CN108034655A - 一种长非编码rna及其组合物在诊断／治疗结直肠癌中的应用 - Google Patents

一种长非编码rna及其组合物在诊断／治疗结直肠癌中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程领域，特别涉及一种长链非编码RNA‑Linc01003及其组合物，在制备诊断直结肠癌及靶点药物治疗中的应用。同时，本发明还涉及其引物，在制备诊断直结肠癌试剂中的应用。通过研究该长链非编码RNA细胞水平的表达，揭示了其与直结肠癌发病机理的关系。

Description

一种长非编码RNA及其组合物在诊断/治疗结直肠癌中的应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，特别涉及长非编码RNA--在诊断及制 备治疗直结肠癌药物的应用。
背景技术
结直肠癌(colorectal carcinoma，CRC)是人类常见的恶性肿瘤 之一，每年发病人数超过七十万人，致死率在各类肿瘤中排名第三。 我国结直肠癌发病率死亡率均位于所有癌症的第五位，发病人数呈逐 年上升趋势，已成为影响中国人健康的最常见恶性肿瘤。寻找出新的 结直肠癌治疗靶点及早期诊断标志物对疾病的预测，诊断与治疗，降 低结直肠癌死亡率具有重要的科学意义。
长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一类新发现 的长度大于200nt的非编码RNA，缺少特异完整的开放阅读框、无蛋 白质编码功能的RNA，在总非编码RNA(ncRNA)中占有相当大的 比例。在过去的十年里,基于快速出现的高通量测序的基因表达分析 技术和生物信息学推动了大规模的人类基因组学的研究,进而发现了 非编码RNAs。人类基因组中只有2％的编码转录成蛋白,而绝大多数 转录成非编码RNAs，包括小分子核糖核酸、长非编码rna(lncRNAs) 和假基因。最近,miRNA在细胞进程的各个方面的作用已经得到证实， 然而，lncRNAs的功能研究不是很透彻。ENCODE计划中GENECODE 研究组新数据显示有成千上万的lncRNAs,但只有其中的一些有生物 学功能。有趣的是,这些lncRNAs通过染色质重塑参与调控多种细胞 进程,包括重组干细胞多能性,父母的印记和肿瘤细胞的扩散和转移以 及表观遗传修饰和吸附miRNAs。
最近,大量的研究显示，异常lncRNAs表达与多样的人类疾病相 关。大量研究表明其可在多个层面广泛参与调控肿瘤的发生发展，影 响肿瘤细胞的分化、增殖、凋亡及侵袭转移等重要的生物学过程，主 要包括表观遗传水平调控、转录水平调控与转录后水平调控。长链非 编码RNA广泛参与了多种肿瘤的癌变过程，如结直肠癌、胃癌、肝 癌及胰腺癌等。从这个角度上说，寻找lncRNA作用于结直肠癌的机 理，进而开发成药物对于结直肠癌的研究和治疗具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种长链非编码RNA在诊断结直肠癌以及 在制备治疗结直肠癌药物中的应用。本发明采用以下技术方案：
一种长链非编码RNA，Linc01003，其特征在于，长度为1438bp， 其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，即
CGGGCACCCCCGCCCGCCAGGCACGGCCGCGGCTCCTTCCTCTTCCTGCCCGCGGTAGTGGGGGTGGGGCAGGCCTCGGGACACCTGCCTCCGCCGCCGGCCGCCGGCCGCCGTCCTCGCGCGGCTTCCCGGGCGGCTCTGCCCCGACCGTAGACTCCCGGCCCGCTCGCCGCGGCAGGAGCCGTGGTTCCGCGGACCTGGGCGCGCTCTCTCCCTGGCCACTGGGAGACCCCCCGCGGCCTCGCGGGGAAAACCTCGGGACTGCCCCGCGCCCCCGGCCGTCTCTGCGTCGCTCCTTCTCGCCCGCGACCGTGGACTCGTCCTCGCGAGCCTGGGTTGGCGGAAGCTGCGGGGGCCGGGGTCGCACTACTTGGCGCGGAAGGGCCGGCGGTGGGCGGAGGGATCCCCGTCCGCGGGGTGAGCCGCTGGGCGGAGCCGGGAGGAGCCGCGAGGATCCGCAGTGGGGAGCCGGGAGGAACCTGGCGCCGGCACCCACCCGCCGCGCCCACGCGTGCCGCGGTCGCTTGTTTCCCGCGGGAGCCCGGCCGCGCTCGGGGGGAGGCGCGCGCGCAGCTGGGGCTGCCTGGGTCTAGGAGCTCCGGAGCCACCGTTTTGTGCCCGTGGAGCCGCGGGGAAGGCGCACGCGCTCGGGTCTTCCCGGCGGGTCGTCCTGCACTTTCTCCCTCTCCGGTACGGACCGCGGCGTTCTGTTTCCAGGCAAAGGAAAATAAGTCAAAGACTCAGAAGGCAGCCTGAATCCAGGGCCTGGGATGCAGGGTTTGCTGGAACGCCAGCCGGTGCGATCGCGCCCCTGGGATTCCGCTTAGCCCGCGCGTCCATTTCCCTGCATGGTGGACTCAGTAAAGCCGGATCTGTCCAACGCCTGCAGCGTGGATGTGGAGGCGGACTAATCAACTAGTGCTCTGTTATTATTTCTACCCATCCCTTTTCTCCATGCTAATTTGCTTAGAACTTTAACATTGAATGGACAGCAAATGTCATGTTCTGTTTAATTATCACTCCTTGACCATTATGTTAATTTCTTTCCCTAACAAGGTGACGCATTGTTTTAAGTAACAATGACCAACTCATCTACTCTTCTTCCAAATTGTGTAAATTGAAGGGTAAAATGTGGGAAAACGCTAAATTTGAATGCTAAATTTGAACATTTCACACAACAATAATTTGAAATGCTTCTTTGCAATATTATGGCGTTTCGGAACAGATAAAAATACTTCATTTTCAGACATTTGGTCAACAAATACTTCTTGGACGTTTATATGCAAAGCAATGCATGTAACATTTTCATTACTTTGCAAGTGTGCTTATCAGTAAAAGAATTTTGTTTTAAATTCTAGCCTTCGTTTAAATGTATTTTAGTTACCACATTGGGAAGAAAATAAAATATTACTATGTACGGA AAAAAAAAAAAAAAAAA
检测上述长链非编码RNA的试剂在制备诊断结直肠癌试剂中的 应用。
进一步的，本发明还提供一种药物组合物，包括诊断上述长链非 编码RNA的检测试剂。
优选的，所述的药物组合物在制备治疗结直肠癌药物中的应用。
另一方面，本发明还提供一种检测Linc01003的引物1，其特征 在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2、3所示，即：SEQ ID NO:2 Linc01003FGTAAAGCCGGATCTGTCCAA，SEQ IDNO：3Linc01003 RAATGCGTCACCTTGTTAGGG。
此外，本发明还提供了四组检测Linc01003的引物2-5，其特征 在于，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：4、5，SEQ ID NO：6、7， SEQ ID NO：8、9和SEQ ID NO：10、11所示。
进一步的，本发明请求保护如上述引物在制备诊断结直肠癌试剂 中的应用。
另外，本发明提供一种试剂盒，包括上述引物；优选的，所述试 剂盒中引物的浓度为0.01～0.1mol/L。
另一方面，本发明提供一种治疗结直肠癌的药物组合物，其中包 括Linc01003的抑制剂。
进一步的，所述Linc01003的抑制剂为Linc01003的siRNA。
此外，本发明还提供六种干扰Linc01003的siRNA 1#-6#,其特征在 于，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：12、13、14、15、16、17所 示。
1#Sequence(5’-3’)-CCA ACU CAU CUA CUC UUC UUC CAA A(SEQ ID NO:12)
2#Sequence(5’-3’)-GAA UGG ACA GCA AAU GUC AUG UUC U(SEQ ID NO:13)
3#Sequence(5’-3’)-GAC UAA UCA ACU AGU GCU GUG UUA U(SEQ ID NO:14)
4#Sequence(5’-3’)-AGA ACA UGA CAU UUG CUG UCC AUU C(SEQ ID NO:15)
5#Sequence(5’-3’)-UUU GGA AGA AGA GUA GAU GAG UUG G(SEQ ID NO:16)
6#Sequence(5’-3’)-AUA ACA GAG CAC UAG UUG AUU AGU C(SEQ ID NO:17)
优选的，所述siRNA的序列为1#Sequence(5’-3’)-CCA ACU CAU CUA CUC UUC UUCCAA A
3#Sequence(5’-3’)-GAC UAA UCA ACU AGU GCU GUG UUA U
、有益效果
本发明从细胞、临床组织标本、整体动物三个层面研究LncRNA Linc01003在CRC发生发展中的作用，揭示了其在结直肠肿瘤中的作 用与机制，亦作为监测结直肠癌复发转移和预后预测的分子标志。本 发明为结直肠癌的辅助诊断和预后预测提供了强有力的分子生物学 工具，具有深远的临床意义和重要的推广应用前景。
