CN110184351A

CN110184351A - 检测试剂盒的应用

Info

Publication number: CN110184351A
Application number: CN201910458624.0A
Authority: CN
Inventors: 王国华; 周佳敏; 王金星; 狄文军
Original assignee: Nantong Pratt Precision Medical Technology Co Ltd
Current assignee: Nantong Pratt Precision Medical Technology Co Ltd
Priority date: 2019-05-29
Filing date: 2019-05-29
Publication date: 2019-08-30

Abstract

本发明提供一种检测试剂盒在检测乳腺癌化疗过程中肿瘤细胞是否具有耐药和转移风险中的应用，所述检测试剂盒通过实时荧光定量PCR检测受试体内的高风险miRNA水平来评估乳腺癌化疗过程中肿瘤细胞是否具有耐药和转移风险，依托于miRNA的检测，是一种相对便捷的方式，在兼顾了准确率的同时考虑到操作的可行性；且通过将高危miRNA对比正常人体内水平进行分级以便评估耐药与转移风险的方法，制定了基于临床前瞻性的预测性程序，兼顾了检测的稳定性和均一性。

Description

检测试剂盒的应用

技术领域

本发明涉及医药领域，具体地，涉及一种检测试剂盒在检测乳腺癌化疗过程中肿瘤细胞是否具有耐药和转移风险中的应用。

背景技术

乳腺癌是女性中最为常见的恶性肿瘤之一，全球乳腺癌发病率自20世纪70年代末开始一直呈上升趋势。由于乳腺癌是一种异质性肿瘤，其组织形态和治疗反映上都存在着巨大差异，因此针对不同形态的乳腺癌需要采取不同的治疗方案。

因为乳腺癌对化疗相对敏感，故化疗仍然是乳腺癌的治疗的重要途径。但由于乳腺癌的异质性，在化疗过程中癌细胞易产生耐药并发生转移，从而危及患者生命。因此，如何检测一些指标来衡量和预估患者化疗过程中的有效程度已称为亟待解决的问题。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种检测试剂盒在检测乳腺癌化疗过程中肿瘤细胞是否具有耐药和转移风险中的应用。

根据本发明，所述检测试剂盒通过实时荧光定量PCR检测受试体内的高风险miRNA水平来评估乳腺癌化疗过程中肿瘤细胞是否具有耐药和转移风险。

根据本发明，所述高风险miRNA包括以下中的一种或多种：miR-130b、miR-29a、miR-132、miR-212、miR-93、miR-222、miR-21、miR-221及miR-29a。

根据本发明，将所述高风险miRNA分为A、B与C级，其中，A级包括：miR-132、miR-212、miR-222，B级包括miR-130b、miR-93、miR-21，C级包括miR-221、mi-R21、miR-29a。

根据本发明，所述用于检测乳腺癌化疗过程中肿瘤细胞是否具有耐药风险包括：

通过针对受试体的肿瘤组织进行实时荧光定量PCR检测，得到第一PCR检测结果；

根据预设高危miRNA分级标准对所述所述第一PCR检测结果进行评估，得到耐药评分。

根据本发明，所述通过针对受试体的肿瘤组织进行实时荧光定量PCR检测，得到第一PCR检测结果的步骤包括：

对提取的肿瘤组织进行称重，并在加入TRizol试剂混匀处理后，得到第一混合溶液，将所述第一混合溶液进行裂解；

在所述第一混合溶液中加入氯仿，混匀处理后，得到第二混合溶液，将所述第二混合溶液静置；

对静置处理后的所述第二混合溶液进行离心；

获取离心后的所述第二混合溶液的上清液，并向所述第二混合溶液的上清液中加入预冷异丙醇，混匀处理后，得到第三混合溶液；

对所述第三混合溶液进行离心；

在舍弃所述第三混合溶液的上清液后的剩余溶液中，加入乙醇洗涤沉淀后进行离心；

舍弃离心后的上清液，并蒸发剩余溶液中的乙醇；

加入RNase-free water溶解RNA；

测定总RNA浓度，并取RNA逆转录得到的cDNA后进行扩增。

根据本发明，所述获取离心后的所述第二混合溶液的上清液，并向所述第二混合溶液的上清液中加入预冷异丙醇的步骤包括：所述第二混合溶液的上清液与所述预冷异丙醇的体积比为1:1。

