CN107674918A - has‑mir‑195‑5p作为生物标志物在制备肺癌诊断试剂盒中的应用 - Google Patents

has‑mir‑195‑5p作为生物标志物在制备肺癌诊断试剂盒中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开has‑mir‑195‑5p作为生物标志物在制备肺癌诊断试剂盒中的应用，以及has‑mir‑195‑5p诱导剂在制备治疗肺癌药物中的应用。hsa‑mir‑195‑5p无论是通过肺组织或血液检测所得的结果，都表明在正常人群中其表达显著高于肺癌患者，可以准确识别出肺癌患者和高危人群排除正常个体。通过诊断性研究分析发现hsa‑mir‑195‑5p的表达水平用于诊断肺癌具有较高的灵敏度、特异度、受试者工作曲线下面积较大(>0.75)，相较于传统生物学标志显示出更高的诊断价值。

Description

has-mir-195-5p作为生物标志物在制备肺癌诊断试剂盒中的 应用
技术领域
本发明属于体外诊断标志物，更具体地讲，涉及has-mir-195-5p作为生物标志物在制备肺癌诊断试剂盒中的应用。
背景技术
在全球范围内，肺癌是发病率和死亡率最高的肿瘤之一，预后较差，五年生存率为15％，由于缺乏高效的早期诊断方法，肺癌早期诊断率仅为15％左右，如能早期诊断，Ⅰ期肺癌的五年生存率将达到60％-90％，因此开发高效的早期诊断方法对减少肺癌疾病负担尤为重要。
肺癌早期诊断的方法主要包括痰细胞学、痰液基细胞学、微创介入检查、影像学等。其中痰细胞学检查无法降低肺癌患者死亡率；痰脱落细胞学检查，结果受样本处理、读片水平等因素的影响，临床应用中仍不能达到理想效果。X 线胸片检查虽然能够发现早期肺癌，但并不能显著降低肺癌的死亡率。微创介入检查由于创伤较大，适用范围有限。肺癌早期诊断方法还包括剂量CT，尽管研究表明低剂量CT相较于胸部X线筛查诊断能降低肺癌死亡率，但回顾性临床研究表明，低剂量CT筛查结果高达90％为假阳性，并且由于低剂量CT筛查价格高昂，其临床辅助诊断的价值受到越来越多的质疑。
近年来肿瘤生物学标志物成为肿瘤诊断研究的新方向，肿瘤标志物的检测属于生物化学检测，具有价格低廉，对人体损伤小，患者易接受、实施便捷等特点。人类微小核糖核酸195-5p(hsa-mir-195-5p，mir-195-5p)是一种微小核糖核酸(MicroRNA,miRNA)属于非编码核糖核酸(Non-coding RNA,ncRNA)，由87 个核糖核苷酸组成，其在组织和血液中是高度稳定的，可以通过有创或无创的方式较为方便地从人体获得，具有样本易于稳定保存，检测周期短，检测技术成熟等特点。hsa-mir-195-5p通过直接作用于高迁移率族蛋白A1(highmobility group AT-hook 1，HMGA1)，可能抑制乳腺癌和前列腺癌的进展。同时有学者报道在骨肉瘤和乳腺癌患者中发现hsa-mir-195-5p表达下调，提示其是一个抑癌基因。关于has-mir-195-5p用于肺癌诊断标志物的用途未见报道。本课题组在此前的研究中发现hsa-mir-195-5p在肺癌病人中异常低表达，进一步认为其可能对肺癌有诊断价值。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供has-mir-195-5p作为生物标志物在制备肺癌诊断试剂盒中的应用。
本发明的第二个目的在于提供has-mir-195-5p促进剂在制备治疗肺癌药物中的应用。
为实现以上第一个目的，本发明公开以下技术方案：has-mir-195-5p作为生物标志物在制备肺癌诊断试剂盒中的应用。
为实现以上第二个目的，本发明公开以下技术方案：has-mir-195-5p诱导剂在制备治疗肺癌药物中的应用。
作为一个优选方案，所述诱导剂是右旋柠烯(d-Limonene，DL)。
所述的诊断试剂盒包括但不限于，血液样肺癌诊断试剂盒、血清样本肺癌诊断试剂盒、肺组织样本肺癌诊断试剂盒。
