CN106480037A

CN106480037A - 一种长非编码rna及在制备诊断子痫前期及靶点药物治疗中的应用

Info

Publication number: CN106480037A
Application number: CN201611185620.2A
Authority: CN
Inventors: 孙丽洲; 左青; 许叶涛; 黄诗韵; 葛志平; 吴丹
Original assignee: Jiangsu Province Hospital
Current assignee: Jiangsu Province Hospital
Priority date: 2016-12-20
Filing date: 2016-12-20
Publication date: 2017-03-08
Anticipated expiration: 2036-12-20
Also published as: CN106480037B

Abstract

本发明属于基因工程领域，特别涉及Linc00673在制备诊断子痫前期及靶点药物治疗中的应用；在子痫前期孕妇胎盘中Linc00673的上调与子痫前期发生发展有关，高表达水平的Linc00673与子痫前期发病机制有着密切的关系，通过改变Linc00673的表达对子痫前期孕妇的滋养细胞的增殖、凋亡、侵袭、迁移等产生影响，敲低Linc00673表达能够促进滋养细胞侵袭和迁移能力。

Description

一种长非编码RNA及在制备诊断子痫前期及靶点药物治疗中的应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，特别涉及长非编码RNA-Linc00673在诊断及制备治疗子痫前期药物的应用。

背景技术

子痫前期(PE)是在多基因遗传背景和环境因素共同影响下产生的妊娠特有疾病,母胎界面免疫平衡和免疫耐受失调,导致胎盘滋养细胞浸润能力减退,进而胎盘着床过浅和胎盘供血供氧不足,造成局部氧化应激反应,产生大量毒性因子及炎性介质,使全身多脏器血管内皮损伤、血管痉挛,出现多系统受累的临床表现。目前仍然是导致孕产妇和围产儿死亡的主要原因之一。现唯一的治愈途径是胎儿和胎盘从母体娩出。由于发病机制尚不明确，疾病发生的分子机制不明，临床预防治疗仍缺乏有力有效的措施。随着基因研究工程的深入，L科学家对运用基因诊断和分子生物学在早期诊断子痫前期并靶向治疗方面进行了很多研究。

近年来，高通量测序的基因表达分析技术和生物信息学推动了大规模的人类基因组学的研究，进而发现的一类非蛋白编码的RNA。长链非编码RNA(Long non-coding RNAs，lncRNAs)是一类转录本长度超过200nt的RNA分子，它们并不编码蛋白，而是以RNA的形式在多种层面上(表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等)调控基因的表达水平。大量的研究显示，异常lncRNAs表达与多样的人类疾病相关。在子痫前期中曾有研究发现lncRNAHOTAIR、MEG3、SPRY4-IT1等的异常表达在该疾病的发生发展过程中起了重要的作用。因此，发现更多与子痫前期相关的lncRNAs，并对他们在疾病中所起的生物学功能进行研究，并深入探索其分子机制，对将来早期诊断及治疗该疾病提供坚实的理论基础。Linc00673是一条长度为2275nt的lncRNA，其位于人类染色体17q25.1。我们发现，相对于正常孕妇胎盘组织，子痫前期胎盘组织中的linc00673表达量显著上调。在敲低Linc00673后，研究了Linc00673在子痫前期发生和发展中的作用并研究了Linc00673在滋养细胞中的相关靶基因的功能。

发明内容

技术目的

本发明的目的是提供Linc00673在诊断子痫前期及在制备治疗子痫前期药物中的应用。

一种长链非编码RNA，其核苷酸序列为SEQ NO:1:

