muestra líquida tras la recogida. En otros casos, por la naturaleza de la técnica de recogida empleada, por ejemplo, recolección quirúrgica o recolección de muestra básica, la muestra recogida puede ser una muestra sólida o semisólida al momento de la recogida. En realizaciones en las que la muestra recogida es una muestra sólida o semisólida, las células de la muestra se pueden disociar para formar una muestra líquida después de la recogida. El método para disociar muestras de tejido sólido y semisólido incluye, pero no se limita a, disociación mecánica, disociación química, disociación enzimática, y combinaciones de las mismas.
En algunos casos, las células de la muestra de células mamarias se pueden manipular después de la recogida de la mama de un sujeto y antes de procesarse y/o fijarse para su análisis como se describe en la presente memoria. La manipulación de células mamarias recogidas se puede realizar para una variedad de propósitos que incluyen, pero no se limitan a, propósitos de investigación. Por ejemplo, en algunos casos, las células recogidas se pueden cultivar in vitro para diversos fines de investigación, que incluyen, pero no se limitan a, la expansión celular, el ensayo de tratamientos o de compuestos experimentales etc. En algunos casos, las células recogidas se pueden cultivar in vivo o xenoinjertarse en un animal huésped con fines de investigación, que incluyen, pero no se limitan a, la expansión celular, ensayos de tratamientos o de compuestos experimentales, etc. Se puede emplear cualquier cultivo celular in vitro conveniente y apropiado y/o técnica de injerto in vivo para la manipulación de células de una muestra de células mamarias como se describe en la presente memoria. Después de dicha manipulación, por ejemplo, manipulación in vitro o in vivo, la muestra se puede procesar y/o las células de la muestra se pueden fijar y los datos se pueden recopilar y analizar según los métodos descritos en la presente memoria.
Tras la recogida o preparación de la muestra, la muestra celular líquida resultante de células de mama se puede fijar y/o permeabilizar según se desee. Como tal, los aspectos de los métodos pueden incluir fijar la muestra celular poniendo en contacto la muestra con un reactivo de fijación adecuado. Los reactivos de fijación de interés son aquellos que fijan las células en un determinado momento deseado. Se puede emplear cualquier reactivo de fijación conveniente, donde los reactivos de fijación adecuados incluyen, pero no se limitan a: formaldehído, paraformaldehído, formaldehído/acetona, metanol/acetona, IncellFP (IncellDx, Inc), etc. Por ejemplo, se ha visto que el paraformaldehído empleado a una concentración final de aproximadamente el 1 al 2% es un buen fijador de reticulación. En algunos casos, las células de la muestra se permeabilizan poniendo en contacto las células con un reactivo permeabilizante. Los reactivos permeabilizantes de interés son reactivos que permiten que las sondas de biomarcadores marcadas, por ejemplo, como se describe con mayor detalle a continuación, accedan al entorno intracelular. Se puede emplear cualquier reactivo permeabilizante conveniente, donde los reactivos adecuados incluyen, pero no se limitan a: detergentes suaves, tales como Triton X-100, NP-40, saponina, etc; metanol, y similares.
En algunos casos, una muestra líquida recogida, por ejemplo, obtenida de FNA que da como resultado la disociación de las células, se pone inmediatamente en contacto con una disolución destinada a preparar las células de la muestra para su posterior procesamiento, por ejemplo., disolución de fijación, disolución de permeabilización, disolución de tinción, disolución de marcaje, o combinaciones de las mismas, para minimizar la degradación de las células de la muestra que puede ocurrir antes de la preparación de las células o antes del análisis de las células. Por "contacto inmediato" se entiende que las células de la muestra o la propia muestra se pone en contacto con el agente o la disolución en cuestión sin demoras innecesarias desde el momento en que se recoge la muestra. En algunos casos, una muestra se pone en contacto inmediatamente con un agente o disolución preparativo en 6 horas o menos desde el momento en que se recoge la muestra, que incluye, pero no se limita a, por ejemplo, 5 horas o menos, 4 horas o menos, 3 horas o menos, 2 horas o menos, 1 hora o menos, 30 minutos o menos, 20 minutos o menos, 15 minutos o menos, 10 minutos o menos, 5 minutos o menos, 4 minutos o menos, 3 minutos o menos, 2 minutos o menos, 1 minuto o menos, etc., incluyendo opcionalmente un límite inferior de la cantidad mínima de tiempo necesaria para poner en contacto físicamente la muestra con el agente o la disolución preparativa, que puede, en algunos casos, ser del orden de 1 segundo a 30 segundos o más.
Los aspectos de las realizaciones de los métodos incluyen la preparación de la muestra y/o la fijación de las células de la muestra realizada de tal manera que las células preparadas de la muestra mantienen las características de las células no preparadas, incluidas las características de las células no preparadas in situ, es decir, antes de la recogida y/o las células no fijadas después de la recogida pero antes de la fijación y/o permeabilización y/o marcaje. Dichas características que se pueden mantener incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, características morfológicas celulares que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, el tamaño celular, volumen celular, forma celular, etc. La preservación de las características celulares a través de la preparación de la muestra se puede evaluar por cualquier medio conveniente que incluyen, por ejemplo, la comparación de células preparadas con una o más muestras de células control, tales como muestras sin preparar o sin fijar o sin marcar. La comparación de células de una muestra preparada con células de una muestra no preparada de una característica medida particular puede proporcionar un porcentaje de conservación de la característica que variará dependiendo de la característica particular evaluada. El porcentaje de conservación de las características celulares de las células preparadas según los métodos descritos en la presente memoria variará y puede oscilar entre un 50% de mantenimiento o más, que incluye, pero no se limita a, por ejemplo, 60% de mantenimiento o más, 65% de mantenimiento o más, 70% de mantenimiento o más, 75% de mantenimiento o más, 80% de mantenimiento o más, 85% de mantenimiento o más, 90% de mantenimiento o más, etc., y opcionalmente con un máximo de 100% de mantenimiento. En algunos casos, la conservación de una característica celular particular se puede evaluar en base a la comparación con un valor de referencia de la característica (por ejemplo, a partir de una medición predeterminada de una o más células de control, de un estándar de referencia conocido basado en células no preparadas, etc.).
Como se describe en la presente memoria, en determinadas realizaciones, las células de la muestra se pueden marcar. El marcaje celular se puede lograr mediante el empleo de una o más mezclas de reacción de marcaje. Al preparar la mezcla de reacción, la muestra se puede poner en contacto o combinar con uno o más agentes de unión específicos (por ejemplo, sondas de biomarcadores marcadas) empleando cualquier protocolo conveniente. La puesta en contacto y/o la combinación se puede llevar a cabo con mezclado, según se desee. La puesta en contacto de la muestra con uno o más agentes aglutinantes específicos se realiza en condiciones de incubación que proporcionan la unión de los agentes a sus respectivos biomarcadores, si están presentes, sobre o en las células de la muestra. En algunos casos, el agente y las muestras se ponen en contacto y se combinan a una temperatura que varía de 15°C a 50°C, tal como de 20°C a aproximadamente 45°C. La puesta en contacto se puede realizar con mezclado o agitación, por ejemplo, con agitación en vórtice, etc., para proporcionar una combinación suficiente de los componentes de reacción y la muestra.
La mezcla de reacción resultante se puede mantener o incubar después durante un período de tiempo antes de obtener datos en un citómetro de flujo (por ejemplo, datos de muestra y/o datos celulares como se describe con mayor detalle a continuación). En algunos casos, la mezcla de reacción se incuba a una temperatura que varía de 15°C a 50°C, tal como de 20°C a aproximadamente 45°C durante un período de tiempo que varía de aproximadamente 30 minutos a 72 horas, tal como de 1 hora a 24 horas, incluyendo de 1 hora a 3 horas. Después de la etapa de incubación anterior, la muestra se puede analizar inmediatamente o almacenarse para análisis en un momento posterior. Si se almacena, en algunas realizaciones la muestra se almacena a una temperatura reducida; por ejemplo, sobre hielo.
Cuando se desee, la mezcla de reacción resultante y las células marcadas de la muestra se pueden lavar, por ejemplo, para eliminar cualquier agente no unido y otros componentes de la muestra. El lavado se puede realizar empleando cualquier protocolo conveniente, por ejemplo, combinando la mezcla de reacción con un tampón de lavado adecuado y separando las células del fluido. Un protocolo de lavado dado puede incluir una o más etapas de lavado distintas, según se desee. Después de cualquier protocolo de lavado, las células marcadas se pueden resuspender en un líquido adecuado, por ejemplo, el tampón de lavado u otro tampón (por ejemplo, tampón de ejecución), para análisis posterior, por ejemplo, mediante análisis de citometría de flujo.
Después de la preparación de la muestra y/o la fijación de las células de la muestra, la muestra se puede procesar para obtener datos inmediatamente o puede que no se obtengan datos de la muestra durante un período de tiempo, por ejemplo, permitiendo el almacenamiento y/o transporte de la muestra. La duración del período de tiempo antes de que se procese una muestra sin efectos perjudiciales en la recopilación de datos dependerá de varios factores que incluyen, pero no se limitan a, la estabilidad general de la muestra, las condiciones de almacenamiento de la muestra, si se empleó el marcaje para preparar la muestra y, de ser así, qué marcadores particulares se emplearon para marcar las células de la muestra, y/o la preparación de la muestra en particular, incluidas las condiciones de fijación de las células, de la muestra. Por "sin efectos perjudiciales en la recopilación de datos" se entiende que no hay un efecto negativo significativo en ningún aspecto de los datos recopilados de la muestra, que incluyen, por ejemplo, datos de muestra y/o datos celulares, de manera que los datos obtenidos y/o una evaluación realizada de la muestra después un período de tiempo tras de la preparación es esencialmente igual a los datos o a la evaluación que se obtendrían inmediatamente después de la preparación. Por ejemplo, en algunos casos, el empleo de fijadores de células estables conserva las células y el marcaje celular de una muestra de modo que la muestra se puede procesar para la recopilación de datos muchos días después de la recogida y preparación de la muestra y los datos obtenidos son suficientes para evaluar las células y/o hacer una valoración. Las muestras marcadas que se se pueden procesar después de un período de tiempo incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, muestras marcadas con anticuerpos, muestras teñidas (por ejemplo, teñidas con ADN), muestras marcadas con ARNm, y similares. El período de tiempo durante el cual no hay efectos perjudiciales en la recopilación de datos variará dependiendo de varios factores discutidos anteriormente y puede variar de 8 horas a 10 días o más, que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, 12 horas o más, 1 día o más, 2 días o más, 3 días o más, 4 días o más, 5 días o más, 6 días o más, 7 días o más, 8 días o más, etc.
Agentes y marcadores
Se puede emplear una variedad de tipos diferentes de agentes aglutinantes específicos, donde el tipo particular de agente aglutinante se selecciona basándose, al menos en parte, en el tipo particular de molécula del marcador de interés. Los agentes de unión específicos de interés incluyen agentes de unión a anticuerpos, proteínas, péptidos, haptenos, ácidos nucleicos, etc. El término "agente de unión a anticuerpos" como se emplea en la presente memoria incluye anticuerpos policlonales o monoclonales o fragmentos que son suficientes para unirse a un analito de interés. Los fragmentos de anticuerpos pueden ser, por ejemplo, fragmentos Fab monoméricos, fragmentos Fab' monoméricos, o fragmentos F(ab) '2 diméricos También dentro del alcance del término "agente de unión de anticuerpos" están las moléculas producidas mediante modificación genética de anticuerpos, tales como las moléculas de anticuerpos de cadena única (scFv) o los anticuerpos humanizados o quiméricos producidos a partir de anticuerpos monoclonales mediante el reemplazo de las regiones constantes de las cadenas pesada y ligera para producir anticuerpos quiméricos o el reemplazo tanto de las regiones constantes como de las porciones marco de las regiones variables para producir anticuerpos humanizados. Los agentes de unión de ácidos nucleicos de interés son ácidos nucleicos que se unen específicamente o se hibridan específicamente con ácidos nucleicos de biomarcadores en una célula. La longitud de estos ácidos nucleicos puede variar, siempre que sea lo suficiente como para que el oligonucleótido sirva como un agente de unión específico, y en algunos casos varía de 13 a 100 nt, tal como de 14 a 50 nt, por ejemplo, de 15 a 25 nt, que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, 15 nt, 16 nt, 17 nt, 18 nt, 19 nt, 20 nt, 21 nt, 22 nt, 23 nt, 24 nt, y 25 nt. Los oligonucleótidos que componen estos agentes de unión a ácidos nucleicos pueden ser ADN o ARN, o un análogo sintético de los mismos, según se desee.
Como se describe anteriormente, un agente de unión específico puede servir por sí mismo como un marcador detectable o puede incluir un marcador detectable adherido o se puede unir mediante un marcador detectable permitiendo así la detección. Por lo tanto, además de un dominio de unión específico que se une específicamente o hibrida específicamente con el biomarcador de interés, el agente de unión específico puede incluir adicionalmente o se puede unir o adherir a un marcador detectable. Son de interés como marcadores detectables los tintes fluorescentes. Los tintes fluorescentes (fluoróforos) se pueden seleccionar de cualquiera de los muchos tintes adecuados para su uso en aplicaciones de obtención de imágenes (por ejemplo, microscopía fluorescente) y aplicaciones de citometría de flujo. Están disponibles comercialmente un gran número de tintes de una variedad de fuentes, tales como, por ejemplo, Molecular Probes (Eugene, OR) y Exciton (Dayton, OH). Ejemplos de fluoróforos de interés incluyen, pero no se limitan a, ácido 4-acetamido-4'-isotiocianatostilbeno-2,2'disulfónico; acridina y derivados, tales como acridina, naranja de acridina, amarillo de acridina, rojo de acridina, e isotiocianato de acridina; Ácido 5-(2'-aminoetil)aminonaftalen-1-sulfónico (EDANS); 4-amino-N-[3-vinilsulfonil)fenil]naftalimida-3,5 disulfonato (Lucifer Yellow VS); N-(4-anilino-1-naftil)maleimida; antranilamida; Amarillo brillante; cumarina y derivados, tales como cumarina, 7-amino-4-metilcumarina (AMC, Coumarin 120), 7-amino-4-trifluorometilculuarina (Coumarin 151); cianina y derivados, tales como cianosina, Cy3, Cy5, Cy5.5, y Cy7; 4',6-diaminidino-2-fenilindol (DAPI); 5',5"-dibromopirogalol-sulfoneftaleína (Rojo de bromopirogalol); 7-dietilamino-3-(4'-isotiocianatofenil)-4-metilcumarina; dietilaminocumarina; pentaacetato de dietilentriamina; ácido 4,4'-diisotiocianatodihidro-estilben-2,2'-disulfónico; ácido 4,4'-diisotiocianatostilben-2,2'-disulfónico; cloruro de 5-[dimetilamino]naftalen-1-sulfonilo (DNS, cloruro de dansilo); ácido 4-(4'-dimetilaminofenilazo) benzoico (DABCYL); 4-dimetilaminofenilazofenil-4'-isotiocianato (DABITC); eosina y derivados, tales como eosina e isotiocianato de eosina; eritrosina y derivados, tales como eritrosina B e isotiocianato de eritrosina; etidio; fluoresceína y derivados, tales como 5-carboxifluoresceína (FAM), 5-(4,6-diclorotriazin-2-il)aminofluoresceína (DTAF), 2'7'-dimetoxi-4'5'-dicloro-6-carboxifluoresceína (JOE), isotiocianato de fluoresceína (FITC), clorotriazinilo de fluoresceína, naftofluoresceína y QFITC (XRITC); fluorescamina; IR144; IR1446; proteína verde fluorescente (GFP); proteína fluorescente de coral de arrecife (RCFP); Lissamine™; Lisamina rodamina, amarillo Lucifer; Isotiocianato de verde de malaquita; 4-metilumbeliferona; orto cresolftaleína; nitrotirosina; pararosanilina; Rojo del Nilo; Verde Oregon; Rojo de fenol; B-ficoeritrina; o-ftaldialdehído; pireno y derivados, tales como pireno, pireno butirato y succinimidil 1-pireno butirato; Reactive Red 4 (Cibacron™ Brilliant Red 3B-A); rodamina y derivados, tales como 6-carboxi-X-rodamina (ROX), 6-carboxirodamina (R6G), 4,7-diclororrodamina lisamina, cloruro de sulfonilo rodamina B, rodamina (Rhod), rodamina B, rodamina 123, rodamina X isotiocianato, sulforrodamina B, sulforrodamina 101, derivado de cloruro de sulfonilo de sulforrodamina 101 (rojo Texas), N,N,N',N'-tetrametil-6-carboxirodamina (TAMRA), tetrametil rodamina e isotiocianato de tetrametil rodamina (TRITC); riboflavina; derivados de ácido rosólico y quelato de terbio; xanteno; o combinaciones de los mismos. También se pueden emplear otros fluoróforos o combinaciones de los mismos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, los disponibles en Molecular Probes (Eugene, OR) y Exciton (Dayton, OH).