附图说明
图1 Linc01003在结直肠癌细胞系HCT116、SW480中较正常肠黏膜 细胞中表达量
图2 Linc01003在CRC组织中较癌旁组织中的表达效果
图3干扰序列1#-6#对Linc01003表达的影响效率
图4a干扰序列1#、3#对结直肠癌细胞系HCT116增殖情况的影响
图4b干扰序列1#、3#对结直肠癌细胞系SW480增殖情况的影响
图5a干扰序列1#、3#对结直肠癌细胞系HCT116细胞周期的影响
图5b干扰序列1#、3#对结直肠癌细胞系SW480细胞周期的影响
图6a干扰序列1#、3#对结直肠癌细胞系HCT116细胞凋亡的影响
图6b干扰序列1#、3#对结直肠癌细胞系SW480细胞凋亡的影响
图7本发明的实验路线
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述，但不限制本发明。
实施例中末注明具体条件的的实验方法，基本上都按照 Sambrook，J等人编著的《分子克隆实验指南(第3版)》 (MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rded.黄培堂等译，科学出版 社.2002.8)中所述的条件及方法或按照材料提供商所建议的条件及方 法进行，其它没有详细描述的技术相应于本领域人员来说是熟知的标 准方法。
本发明的材料：本申请中提及的细胞株以及培养基均有商品供应 或以别的途径能为公众所得，它们仅作举例，对本发明不是唯一的， 可分别用其它适合的工具和生物材料来代替。
一、实验对象
我们收集了80对2015年至2016年在江苏省人民医院接受诊断 和治疗的结直肠癌患者以及不含有该疾病的健康志愿者的组织。组织 样本收集的均为第一时间液氮或储存在-80℃，直至RNA提取。该研 究经过南京医科大学伦理委员会批准。获得所有病人的书面知情同 意。
二、实验设备和试剂
本发明所需要的实验材料如抗体、试剂盒等均可以商购。
1.实验设备：
(1)石蜡切片机RM2135(上海倍曼生物科技有限公司)
(2)-80℃超低温冰箱(法国JOUAN公司)
(3)低温离心机Centrifuge 5810R(德国Eppendorf公司)
(4)CO2恒温细胞培养箱(美国Forman scientific公司)
(5)实时定量PCR仪(德国Eppendorf公司)
(6)JD-801专业数码凝胶成像与分析系统(南京大学捷达公司)
(7)电泳仪(美国Bio-Rad公司)
(8)转膜仪(美国Bio-Rad公司)
(9)倒置显微镜(日本Nikon公司)
(10)荧光显微镜(德国Lecia)公司)
(11)流式细胞仪FACScan(美国BD公司)
(12)自动酶标仪Elx800(美国BioTek公司)
(13)超净工作台(苏州净化设备厂SW-CJ-1C)
(14)AG22331Hamberg分光光度计(美国Eppendorf公司)
(15)DU80核酸蛋白检测仪(美国Beckman Coulter公司)
(16)恒温水浴箱(美国Poly Science公司)
(19)THZ-82A台式恒温震荡仪(上海跃进医疗器械厂)
(20)循环水浴锅(丹麦Heto公司)
(21)摇床(上海嘉鹏科技有限公司)
(22)BS124S型电子天平(美国Sartorius公司)
(23)杂交炉(Agilent公司)
(24)扫描仪(Axon Instrument公司)
2.实验试剂:
(1)Trizol Reagent(Invitrogen美国)
(2)FuGENE&HD转染试剂盒(Roche德国)
(3)反转录试剂盒(TaKaRa日本)
(4)PCR试剂盒子(TaKaRa日本)
(5)引物(GIBICO美国)
(6)小干扰RNA(Invitrogen美国)
(7)过表达载体pCDNA/NC空白载体(Invitrogen美国)
(8)质粒小量抽提试剂盒子(Qiagen Hilden德国)
(9)胎牛血清(GIBICO美国)
(10)DMEM(高糖培养基)(GIBICO美国)
(11)胰蛋白酶(Invitrogen美国)
(12)p57抗体(Invitrogen美国)
(13)EZH2抗体(Invitrogen美国)
(14)Anti-EZH2抗体(Merck&Millipore德国)
(15)MTT苏木紫(Sigma美国)
(16)Nuclease-free Water(Qiagen美国)
(17)RIP试剂盒(Merck&Millipore德国)
(18)CHIP试剂盒(Merck&Millipore德国)
三、实验步骤
1.实验路线，本发明的实验路线如图7：
2.长链筛选
通过分析TCGA和GEO数据库中结直肠癌-正常组织的LncRNA 表达谱，筛选出差异表达LncRNA Linc01003，qRT-PCR在45对患者 结直肠组织和癌旁组织，发现相比较癌旁组织，结直肠组织中的 LINC01003表达显著增高。
3.细胞功能研究
3.1细胞系
