CN105200043B - 一种用于评估乳腺癌预后风险的试剂盒 - Google Patents

一种用于评估乳腺癌预后风险的试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN105200043B
CN105200043B CN201510366235.7A CN201510366235A CN105200043B CN 105200043 B CN105200043 B CN 105200043B CN 201510366235 A CN201510366235 A CN 201510366235A CN 105200043 B CN105200043 B CN 105200043B
Authority
CN
China
Prior art keywords
mir
hsa
seq
breast cancer
amplimer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201510366235.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105200043A (zh
Inventor
宋尔卫
龚畅
谭维格
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sun Yat Sen Memorial Hospital Sun Yat Sen University
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN201510366235.7A priority Critical patent/CN105200043B/zh
Publication of CN105200043A publication Critical patent/CN105200043A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105200043B publication Critical patent/CN105200043B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Abstract

本发明提供了一种用于评估乳腺癌预后风险的试剂盒，通过大数据临床验证试验表明，本发明所述12个miRNAs组合起来作为分子标记物，在ER/PR(+)HER2(‑)乳腺癌的预后风险评估方面具有突出优势。这12个miRNAs组合分子标记物首次应用于ER/PR(+)HER2(‑)乳腺癌miRNA检测试剂盒的开发，该乳腺癌miRNA检测试剂盒基于实时荧光定量PCR方法，可以实现ER/PR(+)HER2(‑)乳腺癌的预后评估，筛选有复发高风险的患者，指导临床个体化治疗，并提高治疗的精准性。