También son de interés como miembros de unión específicos los tintes o tinciones de ácido nucleico que contienen fluorescencia intrínseca, incluidos los que marcan específicamente el ADN. Los tintes y tinciones que son específicos para el ADN (o que se unen preferentemente a polinucleótidos bicatenarios a diferencia de a los polinucleótidos monocatenarios) y, por lo tanto, que se pueden emplear como tintes no específicos incluyen, pero no se limitan a: Hoechst 33342 (2'-(4-Etoxifenil)-5-(4-metil-1-piperazinil)-1H,1'H-2,5'-bibenzimidazol trihidrocloruro) y Hoechst 33258 (4-[6-(4-Metil-1 -piperazinil)-1 ',3'-dihidro-1 H,2'H-2,5'-bibencimidazol-2'-iliden]-2,5-ciclohexadien-1 -ona trihidrocloruro) y otros de la serie Hoechst; SYTO 40, SYTO 11, 12, 13, 14, 15, 16, 20, 21, 22, 23, 24, 25 (verde); SYTO 17, 59 (rojo), DAPI, DRAQ5™ (un tinte de antraquinona con alta afinidad por el ADN bicatenario), YOYO-1, yoduro de propidio, YO-PRO-3, TO-PRO-3, YOYO-3 y TOTO-3, SYTOX Green, SYTOX, verde de metilo, homodímero de acridina, 7-aminoactinomicina D, 9-amino-6-cloro-2-metoxiactridina. Dependiendo de la tinción y el ensayo en particular, la tinción puede servir en la detección de ADN, detección de núcleos, cuantificación de ADN, cuantificación de núcleos, indicador del ciclo celular, indicador de proliferación celular, indicador de integridad del ADN, etc.
Cuando se emplean múltiples sondas distintas de biomarcadores marcadas, la marca de cada sonda distinta se puede elegir para proporcionar una señal distinguible. Por ejemplo, en las realizaciones en las que se emplean una primera y una segunda sondas distintas de biomarcadores marcadas, el marcador de la segunda sonda es un marcador fluorescente que produce una señal fluorescente que se distingue de la primera señal fluorescente del marcador de la primera sonda. Por consiguiente, la primera y la segunda señales fluorescentes producidas tras la excitación del primer y el segundo marcador fluorescente se pueden distinguir entre sí, lo que significa que ambas se pueden detectar al mismo tiempo y que la señal de una no modifica ni cambia la señal de la otra. Cada marcador distinto puede producir señales que se distinguen de cualquier otro marcador. Por ejemplo, las células se pueden teñir con un tercer marcador fluorescente que produce una tercera señal fluorescente que se distingue de la primera y segunda señales fluorescentes.
Los agentes de unión específicos que encuentran uso en la detección y/o medición de biomarcadores como se describe en la presente memoria incluyen, pero no se limitan a, agentes de unión específicos que se unen a inmunomarcadores, agentes de unión específicos que se unen al cáncer y/o biomarcadores de cáncer de mama, agentes de unión específicos que se unen biomarcadores de adhesión celular, agentes de unión específicos que se unen a biomarcadores del ciclo celular o de la proliferación celular, y similares.
Los inmunomarcadores, como se emplean en la presente memoria, se refieren a aquellos marcadores celulares (por ejemplo, marcadores de superficie celular y marcadores intracelulares) que se unen a componentes de células inmunes. Los inmunomarcadores incluyen, pero no se limitan a, aquellas moléculas de la superficie celular identificadas como antígenos o grupos de diferenciación (CD) que históricamente proporcionaron dianas para la inmunofenotipificación. Los antígenos CD y los inmunomarcadores en general se pueden expresar mediante uno o más tipos de células inmunes diferentes. Sin embargo, los antígenos CD e inmunomarcadores generalmente no se expresan exclusivamente en tipos de células inmunes y, en muchos casos, los inmunomarcadores también se pueden expresar en tipos de células no inmunes que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, células epiteliales. Los inmunomarcadores útiles en los métodos descritos en la presente memoria variarán dependiendo del ensayo particular y/o del tipo de célula particular y/o de la población celular a detectar. En algunos casos, los inmunomarcadores que encuentran uso en los métodos descritos en la presente memoria incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, CD44, CD45, y similares.
Los biomarcadores de cáncer de mama, como se emplean en la presente memoria, se refieren a aquellos marcadores celulares (por ejemplo, marcadores de superficie celular y marcadores intracelulares) que se unen a productos génicos (por ejemplo, ARNm, proteína, etc.) que se asocian con el cáncer y/o la progresión del cáncer y aquellos asociados específicamente con el cáncer de mama y la progresión del cáncer de mama (por ejemplo, incluyendo la progresión a metástasis de cáncer de mama). En algunos casos, los biomarcadores cancerosos y los biomarcadores de cáncer de mama que encuentran uso en los métodos descritos en la presente memoria pueden incluir, pero no se limitan a, por ejemplo, proteína receptora de estrógeno, transcripción del receptor de estrógeno, proteína del receptor de progesterona, transcripción del receptor de progesterona, receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2), transcrito de HER2, histona H2A.X fosforilada (p-H2A.X), caspasa 3 escindida, y similares. En otros casos, la evaluación de las células de una muestra puede incluir la detección y/o medición de biomarcadores de cáncer de mama que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, activador de plasminógeno de tipo uroquinasa de serina proteasa (uPA), inhibidor de uPA (PAI-1), antígeno de Thomsen-Friedenreich (TF), mamaglobina (h-MAM), osteopontina, miembros de la familia del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR) (que incluye, por ejemplo, FGFR2), homólogo de fosfatasa y tensina (PTEN), miembros de la familia de Sirtuins (SIRT), proteína de dedo de zinc Snail1, proteína 1 relacionada con la torsión (TWIST1), homeobox 1 de unión a la caja E de dedo de zinc (ZEB1), receptor de estrógeno alfa, receptor de estrógeno beta, p53, receptor tirosina-proteína quinasa erbB-2, y similares.
Los biomarcadores de adhesión celular, como se emplean en la presente memoria, se refieren a aquellos marcadores celulares (por ejemplo, marcadores de superficie celular y marcadores intracelulares) que se unen a componentes de la célula implicados en la adhesión celular, por ejemplo, adhesión de célula a célula, adhesión célula a ECM (matriz extracelular), etc. Dichos componentes de adhesión celular pueden tener o no funciones de señalización celular adicionales y se pueden asociar con la transición epitelio a mesénquima relacionada con la metástasis y/o la progresión del cáncer. Los biomarcadores de adhesión celular útiles en los métodos descritos en la presente memoria variarán dependiendo del ensayo particular y/o del tipo de célula particular y/o de la población celular a detectar. En algunos casos, los biomarcadores de adhesión celular que pueden encontrar uso en los métodos descritos en la presente memoria incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, proteína vimentina, transcrito de vimentina, proteína E-cadherina, transcrito E-cadherina, proteína metadherina (MTDH, LYRIC, AEG-1, etc.), transcripción de MTDH, y similares.
Los biomarcadores del ciclo celular, como se emplean en la presente memoria, se refieren a aquellos marcadores celulares (por ejemplo, marcadores de superficie celular y marcadores intracelulares) que se unen a componentes de la maquinaria del ciclo celular de la célula. Los biomarcadores del ciclo celular pueden ser útiles, en algunos casos, para recopilar datos celulares relacionados con la fase del ciclo celular o si una célula es o no proliferativa. Los biomarcadores del ciclo celular útiles en los métodos descritos en la presente memoria variarán dependiendo del ensayo particular y/o del tipo de célula particular y/o de la población celular a detectar. En algunos casos, los biomarcadores del ciclo celular que pueden encontrar uso en los métodos descritos en la presente memoria incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, Ki67, ciclina D1, ciclina E, y similares.
Los marcadores descritos anteriormente incluyen marcadores intracelulares. Como se emplea en la presente memoria, el término "marcadores intracelulares" se refiere a componentes de la célula que están dentro de la célula más allá de la superficie exterior de la membrana plasmática. Dichos componentes pueden ser o pueden estar dentro de cualquier componente interior de la célula que incluyen, pero no se limitan a, la superficie interna de la membrana plasmática, el citoplasma, el núcleo, las mitocondrias, el retículo endoplásmico, etc. Como tal, el marcaje o la detección de marcadores intracelulares requiere el transporte de un marcador específico o agente de unión específico del marcador intracelular a través de al menos la superficie exterior de la membrana plasmática. En algunos casos, un marcador o un agente de unión específico para un marcador intracelular puede ser permeable a la membrana, por lo tanto, no requiere la modulación de la permeabilidad de la membrana para el marcaje del marcador intracelular. En algunas realizaciones, un marcador o un agente de unión específico para un marcador intracelular puede ser impermeable a la membrana, por lo tanto, requiere la modulación de la permeabilidad de la membrana para el marcaje del marcador intracelular, que incluye, por ejemplo, la preparación o el tratamiento de las células con uno o más reactivos permeabilizantes como se describe en la presente memoria.
Los marcadores descritos anteriormente incluyen marcadores de superficie celular. Como se emplea en la presente memoria, el término "marcadores de superficie celular" se refiere a componentes de la célula que están al menos expuestos, parcial o completamente, en la superficie externa de la membrana plasmática de la célula y, por lo tanto, se puede acceder sin modular la permeabilidad celular, por ejemplo, sin el empleo de uno o más reactivos permeabilizantes como se describe en la presente memoria. En algunos casos, los marcadores de la superficie celular incluyen componentes de la célula que tienen una parte expuesta en la superficie exterior de la membrana celular, pero también contienen una parte intracelular y/o una parte transmembrana.
Como se describe en la presente memoria y como será fácilmente evidente para un experto en la técnica, en los métodos de evaluación celular descritos se puede emplear cualquier combinación de los agentes y marcadores descritos en la presente memoria siempre que la combinación sea apropiada y que los componentes no interfieran física u ópticamente. Por ejemplo, cuando se puedan y/o deban emplear alteraciones o sustituciones de marcadores particulares para permitir la combinación de dos o más componentes deseados, está dentro de la experiencia del experto en la materia. Como ejemplo no limitante, cuando un marcador fluorescente particular de un biomarcador interfiere ópticamente (por ejemplo, tiene un espectro de emisión superpuesto) con un agente de marcaje de ADN deseado de una longitud de onda de emisión particular, el marcador fluorescente del biomarcador se puede sustituir por otro marcador fluorescente diferente que no tiene o tiene menos espectros de emisión solapados con el agente de marcaje de ADN deseado.
Citometría de flujo
Como se resume anteriormente, los métodos de la invención incluyen el análisis citométrico de flujo de una muestra para obtener datos. La citometría de flujo es una metodología que emplea datos de múltiples parámetros para identificar y distinguir entre diferentes tipos de partículas (por ejemplo, células), es decir, partículas que varían entre sí en términos de marcaje (longitud de onda, intensidad), tamaño, etc., en un medio fluido. En el análisis citométrico de flujo de la muestra preparada como se describe anteriormente, se introduce primero una alícuota de la muestra en la trayectoria de flujo del citómetro de flujo. Cuando están en la trayectoria de flujo, las células de la muestra pasan sustancialmente de una en una a través de una o más regiones de detección, donde cada una de las células se expone por separado e individualmente a una fuente de luz en una sola longitud de onda (o en algunos casos a dos o más fuentes de luz distintas) y las mediciones de parámetros celulares, por ejemplo, parámetros de dispersión de luz, y/o parámetros de biomarcadores, por ejemplo, emisiones fluorescentes, según se desee, se registran por separado para cada célula. Los datos registrados para cada célula se analizan en tiempo real o se almacenan en un medio de almacenamiento y análisis de datos, tal como un ordenador, para su posterior análisis, según se desee.
Más específicamente, en un citómetro de flujo, las células pasan, en suspensión, sustancialmente de una en una en una trayectoria de flujo a través de una o más regiones de detección donde en cada región cada célula se ilumina por una fuente de energía. La fuente de energía puede incluir un iluminador que emite luz de una sola longitud de onda, tal como la proporcionada por un láser (por ejemplo, He/Ne o argón) o una lámpara de arco de mercurio con filtros apropiados. Por ejemplo, se puede emplear luz a 488 nm como longitud de onda de emisión en un citómetro de flujo que tiene una única región de detección. Para los citómetros de flujo que emiten luz en dos longitudes de onda distintas, se pueden emplear longitudes de onda adicionales de emisión de luz, donde las longitudes de onda específicas de interés incluyen, pero no se limitan a: 405 nm, 535 nm, 561 nm, 635 nm, 642 nm, y similares.
En serie con una región de detección, los detectores, por ejemplo, los colectores de luz, tales como los tubos fotomultiplicadores (o "PMT"), un fotodiodo de avalancha (APD), etc., se emplean para registrar la luz que pasa a través de cada célula (denominada generalmente como dispersión de luz hacia adelante), luz que se refleja ortogonal a la dirección del flujo de las células a través de la región de detección (generalmente denominada dispersión de luz ortogonal o lateral) y luz fluorescente emitida por las células, si está marcada con un marcador o marcadores fluorescentes, ya que las células pasan a través de la región de detección y se iluminan por la fuente de energía. Cada tipo de dato que se obtiene, por ejemplo, la dispersión de luz directa (o FSC), la dispersión de luz ortogonal (SSC), y las emisiones de fluorescencia (FL1, FL2, etc.), comprenden un parámetro separado para cada célula (o cada "evento").
Los citómetros de flujo pueden incluir además uno o más detectores eléctricos. En determinadas realizaciones, se puede emplear un detector eléctrico para detectar una perturbación causada por una partícula o una célula que pasa a través de un campo eléctrico propagado a través de una abertura en el camino de las partículas/células. Dichos citómetros de flujo que tienen detectores eléctricos contendrán una fuente emisora de energía eléctrica correspondiente que propaga un campo eléctrico a través de la trayectoria del flujo o una abertura a través de la cual se dirigen las células. Se puede emplear cualquier campo eléctrico conveniente y/o combinación de campos con detector o detectores apropiados para la detección y/o medición de partículas (o células) que pasan a través del campo, que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, un campo eléctrico de corriente continua, campo eléctrico de corriente alterna, un campo de radiofrecuencia, y similares.
Los citómetros de flujo incluyen además medios de adquisición, análisis y registro de datos, tales como un ordenador, en donde múltiples canales de datos registran datos de cada detector para cada célula a medida que pasa a través de la región de detección. El propósito del sistema de análisis es clasificar y contar celdas en donde cada célula se presenta como un conjunto de valores de parámetros digitalizados y acumular datos para la muestra como un todo. En las células de ensayo citométrico de flujo en los métodos de la presente divulgación, el citómetro de flujo se puede configurar para que se active en un parámetro seleccionado con el fin de distinguir las células de interés de las de referencia, el ruido y/o un límite preestablecido. "Activador" se refiere a un umbral preestablecido para la detección de un parámetro. Normalmente se emplea como un medio para detectar el paso de la célula a través del rayo láser o el campo eléctrico. La detección de un evento que excede el umbral para el parámetro seleccionado desencadena la adquisición de datos para las células, incluidos los datos de dispersión de luz y fluorescencia. No se adquieren datos de células u otros componentes en el medio que se está analizando y que causan una respuesta por debajo del umbral. En algunos casos, el parámetro de activación puede ser la detección de luz dispersa hacia adelante causada por el paso de una célula a través del haz de luz. A continuación, el citómetro de flujo detecta y recopila datos para la célula, incluidos datos de dispersión de luz, datos de fluorescencia, y similares.
Después, una subpoblación de interés particular se analiza más a fondo mediante "gating" en función de los datos recopilados para toda la población. Para seleccionar una puerta apropiada, los datos se grafican para obtener la separación apropiada de subpoblaciones, por ejemplo, ajustando la configuración del instrumento, que incluyen, por ejemplo, parámetros de excitación, parámetros de recolección, parámetros de compensación, etc. En algunos casos, este procedimiento se realiza trazando la dispersión de luz delantera (FSC) frente a la dispersión de luz lateral (es decir, ortogonal) (SSC) en un diagrama de puntos dimensional. El operador del citómetro de flujo selecciona después la subpoblación de células deseada (es decir, aquellas células dentro de la puerta) y excluye las células que no están dentro de la puerta. Cuando lo desee, el operador puede seleccionar la puerta trazando una línea alrededor de la subpoblación deseada empleando un cursor en la pantalla de un ordenador. Sólo aquellas células dentro de la puerta se analizan más a fondo trazando los otros parámetros para estas células, tal como la fluorescencia.