根据本发明，用于检测乳腺癌化疗过程中肿瘤细胞是否具有转移风险包括：

通过针对受试体的外周血液进行实时荧光定量PCR检测，得到第二PCR检测结果；

根据预设高危miRNA分级标准对所述第二PCR检测结果进行评估，得到转移评分。

根据本发明，所述通过针对受试体的外周血液进行实时荧光定量PCR检测，得到第二PCR检测结果的步骤包括：

提取全血溶液，并在加入TRizol试剂混匀处理后，得到第一混合溶剂，静置所述第一混合溶剂；

在所述第一混合溶剂中加入氯仿，在静置处理后，得到第二混合溶剂，对所述第二混合溶剂进行离心；

获取离心处理后的所述第二混合溶剂的上清液，并向上清液中加入异丙醇，混匀处理后静置，得到第三混合溶剂；

对所述第三混合溶剂进行离心，并在舍弃离心后的所述第三混合溶剂的上清液后的剩余溶剂中加入乙醇，混匀处理后，得到第四混合溶剂；

对所述第四混合溶剂进行离心，舍弃所述第四混合溶剂的上清液；

干燥舍弃所述第四混合溶液的上清液后的剩余溶剂，并加入RNase-free water溶解RNA；

分光光度计测OD值，测定总RNA浓度，并取RNA逆转录得到的cDNA后进行扩增。

根据本发明，所述提取全血，并在加入TRizol试剂混匀处理后，得到第一混合溶剂的步骤包括：所述全血与所述TRizol试剂的体积比例为1:10。

本发明与现有技术相比具有如下有益效果：提供检测试剂盒在检测乳腺癌化疗过程中肿瘤细胞是否具有耐药和转移风险中的应用，通过检测受试体内的高风险miRNA水平来检测乳腺癌化疗过程中肿瘤细胞是否具有耐药和转移风险，填补了目前针对乳腺癌耐药及转移缺乏有效的检测方法的空白；且主要依托于miRNA的检测，是一种相对便捷的方式，在兼顾了准确率的同时考虑到操作的可行性。本发明独创性地采用了回顾式研究的方法发现了发生耐药或转移的乳腺癌患者体内的高危miRNA，并对比正常人体内水平进行分级以便评估的方法，同时制定了基于临床前瞻性的预测性程序，兼顾了检测的稳定性和均一性。

附图说明

说明书附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。本发明公开的实施例和视图为示例性的，仅用于解释本发明，而不能视为对本发明的限制。

图1为miR-130b在肿瘤组织和癌旁组织中的表达示意图。

图2A为miR-132在药物敏感病人和药物不敏感病人体内的表达示意图。

图2B为miR-212在药物敏感病人和药物不敏感病人体内的表达示意图。

图3A为扩增引物序列示意图。

图3B为高危miRNA的分级标准示意图。

图4A为肿瘤组织内miRNA含量确定耐药评分流程图。

图4B为外周血液内miRNA含量确定转移评分流程图。

主要元件符号说明

无

如下具体实施方式将结合上述附图进一步说明本发明。

具体实施方式

下面结合参考附图对本发明的方案进行详细解释，本领域技术人员将会理解，下面示例仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

除非另有定义，本文使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。

本领域技术人员应认识到，许多与本文所述类似或等同的方法和材料能够用于实践本发明。根据以下结合附图所进行的详细描述，本发明的其他方面和优点将变得显而易见，本发明实施例的各种特征在附图中通过举例的方式加以说明。实际上，本发明决不受限于所描述的方法和材料。为了方便起见，此处收集在本说明书、实施例和所附权利要求书中使用的某些术语。

以下术语和短语具有以下所示的含义，除非本文中另外提供。除非另有明确说明或从上下文中可明显看出，下列术语和短语不排除所述术语或短语在其所属领域已具有的含义。本发明的范围仅由权利要求限制，以下定义仅用于帮助描述特定实施例，并不旨在限制所要求保护的发明。除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语的含义均与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的一样。

“有益结果”包括但不限于减轻或减缓疾病的严重性，阻止疾病恶化，治愈疾病状况，预防疾病状况发展，降低患者疾病的发病机率并延长患者寿命或预期寿命。

“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”是指需要诊断，预后或治疗的任何受试者，特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括但不限于人、家畜、农场动物、动物园动物、运动动物、宠物动物例如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛；灵长类动物如猿、猴、猩猩和黑猩猩；犬科动物如狗和狼；猫科动物如猫、狮子和老虎等；马科动物如马、驴和斑马；饲养动物如牛、猪和羊；有蹄类动物如鹿和长颈鹿；啮齿动物如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠。根据某个实施例，哺乳动物是人。该术语不表示特定的年龄或性别。因此，成人和新生儿，像胎儿，无论是男性还是女性，都包含在该术语的范围内。