本发明的优点在于：本发明所所述得hsa-mir-195-5p，无论是通过肺组织或血液检测所得的结果，都表明在正常人群中其表达显著高于肺癌患者，可以准确识别出肺癌患者和高危人群排除正常个体。通过诊断性研究分析发现 hsa-mir-195-5p的表达水平用于诊断肺癌具有较高的灵敏度、特异度、受试者工作曲线下面积较大(>0.75)，相较于传统生物学标志显示出更高的诊断价值。细胞学试验表明肺癌细胞系中hsa-mir-195-5p的表达显著低于肺正常细胞系，同时hsa-mir-195-5p表达升高能减少肺癌细胞增殖数量，减缓肺癌细胞增殖速度，抑制肺癌细胞迁移和侵袭，对肺癌的发展有抑制作用。多个数据集数据表明hsa-mir-195-5p表达水平不受男女性别和吸烟状态的影响，结果稳定，诊断价值高。此外hsa-mir-195-5p对肺癌诊断具有良好的特异性，经过考察 hsa-mir-195-5p在食道癌、胃癌和大肠癌中的表达情况，结果表明hsa-mir-195-5p 对食道癌、胃癌和大肠癌无诊断价值。
附图说明
图1 hsa-mir-195-5p在肺癌和正常人群中的表达，在肺癌中hsa-mir-195-5p 表达显著低于正常组织(**P＜0.001)。
图2 hsa-mir-195-5p在肺癌细胞系和肺正常细胞系的表达，在肺癌细胞系 A549和H1975中hsa-mir-195-5p表达显著低于正常细胞系Beas2B(P＜0.5)。
图3 hsa-mir-195-5p对肿瘤细胞增殖的影响，与肺癌细胞空白对照相比在肺癌细胞中升高hsa-mir-195-5p的表达，能够显著抑制肺癌细胞的增殖(**P ＜0.001)。
图4 hsa-mir-195-5p对肿瘤细胞迁移的影响，与肺癌细胞空白对照相比在肺癌细胞中升高hsa-mir-195-5p的表达，能够显著抑制肺癌细胞的迁移。
图5 hsa-mir-195-5p对肿瘤细胞侵袭的影响，与肺癌细胞空白对照相比在肺癌细胞中升高hsa-mir-195-5p的表达，能够显著抑制肺癌细胞的侵袭(*P＜ 0.05)。
图6 hsa-mir-195-5p对肿瘤细胞周期的影响，与肺癌细胞空白对照相比在肺癌细胞中升高hsa-mir-195-5p的表达，能够使更多肺癌细胞停留在DNA合成前期，抑制肺癌细胞的有丝分裂(*P＜0.05)。
图7在肺癌细胞系与正常细胞系中hsa-mir-195-5p的诱导剂DL对 hsa-mir-195-5p表达的影响。在肺癌细胞系H1975与肺正常细胞系Bease2B中与相应的空白对照组相比DL处理后的细胞其hsa-mir-195-5p的表达显著上升。
图8在公共数据库中hsa-mir-195-5p在正常人、肺癌病人、和慢性阻塞性肺病病人组织或血液中的表达情况，肺癌病人和慢性阻塞性肺病病人的 hsa-mir-195-5p表达显著低于正常人(**P＜0.05，***＜0.01)。
图9 hsa-mir-195-5p在不同性别、不同吸烟状态人群众的表达水平，除 TCGA-LUAD中的hsa-mir-195-5p在男女性别间表现出差异外，其他所有数据表明hsa-mir-195-5p不受性别和吸烟状态的影响(***＜0.01)。
图10 hsa-mir-195-5p在不同消化道肿瘤中的的表达水平，hsa-mir-195-5p 在食道癌、胃癌和大肠癌中的表达情况与正常人无差别。
图11 hsa-mir-195-5p在训练数据集和验证数据集的ROC曲线，训练数据集和验证数据集的曲线下面积分别为0.85和0.92。
图12 hsa-mir-195-5p作为肺癌诊断指标的具体评价参数。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1.人肺组织检测hsa-mir-195-5p的肺癌诊断试验
