CN110423806A

CN110423806A - 一种与AS斑块炎症相关的miRNA标志物及其筛选方法和应用

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Publication number: CN110423806A
Application number: CN201910752932.4A
Authority: CN
Inventors: 姜怡邓; 张慧萍; 郭伟; 马鹏俊; 孙磊; 杨安宁
Original assignee: Ningxia Medical University
Current assignee: Ningxia Medical University
Priority date: 2019-08-15
Filing date: 2019-08-15
Publication date: 2019-11-08

Abstract

本发明公开了一种与AS斑块炎症相关的miRNA标志物及其筛选方法和应用，属于生物工程技术领域，以ApoE基因敲除小鼠和THP‑1源性泡沫细胞为研究对象，提取组织或细胞的RNA，筛选出与AS相关的基因，在细胞水平验证miR‑195‑3p和相关炎症因子IL‑1β,IL‑6和TNF‑α的表达变化，建立了由miR‑195‑3p、IL‑1β,IL‑6和TNF‑α四个因子组成的AS斑块炎症特异性疾病联合诊断方法。该方法简单可靠，取材方便，灵敏度和特异性均与影像学诊断的结果高度吻合，在AS性疾病的早期诊断与预后评估中具有极大的应用价值。

Description

一种与AS斑块炎症相关的miRNA标志物及其筛选方法和应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体地说，涉及一种特异性动脉粥样斑块炎症相关特异性miRNA的筛选及应用。

背景技术

动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)是一种累及大动脉或中动脉的慢性炎症性疾病，是心血管疾病共同的病理基础。近年来，随着经济的发展和人们生活水平的提高，AS的发病率和死亡率越来越高，其发病年龄日趋年青化,且所致并发症已成为全球死亡的主要原因，被称为二十一世纪生命健康的“第一杀手”。AS的致病因素众多，主要有脂源性学说、致突变学说、损伤应答学说、受体缺失学说等，而损伤应答学说中的炎症学说受到广泛关注，随着研究工作的不断深入，炎症学说在AS中再一次被强调。AS过程中单核细胞向巨噬细胞的招募、归巢、迁移和分化，巨噬细胞吞噬脂质，分泌促炎细胞因子、酶和活性氧(ROS)等物质，都会导致细胞死亡，而这些死亡细胞反过来又促进炎性细胞释放，造成炎症反应的级联放大，这将进一步加速其他心血管疾病的进展。鉴于AS的复杂多变性，若能从炎症角度出发，寻找一种AS斑块相关的早期分子诊断标志物有助于提高AS诊断的敏感性和灵敏度，将成为未来临床上早预防、早发现AS的重要目标之一。

miRNAs是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其长度约为20～25个核苷酸。在miRNA 细胞核中，最初的编码基因转录产生长度约为300～1000个核苷酸pri-miRNA，核糖核酸酶Drosha复合物再对pri-miRNA进行剪切、加工后制成长度约70～90个核苷酸pre-miRNA。在细胞质中，Dicer酶会将pre-miRNA剪切，生成长约20～24个成熟核苷酸miRNA。在细胞质中，AGO(Argonaute)蛋白、成熟miRNA相结合，形成RISC(即沉默复合物)。此外，靶分子miRNA能够以依赖和非依赖种子序列的方式将碱基互补配对后与细胞质中靶mRNA的3’UTR结合，进而阻断mRNA的翻译或抑制蛋白质合成。miRNA几乎参与了所有真核生物生理过程，可通过在胞核、胞浆中发挥双重调控作用，有效对机体调控复杂性加以提示。同时，miRNA的异常表达与多种疾病的发生发展密切相关，如肿瘤，心血管疾病等。作为缺血性血管疾病发病的主要病理基础，具体哪些miRNA在AS斑块形成中发挥重要作用尚未可知，因此寻找AS斑块炎症相关的miRNA将在AS的早期诊断及预防中具有潜在的价值。

鉴于AS是一种复杂的不可逆性疾病，寻找AS的生物标志物逐渐成为近年来心血管领域研究者们所关注的新焦点。然而，这些标志物并非针对其不同的发病机制，且对于动脉粥样斑块炎症相关的生物标志物研究尚少，尤其是在动脉斑块中表达的特异性miRNA。因此，寻找一种与动脉斑块炎症相关的特异性miRNA，探讨有效的早期诊断和干预方法，有助于提出更多、更好的AS分子诊断策略。

发明内容

本发明的目的在于一种动脉斑块炎症相关的miRNA筛选及应用。该发明中组织标本来自于雄性ApoE基因敲除小鼠，细胞是THP-1源性泡沫细胞。

一种与AS斑块炎症相关的miRNA标志物，包括：miR-195-3p，IL-1β,IL-6和TNF-α，其中，miR-195-3p：用于人的Human-NR_029712.1的核苷酸序列如SEQ：ID：NO：1所示；miR-195-3p：用于小鼠的mouse-NR_029581.1的核苷酸序列如SEQ：ID：NO：2所示；IL-1β：用于人的Human-NM_000576.2的核苷酸序列如SEQ：ID：NO：3所示；IL-1β：用于小鼠的mouse-NM_008361.4的核苷酸序列如SEQ：ID：NO：4所示；IL-6：用于人的Human-NM_000600.4的核苷酸序列如SEQ：ID：NO：5所示；IL-6：用于小鼠的mouse-NM_031168.2的核苷酸序列如SEQ：ID：NO：6所示；TNF-α：用于人的Human-NM_000594.3的核苷酸序列如SEQ：ID：NO：7所示；TNF-α：用于小鼠的(mouse-NM_013693.3的核苷酸序列如SEQ：ID：NO：8所示。