两种结直肠癌细胞系(SW480和HCT116)，一种正常结直肠上皮细胞 系HcoEpic购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库(中国上 海)。均用DMEM培养基(GIBCO-BRL)培养，培养基中均含有10％ 的胎牛血清、100U/ml的青霉素和100mg/ml的链霉素。5％CO2的37℃ 恒温培养箱中常规培养。每2-3天更换新鲜培养基，当细胞融合度达 到80％-90％时传代。所有细胞系被短串联重复序列的DNA分析验证。
3.2RNA提取和定量PCR分析
根据试剂的使用说明，用Trizol试剂分离总RNA。逆转录反应 应用TaKaRa PrimeScript试剂盒(TaKaRa,大连,中国)。逆转录试 剂盒对1μg总RNA进行逆转录，最终体积为20μl。
RNA的提取
取0.1g组织，液氮研磨充分(成粉末状)，预冷的PBS润洗2 次。加入1ml的Trizol裂解液，以无酶枪头吹打混匀，静置5min， 将裂解液移入预先标记好的无酶1.5ml的离心管中。4℃7500g离心 5分钟，取上清加入1/5体积的氯仿，颠倒混匀30s，静置2min。4℃，12000g离心，15min。溶液分三层(水相-白色沉淀-红色有机物)， 转移水相层至新的1.5ml离心管中，尽量不要吸到白色沉淀。加入等 体积异丙醇，轻轻颠倒混匀，放置5-10min。4℃，12000g离心，10 min。吸弃上清，加入1ml 75％的乙醇(现配)，洗涤RNA沉淀。4℃， 7500g离心，5min，弃上清。尽量去除75％的酒精，于室温中晾干， 约15min。用无RNA酶水(20-25μl)溶解RNA沉淀。
紫外吸收测定法测定RNA的浓度。使用紫外分光光度计测定 RNA浓度和纯度，测量前先用溶解RNA用的DEPC水调零。在260 nm处读值1为表示40ng/μl，RNA溶液的A260/A280的比值用于RNA 纯度的检测，比值范围在1.8到2.1表明符合要求。琼脂糖凝胶电泳 鉴定RNA的完整性。配制1％的琼脂糖胶。加热溶解琼脂糖，冷却， 加入1μl溴化乙锭(EB,10mg/ml)。摇匀后倒胶，待胶冷凝后，置 于电泳槽中，浸于1×TAE缓冲液中平衡10min，待用。点样。按1:4(v/v)将5×核酸电泳上样缓冲液与样本混合，准确将各样本含有1 μg的RNA加入凝胶孔中。80V恒压电泳50min。电泳结束后，在 凝胶成像仪上观察结果。
Tris-乙酸(TAE)缓冲液配方(1L)50×：
逆转录反应应用TaKaRa PrimeScript试剂盒(大连宝生物工程有 限公司)。逆转录反应体系如下：
反转录反应条件如下：37℃15min(反转录反应)；85℃5sec(反 转录酶的失活反应)。
实时定量PCR
结直肠组织及癌旁组织标本，细胞的总RNA，根据Genebank提供的 基因序列，设计引物序列，
QPCR应用7300PCR系统(Applied Biosystems，Warrington，UK)。 cDNA样品采用三部法PCR扩增标准程序。反应体系：
反应条件：
我们共涉及5组检测引物，序列如下：
第一组：LEFT PRIMER:GTAAAGCCGGATCTGTCCAA(SEQ ID NO：2)
RIGHT PRIMER:AATGCGTCACCTTGTTAGGG(SEQ ID NO：3)
第二组:LEFT PRIMER:GTCCTGCACTTTCTCCCTCT(SEQ ID NO：4)
RIGHT PRIMER:TTGATTAGTCCGCCTCCACA(SEQ ID NO：5)
第三组:LEFT PRIMER:CCCTAACAAGGTGACGCATT(SEQ ID NO： 6)
RIGHT PRIMER:CTGTTCCGAAACGCCATAAT(SEQ ID NO：7)
第四组:LEFT PRIMER:TCCTGCACTTTCTCCCTCTC(SEQ ID NO： 8)
RIGHT PRIMER:CTGTTCCGAAACGCCATAAT(SEQ ID NO：9)
第五组:LEFT PRIMER:CTCAGAAGGCAGCCTGAATC(SEQ ID NO： 10)
RIGHT PRIMER:AATGCGTCACCTTGTTAGGG(SEQ ID NO： 11)
结果分析：分析引物的特异性及扩增效率，根据溶解曲线判断引物 的反应特异性。根据扩增曲线得到Ct值，采用相对量法与内参 GAPDH进行目的基因相对表达量的分析。计算公式为：2^(-△Ct)， △Ct＝Ct gene-Ct control。其中CT值是指每个反应管内的荧光信号强 弱达到设定阈值时的循环数，CT值与组织和细胞RNA的表达水平呈 负相关，即CT值增加，则表示RNA水平低。
我们通过qRT-PCR检测发现，与正常结肠上皮相比，LINC01003 在结直肠细胞株SW480与HCT116的表达显著增高。
实验结果：如图2和表1所示，Linc01003在结直肠癌细胞系HCT116、 SW480中也较正常肠黏膜细胞中表达量高。
表1
ΔΔCT值 1 2 3 4 5