切下组织，并剪切成小块，置液氮中冻结，研碎或捣碎。胰酶消化后，PBS 或生理盐水洗一次，1000-2000g离心1-2分钟，弃上清，收集细胞。使用RNAeasy TM动物小RNA抽提试剂盒，按照使用说明提取miRNA。按照A260/A280≥1.8 的标准使用分光光度计质控。实时定量PCR检测hsa-mir-195-5p的表达量。比较肺癌和癌旁组织的表达情况，考察其诊断价值。结果表明，(图1)与正常组织相比肺癌病人的肿瘤组织中hsa-mir-195-5p存在异常低表达(P<0.001)，在正常人群中高表达的hsa-mir-195-5p对正常人群具有保护作用。提示 hsa-mir-195-5p具有诊断肺癌的价值。
实施例2.肺癌细胞系检测hsa-mir-195-5p的肺癌诊断试验
收集悬浮细胞到一个1.5毫升离心管，1000-2000g离心1-2分钟，弃上清，收集细胞。使用RNAeasyTM动物小RNA抽提试剂盒，按照使用说明提取miRNA。按照A260/A280≥1.8的标准使用分光光度计质控。实时定量PCR检测 hsa-mir-195-5p的表达量。比较肺癌细胞系和正常肺细胞系表达情况，考察其诊断价值。结果表明，(图2)与正常肺细胞系Beas2B相比肺癌细胞系A549 和H1975中hsa-mir-195-5p存在异常低表达(P<0.01)。进一步验证 hsa-mir-195-5p具有诊断肺癌的价值。
实施例3.hsa-mir-195-5p表达升高抑制肿瘤细胞增殖试验
通过MTT法测定肺癌细胞A549和H1975的增殖。A549和H1975细胞接种于96孔板，24小时后，细胞转染hsa-mir-195-5p mimics或miRNA空白对照。在转染后的24,48,72、96小时，分别用PBS冲洗细胞，在细胞培养液中加入20μl MTT(5毫克/毫升)。培养4小时后，丢弃培养介质，每孔中加入150μl 的二甲基亚砜来溶解沉淀物。在590nm波长的酶标仪测定所得溶液的吸光度。每个实验条件进行6次重复，整个实验重复3次。结果表明，(图3) hsa-mir-195-5p表达升高后在A549和H1975两个肺癌细胞系中均能够显著降低肺癌细胞的增值速度(P<0.001)。说明升高hsa-mir-195-5p的表达能抑制肺癌发展。
实施例4.hsa-mir-195-5p表达升高抑制肿瘤细胞迁移试验
使用划痕试验在6孔板中测量肺癌细胞A549和H1975细胞的迁移。转染过hsa-mir-195-5p mimic和空白对照的A549和H1975细胞，经过培养完全融合后，用10微升枪头在孔中划线。用3％胎牛血清连续培养72小时。在0,24, 48小时和72小时拍摄了这些细胞的显微照片。共进行了3次独立实验。结果表明，(图4)hsa-mir-195-5p表达升高后在A549和H1975两个肺癌细胞系中均能够显著抑制肺癌细胞的迁移速率。说明升高hsa-mir-195-5p的表达能够抑制肺癌发展。
实施例5.hsa-mir-195-5p表达升高抑制肿瘤细胞侵袭试验
使用trans-well试验检测肿瘤细胞A549和H1975的侵袭能力。将转染过hsa-mir-195-5p mimic和空白对照的A549和H1975细胞，按照1×105个细胞每孔的密度加入到24孔板的基质胶上方的8mm孔中，细胞培养于含10％胎牛血清的培养基中。培养24小时后，通过基质膜或侵入基质胶的细胞用75％乙醇固定30min，后用结晶紫染色。从五个显微镜视野随机拍摄照片，对每一张照片进行细胞计数。实验均重复3次。结果表明，(图5)hsa-mir-195-5p在表达升高后再A549和H1975两个肺癌细胞系中均能够显著抑制肺癌细胞的侵袭程度(P<0.05)。说明升高hsa-mir-195-5p的表达能够抑制肺癌发展。
实施例6.hsa-mir-195-5p表达升高抑制肿瘤细胞周期试验