一种长链非编码RNA在制备治疗子痫前期药物中的应用；

一种检测Linc00673的引物，如SEQ NO:4、5所示；

SEQ NO:4

Linc00673 F TACCACACCCTTTCTTGCCC

SEQ NO:5

Linc00673 R ACACTGGCCTCTTTACACGG

一种干扰Linc00673的siRNA,如SEQ NO:2、3所示；

SEQ NO:2

si-Linc00673 GAGAAAUAGUCUGUGUUGCCCUGAA

SEQ NO:3

si-Linc00673 UGUGCCUUUGUACUCAGCAAUUCUU

一种试剂盒，包括所述引物；

一种包括所述长链非编码RNA的药物组合物；

所述引物在制备诊断子痫前期试剂中的应用；

所述药物组合物在制备治疗子痫前期药物中的应用。

所述药物组合物，其中还包括辅料。辅料包括：(lip2000,Opti-mem培养液,PBS磷酸缓冲盐溶液)

技术方案

通过qPCR筛查临床组织中LincRNA 00673的差异表达，发现在子痫前期孕妇胎盘组织中LincRNA 00673的表达量较正常孕妇胎盘中表达量高。猜想：LincRNA 00673是否参与了子痫前期疾病的发病过程。

选用国际认可的正常滋养细胞(即HTR-8/SVneo细胞株)作为实验研究对象，设计LincRNA 00673的干扰序列，以lip2000为转染载体将干扰序列转入细胞后抑制子痫前期疾病疾病的发生，发展和预后过程。通过检测在干扰序列转入细胞后细胞的表型功能如增殖，凋亡，迁移和侵袭能力等。从而证明在正常的滋养细胞HTR-8/SVneo中敲低LincRNA 00673的表达，影响了细胞的功能，抑制子痫前期疾病的发病进程。

通过基因转录组测序，检测LincRNA 00673的可能参与细胞功能(如增殖，凋亡或迁移)的相关下游靶基因，随后对LincRNA 00673调控机制的初步探讨，通过核质分离实验检测LincRNA 00673更多的存在于滋养细胞的细胞核中，考虑LincRNA 00673可能在转录水平调控相应的靶基因，通过RIP和CHIP实验检测LincRNA 00673通过绑定LSD1蛋白抑制下游靶基因JDP2的表达。

转染过程所需的各种试剂。

(1)lip2000，一种多用途的脂质体转染试剂，适用于DNA、RNA和寡核苷酸的转染，对大多数真核细胞具有很高的转染效率。其独特的配方使其可直接加入培养基中，血清的存在不会影响转染效率，进而将LincRNA 00673干扰序列转进到细胞内。

(2)Opti-mem培养液，含HEPES，2400mg/l碳酸氢钠，次黄嘌呤，胸腺嘧啶，丙酮酸钠，L-谷氨酰胺，微量元素，生长因子，以及减量至1.1mg/l的酚红，作为转染试剂的辅料，其本身对细胞无任何害处，而更好更有效的转进细胞中，以获得预期目的。

(3)PBS磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline)一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用。它是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液，主要成分为Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl，由于Na2HPO4和KH2PO4它们有二级解离，缓冲的pH值范围很广；而NaCl和KCl主要作用为增加盐离子浓度。排除其本身对实验对象的影响。

组织收集

我们收集了67对2014年至2015年在江苏省人民医院，江苏省妇幼保健院接受剖宫产手术，诊断患有子痫前期的孕妇胎盘组织和不含有任何基础疾病的正常孕妇胎盘组织。并记录临床的特点：包括孕妇年龄，有无吸烟史，孕周数，收缩压，舒张压以，蛋白尿以及胎儿体重。组织样本收集的均为第一时间液氮或储存在-80℃,直至RNA提取。该研究经过南京医科大学伦理委员会批准。获得所有病人的书面知情同意。

细胞系

选取滋养细胞(HTR-8/SVneo)由来自加拿大女皇大学提供。HTR-8/SVneo细胞用RPMI 1640培养基培养；培养基中均含有5％的胎牛血清、100U/ml的青霉素和100mg/ml的链霉素。5％CO2的37℃恒温培养箱中常规培养。每2-3天更换新鲜培养基，当细胞融合度达到80％-90％时传代。所有细胞系被短串联重复序列的DNA分析验证。

