CN102676522B

CN102676522B - 乳腺癌分子标志物miR-195-5p

Info

Publication number: CN102676522B
Application number: CN201210153102.8A
Authority: CN
Inventors: 李启靖; 李同恩; 栗世铀
Original assignee: Beijing Quanto Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Union Stemcell & Gene Engineering Co ltd
Priority date: 2012-05-16
Filing date: 2012-05-16
Publication date: 2013-04-10
Anticipated expiration: 2032-05-16
Also published as: CN102676522A

Abstract

本发明提供了一种乳腺癌分子标志物miR-195-5p及其在制备诊断乳腺癌的诊断试剂中的用途。miR-195-5p在乳腺癌患者血清中的含量比在正常人血清中的含量升高，而在患者接受手术后，其血清中的miR-195-5p含量回落到正常水平。本发明还提供了一种诊断乳腺癌的诊断试剂盒。使用本发明的乳腺癌分子标志物miR-195-5p诊断乳腺癌具有操作简单，取材方便，安全无创伤，高特异性，高灵敏性以及易于大量筛查的特点。

Description

乳腺癌分子标志物miR-195-5p

技术领域

本发明涉及肿瘤诊断领域，具体来说涉及一种乳腺癌分子标志物miR-195-5p，其可应用于乳腺癌高危人群的筛选、乳腺癌的鉴定、乳腺癌治疗状况的监测和乳腺癌预后的监测等领域。

背景技术

microRNA（miRNA）是近年来的研究热点，它是一种广泛存在于真核生物中的单链小分子RNA，不具编码功能，但它能够结合于基因序列的侧翼区域阻遏或抑制靶mRNA的翻译，具有高度的保守性、时序性和组织特异性。2008年Mitchell等首先发现许多miRNA稳定存在于血浆中，其中miR-141的水平可作为前列腺癌诊断标志物。随后的研究又发现了结肠癌诊断标志物miR-92a和肝损伤监控标志物miR-122。

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，近50年来发病率在全球呈上升趋势，其发病率占全身各种恶性肿瘤的7-10%，且发病人群呈年轻化趋势。目前，乳腺癌的临床诊断方式主要有以下几种：乳腺钼靶摄片、红外乳腺扫描、活组织病理检查、雌激素和孕激素受体测定及超声显像。乳腺钼靶摄片具有简单、方便、无创伤及费用低等特点，是乳腺癌检查的首选方法之一，它通过显示肿块的大小、数目、位置、密度、边缘、形态、有无钙化以及钙化的形态、大小、数目、分步以及周围的晕环、皮肤改变等提供定位及定性征象并判断病变的性质；其局限性是：（1）当患者的乳腺腺体丰富时与病变重叠，不能显示病变的全貌，甚至出现假阴性，（2）对于接近胸壁和致密性乳腺的小癌灶容易漏诊，（3）有时不能提供明确的定性诊断。红外乳腺扫描操作简便、直观、无损伤，与钼靶摄片有互补的作用，能直接显示乳腺血管的走行分步及管径改变，但因其不能显示肿瘤的内部结构及周围组织所以诊断符合率很低，对乳腺上部及近胸壁的癌灶易于漏诊。活组织病理检查因其创伤性、复杂性不能作为初筛的手段，但是它是乳腺癌确诊的金标准，一般与影像学技术连用，在对患者进行治疗前均应获得病理学诊断依据。人乳腺癌组织中，有60～70％的组织存在雌激素受体（ER）和／或孕激素受体（PR），其存在状况与诊断、治疗及判断预后有关，卫生部发布的乳腺癌诊断标准中所要求的乳腺癌病理报告至少应包括ER、PR和HER-2（人类表皮生长因子受体-2）；其局限性较大主要表现在：（1）技术和设备要求高，标本量大，故对测定非切除标本或肿块较小的早期乳腺癌难以满足需要，（2）受体对温热极不稳定，标本必需新鲜，储存运输不便，（3）肿瘤组织中受体分布不均匀，边缘部位含量较中央部位高，故需混合取材。超声成像对一些缺乏典型征象的实性良恶性肿块有较高的误诊率，且不能发现5mm以下的肿块。

