CN106834288A - 一种长非编码rna及其在诊断/治疗胃癌中的应用 - Google Patents

Abstract

一种长非编码RNA及其在诊断/治疗胃癌中的应用。本发明属于基因工程领域，特别涉及LINC00707在制备预测胃癌预后及靶点药物治疗中的应用；针对LINC00707检测的试剂可以诊断胃癌及判断胃癌患者预后；LINC00707的抑制剂可以治疗胃癌。

Description

一种长非编码RNA及其在诊断/治疗胃癌中的应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，特别涉及一种长非编码RNA及其在诊断/治疗胃癌中的应用。

背景技术

胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤，也是严重威胁人类健康和生命的癌症之一。尽管手术、介入、放化疗、靶向治疗和免疫治疗等综合性治疗手段顺利开展，但胃癌的死亡率仍较高，大部分患者在就诊时已经处于癌症晚期。即使接受根治性手术或者辅助化疗的患者，仍有近60％的病人出现胃癌的复发或转移，严重影响患者的预后。因此，更好地了解胃癌的发病机理和分子机制对胃癌的早期诊断和治疗至关重要。

除蛋白编码基因的异常调控，越来越多的证据表明，一些非编码RNA产物尤其是长非编码RNA(long non-coding RNAs，lncRNAs)的异常表达也参与胃癌恶性进展。lncRNAs是一类转录本长度超过200nt的RNA分子，有别于其他小分子非编码RNA，其可在表观遗传学、转录以及转录后水平等多种层面调控基因的表达，影响肿瘤发生。本课题组前期研究结果显示：lncRNA HOXA-AS2通过表观沉默P21/PLK3/DDIT3的表达促进胃癌细胞的增殖。lncRNAHOTAIR可竞争性吸附miR-331-3p上调HER2，促进胃癌发展。更多文献检索结果显示：lncRNAs发挥原癌基因或抑癌基因的作用，普遍参与胃癌细胞增殖、凋亡和侵袭转移的生物学过程。提示lncRNAs可能作为胃癌细胞功能重要调控分子之一，影响胃癌进程。

为进一步研究lncRNAs在胃癌发生发展中的作用，我们通过对GEO数据库(GeneExpression Omnibus)中一份胃癌病例-对照芯片数据(GSE58828)分析发现，LINC00707在胃癌组织中表达显著上调。同时对TCGA数据库(The Cancer Genome Atlas)中30例胃癌患者癌和癌旁组织中LINC00707的表达量分析发现，LINC00707在胃癌组织中表达上调。临床病理资料分析结果显示，高表达的LINC00707与胃癌患者的肿瘤大小、分期、淋巴结转移及预后密切相关，提示LINC00707可能在胃癌发生发展过程中发挥重要作用且可能成为胃癌诊断及预后的分子靶标。细胞功能学实验发现，在胃癌细胞系中敲低LINC00707的表达抑制胃癌细胞增殖和转移能力，促进胃癌细胞凋亡；动物实验结果证实干扰LINC00707的表达抑制胃癌细胞的肿瘤形成能力。综上结果表明：LINC00707在胃癌细胞中发挥原癌基因的作用，参与胃癌的恶性进程，并可能作为胃癌患者诊断和预后的分子标记物。

发明内容

本发明的目的是提供用于诊断胃癌预后情况或作为治疗胃癌药物靶点的lncRNALINC00707，其基因位于10p14，长度为3087bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1，

SEQ ID NO:1：

本发明还涉及识别所述的长非编码RNA的标记物在制备判断胃癌治疗预后情况的诊断产品中的应用，所述的标记物包括但不限于：

(1)结合所述长非编码RNA的引物/引物组或荧光标记的结合所述长非编码RNA的引物/引物组；

(2)结合所述长非编码RNA的小分子化合物；

(3)结合所述长非编码RNA的生物大分子，所述的生物大分子包括但不限于：抗体或抗体功能片段、荧光标记的抗体或抗体功能片段、RNA结合蛋白或其功能片段、荧光标记的RNA结合蛋白或其功能片段。

优选的，所述的引物组或荧光标记的引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5所示，

LINC00707 Primer F(SEQ ID NO：2)：5'TCACATCTGTGAAAAGAGTGCT3',

Primer R(SEQ ID NO：3)：5’-CTGGACTGTGAGTACCAGGC-3’。

GAPDH Primer F(SEQ ID NO：4)：5'GGGAGCCAAAAGGGTCAT 3',

Primer R(SEQ ID NO：5)：5'GAGTCCTTCCACGATACCAA 3'。

本发明还涉及包含所述的识别所述的长非编码RNA的标记物的用于判断非小细胞肺癌治疗预后情况的试剂或试剂盒。

本发明还涉及所述的识别所述的长非编码RNA的标记物或包含所述标记物的试剂或试剂盒在判断胃癌的治疗预后情况中的应用。

本发明还涉及所述的长非编码RNA在制备治疗胃癌的药物中的应用；

本发明还涉及所述的长非编码RNA在作为筛选判断胃癌预后情况的诊断试剂中的应用。

本发明还涉及所述的长非编码RNA在作为筛选治疗胃癌的药物中的应用。

技术方案

通过qPCR筛查临床组织中LINC00707的差异表达，发现在胃癌患者癌组织中LINC00707的表达量较正常癌旁组织中表达量上调。猜想：高表达的LINC00707可能在胃癌发生发展过程中发挥重要作用。

为进一步探讨LINC00707在胃癌恶性进程中的重要作用，我们将60对胃癌组织中LINC00707的表达水平分为高表达组(n＝30)和低表达组(n＝30)，分析其表达水平与临床病理参数及患者预后的相关性。结果提示：LINC00707在胃癌组织的高表达与胃癌患者的不良预后相关，可能成为胃癌诊断及预后的分子靶标。