一种与AS斑块炎症相关的miRNA标志物筛选的具体步骤：

(1)构建ApoE基因敲除小鼠AS模型；

(2)miRNA芯片分析ApoE基因敲除小鼠血管组织中差异性表达的miRNA，并在细胞水平给予验证；

(3)ELISA和qRT-PCR分别检测培养上清和细胞中炎症因子IL-1β,IL-6和TNF-α的含量及表达；

(4)免疫荧光观察miR-195-3p过表达慢病毒尾静脉注射后小鼠斑块组织中炎症因子IL-1β,IL-6和TNF-α的定位及表达；

(5)小动物超声仪分析miR-195-3p过表达慢病毒尾静脉注射后主动脉根部内膜厚度及弓部血流量大小；

(6)分析比较动脉斑块炎症相关miRNA和炎症因子IL-1β,IL-6和TNF-α的表达改变,并和小动物超声以及形态学染色相比观察AS诊断的特异性、敏感性等指标并进行评价。

进一步，在ApoE基因敲除小鼠中，与正常组相比，实验组血管组织中miR-195-3p表达明显降低，在体外Hcy干预的THP-1源性泡沫细胞中得到了类似的结果。

ApoE基因敲除小鼠AS模型中尾静脉注射miR-195-3p过表达慢病毒，血清及斑块组织中炎症因子IL-1β,IL-6和TNF-α的含量及表达明显缓解。

miR-195-3p与IL-1β,IL-6和TNF-α联合应用的特异性和灵敏度均与AS影像学以及形态学诊断的结果一致。

本发明所述miRNA标志物在制备诊断AS性疾病产品中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

(1)本发明筛选miR-195-3p、miR-451、miR-34c-5p、miR-144c-3p、miR-378a-3p、miR-378a-5p作为建立动脉粥样斑块炎症相关miRNA早期诊断的候选基因。

(2)本发明建立了由miR-195-3p、IL-1β,IL-6和TNF-α组成的AS斑块炎症相关特异性miRNA的应用。

(3)本发明由miR-195-3p、IL-1β,IL-6和TNF-α组成了的AS斑块炎症特异性的miRNA敏感度和特异性与影像学以及形态学诊断的结果高度吻合。

(4)本发明的方法取材来自ApoE基因敲除小鼠AS模型小鼠和THP-1源性泡沫细胞，该方法简单可靠，容易推广。

附图说明

图1miRNA芯片技术筛选ApoE基因敲除小鼠对照组和实验组血管组织中候选miRNA的筛选；

图2qRT-PCR技术对miRNA芯片中差异性miRNA进行验证(^**P<0.01)；

图3qRT-PCR技术观察Hcy作用下THP-1源性泡沫细胞中miR-195-3p的表达改变(^**P<0.01)；

图4ELISA实验观察miR-195-3p mimic和inhibitor转染细胞后培养上清中IL-1β,IL-和TNF-α含量改变(^*P<0.05，^**P<0.01；^#P<0.05，^##P<0.01；^▽▽P<0.01)；

图5qRT-PCR技术检测miR-195-3p mimic和inhibitor转染后培养细胞中IL-1β,IL-6和TNF-α含量及表达改变(^**P<0.01；^##P<0.01；^*P<0.05，^▽▽P<0.01)；

图6miR-195-3p过表达慢病毒注射后小鼠后自身表达验证(^**P<0.01)；

图7ELISA观察miR-195-3p过表达慢病毒注射后小鼠血清IL-1β,IL-6和TNF-α的含量改变(^**P<0.01)；

图8miR-195-3p过表达慢病毒注射小鼠后IL-1β,IL-6和TNF-α在小鼠斑块组织中的表达统计分析(^**P<0.01)；

图9激光共聚焦观察miR-195-3p过表达慢病毒注射小鼠后IL-1β,IL-6和TNF-α在小鼠斑块组织中的定位及表达；

图10小动物超声仪观察miR-195-3p过表达慢病毒注射小鼠后主动脉根部内膜的厚度；

图11miR-195-3p过表达慢病毒注射小鼠后主动脉根部内膜的厚度统计分析(^*P<0.05)；

图12小动物超声仪分析小鼠主动脉弓部血流量大小；

图13miR-195-3p过表达慢病毒注射小鼠后主动脉弓部血流量大小统计分析(^**P<0.01)；

图14miR-195-3p过表达慢病毒注射小鼠后大体血管油红O染色；

图15miR-195-3p过表达慢病毒注射小鼠后大体血管油红O染色动脉斑块面积统计分析(^*P<0.05)；

图16miR-195-3p过表达慢病毒注射小鼠后主动脉根部油红O染色；

图17miR-195-3p过表达慢病毒注射小鼠后主动脉根部油红O染色动脉斑块面积统计分析(^**P<0.01)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方案对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

1材料

1.1主要试剂

天根生物科技有限公司RNA提取试剂盒；广州锐博生物科技有限公司miRNA试剂盒；日本东洋纺逆转录试剂盒；美国Fermentas公司MaximaTMSYBR Green/ROX qPCRMasterMix；炎症因子ELISA检测试剂盒；丙酮；过氧化物酶封闭液；山羊血清；IL-1β,IL-6和TNF-α抗体，荧光二抗；DAPI染液；油红O染色液；小动物B超螯合剂。