SW480 7.9 / 0.59 / /
HCT116 10.6 2.1 1.13 / 4.19
进一步合成针对LINC01003特异性的siRNA序列(invitrogene 公司)和空白对照si-NC并转染到结直肠癌细胞，48小时后收集细胞 的总RNA，qRT-PCR分别检测转染效率。
六种干扰Linc01003的siRNA 1#-6#,其特征在于，其核苷酸序列分 别如SEQ IDNO：12、13、14、15、16、17所示。
1#Sequence(5’-3’)-CCA ACU CAU CUA CUC UUC UUC CAA A(SEQ ID NO:12)
2#Sequence(5’-3’)-GAA UGG ACA GCA AAU GUC AUG UUC U(SEQ ID NO:13)
3#Sequence(5’-3’)-GAC UAA UCA ACU AGU GCU GUG UUA U(SEQ ID NO:14)
4#Sequence(5’-3’)-AGA ACA UGA CAU UUG CUG UCC AUU C(SEQ ID NO:15)
5#Sequence(5’-3’)-UUU GGA AGA AGA GUA GAU GAG UUG G(SEQ ID NO:16)
6#Sequence(5’-3’)-AUA ACA GAG CAC UAG UUG AUU AGU C(SEQ ID NO:17)
发现转染后LINC01003的表达降低。其中1#和3#干扰序列后其 表达水平明显降低，干扰效果更好，在HCT116和SW480中干扰效 率同时超过70％的siRNA，其余序列干扰水平不佳，因此随后实验用 1#和3#干扰序列进行敲低。
下表2和图4均反映了干扰序列1#-6#对Linc01003表达的影响效 率，序列1#、3#对Linc01003的表达具有显著影响,在SW480与HCT116 细胞系中干扰效率都达到70％以上，其余2#、4#、5#、6#干扰序列 均未能在两个细胞系中干扰效率同时达到70％，故选取1#、3#进行细胞功能试验。
表2
干扰效率 NC 1# 2# 3# 4# 5# 6#
HCT116 1 78％ 44％ 76％ 21％ 12％ 29％
SW480 1 72％ 36％ 85％ 47％ 21％ 42％
3.3质粒构建
合成人全长LINC01003pcDNA，并将其插入真核表达载体pCDNA 中，构建LINC01003过表达载体质粒，随后将上述质粒转化大肠杆菌， 摇菌、培养、挑选单克隆菌培养扩增。直接靶向LINC01003的shRNA 由上海吉玛公司合成。
3.4细胞转染
用于转染的质粒载体(pCDNA-LINC01003、sh-LINC01003和空载 体质粒)，均用去除内毒素的质粒提取试剂盒(DNA Midiprep试剂盒， Qiagen)提取。LINC01003的干扰序列及乱序对照(si-NC)均购自 Invitrogen公司(Invitrogen公司，CA，USA)。将细胞SW80和HCT116 按每孔2×105个细胞种于6孔培养板，待细胞贴壁后，于转染前12h吸 弃原有培养基，换成无双抗培养基；取10μL脂质体稀释于250μL 的OPTI-MEM中，温和吹打混匀室温下孵育5min；取100pmol siRNA, si-NC或4ug质粒载体分别稀释于250μL OPTI-MEM中，吹打混匀室温 下孵育5min；将孵育好的脂质体与siRNA或质粒稀释液混合，温和吹 打混匀。于室温下继续孵育20min；将上述混合物均匀滴入事先加好1.5 mL OPTI-MEM的6孔培养板中，轻轻混匀。37℃,5％CO2培养箱中继 续培养6h后，换完全培养基。转染后48h，收集细胞提取RNA或蛋白 进行实时定量RT-PCR或免疫印迹分析。sh-LINC01003或空质粒稳转 SW480细胞系在转染sh-LINC01003或空质粒后用G418筛选两周，随后 收集克隆细胞进行体内肿瘤形成实验。
3.5 MTT实验
将处理后的细胞按每孔1500-2000个细胞接种于96孔培养板。待细 胞80％贴壁后，细胞同步化12h，弃去原有培养基。每个样本设置6个 复孔，每孔总反应体积为200μl。分别于孵箱培养6、24、48、72、96h 后每孔加入20μl的MTT反应液(5mg/ml，溶于PBS)，37℃避光孵育 4h。弃去上清液，每孔加入150μl二甲亚砜(DMSO)，震荡10min，酶 标仪测定490nm波长处的吸光度。
为探究LINC01003在结直肠中发挥的生物学功能，我们在结直肠细 胞系SW480和HCT116中进行敲低LINC01003，MTT实验检测结果显示， 在结直肠癌细胞中敲低LINC01003能显著抑制细胞增殖活。由图可知， 1#干扰序列对HCT116细胞和SW480增值影响基本相同，3#干扰序列对 SW480细胞增殖抑制更为明显。
3.6 EdU实验
(1)将无菌细胞爬片置于24孔板中，并钟入细胞；
(2)在细胞对数生长期转染干扰序列，持续培养48h