随后选用国际认可的4株胃癌细胞系(BGC-823、SGC-7901、MGC-803、AGS)，1株正常胃粘膜上皮细胞系(GES-1)作为实验研究对象，选用BGC-823和SGC-7901细胞做功能缺失性实验，MGC-803细胞做功能获得性实验。设计LINC00707的干扰序列，以lip2000为转染载体将干扰序列转入细胞后模拟胃癌的发病过程。通过检测在干扰序列转入细胞后细胞的功能如增殖，凋亡，迁移等。从而证明在BGC-823和SGC-7901细胞中敲低LINC00707的表达，影响了胃癌细胞的增殖，凋亡及迁移。进而加速胃癌的进程。相反，构建LINC00707质粒，正反验证LINC00707在BGC-823和SGC-7901细胞功能。

组织收集

60对胃癌和癌旁组织标本取自2011年4月至2012年4月之间在江苏省人民医院和南京市第一医院确诊为胃癌并接受手术的患者。所有的组织取下后立即置于液氮中冷冻起来并放于-80℃超低温冰箱储存。此研究通过南京医科大学伦理委员会同意，并得到所有胃癌患者的知情同意书。

细胞培养

4株胃癌细胞系(BGC-823、SGC-7901、MGC-803、AGS)，1株正常胃粘膜上皮细胞系(GES-1)均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。BGC-823、MGC-803细胞均培养在含有10％胎牛血清(10％FBS)的RPMI 1640培养基中；SGC-7901、GES-1细胞培养在含有10％胎牛血清(10％FBS)的DMEM(GIBCO-BRL)培养基中；AGS细胞培养在含有10％胎牛血清(10％FBS)的F12-k培养基中；培养基中含双抗100U/ml青霉素和100毫克/毫升链霉素(Invitrogen公司)。所有细胞在5％CO2的37℃恒温培养箱中常规培养，每2-3天更换新鲜培养基，当细胞融合度达到80％-90％时传代。

RNA提取和定量PCR分析

根据试剂的使用说明，用Trizol试剂分离总RNA。逆转录反应应用TaKaRa PrimeScript试剂盒(TaKaRa，大连，中国)。逆转录试剂盒对1μg总RNA进行逆转录，最终体积为20μl。结果分析：分析引物的特异性及扩增效率，根据溶解曲线判断引物的反应特异性。根据扩增曲线得到Ct值，采用相对量法与内参GAPDH进行目的基因相对表达量的分析。计算公式为：2^(-△Ct)，△Ct＝Ct gene-Ct control。

质粒构建

根据Refseq数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/)查询人类LINC00707基因的全长转录本序列(NR_038291.1)，公司通过化学合成法合成LINC00707的全长序列，并插入真核表达载体pcDNA3.1+中，构建LINC00707过表达载体pcDNA-LINC00707，将上述质粒转化大肠杆菌，摇菌，培养，挑选单克隆菌培养，提取质粒后测序验证序列是否发生突变。

细胞转染

所有用于转染的质粒载体，均用去除内毒素的质粒提取试剂盒提取(DNAMidiprep试剂盒，Qiagen)。LINC00707、HuR的干扰序列及乱序对照(si-NC)均购自Invitrogen公司(Invitrogen公司，CA，USA)。将BGC-823、SGC-7901、MGC-803细胞按每孔2×105个细胞种于6孔培养板，待细胞贴壁后，在转染前12h弃掉原有培养基，换成无双抗培养基；取10μl脂质体稀释于250μL的OPTI-MEM中，温和吹打混匀，室温下孵育5min；取100pmolsiRNA、si-NC或4ug pcDNA、pcDNA-LINC00707分别稀释于250μL OPTI-MEM中，吹打混匀，室温下孵育5min；将孵育好的脂质体与siRNA或质粒稀释液混合，温和吹打混匀，在室温下继续孵育20min；将上述混合物均匀滴入事先加好1.5mL OPTI-MEM的6孔培养板中，轻轻混匀，继续放入37℃，5％CO2细胞培养箱中培养；培养6h后，弃去OPTI-MEM培养基，更换为完全培养基，继续放入37℃，5％CO2细胞培养箱中培养；转染后24-48h，收集细胞提取总RNA或蛋白进行qRT-PCR检测或western blot分析。

细胞增殖活性检测

MTT实验：将转染后24h的BGC-823、SGC-7901、MGC-803细胞按每孔3000个细胞接种于96孔培养板；待细胞80％贴壁后，细胞同步化12h，弃去原有培养基。每个样本设置6个复孔，每孔总反应体积为200μl；每孔加入20μl的MTT反应液(5mg/ml，溶于PBS)，37℃避光孵育4h；弃去上清液，每孔加入150μl二甲亚砜(DMSO)，在微样振荡器上振荡10min，酶标仪测定490nm波长处的吸光度。

克隆形成实验：用0.25％胰蛋白酶消化并吹打成单细胞悬液，以适当的细胞密度(500个)接种于6孔板，使细胞分散均匀；放入细胞培养箱中，每4天换液一次，培养2周；当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS轻轻清洗2次；加纯甲醇或1:3醋酸/甲醇1ml，固定15分钟；弃甲醇固定液，加1ml 0.1％结晶紫染色液染15分钟，然后用PBS缓慢洗去染色液，空气干燥；将6孔板倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。