Se puede emplear cualquier citómetro de flujo que sea capaz de obtener tanto los datos de muestra como los datos celulares, por ejemplo, como se describe anteriormente, a partir de la misma alícuota de una muestra líquida. Ejemplos no limitantes de sistemas de citómetro de flujo de interés son los disponibles de proveedores comerciales que incluyen, pero no se limitan a, Becton-Dickenson (Franklin Lakes, NJ), Life Technologies (Grand Island, NY), Acea Biosciences (San Diego, CA), Beckman-Coulter, Inc. (Indianápolis, IN), Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA), Cytonome, Inc. (Boston, MA), Amnis Corporation (Seattle, WA), EMD Millipore (Billerica, MA), Sony Biotechnology, Inc. (San José, CA), Stratedigm Corporation (San José, CA), Union Biometrica, Inc. (Holliston, MA), Cytek Development (Fremont, CA), Propel Labs, Inc. (Fort Collins, CO), Orflow Technologies (Ketchum, ID), handyem inc. (Quebec, Canadá), Sysmex Corporation (Kobe, Japón), Partec Japan, Inc. (Tsuchiura, Japón), Bay bioscience (Kobe, Japón), Furukawa Electric Co. Ltd. (Tokio, Japón), On-chip Biotechnologies Co., Ltd (Tokio, Japón), Apogee Flow Systems Ltd. (Hertfordshire, Reino Unido), y similares.
En algunos casos, los métodos descritos en la presente memoria se pueden realizar empleando un sistema de citómetro de flujo que tiene un solo detector designado para la detección y adquisición de datos de cada componente de datos, por ejemplo, componente de datos celulares o componente de datos de muestra, empleado para evaluar la muestra, detección de un tipo de célula en particular, y/o realización de una evaluación de la muestra. Por ejemplo, en algunos casos, se puede realizar un método que utiliza dos marcadores fluorescentes empleando un sistema de citómetro de flujo que tiene un solo detector designado para la detección del primer marcador fluorescente y un segundo detector designado para la detección del segundo marcador.
En algunos casos, los métodos descritos en la presente memoria se pueden realizar empleando un sistema de citómetro de flujo que tiene un solo detector designado para la detección y adquisición de datos de múltiples componentes de datos, por ejemplo, componente o componentes de datos celulares o componente o componentes de datos de muestra o combinaciones de componentes de los mismos, empleado en la evaluación de la muestra, la detección de un tipo de célula particular, y/o la realización de una evaluación de la muestra. En algunos casos, dichos detectores configurados para la adquisición de múltiples componentes de datos (es decir, dos o más) se pueden emplear en la adquisición de datos secuenciales, lo que significa que los múltiples componentes de datos se adquieren de uno en uno en secuencia. En algunos casos, dichos detectores configurados para la adquisición de múltiples componentes de datos se pueden emplear en la adquisición de datos simultánea, lo que significa que los múltiples componentes de datos se adquieren al mismo tiempo de forma simultánea y los componentes de datos individuales se separan o analizan posteriormente (por ejemplo, ópticamente dentro del detector, eléctricamente dentro del detector, electrónicamente dentro de un módulo de procesamiento de señales). En algunos casos, un detector puede utilizar tanto la adquisición de datos secuencial como la adquisición de datos simultánea, dependiendo de la configuración del sistema de citometría de flujo y del análisis que se desee realizar. El sistema de citometría de flujo no se limita a detectores y detectores múltiples designados y puede incluir tanto detectores que están designados para la detección de datos de un solo componente como detectores que detectan múltiples componentes de datos.
A continuación se describen con más detalle las configuraciones, los componentes y las variaciones del sistema de citometría de flujo.
Evaluación de la muestra
Los aspectos de los métodos objeto de la divulgación incluyen evaluar una muestra de mama celular, por ejemplo, en forma de una muestra líquida de células de mama, mediante la obtención de datos en un citómetro de flujo. Como se describe en la presente memoria, diferentes componentes de datos, por ejemplo, datos de muestra y datos celulares, se pueden combinar en tal evaluación. En algunos casos, la evaluación tiene un mejor poder predictivo (es decir, puede respaldar una conclusión con más fuerza) que cualquiera de los componentes de datos individuales cuando se emplean en solitario.
Las evaluaciones se pueden realizar mediante cualquier medio conveniente o apropiado dependiendo de los datos obtenidos, el tipo de muestra celular, y/o el propósito de realizar la evaluación. Por ejemplo, en algunos casos, la evaluación de una muestra se realiza considerando los datos combinados obtenidos de la muestra. En algunos casos, una evaluación incluye la comparación de los datos combinados para uno o más controles o valores de referencia. En otros casos, se realiza una evaluación mediante la implementación de un algoritmo o árbol de decisión que hace referencia a los datos obtenidos. En otros casos, se realiza una evaluación mediante la implementación de pruebas estadísticas que hacen referencia a los datos obtenidos, que incluyen, por ejemplo, el ensayo de un modelo estadístico. Dependiendo de los datos particulares obtenidos y/o de los propósitos de realizar la evaluación, un ordenador puede implementar un algoritmo, un árbol de decisión o un ensayo estadístico, por ejemplo, empleando la función de procesamiento del ordenador para realizar etapas matemáticas que no podrían realizarse de forma fiable por una persona.
En algunos casos, los métodos descritos en la presente memoria pueden incluir la detección de un tipo de célula particular en la muestra y/o la identificación de un tipo de célula particular en la muestra. Por ejemplo, en algunos casos, los métodos incluyen determinar que la muestra celular analizada incluye células cancerosas (es decir, que se detectan células cancerosas en la muestra). En estas realizaciones, los métodos incluyen identificar la presencia de una o más células cancerosas en la muestra, donde la identificación se realiza en base a los datos obtenidos, por ejemplo, datos de muestra y/o datos celulares como se describe anteriormente.
En algunos casos, los métodos incluyen determinar que la muestra celular ensayada incluye células no cancerosas, donde la presencia de células no cancerosas es indicativa de cáncer en el sujeto. En estas realizaciones, los métodos incluyen identificar la presencia de (es decir, detectar) una o más células no cancerosas en la muestra, donde la identificación se realiza en base a los datos obtenidos, por ejemplo, datos de muestra y/o datos celulares como se describe anteriormente. En determinados casos, tales células no cancerosas que son indicativas de cáncer en el sujeto incluyen glóbulos blancos y/o una o más subpoblaciones particulares de glóbulos blancos.
En algunos casos, los métodos incluyen determinar que la muestra celular analizada incluye determinadas células cancerosas y/o determinadas células no cancerosas, donde la presencia de determinadas células cancerosas y/o determinadas células no cancerosas es indicativa de cáncer metastásico en el sujeto. En estas realizaciones, los métodos incluyen identificar la presencia de (es decir, detectar) una o más células cancerosas y/o una o más células no cancerosas en la muestra, donde la identificación se realiza en base a los datos obtenidos, por ejemplo, datos de la muestra y/o datos celulares como se describe anteriormente.
En algunos casos, las evaluaciones de los datos de muestra obtenidos se pueden basar en parámetros de los datos de muestra predeterminados. Los parámetros de datos de muestra predeterminados pueden ser valores de referencia (por ejemplo, valores de referencia proporcionados por comparación con los valores experimentales obtenidos) o los datos de muestra predeterminados se pueden definir por el usuario (por ejemplo, mediante la medición de un parámetro de datos de muestra de una muestra de control (por ejemplo, un control sano, un control canceroso, u otro control de referencia y combinaciones de los mismos). Los parámetros de los datos de muestra predeterminados se pueden proporcionar o definir por el usuario para cualquier dato de muestra, por ejemplo, incluidos los descritos en la presente memoria.
En algunos casos, los parámetros de los datos de muestra predeterminados pueden incluir parámetros de densidad celular de la muestra. Por ejemplo, en algunos casos, los datos de muestra obtenidos se pueden evaluar en comparación con una densidad celular de muestra predeterminada de una muestra sana conocida que varía de menos de 10.000 a 30.000 células por volumen de muestra analizada, por ejemplo, 300 pl de muestra analizada, o más que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, 10.000 células por 300 pl de muestra analizada, 15.000 células por 300 pl de muestra analizada, 20.000 células por 300 pl de muestra analizada, 25.000 células por 300 pl de muestra analizada, 30.000 células por 300 pl de muestra analizada, etc. En algunos casos, el parámetro de datos de densidad celular de la muestra predeterminada puede ser un umbral de densidad celular de la muestra indicativo de una muestra sana donde una densidad celular de la muestra en o por debajo del umbral indica una probabilidad de que la muestra sea un muestra sana. Por ejemplo, un umbral de densidad celular de la muestra indicativo de una muestra sana puede incluir, pero no se limitan a, una densidad celular de muestra de 80.000 células o menos por volumen de muestra analizada, por ejemplo, 300 pl de muestra analizada, que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, 80.000 células o menos por 300 pl de muestra analizada, 70.000 células o menos por 300 pl de muestra analizada, 60.000 células o menos por 300 pl de muestra analizada, 50.000 células o menos por 300 pl de muestra analizada, 40.000 células o menos por 300 pl de muestra analizada, 30.000 células o menos por 300 pl de muestra analizada, 20.000 células o menos por 300 pl de muestra analizada, etc.
En algunos casos, los datos de muestra obtenidos se pueden evaluar por comparación con una densidad celular de muestra predeterminada de una muestra de tumor conocida que varía de menos de 80.000 a 1.000.000 de células por volumen de muestra analizada, por ejemplo, 300 pl de muestra analizada, o más, que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, 80.000 células por 300 pl de muestra analizada, 90.000 células por 300 pl de muestra analizada, 100.000 células por 300 pl de muestra analizada, 110.000 células por 300 pl de muestra analizada, 120.000 células por 300 pl de muestra analizada muestra, 130.000 células por 300 pl de muestra analizada, 140.000 células por 300 pl de muestra analizada, 150.000 células por 300 pl de muestra analizada, 160.000 células por 300 pl de muestra analizada, 170.000 células por 300 pl de muestra analizada, 180.000 células por 300 pl de muestra analizada, 190.000 células por 300 pl de muestra analizada, 200.000 células por 300 pl de muestra analizada, etc. En algunos casos, el parámetro de datos de densidad celular de muestra predeterminada puede ser un indicativo del umbral de densidad celular de muestra de una muestra tumoral donde una densidad celular de la muestra en o por encima del umbral indica una probabilidad de que la muestra sea una muestra tumoral. Por ejemplo, un umbral de densidad celular de muestra indicativo de una muestra tumoral puede incluir, pero no se limitan a, una densidad celular de la muestra de 50.000 o más células por volumen de muestra analizada, por ejemplo, 300 pl de muestra analizada, que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, 50.000 células o más por 300 pl de muestra analizada, 60.000 células o más por 300 pl de muestra analizada, 70.000 células o más por 300 pl de muestra analizada, 80.000 células o más por 300 pl de muestra analizada, 90.000 células o más por 300 pl de muestra analizada, 95.000 células o más por 300 pl de muestra analizada, 100.000 células o más por 300 pl de muestra analizada, 105.000 células o más por 300 pl de muestra analizada, etc.
En algunos casos, los datos de la muestra obtenidos se pueden evaluar en comparación con una densidad celular de la muestra predeterminada donde dicha comparación proporciona una densidad celular relativa de la muestra. La densidad celular relativa de la muestra se puede determinar comparando la densidad celular medida de la muestra con una densidad celular medida de un control o valor de referencia, por ejemplo, un control o referencia sano conocido o un control o referencia tumoral conocido. Por ejemplo, la densidad celular relativa de la muestra determinada puede ser indicativa de una muestra tumoral cuando la densidad celular relativa de la muestra es mayor o igual a (>) 2 veces la densidad celular de la muestra de una referencia o control sanos, que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, > 2,1 veces, > 2,2 veces, > 2,3 veces, > 2,4 veces, > 2,5 veces, > 2,6 veces, > 2,7 veces, > 2,8 veces, > 2,9 veces, > 3,0 veces, > 3,1 veces, > 3,2 veces, > 3,3 veces, > 3,4 veces, > 3,5 veces, > 3,6 veces, > 3,7 veces, > 3,8 veces, > 3,9 veces, > 4,0 veces, > 4,1 veces, > 4,2 veces, > 4,3 veces, > 4,4 veces , > 4,5 veces, > 4,6 veces, > 4,7 veces, > 4,8 veces, > 4,9 veces, > 5,0 veces, > 5,1 veces, > 5,2 veces, > 5,3 veces, > 5,4 veces y > 5,5 veces la densidad celular de la muestra de referencia o control sanos.
En algunos casos, los datos de la muestra obtenidos se pueden evaluar por comparación con una densidad celular de la muestra predeterminada de una muestra de tumor metastásico conocido que varía de menos de 200.000 a 1.000.000 de células por volumen de muestra analizada, por ejemplo, 300 |ul de muestra analizada, o más, que incluyen, pero no se limitan a, 200.000 células por 300 |ul de muestra analizada, 250.000 células por 300 |ul de muestra analizada, 300.000 células por 300 |ul de muestra analizada, 450.000 células por 300 |ul de muestra analizada, 500.000 células por 300 |ul de muestra analizada, 550.000 células por 300 |ul de muestra analizada, 600.000 células por 300 |ul de muestra analizada, 650.000 células por 300 |ul de muestra analizada, 700.000 células por 300 |ul de muestra analizada, 750.000 células por 300 |ul de muestra analizada, 800.000 células por 300 |ul de muestra analizada, 850.000 células por 300 |ul de muestra analizada, 900.000 células por 300 |ul de muestra analizada, 950.000 células por 300 |ul de muestra analizada, 1.000.000 células por 300 |ul de muestra analizada, etc. En algunos casos, el parámetro de datos de densidad celular de la muestra predeterminado puede ser un umbral de densidad de células de la muestra indicativo de una muestra de tumor metastásico donde una densidad de células de muestra en o por encima del umbral indica una probabilidad de que la muestra sea una muestra de tumor metastásico. Por ejemplo, un umbral de densidad celular de la muestra indicativo de una muestra de tumor metastásico puede incluir, pero no se limitan a, una densidad celular de la muestra de 200.000 células o más por volumen de muestra analizada, por ejemplo, 300 |ul de muestra analizada, que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, 250.000 células o más por 300 |ul de muestra analizada, 300.000 células o más por 300 |ul de muestra analizada, 350.000 células o más por 300 |ul de muestra analizada, 400.000 células o más por 300 |ul de muestra analizada, 450.000 células o más por 300 |ul de muestra analizada, 500.000 células o más por 300 |ul de muestra analizada, 550.000 células o más por 300 |ul de muestra analizada, 600.000 células o más por 300 |ul de muestra analizada, 650.000 células o más por 300 |ul de muestra analizada , 700.000 células o más por 300 |ul de muestra analizada, 750.000 células o más por 300 |ul de muestra analizada, 800.000 células o más por 300 |ul de muestra analizada, 850.000 células o más por 300 |ul de muestra analizada, etc. En la comparación de la densidad celular de la muestra de las muestras, por ejemplo, con el fin de determinar si una muestra de tumor es una muestra de tumor metastásico, se puede emplear cualquier medición conveniente de la densidad celular de la muestra, que incluyen, pero no se limitan a, recuentos de células individuales, recuentos de células epiteliales, etc.