RNA提取和定量PCR分析

根据试剂的使用说明，用Trizol试剂分离总RNA。逆转录反应应用TaKaRa PrimeScript试剂盒(TaKaRa,大连,中国)。逆转录试剂盒对1μg总RNA进行逆转录，最终体积为20μl。结果分析：分析引物的特异性及扩增效率，根据溶解曲线判断引物的反应特异性。根据扩增曲线得到Ct值，采用相对量法与内参GAPDH进行目的基因相对表达量的分析。计算公式为：2^(-△Ct)，△Ct＝Ctgene-Ct control。

细胞转染

Linc00673的干扰序列及乱序对照(si-NC)均购自Invitrogen公司(Invitrogen公司，CA，USA)。将细胞HTR-8/SVneo按每孔2×10⁵个细胞种于6孔培养板，待细胞贴壁后，于转染前6h吸弃原有培养基，换成无双抗培养基；取10μL脂质体(即lip2000)稀释于240μL的OPTI-MEM中，温和吹打混匀室温下孵育5min；取100pmol siRNA和si-NC分别稀释于240μLOPTI-MEM中，吹打混匀室温下孵育5min；将孵育好的脂质体与siRNA或质粒稀释液混合，温和吹打混匀。于室温下继续孵育20min；将上述混合物均匀滴入事先加好1.5mL OPTI-MEM的6孔培养板中，轻轻混匀。37℃,5％CO2培养箱中继续培养4-6h后，换完全培养基。转染后48h，收集细胞提取RNA或蛋白进行实时定量RT-PCR或蛋白免疫印迹分析。

细胞增殖活性检测

MTT实验，将处理后的细胞按每孔3000-5000个细胞接种于96孔培养板。待细胞80％贴壁后，细胞同步化6h，弃去原有培养基。每个样本设置5个复孔，每孔总反应体积为200μl。每孔加入20μl的MTT反应液(5mg/ml，溶于PBS)，37℃避光孵育4h。弃去上清液，每孔加入150μl二甲亚砜(DMSO)，震荡10min，酶标仪测定490nm波长处的吸光度。

EdU实验，将适量处理后的细胞中在12孔板中，每孔加入10μM EdU试剂。2h后，用4％多聚甲醛固定30分钟。清洗，使用Click-iTR Edu试剂盒染色30分钟，随后用DAPI染色5分钟，随后使用荧光显微镜拍摄(奥林巴斯，日本)。最后，使用Image-Pro Plus软件分析。

流式细胞术

凋亡检测，用胰酶消化收集转染48小时后的HTR-8/SVneo细胞，随后根据FITCAnnexin V凋亡检测试剂盒(BD)及其使用说明予以Annexin V-FITC荧光探针和碘化丙锭(PI)染色。流式细胞仪检测和分析。

细胞周期检测，根据说明书使用Cycle TESTTM PLUS DNA试剂盒(BD)予以PI染色，随后用FACScan分析。

细胞迁移和侵袭实验

24孔板中放置8μm孔径大小的Transwell小室。细胞侵袭实验，用50mg/l BDMatrigel 1:6稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，包被好的小室放入24孔板中，孵箱中孵育2h。消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1-2遍，用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至3x10⁵。取细胞悬液300μl加入Transwell小室。24孔板下室加入700μl含10％FBS的培养基，放入孵箱中常规培养24h。细胞迁移实验，调整细胞密度至1-10x10⁴。取细胞悬液300μl加入Transwell小室。24孔板下室加入700μl含10％FBS的培养基，放入孵箱中常规培养24h。取小室，用棉签擦去基质胶和上室内的细胞，用0.1％结晶紫将小室外底面的细胞染色利用倒置显微镜对Transwel小室底膜上下室侧附着的染色的细胞拍照计数。

亚细胞结构定位

根据使用说明书使用PARIS试剂盒(Life Technologies，USA)分离HTR-8/SVneo细胞的细胞核和细胞质。使用qPCR方法检测LincRNA 00673、GAPDH和U1在细胞质和细胞核中的分布。GAPDH为细胞质参照，U1为细胞核参照。以总RNA百分比呈现Linc00673、GAPDH和U1在细胞质和细胞核中的表达情况。