Description

一种用于评估乳腺癌预后风险的试剂盒
技术领域
本发明涉及一种试剂盒，尤其涉及用于评估ER/PR(+)HER2(-)乳腺癌预后风险的乳腺癌干细胞相关miRNA检测试剂盒。
背景技术
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，全世界每年约有200万的新增乳腺癌患者。乳腺癌是一类在分子水平上高度异质性的肿瘤，其在组织形态、免疫表型、生物学行为及治疗反应上存在着极大的差异，传统病理TNM分期相同的患者对临床治疗的反应和预后可能有很大的区别。
ER/PR(+)HER2(-)型是乳腺癌最常见的分子亚型，人群发病率约为65％～70％。在乳腺癌中预后最好，早期患者较多。与其他分子亚型乳腺癌相比，ER/PR(+)Her2(-)型乳腺癌的预后较好，但仍有约为15～30％的5年复发转移率。根据传统的乳腺癌的TNM临床分期、病理报告以及实验室指标来评估疾病的严重程度，并不足以有效地筛选出这15～30％可能会发生复发转移的高危人群。因此，寻找更加有效的分子指标或基因模型来预测ER/PR(+)HER2(-)型乳腺癌患者的预后，筛选出高危患者，指导临床治疗，是本发明的基本出发点。
乳腺癌干细胞具有放化疗及缺氧抵抗性、高致瘤性及高侵袭转移性等特征，在乳腺癌的发生发展及复发转移中发挥了重要作用，是乳腺癌复发的重要原因，与乳腺癌的预后密切相关。Ginestier et al.(Cell Stem Cell.2008June 10)和Jiang et al.(BreastCancer Research 2012)的研究证实，乳腺癌干细胞与ER阳性乳腺癌的预后密切相关。
miRNAs是一种包含约22个核苷酸的内源性非编码小RNA，可参与细胞的分化、增殖和凋亡过程，与肿瘤密切相关，一些miRNAs作为抑癌基因和原癌基因已被证实。研究还证实，miRNAs参与调控乳腺癌干细胞的生物学功能，而在肿瘤组织中，乳腺癌干细胞相关miRNAs的表达与肿瘤发生、发展和疗效、预后判断等密切相关，具有潜在的癌症预测和预后价值。单个miRNA可作为肿瘤预后评估的分子标记物，但其特异性和敏感性低于现有的传统预后评估指标，如TNM分期等。
传统的乳腺癌诊疗主要是根据TNM临床分期、病理报告以及实验室指标来评估疾病的严重程度和选择不同手段的综合治疗。现代医学模式的转变提示恶性肿瘤治疗应由基于表型的循证医学模式向基于基因的个体化医学模式转变,如miRNAs基因预后模型。马俊等(Lancet Oncol 2012)的研究发现，一个由5个miRNA构成的分子标签和TNM临床分期联合构建的预后危险评分模型能很好地预测鼻咽癌患者的预后。罗俊航等(Lancet Oncol2013；)的研究则通过芯片筛查获得的6个miRNA检测结果结合NCCN指南的4个高危指标构建新型预后模型，可以使Ⅱ期结肠癌患者“被”高危的风险减低20％以上。这些研究结果提示，将乳腺癌临床病理学预后模型与miRNA基因表达谱联合,有助于预测患者预后。
石蜡标本组织中miRNA的含量较低，需要一个非常敏感而特异的检测方法；miRNA引物序列短，引物设计比较困难，没有针对性的软件可以利用，故引物及体系均需要优化过程。目前miRNA的高通量检测一般采用芯片技术，成本高、特异性和敏感度有限，不能满足临床上零星标本的实时检测需求；少数miRNA的实时检测多采用Taqman探针法，部分已形成商业化试剂盒，但成本和售价高昂。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供了一种用于评估乳腺癌预后风险的试剂盒，尤其是针对ER/PR(+)HER2(-)乳腺癌预后风险评估。
ER/PR表达阳性：即免疫组化结果显示ER/PR阳性(+～+++)，或ER/PR表达超过1％。HER2表达阴性：即免疫组化结果显示HER2表达为(-)，或FISH检测结果(-)。
为实现上述目的，所采取的技术方案：一种用于评估乳腺癌预后风险的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括hsa-miR-21-5p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-7-5p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-182-5p、hsa-miR-200a-5p、hsa-miR-200b-5p、hsa-miR-200c-5p、hsa-miR-30c-5p、hsa-miR-181a-5p和hsa-let-7g-5p的扩增引物；所述hsa-miR-21-5p的扩增引物序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，所述hsa-miR-22-5p的扩增引物序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，所述hsa-miR-7-5p的扩增引物序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示，所述hsa-miR-125b-5p的扩增引物序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示，所述hsa-miR-93-5p的扩增引物序列如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示，所述hsa-miR-182-5p的扩增引物序列如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示，所述hsa-miR-200a-5p的扩增引物序列如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示，所述hsa-miR-200b-5p的扩增引物序列如SEQ ID No.15和SEQ ID No.16所示，所述hsa-miR-200c-5p的扩增引物序列如SEQID No.17和SEQ ID No.18所示，所述hsa-miR-30c-5p的扩增引物序列如SEQ ID No.19和SEQ ID No.20所示，所述hsa-miR-181a-5p的扩增引物序列如SEQ ID No.21和SEQ IDNo.22所示，所述hsa-let-7g-5p的扩增引物序列如SEQ ID No.23和SEQ ID No.24所示。
优选地，所述试剂盒包括内参U6的扩增引物。
优选地，所述内参U6的扩增引物如SEQ ID No.25和SEQ ID No.26所示。
优选地，所述试剂盒包括用于配制逆转录反应体系的试剂。