将转染过hsa-mir-195-5p mimic和空白对照的A549和H1975细胞，按照为1×106每孔的密度接种于六孔板中孵育过夜。转染48小时后，收集细胞， PBS洗涤。细胞颗粒固定在-20℃温度下70％的乙醇中。使用PBS洗涤细胞，用细胞周期试剂悬浮定量为5×105细胞/毫升。在室温下细胞避光孵育15分钟。使用流式细胞仪检测细胞周期。结果表明，(图6)hsa-mir-195-5p表达升高后在A549和H1975两个肺癌细胞系中均能够是更多细胞停留在静止期，显著减缓肺癌细胞的分裂(P<0.05)。说明升高hsa-mir-195-5p的表达能够抑制肺癌发展。
实施例7.hsa-mir-195-5p的诱导剂DL能升高肺癌细胞系和肺正常细胞系中hsa-mir-195-5p的表达的试验
将一定数量的H1975细胞种入六孔板中，加入高糖DMEM培养基(含 10％FBS)，待细胞贴壁后，在实验组加入终浓度为0.5mM的DL(溶剂：DMSO)，在对照组加入等体积的DMSO，处理细胞24小时后，收集细胞沉淀。用天根 mirRNA提取试剂盒按照试剂盒内的实验步骤提取细胞内mir-195并逆转录，用RT-qPCR检测实验组和对照组hsa-mir-195-5p的水平。Bease2B细胞在含10％ FBS的DMEM培养基中培养，分别用空白对照和0.0125％DL处理。培养到 10代和30代时收集细胞，用Trizol方法提取total RNA，用PE Labchip进行质检，确保RNA RIN值大于7后，用Qubit进行定量，最后取300ng的样本用 Illumina的PCR free Truseq RNA建库试剂盒进行建库，建库后用PE质检，确认得到目的片段后用C_bot长簇，用Hiseq 3000上机检测基因组表达水平。结果表明，(图7)在肺癌细胞系H1975中加入hsa-mir-195-5p的诱导剂DL后相对于空白对照组其hsa-mir-195-5p的表达显著上升；同样在肺正常细胞系Bease2B中加入hsa-mir-195-5p的诱导剂DL后相对于空白对照组其 hsa-mir-195-5p的表达显著上升。结合上述实施例可以知道经DL诱导升高的 hsa-mir-195-5p可以抑制肿瘤的发生发展。
实施例8.公共库数据hsa-mir-195-5p检测的肺癌诊断试验
从世界范围内广泛使用的公共数据库，美国国家生物技术信息中心 (NationalCenter of Biotechnology Information,NCBI)的基因表达文库 (Gene ExpressionOmnibus,GEO)和肿瘤基因图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)，下载肺癌数据集。得到符合本试验要求的数据集有癌和癌旁组织数据集:GSE15008、GSE62182、GSE64591、TCGA-LUAD、TCGA-LUSC；慢性阻塞性肺病肺组织与正常肺组织样本数据集：GSE49881；肺癌病人、慢性阻塞性肺病病人、正常人血样本:GSE31568、GSE61741、GSE24709、GSE17681。使用经验贝叶斯统计模型比较hsa-mir-195-5p的表达水平。结果表明，(图8)在公共数据库中的所有数据集中均出现癌症病人血或组织样本的hsa-mir-195-5p的表达水平均显著低于正常人血样本或癌旁样本(P<0.05)，显示出hsa-mir-195-5p的抑癌功能，进一步验证hsa-mir-195-5p诊断肺癌的价值。
实施例9.hsa-mir-195-5p表达稳定性试验
对上述公共数据库中的数据集TCGA-LUAD、TCGA-LUSC、GSE62182、GSE64591 和新查询到的数据集GSE29135按性别分层分别比较男性和女性 hsa-mir-195-5p的表达情况；按照吸烟状况分层比较吸烟和女性非吸烟 hsa-mir-195-5p的表达情况。结果表明，(图9)在公共数据库中，除TCGA-LUAD 男女性有差别外，所有数据集都显示hsa-mir-195-5p在男女性之间表达水平一致，所有数据集显示hsa-mir-195-5p在吸烟和非吸烟人群中表达一致。表明hsa-mir-195-5p的表达不受男女性别和吸烟等环境状况的影响，表达十分稳定，作为诊断指标具有稳定性。