1.2主要仪器

超净工作台、梯度PCR仪、荧光PCR仪、核酸分析仪、凝胶成像系统、低温冰箱、迷你离心机、蔡司共聚焦荧光显微镜、高速低温离心机、小动物B超机。

2方法

2.1实验对象的选择

从北京大学(北京)实验动物中心购买体重25-28g的6周龄雄性ApoE^-/-小鼠，小鼠均分笼饲养在SPF环境中，使用高压灭菌垫料，饲养笼及饮水瓶每周消毒，室内温度为20～25℃，相对湿度为55％～65％，明暗交替各12h，换气次数18次/小时，饲养房内定期紫外灯消毒并自由摄食和饮水。将小鼠随机分为两组：(1)对照组(NC)采用正常饮食喂养；(2)实验组(HMD)采用1.7％蛋氨酸(Met)喂养。为了评估重组慢病毒表达载体(Lv-miR-195-3p)的治疗潜力，通过尾静脉给实验组小鼠注射了Lv-miR-195-3p或Lv-miR-neg慢病毒，病毒滴度为2×10⁹tu/ml，用等量PBS作为载体对照。病毒注射30天后，用异氟烷麻醉小鼠，然后采集血液和组织样本进行进一步分析。

2.2 ELISA检测细胞中炎症因子的表达

(1)标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设置标准孔10孔，在第1、2标准孔中加入标准液100μl，然后再往里面加入标准稀释液50μl，混匀；然后从第1/2孔中分别取出100μl加入第3、4孔，再在第3、4孔加入标准品稀释液50μl，混匀；然后从第3、4孔中取50μl弃掉，再各取50μl分别加入第5、6孔，再加入标准品稀释液50μl，混匀；然后从第5、6孔中各取50μl再加入到底7、8孔中，再加入标准品稀释液50μl，混匀；然后从第7、8孔中各取50μl再加入到底9、10孔中，再加入标准品稀释液50μl，混匀后各取50μl液体弃掉。(稀释后各孔加样量均为50μ，浓度分别为240ng/L，160ng/L,80ng/L,40ng/L,20ng/L)；

(2)加样：分别设置空白孔(不加样品及酶标试剂)和待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加入样品稀释液40μl，然后再加入待测样品10μl；

(3)孵育：用封板膜封板后置于37℃孵育30min；

(4)配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用；

(5)洗涤：小心揭取封板膜，弃去液体，甩干，每孔加入洗涤液，静置30s后弃去，重复5次，拍干；

(6)加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外；

(7)孵育、洗涤同前；

(8)显色：每孔加入显色剂A 50μl，再加入显色剂B 50μl轻轻震荡混匀，37℃避光显色15min；

(9)终止：每孔加入终止液50μl，终止反应,(此时蓝色转变为黄色)；

(10)测定：加入终止液15min内在450nm波长下用酶标仪测定各孔的吸光度值；

(11)计算并统计。

2.3 miRNA芯片

使用TRIzol RNA提取试剂盒提取小鼠血管组织总RNA，然后与mircury lnamicroRNA阵列的杂交(安捷伦技术公司，G2534A)。使用安捷伦G2565CA扫描仪(美国安捷伦技术公司)获取微阵列图像，并使用安捷伦特征提取软件(10.7版)进行分析。

2.4 qRT-PCR检测miRNA及mRNA的表达

2.4.1小鼠血管组织及细胞RNA提取

按照RNA提取试剂盒说明书提取小鼠血管组织或细胞的总RNA。组织：将组织在液氮中磨碎，每50-100mg组织加入1mL裂解液RZ，用匀浆仪进行匀浆处理。细胞：离心取细胞，弃上清，加入1ml裂解液RZ，用取样器吹打若干致溶液透明；将组织或细胞匀浆样品在室温静置5min,使核酸蛋白复合物完全分离；4℃12000rpm离心5min，取上清，转入一个新的RNase的离心管中。加入200μl氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15s，室温静置3min；4℃12000rpm离心10min,样品分为三层，黄色有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，将50％水相转移到新管中继续以下操作；缓慢加入0.5倍体积的无水乙醇，混匀，将得到的溶液和沉淀一起转到吸附柱CR3中，4℃12000rpm离心30s,弃掉收集管中废液；向吸附柱CR3中加入500μl去蛋白液RD，4℃12000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱放在收集管中。向吸附柱CR3中加入500μl漂洗液RW，室温静置2min，4℃12000rpm离心30s，弃废液，此步骤重复两遍；将吸附柱放入2mL收集管中4℃12000rpm离心2min，去除残余液体，离心后将吸附柱CR3在室温放置3min，以充分晾干残余漂洗液；将吸附柱CR3转入一个新的1.5ml离心管中，加入30-100μlRNase-Free ddH₂O，室温放置2min,4℃12000rpm离心2min。将所提取的RNA放在-80℃保存备用。

2.4.2逆转录成cDNA

2.4.2.1 miRNA逆转录

(1)取Bulge-Loop^TMmiRNA RT primer(20μM)，加入适量RNase-Free H₂O，配置成Bulge-Loop^TMmiRNA RT primer(5μM)，Bulge-Loop^TMmiRNA RT primer为miRNA特异性逆转录引物，需对应目的miRNA使用。

(2)推荐使用10μlRT反应体系进行实验：

表1逆转录反应体系(冰上配制)

以上体系混匀后瞬时离心，RT反应程序为：42℃60min,70℃10min。

2.4.2.2 mRNA逆转录

反应体系：向无RNAse的200μl EP管中分别加入：

表2 mRNA逆转录反应体系

将上述反应体系短暂离心混匀(避免气泡产生)，放到普通PCR仪中运行程序(70℃5min，42℃ 1h)。

2.4.3 PCR扩增反应

2.4.3.1 miRNA扩增反应

(1)SYBR Green Mix：包括Taq酶、dNTP mix、SYBR GreenⅠ等。

表3 qPCR反应体系(冰上配制)