优选地，所述用于配制逆转录反应体系的试剂包括逆转录酶、dNTP、Randomprimers、Oligo(dT)12-18、RNasin、逆转录缓冲液和纯水。
优选地，所述试剂盒包括用于配制定量PCR反应体系的试剂。
优选地，所述用于配制定量PCR反应体系的试剂SYBR Green I、无核酸酶纯水。
优选地，所述试剂盒包括用于提取RNA的试剂。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种用于评估乳腺癌预后风险的试剂盒，与现有技术相比，具有以下优点：
(1)通过大数据临床验证试验表明，本发明所述12个miRNAs(hsa-miR-21-5p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-7-5p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-182-5p、hsa-miR-200a-5p、hsa-miR-200b-5p、hsa-miR-200c-5p、miR-30c-5p、miR-181a-5p和hsa-let-7g-5p)组合起来作为分子标记物，在ER/PR(+)HER2(-)乳腺癌的预后风险评估方面具有突出优势。这12个miRNAs组合分子标记物首次应用于ER/PR(+)HER2(-)乳腺癌miRNA检测试剂盒的开发，该乳腺癌miRNA检测试剂盒基于实时荧光定量PCR方法，可以实现ER/PR(+)HER2(-)乳腺癌的预后评估，筛选有复发高风险的患者，指导临床个体化治疗，并提高治疗的精准性。
(2)本发明选择了12个乳腺癌干细胞相关miRNAs(hsa-miR-21-5p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-7-5p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-182-5p、hsa-miR-200a-5p、hsa-miR-200b-5p、hsa-miR-200c-5p、miR-30c-5p、miR-181a-5p和hsa-let-7g-5p)进行组合，开发成检测试剂盒，其检测快速方便、检测灵敏度、特异度高、成本低、可以满足绝大对数肿瘤病人的检测需要，应用范围极广，经临床验证预测准确度高。
(3)针对乳腺癌组织标本中作为定量反应的内参，本发明引入稳定的人源RNA序列U6作为内参对照RNA，并优化设计了针对U6的内参正向引物，极大提高了miRNA检测时相对定量的准确度。
附图说明
图1为采用本发明的试剂盒联合检测12miRNAs(hsa-miR-21-5p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-7-5p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-182-5p、hsa-miR-200a-5p、hsa-miR-200b-5p、hsa-miR-200c-5p、miR-30c-5p、miR-181a-5p和hsa-let-7g-5p)与TNM分期的ROC曲线图；
图2为采用本发明的试剂盒检测样本的临床预后与预测风险相关性散点图；
图3为采用本发明的试剂盒检测样本的12个miRNAs(hsa-miR-21-5p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-7-5p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-182-5p、hsa-miR-200a-5p、hsa-miR-200b-5p、hsa-miR-200c-5p、miR-30c-5p、miR-181a-5p和hsa-let-7g-5p)以及内参U6的溶解曲线峰图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本发明所述用于评估乳腺癌预后风险的试剂盒的一种实施例，所述试剂盒包括hsa-miR-21-5p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-7-5p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-182-5p、hsa-miR-200a-5p、hsa-miR-200b-5p、hsa-miR-200c-5p、miR-30c-5p、miR-181a-5p和hsa-let-7g-5p的扩增引物；内参U6的扩增引物；用于提取RNA的试剂；用于配制逆转录反应体系的试剂；和用于配制定量PCR反应体系的试剂。
所述hsa-miR-21-5p的扩增引物序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，所述hsa-miR-22-5p的扩增引物序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，所述hsa-miR-7-5p的扩增引物序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示，所述hsa-miR-125b-5p的扩增引物序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示，所述hsa-miR-93-5p的扩增引物序列如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示，所述hsa-miR-182-5p的扩增引物序列如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示，所述hsa-miR-200a-5p的扩增引物序列如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示，所述hsa-miR-200b-5p的扩增引物序列如SEQ ID No.15和SEQ ID No.16所示，所述hsa-miR-200c-5p的扩增引物序列如SEQ ID No.17和SEQ ID No.18所示，所述hsa-miR-30c-5p的扩增引物序列如SEQ ID No.19和SEQ ID No.20所示，所述hsa-miR-181a-5p的扩增引物序列如SEQ ID No.21和SEQ ID No.22所示，所述hsa-let-7g-5p的扩增引物序列如SEQ IDNo.23和SEQ ID No.24所示；所述内参U6的扩增引物如SEQ ID No.25和SEQ ID No.26所示。所述用于配制逆转录反应体系的试剂包括逆转录酶、dNTP、Random primers、Oligo(dT)12-18、RNasin、逆转录缓冲液和纯水。所述用于配制定量PCR反应体系的试剂SYBR GreenI、无核酸酶纯水。