Edu实验：1、Edu标记，用细胞培养基按1000:1的比例稀释Edu溶液(试剂A)，制备适量50μM的Edu培养基；每孔加入200μl 50μM的Edu培养基孵育2h，弃培养基；PBS清洗细胞1-2次， 每次5min。2、细胞固定化，每孔加入1ml细胞固定液(即含4％多聚甲醛的PBS)，室温孵育30min，弃固定液；每孔加入1ml 2mg/ml甘氨酸，脱色摇床孵育5min后，弃甘氨酸溶液；每孔加入1ml PBS，脱色摇床清洗5min，弃PBS；每孔加入1ml渗透剂(0.5％TritonX-100的PBS)脱色摇床孵育10min；PBS清洗1次，5min。

3、Apollo染色

Apollo染色反应液的配方如下：

每孔加入200μl的上述Apollo染色反应液，避光，室温，脱色摇床孵育30min后，弃染色反应液；加入1ml渗透剂，脱色摇床清洗2-3次，每次10min，弃渗透剂；每孔每次加入1ml甲醇清洗1-2次，每次5min；PBS清洗1次，5min。4、DAPI染色和拍照，按DAPI:PBS(1:1000)配，平均每孔200μl分配，摇床10min；用PBS洗5次，每次5min；在载玻片上滴一滴防淬灭剂，取出玻片，正面朝下；在正置荧光显微镜下拍照。

细胞迁移实验

Transwell实验：将BGC-823、SGC-7901、MGC-803细胞按每孔2×105个细胞种于6孔板，待细胞贴壁后，转染LINC00707、HuR干扰序列或LINC00707过表达质粒；转染后24-48h取出细胞，弃上清，用PBS洗1-2遍，用0.25％胰蛋白酶消化细胞，1ml培养基终止消化，吹打混匀成细胞悬液，取少量细胞到显微镜下计数；调整细胞密度至3×104，取细胞悬液300μl加入Transwell小室；24孔培养板下室加入700μl含20％FBS的培养基，放入孵箱中培养12-48h；取出小室用棉签擦去上室内的细胞，放入700μl的纯甲醇中固定20min；将小室放入0.1％结晶紫中对小室外底面的细胞染色，用流水清洗小室，室内倒扣晾干；选取倒置显微镜对小室拍照计数。

裸鼠皮下成瘤实验

选取4周大的雄性免疫缺陷小鼠，购自南京大学模式动物中心；培养SGC-7901细胞，分别转染sh-LINC00707质粒或空质粒载体；转染24h后从孵箱取出细胞，弃培养基，用1ml PBS清洗两遍，用0.25％胰蛋白酶消化并吹打成单细胞悬液；将细胞悬液收集到15ml无菌无酶的离心管中，1500g，4℃，离心5min；弃上清，用7ml PBS重悬细胞沉淀，1500g，4℃，离心5min；弃上清，用700μl PBS重悬细胞沉淀，轻轻吹打混匀，转移至1.5ml无菌无酶的EP管中，用封口膜封口，置于冰上备用；使用1ml注射器每次吸取100μl细胞悬液，吸前吹打混匀，皮下注射到小鼠腋下；等瘤体出现后，每三天观察并记录一次两组的小鼠瘤体大小；待瘤体形成15天后处死小鼠，取出胃部组织瘤体，拍照记录，并称重。以上所有的实验程序都是按着NIH1996年版的动物实验指导来执行的。用全价颗粒饲料喂养小鼠，自由饮水，室温(22±2)℃，湿度50～60％，通风良好，12:12h光照/黑暗周期。所有实验均经过南京医科大学动物保护和伦理委员会(IACUC)批准。

流式细胞术

凋亡检测，用胰酶消化收集转染24-48小时后BGC-823和SGC-7901细胞的，随后根据FITC Annexin V凋亡检测试剂盒(BD)及其使用说明予以Annexin V-FITC荧光探针和碘化丙锭(PI)染色。流式细胞仪检测和分析。

细胞周期检测，根据说明书使用CycleTESTTM PLUS DNA试剂盒(BD)予以PI染色，随后用FACScan分析。

Tunel实验

吸取旧培养基，PBS清洗2次；4％多聚甲醛固定，室温孵育30min；PBS洗3次，每次5min；加入1％Triton，冰上孵育10min；PBS洗3次，每次5min；加入Enzyme Solution/LabelSolution(10/90)，每孔100μl；37℃，避光反应，60min；PBS洗3次，每次5min；按DAPI:PBS(1:1000)配，平均每孔200μl分配，摇床10min；用PBS洗5次，每次5min在载玻片上滴一滴防淬灭剂，取出玻片，正面朝下；在正置荧光显微镜下拍照。

免疫组化实验

脱蜡：二甲苯3×5min，100％乙醇1×5min，100％乙醇1×1min，95％乙醇2×1min，70％乙醇1×1min，双蒸水浸泡洗去乙醇；烧杯中盛放600ml DW+5.6ml抗原修复液，将玻片架于塑料架上，浸入，置微波炉大火3-5min，沸腾就调成小火，15-20min，时间长些利于抗原更多的暴露；自然冷却后，擦干组织片周围的水，用免疫组化笔划好；PBS+0.03％Tween20(300μl Tween20加入1000ml PBS中)，滴加，冲洗5min，甩去；3％H2O2滴加，15min，甩去；PBS冲洗5min；封闭抗原(用PBS配制5％脱脂牛奶滴加)30min；滴加PBS+0.03％Tween20冲洗，甩去水分，加入一抗，4℃过夜；滴加PBS+0.03％Tween20冲洗，3×5min；滴加二抗孵育；滴加PBS+0.03％Tween20冲洗，2×5min，PBS冲洗1×5min；滴加DAB，流水冲洗5-10min；苏木素染色1min，流水冲洗5min；1％Hcl(用70％酒精配制)浸泡5-15s，流水冲洗10min；70％乙醇2min，80％乙醇2min，95％乙醇2×2min，100％乙醇2×15min，二甲苯3×5min；封片。