RNA测序

将细胞种植于六孔板中，待细胞长至80％左右后给于10ul的lip2000si-linc00673和si-NC处理，48h后用Trizol处理收集细胞，送样，由华大基因检测机构实施，选用Illumina机器进行随后的实验，得到数据并做相应的处理。

RNA免疫印迹(RIP)

裂解HTR-8/SVneo细胞供内源性LSD1免疫印迹实验使用。将细胞上清与包被分别识别LSD1、SNRNP70和对照IgG的蛋白A/G琼脂糖磁珠在4℃孵育6个小时。随后，清洗磁珠，用0.1％SDS/0.5mg/ml蛋白酶K在55℃孵育30分钟以去除蛋白。提取RNA供qPCR分析。

数据处理

实验数据皆用SPSS17.0软件分析，以三次实验的平均值±标准误表示，组间差异用双尾Student’s T检验、秩和检验和卡方检验。单因素分析中p<0.05的随后再使用多因素分析。

附图说明

图1 lincRNA 00673在子痫前期孕妇胎盘组织(N＝67)中表达上调。

1A lincRNA 00673在子痫前期孕妇胎盘组织(N＝67)表达较正常组织上调。

图2 lincRNA 00673对HTR-8/SVneo细胞增殖能力的影响。

2A MTT实验检测在敲低lincRNA 00673的表达后能够促进HTR-8/SVneo细胞的增殖能力。

2B 克隆形成检测敲低lincRNA 00673能够使HTR-8/SVneo细胞克隆形成能力增强。

2C EDU实验证明，敲低lincRNA 00673后增加HTR-8/SVneo细胞的增殖(蓝色代表细胞核，红色代表处于增殖状态的细胞)。

图3 lincRNA 00673对HTR-8/SVneo细胞凋亡、迁移和侵袭的影响。

3A 流式细胞术检测在敲低lincRNA 00673后较正常组能够减少细胞凋亡。

3B Transwell实验检测在敲低lincRNA 00673能够促进HTR-8/SVneo细胞的迁移和侵袭能力。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述，但不限制本发明。

一般性说明：

实施例中末注明具体条件的的实验方法，基本上都按照Sambrook，J等人编著的《分子克隆实验指南(第3版)》(MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rded.黄培堂等译，科学出版社.2002.8)中所述的条件及方法或按照材料提供商所建议的条件及方法进行，其它没有详细描述的技术相应于本领域人员来说是熟知的标准方法。

本发明的材料：本申请中提及的细胞株以及培养基均有商品供应或以别的途径能为公众所得，它们仅作举例，对本发明不是唯一的，可分别用其它适合的工具和生物材料来代替。

实施例1

检测lincRNA 00673在胎盘组织中的表达情况

取0.1g组织，液氮研磨充分(成粉末状)或1-5×107细胞弃培养基，预冷的PBS润洗2次。加入1ml的Trizol裂解液，以无酶枪头吹打混匀，静置5min，将裂解液移入预先标记好的无酶1.5ml的离心管中。4℃7500g离心5分钟，取上清加入1/5体积的氯仿，颠倒混匀30s，静置2min。4℃，12000g离心，15min。转移水相层至新的1.5ml离心管中。加入等体积异丙醇，轻轻颠倒混匀，放置5-10min。4℃，12000g离心，10min。吸弃上清，加入1ml 75％的乙醇(现配)，洗涤RNA沉淀。4℃，7500g离心，5min，弃上清。尽量去除75％的酒精，于室温中晾干，约15min。用无RNA酶水(20-25μl)溶解RNA沉淀。

使用紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度。

实时定量PCR

子痫前期孕妇胎盘组织及正常孕妇胎盘组织标本，HTR-8/SVneo细胞的总RNA，逆转录反应应用TaKaRa PrimeScript试剂盒(大连宝生物工程有限公司)。