1、hsa-miR-21-5p的序列：TAGCTTATCAGACTGA TGTTGA(SEQ ID No.27)；
正向引物：5’ACACTCCAGCTGGGTAGCTTATCAGACTGAT 3’(SEQ ID No.1)；
反向引物：5’CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCAACA3’(SEQ ID No.2)。
2、hsa-miR-22-5p的序列：AGTTCTTCAGTGGCAA GCTTTA(SEQ ID No.28)；
正向引物：5’ACACTCCAGCTGGGAGTTCTTCAGTGGCAAG 3’(SEQ ID No.3)；
反向引物：5’CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTAAAGC 3’(SEQ IDNo.4)。
3、hsa-miR-7-5p的序列：TGGAAGACTAGTGATTT TGTTGT(SEQ ID No.29)；
正向引物：5’ACACTCCAGCTGGGTGGAAGACTAGTGATTTT 3’(SEQ ID No.5)；
反向引物：5’CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACAACA3’(SEQ ID No.6)。
4、hsa-miR-125b-5p的序列：TCCCTGAGACCCTAAC TTGTGA(SEQ ID No.30)；
正向引物：5’ACACTCCAGCTGGGTCCCTGAGACCCTAACT 3’(SEQ ID No.7)；
反向引物：5’CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCACAA3’(SEQ ID No.8)。
5、hsa-miR-93-5p的序列：CAAAGTGCTGTTCGTGC AGGTAG(SEQ ID No.31)；
正向引物：5’ACACTCCAGCTGGGCAAAGTGCTGTTCGTGCA 3’(SEQ ID No.9)；
反向引物：5’CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTACCT 3’(SEQ IDNo.10)。
6、hsa-miR-182-5p的序列：TTTGGCAATGGTAGAACT CACACT(SEQ ID No.32)；
正向引物：5’ACACTCCAGCTGGGTTTGGCAATGGTAGAACTC 3’(SEQ ID No.11)；
反向引物：5’CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG AGTGTG 3’(SEQ IDNo.12)。
7、hsa-miR-200a-5p的序列：CATCTTACCGGACAGT GCTGGA(SEQ ID No.33)；
正向引物：5’ACACTCCAGCTGGGCATCTTACCGGACAGTG 3’(SEQ ID No.13)；
反向引物：5’CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG TCCAGC 3’(SEQ IDNo.14)。
8、hsa-miR-200b-5p的序列：TAATACTGCCTGGTAA TGATGA(SEQ ID No.34)；
正向引物：5’ACACTCCAGCTGGGTAATACTGCCTGGTAAT 3’(SEQ ID No.15)；
反向引物：5’CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCATCA 3’(SEQ IDNo.16)。
9、hsa-miR-200c-5p的序列：TAATACTGCCGGGTAAT GATGGA(SEQ ID No.35)；
正向引物：5’ACACTCCAGCTGGGTAATACTGCCGGGTAATG 3’(SEQ ID No.17)；
反向引物：5’CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG TCCATC 3’(SEQ IDNo.18)。
10、hsa-miR-30c的序列：TGTAAACATCCTACACT CTCAGC(SEQ ID No.36)；
正向引物：5’ACACTCCAGCTGGGTGTAAACATCCTACACTC3’(SEQ ID No.19)
反向引物：5’CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGC TGAG3’(SEQ IDNo.20)
11、hsa-miR-181a-5p的序列：AACATTCAACGCTGTCG GTGAGT(SEQ ID No.37)；
正向引物：5’ACACTCCAGCTGGGAACATTCAACGCTGTCGG3’(SEQ ID No.21)
反向引物：5’CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACTCAC3’(SEQ ID No.22)
12、hsa-let-7g-5p的序列：CTGTACAGGCCACTG CCTTGC(SEQ ID No.38)；
正向引物：5’ACACTCCAGCTGGGCTGTACAGGCCACTGC 3’(SEQ ID No.23)；
反向引物：5’CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGCAAGG 3’(SEQ IDNo.24)。
13、U6的序列：CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA(SEQ ID No.39)；
正向引物：5’AACCAAACCTACCCACAACG 3’(SEQ ID No.25)；
反向引物：5’ACCACTAAGTCAATCCCAGGTG 3’(SEQ ID No.26)。
实施例:2：采用本发明所述试剂盒检测样本miRNA的方法
(A)石蜡包埋组织RNA提取(BIOTAKE，石蜡包埋组织RNA快速提取试剂盒(离心柱型)，目录号：RP5322(100次)):
1.将石蜡包埋的组织切成5 10μm的薄片后置于1.5ml离心管中。
2.加入1ml二甲苯，涡旋振荡10秒。
3.室温12,000rpm离心2min。去掉上清液，小心不要去掉沉淀。
4.加入1ml无水乙醇，涡旋混匀，室温12,000rpm离心2min。