本文所用的“治疗”和“处理”是指诊断、预防和治疗，其目的是预防或减缓(减轻)靶标病理状况，预防病理状况，追求或获得有益效果，或即使治疗最终不成功，也能降低个体发病率。需要治疗的人包括已患病者，易患病者，及易感人群。治疗实例包括但不限于监察，观测，外科手术，化学疗法，免疫治疗，放射治疗(例如大剂量血管外照射，立体定向放射外科手术(γ刀)和分级立体定向放射治疗(FSR))，局部治疗，全身治疗，疫苗疗法，病毒疗法，分子靶向治疗或其组合。

“患者结果”是指患者是否由于治疗而存活或死亡。本发明提供给患者更准确的预后增加了患者存活的机会。

我们以前的研究发现，目前对于乳腺癌的治疗手段多样化，包括手术、放疗、化疗等，其中化疗的方法也是常见的治疗手段。乳腺癌是一种对化疗中度敏感的肿瘤，化疗在乳腺癌的治疗中起着重要的作用，尤其是对于癌细胞已经扩散的患者。

但由于乳腺癌的异质性，在化疗过程中癌细胞易产生耐药并发生转移，从而危及患者生命。因此，如何设定一些指标来衡量和预估患者化疗过程中的有效程度是针对乳腺癌治疗的主要挑战。

已有很多研究证明，miRNA的变化与患者化疗耐药和肿瘤转移息息相关，这提示我们在临床可以通过对患者体内的miRNA进行检测，从而指导乳腺癌化疗用药。其中，miRNA是一类由18-25个核苷酸组成的小RNA，其不编码蛋白质，而对基因的表达起重要的调控作用。miRNA的序列具有高度的物种保守性，其表达具有独特的时间特异性和空间特异性。已经证明，miRNA在胚胎发育、组织分化、细胞代谢、信号通路控制等生理过程中发挥巨大的调控作用，特别是部分miRNA被发现具有肿瘤抑制因子或原癌基因的功能，在癌症及其他疾病的诊断和治疗中发挥重要的作用。因此，miRNA作为非编码RNA的代表，是当今分子生物学和表观遗传学研究的热门方向之一。而我们发现在乳腺癌患者体内某些miRNA的高表达，会伴随患者极易出现肿瘤转移及化疗耐药。

因此，本发明至少部分地基于这样的发现，提供一种检测试剂盒在检测乳腺癌化疗过程中肿瘤细胞是否具有耐药和转移风险中的应用，所述检测试剂盒通过实时荧光定量PCR检测受试体内的高风险miRNA(高风险miRNA为针对在乳腺癌耐药和转移患者体内特异性高表达)水平来评估乳腺癌化疗过程中肿瘤细胞是否具有耐药和转移风险。所述高风险miRNA包括以下中的一种或多种：miR-130b、miR-29a、miR-132、miR-212、miR-93、miR-222、miR-21、miR-221及miR-29a。根据错误发现率(False Discovery Rate，简称为FDR)与P值将所述高风险miRNA分为A、B与C级，其中，A级包括：miR-132、miR-212、miR-222，B级包括miR-130b、miR-93、miR-21，C级包括miR-221、miR-21、miR-29a。所述错误发现率FDR主要用于衡量一次检验假阳性率的指标，所述P值主要用于衡量一次错误发生的指标。引入这两种统计学概念主要是为了保证纳入高风险miRNA的准确性与有效性，避免使用本发明提供的试剂盒的过程中发生假阳性及/或假阴性的问题。如图3B所示，在本发明的至少一实施例中，A级对应的分级标准为：FDR<25％、P<0.001；B级对应的分级标准为：FDR<30％、P<0.01；C级对应的分级标准为P<0.05。由此看出，高危险miRNA的危险等级从A到C依次下降。

本发明中，用于检测乳腺癌化疗过程中肿瘤细胞是否具有耐药风险包括：通过针对受试体的肿瘤组织进行实时荧光定量PCR检测，得到第一PCR检测结果；根据预设高危miRNA分级标准对所述所述第一PCR检测结果进行评估，得到耐药评分。其中，所述预设高危miRNA分级标准为用户预先设置的，如图3B所示的分级标准。