(3)培养48h后用细胞完全培养基按1000：1比例稀释EdU溶液， 制备适量50uM EdU培养液
(4)每孔加200ul的50uM EdU培养液孵育2h，弃培养基；
(5)PBS清洗细胞1-2次，每次5min
(6)每孔加50ul的细胞固定液(即含有4％多聚甲醛的PBS)室温 孵育30min，弃固定液；
(7)每孔加入50ul 2mg/ml的甘氨酸，脱色摇床孵育5min后，弃 甘氨酸溶液；
(8)每孔加500ul的PBS清洗5min
(9)每孔加入200ul渗透剂(0.5％TritonX-100的PBS)并进行脱 色摇床孵育10min，PBS清洗一次，5min；
(10)每孔加入200ul的1X Apollo染色反应液，避光室温脱色摇床 孵育30min，弃染色液；
(11)加入200ul渗透剂(0.5％TritonX-100的PBS)脱色摇床清洗 2-3次，每次10min，弃渗透剂；
(12)每孔每次加入200ul的甲醇清洗1-2次，每次5min；PBS清 洗1次，5min；
(13)取出爬片，行DAPI染色后立即观测。
3.7流式细胞术
凋亡检测，用胰酶消化收集转染48小时后的SW480和HCT116细胞， 随后根据FITCAnnexin V凋亡检测试剂盒(BD)及其使用说明予以 Annexin V-FITC荧光探针和碘化丙锭(PI)染色。流式细胞仪检测和分析。 碘化丙锭(PI)为一种核酸染料，其无法透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚 期的细胞和死细胞中，PI能透过细胞膜并使细胞膜发生红染。所以将Annexin V与PI配合使用，可以将凋亡早晚期以及死细胞区分开来。
为了探究LINC01003促进结直肠癌细胞增殖是否通过部分抑制肿瘤 细胞凋亡进程，我们利用流式细胞术进行细胞凋亡检测，结果发现与对照 组相比，SW480与HCT116细胞系中敲低LINC01003后细胞的凋亡比例 显著增加。6条干扰序列都有增强凋亡的效果，其中1#干扰序列使HCT116 细胞凋亡比例上升18.53％，使SW480细胞凋亡比例上升18.78％，3#干扰 序列使HCT116细胞凋亡比例上升18.07％,使SW480细胞凋亡比例上升 20.12％.由此可见，1#干扰序列对HCT116细胞和SW480凋亡影响基本相 同，3#干扰序列对SW480细胞凋亡影响最大。
3.8肿瘤形成实验
4周龄雌性裸鼠BALB/c小鼠，购自南京大学模式动物中心；培养 SW480细胞，分别转染sh-LINC01003或空载体；细胞转染后48小时， 胰酶消化，PBS洗两遍，重新悬浮在无血清培养基中，并计数。2组细 胞均取1×107个细胞悬浮在0.1ml无血清DMEM培养基中，皮下注射建 立体内肿瘤形成模型。每三天测量一次肿块生长情况。18天后，处死裸 鼠，测量皮下肿瘤组织大小；qRT-PCR检测LncRNA Linc01003的表达水 平，石蜡包埋标本，HE染色，免疫组化检测增殖标记物ki-67及靶基 因的变化。进一步评价LncRNA Linc01003对CRC细胞增殖、凋亡能力 的影响。以上所有的实验程序均按着NIH1996年版的动物实验指导来执 行的。用全价颗粒饲料喂养小鼠，自由饮水，室温(22±2)℃，湿 度50～60％，通风良好，12:12h光照/黑暗周期。所有实验均经过南京医 科大学动物保护和伦理委员会(IACUC)批准。
3.9亚细胞结构定位
根据使用说明书使用PARIS试剂盒(Life Technologies，USA)分 离细胞系细胞核和细胞质。使用qPCR方法检测linc01003、GAPDH和 U1在细胞质和细胞核中的分布。GAPDH为细胞质参照，U1为细胞核参 照。以总RNA百分比呈现LINC01003、GAPDH和U1在细胞质和细胞核中的表达情况。
3.10 RNA免疫印迹
裂解SW480和HCT116细胞供内源性PRC2复合物和LSD1免 疫印迹实验使用。将细胞上清与包被分别识别EZH2、LSD1、 SNRNP70和对照IgG的蛋白A/G琼脂糖磁珠在4℃孵育6个小时。 随后，清洗磁珠，用0.1％SDS/0.5mg/ml蛋白酶K在55℃孵育30分 钟以去除蛋白。提取RNA供qPCR分析。
3.11染色质免疫共沉淀
使用4％多聚甲醛固定SW480和HCT116细胞，孵育10分钟以 产生DNA-蛋白交联。超声裂解细胞以产生200-300bp的染色体碎片， 随后用EZH2、H3K27me3、LSD1和H3K4me2特异性抗体和对照IgG 抗体孵育沉淀。恢复染色质DNA，随后使用qPCR检测分析。
3.12蛋白质免疫印迹
将变性好的细胞蛋白裂解产物加入至预先制好的10％变性聚丙 烯酰氨凝胶(SDS-PAGE)的加样孔中，分离样本中蛋白。随后转至NC 膜，并以特异性抗体孵育。最后用ECL发光液压片曝光。GAPDH抗 体为对照数据处理。