5.去掉上清液，小心不要去掉沉淀。室温晾干10min或直至残留的乙
醇已挥发完全。
6.加入240μl溶液PTL和10μl蛋白酶K溶液，涡旋混匀。55℃孵育15min，再80℃15min。
7.加入750μl裂解液MRL，涡旋混匀，室温放置2min。
8.加入0.2ml氯仿。盖紧样品管盖，剧烈振荡15秒并将其在室温下孵
育3分钟。
9.于4℃12,000rpm离心10分钟，样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，RNA存在于水相中。把水相(约600μl)转移到新管中，进行下一步操作。
10.加入等体积70％乙醇(请先检查是否已加入无水乙醇！)，颠倒混匀(此时可能会出现沉淀)。得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱RA中(吸附柱套在收集管内，溶液太多可分次过柱)。
11.10,000rpm离心45秒，弃掉废液，将吸附柱重新套回收集管。
12.加500μl去蛋白液RE，12,000rpm离心45秒，弃掉废液。
13.加入700μl漂洗液RW(请先检查是否已加入无水乙醇！)，12,000rpm离心60秒，弃掉废液。
14.加入500μl漂洗液RW，12,000rpm离心60秒，弃掉废液。
15.将吸附柱RA放回空收集管中，掀开离心柱盖，12,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
16.取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，加入30μl RNase free water(事先在65-70℃水浴中加热效果更好)，室温放置2分钟，
12,000rpm离心1分钟。收集得到纯净RNA保存于-20℃或者更低。
(B)cDNA的制备(RT)
电泳检验RNA样本质量。
准备Mix 1(20μL体系)
分装于各管中。
加入2μL RNA样本(每管50-1000ng)，在70℃加热5分钟以变性破坏RNA的二级结构，结束后置于冰上2分钟。
进行预变性时准备Mix 2
AMV R.T.指AMV逆转录酶。
分装至各管预变性结束并冷却的管中。如有气泡，稍离心。
室温净置5分钟。
根据逆转录酶工作温度设定PCR仪，一般反应时间为1小时左右。将样品放入，进行反应。反应结束时应有95℃5分钟的灭活步骤，将逆转录酶灭活，防止影响后续的PCR反应。
合成的cDNA第一链可被储存在-20℃。
(C)q RT-PCR检测:
①按下列组成配制PCR反应液(10μl体系)。
项目 用量
SYBR Green I 5μL
Primer-F 0.5μL
Primer-R 0.5μL
cDNA 1μL
RNase Free dH2O Up to 10μL
②反应条件。
3Step PCR的反应条件：
94℃ 30sec
55～65℃ 30sec 30Cycles
72℃ 1min/kbp。
(D)风险值计算
1、公式：Risk score＝0.252(status of miR-93)-0.314(status of miR-200c)+0.348(status of miR-181a)+0.182(status of miR-182)-0.143(status of miR-7)-0.126(status of miR-200a)+0.011(status of miR-21)+0.523(status of let-7g)-0.794(status of miR-22)+0.132(status of miR-30c)-0.137(status of miR-200b)+0.030(status of miR-125b)；
2、高危患者筛选：cut-off值为5.44。样本Risk score<5.44为低危，Risk score≥5.44为高危。
实施例3：本发明所述试剂盒的效果评价
图1为采用本发明的试剂盒联合检测12miRNAs(miR-21、miR-22、miR-7、miR-125b、miR-93、miR-182、miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-30c、miR-181a和Let-7g)与TNM分期的ROC曲线图，结果显示，与传统的TNM分期相比，12-miRNA-based模型具有更好的敏感性和特异性。
采用本发明的试剂盒检测样本的Risk Score计算公式、12个miRNAs相关系数及cut-off值如下所示。其中，miR-200c、miR-7、miR-22、miR-200b、miR-200a、与乳腺癌的预后呈负相关，其余miRNA与乳腺癌的预后正相关。通过Risk Score计算公式计算得到个体患者的风险值大于或等于5.44的为高危患者，小于5.44的为低危患者。
Risk score cutoff：：5.44(High risk≥5.44，Low risk＜5.44)
上述miR-21指hsa-miR-21-5p，miR-22指hsa-miR-22-5p，miR-7指hsa-miR-7-5p，miR-125b指hsa-miR-125b-5p，miR-93指hsa-miR-93-5p，miR-182指hsa-miR-182-5p，miR-200a指hsa-miR-200a-5p，miR-200b指hsa-miR-200b-5p，miR-200c指hsa-miR-200c-5p，miR-30c指miR-30c-5p，miR-181a指miR-181a-5p，Let-7g指hsa-let-7g-5p。
图2为采用本发明的试剂盒检测样本的临床预后与预测风险相关性散点图，结果显示，在123例样本中，运用本发明预测出的为低风险的基本无5年复发转移，而出现5年复发转移的样本均为本发明预测出的高风险病例。
图3为采用本发明的试剂盒检测样本的12个miRNAs(hsa-miR-21-5p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-7-5p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-182-5p、hsa-miR-200a-5p、hsa-miR-200b-5p、hsa-miR-200c-5p、miR-30c-5p、miR-181a-5p和hsa-let-7g-5p)以及内参U6的溶解曲线图。12个miRNAs及U6的溶解曲线及溶解峰图，均呈单峰，提示PCR扩增产物特异性(纯度)高，基本不存在非特异性扩增产物。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (8)