逆转录反应体系如下：

反转录反应条件如下：37℃15min(反转录反应)；85℃5sec(反转录酶的失活反应)。根据Genebank提供的基因序列，设计引物序列，QPCR应用7300PCR系统(AppliedBiosystems，Warrington，UK)。cDNA样品采用三部法PCR扩增标准程序。反应体系：

结果分析：分析引物的特异性及扩增效率，根据溶解曲线判断引物的反应特异性。根据扩增曲线得到Ct值，采用相对量法与内参GAPDH进行目的基因相对表达量的分析。计算公式为：2^(-△Ct)，△Ct＝Ct gene-Ct control。

lincRNA 00673的引物如下：

Primer F 5’-TACCACACCCTTTCTTGCCC-3’，SEQ NO：4，

Primer R 5’-ACACTGGCCTCTTTACACGG-3’，SEQ NO：5。

我们利用实时定量PCR检测了67对子痫前期孕妇胎盘组织表达较正常组织中lincRNA 00673的表达水平，其中选用的lincRNA 00673的引物如下：Primer F 5’-TACCACACCCTTTCTTGCCC-3’，SEQ NO:4，Primer R 5’-ACACTGGCCTCTTTACACGG-3’，SEQ NO:5。

结果表明,与正常孕妇胎盘组织相比，lincRNA 00673在子痫前期孕妇胎盘组织表达上调(图1，P<0.05)。提示lincRNA 00673可能在子痫前期疾病的诊断，发生发展及治疗中扮演着重要的作用。

Table 1子痫前期孕妇和正常妊娠孕妇的临床数据

实施例2

为了研究lincRNA 00673对HTR-8/SVneo细胞功能的影响。

首先，选取正常滋养细胞HTR-8/SVneo细胞系作为本实验的研究对象，利用lip2000作为转染试剂载体，转染lincRNA 00673干扰序列si-673GAGAAAUAGUCUGUGUUGCCCUGAA和si-673UGUGCCUUUGUACUCAGCAAUUCUU以有效的敲低lincRNA 00673的表达，MTT检测发现,用两条小干扰RNA在HTR-8/SVneo细胞中敲低lincRNA00673表达后都取得促进细胞生长的作用，图中仅列举一个结果(图2A)。此外,克隆形成试验结果表明,干扰lincRNA 00673后HTR-8/SVneo细胞克隆形成能力增强(图2B)。此外，EDU染色实验证明,敲低lincRNA 00673后HTR-8/SVneo细胞增殖增强(图2C)。由此可知，这些数据表明,lincRNA 00673可抑制HTR-8/SVneo细胞的增殖能力。

实施例3

lincRNA 00673对滋养细胞凋亡的影响

流式细胞术Annexin V/PI双染色法测细胞凋亡：为了研究是否lincRNA 00673对HTR-8/SVneo细胞的增殖影响了细胞周期转换,以正常滋养细胞HTR-8/SVneo细胞系作为研究对象，利用lip2000作为载体，转染lincRNA 00673干扰序列si-673 1#GAGAAAUAGUCUGUGUUGCCCUGAA si-673 3#UGUGCCUUUGUACUCAGCAAUUCUU以敲低lincRNA00673的表达。

(1)细胞收集：悬浮细胞直接收集到10ml的离心管中，而贴壁细胞先用滴管轻轻吹打，凋亡细胞一经吹打可能脱壁，收集到10ml的离心管中，没脱壁的细胞用0.02％的EDTA消化使之脱壁，每样本细胞数为(1～5)×10⁶，500～1000r/min离心5min弃去培养液。