实施例10.hsa-mir-195-5p作为生物标志物的特异性试验
从全球公共数据库美国国家生物技术信息中心(National Center ofBiotechnology Information,NCBI)的基因表达文库(Gene Expression Omnibus,GEO)下载食道癌数据集GSE13937、GSE71043，胃癌数据集GSE61741、 GSE31568，大肠癌数据集GSE39833、GSE61741，标化后检测hsa-mir-195-5p 肿瘤组织与正常组织的表达情况。结果表明，(图10)在公共数据库中，所有食道癌、胃癌、大肠癌数据集都显示hsa-mir-195-5p在肿瘤组织和正常组织表达水平一致，hsa-mir-195-5p的表达水平仅能反应肺癌的发病状态，作为肺癌诊断指标具有高度的特异性，无法反映消化道肿瘤的发病状况。
实施例11.hsa-mir-195-5p作为肺癌诊断指标的诊断效果评价
从美国国家生物技术信息中心(National Center of BiotechnologyInformation,NCBI)的基因表达文库(Gene Expression Omnibus,GEO)下载数据集GSE17681作为训练数据集，计算诊断试验的灵敏度、特异度等经典评价指标，并绘制受试者工作曲线(receiver operating characteristic curve,ROC) 共同评价hsa-mir-195-5p的肺癌诊断价值；使用GES72526作为验证数据集，同样计算上述经典指标，绘制受试者工作曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)，并与GES72526的原始诊断指标——EGFR突变、 KRAS突变、ALK Fusion等经典指标相比较，评价hsa-mir-195-5p的肺癌诊断价值。结果表明，(图11)在GSE17681训练数据中，hsa-mir-195-5p作为肺癌诊断指标，其灵敏度为0.88，特异度为0.84，曲线下面积(area under the cure,AUC)为0.85。在GES72526验证数据集中hsa-mir-195-5p作为肺癌诊断指标其灵敏度为0.79，特异度为1.00，曲线下面积(area under the cure, AUC)为0.92，与EGFR突变、KRAS突变、ALKFusion等经典指标的灵敏度0.64，特异度1.00相比表现出更好的效果，具体指标如图12所示。综上所述，通过客观指标评价hsa-mir-195-5p的诊断价值，与传统生物学指标相比hsa-mir-195-5p具有更好的特异度和灵敏度，表现出出良好的诊断效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.has-mir-195-5p作为生物标志物在制备肺癌诊断试剂盒中的应用。
2.has-mir-195-5p诱导剂在制备治疗肺癌药物中的应用。
3.根据权利要求3所述has-mir-195-5p诱导剂在制备治疗肺癌药物中的应用，其特征在于，所述诱导剂是右旋柠烯。
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BEN LIU等: ""MiR-195 suppresses non-small cell lung cancer by targeting CHEK1"", 《ONCOTARGET》 *
ZHOU YONGCHUN等: ""MicroRNA-195 inhibits non-small cell lung cancer cell proliferation, migration and invasion by targeting MYB"", 《CANCER LETTERS》 *

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