亚细胞结构定位

根据使用说明书使用PARIS试剂盒(Life Technologies，USA)分离BGC-823、SGC-7901、MGC-803细胞的细胞核和细胞质。使用qPCR方法检测LINC00707、GAPDH和U1在细胞质和细胞核中的分布。GAPDH为细胞质参照，U1为细胞核参照。以总RNA百分比呈现LINC00707、GAPDH和U1在细胞质和细胞核中的表达情况。

RNA免疫印迹(RIP)

裂解BGC-823、SGC-7901细胞供免疫印迹实验使用。将细胞上清与包被分别识别HuR和对照IgG的蛋白A/G琼脂糖磁珠在4℃孵育6个小时。随后，清洗磁珠，用0.1％SDS/0.5mg/ml蛋白酶K在55℃孵育30分钟以去除蛋白。提取RNA供qPCR分析。

数据处理

实验数据皆用SPSS17.0软件分析，以三次实验的平均值±标准误表示，组间差异用双尾Student’s T检验，胃癌患者预后采用Kaplan-Meier函数分析。P值标示于图中，*P<0.05，**P<0.01为差异显著。

附图说明

图1.LINC00707在胃癌组织中高表达及其临床意义

1A、1B：GEO数据库和TCGA数据库分析得出LINC00707在胃癌组织中表达显著上调；

1C：生物信息学预测LINC00707可编码性极低

1D：LINC00707在胃癌患者的癌组织(n＝60)与配对的癌旁组织表达水平比较；

1E：Kaplan-Meier生存函数用于分析两组病人的LINC00707表达水平与病人预后的相关性。

图2.LINC00707在胃癌细胞中的表达水平

2A：LINC00707在胃癌细胞中表达较正常胃粘膜上皮细胞系(GES-1)上调

2B：胃癌细胞中干扰LINC00707，其中LINC00707 1#和2#产生的干扰效率更高，以下功能缺失性实验选择1#和2#干扰序列

2C：胃癌细胞中过表达LINC00707

图3.LINC00707对胃癌细胞增殖的影响

3A：MTT实验，干扰LINC00707能显著抑制BGC-823和SGC-7901细胞的增殖活力；过表达LINC00707促进MGC-803的增殖活力。

3B：克隆形成实验，敲低LINC00707后，BGC-823和SGC-7901细胞的克隆形成能力受到抑制；过表达LINC00707显著提高MGC-803细胞的克隆形成能力。

3C：Edu实验，干扰LINC00707能显著抑制BGC-823和SGC-7901细胞的增殖活力

图4.LINC00707促进胃癌细胞转移，抑制胃癌细胞凋亡

4A：流式细胞术，下调LINC00707表达可以诱导胃癌细胞凋亡；

4B：Tunel实验，下调LINC00707表达可以诱导胃癌细胞凋亡；

4C：transwell实验，下调LINC00707的表达可以抑制BGC-823和SGC-7901细胞的转移能力；过表达LINC00707的表达可以促进MGC-803细胞的转移能力。

图5.LINC00707提高胃癌细胞在体内的肿瘤形成能力

5A-B：裸鼠皮下成瘤实验，观察并记录小鼠瘤体大小，待瘤体形成15天后处死小鼠，取出瘤体，拍照记录；同时量取瘤体的大小并称其重量；

5C：瘤体检测，敲低sh-LINC00707 2#组小鼠瘤体的平均重量显著低于对照组瘤体的重量。

图6LINC00707在胃癌细胞中与HuR蛋白结合

6A：核质分离实验，LINC00707主要定位在细胞质

6B：GEO数据库中一份测序结果(GSE29779)分析LINC00707可能与RNA结合蛋白HuR结合

6C：生物信息学预测LINC00707可能与HuR蛋白结合

6D-E：RNA-pulldown和RIP实验证实LINC00707与HuR蛋白高度结合

图7LINC00707和HuR结合提高VAV3与F11R mRNAs的稳定性

7A：BGC-823细胞中分别敲低LINC00707和HuR 2#，通过转录组高通量测序检测差异表达基因

7B-C：对276个共同差异表达的基因进行GO分析和KEGG通路分析，发现这些基因大多与细胞间粘附、细胞转移、细胞增殖以及凋亡等生物学过程相关

7D：qRT-PCR在BGC-823和SGC-7901细胞中验证了测序结果的准确性

图8VAV3、F11R可能是LINC00707和HuR下游共同的靶基因

8A：生物信息学的方法预测HuR蛋白与筛选的mRNA之间的结合丰度，VAV3、F11R的mRNAs与HuR蛋白的结合丰度较高，且具有一致性

8B：RIP实验在BGC-823和SGC-7901细胞中验证了测序结果的准确性

图9“LINC00707-HuR”复合体与VAV3、F11R mRNAs结合，提高靶mRNAs的稳定性

9A-B：下调LINC00707和HuR后，VAV3和F11R的mRNAs的半衰期明显缩短

图10HuR促进胃癌细胞增殖和转移

10A：HuR在BGC-823和SGC-7901细胞中上调倍数最高

10B：在BGC-823和SGC-7901中分别转染HuR 1#、2#干扰序列后，发现2#干扰序列产生的干扰效率更高，以下功能缺失性实验选择HuR 2#干扰序列

10C：干扰HuR能显著抑制BGC-823和SGC-7901细胞的增殖活力

10D：敲低HuR后，BGC-823和SGC-7901细胞的克隆形成能力受到抑制

10E：下调HuR的表达可以抑制BGC-823和SGC-7901细胞的转移能力

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述，但不限制本发明。

一般性说明：

实施例中末注明具体条件的的实验方法，基本上都按照Sambrook，J等人编著的《分子克隆实验指南(第3版)》(MolecularCloning：ALaboratoryManual，3rded.黄培堂等译，科学出版社.2002.8)中所述的条件及方法或按照材料提供商所建议的条件及方法进行，其它没有详细描述的技术相应于本领域人员来说是熟知的标准方法。