近年来的研究表明，乳腺癌和miRNA密切相关，它们可能参与肿瘤的生成，所以对肿瘤的治疗也可能有相应的作用。与乳腺癌相关的miRNA种类较多且作用不一，已有研究表明在乳腺癌患者中上调的miRNA包括miR-26a，miR-29b，miR-375，miR-92，mir-183，miR-197等，下调的miRNA包括miR-145，miR-497，miR-339-5p，miR-22，miR-125b等。虽然已在该领域进行了一些研究，但是现有的miRNA标志物的准确性、灵敏性方面均有不足，在临床和研究中仍然存在寻找更加准确和灵敏的乳腺癌miRNA标志物的需求。

发明内容

本发明提供了一种新的乳腺癌相关的miRNA作为乳腺癌的分子标志物，该miRNA为miR-195-5p，其序列为5’-UAGCAGCACAGAAAUAUUGGC-3’（SEQ IDNO：1）。

发明人发现，miR-195-5p在乳腺癌患者血清中的含量相比在正常人血清中的含量升高，而在患者接受手术后，其血清中的miR-195-5p含量回落到正常水平，由此可见，增加的miR-195-5p与肿瘤的存在密切相关。

在上述发现的基础上，本发明提供了miR-195-5p在制备诊断乳腺癌的诊断试剂中的用途。

具体地，所述诊断试剂通过检测被试者血清中miR-195-5p的含量，并与正常水平相比较来诊断乳腺癌。在一个特定的实施方案中，使用定量PCR的方法来检测被试者血清中miR-195-5p含量。

本发明还提供了一种诊断乳腺癌的诊断试剂盒，其包括：

（1）血清总RNA提取试剂，

（2）RNA加polyA试剂，

（3）RT-PCR试剂，

（4）定量PCR试剂。

其中，定量PCR试剂中包括乳腺癌分子标志物miR-195-5p的特异性正向引物，优选地，其序列为5’-GGGTAGCAGCACA-3’（SEQ ID NO：7）。

在一个特定的实施方案中，所述血清总RNA提取试剂中包括序列为5’-CAACCUCCUAGAAAGA-3’（SEQ ID NO：2）的External Control-1；所述RNA加polyA试剂中包括序列为5’-UGAGCAACGCGAACAA-3’（SEQ ID NO：3）的External Control-2；所述RT-PCR试剂中包括序列为5’-CAGTGGTATCAACGCACTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’（SEQ ID NO：4）的RT-Primer（其中，V为A或C或G，N为A或T或C或G）；所述定量PCR试剂中包括序列分别为5’-CTCACACGACTCACGACAC-3’（SEQ IDNO：5）和5’-CTCACACGACTCACGACACCAGTGGTATCAACGCACTC-3’（SEQ IDNO：6）的通用反向引物UPM-short和UPM-long。

使用本发明的乳腺癌分子标志物miR-195-5p诊断乳腺癌具有操作简单，取材方便，安全无创伤，高特异性，高灵敏性以及易于大量筛查的特点。

具体实施方式

1.血清中总RNA的提取

抽取5名乳腺癌患者术前及术后7天各2ml血液，同时抽取5名正常人血液各2ml作为正常对照，凝血后进行离心，最后取上层血清1ml置于1.5ml的RNase/DNase-free离心管中。

使用RNA提取试剂盒（北京旷博生物技术有限公司）自血清中提取总RNA，每250μl血清中加入1μl（20nM）序列为5’-CAACCUCCUAGAAAGA-3’（SEQ ID NO：2）的External Control-1（上海生工生物工程技术有限公司合成）来监控血清中RNA的提取质量。提取的总RNA使用Thermo NanoDrop2000c测定浓度。

2.三步法定量检测血清中的miRNA

（1）加polyA尾：

i.在无RNA酶的PCR管（Axygen公司，200μl）中配制加polyA尾的反应液，体系为20μl。每20μl体系中加入1μl（20nM）序列为5’-UGAGCAACGCGAACAA-3’（SEQ ID NO：3）的External Control-2（上海生工生物工程技术有限公司合成）来监控miRNA的加尾及反转录质量。