En algunos casos, los datos de la muestra obtenidos se pueden evaluar por comparación con una densidad celular de la muestra predeterminada donde dicha comparación proporciona una densidad celular relativa de la muestra. La densidad celular relativa de la muestra se puede determinar comparando la densidad celular medida de la muestra con una densidad celular medida de un control o valor de referencia, por ejemplo, un control o referencia de tumor conocido o un control o referencia de tumor metastásico conocido. Por ejemplo, la densidad celular relativa determinada de la muestra puede ser indicativa de una muestra de tumor metastásico cuando la densidad celular relativa de la muestra es mayor o igual a (>) 2 veces la densidad celular de la muestra de una muestra de referencia o control de tumor no metastásico., que incluyen, pero no se limitan a, > 2,5 veces, > 3,0 veces, > 3,5 veces, > 4,0 veces, > 4,5 veces, > 5,0 veces, > 5,5 veces, > 6,0 veces, > 6,5 veces, > 7,0 veces, > 7,5 veces, > 8,0 veces, > 8,5 veces, > 9,0 veces, > 9,5 veces, > 10,0 veces, > 10,5 veces, > 11,0 veces, > 11,5 veces, > 12,0 veces, > 12,5 veces, > 13,0 veces, > 13,5 veces, > 14,0 veces, > 14,5 veces, > 15,0 veces, > 15,5 veces, > 16,0 veces, > 16,5 veces, > 17.0 veces, > 17,5 veces, > 18,0 veces, > 18,5 veces, > 19,0 veces, > 19,5 veces, > 20,0 veces, > 20,5 veces y > 21.0 veces la densidad celular de la muestra de una muestra de referencia o control de tumor no metastásico.
En algunos casos, las evaluaciones de los datos celulares obtenidos se pueden basar en parámetros de datos celulares predeterminados. Los parámetros de datos celulares predeterminados pueden ser valores de referencia (por ejemplo, valores de referencia proporcionados para la comparación con los valores experimentales obtenidos) o los datos celulares predeterminados se pueden definir por el usuario (por ejemplo, midiendo un parámetro de datos celulares de las células de una muestra control) (por ejemplo, un control sano, un control canceroso, u otro control de referencia y combinaciones de los mismos) o una subpoblación de control de la muestra (por ejemplo, una subpoblación cerrada). Los parámetros de datos celulares predeterminados se pueden proporcionar o definir por el usuario para cualquier dato celular, por ejemplo, incluidos los descritos en la presente memoria.
En algunos casos, los parámetros de datos celulares predeterminados pueden incluir parámetros de contenido de ADN por célula, por ejemplo, parámetros de contenido de ADN celular epitelial por célula. Por ejemplo, en algunos casos, los datos celulares obtenidos se pueden evaluar en comparación con un parámetro de contenido de ADN por célula predeterminado calculado u obtenido previamente para una célula epitelial normal o un tipo de célula no epitelial normal de la muestra, que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, un glóbulo blanco de la muestra. Como tal, en algunos casos, el contenido de ADN medido, por ejemplo, el contenido medio de ADN de las células de la muestra o una subpoblación de células de la muestra (por ejemplo, las células epiteliales de la muestra), se puede comparar con el parámetro de contenido de ADN celular predeterminado para llegar a un valor relativo del contenido de ADN por célula para las células sujeto o subpoblación de células sujeto. En algunos casos, un valor relativo del contenido de ADN por célula para las células de la muestra, o una subpoblación de las mismas, puede estar por encima de un umbral particular que indica que la muestra tiene una mayor probabilidad de ser una muestra tumoral. Por ejemplo, un contenido de ADN relativo mayor o igual a un valor umbral de contenido de ADN para una célula normal puede indicar que la muestra tiene una mayor probabilidad de ser una muestra tumoral donde el umbral puede ser mayor o igual a (>) 1,05 veces el contenido de ADN de una célula normal que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, > 1,06 veces, > 1,07 veces, > 1,08 veces, > 1,09 veces, > 1,10 veces, > 1,11 veces, > 1,12 veces y > 1,13 veces el contenido de ADN de una célula normal.
En algunos casos, los datos celulares obtenidos se pueden evaluar en comparación con un parámetro de contenido de ADN por célula predeterminado calculado u obtenido previamente para una célula tumoral de la muestra. Como tal, en algunos casos, el contenido de ADN medido, por ejemplo, el contenido medio de ADN de las células de la muestra o una subpoblación de células de la muestra (por ejemplo, las células epiteliales de la muestra), se puede comparar con un parámetro de contenido de ADN por célula predeterminado de las células tumorales para llegar a un valor relativo del contenido de ADN por célula para las células sujeto o subpoblación de células sujeto que es relativo a las células tumorales, por ejemplo, células tumorales no metastásicas o células tumorales metastásicas. En algunos casos, un valor relativo del contenido de ADN por célula para las células de la muestra, o subpoblación de las mismas, puede estar por encima de un umbral particular que indica que la muestra tiene una mayor probabilidad de ser una muestra de tumor metastásico. Por ejemplo, un contenido relativo de ADN mayor o igual a un valor umbral de contenido de ADN para una célula tumoral no metastásica puede indicar que la muestra tiene una mayor probabilidad de ser una muestra de tumor metastásico donde el umbral puede ser mayor o igual a (>) 1,05 veces el contenido de ADN de una célula tumoral no metastásica que incluyen, pero no se limitan a, > 1,06 veces, > 1,07 veces, > 1,08 veces, > 1,09 veces, > 1,10 veces, > 1,11 veces, > 1,12 veces, > 1,13 veces, > 1,14 veces, y > 1,15 veces el contenido de ADN de una célula tumoral no metastásica.
En algunos casos, los parámetros de datos celulares predeterminados pueden incluir parámetros de proliferación celular, por ejemplo, parámetros de proliferación de células epiteliales. Por ejemplo, en algunos casos, los datos celulares obtenidos se pueden evaluar en comparación a un porcentaje de proliferación celular predeterminado para una muestra sana donde el porcentaje de proliferación se puede expresar como el porcentaje de células, por ejemplo, células epiteliales, en una fase particular del ciclo celular (por ejemplo, G1, S, G2 , M, etc.) o fases del ciclo celular distintas de la fase G1 del ciclo celular (por ejemplo, "post-Gr). En algunos casos, el parámetro de proliferación de células epiteliales para las células epiteliales de una muestra sana será del 15% o menos (por ejemplo, donde el 15% de las células están en fase post-G1 y el 85% de las células están en fase G1) que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, 14% o menos, 13% o menos, 12% o menos, 11% o menos, 10% o menos, 9,5% o menos, 9,0% o menos, 8,5% o menos, 8,0% o menos y 7,5% o menos. En algunos casos, el parámetro de proliferación de células epiteliales para las células epiteliales de una muestra tumoral será del 20% o más (por ejemplo., donde el 20% de las células están en fase post-G1 y el 80% de las células están en G1 fase) que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, 20,5% o más, 21,0% o más, 21,5% o más, 22,0% o más, 22,5% o más, 23,0% o más, 23,5% o más y 24,0% o más. En algunos casos, un porcentaje de proliferación relativo mayor o igual a un porcentaje de proliferación umbral predeterminado para una muestra sana puede indicar que la muestra del sujeto tiene una mayor probabilidad de ser una muestra tumoral donde el umbral puede ser mayor o igual a (>) 1,1 veces el porcentaje de proliferación de la muestra sana, que incluyen, pero no se limitan a, > 1,2 veces, > 1,3 veces, > 1,4 veces, > 1,5 veces, > 1,6 veces, > 1,7 veces, > 1,8 veces, > 1,9 veces , > 2,0 veces, > 2,1 veces, > 2,2 veces, > 2,3 veces, > 2,4 veces, > 2,5 veces, > 2,6 veces, > 2,7 veces y > 2,8 veces el porcentaje de proliferación de la muestra sana.
En algunos casos, los parámetros de datos celulares predeterminados pueden incluir parámetros de expresión de biomarcadores por célula, por ejemplo, parámetros de expresión de biomarcadores epiteliales por célula. Por ejemplo, en algunos casos, los datos celulares obtenidos se pueden evaluar en comparación con un valor de expresión de biomarcador epitelial por célula predeterminado transmitido como intensidad de fluorescencia media o intensidad de fluorescencia media promedio. Por ejemplo, en algunos casos, los datos de expresión de biomarcadores obtenidos se pueden evaluar en comparación con un parámetro de expresión del biomarcador por célula predeterminado calculado u obtenido previamente para células epiteliales de una muestra de tumor no metastásico que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, la intensidad de fluorescencia media (MFI) de la sonda del biomarcador Her2 para las células epiteliales de una muestra de tumor no metastásico. Como tal, en algunos casos, la MFI Her2 medida, por ejemplo, la MFI Her2 media de las células de la muestra o una subpoblación de células de la muestra (por ejemplo, las células epiteliales de la muestra), se puede comparar con el parámetro de MFI de Her2 por célula predeterminado para llegar a un valor de MFI de Her2 relativo por célula para las células del sujeto o la subpoblación de células del sujeto. En algunos casos, un valor relativo de MFI de Her2 por célula para las células de la muestra, o una subpoblación de las mismas, puede estar por encima de un umbral particular que indica que la muestra tiene una mayor probabilidad de ser una muestra de tumor metastásico. Por ejemplo, un valor relativo de MFI de Her2 mayor o igual a un valor umbral de MFI de Her2 para una muestra de tumor no metastásico puede indicar que la muestra tiene una mayor probabilidad de ser una muestra de tumor metastásico donde el umbral puede ser mayor o igual a (>) 1,50 veces el MFI de Her2 de la muestra de tumor no metastásico, que incluyen, pero no se limitan a, > 1,75 veces, > 2,0 veces, > 2,1 veces, > 2,2 veces, > 2,3 veces, > 2,4 veces, > 2,5 veces, > 2,6 veces y > 2,7 veces el MFI de Her2 de la muestra de tumor no metastásico.
En algunos casos, los parámetros de datos celulares predeterminados pueden incluir parámetros de volumen celular por célula, por ejemplo, parámetros de volumen celular por célula epitelial. Por ejemplo, en algunos casos, los datos celulares obtenidos se pueden evaluar en comparación con un volumen celular por célula epitelial predeterminado expresado como volumen corpuscular medio (VCM) o VCM promedio. Por ejemplo, en algunos casos, los datos de volumen celular obtenidos se pueden evaluar en comparación con un parámetro de volumen celular por célula predeterminado calculado u obtenido previamente para las células epiteliales de una muestra sana, que incluye, pero no se limita a, por ejemplo, el VCM medio para el células epiteliales de una muestra sana. Como tal, en algunos casos, los volúmenes celulares medidos de la muestra se pueden comparar con el parámetro de volumen celular predeterminado para llegar a un valor de volumen celular relativo para las células sujeto o subpoblación de células sujeto. En algunos casos, un valor de volumen celular relativo para las células de la muestra, o una subpoblación de las mismas, puede estar por encima de un umbral particular que indica que la muestra tiene una mayor probabilidad de ser una muestra tumoral. Por ejemplo, un valor de volumen celular relativo mayor o igual a un parámetro de volumen celular umbral para una muestra sana puede indicar que la muestra tiene una mayor probabilidad de ser una muestra tumoral donde el umbral puede ser mayor o igual a (>) 1,50 veces el parámetro de volumen celular para una muestra sana, que incluyen, pero no se limitan a, > 1,55 veces, > 1,60 veces, > 1,65 veces, > 1,70 veces, > 1,75 veces, > 1,80 veces y > 1,85 veces el parámetro de volumen celular para un muestra sana.
En algunos casos, un valor de volumen celular relativo para las células de la muestra, o una subpoblación de las mismas, puede estar por encima de un umbral particular que indica que la muestra tiene una mayor probabilidad de ser una muestra de tumor metastásico. Por ejemplo, un valor de volumen celular relativo menor o igual a un parámetro de volumen celular umbral para una muestra de tumor no metastásico puede indicar que la muestra tiene una mayor probabilidad de ser una muestra de tumor metastásico donde el umbral puede ser menor o igual a (<) 0,75 veces el parámetro de volumen celular para una muestra de tumor no metastásico que incluyen, pero no se limitan a, < 0,70 veces, < 0,65 veces, < 0,60 veces, < 0,55 veces y < 0,50 veces el parámetro de volumen celular para una muestra de tumor no metastásico
En algunos casos, los parámetros de datos celulares predeterminados pueden incluir parámetros de glóbulos blancos, por ejemplo, parámetros de señal de biomarcador de referencia de glóbulos blancos, parámetros de proliferación de glóbulos blancos, etc. Por ejemplo, en algunos casos, los datos celulares de glóbulos blancos obtenidos se pueden evaluar en comparación con una señal de biomarcador de referencia predeterminado, por ejemplo, señal de biomarcador de ER de referencia en glóbulos blancos, señal de biomarcador de PR de referencia en glóbulos blancos, señal de biomarcador de combinación de referencia o ER/PR en glóbulos blancos, etc., donde la señal de biomarcador de referencia predeterminada puede ser la fluorescencia media del biomarcador o la fluorescencia promedio del biomarcador en los glóbulos blancos o en una subpoblación de glóbulos blancos. En algunos casos, una señal de biomarcador de referencia de glóbulos blancos relativa en una muestra menor o igual a un umbral predeterminado de la señal de biomarcador de referencia de glóbulos blancos para una muestra sana puede indicar que la muestra del sujeto tiene una mayor probabilidad de ser una muestra tumoral donde el umbral puede ser menor o igual a (<) 0,95 veces la señal del biomarcador de referencia de glóbulos blancos de la muestra sana, que incluyen, pero no se limitan a, < 0,94 veces, < 0,93 veces, < 0,92 veces, < 0,91 veces, < 0,90 veces, < 0,89 veces, < 0,88 veces, < 0,87 veces, < 0,86 veces, < 0,85 veces, < 0,84 veces, < 0,83 veces, < 0,82 veces, < 0,81 veces y < 0,80 veces la señal del biomarcador de referencia de glóbulos blancos de la muestra sana.
En algunos casos, los datos de la muestra de glóbulos blancos obtenidos se pueden evaluar en comparación con un parámetro de muestra de glóbulos blancos predeterminado. Por ejemplo, en algunos casos, los datos obtenidos de la muestra de glóbulos blancos, por ejemplo, el porcentaje de glóbulos blancos en la muestra, se pueden evaluar en comparación con un parámetro de muestra de glóbulos blancos predeterminado, por ejemplo, el porcentaje de glóbulos blancos en la muestra. En algunos casos, el parámetro de muestra de porcentaje de glóbulos blancos para una muestra de tumor no metastásico será del 17% o más, que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, 18% o más, 19% o más, 20% o más, 21% o más, 22% o más y 23% o más. En algunos casos, el parámetro de muestra de porcentaje de glóbulos blancos para una muestra de tumor metastásico será del 15% o menos, que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, 14% o menos, 13% o menos, 12% o menos, 11% o menos, 10% o menos y 9% o menos. En algunos casos, un porcentaje relativo de glóbulos blancos en la muestra menor o igual a un porcentaje umbral predeterminado de glóbulos blancos para una muestra de tumor no metastásico puede indicar que la muestra del sujeto tiene una mayor probabilidad de ser una muestra de tumor metastásico donde el umbral puede ser menor o igual a (<) 0,70 veces el porcentaje de glóbulos blancos de la muestra de tumor no metastásico, que incluyen, pero no se limitan a, < 0,65 veces, < 0,60 veces, < 0,55 veces, < 0,50 veces, < 0,45 veces y < 0,40 veces el porcentaje de glóbulos blancos de la muestra de tumor no metastásico.
Los parámetros útiles para evaluar los datos obtenidos no se limitan a los descritos de forma específica anteriormente. Los parámetros útiles para cualquier tipo de datos, incluidos los datos de muestra y los datos celulares como se describe en la presente memoria, para realizar evaluaciones de muestras celulares de mama se pueden determinar fácilmente según los métodos descritos, que incluyen, pero no se limitan a, el ensayo citométrico de flujo de muestras de control, por ejemplo, muestras sanas control y/o muestras tumorales control, para los datos particulares. En algunos casos, los parámetros de datos útiles se pueden determinar realizando un análisis estadístico de los datos adquiridos, que incluyen, pero no se limitan a, los métodos de ensayo estadístico descritos en la presente memoria. En algunos casos, los parámetros de datos útiles se pueden determinar realizando un análisis estadístico de dos o más tipos de datos adquiridos, que incluyen, pero no se limitan a, análisis estadísticos multivariados y modelos estadísticos multivariados.