本发明的材料：本申请中提及的细胞株、慢病毒干扰载体以及培养基均有商品供应或以别的途径 能为公众所得，它们仅作举例，对本发明不是唯一的，可分别用其它适合的工具和生物材料来代替。

干扰序列如下：

SEQ ID NO:6

LINC00707 1# CAUGACGUGAGAACUUACUAGAGAU

AUCUCUAGUAAGUUCUCACGUCAUG

SEQ ID NO:7

LINC00707 2# UUCAGUGUUAGUCUUAUCCACCUGU

ACAGGUGGAUAAGACUAACACUGAA

SEQ ID NO:8

LINC00707 3# UGUCUGUUAACACUAAUAGAGGGUG

CACCCUCUAUUAGUGUUAACAGACA

SEQ ID NO:9

HuR 1# UUACCAGUUUCAAUGGUCATT

UGACCAUUGAAACUGGUAATT

SEQ ID NO:10

HuR 2# CACGCUGAACGGCUUGAGGTT

CCUCAAGCCGUUCAGCGUGTT

SEQ ID NO:11

NC UUCUCCGAACGUGUCACGUTT

ACGUGACACGUUCGGAGAATT

SEQ ID NO:12

sh-LINC00707 1#

CACCGGCTTTCCATGACCCATAAACTTCAAGAGAGTTTATGGGTCATGGAAAGCCTTTTTTGGATCCAAAAAAGGCTTTCCATGACCCATAAACTCTCTTGAAGTTTATGGGTCATGGAAAGCC

SEQ ID NO:13

sh-LINC00707 2#

CACCGGACCCATCACCTCAACTTTCTTCAAGAGAGAAAGTTGAGGTGATGGGTCCTTTTTTGGATCCAAAAAAGGACCCATCACCTCAACTTTCTCTCTTGAAGAAAGTTGAGGTGATGGGTCC

SEQ ID NO:14

sh-HuR

CACCGCGACTTCAACACCAACAAGTTTCAAGAGAACTTGTTGGTGTTGAAGTCGCTTTTTTGGATCCAAAAAAGCGACTTCAACACCAACAAGTTCTCTTGAAACTTGTTGGTGTTGAAGTCGC

实施例1检测LINC00707在组织和细胞中的表达情况

取0.1g组织，液氮研磨充分(成粉末状)或1-5×10⁷细胞弃培养基，预冷的PBS润洗2次。加入1ml的Trizol裂解液，以无酶枪头吹打混匀，静置5min，将裂解液移入预先标记好的无酶1.5ml的离心管中。4℃7500g离心5分钟，取上清加入1/5体积的氯仿，颠倒混匀30s，静置2min。4℃，12000g离心，15min。溶液分三层(水相-白色沉淀-红色有机物)，转移水相层至新的1.5ml离心管中，尽量不要吸到白色沉淀。加入等体积异丙醇，轻轻颠倒混匀，放置5-10min。4℃，12000g离心，10min。吸弃上清，加入1ml 75％的乙醇(现配)，洗涤RNA沉淀。4℃，7500g离心，5min，弃上清。尽量去除75％的酒精，于室温中晾干，约15min。用无RNA酶水(20-25μl)溶解RNA沉淀。

紫外吸收测定法测定RNA的浓度。使用紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度，测量前先用溶解RNA用的DEPC水调零。在260nm处读值1为表示40ng/μl，RNA溶液的A260/A280的比值用于RNA纯度的检测，比值范围在1.8到2.1表明符合要求。琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的完整性。配制1％的琼脂糖胶。加热溶解琼脂糖，冷却，加入1μl溴化乙锭(EB，10mg/ml)。摇匀后倒胶，待胶冷凝后，置于电泳槽中，浸于1×TAE缓冲液中平衡10min，待用。点样。按1：4(v/v)将5×核酸电泳上样缓冲液与样本混合，准确将各样本含有1μg的RNA加入凝胶孔中。80V恒压电泳50min。电泳结束后，在凝胶成像仪上观察结果。

Tris-乙酸(TAE)缓冲液配方(1L)50×：

实时定量PCR

胃癌组织及癌旁组织标本，胃癌细胞的总RNA，逆转录反应应用TaKaRaPrimeScript试剂盒(大连宝生物工程有限公司)。逆转录反应体系如下：

反转录反应条件如下：37℃15min(反转录反应)；85℃5sec(反转录酶的失活反应)。根据Genebank提供的基因序列，设计引物序列，

QPCR应用7300PCR系统(Applied Biosystems，Warrington，UK)。cDNA样品采用三部法PCR扩增标准程序。反应体系：

反应条件：

结果分析：分析引物的特异性及扩增效率，根据溶解曲线判断引物的反应特异性。根据扩增曲线得到Ct值，采用相对量法与内参GAPDH进行目的基因相对表达量的分析。计算公式为：2^{^(-△Ct)}，△Ct＝Ct gene-Ct control。

LINC00707的引物如下：

Primer F(SEQ ID NO：2)：

5’-TCACATCTGTGAAAAGAGTGCT-3’，

Primer R(SEQ ID NO：3)：

5’-CTGGACTGTGAGTACCAGGC-3’。

结果表明，LINC00707在胃癌组织表达较正常组织上调(图1A、1B)。利用实时定量PCR检测了60例胃癌组织/癌旁正常组织中LINC00707的表达水平。结果显示与癌旁正常组织相比，LINC00707的表达在癌组织中较正常组织表达上调(图1D)。