2)用孵育缓冲液洗1次，500～1000r/min离心5min。

3)用100μl的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育10～15min。

4)500～1000r/min离心5min沉淀细胞，孵育缓冲液洗1次。

5)加入荧光溶液4℃下孵育20min，避光并不时振动。

6)流式细胞仪测定细胞凋亡。

如上述方法，将HTR-8/SVneo/si-lincRNA 00673(对照为HTR-8/SVneo/lnc-NC)细胞种在6孔板上，3×10⁵个细胞/孔。转染48h后流式细胞术测细胞凋亡水平。

结果测定：如图3A所示。

结果分析：与对照组HTR-8/SVneo/lnc-NC相比，HTR-8/SVneo/si-lincRNA 00673给予处理均出现细胞凋亡减少，提示降低lincRNA 00673表达可抑制滋养细胞的凋亡。这些数据表明,lincRNA 00673可抑制HTR-8/SVneo细胞的增殖能力。

实施例4

lincRNA 00673参与HTR-8/SVneo细胞迁移和侵袭

滋养细胞浸润和转移子痫前期发病机制中的一个重要方面。我们用transwells研究了lincRNA 00673对HTR-8/SVneo细胞迁移和侵袭能力影响。结果表明,转染lincRNA00673干扰序列以敲低lincRNA 00673表达后，与对照组细胞相比，促进了滋养细胞HTR-8/SVneo迁移能力,并促进了滋养细胞的侵袭能力(图3B)。这些结果表明，敲低lincRNA00673表达后促进滋养细胞的表型，促进了滋养细胞HTR-8/SVneo的迁移和侵袭。

结论：

近年来，LncRNAs作为热点，受到广泛的关注与研究，极大推动了该领域的飞速发展。目前，lncRNA研究已显示出它在人类多种疾病发病中的重要作用，面对如此庞大的lncRNAs家族，人们的认识是有限的，已鉴定出其功能的lncRNA并不多。关于lncRNA与子痫前期相关联的证据并不多，要想使其成为子痫前期的诊断标志物，需要进一步确定lncRNA在人群中的表达水平，以及具有临床诊断意义的变化程度。在这里，我们首次证实了lincRNA 00673在子痫前期患者中行使的功能。在滋养细胞中敲低lincRNA 00673的表达，表现出滋养细胞增殖增加，细胞凋亡减少，血管形成能力增加。随着生命科学的发展，我们可以利用分子生物学、细胞生物学及动物整体等实验进一步来研究子痫前期发生发展过程中lncRNA的表达变化及其作用机制，为子痫前期早诊早治提供新的靶向分子。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省人民医院

<120> 一种长非编码RNA及在制备诊断子痫前期及靶点药物治疗中的应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2275

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agggcgcgca ggcggcgcgg gtgcgcggtg cggcgctggt atccagagga cgcggtcacc 60