(2)轻轻混匀上述反应体系(避免剧烈涡旋震荡)，建议使用三步法进行检测，反应程序如下：

表4 qPCR反应程序

2.4.3.2 mRNA扩增反应

在Genbank中寻找炎症相关基因(IL-1β,IL-6和TNF-α)序列，使用primer5.0设计引物，按照以下体系加入样品。

(1)反应体系：向无菌的200μl EP管中分别加入：

表5 mRNA PCR扩增反应体系

(2)反应条件

表6 mRNA扩增反应程序

2.4.3.3结果计算

mRNA实验结果的计算按照如下公式：检测目的基因的相对表达量＝2^－△△Ct，其中ΔΔCt＝[Ct_{GI(检测样品)}-Ct_{GAPDH(检测样品)}]-[Ct_{GI(校正样本)}–Ct_{GAPDH(校正样本)}]。GI是指所测目的基因，Ct是指检测到的反应体系中荧光信号强度，校正样本指的是所有被选做能够代表1倍所测目的基因表达量的样本。应用这一方法能直接获得目的基因相对于管家基因的定量结果。

miRNA实验结果的计算使用U6和miR-195-3P的Bulge LoopTMmiRNAs引物，U6用于内参。按2^-ΔΔCT法对PCR产物进行相对定量。检测目的基因的相对表达量＝2^－△△Ct，其中ΔΔCt＝[Ct_{GI(检测样品)}-Ct_{U6(检测样品)}]-[Ct_{GI(校正样本)}–Ct_{U6(校正样本)}]。GI是指所测目的基因miR-195-3P，Ct是指检测到的反应体系中荧光信号强度，校正样本指的是所有被选做能够代表1倍所测目的基因表达量的样本。

2.5 miRNA-195-3pmimic和inhibitor的转染

正常传代培养的THP-1细胞至汇合度达到90％且生长状态良好时，将细胞转至10cm培养皿中，用佛波酯(PMA)刺激单核细胞使其贴壁成为巨噬细胞，然后加入ox-LDL复制泡沫细胞模型。在这个过程中根据实验分组，按照Lipofection 2000TransfectionReagent脂质体转染说明书，即取6只1.5ml的离心管，第1只离心管只加入1.2ml空白的1640培养基和48μl Lipofection 2000Transfection Reagent混匀，第2只离心管加入含100μmol/L Hcy的1640培养基，另外4只离心管中分别加入100μmol/L Hcy的1640培养基+miRNA-195-3p NCmimic、100μmol/L Hcy的1640培养基+miRNA-195-3pmimic、100μmol/L Hcy的1640培养基+miRNA-195-3p NC inhibitor、100μmol/L Hcy的1640培养基+miRNA-195-3pinhibitor。室温静置5min后将培养皿中的正常培养基去掉，使用不含血清的1640培养基洗两遍，每个皿加入含慢病毒和培养基的混合液。在37℃5％CO₂培养箱中培养6小时后，将感染培养基更换为含有10％胎牛血清的1640培养基，在37℃5％CO₂培养箱中培养48小时后收取细胞备用。

2.6小鼠尾静脉注射

选取HMD组体重相似的小鼠24只，平均分为三组，每组8只，通过尾静脉注射病毒，病毒滴度为1×10⁹TU/ml，每周每只注射50μl，分别注射配制好的PBS，Lv-GFP，Lv-miR195-3p，病毒注射一个月后处理小鼠，取材备用。

2.7免疫荧光染色

从-80℃冰箱取小鼠主动脉根部血管冰冻切片平衡至室温，4％冰丙酮固定冰冻切片30min，然后用预先准备好的PBS洗涤3次，每次5分钟；接着用新鲜配制的PBS浸洗波片3次，每次洗涤5分钟，然后用吸水纸将玻片上组织周围的PBS吸干净，滴加内源性过氧化物酶作用10min，用新鲜配制的PBS浸洗波片3次，每次洗涤5分钟；吸干净组织周围的PBS后滴加正常的山羊血清封闭1小时；封闭结束后，用吸水纸将山羊血清封闭液吸干净(注意：不可使玻片干片)，每张玻片滴加足够将血管组织覆盖的一抗，滴加抗体完成后，将玻片放入湿盒中，于4℃孵育过夜或者37℃温箱内孵育30min；回收一抗，用新鲜配制的PBS浸洗3遍，并将荧光二抗滴加到载玻片上，在37℃湿盒孵育1-2h。用PBS浸洗玻片3次，每次浸洗5min；(注意：从加入荧光二抗开始，后面所有操作步骤都必须在避光环境中进行)。将DAPI染料溶液加到组织上，在黑暗环境中孵育3-5min，染色完成后，将玻片用PBS浸洗3次，每次浸洗3分钟；用滤纸吸干爬片上的残留液体，接着用含抗荧光淬灭剂的封片液封片。最后在激光共聚焦显微镜下观察并收集细胞图像。

2.8小鼠组织准备

取小鼠整个主动脉，包括锁骨下动脉、左颈总动脉和左锁骨下动脉，通过冰冻切片油红O染色观察动脉斑块的大小，斑块区域用Image Pro Plus 6.0进行定量分析。

2.9小鼠血管大体和主动脉根部血管环冰冻切片油红O染色

(1)回温：将预先制作好的并保存在-80℃冰箱中的冰冻切片放置到切片架上回温约5-10min，待染；(不需固定，更不可用醇类固定液固定。)

(2)将冰冻切片直接放在装有试剂一应用液的染色缸中染色10-15min，37℃左右温的蒸馏水洗5-20s；

(3)试剂二复染液染色3-5min，水洗30-60s；

(4)未待表面水干透即可滴加试剂三水性固封剂于玻片表面，进行封片。(在封片前应先将水性固封剂于60℃温水中加热至液体状态。)