Las combinaciones de parámetros útiles se pueden determinar evaluando un conjunto de muestras de entrenamiento conocido (por ejemplo, un conjunto de muestras de entrenamiento que contiene muestras sanas conocidas y muestras de cáncer conocidas) o datos de muestra (por ejemplo, un conjunto de datos de entrenamiento de muestras sanas conocidas y muestras de cáncer conocidas) para construir un modelo estadístico multiparamétrico capaz de clasificar una muestra como cancerosa o no cancerosa. En algunos casos, el modelo se puede construir en base a un número deseado de parámetros. El número de parámetros en un modelo multiparamétrico variará dependiendo de si el modelo está restringido a un número predeterminado o deseado de parámetros o si el número de parámetros dentro del modelo no está restringido y se permite que varíe para determinar el mejor conjunto de parámetros o el más eficiente.. El número de parámetros en un modelo multiparamétrico variará y puede oscilar de 2 a 20 o más, que incluyen, pero no se limitan a, de 2 a 20, 2 a 15, 2 a 14, 2 a 13, 2 a 12, 2 a 11, 2 a 10, 2 a 9, 2 a 8, 2 a 7, 2 a 6, 2 a 5, 2 a 4, 3 a 20, 3 a 15, 3 a 14, 3 a 13, 3 a 12, 3 a 11, 3 a 10, 3 a 9, 3 a 8, 3 a 7, 3 a 6, 3 a 5, 4 a 20, 4 a 15, 4 a 14, 4 a 13, 4 a 12, 4 a 11,4 a 10, 4 a 9, 4 a 8, 4 a 7, 4 a 6, 5 a 20, 5 a 15, 5 a 14, 5 a 13, 5 a 12, 5 a 11, 5 a 10, 5 a 9, 5 a 8, 5 a 7, 10 a 20, 15 a 20, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, etc.
En algunos casos, los parámetros de un modelo multiparamétrico se pueden determinar en función de la introducción de un conjunto de datos de entrenamiento en un modelo de regresión lineal y la determinación del conjunto o conjuntos de parámetros capaces de clasificar las muestras como cancerosas o no cancerosas con una especificidad y/o sensibilidad deseada. El nivel de sensibilidad y/o especificidad deseado variará y puede oscilar entre, por ejemplo, al menos el 80% o más, que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, etc. En algunos casos, tanto la sensibilidad como la especificidad son al menos del 80%, que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, etc. La sensibilidad y/o especificidad de un modelo multiparamétrico se puede ensayar en muestras conocidas para confirmar o verificar la sensibilidad y/o especificidad del modelo en muestras y/o datos diferentes del conjunto de entrenamiento a partir del cual se desarrolló.
Valoraciones
Como se ha resumido anteriormente, los aspectos de la presente divulgación están dirigidos a realizar una evaluación de una muestra celular de mama de un sujeto en base a la evaluación de los datos obtenidos de la muestra. Los términos "sujeto", "individuo" y "paciente" se emplean indistintamente en la presente memoria y se refieren a cualquier sujeto mamífero para el que se desea diagnóstico, tratamiento o terapia y, en algunos casos, incluye seres humanos.
En algunos casos, la valoración incluye evaluar la presencia de una enfermedad neoplásica en un sujeto, es decir, un juicio o valoración de si un sujeto padece o no una enfermedad neoplásica. Como se emplea en la presente memoria, el término "enfermedad neoplásica" se refiere a enfermedades y afecciones caracterizadas por un crecimiento anormal de tejido, que incluye el cáncer. En aspectos de la presente divulgación, las evaluaciones de enfermedades neoplásicas incluyen evaluaciones de cáncer de mama donde el término "cáncer de mama" como se emplea en la presente memoria generalmente incluye enfermedades neoplásicas del tejido mamario que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, precánceres, cánceres in situ, cánceres invasivos, carcinomas, sarcomas, adenocarcinomas, carcinoma ductal, carcinoma ductal in situ, carcinoma ductal invasivo, carcinoma lobulillar, carcinoma lobulillar invasivo, cáncer de mama inflamatorio, enfermedad de Paget, tumor filoides, angiosarcoma, carcinoma quístico adenoide, carcinoma adenoescamoso de bajo grado, carcinoma medular, carcinoma mucinoso (o coloide), carcinoma papilar, carcinoma tubular, carcinoma metaplásico, carcinoma micropapilar, carcinoma mixto (por ejemplo, que tiene características tanto ductales como lobulares invasivas), y similares.
En algunos casos, el individuo tiene una cantidad de neoplasia de mama insignificante clínicamente o no padece cáncer de mama. Por ejemplo, las evaluaciones de la presente divulgación encuentran uso en el control de la neoplasia de mama de individuos que no tienen un mayor riesgo de desarrollar neoplasia de mama o cáncer de mama, por ejemplo, individuos sanos o individuos que no han tenido previamente un ensayo de cribado de cáncer de mama positiva, es decir, una prueba de detección de cáncer de mama que indica la presencia de una neoplasia de mama.
En algunos casos, el individuo tiene una cantidad de neoplasia de mama significativa clínicamente, es decir, una cantidad de neoplasia de mama superior a la media en comparación con un individuo sano, por ejemplo, debido a cualquier síndrome o causa que aumente la formación de cáncer de mama. Por ejemplo, las valoraciones de la presente divulgación encuentran uso en el control del cáncer de mama de individuos con tasas aumentadas de cáncer de mama, por ejemplo, las evaluaciones se pueden emplear para la vigilancia del cáncer de mama en individuos con cáncer de mama.
En algunos casos, el individuo tiene un mayor riesgo de desarrollar cáncer de mama. Estas personas pueden tener un mayor riesgo de cáncer de mama debido a la presencia de cualquier factor de riesgo conocido, por ejemplo, antecedentes médicos familiares o un ensayo de cribado positivo (por ejemplo, que incluyen las pruebas genéticas de cáncer de mama) o la presencia previa de cáncer de mama o extirpación o tratamiento previos de cáncer de mama. Otros factores que aumentan el riesgo de cáncer de mama incluyen, pero no se limitan a, el sexo femenino, el aumento de la edad (por ejemplo, más de 45 años, más de 55 años, etc.), la presencia de una mutación genética en un gen relacionado con el cáncer de mama (por ejemplo, mutación en BRCA1, mutación en BRCA2, mutación en ATM, mutación en TP53, mutación en CHEK2, mutación en PTEN, mutación en CDH1, mutación en STK11, mutación en PALB2, etc.), presencia de mutación genética en un gen relacionado con el cáncer, antecedentes familiares de cáncer de mama, antecedentes personales de cáncer de mama, raza caucásica, raza afroamericana, alta densidad del tejido mamario (por ejemplo, alta proporción de tejido glandular y/o de tejido fibroso con respecto al tejido graso), estado postmenopáusico, terapia hormonal menopáusica, presencia de lesiones no proliferativas (por ejemplo, fibrosis, quistes, hiperplasia leve, adenosis no esclerosante, ectasia ductal, tumor filoides benigno, papiloma único, necrosis grasa, fibrosis periductal, metaplasia escamosa, metaplasia apocrina, calcificaciones relacionadas con el epitelio, lipoma, hamartoma, hemangioma, neurofibroma, adenomioepitelioma, etc.), lesiones proliferativas sin atipia (por ejemplo, hiperplasia ductal, fibroadenoma, adenosis esclerosante, papilomatosis, cicatriz radial, etc.), lesiones proliferativas con atipia (por ejemplo, hiperplasia ductal atípica) (ADH), hiperplasia lobulillar atípica (ALH), etc.), presencia de carcinoma lobulillar in situ, mayor exposición a estrógenos y progesterona durante toda la vida (por ejemplo, inicio temprano de la menstruación, inicio tardío de la menopausia, etc.), mayor exposición torácica a radiación (por ejemplo, radioterapia en el área del pecho, etc.), mayor exposición al dietilestilbestrol, tener hijos, tener hijos después de los 30 años, tomar anticonceptivos orales, beber alcohol, tener sobrepeso, obesidad, etc.
En determinados casos, se indica un mayor control del cáncer de mama en un individuo, según los métodos descritos en la presente memoria, cuando el individuo tiene un único factor de riesgo de cáncer de mama. En determinados casos, se indica un mayor control del cáncer de mama en un individuo, según los métodos descritos en la presente memoria, cuando el individuo tiene múltiples factores de riesgo de cáncer de mama, por ejemplo, más de uno, por ejemplo, aproximadamente de 2 a 5, por ejemplo, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, o aproximadamente 5. En determinados casos, se indica un mayor control del cáncer de mama en un individuo, según los métodos descritos en la presente memoria, cuando el individuo tiene un riesgo relativo único o combinado, calculado mediante cualquier método conveniente para calcular el riesgo relativo a partir de un único factor de riesgo o múltiples factores de riesgo, igual o mayor a aproximadamente 1,1, por ejemplo, de aproximadamente 1,1 a aproximadamente 1,4, de aproximadamente 1,3 a aproximadamente 2,0, mayor de aproximadamente 2,0, mayor de aproximadamente 2,5, mayor de aproximadamente 3, mayor de aproximadamente 4, mayor de aproximadamente 5, mayor de aproximadamente 7,5, mayor de aproximadamente 10, mayor de aproximadamente 15, mayor de aproximadamente 20, y similares, opcionalmente con un máximo de aproximadamente 200. El riesgo relativo para factores de riesgo únicos particulares o factores de riesgo múltiples en el cáncer de mama puede, en algunos casos, incluir los descritos en, por ejemplo, Singletary, S.E. (2003) Ann Surg. 237(4):474-482.
Por mayor control se entiende una mayor detección a una frecuencia mayor que la recomendada para individuos sanos comparables (por ejemplo, de la misma edad, mismo género, misma raza, etc.). En determinadas realizaciones, se puede realizar un mayor control a más de aproximadamente 1,5 a 5 veces la frecuencia de detección del cáncer de mama recomendada para individuos sanos comparables donde no está indicado un mayor control, por ejemplo, aproximadamente 1,5 a 2 veces la frecuencia normal, de aproximadamente 2 a 3 veces la frecuencia normal, de aproximadamente 3 a 4 veces la frecuencia normal, o aproximadamente de 4 a 5 veces la frecuencia normal. En determinados casos, las llamadas de control aumentan a evaluaciones trienales, bienales, anuales, semestrales, trianuales o trimestrales.
En algunos casos, el control se puede realizar en sujetos que se sabe que tienen una neoplasia de mama, por ejemplo, para evaluar la malignidad de la neoplasia de mama de un sujeto, por ejemplo, para determinar si el sujeto tiene cáncer de mama metastásico. Se puede realizar un mayor control, como se describió anteriormente, en sujetos con mayor riesgo de desarrollar cáncer de mama metastásico. En algunos casos, el control de la malignidad de la neoplasia mamaria de un sujeto se puede iniciar después de la identificación y/o detección de una neoplasia mamaria en un sujeto y continuar durante un período de tiempo que varía de 6 meses o más que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 1 año, 2 años, 3 años, 4 años, 5 años, 6 años, 7 años, 8 años, 9 años, 10 años, 11 años, 12 años, 13 años, 14 años, 15 años, etc, y/o indefinidamente. La frecuencia de las evaluaciones de control de malignidad para un sujeto en particular variará dependiendo de la neoplasia de mama particular presente en el sujeto, que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, un control trienal, bienal, anual, semestral, trianual, o trimestral, etc.
En algunos casos, una evaluación como se describe en la presente memoria incluye tanto una evaluación de la presencia de una neoplasia de mama como una evaluación de la malignidad de una neoplasia de mama detectada. Por ejemplo, los datos obtenidos de una sola muestra celular obtenida de un sujeto se pueden evaluar según el método que se describe en la presente memoria y, a partir de la evaluación, se puede hacer una valoración para determinar si el sujeto tiene una neoplasia de mama y, de ser así, si la neoplasia de mama es metastásica o no. En otros casos, una evaluación de la neoplasia mamaria realizada a partir de una primera muestra del paciente que indica la presencia de una neoplasia mamaria puede indicar la necesidad de obtener una o más muestras adicionales del sujeto para realizar otras pruebas, por ejemplo, pruebas de malignidad, pruebas de confirmación, etc.
En algunos casos, una evaluación como se describe en la presente memoria puede incluir una comparación o correlación con sistemas de clasificación citológicos basados en portaobjetos conocidos para el carcinoma de mama, que incluyen, pero no se limitan a, los de Fisher, Mouriquand, Robinson, Howell, Khan, Taniguchi, etc. Tales sistemas hacen uso generalmente del frotis FNA teñido con Papanicolaou (Pap) y hacen uso de características celulares, características nucleares, y se han descrito, por ejemplo, en Saha et al. (2013) J. Cytol. 30(2):87-93. En algunos casos, una evaluación como se describe en la presente memoria puede incluir una comparación o correlación con sistemas de clasificación histológicos basados en portaobjetos conocidos para el carcinoma de mama, que incluyen, pero no se limitan a, el sistema Scarff-Bloom-Richardson, el grado histológico de Nottingham (NHG), y similares.
En algunos casos, los métodos incluyen además realizar un análisis adicional de un sujeto si los métodos dan como resultado una evaluación (por ejemplo, juicio o valoración (tal como en forma de una predicción)) de una neoplasia de mama en el sujeto o una evaluación de metástasis de cáncer de mama en el sujeto. Por ejemplo, cuando los métodos de la invención dan como resultado una evaluación de una neoplasia de mama en un sujeto o cáncer de mama metastásico en el sujeto, los métodos pueden incluir además proporcionar una recomendación a un sujeto de que se tomen medidas adicionales, por ejemplo, en forma de otros procedimientos de diagnóstico, tales como una biopsia o una biopsia adicional. En algunos casos, los métodos incluyen realizar más acciones de diagnóstico. La acción de diagnóstico adicional puede incluir, pero no se limita a, una biopsia central o una biopsia quirúrgica, como se describe en la presente memoria. Si la biopsia indica que puede haber cáncer o lesiones precancerosas o cáncer de mama metastásico en el sujeto, se pueden realizar más procedimientos de diagnóstico y tratamiento, tales como una mastectomía parcial o total, en la que se extrae una parte o toda la mama y se puede examinar o no además de manera patológica.
En algunas realizaciones, proporcionar una evaluación de neoplasia de mama, por ejemplo, en forma de un juicio o valoración de la presencia, y en algunos casos un diagnóstico, del cáncer de mama (y en algunos casos de cáncer de mama metastásico), determinar una terapia para un sujeto que tiene cáncer de mama, monitorear a un sujeto que tiene cáncer de mama, etc, incluye la generación de un informe escrito que incluye la evaluación del médico del estado de salud actual del sujeto, es decir, una "evaluación de diagnóstico", del pronóstico del sujeto, es decir, una "evaluación de pronóstico", de posibles regímenes de tratamiento, es decir, una "evaluación del tratamiento" y/o de la capacidad de respuesta a la terapia, es decir, una "evaluación del pronóstico". Por lo tanto, un método sujeto puede incluir además una etapa para generar o emitir un informe que proporcione los resultados de una evaluación de diagnóstico, una evaluación de pronóstico, una evaluación de tratamiento, o una evaluación de seguimiento, y combinaciones de los mismos, cuyo informe se puede proporcionar en forma de un medio electrónico (por ejemplo, una pantalla electrónica en un monitor de ordenador), o en forma de un medio tangible (por ejemplo, un informe impreso en papel u otro medio tangible).
En algunos casos, las evaluaciones como se describen en la presente memoria se realizan como parte de un régimen de tratamiento, por ejemplo, para evaluar la eficacia del tratamiento o para determinar el mejor momento del tratamiento o para determinar si es necesaria la modulación del tratamiento. Por ejemplo, en algunos casos se puede recoger y evaluar una muestra de pretratamiento según los métodos descritos en la presente memoria y, a partir de la evaluación, se selecciona un protocolo de tratamiento. En otros casos, se recoge una muestra posterior al tratamiento y se compara, según las evaluaciones descritas en la presente memoria, con una muestra previa al tratamiento para evaluar la eficacia del tratamiento. En otros casos, se realizan una o más evaluaciones posteriores al tratamiento para determinar mejor el momento de la terapia adicional. Por ejemplo, las evaluaciones como se describen en la presente memoria se pueden realizar como parte de una terapia neoadyuvante (por ejemplo, antes, durante, y/o después) donde una terapia neoadyuvante se realiza para reducir el tumor antes del tratamiento primario. En una realización, se realiza la cirugía y se realizan una o más evaluaciones después de la cirugía para determinar el curso de la terapia adicional, por ejemplo, quimioterapia, radioterapia, terapia hormonal, cirugía adicional, etc.
En algunos casos, la evaluación de la muestra celular de mama se realiza en un breve período de tiempo después de la introducción de la muestra en el citómetro. Por consiguiente, los resultados se pueden proporcionar a un usuario en un período de 6 horas o menos, tal como 3 horas o menos, por ejemplo, 2 horas o menos, que incluye 1 hora o menos, que incluye opcionalmente un mínimo del tiempo necesario para procesar la muestra o una parte suficiente de la muestra a través del citómetro para realizar la evaluación que incluye, pero no se limita a, por ejemplo, 5 minutos, 10 minutos, 20 minutos, y 30 minutos. Cuando se desee, el tiempo de ensayo general que varía desde la obtención de la muestra del sujeto hasta la entrega del resultado al sujeto es de 6 horas o menos, tal como 5 horas o menos, por ejemplo, 4 horas menos, que incluye 3 horas o menos, por ejemplo, 2 horas o menos, que incluye opcionalmente un mínimo del tiempo necesario para recoger físicamente la muestra y procesar la muestra o una parte suficiente de la muestra que incluye pero no se limita a, por ejemplo, 30 minutos, 45 minutos, y 1 hora.