实施例2上调的LINC00707与胃癌入侵性的肿瘤特点和不良预后有显著相关

为进一步探讨LINC00707在胃癌恶性进程中的重要作用，我们将60对胃癌组织中LINC00707的表达水平分为高表达组(n＝30)和低表达组(n＝30)，分析其表达水平与临床病理参数及患者预后的相关性。显而易见的是，胃癌中LINC00707高表达与TNM分期(p＝0.035)和肿瘤大小(p＝0.017)和淋巴结转移(p＝0.003)显著相关。然而，LINC00707的表达与别的参数如性别(p＝0.795)和年龄(p＝0.301)等(表1)不相关。为了确定LINC00707的表达与胃癌患者预后之间的关系，无病生存曲线(d isease-free survival,DFS)和总生存曲线(overall survival,OS)曲线根据Kaplan-Meier分析和对数秩检验中的LINC00707表达水平而作图。(图1E)。这些结果表明LINC00707高表达组的胃癌患者的无病生存率和总生存率均低于LINC00707低表达组的胃癌患者(图1E)。这些结果提示LINC00707在胃癌组织的高表达与胃癌患者的不良预后相关，可能成为胃癌诊断及预后的分子靶标。

表1 LINC00707的表达与胃癌患者的临床病理特征的相关性

实施例3 LINC00707对胃癌细胞增殖的影响

MTT实验：将转染后24h的BGC-823、SGC-7901、MGC-803细胞按每孔3000个细胞接种于96孔培养板；待细胞80％贴壁后，细胞同步化12h，弃去原有培养基。每个样本设置6个复孔，每孔总反应体积为200μl；每孔加入20μl的MTT反应液(5mg/ml，溶于PBS)，37℃避光孵育4h；弃去上清液，每孔加入150μl二甲亚砜(DMSO)，在微样振荡器上振荡10min，酶标仪测定490nm波长处的吸光度。结果显示：干扰LINC00707能显著抑制BGC-823和SGC-7901细胞的增殖活力；过表达LINC00707促进MGC-803的增殖活力(图3A)

克隆形成实验：用0.25％胰蛋白酶消化并吹打成单细胞悬液，以适当的细胞密度(500个)接种于6孔板，使细胞分散均匀；放入细胞培养箱中，每4天换液一次，培养2周；当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS轻轻清洗2次；加纯甲醇或1:3醋酸/甲醇1ml，固定15分钟；弃甲醇固定液，加1ml 0.1％结晶紫染色液染15分钟，然后用PBS缓慢洗去染色液，空气干燥；将6孔板倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。敲低LINC00707后，BGC-823和SGC-7901细胞的克隆形成能力受到抑制；过表达LINC00707显著提高MGC-803细胞的克隆形成能力(图3B)。此外， 我们在BGC-823和SGC-7901细胞中下调LINC00707后进行了Edu实验，结果表明：与对照组相比，干扰组中Edu阳性细胞的比例明显减少(图3C)。以上实验结果提示：在胃癌细胞中，LINC00707可能扮演癌基因的角色，促进胃癌细胞的增殖。

实施例4 LINC00707促进胃癌细胞转移，抑制胃癌细胞凋亡

为了进一步研究LINC00707是否通过细胞凋亡和细胞周期调控影响胃癌细胞的增殖能力，我们在敲低LINC00707后使用流式细胞术检测了细胞凋亡和细胞周期的变化，发现下调LINC00707表达可以诱导胃癌细胞凋亡(图4A)，但是对细胞周期并无明显影响(结果未显示)。紧接着，在SGC-7901细胞中干扰LINC00707后进行Tunel实验，结果显示：与对照组相比，Tunel阳性细胞的比例明显增高(图4B)。

transwell实验：将BGC-823、SGC-7901、MGC-803细胞按每孔2×105个细胞种于6孔板，待细胞贴壁后，转染LINC00707、HuR干扰序列或LINC00707过表达质粒；转染后24-48h取出细胞，弃上清，用PBS洗1-2遍，用0.25％胰蛋白酶消化细胞，1ml培养基终止消化，吹打混匀成细胞悬液，取少量细胞到显微镜下计数；调整细胞密度至3×104，取细胞悬液300μl加入Transwell小室；24孔培养板下室加入700μl含20％FBS的培养基，放入孵箱中培养12-48h；取出小室用棉签擦去上室内的细胞，放入700μl的纯甲醇中固定20min；将小室放入0.1％结晶紫中对小室外底面的细胞染色，用流水清洗小室，室内倒扣晾干；选取倒置显微镜对小室拍照计数。

细胞迁移在肿瘤的发展发展过程中发挥着重要作用。为进一步检测LINC00707对胃癌细胞转移能力的影响，我们进行了transwell实验。结果显示：封闭LINC00707后，穿过小室基底膜的细胞数较对照组明显减少，说明下调LINC00707的表达可以抑制BGC-823和SGC-7901细胞的转移能力；过表达LINC00707后，穿过小室基底膜的细胞数较对照组明显增多，说明上调LINC00707的表达可以增强MGC-803细胞的转移能力(图4C)。