所述通过针对受试体的肿瘤组织进行实时荧光定量PCR检测，得到第一PCR检测结果的实验步骤包括：对提取的肿瘤组织进行称重，并在加入TRizol试剂混匀处理后，得到第一混合溶液，将所述第一混合溶液进行裂解(优选的，放置在冰上裂解5分钟)；在所述第一混合溶液中加入氯仿(每1ml的TRIzol试剂加入200ul的氯仿)，混匀处理后(使其呈乳浊液)，得到第二混合溶液，将所述第二混合溶液静置；对静置处理后的所述第二混合溶液进行离心(离心温度为4摄氏度，离心时长可以为5分钟)；获取离心后的所述第二混合溶液的上清液(可以将上清液装置在另一EP管中)，并向所述第二混合溶液的上清液中加入预冷异丙醇(优选的，所述第二混合溶液的上清液与所述预冷异丙醇的体积比为1:1)，混匀处理后，得到第三混合溶液；对所述第三混合溶液进行离心(离心温度为4摄氏度，离心的时长可以为15分钟)；在舍弃所述第二混合溶液的上清液后的剩余溶液中，加入乙醇(乙醇的浓度为75％，加入乙醇的量可以为1ml)洗涤沉淀后进行离心；舍弃离心后的上清液，并蒸发剩余溶液中的乙醇；加入RNase-free water溶解RNA；测定总RNA浓度，并取RNA逆转录得到的cDNA后进行扩增。

实时荧光定量PCR检测技术具有灵敏性高、特异性腔、快速准确等特点。实时荧光定量PCR检测及时是一种强有力的检测基因表达谱的方法，可以分析基因在不同时期的表达差异以及经过不同处理的样本间基因的表达差异等等。在分析中选用一种合适的内参基因对目的基因的表达量进行校正可以提高该方法的灵敏度和重复性。理想的内参基因应在所研究的各种试验因素条件下均恒定表达。然而,大量的研究结果表明任何一种内参基因在所有的试验条件下都不是恒定表达的,在不同类型的细胞、在细胞生长的不同阶段,内参基因的表达都是有变化的。因此,在进行基因表达分析之前都应该进行内参基因的验证,选定一种较为稳定的内参基因用于对目的基因表达量的校正,以期获得比较真实可信的结果。

在本发明中，所述第一PCR检测结果与所述第二PCR检测结果均以GAPDH(GAPDH是甘油醛-3-磷酸脱氢酶，是糖酵解反应中的一个酶基因，广泛分布于各种组织中的细胞。该酶基因为管家(house keeping)基因，几乎在所有组织中都高水平表达，在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，且不受含有的部分识别位点、佛波脂等的诱导物质的影响而保持恒定，故被广泛用作抽提实验操作的标准化的内参)作为检测的内参物，以10ul作为qPCR扩增的反应体系进行上机检测。以内参的循环数作为对照，计算2^-△△CT，再进行统计学分析，引物序列如下图3A所示。

结合回顾性研究的结果，本发明研究认为对比正常人体内的高危险miRNA水平高于1.2即表明存在耐药和转移的风险。图1为miR-130b在肿瘤组织和癌旁组织中的表达示意图。如图1所示，高风险miR-130b在肿瘤组织和癌旁组织中的表达中具有差异。图2A为miR-132在药物敏感病人和药物不敏感病人体内的表达示意图，图2B为miR-212在药物敏感病人和药物不敏感病人体内的表达示意图。如图2A与图2B所示，高风险miR-132和高风险miR-212在药物敏感病人和药物不敏感病人体内的表达具有差异。

如图4A所示，所述根据预设高危miRNA分级标准对所述所述第一PCR检测结果进行评估，得到耐药评分的步骤包括：获取所述第一PCR检测结果；判断2/3的高危险miRNA对比正常人体内的miRNA水平是否高于1.2；若判断结果为高于1.2，则耐药评分为9分，若判断结果为低于1.2，则判断A级高风险miRNA对比正常人体内的水平是否高于1.2；若判断结果为高于1.2，则耐药评分为7分，若判断结果为低于1.2，则判断B级高风险miRNA对比正常人体内的水平是否高于1.2；若判断结果为高于1.2，则耐药评分为5分，若判断结果为低于1.2，则判断C级高风险miRNA对比正常人体内的水平是否高于1.2；若判断结果为高于1.2，则耐药评分为3分，若判断结果为低于1.2，则耐药评分为0分。

用于检测乳腺癌化疗过程中肿瘤细胞是否具有转移风险包括：通过针对受试体的外周血液进行实时荧光定量PCR检测，得到第二PCR检测结果；根据预设高危miRNA分级标准对所述第二PCR检测结果进行评估，得到转移评分。