实验数据皆用SPSS17.0软件分析，以三次实验的平均值±标准误表 示，组间差异用双尾Student’s T检验、秩和检验和卡方检验。DFS 和OS分析用Kaplan-Meier方法。生存数据还用单因素和多因素Cox 比例风险模型分析。基于Cox回归分析，单因素分析中p<0.05的随 后再使用多因素分析。计算双尾p值，选取a＝0.05的检验水准。
四、临床病理研究
进一步收集CRC组织标本并整理详细病理资料和建立随访记录 库。qRT-PCR技术检测CRC组织标本及癌旁标本中Linc01003的表 达水平，并分析其与CRC病人的病理资料(如TNM分期、病理特 征、预后等)的相关性。qRT-PCR分析CRC组织标本及配对正常 标本中相应靶基因的表达水平；免疫组化检测靶基因蛋白水平的表达 量；分析CRC临床组织标本中靶基因之间相关性。以进一步评价 Linc01003可作为CRC早期预防和诊断的标志物，其表达异常可能是 促进CRC发生的关键靶分子。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京医科大学第二附属医院
<120> 一种长非编码RNA及其组合物在诊断／治疗结直肠癌中的应用
<160> 17
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1438
<212> DNA
<213> 长链非编码RNA
<400> 1
cgggcacccc cgcccgccag gcacggccgc ggctccttcc tcttcctgcc cgcggtagtg 60
ggggtggggc aggcctcggg acacctgcct ccgccgccgg ccgccggccg ccgtcctcgc 120
gcggcttccc gggcggctct gccccgaccg tagactcccg gcccgctcgc cgcggcagga 180
gccgtggttc cgcggacctg ggcgcgctct ctccctggcc actgggagac cccccgcggc 240
ctcgcgggga aaacctcggg actgccccgc gcccccggcc gtctctgcgt cgctccttct 300
cgcccgcgac cgtggactcg tcctcgcgag cctgggttgg cggaagctgc gggggccggg 360
gtcgcactac ttggcgcgga agggccggcg gtgggcggag ggatccccgt ccgcggggtg 420
agccgctggg cggagccggg aggagccgcg aggatccgca gtggggagcc gggaggaacc 480
tggcgccggc acccacccgc cgcgcccacg cgtgccgcgg tcgcttgttt cccgcgggag 540
cccggccgcg ctcgggggga ggcgcgcgcg cagctggggc tgcctgggtc taggagctcc 600
ggagccaccg ttttgtgccc gtggagccgc ggggaaggcg cacgcgctcg ggtcttcccg 660
gcgggtcgtc ctgcactttc tccctctccg gtacggaccg cggcgttctg tttccaggca 720
aaggaaaata agtcaaagac tcagaaggca gcctgaatcc agggcctggg atgcagggtt 780
tgctggaacg ccagccggtg cgatcgcgcc cctgggattc cgcttagccc gcgcgtccat 840
ttccctgcat ggtggactca gtaaagccgg atctgtccaa cgcctgcagc gtggatgtgg 900
aggcggacta atcaactagt gctctgttat tatttctacc catccctttt ctccatgcta 960
atttgcttag aactttaaca ttgaatggac agcaaatgtc atgttctgtt taattatcac 1020
tccttgacca ttatgttaat ttctttccct aacaaggtga cgcattgttt taagtaacaa 1080
tgaccaactc atctactctt cttccaaatt gtgtaaattg aagggtaaaa tgtgggaaaa 1140
cgctaaattt gaatgctaaa tttgaacatt tcacacaaca ataatttgaa atgcttcttt 1200
gcaatattat ggcgtttcgg aacagataaa aatacttcat tttcagacat ttggtcaaca 1260
aatacttctt ggacgtttat atgcaaagca atgcatgtaa cattttcatt actttgcaag 1320