实施例4 LINC00707提高胃癌细胞在体内的肿瘤形成能力

为进一步验证LINC00707对胃癌细胞瘤体形成能力的影响，我们在SGC-7901细胞中转染sh-LINC00707质粒或空质粒载体，皮下注射4周大的雄性免疫缺陷小鼠。等瘤体出现后，每三天观察并记录一次两组的小鼠瘤体大小。待瘤体形成15天后处死小鼠，取出瘤体，拍照记录(图5A)，同时量取瘤体的大小并称其重量。统计结果显示：与空质粒载体转染形成的瘤体组相比较，转染sh-LINC00707质粒组小鼠体内瘤体形成能力显著减弱(图5B)；同时瘤体检测结果显示：敲低LINC00707组小鼠瘤体的平均重量显著低于对照组瘤体的重量(图5C)。取瘤体组织提取总RNA，使用qRT-PCR技术检测LINC00707在两组瘤体组织中的表达水平，结果发现相较于对照组，下调LINC00707组小鼠的瘤体中LINC00707的表达水平显著降低(图5D)。H&E染色及免疫组化检测结果显示：干扰LINC00707组小鼠瘤体组织中ki-67的表达水平明显低于对照组小鼠瘤体组织(图5E)。综上结果证实：敲低LINC00707表达可显著抑制胃癌细胞的肿瘤形成能力。以上所有的实验程序都是按着NIH1996年版的动物实验指导来执行的。用全价颗粒饲料喂养小鼠，自由饮水，室温(22±2)℃， 湿度50～60％，通风良好，12:12h光照/黑暗周期。所有实验均经过南京医科大学动物保护和伦理委员会(IACUC)批准。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京医科大学

<120> 一种长非编码RNA及其在诊断/治疗胃癌中的应用

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 3087

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aaaataaagc aggcagagga acgtggaagg actagactgc ctgagtcttc tgaccttcat 60