(5)镜检。

3.统计学处理

所有涉及到的数据均采用Graphpad Prism 5.0进行统计学处理。数据以均数±标准差表示。两样本均数间比较采用两样本独立t检验，多样本均数间比较采用One-wayANOVA检验，组间的两两比较采用Student-Newman-Keuls检验，以P<0.05为差异有显著性。影像学诊断AS的特异性、敏感性等指标进行评价。

4.结果

4.1 ApoE^-/-小鼠对照组和实验组候选miRNA表达及验证

通过基miRNA芯片分析，发现miR-195-3p、miR-451、miR-34c-5p、miR-144c-3p、miR-378a-3p、miR-378a-5p这6个候选基因，其中miR-195-3p在HMD组中表达明显降低(^**P<0.01)。(见图1和图2)

4.2 THP-1源性泡沫细胞中miR-195-3p的表达验证

Hcy干预THP-1源性泡沫细胞后，提取两组细胞RNA并行qRT-PCR分析。结果显示，Hcy作用后，miR-195-3p表达明显降低(^*P<0.05)。(见图3)

4.3 miR-195-3p mimic和inhibitor转染细胞后培养上清及细胞中IL-1β,IL-6和TNF-α含量及表达改变

ELISA和qRT-PCR结果显示，与对照组相比，Hcy作用后引起THP-1源性泡沫细胞及培养上清IL-1β、IL-1清胞对照和TNF-α这三个炎症因子的表达及含量明显上调；转染miR-195-3p mimic后细胞这三个炎症因子的表达及含量明显上调明显缓解，而转染miR-195-3pmimic后细胞这三个炎症因子的表达及含量出现进一步明显上调(^*P<0.05，^**P<0.01；^#P<0.05，^##P<0.01；^▽▽P<0.01)。(见图4和图5)

4.4 miR-195-3p过表达慢病毒注射后小鼠组织miR-195-3p表达自身验证

miR-195-3p过表达慢病毒经尾静脉注射小鼠，结果显示，与Lv-miR-neg组相比，miR-195-3p过表达慢病毒注射后小鼠中miR-195-3p表达明显上调(^**P<0.01)。(见图6)

4.5 miR-195-3p过表达慢病毒注射后小鼠后血清中IL-1β,IL-6和TNF-α的表达改变

小鼠尾静脉注射miR-195-3p过表达慢病毒后，收集小鼠血清，并经ELISA检测IL-1β,IL-6和TNF-α的含量。结果显示，过表达miR-195-3p后，小鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α含量明显降低(^**P<0.01)。(见图7)

4.6 miR-195-3p过表达慢病毒注射后小鼠后IL-1β,IL-6和TNF-α在小鼠斑块组织中的定位及表达

miR-195-3p过表达慢病毒注射后小鼠后免疫荧光结果显示，IL-1β,IL-6和TNF-α三种炎症因子在小鼠斑块巨噬细胞中表达均明显降低。(见图8和图9)

4.7小动物超声仪分析小鼠主动脉根部内膜的厚度和主动脉弓部血流量大小

小动物超声仪结果显示，与实验组小鼠相比，注射miR-195-3p过表达病毒后根部内膜厚度明显减小，且弓部血流量和速度明显缓解。(^*P<0.05，^**P<0.01)(见图10-图13)

4.8小鼠大体血管及主动脉根部油红O染色观察斑块大小

大体血管及主动脉根部油红O染色显示，注射miR-195-3p过表达慢病毒后，小鼠血管斑块面积明显减轻(^*,P<0.05，^**P<0.01)。(见图14)

5.结论

AS作为心血管系统中比较常见的慢性炎症性疾病，相关炎症因子表达明显升高是其早期的、且频发的事件。另外miR-195-3p在实验组低表达，而IL-1β,IL-6和TNF-α等炎症因子表达显著升高。小鼠尾静脉注射miR-195-3p过表达慢病毒后，IL-1β,IL-6和TNF-α等炎症因子表达降低，血管斑块显著减少，且与影像学检查吻合。由miR-195-3p、IL-1β,IL-6和TNF-α构成的动脉粥样斑块炎症相关的特异性miRNA对AS的诊断特异性和灵敏性均较高，依靠动脉粥样斑块炎症相关的miRNA评估和诊断AS是可靠的。

表7 qRT-PCR引物序列

其中miR195-3p引物序列由广州市锐博生物科技有限公司提供。

表8 shRNA慢病毒表达载体报告单

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

序列表

<110> 宁夏医科大学

<120> 一种与AS斑块炎症相关的miRNA标志物及其筛选方法和应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 87

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agcttccctg gctctagcag cacagaaata ttggcacagg gaagcgagtc tgccaatatt 60

ggctgtgctg ctccaggcag ggtggtg 87

<210> 2

<211> 94

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acacccaact ctcctggctc tagcagcaca gaaatattgg catggggaag tgagtctgcc 60