1.hsa-miR-21-5p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-7-5p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-182-5p、hsa-miR-200a-5p、hsa-miR-200b-5p、hsa-miR-200c-5p、hsa-miR-30c-5p、hsa-miR-181a-5p和hsa-let-7g-5p的组合在制备用于评估乳腺癌预后风险的试剂盒中的用途，其特征在于，所述试剂盒包括hsa-miR-21-5p、hsa-miR-22-5p、hsa-miR-7-5p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-182-5p、hsa-miR-200a-5p、hsa-miR-200b-5p、hsa-miR-200c-5p、hsa-miR-30c-5p、hsa-miR-181a-5p和hsa-let-7g-5p的扩增引物；所述hsa-miR-21-5p的扩增引物序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，所述hsa-miR-22-5p的扩增引物序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示，所述hsa-miR-7-5p的扩增引物序列如SEQ IDNo.5和SEQ ID No.6所示，所述hsa-miR-125b-5p的扩增引物序列如SEQ ID No.7和SEQ IDNo.8所示，所述hsa-miR-93-5p的扩增引物序列如SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示，所述hsa-miR-182-5p的扩增引物序列如SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示，所述hsa-miR-200a-5p的扩增引物序列如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示，所述hsa-miR-200b-5p的扩增引物序列如SEQ ID No.15和SEQ ID No.16所示，所述hsa-miR-200c-5p的扩增引物序列如SEQ ID No.17和SEQ ID No.18所示，所述hsa-miR-30c-5p的扩增引物序列如SEQ IDNo.19和SEQ ID No.20所示，所述hsa-miR-181a-5p的扩增引物序列如SEQ ID No.21和SEQID No.22所示，所述hsa-let-7g-5p的扩增引物序列如SEQ ID No.23和SEQ ID No.24所示。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述试剂盒包括内参U6的扩增引物。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述内参U6的扩增引物如SEQ ID No.25和SEQ ID No.26所示。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述试剂盒包括用于配制逆转录反应体系的试剂。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述用于配制逆转录反应体系的试剂包括逆转录酶、dNTP、Random primers、Oligo(dT)12-18、RNasin、逆转录缓冲液和纯水。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述试剂盒包括用于配制定量PCR反应体系的试剂。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述用于配制定量PCR反应体系的试剂SYBR Green I、无核酸酶纯水。
8.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述试剂盒包括用于提取RNA的试剂。
CN201510366235.7A 2015-06-26 2015-06-26 一种用于评估乳腺癌预后风险的试剂盒 Active CN105200043B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510366235.7A CN105200043B (zh) 2015-06-26 2015-06-26 一种用于评估乳腺癌预后风险的试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510366235.7A CN105200043B (zh) 2015-06-26 2015-06-26 一种用于评估乳腺癌预后风险的试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105200043A CN105200043A (zh) 2015-12-30
CN105200043B true CN105200043B (zh) 2018-08-03