gcctctggca tttgtcgttc tgcgcttctc cgcaaggacc ctctgttagg caggcgccca 120

ccgtaagcct cccgggcctt gtgaacctgc aaacccaagt ctgagagacg atccgccttc 180

agcgctttcc agcttggcag agaggctttc ccggcgggga tctttggttg gcgctggcga 240

tgcgcgggga agaaaggcga ggagcggcgt ccaggctggg tgatgtccca gcacgagtag 300

gcgggatgcg ctcgcttggt cctccgggcg cccggtccct gcccgcgtcg cgcgcccacc 360

cctggggacg agaaggcggc cgcctgagga cccccgcccg cgacctccgc gagtctggag 420

cgcagaggac agggtctggc tgctctttgg ccttggatgg aaagtgggga attgggtggg 480

gggctgcgga ccccttaacg tggattactt ggtgtgtatc agctgggctc agaagaccca 540

cgacctcttc tccatccgtg gattgatttg ttctgcttaa cagctgggtc gccaagctgg 600

aggtattttt ccctctccac cctggtcttc tcctgtaacg tgtggccgcc ttttccagca 660

cggcctcctg ccttcctggt gcactttttg gagaacgtgg tggaatcaga ggtttctggc 720

tgactcggtg ggtgctttga accaggaaag gacaagaaag aggatgggaa ggactgatcc 780

acattcccac caggaagttt agcagaaccc ccgcgtgcca cctggacccc ttggaaggac 840

ctggctcagg ctggaccacc tcttgagagg caggagctct ggatttgatc aagaattctt 900

tgctgagcat ggtgcctcat gcctataatc ccaacacttt gggaggccag tgtgggagga 960

tctcttgagc ccaggagttc aagactagcc tgggcaacac agagagaccc catctctaaa 1020

ataataataa taataaaata aaaaattagc agggcatggt ggcatgtgcc tgtagtccca 1080

gctacccagg aggctgaggc aagaggatgg ctggagcctg ggatgttgag gctgcaatga 1140

actgtgatta ccccactgca ctccagcctg ggcaaaagag cgagagaccc tgtctcaaat 1200

aataataata ataataatct tattttggag aataaagaga cctctggatt tgaggtgcca 1260

tttgggtaga aagaaaagac gtttacaccg agaaatagtc tgtgttgccc tgaaggagca 1320

gagggatgca tcgctggagg tgacctacag ttgaagaaga ctcattatga cagaccttgt 1380

ccttcttcct tgtggaaagt gtttcctctg ctgctactgc tcatgagact cttccccctc 1440

cctgtcccag ggaaccaaag ggctttctac cacacccttt cttgcccccc gcctcccatg 1500

tctgctgtgc ctttgtactc agcaattctt gtttgctcca ttatcttcca gccggataca 1560

gagtgaatag ttaaccacac ttaggtcaaa taggatctaa atttttgttc ctgctccgtg 1620

taaagaggcc agtgtttgtg tgttgcaagc agccttggaa tagtaactct tctcatttgt 1680

ttgggatctg gccaccaagt tccagaatga tacacggatc agtgcagaag ttcatcaggc 1740

tctcggacct tagggctgtt ggagaaggct tcagcagcag aactgatggt gaaggctcgt 1800

gttctccatc ctcaactttc tttgcttcga tcatacacaa gaatacattt ggaagggcaa 1860

aaaatgaaca ctgtcgttca ttgcagccgt gttttgtgac acagatgcac agtctgctgt 1920

gaagaccttc tctcaagtgg catttgggag tccatgccag atcatggtgc ttcatgagag 1980

actgacagct atcaggggtt gtggcactta gtgaggactc tcctccccca gtgtgtgctg 2040

atgacacata cacacctgac aatagcttga gtcttctctg ttccttttac tctgtagcca 2100

acatacacat gatttaaaac cctttctaaa tatctatcat ggttcatcct tgtccaaatg 2160

cagagtcaga gctatttgta cttcattatt atttccaagg cgaatagttg gctttctttt 2220

tgcaaaaata attaaagttt ttgtatgttg cagttgcaaa aaaaaaaaaa aaaaa 2275

<210> 2

<211> 25

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 2

gagaaauagu cuguguugcc cugaa 25

<210> 3

<211> 25

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 3

ugugccuuug uacucagcaa uucuu 25

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

taccacaccc tttcttgccc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

acactggcct ctttacacgg 20

Claims

1.一种长非编码RNA，Linc00673，其核苷酸序列为SEQ NO:1。

2.如权利要求1所述一种长非编码RNA在制备诊断子痫前期的试剂中的应用。

3.一种检测Linc00673的引物组，如SEQ NO:4、5所示。

4.干扰权利要求1所述的Linc00673的siRNA,如SEQ NO:2、3所示。

5.一种试剂盒，包括权利要求3所述的引物组。

6.一种包括权利要求4所述siRNA的药物组合物。

7.如权利要求3所述引物在制备诊断子痫前期的试剂中的应用。

8.如权利要求4所述siRNA在制备治疗子痫前期药物中的应用。

9.权利要求6所述药物组合物在制备治疗子痫前期药物中的应用。

10.根据权利要求6所述药物组合物，其中还包括药学上可接受的辅料，如lip2000,Opti-mem培养液,PBS磷酸缓冲盐溶液。