tgtgcttatc agtaaaagaa ttttgtttta aattctagcc ttcgtttaaa tgtattttag 1380
ttaccacatt gggaagaaaa taaaatatta ctatgtacgg aaaaaaaaaa aaaaaaaa 1438
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gtaaagccgg atctgtccaa 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aatgcgtcac cttgttaggg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gtcctgcact ttctccctct 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ttgattagtc cgcctccaca 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ccctaacaag gtgacgcatt 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ctgttccgaa acgccataat 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tcctgcactt tctccctctc 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ctgttccgaa acgccataat 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ctcagaaggc agcctgaatc 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
aatgcgtcac cttgttaggg 20
<210> 12
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 12
ccaacucauc uacucuucuu ccaaa 25
<210> 13
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 13
gaauggacag caaaugucau guucu 25
<210> 14
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 14
gacuaaucaa cuagugcugu guuau 25
<210> 15
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 15
agaacaugac auuugcuguc cauuc 25
<210> 16
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 16
uuuggaagaa gaguagauga guugg 25
<210> 17
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 17
auaacagagc acuaguugau uaguc 25

Claims (10)

1.一种长链非编码RNA，Linc01003，其特征在于，长度为1438bp，其核苷酸序列如SEQID NO:1所示。
2.检测权利要求1所述的长链非编码RNA的试剂在制备诊断结直肠癌试剂中的应用。
3.一种组合物，包括诊断权利要求1所述的长链非编码RNA的检测试剂。
4.一种检测Linc01003的引物，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2、3所示。
5.四组检测Linc01003的引物，其特征在于，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：4、5，SEQID NO：6、7，SEQ ID NO：8、9和SEQ ID NO：10、11所示。
6.如权利要求4所述的引物在制备诊断结直肠癌试剂中的应用。
7.一种试剂盒，包括权利要求4-5任一项所述的引物；优选的，所述试剂盒中引物的浓度为0.01～0.1mol/L。
8.一种治疗结直肠癌的药物组合物，其中包括Linc01003的抑制剂。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述Linc01003的抑制剂为Linc01003的siRNA。
10.根据权利要求8-9中的药物组合物，其特征在于，包括如序列12或13、14、15、16、17所示的siRNA。
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