Family

ID=54948005

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510366235.7A Active CN105200043B (zh) 2015-06-26 2015-06-26 一种用于评估乳腺癌预后风险的试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105200043B (zh)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3304041B1 (en) * 2015-05-26 2021-03-10 IncellDx, Inc. Methods of assessing cellular breast samples and compositions for use in practicing the same
CN105969892B (zh) * 2016-07-14 2019-07-19 北京大学人民医院 Csrp2在作为评估成人b-all患者预后风险标记物中的应用
CN106222270A (zh) * 2016-08-02 2016-12-14 滨州医学院 一种乳腺癌发生或转移的诊断试剂盒
US10738363B2 (en) 2016-08-31 2020-08-11 National Central University Analyzer and analytical method for predicting prognosis of cancer radiotherapy
US20210079478A1 (en) * 2017-12-13 2021-03-18 Hiroshima University Method for assisting in detection of breast cancer
CN109055544B (zh) * 2018-09-28 2021-12-28 新乡医学院 动脉粥样硬化分子标志物及其应用
CN110184351A (zh) * 2019-05-29 2019-08-30 南通普惠精准医疗科技有限公司 检测试剂盒的应用
CN110607366A (zh) * 2019-06-18 2019-12-24 中山大学孙逸仙纪念医院 一种用于预测激素受体阳性乳腺癌术前化疗敏感性的试剂盒
CN111004846A (zh) * 2019-12-17 2020-04-14 中山大学附属第三医院 用于检测视神经脊髓炎的miRNA标志物及其应用
CN113555118B (zh) * 2021-07-26 2023-03-31 内蒙古自治区人民医院 一种病症程度的预测方法、装置、电子设备及存储介质

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101341259A (zh) * 2005-08-01 2009-01-07 俄亥俄州立大学研究基金会 用于乳腺癌的诊断、预后和治疗的基于MicroRNA的方法和组合物
CN101988061A (zh) * 2009-07-30 2011-03-23 江苏命码生物科技有限公司 乳腺癌检测标记物及其检测方法、试剂盒和生物芯片
WO2011110644A1 (en) * 2010-03-11 2011-09-15 National University Of Ireland, Galway Detection and quantification of micrornas in the circulation and the use of circulating micrornas as biomarkers for cancer
CN104685065A (zh) * 2012-01-20 2015-06-03 俄亥俄州立大学 浸润性和预后的乳腺癌生物标志物标签

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101341259A (zh) * 2005-08-01 2009-01-07 俄亥俄州立大学研究基金会 用于乳腺癌的诊断、预后和治疗的基于MicroRNA的方法和组合物
CN101988061A (zh) * 2009-07-30 2011-03-23 江苏命码生物科技有限公司 乳腺癌检测标记物及其检测方法、试剂盒和生物芯片
WO2011110644A1 (en) * 2010-03-11 2011-09-15 National University Of Ireland, Galway Detection and quantification of micrornas in the circulation and the use of circulating micrornas as biomarkers for cancer
CN104685065A (zh) * 2012-01-20 2015-06-03 俄亥俄州立大学 浸润性和预后的乳腺癌生物标志物标签