其中，通过针对受试体的外周血液进行实时荧光定量PCR检测，得到第二PCR检测结果的实验步骤包括：提取全血溶液(全血溶液可以为50-250ul)，并在加入TRizol试剂(主要是异硫氰酸胍)混匀处理后(所述全血与所述TRizol试剂的体积比例为1:10)，得到第一混合溶剂，静置所述第一混合溶剂(优选的，静置时长为5分钟，以使得核酸蛋白复合物完全分离)；在所述第一混合溶剂中加入氯仿(每1ml的TRIzol试剂加入200ul的氯仿)，在静置处理后，得到第二混合溶剂，对所述第二混合溶剂进行离心(离心的温度为4摄氏度，离心的时长可以为15分钟)；获取离心处理后的所述第二混合溶剂的上清液，并向上清液中加入异丙醇(异丙醇可以为500ul)，混匀处理后静置，得到第三混合溶剂；对所述第三混合溶剂进行离心，并在舍弃离心后的所述第三混合溶剂的上清液后的剩余溶剂中加入乙醇(乙醇的浓度为75％，乙醇的量可以为1ml)，混匀处理后，得到第四混合溶剂；对所述第四混合溶剂进行离心，舍弃所述第四混合溶剂的上清液；干燥舍弃所述第四混合溶液的上清液后的剩余溶剂(室温干燥5-10分钟，充分干燥不好溶解)，并加入RNase-free water溶解RNA；分光光度计测OD值，测定总RNA浓度，并取RNA逆转录得到的cDNA后进行扩增。

如图4B所示，所述根据预设高危miRNA分级标准对所述第二PCR检测结果进行评估，得到转移评分的步骤包括：获取所述第二PCR检测结果；判断任意高危险miRNA对比正常人体内的miRNA水平是否高于1.2；若判断结果为低于1.2，则转移评分为0分，若判断结果为高于1.2，则判断A级高风险miRNA对比正常人体内的水平是否高于1.2；若判断结果为高于1.2，则转移评分为9分，若判断结果为低于1.2，则判断B级高风险miRNA对比正常人体内的水平是否高于1.2；若判断结果为高于1.2，则转移评分为6分，若判断结果为低于1.2，则判断C级高风险miRNA对比正常人体内的水平是否高于1.2；若判断结果为高于1.2，则转移评分为3分。

本发明提供了一种试剂盒的用途，一种检测试剂盒在检测乳腺癌化疗过程中肿瘤细胞是否具有耐药和转移风险中的应用，所述检测试剂盒通过实时荧光定量PCR检测受试体内的高风险miRNA水平来评估乳腺癌化疗过程中肿瘤细胞是否具有耐药和转移风险，填补了目前针对乳腺癌耐药及转移缺乏有效的检测方法的空白，且主要依托于miRNA的检测，是一种相对便捷的方式，在兼顾了准确率的同时考虑到操作的可行性。本发明独创性地采用了回顾式研究的方法发现了发生耐药或转移的乳腺癌患者体内的高危miRNA，并对比正常人体内水平进行分级以便评估的方法，同时制定了基于临床前瞻性的预测性程序兼顾了检测的稳定性和均一性。

当然，上文描述的各种方法和技术提供多种方式来执行本发明。当然，应理解，根据本文描述的任何具体实施方案可能不一定会实现所描述的所有目的或优点。因此，例如，本领域技术人员将认识到，所述方法可以按实现或优化如本文教导的一个优点或一组优点的方式来执行，而不必实现如本文可能教导或提出的其他目的或优点。本发明提供各种替代的实施例。应当理解，本发明并不排除在某些优选实施例中添加或减少一个或多个特征，或者简单替换一个或多个特征。

此外，技术人员将认识到本文公开的不同实施方案的各种特征的可互换性。类似地，本领域普通技术人员可以组合和匹配上文论述的各种特征和步骤以及每个这种特征或步骤的其他已知的等效形式以根据本文描述的原理来执行方法。

虽然已经在某些实施方案和实例的背景下公开了本发明，但是本领域技术人员将理解，本发明可超出确切公开的实施方案而延伸到其他替代性实施方案和/或它们的使用和明显的修改以及等效形式。