Kits
En otro aspecto más, la presente invención proporciona kits para practicar los métodos objeto, por ejemplo, como se describe anteriormente. Los kits en cuestión pueden incluir cualquier combinación de los reactivos, dispositivos o sistemas descritos anteriormente útiles en la práctica de los métodos como se describe anteriormente, que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, uno o más de los agentes de unión específicos o marcadores descritos. Los kits en cuestión pueden incluir además uno o más reactivos de preparación de muestras, que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, fijadores celulares, reactivos permeabilizantes celulares, reactivos de marcaje celular, tampones, diluyentes, etc. Los componentes anteriores se pueden presentar en recipientes separados o se pueden combinar uno o más componentes en un solo recipiente, por ejemplo, un vial de vidrio o plástico.
Los kits pueden incluir además dispositivos de obtención de muestras, por ejemplo, dispositivos de biopsia con aguja, dispositivos de biopsia central, dispositivos de biopsia por punción, dispositivos de biopsia quirúrgica, dispositivos de biopsia asistida por vacío, etc. En algunos casos, los kits pueden incluir además uno o más reactivos y/o dispositivos para disociación celular que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, enzimas, inhibidores de enzimas, detergentes, medios o tampones de disociación celular, dispositivos de vórtice, dispositivos de nutación, dispositivos de balanceo, etc. Los kits en cuestión pueden incluir además reactivos de control y muestras que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, muestras de células de control (por ejemplo, muestras celulares de control positivo, muestras celulares de control negativo, etc.) reactivos de calibración (por ejemplo, perlas fluorescentes, células pre-marcadas, etc.).
Además de los componentes anteriores, los kits en cuestión pueden incluir además instrucciones para practicar los métodos objetivo. Estas instrucciones se pueden presentar en los kits en cuestión en una variedad de formas, una o más de las cuales pueden estar presentes en el kit. Una forma en la que estas instrucciones pueden estar presentes es como información impresa en un medio o sustrato adecuado, por ejemplo, una hoja o hojas de papel en las que está impresa la información, en el envase del kit, en un prospecto, etc. Otro medio sería un medio legible por ordenador, por ejemplo, un disquete, CD, unidad extraíble (por ejemplo, dispositivo de memoria flash), etc., en el que se ha grabado la información. Otro medio más que puede estar presente es una dirección de una página web que se puede utilizar a través de Internet para acceder a la información en un apartado retirado. En los kits puede estar presente cualquier medio adecuado.
Sistemas
Los aspectos de la invención incluyen además sistemas para usar en la práctica de los métodos objetivo. Los sistemas de interés incluyen un citómetro de flujo configurado para analizar una muestra líquida tanto para datos de muestra como para datos celulares, por ejemplo, como se describe anteriormente. Los sistemas de citometría de flujo de interés incluyen, por ejemplo, los disponibles de proveedores comerciales que incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, Becton-Dickenson (Franklin Lakes, NJ), Life Technologies (Grand Island, NY), Acea Biosciences (San Diego, CA), Beckman-Coulter, Inc. (Indianápolis, IN), Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA), Cytonome, Inc. (Boston, m A), Amnis Corporation (Seattle, WA), Em D Millipore (Billerica, MA), Sony Biotechnology, Inc. (San José, CA), Stratedigm Corporation (San José, CA), Union Biometrica, Inc. (Holliston, MA), Cytek Development (Fremont, CA), Propel Labs, Inc. (Fort Collins, CO), Orflow Technologies (Ketchum, ID), handyem inc. (Quebec, Canadá), Sysmex Corporation (Kobe, Japón), Partec Japan, Inc. (Tsuchiura, Japón), Bay bioscience (Kobe, Japón), Furukawa Electric Co. Ltd. (Tokio, Japón), On-chip Biotechnologies Co., Ltd (Tokio, Japón), Apogee Flow Systems Ltd. (Hertfordshire, Reino Unido), y similares.
En algunos casos, el citómetro de flujo incluye: un canal de flujo; al menos una primera fuente de luz configurada para dirigir la luz a una región de ensayo del canal de flujo (donde en algunos casos el citómetro incluye dos o más fuentes de luz); uno o más detectores configurados para recibir luz de una primera longitud de onda de emisión de la región de ensayo del canal de flujo y luz de una segunda longitud de onda de emisión de la región de ensayo del canal de flujo; y un detector eléctrico configurado para medir el volumen celular mediante la detección de cambios en una corriente eléctrica provocada por una célula de la muestra en la región de ensayo. Dicho citómetro tendría al menos un canal de detección además del detector eléctrico. En algunos casos, el dispositivo puede incluir más de un canal de detección, por ejemplo, 2 o más, 3 o más, 4 o más, 5 o más, 10 o más, etc.
Los aspectos de la invención incluyen además un módulo de procesamiento de señales configurado para recibir los datos de la muestra y los datos celulares de uno o más detectores y el detector eléctrico para generar un resultado de una evaluación de si un sujeto tiene una neoplasia de mama o cáncer de mama metastásico en base a tanto los datos de muestra como a los datos celulares. El módulo de procesamiento de señales se puede integrar en el citómetro como un único dispositivo, o distribuir desde el citómetro donde el módulo de procesamiento de señales y el citómetro están en comunicación entre sí, por ejemplo, a través de un protocolo de comunicación con cable o sin cable.
Por consiguiente, los aspectos de la invención incluyen además sistemas, por ejemplo, sistemas basados en ordenador, que están configurados para predecir la presencia de una neoplasia de mama o cáncer de mama metastásico en un sujeto, por ejemplo, como se describe anteriormente. Un "sistema basado en ordenador" se refiere a los medios de hardware, los medios de software, y los medios de almacenamiento de datos utilizados para analizar la información de la presente invención. El hardware mínimo de los sistemas basados en ordenador de la presente invención comprende una unidad central de procesamiento (CPU), medios de entrada, medios de salida, y medios de almacenamiento de datos. Un experto en la técnica puede apreciar fácilmente que cualquiera de los sistemas informáticos disponibles actualmente es adecuado para su uso en la presente invención. Los medios de almacenamiento de datos pueden comprender cualquier fabricación que comprenda un registro de la información existente como se describe anteriormente, o un medio de acceso a la memoria que pueda acceder a dicha fabricación.
Por "registro" de datos, programación u otra información en un medio legible por ordenador se refiere a un proceso para almacenar información, empleando cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. Se puede elegir cualquier estructura de almacenamiento de datos adecuada, en base a los medios empleados para acceder a la información almacenada. Se puede utilizar una variedad de programas y formatos de procesamiento de datos para el almacenamiento, por ejemplo, archivo de texto de procesamiento de texto, formato de base de datos, etc.
Un "procesador" hace referencia a cualquier combinación de hardware y/o software que realizará las funciones requeridas. Por ejemplo, en la presente memoria cualquier procesador puede ser un microprocesador digital programable, tal como el disponible en forma de controlador electrónico, unidad central, servidor u ordenador personal (de escritorio o portátil). Cuando el procesador es programable, la programación adecuada se puede comunicar desde una ubicación remota al procesador, o se puede guardar previamente en un producto de programa de ordenador (tal como un medio de almacenamiento portátil o fijo legible por ordenador, ya sea magnético, óptico o basado en un dispositivo de estado sólido). Por ejemplo, un medio magnético o un disco óptico puede llevar la programación, y se puede leer por un lector adecuado que se comunica con cada procesador en su estación correspondiente.
Las realizaciones de los sistemas objetivo incluyen los siguientes componentes: (a) un módulo de comunicaciones para facilitar la transferencia de información entre el sistema y uno o más usuarios, por ejemplo, a través de un ordenador de usuario, como se describe a continuación; y (b) un módulo de procesamiento para realizar una o más tareas implicadas en los métodos de análisis cuantitativo de la invención.
En determinadas realizaciones, se describe un producto de programa informático que comprende un medio utilizable por ordenador que tiene una lógica de control (programa de software informático, que incluye el código de programa) almacenada en el mismo. La lógica de control, cuando se ejecuta por el procesador del ordenador, hace que el procesador realice las funciones descritas en la presente memoria. En otras realizaciones, algunas funciones se implementan principalmente en hardware empleando, por ejemplo, una máquina de estado de hardware. La implementación de la máquina de estado de hardware para realizar las funciones descritas en la presente memoria se puede conseguir empleando cualquier método y técnica adecuada.
Además del dispositivo sensor y del módulo de procesamiento de señales, por ejemplo, como se describe anteriormente, los sistemas de la invención pueden incluir una serie de componentes adicionales, tales como dispositivos de salida de datos, por ejemplo, monitores y/o altavoces, dispositivos de entrada de datos, por ejemplo, puertos de interfaz., teclados, etc., componentes de manejo de fluidos, fuentes de energía, etc.
En algunos casos, los sistemas pueden incluir además una mezcla de reacción derivada de los mismos (por ejemplo, células lavadas producidas a partir de ellas), donde la mezcla de reacción se prepara como se describe anteriormente, por ejemplo, combinando una muestra, uno o más agentes aglutinantes específicos detectables y, opcionalmente, un marcador adicional.
Utilidad
Las evaluaciones de muestras celulares de mama como se describen en la presente memoria encuentran uso en una variedad de aplicaciones. Tales evaluaciones son útiles para adquirir datos de muestra y/o datos celulares que se pueden emplear para hacer determinaciones relacionadas con la muestra y/o con las células de la muestra. Las muestras que se pueden evaluar según los métodos descritos en la presente memoria se han descrito en detalle anteriormente y generalmente incluyen muestras de investigación de laboratorio (por ejemplo, las descritas para uso de investigación no clínica), muestras de investigación clínica, muestras de pacientes, muestras de diagnóstico, muestras de pronóstico, muestras de tratamiento, y similares. Los datos combinados de las evaluaciones de muestras descritas son útiles para comparar muestras entre sí, por ejemplo, como en la comparación de dos muestras de investigación (por ejemplo, dos muestras de investigación tratadas con dos agentes experimentales diferentes), comparación de una muestra experimental con un control (por ejemplo, comparación de una muestra tratada con un control sin tratar) y en la comparación de muestras con una referencia (por ejemplo, una referencia de control o un valor de referencia, tal como una muestra sana o cancerosa o un nivel sano o canceroso).
Como se describe anteriormente, las evaluaciones basadas en los datos recopilados se emplean para detectar células neoplásicas y realizar evaluaciones de si un sujeto tiene una lesión neoplásica y/o predecir la malignidad de una lesión detectada. Sin vincularse a la teoría, las evaluaciones basadas en varios factores de datos de muestra combinados y datos celulares, como se describe en la presente memoria, aprovechan las causas de desarrollo multimodal del cáncer de mama para ayudar en la detección del cáncer y/o en la identificación de la enfermedad metastásica.
Las evaluaciones descritas en la presente memoria encuentran uso en el cribado de sujetos en busca de enfermedad, ya sea como primera línea de detección en individuos sanos sospechosos y/o como mecanismo de control para aquellos con mayor riesgo de desarrollar enfermedad neoplásica o enfermedad metastásica. Las evaluaciones se pueden realizar de forma independiente o combinar con ensayos de cribado y biopsias rutinarios convencionales, lo que aumenta la tasa de detección, reduce la tasa de evaluaciones de falsos negativos y falsos positivos y, en general, mejora el estándar de atención relacionado con la detección, el seguimiento, y el tratamiento del cáncer de mama.
Además de las evaluaciones de pacientes descritas anteriormente, las evaluaciones descritas también encuentran uso en el ámbito de la investigación en la evaluación de datos de muestra obtenidos de modelos clínicos, preclínicos, y de laboratorio del desarrollo y tratamiento del cáncer de mama. Por ejemplo, debido a la naturaleza celular del método descrito, los xenoinjertos (por ejemplo, xenoinjertos de origen humano) se pueden analizar directamente de un animal huésped y evaluar según los métodos descritos en la presente memoria, por ejemplo, como un método para estudiar el desarrollo del cáncer de mama en tales modelos con relevancia clínica directa. Dichos xenoinjertos y/u otros modelos animales de cáncer, que incluyen, pero no se limitan al cáncer de mama, también se pueden estudiar bajo regímenes o agentes de tratamiento experimental que utilizan las evaluaciones descritas en la presente memoria como un método para ensayar la eficacia de dichos regímenes o agentes de tratamiento. Además, dado el enfoque no subjetivo e imparcial de las evaluaciones celulares descritas en la presente memoria, los métodos descritos también encuentran uso en combinación con la investigación clínica, por ejemplo, en la evaluación de muestras previas y posteriores al tratamiento para determinar la eficacia del tratamiento y/o monitorear la eficacia del tratamiento durante ensayos a través de una o más evaluaciones durante el curso de un ensayo clínico.
Los usos descritos anteriormente de ninguna manera deben considerarse limitantes, ya que los métodos y sistemas descritos en la presente memoria pueden tener una utilidad adicional no descrita en la presente memoria.
Realizaciones relacionadas con el ordenador
Los aspectos de la invención incluyen además una variedad de realizaciones relacionadas con el ordenador. Específicamente, los métodos de análisis de datos descritos en las secciones anteriores se pueden realizar empleando un ordenador. Por consiguiente, la invención proporciona un sistema informático para analizar datos producidos empleando los métodos anteriores con el fin de realizar una evaluación de neoplasia de mama o una evaluación de cáncer de mama metastásico.
En determinadas realizaciones, los métodos se codifican en un medio físico legible por ordenador en forma de "programación", donde el término "medio legible por ordenador" como se emplea en la presente memoria se refiere a cualquier medio de almacenamiento o transmisión que participa en el suministro de instrucciones y/o datos a un ordenador para su ejecución y/o procesamiento. Ejemplos de medios de almacenamiento incluyen disquetes, cinta magnética, CD-ROM, una unidad de disco duro, una ROM o circuito integrado, un disco magneto-óptico, o una tarjeta legible por ordenador, tal como una tarjeta PCMCIA, y similares, ya sean o no tales dispositivos internos o externos al ordenador. Un archivo que contiene información se puede "almacenar" en un medio legible por ordenador, donde "almacenar" significa registrar información de manera que sea accesible y recuperable por un ordenador en una fecha posterior. Los medios de interés, son los medios no transitorios, es decir, los medios físicos a los que se asocia la programación, tal como el medio de grabado, una estructura física. Los medios no transitorios no incluyen señales electrónicas en tránsito a través de un protocolo inalámbrico.
Con respecto a los medios legibles por ordenador, "memoria permanente" se refiere a la memoria que es permanente. La memoria permanente no se borra por la terminación del suministro eléctrico a un ordenador o procesador. El disco duro del ordenador, el CD-ROM, el disquete y el DVD son ejemplos de memoria permanente. La memoria de acceso aleatorio (RAM) es un ejemplo de memoria no permanente. Un archivo en memoria permanente puede ser editable y re-escribible.
Experimental
Los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar a los expertos en la técnica una divulgación y descripción completas de cómo hacer y usar la presente invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran su invención ni tienen la intención de representar que los experimentos de a continuación son todos o los únicos experimentos realizados. Se han realizado esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.) pero se deben tener en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular medio, la temperatura es en grados centígrados, y la presión es igual o cercana a la atmosférica.
Los métodos generales de bioquímica molecular y celular se pueden encontrar en libros de texto estándar como Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a Ed. (Sambrook et al., HaRBor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4a Ed. (Ausubel et al. Eds., John Wiley e Hijos 1999); Protein Methods (Bollag et al., John Wiley e Hijos 1996); Nonviral Vectors for Gene Therapy (Wagner et al. eds., Academic Press 1999); Viral Vectors (Kaplift y Loewy eds., Academic Press 1995); Immunology Methods Manual (I. Lefkovits ed., Academic Press 1997); y Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle y Griffiths, John Wiley e Hijos 1998). Los reactivos y dispositivos a los que se hace referencia en esta descripción están disponibles en proveedores comerciales, tales como Abcam, Biolengend, Life Technologies, Sigma-Aldrich, CST, Biosearch, Sony Biotechnology y otros.