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
De novo sequencing of circulating miRNAs identifies novel markers predicting outcome of locally advanced breast cancer;Xiwei Wu et al;《Journal of Translational Medicine》;20120308;第10卷;全文 *
MicroRNA Gene Expression Deregulation in Human Breast Cancer;Marilena V. Iorio et al.;《Cancer Res》;20050815;第65卷(第16期);全文 *
MicroRNA miR-21 overexpression in human breast cancer is associated with advanced clinical stage, lymph node metastasis and patient poor prognosis;LI-XU YAN et al;《RNA》;20081231;第14卷;全文 *
MicroRNA sequence and expression analysis in breast tumors by deep sequencing;Thalia A. Farazi et al;《Cancer Research》;20110517;摘要，第9-10、11-12页，Supplement Table 4 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN105200043A (zh) 2015-12-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105200043B (zh) 一种用于评估乳腺癌预后风险的试剂盒
Wu et al. Advances in molecular biomarkers for gastric cancer: miRNAs as emerging novel cancer markers
Cao et al. Comprehensive expression profiling of microRNAs in laryngeal squamous cell carcinoma
Feber et al. MicroRNA prognostic signature for nodal metastases and survival in esophageal adenocarcinoma
Hong et al. MicroRNA expression profiling of diagnostic needle aspirates from surgical pancreatic cancer specimens
Shih et al. Amplification of the ch19p13. 2 NACC1 locus in ovarian high-grade serous carcinoma
Liang et al. Prognostic microRNAs and their potential molecular mechanism in pancreatic cancer: A study based on The Cancer Genome Atlas and bioinformatics investigation
Baratieh et al. Aberrant expression of PlncRNA-1 and TUG1: potential biomarkers for gastric cancer diagnosis and clinically monitoring cancer progression
Nakka et al. Biomarker significance of plasma and tumor miR-21, miR-221, and miR-106a in osteosarcoma
Záveský et al. Ascites-derived extracellular microRNAs as potential biomarkers for ovarian cancer
Zhu et al. Expression of microRNA‐218 in human pancreatic ductal adenocarcinoma and its correlation with tumor progression and patient survival
Sethi et al. Clinical implication of microRNAs in molecular pathology: an update for 2018
CN106755344A (zh) 用于胰腺癌临床预后诊断的分子标记物及其应用
Fu et al. MicroRNA-19a acts as a prognostic marker and promotes prostate cancer progression via inhibiting VPS37A expression
Zhang et al. Integrated miRNA profiling and bioinformatics analyses reveal potential causative miRNAs in gastric adenocarcinoma
Nam et al. Identification of a novel MicroRNA panel associated with metastasis following radical prostatectomy for prostate cancer
Kang et al. Do microRNA 96, 145 and 221 expressions really aid in the prognosis of prostate carcinoma?
Wang et al. Identification of potential signatures and their functions for acute lymphoblastic leukemia: a study based on the cancer genome atlas
Yang et al. Upregulation of microRNA miR-141-3p and its prospective targets in endometrial carcinoma: a comprehensive study
Wei et al. microRNA‐messenger RNA regulatory network of esophageal squamous cell carcinoma and the identification of miR‐1 as a biomarker of patient survival
Chen et al. Regulation of microRNAs by rape bee pollen on benign prostate hyperplasia in rats
Chen et al. Identification of key regulators of hepatitis C virus-induced hepatocellular carcinoma by integrating whole-genome and transcriptome sequencing data
Pillar et al. MicroRNAs as predictors for CNS relapse of systemic diffuse large B-cell lymphoma
Zadran et al. Surprisal analysis of Glioblastoma Multiform (GBM) microRNA dynamics unveils tumor specific phenotype
Kong et al. Expression signatures and roles of Micro RNA s in human oesophageal adenocarcinomas

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20190111

Address after: 510120 No. 107 Yanjiangxi Road, Guangzhou, Guangdong Province

Patentee after: Sun Yat-Sen Memorial Hospital, Sun Yat-Sen University

Address before: 510120 No. 107 Yanjiangxi Road, Guangzhou, Guangdong Province

Co-patentee before: Gong Chang

Patentee before: Song Erwei

Co-patentee before: Tan Weige

TR01 Transfer of patent right