aatattggct gtgctgctcc aggcagggtg gtga 94

<210> 3

<211> 1498

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

accaaacctc ttcgaggcac aaggcacaac aggctgctct gggattctct tcagccaatc 60

ttcattgctc aagtgtctga agcagccatg gcagaagtac ctgagctcgc cagtgaaatg 120

atggcttatt acagtggcaa tgaggatgac ttgttctttg aagctgatgg ccctaaacag 180

atgaagtgct ccttccagga cctggacctc tgccctctgg atggcggcat ccagctacga 240

atctccgacc accactacag caagggcttc aggcaggccg cgtcagttgt tgtggccatg 300

gacaagctga ggaagatgct ggttccctgc ccacagacct tccaggagaa tgacctgagc 360

accttctttc ccttcatctt tgaagaagaa cctatcttct tcgacacatg ggataacgag 420

gcttatgtgc acgatgcacc tgtacgatca ctgaactgca cgctccggga ctcacagcaa 480

aaaagcttgg tgatgtctgg tccatatgaa ctgaaagctc tccacctcca gggacaggat 540

atggagcaac aagtggtgtt ctccatgtcc tttgtacaag gagaagaaag taatgacaaa 600

atacctgtgg ccttgggcct caaggaaaag aatctgtacc tgtcctgcgt gttgaaagat 660

gataagccca ctctacagct ggagagtgta gatcccaaaa attacccaaa gaagaagatg 720

gaaaagcgat ttgtcttcaa caagatagaa atcaataaca agctggaatt tgagtctgcc 780

cagttcccca actggtacat cagcacctct caagcagaaa acatgcccgt cttcctggga 840

gggaccaaag gcggccagga tataactgac ttcaccatgc aatttgtgtc ttcctaaaga 900

gagctgtacc cagagagtcc tgtgctgaat gtggactcaa tccctagggc tggcagaaag 960

ggaacagaaa ggtttttgag tacggctata gcctggactt tcctgttgtc tacaccaatg 1020

cccaactgcc tgccttaggg tagtgctaag aggatctcct gtccatcagc caggacagtc 1080

agctctctcc tttcagggcc aatccccagc ccttttgttg agccaggcct ctctcacctc 1140

tcctactcac ttaaagcccg cctgacagaa accacggcca catttggttc taagaaaccc 1200

tctgtcattc gctcccacat tctgatgagc aaccgcttcc ctatttattt atttatttgt 1260

ttgtttgttt tattcattgg tctaatttat tcaaaggggg caagaagtag cagtgtctgt 1320

aaaagagcct agtttttaat agctatggaa tcaattcaat ttggactggt gtgctctctt 1380

taaatcaagt cctttaatta agactgaaaa tatataagct cagattattt aaatgggaat 1440

atttataaat gagcaaatat catactgttc aatggttctg aaataaactt cactgaag 1498

<210> 4

<211> 1348

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aacaaaccct gcagtggttc gaggcctaat aggctcatct gggatcctct ccagccaagc 60