本文所述的本发明的实施方案包括本发明人所知的实施本发明的最佳方式。通过阅读前述说明书，那些实施方案的变型对于本领域普通技术人员会变得显而易见。本发明人预期熟练的技术人员将会酌情采用此类变型，并且本发明人预计本发明将以本文所具体描述的以外的方式实施。因此，本发明包括适用法律允许的所附权利要求中列举的该主题的全部修改方式和等同形式。此外，除非在本文中另外指明或与上下文明显抵触，否则本发明涵盖了上述要素在其全部可能的变型中的任意组合。

针对本申请引用的每个专利、专利申请、专利申请公开物和其他材料，如文章、书籍、说明书、出版物、文档等，特此将其全部内容并入本申请作为参考。与本申请内容不一致或产生冲突的申请历史文件除外，对本申请权利要求最广范围有限制的文件(当前或之后附加于本申请中的)也除外。需要说明的是，如果本申请附属材料中的描述、定义、和/或术语的使用与本申请所述内容有不一致或冲突的地方，以本申请的描述、定义和/或术语的使用为准。

应当理解的是，本申请中所述实施例仅用以说明本申请实施例的原则。其他的变形也可能属于本申请的范围。因此，作为示例而非限制，本申请实施例的替代配置可视为与本申请的教导一致。相应地，本申请的实施例不仅限于本申请明确介绍和描述的实施例。

本文所描述的例子和实施例只是用于说明性目的，应当理解，其所涉及的各种修改或变化将启发本领域技术人员，这些修改或变化将被包括在本申请的精神和范围之内。除非特别说明，此处所使用的单词和短语应当理解和解释为：具有与相关技术领域的技术人员对这些单词和短语的理解相一致的意思。

虽然以上已经描述了本发明的各种实施例，但是应该理解的是，它们已仅通过举例的方式呈现，而非限制。本本不旨在是穷尽或将本发明限制为所公开的精确形式。鉴于以上教导，许多修改和变化是可能的。实施例仅供解释本发明及其实际应用的原理，从而使本领域技术人员能够最好地利用本发明和各种实施例的各种修改所考虑的特定用途说明。因此，本发明不受本文中所公开的具体实施例的限制。

虽然已经示出和描述了这些实施例及应用，但对于受益于本申请的本领域技术人员而言显而易见的是，在不脱离本申请中所披露的发明构思的情况下，比上面提及的更多的修改例都是可能的，因此所附权利要求旨在覆盖这些实施例的落入其真实精神和范围内的所有这些特征和优点。

Claims

1.检测试剂盒在检测乳腺癌化疗过程中肿瘤细胞是否具有耐药和转移风险中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测试剂盒通过实时荧光定量PCR检测受试体内的高风险miRNA水平来评估乳腺癌化疗过程中肿瘤细胞是否具有耐药和转移风险。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述高风险miRNA包括以下中的一种或多种：miR-130b、miR-29a、miR-132、miR-212、miR-93、miR-222、miR-21、miR-221及miR-29a。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将所述高风险miRNA分为A、B与C级，其中，A级包括：miR-132、miR-212、miR-222，B级包括miR-130b、miR-93、miR-21，C级包括miR-221、miR-21、miR-29a。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述用于检测乳腺癌化疗过程中肿瘤细胞是否具有耐药风险包括：

根据预设高危miRNA分级标准对所述第一PCR检测结果进行评估，得到耐药评分。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述通过针对受试体的肿瘤组织进行实时荧光定量PCR检测，得到第一PCR检测结果的步骤包括：

在所述第一混合溶液中加入氯仿，混匀处理后，得到第二混合溶液，将所述第二混合溶液静置并离心；

获取离心后的所述第二混合溶液的上清液，并向所述第二混合溶液的上清液中加入预冷异丙醇，混匀处理后，得到第三混合溶液并对其离心；

舍弃离心后的上清液，并蒸发剩余溶液中的乙醇；

加入RNase-free water溶解RNA；

测定总RNA浓度，并取RNA逆转录得到的cDNA后进行扩增。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述获取离心后的所述第二混合溶液的上清液，并向所述第二混合溶液的上清液中加入预冷异丙醇的步骤包括：所述第二混合溶液的上清液与所述预冷异丙醇的体积比为1:1。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，用于检测乳腺癌化疗过程中肿瘤细胞是否具有转移风险包括：

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述通过针对受试体的外周血液进行实时荧光定量PCR检测，得到第二PCR检测结果的步骤包括：

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述提取全血，并在加入TRizol试剂混匀处理后，得到第一混合溶剂的步骤包括：所述全血与所述TRizol试剂的体积比例为1:10。