Ejemplo 1
Calibración
Antes de realizar los ensayos de citometría de flujo, el citómetro de flujo (especificación Sony Biotechnology EC800) se calibró de tal manera que: (1) las perlas Align Check lograron un HPCV (pico medio CV ) de menos del 2,5% en todos los parámetros recolectados, (2) el pico 8 de las perlas arco iris demostró 8 picos distintos en FL1, FL2, FL3, FL4 y FL5, y (3) el pico 6 de las perlas demostró 6 picos distintos en FL3 y FL4.
Materiales
En el Ejemplo 1 se utilizaron los siguientes anticuerpos y sondas:
Figure imgf000026_0001
Además de lo anterior, en el Ejemplo 1 también se utilizó la siguiente lista no limitante de reactivos y equipación: 1X PBS 2% BSA; 1X PBS FBS/FCS al 2%; Tubos de microcentrífuga; Tubos cónicos desechables de 12 x 75 mm (polipropileno); Pipetman o pipetas equivalentes (intervalo 2-20pL, 20-200pL, 200-1000gL); Mezclador Vortex; Centrífuga; Aspirador de vacío; Baño de agua a 43°C ± 1 °C.
Preparación de la muestra
Las muestras líquidas se mezclaron agitando suavemente con vórtex a un ajuste medio durante 1-2 segundos, o se mezclaron agitando el tubo con un dedo. Se observaron las células para asegurar que el sedimento celular se hubiese disociado. La agitación excesiva o el manejo brusco de las células conducirá a una cantidad excesiva de desechos y afectará a los resultados.
Aspiración y fijación de tejidos
Las muestras de aspirado con aguja fina (FNA) se recogieron empleando la técnica francesa. En resumen, la técnica francesa implica una aguja de punta abierta, sin succión negativa adjunta. Los golpes cortos y rápidos dentro de la lesión provocan el desplazamiento de las células y permiten una recogida eficaz dentro de la aguja a través de la acción capilar. Se puede conectar una jeringa sin el émbolo para recoger del exceso de líquido. Independientemente del accesorio utilizado, el extremo del aparato debe estar abierto a la atmósfera para permitir la recogida adecuada de la muestra; esta abertura no se debe cubrir con la yema del dedo durante el procedimiento, especialmente cuando se emplea sólo una aguja.
Las masas tumorales de mama se aspiraron según esta técnica de muestreo. Se tomó una muestra del tumor de mama una vez y después, tras la recuperación de la muestra, el aspirado se inyectó directamente en un vial que contiene 1 ml de IncellFP.
Hibridación de ARNm
Las células se fijaron en 2 ml de Reactivo 1 a su llegada a IncellDx. Se realizó un recuento de células en el celómetro para determinar la densidad celular y el volumen a pipetear para 400.000 células. Se dividieron en alícuotas de 400.000 células en 3 tubos de 12x75 mm. Las células se lavaron en 1 ml de Reactivo 2 (tampón de pre­ hibridación 1), se mezclaron a mano suavemente, y se centrifugaron a 600 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se aspiró el sobrenadante, asegurándose de que el sedimento celular no se rompiera; la aspiración se realizó en el lado opuesto del tubo. Se añadió 1 ml de Reactivo 3 (tampón de pre-hibridación 2), las células se mezclaron a mano suavemente, y se centrifugaron a 600 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante se aspiró como anteriormente.
El cóctel de hibridación se preparó mezclando los volúmenes apropiados de Reactivo 4 (tampón de hibridación) (101,5 pL por muestra) y 1,5 pL de sonda de ARNm de HER2 en el tubo 1 y 1,5 pL de sonda de ARNm de MTDH en el tubo 2. Se añadieron 103 pL a cada tubo de muestra. Las células se mezclaron a mano suavemente. Se dejó incubar la reacción en un baño de agua precalentado a 43°C ± 1°C durante 30 minutos.
Lavados celulares rigurosos
Se añadió 1 ml de Reactivo 6 precalentado (tampón de lavado riguroso 1) a cada tubo de muestra y las células se mezclaron a mano suavemente. Las células se centrifugaron a 600 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante se aspiró como anteriormente. Se añadió 1 ml de Reactivo 7 precalentado (tampón de lavado riguroso 2) a cada tubo de muestra y las células se mezclaron a mano suavemente. Se dejó incubar la reacción en un baño de agua a 43°C durante 15 minutos. Las células se centrifugaron a 600 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante se aspiró como anteriormente.
Tubos de hibridación de anticuerpos primarios 1 y 2
Se añadió 1 ml 1X de PBS BSA al 2%. Las células se centrifugaron a 600 x g durante 5 min a temperatura ambiente. El sobrenadante se aspiró como anteriormente. Se prepararon diluciones de trabajo de 100 pL de anticuerpos primarios E-cadherina, ER, y PR como sigue:
Tubo 1: 5 pL de ER, y 5 pL de PR en 90 pL de PBS BSA al 2%.
Tubo 2: 1 pL de E-cadherina en 99 pL de PBS BSA al 2%.
Se añadió la dilución de anticuerpo E-cadherina de 100 pl al tubo 2 y la dilución de anticuerpo ER y PR de 100 pl se añadió al tubo 1. Se dejó incubar los tubos a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 minutos. Las células se lavaron con 1 ml de PBS 1X FBS al 2%. Los tubos se dejaron reposar durante 5 minutos a temperatura ambiente. Los tubos se centrifugaron a 400 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante se aspiró como anteriormente. Las etapas de lavado, centrifugado y aspiración se repitieron una vez.
Hibridación de anticuerpos secundarios
Se prepararon diluciones de trabajo de 100 pL de lo siguiente:
Tubo 1: 5 pL HER2 PE, 5 pL CD45, 1 pL Anti-conejo 647, 89 PBS BSA al 2%
Tubo 2: 5 pL de CD44, 5 pL de CD45, 1 pL Anti-conejo 647, 89 pL de PBS BSA al 2%
Tubo 3: 2 pL de caspasa 3 escindida, 2 pL de H2A.X, 2 pL de vimentina, 5 pL de CD45, 89 pL de PBS BSA al 2%
Las diluciones de anticuerpo de 100 pl se agregaron a los tubos apropiados. Los tubos se incubaron a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 minutos. Las células se lavaron con 1 ml de PBS 1X FBS al 2%. Los tubos se dejaron reposar durante 5 minutos a temperatura ambiente. Los tubos se centrifugaron a 400 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante se aspiró como anteriormente. Los pasos de lavado, centrifugación y aspiración se repitieron una vez.
Hibridación DAPI
Se preparó una dilución de tinte de ADN DAPI en 1X PBS según el siguiente cuadro para una alícuota de 5 mL:
Figure imgf000027_0001
Se añadió 200 pL de DAPI diluido a cada tubo de muestra y las células se mezclaron a mano suavemente. Las células se incubaron a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 minutos, después de lo cual las muestras estaban listas para el análisis citométrico en un citómetro de flujo equipado con un sistema de tres láseres.
Análisis de la muestra
Las muestras se recogieron en un citómetro de flujo EC800 (Sony Biotechnology Inc., San José, CA) bajo el Protocolo Inicial de Recogida de mama deteniéndose en 30.000 eventos en total.
Comenzando con el Tubo 1 (ER/PR/Her2/HER2/DAPI/CD45), se estableció una puerta celular Q única y se aplicó SSC/CD45. La ganancia se ajustó hasta que la región de glóbulos blancos estaba en el canal 200 como se muestra en la Fig.1 y, una vez establecida, se creó una matriz de compensación aplicando primero FL1 comp en todos los demás parámetros, y continuando con FL2, FL3, FL4 y FL5. La matriz de compensación completa se asemeja a la Fig.2.
Una vez que se completó la compensación, se aplicó un control para generar estadísticas sobre las poblaciones de células diana (Fig. 3). La población tumoral control estaba fuera de los niveles de referencia cuando ER era y esta fue la población para la que se registró la intensidad de fluorescencia media (MFI) de ER, la MFI de Her2 y la MFI de ARNm de HER2. El % de CD45+ se tomó como EIL (leucocitos infiltrantes epiteliales) como una media de los tres tubos. Si el archivo tenía 30.000 eventos, se exportó un archivo FCS para analizarlo en ModFitLT para el índice de ADN (DI) y el % de la fase S. Se registraron los porcentajes de la región del ciclo celular.
En los casos en los que no se generaron 30.000 eventos, el MFI de Y (tumor) se dividió por el MFI de los glóbulos blancos (X) para calcular el DI del tumor (véase la Fig. 4). El % de la fase G1 posterior se registró como la media de los tres tubos. Los datos del estudio de rendimiento clínico que compara esta técnica manual con ModFitLT revelaron una concordancia del 100% en DI y como se predijo, la fase G1 fue consistentemente mayor que la fase S.
Continuando con el Tubo 2 (E-cadherina/CD44/ARNm de MTDH/CD45/DAPI), nuevamente se usaron los glóbulos blancos para establecer el nivel de referencia y el enfoque de análisis para el Tubo 1 se repitió con el Tubo 2.
Se registró la MFI y el % positivo de la población tumoral. Los glóbulos blancos se utilizaron para determinar cuándo CD44 era positivo (los glóbulos blancos son >90%) (véase la Fig. 5). La capacidad de definir estas poblaciones por separado reveló tendencias estadísticas en el modelo de metástasis.
La lectura total de ambos tubos se añadió a la base de datos de mama Fase II en la que los metadatos se combinaron con los datos de Cellular Multiplex vinculados por ID de muestra.
Especificaciones generales del ensayo
Para asegurar el rendimiento longitudinal, cada 3 meses del estudio, los resultados de las muestras de células mamarias obtenidas se compararon con un imitador de FNA que contiene glóbulos blancos, MCF-7 y SK-BR-3 teñidos con todos los anticuerpos, sondas de ARNm y DAPI.
Las muestras se analizaron para las siguientes especificaciones: que la señal de ER y la señal de ARNm de Her2 se separan en direcciones opuestas, que la señal de CD44 y el ARNm de MTDH se separan en direcciones opuestas, que el índice de ADN de mezcla de glóbulos blancos y tumores se puede resolver claramente (véase la Fig. 6).
Análisis estadístico
Cellular Multiplex™ crea una serie de variables (lecturas citométricas como se describió anteriormente) que vinculamos con metadatos en una hoja de cálculo de Excel. Los archivos .cdf sin procesar (archivos de datos de citometría) se analizaron por 2 científicos diferentes antes de ingresar los datos en la hoja de cálculo. Una vez que se acordó y se verificó si había errores, se transfirió un archivo .csv para un análisis adicional.
Los datos del proyecto de cáncer de mama se analizaron en R (R Core Team (2014) R: A Language and Environment for Statistical Computing, Viena, Austria; www (dot)R-project(dot) org). Primero, se calcularon el mínimo, el primer cuartil, la mediana, la media, el tercer cuartil y el máximo de cada variable tanto para los grupos sanos como para los grupos enfermos y se crearon diagramas de caja para comparar los dos grupos. En segundo lugar, se empleó el análisis no paramétrico de Mann-Whitney-Wilcoxon para decidir si las distribuciones poblacionales de cada variable para los grupos sanos y los grupos enfermos eran idénticas sin asumir que seguían una distribución normal. Una vez que se estableció la diferencia, se emplearon modelos basados en árboles y bosques aleatorios para crear una clasificación y una regresión. Finalmente, se aplicó un modelo de regresión lineal a nuestros datos para separar los grupos sanos de los grupos enfermos.
El conjunto completo de dos tubos crea 19 variables en total en cada caso; este gran número reduce el tamaño total de la muestra a 32 tumores y 6 casos normales. El modelo completo contiene las siguientes variables: Recuento celular total, recuento de células individuales, recuento de células epiteliales, Media.G1..Epitelial, X..Referencia..G1., X..CD45.EIL, X.ER.PR..glóbulos blancos, X.Her2.ARNm..Epitelial, X.HER2.proteína..Epitelial, X..CD44.Epitelial, X ... E.cadherina..CD44 ... Epitelial, MCV. Epitelial, Cellometer.Count y iCyt.Count. Los coeficientes de las variables se proporcionan a continuación:
Figure imgf000028_0001
Figure imgf000029_0001
Después, el número de variables se redujo en base a los valores p de los resultados derivados, seguido de un método de etapas de avance y retroceso para encontrar un modelo reducido. Como resultado, el modelo final contiene 5 variables: Media.G1..Epitelial, X..Referencia..G1., X.ER.PR. Glóbulos blancos, MCV.Epitelial y Recuento iCyt. Los coeficientes finales para el modelo reducido se proporcionan a continuación:
Figure imgf000029_0002
En la Figura 7 se proporciona una representación visual de este análisis estadístico en lo que respecta a los sujetos de los que se derivaron las muestras. Estadísticamente, las 5 variables enumeradas anteriormente separan una célula "tumoral" de una célula "sana" en el sentido de que no son idénticas.
Con respecto a lo que miden estas variables y cómo se relacionan con el cáncer se analiza a continuación. La media G1 epitelial compara el contenido de ADN del epitelio tumoral con el contenido de ADN de las células sanas (véase la Figura 4 para obtener una descripción gráfica relevante). Esto refleja una diferencia en la integridad genómica y puede indicar, sin estar ligado a la teoría, la inserción/eliminación de tiras de ADN en las células cancerosas. El G1 de referencia se refiere al % de células en la etapa G1 del ciclo celular. A partir del análisis estadístico, queda claro que los componentes en reposo y proliferativos del ciclo celular difieren cuando se compara una muestra tumoral con una normal. Los glóbulos blancos ER/PR representan los niveles de referencia de los marcadores en el infiltrado de glóbulos blancos. Esta diferencia estadística fue un hallazgo estadístico inesperado. El epitelio MCV se refiere al volumen corpuscular medio (volumen de Coulter) de las células individuales. Esta diferencia estadística representa una firma digital de la diferencia en la morfología de una célula tumoral frente a una célula normal. En una serie de experimentos antes de comenzar este estudio, se confirmó una diferencia de tamaño "real" de las células cancerosas (SK-BR-3 y MCF-7) frente a las células mamarias humanas normales (HMEC) en el estado fijo y sin fijar. En estos mismos estudios, se confirmó que las células fijadas en IncellFP™ mantienen el 90% del MCV sin fijar. La última variable es el recuento de iCyt, que es el número de células que pasan a través del flujo celular en 300 ul de líquido. Esta diferencia estadística representa que la FNA del espacio tumoral contiene más células de las que contiene un conducto normal.
El modelo metastásico siguió el mismo proceso que el anterior con menos casos debido a la inclusión de MTDH, que se añadió en el punto medio del estudio, y la definición clara de metástasis en los metadatos. El modelo completo contiene las siguientes 18 variables: Recuento celular total, recuento de células individuales, recuento de células epiteliales, media.G1..Epitelial., media.G1glóbulos blancos, X..CD45.EIL, X. .E.Cadherina.Epitelial, X.ER.PR..Epithelial, X.ER.PR..WBCS, X.Her2.mRNA..Epithelial, X.HER2.proteína..Epithelial, X.MTDH.ARNm.. Epitelial, X..CD44.Epithelial, X ... E.cadherina..CD44 ... Epitelial, MCV. Epitelial, recuento de iCyt. y recuento del celómetro. En la Figura 8 se proporciona una representación visual del análisis estadístico basado en el modelo completo. A continuación, se muestran los coeficientes de las variables:
Figure imgf000030_0001
Después, el número de variables se redujo en base a los valores p de los resultados y los métodos de etapas de avance y retroceso para encontrar un modelo reducido, el modelo final tiene 6 variables: HER2.proteína..Epitelial, recuento ce células individuales, recuento de células epiteliales, Media.G1..Epitelial, Media.G1. Glóbulos blancos y recuento del celómetro. En la Fig. 9 se muestra una representación visual del análisis estadístico basado en el Modelo Reducido. A continuación se muestran los coeficientes del modelo final:
Figure imgf000030_0002
Ejemplo 2
Muestras y recopilación de datos
Los datos se recopilaron mediante citometría de flujo esencialmente como se describió anteriormente para un conjunto de muestras de cáncer de mama (es decir, tejido de cáncer de mama) y un conjunto de muestras sanas (es decir, tejido de mama normal). Se obtuvieron varios parámetros, incluidos los que se importaron para construir el modelo de clasificación como se describe a continuación.