ttccttgtgc aagtgtctga agcagctatg gcaactgttc ctgaactcaa ctgtgaaatg 120

ccaccttttg acagtgatga gaatgacctg ttctttgaag ttgacggacc ccaaaagatg 180

aagggctgct tccaaacctt tgacctgggc tgtcctgatg agagcatcca gcttcaaatc 240

tcgcagcagc acatcaacaa gagcttcagg caggcagtat cactcattgt ggctgtggag 300

aagctgtggc agctacctgt gtctttcccg tggaccttcc aggatgagga catgagcacc 360

ttcttttcct tcatctttga agaagagccc atcctctgtg actcatggga tgatgatgat 420

aacctgctgg tgtgtgacgt tcccattaga caactgcact acaggctccg agatgaacaa 480

caaaaaagcc tcgtgctgtc ggacccatat gagctgaaag ctctccacct caatggacag 540

aatatcaacc aacaagtgat attctccatg agctttgtac aaggagaacc aagcaacgac 600

aaaatacctg tggccttggg cctcaaagga aagaatctat acctgtcctg tgtaatgaaa 660

gacggcacac ccaccctgca gctggagagt gtggatccca agcaataccc aaagaagaag 720

atggaaaaac ggtttgtctt caacaagata gaagtcaaga gcaaagtgga gtttgagtct 780

gcagagttcc ccaactggta catcagcacc tcacaagcag agcacaagcc tgtcttcctg 840

ggaaacaaca gtggtcagga cataattgac ttcaccatgg aatccgtgtc ttcctaaagt 900

atgggctgga ctgtttctaa tgccttcccc agggcatgtt aaggagctcc cttttcgtga 960

atgagcagac agctcaatct ccaggggact ccttagtcct cggccaagac aggtcgctca 1020

gggtcacaag aaaccatggc acattctgtt caaagagagc ctgtgttttc ctccttgcct 1080

ctgatgggca accacttacc tatttattta tgtatttatt gattggttga tctatttaag 1140

ttgattcaag gggacattag gcagcactct ctagaacaga acctagctgt caacgtgtgg 1200

gggatgaatt ggtcatagcc cgcactgagg tctttcattg aagctgagaa taaataggtt 1260

cctataatat ggatgagact ttttatgaat gaagcaccag cacattgctt tgatgagtat 1320

gaaataaatt tcattaaaac aaacaaac 1348

<210> 5

<211> 1127

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

attctgccct cgagcccacc gggaacgaaa gagaagctct atctcccctc caggagccca 60

gctatgaact ccttctccac aagcgccttc ggtccagttg ccttctccct ggggctgctc 120

ctggtgttgc ctgctgcctt ccctgcccca gtacccccag gagaagattc caaagatgta 180

gccgccccac acagacagcc actcacctct tcagaacgaa ttgacaaaca aattcggtac 240

atcctcgacg gcatctcagc cctgagaaag gagacatgta acaagagtaa catgtgtgaa 300

agcagcaaag aggcactggc agaaaacaac ctgaaccttc caaagatggc tgaaaaagat 360

ggatgcttcc aatctggatt caatgaggag acttgcctgg tgaaaatcat cactggtctt 420

ttggagtttg aggtatacct agagtacctc cagaacagat ttgagagtag tgaggaacaa 480

gccagagctg tgcagatgag tacaaaagtc ctgatccagt tcctgcagaa aaaggcaaag 540

aatctagatg caataaccac ccctgaccca accacaaatg ccagcctgct gacgaagctg 600

caggcacaga accagtggct gcaggacatg acaactcatc tcattctgcg cagctttaag 660

gagttcctgc agtccagcct gagggctctt cggcaaatgt agcatgggca cctcagattg 720

ttgttgttaa tgggcattcc ttcttctggt cagaaacctg tccactgggc acagaactta 780

tgttgttctc tatggagaac taaaagtatg agcgttagga cactatttta attattttta 840

atttattaat atttaaatat gtgaagctga gttaatttat gtaagtcata tttatatttt 900

taagaagtac cacttgaaac attttatgta ttagttttga aataataatg gaaagtggct 960

atgcagtttg aatatccttt gtttcagagc cagatcattt cttggaaagt gtaggcttac 1020

ctcaaataaa tggctaactt atacatattt ttaaagaaat atttatattg tatttatata 1080

atgtataaat ggtttttata ccaataaatg gcattttaaa aaattca 1127

<210> 6

<211> 1141

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aaatatgaga ctggggatgt ctgtagctca ttctgctctg gagcccacca agaacgatag 60