ctttcccctg tgttggatgc ctcctgccct caaacatcag actccaggtt cttcagcttt 120

tggactcttg gacctacccc ccgagtggtt tgccaggggc tctcaggcct tcggctacag 180

actgagggct gcattatcag ctttcctact tttgaggttt tgggacttta ctggctttct 240

tgctcctcaa cttgcagatg gcctgttgtg ggacctcacc ttgtgatcat gtacatgagg 300

gaaatacaca cccctcccag ggatgatgga aggttaaggt cctaacacct cctgcacatc 360

tgagcagctg cacattgaac cagatagtcc tggaatgtgg gaaaacagag gcagactcaa 420

gagtctggaa cattatttta ggatcacaca aaaaagatac ataattttca tagaatgata 480

ctgaaagcat ctcaaaaata aaatcacgag tatctgcaga tcactatgag actggactgg 540

aacattacct tcagacacat tgatatgact acatgctgga cattttcttg cggaaatcca 600

aaagaaatcc ccattttctt gcagaaatct aaaataatct cccctatgtg caagtcagac 660

tgagcaccac tcccaagacc atgacctccc ctgcagccct gctccttccc actcacctct 720

cctcttgaga aagccacctc ccaccaccca gtctgcagtg ccagaaaact ggaaaccagc 780

ccctaagctg ctttcacctt cggcccattt ctcactagcc agcctctccc acggcctccc 840

cagtttcttc aaatacaccc cctccactat tcaccatact gccaccgtga tttatttaca 900

actttttgtc cggattacct cagtagcctt ctaattgtcc cctttgcatc taaagtagcc 960

cctctcatcc cccaaatctt acgtcactct tctacataat tctggctttc catgacccat 1020

aaaccacatt tctcaagtgt gctctatgct ggcttgaata tgttaataat cttaattcta 1080

cttttagtgc aattttctta gagctggcat cactttcatc atgacgtgag aacttactag 1140

agataggcaa tgatgactca cagtcaagcc acatgtcata tgctgcagac atctggactg 1200

ctgcttattt gcaaatcctt ttcttcatat ttttctcatt tgtagcactg gatcaattcc 1260

aattaagagt ttaataatga attaactaat gatttaaaca ggtggataag actaacactg 1320

aaccaatgat tttaagtaaa tctaaataca taaatccccc caaattatta atctatgttg 1380

tttactaaga agtgtattaa aatgatattg aaaaagtttg ctttgggaaa gagctagaag 1440

ttagaaggtc taggttcaaa tcccgcctct actccatcct tgactaagat gttggaccca 1500

tcacctcaac tttccttggg tctttttgcc cagacatgac ccgatgacac agagcttacc 1560

tggacctcca caatagtaaa tagaacaggg ccagcaaacc aaaatttgtt gagtccttta 1620

gaattaagta gcttagataa attttcatca aaatctttat atagtaggga atagaaaaaa 1680

gtcaattctg ttttatttga ggatgtatga atatgttacc atttttcaga ctctgattta 1740

ccttccaatt attgtttatt ggggtcattg taaattagtt atcatttttt gaatacacat 1800

tcactgctga caaagtggtg aagccagaag ttatgtttga ccagggaaga ttatgaccct 1860

caaaggagaa aaattcacag ggggtagttg attattggtg gaatggagtg agagtgaatt 1920

ccttaaaagt ttaaacgaaa gcagaactat attcatatca tggagggaac ttagtttcta 1980

atatgatgaa ctattgcccc aagtcatgac aataccttgc tctctggaag agaatgagtg 2040

agtttttcat ccgccaagat acacactcta tatttccaac catcacatct gccttgcagg 2100

ctgactgaac ccagagcaaa tcaatcacaa aagttaatcc aaaagacttc ccttcagctg 2160

ctggaaatca gtcatcacat ctgtgaaaag agtgctagtt ataacaaatg agatcacaaa 2220

tttgaccatt ttattagaca ccctctatta gtgttaacag acaaagatga aggttaagtt 2280

gaaatcaaat tgaaatcttc ttccctctgt acagattgca atatctgata ataccctcaa 2340

ctttcttggt gcaaattaat tgcctggtac tcacagtcca gtgttaacag gcaataatgg 2400

tgtgattcca gaggagagta ctaggtggca ggaaaataaa tgagattagc agtatttgac 2460

ttggagccat aggcatcaat tctgctccag ctgtcgacca ggttctaaaa acaagactcg 2520

gagcagcttt tgctcttgct agtgatgcag ggccaggaga gcccccacac tctgcatttg 2580

caggtgtcca tgaggggaag ccactcctgc atttatcctg tgagtggaga agctcagagg 2640

aatgaggaca ttccaacagg gtatcagaat tctcttttgt ttatgctaat tgacagcagg 2700

aacatcacca tcttggacaa acaccaccat tttaagttct cttttattta aaaactgcct 2760

aaatccagcc ccaaaacatc agcctaatgg ctattgtcag cataatcaga aacattccaa 2820

ccctaagata aacacccctc tggccagaaa tatgccgacc ccgagacagc ctcccctccg 2880

accagagaca ttccaaaccc gcagtaaact ttccttcaca tggaaacatt ccaaacctac 2940

aaaaagcttc cctcttccta aacccttaaa tatccttagt ctgcaagaga gaatgctcct 3000

gactgaaatc agccagaagc ccctctcagg tttattctcc aaaataaacc tgtctttgac 3060

tgttgagcca aaaaaaaaaa aaaaaaa 3087

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tcacatctgt gaaaagagtg ct 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctggactgtg agtaccaggc 20

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gggagccaaa agggtcat 18

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gagtccttcc acgataccaa 20

<210> 6

<211> 50

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 6

caugacguga gaacuuacua gagauaucuc uaguaaguuc ucacgucaug 50

<210> 7

<211> 50

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 7

uucaguguua gucuuaucca ccuguacagg uggauaagac uaacacugaa 50

<210> 8

<211> 50

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 8

ugucuguuaa cacuaauaga gggugcaccc ucuauuagug uuaacagaca 50

<210> 9

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

uuaccaguuu caauggucat tugaccauug aaacugguaa tt 42

<210> 10

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cacgcugaac ggcuugaggt tccucaagcc guucagcgug tt 42

<210> 11

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

uucuccgaac gugucacgut tacgugacac guucggagaa tt 42

<210> 12

<211> 124

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

caccggcttt ccatgaccca taaacttcaa gagagtttat gggtcatgga aagccttttt 60

tggatccaaa aaaggctttc catgacccat aaactctctt gaagtttatg ggtcatggaa 120

agcc 124

<210> 13

<211> 124

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

caccggaccc atcacctcaa ctttcttcaa gagagaaagt tgaggtgatg ggtccttttt 60

tggatccaaa aaaggaccca tcacctcaac tttctctctt gaagaaagtt gaggtgatgg 120

gtcc 124

<210> 14

<211> 124

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

caccgcgact tcaacaccaa caagtttcaa gagaacttgt tggtgttgaa gtcgcttttt 60

tggatccaaa aaagcgactt caacaccaac aagttctctt gaaacttgtt ggtgttgaag 120

tcgc 124

Claims (10)

1.一种用于判断胃癌(GC)预后情况或作为胃癌治疗靶点的长非编码RNA(LINC00707),其特征在于，所述长非编码RNA的核苷酸序列如Seq ID NO：1所示。

2.识别权利要求1所述的长非编码RNA的标记物在制备诊断胃癌及判断胃癌治疗预后情况的诊断产品中的应用，所述的标记物包括但不限于：

(1)结合所述长非编码RNA的引物/引物组或荧光标记的结合所述长非编码RNA的引物/引物组；

(2)结合所述长非编码RNA的小分子化合物；

(3)结合所述长非编码RNA的生物大分子，所述的生物大分子包括但不限于：抗体或抗体功能片段、荧光标记的抗体或抗体功能片段、RNA结合蛋白或其功能片段、荧光标记的RNA结合蛋白或其功能片段。

3.识别权利要求1所述的长非编码RNA的标记物在诊断胃癌及判断胃癌治疗预后情况的应用，所述的标记物包括但不限于：

(1)结合所述长非编码RNA的引物/引物组或荧光标记的结合所述长非编码RNA的引物/引物组；

(2)结合所述长非编码RNA的小分子化合物；

(3)结合所述长非编码RNA的生物大分子，所述的生物大分子包括但不限于：抗体或抗体功能片段、荧光标记的抗体或抗体功能片段、RNA结合蛋白或其功能片段、荧光标记的RNA结合蛋白或其功能片段。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述的引物组或荧光标记的引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

5.包含权利要求2-4所述的标记物的试剂或试剂盒。

6.针对权利要求1所述的长非编码RNA的检测试剂在制备诊断胃癌及筛选判断胃癌预后情况的诊断试剂中的应用。

7.权利要求5所述试剂盒在制备诊断胃癌及筛选判断胃癌预后情况的诊断试剂中的应用。

8.权利要求1所述的长非编码RNA在筛选治疗胃癌的药物中的应用。

9.权利要求1所述的长非编码RNA的抑制剂在治疗胃癌中的应用，所述抑制剂包括但不限于：

(1)抑制所述长非编码RNA的siRNA、shRNA或功能类似的干扰小RNA；

(2)抑制所述长非编码RNA的小分子化合物；

(3)抑制所述长非编码RNA的生物大分子，所述的生物大分子包括但不限于：抗体或抗体功能片段、高底物专一性的酶或其功能片段。

10.权利要求1所述的长非编码RNA的抑制剂在制备治疗胃癌的药物中的应用，所述抑制剂包括但不限于：

(1)抑制所述长非编码RNA的siRNA、shRNA或功能类似的干扰小RNA；

(2)抑制所述长非编码RNA的小分子化合物；

(3)抑制所述长非编码RNA的生物大分子，所述的生物大分子包括但不限于：抗体或抗体功能片段、高底物专一性的酶或其功能片段。