Generación del modelo
Se emplearon los parámetros medidos a partir del tejido del cáncer de mama y conjuntos de datos de tejido de mama sano para generar un modelo de clasificación. Se utilizaron los siguientes parámetros: recuento celular total, recuento de células individuales, recuento de células epitelailes, MCV epitelial, Media G1 de glóbulos blancos, media de G1 epitelial, porcentaje de G1 epitelial, índice o índices de ADN, porcentaje de Post G1 epitelial, porcentaje de CD45 EIL, (ER/PR)de glóbulos blancos, porcentaje de ER/PR epitelial, (ER/PR) epitelial, (ARNm de Her2) epitelial, (proteína HER2) epitelial, ARNm de MTDH, porcentaje de CD44+ E-cadherina epitelial, porcentaje de E-cadherina CD44 - epitelial, (porcentaje de E-cadherina- CD44+) epitelial, porcentaje de epitelio de vimentina, porcentaje de epitelio de caspasa 3 y porcentaje de p H2A.X epitelial.
El esquema general para generar y evaluar un modelo multiparamétrico se proporciona en el diagrama de flujo que se presenta en la Figura 12. En resumen, los conjuntos de datos de entrenamiento para muestras no cancerosas (100) y cancerosas (101) se importaron a un modelo de regresión lineal general (102). En este ejemplo, los datos de los parámetros anteriores se importaron al siguiente modelo de regresión lineal general:
Y _ í 1 cancerosa
10 no-cancerosa
Figure imgf000031_0001
La regresión lineal generó un modelo multiparamétrico (103) que contiene un conjunto definido de parámetros (es decir, un modelo de múltiples parámetros). El modelo se aplicó a un conjunto de pruebas de muestras que contienen tanto muestras sanas (no cancerosas) como cancerosas (104). El modelo multiparamétrico se empleó para la clasificación de muestras del conjunto de pruebas (105) para identificar las muestras como no cancerosas (106) o cancerosas (107). Se comparó la clasificación de la muestra en base al modelo multiparamétrico (108) y la comparación se empleó para la evaluación de la clasificación (109) para determinar la sensibilidad y la especificidad del modelo multiparamétrico generado. Con el ejemplo proporcionado, el modelo produjo un modelo de clasificación que clasifica a las muestras cancerosas frente a las no cancerosas con una sensibilidad del 95% y una especificidad del 95%. En la Figura 10 se presenta una representación gráfica de la clasificación de muestras de cáncer de mama y muestras de tejido de mama normal empleando este modelo. Como control, también se realizaron comparaciones empleando el modelo entre muestras normales, por ejemplo, como se muestra en la Figura 11.
Este ejemplo demuestra la capacidad para construir un modelo de clasificación multiparamétrico a partir de los parámetros medidos de forma individual enumerados anteriormente. Estos resultados demuestran que dicho modelo se puede emplear para clasificar con éxito muestras de cáncer de mama y de tejido normal, con alta especificidad y sensibilidad.
Aunque la invención anterior se ha descrito con cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo para mayor claridad y comprensión, es evidente de manera fácil para los expertos en la técnica a la luz de las enseñanzas de esta invención, que se pueden realizar determinados cambios y modificaciones de la misma sin apartarse del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
Lo anterior simplemente ilustra los principios de la invención. Se apreciará que los expertos en la técnica serán capaces de idear diversas disposiciones que, aunque no se describen o muestran explícitamente en la presente, memoria, incorporan los principios de la invención y se incluyen dentro de su alcance. Además, todos los ejemplos y el lenguaje condicional citados en la presente memoria están destinados principalmente a ayudar al lector a comprender los principios de la invención y los conceptos aportados por los inventores para promover la técnica, y deben interpretarse sin limitación a los ejemplos y condiciones citados específicamente.. Además, todas las declaraciones en la presente memoria que recitan principios, aspectos y realizaciones de la invención, así como ejemplos específicos de la misma, pretenden abarcar tanto los equivalentes estructurales como los funcionales de la misma. Además, se pretende que dichos equivalentes incluyan tanto los equivalentes conocidos actualmente como los equivalentes desarrollados en el futuro, es decir, cualquier elemento desarrollado que realice la misma función, independientemente de la estructura. El alcance de la presente invención, por lo tanto, no se pretende limitar a las realizaciones ejemplares mostradas y descritas en la presente memoria. Más bien, el alcance de la presente invención se materializa mediante las reivindicaciones adjuntas.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un método para detectar una célula de cáncer de mama en una muestra celular de mama obtenida de tejido mamario de un sujeto, el método comprende:
a) análisis citométrico de flujo de la muestra celular de mama para obtener:
i) datos de muestra que comprenden datos de densidad celular de muestra;
ii) datos de células epiteliales que comprenden datos de contenido de ADN, datos de proliferación y datos de volumen celular; y
iii) datos de glóbulos blancos (WBC) que comprenden al menos uno de un nivel de expresión del receptor de estrógeno y un nivel de expresión del receptor de progesterona; y
b) evaluar los datos de muestra obtenidos, los datos de células epiteliales y los datos de glóbulos blancos para detectar la célula de cáncer de mama en la muestra celular de mama.
2. El método según la reivindicación 1, en donde la muestra celular de mama es una muestra aspirada con aguja fina.
3. El método según las reivindicaciones 1 o 2, en donde el método comprende además poner en contacto las células de la muestra de mama celular con un marcador en condiciones suficientes para producir una muestra de mama celular marcada, en donde el marcador es un marcador nuclear o un marcador para una superficie celular seleccionado del grupo que consiste en CD45, receptor de estrógeno y receptor de progesterona.
4. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la evaluación comprende evaluar si el sujeto tiene una enfermedad neoplásica.
5. Un método para detectar una célula de cáncer de mama en una muestra celular de mama obtenida de tejido mamario de un sujeto, el método comprende:
a) análisis citométrico de flujo de una muestra celular de mama:
i) datos de muestra que comprenden datos de recuento celular de la muestra;
ii) datos de células epiteliales que comprenden datos de contenido de ADN, datos de recuento de células epiteliales y datos de biomarcadores de cáncer de mama; y
iii) datos de glóbulos blancos (WBC) que comprenden datos de proliferación WBC; y
b) evaluar los datos de muestra obtenidos, los datos de células epiteliales y los datos de glóbulos blancos para detectar la célula de cáncer de mama en la evaluación de la muestra celular de mama.
6. El método según la reivindicación 5, en donde los datos de biomarcadores de cáncer de mama comprenden datos de expresión del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2).
7. El método según la reivindicación 5 o 6, en donde la muestra celular de mama es una muestra aspirada con aguja fina.
8. El método según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en donde el método comprende además poner en contacto las células de la muestra celular de mama con un marcador en condiciones suficientes para producir una muestra de mama celular marcada, en donde el marcador es un marcador nuclear o un marcador para una marcador de superficie celular seleccionado del grupo que consiste en CD45, receptor de estrógeno, receptor de progesterona, y HER2.
9. El método según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en donde la muestra celular de mama se obtiene de un sujeto y la evaluación comprende evaluar si el sujeto tiene una enfermedad neoplásica.
10. El uso de un kit en el método de las reivindicaciones 1 a 9, el kit comprende:
a) un marcador nuclear fluorescente; y
b) uno o más miembros de unión a marcadores de superficie celular marcados de forma detectable, en donde los marcadores de superficie celular se seleccionan del grupo que consiste en: CD45, receptor de estrógeno, receptor de progesterona, HER2, y combinaciones de los mismos; y
c) instrucciones para realizar el método de las reivindicaciones 1 a 9.
11. Un sistema de citometría de flujo adaptado para llevar a cabo el método de las reivindicaciones 1 a 9, el sistema comprende:
un citómetro de flujo que comprende una célula de flujo;
una fuente de luz configurada para dirigir la luz a una región de ensayo de la célula de flujo;
uno o más detectores de fluorescencia configurados para recibir luz de una primera longitud de onda de emisión emitida por un marcador nuclear fluorescente y una segunda longitud de onda de emisión emitida por un primer miembro de unión de marcador de superficie celular marcado de manera detectable presente en una muestra de mama celular líquida marcada obtenida de tejido mamario en la región de ensayo;
un detector eléctrico configurado para medir el volumen celular detectando cambios en una corriente eléctrica provocada por una célula de la muestra de mama celular en la región de ensayo;
un módulo de procesamiento de señales configurado para recibir señales de uno o más detectores de fluorescencia y el detector eléctrico y generar un resultado de si una célula de cáncer de mama del tejido de mama está presente en la muestra.
12. Un sistema de citometría de flujo adaptado para llevar a cabo el método de las reivindicaciones 1 a 9 que comprende:
un citómetro de flujo que comprende una célula de flujo;
una fuente de luz configurada para dirigir la luz a una región de ensayo de la célula de flujo;
uno o más detectores de fluorescencia configurados para recibir luz de una primera longitud de onda de emisión emitida por un marcador nuclear fluorescente, una segunda longitud de onda de emisión emitida por un primer miembro de unión de marcador de superficie celular marcado de manera detectable y una tercera longitud de onda de emisión emitida por un segundo miembro de unión de marcador de superficie celular marcado de manera detectable presente en una muestra líquida marcada de células de mama obtenida de tejido de mama en la región de ensayo;
un módulo de procesamiento de señales configurado para recibir señales de uno o más detectores de fluorescencia y generar un resultado de si una célula de cáncer de mama metastásico está presente en la muestra.
13. Un medio legible por ordenador, que comprende la programación para su ejecución por un ordenador que comprende:
a) instrucciones para analizar señales producidas por:
i) uno o más detectores de fluorescencia configurados para recibir luz de una primera longitud de onda de emisión emitida por un marcador nuclear fluorescente unido a células de una muestra de mama celular líquida marcada obtenida de tejido mamario y una segunda longitud de onda de emisión emitida por un miembro de unión de marcador de superficie celular marcado de manera detectable unido a células de la muestra;
ii) un detector eléctrico configurado para medir el volumen celular de las células de la muestra detectando cambios en una corriente eléctrica, para producir datos;
b) instrucciones para almacenar los datos en un medio legible por ordenador; y
c) instrucciones para dar salida a los datos para proporcionar un resultado de si una célula de cáncer de mama está presente en la muestra según el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
ES16800679T 2015-05-26 2016-05-25 Métodos de evaluación de muestras celulares de mama y composiciones para uso en practicar los mismos Active ES2870474T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562166583P 2015-05-26 2015-05-26
PCT/US2016/034195 WO2016191504A1 (en) 2015-05-26 2016-05-25 Methods of assessing cellular breast samples and compositions for use in practicing the same

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2870474T3 true ES2870474T3 (es) 2021-10-27

Family

ID=57393692

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES16800679T Active ES2870474T3 (es) 2015-05-26 2016-05-25 Métodos de evaluación de muestras celulares de mama y composiciones para uso en practicar los mismos

Country Status (5)

Country Link
US (2) US10627389B2 (es)
EP (1) EP3304041B1 (es)
CN (1) CN107850526B (es)
ES (1) ES2870474T3 (es)
WO (1) WO2016191504A1 (es)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11494578B1 (en) * 2015-09-21 2022-11-08 Ares Trading S.A. Systems and methods for automated assessment of embryo quality using image based features
US10510143B1 (en) * 2015-09-21 2019-12-17 Ares Trading S.A. Systems and methods for generating a mask for automated assessment of embryo quality
US20220107320A1 (en) * 2019-02-15 2022-04-07 Incelldx, Inc. Assaying Bladder-Associated Samples, Identifying and Treating Bladder-Associated Neoplasia, and Kits for Use Therein
US12019040B2 (en) 2019-09-30 2024-06-25 Cornell University System and devices for monitoring cell-containing materials and methods of their use

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5798827A (en) * 1996-11-26 1998-08-25 Coulter International Corp. Apparatus and method for determination of individual red blood cell shape
JP2002529704A (ja) * 1998-10-29 2002-09-10 セル ワークス インコーポレイテッド 単一細胞の複数マーカー特徴付け
US8131053B2 (en) * 1999-01-25 2012-03-06 Amnis Corporation Detection of circulating tumor cells using imaging flow cytometry
KR20050100371A (ko) * 2003-01-13 2005-10-18 에모리 유니버시티 정상 및 암세포에서의 유전자 발현의 검출 방법
WO2006113747A2 (en) 2005-04-19 2006-10-26 Prediction Sciences Llc Diagnostic markers of breast cancer treatment and progression and methods of use thereof
EP1777523A1 (en) 2005-10-19 2007-04-25 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) An in vitro method for the prognosis of progression of a cancer and of the outcome in a patient and means for performing said method
WO2007089880A2 (en) 2006-01-31 2007-08-09 Georgetown University Method to detect breast cancer cells
WO2011083754A1 (ja) 2010-01-06 2011-07-14 三井造船株式会社 蛍光検出装置、蛍光検出方法及び蛍光信号を信号処理する方法
EP2638396B1 (en) 2010-11-12 2017-03-01 incellDX, Inc. Methods and systems for predicting whether a subject has a cervical intraepithelial neoplasia (cin) lesion from a suspension sample of cervical cells
US20120142089A1 (en) 2010-12-01 2012-06-07 Samsung Electronics Co., Ltd. Method of separating target cell in biological sample
CN103376228B (zh) 2012-04-27 2016-02-17 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 一种检测或辅助检测放射性肺纤维化的试剂盒
CN104535481B (zh) * 2014-12-29 2017-04-05 中国科学院长春光学精密机械与物理研究所 成像流式细胞仪
CN105200043B (zh) * 2015-06-26 2018-08-03 宋尔卫 一种用于评估乳腺癌预后风险的试剂盒

Also Published As

Publication number Publication date
EP3304041A1 (en) 2018-04-11
WO2016191504A1 (en) 2016-12-01
US20160349232A1 (en) 2016-12-01
US10627389B2 (en) 2020-04-21
CN107850526B (zh) 2022-09-30
CN107850526A (zh) 2018-03-27
US11988658B2 (en) 2024-05-21
EP3304041B1 (en) 2021-03-10
EP3304041A4 (en) 2018-11-07
US20200271638A1 (en) 2020-08-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Marrinucci et al. Fluid biopsy in patients with metastatic prostate, pancreatic and breast cancers
US11988658B2 (en) Methods of assessing cellular breast samples and compositions for use in practicing the same
Hellquist et al. Criteria for grading in the Ljubljana classification of epithelial hyperplastic laryngeal lesions. A study by members of the Working Group on Epithelial Hyperplastic Laryngeal Lesions of the European Society of Pathology
Kwok et al. Histological grading of breast cancer on needle core biopsy: the role of immunohistochemical assessment of proliferation
CN101672779B (zh) 用于在生物样品中进行稀有事件分析的高灵敏度多参数方法
JP2008533487A (ja) 循環腫瘍細胞を用いる転移性乳癌患者の療法中の各追跡期間ポイントでの無増悪および全生存を予測する方法
KR102412396B1 (ko) 객담유래 세포의 dna 메틸화 표현형결정에 의한 조기 폐암 검출
JP5548890B2 (ja) 細胞の画像を格付けするための方法
Bean et al. Recent developments in defining microinvasive and early invasive carcinoma of the uterine cervix
Brünagel et al. Nuclear matrix protein alterations associated with colon cancer metastasis to the liver
Dumont et al. PAX3/7–FOXO1 fusion status in older rhabdomyosarcoma patient population by fluorescent in situ hybridization
Bremmer et al. Comparative evaluation of genetic assays to identify oral pre‐cancerous fields
Maiques et al. Recent advances in tissue imaging for cancer research
Kang et al. A handheld device for potential point-of-care screening of cancer
Connolly et al. Role of the Surgical Pathologist in the Diagnosis and Management of the Cancer Patient
Ridgway et al. Perioperative diagnosis of cystosarcoma phyllodes of the breast may be enhanced by MIB-1 index
Peters et al. Identification of cell-surface markers for detecting breast cancer cells in ovarian tissue
Vijayavel et al. Correlation between histological grading and ploidy status in potentially malignant disorders of the oral mucosa: A flow cytometric analysis
CN110139656A (zh) 作为膀胱癌的生物标志物的角蛋白17
Biermann et al. c-KIT protein expression does not discriminate neoplastic from non-neoplastic intratubular germ cells.
Böhm et al. Urinary immunocytology—Promise or nonseller? A review with an opinion
Kinsella et al. Highlighting nuclear membrane staining in thyroid neoplasms with emerin: review and diagnostic utility
Fujino et al. Perineurioma in the sigmoid colon diagnosed and treated by endoscopic resection
JP2012022002A (ja) 循環腫瘍細胞を用いる転移性乳癌患者の療法中の各追跡期間ポイントでの無増悪および全生存を予測する方法
Coban et al. Emerin expression in well differentiated epithelial lesions of thyroid: implications in papillary thyroid carcinoma diagnosis and predicting malignant behavior