tcaattccag aaaccgctat gaagttcctc tctgcaagag acttccatcc agttgccttc 120

ttgggactga tgctggtgac aaccacggcc ttccctactt cacaagtccg gagaggagac 180

ttcacagagg ataccactcc caacagacct gtctatacca cttcacaagt cggaggctta 240

attacacatg ttctctggga aatcgtggaa atgagaaaag agttgtgcaa tggcaattct 300

gattgtatga acaacgatga tgcacttgca gaaaacaatc tgaaacttcc agagatacaa 360

agaaatgatg gatgctacca aactggatat aatcaggaaa tttgcctatt gaaaatttcc 420

tctggtcttc tggagtacca tagctacctg gagtacatga agaacaactt aaaagataac 480

aagaaagaca aagccagagt ccttcagaga gatacagaaa ctctaattca tatcttcaac 540

caagaggtaa aagatttaca taaaatagtc cttcctaccc caatttccaa tgctctccta 600

acagataagc tggagtcaca gaaggagtgg ctaaggacca agaccatcca attcatcttg 660

aaatcacttg aagaatttct aaaagtcact ttgagatcta ctcggcaaac ctagtgcgtt 720

atgcctaagc atatcagttt gtggacattc ctcactgtgg tcagaaaata tatcctgttg 780

tcaggtatct gacttatgtt gttctctacg aagaactgac aatatgaatg ttgggacact 840

attttaatta tttttaattt attgataatt taaataagta aactttaagt taatttatga 900

ttgatattta ttatttttat gaagtgtcac ttgaaatgtt atatgttata gttttgaaat 960

gataacctaa aaatctattt gatataaata ttctgttacc tagccagatg gtttcttgga 1020

atgtataagt ttacctcaat gaattgctaa tttaaatatg tttttaaaga aatctttgtg 1080

atgtattttt ataatgttta gactgtcttc aaacaaataa attatattat atttaaaaac 1140

c 1141

<210> 7

<211> 1626

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

accccccctg aaaacaaccc tcagacgcca catcccctga caagctgcca ggcaggttct 60

cttcctctca catactgacc cacggctcca ccctctctcc cctggaaagg acaccatgag 120

cactgaaagc atgatccggg acgtggagct ggccgaggag gcgctcccca agaagacagg 180

ggggccccag ggctccaggc ggtgcttgtt cctcagcctc ttctccttcc tgatcgtggc 240

aggcgccacc acgctcttct gcctgctgca ctttggagtg atcggccccc agagggaaga 300

gttccccagg gacctctctc taatcagccc tctggcccag gcagtcagat catcttctcg 360

aaccccgagt gacaagcctg tagcccatgt tgtagcaaac cctcaagctg aggggcagct 420

ccagtggctg aaccgccggg ccaatgccct cctggccaat ggcgtggagc tgagagataa 480

ccagctggtg gtgccatcag agggcctgta cctcatctac tcccaggtcc tcttcaaggg 540

ccaaggctgc ccctccaccc atgtgctcct cacccacacc atcagccgca tcgccgtctc 600

ctaccagacc aaggtcaacc tcctctctgc catcaagagc ccctgccaga gggagacccc 660

agagggggct gaggccaagc cctggtatga gcccatctat ctgggagggg tcttccagct 720

ggagaagggt gaccgactca gcgctgagat caatcggccc gactatctcg actttgccga 780

gtctgggcag gtctactttg ggatcattgc cctgtgagga ggacgaacat ccaaccttcc 840

caaacgcctc ccctgcccca atccctttat taccccctcc ttcagacacc ctcaacctct 900

tctggctcaa aaagagaatt gggggcttag ggtcggaacc caagcttaga actttaagca 960

acaagaccac cacttcgaaa cctgggattc aggaatgtgt ggcctgcaca gtgaagtgct 1020

ggcaaccact aagaattcaa actggggcct ccagaactca ctggggccta cagctttgat 1080

ccctgacatc tggaatctgg agaccaggga gcctttggtt ctggccagaa tgctgcagga 1140

cttgagaaga cctcacctag aaattgacac aagtggacct taggccttcc tctctccaga 1200

tgtttccaga cttccttgag acacggagcc cagccctccc catggagcca gctccctcta 1260

tttatgtttg cacttgtgat tatttattat ttatttatta tttatttatt tacagatgaa 1320

tgtatttatt tgggagaccg gggtatcctg ggggacccaa tgtaggagct gccttggctc 1380

agacatgttt tccgtgaaaa cggagctgaa caataggctg ttcccatgta gccccctggc 1440

ctctgtgcct tcttttgatt atgtttttta aaatatttat ctgattaagt tgtctaaaca 1500

atgctgattt ggtgaccaac tgtcactcat tgctgagcct ctgctcccca ggggagttgt 1560

gtctgtaatc gccctactat tcagtggcga gaaataaagt ttgcttagaa aagaaaaaaa 1620

aaaaaa 1626

<210> 8

<211> 1653

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

agcagaagct ccctcagcga ggacagcaag ggactagcca ggagggagaa cagaaactcc 60

agaacatctt ggaaatagct cccagaaaag caagcagcca accaggcagg ttctgtccct 120

ttcactcact ggcccaaggc gccacatctc cctccagaaa agacaccatg agcacagaaa 180

gcatgatccg cgacgtggaa ctggcagaag aggcactccc ccaaaagatg gggggcttcc 240

agaactccag gcggtgccta tgtctcagcc tcttctcatt cctgcttgtg gcaggggcca 300

ccacgctctt ctgtctactg aacttcgggg tgatcggtcc ccaaagggat gagaagttcc 360

caaatggcct ccctctcatc agttctatgg cccagaccct cacactcaga tcatcttctc 420

aaaattcgag tgacaagcct gtagcccacg tcgtagcaaa ccaccaagtg gaggagcagc 480

tggagtggct gagccagcgc gccaacgccc tcctggccaa cggcatggat ctcaaagaca 540

accaactagt ggtgccagcc gatgggttgt accttgtcta ctcccaggtt ctcttcaagg 600

gacaaggctg ccccgactac gtgctcctca cccacaccgt cagccgattt gctatctcat 660

accaggagaa agtcaacctc ctctctgccg tcaagagccc ctgccccaag gacacccctg 720

agggggctga gctcaaaccc tggtatgagc ccatatacct gggaggagtc ttccagctgg 780

agaaggggga ccaactcagc gctgaggtca atctgcccaa gtacttagac tttgcggagt 840

ccgggcaggt ctactttgga gtcattgctc tgtgaaggga atgggtgttc atccattctc 900

tacccagccc ccactctgac ccctttactc tgaccccttt attgtctact cctcagagcc 960

cccagtctgt atccttctaa cttagaaagg ggattatggc tcagggtcca actctgtgct 1020

cagagctttc aacaactact cagaaacaca agatgctggg acagtgacct ggactgtggg 1080

cctctcatgc accaccatca aggactcaaa tgggctttcc gaattcactg gagcctcgaa 1140

tgtccattcc tgagttctgc aaagggagag tggtcaggtt gcctctgtct cagaatgagg 1200

ctggataaga tctcaggcct tcctaccttc agacctttcc agattcttcc ctgaggtgca 1260

atgcacagcc ttcctcacag agccagcccc cctctattta tatttgcact tattatttat 1320

tatttattta ttatttattt atttgcttat gaatgtattt atttggaagg ccggggtgtc 1380

ctggaggacc cagtgtggga agctgtcttc agacagacat gttttctgtg aaaacggagc 1440

tgagctgtcc ccacctggcc tctctacctt gttgcctcct cttttgctta tgtttaaaac 1500

aaaatattta tctaacccaa ttgtcttaat aacgctgatt tggtgaccag gctgtcgcta 1560

catcactgaa cctctgctcc ccacgggagc cgtgactgta atcgccctac gggtcattga 1620

gagaaataaa gatcgcttgg aaaagaaatg tga 1653

Claims

1.一种与AS斑块炎症相关的miRNA标志物，其特征在于，包括miR-195-3p、IL-1β,IL-6和TNF-α，其中，miR-195-3p：用于人的Human-NR_029712.1的核苷酸序列如SEQ：ID：NO：1所示；miR-195-3p：用于小鼠的mouse-NR_029581.1的核苷酸序列如SEQ：ID：NO：2所示；IL-1β：用于人的Human-NM_000576.2的核苷酸序列如SEQ：ID：NO：3所示；IL-1β：用于小鼠的mouse-NM_008361.4的核苷酸序列如SEQ：ID：NO：4所示；IL-6：用于人的Human-NM_000600.4的核苷酸序列如SEQ：ID：NO：5所示；IL-6：用于小鼠的mouse-NM_031168.2的核苷酸序列如SEQ：ID：NO：6所示；TNF-α：用于人的Human-NM_000594.3的核苷酸序列如SEQ：ID：NO：7所示；TNF-α：用于小鼠的(mouse-NM_013693.3的核苷酸序列如SEQ：ID：NO：8所示。

2.一种权利要求1所述与AS斑块炎症相关的miRNA标志物的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)ApoE敲除小鼠对照组和实验组血管组织中候选miRNA的筛选；

(2)THP-1源性泡沫细胞中miR-195-3p的表达验证；

(3)miR-195-3p mimic和inhibitor转染细胞后培养上清及细胞中IL-1β,IL-6和TNF-α含量及表达改变；

(4)miR-195-3p过表达慢病毒注射后小鼠后IL-1β,IL-6和TNF-α在小鼠斑块组织巨噬细胞中的表达；

(5)miR-195-3p过表达慢病毒注射后小鼠后血清中IL-1β,IL-6和TNF-α的表达改变；

(6)小动物超声仪分析小鼠主动脉根部内膜的厚度和主动脉弓部血流量大小；

(7)小鼠血管大体及主动脉根部油红O染色观察显示miR-195-3p过表达慢病毒注射后斑块大小；

(8)分析比较动脉斑块炎症相关miRNA和炎症因子的表达改变，与小动物超声结果相比诊断AS的特异性、敏感性指标并进行评价。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，HMD中miR-195-3p表达明显降低，且炎症因子表达明显升高。

4.权利要求1所述与AS斑块炎症相关的miRNA标志物在制备诊断AS性疾病产品中的应用。