（注：加入的RNA体积由RNA的浓度确定，x=500ng/RNA浓度，本实验所使用的酶均为北京旷博生物技术有限公司的产品。）

ii将装有配置好反应液的PCR管放入PCR仪（Thermo）中37℃孵育1小时。

（2）RT-PCR得到cDNA单链：

i.向（1）得到的反应液中加入0.5μl（0.5ng/μl）序列为5’-CAGTGGTATCAACGCACTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’（SEQ ID NO：4）的RT-Primer（上海生工生物工程技术有限公司合成），70℃孵育5min，立即放到冰上冰浴至少2min。

ii配制反转录反应液：

（注：所用产品均为北京旷博生物技术有限公司的产品。）

iii.将i与ii得到的溶液混合，50℃孵育50min后70℃保温15min，置冰上冷却，得到cDNA。

iv.将iii得到的产物稀释至1μl体系中含有1ng总RNA的反转录产物，分装后-20℃保存。

（3）qPCR定量检测：

i.在2ml EP管（Axygen公司）中配制反应液：

（注：UPM-long、UPM-short均在Invitrogen公司合成，其余试剂均来自北京旷博生物技术有限公司的

Green PCR Master Mix。）

其中，通用反向引物UPM-short和UPM-long的序列分别为5’-CTCACACGACTCACGACAC-3’（SEQ ID NO：5）和5’-CTCACACGACTCACGACACCAGTGGTATCAACGCACTC-3’（SEQ ID NO：6）。

ii配置好的反应液充分颠倒混匀后，分装入96孔尖底PCR板中（Axygen公司），每孔18μl。

iii.使用排枪（Eppendoff公司，1-10μl）加入序列为5’-GGGTAGCAGCACA-3’（SEQ ID NO：7）的miR-195-5p特异性正向引物（Invitrogen公司合成），每孔2μl（10μM）。

iv.加入10μl石蜡油液封后用专用贴膜（ABI公司）密封。

v.放入ABI7900PCR定量检测仪中，程序设定为：

vi.绘制熔解曲线，检查引物的特异性，程序设定为：95℃15s,60℃15s,95℃15s。

3.采用Array Tools4.1.0进行数据分析

用上述方法可测得乳腺癌患者术前、术后7天以及正常人组各样本血清中miR-195-5p的平均Ct值分别为22.88、33.81和33.13，结果表明miR-195-5p在患者术前血清中的相对含量显著升高，术后恢复至正常水平。

以qPCR检测中经典的2^-ΔCt的方式表示血清中目的miRNA的水平（ΔCt为目标miRNA与External Control-1的Ct值之差）。与正常对照血清中miR-195-5p的含量相比，乳腺癌患者术前血清中miR-195-5p的水平是其1217.75倍（2^{-(22.88-33.13)}），差异显著；而患者术后血清中miR-195-5p含量是正常对照的0.62倍（2^{-(33.81-33.13)}），差异不显著。

<110> 北京旷博生物技术有限公司

<120> 乳腺癌分子标志物miR-195-5p

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> RNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 1

uagcagcaca gaaauauugg c 21

<210> 2

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

caaccuccua gaaaga 16

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ugagcaacgc gaacaa 16

<210> 4

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cagtggtatc aacgcactcc tttttttttt tttttttttt tttttttttt vn 52

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ctcacacgac tcacgacac 19

<210> 6

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ctcacacgac tcacgacacc agtggtatca acgcactc 38

<210> 7

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gggtagcagc aca 13

Claims

1.一种诊断乳腺癌的诊断试剂盒，其包括：

（1）血清总RNA提取试剂，

（2）RNA加polyA试剂，

（3）RT-PCR试剂，

（4）定量PCR试剂；

其中，RT-PCR试剂中包括序列为SEQ ID NO：4的RT-Primer；定量PCR试剂中包括乳腺癌分子标志物miR-195-5p的特异性正向引物，以及序列分别为SEQ IDNO：5和6的通用反向引物UPM-short和UPM-long。

2.权利要求1所述诊断试剂盒，其中，所述血清总RNA提取试剂中包括序列为SEQ IDNO：2的External Control-1。

3.权利要求1所述诊断试剂盒，其中，所述RNA加polyA试剂中包括序列为SEQ ID NO：3的External Control-2。

4.权利要求1所述诊断试剂盒，其中，所述乳腺癌分子标志物miR-195-5p的序列如SEQID NO：1所示。

5.权利要求4所述诊断试剂盒，其中，所述乳腺癌分子标志物miR-195-5p的特异性正向引物的序列如SEQ ID NO：7所示。